Ontregelde toelevering van oxideerbare substraten aan de mitochondrieën in M.E.(cvs)-lymfoblasten

Het mag duidelijk zijn uit onze eerdere meldingen alhier (zie ook referenties in de tekst) dat er bij M.E.(cvs) sprake is van een metabool probleem, toch is de wetenschappelijke literatuur omtrent de cellulaire energie-voorziening (en dus de mitochondrieën) niet altijd éénduidig. Het team van de Australische professor Paul R. Fisher is dit ook al een tijd aan het onderzoeken (zie bv. ‘Complex-V inefficiëntie & ontregelde mitochondriale funktie bij M.E.(cvs)’ – Missailidis D, Fisher PR et al. An isolated Complex V inefficiency and dysregulated mitochondrial function in immortalized lymphocytes from ME/CFS patients. Int. J. Mol. Sci. (2020) 21: 1074) en dit onderzoek wordt hier verder gezet. Onderstaand artikel is weerom uitgebreid en we kunnen niet alles in detail uitleggen maar de resultaten geven aan dat het metabolisme M.E.(cvs) ontregeld is op zo’n manier dat de alternatieven voor glycolyse méér (dan bij controles) worden aangewend om de mitochondrieën te voorzien van oxideerbare substraten (zeg maar brandstof-bronnen voor de energie-voorziening). De resultaten worden omstandig besproken en vergeleken met de resultaten van andere onderzoeksgroepen.

Bevoorrading en gebruik van oxideerbare substraten door de mitochondrieën. De ‘low’ van substraat-molekulen afgeleid van glucose, vetzuren of aminozuren is aangegeven met pijltjes (respectievelijk groen, blauw & rood). Reducerende equivalenten zijn aangeduid (paars). Glucose kan worden gekataboliseerd via glycolyse om de mitochondrieën te voorzien van pyruvaat, dat wordt omgezet door het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) naar acetyl-CoA (voor gebruik in de TCA-cyclus. β-oxidatie van vetzuren levert ook acetyl-CoA aan de TCA-cyclus, door het katabolisme van vetten i.p.v. koolhydraten. Er zijn diverse manieren waarop aminozuren kunnen worden gebruikt. Het gebruik van glutamine wordt benadrukt omwille van z’n belang. Glutamine kan worden omgezet naar glutamaat door glutaminase. Glutamaat kan worden omgezet naar α-KG door glutamaat-dehydrogenase (GLUD1) voor gebruik in de TCA-cyclus, of naar aspartaat door mitochondriaal aspartaat-aminotransferase (GOT2), wat wordt gebruikt bij het evenwicht brengen van de celullaire reductie/oxidatie-toestand en anaplerose (bevoorrading met tussenprodukten) van de TCA-cuclus. Hierbij worden reducerende equivalenten voorzien aan de OXPHOS en intermediairen aan de TCA-cyclus. Reducerende equivalenten komen voort uit een waaier aan processen die elektronen in de elektron-transport-keten kunnen brengen om de protonen-aandrijvende kracht die de ATP-synthese aanstuurt te faciliteren.

————————-

International Journal of Molecular Sciences Vol 22, #4, p 2046 (februari 2021)

Dysregulated provision of oxidisable substrates to the mitochondria in ME/CFS lymphoblasts

Daniel Missailidis (1), Oana Sanislav (1), Claire Y Allan (1), Paige K Smith (2), Sarah J Annesley (1), Paul R Fisher (1)

1 Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, School of Life Sciences, La Trobe University, Melbourne, VIC 3086, Australia

2 Monash Health, Melbourne, VIC 3186, Australia

Samenvatting

Hoewel men steeds meer de biomedische basis van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) begrijpt, blijven de onderliggende pathologische mechanismen onzeker. We rapporteerden eerder over een gereduceerd aandeel van ATP-synthese door Complex-V in de basale zuurstof-consumptie in van M.E./CVS-patiënten verkregen lymfoblast-cellijnen; wat suggestief is voor mitochondriale respiratoire inefficiëntie. Dit was vergezeld van een verhoogde respiratoire capaciteit, gestegen ‘mammalian target of rapamycin complex-1’ (mTORC1) signalisering-aktiviteit en verhoogde expressie van enzymen betrokken bij de TCA-cyclus, beta-oxidatie van vetzuren en mitochondriaal transport. Deze en andere observaties leidden ons tot de hypothese omtrent de ontregeling van mechanismen die de mitochondrieën voorzien van oxideerbare substraten. Het doel van de huidige studie was het herbekijken van deze hypothese door het toepassen van een combinatie van totale-cel transcriptomica, proteomica en metingen van de energie-stress signalisering-aktiviteit gebruikmakend van lymfoblast-cellijnen van 34 M.E./CVS-patiënten en 31 gezonde controles. Hoewel de waarden van glycolytische enzymen onveranderd bleken (overéénkomstig onze eerdere observaties aangaande ongewijzigde glycolyse), vertoonden de totale-cel proteomen van M.E./CVS-lymphoblasten verhoogde waarden qua enzymen betrokken bij de TCA-cyclus […], het pentose-fosfaat pad […], mitochondriale vetzuren beta-oxidatie […] en afbraak van aminozuren inclusief glutamine/glutamaat […], vertakte-keten amino-zuren […] en essentiële aminozuren […]. De aktiviteit van de belangrijke cellulaire energie-stress sensor, AMPK, was gestegen maar de toename was niet statistisch significant. De resultaten suggereren dat het metabolisme bij M.E./CVS ontregeld is op zo’n manier dat alternatieven voor glycolyse meer gebruikt worden dan bij controles, om de mitochondrieën te voorzien van oxideerbare substraten.

1. Inleiding

1.1. Achtergrond

[…] Er werd reeds veel bewijsmateriaal voor de biologische basis van M.E./CVS gepresenteerd maar er werd nog geen onderliggend ziekte-mechanisme geïdentificeerd. Er is een vermoeden van ontoereikende cellulaire energie-bevoorrading, en overéénkomstig daarmee hebben we eerder gerapporteerd over inefficiënte ATP-synthese door Complex-V in M.E./CVS-lymfoblasten [zie onze inleiding].

1.2. Bevoorrading van de mitochondrieën

OXPHOS [oxidatieve fosforylatie] is de voornaamste bron van cellulair ATP. Dit proces wordt aangestuurd door het stromen van elektronen doorheen Complexen I-IV, wat het pompen van protonen naar de mitochondriale intermembraan ruimte medieert. Dit genereert de elektrochemische gradient die door Complex-V wordt aangewend om ADP te fosforyleren [toevoegen van een fosfaat-groep] tot ATP. De elektronen die noodzakelijk zijn voor dit proces worden aan de elektronen-transport-keten geleverd door het reduceren van [de co-enzymen]  NADH [nicotinamide-adenine-dinucleotide] & FADH2 [flavine-adenine-dinucleotide]. De aanlevering van deze elektronen-donoren naar de OXPHOS-complexen is daarom cruciaal voor ATP-synthese via de aërobe ademhaling. De belangrijkste mitochondriale bron van gereduceerd NADH & FADH2 is de TCA-cyclus [tricarbonzuur-, citroenzuur- of Krebs-cyclus; pyruvaat + acetyl-CoA => citraat, enz.], welke wordt bevoorraad met metabole intermediairen, op meerdere ingangsplaatsen via een waaier aan nutriënten-metabole paden. De TCA-cyclus is zodoende een mitochondriaal verbindingspunt voor de participatie van diverse brandstof-bronnen aan de respiratie, inclusief koolhydraten, vetzuren en aminozuren [zie figuur].

Overéénkomstig de vermoedens omtrent ontoereikende cellulaire energie-toevoer, is het bestuderen van het metabolisme en mechanismen die de mitochondrieën voorzien van substraten bij M.E./CVS toegenomen. Door het aanwenden van technieken zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) of massa-spectroscopie kunnen kwantitatieve momentopnames van de aanwezige metabolieten in een staal (gewoonlijk bloed of urine) worden verkregen. De relatieve concentraties van metabolieten bij patiënten vs. controles kunnen vervolgens worden gebruikt om af te leiden welke metabole paden zouden kunnen ge-upreguleerd, gedownreguleerd of omzeild zijn. Er zijn door een stijgend aantal researchgroepen op gebied van M.E./CVS metaboloom-studies opgestart. Veel van dit werk besprak de potentiële ontregeling bij M.E./CVS van de glycolyse, welke de conversie (meerdere stappen) van glucose naar pyruvaat medieert, dat dan kan worden omgezet door pyruvaat-dehydrogenase (PDH) naar acetyl-CoA, een belangrijk substraat voor de TCA-cyclus. Armstrong CW et al. gebruikte 1H-NMR om de concentraties van metabolieten in het serum en de urine van M.E./CVS patiënten te vergelijken met die van gezonde controles [NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Chim. Acta (2012) 413: 1525-1531 /// Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639]. Hun resultaten suggereren een inhibitie van de glycolyse, wat consistent is met een rapport van anderen die M.E./CVS-plasma gebruikten, suggererend dat het benutten van glycolytisch pyruvaat door de TCA-cyclus gereduceerd is [Yamano E et al. Index Markers of Chronic Fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Anderen, die serum gebruikten, hebben echter voorgesteld dat verstoorde voorziening van uit glucose voortspruitend acetyl-CoA aan de TCA-cyclus in de plaats wordt veroorzaakt door een verstoorde PDH-funktie ‘downstream’ van de glycolyse, eerder dan een verstoring van de glycolyse zelf [Fluge Ø et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Andere studies hebben in plaats daarvan ‘Seahorse’ respirometrie aangewend om ‘real-time’ parameters van de respiratie en glycolyse te onderzoeken in levende cellen van M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Terwijl de mate van glycolyse gereduceerd bleek in M.E./CVS CD4+ & CD8+ T-cellen [Mandarano et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients exhibit altered T cell metabolism and cytokine associations. J. Clin. Investig. (2019) 130: 1491-1505], vonden wij geen verschil qua glycolyse in M.E./CVS-lymfoblasten [ref. zie onze inleiding], net zoals Tomas C et al. in M.E./CVS PBMCs of skeletspier-cellen [Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802 /// Substrate utilisation of cultured skeletal muscle cells in patients with CFS. Sci. Rep. (2020) 10, 18232]. Globaal is de rol van de glycolyse bij M.E./CVS onduidelijk en het zou nuttig zijn het onderzoek verder te zetten.

In het licht van het inconsistent bewijs voor een specifiek glycolytisch defekt, is het overwegen van andere processen betrokken bij het gebruik van koolhydraten ook gerechtvaardigd. Anderen hebben gerapporteerd over reducties qua waarden van 5/7 subgroepen metabolieten betrokken bij het koolhydraten-metabolisme (inclusief het disaccharide sucrose) in M.E./CVS plasma-stalen vs. die van gezonde controles [Germain A et al. Comprehensive circulatory metabolomics in ME/CFS reveals disrupted metabolism of acyl lipids and steroids. Metabolites. (2020) 10: 34]. Een daling van de plasma-waarden van disacchariden in de energie-deficiënte context van M.E./CVS kan een weerspiegeling zijn van een verhoogd koolhydraten-katabolisme om te voldoen aan een gestegen cellulair verbruik van glucose. Als de mate van glycolyse zelf onaangetast of verstoord zou zijn, zou glucose in plaats daarvan uitgeput kunnen zijn door verhoogd verbruik door het pentose-fosfaat pad (PPP), wat zich vertakt van de glycolyse via de onomkeerbare dehydrogenatie van glucose-6-fosfaat, en betrekking heeft op de ATP-neutrale synthese van produkten die cruciaal zijn voor het cellulair redox-evenwicht en biosynthetische mechanismen. Belangrijk: PPP-produkten zoals pyruvaat kunnen ook worden aangewend om ATP te genereren, wat oxideerbare substraten voor de mitochondrieën verschaft. Inderdaad: dezelfde auteurs die gedaalde plasma-disacchariden zagen bij M.E./CVS hebben eerder gesuggereerd dat het PPP ontregeld kan zijn bij M.E./CVS [Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. 2017) 13: 371-379]. Dit pad zou daarom ook nauwkeuriger moeten worden onderzocht.

1.3. Alternatieve bronnen van oxideerbare substraten i.p.v. koolhydraten

Aminozuren kunnen worden gemetaboliseerd om te worden aangeboden aan de TCA-cyclus als bronnen van oxideerbare substraten voor de respiratie, of deel te nemen aan de aanvulling van andere metabole intermediairen. Glutamaat is het metabool produkt van meerdere aminozuren, prominent samen met glutamine. De omzetting van glutamine naar glutamaat door glutaminase (GLS) en de daaropvolgende conversie naar het TCA-cyclus intermediair α-ketoglutaraat (α-KG) door glutamaat-dehydrogenase (GLUD1) is een belangrijk mechanisme waardoor de TCA-cyclus aminozuren kan aanwenden om de mitochondriale energie-produktie te helpen opdrijven. Deze reaktie reduceert simultaan NAD+ naar NADH, en is zodoende een andere directe manier voor de bevoorrading van de OXPHOS met reducerende equivalenten. De werking van GLS & GLUD1 in tandem zijn daarom belangrijk voor de directe aanvulling van mitochondriale NADH én als een belangrijke route voor het binnentreden van aminozuren in de TCA-cyclus. Dit mechanisme wordt gereguleerd naargelang de cellulaire energie vereisten, waarbij GLUD1-aktiviteit voornamelijk […] negatief wordt gecontroleerd door GTP [guanosinetrifosfaat; ook een ‘energie-drager’ (zoals ATP)] en positief door ADP.

Cellen kunnen ook glutamaat gebruiken om reducerende equivalenten aan te vullen in de mitochondrieën én te helpen de TCA-cyclus bevoorraden met intermediairen via participatie in de malaat-aspartaat ‘shuttle’ (MAS [biochemisch systeem om elektronen geproduceerd bij de glycolyse te verplaatsen van voor gebruik in OXPHOS]). Hier worden glutamaat en oxaloacetaat omgezet naar aspartaat en α-KG door mitochondriaal aspartaat-aminotransferase (GOT2). Aspartaat wordt dan vertransporteerd uit de mitochondrieën en neemt deel aan de rest van de cyclus, die regeneert (a) cytosolisch NAD+ uit NADH, om dan weerom te worden gereduceerd in katabole niet-mitochondriale processen zoals glycolyse of peroxisomale β-oxidatie [peroxisomen = cel-organellen met belangrijke rol in het lipiden-metabolisme en de omzetting van ROS] en (b) mitochondriaal NADH voor OXPHOS via malaat-dehydrogenase in de TCA-cyclus. Glutamaat werkt daarom niet enkel als een directe bron voor van aminozuren afgeleid NADH en TCA-cyclus substraat via de eerder beschreven GLUD1-route, maar ook door bevoorrading de van de GOT/MAS-route.

De eerder genoemde studies (met serum) door Fluge Ø et al. & Armstrong CW et al. suggereerden ook dat het katabolisme van aminozuren om de TCA-cyclus te voeden meer aangewend wordt bij M.E./CVS-patiënten. De details verschillen echter. Armstrong CW et al. stellen gestegen glutamaat-gebruik door de mitochondrieën voor, specifiek via de deaminatie van glutamaat naar aspartaat, zoals aangegeven door gereduceerde glutamaat en toegenomen aspartaat-waarden (GOT2-route). In tegenstelling daarmee zagen Fluge Ø et al. reducties van de waarden van zowel glutamine als glutamaat maar ook van aspartaat, wat dan in plaats daarvan verhoogde glutamaat-degradatie via de GLUD1-route suggereert, eerder dan via GOT2 zoals gesuggereerd door Armstrong CW et al. Misschien in tegenstelling hiermee rapporteerden Fluge Ø et al. echter ook verhoogde mRNA-expressie voor sirtuine-4 (SIRT4) [mitochondriaal enzyme dat de PDH-aktiviteit inhibeert] in M.E./CVS PBMCs en SIRT4 staat is bekend voor de onderdrukking van GLUD1-aktiviteit. Ondanks sommige inconsistente details, beklemtonen deze studies een ontregeld aminozuren-metabolisme als een belangrijk exploratie-gebied dat verder zou moeten worden nagestreefd bij M.E./CVS, bijzonderlijk in een metabool aktieve cellulaire context.

De mogelijkheid voor abnormaal aanwenden van vetzuren β-oxidatie komt duidelijk naar voor uit ons werk waar we inefficiënte ATP-synthese door Complex-V vergezeld van een compenserende stijging van de respiratoire capaciteit zagen, en verhoogde expressie van mitochondriale transporters, TCA-cyclus en vetzuren β-oxidatie enzymen in M.E./CVS-lymfoblasten [ref. zie onze inleiding]. Vetzuren β-oxidatie omvat de afbraak van vetzuren naar acetyl-CoA voor de TCA-cyclus terwijl ook reducerende equivalenten worden aangevuld. Hoewel besproken in meerdere metaboloom-studies, is het lipiden-metabolisme over het algemeen in M.E./CVS-research ook een punt van onzekerheid dat her-onderzoek. Naviaux RK et al. [Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-E5480] rapporteerden dat ceramide-waarden [(sfingo)lipide-molekule in het celmembraan waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood] gedaald waren bij M.E./CVS-patiënten, terwijl Nagy-Szakal D et al. [Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics. Sci Rep. (2018) 8: 10056] daarna geen consistente daling zagen, en Germain et A al. [2020; zie hierboven] rapporteerde dan weer een stijging van de ceramide-waarden. Een andere discrepantie is dat de gedaalde FAD-concentraties gerapporteerd door Naviaux RK et al. en gereduceerde carnitines gemeld door Nagy-Szakal D et al. worden geïnterpreteerd als waarschijnlijk hinderend voor vetzuren β-oxidatie, terwijl […] Germain A et al. in plaats daarvan wijzen op een upregulering van vetzuren β-oxidatie bij M.E./CVS-patiënten. Ze rapporteerden verschillen tussen twee van hun eigen studies, die ze toeschreven aan verschillen in staal-afname en -verwerking [Germain A et al. Prospective Biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology. Metabolites 2018, 8: 90]. Dit beklemtoont de waarde van het opstellen en herbekijken van ziekte-modellen in stabiele proliferatieve celcultuur-systemen die minder beïnvloed worden door dergelijke staalname-kwesties en meer reproduceerbaar zijn.

β-oxidatie van vetzuren wordt gestimuleerd door AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) aktiviteit, één van de voornaamste regulators van het energie-metabolisme in de cel. Abnormale verhoging van AMPK-aktiviteit kan de gerapporteerde stijging van korte-keten vetzuren bij M.E./CVS-patiënten verklaren [Armstrong CW et al. The association of fecal microbiota and fecal, blood serum and urine metabolites in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Metabolomics (2017) 13: 8]. Verhoogde waarden van gefosforyleerd (geaktiveerd) AMPK werden vastgesteld door Mensah FFK et al. in subpopulaties B-cellen waarvan de frequentie in de B-cel populatie was gestegen in M.E./CVS-stalen [CD24 expression and B cell maturation shows a novel link with energy metabolism: Potential implications for patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front. Immunol. (2018) 9: 2421]. Anderen hebben echter gemeld dat de AMPK-aktivatie toestand niet significant verschilde tussen gecultiveerde spiercellen van CVS-patiënten (Fukuda-criteria) en gezonde controles [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Er is daarom bijkomend onderzoek nodig ter verduidelijking van de rol van AMPK bij M.E./CVS.

1.4. Onderzoek van brandstof-bron preferentie in M.E./CVS-lymfoblasten

Bij onze eerdere bevindingen omtrent inefficiënte ATP-synthese, gestegen respiratoire capaciteit, niet-mitochondriaal katabolisme, en verhoogde expressie van mitochondriale ‘carriers’, TCA-cyclus en β-oxidatie enzymen in M.E./CVS-lymfoblasten, werd het duidelijk dat het aanwenden van andere mechanismen die substraten aan de mitochondrieën leveren waarschijnlijk ook ontregeld waren in deze cellen. We startten daarna gecombineerde transcriptomica en proteomica met als doel het identificeren van mechanismen (duidelijker en op beide vlakken) ontregeld zijn in M.E./CVS-lymfoblasten, en het verifiëren van de conclusies van onze preliminair proteomica werk [ref. zie onze inleiding] bij een grotere groep. We bepaalden ook de AMPK-aktiviteit in M.E./CVS-lymfoblasten. Onze observaties hierbij suggereren gestegen aanwending van het PPP, vetzuren β-oxidatie, en van de mitochondriale mechanismen voor degradatie van specifieke aminozuren. Tesamen lijken deze resultaten een verschuiving te weerspiegelen naar vetzuren- en aminozuren-katabolisme als geprefereerde bronnen van oxideerbare substraten voor de mitochondrieën in M.E./CVS-lymfoblasten.

2. Resultaten

[We beperken ons tot de hoofdlijnen van de zeer uitgebreide oplijsting – tekst op aanvraag beschikbaar – en verwijzen naar de bespreking.]

2.1. Globale veranderingen in transcriptomen & proteomen van M.E./CVS-lymfoblasten

[…]

2.1.1. Transcriptomen

[…]

2.1.2. Proteomen

[…]

2.2. Bevestigen van eerdere proteïne-expressie resultaten en onderzoeken van transcript-waarden in belangrijke mitochondriale mechanismen

[…]

2.3. Expressie van enzymen betrokken in het koolhydraten-katabolisme via glycolyse & het pentose-fosaat pad (PPP)

[…]

2.4. Enzymen betrokken bij mitochondriale en vetzuren and β-oxidatie zijn verhoogd wat betreft hun expressie

[…]

2.5. Expressie van enzymen betrokken bij het mitochondriaal gebruik van glutamine, BCAAs & essentiële aminozuren is gestegen in M.E./CVS-lymfoblasten

[…]

2.6. Expression of Proteasome Subunits Is Elevated in ME/CFS Lymphoblasts

[…]

3. Bespreking

Onze resultaten tonen onveranderde expressie-waarden van glycolytische enzymen in M.E./CVS-cellen maar de waarden van enzymen betrokken bij het pentose-fosfaat pad, alsook proteïnen, aminozuren en vetzuren degradatie blijken gestegen. Dit opvallend patroon van ontregelde expressie van katabole enzymen biedt sterke ondersteuning voor eerdere metingen van metabolomica, glycolytische flux en mitochondriale funktie, wat een metabole verschuiving naar alternatieven voor glycolytische aanlevering van oxideerbare substraten aan de mitochondrieën suggereert. Eerder dan mediatie door een reductie qua glycolytische funktie, ondersteunen onze resultaten onze eerder suggestie dat deze verschuiving wordt veroorzaakt door een verhoging van alternatieve katabole mechanismen. De observatie van een inefficiëntie qua respiratoire ATP-synthese door mitochondriaal Complex-V in M.E./CVS-cellen suggereert dat deze metabole verschuiving wellicht gecompenseerd is, terwijl de gestegen aktiviteit van mTORC1 (en mogelijks AMPK) suggereert dat dit gemedieerd wordt door cellulaire stress signalisering mechanismen.

Een karakteristiek van onze resultaten is het opvallend verschil qua patroon van expressie-veranderingen op RNA- & proteïne-niveaus. De proteomica onthulde een breed patroon van verhoogde expressie van proteïnen betrokken bij alternatieven voor de glycolytische bevoorrading en het katabolisme van oxideerbare substraten voor mitochondriale respiratie. In tegenstelling daarmee bleken de waarden van transcripten coderend voor deze proteïnen, in veel gevallen, onveranderd of gedaald. Dit is een onverwacht maar belangrijk inzicht in de onderliggende cytopathologische mechanismen van M.E./CVS. Het suggereert dat het globale patroon van ontregeling in M.E./CVS-cellen het resultaat is van een netwerk van normaal homeostatische mechanismen, inclusief concurrerende antagonistische elementen zoals gestegen mTORC1- & AMPK-aktiviteiten, die gen-expressie en metabolisme op transcriptioneel, translationeel en post-translationeel niveau reguleren. De belangrijke mechanismen die op die manier ontregeld bleken zijn β-oxidatie van vetzuren, glutamine-metabolisme, metabolimse van vertakte-keten aminozuren en proteasomale proteïne-afbraak.

3.1. Preferentiële vetzuren β-oxidatie en ontregelde intracellulaire energie-stress signalisering

We vonden eerder geen veranderingen qua mate, reserve en capaciteit van glycolyse in M.E./CVS-lymfoblasten en we rapporteren hier ongewijzigde expressie van glycolytische enzymen op proteïne-niveau. In plaats van een verstoorde capaciteit tot glycolyse, suggereren onze resultaten dat veranderingen in het M.E./CVS-lymfoblast metabolisme gestuurd zou kunnen worden door ontregelde energie-stress signalisering en gestegen gebruik van alternatieven zoals de β-oxidatie van vetzuren of het verhoogde afleiden van glucose naar het PPP. Onze observatie dat enzymen die vetzuren β-oxidatie mediëren breed ontregeld zijn in M.E./CVS-lymfoblasten bevestigen onze eerdere observatie in een piloot-studie [ref. zie onze inleiding]. Naast de andere β-oxidatie enzymen die ge-upreguleerd bleken, suggereren enzymen die meer tot expressie kwamen – zoals zeer-lange-keten specifiek acyl-CoA-dehydrogenase (ACADVL) & acyl-CoA-oxidase-1 (ACOX1) [enzymen] – een gestegen gebruik van zeer-lange-keten vetzuren (VLCFA). Dit is consistent met de gedaalde sfingolipiden in het plasma van M.E./CVS-patiënten die werden gerapporteerd door Naviaux R et al., aangezien VLCFA daarvan zijn afgeleid. Op dezelfde manier is de gestegen vetzuren β-oxidatie gesuggereerd door Germain A et al. (2020) ook consistent met onze observaties hier, als de mate van vetzuren β-oxidatie inderdaad ge-upreguleerd is overéénkomstig de expressie van de betrokken enzymen [zie hierboven]. Sweetman E et al. zagen verhoogde waarden qua enzymen betrokken bij het metabolisme van keton-lichamen [molekulen met C=O-groep (bv. aceton), die in het lichaam gemaakt worden als vet moet worden afgebroken als gevolg van een tekort aan koolhydraten (suikers)] in de proteomen van M.E./CVS-PBMCs, wat kan wijzen op verhoogde oxidatie van vetzuren en hun afgeleiden door de TCA-cyclus [A SWATH-MS analysis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome peripheral blood mononuclear cell proteomes reveals mitochondrial dysfunction. J. Transl. Med. (2020) 18: 365]. Meer opvallend in dezelfde studie: de expressie van acyl-CoA-dehydrogenasen en specifiek de beta-subunit (HADHB) van mitochondriaal trifunktioneel enzyme [katalyseert 3 van de 4 stappen van de beta-oxidatie] was verhoogd in PBMCs – wat wij ook zagen in ons werk met lymfoblasten hier. Dit is een aanvulling op de gedeelde observaties van verhoogde expressie van OXPHOS-complex subunits – prominent Complexen I & V – en proteïnen in substraat-bevoorrading mechanismen zoals de TCA-cyclus. Aangezien de studie door het team van Sweetman niet-geïmmortaliseerde PBMCs (waarvan lymfoblasten zijn afgeleid) onderzocht, bevestigt dit dat de ge-upregeerde respiratoire capaciteit en upregulering van substraten-aanleverende mitochondriale mechanismen, gezien in M.E./CVS-lymfoblasten, aanwezig is onafhankelijk van immortalisatie.

Ondanks deze brede overéénkomst, blijven er enkele discrepanties in de literatuur omtrent vetzuren β-oxidatie. De door Naviaux RK et al. gerapporteerde gereduceerde FAD-waarden en de gedaalde carnitinen gemeld door Nagy-Szakal D et al. worden geïnterpreteerd als hinderend voor vetzuren β-oxidatie. Aangezien deze en andere eerder vernoemde studies conclusies trekken aangaande de cellulaire funktie uit de waarden van bloed-metabolieten, en ons werk hier enkel expressie-waarden onderzocht, dienen meer directe metingen van de mate van vetzuren β-oxidatie in een cellulaire context te worden nagestreefd in de toekomst. Een eerdere studie hieromtrent gebruikte ‘Seahorse’ respirometrie en meldde een ongewijzigde mate van vetzuren-gebruik in gepermeabiliseerde PBMCs van M.E./CVS-patiënten [Tomas C et al. Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types. PeerJ (2019) 7: e6500]. De metabole sluimertoestand en grotere sterfte van M.E./CVS-lymfocyten [Missailidis D et al. Cell-based blood biomarkers for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Int. J. Mol. Sci. (2020) 21: 1142] zou echter verschillen kunnen hebben verdoezeld, wat ook het geval zou kunnen zijn door het verlies aan cytoplasmische inhoud te wijten aan permeabilisatie. De bevoorrading van de respiratie door gebruik van vetzuren bleek ook ongewijzigd in skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten, in tegenstelling tot de verwachtingen van de auteurs over gestegen, compenserende β-oxidatie als deel van een verschuiving weg van het glucose-metabolisme [zie Tomas C et al. (2020) hierboven]. De verwachte toename zou afwezig geweest kunnen zijn door de verminderde inspanning die M.E./CVS-patiënten kunnen leveren, aangezien inspanning mitochondriale biogenese en spier-funktie upreguleert. Een andere mogelijkheid is dat het metabolisme door prolifererende cellen (geïllustreerd door lymfoblasten) en niet-proliferende cellen (geïllustreerd door spiercellen) bij M.E./CVS verschillen wat betreft hun patronen van substraat-gebruik of hun capaciteit om metabool adaptief te zijn. Directe testen van vetzuren-gebruik in lymfoblasten en proteïne-expressie in spiercellen zijn daarom nodig om te bevestigen dat de vetzuren acid β-oxidatie en expressie van de betrokken enzymen gewijzigd zijn in overleg met elkaar in zowel M.E./CVS-lymfoblasten en spiercellen.

Samen met de upregulering van β-oxidatie enzymen, zagen we een statistisch niet-significante ca. 17% toename van de fosforylatie van acetyl-CoA-carboxylase (ACC [katalyseert de synthese of malonyl-CoA, een belangrijk substraat voor vetzuren-synthese]) in M.E./CVS-lymfoblasten. Als dit via toekomstig werk wordt bevestigd, zou deze mogelijke toename van de AMP-gektiveerd proteïne-kinase (AMPK) inhibitie van ACC suggestief kunnen zijn voor een verschuiving naar katabolisme eerder dan biosynthese van vetzuren. Anderzijds is ‘mammalian target of rapamycin complex-1’ (mTORC1) gekend voor de aktivatie van de transcriptie-factor ‘sterol regulatory element-binding protein-1’ (SREBP-1 [speelt een belangrijke rol bij de lipogenese door de lever]) als onderdeel van het Akt signalisering-mechanisme [reguleert de celcyclus] en de upregulatie van de expressie van ACC & vetzuren-synthase (FASN) [enzymen die de vetzuren-biosynthese controleren]. Aangezien mTORC1 chronisch hyperaktief is in M.E./CVS-lymfoblasten, verwachtten we verhoogde waarden van ACC1- & FASN-transcripten te zien. We vonden dat beide de neiging vertoonden verhoogd te zijn in M.E./CVS-lymfoblasten maar zonder statistische significantie. Niettemin zijn de resultaten consistent met de eerdere gerapporteerde stijging van de mTORC1-aktiviteit en de ‘downstream’ aktivatie van SREBP-1. SREBP-gereguleerde transcriptie behoorde tot de mechanismen waarvan we vonden ze ge-upreguleerd waren bij gen-expressie analyse van de transcriptomica-gegevens. Ondanks deze mogelijke upregulering van ACC- & FASN-transcriptie, vonden we geen bewijs voor verhoogde waarden van deze beide proteïnen […]. Als er al iets van aan zou zijn, hadden ze de neiging gedaald te zijn en, indien bevestigd via toekomstig werk, zou dit ook een metabole verschuiving ten voordele van vetzuren-katabolisme suggereren.

3.2. Ontregeling van het glutamine-metabolisme

De verhoogde expressie van enzymen betrokken bij mitochondriale glutamine-afbraak die we hier zagen, is consistent met de dalingen van de waarden van glutamine in het bloed die eerder werden gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten [zie Armstrong CW et al. (2012 & 2015) & Fluge Ø et al. hierboven]. Dit is sterk suggestief voor gestegen gebruik van glutamine als een mitochondriaal substraat door M.E./CVS-cellen. Een dergelijke ontregeling van het glutamine-metabolisme zou ver-strekkende gevolgen hebben gezien het belang bij veel cellulaire processen.

Terwijl het ook dient ter aanvulling van metabole intermediairen en reducerende equivalenten om te helpen bij het voortstuwen van de respiratie, aktiveert mitochondriale glutamine-degradatie zelf de mTORC1-signalisering. Er wordt gedacht dat dit optreedt na glutamaat-deaminatie naar α-KG door glutamaat-dehydrogenase (GLUD1), één van de enzymen waarvan de expressie hier verhoogd bleek. α-KG wordt vertransporteerd naar het cytosol door het mitochondriaal transporter-proteïne SLC25A11 waar het mTORC1 aktiveert […]. […] SLC25A11 is één van de mitochondriale transport-proteïnen waarvan we eerder meldden dat ze ge-upreguleerd waren in M.E./CVS-lymfoblasten en er werd ook door Sweetman A et al. gevonden dat ze ge-upreguleerd waren in PBMCs.

Als mitochondriaal glutamine-gebruik inderdaad verhoogd is, zoals wordt gesuggereerd door de verhoogde expressie van de betrokken enzymen, kan het bijdragen tot de chronische hyperaktivatie van mTORC1 in M.E./CVS-lymfoblasten. Dit is bijzonder waarschijnlijk gezien werd voorgesteld dat de krachtigste aminozuren-aktivator van mTORC1 (leucine) dit specifiek zou doen via […] aktivatie van GLUD1 en upregulering van het mitochondriaal glutamine-katabolisme. Er dient verder werk te worden ondernomen om oorzaak/effekt-verbanden betrokken bij mTORC1-aktivatie in M.E./CVS-lymfoblasten te verduidelijken.

Verhoogde glutamaat-flux naar aspartaat (gekatalyseerd door GOT2) wordt in onze resultaten gesuggereerd door de stijging van de mitochondriaal aspartaat-aminotransferase (GOT2) expressie en werd voorgesteld in metaboloom-studies door anderen [Armstrong CW et al. (2015)]. Zoals eerder werd beschreven, is dit mechanisme een belangrijke component van de malaat-aspartaat ‘shuttle’ (MAS) die de cytosol en mitochondriale redox-status in evenwicht houdt. In M.E./CVS-lymfoblasten vertoonde het cytoplasmisch enzyme malaat-dehydrogenase (MDH1) – dat cruciaal is voor de MAS – ook een toegenomen expressie. Hoewel de MAS belangrijk is voor het aanvullen van reducerende equivalenten voor OXPHOS, zijn de werkingen er van ook noodzakelijk om andere ontregelde processen die M.E./CVS-mitochondrieën voorzien van oxideerbare substraten, zoals peroxisomale vetzuren β-oxidatie, te faciliteren. Peroxisomale β-oxidatie genereert NADH en is duurzaam als mitochondriale transport-mechanismen beschikbaar zijn om NADH terug naar NAD+ te oxideren.

Verhoogde MAS-aktiviteit in M.E./CVS-lymfoblasten zou daarom niet enkel werken door op een directe manier respiratie te ondersteunen via de aanvulling van mitochondriale reducerende equivalenten, maar ook indirect assisteren bij het aanleveren van acetyl-CoA, afgeleid van alternatieve bronnen zoals VLCFA, aan de TCA-cyclus.

De toegenomen expressie die we zagen in M.E./CVS-lymfoblasten draagt bij aan het steeds groeiend bewijsmateriaal van proteomica en metabolomica dat hyperkatabolisme van glutamine in M.E./CVS-cellen ondersteunt, dus zijn directe bepalingen van glutamine-verbruik in M.E./CVS-lymfoblasten of andere metabool aktieve celtypes gerechtvaardigd om dit te bevestigen. Het zal belangrijk zijn dit in aktief metaboliserende, proliferende cellen te bepalen, gezien het feit dat uit voorafgaand werk door anderen bleek dat er geen verschil was wat betreft door glutamine ondersteunde respiratie in metabool sluimerende, gepermeabiliseerde PBMCs en een klein staal gepermeabiliseerde myotubes [Tomas C et al. (2019)]. Aangezien conventioneel zoogdieren celcultuur-medium gesupplementeerd wordt met glutamine in fysiologische hoeveelheden om te voldoen aan proliferatieve cel-metabolisme programma’s, zou het nuttig zijn de effekten van wisselende glutamine-beschikbaarheid te testen in culturen van M.E./CVS- en controle-lymfoblasten.

Aangezien van glutamine afgeleid α-KG cruciaal is voor de inductie van epigenetische modificaties door DNA- & histoon-demethylases, kan verhoogd gebruik van glutamine en TCA-cyclus intermediairen om mitochondriale respiratie aan te drijven, geassocieerd zijn met veranderingen qua niveaus van DNA- en histoon-methylatie. Dit zou belangrijk kunnen zijn gezien het groot aantal ge-upreguleerde en een zelfs groter aantal gedownreguleerde transcripten in M.E./CVS-lymfoblast transcriptomen. Er hebben eerder meerdere studies die DNA-methylatie onderzochten bij M.E./CVS-patiënten plaats gevonden [de Vega WC et al. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS one (2014) 9: e104757 /// de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Medical Genomics (2017) 10: 11 /// de Vega WC et al. Integration of DNA methylation & health scores identifies subtypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Epigenomics (2018) 10: 539-557 /// Trivedi MS et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLoS ONE (2018) 13: e0201066 /// Brenu EW et al. Methylation profile of CD4⁺ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228]. Deze studies, die differentiële methylatie-status bekeken, werden besproken: de aandelen van plaatsen met differentiële hypo- of hyper-methylatie bij M.E./CVS bleken inconsistent [Almenar-Perez E et al. Epigenetic components of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome uncover potential transposable element activation. Clin. Ther. (2019) 41: 675-698]. Helliwell AM et al. voerden de eerste epigenetische studie op basis van ‘reduced representation’ bisulfiet-sequentiebepaling [voor DNA-methylatie meting] (wat in staat is meer CpG-plaatsen te beslaan dan ‘array’-methodes) uit [Changes in DNA methylation profiles of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients reflect systemic dysfunctions. Clin. Epigenetics (2020) 12: 167]. Deze studie vond significante verschillen (vergelijkbare aantallen) qua hypo- én hyper-gemethyleerde plaatsen in de genomen van PBMCs van M.E./CVS-patiënten, suggererend dat significante epigenetische ontregeling aanwezig is maar niet specifiek ten voordele van hypo- of hyper-methylatie. Dit contrasteert met onze bevinding van significant meer gedownreguleerde dan ge-upreguleerde transcripten in M.E./CVS-lymfoblasten.

Binnen de regulerende gebieden van proteïne-coderende genen, onderzocht in de studie door Helliwell AM et al., is het de moeite waard op te merken dat het gen coderend voor de Complex-1 subunit NDUFA11 [deel van NADH-dehydrogenase (complex-1)] gehypomethyleerd was. Dit is consistent met de verhoogde Complex-1 expressie die evident is in deze en andere studies met lymfoblasten, alsook met de studie met PBMCs van dezelfde auteurs [zie Sweetman E et al.]. Bijkomende epigenetische studies die gebruik maken van verschillende celtypes zouden waardevol zijn, aangezien het mogelijk is dat in proliferatieve celtypes zoals lymfoblasten, factoren zoals gewijzigde gen-expressie programma’s of glutamine-depletie geaccentueerd zijn en dus een grotere impact kunnen hebben op de DNA-methylatie status dan in PBMCs.

3.3. Ontregelde vertakte-keten aminozuren- en proteïne-afbrekende mechanismen

Upregulering van het vertakte-keten ketozuur-dehydrogenase (BCKDH [‘branched-chain’ ketozuur dehydrogenase (BCKDH), mitochonriaal enzyme-complex dat de afbraak van vertakte-keten aminozuren controleert ]) complex in M.E./CVS-lymfoblasten wijst sterk op gestegen mitochondriaal katabolisme van vertakte-keten aminozuren (BCAAs) als bron voor oxideerbare substraten en TCA-cyclus intermediairen. Er werd bij muizen aangetoond dat de mTORC1-funktie essentieel is voor de stimulatie van BCKDH-degradatie van BCAAs, aangezien behandeling met de mTORC1-inhibitor rapamycine de aktivatie van het BCKDH-complex onderdrukte. Gezien mTORC1 hyperaktief is in M.E./CVS-lymfoblasten, verwachtten we en zagen we inderdaad verhoogde expressie van BCKDH in de M.E./CVS-proteomen. De toegenomen degradatie en depletie van BCAA dat dit zou opleveren, zou op z’n beurt echter de aktiviteit van mTORC1 kunnen bedwingen, aangezien gestegen cellulaire BCAA-concentraties mTORC1 aktiveren. Het lijkt waarschijnlijk dat mTORC1-aktiviteit BCAA-degradatie upreguleert terwijl mTORC1 zelf wordt geaktiveerd door andere fenomenen in M.E./CVS-lymfoblasten, zoals de verhoogde mitochondriale degradatie van glutamine.

BCKDH-aktiviteit wordt ook gereguleerd door inhiberende fosforylatie door zn’ kinase BCKDK maar de waarden van BCKDK in M.E./CVS-lymfoblasten waren niet significant verschillend van deze bij gezonde controles. Het zou waardevol zijn de mate van BCAA-gebruik in M.E./CVS-lymfoblasten direct te meten, om de richtingsverschuiving qua mitochondriaal BCAA-metabolisme, dat wordt aangegeven door verhoogde BCKDH-expressie, te bevestigen.

Een bron van BCAAs en andere aminozuren, zowel als oxideerbare substraten voor de mitochondrieën en als aktivatoren van mTORC1, is proteolyse [afbraak van proteïnen tot polypeptiden of aminozuren].. Proteolyse, gemedieerd door het ubiquitine-proteasoom systeem [proteasoom = proteïnen-complex dat overbodige of beschadigde proteïnen afbreekt; ubiquitine = proteïne dat proteïnen markeert die moeten worden afgebroken] resulteert in de gerichte degradatie van intracellulaire proteïnen en de afgifte van vrije aminozuren. Het is een normale respons op ontoereikende calorie-inname en is ontregeld bij veel ziekten. De verhoogde expressie van proteasoom-subunits en assemblage-factoren in M.E./CVS-lymfoblasten suggereert dat gerichte proteïne-afbraak ge-upreguleerd is. De proteoom-studie door Sweetman E et al. rapporteerde ook verhoogde expressie van proteasoom-subunits en assemblage-factoren in PBMCs bij M.E./CVS. Tesamen met onze resultaten biedt dit overtuigend bewijs voor het feit dat het ubiquitine-proteasoom systeem ge-upreguleerd is in lymfoïde cellen van M.E./CVS-patiënten. Dit zou niet enkel werken om vrije aminozuren te leveren maar kan ook nodig zijn om het hoger aantal of verkeerd gevouwen proteïnen, die natuurlijk gepaard gaan met de translationele upregulering van veel proteïnen in M.E./CVS-lymfoblasten, af te breken. Aangezien enzymen betrokken bij de autofage degradatie van proteïnen moeilijk gedetekteerd werden in de totale-cel proteomen, is het onzeker of de degradatie van intracellulaire proteïnen door autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert, opruimen van beschadigde mitochondrieën)] ook ge-upreguleerd is.

Autofagie wordt gestimuleerd door aktivatie van serine/threonine-proteïne-kinase (Ulk1) door AMPK, en geïnhibeerd door mTORC1, terwijl mTORC1 zelf wordt geïnhibeerd door AMPK-aktiviteit. Er kan echter nog gelijktijdige aktivatie van AMPK en mTORC1 optreden en resulteren in aanhoudende autofagie. Dit kan tegemoet komen aan de nood tot afbraak van de toegenomen aantallen verkeerd gevouwen proteïnen die natuurlijk gepaard gaan met de ge-upreguleerde translatie van proteïnen die wordt gestimuleerd door mTORC1, of om katabool metabole intermediairen die worden gebruikt om proliferatief cel-metabolisme te ondersteunen (zoals deze gebruikt in de TCA-cyclus) aan te vullen. Gezien het feit dat de stijging van gemiddelde AMPK-aktiviteit niet statistisch significant was, en dat dit optrad samen met verhoogde mTORC1-aktiviteit in M.E./CVS-lymfoblasten, is het onduidelijk of men gestegen of gedaalde autofagie moet verwachten in deze cellen. Potentiële ontregeling van autofagie bij M.E./CVS verdient daarom verder te worden bestudeerd.

4. Materialen & methodes

[…]

5. Besluiten

De studie betrachtte het verder onderzoeken van mechanismen die oxideerbare substraten aan de mitochondrieën in M.E./CVS-lymfoblasten verstrekken. Onze resultaten hier bevestigen onze eerdere observaties omtrent OXPHOS-complex, TCA-cyclus enzymen, vetzuren β-oxidatie enzymen en mitochondriale ‘carrier’ [familie proteïnen die molekulen over de mitochonsriale membranen transfereren] expressie in M.E./CVS-lymfoblasten. De ongewijzigde waarden van glycolytische enzymen zijn consistent met de onveranderde mate van glycolyse die we eerder observeerden in deze celln. Onze nieuwe observaties tonen ook ge-upreguleerde expressie van enzymen betrokken bij het PPP en mitochondriale afbraak van aminozuren voor energie. Tesamen versterken deze bevindingen het voorstel dat M.E./CVS-lymfoblasten wenden in toenemende mate alternatieven voor glycolyse aan in een poging de respiratoire inefficiëntie van Complex-V te compenseren (die we eerder rapporteerden). Veel van de mechanismen of proteïnen die ge-upreguleerd zijn in onze proteomica dataset overlappen met werk van anderen die gebruikmaken van niet-geïmmortaliseerde PBMCs [zie Sweetman E et al.], wat er sterk op wijst dat deze veranderingen inherent zijn voor lymfoïde cellen van M.E./CVS-patiënten. Gecombineerde analysie met onze transcriptomia dataset geeft ge-upreguleerde expressie van vele mitochondriale proteïnen aan op translationeel niveau, waarschijnlijk gestimuleerd door mTORC1-signalisering. Onze eerder verkennende analyse van beide datasets wees ook op de brede aktivatie van immunologische mechanismen in M.E./CVS-lymfoblasten, welke een basis bieden voor toekomstige hypothesen en onderzoek. Daarnaast vonden we eerder dat parameters van de mitochondriale werking van lymfoblasten, mTORC1-signalisering en PBMC-leefbaarheid accuraat M.E./CVS-gevallen van controles kunnen onderscheiden. De 259 proteïnen en 2.243 transcripten die significant gewijzigd bleken wat betreft expressie (na correctie voor meerdere vergelijkingen) beklemtonen daarom de mogelijkheid dat diagnostische panels van differentieel tot expressie komende genen succesvol kunnen worden aangewend voor gelijkaardige doeleinden bij toekomstige biomerker-o

Cellulaire energie in gecultiveerde skeletspier-cellen van patiënten met CVS

Mensen uit het onderzoeksteam rond Prof. Julia Newton zijn al enkele jaren bezig met gedegen onderzoek rond de cellulaire energie-produktie bij M.E.(cvs). Onderstaand artikel is een voorzetting daarvan. Lees dus ook hun publicaties over eerder werk:

2015, Brown, ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’

2017, Tomas, ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’

2018, Brown, ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen’

2019, Tomas/Brown, ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS’

Deze studie toonde dat spiercellen hetzelfde probleem vertonen als wat werd gevonden in monoycten uit de bloedsomloop. Dit wijst er op dat de verstoorde aanmaak van energie dus een algemeen probleem is: “skeletspier-cellen van CVS-patiënten vertonen een gelijkaardige dysfunktie wat betreft mitochondriale respiratie als PBMCs”. Zoals ook reeds door andere teams werd gesuggereerd ligt de dysfunktie wellicht in de verbindingsstap tussen glycolyse en de TCA-cyclus. De resultaten worden omstandig besproken.

Daar het een studie over spierbiopten (invasief) gaat, betreft het een kleine populatie. Er wordt aangegeven dat de diagnostische criteria van Fukuda (niet CCC) werden gehanteerd maar de patiënten hadden wel een zeer ernstige vermoeidheidsgraad.

Het werk werd gefinancierd door ‘ME Research UK’ en via bijdragen van de ‘ME Association’ & ‘Action for ME’.

————————-

Scientific Reports (2020) 10: 18232

Substrate utilisation of cultured skeletal muscle cells in patients with CFS

Cara Tomas (1), Joanna L. Elson (1,2), Julia L. Newton (1,3) & Mark Walker (1,3)

1 Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK

2 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, UK

Patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) lijden dikwijls onder ernstige spierpijn en een onvermogen om zich in te spannen omwille van spier-moeheid. Er werd eerder aangetoond dat CVS skeletspier-cellen lagere waarden qua ATP en een AMP-gektiveerd proteïne-kinase dysfunktie hebben. Deze studie beschrijft experimenten die kijken naar het gebruik van verschillende substraten door by skeletspier-cellen van CVS-patiënten (n = 9) en gezonde controles (n = 11) gebruikmakend van extracellulaire flux analyse. De resultaten tonen dat CVS skeletspier-cellen niet in staat zijn glucose in dezelfde mate te gebruiken als cellen van gezonde controles. CVS skeletspier-cellen bleken normaal galactose en vetzuren te oxideren, wat er op wijst dat de bio-energetische dysfunktie ‘upstream’ van de TCA-cyclus ligt. De dysfunktie qua glucose-oxidatie is gelijkaardig met wat eerder werd getoond in bloedcellen van CVS-patiënten. De samenhang van de cellulaire bio-energetische dysfunktie bij verschillende celtypes ondersteunt de hypothese dat CVS een systemische ziekte is. Het behoud van de bio-energetische defekten in gecultiveerde cellen geeft aan dat er een genetische of epigenetische component verbonden is aan de ziekte. Dit is de eerste studie die cellen afgeleid van skeletspier-biopten van CVS-patiënten en gezonde controles gebruikt om de cellulaire bio-energetische funktie in complete cellen te bekijken.

Inleiding

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), algemeen bekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)  is […] met universeel aanvaarde diagnostische criteria die nog dienen te worden overééngekomen. De cellulaire bio-energetica van CVS werden eerder bestudeerd [Naast onderstaande studies: Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Fluge Ø., Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Yamano E et al. Index Markers of Chronic Fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-80 /// Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 13: 371-379]. Deze studies maakte gebruik van verschillende celtypes en toonden dat cellen van CVS-patiënten een dysfunktie qua cellulaire energie-produktie vertonen. Onze groep gebruikte eerder perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en toonde dat cellen van CVS-patiënten in aanwezigheid van glucose het oxidatieve fosforylatie mechanisme (OXPHOS, ook gekend als mitochondriale respiratie, niet in dezelfde mate aanwenden als gezonde controles [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. Deze studie toonde ook dat niet enkel de stoornis aanwezig was bij ‘baseline’ maar dat cellen van CVS-patiënten ook significant lagere OXPHOS-waarden hadden wanneer de cellen tot hun maximum werden gedwongen d.m.v. een cellulaire stressor. Een daaropvolgende studie bekeek de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten in PBMCs en skeletspier-cellen, en vond dat deze allemaal normaal waren [Tomas C, Brown AE et al. Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types. Peer J. (2019) 7: e6500].

Brown AE et al. gebruikten skeletspier-cellen afgeleid van biopten bij CVS-patiënten en voor leeftijd/geslacht gematchte gezonde controles om te tonen dat – anders dan in cellen van gezonde controles – CVS-cellen de energie-sensor AMP-geaktiveerde proteïne-kinase (AMPK) niet aktiveren in respons op in vitro ‘inspanning’ [Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Een ‘follow-up’ studie toonde echter dat farmacologische aktivatie van AMPK succesvol was bij CVS-cellen, wat leidde tot de suggestie dat het onvermogen om AMPK te aktiveren bij vitro inspanning wordt veroorzaakt door een defekt proximaal aan AMPK [Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with ME/CFS. Biosci. Rep. (2018) 38]. De studie toonde ook dat CVS-cellen significant lage ATP-waarden levels hebben dan gezonde controles, zelfs wanneer AMPK farmacologisch werd geaktiveerd.

De twee belangrijkste mechanismen voor cellulaire energie-produktie zijn OXPHOS en glycolyse. Deze kunnen simultaan worden onderzocht gebruikmakend van de Seahorse extracellulaire flux analyser. Er werd eerder aangetoond dat CVS-PBMCs een verstoorde OXPHOS vertonen in respons op glucose. Via deze werd in deze studie het vermogen onderzocht van CVS skeletspier-cellen en deze van voor leeftijd/geslacht gematchte gezonde controles, om verschillende brandstoffen te gebruiken voor cellulaire energie-produktie. Het gebruik van glucose, galactose en vetzuren werden allemaal onderzocht. Deze studie is de eerste om CVS skeletspier-cellen aan te wenden om te kijken naar de cellulaire bio-energetische funktie in complete cellen.

Resultaten

Karakteristieken van de deelnemers

Bij afname van de spier-biopten werden de vermoeidheid impact schaal (FIS) afgenomen en de BMI geregistreerd voor alle CVS-patiënten. Ook leeftijd en geslacht werden voor elke deelnemer genoteerd. [CVS: 8 vrouwen/ 1 man; leeftijd 47 ± 0,96; FIS (zie Methodes) 101 ± 22,3; BMI 27 ± 2,3].

Glycolyse

De glycolyse werd beoordeeld d.m.v. extracellulaire flux analyse om metingen van glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve voor skeletspier-cellen van CVS en gezonde controles te bekomen. De resultaten tonen dat er geen significante verschillen zijn qua gebruik van het glycolyse-pad tussen onbehandelde CVS en controle spiercellen (p ≥ 0.372). De cellen werden ook behandeld met ‘compound 991’ (een directe AMPK-aktivator) of metformine (een indirecte AMPK-aktivator) om dan de glycolyse te meten. Glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve bleken vergelijkbaar zelfs na behandeling met ‘compound 991’ (p ≥ 0.129) of metformine (p ≥ 0.136). Metformine verhoogde de glycolyse en de glycolytische capaciteit bij beide groepen t.o.v. onbehandelde cellen (p ≤ 0.008). Behandeling met zowel metformine als ‘compound 991’ toonde een trend naar een relatieve toename van de glycolytische parameters voor beide groepen, dit was echter enkel statistisch significant voor glycolyse en glycolytische capaciteit van de gezonde controles (p ≤ 0.036).

OXPHOS

Glucose. Gebruikmakend van glucose als substraat werd de OXPHOS gemeten in onbehandelde, met ‘compound 991’ behandelde en metformine-behandelde skeletspier-cellen van CVS en gezonde controles. Onbehandelde CVS-cellen vertoonden een significante reductie van het OXPHOS-niveau bij ‘baseline’ (p = 0.001) en bij maximale stimulatie (p = 0.002) om zuurstof te consumeren met glucose als substraat. Wanneer de cellen werden behandeld met metformine vertoonden spiercellen van zowel gezonde controles als CVS een daling qua OXPHOS-parameters, zoals wordt verwacht bij inhibitie van complex-I [deel van de elektronen-transport-keten, NADH coenzyme-Q oxidoreductase]. Met ‘compound 991’ bleek in de CVS-groep nog significant lagere waarden qua basale respiratie (p < 0.001) en maximale respiratie te vertonen (p = 0.002) t.o.v. cellen van gezonde controles. Behandeling met metformine toonde dat de CVS-groep lagere waarden qua basale respiratie (p = 0.058) en maximale respiratie (p = 0.074) had maar deze resultaten waren niet statistisch significant. Er waren geen verschillen tussen CVS en gezonde controles qua ATP-produktie. De behandeling van de cellen met de directe AMPK-aktivator ‘compound 991’ verhoogde de basale respiratie van CVS spiercellen tot waarden vergelijkbaar met die van onbehandelde controles. Dit toont dat ‘compound 991’ het vermogen heeft om de OXPHOS-funktie te normaliseren in geïsoleerde spiercellen. Cellen van CVS-patiënten waren ook vergelijkbaar met die van gezonde controles wat betreft van ATP-produktie en maximale respiratie bij behandeling met ‘compound 991’. Metformine veroorzaakt een vergelijkbare relatieve daling qua basale respiratie tussen de controle- en CVS-groepen. Evenzo veroorzaakte ‘compound 991’ vergelijkbare percentage toenames in de twee groepen wat betreft basale respiratie; wat toont dat beide groepen op dezelfde manier worden beïnvloed door de twee molekulen.

Galactose. Het effekt van het gebruik van galactose als substraat voor de skeletspier-cellen werd ook onderzocht. Cellen van CVS en gezonde controles werdengedurende 24 h behandeld met 10 mM galactose vóór OXPHOS werd gemeten. Galactose dwingt cellen OXPHOS in grotere mate te gebruiken dan glucose, aangezien het gebruik van galactose niet resulteert in een netto-winst van ATP via de glycolyse en zodoende de cellen dwingt om de mitochondriale respiratie aan te wenden om ATP te produceren. Wanneer galactose wordt gebruikt als substraat vertoonden CVS skeletspier-cellen normale waarden qua basale respiratie en ATP-produktie (p ≥ 0.180). Dit toont aan dat OXPHOS normaal kan funktioneren in deze cellen maar het is afhankelijk van het substraat. CVS skeletspier-cellen geïncubeerd in galactose vertoonden hogere waarden qua maximale respiratie dan cellen van gezonde controles (p = 0.019). Deze toename geeft aan dat onder cellulaire energetische belasting cellen van een subgroep CVS-patiënten in staat zijn hun respiratoire capaciteit te verhogen afhankelijk van het beschikbaar substraat.

Vetzuur-oxidatie. Het vermogen van skeletspier-cellen om vetzuren aan te wenden als brandstof werd ook onderzocht. Beta-oxidatie van vetzuren vereist het glycolyse-mechanisme niet aangezien het aangemaakte acetyl-CoA direct de TCA-cyclus binnenkomt. Aangezien we hebben getoond dat OXPHOS dysfunktioneel is in CVS skeletspier-cellen, wilden we de mogelijke mechanismen die bij deze dysfunktie mogelijk betrokken zijn verminderen. Aangezien het via de vetzuur-oxidatie geproduceerde acetyl-coA direct de TCA-cyclus binnentreedt, laat dit experiment ons toe om te bekijken of de TCA-cyclus, en de ‘downstream’ processen, normaal funktioneren. We berekenden basale en maximale mitochondriale respiratie voor zowel endogene als exogene vetzuren. Daaruit bleek dat er geen significante verschillen zijn tussen de vetzuur-oxidatie in skeletspier-cellen van controles en CVS (p ≥ 0.142).

ROS

De aanmaak van ROS kan de cellulaire zuurstof-consumptie significant wijzigen. Zuurstof-consumptie is de meting die wordt gebruikt om OXPHOS te berekenen bij extracellulaire flux analyse. Om te tonen dat de resultaten van de OXPHOS-experimenten te wijten zijn aan mitochondriale respiratie i.p.v. ROS-produktie maten we daarom ROS gebruikmakend van de ROS-detektor DCFDA. De aanmaak van ROS werd gemeten in aanwezigheid van glucose, galactose en palmitaat/BSA [het vetzuur palmitinezuur geconjugeerd met BSA (runder serum-albumine), substraat bij de meting van gebruik van exogene vetzuren; BSA alleen voor het gebruik van endogene vetzuren]. Voor alle drie de substraten toonden we dat er geen significante verschillen waren tussen de aanmaak van ROS door skeletspier-cellen van CVS en die van gezonde controles (p ≥ 0.390).

Aangezien er geen verschil qua ROS-produktie was tussen de twee groepen, impliceert dit dat de zuurstof-consumptie gemeten via de Seahorse niet te wijten is aan verschillen in ROS-aanmaak en daarom waarschijnlijk enkel te wijten is aan de mitochondriale respiratie.

Bespreking

Deze studie heeft getoond dat het vermogen van CVS skeletspier-cellen om glucose als substraat te gebruiken, verminderd is, vergeleken met cellen van gezonde controles. CVS skeletspier-cellen bleken echter galactose en vetzuren normaal te verbranden alsook werd een normale glycolytische funktie getoond. De studie geeft aan dat de cellulaire bio-energetische dysfunktie bij CVS ‘upstream’ van de TCA-cyclus ligt. We hebben een normaal funktionerend glycolyse-mechanisme getoond gelijkaardig als bij eerdere observaties in PBMCs [zie Tomas C et al. (2017) hierboven]. Dit toont een gemeenschappelijke factor tussen de twee celtypes van individuen met CVS.

Dit werk heeft getoond dat CVS skeletspier-cellen gedaalde OXPHOS hebben vergeleken met cellen van gezonde controles wanneer glucose het substraat is. Dit is ook gelijkaardig met wat eerder werd getoond in PBMCs [zie Tomas C et al. (2017) hierboven]. Bij het gebruik van glucose als cellulair substraat behandelden we skeletspier-cellen met twee AMPK-aktivators – ‘compound 991’ & metformine. ‘Compound 991’ (dat nog moet worden getest in klinische proeven bij mensen) is een directe AMPK-aktivator [zie Brown AE et al. (2018) hierboven]. Behandeling met ‘compound 991’ lijkt de OXPHOS-waarden van cellen van CVS-patiënten naar het zelfde niveau te brengen als onbehandelde controle-cellen. Het is onduidelijk of dit effekt zich zou uitbreiden tot cellen die zich in vitro inspannen d.m.v. elektrische puls stimulatie (EPS) aangezien er momenteel geen manier bestaat om EPS toe te passen binnen Seahorse-experimenten.

Bij het vergelijken van metformine-behandelde met onbehandelde cellen toonden de resultaten dat CVS skeletspier-cellen in staat waren zich aan te passen aan de lagere energie-produktie door de mitochondrieën via het verhogen van de glycolytische funktie. Dit patroon wordt ook gezien in cellen van gezonde controles. De resultaten in CVS-cellen tonen dat de cellen het vermogen hebben om hun glycolytische funktie te verhogen in respons op verminderde mitochondriale funktie; het is echter niet duidelijk waarom de cellen niet in staat zijn dit te doen wanneer de mitochondriale funktie op een natuurlijke manier lager is i.p.v. dat de gereduceerde OXPHOS wordt veroorzaakt door een farmacologische interventie. Het kan zijn dat metformine-behandeling OXPHOS doet dalen naar een drempel die laag genoeg is om de cellulaire respons van verhoogde glycolytische funktie to triggeren ter compensatie. Het vermogen van de CVS-cellen om glycolytische funktie te doen stijgen in respons op metformine-behandeling impliceert dat AMPK werkt zoals verwacht in rust bij CVS. Ook al kan metformine-behandeling de glycolytische funktie doen stijgen in zowel controle- als CVS-groepen, lijkt de relatieve toename lager bij de CVS-groep hoewel het verschil niet statistisch significant is. Dit suggereert nog steeds een probleem met het aanpassend vermogen van de cellen of hun onvermogen om even snel te adapteren aan veranderingen van beschikbaarheid van voedingstoffen en energie-produktie.

Oxidatie van galactose levert geen netto toename van ATP via het glycolyse-pas, het is enkel wanneer het substraat door de mitochondrieën wordt aangewend tijdens OXPHOS dat ATP wordt geproduceerd. Dit dwingt de cellen om enkel OXPHOS te gebruiken voor ATP-aanmaak i.p.v. ook te betrouwen op het glycolyse-mechansime. Normale basale OXPHOS-waarden bij gebruik van galactose als substraat duidt op normaal funktioneren van de processesn ‘downstream’ van glycolyse, zoals de TCA-cyclus en werking van mitochondriale respiratoire complexen. Deze research ondersteunt eerder gepubliceerde gegevens die normale funktie van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten tonen en werk dat geen bewezen pathogene mitochondriale DNA-variaties vond bij CVS, en impliceert dat enig defekt ‘upstream’ van de of mitochondriale respiratoire complexen zelf ligt [zie Tomas C et al. (2019) hierboven & De Venter M, Newton J et al. MtDNA population variation in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome in two populations: a study of mildly deleterious variants. Sci. Rep. (2019) 9: 2914]. Het vermogen van sommige van de cellen van CVS-patiënten om maximale respiratie te doen stijgen boven die van gezonde controles wanneer galactose als substraat wordt gebruikt, toont een stratificatie-effekt in de patiënten-populatie. Dit kan er op wijzen dat sommige patiënten beter in staat zijn dan anderen om zich aan te passen aan veranderende substraat-beschikbaarheid. Er dient echter te worden opgemerkt dat er bij de galactose-experimenten geen exogeen glucose in het celmedium werd aangeboden. Dit zou de UDP-glucose substraat-voorraad (die vereist is voor de galactose-uridyl-transferase reaktie en de omzetting van galactose) kunnen hebben beperkt. Er kunnen verschillende resultaten worden gezien bij toevoeging van exogeen glucose aan het celmedium.

De vetzuur-oxidatie was ook normaal in de CVS skeletspier-cellen, wat opnieuw impliceert dat een defekt ‘upstream’ van de TCA-cyclus ligt, aangezien beta-oxidatie acetyl-CoA oplevert die rechtstreeks de TCA-cyclys kan binnentreden. De normale basale funktie van CVS skeletspier-cellen bij gebruik van galactose of vetzuren als substraten, gekoppeld met normale glycolytische funktie kan er op wijzen dat het probleem bij de verbindingsstap tussen pyruvaat en de TCA-cyclus ligt. Dit omvat mogelijks defekten van het pyruvaat-dehydrogenase-complex (PDH), pyruvaat-dehydrogenase-kinase (PDK) of mitochondriale proteïne-carriers. Dit past bij een studie waarbij een PDK-inhibitor werd gebruikt in een open-label ‘proof-of-principle’ proef en een studie door by Fluge et al. waar werd gekeken naar PDH-ontregeling in CVS-bloedstalen [zie Fluge Ø et al. hierboven & Comhaire F. Treating patients suffering from Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) with sodium dichloroacetate: an open-label, proof-of-principle pilot trial. Med. Hypotheses (2018) 114: 45-48]. De in vitro studie door Fluge Ø et al. gebruikte aminozuur- en mRNA-analyse, en suggereerde dat mitochondriale pyruvaat-oxidatie abnormaal kan zijn bij CVS. Het gebruik van galactose als cellulair substraat toont een stijging qua maximale respiratie en reserve-capaciteit bij CVS skeletspier-cellen vergeleken met gezonde controles. Deze toename werd ook gezien door Fluge Ø et al. wanneer controle-spiercellen werden behandeld met serum van CVS-patiënten. Ze postuleerden dat het kon liggen aan een PDH-deficiëntie.

Een studie door die keek naar het brandstof-gebruik van menselijke spieren, heeft getoond dat in rust de oxidatie van vetzuren 56% van de energie levert en koolhydraten 44%. Dit verandert lichtjes naar 55% en 46% respectievelijk bij 40% van de maximale belasting voor elk individu. Bij inspanning aan hogere intensiteit (75% van de maximale belasting) schakelt de verhouding weer om naar 24% van de geleverde energie voor vetzuur-oxidatie en 76% voor verbranding van koolhydraten. De neiging van spieren om koolhydraten in grotere mate aan te wenden tijdens inspanning gekoppeld aan het onvermogen van cellen van CVS-patiënten om glucose-oxidatie in dezelfde mate te gebruiken als gezonde controles kan, minstens gedeeltelijk, verklaren waarom CVS-patiënten lijden aan post-exertionele malaise.

De experimenten in deze studie werden ontworpen om de oxidatie en het gebruik van één per één individuele substraten te onderzoeken. Dit weerspiegelt echter niet volledig hoe de substraten in realiteit aanwezig zijn patiënten. Bv.: gezien de tekorten betreffende het vermogen van CVS-cellen om glucose als substraat aan te wenden, zouden we verwachten een verschuiving naar beta-oxidatie van vetzuren te zien om voor de deficiënties te compenseren. Deze experimenten tonen echter dat dit niet lijkt te gebeuren. Het zou kunnen zijn dat de gebreken qua CVS mitochondriale funktie te wijten zijn aan een onvermogen om te wisselen tussen substraat-oxidatie op een even doeltreffende als snelle manier als in cellen van gezonde controles.

Deze studie suggereert dat AMPK normaal funktioneert in rust aangezien de cellen in staat zijn de OXPHOS van controles te evenaren wanneer ze galactose als brandstof krijgen. Daarnaast zijn CVS skeletspier-cellen in staat zich aan te passen aan inhibitie van mitochondriaal complex-I door metformine via het overéénkomstig verhogen van de glycolyse. Dit is niet in contradictie met het werk gepubliceerd door Brown AE et al. waar werd getoond dat inspanning skeletspier-AMPK niet op gepaste manier kan aktiveren [zie Brown AE et al. (2015) hierboven]. Dit werk wijst er eerder op dat er twee afzonderlijke kwesties kunnen spelen bij de energie-produktie processen in cellen van CVS-patiënten – de aktivatie van AMPK in respons op inspanning en het vermogen van cellen om OXPHOS aan te wenden in respons op glucose als substraat in rust. Zelfs bij matig intensieve inspanning, neemt glucose ca. 50% van de gebruikte brandstof voor z’n rekening voor ATP-produktie. Dit, samen met het onvermogen van AMPK om geaktiveerd te worden bij inspanning, kan de reden zijn waarom patiënten niet in staat zijn zich op gepaste manier in te spannen – aangezien ze niet in staat zijn naar behoren energie te produceren uit glucose en AMPK de cellen niet vertelt dat er niet genoeg energie is. Deze twee factoren zullen zorgen dat spiercellen van patiënten moeten afrekenen met een depletie van ATP tijdens inspanning.

Deze studie, die gebruik maakte van skeletspier-cellen en ook verder bouwt op werk van onze groep, heeft eerder gekeken naar de cellulaire bio-energetische funktie bij CVS in PBMCs [zie Tomas C et al. (2017) hierboven]. Er zijn veel gelijkenissen tussen de twee celtypes wat betreft de manier waarop patiënten-cellen bio-energetische mechanismen aanwenden. Beide celtypes vertoonden een vergelijkbare mate van glycolyse (als we de CVS-groep als een geheel bekeken). Daarnaast hadden zowel PBMCs als skeletspier-cellen van CVS-patiënten een significant lagere mitochondriale funktie bij het gebruiken van glucose als brandstof. Er werd ook lagere ATP-produktie door mitochondrieën gezien in beide celtypes [zie Tomas C et al. (2017) & Brown AE et al. (2018) hierboven]. De gelijkaardige dysfunktie qua bio-energetische funktie voor de twee celtypes geeft aan dat CVS een multi-systeem ziekte is. Dit komt overéén met de ervaringen van patiënten met de ziekte. De PBMCs die eerder werden geanalyseerd en de skeletspier-cellen die in deze experimenten werden gebruikt, kwamen niet van dezelfde patiënten of controles. Bij het verder gaan, zal het nuttig zijn bloedstalen en spier-biopten van deelnemers af te nemen op dezelfde dag om te kijken naar de correlaties tussen PBMC en skeletspier-cel bio-energetica bij individuele patiënten. Bijkomend moeten er ook worden gekeken naar stalen die longitudinaal worden genomen.

Dit is de eerste studie waarbij cellen worden gebruikt die zijn afgeleid van skeletspier-biopten van CVS-patiënten en gezonde controles om te kijken naar de cellulaire bio-energetische funktie in complete cellen. Het gebruiken van skeletspier-cellen van patiënten is cruciaal voor de progressie van ons begrip omtrent hoe de ziekte patiënten beïnvloedt, gezien het feit dat velen lijden onder spierpijn en vermoeidheid als kern-component van hun ziekte. Dit werk illustreert het belang van skeletspier-cellen gecultiveerd uit biopten als een belangrijke toevlucht voor het onthullen van de biochemische oorzaken van de ziekte.

Besluit

CVS skeletspier-cellen vertonen een gelijkaardige dysfunktie wat betreft mitochondriale respiratie als PBMCs. Het onvermogen van CVS-cellen om glucose in dezelfde mate als brandstof te gebruiken te gebruiken als gezonde controles resulteert in verminderde mitochondriale respiratie, zowel basaal als maximaal. Het onvermogen van CVS skeletspier-cellen om galactose en vetzuren in dezelfde mate aan te wenden als gezonde controles suggereert dat de dysfunktie in de verbindingsstap tussen glycolyse en de TCA-cyclus ligt. De gelijkenissen tussen de dysfunktie die eerder werd gezien in PBMCs en deze hier beschreven in spiercellen suggereert dat CVS is een ziekte is die meerdere weefsels treft, wat weerspiegelt wat patiënten rapporteren en de symptomen die ze hebben.

Methodes

Studie-individuen

Er werden spier-biopten genomen uit de vastus lateralis [spier aan de voorzijde van het dijbeen] van 9 CVS-patiënten en 11 voor leeftijd/geslacht gematchte controles. Op de dag van de bioptie vulden de CVS-patiënten een vermoeidheid impact schaal (FIS) vragenlijst in opdat hun funktionele beperkingen omwille van vermoeidheid konden worden gemeten [≥ 40 = overmatige vermoeidheid; ≥ 80 ernstige vermoeidheid]. Leeftijd, geslacht en ‘body-mass-index’ (BMI) van de patiënten werden ook geregistreerd. […] Alle CVS-patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria. […]

Reagentia

[…]

Cel-cultuur

Uit de spierbiopten werden spier-voorlopercellen geïsoleerd. Myoblasten [voorlopers van spiercellen] werden gecultiveerd […] en differentiatie naar myotubes [zich ontwikkelende skeletspier-vezels] geïnduceerd. […]

Extracellulaire flux analyse

Beoordeling van glycolyse en OXPHOS d.m.v. XFe96 (Agilent Technologies) [zie Tomas C et al. (2017)] […].

[…]

Detektie van reaktieve zuurstof soorten

Reaktieve zuurstof soorten (ROS) werden gemeten d.m.v. 2’,7’-dichlorofluoresceïne-diacetaat (DCFDA [fluoroscerende kleurstof die de cel binnen kan]). […]

Normalisatie naar proteïne-concentratie

[…]

Statistische analyse

[…]

Beschikbaarheid van gegevens

[…]

Proteoom-analyse van M.E.(cvs) PMBCs onthult mitochondriale dysfunktie

‘Sequential Windows Acquisition of all THeoretical fragment ion-spectra’ (SWATH) massa-spectrometrie is techniek voor studie van proteomica (proteoom = de verzameling van alle proteïnen van een organisme of een cel) gebaseerd op ‘Data-Independent Acquisition’ (DIA) massa-spectrometrie (MS). Daarbij wordt MS/MS simultaan op alle peptiden uitgevoerd in een vooraf gedefinieerd massa-spectrum. Om elk peptide te identificeren in de ingewikkelde MS/MS-spectra wordt vooraf een uitgebreide referentie spectrum-bibliotheek afgeleid van een gelijkaardig staal.

Het is een nieuwe technologie maar het betreft een kleine studie (11 M.E.(cvs-)-patiënten met een diagnose volgens de Canadese Consensus Criteria). Het beperkte aantal komt wellicht omdat het een dure techniek is. Er werd een totaal van 2.970 proteïnen gekwantificeerd. 60 proteïnen bleken verschillende relatieve hoeveelheden (t.o.v. 9 gematchte controles te vertonen: 38 verhoogd (funkties bij methylatie van histonen & DNA-schade/ door telomeer-stress (telomeren = repetitieve sequenties die de uiteinden van chromosomen beschermen en de integriteit van het genoom helpen bewaren) geïnduceerde senescentie (veroudering), proteasoom-assemblage, NAD, NAD(P)-binding en transport van mitochondriale molekulen) en 22 verlaagd (wond-heling, aktivatie & adhesie van bloedplaatjes, bloedstolling en zuurstof-transport).

Aangezien het een verkennende studie betrof en omdat het waarschijnlijk was dat er subgroepen zouden zijn werd een ‘principal component analysis’ (PCA; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten) uitgevoerd. Hieruit kwam een subgroepering van studie-stalen met gelijkaardige proteoom expressie-patronen naar voor: een subgroep met 9 patiënten (de ‘ME/CVS’ subgroep) en een tweede met de 9 controles & 2 patiënten. Leeftijd, geslacht of BMI kon deze ‘clusters’ niet verklaren; misschien hadden ze een verschillende ziekte-ernst… De 9 patiënten die zich onderscheidden van de controles werden dan afzonderlijk vergeleken met de controles.

De resultaten worden hieronder besproken. Personen die Engels begrijpen kunnen een presentatie door dr. Eiren Sweetman uit oktober 2019 (relevant stuk start 06:22) beluisteren die dit alles kadert.

Het belang is dat de bevindingen (over mitochondriale dysfunktie) van deze Nieuw-Zeelandse onderzoekers aansluiten bij die van andere studies (door het Australische team van Paul Fisher & de Britse groep rond Julia Newton: zie bv. ‘Complex-V inefficiëntie & ontregelde mitochondriale funktie bij M.E.(cvs)’, ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS’ & ‘Het effekt van de ernst van M.E.(cvs) op de cellulaire bioenergetische funktie’).

Zoek op deze pagina’s ook meer info over mitochondria.

————————-

Journal of Translational Medicine (Pre-print August 2020)

A SWATH-MS analysis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome peripheral blood mononuclear cell proteomes reveals mitochondrial dysfunction

Eiren Sweetman (1), Torsten Kleffmann (2), Christina Edgar (2), Michel de Lange (3), Rosamund Vallings (4), Warren Tate (2)

1 University of Otago, New Zealand

2 Department of Biochemistry, University of Otago, New Zealand

3 Centre for Biostatistics, University of Otago, New Zealand

4 Howick Health and Medical Centre, New Zealand

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ernstige en complexe lichamelijke ziekte die alle lichaam-systemen aantast met een veelheid aan symptomen, maar de hoofdkenmerken van de ziekte zijn aanhoudende vermoeidheid en ‘post-exertionele malaise’, verslechtering door fysieke en/of mentale aktiviteit van de vermoeidheid en andere symptomen die sterk invaliderend kunnen zijn en dagen tot maanden lang kunnen duren. Hoewel de ziekte sterk kan variëren tussen individuen, omvatten de gemeenschappelijke symptomen ook pijn, cognitieve gebreken, slaap-dysfunktie, alsook immune, neurologische en autonome symptomen. Het is een sterk sociaal-isolerende ziekte, die een stigma draagt omwille van het niet begrijpen van de oorzaak en pathofysiologie.

Methodes Om inzicht te verwerven in de pathofysiologie van M.E./CVS, onderzochten we de proteomen van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) d.m.v. SWATH-MS analyse bij een kleine goed-gekarakteriseerde groep patiënten en gematchte controles. Er werd een ‘principal component’ analyse (PCA [zie onze inleiding] aangewend om groepen to stratificeren op basis van patronen van proteïnen-hoeveelheid, die de meerderheid van de M.E./CVS-patiënten (9/11) duidelijk onderscheidden van de controles. Deze meerderheid-subgroep M.E./CVS-patiënten werd dan verder vergeleken met de controle-groep.

Resultaten Er bleken in het totaal 60 proteïnen van de M.E./CVS-patiënten differentieel tot expressie te komen (P < 0.01, log₁₀ [mate van verandering t.o.v. controles] > 0.2 & < -0.2). Vergelijking van de via PCA geselekteerde subgroep M.E./CVS-patiënten (9/11) met controles deed het aantal proteïnen met differentiële expressie stijgen tot 99. Van bijzonder belang voor de kern-symptomen van vermoeidheid en post-exertionele malaise die wordt ervaren bij M.E./CVS: een deel van de geïdentificeerde proteïnen bij M.E./CVS bleken betrokken bij mitochondriale funktie, oxidatieve fosforylatie, complexen van de elektronen-transport-keten en redox-regulering. Een significant aantal was ook betrokken bij eerder geïmpliceerde stoornissen bij M.E./CVS, zoals de immune inflammatoire respons, DNA-methylatie, apoptose en proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] -aktivatie.

Besluiten De resultaten van deze studie ondersteunen een model van deficiënte ATP-produktie bij M.E./CVS, die wordt gecompenseerd door upregulering van mechanismen ‘upstream’ van (vóór) Complex-V, dat een stijging van oxidatieve stress suggereert. Deze studie en anderen vonden bewijs voor een uitgesproken pathologie bij M.E./CVS, die beloftevol is voor het ontwikkelen van diagnostische biomerkers.

1. Achtergrond

[…]. M.E./CVS is een complexe ziekte waarbij een diepgaande ontregeling van het centraal zenuwstelsel (CZS) en het immuunsysteem, dysfunktie van het cellulair energie metabolisme en ionen-transport, alsook cardiovasculaire abnormaliteiten zijn betrokken. De kans op volledig herstel is miniem: slechts 6% van de patiënten meldde een terugkeer naar hun eerdere welzijn-toestand. Griep-achtige en respiratoire symptomen zijn courant, en voor een grote subgroep patiënten gebeurt de aanvang van de ziekte plots en wordt voorafgegaan door een acute virus-achtige infekteuze periode. Bij veel patiënten is dit gelinkt met een Epstein-Barr infektie en klierkoorts. Er wordt gespeculeerd dat de huidige covid-19 pandemie een significante toename van de incidentie van M.E./CVS kan meebrengen, zoals werd gerapporteerd na de oorspronkelijke SARS-epidemie. Er werd reeds een hoog mate van post-virale vermoeidheid gerapporteerd en bij sommige patiënten zal dit zich waarschijnlijk ontwikkelen tot M.E./CVS.

Er wordt ook graduele aanvang van M.E./CVS gerapporteerd, waarbij het ‘symptomen-complex’ zich ontwikkelt over een periode van meerdere weken of maanden. Niettemin beschrijven de huidige diagnostische criteria M.E./CVS als invaliderende lichamelijke en mentale vermoeidheid, gewoonlijk met acute aanvang, die significant wordt verergerd door inspanning en aktiviteit, en door mentale of emotionele inspanning. Een formele medische diagnose kan enkel worden gegeven na een proces van uitsluiting van andere goed-gekende vermoeidheid-ziekten, en er is een waaier aan zelf-gerapporteerde symptomen die passen binnen één van de meerdere beschikbare, breed-gedefinieerde klinische criteria voor M.E./CVS. Er zijn tot op heden geen diagnostische merkers of definitieve klinische testen, het oorzakelijk mechanisme wordt niet goed begrepen en de resulterende ziekte-pathofysiologie is nog steeds niet goed gedefinieerd. Immuun-dysfunktie, chronische virale infektie, en metabole en mitochondriale ontregeling bleken allemaal betrokken als mogelijke onderliggende gevolgen van M.E./CVS die de ziekte ondersteunen. We hebben ook voorgesteld dat chronische neuro-inflammatie, waarbij de paraventriculaire kern van de hypothalamus is betrokken, een cruciale factor kan zijn bij het onderhouden van M.E./CVS [Mackay A, Tate WP. A compromised paraventricular nucleus within a dysfunctional hypothalamus: A novel neuroinflammatory paradigm for ME/CFS. Int J Immunopathol Pharmacol. (2018) 32: 1-8]. M.E./CVS-research verschoof z’n focus van het proberen een universeel ‘oorzakelijk agens’ voor de ziekte te identificeren, naar het nagaan van de belangrijkste aangetaste fysiologische en biologische mechanismen achter het M.E./CVS symptomen-complex. ‘High-throughput’ molekulaire analyses, inclusief cytokine-produktie, metabolomica, het microbioom, epigenetica, transcriptoom- en proteoom-onderzoeken, hebben substantieel bewijsmateriaal geleverd voor immune/inflammatie betrokkenheid en, betekenisvol, suggereren dat er gebreken zijn qua energie-metabolisme en mitochondriale funktie bij M.E./CVS. Hoewel er inconsistenties bestaan wat betreft het bewijs voor mitochondriale dysfunktie, komen er steeds meer research-artikels ter ondersteuning van deze hypothese. Eerdere studies van ons laboratorium hebben een kleine groep zorgvuldig gediagnostiseerde M.E./CVS-patiënten (de Dunedin groep) gebruikt en uitgebreide molekulaire studies uitgevoerd die de principes van de precisie-geneeskunde aanwenden met strikte statistische begrenzingen. We hebben zeer significante verschillen tussen de patiënten en de controle-groep geïdentificeerd [Sweetman EC, Vallings R, Tate WP et al. Current research provides insight into the biological basis and diagnostic potential for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Diagnostics (2019) 9: 73-96 /// Sweetman EC, Vallings R, Tate WP et al. Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2019) 33: 1-8].

De huidige research heeft deze analyses uitgebreid door het onderzoeken van tot expressie komende proteïnen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van de Dunedin groep, vergeleken met voor leeftijd en geslachte gematchte controle-individuen. Voor de eerste keer werd de uitgebreide gegevens-onafhankelijke methode SWATH-MS [zie onze inleiding] aangewend om aangetaste biologische mechanismen te identificeren. Vloeistof-chromatografie gekoppeld met tandem massa-spectrometrie (LC-MS/MS) heeft zich ontwikkeld tot dé technologie voor ‘high-throughput’ karakterisatie van proteïnen en proteomen, bijzonderlijk in de initiële ontdekking fase. SWATH-MS is een LC-MS/MS strategie [scheiding van de molekulen via vloeistof-chromatografie & massa-spectrometrie] die systematische, onbevooroordeelde detektie en kwantificering toelaat van detekteerbare molekulen in een staal. Individuele proteïnen, of hun expressie-patronen of ‘biosignaturen’, zouden waardevolle biomerkers kunnen blijken voor een diagnostische test voor M.E./CVS en ook doeltreffend kunnen zijn wat betreft het meten van de ziekte-ernst, dynamische variaties qua symptomatologie, en longitudinale veranderingen om herval- en herstel-fases van de ziekte te beoordelen, of andere belangrijke factoren zoals behandelingen. Gezien er momenteel, in sommige landen en onder gezondheidwerkers, nog steeds controverse bestaat omtrent het feit of M.E./CVS een rechtmatige medische aandoening is, kunnen proteoom-, transcriptoom en metaboloom-profielen waardevol initieel objectief bewijsmateriaal leveren voor de legitimiteit van M.E./CVS als een afzonderlijke ziekte.

Deze ‘ontdekking’-studie werd ontworpen om een breed net uit te werpen om de identificatie van proteïnen in de stalen tot het uiterste te vergroten. […] De hier gepresenteerde proteoom-analyse levert, naast het verder vastleggen van de verstoorde regulering van immune en inflammatoire biologische mechanismen bij M.E./CVS, ook bewijsmateriaal omtrent histoon-methylatie [histoon-proteïnen = kleine eiwitten met een hoog aantal positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA binden] en proteasoom-aktivatie. Het meest betekenisvol waren echter een groot aantal mitochondriale proteïnen die een verhoogde expressie vertoonden, bijzonderlijk deze betrokken bij de complexen van de elektronen-transport-keten, specifiek Complex-I (NADH coenzyme-Q oxidoreductase), oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) (complex-V), de oxidatieve stress respons en de TCA-cyclus. Deze wijzigingen betreffende sleutel-proteïnen betrokken bij de complexen van energie-produktie en regulering van reaktieve zuurstof soorten (ROS) vormen de belangrijkste focus van dit artikel, als nieuw en betekenisvol resultaat van de analyse. De resultaten suggereren dat er een deficiëntie bestaat qua ATP-produktie en mitochondriale funktie, wat gecompenseerd wordt door gestegen expressie van proteïnen betrokken bij de belangrijkste ATP-genererende mechanismen. Het is een aanvulling op een uitgebreide studie die ook verhoogde expressie van de OXPHOS-proteïnen vond, gekoppeld met deficiënte ATP-produktie door Complex-V (ATP-synthase); leidend to hun hypothese dat M.E./CVS-patiënten een gebrek qua reserve respiratoire capaciteit vertonen bij fysieke of andere stress [Missailidis D, Fisher PR et al. An isolated complex V ineffciency and dysregulated mitochondrial function in immortalized lymphocytes from ME/CFS patients. Int J Mol Sci. (2020) 21: 1074].

[…]

4. Bespreking

4.1. Bewijs voor mitochondriale dysfunktie in deze studie

Het meest opvallende resultaat van deze proteoom-analyse was het aantal verschillende mitochondriaal-gerelateerde proteïnen die in expressie zijn toegenomen in de M.E./CVS-groep t.o.v. controles, bijzonderlijk na PCA-groepering en analyse [van funktionele associaties en potentiële interakties]. Meerdere van deze mitochondriale proteïnen waren ook verhoogd wanneer de volledige set van elf M.E./CVS-deelnemers werd vergeleken met de gematchte controle-individuen. Deze omvatten D-beta-hydroxybutyraat-dehydrogenase (BDH1) en acetyl-CoA-acetyltransferase 2 (ACAT2), [enzymen] die beide rollen spelen bij het vetzuren-metabolisme, en de synthese en afbraak van of keton-lichamen. Mitochondriaal 2-oxoglutaraat/malaat ‘carrier’ proteïne isoform-2 (SLC25A11) heeft meerdere rollen en is betrokken bij (i) transport van 2-oxoglutaraat door het binnenste mitochondriaal membraan en speelt een rol bij gluconeogenese uit lactaat, (ii) het behouden van mitochondriale fusie en splitsing, & (iii) de organisatie en morfologie van de mitochondriale cristae [instulpingen van het binnenste membraan in een mitochondrium] en fosfaat-‘carrier’ proteïne, mitochondriale isoform-b (SLC25A3) dat fosfaat transporteert in de mitochondrieën voor oxidatieve fosforylatie. FUN14-domein-bevattend 2 (FUNDC2) in het buitenste mitochondriaal membraan en thioredoxine-reductase 2 (TXNRD2), betrokken bij mitochondriale redox homeostase werden ook geïdentificeerd. Tesamen suggereren deze veranderingen dat mitochondriale aktiviteit gestegen kan zijn, misschien tot het punt waar schadelijke waarden qua reaktieve zuurstof soorten (ROS) worden bereikt en aanhouden in de M.E./CVS-groep.

De interessante funktionele rollen van deze proteïnen worden duidelijker met de uitgbreide proteïnen-gegevensset die naar boven komt uit de vergelijking van de subgroep of M.E./CVS-individuen vs. de controle-individuen op basis van het clusteren in de PCA analyse waar de studie-individuen zich afsplitsten op basis van de proteoom-gegevens i.p.v. alleen maar op het feit dat ze als M.E./CVS of controle werden benoemd. De M.E./CVS-individuen die duidelijk verschillen van hun gematchte controles vertoonden een verhoogd aantal mitochondriale proteïnen met gewijzigde relatieve hoeveelheden. Complex-I proteïnen, TCA-cyclus proteïnen, redox-regulerende proteïnen, Complex-III proteïnen en Complex-V (ATP-synthase) proteïnen waren aanwezig in significant verschillende (en voornamelijk gestegen) hoeveelheden bij ‘M.E./CVS’ t.o.v. ‘controles’. De resultaten suggereren dat deze meerderheid M.E./CVS-patiënten ontregeling van de mitochondriale energie-produktie componenten vertonen, in het bijzonder te zien via significante toenames van meerdere belangrijke Complex-I proteïnen.

Veel van de geïdentificeerde mitochondriale proteïnen met verhoogde expressie zijn betrokken bij het correct funktioneren van het OXPHOS-complex in het binnenste membraan van het mitochondrium. Van de OXPHOS-complexen vertoonden een significant aantal van de samenstellende proteïnen van Complex-I & Complex-V (ATP-synthase) toegenomen expressie vergeleken met controles (NDUFA3, NDUFB3, NDUB11 & NDUB12 in Complex-I; ATP5E, ATP5D, ATP5F1 & USMG5 in Complex-V). Versterkte ATP metabole processen, generatie van precursor-metabolieten en energie, oxidatieve fosforylatie, redox-homeostase en verhoogde recyclage van NAD werden geïdentificeerd via […] funktionele associatie analyse in de M.E./CVS PCA groep. Hoewel voornamelijk toegenomen hoeveelheden van mitochondrium-gerelateerde proteïnen werd gezien in de M.E./CVS PCA groep, waren er meerdere belangrijke proteïnen met afgenomen relatieve hoeveelheden. Deze omvatten PRDX6 [gen coderend voor peroxiredoxine-6, een anti-oxidatie enzyme] en OXR1 [gen coderend voor ‘oxidation resistance protein-1’] met rollen in redox-regulering, en enkele proteïnen betrokken bij de assemblage van het mitochondrium (zoals TIMM8A). Mitochondriaal IDH2, ook relatief gestegen in de M.E./CVS PCA subgroep, gebruikt NADP+ als elektron-receptor om z’n oxidatieve decarboxylatie reaktie te katalyseren bij cellulaire verdediging tegen oxidatieve schade.

De bevindingen suggereren bij M.E./CVS verhoogde waarden van Complex-I & Complex-V constituenten, en toegenomen inspanningen om ATP-produktie aan te zwengelen. Aangezien Complex-I de belangrijkste producent van ROS is in de elektronen-transport-keten, is de identificatie van klaarblijkelijke ontregelde redox-homeostase bij M.E./CVS belangrijk om te noteren. Ontregelde hoeveelheden van belangrijke redox-regulerende proteïnen impliceert een respons op toegenomen ROS in de cellen, alsook het potentieel vermogen om met hoge waarden of ROS (geproduceerd in het mitochondrium) om te gaan. De resultaten van deze studie suggereert dat bij toekomstige studies, het overwegen van ATP-waarden en ROS-aanmaak in biologische stalen belangrijk zal zijn. Het ontrafelen van de mitochondriale funktie d.m.v. Seahorse analyse (d.i. het meten van zuurstof-consumptie en extracellulaire verzuring om de efficiëntie van verschillende mitochondriale parameters – bv. ATP-produktie en maximale ontkoppelde respiratie – te bepalen), is ook van belang.

4.2. Histonen-methylatie en proteasoom-aktivatie; gedempte bloedplaatjes-aktivatie en immuun-processen

Hoewel mitochondrieën-gerelateerde proteïnen met differentiële expressie van de studie evolueerden tot het belangrijkste interesse-punt en focus van de bespreking, is het ook belangrijk op te merken dat ook significante veranderingen werden gezien wat betreft proteïnen betrokken bij histonen-methylatie, immune inflammatie en proteasoom-aktivatie funktionele netwerken. Histonen-methylatie mechanismen […] gaven methylatie aan op [genen coderend voor histonen] H3K4 (aktivatie van nabijgelegen gen-expressie) & H3K27 (onderdrukking van gen-expressie). Wij en andere reserach-groepen zagen reeds differentiële methylatie-patronen bij M.E./CVS [Helliwell AM. An Epigenetic Analysis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. MSc thesis, University of Otago; 2020], dikwijls in immuun-gerelateerde genen [Trivedi MS et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLoS ONE (2018) 13: e0201066]. Er werd al gesuggereerd dat epigenetische modificaties belangrijke rollen spelen bij inflammatoire en auto-immune ziekten die gelijkenissen delen met M.E./CVS [de Vega WC, Vernon SD et al. Integration of DNA methylation and health scores identifies subtypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Epigenomics (2018) 10: 539-57]. Verscheidene DNA-methylatie studies hebben zowel hypo-methylatie als hyper-methylatie aangetoond op specifieke gen-promoters bij M.E./CVS-patiënten, inclusief onze lopende patiënten/controle-studie. In onze studie bleken hyper-methylatie wijzigingen proportioneel veel frequenter op promoters dan over het ganse genoom, waarbij verlies aan methylatie verantwoordelijk was voor de meeste van de veranderingen tussen M.E./CVS studie-groep en de controles [zie hierboven: Sweetman EC, Vallings R, Tate WP et al. Diagnostics (2019)]. De toevoeging van methyl-groepen op promoters is consistent met een hypometabole toestand waarbij de expressie van genen betrokken bij metabole mechanismen gedownreguleerd is. Er werd differentiële methylatie bij M.E./CVS gevonden in de onmiddellijke nabijheid van genen betrokken bij immuun-funktie en cellulair metabolisme, gelinkt met het M.E./CVS-fenotype [de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Medical Genomics (2017) 10: 11 /// Herrera S, de Vega WC et al. Genome-epigenome interactions associated with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Epigenetics (2018) 5: 1-17 /// de Vega WC et al. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS one (2014) 9: e104757]. Globaal komen deze bevindingen overéén met M.E./CVS-bevindingen die wijzen op stoornissen qua cellulaire energie-produktie en immuun-dysfunktie bij de patiënten. Er waren ook meerdere proteasoom-proteïnen verhoogd in de proteomen van zowel de volledige groep M.E./CVS-individuen als de via PCA geselekteerde M.E./CVS-subgroep. Deze klaarblijkelijke upreguleringen van het proteasoom kunnen een respons zijn op verkeerd gevouwen proteïnen, een fenomeen dat ook wordt geïmpliceerd door […] funktionele beoordelingen, te wijten aan ROS-schade en oxidatieve stress in M.E./CVS PBMCs.

De observatie van een dempend effekt op bloedplaatjes-aktivatie en MHC klasse-I immuun-funkties bij M.E./CVS is ook van belang. Er werden bloedplaatjes-oppervlakte membraan glycoproteïnen geïdentificeerd, samen met aktiverende factoren, wat suggereert dat sommige bloedplaatjes-proteïnen in de PBMC-fraktie achterbleven en dit in hogere hoeveelheden bij controle dan bij M.E./CVS. Geaktiveerde bloedplaatjes hebben een anti-inflammatoir effekt door directe interaktie met monocyten via receptoren voor IgG, ter versterking van de IL-10 produktie en reductie van de TNFα-sekretie. Het is ook mogelijk dat M.E./CVS-patiënten globaal minder bloedplaatjes hebben of onderdrukte immuun-aktivatie, die bijdroeg tot hun lagere hoeveelheid bloedplaatjes-proteïnen. MHC klasse-I gerelateerde proteïnen waren gedaald in de M.E./CVS-groep. De funktie van deze klasse proteïnen is het presenteren van intracellulaire peptiden (voornamelijk gegenereerd door degradatie van cytosol-proteïnen door het proteasoom) aan cytotoxische T-cellen. Interessant is dat proteasoom-aktiviteit en proteïnen-afbraak versterkt lijkt te worden bij M.E./CVS, suggestief voor het feit dat het dempen van de MHC klasse-I funktionele mechanismen een respons kan zijn ter vermijding van onnodige aktivatie van de immuun-respons. Een transcriptoom-studie met dezelfde M.E./CVS- en controle-studiegroep vond bij de genen die significant differentieel tot expressie kwamen bij M.E./CVS (de drie meest significante en verhoogde): IL8, NFKBIA & TNFAI3P, allen funktioneel gerelateerd als responders op over-aktivatie van inflammatoir NF-κB [nucleaire factor kappa B: proteïne-complex dat de DNA-transcriptie, cytokine-produktie en overleving van de cel regelt]. Analyse wees op de volgende biologische mechanismen aangetast door deze gewijzigde genen: immune/inflammatoire mechanismen, cellulaire stress respons en oxidatieve stress, circadiaans ritme, metabolisme en mitochondriale funktie [zie hierboven: Sweetman EC, Vallings R, Tate WP et al. Int J Immunopathol Pharmacol. (2019)]. De correlerende gen-transcripten coderend voor de respiratoire complexen, TCA-cyclus proteïnen en ATP-synthase subunits bleken niet significant veranderd in het M.E./CVS-transcriptoom, dus ze zouden gereguleerd kunnen worden via post-translationele mechanismen om hun proteïnen te verhogen maar er waren echter klaarblijkelijk gelijkaardige biologische mechanismen aangerijkt in beide studies. Dus: deze bevindingen ondersteunen de substantiële hoeveelheid reeds gepubliceerd bewijsmateriaal voor immuun-ontregeling die een belangrijke rol speelt bij de pathogenese van M.E./CVS [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9].

4.3 Cellulaire veroudering bij M.E./CVS

Een belangrijke bevinding was de cluster van vijf histoon H1 proteïnen (H1-1, H1-2, H1-3, H1-4 & H1-5): ze waren allemaal aanwezig met hogere relatieve hoeveelheden bij de ganse M.E./CVS-groep vergeleken met controle-individuen. Aanrijking van deze proteïnen wijst op versterkte chromatine [complex van DNA en proteïnen (histonen) in de celkern] -hermodelering en DNA-methylatie bij M.E./CVS. Analyse van de proteïnen met significant gewijzigde relatieve hoeveelheden (P <  0.01, log₁₀ > 0.2 & < -0.2) suggereert dat de gestegen expressie van deze H1 histonen, naast proteasoom- en redox-regulerende proteïnen, een aanhoudende stress-respons in M.E./CVS PBMCs onthult, leidend tot door DNA/telomeer-schade geïnduceerde veroudering. Het proces van door DNA-schade/telomeer-stress geïnduceerde veroudering culmineert in de vorming van ‘met veroudering geassocieerde heterochromatine foci’ (SAHF) [gespecialiseerde domeinen in heterochromatine (DNA rijk aan histonen) die bijdragen tot het stilleggen van proliferatie-bevorderende genen in verouderende cellen], een proces waarbij de vijf histoon-proteïnen belangrijke spelers zijn. Cellulaire veroudering wordt gedefinieerd als het onomkeerbaar verlies van deling-potentieel van somatische cellen. Veroudering heeft een belangrijke rol in vivo, aan de ene kant beschermt het tegen een opstapeling van cellen met DNA-schade en aan de andere kant draagt het bij tot leeftijd-afhankelijke weefsel-dysfunktie. Cellulaire veroudering werd gevonden in een waaier van weefsels en ziekten, zoals kanker (long-kanker, borst-kanker, neuroblastoma, astrocytoma, colon-kanker, enz), fibrose [overmatige vorming van bindweefsel] […], chronische obstructieve pulmonaire ziekte (COPD) en pulmonaire hypertensie. Toegenomen cellulaire veroudering wordt gewoonlijk toegeschreven aan het veroudering-proces, maar dit is echter niet het geval in onze M.E./CVS-groep: de leeftijd van de studie-deelnemers varieert van 11 tot 69 jaar. Dit zou kunnen worden verklaard door bewijs voor persistente oxidatieve stress en cel-schade door ROS in de M.E./CVS-groep. De stijgingen qua proteïnen van het respiratoire keten complex die wordt gezien bij de M.E./CVS-groep [de negen na PCA], wijzen op excessieve ROS-produktie bij M.E./CVS en een onevenwicht tussen het anti-oxidant en oxidatief systeem in de PBMCs. Mitochondrieën zijn de voornaamste bron van ROS in cellen en het belangrijkste doelwit van oxidatieve schade, wat op z’n beurt de efficiëntie van mitochondrieën kan reduceren en ROS-produktie induceren. Zodoende: voortijdige veroudering bij M.E./CVS is een aannemelijk resultaat van verhoogde oxidatieve stress ten gevolge geëscaleerde en ontregelde mitochondriale aktiviteit.

Verouderde cellen, hoewel niet prolifererend, zijn metabool en transcriptioneel aktief, waardoor ze in staat zijn hun micro-omgeving aan te tasten, met name via de produktie van inflammatoire mediatoren. Deze mediatoren onderhouden en verbreiden het veroudering-proces naar naburige cellen en recruteren dan immuuncellen om senescente cellen op te ruimen. De chronische ontregeling van de immuun-respons mechanismen bij M.E./CVS zouden dus gelinkt kunnen zijn met de mitochondriale dysfunktie, oxidatieve stress en daaropvolgend triggeren van voortijdige veroudering. Interessant: een studie aangaande hoge ouderdom bij muizen beklemtoonde het belang van proteïnen van de elektronen-transport-keten (ETC), bijzonderlijk het matrix-arm onderdeel van Complex-I. Jonge langlevende muizen hadden gedaalde waarden van deze ETC-proteïnen (wat geassocieerd is met verbeterde Complex-I assemblage), hogere met Complex-I gelinkte toestand-3 zuurstof-consumptie [ADP-gestimuleerde respiratie] en verminderde superoxide-aanmaak. Het tegengestelde was waar bij oude muizen. De studie vond dat ontwrichting van Complex-I assemblage het oxidatief metabolisme reduceert en aanleiding geeft tot mitochondriale superoxide-produktie, waarbij het effekt wordt weggewerkt door ‘knockdown’ [geen expressie] van prohibitine (PHB), een mitochondriaal chaperone [molekule die helpt bij het vouwen of ontvouwen en het op- of afbouwen van macromolekulaire strukturen (proteïnen/DNA)]. Prohibitine-waarden waren verhoogd in onze M.E./CVS PCA subgroep, suggererend dat dit redding-effekt niet optreedt.

4.4. Hoe deze proteoom-analyse zich verhoudt met andere M.E./CVS proteoom-analyses en mitochondriale dysfunktie

Proteoom-studies, hoewel niet op basis van SWATH-MS analyse, hebben mitochondriale betrokkenheid bij M.E./CVS geïmpliceerd, maar met tegenstrijdig bewijsmateriaal. Eén groep vond gereduceerde biogenese van mitochondrieën maar geen genormaliseerde aktiviteiten van respiratoire keten enzymen in de spieren van of M.E./CVS-patiënten. Consistent met deze studie werden verhoogde expressie van mitochondriale proteïnen in serum, bloedplaatjes en lymfocyten gevonden in sommige studies [zie Missailidis D et al. hierboven /// Kaushik N, Kerr JR et al.. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32]. Tegengesteld aan wat anderen vonden, leek de mitochondriale funktie verminderd in geïsoleerde neutrofielen, [Ciregia F et al. Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry (2016) 6: e904], net zoals de respiratie in M.E./CVS PBMCs [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802], terwijl oxidatieve fosforylatie complexen onaangetast bleken [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J. Mitochondrial dysfunction and the pathophysiology of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue syndrome (ME/CFS). Int J Clin Exp Med. (2012) 5: 208-20 /// Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8:93].

Studies die een significante rol voor mitochondriale dysfunktie bij M.E./CVS impliceren zijn echter consistent met de bevinding van deze SWATH-MS studie. Een belangrijke studie was een translationele ‘case-control’ studie met monozygote tweelingen met/zonder M.E./CVS door Ciregia F et al. [zie hierboven], waarbij proteomica op bloedplaatjes-mitochondrieën werd uitgevoerd. Van de 1.007 gedekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant verschillend bij M.E./CVS. Daarvan hadden 41 een verandering van meer dan 2,0 maal (34 geupreguleerd en 7 gedownreguleerd). Deze studie merkte gelijkaardige proteïne-expressie wijzigingen op t.o.v. deze gepresenteerd in onze PBMC proteoom-studie en er werd ook afgeleid dat belangrijke biologische mechanismen ontregeld te zijn in onze SWATH-MS proteoom-studie van de Dunedin M.E./CVS-groep. De studie door Ciregia F et al. [zie hierboven] markeerde bv. ‘metabolisme van NADH’ bv. als één van de belangrijkste biologische funkties betrokken bij M.E./CVS. Onze resultaten impliceren dat hogere waarden qua NADH zouden worden aangemaakt omwille van gestegen proteïnen in de TCA-cyclus, tesamen met potentieel verhoogde oxidatie van NADH door ge-upreguleerd Complex-I. De NAD+/NADH verhouding heeft een belangrijke rol bij het regelen van de intracellulaire redox-toestand en, daarom, heeft het de metabole toestand weer. Enkele studies hebben gesuggereerd dat NADH-concentraties daarentegen significant lager zijn bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med. (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improvefatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antiox Redox Signal. (2015) 22: 679-85]. Er werden hogere waarden qua malaat-dehydrogenase en isocitraat-dehydrogenase [enzymen van de TCA-cyclus] gezien in de hierboven vermelde ‘case-control’ studie en er werd voorgesteld dat dit een adaptieve respons is op deficiënties van NADH, wat op z’n beurt een cruciale rol zou spelen bij de mitochondriale ATP-produktie. Wanneer we de resultaten van deze studie en die van ons integreren, is een plausibele hypothese dat er een metabole dysfunktie bestaat bij M.E./CVS die resulteert in onvoldoende energie-produktie en het triggereren van compenserende toenames van OXPHOS-proteïnen om dit tekort te verbeteren.

Er is een artikel dat significante en substantiële ondersteuning voor deze hypothese levert [zie Missailidis D et al. hierboven]: dit artikel onderzocht geïmmortaliseerde lymfoblasten van 51 M.E./CVS-patiënten, waarbij parameters van de mitochondriale funktion d.m.v. Seahorse extracellulaire flux analyse, proteomica en biochemische testen werden beoordeeld. De meest frappante bevinding van deze experimenten was de observatie dat de mate van ATP-synthese door Complex-V, als deel van de basale zuurstof-consumptie, significant was gereduceerd bij M.E./CVS. Ter zelfder tijd werden significante stijgingen getoond qua Complex-I zuurstof-consumptie (OCR), maximum OCR, reserve respiratoire capaciteit, niet-mitochondriale OCR en ‘proton-lek’ als deel van de basale OCR. Ook gezien: ge-upreguleerde expressie van de mitochondriale respiratoire complexen, vetzuren-transporters, en enzymen van de ß-oxidatie en TCA cycli. Samen ondersteunen deze bevindingen een ziekte-model waarbij een defekt in Complex-V, en daardoor deficiënte ATP-produktie, vergezeld gaat met een compenserende upregulering van de mitochondriale respiratoire capaciteit en respiratoire complexen, membraan-transporters en proteïnen betrokken bij vetzuren ß-oxidatie. Deze compenserende mechanismen maken een adequate ATP-synthese in rustende cellen mogelijk, welke echter niet in staat is in voldoende mate te reageren op acute energie-eisen.

4.4.1. De sleutelrol van mitochondriaal Complex-I

De observatie bij onze studie, door Missailidis D et al. [zie hierboven] en door Cirega F et al. [zie hierboven], van significante toenames van de expressie van Complex-I proteïnen verdient verdere discussie. Deze belangrijke studies, en de proteoom-resultaten die hier worden gepresenteerd, wijze er op dat in sterke mate op oxidatieve schade optreedt bij M.E./CVS. Complex-I is samengesteld uit 44 verschillende subunits, en de assemblage ervan vereist minstens 13 specifieke assemblage-factoren. De modulaire assemblage van Complex-I is afhankelijk van een serie strak gecoördineerde series stappen, waarbij wordt voorgesteld dat de verschillende funktionele modules afzonderlijk assembleren en zich nadien samen verbinden om het uiteindelijke enzyme te vormen. Verder staat Complex-I er om bekend super-complexen te vormen met Complex-III & -IV in het binnenste mitochondriaal membraan, wat help bij ’t vormgeven van de cristae-vouwingen in het mitochondrium, en direct de mitochondriale funktie en ATP-synthese beïnvloedt. Mitochondriale cristae zijn op zo’n manier gestruktureerd dat OXPHOS-complexen bij elkaar liggen, met Complex-V (ATP-synthase) aan de rand van de cristae en andere complexen langs beide zijden. Deze strikte vormgeving van de cristae lijkt fundamenteel voor het creëren van een proton-gradient, waarbij protonen van de complexen naar de ATP-synthase stromen. Complex-I is een L-vormige molekule, met een perifere arm die uitsteekt in de mitochondriale matrix en een membraan-arm die in het binnenste membraan zit. De twee funktionele blokken binnen de perifere arm werden de N (NADH-bindende) & Q (ubiquinon-bindende) modules genaamd. De membraan-arm bestaat uit de P (proton-pompende) module, die op z’n beurt proximale en distale uiteinden heeft die afzonderlijk worden gevormd tijdens Complex-I assemblage. Drie van de geïdentificeerde verhoogde proteïnen zijn betrokken bij de transmembraan module; NDUFA3 in het proximaal deel van de P-module; en NDUFB3 & NDUFB11 in het distaal deel van de P-module. NDUFA12 ligt aan de interface tussen modules N & Q, terwijl het gedaald NDUFA5 in de Q-module ligt en betrokken is bij de vroegste sub-assemblage van de module. De specifieke rollen van vele van de bijkomende subunits in Complex-I zijn nog niet bekend […].

Complex-I is de vornaamste producent van reaktieve zuurstof soorten (ROS) binnen de elektronen-transport-keten en zodoende een significante bijdragende factor aan cellulaire oxidatieve stress. Er kan worden verwacht dat een toename van ROS kan worden gezien in combinatie met de verhoging qua Complex-I proteïne-expressie, alsook effekten op enzymen betrokken bij redox-regulering en homeostase. Complex-I is ook bijzonder gevoelig voor ROS-schade: daarom zou de verhoogde expressie van Complex-I proteïnen in respons op de schade kunnen gebeuren. Bovendien blijkt Complex-I frequent te worden geassembleerd als een supercomplex met Complex-III & -IV, en dit werd voorgesteld als een methode om het genereren van ROS door Complex-I te controleren. Het supercomplex werkt ter preventie van overmatige superoxide-produktie tijdens oxidatie van met NAD gelinkte substraten omdat de resulterende efficiënte kanalisering van CoQ helpt om de keten in de geoxidiseerde toestand te houden. Deze supercomplex-vorming steunt op evenwichtige verhoudingen van elke complex. Verhoogde expressie van Complex-I subunits zouden dan de supercomplex-organisatie kunnen beïnvloeden, wat dan een dramatische versterking van ROS-produktie door Complex-I veroorzaakt.

Misschien een indicatie van defekte ATP-produktie door M.E./CVS-mitochondrieën: een M.E./CVS-studie uit 2016 van ATP-waarden in PBMCs stelde vast dat de ATP-concentraties hoger lagen en de cristae meer gecondenseerd waren t.o.v. controles [Lawson N et al.. Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. J Nat Sci. (2016) 2: e221]. Er werd omgemerkt dat het toegenomen ATP grotendeels van niet-mitochondriale oorsprong was. Verstoringen qua mitochondrieën-vormgevende proteïnen en de ontwrichting van supercomplex-vorming, waardoor de struktuur van de cristae verandert, bleken geïmpliceerd bij verscheidene ziekten (bv. Parkinson’s). Inderdaad: een analyse van de mitochondrieën-vormgevende proteïnen die gewijzigd waren in de context van Parkinson’s (waarvan de grote meerderheid gerelateerd zijn met de organisatie van cristae) vond dat veel van hun binding-partners gerelateerd waren met de mitochondrieën en het proteasoom. Wat ook gelijkenissen vertoont met onze M.E./CVS-bevindingen is dat de mitochondrieën-vormgevende proteïnen (die gewijzigd zijn bij Parkinson’s) betrokken zijn bij biologische mechanismen die verband houden met de aanmaak en het metabolisme van ATP, de immuun-respons en oxidatieve stress.

5. Besluit

Er is steeds meer bewijs dat mitochondriale dysfunktie een significante rol speelt in de pathogenese van M.E./CVS. Verscheidene studies met inbegrip van proteoom-studies op verschillende biologische stalen zijn beloftevol wat betreft het blootleggen van de onderliggende pathologie van complexe ziekten zoals M.E./CVS. Of individuele veranderingen in proteïne-expressie, of combinaties van proteïnen, kunnen fungeren als diagnostische biomerker voor M.E./CVS dient te worden geëvalueerd, nadat validatie-experimenten zijn uitgevoerd met verschillende en grotere M.E./CVS-groepen, en bij andere ziekten met gelijkaardige presentatie. Er werd echter een model ontwikkeld voor deficiënte ATP-produktie en de resulterende compenserende mechanismen [zie Missailidis D et al. hierboven] – door deze studie wordt bekrachtigd – dat een plausibele verklaring biedt voor de kenmerkende post-exertionele malaise die wordt ervaren bij M.E./CVS.

HHV-6 reaktivatie, mitochondriale fragmentatie en antivirale & metabole fenotypes bij M.E.(cvs)

Onderstaand onderzoek (o.a. gefinancierd door ‘Solve M.E. Initiative’) toont een connectie tussen het courant voorkomend humaan herpes virus-6 (dat DNA-materiaal achterlaat in de cellen) en veel van de symptomen van M.E.(cvs).

Een team researchers van de ‘University of California San Diego School of Medicine’ en drie Duitse universiteiten illustreert hoe de inspanningen die het lichaam levert om de bescherming door het immuunsysteem op te krikken, kunnen leiden tot fysiologische uitputting. Ze focusten daartoe op Humaan Herpes Virus 6 (HHV-6), dat kan sluimeren (virale latentie) door te integreren in de chromosomen.

Eén van de auteurs, Robert Naviaux (de bedenker van de ‘cell-danger response’) stelt voor dat cellen al hun energie aanwenden voor hun verdediging en overleving, zodat ze er niet genoeg over hebben voor een normale cellulaire aktiviteit) liet optekenen: “Deze bevindingen zijn belangrijk omdat ze voor ‘t eerst tonen dat er antivirale aktiviteit in het serum van M.E.(cvs)-patiënten werd aangetroffen die nauw verbonden is met een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verminderde cellulaire energie (ATP-produktie).”. En “Het biedt een verklaring voor de observatie dat M.E.(cvs)-patiënten minder virale infekties ervaren nadat ze de ziekte kregen. Ons werk helpt ook de link met eerdere infektie met Humaan Herpes Virus-6 (HHV-6) of HHV-7 begrijpen.”.

90 % van de bevolking wordt vóór de leeftijd van drie blootgesteld aan HHV-6. Het virus-DNA nestelt zich dan in een chromosoom en blijft er jaren lang latent in slechts enkele cellen. Voor de meeste mensen geeft dit geen problemen.

Hier werd echter gevonden dat blootstelling aan nieuwe metabole of chemische stressoren de cellen (met een geïntegreerde copie van of HHV-6), aanzet om naburige cellen te waarschuwen voor een bedreiging. De aktiviteit (een substantie die door HHV-6 geïnfekteerde cellen wordt gesekreteerd) beschermt andere cellen tegen nieuwe infekties (“super-infektie”) met RNA- & DNA-virussen maar veroorzaakt ook een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verlaagt hun intracellulaire ATP-reserve (energie-voorraad). De researchers dienden cultuur-medium van cellen met HHV-6 reaktivatie toe aan gezonde cellen: ze zagen wijzigingen in mitochondriale strukturen geassocieerd met een lage metabole toestand. Dezelfde strukturele veranderingen werden ook gevonden als gezonde cellen werden gekweekt in medium met serum van M.E.(cvs)-patiënten. Cellen zonder een geïntegreerde copie van of HHV-6 sekreteren die antivirale activiteit niet.

De resultaten tonen, volgens de auteurs, dat de cellulaire bio-energetische vermoeidheid en cellulaire verdediging twee zijden van hetzelfde muntstuk zijn bij M.E.(cvs): Wanneer energie wordt verbruikt voor de verdediging van de cellen, is die niet meer beschikbaar voor normale cel-funkties (groei, herstel, en de werking van het neuro-endocrien systeem en het autonoom zenuwstelsel).

De bevindingen belichten verder het concept (de ‘cell-danger response’ (CDR) theorie) dat Naviaux al jaren onderzoekt. Deze theorie stelt dat chronische ziekte het gevolg is van de blokkage van een cyclus van natuurlijk herstel door ontwrichtingen op metabool en cellulair niveau. Bij M.E.(cvs) leidt dit alles tot levenslange ziekte.

HHV-6 & HHV-7 spelen dus misschien een rol bij de ziekte maar of ze dé (enige) oorzaak zijn …? Er wordt getoond dat met HHV-6 geïnfekteerde of gereaktiveerde celllen een krachtige metabole en mitochondriale her-modelerende respons kunnen opwekken die zelfs de cellen die geen virus bevatten kunnen leiden naar een hypo- (abnormaal lage) metabole toestand. Dus: zelfs (virus-gereaktiveerde) cellen met een laag aantal copieën van het virus in het bloed hebben nog een impact op de energie-produktie van andere cellen bij M.E.(cvs). De auteurs geloven dat dit mechanisme ook geldt voor gevallen die getriggerd zijn geweest door andere virussen.

Er zijn nu grotere studies nodig om de resultaten te valideren. De vraag blijft ook waarom reaktivatie van latent HHV-6 DNA in slechts enkele cellen genoeg zou om een signaal af te geven dat andere cellen doet ‘slapen’ en waarom dat enkel bij M.E.(cvs) gebeurt? Is er misschien een genetische factor in het spel? Er dient ook te worden gezocht naar de substantie die de cellen in ‘alarm’ zet en hun energie-produktie ondermijnt; en naar manieren om het signaal (waarvan de auteurs denken dat het niet-geïnfekteerde cellen in de ‘cell danger’ modus zet) te blokkeren…

————————-

ImmunoHorizons Vol 4, #4, pp 201-215 (april 2020)

Human Herpesvirus-6 reactivation, mitochondrial fragmentation, and the coordination of antiviral and metabolic phenotypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Philipp Schreiner (1), Thomas Harrer (2), Carmen Scheibenbogen (3), Stephanie Lamer (4), Andreas Schlosser (4), Robert K. Naviaux (5), Bhupesh K. Prusty (1,5,6)

1 Lehrstuhl fur Mikrobiologie, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

2 Medizinische Klinik 3, Universitatsklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nurnberg, Germany

3 Institut fur Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum, Germany

4 Rudolf-Virchow-Zentrum fur Experimentelle Biomedizin, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

5 Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

6 Department of Pediatrics, School of Medicine, University of California, San Diego

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een multi-factoriële aandoening met veel mogelijke triggers. Humaan herpesvirus (HHV)-6 & HHV-7 zijn twee infektueuze triggers waarvoor het bewijsmateriaal omvangrijker werd. Om de mogelijke oorzakelijke rol van HHV-6 bij M.E./CVS te begrijpen, werden metabole en antivirale fenotypes van U2-OS cellen bestudeerd met en zonder chromosomaal geïntegreerde HHV-6, en met en zonder virus-reaktivatie gebruikmakend van de histoon-deacetylase inhibitor trichostatine-A [TSA]. Er werd proteoom-analyse uitgevoerd d.m.v. isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur analyse. De door HHV-6 transaktivatie geïnduceerde antivirale eigenschappen werden bestudeerd in virus-naïeve A549 cellen belast door infektie met influenza-A (H1N1) of HSV-1. Fragmentatie van mitochondrieën, en 1-koolstof metabolisme, dUTPase en thymidylaat-synthase bleken sterk geïnduceerd door HHV-6 reaktivatie, terwijl superoxide-dismutase-2 en proteïnen vereist voor mitochondriale oxidatie van vetzuren, aminozuren en glucose-metabolisme, inclusief pyruvaat-dehydrogenase, sterk waren geïnhibeerd. Transfer van supernatanten van U2-OS cellen na reaktivatie van HHV-6A leidde tot een antivirale toestand in A549 cellen zodat superinfektie met influenza-A en HSV-1 werden voorkomen. Adoptieve transfer van serum van 10 patiënten met M.E./CVS veroorzaakte een gelijkaardige fragmentatie van mitochondrieën en de geassocieerde antivirale toestand in de A549 cel test. Tot besluit: HHV-6 reaktivatie bij M.E./CVS-patiënten aktiveert een multisystemische, pro-inflammatoire, ‘cell-danger’ respons die beschermt tegen bepaalde RNA- en DNA-virus infekties maar ten koste van mitochondriale fragmentatie en ernstig verstoord energie-metabolisme.

INLEIDING

Humaan herpesvirus (HHV)-6A & -6B zijn neurotrope virussen [gericht op het zenuwstelsel] die reeksen telomeer- ‘repeats’ [herhaalde DNA-sequenties] dragen aan beide uiteinden van hun lineair genoom, wat hun genoom-integratie in menselijke chromosomen vergemakkelijkt en leidt tot latentie [virale latentie = de fase in de levenscyclus van een virus waarbij, na initiële infektie, de proliferatie van virus-partikels ophoudt]. Chromosomaal geïntegreerd HHV-6 (ciHHV-6) wordt nu en dan genetisch overgeërfd (iciHHV-6). Ca. 0,2-1% van de bevolking draagt iciHHV-6 en 90-100% is geïnfekteerd op de leeftijd van 3 jaar. HHV-7 is een ander lid van de beta-herpesvirus familie dat gelijkaardige genoom-integratie kenmerken heeft als HHV-6. HHV-6 & HHV-7 zijn dikwijls geassocieerd met meerdere menselijke ziekten, inclusief Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), waar ook mitochondriale dysfunktie bij betrokken is. Er wordt al lang voorspeld dat mitochondriale dysfunktie een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van en/of progressie van M.E./CVS. Een gewijzigde mitochondriale dynamiek, deficiënte mitochondriale ATP-aanmaak en verhoogde oxidatieve stress werden bij M.E./CVS gerapporteerd. Biofysische veranderingen in cellen van M.E./CVS-patiënten die onder osmotische stress werden geplaatst werden gebruikt als een [mogelijke] vernieuwende diagnostische test voor M.E./CVS [Davis RW et al. A nanoelectronics-blood-based diagnostic biomarker for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2019- 116: 10250-10257]. De exacte antecedent voor mitochondriale modulatie bij M.E./CVS is echter grotendeels onbekend. We hebben aangetoond dat HHV-6A reaktivatie mitochondriale fragmentatie induceert [Prusty BK et al. HHV-6 encoded small non-coding RNAs define an intermediate and early stage in viral reactivation. NPJ Genom. Med. (2018) 3: 25]. In deze studie hier onderzochten we potentiële infektueuze oorzaken en molekulaire mechanismen van mitochondriale dysfunktie, die wellicht resulteren in de ontwikkeling en/of progressie van M.E./CVS, gebuikmakend van HHV-6A reaktivatie als model. Onze resultaten tonen een serum-transfereerbare aangeboren immuun-aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten die een toestand van lage mitochondriale aktiviteit gepaard met veranderingen qua mitochondriale dynamiek induceert, wat kan bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte.

MATERIALEN & METHODES

Cel-culturen en virale infektie

A549 [long-carcinoom] cellen […]. U2-OS [beender-osteosarcoom] cellen […] dragen latent HHV-6A.

[…]

Bloed-afname, DNA-extractie en kwantitatieve PCR van HHV-6 & HHV-7 DNA

[…]

RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

[…]

ATP-test

[…]

Microscopie van de mitochondrieën en kwantificaties

[…] Meting van mitochondriale oppervlakte. […]

Fluorescentie in situ hybridisatie analyse

FISH [fluorescentie in-situ hybridisatie; techniek waarbij (delen van) chromosomen gekleurd worden en vervolgens onder een fluorescentie-microscoop worden bekeken] ter detektie van HHV-6A klein niet-coderend RNA-U14 (sncRNA-U14) [volgens Prusty BK et al. (zie hierboven), een merker voor virale reaktivatie].

Cytokine-analyse in PBMCs

De diagnose van M.E./CVS werd gesteld aan de Charité kliniek voor immunodeficiënties op basis van de Canadese Consensus Criteria en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Gezonde controles (HCs) gematcht voor leeftijd en geslacht werden gerecruteerd bij het personeel […].

Cytokine-produktie door monocyten […] en T-lymfocyten […]: kwantificatie van TNF-α & IL-1β in met LPS-gestimuleerde, en Il-5 & IFN-γ in met ConA gestimuleerde stalen, d.m.v. ELISA […].

Gepulseerde stabiele isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur

[op massa-spectrometie gebaseerde techniek die verschillen qua hoeveelheden proteïnen detekteert gebruikmakend van labeling met niet-radioaktieve isotopen] […]

MS en MS gegevens-analyse

[…]

Statistiek

[…]

Toegankelijkheid van de gegevens

[…]

RESULTATEN

HHV-6A reaktivatie induceert mitochondriale dysfunktie

Verscheidene pathogene infekties wijzigen de mitochondriale dynamiek en funktie ten voordele van hun eigen vereisten. In het bijzonder virale infekties richten zich tegen mitochondrieën om de aangeboren immuniteit te ondergraven. Daarom dachten we dat een virale oorzaak achter de ontwikkeling van M.E./CVS zit, minstens bij een subgroep patiënten. Gebruikmakend van een uniek in-vitro model met menselijke U2-OS cellen, hebben we eerder getoond dat HHV-6A transaktivatie mitochondriale fissie [splijting] induceert, wat geassocieerd is met gewijzigingen van microRNAs (miRNA) alsook van het mRNA-transcriptoom van de gastheer. HHV-6 reaktivatie in U2-OS cellen is niet-produktief [Er worden geen infektueuze virussen aangemaakt.] en wordt gemarkeerd door de initiatie van transcriptie van meerdere virale kleine niet-coderende RNAs [sncRNA] in afwezigheid van substantiële virale DNA-replicatie en virale proteïne-synthese. Het viraal polymerase [enzyme dat DNA- of RNA-molekulen synthetiseert/copieert] is niet detekteerbaar, en er kunnen slechts heel weinig selektieve virale ‘onmiddellijk vroege’ (I.E.) [‘immediate-early’] en ‘vroege’ transcripten en proteïnen [van genen die (heel) vroeg worden overgeschreven] in deze cellen worden gedetekteerd na virus-reaktivatie.

Om de potentiële effekten van HHV-6A transaktivatie op de mitochondriale funktie in U2-OS cellen verder te begrijpen, voerden we onderzoek naar veranderingen in het gastheer-proteoom na virus-reaktivatie in deze cellen. Daartoe werd HHV-6A reaktivatie eerst geïnduceerd d.m.v. TSA [trichostatine-A; kan gen-expressie wijzigen (interfereren met histoon-deacetylasen) door de toegang van transcriptie-factoren tot DNA-molekulen te veranderen] en de mitochondriale fragmentatie werd gedocumenteerd d.m.v. microcopie: we zagen een overheersende gestippelde vorm van mitochondrieën na HHV-6A reaktivatie. Gebruikmakend van kwantitatieve proteomica (gebaseerd op isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur), observeerden we een effekt van virus-reaktivatie op de proteïnen-dynamiek van de gastheer-cel. Gegevens afgeleid van twee biologische gerepliceerde experimenten toonden sterke reproduceerbaarheid van de identificatie van de proteïnen waarvan de expressie gewijzigd was na virale reaktivatie. We detekteerden veranderingen qua expressie-dynamiek van meerdere belangrijke cellulaire proteïnen. Omwille van onze interesse in HHV-6 gemedieerde mitochondriale dysfunktie, analyseerden we verder de mitochondrieën-specifieke proteïnen. Meerdere belangrijke mitochondriale proteïnen betrokken bij glycolytische mechansimen, foliumzuur- en 1-koolstof metabolisme [groep biochemische reakties die de the transfer van 1-koolstof groepen gemeenschappelijk hebben; speelt een belangrijke rol bij o.a. biosynthese, aminozuur-homeostase, enz.], vetzuur-oxidatie, en aminonozuren-metabolisme bleken gewijzigd na HHV-6A transaktivatie, suggestief voor een potentieel effekt op het cellulair alsook het mitochondriaal metabolisme. De meest interessante observatie was de downregulering qua expressie van de mitochondriale proteïnen [enzymen] pyruvaat-dehydrogenase fosfatase katalytische subunit 1 (PDP1) en mangaan-afhankelijk superoxide-dismutase-2 (SOD2). [zie bespreking] Verhoogde oxidatieve stress – waar dikwijls naar wordt verwezen als de oxidatieve bescherming respons [Naviaux RK. Oxidative shielding or oxidative stress? J. Pharmacol. Exp. Ther. (2012) 342: 608-618; oxidatieve stress is niet het resultaat van een falend anti-oxidant systeem maar een intentionele en beschermende respons] – en gewijzigde pyruvaat-dehydrogenase funktie [Fluge Ø. et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376] zijn sleutel-kenmerken van M.E./CVS. Verminderde SOD2-waarden kunnen bijdragen tot verhoogde reaktieve zuurstof-soorten (ROS) in de cel. In een eerdere studie hebben we verhoogde ROS getoond in HHV-6 geïnfekteerde cellen. Vandaar dat we speculeerden over een directe rol van HHV-6 infektie bij de pathofysiologie van M.E./CVS.

Om de gevolgen te begrijpen van HHV-6 gemedieerde mitochondriale veranderingen op het gastheer-metabolisme, focusten we op de verhoogde mitochondriale fissie in HHV-6 gereaktiveerde cellen. Verhoogde mitochondriale fissie vermindert de respiratoire capaciteit van de cel, met als gevolg verlaging van de cellulaire ATP-produktie. Lagere cellulaire energie kan ook mitochondriale fragmentatie induceren. Vandaar dat we ons afvroegen of HHV-6A transaktivatie ook leidt tot een lagere ATP-inhoud van de cel. We hebben de ATP-inhoud van U2-OS cellen gemeten in aan- of afwezigheid van latent HHV-6A. Bovendien reaktiveerden we HHV-6A in deze cellen d.m.v. de histoon-deacetylase inhibitor TSA en bestudeerden de ATP-inhoud na virus-reaktivatie. Om de mitochondriale ATP-generatie enkel in afwezigheid van de glycolytische ATP-machinerie te meten, vervingen we glucose-bevattende media met een galactose-bevattend in parallelle experimenten. Galactose kan niet efficiënt worden gemetaboliseerd naar pyruvaat op een anaërobe manier en dwingt cellen te verschuiven naar mitochondriale oxidatieve fosforylatie voor energie-metabolisme en overleving. Onze resultaten toonden een afname qua cytoplasmisch én mitochondriaal ATP na HHV-6A reaktivatie. De mogelijkheid van verlies van ATP omwille van een produktieve virale levenscyclus werd uitgesloten, aangezien HHV-6A een niet-produktieve levenscyclus heeft in deze cellen.

HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen zou leiden tot een aangeboren immuun-respons. Zoals veel andere virussen zou HHV-6A echter ook een mechanisme kunnen ontplooien om mitochondriale fissie te induceren. Mitochondriale fissie reduceert het vermogen van cellen om een aangeboren immuun-respons op te zetten. Om dit te controleren, evalueerden we de IFN-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie via qRT-PCR: mRNA-waarden van IFN-β, IFN-responsief en viraal RNA-bindend gen IFIT-1 en TNF-α respons gen ICAM-1 werden gekwantificeerd. Er werden U2-OS cellen na transfektie met een RNA-sequentie van influenza-A (H1N1) virus gebruikt als positieve controle. Onze resultaten tonen een verminderde aangeboren immuun-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie, met lagere waarden qua IFN-β en TNF-α mRNA. Interessant: we zagen in vergelijking hogere IFIT-1 mRNA waarden in aanwezigheid van latent HHV-6A vóór stimulatie met TSA. Een verhoogde ISG [IFN-gestimuleerd gen; proteïne-produkten van ISGs controleren pathogeen-infekties] -respons […] in latent virus bevattende cellen, versterkt ons argument dat mitochondriale fragmentatie een aanpassing van het virus kan zijn om aangeboren immuun-respons te vermijden op het moment van virale reaktivatie wanneer virale ‘I.E.’ RNAs vrij beschikbaar zijn in het gastheer-cytoplasma. Gefragmenteerde mitochondrieën zijn inefficiënt wat betreft het opwekken van een sterke aangeboren immunieit respons, aangezien ze de interaktie voorkomen tussen mitochondriaal antiviraal signalisering (MAVS) proteïne en stimulator van IFN-genen (STING) op mitochondriale membranen. De mogelijkheid van een produktieve virale levenscyclus in U2-OS cellen werden uitgesloten via het kwantificeren van P41 & U94 mRNAs in dezelfde mRNA-preparaties. HHV-6 P41, een ‘I.E.’ viraal proteïne dat betrokken bleek bij de vroege fases van de virale replicatie, werd gedetekteerd na TSA-behandeling, wat onze eerdere gegevens ondersteunt. Ter zelfder tijd werd het viraal proteïne U94 niet gedetekteerd 48 h na TSA-behandeling, wat aantoont dat de virus-reaktivatie incompleet was. We toonden eerder ook een ontbreken van U94 transcriptie na HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen. Zodoende tonen onze resultaten dat partiële reaktivatie van HHV-6A genoeg is om mitochondriale fragmentatie te induceren die leidt tot een lagere ATP-inhoud gepaard met een verlaagde aangeboren immune respons.

Pro-inflammatoire mitochondriale architectuur kan worden overgedragen via gesekreteerde factoren van HHV-6 gereaktiveerde cellen

Er werd gesuggereerd dat een dergelijke gewijzigde respiratoire toestand van de cel, vergezeld van een afname qua mitochondriale oxidatieve fosforylatie en gefragmenteerde mitochondriale architectuur (M1 mitochondrieën) de pro-inflammatoire ‘cell-danger’ respons (CDR) verhoogt [Naviaux RK. Incomplete healing as a cause of aging: the role of mitochondria and the cell danger response. Biology (2019) 8: E27 /// Naviaux RK. Metabolic features and regulation of the healing cycle – A new model for chronic disease pathogenesis and treatment. Mitochondrion (2019) 46: 278-297] en een kritische rol vervult in de cellulaire verdediging tegen microbiële pathogenen. Om deze hypothese te testen, ontwikkelden we een test-systeem gebruikmakend van menselijke A549 long-carcinoom cellen. A549 cellen werden voor-behandeld met cultuur-supernatant van U2-OS cellen met en zonder geïntegreerd HHV-6A gedurende 48 h. De cellen werden dan grondig gewassen en belast met een RNA- (influenza-A) of DNA-virus (HSV-1) infektie […]. 24 h na infektie werden de cellen verzameld en de virale infektie werd gekwantificeerd via qRT-PCR voor één van de vroeger virale RNAs. Viraal M1 RNA werd gebruikt als indicator voor influenza-virus infektie en ICP0 RNA als indicator voor HSV-1 infektie. Onze resultaten toonden dat cultuur-supernatanten enkel van cellen met ciHHV-6 DNA dat getransaktiveerd was, bescherming konden bieden tegen HSV-1 én influenza-A. Indirecte effekten van virale reaktivatie medicijnen werden uitgesloten door cellen te gebruiken die geen latent viraal genoom droegen maar wel behandeld waren met het reaktiverend agens (TSA). Deze resultaten tonen dat cellen die latent HHV-6A DNA bevatten dat was getransaktiveerd door TSA, een krachtige aktiviteit sekreteren die kan worden overgedragen en een mitochondriale fragmentatie en pro-inflammatoire CDR induceren in naïeve responder-cellen, en zo sterke bescherming tegen DNA- én RNA-virus infekties verlenen. Het is echter niet nodig dat zowel de mitochondriale fragmentatie als de antivirale bescherming fenotypes van elkaar afhankelijk zijn en worden veroorzaakt door dezelfde factor.

Op basis van de bovenstaande resultaten, stelden we ons de volgende vraag: kan een cel-vrij cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen gelijkaardige veranderingen veroorzaken in de mitochondriale architectuur van nabijgelegen cellen? Daartoe verzamelden we cel-vrij cultuur-supernatant van U2-OS cellen na 2 dagen virale reaktivatie en incubeerden ze met verse U2-OS cellen zonder enig virus maar met expressie van een oplosbaar mitochondriaal GFP (mitoGFP) [Groen Fluorescerend Proteïne; gebruikt om andere proteïnen te labelen en visualiseren; merker voor virale reaktivatie]. Oplosmiddel-gecontroleerd behandeld cel-vrij cultuur-supernatant én cel-vrij cultuur-supernatant van niet virus-dragende cellen dienden als controle. Bij analyse van de mitochondriale architectuur, detekteerden we significante wijzigingen qua mitochondriale morfologie na incubatie van gezonde cellen met cel-vrij cultuur-supernatant verkregen van HHV-6A gereaktiveerde cellen. Er werd verhoogde mitochondriale fragmentatie, leidend tot gedaalde gemiddelde mitochondriale oppervlakte gezien in de cellen die waren behandeld met cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen t.o.v. controles. Dit effekt van virale reaktivatie op de mitochondriale morfologie van nabijgelegen cellen biedt een interessant scenario dat kan worden aangewend om M.E./CVS-pathofysiologie te bestuderen. Een transfereerbaar hypo-metabool fenotype in responder-cellen werd verder ondersteund door observaties omtrent verminderde intracellulaire ATP-inhoud. Een potentiële rol van verhoogde immuun-respons in responder-cellen die dient als een antivirale factor werd uitgesloten door het kwantificeren van de IFN-respons in deze cellen. Er werd een zeer milde (2-3 voudige) toename van IFN-β & TNF-α respons gedetekteerd in de U2-OS cellen met latent virus, onafhankelijk van TSA. Een mogelijke door viraal RNA geïnduceerde immuun-respons werd echter uitgesloten in U2-OS én A549 cellen omwille van het ontbreken van geïnduceerd IFIT-1 mRNA. Deze resultaten suggereren dat een onbekende en IFN-onafhankelijke transfereerbare factor van HHV-6A gereaktiveerde cellen een hypo-metabool, gefragmenteerd mitochondriaal fenotype kan induceren in responder-cellen.

HHV-6 & HHV-7 als potentiële oorzakelijke factor voor M.E./CVS

Aangezien onze in-vitro HHV-6A reaktivatie studies wezen in de richting van mogelijke gelijkenissen tussen virale reaktivatie en M.E./CVS-pathofysiologie, bekeken we de mogelijkheid van een virale oorzaak achter M.E./CVS bij 25 M.E./CVS-patiënten (n = 25) en 10 controles (n = 10) gebruikmakend van DNA qPCR. We argumenteerden dat een hoge virale lading dient te worden gedetekteerd in het bloed van M.E./CVS-patiënten om virale infektie te to associëren met de ziekte. Patiënten met een M.E./CVS-diagnose gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria werden willekeurig geselekteerd (leeftijd 21-59 jaar). De controles waren individuen zonder M.E./CVS alsook personen met andere klinische aandoeningen. Er werd DNA verkregen uit totaal bloed, geïsoleerde PBMCs, serum en haar-follikels van alle patiënten. De haar-folikels werden getest op viraal DNA om te zoeken naar potentiële iciHHV-6 [zie inleiding] gevallen, die een hoge virale lading dragen (één tot twee copieën per cel). Serum werd getest op extracellulair viraal DNA dat het resultaat zou kunnen zijn van viremie [aanwezigheid van virus in het bloed], suggestief voor een mogelijke virale aktivatie/infektie.

qPCR-studies detekteerden geen viraal DNA in geen enkel van de 25 M.E./CVS haar-follikel stalen. Twee controles hadden echter ca. 1 copie van HHV-6A of HHV-6B in hun haar-follikels, suggestief voor, respectievelijk, mogelijks iciHHV-6A en iciHHV-6B. Er werden gelijkaardige hoeveelheden viraal DNA gedetekteerd in bloed, PBMCs en serum van deze twee controles, wat latente virale integratie bevestigt. De afwezigheid van enig viraal mRNA bij deze twee gevallen bevestigde ook de latente virale toestand. Serum-stalen van deze twee werd gebruikt als controle in alle volgende experimenten. Drie M.E./CVS-patiënten bleken positief voor HHV-6 in totaal-bloed alsook PBMCs. Een andere M.E./CVS-patient bleek ook HHV-6 positief in PBMCs maar niet in totaal-bloed, dus slechts 16% (4 op 25) van de M.E./CVS-patiënten had HHV-6 DNA in het bloed. Een zeer lage hoeveelheid viraal DNA in het bloed kan te wijten zijn aan latent virus of potentiële virale aktivatie in zeer weinig cellen, die kunnen resulteren in het verminderen van viraal DNA en RNA in totaal-bloed. We hebben HHV-6 gecodeerd sncRNA-U14 geïdentificeerd als krachtige merker voor virale reaktivatie. Aangezien we verwachtten dat de hoeveelheid viraal RNA bij reaktivatie/infektie hoger kan zijn dan de hoeveelheid viraal DNA en dat het makkelijker detekteerbaar zou zijn, voerden we FISH-studies uit gebruikmakend van geconcentreerde PBMCs of bloedklonters van een deel van deze M.E./CVS-gevallen (n = 20). FISH-analyse verhoogde het aantal HHV-6 positieve gevallen tot 40% (8 op 20). FISH beeld-analyse bevestigde onze hypothese dat slechts een klein deel van de HHV-6 sncRNA-U14 droeg. Geen enkele van de controles, inclusief de twee iciHHV-6 gevallen, kleurde positief voor sncRNA-U14. 36% van de M.E./CVS-patiënten testte positief voor HHV-7 DNA, (gemiddeld 1.835-26.056 copieën viraal DNA per miljoen cellen). We karakteriseerden latente of aktieve HHV-7 infektie niet. Tot besluit: we detekteerden een zeer laag aantal copieën viraal genoom bij M.E./CVS-patiënten, niet genoeg om te duiden op een directe rol van aktieve virale infektie bij de ziekte.

Serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles induceerde veranderingen in de mitochondriale architectuur van gezonde cellen

Een laag aantal copieën van virus-DNA en -RNA in het bloed van M.E./CVS-patiënten leidde tot een verwarrend scenario waarbij de oorzakelijke rol van deze virussen bij ziekte-progressie moeilijk te begrijpen is. Een plausibele verklaring kan gelokaliseerde virale infektie/aktivatie in afgelegen delen van het lichaam zijn, waarbij enige geïnfekteerde cellen die geaktiveerd virus dragen worden vrijgesteld of enkele aktivatie-gemedieerde cellulaire factoren in het bloed worden afgegeven. Interessant is dat eerder werk [Fluge Ø et al; zie hierboven] heeft getoond dat serum van M.E./CVS-patiënten met ernstige ziekte het mitochondriaal oxidatief metabolisme en respiratie verhoogt in gezonde spiercellen onder belasting. We vroegen ons zodoende af of serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale morfologie in gezonde cellen op een zelfde manier kan wijzigen, zoals werd gezien bij HHV-6 infektie. We kweekten zodoende U2-OS cellen die oplosbaar mitoGFP hebben maar geen HHV-6, in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten alsook van controles. De mitochondriale dynamiek werd geanalyseerd via microscopie. Onze resultaten toonden verhoogde mitochondriale fragmentatie (gekwantificeerd door gemiddelde mitochondriale oppervlakte) in gezonde gecultiveerde cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten maar niét van gezonde controles. Directe kwantificatie van de mitochondriale oppervlakte in PBMCs van M.E./CVS-patiënten was niet nuttig, aangezien PBMCs kleiner zijn en een ronde vorm hebben, wat […] kwantificatie van de mitochondriale grootte hindert. Onze resultaten suggereren dat wijzigingen qua mitochondriale architectuur om een meer pro-inflammatoire vorm van de mitochondrieën te verkrijgen, een belangrijk kenmerk bij M.E./CVS-patiënten is en geen directe viral infektie in elke cel vereist.

Serum-transfereerbare aangeboren immuniteitbij M.E./CVS-patiënten

Aangezien verhoogde CDR een transfereerbaar kenmerk van HHV-6A reaktivatie in vitro was, testten we of een gelijkaardige pro-inflammatoire aktiviteit kon worden gemeten in het bloed of M.E./CVS-patiënten. Als test-systeem kweekten we A549 cellen in aanwezigheid van serum van 10 M.E./CVS-patiënten en 5 controles. Na 2 dagen blootstelling aan serum, werden de cellen gewassen en blootgesteld aan influenza-A of HSV-1 […]. Kwantificatie van virale infektie onthulde tot 99% afname van virale infektie voor zowel HSV-1 als influenza na behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten. Slechts 1 van de 10 M.E./CVS-patiënten had geen negatief effekt van influenza-A infektie. In feite zagen we een toename van 2,5 maal qua influenza-infektie in aanwezigheid van serum van deze patient. 4 van de 5 controle-sera gaf geen negatief effekt op influenza-A infektie. Slechts 1 van de controle-sera verminderde influenza-infektie tot 50%. Deze afname was echter vergelijkbaar met de mate van bescherming die we zagen in aanwezigheid van M.E./CVS sera. In het geval van HSV-1 infektie gaf geen enkel van de controle-sera bescherming. Statistische analyse toonde sterke significantie en uitstekende prestatie-karakteristieken voor de diagnostische bruikbaarheid van dit test-systeem. De positieve voorspellende waarde voor de influenza-A inhibitie test om serum van M.E./CVS-patiënten te identificeren was 0.9 (95% CI = 0.6-0.99; p = 0.017). De positieve voorspellende waarde voor de HSV-1 inhibitie test was 1.0 (95% CI = 0.72-1.0; p = 0.0003). Om de mogelijkheid te testen van een hypo-metabole toestand in de responder A549 cellen, hebben we intracellulaire ATP-waarden gemeten in A549 cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten of HCs. We zagen een lager intracellulair ATP in deze cellen. Omwille van de kleinere grootte van het staal konden we echter geen statistisch significant verschil qua ATP-inhoud zien.

Uitsluiten van TNF-α & IFN respons

Eén van de meest prominente kandidaat-molekulen die een sterke antivirale verdediging kan bieden, is IFN [interferon]. Vandaar dat we de IFN-respons testten in A549 cellen na behandeling met M.E./CVS- of HC-serum. We zagen een sterke afname qua mRNA-waarden van IFN-β, IFIT-1 & ICAM-1 in de A549 cellen in aanwezigheid van M.E./CVS-serum in vergelijking met HC-serum. Dan vroegen we ons af of de sekretorische IFN-respons in geïsoleerde PBMCs hoger is bij M.E./CVS-patiënten. Daartoe gebruikten we een andere groep van 22 M.E./CVS-patiënten en 22 HCs. Na behandeling met LPS vonden we lagere waarden qua gesekreteerd TNF-α (p < 0.01) & IFN-γ (p < 0.05) voor M.E./CVS-patient PBMCs vergeleken met die van HCs. Er werden geen significante verschillen gezien voor IL-1β & IL-5. Deze resultaten sluiten een potentiële rol uit voor IFN-respons wat betreft de mitochondriale fragmentatie en antivirale respons bij M.E./CVS-patiënten.

BESPREKING

HHV-6 infektie en reaktivatie wijzigen het gastheer-cel transcriptoom, inclusief het miRNAoom. miRNAs reguleren de intra-organel mechanismen, waarbij ze de job uitoefenen van het fijnregelen van de funkties die vereist zijn om de metabole vereisten van een orgaan of cel-type te vervullen. Onze ‘deep-sequencing’ benadering eerder onthulde belangrijke veranderingen in de expressie van een groot panel menselijke miRNAs na HHV-6A reaktivatie dat wijst op een brede waaier aan effekten op mitochondrieën en geassocieerde metabole funkties na virale aktivatie. Hier bestudeerden we kwantitatieve veranderingen in cellulaire en mitochondriale proteomica na HHV-6A reaktivatie en vonden meerdere significante wijzigingen sterk lijkend op M.E./CVS-pathofysiologie. PDP1 was ge-downreguleerd in respons op HHV-6A reaktivatie. PDP1 helpt bij het terugdraaien van de negatieve effekten van pyruvaat-dehydrogenase kinasen op pyruvaat-dehydrogenase. Een afname van PDP1 suggereert een mogelijke daling qua funkties van pyruvaat-dehydrogenase, die ook wordt gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten [Fluge Ø et al; zie hierboven].We vonden ook een daling van de SOD2-waarde die kan leiden tot hoge hoeveelheden ROS in de cel. We hebben eerder getoond dat HHV-6 infektie ROS induceert in gastheer-cellen en de expressie van of glutathion-reductase wijzigt. Deze observaties ondersteunen sterk een pathologische link tussen HHV-6 reaktivatie en M.E./CVS.

Hypo-metabole toestand van bloedcellen is een kenmerk van M.E./CVS [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-E5480]. Hoewel we geen metabole studies deden, heeft onze studie omtrent de mitochondriale architectuur in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles transfereerbare aktiviteit in M.E./CVS-serum onthuld die mitochondrieën fragmenteert en een gecoördineerde antivirale toestand in naïeve responder cellen in vitro. Deze test was zeer gevoelig (0.9-1.00; 95% CI = 0.6-1.0) en specifiek (0.8-1.0; 95% CI = 0.38-1.0) wat betreft de identificatie van serum van M.E./CVS-patiënten. In onze studies bleek virale reaktivatie alsook behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten een typische (M1) toestand van de mitochondrieën te induceren [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] in gastheer-cellen, wat ook gepaard ging met een sterke pro-inflammatoire toestand van de cel die de gastheer-cellen beschermde tegen binnenkomende DNA- én RNA-virussen, consistent met oxidatieve bescherming. Er zijn veel mogelijke manieren waarop een nabijgelegen gezonde cel een potentieel infektueus risico in de omgeving kan voelen. Een verhoogde IFN-respons van de virus-getransaktiveerde cellen kan resulteren in gesekreteerd IFN dat kan worden gevoeld door nabijgelegen cellen, leidend tot een hypo-metabole toestand. Er werd gerapporteerd dat meerdere type-I [o.a. IFN-α & IFN-β] en type-II [IFN-γ] IFNs [cytokinen], alsook IFN respons genen, sterk aanwezig zijn in het serum van M.E./CVS-patiënten [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158 /// Moss RB et al. TNF-alpha and Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Immunol. (1999) 19: 314-316]. We zagen echter geen toename qua IFN-γ in PBMCs van een kleine groep M.E./CVS-patiënten. Daarnaast zagen we een significante daling qua ISG-expressie na behandeling met M.E./CVS-serum. Vandaar dat het sterk antiviraal fenotype in ons test-systeem IFN-onafhankelijk lijkt te zijn. Gefragmenteerde mitochondrieën kunnen kapot mitochondriaal DNA in het cytoplasma en de extracellulaire ruimte afgeven, dat TLR-gemedieerde cytokine-produktie in nabijgelegen cellen kan induceren. Nieuw gesynthetiseerd, 8-hydroxyguanosine [biomerker voor oxidatieve stress] bevattend mitochondriaal DNA (ox-mtDNA) kan direct de assemblage van het NLRP3 inflammasoom [lees: ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie’]. aktiveren. Interessant is dat een overmaat aan bepaalde cytokinen ook het mitochondriaal metabolisme kan veranderen om verdere groei van pathogenen te voorkomen. Bepaalde complexe aandoeningen, zoals Amyotrofe Laterale Sclerose, zijn geassocieerd met een hypo-metabole toestand die wordt gekenmerkt door een kleinere grootte en hoeveelheid mitochondrieën.

Auto-immuniteit is courant bij M.E./CVS [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609]. Meerdere auto-antilichamen zijn in staat een pro-inflammatoire toestand te induceren in doelwit-cellen. Interessant: HHV-6 is gelinkt met meerdere auto-immune ziekten, inclusief Multipele Sclerose en Hashimoto thyroïditis. Auto-antilichamen tegen β2-adrenerge receptoren (β2R) bleken ge-upreguleerd in een subgroep M.E./CVS-patiënten [Loebel M, Fluge Ø et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52: 32-39]. Dergelijke antilichamen behoren tot een netwerk van natuurlijke antilichamen tegen adrenerge, acetylcholine (cholinerge) en andere GPCR-receptoren die dysfunktioneel bleken bij verscheidene auto-immune ziekten. [lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie’] Autonome ontregeling is een hoofdkenmerk van M.E./CVS. Er is bewijsmateriaal voor het feit dat de β2R-gemedieerde regulering van cytokinen door terbutaline [β₂-adrenerge receptor agonist] wordt verstoord in totaal-bloed immuuncellen van M.E./CVS-patiënten [Kavelaars A, Heijnen CJ et al. Disturbed neuroendocrine-immune interactions in Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. (2000) 85: 692-696]. Een artikel toonde dat influenza-replicatie wordt geïnhibeerd door α2-adrenerge stimulatie via cAMP-inhibitie. In tegenstelling daarmee staat β2R-stimulatie bekend cAMP te stimuleren. Zodoende: een onevenwicht van adrenerge stimulatie die cAMP-downregulering begunstigt, zou ook een verklaring kunnen zijn voor onze bevindingen. Gelijkenissen tussen transfer van HHV-6A reaktivatie cultuur-supernatant en M.E./CVS-serum suggereert echter een potentiële metabole rol naast andere mogelijkheden.

Het ontbreken van een sterke HHV-6 en HHV-7 infektie bij M.E./CVS-patiënten in meerdere studies heeft twijfel gezaaid omtrent de betrokkenheid van deze virussen bij M.E./CVS. In deze studie tonen we echter dat onvolledige HHV-6 reaktivatie, zelfs in een klein aantal latent geïnfekteerde cellen, er de oorzaak van is dat gereaktiveerde cellen een aktiviteit sekreteren die kan worden getransfereerd in serum, en mitochondriale fragmentatie veroorzaakt en een krachtig programma coördineert in reagerende cellen. Onze studies toonden dat enkel ‘I.E.’-gebeurtenissen, zoals de transcriptie van meerdere kleine niet-coderende virale RNAs, nodig waren om de aanmaak en sekretie van de mitochondriale fragmentatie-factor en transfereerbare antivirale toestand te triggeren. Er worden geen HHV-6 proteïnen gemaakt tijdens de onvolledige reaktivatie die hier in dit artikel wordt beschreven. Specifiek: er werd geen belangrijke wijziging qua HHV-6 replicatie geobserveerd. Dit verklaart het falen van anti-herpesvirus medicijnen in een subgroep patiënten, omdat het HHV-6 polymerase niet tot expressie komt tijdens een onvolledige virus-reaktivatie, en medicijnen gericht tegen het viraal DNA-polymerase dus geen viraal doelwit hebben.

De virus-reaktivatie experimenten die in deze studie werden beschreven, tonen dat een antivirale toestand ontstaat zowel in cellen met ongereaktiveerd en gereaktiveerd HHV-6. Dit lijkt in te gaan tegen de virale groei en kan daarom dus de korte-termijn voordelen van virale reaktivatie vanuit pathogeen standpunt niet verklaren, tenzij passieve transmissie van viraal genoom naar dochter-cellen na mitose een belangrijke rol speelt in HHV-6 genoom propagatie. Een gedaalde IFN-respons in virus-gereaktiveerde cellen kan een voordeel bieden voor het overleven van ‘I.E.’ RNAs in het gastheer-cel cytoplasma. In deze studie hebben we echter enkel de niet-produktieve transaktivatie-toestand van het virus getest. Produktieve virale infektie, met virion [compleet virus-partikel met een buitenste proteïnen-omhulsel (capside) en in de kern nucleïnezuur] -aanmaak en -afgifte, zou bijkomende virale factoren kunnen binnenbrengen die het vermogen van de cel schaden om een hypo-metabole toestand te ondergaan om succesvolle virus-groei te bewerkstelligen. Bijkomend: mitochondriale fragmentatie laat het virus dikwijls toe een persistente of latente toestand onder hypo-metabole toestand te verwerven.

In deze studie vonden we dat geen enkele van de 25 patiënten met M.E./CVS bewijs van een volledig gereaktiveerde HHV-6 of HHV-7 infektie in het perifeer bloed had en slecht 8 op 20 (40%; 95% CI = 0.19-0.64) vertoonden partiële reaktivatie gemeten via FISH-analyse van HHV-6 klein niet-coderend RNA U14 in totaal-bloed. Gebruikmakend van een in-vitro reporter-cel test, toonden we echter dat serum van M.E./CVS-patiënten een aktiviteit bevatte die mitochondriale fragmentatie, gedaalde mitochondriale ATP-produktie verzaakt, en een krachtige antivirale toestand induceert. In 2016 onthulde een metaboloom-analyse bij ME./CVS-patiënten een chemische signatuur die gelijkaardig is met de evolutionair bewaarde, hypo-metabole toestand die bekend staat als ‘dauer’ [zie Naviaux RK (2016) hierboven]. Deze ‘dauer’-achtige toestand bleef behouden door versperringen van genezing, voortkomend uit een abnormale persistentie van CDR. De CDR bleek direct betrokken bij zowel genezing als de biologie van het ouder-worden. In dit eerder werk, was de hypothese dat de metabole kenmerken van de CDR bij M.E./CVS-patiënten kan beschermen tegen bepaalde infekties, maar de antivirale aktiviteit werd niet direct getest [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] […]. Onze huidige gegevens tonen dat slechts een klein deel cellen latent geïnfekteerd moet zijn met HHV-6 om een sekretorisch fenotype te triggeren dat sterk beschermt tegen sommige RNA- en DNA-virussen in nabij- en af-gelegen cellen zonder HHV-6 DNA. Er dienen in de toekomst grotere studies met meerdere groepen M.E./CVS-patiënten van verschillende leeftijden te worden uitgevoerd, en met methodes die zowel produktieve als non-produktieve (incomplete) virale reaktivatie gebeurtenissen detekteren en kwantificeren. Bovendien zouden potentiële factoren die de mitochondriale dynamiek bij M.E./CVS-patiënten aantasten systematisch moeten worden geëvalueerd wat betreft hun vermogen om een krachtige antivirale toestand te induceren. Ons mitochondriaal, reporter-gebaseerd cel-systeem zal de mogelijkheid bieden om een diagnostische test voor M.E./CVS te ontwikkelen alsook een platform te bieden voor verdere identificatie van potentiële factoren die M.E./CVS-pathofysiologie definiëren.

Het effekt van de ernst van M.E.(cvs) op de cellulaire bioenergetische funktie

Onderstaande studie werd o.a. gefinancierd door ‘ME Research UK’. Het is een vervolg op een voorafgaande studie door dezelfde onderzoeksgroep (zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’). Dit team deed ook al opmerkelijke vondsten wat betreft de cellulaire energie-produktie: o.a. een daling van de cellulaire energie (ATP-waarden) en problemen betreffende de AMPK-signalisering (verantwoordelijk voor het regelen van de energie in cellen; zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’).

De belangrijkste bevindingen zijn dat mensen met matige M.E.(cvs) een mitochondriale dysfunktie hebben en dat patiënten met ernstige M.E.(cvs) mitochondriale én glycolyse-stoornissen vertonen.

De onderzoekers her-onderzochten resultaten van hun eerder werk waarbij ze M.E.(cvs)-patiënten in twee groepen opdeelden: mensen die matig (huisgebonden) en ernstig (bedlegerig) ziek zijn. Ze maten de respiratie (cellulaire ademhaling) in bloedcellen van patiënten en controles om te bepalen of er een verschil was wat betreft de mitochondriale funktie en metabole mechanismen zoals glycolyse. Mitochondrieën voorzien in het grootste deel van de energieproduktie in cellen en glycolyse is het proces waarbij glucose wordt verbruikt om energie te leveren.

Ze vonden dat de mitochondriale funktie voor beide groepen patiënten in dezelfde mate verminderd was, vergeleken met gezonde individuen. De gereduceerde mitochondriale werking was dus niet gelinkt met de ernst van de ziekte, wat suggereert dat het dus een gevolg is van de M.E.(cvs) en niét van deconditionering. Beide groepen patiënten vertoonden ook gedaalde ATP-gelinkte respiratie, wat wijst op een mogelijk defekt van metabole mechanismen (zoals glycolyse en/of OXPHOS (oxidatieve fosforylatie in de mitochondrieën), allebei belangrijke manieren van ATP (energie)-produktie bij M.E.(cvs)-patiënten. De verminderde output was verbonden met de ernst van de ziekte: er was een grotere daling in de ernstig aangetaste groep.

In hun voorafgaande studie hadden de researchers geen verschil gevonden tussen controles en patiënten voor de glycolyse. Door de patiënten echter te verdelen op basis van de ernst van de ziekte, kon worden vastgesteld dat patiënten die ernstig ziek zijn eigenlijk gereduceerde glycolyse vertonen, wat niet het geval is bij patiënten die matig ziek zijn. Dus: degenen die matig aangetast zijn hebben een mitochondriale stoornis, deze die ernstig aangetast zijn hebben zowel een mitochondriale stoornis als problemen met de glycolyse.

Dit betekent dat de post-exertionele malaise en vermoeidheid bij M.E.(cvs) kan worden veroorzaakt door een defekt in – of gerelateerd met – één van de metabole mechanismen (zoals glycolyse of OXPHOS). De studie beklemtoont ook het belang van onderzoek bij patiënten met ernstige M.E.(cvs) – waar mogelijk.

————————-

PLoS One Vol 15 (2020): e0231136

The effect of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS) severity on cellular bioenergetic function

Cara Tomas (1), Joanna L. Elson (1,2), Victoria Strassheim (3), Julia L. Newton (1,3), Mark Walker (1)

1 Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) bleek verbonden met abnormaliteiten qua mitochondriale funktie. In deze studie analyseerden we eerdere bio-energetica gegevens in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) gebruikmakend van nieuwe technieken om verschillen tussen groepen met M.E./CVS en gezonde controles verder op te helderen. We deelden onze M.E./CVS-groep op in twee aparte groepen met matig en ernstig aangetaste patiënten om te bepalen of ziekte-ernst geassocieerd is met de bio-energetische funktie in PBMCs. Beide M.E./CVS-groepen vertoonden een verminderde mitochondriale funktie t.o.v. een groep gezonde controles. Dit toont aan dat ziekte-graad niet correleert met mitochondriale funktie en dat zelfs degenen met een milde vorm van de ziekte mitochondriale dysfunktie blijken te vertonen. Vergelijkingen ontworpen door een andere research-groep hebben ons in staat gesteld de mate van ATP-gelinkte respiratie en glycolytische parameters te berekenen. Parameters van de glycolytische funktie werden berekend door respiratoire verzuring in rekening te brengen. Dit onthulde dat ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten een hogere mate van respiratoire verzuring hebben en toonde het belang aan van het meenemen van de respiratoire verzuring bij het berekenen van parameters van de glycolytische funktie. Analyse van eerder gepubliceerde glycolyse-gegevens, na het in rekenschap brengen van de respiratoire verzuring, toonde dat ernstig aangetaste patiënten gedaalde glycolyse hebben vergeleken met matig aangetaste patiënten en gezonde controles. De ATP-gelinkte respiratie werd ook berekend en bleek lager bij beide M.E./CVS-groepen. Deze studie toont dat ernstig aangetaste patiënten mitochondriale en glycolytische stoornissen hebben, wat hen onderscheidt van matig aangetaste patiënten die enkel een mitochondriale stoornis hebben. Dit kan verklaren waarom deze patiënten zich manifesteren met een ernstiger fenotype.

Inleiding

[…]. Onze groep heeft eerder extracellulaire flux analyse aangewend om te tonen dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten een significant lagere mitochondriale funktie hebben dan gezonde controles [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. Bio-energetische profilering gebruikmakend van bloedstalen is geen nieuwe techniek en werd aangewend in andere studies die een reeks ziekte-types bekeken. De technieken vereist voor onderzoek van de mitochondriale funktie in bloedcellen zijn minimaal invasief maar leveren een weelde aan gegevens die toelaten de pathofysiologie van ziekte verder te begrijpen. Bloedcellen vindt men systemisch, daarom wordt gedacht dat het bio-energetisch profiel van deze cellen representatief is voor het ganse lichaam. Er dient echter nog te worden bepaald of mitochondriale veranderingen in het bloed een oorzaak of gevolg zijn van ziekte. De M.E./CVS-groep in onze eerdere studie omvatte matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten maar bekeek niet of de achteruitgang qua bio-energetische funktie gecorreleerd was met ziekte-ernst. In deze studie voerden we een her-onderzoek uit van eerder gepubliceerde gegevens om de rol na te gaan van de mitochondriale en glycolytische funktie in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) omtrent de ziekte-ernst bij M.E./CVS. Er zijn eigenlijk zeer weinig studies op gebied van M.E./CVS-research die ernstig aangetaste patiënten omvatten. Dit is te wijten aan het feit dat dergelijke patiënten als ‘moeilijk te bereiken’ worden geacht, gezien ze aan huis gebonden of zelfs bedlegerig zijn. Het onvermogen van klinici en onderzoekers om toegang te krijgen tot deze patiënten, betekent dat ze uitgesloten blijven van de meerderheid van de M.E./CVS-studies ondanks de dringende klinische nood. Dit artikel is de eerste studie die de cellulaire bio-energetica bekijkt bij patiënten met ernstige M.E./CVS en onderzoek of ze verschillen van deze die matig aangetast zijn.

Deze studie bekijkt ook de relatieve bijdrage van glycolytische verzuring aan de algemene extracellulaire verzuring en hoe het een impact heeft op de berekening van glycolytische parameters. De glycolyse-stress-test van Agilent Technologies, die wordt gebruikt om de mate van extracellaire verzuring (ECAR) te meten en de glycolyse in cellen te berekenen, is gebaseerd op de veronderstelling dat de meerderheid van de protonen [H⁺; verhoging => verzuring] die naar het extracellulair milieu gaan, geproduceerd worden door de omzetting van pyruvaat naar lactaat en de daaropvolgende uitdrijving van protonen uit de cel. In sommige cel-types is dit wellicht echter niet het geval. Er werd eerder aangetoond dat het percentage bijdrage van respiratoire verzuring enorm kan variëren tussen cel-types met resultaten die een percentage bijdrage 0-100% voor verschillende cel-types tonen [Mookerjee SA et al. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta (2015) 1487: 171-81]. Respiratoire verzuring wordt veroorzaakt door de produktie van CO₂ bij substraat-oxidatie. Het CO₂ wordt gehydrateerd tot koolzuur dat daarna dissocieert tot bicarbonaat en een proton. Bij de glycolyse-stress-test kan respiratoire verzuring verkeerdelijk worden toegeschreven een cellulaire glycolyse aangezien de glycolyse-stress-test geen onderscheid kan maken tussen glycolytische verzuring en respiratoire verzuring wanneer deze wordt aangewend zoals voorgeschreven door de producent. Het gebruik van een vergelijking beschreven door Mookerjee SA et al. Laat toe het percentage bijdrage van respiratoire en glycolytische verzuring in rekening te brengen bij het berekenen van glycolytische parameters bij de glycolyse-stress-test.

Bijkomend voerden we een berekening uit van de ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van de M.E./CVS-groep en de gezonde controles, ontworpen door Mookerjee SA et al., die ons toeliet de individuele bijdrage van glycolyse en oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) aan cellulaire ATP-gelinkte respiratie te bepalen [Mookerjee SA et al. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry (2017) 292: 7189-202]. We waren dan in staat te onderzoeken hoe extracellulaire glucose-concentraties het evenwicht tussen glycolytisch en OXPHOS-afgeleid ATP beïnvloedt.

Dit werk beschrijft nieuw onderzoek omtrent het funktioneren van energie-produktie mechanismen in M.E./CVS-cellen en is uniek omwille van de inclusie van een groep ernstig aangetaste patiënten in bio-energetica studies voor de eerste keer.

Materialen & methodes

Informatie over de deelnemers

De M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose […] op basis van de Fukuda criteria maar alle patiënten voldeden ook aan de Canadese Consensus Criteria. […]

Er werden twee groepen M.E./CVS-patiënten met verschillende ziekte-graad opgenomen deze studie. De mild aangetaste groep had verminderde mobiliteit omwille van de ziekte maar ze waren in staat de lokale ‘fatigue clinic’ te bezoeken. De meeste van de matig aangetaste patiënten waren in staat zonder hulp naar de kliniek te wandelen maar een klein deel had ondersteuning (krukken of rolstoel) nodig. De ernstige aangetaste groep was aan huis gebonden of bedlegerig, en niet in staat de kliniek te bezoeken, zelfs niet met een rolstoel. […]. De ogenschijnlijk willekeurige categorieën worden gebruikt omwille van de afwezigheid van biomerkers  […].

[…] We waren er ons bewust van hoe vermoeiend een bloedafname/bezoek voor de patiënten kan zijn en besloten daarom, om het effekt op de patiënten minimaal te houden, dat er geen verdere informatie tijdens het bezoek zou worden verzameld. Daarom kunnen we de patiënten-demografie tussen de groepen niet vergelijken.

PBMC-preparatie

[…] Alle bloedstalen werden verwerkt binnen 4 uur na afname.

Extracellulaire flux analyse

[…] Voor de mitochondriale respiratie werd het zuurstof-verbruik (OCR) van cellen gemeten (Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser). […] Als glycolytische parameters werd de extracellulaire verzuring (ECAR) van cellen gemeten (Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser). […] [voor uitleg zie link in onze inleiding]

Extracellulaire verzuring analyse

Extracellulaire verzuring is toe te schrijven aan respiratoire of glycolytische aktiviteit. Deze twee parameters dragen bij tot de totale protonen-produktie (PPR_tot) gemeten in cellen. PPR is ECAR gedeeld door de buffer-capaciteit van het milieu dat in het experiment wordt gebruikt […]. In deze studie hebben we rekening gehouden met de glycolytische verzuring bij het berekenen van cellulaire glycolytische parameters. De glycolytische verzuring werd berekend via de formule van Mookerjee SA et al. […]. De respiratoire verzuring (PPR_resp) is de PPR_tot gemeten via de extracellulaire flux analyser min de PPR_glyc. Deze studie keek ook naar de ATP-gelinkte respiratie van cellen gebruikmakend van de stalen van het eerder gepubliceerd werk. We berekenden de totale ATP-gelinkte respiratie, glycolyse ATP-gelinkte respiratie, OXPHOS ATP-gelinkte respiratie en % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. [ATP_glyc & ATP_OX werden ook berekend via formules van van Mookerjee et al.] ATP_tot = ATP_glyc + ATP_OX

Statistiek

[…] Significantie: p < 0.01.

Resultaten

Mitochondriale funktie is verstoord bij M.E./CVS ongeacht de ziekte-ernst

De cellulaire respiratie gegevens getoond in Tomas C et al. [zie hierboven] werden opnieuw geanalyseerd om te bepalen of de ziekte-ernst de mitochondriale funktie beïnvloedt. Op basis van de eerder gepubliceerde gegevens maakten we een onderscheid tussen matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten, en vergeleken mitochondriale parameters van de twee groepen en ook de twee patiënten-groepen met de gezonde controles cohort.

Voor de cellulaire respiratoire parameters bleken er verschillen tussen de groepen voor de parameters van de basale respiratie, ATP-gelinkte respiratie, proton-lek, maximale respiratie en reserve-capaciteit (p < 0.001). Wanneer we de groepen verder statistisch analyseerden, bleek dat de matig én ernstig aangetaste groepen significant lager waren wat betreft alle vijf de parameters dan de gezonde controles (p ≤ 0.05). Dit komt overéén met de eerder gepubliceerde gegevens die toonden dat de M.E./CVS-groep als geheel significant lagere waarden had voor deze vijf parameters.

De parameters gemeten via deze test zijn onderling afhankelijk omdat sommige uit andere worden berekend. Om te bekijken of de verbanden tussen de parameters verschillen tussen de groepen van deze studie, voerden we multi-variate analyse uit. […]

De correlatie tussen basale respiratie en ATP-gelinkte respiratie is zeer sterk voor alle drie de groepen. Dit toont dat de strakke koppeling tussen deze twee parameters wordt behouden, zelfs bij de ernstige aangetaste patiënten. Sommige parameters van de mitochondriale stress test worden berekend op basis van andere parameters, dus verbanden tussen sommige parameters kunnen worden verwacht, bv. basale respiratie bestaat uit ATP-gelinkte respiratie en proton-lek.

Te samen tonen de gegevens van de parameter-correlaties dat de verbanden tussen sommige parameters verschillen tussen de drie groepen waarbij de enige parameters die consistent gecorreleerd zijn in alle drie de groepen basale respiratie en ATP-gelinkte respiratie zijn. Er is meer experimenteel werk vereist om te onderzoeken waarom en hoe bepaalde verbanden ontregeld worden in M.E./CVS PBMCs.

Glycolytische verzuring is lager bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten

Het percentage bijdrage van glycolytische verzuring in PBMCs werd berekend voor de gezonde controles, de totale M.E./CVS-groep, en de matig en ernstig aangetasten.

De glycolytische verzuring in PBMCs van de M.E./CVS-groep als geheel werd vergeleken met die van de gezonde controles. Er werden significante verschillen gezien wat betreft het percentage bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale extracellulaire verzuring tussen de twee groepen M.E./CVS-patiënten, met een lagere bijdrage van glycolytische verzuring t.o.v. gezonde controles (p < 0.001). Wanneer de M.E./CVS-groep echter wordt opgedeeld in matig en ernstig aangetaste groepen, wordt het duidelijk dat de resultaten voor de ganse M.E./CVS-groep worden scheefgetrokken door de resultaten van de ernstig aangetasten. Er is een afname van het percentage van de extracellulaire verzuring dat kan worden toegeschreven aan glycolytische verzuring in de PBMCs van de ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten vergeleken met de gezonde controles en de matig aangetaste M.E./CVS-patiënten (p ≤ 0.002). De afname qua bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale extracellulaire verzuring in de ernstig aangetaste groep is te wijten aan een groter percentage respiratoire verzuring. De matig aangetasten en gezonde controles hebben vergelijkbare waarden qua glycolytische verzuring (p = 0.257). Er dient te worden opgemerkt dat het een subgroep van ernstig aangetaste patiënten is die een gedaalde glycolytische verzuring vertoont, waarbij veel van de ernstig aangetasten vergelijkbare waarden vertoont met de matig aangetasten. CO₂ verzuring, of respiratoire verzuring, draagt substantieel bij tot de totale cellulaire verzuring in PBMCs van ernstig aangetasten en daarom dient daar rekening mee te worden gehouden wanneer men ECAR in PBMCs meet. Dit toont het belang aan van het onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische verzuring […].

Glycolyse is lager bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten

Onze groep heeft eerder gegevens gepubliceerd op basis van PBMCs van M.E./CVS en gezonde controles om de glycolytische funktie van cellen te vergelijken. Glycolyse werd berekend via het meten van de extracellulaire verzuring na toediening van glucose aan de celllen, aangezien glycolyse protonen produceert die worden getransporteerd naar het extracellulair milieu. Onze eerdere publicatie toonde dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles een vergelijkbare glycolyse vertonen. We vonden hier hogere waarden qua respiratoire verzuring in een subgroep patiënten met ernstige M.E./CVS; wat betekent dat de oorspronkelijke resultaten de glycolytische aktiviteit in de cellen misschien niet accuraat weerspiegelen, aangezien een minimale bijdrage van respiratoire verzuring werd verondersteld. Her-analyse van de eerder gepubliceerde gegevens, om de echte bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale ECAR in rekening te brengen, toonde dat er geen significante verschillen waren tussen de PBMCs van de ganse M.E./CVS-groep en de groep gezonde controles voor geen enkele van de glycolytische parameters berekend via een glycolyse stress test (p ≥ 0.263).

Er waren geen significante verschillen qua glycolyse tussen de groepen wanneer de M.E./CVS-groep werd opgedeeld in matig en ernstig aangetasten. Dit is consistent met de eerdere resultaten van ons team, waarbij geen significante verschillen qua glycolyse werden gevonden wanneer alle M.E./CVS-patiënten als één enkele groep werden geanalyseerd [ref. zie hierboven]. Wanneer de matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten echter werden gescheiden en er rekening werd gehouden met de respiratoire verzuring, bleek de ernstig aangetaste groep significant lagere waarden qua glycolyse te hebben dan de matig aangetaste en de gezonde controles (p ≤ 0.036). Deze significante verschillen tussen groepen wordt veroorzaakt door de lagere waarden qua glycolytische verzuring die wordt gezien bij de ernstig aangetaste groep. Wanneer de M.E./CVS-groep werd opgedeeld in matig en ernstig aangetasten, en beoordeeld voor en na aanpassing voor respiratoire verzuring, waren er geen verschillen tussen de groepen voor de andere drie glycolyse-parameters – glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring.

ATP-gelinkte respiratie

De ATP-gelinkte respiratie van PBMCs werd berekend voor cellen van gezonde controles, en patiënten met matige en ernstige M.E./CVS. Er werden vier aspecten gemeten van ATP-gelinkte respiratie in ingevroren PBMCs geïncubeerd in laag (1 mM) en hoog (10 mM) extracellulair glucose – totale ATP-gelinkte respiratie (ATP_tot); glycolysie ATP-gelinkte respiratie (ATP_glyc); OXPHOS ATP-gelinkte respiratie (ATP_OX); % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie. Vergelijkingen tussen de drie groepen toonden dat ernstig aangetaste groep significant lagere waarden hadden dan de gezonde controles voor alle vier de parameters bij zowel laag- en hoog-glucose (p ≤ 0.024). De matig aangetasten bleken significant lager dan de gezonde controles voor drie van de vier parameters (ATP_glyc; ATP_OX; ATP_tot) bij zowel laag- en hoog-glucose (p ≤ 0.007) maar de groepen waren niet verschillend wat betreft % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie (p = 0.271). In laag-glucose, wanneer de matig en ernstig aangetasten werden vergeleken, waren er geen significante verschillen (p ≥ 0.126). In hoog-glucose werden echter verschillen tussen de twee groepen gezien: de patiënten met ernstige M.E./CVS hadden een significant lagere ATP_tot (p < 0.001), ATP_glyc (p = 0.002) en % bijdrage (p = 0.007). Wanneer we keken naar het effekt van glucose-concentratie op ATP-gelinkte respiratie parameters bij de drie groepen, zagen we significante verschillen bij de gezonde controles en matig aangetasten. Bij de groep gezonde controles veroorzaakte de incubatie van cellen in laag-glucose dalingen qua ATP_tot, ATP_glyc en % bijdrage t.o.v. incubatie in hoog-glucose (p ≤ 0.018). De ATP_OX nam toe in cellen van gezonde controles geïncubeerd in laag-glucose (p < 0.001). Bij de matige aangetaste M.E./CVS-patiënten bleken ATP_glyc en % bijdrage significant verminderd in laag-glucose (p ≤ 0.049). De ernstig aangetaste groep vertoonde geen significante verschillen wat betreft ATP-gelinkte respiratie van cellen geïncubeerd in laag- en hoog glucose (p ≥ 0.744).

Bespreking

In deze studie analyseerden we gegevens die eerder door onze groep werden gepubliceerd, om te bekijken hoe ziekte-ernst bij M.E./CVS verbonden is met de mitochondriale en glycolytische funktie in PBMCs. We hebben ook ATP-gelinkte respiratie en glycolyse berekend gebruikmakend van nieuwe technieken. Eerdere studies hebben getoond dat er een correlatie is tussen bloedcel bio-energetische capaciteit en zowel aërobe als anaërobe aktiviteit [bij overgewicht en ouderen].

Er waren geen verschillen tussen de matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-groepen voor enige cellulaire respiratoire parameters. Dit suggereert dat mitochondriale funktie van PBMCs niet correlereert met ziekte-ernst bij M.E./CVS en dat zelfs degenen die matig zijn aangetast een stoornis van de bio-energetische funktie hebben. Het ontbreken van een associatie tussen ziekte-ernst en mitochondriale funktie suggereert dat de eerder gerapporteerde vermindering qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS niet te wijten is aan deconditionering. Als de bij M.E./CVS gerapporteerde gedaalde mitochondriale werking te wijten zou zijn deconditionering zou men verwachten een significant lagere mitochondriale werking te zien bij de ernstig aangetaste groep t.o.v. de matig aangetasten.

Noch is het te wijten aan de aanwezigheid van schadelijke mtDNA-varianten. Een artikel vond geen mtDNA-verschillen tussen matig en ernstig aangetaste patiënten ondanks verschillen tussen deze twee groepen en controles [Schoeman EM, Newton J et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18: 29] Dit werk levert dus belangrijk experimenteel bewijsmateriaal ter ondersteuning van één van de weinige genetische studies uitgevoerd bij M.E./CVS-patiënten.

We onderzochten de relatieve bijdragen van glycolytische en respiratoire verzuring aan de globale extracellulaire verzuring in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Glycolytische verzuring bleek significant lager in de M.E./CVS-groep. Dit suggereert dat de bijdrage van respiratoire verzuring bij M.E./CVS PBMCs significant hoger is dan bij controle-cellen. Wanneer de M.E./CVS-groep echter werd opgedeeld in matig en ernstig aangetaste patiënten, konden we tonen dat de ernstig aangetaste patiënten degenen waren met significant lagere glycolytische verzuring, terwijl de matig aangetaste groep glycolytische verzuring waarden had vergelijkbaar met deze van gezonde controles. Dit toont het belang van een accurate bepaling van glycolytische verzuring voor het berekenen van glycolytische parameters. We hebben getoond dat wanneer de glycolyse wordt berekend zoals de producent van de test aangeeft, er geen significante verschillen bestaan tussen controles, matige aangetaste patiënten en ernstig aangetaste patiënten. Wanneer we echter de respiratoire verzuring in rekening brengen, zien we dat glycolyse significant lager is bij de groep met ernstige M.E./CVS. De hier gepresenteerde gegevens komen overéén met een metabole profilering studie die een daling qua specifieke metabole merkers in bloed en urine van M.E./CVS-patiënten toonde, wijzend op een reductie qua glycolytische aktiviteit bij M.E./CVS [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39]. Er dient echter voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van deze resultaten aangezien de lagere glycolytische funktie representatief kan zijn voor deconditionering in de ernstig aangetaste groep. Om dit te bevestigen of verwerpen zijn verdere studies nodig.

Wanneer we de ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles onderzochten, en het effekt van de glucose-concentratie op de ATP-gelinkte respiratie, vonden we significante verschillen tussen de gezonde controles en de M.E./CVS-groepen. Er werd lagere ATP-gelinkte respiratie gezien bij de matig én de ernstig aangetaste M.E./CVS-groepen vergeleken met de controles. Dit weerspiegelt eerder gepubliceerd werk, dat berekeningen van een mitochondriale stress test gebruikte om ATP-gelinkte respiratie te benaderen. Deze resultaten geven aan dat er een defekt in de glycolyse en/of OXPHOS-mechanisme is dat patiënten-cellen verhindert voldoende ATP te produceren. Dit kan bijdragen aan de vermoeidheid en post-exertionele malaise die hoofdkenmerken zijn van M.E./CVS. De ernstig aangetaste groep had een significant lagere ATP_glyc en ATP_tot dan de matig aangetaste groep in hoog-glucose. De verschillen qua ATP-gelinkte respiratie tussen de twee patiënten-groepen kan verklaren waarom de ernstig aangetaste patiënten bedlegerig worden door de ziekte, aangezien ze een zelfs lagere ATP-gelinkte respiratie hebben dan de matig aangetasten. Of de verschillen een oorzaak of gevolg van de ziekte zijn, dient echter nog te worden bepaald.

We hebben getoond dat verschillen in glucose-concentratie de ATP-produktie uit glycolyse en OXPHOS beïnvloeden in cellen van gezonde controles. De veranderingen in controle PBMCs in laag-glucose volgden het patroon dat we hypothiseerden – een afname van de glycolyse en een toename van het OXPHOS-gebruik. Dit is omdat de lagere glucose-concentratie cellen dwingt om OXPHOS in grotere mate te gebruiken omwille van de hogere opbrengst van ATP per glucose-molekule t.o.v. bij glycolyse. De matig aangetaste patiënten vertonen dezelfde trends voor alle vier de parameters als de controles, hoewel niet alle verschillen significant waren. De ernstig aangetaste groep vertoonde heel weinig verschil tussen laag- en hoog-glucose. We hebben getoond dat PBMCs van controles en matig aangetasten glycolytisch gedragen in hoog-glucose maar verschuiven naar OXPHOS als overheersende energie-bron in laag-glucose. Cellen van ernstig aangetaste patiënten produceren hun ATP voornamelijk via cellulaire respiratie (OXPHOS) in zowel laag- als hoog-glucose met zeer weinig wijziging qua energie-produktie tussen de twee glucose-condities. Het kan zijn dat M.E./CVS-patiënten, bijzonderlijk de ernstig aangetaste groep, reeds maximaal ATP produceren bij hoog-glucose, daarom heeft het verlagen van de glucose-concentratie geen effekt van ATP-gelinkte respiratie. Dit kan duiden op abnormaliteiten in factoren zoals glucose-transport, glycolytische/ OXPHOS enzyme-aktiviteit of AMPK funktie, wat eerder werd aangetoond abnormaal te zijn in M.E./CVS skeletspier-cellen [Brown AE, Newton JL et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Het kan ook zijn dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten minder in staat zijn zich aan te passen of trager adapteren in laag-glucose.

Er zijn meerdere beperkingen omtrent deze studie. PBMCs zijn een zeer heterogene cel-populatie die bestaat uit een aantal verschillende cel-types met verschillende bio-energetische vereisten. Bij deze studie hebben we PBMCs gebruikt i.p.v. de populatie op te delen in subpopulaties. Dit omwille van het hoog aantal cellen dat vereist is om elke PBMC-subpopulatie te bekijken. Als echter ethische goedkeuring kan worden verkregen om genoeg cellen te verkrijgen, dan zou deze opdeling een voordeel kunnen bieden. Toekomstige studies zouden moeten kijken naar het lipiden-metabolisme (wat in andere studies gewijzigd bleek bij M.E./CVS [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight( 2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480 /// Germain AR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9]), en of het verschilt tussen de groepen en hoe het verband houdt met de resultaten wat betreft glucose-metabolisme die we hier zagen. De beperking van het enkel onderzoeken van het glucose-metabolisme in deze cellen betekent dat een globale beoordeling van cellulaire bio-energetica nog niet kon gebeuren. Er zou waardevolle informatie kunnen worden verkregen via het herhalen van dit type experimenten en analyses in andere cel-types om te zien of deze veranderingen specifiek zijn voor PBMCs of meer systemisch. Dit werk zou ook voordeel kunnen halen uit het bestuderen van andere ziekte-groepen met vermoeidheid als kern-symptoom om te bepalen of de bio-energetische veranderingen een merker van de ziekte M.E./CVS of van het symptoom vermoeidheid zijn. Hoewel in deze studie duidelijke verschillen tussen de groepen werden geïdentificeerd, zelfs gebruikmakend van robuuste en conservatieve statistische technieken, zouden grotere aantallen deelnemers, inclusief stalen van meerdere internationale lokaties, de bevindingen nog meer kracht geven.

Besluiten

Het is van vitaal belang dat mensen met verschillende ziekte-graden worden opgenomen M.E./CVS-studies als we vooruitgang willen boeken naar een beter begrip omtrent de pathofysiologie van of M.E./CVS. De inclusie van de twee ziekte-ernst patiënten-groepen heeft ons toegelaten verschillen en gelijkenissen te identificeren tussen personen met een matige en ernstige vorm van de ziekte. Het ontbreken van een associatie tussen ziekte-ernst en mitochondriale funktie die hier werd getoond, geeft aan dat abnormaliteiten in mitochondriale funktie een kenmerk zijn van de ziekte, ongeacht de ernst. De verminderde glycolytische funktie bij de ernstig aangetaste patiënten-groep die we hebben geïdentificeerd is ook vitaal, aangezien het toont dat deze patiënten een glycolytische stoornis hebben naast de mitochondriale problemen, wat kan verklaren waarom deze patiënten een ernstiger fenotype vertonen. Lagere waarden wat betreft zowel mitochondriale als glycolytische funktie kunnen worden veroorzaakt door een hypo-metabole toestand bij M.E./CVS die gelinkt is met ziekte-ernst. Dit werk heeft ons begrip omtrent cellulaire energie-produktie abnormaliteiten bij M.E./CVS en hoe dit de ziekte-ernst beïnvloedt, uitgebreid.

Veranderd T-cel metabolisme & cytokine-verbanden bij M.E.(cvs)

Hier volgt een studie door de groep van Prof. Maureen Hanson, ondersteund door het ‘M.E./CVS Collaborative Research Network’, een consortium van meerdere instituten en centra van het NIH. De bevindingen suggereren dat specifieke immuun-cellen van mensen met M.E.(cvs) verstoringen vertonen wat betreft de manier waarop ze energie produceren. Deze research biedt bijkomend bewijs voor de rol van het immuunsysteem bij de ziekte.

De onderzoeksgroep rond Donald Staines (uit Australië) publiceerde reeds preliminaire resultaten voor een reductie van de glycolytische reserve (meting die aangeeft hoe dicht de glycolyse – een belangrijke vorm van energie-produktie in de cel – bij het theoretisch maximum van de cel zit) in rustende geïsoleerde NK-cellen (een type immuun-cellen) van M.E.(cvs)-patiënten (referentie – Nguyen T et al. – zie tekst) en dat leidde hen er toe te postuleren dat deze NK-cellen het wellicht moeilijk hebben de glycolyse aan te zwengelen als ze (immunologisch) belast worden of bij stress. Ze besloten dat dit verder dient te worden onderzocht.

Anderen (zie Tomas C et al. in de tekst) vonden ook al verminderde mitochondriale respiratie (“cellulaire ademhaling” in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs; mix van lymfocyten – T-cellen, B-celen & NK-cellen – en monocyten) van mensen met M.E.(cvs) maar geen verschil qua glycolyse.

Men weet echter nog niet hoe het metabolisme van specifieke immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast is bij M.E.(cvs). Daarom werd hier werd het metabolisme onderzocht van CD4 T-cellen (die andere immuun-cellen alarmeren bij invaderende pathogenen) en CD8 T-cellen (die geïnfekteerde cellen aanvallen). Het team van Hanson vond geen significante verschillen wat betreft mitochondriale ademhaling tussen de cellen van gezonde individuen en mensen met M.E.(cvs), in rust of na aktivatie. De glycolyse (een minder efficiënte methode van energie-produktie) bleek echter ontregeld te zijn: vergeleken met die van gezonden, vertoonden CD4 en CD8 cellen van M.E.(cvs)-patiënten een mindere mate van glycolyse. Daarnaast vertoonden M.E.(cvs) CD8 cellen minder glycolyse na aktivatie. Prof. Hanson stelt: “Ons werk toont het belang aan van het bekijken van verschillende types immuun-cellen met verschillende taken, i.p.v. ze allemaal te samen te onderzoeken; dit kan problemen verbergen die specifiek zijn voor afzonderlijke cellen.”

Haar groep bekeek ook de grootte van de mitochondrieën en het membraan-potentiaal, indicatoren voor de gezondheid van T-cel mitochondrieën. Bij gezonde controles en M.E.(cvs)-patiënten bleken deze van CD4 cellen niet significant te verschillen qua grootte of funktie. Deze van CD8 cellen van mensen met M.E.(cvs)-patiënten vertoonden een verlaagd membraan-potentiaal t.o.v. gezonde cellen (in rust en geaktiveerd).

Ook verbanden tussen cytokinen en T-cel metabolisme werden onderzocht. Men vond verschillende, en dikwijls tegengestelde, patronen tussen gezonde cellen en die bij M.E.(cvs). Dit suggereert veranderingen in het immuunsysteem. Daarnaast bleek (onverwacht) dat de aanwezigheid van cytokinen die inflammatie veroorzaken correleerden met een verminderd metabolisme in T-cellen.

————————-

Journal of Clinical Investigation (Pre-print December 2019)

Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients exhibit altered T cell metabolism and cytokine associations

Alexandra H. Mandarano (1), Jessica Maya (1), Ludovic Giloteaux (1), Daniel L. Peterson (2), Marco Maynard (3), C. Gunnar Gottschalk (3) & Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

2 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

3 Simmaron Research Institute, Incline Village, NV, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ingewikkelde ziekte waarvan het mechanisme niet is gekend. Er is steeds meer erkenning voor de rol van immuun en metabool dysfunktioneren. M.E./CVS heeft zich historisch gepresenteerd in uitbraken, heeft dikwijls een griep-achtige aanvang en resulteert in inflammatoire symptomen. Patiënten lijden onder ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. Er is weinig bekend omtrent het metabolisme van specifieke immuun-cellen van M.E./CVS-patiënten. Om het immune metabolisme bij M.E./CVS te onderzoeken, isoleerden we CD4⁺ & CD8⁺ T-cellen van 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles. We analyseerden de glycolyse en mitochondriale respiratie van rustende en geaktiveerde T-cellen, samen met merkers verbonden met het cellulair metabolisme, en plasma-cytokinen. We vonden dat M.E./CVS CD8⁺ T-cellen een gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal hebben vergeleken met gezonde controles. Zowel CD4⁺ als CD8⁺ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vertoonden verminderde glycolyse in rust, terwijl CD8⁺ T-cellen ook verminderde glycolyse na aktivatie. Bij M.E./CVS-patiënten bleken significante correlaties tussen metingen van het T-cel metabolisme en hoeveelheid plasma-cytokinen die verschilden van de gezonde controles. Onze gegevens wijzen er op dat patiënten een verstoord T-cel metabolisme vertonen dat consistent is met immune veranderingen bij M.E./CVS die het mechanisme achter de ziekte kunnen ophelderen.

Inleiding

[…]

Historisch zijn er wereldwijd clusters van uitbraken van M.E./CVS geweest […]. Om die reden, en de aanvang van de ziekte en de symptomen, is de potentiële identificatie van een pathogeen een research-prioriteit. Desondanks is er nog geen viraal, bakterieel of eukaryoot pathogeen geïdentificeerd als oorzaak voor de ziekte.

Het karakteriseren van het immuunsysteem is een alternatieve methode om mogelijke immune of infektueuze componenten bij M.E./CVS te exploreren. Er is substantieel bewijsmateriaal voor het feit dat het immuunsysteem een rol speelt en ontregeld is. Veel studies hebben de hoeveelheden van cytokinen of immuun-cel subpopulaties onderzocht, dikwijls met tegenstrijdige resultaten. Er werden echter wijzigingen qua cytokinen geïdentificeerd met verloop van de ziekte of tussen patiënten met een verschillende ziektegraad [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1 /// Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc Natl Acad Sci USA. (2017) 114: E7150-E8 /// Patarca R. Cytokines and Chronic Fatigue Syndrome. Ann N Y Acad Sci. (2001) 933: 185-200]. Cytokinen die veranderd bleken, omvatten: TNFα, TGFβ, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-6 & IL-4. Sommige studies rapporteerden ook verschillen qua CD4⁺ vs. CD8⁺ T-cellen, regulerende T-cellen en/of geheugen T-cellen bij M.E./CVS-patiënten.

Interessant is ook dat consistent werd gerapporteerd dat Natural Killer (NK) cellen van individuen met M.E./CVS verminderde cytotoxiciteit vertonen vergeleken met NK-cellen van gezonde controles. Er zijn ook meldingen van gedaalde CD8⁺ T-cel cytotoxiciteit bij M.E./CVS-patiënten, alsook verminderd granzyme-A en perforine in CD8⁺ T-cellen van patiënten [Brenu EW, Staines D et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Maher KJ, Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Anderen hebben verhoogde gevoeligheid voor dexamethason en verlaagde proliferatie van CD4⁺ T-cellen gerapporteerd, maar geen verschil qua cel-dood bij CD4⁺ of CD8⁺ T-cellen [bv. Visser J et al. CD4 T lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4]. Globaal blijft ons begrip omtrent funktionele stoornissen in M.E./CVS T cellen beperkt.

Omwille van de symptomen van vermoeidheid en post-exertionele malaise, werd degelijk onderzoek uitgevoerd omtrent het metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Er is bewijsmateriaal voor oxidatieve stress en voor verminderd coenzyme-Q10 bij M.E./CVS. Er zijn tegenstrijdige bevindingen aangaande cellulaire mitochondriale inhoud bij M.E./CVS, maar meerdere studies vonden geen verschil qua specifieke mitochondriale complex aktiviteiten. Ons laboratorium rapporteerde eerder dat er geen verband is tussen mitochondriale ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en M.E./CVS, hoewel sommige SNPs correleerden met specifieke symptomen bij patiënten [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2016) 14: 19]. Anderen vonden ook dat er geen klinisch relevante mitochondriale SNPs waren bij M.E./CVS-patiënten.

Er werden meerdere metabolomica-analyses op plasma, serum of urine van M.E./CVS-patiënten uitgevoerd. Deze toonden talrijke differentiële metabolieten behorend tot mechanismen zoals vetzuren-metabolisme, de TCA-cyclus, glucose- en aminozuren-metabolisme. Wijzigingen qua plasma-metabolieten betekenen waarschijnlijk dat het cellulair metabolisme is ook veranderd is bij M.E./CVS.

Metabolisme is cruciaal voor de werking van alle cellen maar is bijzonder noodzakelijk voor de correcte werking van het immuunsysteem. Immunometabolisme, of de studie van hoe het metabolisme van immuun-cellen ten grondslag ligt aan de werking en respons van het immuunsysteem, speelt een rol bij veel ziekten. In het bijzonder: slapende T-cellen vertonen weinig anabool metabolisme [opbouwen van molekulen uit kleinere eenheden; dit vereist energie]. In respons op een immune belasting verhogen T-cellen hun gebruik van oxidatieve fosforylatie, glycolyse en glutaminolyse [omzetting van het aminozuur glutamine], terwijl ze vetzuur-oxidatie verminderen. Deze verschuivingen qua metabolisme vereisen vereisen veranderingen in de oppervlakte-expressie van substraat-transporters. Veranderingen in T-cel metabolisme worden aangedreven door specifieke signalisering-mechanismen en zijn zeer sterk gereguleerd. Gepaste metabole programmas in rust en volgend op een immune belasting zijn essentieel voor optimale T-cel effector funktie, proliferatie en levensvatbaarheid.

Dysfunktie van het immunometabolisme kan bijdragen tot het ontstaan en/of handhaven van ziekte. Verhoogd T-cel metabolisme of aanmaak van reaktieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bijdragen tot inflammatie en/of auto-immuniteit. Omgekeerd kan hypometabolisme, het onvermogen om het metabolisme te verhogen na een immune belasting, een chronische infektie of kanker-progressie helpen onderhouden. Specifiek: chronische infektie kan leiden tot T-cel uitputting, waarbij metabolisme en effector-funkties verstoorden worden.

De karakterisatie van immunometabolisme bij M.E./CVS kan inzicht bieden omtrent het mechanisme van de ziekte, potentiële oorzaken en doelwitten voor behandeling. Er werd eerder mitochondriale dysfunktie in neutrofielen van individuen met M.E./CVS gerapporteerd [Myhill S et al. – gecontesteerd]. Een piloot-studie maakte melding van gedaalde glycolytische reserve in M.E./CVS NK-cellen [Nguyen T, Staines D et al. Reduced glycolytic reserve in isolated natural killer cells from Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients: A preliminary investigation. Asian Pac J Allergy Immunol. (2019) 37: 102-108]. Anderen vonden verminderde mitochondriale respiratie in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-individuen, maar geen verschil qua glycolyse [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. We weten echter nog niet hoe het metabolisme van andere immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast zijn bij M.E./CVS. Daarnaast is de capaciteit van specifieke M.E./CVS immuun-cellen om hun metabolisme te her-programmeren onbekend.

Om T-cel metabolisme en z’n potentiële rol bij M.E./CVS te onderzoeken, probeerden we het metabolisme in M.E./CVS CD4⁺ & CD8⁺ T-cellen in rust en na aktivatie te karakteriseren. We verzamelden stalen van 45 gezonde controles en 53 patiënten, waaruit we CD4⁺ & CD8⁺ T-cellen isoleerden. We verkregen uitgebreide informatie van elke individu. We testten dan zowel het mitochondriaal metabolisme en de glycolyse in rustende en gestimuleerde T-cellen. We karakteriseerden ook de mitochondrieën en keken naar de hoeveelheid GLUT1 [glucose-transporter; zorgt voor diffusie door celmembranen] van deze cellen. Ten slotte bepaalden we de hoeveelheid cytokinen in plasma van dezelfde individuen en analyseerden onze gegevens wat betreft correlaties.

Resultaten

[eerder voor experten; leken kunnen de bespreking hieronder lezen]

Individuen van de studie-populatie

De individuen werden gerecruteerd via Simmaron Research (Incline Village, Nevada) door Dr. Daniel Peterson en ze voldeden aan de Canadese Consensus Criteria. Er werden 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles opgenomen in de. De groepen waren gelijkaardig qua geslacht en leeftijd. […] De patiënten hadden een gemiddelde ziekte-duur van 21,7 jaar en de meeste waren langer dan 10 jaar ziek. […]

[…]

CD4⁺ T-cel mitochondriaal metabolisme is niet veranderd bij M.E./CVS-patiënten

[…]

Om te onderzoeken of de mitochondriale respiratie gewijzigd is gebruikten we een ‘Agilent Seahorse XFe96’ extracellulaire flux analyser [zie ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS] en de Mito Stress Test kit [voor het meten van de mitochondriale funktie]. […] Om de mitochondriale ademhaing in rust te vergelijken, alsook het vermogen van de T-cellen om het mitochondriaal metabolisme na aktivatie te her-modeleren, deden we de Mito Stress Test ook na stimulatie (met anti-CD3/anti-CD28 en IL-2). We bevestigden onze aktivatie-methode via flow-cytometrie (op basis van de aktivatie-merker CD69 [trans-membraan proteïne]). De T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles vertoonden significant verhoogde CD69 fluorescente intensiteit na stimulatie overnacht. […]

Wat betreft de CD4⁺ T-cellen was er geen significant verschil qua basale mitochondriale ademhaling in rust tussen de groepen. Er was een kleine maar niet significante afname van de maximale respiratie [men bootst een fysiologische “vraag naar energie” na door de respiratoire keten aan z’n maximum capaciteit te laten werken] van de M.E./CVS CD4⁺ T-cellen t.o.v. controle CD4⁺ T-cellen, maar niet voor de reserve respiratoire capaciteit. Zowel de maximale respiratie als de reserve respiratoire capaciteit [meting van het vermogen van de cel om te beantwoorden aan de energie-vraag] varieerden sterk (controles & and M.E./CVS) in rust. Er was geen significant verschil qua in proton-lek [overblijvende basale respiratie die niet voor ATP-produktie zorgt; dit kan een teken voor mitochondriale schade zijn]. De ATP-produktie [het aandeel van de basale respiratie dat gebruikt wordt om ATP (energie) aan te maken, de hoeveelheid ATP die wordt geproduceerd door de mitochondrieën om te voldoen aan de energie-behoeften van de cel] in rust was lichtjes gereduceerd in CD4⁺ T-cellen van patiënten […].

Er was geen significant verschil wat betreft basale mitochondriale respiratie na stimulatie tussen de groepen. Er was ook geen verschil qua maximale respiratie of ATP-produktie. Er was een kleine toename qua reserve respiratoire capaciteit en afname van het proton-lek maar geen van deze beide verschillen was statistisch significant.

CD4⁺ T-cellen van zowel controles als M.E./CVS vertoonden hogere, hoewel niet-significante, basale en maximale mitochondriale ademhaling na aktivatie t.o.v. rust. In beide groepen was er substantiële variatie in het metabolisme na aktivatie. De ATP-produktie na aktivatie was significant gestegen in de controle CD4⁺ T-cellen en er was een trend naar toename in M.E./CVS CD4+ T-cellen.

Globaal vertoonden CD4⁺ T-cellen van patiënten geen significante verschillen wat betreft mitochondriale respiratie, noch in rust, noch na stimulatie. Dit suggereert dat er geen belangrijke defekten zijn qua mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS CD4⁺ T-cellen geen defekt in hun respons na aktivatie via mitochondriale respiratie te vertonen.

M.E./CVS CD8⁺ T-cellen vertonen een gedaald proton-lek en ATP-produktie

We analyseerden mitochondriale respiratie in CD8⁺ T-cellen. In rust was er geen significant verschil voor basaal of maximaal mitochondriaal metabolisme van CD8+ T-cellen tussen de groepen. Het proton-lek was echter significant gereduceerd voor de M.E./CVS-patiënten, suggestief voor verhoogde mitochondriale efficiëntie. De ATP-produktie was lichtjes gedaald maar deze was zeer variabel in beide groepen. Er was geen verschil wat betreft reserve respiratoire capaciteit in rust.

Na aktivatie was er een kleine reductie qua basale mitochondriale respiratie in M.E./CVS CD8+ T-cellen. M.E./CVS CD8⁺ T-cellen vertoonden ook een kleine maar niet-significante daling qua maximale respiratie. Er was geen verschil in reserve respiratoire capaciteit na aktivatie. Het proton-lek vertoonde een trend naar lagere waarden in gestimuleerde M.E./CVS CD8⁺ T-cellen, consistent met de afname in rustende cellen. De ATP-produktie was echter significant verlaagd in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen na aktivatie, suggestief voor het feit dat het verminderd proton-lek niet resulteert in verbeterde ATP-produktie.

Het metabolisme van gezonde CD8⁺ T-cellen vertoonde een kleine verhoging qua basale respiratie van rust naar aktivatie. Daarentegen vertoonden M.E./CVS CD8⁺ T-cellen geen verandering of daling van het basaal mitochondriaal metabolisme na aktivatie t.o.v. rustende cellen. Het zelfde patroon werd gevonden voor maximale respiratie en ATP-produktie. Dus: CD8⁺ T-cellen zijn wellicht minder in staat het metabolisme te induceren na aktivatie.

Globaal duiden deze gegevens er op dat mitochondriale dysfunktie in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen mogelijk is. Het ontbreken van verhoging van het metabolisme in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen bijkomende verschillen tussen controles en patiënten na aktivatie suggereert een verstoord vermogen om het metabolisme te her-programmeren.

CD4⁺ T-cel mitochondriale massa en membraan-potentiaal verschilt niet tussen patiënten en controles

Om de mitochondrieën van M.E./CVS T-cellen verder te onderzoeken, wilden we de mitochondriale morfologie en het membraan-potentiaal in T-cellen karakteriseren. Zowel CD4⁺ als CD8⁺ T-cellen werden simultaan gekleurd met ‘MitoTracker Green’ (MTG) & ‘MitoTracker Red’ (MTR) CMXRos. MTG geeft de mitochondriale massa [totaal mitochondriaal membraan binnen het dynamisch netwerk van mitochondrieën in de cel] aan, terwijl MTR CMXRos sensitief is voor het mitochondriaal membraan-potentiaal [de lading-gradient over het binnenste mitochondriaal membraan, spanning-verschil tussen buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]. De mitochondrieën werden beoordeeld via microscopie, alsook via flow-cytometrie. […]

We zagen geen verschil voor MTG noch MTR CMXRos in CD4⁺ T-cellen. Zowel in rust en na aktivatie was er een goede kleuring voor de CD4⁺ T-cellen van patiënten en controles. We zagen geen morfologische verschillen in de mitochondriën in CD4⁺ T-cellen van patiënten en controles, hoewel de fluorescentie resolutie beperkt is.

Bij flow-cytometrie was er geen significant verschil te zien met MTG voor de CD4⁺ T-cellen, in rust noch na stimulatie, wat er op wijst dat er geen verschil is in mitochondriale massa in geen van beide toestanden. Er waren ook geen significante verschillen met MTR CMXRos. Op zich lijkt er ook geen verschil te zijn qua mitochondriaal membraan-potentiaal tussen patiënten en controle CD4⁺ T-cellen.

M.E./CVS CD8⁺ T-cellen vertonen een gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal

We visualiseerden microscopisch ook de mitochondriale morfologie, massa en membraan-potentiaal van CD8⁺ T-cellen. We zagen geen verschil in mitochondrieën via MTG. We observeerden echter, zowel in rust als na stimulatie, M.E./CVS CD8⁺ T-cellen met mitochondriën die waren gekleurd door MTG maar weinig of niet met MTR CMXRos. Daarentegen vertoonden CD8⁺ T-cellen van gezonde controles co-kleuring, zoals bij de CD4⁺ T-cellen. We zagen geen observeerbaar verschil in mitochondriale morfologie van CD8+ T-cellen tussen controles en M.E./CVS-patiënten in geen van beide toestanden. Verdere experimenten (elektronen-microscopie) zullen nodig zijn om te onderzoeken of er verschillen zijn die niet detekteerbaar zijn met fluorescentie-microscopie.

We wenden dan flow-cytometrie aan om de fluorescentie van de twee mitochondriale kleurstoffen te kwantificeren in CD8⁺ T-cellen. Consistent met de microscopische beelden was er geen significant verschil voor MTG bij CD8⁺ T-cellen in rust. Er was een kleine maar niet-significante toename voor MTG na stimulatie bij zowel controle- als patiënten-cellen. MTR CMXRos was ook lichtjes gestegen in CD8⁺ T-cellen van controles en M.E./CVS na aktivatie. M.E./CVS CD8⁺ T-cellen vertoonden echter significant minder MTR CMXRos zowel in rust als na aktivatie. Dus: CD8⁺ T-cellen van patiënten vertonen geen verschil qua mitochondriale massa (beide toestanden) maar hebben wel een verminderd mitochondriaal membraan-potentiaal vergeleken met controle-cellen.

M.E./CVS CD4⁺ T-cel glycolyse is gereduceerd in rust vergeleken cellen van gezonde controles

Het tweede belangrijk, hoewel minder efficiënt, energie-producerend mechanisme voor de cel is glycolyse [omzetting van glucose naar lactaat]. Glycolyse speelt een significante rol bij de werking van immuun-cellen en is cruciaal voor T-cel aktivatie. We onderzochten daarom of de glycolyse in T-cellen bij M.E./CVS op een vergelijkbare manier funktioneert als bij gezonde controles. Bijkomend bepaalden we of M.E./CVS T-cellen de glycolyse gepast kunnen stimuleren na aktivatie. We gingen de glycolyse na zowel CD8⁺ als CD4⁺ T-cellen in rust en na at rest stimulatie m.b.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser. Voor rustende T-cellen (‘Seahorse Glycolytic Rate Assay’) verkregen we kwantitatieve metingen van de basale glycolyse, compenserende glycolyse [glycolyse na toevoeging van mitochondriale inhibitoren (die de oxidatieve fosforylatie inhiberen) en compenserende veranderingen in de cel induceren om glycolyse te gerbuiken om aan de energie-behoeften te voldoen] en post-2DG verzuring [extracellulaire verzuring niet veroorzaakt door glycolyse of mitochondriale TCA-aktiviteit alsook door residuele glycolyse die niet wordt geïnhibeerd door 2-DG (2-deoxyglucose stopt de glycolyse)]. Door het beperkt aantal cellen die beschikbaar waren voor het testen van de glycolyse na aktivatie, gebruikten we in plaats daarvan een combinatie van molekulen die simultane metingen van de glycolyse en mitochondriale respiratie toeliet. […] Omwille van deze strategie, vergeleken we in gestimuleerde cellen de basale glycolyse, alsook de glycolytische capaciteit, of de glycolyse geïnduceerd door de injektie van oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], en post-2DG verzuring. We maakten geen directe vergelijking tussen compenserende glycolyse en glycolytische capaciteit, maar we waren in staat basale glycolyse tussen rust en aktivatie te vergelijken.

Wanneer we de glycolyse bepaalden in CD4⁺ T-cellen in rust, was de basale glycolyse significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controle cellen. De compenserende glycolyse was ook significant gedaald in rust in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen. De post-2DG verzuring was lichtjes, maar niet significant verminderd in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen vergeleken met gezonde controles. Interessant: er was geen verschil qua basale glycolyse tussen voor CD4⁺ T-cellen na stimulatie, suggererend dat de aktivatie voldoende is om de gedaalde glycolyse in rust te boven te komen. Er was echter substantiële variatie qua glycolyse in gestimuleerde M.E./CVS-cellen. Zo ook was de glycolytische capaciteit niet significant verschillend tussen controle M.E./CVS CD4⁺ T-cellen na aktivatie, ondanks een kleine toename in de cellen van patiënten. De post-2DG verzuring was significant hoger in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen vergeleken met gezonde controles, ondanks het feit dat we een lichte afname zagen in rustende cellen. Dit kan duiden op extracellulaire verzuring uit niet-glycolytische bronnen in geaktiveerde M.E./CVS CD4⁺ T-cellen. Daarnaast kan dit de kleine toename van de glycolyse in vergelijking met controle-cellen verklaren.

De basale glycolyse steeg bij gezonde controle en M.E./CVS CD4⁺ T-cellen (van rust naar stimulatie) maar dit verschil was enkel significant in M.E./CVS-cellen. De post-2DG verzuring was niet verschillend in gezonde controle CD4+ T-cellen maar was significant hoger in CD4⁺ T-cellen van patiënten na aktivatie, suggestief voor verhoogde extracellulaire bronnen van verzuring na stimulatie.

Aangezien de glycolyse afhangt van de opname van glucose via de voornaamste glucose-transporter GLUT1, bepaalden we ook de aanwezigheid van of GLUT1 op het cel-oppervlak d.m.v. flow-cytometrie. Het percentage GLUT1+ cellen was significant gestegen bij gezonde individuen en er was een trend tot toename bij M.E./CVS-patiënten na stimulatie, vergeleken met cellen in rust. Er waren geen significante verschillen qua percentage GLUT1⁺ cellen tussen gezonde en M.E./CVS CD4⁺ in rust of na aktivatie. Er was echter een kleine toename van GLUT1⁺ cellen in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen t.o.v. controles in rust, ondanks de daling qua glycolyse.

M.E./CVS CD8⁺ T-cel glycolyse is verminderd in rust en na aktivatie

Dan onderzochten we de glycolyse in CD8⁺ T-cellen. Gelijkaardig met CD4⁺ T-cellen was de basale glycolyse significant gedaald in M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust. De compenserende glycolyse was ook significant verminderd in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen in rust. De post-2DG verzuring was gereduceerd, hoewel dit verschil niet significant was. Anders dan onze resultaten voor CD4⁺ T-cellen, vertoonden M.E./CVS CD8⁺ T-cellen ook significant lagere basale glycolyse t.o.v. gezonde controle CD8⁺ T-cellen na aktivatie. Er was geen significant verschil qua glycolytische capaciteit of post-2DG verzuring in gestimuleerde CD8⁺ T-cellen (M.E./CVS vs. controle). We stelden een sterke variabiliteit vast qua glycolytische capaciteit in beide groepen.

Er waren minimale veranderingen qua glycolyse (rust vs. aktivatie) in CD8⁺ T-cellen (controle of M.E./CVS). Interessant: er was een lichte, niet-significante toename qua post-2DG verzuring in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen na stimulatie, overéénkomstig met de respons die we zagen in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen. De gereduceerde basale glycolyse na aktivatie kan wijzen op een verstoord vermogen van CD8⁺ T-cellen om glycolyse te her-modeleren na aktivatie, zoals we zagen voor de mitochondriale respiratie.

We kwantificeerden ook GLUT1⁺ cellen (flow-cytometrie) op M.E./CVS en gezonde CD8⁺ T-cellen. Zoals bij de CD4⁺ T-cellen, hadden CD8⁺ T-cellen van beide groepen een hoger percentage GLUT1⁺ cellen na stimulatie. Daarnaast waren er weer geen significante verschillen qua GLUT1⁺ cellen, in rust of na aktivatie. Niettemin was er een kleine afname qua GLUT1⁺ cellen bij de patiënten (in rust).

Plasma-cytokinen correleren op een unieke manier met het T-cel metabolisme van M.E./CVS-patiënten

Naast PBMCs namen we EDTA-plasma af bij alle individuen. Om de immuun-funktie bij M.E./CVS verder te onderzoeken, w analyseerden de de hoeveelheden plasma-cytokinen in stalen van 37 gezonde controles en 36 M.E./CVS-patiënten […]. Van de 48 gemeten cytokinen/chemokinen, warden er 44 gedetekteerd. […] We vonden geen significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor geen enkele van de 44 gedetekteerde cytokinen.

Hoewel we geen verschillen zagen qua hoeveelheden plasma-cytokinen tussen patiënten en controles, waren we geïnteresseerd om te bepalen of het T-cel metabolisme correleerde met de waarden van plasma-cytokinen of bevragings-gegevens. We bepaalden ook of het T-cel metabolisme verschilde tussen patiënten met of zonder IBS [prikkelbare darm] of inflammatoire darm ziekte (IBD).

We vonden geen significante correlaties tussen T-cel metabolisme en bevragings-gegevens bij M.E./CVS-patiënten of gezonde controles. Daarnaast bleek het T cel-metabolisme niet significant verschillend bij IBS- of IBD-patiënten t.o.v. mensen zonder deze ziekten. We zagen echter wel een aantal significante correlaties tussen plasma-cytokinen en het metabolisme. Zeer interessant: deze correlaties waren uniek bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met de controle-groep. Bij M.E./CVS-patiënten vonden we significante negatieve correlaties tussen basale glycolyse in CD8+ T-cellen, en de hoeveelheden IL-2, IL-8, IL-10, IL-12 p70 & SCGFβ [‘stem cell growth factor beta’]. Geen van deze correlaties waren significant bij gezonde controle-individuen. Omgekeerd: we vonden een significante positieve correlatie tussen basale glycolyse in CD8⁺ T-cellen en IL-9. Dezelfde trend was aanwezig bij gezonde in controles maar dit was niet significant. De compenserende glycolyse van rustende CD8⁺ T-cellen bleek significant negatief correlerend met M-CSF [‘macrophage colony-stimulating factor’] en TNFα. Interessant was dat tegengestelde trends werden vastgesteld bij gezonde controles. Na stimulatie correleerden in CD8⁺ T-cellen van patiënten de post-2DG verzuring en glycolytische capaciteit allebei negatief met de hoeveelheid M-CSF. Bij gezonde controles kwamen dezelfde verbanden voor maar deze waren niet significant. Aangezien veel van deze cytokinen pro-inflammatoir zijn, is het verrassend dat ze correleren met gedaald metabolisme in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen.

Er waren vier significante correlaties tussen cytokinen en metingen van het metabolisme bij controles, voornamelijk in geaktiveerde CD4⁺ T-cellen. De basale mitochondriale respiratie en maximale respiratie van gestimuleerde CD4⁺ T-cellen waren positief gecorreleerd met het pro-inflammatoir cytokine IL-17. Daarentegen waren bij M.E./CVS-patiënten deze correlaties niet-significant en de maximale respiratie was negatief geassocieerd met IL-17. Er was een significante negatieve correlatie tussen plasma IL-9 en geaktiveerde basale respiratie van CD4⁺ T-cellen, welke niet aanwezig was bij M.E./CVS-patiënten. Ten slotte was er een significante negatieve correlatie tussen de reserve mitochondriale respiratoire capaciteit in rustende CD8⁺ T-cellen en GCSF bij gezonde controles, maar niet bij M.E./CVS-patiënten. Globaal vertoonden mensen met M.E./CVS en gezonde controles unieke correlaties tussen plasma-cytokinen en het T-cel metabolisme, wat een verdere indicatie is voor immune veranderingen bij M.E./CVS.

Bespreking

T-cellen bleken eerder al betrokken bij M.E./CVS (funktie-testen en karakterisatie van oppervlakte-merkers). De cluster-uitbraken van M.E./CVS, de ziekte-aanvang en immuun-gerelateerde symptomen suggereren allemaal een infektueuze trigger. Gewijzigde cytokine-profielen, gedaalde NK-cel cytotoxiciteit en succesvolle behandelingen impliceren verder het mechanisme. In onze studie-populatie zagen we bewijs voor immune betrokkenheid bij M.E./CVS. Van de 53 M.E./CVS-patiënten rapporteerden er 41 een gekende virale infektie of een virus-achtige ziekte als trigger voor hun ziekte. M.E./CVS-patiënten hadden een hogere prevalentie van gastro-intestinale symptomen of aandoeningen, wat eerder al werd gerapporteerd en gelinkt met veranderingen qua darm-bakterieën [Giloteaux L, Hanson MR et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Nagy-Szakal D et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44]. Bovendien ondersteunt de toegenomen co-morbide diagnose bij patiënten of van familieleden met immuun-gerelateerde aandoeningen, een rol voor het immuunsysteem en potentiële genetische voorbestemdheid voor de ziekte.

Onze studie-populatie was evenwichtig qua geslacht, wat ons toeliet T-cellen te karakteriseren bij zowel mannen als vrouwen. […] Onze studie-groep omvatte voornamelijk patiënten met langdurige ziekte, wat niet verrassend is, gezien het feit dat de gemiddelde tijd tot de diagnose die wordt gemeld bijna zeven jaar bedraagt. Een analyse van het T-cel metabolisme van patiënten met korte vs. lange ziekte was dus niet mogelijk in deze studie, maar een toekomstig onderzoek met meer patiënten met ziekte van kort duur zou bijkomend inzicht kunnen verstrekken.

Op basis van het bewijsmateriaal voor een dysfunktioneel immuunsysteem bij M.E./CVS-patiënten en de toenemende erkenning voor de rol die het immuun-metabolisme speelt bij de werking van T-cellen, wilden we het metabolisme van M.E./CVS CD4⁺ & CD8⁺ T-cellen onderzoeken. Een eerdere studie [zie Tomas C et al. hierboven] vond gedaalde mitochondriale respiratie in M.E./CVS PBMCs t.o.v. gezonde controles, maar onze studie is het eerste specifiek onderzoek van het T-cel metabolisme bij M.E./CVS. We karakteriseerden de twee voornaamste energie-producerende mechanismen, oxidatieve fosforylatie en glycolyse, in cellen en hun onderliggende cellulaire componenten. Onze studie van mitochondriale respiratie vond geen dysfunktie van het mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4⁺ T-cellen, noch enige moeilijkheid omtrent het verhogen van de respiratie in respons op aktivatie. De brede variatie bij veel van de metingen voor het metabolisme was verwacht, maar beperkte differentiatie tussen patiënten- en controle-cellen. Onze voornaamste beperking was de grootte van de groep, vooral wat betreft de experimenten met overnacht stimulatie. Zoals verwacht en eerder aangetoond, vonden we een verhoogde mitochondriale respiratie in CD4⁺ T-cellen van zowel M.E./CVS-patiënten als gezonde controles na aktivatie. Er waren ook geen verschillen qua mitochondriale massa of membraan-potentiaal tussen CD4⁺ T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Verrassend: er was geen significante stijging qua mitochondriale massa na aktivatie, wat eerder werd aangetoond. Dit kan verband houden met de gebruikte stimulatie-methodes. Het is het vermelden waard dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MitoTracker ook sterk varieerde in alle populaties.

In CD8⁺ T-cellen zagen we enkel een significante reductie qua proton-lek in rust bij M.E./CVS-cellen vergeleken met gezonde controles. Een verminderd proton-lek zou verhoogde mitochondriale respiratoire efficiëntie suggereren, maar toch waren de basale respiratie, maximale respiratie en ATP-produktie niet significant verschillend in CD8⁺ T-cellen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Na aktivatie zagen we een gelijkaardig fenotype. Als geheel verhoogden M.E./CVS CD8⁺ T-cellen hun basale respiratie niet in dezelfde mate als cellen van gezonde controles na stimulatie, suggestief voor een stoornis van het vermogen tot metabole her-programmering.

Ons onderzoek van mitochondrieën in CD8⁺ T-cellen via beeldvorming onthulde een significante reductie qua mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen, zowel in rust als na aktivatie. Dit was verrassend gezien de afname van het proton-lek dat we zagen in patiënten-cellen, Maar wordt niettemin ondersteund door andere observaties van hypo-metabolisme in immuun-cellen bij M.E./CVS [bv. Mensah FFK, Armstrong CW et al. CD24 Expression and B cell maturation shows a novel link with energy metabolism: potential implications for patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front Immunol. (2018) 9: 2421]. Bovendien had een subgroep M.E./CVS CD8⁺ T-cellen meer mitochondriale massa dan gezonde controle-individuen in rust. CD8⁺ T-cellen van zowel gezonde controles als M.E./CVS-patiënten vertoonden de verwachte toenames qua mitochondriale massa en membraan-potentiaal na aktivatie, hoewel dit verschil niet significant was en niet volstond om het gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS-cellen te boven te komen. In feite was het verschil qua mitochondriaal membraan-potentiaal groter na overnacht stimulatie. Dit kan een verstoorde metabole respons na aktivatie en grotere observeerbare verschillen qua mitochondriale respiratie in gestimuleerde cellen helpen verklaren. Er werd gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal gezien na chronische virale infektie, en dit is een courant kenmerk van of T-cel uitputting.

Bij zowel CD4⁺ als CD8⁺ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vonden we significante dalingen van de basale glycolyse en compenserende glycolyse in rust. Interessant is dat eerder al gedaald plasma-glucose bij M.E./CVS werd gerapporteerd [Germain A, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst. (2017) 13: 371-9. Verminderingen qua glucose-metabolisme, zonder overéénkomende verhogingen qua mitochondriale respiratie, duiden op hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Na stimulatie was er geen significant verschil wat betreft CD4⁺ T-cel basale glycolyse of glycolytische capaciteit, wat er op duidt dat aktivatie voldoende is om defekten in de glycolyse in rust te boven te komen. M.E./CVS en controle CD4⁺ T-cellen verhoogden allebei de glycolyse (rust naar aktivatie) zoals verwacht, wat weer suggereert dat M.E./CVS CD4⁺ T-cellen in staat zijn tot gepaste metabole her-programmering. In tegenstelling daarmee vertoonden M.E./CVS CD8⁺ T-cellen nog significant gedaalde basale glycolyse vergeleken met gezonde controles na aktivatie. Samen met onze bevindingen in CD8⁺ T-cellen over mitochondriale respiratie na aktivatie, ondersteunt dit een verstoring van de metabole respons op aktivatie in CD8⁺ T-cellen bij M.E./CVS. Niettemin waren er minimale wijzigingen wat betreft glycolyse in CD8⁺ T-cellen van patiënten of gezonde controles in rust vs. geaktiveerde toestand.

In zowel CD4⁺ als CD8⁺ T-cellen was het percentage GLUT1⁺ cellen verhoogd na stimulatie, zoals eerder werd getoond in T-cellen. Er waren geen significante verschillen tussen patiënten en controles. Er was een lichte toename qua percentage CD4⁺ GLUT1⁺ cellen bij M.E./CVS (t.o.v. controles). Er was echter een kleine afname van het percentage GLUT1⁺ cellen bij de M.E./CVS CD8⁺ T-cellen in rust vergeleken met controles, wat consistent is met de verminderde glycolyse in rust. Een eerdere studie omtrent T-cel uitputting toonde gestegen, in plaats van gedaalde, GLUT1 bij verstoorde glycolyse. Daarnaast kan glucose worden aangewend voor alternatieve mechanismen die niet worden gemeten met de Seahorse bepalingen.

Wanneer we al onze gegevens analyseerden wat betreft correlaties, vonden we significante correlaties tussen hoeveelheden plasma-cytokinen en metingen van het T-cel metabolisme, die uniek waren bij M.E./CVS-patiënten in vergelijking met controles. M.E./CVS CD8⁺ T-cel glycolyse vertoonde meerdere significante correlaties met cytokinen die bekend staan als pro-inflammatoir of als groeifactoren. Het is bijzonder interessant gezien de gedaalde basale glycolyse die we zagen bij M.E./CVS-patiënten. Bijzonderlijk IL-2 zou worden verwacht glycolyse in T-cellen te induceren, in plaats van glycolyse te verstoren. Er zou kunnen worden verwacht dat pro-inflammatoire cytokinen positief gecorrelereerd zijn met T-cel metabolisme, maar ze bleken negatief gecorrelereerd met het T-cel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Bij gezonde controles was het pro-inflammatoir cytokine IL-17 positief gecorrelereerd met basale en maximale respiratie in gestimuleerde CD4⁺ T-cellen. Interessant: dezelfde verbanden vertoonden negatieve trends bij M.E./CVS-patiënten.

Andere cytokinen die van belang kunnen zijn, vertoonden uniek verbanden met M.E./CVS en controle T-cel metabolisme. IL-10, dat ook negatief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8⁺ T-cel glycolyse, is een immunosuppressief cytokine dat eerder werd gelinkt met chronische infektie, immuun-cel uitputting en inhibitie van T-cel aktivatie. Bij deze voorbeelden zou verminderd T-cel metabolisme worden voorspeld zodat een negatieve correlatie met glycolyse in M.E./CVS CD8⁺ T-cellen wordt verwacht. Niettemin is de afwezigheid van deze correlatie bij gezonde controles opvallend. IL-9, dat positief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8⁺ T-cel glycolyse, is een T-cel groeifactor maar heeft complexe effekten. Bij borstkanker-patiënten leidden IL-9 producerende Th9-cellen tot verbeterde CD8⁺ T-cel cytotoxiciteit, wat een toename qua cellulair metabolisme zou vereisen. IL-9 was negatief gecorrelereerd met de basale respiratie van geaktiveerde CD4⁺ T-cellen bij gezonde controles, wat verband zou kunnen houden met verbetering van de funktie van regulerende T cellen door IL-9. Cytokinen aangemaakt door andere immuun-cellen of T-cel subsets worden ook gesekreteerd in het plasma en droegen bij tot onze metingen. Niettemin vertoonden M.E./CVS CD8⁺ T-cellen meerdere negatieve correlaties tussen het metabolisme and plasma-cytokinen daar waar positieve correlaties kunnen worden verwacht. Dit suggereert dat het verband tussen pro-inflammatoire cytokinen in plasma en T-cel metabolisme gewijzigd is bij M.E./CVS-patiënten en impliceert specifieke cytokinen voor verder onderzoek bij M.E./CVS. Het is duidelijk dat het immuunsysteem een rol speelt bij M.E./CVS. Onze gegevens wijzen er op dat er reductie qua rustend T-cel metabolisme bij patiënten bestaat. In het bijzonder: CD8⁺ T-cellen vertonen een gewijzigd mitochondriaal membraan-potentiaal en een verstoring van hun metabole respons op aktivatie. CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen vertonen beide significante dalingen qua glycolyse. Dit hypo-metabolisme in T-cellen ligt in dezelfde lijn als andere bevindingen aangaande hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS-patiënten veranderde verbanden te vertonen tussen plasma cytokine-hoeveelheden en T-cel metabolisme, waarbij pro-inflammatoire cytokinen onverwacht correleren met hypo-metabolisme. Een dergelijke ontregeling kan aangeven dat M.E./CVS T-cellen responsiviteit voor sommige pro-inflammatoire cytokinen hebben verloren. Tesamen met een hypo-metabolisme in immuun-cellen, is dit consistent met een aanhoudende infektie, hoewel een dergelijk agens nog niet werd geïdentificeerd. Om vooruit te komen zal het bepalen van het mechanisme achter een hypo-metabolisme in M.E./CVS T-cellen hoge prioriteit moeten krijgen, alsook het nagaan van hoe een gewijzigd metabolisme de funktie van deze cellen beïnvloedt.

Methodes

Studie-populatie

M.E./CVS diagnose door Dr. Daniel Peterson (Simmaron Research in Incline Village, Nevada) op basis van vragenlijsten zoals de SF-36 & ‘Bell Scale’, inventaris van specifieke symptomen en bijkomende vragen (bv. co-morbiditeiten en familiale geschiedenis).

Afname ne verwerking van stalen

[…]

Isolatie van immuun-cellen

[…]

Extracellulaire flux analyse

[…] Seahorse XFe96 […] Seahorse ‘Mito Stress kit’, Seahorse ‘Glycolytic Rate Assay’ (oligomycine, FCCP, rotenon/antimycine-A, 2-DG). Aktivatie: stimulatie met STEMCELL ImmunoCult™ (anti-CD3 & anti-CD28), plus IL-2. [zie hierboven] […]

Flow-cytometrie

[…]

Confocale microscopie

[…]

Analayse van plasma-cytokinen

[…] 48 cytokinen & chemokinen (‘Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel’) […]

Statistiek

[…]

Complex-V inefficiëntie & ontregelde mitochondriale funktie bij M.E.(cvs)

Een complex artikel waarvan de bespreking voor leken wellicht moeilijk te begrijpen is. We kunnen onmogelijk een cursus mitochondriale biochemie doceren. Veel termen kwamen al aan bod in onze eerdere stukken. Wij vragen de geïnteresseerde lezer de moeite te doen via het intikken van de zoekterm ‘Mitochondria’ (op deze website) zich verder te informeren…

Is er sprake van een mitochondriaal probleem bij M.E.(cvs)? Door de aanhoudende vermoeidheid en post-exertionele malaise lijkt een probleem qua cellulaire energie-voorziening (en dus de mitochondrieën) aannemelijk. Niettemin is (was) de wetenschappelijke literatuur (nog) niet éénduidig.

In een review (‘Pathological Mechanisms Underlying Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic fatigue Syndrome’ in Diagnostics (2019) 9) besprak de gerenommeerde onderzoeker professor Paul R. Fisher – specialist in neurodegeneratieve aandoeningen, mitochondriale biologie en de mitochondrieën bij ziekte – waarom mensen met M.E.(cvs) misschien niet adequaat reageren op hogere energie-vereisten. De regulering van het cellulair energie metabolisme draait rond twee stress-voelende enzyme, AMP-geaktiveerd proteïne kinase (AMPK) en ‘target of rapamycin’ (TOR). Chronische ontregeling van hun aktiviteiten zouden er toe kunnen leiden dat de bijkomende energie-eisen niet voldaan worden. “Er werd al melding gemaakt over contractie geïnduceerde ATP-depletie. Een dergelijke ongevoeligheid kan het gevolg zijn van het feit dat AMPK al in geaktiveerd is in de cellen of van z’n inhibitie door chronisch hyper-geaktiveerd TOR complex 1 (TORC1)”…

Onderstaand artikel (door een Australische groep, o.l.v. Fisher) heeft de kwestie op een alternatieve manier aangepakt: door gebruik te maken van onsterfelijk gemaakte immuuncellen, lymfoblasten (die veel beter lijken op in het lichaam metaboliserende cellen dan de bij andere studies gewoonlijke gebruikte immuuncellen: lymfocyten verkeren buiten het lichaam in een toestand van fysiologische inakiviteit/rust en zijn dus wellicht niet representatief voor metabool aktieve cellen; lymfocyten van M.E.(cvs)-patiënten sterven ook sneller dan die van controles.)…

Er lijkt wel degelijk spraken van een dysfunktie, nl. van Complex-V van de mitochondriale ademhaling keten (één van de stappen die leidt tot de aanmaak van de cellulaire energiebron, ATP). In rust blijkt dit echter te worden gecompenseerd door upregulering van TORC1-aktiviteit en expressie van mitochondriale proteïnen. De belangrijkste verhoogde parameters bleken allemaal gecorreleerd met klinische symptomen, wat bewijst dat de gevonden mitochondriale abnormaliteiten klinisch relevant zijn.

TOR Complex I (TORC1) is één van de belangrijkste regulatoren van de expressie van mitochondriale proteïnen. De auteurs vonden dat de aktiviteit er van verhoogd is bij M.E.(cvs). mTORC1 (‘mammalian target of rapamycin complex 1’ of ‘mechanistic target of rapamycin complex 1’, is een proteïnen-complex dat werkt als een sensor voor nutriënten/energie/redox-toestand en proteïnen-synthese controleert. Het mTOR Complex 1 (mTORC1) is samengesteld uit mTOR (een kinase-enzyme) zelf en ‘regulatory-associated protein of mTOR’. Torin2, een krachtige en selektieve mTOR inhibitor, bleek een effekt te hebben op de TORC1-aktiviteit…

We merken op dat het artikel niet ‘peer-reviewed’ is maar zover we kunnen oordelen is dit héél gedegen werk. Paul Fisher en zijn collega’s hebben bijkomende fondsen verkregen en starten verder onderzoek op (in samenwerking met de ‘Australian Registry and Biobank for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’)…

————————-

Preprints 2019090043 (september 2019)

An isolated Complex V inefficiency and dysregulated mitochondrial function in immortalized lymphocytes from ME/CFS patients

Daniel Missailidis, Sarah Annesley, Claire Allan, Oana Sanislav, Brett Lidbury, Don Lewis, Paul Fisher

Physiology Anatomy & Microbiology, La Trobe University, Melbourne, Australia

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een enigmatische aandoening die wordt gekenmerkt door vermoeidheid die niet wordt verholpen door rust en door verergering van symptomen na inspanning (post-exertionele malaise of ‘PEM’). Er is geen definitieve molekulaire merker of gekend onderliggend pathologisch mechanisme voor de aandoening. Er is steeds meer bewijsmateriaal voor een afwijkend energie-metabolisme, suggestief voor een rol voor mitochondriale dysfunktie bij M.E./CVS. Onze doelstelling was daarom het meten van de mitochondriale funktie en cellulaire stress voelende mechanismen in aktief metaboliserende cellen van patiënten. We immortaliseerden lymfoblasten geïsoleerd uit het bloed van 51 M.E./CVS-patiënten die de diagnose kregen op basis van de Canadese Consensus Criteria, en van een voor leeftijd en geslacht gematchte controle-groep. Parameters voor de mitochondriale funktie en het ‘voelen’ van energie-stress werden bepaald d.m.v. Seahorse extracellulaire flux analyse [voor beschrijving, zie ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS’], proteomica en een waaier aan bijkomende biochemische testen. Als proportie van het basaal zuurstof-verbruik (OCR), bleek de mate van ATP-synthese door Complex-V significant gereduceerd in M.E./CVS-lymfoblasten, terwijl significante verhogingen werden geobserveerd wat betreft Complex-I OCR, maximum OCR, reserve respiratoire capaciteit, niet-mitochondriale OCR en ‘proton-lek’ als onderdeel van de basale OCR. Dit ging gepaard met een stijging van het mitochondriaal membraan-potentiaal, chronicsche hyper-geaktiveerde TOR Complex-I stress-signalisering en ge-upreguleerde expressie van mitochondriale respiratoire complexen, vetzuur-transporters en enzymen van de beta-oxidatie en TCA cycli. In tegenstelling daarmee bleken de mitochondriale massa en het genoom ‘copy-number’ [aantal copieën], alsook de mate van glycolyse en ‘steady-state’ [stabiele rust/evenwicht-toestand] ATP-waarden onveranderd. Onze resultaten suggereren een model waarbij M.E./CVS-lymfoblasten een Complex-V defekt hebben, vergezeld door compenserende upregulering van hun respiratoire capaciteit (de mitochondriale respiratoire complexen, membraan-transporters en enzymen betrokken bij vetzuur beta-oxidatie omvattend). Dit doet de ATP-synthese en ‘steady-state’ naar ‘normaal’ terugkeren in rustende cellen, maar kan er voor zorgen dat ze niet in staat zijn om adequaat te reageren op acute toenames van de energie-vereiste aangezien de relevante homeostatische mechanismen reeds geaktiveerd zijn.

1. Inleiding

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), ook Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) genoemd, is een aandoening die slecht wordt begrepen, met als kenmerken chronische, onverklaarde vermoeidheid en de invaliderende ‘payback’ bij over-inspanning – post-exertionele malaise (PEM). PEM kan optreden na een simpele dag-dagelijkse fysieke taak en kan gepaard gaan met symptomen die een reeks lichamelijke systemen aantasten. Het gebrek aan objectieve en accurate diagnostische criteria zorgt er voor dat patiënten gedurende lange tijd moeten wachten op een duidelijke diagnose of begrip voor de aandoening. Het is van het grootste belang dat er wordt gestreefd naar fundamentele molekulaire verklaringen voor de onderliggende pathofysiologie van M.E./CVS en betrouwbare biomerkers. Deze kunnen leiden tot een betrouwbare, snellere diagnose en, op langere termijn, rationele, doeltreffende behandelingen.

De mitochondriale funktie is van belang voor M.E./CVS-research aangezien een bio-energetische verklaring de terugkerende vermoeidheid en het groot aantal links tussen de karakteristieke immune inflammatie en de mitochondrieën. Er werd de laatste tien jaar bewijsmateriaal voor mitochondriale dysfunktie bij M.E./CVS gezocht maar dit blijft inconsistent. Er werd gedaalde mitochondriale biogenese gerapporteerd maar geen genormaliseerde respiratoire keten enzyme-aktiviteiten in de spieren van M.E./CVS-individuen. De mitochondriale biogenese in spieren wordt ge-upreguleerd door inspanning [studie bij muizen], dus wordt deze reductie waarschijnlijk veroorzaakt door de noodzakelijkerwijs verminderde inspanning die M.E./CVS-patiënten kunnen uitvoeren. Er werd gerapporteerd dat mitochondriale funktie in M.E./CVS-neutrofielen [gecontesteerde resultaten van Myhill S et al.] of respiratie in M.E./CVS perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802] gereduceerd zijn maar toch lijken de Oxidatieve Fosforylatie (OXPHOS) complexen normaal [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93 /// Lawson N et al. Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. J Nat Sci (2016) 2], terwijl de expressie van mitochondriale proteïnen in speeksel, bloedplaatjes en lymfocyten van patiënten gestegen zijn [Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol (2005) 58: 826-832 /// Ciregia F et al. Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry (2016) 6: e904].

Verschillen (patient vs. controle) qua serum- en urine-metabolomen werden toegeschreven aan gedaalde voorziening van acetyl-CoA aan de TCA-cyclus veroorzaakt door een defekt in de glycolyse [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] of een defekt pyruvaat-dehydrogenase (PDH) [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight( 2016) 1: e89376]. Hoewel inconsistent, trekken beide voorstellen de aandacht naar een mogelijke rol voor verstoorde voorziening van reducerende equivalenten aan de mitochondriale OXPHOS (door de TCA-cyclus) bij M.E./CVS. Ondanks de gedeelde overtuiging dat M.E./CVS-cellen fundamentele problemen in het energie-metabolisme vertonen, zetten de tegenstrijdige rapporten aangaande de aard van deze problemen ons aan om de kwestie van de mitochondriale funktie en z’n regulering in M.E./CVS-cellen te her-onderzoeken.

Een belangrijke regulator van de mitochondriale funktie is TORC1 (‘Target of Rapamycin Complex-I’) die cel-groei en energetica reguleert bij verscheidene cellulaire stress voelende mechanismen. Dit mechanisme upreguleert de expressie of nucleair gecodeerde mitochondriale proteïnen, waaronder subunits van de OXPHOS-complexen. Ondanks deze connectie, en de tussenkomst van TORC1 binnen een complex regulerend netwerk dat reageert op intracellulaire stressoren (waaronder energie-voorziening), werd ontregeling van dit signalisering-mechanisme nog niet eerder onderzocht in M.E./CVS-cellen.

Om de rollen van afwijkende mitochondriale funktie en TORC1-signalisering bij M.E./CVS te verduidelijken, hebben we parameters van de mitochondriale funktie in geïmmortaliseerde lymfocyten (genaamd lymfoblasten) uit bloed van patiënten vergeleken met die van gezonde voor leeftijd en geslacht gematchte controles. We vonden dat de mitochondriale funktie in M.E./CVS-cellen inderdaad abnormaal is: een geïsoleerde Complex-V deficiëntie vergezeld van gestegen capaciteit van Complexen I tot IV, verhoogd membraan-potentiaal, upregulering van TORC1-aktiviteit en gestegen expressie van diverse mitochondriale proteïnen betrokken bij ATP-genererende katabole mechanismen. Dit patroon van veranderingen qua mitochondriale funktie in M.E./CVS-lymfoblasten is duidelijk verschillend van wat we observeerden als we gebruik maakten van dezelfde benadering bij andere neurologische aandoeningen (bv. de mitochondriale hyperaktiviteit in lymfoblasten bij Parkinson’s en Fragiel X syndroom [erfelijke aandoening] die we rapporteerden). Het suggereert een model waarbij een primaire deficiëntie qua Complex-V funktie is betrokken, gecombineerd met homeostatische, compenserende upregulering van TORC1-aktiviteit en expressie van mitochondriale proteïnen.

2. Materialen & Methodes

2.1. Deelnemers

Twee groepen: M.E./CVS-patiënten (n = 51, 86% vrouwen, mediane leeftijd 50, leeftijden 26-70) of gezonde controles (n = 22, 68% vrouwen, mediane leeftijd 41, leeftijden 21-58) zonder enige familiale geschiedenis van M.E./CVS of spierpijn en ook niet samenwonend met M.E./CVS-patiënten. […]

M.E./CVS-diagnose op basis van de Canadese Consensus Criteria. Beoordeling van post-orthostatisch tachycardie syndroom co-morbiditeit. ‘Depression, Anxiety and Stress Scale’ vragenlijst [angst, depressie en veralgemeende stress] & ‘Epworth Sleepiness Scale’ vragenlijst [slaap-patroon]. Beoordeling van M.E./CVS-ernst op basis van Richardson & Lidbury’s ‘Weighted Standing Time’ [Weighting of orthostatic intolerance time measurements with standing difficulty score stratifies ME/CFS symptom severity and analyte detection. J Transl Med (2018) 16: 97 => 20 min staan zonder hulp; hartslag, bloeddruk en zuurstof-saturatie meting vóór en om de 2 min + score van de ondervonden moeite]. […]

[…]

2.2. PBMC-isolatie uit bloedstalen en immortalisatie

[…]

2.3. Lymfoblast-culturen

[…]

2.4. Telling van levensvatbare cellen

[…]

2.5. Mitochondriale massa & mitochondriaal membraan potentiaal (MMP)

Testen met de mitochondriale kleurstoffen MitoTracker® Green FM & MitoTracker® Red CMXRos. Beide binden specifiiek op mitochondriale membranen, MitoTracker® Red binding is afhankelijk van het membraan-potentiaal (Δψm), MitoTracker® Green niet. […]

[…]

2.6. Mitochondriale Stress Test (Seahorse respirometrie)

[…] Het zuurstof-verbruik (‘oxygen consumption rate; OCR in pmol/min) werd gemeten vóór (basale OCR) en nadat 1 µM oligomycine (ATP-synthase inhibitor), 1 µM CCCP (carbonyl-cyanide m-chlorofenyl hydrazone, [chemische inhibitor van de oxidatieve fosforylatie, vernietigt het mitochondriaal membraan-potentiaal]), 1 µM rotenon (Complex-I inhibitor) & 5 µM antimycine-A (Complex-III inhibitor) werd toegevoegd. Dit levert OCR-waarden op voor respiratoire ATP-synthese (oligomycine-sensitief), de maximum OCR bij CCCP-ontkoppelde mitochondrieën en de rotenon-sensitieve OCR (toe te schrijven aan ontkoppelde Complex-I aktiviteit), de antimycine-sensitieve Complex-II/III aktiviteit, de OCR door mitochondriale werking (bv. proteïnen-import) buiten de ATP-synthese […] (zgn. ‘proton-lek’ [diffusie van protonen zodat die niet meer kunnen bijdragen tot de synthese van ATP, die energie gaat verloren], niet-respiratoire zuurstof-consumptie (bv. door cellulaire en mitochondriale oxygenasen & oxidasen), en de respiratoire ‘reserve-capaciteit’ (over-capaciteit van de respiratoire elektron-transport-keten die niet wordt gebruikt bij basale respiratie).

2.7. Glycolytische stress test

De extracellulaire verzuring (‘Extracellular Acidification Rate’, ECAR) van levende, intacte lymfoblasten werd gemeten via een gemodificeerde glycolyse stress-test in de ‘Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer’ […]. Via de injektie-poorten van het toetsel werden de volgende molekulen (chronologisch) tot de aangegeven finale concentraties toegediend: glucose (10 mM), oligomycine (2 μM), rotenon (1 μM) & antimycine-A (5 μM) (gecombineerd), 2-deoxyglucose (50 mM). De behandeling met rotenon/antimycine liet de bepaling toe van de impact van elektron-transport op de ECAR door respiratoire verzuring gekoppeld aan de passage van glycolytisch pyruvaat door de TCA-cyclus. […]

2.8. ‘Steady-state’ ATP-analyse

De ‘steady-state’ intracellulaire ATP-concentratie werd bepaald d.m.v. luciferine bioluminescentie.

2.9. Intracellulaire Reactive Zuurstof Soorsten Species (ROS)

[…]

2.10. Mitochondriaal of EBV genoom ‘copy-number’

Amplificatie en detektie van twee mitochondriaal gecodeerde genen (mtND1 & mtND4).

[…]

2.11. 4E-BP1 fosforylatie (TOR aktiviteit)

TOR inhibitie door 0,5 μM Torin2 […]

2.12. ‘Western blotting’

[…]

2.13. Cel-proteomica

[…]

2.14. Kwantificatie & statistische analyse

[…]

3. Resultaten

3.1. Ex vivo lymfocyten zijn metabool ‘quiescent’ en die van M.E./CVS-patiënten sterven sneller dan die van controles

Hoewel de expressie van mitochondriale proteïnen gestegen is in het speeksel, de lymfocyten en de bloedplaatjes bij M.E./CVS [zie hierboven], zijn fysiologische metingen van de respiratoire funktie en capaciteit in M.E./CVS lymfocyt-mitochondrieën naar verluidt gereduceerd [zie Myhill S et al. eerder]. Een mogelijke verklaring is dat de ex vivo [buiten het lichaam] M.E./CVS-lymfocyten dieper ‘quiescent’ [in een staat of periode van inakiviteit of rust] zijn (metabolisme meer onderdrukt) dan controle-cellen. We onderzochten dit door het vergelijken van de respiratie in geïmmortaliseerde lymfocyten (lymfoblasten) van M.E./CVS-patiënten en controles met deze van lymfocyten van een subgroep van dezelfde deelnemers-groep. Hoewel de M.E./CVS-lymfocyten lagere graad qua respiratie leken te hebben dan controles, was het verschil niet significant. De basale respiratie in patiënten- zowel als controle-lymfocyten lag 2 orden van grootte lager dan in de geïmmortaliseerde cellen, en benaderde de ondergrens van wat detekteerbaar is voor het instrument, zoals bij eerder gerapporteerde experimenten met dit cel-type [zie Tomas C et al. (2017) eerder]. Dit bevestigde dat ex vivo lymfocyten van zowel patiënten als controles in een toestand van fysiologische quiescentie verkeren en zodoende wellicht niet representatief voor metabool aktieve cellen in vivo.

Een andere mogelijke bijdragende factor tot de gerapporteerde daling qua mitochondriale aktiviteit in M.E./CVS-lymfocyten t.o.v. controles, is een verhoogde sterfte van M.E./CVS-lymfocyten vergeleken met controles. We bepaalden daarom de leefbaarheid met verloop van tijd voor M.E./CVS-lymfocyten versus gezonde controles. Er was een dramatisch grotere sterfte van de M.E./CVS-lymfocyten dan die van controles, suggererend dat eerder gerapporteerde reducties qua M.E./CVS-lymfocyten mitochondriale funktie wellicht het resultaat is van een hoger aandeel dode cellen bij de onderzochte populatie. Als dit de in vivo levensduur van ongeaktiveerde lymfocyten weerspiegelt, zou dit resultaat ook suggereren dat de ‘turn-over’ van ongeaktiveerde lymfocyten bij M.E./CVS-patiënten wellicht dramatisch gestegen is.

3.2. ATP-synthese door Complex-V is inefficiënt in M.E./CVS-lymfoblasten

De voornoemde resultaten suggereren dat lymfoblasten wellicht beter de funktie van aktief metaboliserende cellen in vivo weerspiegelen, inclusief geaktiveerde leukocyten zoals deze die betrokken kunnen zijn bij inflammatoire processen voorkomend bij M.E./CVS-patiënten. We gebruikten daarom in de rest van de studie lymfoblasten om de mitochondriale funktie in M.E./CVS-cellen te onderzoeken. De creatie van lymfoblasten omvat immortalisatie door EBV-infektie en integratie van het EBV-genoom in het lymfocyt-genoom. We bepaalden daarom de EBV-genoom ‘copy-numbers’ (d.m.v. qPCR) en vonden geen significant verschil tussen patiënten en controles [het genoom ‘copy-number’ van een EBV-gen is onveranderd]. Bovendien was er geen effekt van het EBV-genoom ‘copy-number’ op de parameters voor mitochondriale en cel stress-signalisering parameters die we maten, bij geen van de groepen ([…] p > 0.05).

In M.E./CVS-lymfoblasten, was de basale respiratie lichtjes verhoogd en de mate van O₂-verbruik door ATP-synthese (oligomycine-sensitieve component van de basale respiratie) lichtjes onderdrukt, maar geen van beide veranderingen was statistisch significant. De mate van ATP-synthese door Complex-V, als deel [%] van de basale OCR, was echter significant gedaald (ca. 15% t.o.v. controles) in M.E./CVS-lymfoblasten, wat duidt op een inefficiëntie qua respiratoire ATP-synthese. Deze inefficiëntie, specifiek door Complex-V, impliceert een Complex-V defekt of inhiberende ontregeling.

Aangezien de absolute mate van ATP-synthese niet significant was gewijzigd, ondanks het Complex-V defekt, anticipeerden we dat rustende [‘steady state’] M.E./CVS-cellen homeostatisch normale ATP-waarden behouden. Om dit te verifiëren, bepaalden we de totale-cel ATP-waarden en vonden geen verschil tussen M.E./CVS- en controle-lymfoblasten.

3.3. M.E./CVS-lymfoblasten vertonen gestegen respiratoire capaciteit, aktiviteit en expressie van OXPHOS-complexen die funktioneel normaal zijn (uitgezonderd Complex-V)

Om een normale mate van ATP-synthese en ‘steady-state’ waarden te bereiken, kunnen M.E./CVS-lymfoblasten compenseren voor de verminderde efficiëntie van respiratoire ATP-synthese door het upreguleren van respiratoir elektronen-transport. Dit bleek het geval te zijn gezien de gestegen maximum OCR van de CCCP-ontkoppelde mitochondrieën [zie ‘methodes’] en de voornaamste bijdragen factor hieraan, ontkoppelde O₂-consumptie door Complex-I (rotenon-sensitief) alsook de reserve respiratoire capaciteit die niet wordt aangewend bij basale respiratie. Deze verhoogde respiratoire capaciteit in M.E./CVS-mitochondrieën impliceert een toename van de expressie, import of aktiviteit van de proteïnen van deze complexen en de ondersteunende mechanismen. Om na te gaan of dit het geval was, gebruikten we semi-kwantitatieve ‘western blotting’ op ruwe lysaten van M.E./CVS- en controle-lymfoblasten om de relatieve expressie-waarden van indicatieve subunits van elk van de 5 mitochondriale respiratoire complexen te testen. We vonden significante stijgingen van de waarden voor Complex-I, -II & -IV subunits. Kleinere toenames van de waarden van subunits in de anderen complexen (III, V) waren niet statistisch significant.

Deze resultaten suggereren dat de expressie van de respiratoire complexen in M.E./CVS-cellen homeostatisch toegenomen is om te compenseren voor inefficiënte ATP-synthese. Om deze hypothese verder te testen, voerden we een totale-cel proteomica analyse uit van 16 controle- and 22 patient-lymfoblast cellijnen. Voor meerdere van de individuele subunits van zowel Complex-I en -V, overschreed de gemeten toename in expressie van die subunit alleen de drempel voor statistische significantie. 31 van de 44 Complex-I subunits werden gedetekteerd, 26 daarvan in meer dan 5 stalen, en de meeste vertoonden toenames van hun waarden in M.E./CVS-cellen vergeleken met de controles, significant meer dan wat door toeval zou worden verwacht. De gemiddelde expressie van de Complex-I subunits in M.E./CVS-cellen was significant hoger dan in de controles (1,48 maal, p = 6.3 x 10^-3). 11 van de 12 Complex-V subunits waren ge-upreguleerd, een significant groter deel dan wat door toeval zou worden verwacht. De gemiddelde expressie-waarden waren ook significant gestegen voor de subunits van Complex-V (1,1 maal, p = 3.0 x 10^-3). […]. Als we deze 10% hogere expressie van Complex-V subunits in acht nemen, is de relatieve inefficiëntie van Complex-V in de M.E./CVS-cellen zelfs groter dan gemeten via respirometrie – bijna 25% lager dan de controles.

De expressie van subunits van de andere respiratoire complexen was ook hoger in M.E./CVS-lymfoblasten in onze proteomica-analyse, maar de stijgingen bereikten geen statistisch significante waarden. Hoewel het klein aantal van Complex-II subunits onvoldoende statistische ‘power’ opleverde om significante upregulering te detekteren bij een dergelijke test, leken de waarden van elk van de gedetekteerde subunits gestegen, wat consistent is met de significante toename gezien via ‘western blotting’. Tesamen tonen deze resultaten dat waarden van de belangrijkste mitochondriale OXPHOS-proteïnen verhoogd zijn in M.E./CVS-cellen, wat de gestegen maximum OCR van de Seahorse respirometrie-testen verklaart.

De elekronen-flow van Complex-I naar Complex-III & -IV is de belangrijkste bijdragende factor aan het respiratoir elektronen-transport; de bijdragen van Complex-II in deze cellen is zeer klein. Bij de observatie dat Complex-V inefficiënt funktioneert, een kleinere fraktie bijdraagt aan de basale respiratie in M.E./CVS-cellen dan in controle-cellen, bepaalden we of Complex-I, -III & -IV normaal funktioneren.

In tegenstelling met de partiële bijdrage van Complex-V aan de basale respiratie, vonden we dat de partiële O₂-consumptie bij ontkoppelde elekronen-flow van Complex-I [Complex I OCR als percentage van de ontkoppelde maximum OCR] door Complexen III & IV aan de molekulair zuurstof onveranderd was in M.E./CVS-cellen. Zodoende is het elekronen-transport functioneel normaal in M.E./CVS-cellen en de inefficiëntie qua oxidatieve fosforylatie geïsoleerd tot ATP-synthese door Complex-V. Dit kan worden besloten aangezien een defekt in Complex-I, -III of -IV zou resulteren in het feit dat de elektronen-flow door deze complexen proportioneel minder zou bijdragen aan de totale OCR, zelfs als compenserende upregulering van expressie de respiratie zou normaliseren of zelfs naar hoger dan normale absolute waarden zou brengen. We concludeeren dat elektronen-transport in de M.E./CVS-cellen functioneel normaal is maar qua capaciteit gestegen omwille van verhoogde expressie van de betrokken respiratoir complex proteïnen.

Een andere indicator voor abnormaliteiten qua elektronen-transport is de concentratie radikale zuurstof-soorten (ROS). Deze worden aangemaakt bij elektronen-‘lekkage’ op het punt waar elektronen normaal van Complex-I of -II naar Complex-III gaan. ROS-produktie kan gestegen zijn door een verhoogde flux van elektronen door de elektron-transport-keten of door een ‘downstream’ blokkage die de elektronen-flow afleidt. We hebben daarom de ROS-waarden gemeten in patiënten- en controle-cellen, en vonden geen verandering qua intracellulaire ROS in M.E./CVS-lymfoblasten vergeleken met controles. Dit is consistent met de niet-significante veranderingen qua basale respiratie en suggereert ook dat de elektron-transport-keten (ETC) funktioneel normaal is.

De compenserende stijging van de expressie en aktiviteit van mitochondriale respiratoire complexen aangetoond door onze gegevens, suggereert dat M.E./CVS-mitochondrieën verhoogde door ‘proton motive force’ (PMF [beweging van ionen door het membraan]) aangedreven transport-processen in het mitochondriaal membraan zou moeten vertonen, die mitochondriale biogenese en funktie ondersteunen en behouden. Bijvoorbeeld: de waarden van sleutel proteïnen van de mitochondriale proteïnen-import complexen waren gestegen in de M.E./CVS-proteomen, alsook de waarden van meerdere SLC25 transporters [mitochondriale transporter proteïnen] in het binnenste mitochondriaal membraan. Dergelijke ondersteunende transport-mechanismen dragen bij tot het zogenaamde ‘proton-lek’, dat refereert naar de depletie van de PMF door mitochondriale transport-processen buiten de ATP-synthese door Complex-V. Het proton-lek was significant verhoogd als aandeel van het basaal metabolisme in M.E./CVS-lymfoblasten bij vergelijking met controles.

De voornoemde gegevens duiden er op dat de mitochondriale respiratoire capaciteit in M.E./CVS-lymfoblasten ge-upreguleerd is, vermoedelijk in respons op de inefficiënte ATP-synthese. Dit is gekoppeld met verhoogde depletie van energie door transport-processen waarvan we hypothiseerden dat ze deze zouden omvatten die oxideerbare substraten leveren aan de mitochondrieën. We verwachten daarom dat de niet-mitochondriale katabole processen die deze substraten leveren ook verhoogd zijn. Onze gegevens ondersteunen een dergelijke verschuiving in het metabolisme aangezien de ‘niet-mitochondriale’ OCR, een indicator voor de katabole graad, significant verhoogd was in M.E./CVS-lymfoblasten.

3.4. Mitochondriale abnormaliteiten in M.E./CVS-lymfoblasten zijn gecorrelereerd met ziekte-ernst

Gelet op de voornoemde funktionele abnormaliteiten in M.E./CVS-mitochondrieën, testten we de belangrijkste verhoogde parameters wat betreft correlatie met ziekte-ernst (beoordeling via de ‘Richardson and Lidbury Weighted Standing Test’) [zie ‘methodes’]. We vonden dat ze allemaal gecorreleerd waren met de klinische uitkomsten. Dit levert sterk bewijsmateriaal voor het idee dat de gevonden mitochondriale abnormaliteiten klinisch relevant zijn.

3.5. Mitochondriaal genoom ‘copy-number’ en massa per cel zijn ongewijzigd in M.E./CVS-lymfoblasten maar het mitochondriaal membraan potentiaal is verhoogd

De mitochondriale massa refereert naar totaal mitochondriaal membraan binnen het dynamisch netwerk van mitochondrieën in de cel, terwijl het membraan-potentiaal de lading-gradient over het binnenste mitochondriaal membraan is – wat deel uitmaakt van de totale PMF, die de ATP-synthese door Complex-V (ATP-synthase) aandrijft. Aangezien de expressie van mitochondriale proteïnen ge-upreguleerd is in M.E./CVS-lymfoblasten, was het mogelijk dat dit zou worden weerspiegeld in een toename van de totale cellulaire mitochondriale inhoud. Om dit te beoordelen, hebben we zowel mitochondriaal genoom inhoud t.o.v. het nucleair genoom bepaald, alsook de mitochondriaal membraan ‘massa’ per cel en zagen geen verschillen tussen M.E./CVS- en controle-lymfoblasten. Dit suggereert dat de M.E./CVS-mitochondrieën een hogere concentratie mitochondriale respiratoire proteïnen dan controle-cellen bevatten.

De inefficiënte ATP-synthese door Complex-V betekent dat basale respiratie door M.E./CVS-mitochondrieën ook gereduceerd zou zijn, ware het niet van de compenserende upregulering van hun waarden van het respiratoir complex. Dit laat hen toe normale ATP-synthese te behouden en, zoals werd gezien, gaat dit gepaard met een gestegen respiratoire capaciteit van de elektron-transport-keten (hoofdzakelijke Complex-I aktiviteit). Dit zou resulteren in een overmatig proton-pompende capaciteit met de betrekking tot de gecombineerde vereisten van ATP-synthese door Complex-V en het ‘proton-lek’. De verwachte uitkomst van deze toegenomen reserve qua respiratoire capaciteit zou een verhoogd mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS-cellen zijn, die we hebben bevestigd via het onderzoeken van de verhouding MitoTracker® Red op MitoTracker® Green fluorescentie in M.E./CVS-lymfoblasten.

3.6. De glycolyse in M.E./CVS-lymfoblasten is onaangetast maar waarden van enzymen betrokken bij vetzuur β-oxidatie en de TCA-cyclus zijn verhoogd

Gepubliceerd metabolomica-werk suggereert dat het metabolisme bij M.E./CVS ontregeld is, zodanig dat de voorziening van acetyl-CoA [intermediair voor de TCA-cyclus: pyruvaat + acetyl-CoA => citraat, enz.; levert energie] aan de TCA-cyclus via pyruvaat (afkomstig van de glycolytse) verminderd is en er in plaats daarvan een verschuiving weg van het koolhydraten-metabolisme is, naar alternatieve oxideerbare substraten [zie Armstrong CW et al. hierboven]. Ander werk suggereert dat de glycolyse zelf onverstoord is en dat gereduceerde omzetting van pyruvaat naar acetyl-CoA door PDH verantwoordelijk is voor een gelijkaardig ‘downstream’ gevolg [zie Fluge O et al. hierboven]. Tomas C et al. (2017) [zie eerder] vonden echter geen verschil qua glycolyse tussen lymfocyten van M.E./CVS- en controle-individualen, terwijl Nguyen T et al. [Reduced glycolytic reserve in isolated natural killer cells from Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients: A preliminary investigation. Asian Pac J Allergy Immunol (2018) 10] een daling van de glycolytische capaciteit rapporteerden voor een klein staal NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Om de glycolyse in intacte M.E./CVS-lymfoblasten te onderzoeken, ontwierpen we een geoptimaliseerde Seahorse test om de glycolytische produktie van of lactaat in ‘real-time’ in levende cellen te beoordelen, door het meten van de extracellulaire verzuring (ECAR) van het cultuurmedium. We vonden geen verschil tussen M.E./CVS- en controle-cellen wat betreft de mate, reserve of capaciteit van glycolyse.

Eerdere metaboloom-studies suggereerden dat het lipiden-metabolisme ontregeld is bij M.E./CVS [bv. Nagy-Szakal D et al. Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics. Sci Rep (2018) 8: 10056 /// Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst (2017) 13: 371-379 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480]. Aangezien het vergroot ‘proton-lek’ en ‘niet-mitochondriale’ OCR consistent waren met een toename qua mitochondriale opname en katabolisme van alternatieve oxideerbare substraten, onderzochten we de expressie van mitochondriale vetzuur-transporters en enzymen verantwoordelijk voor vetzuur β-oxidatie in cel-proteomen van M.E./CVS- en controle-lymfoblasten. We vonden dat proteïnen bij beide groepen significant gestegen waren in de M.E./CVS-cellen. De waarden van alle drie de vetzuur-transport-proteïnen (carnitine-acyltransferase-I & -II alsook acyl-carnitine ‘carrier’-proteïne) gestegen waren, hoewel er dit enkel statistische significantie bereikte in het geval van carnitine-acyl-transferase-II. Bovendien waren 17 op 20 proteïnen betrokken bij mitochondriale β-oxidatie ge-upreguleerd (p = 2.6 x 10^-3), met gemiddelde waarden 23 ± 13% hoger dan controles (p = 9.4 x 10^-4). Alle 6 de centrale enzymen van de mitochondriale β-oxidatie cyclus waren ge-upreguleerd (p = 0.016) en de waarde van één ervan (enoyl-CoA hydratase) was significant verhoogd. Als de mate van mitochondriale β-oxidatie verhoogd was in M.E./CVS-cellen in overéénkomst met de expressie van de betrokken proteïnen, zouden deze mechanismen acetyl-CoA aan de TCA-cyclus leveren in een sneller tempo. In overéénstemming hiermee, vonden we dat de expressie van TCA-cyclus proteïnen ook was gestegen in M.E./CVS-cellen. Zodoende bleken 16 op 19 gedetekteerde proteïnen betrokken bij de TCA-cyclus overvloediger aanwezig in het M.E./CVS-proteoom (p = 2.2 x 10^-3). De gemiddelde expressie-waarden van TCA-cyclus proteïnen in M.E./CVS-lymfoblasten lag 17 ± 10% hoger dan in controle-cellen (p = 1.0×10^-3). Tesamen genomen tonen deze resultaten dat M.E./CVS-lymfoblasten een verhoogde capaciteit hebben om mitochondriale β-oxidatie aan te wenden, de oxidatieve fosforylatie aan te drijven met een hoger tempo dan anders het geval zou zijn.

3.7. Stress-voelende mechanismen bij M.E./CVS zijn verstoord – TORC1 is chronisch gehyperaktiveerd

De compenserende werking om ATP-waarden terug naar normaal te brengen in M.E./CVS-lymfoblasten, ondanks de Complex-V inefficiëntie, wordt waarschijnlijk aangedreven door de signalisering-netwerken die diverse soorten cellulaire stress ‘voelen’ en er homeostatisch een antwoord op bieden. Een centraal element bij deze mechanismen, onderling verbonden met alle andere, is het proteïne-kinase TORC1 (‘Target of Rapamycin Complex-I’), dat zorgt voor de coördinatie de translationele upregulering van belangrijke funktionele groepen proteïnen, inclusief nucleair gecodeerde mitochondriale proteïnen. We hebben de aktiviteit ervan gemeten in M.E./CVS- en controle-lymfoblasten door de fosforylatie-toestand te meten van één van z’n belangrijke substraten, 4E-BP1 (‘Eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding protein 1’). 4E-BPs worden gefosforyleerd door TORC1, waarvan de katalytische subunit mTOR (‘mechanistic Target Of Rapamycin’) is. Samen met S6-kinase (S6K), medieert 4E-BP1 de rollen van TORC1 bij het reguleren van de translatie van mRNAs coderend voor belangrijke funktionele groepen proteïnen (in het cytosol). Als één van de sleutel-substraten van TORC1 betrokken bij het reguleren van de proteïne-synthese, wordt 4E-BP1 dikwijls gebruikt als een merker van TORC1-aktiviteit. We vonden dat de waarden van 4E-BP1 fosforylatie significant gestegen waren in M.E./CVS-lymfoblasten en vergezeld gingen van een corresponderende verhoogde respons op de mTOR-inhibitor Torin2. Deze chronische toename van TORC1-aktiviteit zou de verhoogde expressie van mitochondriale proteïnen en respiratoire capaciteit die we vonden in M.E./CVS-lymfoblasten kunnen verklaren.

4. Bespreking

Eerdere ‘steady-state’ metingen en metabole flux metingen van de mitochondriale respiratoire funktie in M.E./CVS-lymfocyten hebben gesuggereerd dat er in M.E./CVS-cellen een veralgemeende reductie qua mitochondriale aktiviteit en respiratoire capaciteit is [zie Tomas C et al. (2017) hierboven]. Het is paradoxicaal dat funktioneel normale OXPHOS complex-I tot -IV aktiviteit [Tomas C et al. Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types. PeerJ (2019) 7: e6500] en gestegen niet-mitochondriale ATP-produktie [zie Lawson N et al. hierboven] ook werden gerapporteerd voor M.E./CVS-lymfocyten, terwijl de expressie van mitochondriale proteïnen ge-upreguleerd bleek in speeksel, bloedplaatjes en lymfocyten van patiënten [zie hierboven].

In dit werk hebben we deze inconsistenties opgelost door de kwestie van mitochondriale funktie en capaciteit in geïmmortaliseerde lymfocyten (lymfoblasten) te herbekijken. Zoals we hier toonden zijn ongeaktiveerde ex vivo lymfocyten ‘quiescent’ en stervend, zodat een verschil tussen patiënten- en controle-groepen van deze quiescentie en/of de mate van cel-dood de eerder gerapporteerde reductie qua mitochondriale aktiviteiten in M.E./CVS-lymfocyten kunnen verklaren. We vonden dat in cultuur-medium M.E./CVS-lymfocyten dramatisch sneller sterven dan controle-lymfocyten. Het is waarschijnlijk dat de M.E./CVS-lymfocyten waarvan de mitochrondriale aktiviteit werd getest in eerdere studies, een groter deel dode cellen omvatte dan de controles. De hogere mortaliteit voor M.E./CVS-lymfocyten is niet verrassend gezien het feit al lang geweten is dat farmacologische inhibitie van mitochondriale respiratie, inclusief Complex-V stoornis, resulteert in apoptotische cel-dood in ex vivo lymfoïde cellen.

In tegenstelling daarmee, zijn de lymfoblasten die in ons werk werden gebruikt metabool aktieve lymfoïde cellen die geaktiveerde lymfocyten, die neuro-inflammatie in vivo aandrijven, beter vertegenwoordigen. Onze resultaten tonen dat M.E./CVS-lymfoblasten een geïsoleerde Complex-V inefficiëntie vertonen die vergezeld gaat wordt door upregulering van mitochondriale proteïnen expressie, inclusief mitochondriale respiratoire complexen en enzymen betrokken bij de TCA-cyclus, vetzuur-opname en β-oxidatie. Deze bevindingen bevestigen dat M.E./CVS-cellen inderdaad een mitochondriale deficiëntie qua generatie van ATP vertonen maar onthullen dat deze specifiek Complex-V omvatten i.p.v. een veralgemeende reductie van alle mitochondriale funkties. Dit profiel van mitochondriale dysfunktie in intacte M.E./CVS-lymfoblasten is anders dan deze die we eerder vonden bij Parkinson’s lymfoblasten, dus kan het geen simpele weerspiegeling zijn van de neuro-inflammatoire processen waarvan wordt geloofd dat ze optreden bij beide ziekten.

Wat kan de oorzaak zijn van een dergelijke mitochondriale Complex-V inefficiëntie? Er zijn drie mogelijkheden: een mutatie in één van de subunits van Complex-V of assemblage-proteïnen, een ontregeling van Complex-V of een vermeerdering van het relatief gebruik van de ‘proton motive force’ voor andere doeleinden (‘proton-lek’) waardoor er minder beschikbaar is voor ATP-synthese. Een mutatie-defekt in Complex-V lijkt onwaarschijnlijk gezien het feit dat eerdere onderzoeken geen ‘single nucleotide’ polymorfisme konden aantonen in Complex-V genen dat verband houdt met de ziekte-toestand [Schlauch KA et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry (2016) 6: e730 /// Billing-Ross P et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2016) 14: 19]. Ontregelende inhibitie van Complex-V is een tweede mogelijkheid. Het is geweten dat mitochondriale ATP-synthase aktiviteit door een waaier aan proteïnen, kleine molekulen en signalisering-mechanismen kan gereguleerd worden, waarvan sommige werken via Complex-V’s eigen inhiberende subunit AIF1. De derde mogelijkheid, dat Complex-V inefficiënt is in M.E./CVS-cellen omwille van het gestegen gebruik van de ‘proton motive force’ door andere processen, wordt gesuggereerd door het vergroot proton-lek dat we hebben gemeten in M.E./CVS-lymfocyten. De M.E./CVS-mitochondrieën vertonen echter een overmaat aan onbenutte respiratoire capaciteit en een gestegen ‘proton motive force’. Dit zou suggereren dat het membraan-potentiaal en de elektron-transport capaciteit in M.E./CVS-cellen meer dan voldoende zijn om toe te laten dat Complex-V met een normale efficiëntie funktioneert. Deze mogelijke oorzaken voor Complex-V inefficiëntie in M.E./CVS-mitochondrieën dient te worden onderzocht.

De verhoogde maximum respiratoire capaciteit, mitochondriale Complex-I aktiviteit en het proton-lek die we vonden in M.E./CVS-lymfoblasten zijn consistent met de hogere expressie van mitochondriale proteïnen die we in deze cellen zagen (beoordeeld via zowel semi-kwantitatieve ‘western blots’ en cel-proteomica. Consistent hiermee werd eerder gerapporteerd dat mitochondriale proteïnen ge-upreguleerd zijn in de M.E./CVS-proteomen van speeksel, lymfocyten en bloedplaatjes [zie hierboven], terwijl verhoogde translocase-aktiviteit [translocasen = transporter-proteïnen] naar de mitochondriale matrix ook werd gerapporteerd [Myhill S]. Alles tesamen suggereren onze resultaten een model waarbij het Complex-V defekt een proximale aktivator is van compenserende upregulering van de expressie van mitochondriale proteïnen.

De gestegen waarden van diverse mitochondriale proteïnen in M.E./CVS-cellen suggereren de mogelijkheid dat mitochondriale biogenese breder geaktiveerd is in deze cellen. We vonden echter dat de mitochondriale membraan ‘massa’ per cel (Mitotracker Green fluorescentie) en het ‘copy-number’ van het mitochondriaal genoom t.ov. het nucleair genoom ongewijzigd waren. Dienoveréénkomstig lijken M.E./CVS-mitochondrieën hogere concentraties van mitochondriale respiratoire proteïnen en katabole enzymen te hebben.

Eén van de belangrijkste ‘upstream’ regulatoren van mitochondriale proteïne expressie is TOR Complex I (TORC1 waarvan de katalytische subunit mTOR (‘mechanistic Target Of Rapamycin’) is. We vonden dat TORC1 aktiviteit gestegen is in M.E./CVS-cellen. Het is geweten dat de expressie van mitochondriale enzymen betrokken bij elektron-transport ge-upreguleerd wordt door TORC1 via selektieve aktivatie van translatie via inhiberende fosforylatie van het TORC1 ‘target’ 4E-BP1. Naast zijn werkingen op de translatie van nucleair-gecodeerde mitochondriale proteïnen, zorgt TORC1 voor upregulering van de expressie van transcriptie-factoren PGC-1α [‘peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α’; lid van een familie van transcriptie co-aktivatoren die een centrale rol speelt bij de regulering van het cellulair energie-metabolisme] […] & TFAM [mitochondriale transcriptie-factor A; aktivator van mtDNA-transcriptie] (translationeel), wat respectievelijk de transcriptie van nucleaire en mitochondriale genen coderend voor mitochondriale proteïnen induceert. Het meest opmerkelijk bij de mitochondriale proteïnen waarvan de translatie ge-upreguleerd wordt door TORC1 zijn de nucleair-gecodeerde subunits van Complexen I & V, de twee respiratoire complexen waarvan de expressie het meest evident verhoogd bleek in de cel-proteomen van M.E./CVS-lymfoblasten.

Mitochondriale enzymen betrokken bij de β-oxidatie van vetzuren behoren tot de vele proteïnen waarvan de expressie ge-upreguleerd wordt door PGC1α en dus indirect door TORC1. Vetzuur β-oxidatie levert acetyl-CoA aan de TCA-cyclus, net zoals de glycolyse, maar het levert meer ATP op. Thermodynamisch klinkt dit logisch, gezien de hogere reductie-toestand van vetzuur-ketens vergeleken met suiker-molekulen. M.E./CVS-cellen zouden hun metabolisme kunnen verschuiven ten voordele van vetzuur β-oxidatie omwille van een deficiëntie van de glycolyse [zie Armstrong CW et al. eerder] of pyruvaat-dehydrogenase die gedeeltelijk pyruvaat oxidieert en acetyl-CoA levert aan de TCA-cyclus [zie Fluge O et al. eerder]. Er werd ook gesuggereerd dat het metabolisme in M.E./CVS-cellen verschuift weg van de glycolyse ten voordele van het pentose-fosfaat pad [proces waarbij o.a. NADPH gegenereerd wordt] dat suikers in het cytosol kan oxideren om reducerende kracht te genereren die kan worden getransporteerd in de mitochondrieën om elektronen-transport aan te drijven [zie Germain A et al. eerder]. Onze resultaten ondersteunen het bestaan van een dergelijke verschuiving maar we vonden geen deficiëntie qua glycolyse-graad, glycolytische reserve of glycolytische capaciteit. Hoewel er rapporten zijn geweest omtrent verminderde mate van glycolyse in M.E./CVS-lymfocyten [zie Nguyen T et al. eerder], contrasteert dit met meldingen van anderen [zie Tomas C et al. (2017) eerder]. In plaats van gereduceerde glycolytische capaciteit die de verschuiving in het metabolisme aandrijft, suggereren onze resultaten dat de veranderingen kunnen worden aangedreven door verhoogd verbruik van alternatieven zoals de β-oxidatie van vetzuren. Er werd eerder gerapporteerd dat de mate van vetzuur-gebruik ongewijzigd was in gepermeabiliseerde M.E./CVS-lymfocyten [zie Tomas C et al. (2019) eerder]. Het permeabilisatie-proces (met verlies van cytoplasmatische cellulaire inhoud, bv. metabolieten) of de metabole quiescentie en hogere sterfte van M.E./CVS-lymfocyten kan echter de resultaten in die eerdere studie hebben verdoezeld. Het zou waardevol zijn om bij toekomstige experimenten de mate van vetzuur-verbruik in M.E./CVS- en controle-lymfoblasten te meten.

TORC1 is niet het enige cellulaire stress waarnemende proteïne dat expressie van proteïnen betrokken bij cellulair metabolisme en mitochondriale funktie reguleert. Het werkt in overleg met AMPK als onderdeel van een complex stress-‘voelend’ netwerk. AMPK wordt geaktiveerd door een waaier aan cellulaire stressoren inclusief ATP-insufficiëntie, verhoogde cytosol Ca²⁺-concentraties en oxidatieve stress. Als primaire ATP-sensor is AMPK betrokken bij mitochondriale ziekte en aktiveert meerdere katabole mechanismen die alternatieve oxideerbare substraten aan de mitochondrieën leveren – inclusief aminozuren en vetzuren. In M.E./CVS-cellen, met hun chronisch inefficiënte ATP-synthese, wordt verwacht dat AMPK chronisch geaktiveerd is en deelneemt aan de compenserende upregulering van de mitochondriale respiratoire capaciteit die we observeren. Ondanks lagere ‘steady-state’ ATP-waarden, was de AMPK-aktivatie toestand echter niet significant verschillend tussen gecultiveerde spiercellen van CVS-patiënten (Fukuda criteria) en gezonde controles [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Toekomstig werk zou daarom de hypothese moet testen dat AMPK chronisch geaktiveerd is in M.E./CVS-lymfoblasten.

5. Besluiten

Onze resultaten tonen dat in M.E./CVS-lymfoblasten er een geïsoleerde Complex-V inefficiëntie is voor ATP-synthese in de laatste stap van de mitochondriale oxidatieve fosforylatie. Dit gaat gepaard met meerdere homeostatische compensaties, inclusief verhoogde respiratoire capaciteit, Complex-V expressie en capaciteit voor vetzuur β-oxidatie. Tesamen lijken deze compenserende veranderingen voldoende om te voldoen aan de normale noden van een aktief metabolisme ondanks de inefficiëntie van ATP-synthese door Complex-V. Zodoende bleken de ‘steady-state’ ATP-waarden en absolute ATP-synthese beiden bijna normaal in M.E./CVS-cellen. Dit kan er echter voor zorgen dat cellen minder in staat zijn te reageren op verdere acute toenames qua ATP-vereisten, omdat de betrokken signalisering en metabole mechanismen al chronisch ge-upreguleerd zijn. Er werd gerapporteerd dat AMPK-aktiviteit in gecultiveerde spiercellen van CVS-patiënten (Fukuda criteria) niet reageren op door elektrische puls geïnduceerde contractie in vitro, maar niet omdat AMPK zelf niet responsief is voor aktivatie door een inhibitor van mitochondriaal Complex-I (metformine) of een directe AMPK-activator (‘compound 991’) [Brown AE et al. Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with ME/CFS. Biosci Rep (2018) 38]. De auteurs suggereerden dat het feit dat CVS-cellen niet reageren op bijkomende energie-vereisten elders ligt. Een mogelijkheid is de reeds gestegen TORC1-aktiviteit, aangezien TORC1 een inhibitor is van de upstream mechanismen die AMPK aktiveren. In elk geval kan deze ‘cellulaire chronische vermoeidheid’ bijdragen tot de onverklaarde vermoeidheid die wordt ervaren door M.E./CVS-patiënten, zoals wordt gesuggereerd door het feit dat alle door ons geobserveerde mitochondriale abnormaliteiten gecorreleerd waren met de ernst van de symptomen (gemeten via de ‘Weighted Standing Time’). Deze correlaties verifiëren ook dat de mitochondriale abnormaliteiten die we hebben gevonden klinisch relevant zijn voor de onderliggende cytopathologische mechanismen en kunnen dienen als biomerkers voor de ziekte.

Post-exertionele malaise is geassocieerd met hypermetabolisme, hypoacetylering & purine-metabolisme ontregeling bij M.E.(cvs)

Het mag nu wel duidelijk zijn dat er bij M.E.(cvs) sprake is van een probleem met de cellulaire energie-voorziening/produktie. De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. Het werk van de Australische metaboloom-specialisten Prof. Neil McGregor & Christopher Armstrong kwam hier dan ook al meermaals ter sprake.

Op het EMERGE 2019 ‘ME/CFS International Research Symposium’ kondigde McGregor onderstaande studie al aan. De bevindingen van McGregor suggereerden nogmaals dat glycolyse – de vroege stap in het proces van energie-produktie – bij M.E.(cvs) uit de hand loopt. Er zijn flink wat enzymen bij glycolyse betrokken dus er kan heel wat mis gaan. Hier wordt weer een stukje van de puzzel ontrafeld…

McGregor gelooft dat een chronische depletie van essentiële metabolieten een cruciale rol speelt bij M.E.(cvs) en aanleiding geeft tot post-exertionele malaise, inflammatie, enz. Het probleem bij de glycolyse zou verband kunnen houden met veranderingen in de acetylering, wat een effekt heeft op de DNA-transcriptie, resulterend in de brede en systemische problemen.

————————-

Diagnostics Vol 9, #3, p 70 (juli 2019)

Post-Exertional Malaise is associated with hypermetabolism, hypoacetylation and purine metabolism deregulation in M.E./CFS cases

Neil R. McGregor (1), Christopher W. Armstrong (2), Donald P. Lewis (3), Paul R. Gooley (2)

1 Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, Parkville VIC 3010, Australia

2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bio21 Molecular Science and Biochemistry Institute, 30 Flemington Road, Parkville VIC 3010, Australia

3 CFS Discovery, Donvale Medical Centre, Donvale VIC 3111, Australia

Samenvatting

Post-exertionele malaise (PEM) is een fundamenteel voorspellend symptoom voor de definitie van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Als de patiënten zich te veel inspannen, ondervinden ze wat ‘payback’ wordt genoemd, resulterend in een verslechtering van de symptomen of een terugval die dagen, weken of zelfs maanden kan aanslepen. Het doel was het beoordelen van de veranderingen in de biochemie geassocieerd met de door de patiënten zelf-gerapporteerde PEM-scores over een periode van 7 dagen en de frequentie waarmee die worden gerapporteerd over een periode van of 12 maanden. 47 M.E./CVS-gevallen en voor leeftijd/geslacht gematchte controles werden klinisch onderzocht, vulden vragenlijsten in, werden onderworpen aan standaard serum-biochemie testen, en hun serum- en urine-metabolomen werden geanalyseerd in een observationele studie. 35 van de 46 M.E./CVS-patiënten rapporteerden PEM in de laatste 7 dagen en deze werden toegewezen aan de PEM-groep. De voornaamste biochemische verandering gerelateerd aan de PEM-ernst van deze 7 dagen was de daling van het purine-metaboliet, hypoxanthine. [purinen = bouwstenen, organische basen van DNA/RNA] Deze afname correleerde met wijzigingen van de glucose/lactaat-verhouding die zeer suggestief is voor een glycolytische anomalie. Verhoogde excretie van urine-metabolieten in de 7-daagse respons-periode geven een hyper-metabole gebeurtenis aan. Er werden stijgingen van de urine-excretie van methylhistidine (spier-proteïne afbraak), mannitol (ontregeling van de intestinale barrière) en acetaat opgemerkt bij het hyper-metabool voorval. Deze gegevens duiden er op dat hypo-acetylatie aan de gang was, wat ook gerelateerd kan zijn met ontregeling van meerdere cytoplasmatische enzymen en DNA-histoon regulering. [Histonen zijn specifieke eiwitten die samen met het DNA in de celkern het chromatine vormen. Een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt.] Deze bevindingen suggereren dat de primaire gebeurtenissen die gepaard gaan met PEM te wijten zijn aan hypo-acetylering [acetyleren = (enzymatisch) plaatsen van acetyl-groepen (O=C-CH₃) op proteïnen; in het geval van histoon-eiwitten regelt dit de vertaling van DNA (dat rond de histonen is gewikkeld) naar RNA] en verlies van metabolieten tijdens de acute PEM-respons.

1. Inleiding

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een medisch onverklaarde aandoening die overwegend voorkomt bij vrouwen. Ze wordt gekenmerkt door persisterende of terugkerende vermoeidheid en veranderde responsen op inspanning, en wijzigingen in de normale slaap-struktuur. Post-exertionele malaise (PEM) komt 10,4 keer frequenter voor bij M.E./CVS-patiënten vergeleken controles [Brown A & Jason LA. Meta-analysis investigating post-exertional malaise between patients and controls. J. Health Psychol. (2018)]. Er is echter weinig bekend omtrent de onderliggende pathofysiologie van PEM.

Er werd gerapporteerd dat vrouwen met M.E./CVS biochemische veranderingen vertonen die consistent zijn met de ontregeling van glycolyse en ureum-cyclus aktiviteit [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639]; deze werden aangegeven door stijgingen van de nuchtere serum metaboloom glucose ‘s morgens vroeg en dalingen qua lactaat en acetaat. De ontregeling van de glycolyse op het niveau van pyruvaat-dehydrogenase werd door andere researchers bevestigd [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Deze ontregeling van de glycolyse resulteert in afnames qua acetaat en aktivatie van histoon-deacetylatering, alsook ontregeling van acetylering van cytoplasmatische en mitochondriale enzymen. Belangrijk: histoon-deacetylase 2 (HDAC2) bleek 4 maal hoger en HDAC3 2 maal hoger bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles [Jason L et al. Increased HDAC in association with decreased plasma cortisol in older adults with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2011) 25: 1544-1547]. Ter verdere ondersteuning: een studie van gen-upregulering bij M.E./CVS-patiënten, na een inspanning-test, onthulde dat twee histoon-genen ge-upreguleerd waren [Whistler T et al. Exercise responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control subjects. BMC Physiol. (2005) 5: 5]. Analyse van HDAC binding-plaatsen binnen de genen van die studie, toonde dat 19 van de 20 ge-upreguleerde genen binding-plaatsen hadden voor HDAC1 & HDAC2 maar ook leden van de SMAD transcriptie-factor familie [intracellulaire proteïnen die signalen van buiten de cel overbrengen naar de cel-kern waar ze gen-transcriptie aktiveren] die het signaal overbrengen van de ‘transforming growth factor’ beta (TGF-β) receptor, – namelijk SMAD1, SMAD4 & SMAD5. De studie door Whistler et al. [zie hierboven] ondersteunt ook de hypothese dat wijzigingen qua acetylering kunnen optreden wanneer M.E./CVS-patiënten PEM hebben. Er werden ook anomalieën in TGF-β geïdentificeerd in enkele M.E./CVS-studies [bv. Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad Sci. USA (2017), 114: E7150-E7158; zie ook ‘TGF-β1 expressie in PBMCs bij CVS’] maar niet bij alle. Geen enkele daarvan werden echter beoordeeld in funktie van PEM-aktiviteit. Deze gegevens duiden er op dat de verandering qua glycolyse bij M.E./CVS gerelateerd kan zijn met op z’n minst één of een combinatie van effekten: (1) histoon-deacetylering; (2) een chronische daling van de acetaat-produktie via glycolyse; (3) ontregeling van cytoplasmatische en mitochondriale enzyme acetylering.

Er werden ook dalingen van het purine-metaboliet, hypoxanthine, gevonden in de serum-metabolomen van vrouwen in ochtendlijke nuchtere stalen [zie Armstrong CW et al. hierboven] en die wezen mogelijks op reducties van de capaciteit om ATP aan te maken. Tijdens inspanning gebeurt de afgifte van hypoxanthine door spieren gedeeltelijk via een hyper-metabole gebeurtenis wanneer de waarden van mitochondriaal/cytoplasmatisch ATP dalen. De hyper-metabole gebeurtenis van de afgifte van metabolieten door de spieren gaat gepaard met inhibitie van proteïne-synthese in spieren op het moment dat de inspanning start. Die zelfde gebeurtenis treedt op in lymfocyten wanneer de glycolyse geïnhibeerd wordt. Hoewel er meerdere immune kwesties werden ontdekt bij M.E./CVS-patiënten, werd het onderliggende mechanisme achter de veranderingen nog niet geïdentificeerd. Aktivatie van glycolyse en histoon-acetylering zijn essentiële stappen bij in immuun-aktivatie, in het bijzonder voor T-cellen en NK-cellen. Een interessante studie [niet specifiek over M.E.(cvs)] met lymfocyten toonde dat wanneer de ATP-waarden daalden na inhibitie van de glycolyse en de adenosine afbraak-produkten stegen, het inbouwen van leucine [aminozuur] in proteïnen dramatisch werd geïnhibeerd. Dus: de immuunsysteem-kwesties bij M.E./CVS kunnen het resultaat zijn van glycolyse- en acetylering-ontregeling, resulterend in een verminderd vermogen om DNA te vertalen naar proteïnen en daardoor proteïne-synthese. Er is ook bewijsmateriaal dat een switch aangeeft naar het gebruiken van vertakte-keten aminozuren als energiebron, bijzonderlijk tijdens uitputtende omstandigheden [Georgiades E et al. Chronic Fatigue Syndrome: New evidence for a central fatigue disorder. Clin. Sci. (2003) 105, 213-218].

Acetaat [zout of ester van azijnzuur] wordt geassocieerd met controle van meerdere enzymen binnenin de cel, die cruciaal kunnen zijn voor de biochemische veranderingen bij M.E./CVS. Er werden in het totaal of 1.750 cellulaire proteïnen geïdentificeerd met het kenmerk acetaat te binden en de proteïne-funktie te wijzigen; deze omvatten DNA-replicatie (52 proteïnen), DNA-herstel (72 proteïnen), cel-cyclus omschakeling (132 proteïnen), nucleotide uitwisseling factoren (55 proteïnen), en acetylering en deacetylering (21 proteïnen). De biochemie van deze door acetaat gereguleerde gebeurtenissen kan secundair zijn aan de afname van acetaat maar hebben waarschijnlijk diepgaande effekten op de cellulaire funktie bij M.E./CVS.

De doelstelling voor dit artikel was het beoordelen van de 7-dagen PEM-ernst en 12-maanden symptoom-frequentie scores, en gerelateerde biochemie (bloed & urine) bij M.E./CVS-patiënten en controles. Verbanden tussen de PEM-scores werden onderzocht gebruikmakend van standaard serum-biochemie, beoordeling van 24uurs urine, en een bloed- en urine-metaboloom.

2. Methodes

Er werden 46 M.E./CVS-patiënten en 26 individuen voor leeftijd en geslacht gematcht, zonder vermoeidheid gerecruteerd. […] De M.E./CVS-groep had de diagnose gekregen op basis van de Canadese richtlijnen en bijbehorende exclusie-criteria. De ‘Depression Anxiety Stress assessment’ (DASS) werd gebruikt ter beoordeling van de psychiatrische co-morbiditeit. […]

2.1. Klinische metingen

De individuen ondergingen een volledig klinisch onderzoek […] criteria voor de Canadese M.E./CVS-richtlijnen. Ze vulden allemaal meerdere vragenlijsten in. […]

2.2. Biochemie

[…] Bloedafname voor standaard serum-biochemie […] of een metaboloom. Tweede urine-staal na het opstaan […]. Binnen 6 h bloedstaal […] opslag -80 °C […] voor NMR-analyse […]. Er werden 29 metabolieten per serum-staal en 30 per urine-staal geïdentificeerd.

2.3. Data-analyse

De metaboloom-gegevens werden voorbereid in µM en als % (metaboliet-concentratie gedeeld door totale concentratie of metabolieten in elk staal). […]

3. Resultaten

3.1. Demografie

Om de PEM biochemie te onderzoeken, kozen we voor een opdeling van de M.E./CVS-groep op basis van aan-/afwezigheid van significante PEM-responsen gedurende de laatste 7 dagen (PEM, NoPEM – d.w.z. degenen zonder huidige symptomen, controles (C)). […] Er werden geen verschillen gevonden voor plotse vs graduele aanvang of triggers bij aanvang (bv. infekties) (significantie p < 0.01). […] Los va de PEM-scores waren er geen verschillen qua symptoom-profielen tussen de NoPEM- en PEM-groepen. Beiden groepen vertoonden hogere scores t.o.v. controles.

3.2. Biochemie

[…] De M.E./CVS-groepen hadden significante dalingen qua serum-hypoxanthine (NoPEM 4,4 maal lager, PEM 2,4 maal lager vs controles), serum-lactaat (NoPEM 1,9 maal lager, PEM 1,6 maal lager vs controles), fenylalanine [aminozuur] (zowel NoPEM als PEM 1,3 maal lager vs controles). Glucose was gestegen bij de M.E./CVS-patiënten (zowel NoPEM als PEM 1,2 maal hoger vs controles). In de urine was de daling van acetaat het grootst (NoPEM 2,5 maal lager, PEM 1,5 5 maal lager vs controles) en dit was statistisch verschillend tussen de NoPEM- and PEM-subgroepen (p < 0.01). De excretie van methylhistidine was hoger in de PEM-subgroep (1,6 maal) en controle-groep (1,3 maal), respectievelijk, vergeleken met de NoPEM-subgroep. In het faecaal metaboloom was het % butyraat [boterzuur; een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten] verhoogd in de NoPEM-groep vergeleken met zowel de PEM- als controle-groep. […]

[…] Uit de correlatie-analyse van de totale groep bleek dat de 7-dagen PEM score en 12-maanden frequentie van PEM scores positief gecorreleerd waren met serum-glucose en negatief gecorreleerd met hypoxanthine, fenylalanine, lactaat en threonine. […] De absolute urine-waarden toonden een significante correlatie tussen de 7-dagen PEM score met mannitol, serine, acetaat, methylhistidine en glucose. De 12-maanden frequentie van PEM correleerde enkel met een afname qua acetaat. De gegevens omtrent urine-percentage toonden afnames qua ureum, pyruvaat en acetaat met zowel de 7-dagen PEM ernst als 12-maanden frequentie scores. De enige faecale component die statistische significantie bereikte, was het percentage uracil [RNA-base]. Deze gegevens tonen dat een significante renale concentrering kwestie speelt bij de M.E./CVS-groep tijdens een PEM-gebeurtenis en dit was hoofdzakelijk gerelateerd met afnames qua ureum en acetaat. Om dit na te gaan, berekenden we de serum/urine-verhoudingen van meerdere metabolieten. De 7-dagen PEM van PEM correleerde met de volgende verhoudingen: serum-acetaat/urine-acetaat (r = -0.44, p < 0.002), serum-tyrosine/urine-tyrosine (r = -0.40, p < 0.006), serum-serine/urine-serine (r = -0.39, p < 0.008), serum-creatine/urine-creatine (r = -0.38, p < 0.009) en serum-leucine/urine-leucine (r = -0.37, p < 0.01). Dus: de 7-dagen ernst van PEM was geassocieerd met een gestegen urinaire excretie van metabolieten in de M.E./CVS-groep en dit was geassocieerd met een reductie van meerdere serum-metabolieten inclusief het belangrijk proteïne-synthese regulerend aminozuur leucine.

De serum glucose/lactaat verhouding is zeer vergelijkbaar met de veranderingen in de urine glucose/lactaat verhouding, die consistent is met de verandering die wordt gezien in de serum-acetaat/urine-acetaat verhouding. Dit suggereert dat de serum en urine veranderingen zeer vergelijkbaar zijn. Het beschikbaar acetaat in het serum lijkt dus significant gereduceerd en is het laagst bij de NoPEM-patiënten.

3.3. Purine-metabolisme veranderingen

Aangezien serum-hypoxanthine de voornaamste voorspellende variabele voor wijzigingen van de PEM-scores was, beoordeelden we de verbanden tussen serum-hypoxanthine en de purine-gerelateerde metabolieten. Serum- en urine-hypoxanthine waren lager in de PEM-subgroep vs controles. Hoewel er geen verschil was qua serum-uraat waarden, was de merker voor purine-degradatie in de lever, de serum hypoxanthine/uraat verhouding lager in de M.E./CVS-groep. De verhouding in de NoPEM-subgroep was 5,4 maal lager terwijl in de PEM-groep ze 3,5 maal lager lag. De hypoxanthine/uraat verhouding was negatief gecorreleerd met serum-glucose (p < 0.001), en positief gecorreleerd met serum-lactaat (p < 0.001), de purine-ring precursor aminozuren (p < 0.001), acetaat (p < 0.001) en de totale serum aminozuren (p < 0.006). De correlatie tussen serum-hypoxanthine en de purine-ring precursoren, indicatief voor purine-synthese, was niet verschillend tussen de M.E./CVS-patiënten en de controles […]. De verhouding was echter was significant lager in de M.E./CVS-groep en de purine-ring precursor aminozuren correleerden positief met serum-acetaat (p < 0.001). Zodoende waren de synthese en mogelijks hergebruik van hypoxanthine gereduceerd terwijl purine-afbraak binnen de normale grenzen lag. De waarden van hypoxanthine in het serum waren geassocieerd met de beschikbaarheid van de purine-ring precursoren, de glucose/lactaat verhouding en acetaat. Dit suggereert dat acetylering een belangrijke factor voor de verandering in het purine-metabolisme ontregeling bij M.E./CVS is. De toename van het verlies qua urine-metabolieten tijdens inspanning bij M.E./CVS-patiënten resulteert dus in een verlies van purine-ring precursoren en een daling qua acetaat en hypoxanthine.

4. Bespreking

Dit artikel identificeerde dat de post-exertionele malaise die wordt ervaren door een Australische groep M.E./CVS-patiënten, geassocieerd is met een ontregeling van het purine-metabolisme en lage acetaat-concetraties. Deze ontregeling van het purine-metabolisme gaat gepaard met een wijziging qua glycolytische aktiviteit en een omschakeling naar de ureum-cyclus creatine-fosfaat energie-verbruik [zie Armstrong CW et al. hierboven]. Dit heeft het effekt van het reduceren van de beschikbaarheid van acetaat en upregulering van de histoon-deacetylase aktiviteit. Een 4- en 2-voudige toename van HDAC2 & HDAC3, respectievelijk, werden bevestigd bij M.E./CVS [zie Jason L et al. hierboven], en een zeer hoge waarde van HDAC1 & HDAC2 binding-plaatsen treedt op in de genen die ge-upreguleerd zijn bij M.E./CVS na inspanning [zie Whistler T et al. hierboven]. Hypoxanthine-fosforibosyltransferase is een belangrijk enzyme voor het hergebruik van purinen, adenosine en guanine. Het coderend gen (HPRT1) ligt op het X-chromosoom en geeft aanleiding tot een ongewoon probleem qua regulering. Acetylering en methylatie van één X-chromosom leggen de aktiviteit bij vrouwen stil, wat resulteert in het feit dat slechts één X-chromosoom aktief is voor transcriptie, zoals bij mannen. Dit vormt een mogelijks belangrijk probleem als er een verlies is wat betreft het stilleggen van het tweede X-chromosoom. Deze studie omvatte te weinig mannen om dit behoorlijk te kunnen beoordelen. Ontregeling van het stilleggen van een of X-chromosoom kan gerelateerd zijn met de daling qua hypoxanthine-hergebruik en het feit dat vrouwen ernstiger ziek zijn dan mannen [zie Brown A & Jason LA. hierboven]. Studies om deze interessante mogelijkheid te onderzoeken, zijn gerechtvaardigd.

Er is verhoogde urine-excretie van metabolieten geassocieerd met de 7-dagen PEM scores, in het bijzonder van mannitol, methylhistidine, acetaat en glucose. Deze gestegen metabolieten-uitscheiding correleert met de door M.E./CVS-patiënten gerapporteerde 7-dagen ernst van PEM-symptomen. De beoordeling van de relatieve hoeveelheid toont dat de uitstroom van metabolieten geassocieerd is met dalingen qua urinair ureum, pyruvaat en acetaat, suggestief voor een energie- en renale concentrering -kwestie, mogelijks geassocieerd met hypo-acetylering, die hoogstwaarschijnlijk optreedt op het tijdstip van het metabolieten-verlies. Bij diabetische nefropathie [langdurig verhoogde glucose-waarden zijn nefast voor de filter-funktie van de nieren], zorgen de renale tubulaire cellen [tubuli = nierbuisjes, onderdelen van de nefronen (filter-eenheden)] voor upregulering van de glycolyse en lactaat-produktie. Dit zou ook het geval kunnen zijn bij deze studie, aangezien de uitscheiding van glucose & acetaat positief gecorreleerd waren met 7-dagen PEM-ernst. Belangrijk: acetaat was negatief gecorreleerd met de 12-maanden frequentie van PEM. Deze wijziging qua renale retentie [al dan niet uitscheiding via de nieren] van acetaat wordt ook ondersteund door de negatieve correlatie tussen de 7-dagen PEM score en de serum-acetaat/urine-acetaat verhouding. Dus: hoe hoger de frequentie aan PEM-gebeurtenissen, hoe groter het verlies aan acetaat. Renale glomerulaire podocyten [glomeruli = groepje capillairen die zorgen voor filtratie van het bloed in de nieren; podocyten = cellen met uitsteeksels die tussenliggende poriën open laten] raken beschadigd door verhogingen van het bloed-glucose bij diabetes-patiënten en dit werd gelinkt aan deacetylering van nefrine [proteïne dat een belangrijk bestanddeel vormt van de filtratie-spleten] en microRNA-aktiviteit. In deze studie lijkt de reductie qua serum-acetaat te resulteren in een conditionele renale hypo-acetylering die verhoogd metabolieten-verlies via de nieren zal toelaten. Renale veranderingen bij diabetes nefropathie gaan ook gepaard met downregulering van beender morfogeen proteïne (BMP [BMP’s = subgroep van de ‘transforming growth factor’s; signaal-molekulen die weefsel-architectuur dirigeren]) receptor funktie en TGF-β gemedieerde transcriptie-factor produktie, en het aanvoeren van BMP-7 herstelt de werking. Hoewel de renale veranderingen gelijkaardig zijn met deze die worden gezien bij centrale diabetes insipidus [stoornis in de produktie van anti-diuretisch hormoon door de hypofyse waardoor het lichaam teveel water gaan verliezen via de urine], proteïne-calorie restrictie en infektie/inflammatoir-gemedieerde gebeurtenissen, waren er geen individuen met diabetes insipidus of met proteïne-calorie restrictie, en ze hadden allemaal een gemiddeld BMI. Deze renale veranderingen bieden bijkomende ondersteuning voor ofwel een inflammatoire oorsprong of mogelijks een energie/acetylering of zelfs een transcriptie-factor probleem. Belangrijk: meerdere studies vonden dat de niveaus van serum-cytokinen niet significant verschillen tussen M.E./CVS en controles, en niet correleren met symptoom-expressie. Daarom zijn studies ter beoordeling van de aktiviteiten van HDAC en BMP transcriptie-factoren bij M.E./CVS aangewezen.

De verandering qua renaal metabolieten-verlies is geassocieerd met gestegen mannitol-excretie, wat suggereert dat een probleem met de gastro-intestinale barrière zou kunnen optreden. NoPEM M.E./CVS-patiënten hadden een 3,2 maal lager urinair mannitol [een suiker-alkohol], anders dan wat wordt gezien bij Multipele Sclerose patiënten. De waarde van urinair mannitol steeg echter met de 7-dagen PEM-scores. Deze toename van mannitol geeft een mogelijke verandering van de intestinale barrière aan, wat consistent is met de bevinding van bakteriemie [aanwezigheid van bakteriën in de bloedbaan] na inspanning bij M.E./CVS [Shukla SK et al. Changes in Gut and Plasma Microbiome following Exercise Challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS ONE (2015) 10: e0145453]. De aanwezigheid van bakteremie wordt ondersteund door de correlatie tussen faecaal uracil en de 7-dagen PEM-score. De stijging qua faecaal uracil was ook gecorreleerd met de serum-hypoxanthine waarde in de PEM-groep, die aantoont dat ze samen stegen als onderdeel van de PEM-geassocieerde hyper-metabole gebeurtenis. Uracil is een afbraak-produkt van RNA maar kan ook van bakteriële oorsprong zijn. Of dit een afbraak in enterocyten [darmcellen] aangeeft of een wijziging in de faecale flora of hun metabotoxinen/toxinen, is niet geweten. Verder onderzoek van deze veranderingen is gewenst.

Er werd ook een toename van 1,6 maal gezien qua urinaire excretie van methylhistidine bij de PEM-subgroep vergeleken met de NoPEM-subgroep. Methylhistidine is een afbraak-produkt van spier-samentrekking proteïnen, volgend op een kortdurende weerstand-inspanning. De synthese van spier-proteïnen wordt gecontroleerd door het beschikbaar leucine & fenylalanine [aminozuren], en door BMP proteïne receptor aktiviteit. In deze studie was urinair methylhistidine positief gecorreleerd met urinair creatine (p < 0.001), leucine (p < 0.001), fenylalanine (p < 0.001) & acetaat (r = +0.47, p < 0.001) voor alle groepen. Een daling qua beschikbaar acetaat tijdens inspanning is geassocieerd met een vermindering qua fosfocreatine-afbraak en is daardoor geassocieerd met verhoogd fosfocreatine [creatine-fosfaat; een gefosforyleerde creatine-molekule die een belangrijke energie-voorraad in spieren en in de hersenen vertegenwoordigt] en mitochondriale energie-voorziening, wat consistent is met de glycolyse/ureum-cyclus energie omschakeling die bij deze M.E./CVS-groep werd geïdentificeerd [zie Armstrong CW et al. hierboven]. Interessant: 3-methylhistidine in niet-geacetyleerde vorm wordt veel meer uitgescheiden wanneer ratten worden blootgesteld aan bakteriële lipopolysacchariden. Het is waarschijnlijk dat de toegenomen excretie van 3-methylhistidine, die we zagen tijdens de 7-dagen PEM-respons, het resultaat is van de verminderde energie-voorziening en de afname van aminozuren, die gemedieerd kan zijn door acetylering. De respons zou echter ook kunnen worden verslechterd door anomalieën van de gastro-intestinale barrière die wordt gesuggereerd door de gestegen bakteremie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten [zie Shukla SK et al. hierboven]. Een alternatief: er kan ook een anomalie in de BMP-regulering betrokken zijn bij de verhoogde uitscheiding van 3-methylhistidine. Dus: een combinatie van minstens drie verschillende gebeurtenissen kan bijdragen tot de gestegen 3-methylhistidine excretie en dit kan worden weerspiegeld in verschillende genetische vatbaarheden binnen verschillende individuen.

De bevindingen dat de PEM geassocieerd is met een verlies aan metabolieten, daling van de acetylering, ontregeling van het purine-metabolisme, verhoogde afbraak van spier-samentrekking proteïnen en bakteremie geassocieerd met inspanning, suggereert dat behandeling zoals graduele inspanning meer schadelijk dan nuttig (wat in sommige studies wordt geclaimd) zijn. Tot het moment dat deze biologische veranderingen verder kunnen worden onderzocht, zou het gebruik van graduele inspanning als therapie voor mensen met een ernstige vorm van M.E./CVS als potentieel schadelijk worden beschouwd. Ter ondersteuning hiervan: het gebruik van graduele inspanning therapie heeft significant protest uitgelokt vanwege M.E./CVS-patiënten die het als nadelig ervaren [zie bv. Geraghty KJ. & Blease C. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome and the biopsychosocial model: A review of patient harm and distress in the medical encounter. Disabil. Rehabil. (2018) 1-10].

Deze studie werd opgezet om metabole veranderingen te onderzoeken bij M.E./CVS-individuen op basis van een ontdekking-hypothese en niet een specifieke hypothese-gestuurde methode om specifieke biochemische gebeurtenissen te beoordelen. De studie, met deze beperkingen, resulteerde in de ontwikkeling van een hypothese die nu dient te worden nagegaan via een typisch hypothese-gestuurd proces. Hoewel de grootte van de studie-groep klein is, reproduceerde het toch eerdere bevindingen maar die dienen te worden bevestigd bij een grotere groep of via meerdere centra. Het gebruik van zelf-gerapporteerde symptomen kan een herinnering-bias introduceren bij de individuen subjects en in een grotere studie moet elke van de variabelen waarvan wordt gevonden dat ze geassocieerd zijn met de ernst van de symptomen (en de verdeling ervan) worden geëvalueerd via andere methodes. Studies die acetylering en z’n gerelateerde DNA-transcriptie veranderingen, en de wijziging van cytosol enzyme-aktiviteit onderzoeken, zouden moeten toelaten meer kennis te krijgen omtrent de mechanismen van het ontstaan van PEM en geschikte therapieën te vinden op basis van de onderliggende biochemie.

5. Besluiten

Deze studie onthulde dat post-exertionele malaise geassocieerd is met veranderingen in glycolyse en acetylering bij M.E./CVS. Deze wijzigingen zijn consistent met een toestand van hypo-acetylering en veranderen waarschijnlijk op een significante manier de histoon-acetylering, en de werking van acetylering en deacetylering bij het controleren van cellulaire enzymatische gebeurtenissen. Gedegen ontworpen studies die deze belangrijke factoren evalueren, zijn aangewezen.

Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome’ uit 2017 (zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’), waar werd aangetoond dat er statistisch significante verschillen zijn in het bio-energetisch profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen van M.E.(cvs)-patiënten t.o.v. controles. Wanneer deze cellen fysiologische stress ondervinden, blijken ze minder capabel om hun respiratie (mitochondriale ademhaling) te verhogen om de stijgende stress te compenseren en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften.

In het huiding artikel (studie gefinancierd door van de ‘Medical Research Council’, ‘Action for ME’, ‘ME research UK’ & de ‘ME Association’) probeerden de onderzoekers na te gaan waaraan de mitochondriale dysfunktie zou kunnen gelegen zijn, door te kijken hoe ’t is gesteld met de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten in dezelfde soort cellen (waar de mitochondrieën direct bereikbaar zijn gemaakt) en in ‘voorlopers van spiercellen’.

Ter herinnering: Oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie. Het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen (I t/m V) gelokaliseerd in het mitochondriaal binnenste membraan: Complex I: NADH/ubiquinon oxidoreductase – krijgt elektronen van NADH en geeft deze door aan co-enzyme Q10 (ubiquinon); elektronen worden verder doorgegeven aan Complex II: succinaat-degydregenase, Complex III: ubiquinol/ferrocytochroom-c oxidoreductase en Complex IV: cytochroom-c oxidase – ze reageren met zuurstof en vormen water; en Complex V: proton-transporterend ATPase gebruikt de protonen om ATP te vormen.

Het lijkt er op dat de mitochondriale dysfunktie bij M.E.(cvs) (waar de al eerder over rapporteerden – zie bv. M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte en elders) te wijten is aan verstoorde cellulaire mechanismen ‘upstream’ (stroomopwaarts) van de werking van de mitochondrieën, m.a.w. niet de mitochondrieën zelf maar systemen die ze sturen zouden zijn aangetast…

—————

PeerJ Vol 7, paper e6500 (March 2019)

Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types

Cara Tomas (1), Audrey E. Brown (1), Julia L. Newton (1,2), Joanna L. Elson (3,4)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne Hospitals, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Centre for Human Metabonomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Er werden eerder abnormaliteiten qua mitochondriale funktie bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) aangetoond, wat impliceert dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. Deze studie bouwt verder op eerder werk dat aantoonde dat mitochondriale ademhaling parameters verstoord zijn in cellen van CVS-patiënten en dit via het onderzoeken van de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten. Er werden twee verschillende cel-types gebruikt in deze studies, om de aktiviteit te bepalen van individuele complexen lokaal – in skeletspier (myotubes [zich ontwikkelende skeletspier-vezels]) (n = 6) – en systemisch – perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) – bij controles (n = 6) en CVS (n = 13). De aktiviteiten van complex-I, -II & -IV, en respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie en glutaminolyse [reeks biochemische reakties waarbij het aminozuur glutamine wordt omgezet naar o.a. pyruvaat/lactaat] werden gemeten gebruikmakend van extracellulaire flux analyse. De cellen werden doorlaatbaar gemaakt, en er werden voor de bepalingen combinaties van substraten en inhibitoren toegvoegd om toe te laten de toestand van de mitochondriale respiratie na te gaan en de aktiviteit van specifieke aspecten van de respiratoire aktiviteit te meten. De resultaten toonden geen significante verschillen qua individuele mitochondriale complexen aktiviteit of respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie of glutaminolyse tussen groepen gezonde controles en CVS-patiënten, noch voor skeletspier (p ≥ 0.190) of PBMCs (p ≥ 0.065). Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse [flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex] aanwendt om de aktiviteit van individuele mitochondriale complexen te onderzoeken in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. De afwezigheid van verschillen qua complex-aktiviteit in CVS PBMCs suggereert dat de eerder geobserveerde mitochondriale dysfunktie in totale PBMCs te wijten is aan oorzaken ‘upstream’ van de mitochondriale admhaling-keten.

INLEIDING

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een uitputtende ziekte die 0,2-0,4% van de bevolking in het V.K. aantast. CVS heeft een significante impact op de levenskwaliteit van patiënten met symptomen zoals ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. De mechanismen achter de etiopathogenese van CVS moeten nog opgehelderd worden. Het gebrek aan kennis omtrent de mechanismen achter de ziekte draagt bij tot de moeilijkheden bij het vormen van een consensus aangaande diagnostische criteria en de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen.

Er werden eerder verscheidene aspecten van mitochondriale dysfunktie gepostuleerd als bijdragende factor tot CVS [referenties beschikbaar]. Vermoeidheid bleek courant bij patiënten met primaire mitochondriale ziekte maar er dient echter te worden opgemerkt dat patiënten met CVS geen primaire mitochondriale mutaties dragen [Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18: 29]. Andere onderzoekers toonden dat bepaalde wijzigingen in het mitochondriaal genoom de kans vergroten op specifieke symptomen bij CVS-patiënten (gastro-intestinale, neurologische en inflammatoire) [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. Journal of Translational Medicine (2016) 14: 19]; deze genomische veranderingen maken de patiënten echter niet vatbaarder voor het ontwikkelen van de ziekte. Eerdere studies hebben aangetoond dat de energie-produktie, inclusief mitochondriale aktiviteit, van totale PBMCs van CVS-patiënten significant verstoord is in vergelijking met een groep gezonde controles [Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1: e89376 /// Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Eén studie, gebruikmakend van extracellulaire flux analyse van complete cellen, toonde dat CVS PBMCs significant verstoorde mitochondriale funktie hebben onder zowel basale omstandigheden als bij maximale stimulatie, bij een aantal experimentele condities [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Dit suggereerde dat CVS-patiënten niet in staat waren om mitochondriale energie-produktie in dezelfde mate aan te wenden als gezonde controles en impliceerde dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. De studie die hier wordt gepresenteerd, werd uitgevoerd om verder te onderzoeken of de mitochondriale dysfunktie die werd gezien in CVS PBMCs te wijten was aan a-typische aktiviteit van individuele mitochondriale complexen, door gebruik te maken van dezelfde techniek als de eerdere studie (extracellulaire flux analyse) maar met gepermeabilseerde cellen i.p.v. complete cellen. Het gebruik van doorlaatbaar gemaakte cellen laat toe om mitochondrieën direct toegankelijk te maken voor substraten zonder cellulaire interferentie in termen van substraat-transport of intracellulaire interakties. De permeabilisatie van cellen laat ook toe om de enzymatische aktiviteit van individuele respiratoire keten complexen te meten wat niet makkelijk is complete cellen. Deze studie onderzoekt de aktiviteit van individuele complexen en componenten van de mitochondriale respiratoire keten in myotubes en PBMCs – myotubes werden gebruikt om de mitochondriale aktiviteit lokaal in skeletspier te onderzoeken, terwijl PBMCs werden gebruikt om de aktiviteit van mitochondriale complexen systemisch te bekijken. Dit werd bewerkstelligd door het permeabiliseren van cellen om er zeker van te zijn dat de mitochondrieën intact blijven en het aanwenden van extracellulaire flux analyse om de zuurstof-consumptie van cellen te registreren na opéénvolgende behandeling met mitochondriale aktivitet veranderende molekulen. Respiratoire parameters werden berekend en vergeleken tussen spiercellen en PBMCs van controles en CVS-patiënten.

Voor deze studie werd saponine aangewend om het cel-membraan doorlaatbaar te maken. Saponine is een cel-permeabilsator die werkt door het vormen van complexen met cholesterol, wat leidt tot een vermindering van de integriteit van het cel-membraan, terwijl de mitochondriale membranen intact blijven. Wanneer mitochondrieën uit cellen geïsoleerd worden, wordt de architectuur en de morfologie van de mitochondrieën gewijzigd, maar permeabilisatie van het cel-membraan laat toe om de architectuur en morfologie van de mitochondrieën normaal te houden, een voordeel van het gebruik van geïsoleerde mitochondrieën, aangezien de mitochondriale funktie eerder een sterk verband met struktuur bleek te vertonen. Permeabilisatie van het cel-membraan laat toe het effekt van substraten op mitochondriale aktiviteit uitgebreid na te gaan doordat endogene substraten toegang krijgen tot mitochondrieën. De toediening van verschillende substraten en inhibitoren wijzigt de mitochondriale ademhaling en laat toe de aktiviteit van individuele componenten van mitochondriale respiratie te meten. In 1955 werd al beschreven dat de mitochondriale ademhaling aktiviteit kan worden gemeten in termen van meerdere respiratoire ‘toestanden’. Toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) worden dikwijls gebruikt als merkers voor mitochondriale respiratoire aktiviteit. Toestand-3 respiratie is wanneer mitochondrieën een hoge concentratie ADP extern hebben, en een hoge zuurstof-consumptie en ATP-synthese waardoor een toestand ontstaat waarbij door ADP gestimuleerde ademhaling kan worden gemeten. Toestand-4 respiratie, anderzijds, is wanneer mitochondrieën een zeer lage externe ADP-concentratie hebben, en weinig of geen ATP-synthese omwille van de complete fosforylatie van ADP naar ATP. De respiratoire controle ratio (RCR) is een maatstaf voor het koppelen van ATP-synthese en elektron-flux, en toont de capaciteit van mitochondrieën om ATP te synthetiseren via de oxidatie van respiratoire substraten.

Dit werk had tot doel te bepalen of de enzymatische aktiviteit van verschillende complexen van de mitochondriale respiratoire keten verschillen tussen CVS-patiënten en gezonde controles, en dit lokaal (skeletspier) of systemisch (PBMC)s.

MATERIALEN & METHODES

Deelnemers aan de studie

Primaire myoblasten werden verkregen via spier-bioptie […]. Alle CVS-patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria […].

[…]

Reagentia

[…]

Cel-culturen & voorbereiding

Myotubes

[…]

PBMCs

[…]

Extracellulaire flux analyse

XFe96 analyser (Agilent Technologies) […]. Zuurstof-consumptie (OCR) werd op 12 tijdstippen gemeten. Drie basale metingen vóór de eerste toevoeging met een mix van de substraten van belang, ADP, FCCP [carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS] & saponine. Nog drie volgende metingen en dan de tweede toevoeging, met oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken]. Daarna nog drie metingen van de OCR en dan de laatste toevoeging met ofwel rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] of kalium-azide [inhibeert cytochroom-c oxidase (complex-IV)], en de laatste finale drie OCR-metingen. De concentratie van saponine werd geoptimaliseerd voor myotubes en PBMCs, en de schade aan de mitochondrieën veroorzaakt door saponine werd bepaald gebruikmakend van cytochroom-c. De optimale concentratie van saponine voor myotubes werd bepaald op 25 mg/ml, voor PBMCs 2,5 mg/ml. […]

Voorbereiding van de molekulen

[pyruvaat/malaat => complex-I gemedieerde respiratie /// succinaat => complex-II gemedieerde respiratie /// tetramethylfenylendiamine(TMPD)/ascorbaat => complex-IV aktiviteit /// palmitoyl-l-carnitine => respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie /// glutamine/malaat => respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse /// ADP => toestand-3 respiratoire aktiviteit /// FCCP => maximale respiratoire aktiviteit /// oligomycine => toestand-4 respiratoire aktiviteit / rotenon => metabole inhibitor / kalium-azide => metabole inhibitor]

Berekening van de parameters

[…]

Toestand-3 respiratie = (gemiddelde van de metingen 4-6) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

Toestand-4 respiratie = (gemiddelde van de metingen 7-9) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

RCR = Toestand-3 respiratie/ Toestand-4 respiratie.

Data-analyse

[…]

RESULTATEN

Respiratoire keten complex aktiviteit in myobutes

[…] Complex-II respiratie (succinaat) en complex-IV aktiviteit (TMPD [tetramethylfenylendiamine; staat elektronen af aan cytochroom-c] & ascorbaat) bleken niet significant verschillend tussen de controle- (n = 6) en CVS- (n = 6) groep voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR […] (p ≥ 0.190).

Er werd geprobeerd complex-I gemedieerde respiratie (gebruikmakend van pyruvaat en malaat), respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie (toevoeging van palmitoyl-l-carnitine) en respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse (toevoeging van glutamine en malaat) te meten. De resultaten voor alle drie de experimenten gaven consistent negatieve waarden voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle- (n = 6) myotubes en daarom was het onmogelijk toestand-3, toestand-4 en RCR voor deze experimenten te berekenen.

Respiratoire keten complex aktiviteit in PBMCs

Er werden PBMCs van gezonde controles en CVS-patiënten gebruikt om verschillende aspecten van mitochondriale respiratoire keten aktiviteit te onderzoeken. De resultaten toonden dat er geen verschil voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR was tussen PBMCs van CVS-patiënten (n = 13) en gezonde controles (n = 6; succinaat controles n = 4) voor geen enkele van de substraat/inhibitor-combinaties (p ≥ 0.065).

BESPREKING

De aktiviteit van verschillende aspecten van de mitochondriale respiratoire keten funktie werden onderzocht via het toedienen van verscheidene substraten en inhibitoren. Het effekt van de verschillende substraten op toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) werd gemeten.

Er werden vijf verschillende combinaties van substraten onderzocht omtrent hun effekten op myotubes en PBMCs – glutamine & malaat; palmitoyl-l-carnitine; pyruvaat en malaat; succinaat; TMPD & ascorbaat. Deze werden toegediend om respiratie ondersteund door glutaminolyse, respiratie ondersteund door vetzuur-oxidatie, complex-I aktiviteit, complex-II aktiviteit, en complex-IV aktiviteit (respectievelijk) te onderzoeken. Ondanks het ontbreken van een verschil qua OXPHOS tussen de controle- en CVS-groepen aangetoond in complete myotubes [Rutherford G. Investigating the biochemical basis of muscle cell dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. PhD thesis, Newcastle University, Newcastle upon Tyne (2016)], hadden deze experimenten tot doel te onderzoeken of meer subtiele en specifieke verschillen optraden in individuele complexen. Er werden PBMCs gebruikt om te bekijken of de specifieke lokatie van eerder gerapporteerde abnormaliteiten geïdentificeerd in totale cellen kon worden vastgepind op specifieke complexen of mechanismen [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding].

In myotubes gaven slechts twee van de substraten-combinaties nuttige resultaten. De toevoeging van pyruvaat & malaat, palmitoyl-l-carnitine, en glutamine & malaat leverde negatieve waarden op voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle-myotubes (n = 6). De toevoeging van de molekulen leek een effekt te hebben op de OCR, maar niet het geanticipateerd effekt. Het resulteerde slechts in meer negatieve OCR-metingen bij elke toediening en gaf niet de verwachte toename na de eerste toediening. Deze experimenten werden een aantal keer herhaald met elke keer gelijkaardige vaststellingen. Dit suggereert dat deze techniek voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen misschien wel niet geschikt is voor het gebruik in myotubes. Er waren wel succesvolle metingen van het effekt van succinaat, en TMPD & ascorbaat voor controle- en CVS-myotubes. Er werd geen verschil gezien qua toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR tussen de controle- en CVS-groepen. Dit geeft aan dat er geen abnormaliteiten zijn qua respiratoire aktiviteit gelinkt aan glutaminolyse of complex-IV aktiviteit in CVS-myotubes. Dit stemt overéén met eerdere research waarbij, gebruikmakend van 3 carboxyl-¹⁴C gelabelde substraten, werden gevonden dat er geen verschil is tussen CVS en controle skeletspier-cel complex-I, complex-II+III, complex-III of complex-IV aktiviteit [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738]. Echter: gezien de inconsistentie tussen substraten-metingen bij deze studie, waarbij enkele substraten succesvolle metingen gaven en andere niet, en de grote fouten-marges aangegeven voor elk van de substraten (inclusief deze waarvoor we toestand-3 & -4 respiratie succesvol konden afleiden), dient het gebruik van deze techniek in vraag te worden gesteld wat betreft accuraat meten van de aktiviteit van specifieke aspecten van de mitochondriale ademhaling in gepermeabiliseerde myotubes. Andere technieken zoals fosforescentie zuurstof-sensitieve probes en spectrofotometrische enzyme-testen zouden moeten worden aangewend om dezelfde stalen in toekomstige experimenten te analyseren, om te bepalen of ze meer accurate resultaten kunnen geven dan deze die hier met de XFe96 werden bekomen en de consistentie ertussen te bekijken. Er zijn slechts zeer weinig eerder gepubliceerde studies die gebruikmaakten van extracellulaire flux analyse om de mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde myotubes te detekteren. Eén studie gebruikte extracellulaire flux analyse en hoge-resolutie respirometrie [HRR of oxygrafie; gestandardiseerde metingen van de mitochondriale respiratoire funktie] om de verschillen tussen de technieken te bepalen [bij obese mensen]. De studie toonde dat de metingen van de Seahorse XFe24 hogere waarden qua variabiliteit hadden voor elk gegevens-punt, wat de hier gerapporteerde gegevens ondersteunt en aantoont dat extracellulaire flux analyse misschien niet de meest geschikte techniek is voor het detekteren van veranderingen in de aktiviteit van mitochondriale complexen in gepermeabiliseerde myotubes.

In PBMCs waren er succesvolle metingen voor alle vijf de substraten-combinaties. We vergeleken toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en RCR van controle- (n = 6, succinaat-controles n = 4) & CVS- (n = 13) PBMCs. Er werd geen verschil gezien tussen de twee groepen voor geen enkele van de onderzochte substraten. Dit suggereert dat de aktiviteit van complex-I, -II & -IV, en de respiratie ondersteund door vetzuur-oxidation of glutaminolyse niet verschillend is in CVS-PBMCs vergeleken met gezonde controles. Deze resultaten zijn in overéénstemming met een studie door Lawson N et al. [Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. Journal of Nature and Science (2016) 2: e221] waar spectrofotometrische technieken gebruikten om te tonen dat gepermeabiliseerde CVS-PBMCs niet verschillen van gezonde controles in termen van complex-I, complex-II+III of complex-IV aktiviteit. De consistentie van de resultaten tussen de verschillende research-groepen, gebruikmakend van verschillende technieken, versterkt de bewijskracht die suggereert dat er geen abnormaliteiten zijn qua individuele mitochondriale complex aktiviteiten in CFS-PBMCs. Het ontbreken van verschillen PBMCs kan suggereren dat de eerder gevonden abnormaliteiten in complete cellen zijn niet te wijten aan abnormaliteiten qua complexen van de mitochondriale respiratoire keten maar eerder aan andere aspecten van het respiratie-mechanisme zoals transport van glucose in de cellen, AMPK-abnormaliteiten of gewijzigd funktioneren van andere mitochondriale enzymes [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Er dient echter omzichtigheid in acht te worden genomen bij het interpreteren van deze resultaten op zich, gezien de verschillen in OXPHOS die worden gezien in complete PBMCs [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding], aangezien de resultaten van complete cellen een weerspiegeling is van een natuurlijker en fysiologisch relevanter milieu voor de mitochondrieën. Hoewel in deze studie relatief kleine groepen werden gebruikt, verhoogt de samenhang van de bevindingen van deze studie met eerdere studies, die andere technieken voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in myotubes en PBMCs van CVS-patiënten, de deugdelijkheid van de resultaten [Lawson N et al. (2016) & Smits B et al. (2011); zie hierboven].

BESLUITEN

Deze studie onderzocht de aktiviteit van specifieke componenten van de mitochondriale ademhaling door te kijken naar individuele complex aktiviteit en mechanismen in myotubes en PBMCs. Op basis van een cel-permeabilisatie protocol en gebruikmakend van de XFe96 extracellular flux analyser werd aangewend om deze experimenten uit te voeren. Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse gebruikt om individuele mitochondriale complex aktiviteit na te gaan in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. Uiteindelijk werd een normale mitochondriale funktie opgetekend in CVS-myotubes & -PBMCs; er werden echter relatief kleine groepen gebruikt en daarom dienen de resultaten omzichtig te worden geïnterpreteerd. De bevinding van een normale mitochondriale werking van CVS-myotubes ondersteunt de resultaten van ongepubliceerde gegevens van complete cellen [zie Rutherford G 2016; hierboven]. De resultaten waar geen verschil qua mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde PBMCs werden gevonden, waren onverwacht gezien het feit dat de mitochondriale funktie in PBMCs eerder significant lager bleek bij CVS [Tomas et al. 2017; zie onze inleiding]. Het ontbreken van een verschil qua complex-aktiviteit in CFS-PBMCs is echter in overéénstemming met resultaten die door andere groepen werden gerapporteerd – die normale mitochondriale respiratoire keten complex-aktiviteiten toonden [Lawson N et al. (2016); zie hierboven] en postuleerden dat wijzigingen qua mitochondriale ATP-synthese dient te worden toegeschreven aan andere oorzaken zoals de transport-capaciteit van zuurstof [Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8: 93]. Gezien onze resultaten hier, moeten toekomstige bio-energetische studies bij CVS zich concentreren op mechanismen ‘upstream’ van de mitochondriale respiratoire keten.

Hoge energie-kost bij laag-gradige inflammatie

Prof. Jacoba (Cobi) Heijnen is een belangrijk figuur in het gebied van de psychoneuro-immunologie. Haar research focust op de cellulaire en molekulaire mechanismen van neuronale schade, motorisch gedrag en neuroprotectanten. Ze combineert brein/immuunsysteem-communicatie om de invloed van het neuro-endocrien systeem op de immuunrespons van patiënten met auto-immuunziekten te bestuderen. Samen met Prof. Robert Dantzer richtte ze het ‘Neuroimmunology Laboratory’ aan de universiteit van Texas op; waar onderzoek wordt verricht omtrent pijn, vermoeidheid, neuropathie en cognitieve stoornissen. Dantzer lanceerde het nu het nu aanvaarde idee dat het immuunsysteem de symptomen van ‘sickness-behaviour’ (ziekte-gedrag; vermoeidheid, hoofdpijn, spierpijn, keelpijn, enz.) bepaalt en dat deze fungeren als een manier om het energie-verbruik te reduceren (om, zo wordt gesteld, de verspreiding van pathogenen te voorkomen). Lees ook ‘Identifikatie en behandeling van symptomen geassocieerd met inflammatie’.

In onderstaand ‘review’-artikel focust hun team op twee zaken die op deze pagina’s al veelvuldig aan bod kwamen: de problematische energie-voorziening en de laag-gradige (neuro)inflammatie. Op basis van de literatuur (grotendeels door M.E.(cvs)-researchers) stellen ze voor dat deze inflammatie problemen met de energie-produktie veroorzaakt.

Vroeger had Heijnen het over cognitieve gedrag therapie als hulpmiddel maar daar wordt nu blijkbaar niets meer over geopperd…

————————-

Front Behav Neurosci. (2018) 12: 78

The High Costs of Low-Grade Inflammation: Persistent Fatigue as a Consequence of Reduced Cellular-Energy Availability and Non-adaptive Energy Expenditure

Lacourt TE, Vichaya EG, Chiu GS, Dantzer R, Heijnen CJ

Neuroimmunology Laboratory, Symptom Research Department, The University of Texas MD Anderson Cancer Institute, Houston, TX, United States

Samenvatting

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom bij meerdere ziekten. Persistente vermoeidheid bleek geassocieerd met laag-gradige inflammatie in meerdere modellen voor vermoeidheid (inclusief kanker-gerelateerde vermoeidheid [CRF] en Chronische Vermoeidheid Syndroom). Het is echter onduidelijk hoe laag-gradige inflammatie tot het ervaren van vermoeidheid leidt. We presenteren hier een model voor een onevenwicht qua energie-beschikbaarheid en energie-verbruik als een gevolg van laag-gradige inflammatie. In dit verhalend overzicht, bespreken we hoe laag-gradige inflammatie kan leiden tot verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie. Laag-gradige inflammatie induceert een metabole omschakeling van energie-efficiënte oxidatieve fosforylatie naar snel-werkende, maar minder efficiënte, aërobe glycolytische energie-produktie; doet reaktieve zuurstof soorten verhogen en reduceert insuline-sensitiviteit. Deze effekten resulteren in gedaalde glucose-beschikbaarheid en, daardoor, verminderde cellulaire energie. Daarnaast suggereert nieuw bewijsmateriaal dat chronische laag-gradige inflammatie verbonden is met de bereidheid om inspanning te leveren onder specifieke omstandigheden. Veranderingen in het circadiaans ritme en slaap-stoornissen kunnen de effekten van inflammatie op de beschikbaarheid van cellulaire energie en niet-adaptief energie-verbruik mediëren. In het tweede deel van deze bespreking, presenteren we bewijs voor deze metabole mechanismen in modellen voor aanhoudende vermoeidheid, waarbij we focussen op Chronische Vermoeidheid Syndroom en kanker-gerelateerde vermoeidheid. Het meeste bewijsmateriaal voor gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie met betrekking tot vermoeidheid komt van studies over het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Hoewel het mechanistisch bewijs uit de literatuur omtrent kanker-gerelateerde vermoeidheid nog beperkt is, wijzen de beperkte resultaten ook naar gereduceerde beschikbaarheid van cellulaire energie. Er is ook groeiend bewijs voor het feit dat het energie-verbruik voor aktiviteiten de verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie bij patiënten met persisterende vermoeidheid overstijgt. Dit suggereert dat een onvermogen om energie-verbruik aan te passen aan de beschikbare bronnen één mechanisme kan zijn dat aan de basis ligt van persistente vermoeidheid.

Inleiding

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom van meerdere ziekten. Het is één van de meeste frequent gerapporteerde symptomen bij kanker en kanker-behandeling, en is zeer sterk aanwezig bij meerdere chronische ziekten, zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis. Daarnaast is ‘t het kenmerkend symptoom van het Chronische Vermoeidheid Syndroom, een aandoening waarbij ernstige persistente vermoeidheid wordt ervaren in afwezigheid van een gediagnostiseerde ziekte. Aanhoudende vermoeidheid is anders dan acute vermoeidheid. Acute vermoeidheid is een gezonde, adaptieve respons op fysieke of mentale inspanning, die metabole signalisering induceert om verdere energie-consumptie te vermijden. Acute vermoeidheid verdwijnt typisch na rust of slaap. In tegenstelling daarmee is persisterende vermoeidheid dikwijls disproportioneel met de uitgeoefende aktiviteiten en wordt over het algemeen niet volledig verlicht door rust. Er zijn geen behandelingen voor aanhoudende vermoeidheid die goedgekeurd werden door de Amerikaanse ‘Food and Drug Administration’, ten dele omdat de onderliggende mechanismen nog niet goed worden begrepen.

Er werd gesuggereerd dat aktivatie van inflammatoire mechanismen aan de basis ligt van persistente vermoeidheid bij veel patiënten-populaties [bv. Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158] en dieren-modellen. Inderdaad: het is goed bekend uit experimentele studies dat acute ernstige inflammatie, zoals deze geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS), acuut ziekte-gedrag, inclusief vermoeidheid, veroorzaakt. Deze respons werd geïnterpreteerd als een adaptief proces dat leidt tot het behoud van energie en reductie van het risico op verdere verspreiding van pathogenen (bv. door het zich terugtrekken uit sociale interakties) [Dantzer R et al. The neuroimmune basis of fatigue. Trends Neurosci. (2014) 37: 39-46]. Bovendien is, bij auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis, het vermoeidheid-niveau geassocieerd met een toename van plasma-cytokinen, bijzonderlijk bij opflakkering van symptomen. Verbanden tussen kleine, langdurige verhogingen qua inflammatoire cytokinen en chemokinen in het plasma, en persisterende vermoeidheid werden ook gerapporteerd bij kanker-overlevers; en bij individuen met het Chronische Vermoeidheid Syndroom [zie Montoya JG et al. hierboven]. Bij deze patiënten zijn de waarden van plasma-cytokinen over het algemeen veel lager dan deze die worden gedetekteerd bij patiënten met auto-immune ziekten. De mechanismen waarmee subtiele verhogingen qua inflammatie vermoeidheid induceren zijn nog onduidelijk en zouden verschillend kunnen zijn van wat werd aangetoond voor acute ernstige inflammatie. Het aantal in de literatuur gerapporteerde associaties suggereert echter dat het effekt biologisch significant is.

We stellen voor dat chronische laag-gradige inflammatie persistente vermoeidheid induceert en/of bestendigt door het induceren van een onevenwicht tussen beschikbaarheid van cellulaire energie en cellulair & aktiviteiten energie-verbruik. Inflammatie verhoogt de noodzaak van immuun-cellen om snel cellulaire energie te genereren. Om hieraan te voldoen verschuiven immuun-cellen naar aërobe glycolyse voor energie-produktie, een minder efficiënt maar snel-werkend mechanisme. Tijdens chronische laag-gradige inflammatie wordt verwacht dat het uitgebreid vertrouwen op aërobe glycolyse zal leiden tot gedaalde beschikbaarheid van nutriënten en dus tot minder energie-beschikbaarheid voor de noodlijdende orgaan-systemen. Het energie-evenwicht van het organisme kan verder belast raken door veranderingen qua circadiaanse ritmes en slaap. Daarnaast is er bewijs dat suggereert dat laag-gradige of chronische inflammatie (maar niet acute ernstige inflammatie) gelinkt kan worden aan verhogingen qua energie-verbruik bij aktiviteiten, wat bijdraagt tot het onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid en -verbruik en, daardoor, leidt tot vermoeidheid.

Effekten van laag-gradige inflammatie op energie-produktie en -verbruik

Adenosine-trifosfaat (ATP) is de voornaamste vorm van energie-‘munteenheid’ die door de cellen wordt gebruikt. Het genereren van ATP omvat het katabolisme van macronutriënten (koolhydraten, lipiden en proteïnen), elk startend van een uniek metabool mechanisme, maar dat uiteindelijk leidt tot ATP-produktie door de cellen. Factoren die ATP-produktie negatief kunnen beïnvloeden omvatten gedaalde intracellulaire glucose-beschikbaarheid (door veranderingen in het metabolisme van macronutriënten of verminderde glucose-opname door de cellen), gedaalde funktie van de mitochondrieën wat betreft aërobe energie-produktie en daaropvolgende afhankelijkheid van minder-efficiënte aërobe glycolyse.

Energie-produktie tijdens langdurige inflammatie

Inflammatie vereist een verandering qua metabolisme en deze wijzigingen verschillen voor acute en chronische of langdurige inflammatie. Bij acute inflammatie is snelle ATP-produktie door de immuun-cellen vereist voor de ganse reeks immuun-responsen. Immuun-cellen (lymfocyten en leukocyten) wisselen van oxidatieve fosforylatie naar een groter vertrouwen op aërobe glycolyse voor snelle ATP-produktie. Deze verschuiving is in het voordeel van overhaaste ATP-produktie terwijl de katabole efficiëntie wordt opgeofferd, resulterend in verminderde mitochondriale werking en gestegen aanmaak van lactaat.

Bijkomend is langdurige inflammatie geassocieerd met verhoogde insuline-resistentie en gedaalde glucose-tolerantie, wat leidt tot verminderde glucose-opname door de immuun-cellen en, bijgevolg, minder globale ATP-produktie uit glucose. Tijdens persistente laag-gradige inflammatie worden daarom energie en glucose afgeleid van andere systemen om de immuun-respons te ondersteunen. Ter compensatie doet het lichaam het lipiden- en proteïnen-metabolisme stijgen voor de produktie van ATP. Het lipiden-metabolisme is een traag proces en kan dus niet voldoen aan de snelle energie-vereisten. Daarnaast betekent een verhoogd betrouwen op het proteïnen-metabolisme dat andere funkties, zoals het bevorderen van groei-stimulatie, gecompromitteerd raken. Inflammatie leidt ook tot meer reaktieve zuurstof soorten (ROS) om binnendringende pathogenen te bestrijden. ROS kunnen echter schadelijk zijn voor mitochondrieën en mitochondriaal DNA, en dus draagt langdurige blootstelling aan ROS tijdens chronische inflammatie bij tot mitochondriale dysfunktie.

De effekten van chronische inflammatie zijn bijzonder schadelijk voor neuronen die sterk afhankelijk zijn van oxidatieve fosforylatie voor hun ATP-behoeften. Bij normaal brein-metabolisme vertrouwen neuronen sterk op astrocyten. Astrocyten gebruiken glycolyse om lipiden en glucose om te zetten naar pyruvaat en dan lactaat. Lactaat wordt dan naar neuronen gestuurd, waar het binnenkomt in de TCA-cyclus. Tijdens chronische inflammatie zorgt insuline-resistentie voor een daling van glucose en het proteïnen-metabolisme in het astrocyten, wat resulteert in verminderde beschikbaarheid van lactaat voor neuronen, wat deze er toe dwingt sterker te leunen op het trager proces van het lipiden-metabolisme. Verder is inflammatie in staat om de mitochondriale efficiëntie te verlagen, wat de metabole belasting op neuronen verhoogt. Veranderingen qua neuronaal metabolisme zullen uiteindelijk het neuronaal funktioneren aantasten.

Aktiviteiten energie-verbruik tijdens inflammatie

Er wordt geraamd dat chronische laag-gradige inflammatie het systemisch energie-verbruik met 10% verhoogt. Gezien de gestegen energie-vereisten bij chronische inflammatie en de resulterende gedaalde energie-beschikbaarheid, zou men verwachten dat het aktiviteiten energie-verbruik (d.i. de hoeveelheid energie die wordt gespendeerd aan aktiviteiten) zou verminderen. Meerdere studies in de context van acute, ernstige inflammatie bekrachtigen deze hypothese en tonen de verminderde bereidheid (motivatie) tot inspanning, zowel bij knaagdier-modellen als bij mensen. Resultaten van deze en andere studies suggereren echter ook dat motivatie-gedrag anders beïnvloed kan zijn bij laag-gradige inflammatie.

Studies met dieren-modellen tonen een daling qua inspanning om voedsel te verkrijgen enkel na toediening van hogere dosissen inflammatoire mediatoren. Voor de laagste dosissen was er niet alleen geen verminderde, er bleek ook een trend naar meer aktiviteit. Verder testten onderzoekers dieren 24 h na een acute inflammatoire aanval (LPS-injektie), een punt waar de acute inflammatoire respons en het ziekte-gedrag waren geluwd: er werd een verschuiving vastgesteld wat betreft motivationele prioriteit naar keuzes die een hogere inspanning voor een meer in het oog springende beloning vereisten.

Een vergelijking van de resultaten van de twee beschikbare studies bij mensen wijst ook op afzonderlijke effekten van hoog- vs. laag-gradige inflammatie op keuzes omtrent energie-verbruik. Researchers testten gezonde individuen 2 en 5 h na LPS-injektie en vonden een verminderde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (2, maar niet 5, h na injektie; op 2 h had de inflammatie z’n piek bereikt). In tegenstelling daarmee vonden anderen, bij deelnemers 5 h na LPS, een verhoogde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (maar enkel in omstandigheden die voordelig waren om iets te winnen). Ze merkten verder op dat deelnemers te zwak waren om getest te worden tussen 3 en 4 h na injektie. Op te merken: de 2 studies verschilden wat betreft meerdere belangrijke aspecten, inclusief karakteristieken van het staal (enkel mannen vs. een mix van mannen en vrouwen) en taken (keuze tussen aanvaarden of afwijzen van een taak vs. keuze tussen een taak met grote inspanning/grote beloning of een lage inspanning/kleine beloning). Niettemin, stellen we op basis van deze experimentele gegevens bij muizen en mensen als hypothese dat acute ernstige inflammatie leidt tot veralgemeende adaptieve dalingen van energie-verbruik/inspanning, terwijl milde inflammatie kan leiden tot relatieve stijgingen van energie-verbruik/inspanning op voorwaarde dat de drijfveer groot genoeg is. Deze notie wordt ondersteund door onze bevindingen dat laag-gradige inflammatie geassocieerd was met keuzes voor verhoogde inspanning van een groep kanker-patiënten en -overlevers. Er dient nog te worden nagegaan of deze verschuivingen qua inspanning-gedrag/energie-verbruik overéénkomen met ‘herstel’ of met een omschakeling van de immuun-cellen van een glycolytisch naar een meer oxidatief gestuurd metabool profiel. Daarnaast werden verschuivingen in het gedrag tijdens chronische laag-gradige inflammatie nog niet bestudeerd.

De effekten van inflammatie op inspanning/energie-verbruik bij motivatie-taken lijken te worden gemedieerd door het dopaminerg systeem. Hoewel het mechanisme waardoor inflammatie in staat is de dopamine-neurotransmissie te wijzigen nog onduidelijk is, geeft de literatuur omtrent Parkinson’s aan dat chronische neuro-inflammatie leidt tot oxidatieve stress en mitochondriale schade in dopaminerge neuronen, leidend tot een belangrijke verstoring qua dopaminerge [via dopamine werkende] neurotransmissie. Dopaminerge neuronen zijn bijzonder kwetsbaar voor inflammatie. Hoewel de oorzaak van deze kwetsbaarheid nog niet volledig wordt begrepen, kunnen de verhoogde basale oxidatieve fosforylatie van deze cellen en de auto-oxidatie van overmatig extracellulair dopamine daartoe bijdragen.

Slaap en circadiaanse ritmes als partiële mediatoren van de effekten van chronische laag-gradige inflammatie op energie-beschikbaarheid en -verbruik

Inflammatie kan bijkomend leiden tot meer aanhoudende wijzigingen in het metabolisme via veranderingen van het circadiaans ritme en slaap. Chronische laag-gradige en ernstige inflammatie bleek de slaap-kwaliteit en circadiaanse ritmes te beïnvloeden, en vice versa [Rahman K et al. Sleep-wake behavior in Chronic Fatigue Syndrome. Sleep (2011) 34: 671-678]. Veranderingen qua ritmes van de circadiaanse aktiviteit werden gelinkt met vermoeidheid. Slaap-stoornissen en verminderde slaap-kwaliteit – dikwijls gerapporteerd door individuen met persistente vermoeidheid – kunnen ook leiden tot een gedesorganiseerd/ontregeld circadiaans ritme omwille van dutjes tijdens de dag en strukturele wijzigingen qua slaap-aanvang ‘s nachts.

De meeste metabole processen worden gereguleerd door de circadiaanse klok en veranderingen qua circadiaans ritme of slaap zijn verbonden met metabole veranderingen, zoals verhoogd circulerend glucose en gedaalde insuline-sensitiviteit. Specifiek: expressie van mitochondriale proteïnen betrokken bij veel metabole processen ondergaat post-translationele modificaties die worden gereguleerd door het ‘Clock’-gen [‘Circadian Locomotor Output Cycles Kaput’; beïnvloedt de circadiaanse ritmes]. Daarnaast wordt het mitochondriaal oxidatief metabolisme ook gecontroleerd door de circadiaanse klok via oscillaties in de biosynthese van nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD⁺) en de beschikbaarheid van mitochondriale enzymen.

Onvoldoende slaap en wijzigingen in circadiaanse ritmes kunnen ook het verbruik van cellulaire energie en aktiviteit veranderen. Pre-klinische studies tonen een verhoogd energie-verbruik na totale slaap-onthouding bij ratten. Zo ook leidde experimenteel geïnduceerde slaap-onthouding bij gezonde menselijke vrijwilligers tot gestegen dagelijks energie-verbruik (bepaald via totale-ruimte calorimetrie; meten van zuurstof-consumptie en koolstof-dioxide produktie). Hoewel dit gepaard ging met een compenserende toename in energie (voedsel-inname, t.t.z. calorische inname hoger dan calorisch verbruik), steeg de fysieke inspanning significant. Als de hierboven beschreven studies steunen op experimenteel geïnduceerde veranderingen qua circadiaans ritme en slaap, is het onduidelijk in welke mate deze bevindingen relevant zijn voor natuurlijk optredende veranderingen. Daarnaast: of meer subtiele, aanhoudende veranderingen qua slaap en circadiaans ritme, zoals deze geobserveerd bij vermoeide individuen, ook energie-verbruik wijzigen, dient nog te worden aangetoond.

Samenvatting van de voorgestelde mechanismen

Chronische laag-gradige inflammatie is gerelateeerd met een persistente metabole switch naar snellere, maar minder efficiënte, glycolytische energie-produktie, en verhoogde aanmaak van ROS. Dit beïnvloedt op z’n beurt de mitochondriale funktie, waardoor het betrouwen op glycolytische mechanismen vergroot. Daarnaast gaat, hoewel chronische inflammatoire processen meer energie vereisen, deze verhoogde nood aan energie niet altijd gepaard met verminderingen qua aktiviteiten energie-verbruik. Dit lijkt in het bijzonder het geval in de context van laag-gradige inflammatie, die motivatie voor inspanning bleek te verhogen. Inflammatie kan ook circadiaanse ritmes en slaap beïnvloeden (en vice versa), wat de effekten op energie-beschikbaarheid en -verbruik verder kan verergeren.

We stellen voor dat dit onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid vs. -verbruik aan de basis ligt van het ervaren van vermoeidheid geïnduceerd door chronische laag-gradige inflammatie. Hierna bespreken we het bewijsmateriaal voor deze metabole mechanismen bij persistente vermoeidheid.

Aanhoudende vermoeidheid ten gevolge gereduceerde energie-beschikbaarheid en verhoogd energie-verbruik?

Er werden voornamelijk verbanden tussen laag-gradige inflammatie en aanhoudende vermoeidheid gerapporteerd bij individuen met CVS of CRF. Bij patiënten met CVS, bleek de vermoeidheid-ernst geassocieerd met gestegen cytokine-concentraties in plasma [zie Montoya JG et al. hierboven] en ruggemergvocht [Hornig M et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Psychiatry (2016) 21: 261-269]. Er werden ook wijzigingen in de fysiologische stress-respons (overwegend hypothalamus-hypofyse-bijnier as output) bij CVS-patiënten gerapporteerd [bv. Silverman M et al. Neuroendocrine and immune contributors to fatigue. PMR (2010) 2: 338-346], suggererend dat laag-gradige inflammatie het resultaat kan zijn van een gereduceerde sensitiviteit voor immuun-regulerende stress-hormonen zoals cortisol. Voor CRF begint de vermoeidheid gewoonlijk tijdens de kanker-behandeling maar houdt bij overleving aan bij een significante subset patiënten. Het is geweten dat de meeste eerste-lijn behandelingen zoals chemotherapie en chirurgie een inflammatoire respons induceren (bv. door weefsel-beschadiging). Stijgingen van inflammatoire merkers bleken inderdaad geassocieerd met verhoogde vermoeidheid-ernst bij patiënten die behandeling ondergingen, hoewel niet alle inflammatoire merkers geassocieerd met vermoeidheid een respons op kanker-behandeling vertonen, wat de aanwezigheid van andere oorzakelijke factoren suggereert. Bij kanker-overlevers werden ook, ondanks het ophouden van de onmiddellijke inflammatoire effekten van de kanker-behandeling, verbanden tussen gestegen waarden van inflammatoire merkers en verhoogde vermoeidheid gezien. CRF bij overlevers bleek daarnaast geassocieerd met psychosociale stress factoren (zoals angst voor het terugkeren van de kanker) wat suggereert dat inflammatoire processen bij overlevers (ten dele) stress-gerelateerd kunnen zijn.

Gedaalde energie-beschikbaarheid bij aanhoudende vermoeidheid

Bewijs voor verminderde energie-beschikbaarheid bij langdurige vermoeidheid komt voornamelijk uit metaboloom-studies [bv. Fluge Ø et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-5480 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] en van studies omtrent mitochondriale dysfunktie [bv. Filler K et al. Association of mitochondrial dysfunction and fatigue: a review of the literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]

Mitochondriale Dysfunktie

Mitochondrieën worden dikwijls voorgesteld als de ‘krachtcentrales van de cel’. De mitochondriale werking kan gecompromitteerd worden door meerdere factoren, inclusief verminderde beschikbaarheid van de nodige metabolieten en mitochondriale schade door, bijvoorbeeld, oxidatieve stress. De notie dat mitochondriale dysfunktie kan leiden tot vermoeidheid wordt aangegeven door de observatie dat vermoeidheid een courant symptoom bij mitochondriale ziekte is en dat vermoeidheid-achtig gedrag in dieren-modellen geassocieerd is met gedaalde expressie van mitochondriale complexen, verminderingen qua metabole aktiviteit en veranderingen qua mitochondriale morfologie in de hersenen.

Het verband tussen mitochondriale dysfunktie en persistente vermoeidheid werd het meest bestudeerd bij patiënten met CVS. Een systematische ‘review’ rapporteerde dat 21 op 25 artikels beperkt waren tot CVS [zie Filler K et al. hierboven]. Lagere serum-waarden van het anti-oxidant CoQ10 was de meest consistente bevinding van het overzicht, met beperkt bewijs voor lagere waarden van andere anti-oxidanten en verhoogde waarden van oxidatieve stress merkers. Er werden lagere carnitine-waarden gezien in sommige studies maar de resultaten hingen af van het type carnitine dat werd bepaald. Later gepubliceerde studies over CVS bevestigen verhoogde oxidatieve stress, mogelijke dalingen qua efficiëntie van de ATP-aanmaak en verminderingen van de mitochondriale energie-produktie bij CVS-patiënten [Ciregia F et al. Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome. Transl. Psychiatry (2016) 6: e904]. Het bepalen van de zuurstof-consumptie in PBMCs [Tomas C et al. (2017). Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE 12: e0186802] is veelbelovend, wijzend op een gereduceerde capaciteit van de mitochondrieën om te voldoen aan de gestegen energie-vereisten tijdens cellulaire stress; een replicatie omwille van het gebruik van ingevroren en verse bloedstalen, en de beperkte grootte van het staal is aangewezen.

Studies aangaande CRF bleven tot hier toe beperkt tot de onmiddellijke effekten van kanker-behandeling en het is onduidelijk in welke mate deze effekten nog aanwezig zijn bij overlevers. Pre-klinische research heeft aangetoond dat zowel kanker als kanker-therapie geassocieerd zijn met mitochondriale dysfunktie. Op basis van pre-klinische modellen is het onbekend of door behandeling geïnduceerde of door kanker geïnduceerde veranderingen qua mitochondriale funktie verband houden met vermoeidheid. Een handvol observationele studies van één research-groep rapporteren echter over een associatie bij prostaat-kanker patiënten die bestraling-therapie ondergaan. Hun resultaten duiden op verminderd mitochondriaal funktioneren tesamen in associatie met vermoeidheid, zoals bewezen door gedaalde expressie van mitochondrieën-gerelateerde genen, verminderde expressie van mitochondriale elektronen-transport complex-II enzymen en gestegen apoliproteïne-A1 (ApoA1) in associatie met hogere vermoeidheid. ApoA1 is belangrijk voor lipiden-opruiming en een stijging qua ApoA1 is indicatief voor een gedaald gebruik van lipiden voor ATP-synthese.

Een handvol studies en klinische proeven bekrachtigen de hierboven beschreven bevindingen. Twee experimentele studies bij CVS-patiënten toonden wijzigingen in metabole processen. Resultaten van de in vitro stimulatie van skeletspier-cellen van patiënten met CVS gaven insuline-resistentie of verminderde sensitiviteit van insuline-receptoren aan [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10: e0122982; zie ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen’]. Verder vertoonden CVS-patiënten een trager herstel na maximale inspanning-test, leidend tot een snellere afhankelijkheid op het minder efficiënt glycolytisch metabolisme tijdens een daaropvolgende test [Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492].

Anti-oxidanten supplementering kan doeltreffend zijn naar het verminderen van vermoeidheid toe, wat een oorzakelijk verband suggereert tussen verminderde beschikbaarheid van anti-oxidanten en vermoeidheid. Bij patiënten met CVS deed supplementering met CoQ10 en nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) de vermoeidheid dalen, terwijl dat niet geval was voor een placebo-behandeling [Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid. Redox Signal. (2014) 22: 679-685]. Supplementering bleek ook CRF te verbeteren. Cachexische patiënten [cachexie = veralgemeende zwakte-toestand] met gevorderde gynaecologische kanker leken voordeel te halen uit de toediening van meerdere metabolisme-gerelateerde supplementen naast hun standaard cachexie-behandeling met synthetisch progestogeen; wat verminderingen qua vermoeidheid, inflammatie en energie-verbruik aantoont in vergelijking met enkel de standaard behandeling. Bij patiënten met borst-kanker die chemotherapie ondergaan, leidde supplementering met een aminozuren-gel die CoQ10 en L-carnitine bevat tot minder ernstige vermoeidheid. Aangezien deze studie een ‘standard-of-care’ conditie als controle omvatte, kan een placebo-effekt niet worden uitgesloten. In tegenstelling daarmee werd bij een grote studie met of borst-kanker patiënten die chemotherapie ondergingen, gebruikmakend van supplementering met vitamine-E met of zonder CoQ10, geen enkel effekt van CoQ10 op de ontwikkeling van vermoeidheid gevonden. In dieren-modellen werd ook aangetoond dat verscheidene molekulen met anti-oxidante eigenschappen vermoeidheid-achtig gedrag kunnen verminderen [bv. quercetine, coenzyme-Q10, ginsenoside-Rb1 (steroïd-achtige stof voorkomend in ginseng, agonist voor de oestrogeen-receptor)]. Bij deze studies dient te worden opgemerkt dat de vermoeidheid-modellen een significante beperking betekenen. Aangezien de mechanismen die ten gronde liggen aan CVS nog slecht gedefinieerd zijn, is de validiteit van dieren-modellen voor CVS betwistbaar. Bovendien induceren en kwantificeren veel van deze studies vermoeidheid in dezelfde interventie (bv. gedwongen zwemmen), wat inherent problematisch is. Daarom is nog veel werk vereist om onze model-systemen te verbeteren en deze bevindingen te valideren.

Samengevat: het meeste bewijsmateriaal voor een verband tussen vermoeidheid en mitochondriale werking komt van CVS, wijzend op lagere waarden van anti-oxidanten en mogelijke dalingen qua mitochondriale ATP-produktie. Hoerwel er geen lagere anti-oxidanten concentraties werden gevonden bij kanker-patiënten, duiden wijzigingen van de mitochondriale gen-expressie toch op een rol voor het mitochondriaal funktioneren bij vermoeidheid. Resultaten van klinische en pre-klinische studies wijzen op mogelijke voordelige effekten van mitochondrieën-ondersteunende supplementen. De meeste observationele en interventie-studies lijden echter onder ernstige beperkingen wat betreft staal-grootte of studie-ontwerp. Daarnaast werden de exacte oorzaken van gedaalde waarden van anti-oxidanten of ATP-aanmaak nog niet bestudeerd. Hoewel inflammatie waarschijnlijk de oorzaak is, is het zeker niet de enige kandidaat. Dus zijn bijkomende pre-klinisch onderzoek om de mechanismen te identificeren, als ook klinische replicaties bij grotere groepen, gebruikmakend van placebo-gecontroleerde ontwerpen en relevante biomerkers, dringend aangewezen.

Metabolomica

Metabolomica-studies laten een brede beoordeling van veranderingen in het metabolisme toe. Drie dergelijke studies rapporteerden over CVS, elk met verschillende resultaten maar allemaal wijzend naar gereduceerde metabole aktiviteit. Yamano et al. [ref. zie hierboven] leverden bewijs voor verminderde aktiviteit in de TCA- en de ureum-cyclus. Naviaux [ref. zie hierboven] rapporteerde over gedownreguleerde metabolieten van twee klassen lipiden en Fluge [ref. zie hierboven] over gedaalde concentraties aminozuren die fungeren als voorlopers voor acetyl-Coenzyme A, één van de voornaamste inputs van de TCA-cyclus. Hoewel Yamano et al. & Naviaux et al. geen meldingen maakten over verbanden tussen metabolieten en vermoeidheid-graad, rapporteerde Fluge et al. dat er geen assosciaties waren. Ze observeerden eerder verbanden tussen leeftijd en ‘body-mass-index’, suggererend dat hun bevindingen niet specifiek waren voor vermoeidheid bij de CVS-patiënten.

Er werd slechts beperkt werk verricht aangaande metabolomica in dieren-modellen voor vermoeidheid; bij één studie van inspanning-geïnduceerde vermoeidheid werden echter meerdere potentiële “anti-vermoeidheid” metabolomica biomerkers geïdentificeerd. Eén daarvan was geranyl-difosfaat [wordt beschouwd als een sleutel-intermediair bij de biosynthese van steroïden], dat indirect de lipiden-synthese en proteïnen-afbraak kan reguleren. Sebacinezuur [een dicarbonzuur], een resultaat van het vetzuren-metabolisme dat geoxideerd kan worden tot metabole intermediairen voor de TCA-cyclus [acetyl-CoA & succinyl-CoA], was een ander.

Samengevat: de resultaten van de drie metabolomica-studies duiden op veranderingen in het lipiden- & vetzuren metabolisme en gedaalde TCA-aktiviteit in verband met vermoeidheid, wat lijkt op metabole wijzigingen tijdens chronische laag-gradige inflammatie. Aangezien de TCA-cyclus nodig is om de voorlopers voor het proces van oxidatieve fosforylatie te creëeren, zou een verminderde aktiviteiten wijzen op gedaalde ATP-produktie via gereduceerde oxidatieve fosforylatie. Aangezien het lipiden-metabolisme, of lipolyse, de meeste energie per gram substraat genereert, is het de meest efficiënte manier voor energie-opslag. Het katabolisme van lipiden naar bruikbare energie is een traag proces en wordt hoofdzakelijk aangewend bij uitgebreide energie-vereisten, zoals bij chronische inflammatie. Veranderingen in dit metabool mechanisme kunnen dus resulteren in verminderde beschikbaarheid van efficiënte energie-bronnen, wat leidt tot verhoogde afhankelijkheid van een op koolhydraten gebaseerd metabolisme. Daarnaast zou de gedaalde beschikbaarheid van vetzuren interfereren met de aërobe energie-produktie, wat de nood voor anaërobe glycolytische ATP-produktie verhoogt.

Verhoogd energie-verbruik bij aanhoudende vermoeidheid

Meerdere bevindingen wijzen naar een energie-verbruik voor aktiviteiten die de beschikbare energie overstijgt bij patiënten met CVS & CRF. Bv.: één studie rapporteerde dat ca. de helft van een groep CVS-patiënten een energie-verbruik ervaarde dat hun ervaren energie-beschikbaarheid overschreed [Jason L et al. The impact of energy modulation on physical functioning and fatigue severity among patients with ME/CFS. Patient Educ. Couns. (2009) 77: 237-241]. Daarnaast bleek dat een niet-farmacologische interventie gericht op het verminderen van de vermoeidheid bij CVS-patiënten enkel doeltreffend was bij die patiënten waar energie-beschikbaarheid en -verbruik overéénkwamen [Brown M et al. The role of changes in activity as a function of perceived available and expended energy in nonpharmacological treatment outcomes for ME/CFS. J. Clin. Psychol. (2011) 67: 253-260]. Bij CRF hebben we getoond dat kanker-overlevers die melding maken van ernstiger vermoeidheid, een verhoogde tendens vertoonden om inspanning te leveren. Kanker-patiënten onder behandeling vertoonden dit verband niet maar eerder een gedaalde neiging om inspanning te leveren. Andere onderzoekers rapporteerden significante positieve verbanden tussen vermoeidheid-ernst en gemiddeld dagelijks calorie-verbruik bij patiënten met borst-kanker na de vierde cyclus chemotherapie. Dus is er preliminair bewijs dat suggereert dat energie-verbruik niet overéénkomt met (ervaren) energie-beschikbaarheid.

Veranderingen in circadiaanse ritmes en slaap bij bij aanhoudende vermoeidheid

Zoals hierboven vermeld, kunnen door laag-gradige inflammatie geïnduceerde veranderingen van het metabolisme gemedieerd zijn door wijzingen in circadiaanse ritmes & slaap, mogelijks via veranderingen van de melatonine-ritmiciteit. Hieronder bespreken we de bevindingen omtrent slaap, circadiaans ritme en melatonine in relatie tot chronische vermoeidheid.

Bij CVS werden een slechte slaap en wijzigingen qua melatonine-ritmiciteit, maar niet qua circadiaans ritme, gerapporteerd. CVS-patiënten maken meer melding van slaap-storrnissen en vertonen abnormale slaap-progressie (d.w.z. grotere mate van cyclisch alternerend patroon). Daarnaast was de vermoeidheid-graad geassocieerd met door de patiënten gerapporteerde slechte slaap, wat op z’n beurt verband hield met kleine toenames van de waarden van de pro-inflammatorire cytokinen interleukine-1β & tumor necrose factor-α in het plasma. Hoewel er geen bewijs werd gevonden voor een gewijzigd circadiaans ritme bij CVS, is er bewijs voor veranderde melatonine-ritmiciteit. Bv.: er werden significant hogere nachtelijke melatonine-waarden in het speeksel gezien bij adolescenten met CVS die melding maakten van niet-verfrissende slaap vergeleken met gezonde individuen. Verder was de associatie tussen het circadiaans ritme van de lichaamstemperatuur een melatonine-aanvang, die wordt gezien bij gezonde mensen, afwezig bij CVS-patiënten. Hoewel in één studie de behandeling met melatonine of fototherapie (daglicht-therapie) de vermoeidheid niet deden afnemen bij CVS-patiënten, was melatonine succesvol voor het verminderen van vermoeidheid wanneer de deelnemers werden geselekteerd voor een later-dan-gewoonlijke avondlijke melatonine-start. Deze studie omvatte placebo-controle maar de vermoeidheid-reducties waren significant meer uitgesproken bij patiënten met een zeer late start vs. Deze met een relatief vroege start, suggererend dat de effekten waarschijnlijk niet te verklaren zijn door enkel een placebo-effekt.

Bij kanker-patiënten werden associaties tussen CRF en verstoord circadiaans ritme en slaap gerapporteerd vóór, tijdens en na behandeling. In een longitudinale studie bij borst-kanker patiënten, waren verhoogde vermoeidheid tijdens chemotherapie gerelateerd met meer meldingen van slaap-stoornissen alsook meer dutjes en verminderd wakker-zijn tijdens de dag. In een subgroep van deze patiënten, waarvan info over inflammatie beschikbaar was, bleken verhoogde vermoeidheid of ontregelde slaap geassocieerd met meer inflammatie. Interventies gericht op het normaliseren van het circadiaans ritme bleken succesvol wat betreft het verlichten van CRF. Behandeling met helder wit licht was doeltreffend wat betreft het voorkomen en behandelen van circadiaans ritme desynchronisatie bij patiënten met borst-kanker, en verbeterde vermoeidheid bij overlevers van borst-kanker en in een gemengde groep van overlevers van niet-uitgezaaide kanker. Er werd getoond dat licht-behandeling tijdens chemotherapie voor borst-kanker verhoogde vermoeidheid voorkomt, hoewel verrassend genoeg, deze effekten niet gemedieerd bleken door samenlopende effekten op het circadiaans ritme.

Samengevat: verstoorde slaap en gewijzigde circadiaanse of melatonine-ritmiciteit treden frequent op bij individuen met aanhoudende vermoeidheid, hoewel deze kan worden ervaren in afwezigheid van een veranderde slaap en circadiaans ritme. Slechts enkele studies hebben de verbanden tussen laag-gradige inflammatie en slaap of circadiaans ritme in de context van vermoeidheid beoordeeld, en de resultaten zijn inconsistent. Daarnaast warden associaties tussen slaap of circadiaans ritme en metabole uitkomsten niet bestudeerd in vermoeide populaties.

Samenvatting & besluit

We hebben hier een model voorgesteld van persistente vermoeidheid ten gevolge chronische laag-gradige inflammatie die leidt tot een onevenwicht in energie-beschikbaarheid en -verbruik, wat kan worden gemedieerd en onderhouden door veranderingen qua circadiaans ritme en slaap. De hier besproken literatuur duidt inderdaad op associaties tussen aanhoudende vermoeidheid bij CVS en CRF met veranderingen in cellulair metabolisme, verstoorde slaap en, in mindere mate, ontregelingen van het circadiaans ritme. Voor zowel CRF en CFS werden modellen met meerdere oorzaken gesuggereerd; deze omvatten niet enkel laag-gradige inflammatie en verstoorde slaap, maar ook veranderingen qua in stress-fysiologische responsen, genetische kwetsbaarheid en socio-demografische factoren (o.a.). Deze oorzaken zijn niet wederzijds exclusief en wijzen mogelijks op een beperkter aantal uiteindelijke eindpunten. We bespraken hier een dergelijk finaal gemeenschappelijk mechanisme, waarbij meerdere erkende bijdragende factoren aan persistente vermoeidheid zijn opgenomen.

Er zijn meerdere beperkingen omtrent de huidige stand van de kennis. Ten eerste: de meeste studies warden uitgevoerd bij patiënten met CVS, en dit is in het bijzonder het geval voor studies omtrent metabolisme en energie-produktie. Het is dus zeker onduidelijk in welke mate de bevindingen omtrent metabolisme en energie-produktie ook betrekking hebben op patiënten met CRF. Bovendien zijn slechts weinig rapporten beschikbaar die meer dan één van de gesuggereerde parameters voor ons voorgesteld model omvatten. Slechts twee studies verkenden associaties tussen laag-gradige inflammatie en slaap, één bij CVS-patiënten en één bij vermoeide borst-kanker patiënten. Naar ons weten werden er geen studies gepubliceerd die verbanden beschrijven tussen inflammatie en metabolisme bij patiënten met aanhoudende vermoeidheid. Ondanks dit gebrek aangaande meer allesomvattende studies, suggereert het bewijsmateriaal dat nu beschikbaar is, dat gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie een rol bij chronische vermoeidheid kan spelen wanneer deze vermoeidheid geassocieerd is met laag-gradige inflammatie. Daarnaast is er beperkt bewijs voor gestegen energie-verbruik voor aktiviteiten, wat suggereert dat het energie-verbruik niet aangepast is aan de mate van vermoeidheid of aan de energie-beschikbaarheid.

Interventie-studies gericht op het verbeteren van aspecten van het gepresenteerde model, met als uiteindelijk doel het verlichten van vermoeidheid, zijn nog schaars. Niettemin is het reeds duidelijk dat deelnemers aan dergelijke studies zorgvuldig geselekteerd dienen te worden en niet enkel op basis van hun ervaren van vermoeidheid. De studie waarbij zorgvuldige selektie van individuen met CVS met een avondlijke melatonine-start die later gewoonlijk valt en significant voordelige effekten onthulde van melatonine-supplementering, illustreert dit mooi. Dergelijke effekten werden niet gezien wanneer de deelnemers enkel werden geselekteerd op basis van hun vermoeidheid-toestand.

Samengevat: er is meer research nodig om inéén te puzzelen hoe chronische laag-gradige inflammatie kan leiden tot het ervaren van aanhoudende vermoeidheid. Niettemin ligt een mogelijke belangrijke verklaring bij gereduceerde cellulaire energie gekoppeld met verhoogde of maladaptieve veranderingen qua energie-verbruik. Bewijsmateriaal voor dit model kan worden gevonden voor zowel laag-gradige inflammatie als vermoeidheid.