M.E.(cvs)-wetenschap

augustus 26, 2018

Mogelijke rol van mest-cellen bij inflammatie in de hypothalamus bij M.E.(cvs)

We hadden in het op deze pagina’s al over de suggestie dat mest-cellen – mastocyten; een type immuun-cellen die een rol spelen bij allergie en overgevoeligheid, ook betrokken bij wond-heling en verdediging tegen pathogenen – mogelijks betrokken zijn bij de pathogenese van M.E.(cvs) en hoe het gebruik van natuurlijke flavonoïden, organische verbindingen uit planten, bepaalde symptomen zouden kunnen verlichten (zie Hersen-mist, inflammatie – behandeld met luteoline?’).

Anderen opperden dat mest-cel aktivatie betrokken kan zijn bij ander symptomen die voorkomen bij M.E.(cvs) (zie Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS?)’).

Theoharis C. Theoharides van het Laboratorium of Molekulaire Immunofarmacologie, Departement Immunologie van de ‘Tufts University School of Medicine’ in Boston is zowat dé specialist op het gebied van mest-cellen.

Prof. Theoharides heeft een aantal patenten aangevraagd en heeft het daarbij over “samenstellingen met anti-inflammatoire effekten die het resultaat zijn van de aktivatie en daaropvolgende degranulatie van mest-cellen met sekretie van inflammatoire molekulen”. Die omvatten “één of meerdere flavonen of flavonoïd-glycosiden, een sterk gesulfateerd proteoglycan, een ongerafineerde olijfpitten-extract […], een hexosamine-sulfaat zoals D-glucosamine-sulfaat, S-adenosylmethionine, een histamine-1 receptor antagonist, een histamine-3 receptor agonist, een antagonist van de werking van CRH, een lange-keten onverzadigd vetzuur, een fosfolipide, Krill-olie [omega-3 vetzuren], een polyamine, glutiramer-acetaat en interferon”. Onderzoeken daaromtrent lopen… Zoals eerder meegegeven creëerde Theoharides (bij het bedrijf Algonot Inc.) flavinoïd-rijke supplementen (zoals bv. Neuroprotek dat luteoline, quercetine en rutine bevat). Er zijn een aantal aanwijzingen voor een mogelijke werking maar nog geen échte wetenschappelijk bewijzen…

Dit overzicht geeft de context voor en de hypothese over het mogelijk ontstaan van hersen-inflammatie door toedoen van mest-cellen. De stukken over ‘Metabole onregelmatigheden’, ‘Het verband tussen M.E./CVS en metabole ziekte’ en ‘Mitochondriale dysfunktie’ laten we nu achterwege omdat dit hier al meermaals aan bod is gekomen. Als de geïnteresseerde lezer alsnog de tekst wil lezen, kan men deze aanvragen…

————————-

Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (augustus 2018)

Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome – Metabolic Disease or Disturbed Homeostasis due to Focal Inflammation in the Hypothalamus?

Erifili Hatziagelaki, MD, PhD, Maria Adamaki, PhD, Irene Tsilioni, PhD, George Dimitriadis, MD, Theoharis C. Theoharides, MS, MPhil, PhD, MD

Second Department of Internal Medicine, Attikon General Hospital, Athens Medical School, Athens, Greece (EH, MA, GD)

Laboratory of Molecular Immunopharmacology and Drug Discovery, Department of Immunology, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA (IT, TCT)

Sackler School of Graduate Biomedical Sciences, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA (TCT)

Departments of Internal Medicine and Psychiatry, Tufts University School of Medicine and Tufts Medical Centre, Boston, MA, USA (TCT)

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe ziekte die wordt gekenmerkt door invaliderende vermoeidheid, die voor minstens 6 maanden aanhoudt, samen met malaise, hoofdpijn, slaap-stoornissen en cognitieve problemen, met een ernstige impact op de levenskwaliteit. Een significant percentage M.E./CVS-patiënten krijgt geen diagnose, voornamelijk door de complexiteit van de ziekte en het gebrek aan betrouwbare objectieve biomerkers. M.E./CVS-patiënten vertonen een verminderd metabolisme en de ernst van de symptomen lijkt direct gecorreleerd met de graad van de metabole reductie die wellicht per individu verschilt. De precieze pathogenese is echter nog onbekend, wat de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen bemoeilijkt. Het M.E./CVS-fenotype bleek geassocieerd met abnormaliteiten qua energie-metabolisme, klaarblijkelijk te wijten aan mitochondriale dysfunktie, in afwezigheid van mitochondriale ziekten, resulterend in een gedaald oxidatief metabolisme: mitochondrieën kunnen verder bijdragen tot de M.E./CVS-symptomatologie door de extracellulaire sekretie van mitochondriaal DNA, dat kan fungeren als een ‘aangeboren’ pathogen en een auto-inflammatoire toestand kan creëren in de hypothalamus. We stellen voor dat stimulatie van hypothalamische mest-cellen door neuro-immune pathogene en stress-triggers uit de omgeving microglia aktiveert, leidend tot focale inflammatie in het brein en tot verstoorde homeostase. Dit proces zou het doelwit kunnen worden voor de ontwikkeling van nieuwe doeltreffende behandelingen.

Inleiding

[…]

Er bleek een aantal mechanismen en molekulen betrokken bij de pathogenese van M.E./CVS. Auto-immune en metabole mechanismen lijken belangrijke rollen te spelen in de pathophysiologie van M.E./CVS. Neuro-immune en neuro-endocriene processen zouden ook betrokken maar die zijn nog grotendeels onbekend. Er werden klinische en sub-klinische virale infekties verdacht maar nooit bevestigd, als een mogelijke risico-factor voor de ontwikkeling van M.E./CVS. De betrokkenheid van neuro-inflammatie van de hersenen werd gesuggereerd zonder enig specifiek pathogeen mechanisme. Hier geven we een overzicht van de kennis omtrent de verbanden tussen M.E./CVS en metabole ziekte, en stellen voor dat focale inflammatie in de hypothalamus – te wijten aan de lolale aktivatie van mest-cellen en microglia – de homeostase kan wijzigen en een doelwit kan vormen voor nieuwe therapeutische benaderingen.

Metabole onregelmatigheden

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Het verband tussen M.E./CVS en metabole ziekte

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Mitochondriale dysfunktie

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Focale inflammatie in de tussenhersenen en dysfunktionele HPA-as

Er werd gesuggereerd dat neuro-inflammatie [Nakatomi Y et al. Neuroinflammation in Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: An 11C-(R)-PK11195 PET Study. J Nucl Med (2014) 55: 945-950] en immuun-dysfunktie [Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116 /// Trivedi MS et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLos One (2018) 13: e201066] betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS maar de serum-waarden van pro-inflammatoire cytokinen werden niet bevestigd. Er is aanzienlijk bewijs dat aangeeft dat M.E./CVS wordt gekenmerkt door dysfunktie van de HPA-as en het is bekend dat de symptomen verergeren bij stress. Stress kan ook obesitas en cardiovasculaire voorvallen verergeren of precipiteren, door lokale inflammatie.

Corticotropine-afgevend hormoon (CRH) wordt gesekreteerd door de hypothalamus onder stress en stimuleert de HPA-as via aktivatie van 2 types of G-proteïne gekoppelde receptoren: CRHR-1 and CRHR-2 [signaaloverdracht via een trans-membranair systeem]. CRH dat wordt gesekreteerd bij acute stress bleek geïmpliceerd in de pathofysiologie van neuro-inflammatoire aandoeningen en myocard-infarct (MI).

We stellen voor dat stimulatie van hypothalamische mest-cellen door factoren in het milieu, neurale, immuun-pathogene (Lyme, mycotoxinen) of stress-triggers (CRH, somatostatine) microglia aktiveren, leidend tot focale inflammatie en verstoorde homeostase. [Samengevat: de voorgestelde mest-cell/microglia interakties in de hypothalamus dragen als volgt bij tot de pathogenese van M.E./CVS. Hypothalamische mest-cellen worden gestimuleerd door met stress geassocieerde triggers (zoals CRH, substantie-P & z’n homoloog hemokine-1) samen met mtDNA en IL-33. Gestimuleerde mest-cellen sekreteren dan molekulen zoals CXCL8, neurotensine, TNF, tryptase en mtDNA, die dan microglia aanzetten tot de afgifte van inflammatoire molekulen zoals IL-1β, IL-6 en CXCL8 die de homeostase verder ontregelen, mitochondriale dysfunktie veroorzaken en leiden tot de symptomen van M.E./CVS. Luteoline zou deze processen op meerdere niveaus kunnen inhiberen.] Mest-cellen en/of microglia triggers kunnen voortkomen uit de neus-holte of de hersenen bereiken door een verstoorde BBB [bloed-brein-barrière] of via de lymfevaten. Gestimuleerde mest-cellen zouden molekulen kunnen sekreteren die de homeostase op een directe manier kunnen wijzigen (via afgifte van CRH, urocortine [proteïne van de corticotropine-afgevende factor (CRF) familie; betrokken bij de stress-respons]) of microglia aktiveren (via sekretie van histamine, tryptase [enzyme] en mtDNA [mitochondriaal DNA]). Microglia geven dan meer inflammatoire molekulen (IL-1ß, IL-6 & CCL2 [cytokine/chemokine; chemokine (C-C motief) ligand 2 ook monocyten-aantrekkend proteïne 1 (MCP1) genoemd]) af, die de homeostase verder ontregelen, mitochondriale dysfunktie veroorzaken en bijdragen tot centrale én perifere vermoeidheid. Er werd gerapporteerd dat geaktiveerde microglia bijdragen tot de pathofysiologie van slaap-stoornissen. De betrokkenheid van meer dan één trigger kan leiden tot een significant verhoogde respons, en de trigger-drempel van mest-cellen én microglia verlagen, wat aanleiding geeft tot chronische symptomen.

Mest-cellen zijn unieke weefsel immuun-cellen betrokken bij allergische reakties maar die ook werken als sensoren voor omgeving- en psychologische stress. Zelfs indien we stimulatie van mest-cellen in de hypothalamus inroepen, betekent dit niet noodzakelijk dat mest-cellen noodzakelijkerwijs gestimuleerd zouden moeten zijn buiten het CZS. Niettemin zijn er rapporten geweest over een verband tussen M.E./CVS en acute rhinitis [ontsteking van het neusslijmvlies], inclusief significant hogere TNF & CXCL8 [chemokine; ook interleukine-8 (IL-8) of neutrofiel-aktiverende factor (NAF) genoemd] -waarden in lavage-vocht uit de neus. Daarnaast waren chronische rhinosinusitis symptomen significant erger bij patiënten met M.E./CVS [Chester AC. Symptoms of rhinosinusitis in patients with unexplained chronic fatigue or bodily pain: a pilot study. Arch Intern Med (2003) 163: 1832-1836], blijkbaar door niet-allergische rhinitis [Baraniuk JN & Ho LU The nonallergic rhinitis of Chronic Fatigue Syndrome. Clin Allergy Immunol 19 (2007): 427-447]. Het is goed bekend dat zowel allergische als aanhoudende rhinitis de aktivatie van mest-cellen omvatten. Er werd gerapporteerd dat de incidentie van M.E./CVS hoger lag bij patiënten met een voorgeschiedenis van atopie [de aanleg om immunglobuline (Ig)-E (antistoffen) aan te maken specifiek gericht tegen stoffen uit de omgeving] [Yang TY et al. Increased Risk of Chronic Fatigue Syndrome Following Atopy: A Population-Based Study. Medicine (Baltimore) (2015) 94: e1211]. Er werden overigens meer circulerende bloed mest-cel voorlopers gevonden bij M.E./CVS-patiënten [Nguyen T et al. Novel characterisation of mast cell phenotypes from peripheral blood mononuclear cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients. Asian Pac J Allergy Immunol (2017) 35: 75-81].

Mest-cellen zijn perivasculair [rond de bloedvaten] gelokaliseerd in de hypothalamus, de thalamus en het derde [hersen]ventrikel [omvat de ‘plexus chorioides’ waar hersenvocht aangemaakt wordt] van het diencefalon [tussenhersenen]. CRH kan mest-cellen stimuleren in de hypothalamus aangezien het CRHR-1 gen tot expressie komt op menselijke gecultiveerde mest-cellen: aktivatie daarvan induceert de aanmaak van vasculaire endotheliale groei-factor (VEGF) door de hersenen. Bovendien wordt CRH gesynthetiseerd door mest-cellen, wat impliceert dat het autocriene effekten [waarbij de uitgescheiden stoffen op de eigen cel inwerken] kan hebben. Interessant: zelfs somatostatine stimuleert mest-cellen. Mest-cellen worden ook gevonden in de pijnappelklier, hypofyse en schildklier, wat hun bijdrage tot de symptomen van M.E./CVS (zoals slaap-stoornissen, dysfunktionele HPA-as en vermoeidheid te wijten aan een dysfunktionele schildklier) verder uitbreidt. Mest-cellen zijn goed gekend voor hun rol bij allergie, wat de permeabileit van de bloed-brein-barrière (BBB) kan verhogen, leidend tot inflammatie-reakties; maar mest-cellen worden nu als belangrijk beschouwd bij aangeboren en verworven immuniteit, antigen-presentatie en inflammatie [Theoharides TC et al. Mast cells and inflammation. Biochim Biophys Acta (2010) 1822: 21-33].

Mest-cellen kunnen gestimuleerd worden door neuronen, hormonen, omgeving-, neuro-immune, pathogene en stress-triggers. [Stimuleren degranulatie: o.a. acetylcholine, adenosine, complement-fragmenten, IgE, IgG1, IgG4, histamine, serotonine, tryptase /// Stimuleren selektieve release van mediatoren zonder degranulatie: o.a. ATP, Borrelia burgdorferi, CRH, zware metalen, IL-33, mycotoxinen, LPS, virussen]. Reaktieve zuurstof soorten (ROS) kunnen mest-cellen ook stimuleren. Mest-cellen sekreteren ook leptine dat kan bijdragen tot cachexie [veralgemeende zwakte-toestand] en vermoeidheid. Mest-cellen sekreteren wel 100 verschillende mediatoren, dikwijls op een selektieve manier zonder degranulatie [Theoharides TC et al. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev (2007) 217: 65-78] en gebruikmakend van verschillende sekretorische mechanismen. Mest-cellen kunnen ook ‘danger’-signalen [molekulen die attenderen op beschadiging/infektie] sekreteren [Theoharides TC. Danger Signals and Inflammation. Clin Ther (2016) 38: 996-999], inclusief veel chemokinen en cytokinen, en bijzonderlijk mitochondriaal DNA (mtDNA) (Zhang B et al. Stimulated human mast cells secrete mitochondrial components that have autocrine and paracrine inflammatory actions. PloS One (2012) 7:e49767] dat als een ‘aangeboren pathogen’ kan werken en leidt tot een plaatselijke auto-inflammatoire respons in de hersenen [Collins LV et al. Endogenously oxidized mitochondrial DNA induces in vivo and in vitro inflammatory responses. J Leukoc Biol (2004) 75: 995-1000 /// Theoharides TC et al. The “missing link” in autoimmunity and autism: Extracellular mitochondrial components secreted from activated live mast cells. Autoimmun Rev (2013) 12: 1136-1142]. Extracellulair mtDNA kan ofwel direct gesekreteerd worden in het diencefalon of het brein bereiken via lymfevaten. We rapporteerden dat mtDNA verhoogd is in het serum van kinderen met autisme spectrum aandoening (ASD). Van mest-cellen afkomstige mediatoren kunnen microglia dan stimuleren [Zhang X et al. Induction of Microglial Activation by Mediators Released from Mast Cells. Cell Physiol Biochem (2016) 38:1520-1531] om bijkomende pro-inflammatoire en homeostase-verstorende molekulen [de cytokinen IL-1β, IL-6 & TNF, en de chemokinen CCL2, CXCL8 & CCL5] te sekreteren, wat bijdraagt tot vermoeidheid en neuropsychiatrische symptomen [studie bij autisme spectrum stoornissen]. Het is interessant dat peptide-Y [stress-mediator] gestegen bleek te zijn in het plasma van patiënten met M.E./CVS en significant correleerde met stress [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in chronic fatigue syndrome. Behav Brain Funct (2010) 6: 76], aangezien van dit peptide is geweten dat het mest-cellen stimuleert.

Een belangrijk onderdeel is dat de combinatie van triggers waarschijnlijk een belangrijker pathogenetische rol speelt dan individuele triggers. Bv.: we rapporteerden dat de combinatie van CRH en NT een synergistische werking vertonen bij het stimuleren van de VEGF-afgifte zonder tryptase van menselijke mest-cellen, alsook het induceren van de expressie van hun receptoren op menselijke mest-cellen. We toonden ook dat de combinatie van SP en IL-33 synergistisch werken bij het stimuleren van TNF-sekretie zonder tryptase door menselijke gecultiveerde mest-cellen [Taracanova A et al. SP and IL-33 together markedly enhance TNF synthesis and secretion from human mast cells mediated by the interaction of their receptors. Proc Natl Acad Sci USA (2017) 114: E4002-E4009].

CRH wordt dikwijls afgegeven tesamen met een ander peptide, neurotensine (NT) [neurotransmitter], dat vaso-aktief is en ook geïmpliceerd bleek bij inflammatie en neurologische ziekten. NT is verhoogd in de huid na acute stress en verhoogt de vasculaire doorlaatbaarheid, een effekt dat synergistisch is met CRH.

Mest-cellen worden ook gestimuleerd door het peptide Substantie-P (SP [neuropeptide dat funktioneert als een neurotransmitter en als een neuromodulator; zie ‘Mest-cellen & Substantie-P]) […] en er werd aangetoond dat het deelneemt in inflammatoire processen. IL-33 is een lid van de IL-1 familie van cytokinen en dook op als een vroeg waarschuwing-signaal (‘alarmine’ [alarminen zijn endogene molekulen die weefsel- en cel-schade signaliseren]) bij auto-immune of inflammatoire processen. IL-33 wordt afgegeven door fibroblasten en endotheliale cellen maar ook door mest-cellen. IL-33 verhoogt het effekt van IgE op de sekretie van histamine door mest-cellen en basofielen; maar er zijn geen rapporten over het effekt van IL-33 op zichzelf of in combinatie met SP op de sekretie van IL-1ß door menselijke mest-cellen. Substantie-P stimuleerde de afgifte van VEGF, een werking die wordt verhoogd door IL-33.

We toonden dat de stimulatie van menselijke mest-cellen door SP tesamen met IL-33 de sekretie en gen-expressie van het pro-inflammatoir cytokine TNF uitgesproken doet stijgen [zie Taracanova A et al. hierboven]. Interessant is dat chronische rhinosinusitis, wat (zoals eerder besproken) vrij courant voorkomt bij M.E./CVS, geassocieerd bleek met hoge waarden van nasaal IL-33, wat de hypothalamus kan bereiken via de cribriforme plexus [‘zeefvormig netwerk’; het hersenvlies rond de reukzenuw gaat door het zeefbeen (cribriforme plaat) en gaat over in lymfevaten die het hersenvocht door de lymfeknopen pompen].

Is er een behandeling die werkt?

Er zijn momenteel geen door de FDA goedgekeurde medicijnen drugs voor M.E./CVS, en de beschikbare psychologische, fysieke en farmacologische interventies lijken niet doeltreffend. Mitochondrieën lijken een aantrekkelijk doelwit voor medicijnen bij de behandeling van M.E./CVS, maar andere artikels rapporteerden geen klaarblijkelijke wijziging van de ATP-produktie [Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. III. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed (2012) 25: 1073-1087]. Chemokinen en cytokinen werden voorgesteld als doelwitten voor neuro-inflammatoire aandoeningen maar die werden niet uitgeprobeerd bij M.E./CVS.

De peroxisoom proliferator geaktiveerde receptor (PPAR [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren zijn een groep receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren]) agonist bezafibraat [bedoeld als vet-verlagend middel] verbeterde de mitochondriale funktie door stimulatie van mitochondriale biogenese en het verhogen van de efficiëntie van de oxidatieve fosforylatie in een aantal studies [Systemische Lupus Erythematosus, Huntington’s]. Er werd ook gesuggereerd dat – aangezien vermoeidheid geassocieerd is met hypotensie bij M.E./CVS-patiënten – het verhogen van de bloeddruk een doeltreffende therapeutische benadering kan betekenen voor dit symptoom. Alhoewel eerdere studies aangaande het gebruik van het mineralcorticoïd fludrocortison geen verbetering kon aantonen, heeft het aanwenden van de agonist midodrine [alfa-adrenerge agonist voor de behandeling van orthostatische hypotensie] om de bloeddruk te doen stijgen, enige verbetering van de vermoeidheid opgeleverd [Naschitz J et al. Midodrine treatment for Chronic Fatigue Syndrome. Postgrad Med J (2004) 80: 230-232]. Interessant is dat werd getoond dat angiotensine-II inhibitoren het mitochondriaal membraan potentiaal verhogen, mitochondriale funktie verbeteren en mitochondriale biogenese stimuleren. Inderdaad: er werd getoond dat blokkage van angiotensine-II de aanvang van T2DM [diabetes type-2] bij muizen voorkomt door het verhogen van de vet-oxidatie, triglyceriden in spieren vermindert en de glucose-tolerantie verbetert. De angiotensine-receptor blokker telmisartan [bloeddruk-verlagend middel] verbetert de mitochondriale dysfunktie door het versterken van mitochondriale biogenese en het beschermen tegen beschadiging van vasculaire en endotheliale cellen. Op dezelfde manier werd getoond dat de angiotensine-receptor blokker losartan [wordt gebruikt bij de behandeling van verhoogde bloeddruk] de werking van de mitochondriale respiratoire keten en co-enzyme-Q10 (CoQ10) inhoud verbetert bij hypertensieve dieren. Gezien de bloeddruk-verlagende effekten van deze middelen is het echter onwaarschijnlijk dat ze nuttig zouden zijn bij M.E./CVS, uitgezonderd bij een selekte groep patiënten misschien.

Meerdere natuurlijke stoffen kunnen een voordelig effekt hebben op de mitochondriale funktie. Magnesium-ionen spelen cruciale rollen bij het energie-metabolisme en het behouden van normale spier-funktie, als positief aktieve regulator van de glycolyse en van alle enzymatische reakties waarbij de transfer van fosfaat-groepen van ATP betrokken is. Meerdere studies hebben aangetoond dat magnesium-ion supplementen de spierkracht significant verhogen en optimale lichamelijke aktiviteit-prestaties bij mensen bewaren. Bij dieren lijkt deze verbetering van inspanning-prestaties te geschieden via het verhogen van de beschikbaarheid van glucose in de hersenen en spieren, en via het verminderen/vertragen van lactaat-accumulatie. Magnesium-sulfaat kan ook de mitochondriale respiratoire funktie verbeteren en de aanmaak van stikstof-oxide in het brein voorkomen.

Coenzyme-Q10 deficiëntie werd gerapporteerd bij patiënten met M.E./CVS. De toediening van CoQ10 aan M.E./CVS-patiënten gaf echter geen voordeel [Campagnolo N et al. Dietary and nutrition interventions for the therapeutic treatment of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic review. J Hum Nutr Diet (2017) 30: 247-259]. [Een Spaans onderzoeksteam rapporteerde “een significante verbetering qua vermoeidheid”; zie ‘Oraal Co-enzyme Q10 plus NADH voor M.E.(cvs)]

In de natuur voorkomende flavonoïden hebben krachtige anti-oxidante, anti-inflammatoire en neuroprotectieve werkingen en worden over het algemeen als veilig beschouwd. Het flavonoïd genisteïne verlicht spier-vermoeidheid bij mensen door het downreguleren van oxidatieve stress en het versterken van de aktiviteit van anti-oxidante enzymen. De flavonoïden epigallocatechine, naringine [polyfenol anti-oxidant] en curcumine kunnen M.E./CVS-symptomen verbeteren in experimentele modellen [ratten & muizen]. Andere rapporten documenteerden gelijkaardige chronische vermoeidheid verlichtende effekten voor de Astragalus [belangrijk kruid in de traditionele chinese geneeskunde] flavonoïden [ononine, formononetine & demethylhomopterocarpine] [Kuo YH et al. Astragalus membranaceus flavonoids (AMF) ameliorate Chronic Fatigue Syndrome induced by food intake restriction plus forced swimming. J Ethnopharmacol (2009) 122: 28-34] en olijven-extract [Gupta A et al. Possible role of oxidative stress and immunological activation in mouse model of Chronic Fatigue Syndrome and its attenuation by olive extract. J Neuroimmunol (2010) 226: 3-7]. Van de isoflavonen genisteïne en daidzeïne werd een omkering getoond van de effekten van poly-inosine:poly-cytidine zuur (poly I:C) [synthetisch dubbel-strengig RNA] op locomotor-aktiviteit bij muizen en expressie van brein-inflammatie mediator in een muizen-model voor vermoeidheid [Vasiadi M et al. Isoflavones inhibit poly(I:C)-induced serum, brain, and skin inflammatory mediators – relevance to chronic fatigue syndrome. J Neuroinflammation (2014) 11: 168]. Quercetine [flavonoïd; zie ook ‘Quercetine – Effekt op mitochondriale biogenese & inspanning-tolerantie] lijkt de inspanning-tolerantie te verhogen door het verlichten van oxidatieve stress in muizen-hersenen, en ter zelfder tijd een anti-oxidante en anti-inflammatoire werking te verlenen [Davis JM et al. Quercetin increases brain and muscle mitochondrial biogenesis and exercise tolerance. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol (2009) 296: R1071-R1077].

Luteoline onderdrukt de adipocyten [vet-cellen] -aktivatie van macrofagen en inflammatie, terwijl het de insuline-sensitiviteit van het endothelium verhoogt [Deqiu Z et al. Luteolin inhibits inflammatory response and improves insulin sensitivity in the endothelium. Biochimie (2011) 93: 506-512]. Luteoline inhibeert ook mest-cellen [Weng Z et al. The novel flavone tetramethoxyluteolin is a potent inhibitor of human mast cells. J Allergy Clin Immunol (2015) 135: 1044-1052] en microglia. In deze context is het interessant dat luteoline verbetering gaf van symptomen van ASD, post-Lyme syndroom en hersen-mist; in open-label testen. We toonden dat tetramethoxyluteoline krachtiger is dan luteoline wat betreft het vermogen om menselijke gecultiveerde microglia en mest-cellen te inhiberen [Patel AB & Theoharides TC. Methoxyluteolin Inhibits Neuropeptide-stimulated Proinflammatory Mediator Release via mTOR Activation from Human Mast Cells. J Pharmacol Exp Ther (2017) 361: 462-471]. Intranasale toediening van selekte flavonoïden kunnen inflammatie in de hypothalamus reduceren en de centrale pathogenese van M.E./CVS corrigeren. Er zijn nieuwe behandelingen nodig om de centrale pathogene processen aan te pakken. Bv.: er werd getoond dat intranasale toediening van curcumine ingekapseld in microvesikels inflammatie van het brein in een muizen-model inhibeert [Sun D et al. A novel nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Mol Ther (2010) 18: 1606-1614].

Besluiten

Over het geheel genomen bleek het M.E./CVS-fenotype verband te houden met klaarblijkelijke abnormaliteiten in het metabool profiel, mogelijks te wijten aan lokale inflammatie in de hypothalamus. Molekulen die de inflammatie in het brein zouden kunnen inhiberen, zoals tetramethoxy-luteoline of het anti-inflammatoir cytokine IL-37 [Mastrangelo F et al. Low-grade chronic inflammation mediated by mast cells in fibromyalgia: role of IL-37. J Biol Regul Homeost Agents (2018) 32: 195-198.] kunnen potentiële behandel-opties zijn.

Advertenties

juli 29, 2018

Uitgebreide metaboloom-studie bij M.E.(cvs)

Aankondigingen als “Nieuwe CVS-test is 84 percent accuraat’ klinken natuurlijk hoopgevend maar de realiteit is toch ietsje ingewikkelder… Als men het artikel hier onder leest, zal men te weten komen dat het niet over één (snel) test(je) gaat maar een complexe analyse die op lange termijn inzichten zou kunnen verschaffen over de pathologie, subgroepen en een mogelijke therapeutische aanpak daarvan. ‘Inzichten over metabolieten brengen ons dichter naar een test voor CVS’ klinkt al wat genuanceerder…

Onderstaande studie, door een research-team o.l.v. onderzoekers van het ‘Centre for Infection and Immunity’ (CII) van de Columbia Universiteit (New York City), levert dus geen kant-en-klare diagnostische test op. D.m.v. hoog-technologische technieken (die bijlange niet in elk routine-lab beschikbaar zijn) werden 562 metabolieten (zeg maar produkten die ontstaan bij menselijke en of microbiële processen die suikers/vetten/eiwitten verwerken) gevonden die bij M.E.(cvs)-patiënten al dan niet anders waren. Een aantal daarvan bleken te wijzen op mogelijk slecht funktioneren van de mitochondrieën (de energie-fabriekjes van cellen) – wat overéénkomt met wat andere research-teams vonden. Ook hun eerdere vondst van een onderscheidend metabolieten-patroon tussen M.E.(cvs) en prikkelbare darm syndroom werd bevestigd. Combinatie van de gegevens (metaboloom) met de eerder gevonden biomerkers (microbioom) leverde een voorspellend model op en statistische analyse gaf aan dat de accuraatheid daarvan om de diagnose M.E.(cvs) te kunnen stellen 84% is.

Dr. W. Ian Lipkin, directeur van het CII en het ‘National Institutes of Health Centre for Solutions for ME/CFS’ liet optekenen: “We beginnen te begrijpen hoe de ziekte in z’n werk gaat. We zouden dieren-modellen kunnen gaan ontwikkelen die ons in staat kunnen stellen om hypotheses en potentiële therapieën (bv. probiotica de darm-flora regelen of medicijnen die bepaalde neurotransmitter-systemen aktiveren) te testen.”.

————————-

Scientific Reports Vol 8, #1, article 10056 (juli 2018)

Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics

Dorottya Nagy-Szakal (1), Dinesh K. Barupal (2), Bohyun Lee (1), Xiaoyu Che (1), Brent L. Williams (1), Ellie J.R. Kahn (1), Joy E. Ukaigwe (1), Lucinda Bateman (3), Nancy G. Klimas (4,5), Anthony L. Komaroff (6), Susan Levine (7), Jose G. Montoya (8), Daniel L. Peterson (9), Bruce Levin (10), Mady Hornig (1), Oliver Fiehn (11), W. Ian Lipkin (12)

1 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

3 Bateman Horne Center, Salt Lake City, UT, USA

4 Institute for Neuro Immune Medicine, College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, USA

5 Miami VA Medical Centre, Miami, FL, USA

6 Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA

7 Levine Clinic, New York, NY, USA

8 Stanford University, Palo Alto, CA, USA

9 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

10 Department of Biostatistics, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

11 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

12 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

Samenvatting

De pathogenese van M.E./CVS, een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, slaap-stoornissen, orthostatische intolerantie, koorts, prikkelbare darm syndroom (IBS) en lymfadenopathie [afwijkingen/vergroting van de lymfeklieren], wordt niet goed begrepen. We rapporteren over biomerkers en topologische analyse van het plasma metaboloom, faecaal bakterieel metagenoom en klinische gegeven van 50 M.E./CVS-patiënten & 50 gezonde controles. We bevestigen meldingen van gewijzigde plasma-waarden van choline, carnitine en complexe lipiden, en tonen aan dat patiënten met M.E./CVS & IBS verhoogde plasma-waarden van ceramide hebben. Integratie van faecal metagenoom en plasma metaboloom gegevens resulteerde in een sterker voorspellend model voor M.E./CVS (kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom (kruis-validatie AUC = 0.745) of metaboloom (kruis-validatie AUC = 0.820) -analyse apart. Onze bevindingen kunnen inzicht bieden in de pathogenese van M.E./CVS en z’n subtypes, en suggereren mechanismen voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën.

Inleiding

[…]

Metaboloom-studies over M.E./CVS hebben onregelmatigheden onthuld aangaande het energie-, aminozuren-, nucleotiden- en stiktstof-metabolisme [Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172], alsook inconsistente verstoringen in neurotransmitter-gerelateerde mechanismen en het lipiden-metabolisme. In een massa-spectrometrische studie met 45 M.E./CVS-individuen en 39 gezonde controles, rapporteerden Naviaux et al. abnormaliteiten qua niveaus van fosfo- en sfingolipiden, cholesterol, ‘vertakte’ aminozuren, vitaminen, proline/glutamaat en mitochondriale metabolieten. [Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480] In een studie met 67 M.E./CVS-patiënten en 66 gezonde controles bepaalden Yamano en z’n collega’s 144 metabolieten en rapporteerden abnormaliteiten qua waarden van metabolieten gerelateerd met glycolyse, de TCA-cyclus en de ureum-cyclus, maar niet van het glutamine-metabolisme. [Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep (2016) 6: 34990] Fluge et al. brachten bewijsmateriaal aan voor afwijkingen die consistent zijn met verstoorde funktie van pyruvaat-dehydrogenase die gelinkt is met verstoringen van de (TCA-cyclus gebaseerde) energie-produktie. [Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1] Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie heeft ook metaboloom-abnormaliteiten onthuld die consistent zijn met veranderde gluconeogenese, mogelijke inhibitie van de glycolyse en een verstoorde respons op oxidatieve stress. [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] Een andere NM-studie vond dat bij M.E./CVS (t.o.v. controles) de waarden van glutamine en ornithine in het serum lager waren, en correleerden met metabolieten verbonden met de ureum-cyclus. [Armstrong CW et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531] Een piloot-studie (met de focus op plasma van vrouwen met M.E./CVS) onthulde wijzigingen qua energie-gerelateerde metabole molekulen en mechanismen. [Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst (2017) 13: 371-379] We hebben melding gemaakt van analyses van het faecaal microbioom en stelden een model voor waarbij intestinale dysbiose kan bijdragen tot bakteriële metabole stoornissen die verschillen tussen M.E./CVS-subgroepen met of zonder IBS. [Nagy-Szakal D. et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5, 44]

Hier rapporteren we over gerichte en ongerichte analyses van 562 molekulen die primaire metabolieten, biogene aminen, lipiden-complexen en oxylipinen [molekulen ontstaan door oxidatie van vetzuren] vertegenwoordigen, in het plasma van M.E./CVS-patiënten en controles. We beschreven ook de verbondenheid van de resulterende metaboloom-gegevens met faecaal metagenoom en klinische gegevens. Zoals bij onze eerder gerapporteerde metagenoom-analyses, vonden we dat metaboloom-profielen niet enkel verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en controles maar ook tussen M.E./CVS-patiënten die al dan niet IBS hebben.

Methodes

Studie-ontwerp

[…]

Studie-populatie en plasma-collectie

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Controles gematcht voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en seizoen van afname. […]

[…]

Klinische beoordeling & medische anamnese

[…]

Zelf-gerapporteerd diagnose van IBS […] 24/50 M.E//CVS-patiënten (48%), 1/50 controle-individuen (2%). […]

Metabolomica

Er werden 3 ongerichte metaboloom-testen en 1 gerichte test uitgevoerd voor 562 metabolieten van 20 biochemische mechanismen [massa-spectrometrie]. […].

Statistische analyses

[…]

MetaMapp

[Methode om verbanden tussen biochemische en chemische verbanden te integreren om alle gedetekteerde metabolieten d.m.v. in netwerk-diagrammen in kaart te brengen. Deze diagrammen visualiseren op een efficiënte manier de op massa-spectrometrie gebaseerde metaboloom-gegevens. Een knooppunt vertegenwoordigt een metaboliet. Ge-upreguleerde en ge-downreguleerde knooppunten krijgen een verschillende kleur. De grootte van een knooppunt weerspiegelt de grootte-orde van het effekt.] […] Struktureel geïdentificeerde metabolieten werden gegroepeerd in 21 chemische groepen [carnitine-choline * tryliceriden (TG) * ceramide * fosfatidylethanolminen (PE) * aminozuren * oxylipinen * exposoom * vetzuren * sfingomyelinen (SM) * energie * complexe lipiden (LPC) * carnitine * suiker * suiker-alkohol * cholesterol * neutrale lipiden * één-koolstof/nicotinaat * neurotransmitter * nucleotide * vitamine]. De metabolieten werden manueel geklassificeerd omdat dit voor veel molekulen, inclusief complexe lipiden, niet altijd even goed gebeurt in bestaande databases. […]

Analyses van topologische gegevens

Metagenoom- en metaboloom-gegevens, inclusief plasma-waarden van de metabolieten, bakteriële samenstelling en afgeleide metabole mechanismen, plasma immuun-profielen en symptoom-ernst-scores, werden gebruikt voor TDA [‘topological data analysis’, topologische gegevens analyse]. De aangewende methodiek geeft de complexe biologische sets gegevens weer als gestruktureerde 3-dimensionele netwerken [knooppunten verbonden met lijnen]. […] De lijnen verbinden netwerk-knooppunten die gemeenschappelijke gegevenspunten bevatten. […] De grootte van een knooppunt in het topologisch netwerk was proportioneel met het aantal variabelen met een gelijkaardig profiel. We construeerden een netwerk bestaande uit 100 stalen en 1.900 variabelen (562 plasma-metabolieten, 574 faecale bakteriële relatieve aantallen […], 586 voorspelde bakteriële metabole mechanismen, 61 immuun-molekulen, 81 variabelen met betrekking tot M.E./CVS-vermoeidheid en andere symptoom-scores/vragenlijst-items, en informatie over co-morbiditeiten en 36 demografische variabelen). […]

Resultaten

Karakteristieken van de studie-populatie

[…] 41 vrouwelijke en 9 mannelijke M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 51,1 ± 1,6 jaar); 41 vrouwelijke en 9 mannelijke controle-individuen (gemiddelde leeftijd 51,3 ± 1,6 jaar). […] Prikkelbare darm syndroom (IBS) diagnose bij 24 van de 50 M.E./CVS-patiënten (48%). Eén van de 50 controle-individuen meldde een diagnose van IBS (2%).

Metaboloom-gegevens

Gerichte en ongerichte massa-spectrometrie leverde gegevens op voor 562 metabolieten: 111 primaire metabolieten (PM), inclusief deze gerelateerd met het tryptofaan-metabolisme, suikers, hydroxyzuren, keton-lichamen en andere molekulen van het energie-metabolisme; 103 biogene aminen (BA) inclusief vertakte en onvertakte acylcarnitinen, trimethylamine N-oxidase (TMAO [osmolyt (molekule bijdragend tot de (regulering van) osmotische druk in cellen en weefsels); ook gerapporteerd significant verhoogd te zijn bij fibromyalgie]), choline [organische stof die belangrijk is voor de struktuur van cel-membranen en andere membraan-strukturen, en voor neurotransmissie] en aminozuren; 302 complexe lipiden (CL) inclusief mono- en di-acylglyceriden [molekulen van glycerol gelinkt met 1 of 2 vetzuren], vetzuren, ceramide [(sfingo)lipide-molekule in het celmembraan waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood; Naviaux rapporteerde bij M.E.(cvs) gedaalde waarden] sfingomyelinen [sfingolipiden die voornamelijk voorkomen in de myeline-schede rond axonen] en fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden]; en 46 bio-aktieve oxylipinen (OL), steroïden en galzuren. […]

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel

Exposoom- en vitamine-metabolieten (exogene milieu-stoffen) [Het exposoom is het geheel van menselijke (d.i. niet-genetische) blootstellingen aan het milieu vanaf de conceptie.]) werden uitgesloten [lijst beschikbaar op aanvraag] bij onze biomerker-analyse omdat vitamine-supplementen, medicijnen en dieet een impact kunnen hebben op de concentraties metabolieten onafhankelijk van de ziekte-toestand. [514 overblijvende metabolieten] We selekteerden de top 10 potentiële M.E./CVS-biomerkers. […] 5-methoxytryptamine (5-MT) werd uitgesloten aangezien het in 50% van de gevallen wordt verstoord door het gebruik van antidepressiva. […]

Bij de top plasma-biomerkers die M.E./CVS-patiënten differentiëren van controles waren gedaalde waarden van betaïne [osmolyt], complexe lipiden (lysofosdatidylcholine [LPC], fosfatidylcholinen [PC]) en sfingomyelinen (SM), en gestegen waarden van triglyceriden (TG), α-N-fenylacetyl-glutamine [metaboliet van de ureum-cyclus], ε-caprolactam [cyclisch amide] en urobiline [afbraakprodukt van oude erythrocyten; kleurstof in de urine]. [complete lijst beschikbaar op aanvraag] Analyse leerde dat M.E./CVS-individuen verminderde waarden qua PC en ontregeling van het of choline-carnitine mechanisme vertoonden.

MetaMapp-analyse van alle metabolieten, inclusief vitaminen en neurotransmitters, bracht de biochemische en chemische relaties in kaart in een metabool netwerk-diagram. De diagrammen beschrijven verhoogde TG en vetzuren, en verlaagde carnitinen, ceramiden, SM en fosfatidylcholinen bij M.E./CVS i.v.m. controles. De analyse toonde ook verminderd 5-MT, tyrosine en indol-3-lactaat [tryptofaan-metaboliet], en verhoogd vitamine-B5 (pantotheenzuur) bij de M.E./CVS-individuen. [In detail: MetaMapp identificeerde verstoringen in het tryptofaan-metabolisme, de carnitine-‘shuttle’ (enzymen-mechanisme verantwoordelijk voor de transfer van lange-keten vetzuren door het binnenste mitochondriaal membraan om te worden afgebroken) / energie-homeostase en de complexe lipiden. Metabolieten die het tryptofaan- en carnitine-mechanisme vertegenwoordigen waren gedaald bij M.E./CVS (t.o.v. controles). In tegenstelling daarmee waren threonzuur (metaboliet van ascorbinezuur of vitamine-C), aminozuren (tyrosine, methionine & lysine), fenylacetyl-glutamine, pantotheenzuur, hexa-ethyleen-glycol (metaboliet) & ε-caprolactam gestegen bij M.E./CVS. Lipiden-analyses toonden dat terwijl metabolieten die de SM, Cer/CE (ceramide) & PC/LPC mechanismen vertegenwoordigen verminderd waren bij M.E./CVS, de TG-mechanismen waren verhoogd.]

IBS co-morbiditeit is geassocieerd met veranderde metabole profielen bij M.E./CVS-patiënten

In eerder werk (met dezelfde individuen) bleek IBS co-morbiditeit de sterkste factor die bepalend was voor de topologische netwerken gebaseerd op faecaal metagenoom gegevens (bakteriële relatieve hoeveelheden en voorspelde bakteriële metabole mechanismen). Analyse van plasma-metabolieten onthulde dat metaboloom-profielen van M.E./CVS-patiënten met IBS zich onderscheiden van controles door waarden van TG, ceramiden, fosfatidylethanolminen (PE) [membraan-fosfolipiden] en metabolieten van het carnitine-choline mechanisme.

M.E./CVS-patiënten zonder IBS co-morbiditeit vertoonden verstoringen qua PCs en het carnitine-choline mechanisme, gelijkaardig met die gevonden bij de globale M.E./CVS-groep. Statistische analyses van de plasma-metabolieten identificeerden verhoogde waarden qua ceramiden, TG, PE, 5-methylthio-adenosine [een nucleoside; zie hieronder], mannitol [een een polyol of suiker-alkohol] en betaïne, alsook gedaalde waarden LPCs en γ-butyrobetaïne [voorloper van carnitine] bij M.E./CVS-patiënten met IBS t.o.v. controles. Bij M.E./CVS-patiënten zonder IBS vonden we verminderde waarden qua tyrosine en PC, en verhoogde waarden qua TG en Tyr-Met-Lys [de 3 aminozuren tyrosine, methionine & lysine] t.o.v. controles. In vergelijking met controles hadden alle M.E./CVS-groepen (globaal, met IBS en zonder IBS) gedaalde waarden van carnitine-choline metabolieten. M.E./CVS-patiënten met IBS hebben een onderscheidend metaboloom-profiel.

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel bij vrouwen

De metabole profielen bij vrouwen met M.E./CVS waren gelijkaardig met deze die worden gezien bij alle M.E./CVS-gevallen. De waarden van complexe lipiden (LPC & PC) waren gedaald en de TG-waarden waren verhoogd bij M.E./CVS vs. controles. Bij de top 10 plasma biomerkers die de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten differentieerden van de vrouwelijke controles waren verlaagd indol-3-lactaat en γ-butyrobetaïne. Deze bleken ook gereduceerd bij de globale M.E./CVS-groep maar behoorden niet tot de top 10.

Geselekteerde metabolieten als potentieel diagnostisch instrumetn bij M.E./CVS

M.E./CVS vs. controles

We testten de sensitiviteit en de specificiteit van de top 10 M.E./CVS-biomerkers […]. Deze metabolieten onderscheiden de M.E./CVS-individuen van de controles met een accuraatheid (‘receiver operating characteristic’ (ROC) [ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit] & ‘area under the curve’ (AUC) [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] van 0.960 (kruis-validatie [een techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] AUC = 0.820). Er bleken in onze eerder studie 8 bakteriële soorten M.E./CVS te voorspellen […] (Coprococcus (C.) catus, Pseudoflavonifractor (P.) capillosus, Dorea (D.) formicigenerans, Faecalibacterium (F.) prausnitzii, Clostridium (C.) asparigiforme, Sutterella (S.) wadsworthensis, Alistipes (A.) putredinisand Anaerotruncus (A.) colihominis; kruis-validatie AUC = 0.745). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (ROC AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart. […]

IBS-subgroepen vs. controles

[…] De top 10 metabolieten onderscheiden M.E./CVS met IBS van de controles met een accuraatheid van AUC = 0.877 (kruis-validatie AUC = 0.754). In onze eerdere studie werden 9 bakteriële soorten geselekteerd om M.E./CVS+IBS te voorspellen […] (F. cf., F. prausnitzii, Bacteroides (B.) vulgatus, A. putredinis, C. catus, Anaerostipes (A.) caccae, D. formicigenerans, A. colihominis & C. asparagiforme; kruis-validatie AUC = 0.791. Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.824) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Bij M.E./CVS zonder IBS zorgden de top 10 metabolieten ook voor een onderscheid met een hoge accuraatheid (AUC = 0.975, kruis-validatie AUC = 0.839). In onze eerdere studie werden 7 bakteriële soorten geselekteerd om ME/CFS-IBS te voorspellen (B. caccae, P. capillosus, Parabacteroides (P.) distasonis, B. fragilis, Prevotella (P.) buccalis, B. xylanisolvens & D. formicigenerans; kruis-validatie AUC = 0.754). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (MET+BACT: AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.880) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Plasma metaboloom-profielen, faecale bakteriële profielen en symptoom-scores bij M.E./CVS

[lijst met unieke en gedeelde metabolieten in de M.E./CVS-subgroepen beschikbaar op aanvraag]

De relatieve aantallen van bakteriële soorten in faeces van de individuen varieerden met hun plasma metaboloom-profielen. Verminderd betaïne bleek geassocieerd met minder A. colihominis. Gedaald PC 30:0 correleerde met minder A. putredinis, een bakterie die sulfonolipiden – ongewone sfingolipiden die struktureel gerelateerd zijn met ceramiden – produceert. Van sfingolipiden is geweten dat ze bakterieën helpen overleven en stress-resistentie bevorderen.

Bij M.E./CVS met IBS was 5-methylthio-adenosine (een metaboliet afgeleid van S-adenosylmethionine als neven-produkt van de polyamine-biosynthese, dat toxisch kan zijn voor zoogdier-cellen) geassocieerd met funktionele stoornissen. Ceramide was geassocieerd met verhoogde lichamelijke vermoeidheid. Gedaald γ-butyrobetaïne correleerde met meer Faecalibacterium, een bakterie die een belangrijke rol speelt bij de aanmaak in de dikke-darm van butyraat [boterzuur], een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten.

In M.E./CVS zonder IBS correleerde gedaald tyrosine met minder P. distasonis. Verhoogd TG 54:6 A was gecorreleerd met D. formicigenerans, en TG 54:8 was gecorreleerd met minder B. caccae & D. formicigenerans. Parabacteroides & Bacteroides soorten hebben het vermogen complexe polysacchariden om te zetten in energie-bronnen. D. Formicigenerans is een koolhydraten-fermenterende bakterie die mierenzuur en lactaat produceert.

TDA-analyse voor netwerk-identificatie

‘Topological data analysis’ (TDA) [zie methodes] van plasma metaboloom- en faecaal metagenoom-gegevens, en klinische symptoom-ernst identificeerde netwerken die M.E./CVS van controles onderscheiden. Profielen van bakteriële relatieve aantallen waren sterkere bepalende factoren voor netwerk-onderscheid dan plasma-metabolieten.

Bespreking

We rapporteerden eerder dat M.E./CVS-patiënten met IBS, M.E./CVS-patiënten zonder IBS en normale controle-individuen groep-specifieke verschillen vertonen qua faecale microflora. We hebben de karakterisatie van dezelfde individuen uitgebreid d.m.v. gerichte en ongerichte metaboloom-analyses van het plasma en geïntegreerde analyse van plasma metaboloom-, faecal metagenoom- en klinische gegevens.

De groep van Naviaux rapporteerde eerder gedaalde plasma-waarden van sfingomyelinen, ceramiden en fosfolipiden (met uitzondering van 18:1 & PC 22:6, die gestegen waren). Tomic et al. rapporteerden verhoogde plasma-waarden TG. [Lipid and protein oxidation in female patients with Chronic Fatigue Syndrome. Arch Med Sci (2012) 8: 886-891] Germain et al. rapporteerden over metabolome biomerkers voor het verstoorde aminozuren-, energie-, suiker- en vetzuren-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [zie hierboven] Geen van deze research-groepen onderzocht de impact van IBS op metaboloom-profien bij M.E./CVS. Onze analyse bevestigde de gedaalde waarden van fosfolipiden en SM, en de gestegen waarden van TG, maar verschilde met betrekking tot specifieke molekulen. We vonden bij de gevallen geen verschillen qua PC 18:1 & PC 22:6. We vonden ook geen consistente afname qua ceramide-waarden. Terwijl M.E./CVS zonder IBS verminderde waarden van de ceramiden d43:1 & d42:1 vertoonden, bleken bij M.E./CVS met IBS verhoogde waarden van 6 ceramiden: d36:1, d40:0, d42:0, d 34:1, d38:1 & d40:1.

Ceramide is een was-achtig lipide dat betrokken is bij de suppressie van elektronen-transport, insuline- & leptine-resistentie, en apoptose. Eerdere studies meldden dat ceramiden betrokken zouden kunnen zijn bij de pathologie van IBS en metabole aandoeningen. Verhoogde waarden van lipopolysacchariden (LPS) geassocieerd met een gewijzigd darm-microbioom [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30] kunnen de aktivatie van sfingomyelinase (SMAse [enzyme]) en de hydrolyse [splitsing] van SM triggeren om ceramide te produceren. Ceramiden zijn toxisch voor veel cel-subtypes via de aanmaak van reaktieve zuurstof-soorten en zou een rol kunnen spelen bij darm-barrière-dysfunktie en verhoogde darm-permeabiliteit. Er werden gestegen waarden van ceramide gerapporteerd in mucosa [(darm)slijmvlies] -stalen van IBS-patiënten alsook in plasma- en weefsel-stalen bij diabetes, cardiomyopathie, insuline-resistentie, atherosclerose [‘aderverkalking’] en steatohepatitis [‘vette lever’; veroorzaakt levercirrose]. Het blokkeren van SMAse om ceramide-waarden te doen dalen kan therapeutisch zijn door inflammatie te reduceren. Patiënten met M.E./CVS en IBS hadden ook hogere plasma mannitol-concentraties. We speculeren dat mannitol de permeabiliteit kan verhogen van de darm-mucosa en de bloed-hersen-barrière resulterend in het doorlaten van molekulen zoals cytokinen en neurotransmitters, wat bijdraagt tot de ziekte.

Net als Armstrong en z’n collega’s, vinden we wijzigingen qua metabolieten geassocieerd met het mitochondriaal energie-metabolisme. Een eerdere studie meldde significante dalingen van TCA-cyclus metabolieten gerelateerd met het energie-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [Yamano E et al.] De gerapporteerde dysfunktie had een impact op het carnitine-metabolisme en ATP/energie-metabolisme in de spieren van M.E./CVS-patiënten. [Armstrong CW et al. (2015)] Carnitine is een belangrijk supplement dat acyl-CoA transfereert naar de mitochondriale matrix en deelneemt aan vetzuur β-oxidatie (TCA-cyclus, ATP-produktie en energie-metabolisme). Studies omtrent carnitine-waarden in het serum en plasma bij M.E./CVS bleken niet overtuigend: sommige teams meldden reducties terwijl andere normale waarden vonden. In een open-label studie met 30 patiënten, bleken acetyl-carnitine supplementen de vermoeidheid en cognitieve funktie verbeteren bij 59% van de M.E./CVS-patiënten. [Vermeulen RC & Scholte HR. Exploratory open label, randomized study of acetyl- and propionylcarnitine in Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom Med (2004) 66: 276-282; zie ook ‘Lange-keten acylcarnitine deficiëntie bij CVS] In onze studie waren molekulen van het choline-carnitine mechanisme gedaald bij M.E./CVS-patiënten ongeacht hun IBS-status.

Onze resultaten zijn consistent met vroegere rapporten die suggereren dat metabolieten gelinkt met het lipiden- en energie-metabolisme aangetast zijn bij M.E./CVS. Ze breiden vroeger werk uit door aan te tonen dat M.E./CVS-individuen met IBS co-morbiditeit een duidelijk verschillend metaboloom-profiel hebben t.o.v. M.E./CVS-individuen zonder IBS en controles.

Veel M.E./CVS-patiënten in onze groep namen vitamine-B supplementen (26/50, 52%) die het potentieel hebben de waarden van pantotheenzuur te doen stijgen. Het gebruik van vitamine-B supplementen was geassocieerd met hogere waarden van pantotheenzuur en lagere vermoeidheid-scores (gegevens niet getoond). Het aantal stalen was echter onvoldoende groot om een significant verband te testen. Plasma-waarden van 5-MT, een molekule gerelateerd met het tryptofaan-, serotonine- en melatonine-metabolisme, waren gedaald bij M.E./CVS; deze bevinding werd echter verstoord door het gebruik van selektieve serotonine heropname inhibitoren (SSRIs) of andere antidepressiva (serotonine-norepinefrine heropname inhibitoren en tricyclische antidepressiva) bij 25 van de 50 (50%) M.E./CVS-individuen vs. 6 of 50 (12%) gezonde controles. Voorafgaande metaboloom-studies hebben gereduceerde waarden van 5-MT in het plasma aangetoond bij chronische, maar niet acute, SSRI-toediening. In menselijke cellen is 5-MT een belangrijk metaboliet dat betrokken is bij de omzetting van serotonine (5-hydroxytryptamine) en melatonine (N-acetyl-5-methoxytryptamine). Er werden eerder al gedaalde waarden van serotonine-transporters, die een rol spelen bij het reguleren van serotonine-waarden in de synapsen, gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamamoto S. et al. Reduction of serotonin-transporters of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neuroreport (2004) 15: 2571-2574]

Correlatie-studies suggereerden mogelijke verbanden tussen 5-MT neurotransmitter metabolieten en de ernst van M.E./CVS, inclusief verstoorde cognitieve funktie, slaap-stoornissen en globaal verhoogde vermoeidheid-scores bij M.E./CVS. Bijkomende studies met grotere aantallen individuen zullen nodig zijn om te bekijken of plasma-waarden van pantotheenzuur of 5-MT gecorreleerd kunnen worden met symptomen en om te bepalen of er een subgroep M.E./CVS-patiënten is waarvan kan worden voorspeld dat ze voordeel haalt uit medicijnen die de geassocieerde mechanismen moduleren.

In onze studie waren 41 van de 50 M.E./CVS-individuen (82%) vrouwen, net zoals 41 op 50 (82%) controle-individuen. Gezien het feit dat de overgrote meerderheid patiënten en controles vrouwen waren, is het niet verrassend dat de bevindingen bij vrouwen met M.E./CVS gelijkaardig waren met de bevindingen in de globale M.E./CVS-groep. Beide hadden lage waarden complexe lipiden (LPC & PC) en hogere waarden TG dan controles. De studie-groep omvatte slechts 9 M.E./CVS mannen en 9 mannelijke controles; dus is er onvoldoende ‘power’ om ev. verschillen tussen vrouwen en mannen te bekijken. Dit verschil qua prevalentie per geslacht is kenmerkend voor M.E./CVS (typisch 4:1 vrouwen:mannen).

Ons voorspellend model onderscheidt M.E./CVS-patiënten van controles met hoge accuraatheid; maar dit dient echter te worden geverifieerd via een onafhankelijke studie.

M.E./CVS is een heterogene aandoening. Identificatie van M.E./CVS-subgroepen die worden gekarakteriseerd d.m.v. specifieke metaboloom-profielen die primaire metabolieten, biogene aminen, complexe lipidomica [studie van mechanismen en netwerken van cellulaire lipiden in biologische systemen] en oxylipinen integreren, zouden de aflijning van subtypes moeten mogelijk maken en leiden tot specifieke diagnostische en therapeutische strategieën.

mei 5, 2018

Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen

Filed under: Behandeling,Celbiologie — mewetenschap @ 7:52 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel betreffende AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) – niet te verwarren met ‘mitogen-activated protein kinase’ (MAPK) – is een vervolg op ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’. AMPK is een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt; een nutriënten- en energie-sensor die zorgt voor energie-homeostase. Het is ook betrokken bij de ‘cell danger response’, beschreven door Robert Naviaux: “AMPK optimaliseert de energie-efficiëntie en stimuleert de recyclage van cellulaire materialen bij autofagie (opruimen van beschadigde mitochondrieën). De mechanismen die geaktiveerd worden door AMPK ondersteunen regeneratie en zijn anti-inflammatoir omdat ze beschadigde proteïnen, lipiden, glycanen, RNA en DNA afbreken. AMPK faciliteert de her-synthese van deze macromolekulen via nieuw gesynthetiseerde monomeren en ververste bouwstenen.”.

Ook op te merken (zie ons stuk ‘Potentiële speeksel-biomerkers bij M.E.(cvs)’):“Er werd een een downregulering van ZAG (zink alfa-2-glycoproteïne; een belangrijke regulator van het energie-metabolisme in skelet-spieren) gevonden bij CVS. Dit adipokine (cytokine afgegeven door vet-weefsel) speelt een rol bij aktivatie AMPK, een belangrijke regulator van energie-metabolisme in cellen van menselijke skelet-spieren.”…

In een kort overzicht getiteld ‘Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis’ (Biochemical Society Transactions; 2018) Laat Prof. Julia Newton optekenen: “Studies die veranderingen qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS tonen, dienen omzichtig te worden geïnterpreteerd aangezien de mitochondriale veranderingen te wijten kunnen zijn aan de ontregeling van verdergelegen signalisering-mechanismen, zoals het AMPK-mechanisme, eerder dan een defekt in de mitochondrieën zelf.”

AMPK-aktivatie door metformine bleek al de respons op oxidatieve stress en het mitochondriaal metabolisme te verbeteren in fibromyalgie-fibroblasten (‘Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients’; Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease (2015) 1852: 1257-1267)…

————————-

Bioscience Reports (Pre-print April 2018)

Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with M.E./CVS

Audrey E Brown, Beth Dibnah, Emily Fisher, Julia L Newton, Mark Walker

Institute of cellular medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Achtergrond Vermoeide skeletspieren en post-exertionele malaise zijn sleutel-symptomen van Myalgische Encefalomyelitis (M.E./CVS). We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord zijn in celculturen van menselijke skeletspieren afkomstig van patiënten M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie, een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro. Het doel van deze studie was vaststellen of AMPK farmacologisch kan worden geaktiveerd bij M.E./CVS.

Methodes

Primaire skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden behandeld met metformine of ‘compound 991’. De AMPK-aktivatie werd beoordeeld via western-blot en de glucose-opname werd gemeten.

Resultaten Zowel metformine als ‘compound 991’ behandeling verhoogde de AMPK-aktivatie en glucose-opname in culturen van spiercellen significant bij controles en M.E./CVS. De cellulaire ATP-inhoud bleef onveranderd door de behandeling hoewel deze significant verminderd was bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Besluiten Farmacologische aktivatie van AMPK kan de glucose-opname in spiercel-culturen van patiënten met M.E./CVS verbeteren. Dit suggereert dat het feit dat elektrische puls stimulatie AMPK in dergelijke spiercel-culturen niet kon aktiveren, te wijten is aan een defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defect af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij M.E./CVS-patiënten verbetert.

Inleiding

[…]

AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) is een belangrijke mediator van de skeletspier-respons op inspanning. In respons op een energie-tekort, zoals tijdens spier-contractie, wordt AMPK geaktiveerd, resulterend in het uitschakelen van ATP-verbruikende processen en het opstarten van ATP-genererende processen. In skeletspieren omvat dit een verhoging van de opname van glucose in de spiercellen. We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie verstoord is in celculturen van skeletspieren afkomstig van patiënten met M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie (EPS), een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Deze abnormale AMPK-aktivatie resulteerde ook in een onvermogen op glucose-opname in de cellen in respons op EPS te verhogen.

AMPK is een heterotrimeer [samengesteld uit 3 verschillende onderdelen] complex van α, β & γ subunits. Er bestaan meerdere isoformen voor elke subunit en sommige isoformen komen tot expressie in een celtype- of weefsel-specifieke manier. AMPK kan allosterisch [verandering (dikwijls door wijziging van de 3-dimensionele vorm) van de aktiviteit van een proteïne/enzyme door de binding van een effector-molekule op een specifieke plaats] worden geaktiveerd, vooral door AMP, of via aktivatie van kinasen [groep enzymen die een fosfaat-groep aanbrengen op een proteïne of andere molekule (fosforylatie)] inclusief lever kinase-B1 (LKB1) en het Ca2+/calmoduline-afhankelijk kinase kinase (CaMKK). AMPK kan ook worden gereguleerd door farmacologische middelen zoals metformine, dat AMPK indirect aktiveert via de inhibitie van de ATP-synthese. Er werd een aantal kleine aktiverende molekulen ontwikkeld die direct op AMPK binden, resulterend in allosterische aktivatie van AMPK.

Het doel van deze studie was om te onderzoeken of AMPK gemodifieerd kan worden door farmacologische behandeling van culturen van menselijke skeletspier-cellen afkomstig van patiënten met M.E./CVS. We gebruikten een indirecte aktivator van AMPK (metformine [medicijn ter behandeling van diabetes type-2]) en een directe aktivator (‘compound 991’ [kleine organische molekule die bindt op AMPK; ontwikkeld door Merck – patent WO2010036613) om AMPK-aktivatie, glucose-opname en ATP-content van spiercellen na te gaan.

Studie-ontwerp en methodes

Studie-individuen

Er werden spier-biopten verkregen van 10 patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom en 7 gezonde controle-individuen. De groepen warden gematcht voor leeftijd, en omvatten vrouwen en mannen. […] Alle patiënten voldeden aan de Fukuda criteria […]. Niemand vertoonde een neurologisch gebrek op basis van de klinische beoordeling. […]

Reagentia

[…]

Celculturen

[…] Alle experimenten warden uitgevoerd op gedifferentieerde myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] […].

Western-blotting

[…]

ATP-bepaling

[…]

Glucose-opname

[…]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op AMPK-aktivatie

Skeletspier-cellen van 7 gezonde controles en 8 CVS-individuen werden opgekweekt gedurende 7 dagen om te differentiëren. De cellen werden behandeld met 2 mM metformine gedurende 16 h of 1 μM ‘compound 991’ gedurende 2 uur vóór proteïne-extractie en ‘western blotting’. Metformine-behandeling verhoogde significant de AMPK-aktivatie […] bij controle- (p < 0.01) en CVS- (p < 0.05) myotubes (t.o.v. onbehandeld). De behandeling met ‘compound 991’ had een gelijkaardig effect: significante toename van de AMPK-aktivatie t.o.v. onbehandelde myotubes bij controles en CVS (p < 0.05). De fosforylatie van acetyl-CoA carboxylase [enzyme; AMPK is de voornaamste kinase-regulator van ACC] verhoogde op een dosis-afhankelijke manier in respons op ‘compound 991’.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op glucose-opname

Er kan worden verwacht dat de aktivatie van AMPK leidt tot een toename qua glucose-opname. Metformine-behandeling verhoogde significant de glucose-opname bij controle- en CVS-cellen, en het effekt was vergelijkbaar met dat van insuline. Bij de controles verhoogde metformine de glucose-opname van 632,8 ± 50,4 pmol/mg/min tot 1.014 ± 79,2 pmol/mg/min (p < 0.0005), terwijl bij CVS de glucose-opname steeg van 576,4 ± 26,5 pmol/mg/min tot 715 ± 21,2 pmol/mg/min (p < 0.0005). Behandeling met ‘compound 991’ verhoogde ook de glucose-opname bij concentraties van 0,1 μM & 1 μM bij zowel controle- als CVS-cellen. Bij de controles steeg de glucose-opname van 802,2 ± 59,4 pmol/mg/min tot 963,9 ± 37,9 pmol/mg/min en 1.084,3 ± 44,9 pmol/mg/min (p < 0.05) voor 0.1 μM & 1 μM 991, respectievelijk. ‘Compound 991’ verhoogde de glucose-opname van 633,8 ± 56,8 pmol/mg/min tot 933,7 ± 93,3 pmol/mg/min (p < 0.01) en 913,9 ± 105,7 pmol/mg/min (p < 0.01) voor 0,1 μM & 1 μM, respectievelijk. Voor zowel controle- als CVS-cellen was het effekt van de behandeling met ‘compound 991’ vergelijkbaar met dat van insuline.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op cellulaire ATP-inhoud

Behandeling met metformine of ‘compound 991’ verlaagde de cellulaire ATP-inhoud niet. De ATP-inhoud is echter significant gedaald in spiercel-culturen van CVS-patiënten in vergelijking met controles (p < 0.05), ongeacht de behandeling.

Bespreking

Deze studie toont aan dat AMPK en daaropvolgende ‘downstream’ effekten kunnen worden geaktiveerd door zowel een indirecte (metformine) als directe (‘compound 991’) aktivator van AMPK in skeletspier-cellen van patiënten met M.E./CVS. Dit in tegenstelling met onze eerdere studie van dezelfde spiercel-culturen die toonde dat EPS-gemedieerde contractie niet in staat was AMPK en glucose-opname te aktiveren in skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten. Deze bevindingen duiden op een signalisering-defekt in de nabijheid van AMPK en er zijn verdere studies aan de gang om de expressie en werking van de belangrijkste proximale signalisering-molekulen te verkennen in M.E./CVS-culturen. Dit is het eerste rapport dat aantoont dat ‘compound 991’ actief is bij menselijke skeletspiercel-culturen. Er werd eerder aangetoond dat ‘compound 991’ de AMPK-aktiviteit en glucose-opname verhoogt in geïsoleerde skeletspieren van ratten. Deze effekten worden te niet gedaan in AMPKα1-/α2 myotubes van ‘knockout’ muizen, wat suggereert dat ‘compound 991’ specifiek werkt via AMPK. Verder bewijsmateriaal voor de specificiteit van ‘compound 991’ van AMPK wordt aangegeven door een screening van ‘compound 991’ tegen een panel proteïne-kinasen in cel-vrije testen. Dit toonde dat ‘compound 991’ AMPK-aktiviteit versterkt terwijl het geen effekt heeft op ‘upstream’ kinasen inclusief LKB1 & CaMKK.

Bewijsmateriaal geeft aan dat AMPK-aktivatie de glucose-opname verhoogt via aktivatie van AS160 [proteïne dat fosforylatie-afhankelijke glucose-opname in spiercellen medieert] en glucose-transporter translocatie naar het cel-membraan. Als onderdeel van ons lopend werk, onderzochten we hoe het zit met de AMPK-gemedieerde glucose-opname (met bijzondere focus op glucose-oxidatie en glycolyse) in de M.E./CVS-culturen. De regulering van AMPK is complex. Naast allosterische aktivatie door de binding van AMP, kan AMPK geaktiveerd worden door upstream kinasen zoals LKB1 & CaMKK. Een verstoorde inspanning-gestimuleerde glucose-opname in spier-specifieke LKB1 ‘knockout’ [gen coderend voor lever kinase-B1 ontbreekt] muizen suggereert dat LKB1 het voornaamste kinase zou kunnen zijn dat betrokken is bij regulering van AMPK bij contractie van skeletspieren. Het verband tussen AMPK en inspanning-tolerantie werd ook aangetoond bij AMPK-‘knockout’ muizen. Een skeletspier-specifiek AMPK-‘knockout’ model toonde een verminderde inspanning-capaciteit (‘voluntary wheel running’ [aktiviteit-meting bij proefdieren, waarbij ze vrij in een rad lopen] en ‘treadmill running to exhaustion’ [inspanning op een loopband tot uitputting]). Verstoorde spier-funktie werd aangegeven door een gedaalde maximale kracht en resistentie tegen vermoeidheid ex vivo [experiment met levend weefsel, buiten het lichaam]. Het is ook duidelijk dat spier-funktie sterk afhankelijk is van de metabole funktie, bijzonderlijk glucose-opname, zoals getoond in GLUT4-‘knockout’ [gen coderend voor glucose-transporter type-4 ontbreekt] muizen. Deze modellen tonen dat wanneer de glucose-opname verstoord is, de gevoeligheid voor vermoeidheid na inspanning versterkt is. Onderzoekers toonden ook dat de maximale kracht-ontwikkeling en het samentrekking-vermogen gedaald waren in deze muizen-modellen. Zoals werd gezien voor onze M.E./CVS skeletspiercel-culturen, in respons op contractie geïnduceerd door EPS, zijn zowel AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord is. We zouden voorspellen dat het ontbreken van een effekt op glucose-opname door EPS de samentrekking van spieren zou kunnen verstoren, leidend tot inspanning-intolerantie. De huidige studie suggereert dat dit onvermogen om AMPK te aktiveren in respons op contractie zou kunnen worden omzeild d.m.v. een farmacologische interventie, en bijdraagt aan het bewijs voor een klinische test aangaande een AMPK-aktivator in M.E./CVS.

Een andere belangrijke bevinding van deze studie is de significante daling qua cellulaire ATP-inhoud in skeletspieren bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Deze afname trad op ongeacht de behandeling en werd op 2 afzonderlijke momenten gemeten. Een gereduceede ATP-inhoud werd eerder al gezien bij M.E./CVS-patiënten na inspanning [Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-1722] en verstoorde ATP-synthese werd ook al vastgesteld bij patiënten in vivo [Vermeulen RC, Kurk RM, Visser FC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93]. De ATP-inhoud beïnvloedt cel-overleving: een met leeftijd gerelateerde afname van de ATP-hoeveelheid in gecultiveerde fibroblasten is gelinkt met een verhoogde gevoeligheid voor cel-dood door necrose. Een andere studie rapporteerde echter verhoogde ATP-waarden in perifeer bloed mononucleaire cellen van patiënten met M.E./CVS [Lawson N et al. Elevated Energy Production in Chronic Fatigue Syndrome Patients. J Nat Sci (2016) 2]. Deze auteurs suggereerden dat vermoeidheid gelinkt zou kunnen zijn met niet-mitochondriale processen die ATP produceren, zoals glycolyse.

Potentiële oorzaken van een reductie qua cellulaire ATP-inhoud omvatten stoornissen van de mitochondriale funktie, een afname van het mitochondriaal membraan potentiaal, of verhoogde produktie van reaktieve zuurstof/stikstof soorten (ROS/RNS). Bewijsmateriaal voor een daling van de mitochondriale funktie in skeletspieren bij M.E./CVS is tegenstrijdig. Sommige studies vonden een verminderde mitochondriale inhoud, maar geen mitochondriale dysfunktie in skeletspier-biopten van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738], terwijl anderen metabole abnormaliteiten (consistent met verstoorde mitochondriale werking) identificeerden bij M.E./CVS [Naviaux RK, Naviaux JC et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: E5472-5480]. ROS kunnen een belangrijke rol spelen bij het vermogen van skeletspieren om zich aan te passen bij inspanning maar evenzeer kunnen toegenomen ROS de mitochondriale funktie verstoren, de samentrekkingskracht van spieren reduceren en bijdragen tot spier-dysfunktie. Er is enig bewijsmateriaal dat suggereert dat oxidatieve stress mechanismen geaktiveerd zijn in vivo bij M.E./CVS [Kennedy G, Spence VA, McLaren M et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39: 584-589] maar, naar ons weten, werd dit niet onderzocht in vitro. Toekomstig werk zal zich moeten focussen op het onderzoeken van de mechanismen die er voor zorgen dat contractie AMPK niet kan aktiveren en op de mitochondriale funktie in skeletspieren.

De belangrijk bevindingen van deze studie zijn dat, ten eerste, farmacologische aktivatie van AMPK de glucose-opname in skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten kan verbeteren en, ten tweede, cellulaire ATP-inhoud significant verminderd is in M.E./CVS spiercel-culturen. De vaststelling dat AMPK op een directe manier werd geaktiveerd door metformine en ‘compound 991’ maar niet via EPS in M.E./CVS culturen duidt op een signalisering-defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defekt af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij patiënten met M.E./CVS verbetert.

april 21, 2018

NIR-spectroscopie screening ter detektie van pathogene mitochondriale DNA-varianten bij ‘onverklaarde vermoeidheid’

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , , , ,

Op onze pagina’s hadden we het al over M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte. We gaven er daaromtrent de mening van M.E.(cvs)-specialisten weer. Een Italiaans onderzoeksteam schreef dienaangaande ook: “Een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong zou de daling in funktionele mogelijkheden van de spier kunnen verklaren, zowel als een vermindering in kracht maar, vooral, een vermindering in weerstand.” (‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’). Oproepen tot verder onderzoek bleven niet uit; zie ‘Rol van mitochondriale dysfunkties bij pijn (CVS & FM)’ & ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’. Er werd ook gewag gemaakt van “extreem zware of uitputtende inspanning die mitochondriale stoornissen bevordert, die de werking ervan permanent kunnen beschadigen” (zie ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’)…

Onderstaande publicatie over onderzoek uitgevoerd door researchers en artsen verbonden aan de Universiteit Gent zou een respons op de vraag naar meer onderzoek kunnen vertegenwoordigen maar jammer genoeg toont het de ongemakkelijke spreidstand aan tussen verschillende ‘stromingen’ betreffende onverklaarde vermoeidheid. Sommigen (bv. Prof. Van Coster) gaan hier voor de hypothese dat M.E.(cvs) elementen van een mitochondriale myopathie heeft, terwijl de adepten van de biopsychosociale school (bv. psychiater dr Mariman) alle langdurige vermoeiden op één hoop gooit, brede definities hanteren en een mengelmoes van patiënten (waarvan misschien slechts enkelen die M.E.(cvs) hebben) in één studie opnemen. Dat deze zoektocht slechts bij 1/3 aanwijzingen voor een eventuele mitochondriale myopathie oplevert, lijkt ons dan ook maar evident. Men zal argumenteren dat dit een piloot-studie betreft met maar een klein aantal patiënten maar ons lijkt dit een quasi amateuristische aanpak die van bij aanvang gedoemd is te mislukken en/of dergelijke halfslachtige resultaten op te leveren. Verder blijft de noodzakelijkheid van (invasieve) biopten een bijkomend obstakel. Ook hierbij is het amateurisme niet ver weg, te meer daar we vernemen dat spierbiopt-materiaal van sommige deelnemers gewoon is ‘verdwenen’…

De waarde van de nieuwe methodiek kan o.i. enkel worden nagegaan bij patiënten die beoordelen aan de geschikte criteria voor M.E.(cvs).

————————-

Appl Spectrosc. (2018) [pre-print]

Near-Infrared Spectroscopy Screening to Allow Detection of Pathogenic Mitochondrial DNA Variants in Individuals with Unexplained Abnormal Fatigue: A Preliminary Study

Celie BM1, Mariman A2,3, Boone J1,4, Delesie L2, Tobback E2,3, Seneca S5, De Paepe B6, Vogelaers D2,3, Van Coster RN6, Bourgois JG1,4

1 Department of Movement and Sports Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium

2 Department of General Internal Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

3 Centre for Neurophysiologic Monitoring, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

4 Centre of Sports Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

5 Centre for Medical Genetics, University Hospital Brussels, Neurogenetics Research Group, Reproduction Genetics and Regenerative Medicine Research Group, Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium.

6 Department of Pediatrics, Division of Pediatric Neurology and Metabolism, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

Samenvatting

Onverklaarde abnormale vermoeidheid wordt gekenmerkt door chronische vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand en onvoldoende wordt verklaard door enige erkende medische aandoening. In deze piloot-studie, werden 12 individuen met abnormale vermoeidheid die onverklaard bleef na een grondige screening, onderzocht m.b.v. een ‘near-infrared’ [elektromagnetische straling net buiten het zichtbaar licht; golflengte > 780 nm] (NIR) spectroscopie handgreep-test. Daarvan bleken er 4 een abnormaal zuurstof-extractie patroon te vertonen dat lijkt op dat van individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [MM]. Bij 3 van deze 4 individuen werden diverse mitochondriale abnormaliteiten gedocumenteerd via spectrofotometrische, immunocytologische, fluorescente en morfologische analyses uitgevoerd op skeletspier[biopten] en gecultiveerde huid-fibroblasten. Bij 3 van de 4 mensen met verminderde musculaire zuurstof-extractie werd een verschillende homoplasmatische pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie (m.961T > C, m.1555A > G, m.14484T > C) getoond. [homoplasmie = enkel identieke mtDNA-kopieën aanwezig; alle cellen hetzelfde mitochondriaal genoom] Bij de vierde werd de aanwezigheid van meerdere grote mitochondriaal-DNA deleties [ontbrekende fragmenten] in spierweefsel vermoed. In tegenstelling daarmee hadden geen enkele van de 8 abnormaal vermoeide individuen met normale NIR-spectroscopie resultaten een pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie of grote deleties (P < 0.001). Deze piloot-studie geeft aan dat NIR-spectroscopie kan dienen als een niet-invasief screening-instrument om een subgroep (patiënten) met mitochondriale dysfunktie af te bakenen bij de grote groep individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid.

Inleiding

Onverklaarde abnormale vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand vormt een significant probleem dat leidt tot ernstige dalingen qua beroeps- en sociale aktiviteiten. De diagnostische benadering van onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist een zorgvuldige uitsluiting van andere verklarende aandoeningen, zoals psychiatrische, farmacologische, endocriene, neoplastische, hematologische, infektueuze, metabole (inclusief mitochondriale), cardiopulmonaire, bindweefsel ziekten en slaap-stoornissen. Meerdere van deze aandoeningen kunnen makkelijk worden uitgesloten door gebruik te maken van de gepaste klinische onderzoeken. Sommige vormen onverklaarde abnormale vermoeidheid worden als idiopathisch [zonder bekende oorzaak] beschouwd, t.t.z. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie, en de diagnose hangt af van de exclusie van andere ziekten en het voldoen aan diagnostische criteria (bv. de Fukuda criteria).

De uitsluiting van een mitochondriaal defekt als de onderliggende oorzaak voor vermoeidheid ligt niet altijd voor de hand. Bij jongere individuen zijn de klinische en biochemische abnormaliteiten overduidelijk. Uiteindelijk wordt de diagnose weerhouden na de geschikte biochemische, radiologische en genetische testen. In sommige gevallen, bijzonderlijk bij volwassenen, kunnen de klinische symptomen van mitochondriale defekten subtieler zijn. Sommige individuen met mitochondriale defekten vertonen zelfs geen tekenen van een myopathie of andere orgaan-betrokkenheid vooraleer ze ouder zijn geworden of symptomatisch worden na het innemen van medicatie die toxisch is voor de mitochondriale werking (natrium-valproaat [anti-epilepticum], aminoglycosiden [antibiotica], linezolid [antibioticum]). Hoewel inspanning-intolerantie, spierpijn en spierzwakte sleutel-symptomen zijn voor de erkende entiteit mitochondriale myopathie, kan onverklaarde abnormale vermoeidheid het enige of overwegende symptoom zijn bij een persoon met een mitochondriaal defekt. Bovendien kan het klinisch beeld CVS nabootsen. In een studie […] rapporteerden 62% van patiënten met gedocumenteerde mitochondriale ziekte overmatige symptomatische vermoeidheid (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 40), terwijl 32% ernstige, funktioneel beperkende vermoeidheid-symptomen meldden (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 80), vergelijkbaar met de vermoeidheid die wordt ervaren door patiënten met Myalgische Encefalopathie/CVS. Volgens de auteurs is subjectieve vermoeidheid een prominent symptoom bij individuen met mitochondriale ziekte maar de prevalentie, impact en etiologie ervan wordt nog niet goed begrepen.

In een eerdere studie toonden we dat ondubbelzinnig onderscheid gemaakt kan worden tussen gezonde controles en individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [Celie B, Boone J, Smet J et al. Forearm Deoxyhemoglobin and Deoxymyoglobin (Deoxy[Hb+Mb]) Measured by Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Using a Handgrip Test in Mitochondrial Myopathy. Appl. Spectrosc. (2015) 69: 342-347] d.m.v. NIR-spectroscopie in voorarm-spieren tijdens een ‘incremental cyclic contractions protocol’ [cyclus van spier-samentrekkingen met oplopende intensiteit] (ICCP) [Celie B, Boone J, Van Coster R, Bourgois J. Reliability of Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for Measuring Forearm Oxygenation During Incremental Handgrip Exercise’’. Eur. J. Appl. Physiol. (2012) 112: 2369-2374]. Het doel van de huidige studie was om NIR-spectroscopie te gebruiken als een niet-invasief screening-instrument voor mitochondriale dysfunktie bij individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid zonder co-morbiditeit en geselekteerd na multidisciplinaire beoordeling [Vraag is: hoe onbevooroordeeld dit gebeurde wetende dat de artsen van het Gentse ‘CVS referentiecentrum’ de biopsychosociale school’ aanhangen…]. De deelnemers waarbij abnormale NIR-spectroscopie resultaten werden gevonden werden verder onderzocht d.m.v. spier- en huid-biopten [niet allemaal, zie ook onze inleiding] alsook bloed-onderzoeken om morfologische, biochemische of genetische abnormaliteiten in hun mitochondrieën en mitochondriaal DNA (mtDNA) te documenteren. Er werd ook bloed afgenomen van individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid en normale NIR-spectroscopie resultaten.

Methodes

Deelnemers

Er werden 2 groepen individuen vergeleken. Een eerste bestond uit 12 patiënten met de diagnose ‘ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid, zonder co-morbiditeit’ [niet noodzakelijk ME.(cvs)]. De tweede bestond uit 12 voor leeftijd en geslacht gematchte ongetrainde gezonde controles. De patiënten met ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ werden gerecruteerd via de Afdeling Algemene Interne Geneeskunde van het Universitair Ziekenhuis van Gent, België. […] De leeftijd, lengte en gewicht van de patiënten (11 vrouwen, 1 man) waren 45 ± 8 jaar, 165 ± 6 cm & 71 ± 17 kg (gemiddelde ± standaard-deviatie). De controles (11 vrouwen, 1 man) waren gematcht voor leeftijd en geslacht. Hun leeftijd, lengte en gewicht waren 46 ± 8 jaar, 168 ± 7 cm & 70 ± 15 kg.

Diagnostisch beslissingmaking-proces voor Onverklaarde Abnormale Vermoeidheid

Voor de beoordeling van tot dusver onverklaarde en langdurige abnormale vermoeidheid, volgden we een holistische benadering gebaseerd op het biopsychosociaal model van Wessely et al. [!!!] Het geïntegreerd diagnostisch pad omvatte een internistische beoordeling, psycho-diagnostische screening, revalidatie-beoordeling en polysomnografie gecombineerd met een multipele slaap-latentie-test [EEG-registraties met een tussentijd van ongeveer 2 uur om het slaap-patroon overdag te onderzoeken]. De internistische beoordeling bestond uit een uitgebreide anamnese, met oog voor eerdere medische diagnoses of onderzoeken, en een lichamelijk onderzoek met bijkomende onderzoeken indien daar indicatie voor was. Een revalidatie-arts evalueerde de aanwezigheid van musculoskeletale co-morbiditeit waarvoor fysiotherapie voor bestaat. De psycho-diagnostische werd uitgevoerd door een klinisch psycholoog en omvatte anamnese, gevalideerde vragenlijsten en psychologische testen. Er had een psychiatrisch consult plaats wanneer de voorgeschiedenis suggestief was voor eerdere of huidige psychiatrische problemen, en wanneer er hints voor de aanwezigheid van een psychiatrische aandoening opdoken uit de psycho-diagnostische evaluatie of de multidisciplinaire bespreking. De uitkomst van deze multidisciplinaire bespreking was een diagnostische klassificatie in: (1) ‘ondubbelzinnige onverklaarde abnormale vermoeidheid’, (2) onverklaarde abnormale vermoeidheid met co-morbiditeit of (3) een aandoening die onverklaarde abnormale vermoeidheid uitsluit. Bij ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid waren naast elkaar bestaande slaap- of psychiatrische aandoeningen uitgesloten. Zodoende werd het diagnostisch proces niet beperkt tot enkel tekenen en symptomen. Zonder de discussie te willen aangaan omtrent de controversiële syndroom-definities, hebben we geopteerd voor het gebruik van de benaming ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ om deze patiënten te beschrijven. [M.a.w. dit artikel handelt niet over M.E.(cvs) per se.]

‘Incremental Cyclic Contraction Protocol’ (ICCP)

Het ICCP bestond uit ritmische handgreep-samentrekkingen met oplopende intensiteit […]. Deze test werd uitgevoerd in ruglig m.b.v. een handgreep-dynamometer. Na bepaling van de maximale vrijwillige contractie kracht (MVC) […] werd de NIR-spectroscopie sonde op de M. flexor carpi ulnaris [spier die het polsgewricht laat buigen] & de M. flexor digitorum superficialis [onderarm-spier die zorgt voor buiging van alle vingers behalve de duim] geplaatst om de microvasculaire zuurstof-extractie te bepalen. Dit protocol startte met het afsluiten van de voorarm-arterie door het opblazen van een manchet tot 260 mmHg (onbepaalde duur, tot een evenwicht-toestand in deoxy[Hb+Mb] [deoxy-haemoglobine/ -myoglobine = haemoglobine/myoglobine dat niet gecombineerd is met zuurstof; het verschil qua weefsel absorptievermogen tussen de 2 geeft de balans tussen de aan- en afvoer van zuurstof in kleine bloedvaten] werd bereikt). De taak bestond uit periodes van 2 min waar oplopende samentrekkingen werden uitgevoerd (1 sec contractie, 1 sec relaxatie), met verschillende intensitieiten van de vrijwillige contractie kracht (% MVC). De samentrekking-periodes werden onderbroken door 60 sec rust. De arbeid-intensiteit begon aan 20% MVC en verhoogde per stap met 10% MVC. Het ICCP werd uitgevoerd tot er uitputting optrad. […] Het onderscheid tussen normale en abnormale NIR-spectroscopie responsen was overwegend gebaseerd op de resultaten van eerdere research; waarbij gezonde controles in staat bleken tot een funktionele toename van hun microvasculaire O2-extractie tot 72,8 % van hun maximale ‘gedwongen’ O2-extractie (tijdens arteriële occlusie [afsluiting]), terwijl MM-patiënten een gemiddelde maximale O2-extraction van 26 % bereikten. MM-patiënten vertoonden een homogene respons op deze handgreep-inspanning met een zeer klein deoxy[Hb+Mb] bereik van 17,2-34,4% van de gedwongen maximale O2-extractie. Eerder hebben we een goede test-hertest betrouwbaarheid van deze NIR-spectroscopische metingen bij gezonde controles getoond […]. Er werd enkel een hertest bij de patiënten uitgevoerd om de resultaten van de eerste test te bevestigen.

Metingen en analyse van de gegevens

NIR-spectroscopie. De skelet-spier weefsel-oxygenatie werd non-invasief gemeten d.m.v. een systeem gebaseerd op absorptie van infrarood (IR) licht, waarbij IR licht van verschillende golflengten wordt uitgezonden. De veranderingen in deoxyhaemoglobine en deoxymyoglobine (deoxy[Hb+Mb]) tijdens het ICCP (t.t.z. het gemiddelde van de hoogste 10 sec) werden uitgedrukt in verhouding met de arteriële occlusie, om mogelijke invloeden van de dikte van het vetweefsel in de voorarm en eventuele deconditionering-effekten te verminderen.

Analyses van skeletspier[biopt]en en huid-fibroblasten

Biopten. 4 individuen met abnormale deoxy[Hb+Mb] waarden (in %) tijdens het ICCP werden uitgenodigd om weefsel-biopten ondergaan om mitochondriale abnormaliteiten te documenteren. 3 daarvan (S1, S2 & S3) gaven toestemming voor skeletspier- (quadriceps) en huid-biopten. […] De spier-biopten werden verwerkt voor licht- en elektronen-microscopie & spectrofotometrische analyse, terwijl de huid-biopten dienden voor primaire fibroblast culturen. […]

Microscopische evaluatie van skeletspier[biopten]

[…]

Funktionele evaluatie van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)

Er werd een standaard spectrofotometrische analyse gebruikt voor de meting van de aktiviteiten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) complexen (I, II, II+III, III & IV) en citraat-synthase in skeletspieren. Dezelfde enzymen werden getest in gecultiveerde huid-fibroblasten (uitgezonderd complex-I). Z-score [gestandaardiseerde waarde] = aktiviteit van het patient-staal min de gemiddelde aktiviteit van de controle-stalen gedeeld door de standaard-deviatie van de controle-stalen. De patient-aktiviteit wordt als deficiënt beschouwd als de Z-score < -3.0 is.

Immuno- en fluorescente kleuring van gecultiveerde huid-fibroblasten

[…]

Sequentie-bepaling van het volledig mitochondriaal genoom

[…]

Statistische Analyse

[…]

Resultaten & bespreking

Er werden significante verschillen gevonden qua deoxy[Hb+Mb] in de groep met onverklaarde abnormale vermoeidheid in vergelijking met een groep gezonde controles (P = 0.019). […] De gemiddelde deoxy[Hb+Mb] waarden tijdens de ICCP waren significant beïnvloed door een subgroep van 4 individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid. Bij deze individuen konden geen significante toenames qua deoxy[Hb+Mb] worden gevonden (test & hertest). Analyse van deze individuele resultaten toonde dat 3 individuen (S1, S2 & S4) een identiek, abnormaal deoxy[Hb+Mb] profiel hadden (test & hertest), wat gelijkaardig was met eerdere observaties bij patiënten met mitochondriale myopathie (MM). Volgens de resultaten van deze laatste studie, konden mitochondriale defekten bij gezonde controles worden uitgesloten, op basis van hun deoxy[Hb+Mb] profiel in de huidige studie. Bij 1 patient (S3) werd dit gewijzigd profiel slechts gevonden bij de hertest (normale deoxy[Hb+Mb] respons tijdens de eerste test), wat aangeeft dat de deoxy[Hb+Mb] respons van dit individu tijdens ICCP niet dezelfde was bij test en hertest.

Voor het testen van het mitochondriaal membraan potentiaal (ΔΨ [ΔΨmt; het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]) werden JC-1 [fluorescente kleurstof die aktieve (rood) en inaktieve (groen) mitochondrieën kleurt; mitochondriale depolarisatie wordt aangegeven door een afname van de rood/groene fluorescentie-intensiteit] en MitoTracker [fluorescente kleurstof die afhankelijk van het membraan-potentiaal de mitochondrieën labelt] testen aangewend, welke geen wijzigingen qua ΔΨ opbouw oppikten. Hoewel de JC-1 fluorescente kleuring homogeen was bij controles en in fibroblasten van S2, vertoonden cellen van S1 & S3 een mozaïek-patroon [doordat de aanwezigheid van mtDNA-afwijkingen varieert van cel tot cel] aangezien een subset cellen voornamelijk inaktieve (groene) mitochondrieën bevatte. Dit mozaïek-patroon doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (e.g. punt-mutatie, deletie of depletie van het mtDNA). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. In tegenstelling daarmee was de immunokleuring voor het oxidatieve fosforylatie complex-II (een complex dat enkel nucleair gecodeerde strukturele subunits bevat) normaal voor alle cel-lijnen (gegevens niet getoond), wat verder duidt op een onderliggend mtDNA-gerelateerd defekt.

De 4 abnormaal vermoeide individuen waarbij gedaalde zuurstof-extractie werd gedocumenteerd, droegen een pathogene mtDNA-variant. Het eerste individu (S1) bleek homoplasmatisch voor de m.961 T>C variant in gecultiveerde huid-fibroblasten en skeletspier. [homoplasmie voor een mutatie wil zeggen: alleen afwijkend mtDNA] Uit de literatuur is bekend dat de m.961 T>C variant gelinkt is met ‘non-syndromic hearing impairment’ [gedeeltelijk of totaal gehoor-verlies dat niet gepaard gaat met andere tekenen en symptomen]. De patient klaagde daadwerkelijk over gehoor-verlies sinds de vroege kindertijd en haar audiogram toonde significant gehoor-verlies in de hoge frequenties. Zoals verwacht op basis van het maternaal overerving-patroon of mtDNA, was haar moeder ook homoplasmatisch voor deze m.961 T>C variant. Er is weinig geweten over de prevalentie van deze mtDNA-wijziging. Poolse onderzoekers vonden dat slechts 2 op 500 gezonde individuen (0,4%) deze variant droegen in Polen. Onze tweede deelnemer (S2) had de m.1555A>G variant in homoplasmie, zoals haar moeder. Deze m.1555 A>G variant is geassocieerd met aminoglycoside-geïnduceerde doofheid welke maternaal wordt overgedragen […] Naar ons weten zijn er geen meldingen over de incidentie [mate van voorkomen] van de m.1555 A>G variant in de algemene bevolking. Er zijn slechts studies beschikbaar die prevalenties variërend tussen 0-0,70% tonen. De vierde deelnemer (S4) in onze studie bleek homoplasmatisch voor de m.14484 T>C variant in het MT-ND6 gen, wat één van de mtDNA-varianten is die geassocieerd zijn met Leber hereditaire optische neuropathie (LHON [plots verlies van gezichtsvermogen door afsterven van cellen in de oogzenuw]). Zoals verwacht waren alle onderzochte matrilineaire [in vrouwelijke lijn] verwanten (moeder en 6 nakomelingen) homoplasmatisch voor deze LHON-mutatie. LHON wordt veroorzaakt door een mitochondriaal overgeërfde degeneratie van de retinale ganglion cel-laag [type neuronen van het netvlies] en optische zenuw, leidend tot sub-acuut of acuut pijnloos, bilateraal visueel falen bij jong-volwassenen, voornamelijk mannen. De m.14484 T>C die de p.(Met64Val) substitutie [door de mutatie bepaalde omwisseling van het betreffend aminozuur in het proteïne] in de MT-ND6 subunit van complex-I veroorzaakt, is 1 van de 3 belangrijke mtDNA primaire mutaties van LHON. Ca. 50% van de mannen en 10% van de vrouwen met deze mutaties ontwikkelen optische neuropathie. Prevalentie-studies aangaande Leber hereditaire optische neuropathie werden meestal in West-Europa uitgevoerd: de prevalenties lagen tussen 1,36-3,22 per 100.000 voor de 3 meest frequente LHON-mutaties tesamen. Er werd een rigoureuze klinische en genetische studie betreffende LHON uitgevoerd in het noord-oosten van Engeland: in een populatie van 2,2 miljoen werden alle patiënten met onverklaard visueel falen en hun familieleden gescreend. Stamboom-analyse onthulde een minimum prevalentie voor m.14484 T>C van 0,3 per 100.000. Bij deelnemer 3 (S3) werden geen pathogene punt-mutaties gedetekteerd maar er werden meerdere deleties gevonden in het mitochondriaal genoom. De incidentie van multipele mtDNA-deleties in de algemene bevolking is onbekend. Als we voor de m.961 T>C mutatie een incidentie van 4/1.000 aannemen, voor de m.1555 A>G mutatie een incidentie van 7/1.000 en voor de m.14484 T>C mutatie een incidentie van 0,003/1000, is de kans dat een individu één van deze mitochondriale punt-mutaties draagt 0,011 [(4.000+7.000+3)/1.000.000]. In tegenstelling daarmee werd gevonden dat 3 van de 12 (0,25) individuen in onze studie één van deze pathogene punt-mutaties droegen. […] Geen enkele van de 8 patiënten met onverklaarde abnormale vermoeidheid waarbij normale NIR-spectroscopie resultaten werden verkregen, bleken een pathogene variant in hun mtDNA te dragen [sequentie-bepaling].

In de literatuur zijn er geen meldingen van NIR-spectroscopie abnormaliteiten gedetekteerd bij individuen die een uiteindelijke diagnose van CVS kregen. In een studie waarbij 16 patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/CVS werden vergeleken met 16 gezonde controles (handgreep-test/NIR-spectroscopie) [Miller RR, Reid WD, Mattman A, Yamabayashi C et al. Submaximal Exercise Testing with Near-Infrared Spectroscopy in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Patients Compared to Healthy Controls: A Case-Control Study. J. Transl. Med. (2015) 13: 159], werd geen significant verschil tussen de 2 groepen gevonden. In een andere studie werden bloedstalen van 193 CVS-patiënten (Canadese criteria) genetisch geanalyseerd voor mogelijke mtDNA-variaties d.m.v. sequentie-bepaling van het ganse mitochondriaal genoom. [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. J. Transl. Med. (2016) 14: 19] In deze laatste studie werd de sequentie van gans het mtDNA bepaald en geen enkele van de bekende pathogene mitochondriaal DNA mutaties werden gedetekteerd bij de individuen met CVS. Men zou een mogelijke heterogeniteit in verschillende groepen gelabeld als CVS in gedachten moeten houden, gezien de variabiliteit qua gebruikte definities, en verschillen qua diepgang van zowel somatische als psychiatrische diagnostische screening en het verstrekken van gegevens over de familiale geschiedenis.

Aangezien de 4 individuen werden gescreend via een gedaalde zuurstof-extractie tijdens inspanning van de voorarm-spieren, had een in vitro zuurstof-consumptie test moeten worden uitgevoerd in voorarm-skeletspier stalen om de gedaalde zuurstof-consumptie te bevestigen. Omwille van ethische redenen was het echter niet mogelijk om een skeletspier-biopt te nemen in voorarm-spieren gezien de hoge concentratie zenuwen en capillairen. In plaats daarvan werd een batterij diagnostische testen aangewend om aan te tonen dat de mtDNA-abnormaliteiten inderdaad een negatieve funktionele impact op de mitochondrieën hadden. Er werd een afname of complex-I aktiviteit en van complex-II+III aktiviteit in skeletspieren, en een daling van complex-IV aktiviteit in gecultiveerde huid-fibroblasten gedetekteerd in S2 m.b.v. spectrofotometrische analyse. In skeletspieren van S3 werd een vermindering van OXPHOS complex-IV aktiviteit gedetekteerd (uitgedrukt t.o.v. OXPHOS complex-II aktiviteit). De JC-1 groene en rode fluorescente kleuring van […] cellen van S1 & S3 toonde een mozaïek-patroon dat doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (punt-mutatie, deletie, depletie). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. […] Bij elk van de 3 patiënten [die toestemmming gaven voor een biopt] werden één of meer mitochondriale abnormaliteiten gedetekteerd. Bij S4 waren bijkomende testen niet mogelijk aangezien de patient een huid/spier-biopt had afgewezen. S4 was echter homozygoot voor de m.14484 T>C mutatie die onbetwijfeld als een pathogene mutatie wordt beschouwd.

Besluit

Via niet-invasieve screening met NIR-spectroscopie en een ICCP, identificeerden we een subgroep [sterk uitgedrukt voor maar 4 op 12 patiënten…] individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid die drager zijn van een pathogene mtDNA variant. NIR-spectroscopie zou een krachtige techniek kunnen zijn om deze individuen te detekteren. Het spreekt vanzelf dat verdere studies met grotere groepen met onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist zijn om onze bevindingen te bevestigen en hun klinische significantie te evalueren.

————————-

We herinneren er ook nog eens aan dat het meten van de ‘baseline’ spier-pH (via magnetische resonantie spectroscopie) metabole onevenwichten bij rust kan aantonen (bv. bij ernstige mitochondriale myopathieën). In ‘Abnormale zuur-verwerking in spieren bij CVS’ kan men lezen dat deze niet significant verschilde tussen controle- en CVS/M.E.-groepen…

Men weet ook dat bij bepaalde myopathieën het ryanodine receptor gen is aangetast (mutaties). Daarom willen we, n.a.v. het bovenstaande nog es oproepen tot meer research hieromtrent (zie ‘Ryanodine receptor & inspanning’)…

januari 25, 2018

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 12:26 pm
Tags: , , , , , , ,

In het artikel ‘Metabolic profiling indicates impaired pyruvate-dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome’ (zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’) rapporteerden de Noorse Ritixumab-onderzoekers Øystein Fluge & Olav Mella over een funktionele verstoring van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) op basis van biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. Hun resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van andere metabolisme-researchers.

Een Noorse arts/professor van de afdeling Medische Biochemie van het Universitair Ziekenhuis van Oslo, goed op de hoogte in zake de biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, publiceerde een commentaar/kritiek daarop in een landelijk tijdschrift (enkel in het Noors).

Fluge & Mella hebben het eerder over een PDH-inhibitie (suppressie/onderdrukking). Dit kan misschien een gevolg zijn van een andere dysfunktie in het energie-metabolisme. Nu wordt er geargumenteerd dat er geen deficiëntie is. Spreekt men hier over twee verschillende dingen? Het is bij wetenschappelijk onderzoek ook van belang kritiek in acht te nemen en daarom geven wij dit mee. Bij verder onderzoek kan zeker rekening worden gehouden met de aanbevelingen.

De auteur gaf als belangen-conflict aan dat hij een vergoeding heeft ontvangen voor een lezing op een professioneel forum van psychiaters, ondersteund door het farmaceutisch bedrijf Lundbeck.

————————-

Tidsskr Nor Laegeforen. (2017) 137: 23-24

Tenuous link between Chronic Fatigue Syndrome and pyruvate dehydrogenase deficiency

Yngve Thomas Bliksrud

In een studie van het energie-metabolisme bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom concludeerden onderzoekers verminderde pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit bij patiënten, maar de metingen passen niet bij de veranderingen die we zien bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie.

In een studie gepubliceerd in december 2016 werd een gewijzigd patroon van aminozuren in plasma gevonden bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Bovendien werd veranderde gen-expressie gedetekteerd in witte bloedcellen en veranderde de energie-produktie in spiercellen [zie link in onze inleiding]. De auteurs interpreteren de resultaten als expressie van funktionele remming van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase, en ze suggereren een ontregeling van dit enzyme-complex als mogelijke belangrijke factor in de pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Het onderzoek kreeg uitgebreide aandacht in de [Noorse] media en de link met pyruvaat-dehydrogenase werd openbaar gemaakt zonder voorbehoud. In ons laboratorium ontvingen we stalen voor de metabole screening van patiënten met mogelijk vermoeidheid-syndroom. Op basis van mijn ervaring met biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, wil ik wijzen op gebreken in de studie die moeten aansporen tot een aanzienlijk grotere mate van voorzichtigheid omtrent de conclusies.

Kritiek op methode en interpretatie

In het onderzoek werden aminozuur-concentraties in plasma van 200 patiënten en 102 gezonde controle-personen onderzocht. De onderzoekers vonden significante verschillen tussen de twee groepen maar de betekenis is onduidelijk omdat ze zich niet hebben gebaseerd op de gevestigde diagnose van pyruvate-dehydrogenase deficiëntie en omdat de stalen niet op een gestandaardiseerde manier zijn genomen.

AMINOZUREN-PATROON VOLDOET NIET AAN WAT WIJ ZIEN BIJ PATIËNTEN MET PRIMAIRE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie verhoogt de concentratie van pyruvaat in bijvoorbeeld spier- en zenuwcellen. Pyruvaat wordt omgezet in lactaat en het aminozuur alanine. Alanine is het enige aminozuur dat naar verwachting buiten het referentie-gebied valt in plasma en cerbrospinaal vocht bij primaire pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie (één tot twee keer de bovengrens van referentie). Het onderzoek meldde echter een neiging tot lagere alanine-spiegels bij de patiënten. Het is verrassend dat deze opvallende discrepantie niet in het artikel wordt genoemd.

VERKEERDE NORMALISATIE VOOR TESTEN KAN HET VERSCHIL TUSSEN DE GROEPEN VERKLAREN

Een vasten-test wordt sterk aanbevolen bij het bepalen van de plasma-concentratie van aminozuren, omdat de niveaus aanzienlijk variëren met het dieet en ook gedurende de dag tot 10-15%. In de studie worden niet-nuchtere aminozuur-patronen met kleine afwijkingen vergeleken. Het is heel vreemd dat de auteurs geen grotere bedenkingen hebben bij dieet als een verstorende factor wanneer ze zelf hebben aangetoond dat het dieet alleen de groep aminozuren beïnvloedt die argumenteren voor verstoord pyruvaat-dehydrogenase. De studie toonde significante verschillen tussen nuchtere en niet-nuchtere patiënten. De nuchtere patiënten werden daarom uitgesloten van verdere statistische analyse. De auteurs moeten ook duidelijker maken dat een mogelijke verborgen vertekening tussen de patiënten-groep en de controle-groep met betrekking tot voeding en staalname een alternatieve verklaring kan zijn voor de gevonden verschillen. Systematische verschillen in voeding tussen de groepen zijn niet ondenkbaar. […]

WAT MET DE PYRUVAAT/LACTAAT-RATIO EN EEN DIRECTE METING VAN DE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE AKTIVITEIT?

De pyruvaat/lactaat-verhouding in het plasma kan patiënten met pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie van andere patiënten met hyperlactacidemie [verhoogd lactaat in het bloed] onderscheiden. Deze ratio heeft daarom een centrale plaats in de biochemische diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. In het onderzoek werd de pyruvaat/lactaat-verhouding niet bepaald. Dat is jammer: de verhouding had een belangrijke aanwijzing kunnen geven voor, mogelijk tegen, pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Een directe bepaling van de enzyme-aktiviteit in de cellen is ook de sleutel bij de routine-matige diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Het is vreemd dat dit in de studie niet is gedaan in spiercellen die groeien in de aanwezigheid van serum van de patiënt.

SPECIFIEKE LINK MET CHRONISCHE VERMOEIDHEID SYDROOM VEREIST MEERDERE CONTROLE-GROEPEN

In de studie heeft de patiënten-groep een ander expressie-patroon dan de controle-groep met betrekking tot genen geassocieerd met het pyruvaat-dehydrogenase complex. Dit is een interessant resultaat maar de studie biedt geen basis voor het interpreteren van het verschil als specifiek voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Volgens de consensus-criteria hebben patiënten een “aanzienlijk verminderd aktiviteiten-niveau” gehad gedurende minimaal zes maanden. Het is bekend dat de expressie van genen geassocieerd met het volledige metabolisme (inclusief pyruvaat-dehydrogenase complex) verandert bij immobilisatie. Spieren groeien en verdwijnen naar gelang het aktiviteit-niveau, daarom zijn er in deze studie verschillende expressie-patronen te verwachten. Vooraleer het expressie-patroon specifiek kan worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom, moet het niet alleen worden vergeleken met gezonde mensen maar met andere patiënten-groepen die een overeenkomstig verminderd aktiviteiten-niveau ervaren, zoals een beroerte, fracturen, nier-falen of ernstige depressie. In het onderzoek werd ook aangetoond dat in spiercellen in vitro het energie-metabolisme kan veranderen in de aanwezigheid van serum van patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het is interessant dat dit experimenteel kan worden aangetoond maar evenmin kan deze waarneming specifiek worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Nogmaals: meer controle-groepen van patiënten met verminderde aktiviteiten-niveaus zijn om andere redenen nodig. De studie laat bijvoorbeeld een verminderde produktie van hoge-energie fosfaten (ATP) in vitro zien. In een muizen-model waarin spiercellen worden gekweekt in aanwezigheid van serum van individuen met spier-atrofie en chronisch nierfalen, neemt de ATP-produktie ook af.

CHRONISCHE VERMOEIDHEID IS NIET TYPISCH VOOR PRIMAIRE GENETISCHE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

De auteurs suggereren dat pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie een sleutel is in de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Chronische vermoeidheid is geen typisch symptoom bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, noch ernstig noch mild. Het vereist een opmerking maar wordt met geen woord vermeld.

Pragmatische beoordelingen gevraagd

Onderzoek naar metabole mechanismen voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom is interessant, en het grote werk van Fluge en collega’s kan hypotheses genereren die verder onderzoek waard zijn. De auteurs komen echter al heel vroeg vast te zitten bij de opvallende pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie als onderdeel van de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Momenteel is het verband tussen bewezen aminozuur-veranderingen en pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie te zwak, en de verandering in gen-expressie en energie-metabolisme is te onspecifiek voor een dergelijke harde conclusie.

————————-

De endocrinoloog Emeritus Professor Frank Comhaire (Universitair Ziekenhuis, Gent) staat bekend als specialist op het vlak van de behandeling van mannelijke infertiliteit en ondernemer (het op de markt brengen van testen en complementaire behandelingen). De voorbije jaren ontwikkelde hij ook een interesse voor M.E.(cvs)…

In een artikel getiteld ‘Chronic Fatigue Syndrome (CFS) or “systemic immune disorder” (SID)? (Internal Medicine 2016, 6: 225) rapporteerde hij dat er bewijs voor het feit dat “CVS te wijten” is “aan een systemische immuun-stoornis waarbij oxidatieve, immunologische en epigenetische mechanismen de aktiviteit van pyruvaat-dehydrogenase kinase (PDHK) kunnen verhogen en de pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit inhiberen”. Op basis daarvan liet hij een ‘nutriceutical’ (voeding-supplement) testen dat bepaalde organische zuren van algen, vitamine-B1, alfa-liponzuur, acetyl-L-carnitine en oxidoreductase-ubiquinon Q10 bevat. Bij publicatie van een kleine piloot-studie (n = 10; patiënten gediagnosticeerd in Belgische CVS-referentie-centra (!???!)) (‘A Novel Nutriceutical Treatment of Myalgic Encephalitis/Chronic FatigueSyndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”; Internal Medicine 2017, 7:5) bleken er evenveel responders als niet-responders te zijn. Deze laatsten bleken uiteindelijk (na verdere diepgaande screening) aan een andere aandoening dan M.E.(cvs) te leiden. Op het moment van het verschijnen van het artikel was een patent hangende…

Er werd verder meegegeven dat een mogelijke diagnostische methode voor de detektie van deficiënte enzymatische aktiviteit van PDH is: het meten van de concentraties van pyruvaat en acetyl-coenzyme-A in monocyten. “Dit vergt geavanceerde laboratoriumtechnologie”…

Merk op: het tijdschrift Internal Medicine (met slechts een beperkte impact en niet opgenomen in PubMed of Web Of Science) is niet het gerenommeerde Journal of Internal Medicine of het befaamde Annals of Internal Medicine…

november 10, 2017

Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:36 am
Tags: , , , ,

Julia Newton en haar collega’s van de ‘Newcastle University’ rapporteren hier dat PBMCs (type witte bloedcellen in het circulerend bloed) van M.E.(cvs)-patiënten niet in staat zijn om voldoende energie te produceren. Bij bevestiging (bij grotere groepen en andere types cellen) zou dit een indicatie kunnen zijn voor een elematair probleem bij de aandoening.

Ze bestudeerden het oxidatieve fosforylatie systeem (‘elektronentransportketen’, mitochondriaal mechanisme voor de produktie van energie (ATP) en de glycolyse (omzetting van glucose waarbij ook energie vrijkomt) onder basale omstandigheden en onder ‘stress’ (belasting), en concludeerden dat de cellen bij fysiologische stress (lees: hogere nood aan glucose) minder in staat zijn om de cellulaire (mitochondriale) ademhaling op te drijven en zo tegemoet te kunen komen aan de energie-behoeften. Een zoveelste aanwijzing dat er iets mis is met de cellulaire energie-produktie bij M.E.(cvs) – zie referenties/links in de tekst.

Bij de mitochondriale stress test wordt d.m.v. de toevoeging van bepaalde chemische stoffen aan het cultuur-milieu van de cellen enkele parameters gemeten waaruit de ATP-produktie, de reserve-capaciteit, het ‘proton-lek’ (mitochondriale ontkoppeling; diffusie van protonen zodat die niet meer kunnen bijdragen tot de synthese van ATP, de energie gaat verloren als warmte), de niet-mitochondriale respiratie, de maximale respiratie (= reserve-capaciteit + ATP-produktie), de basale respiratie (= ATP-produktie + proton-lek) en de koppeling-efficiëntie (graad waarop nuttige energie wordt gemaakt uit de cellulaire brandstof; mate waarop de mitochondriale systemen op elkaar zijn afgestemd) worden berekend.

Voor de glycolyse stress test worden de cellen ‘behandeld’ (ten einde hen glucose te ontzeggen en zo te ‘dwingen’ andere paden aan te wenden om energie te produceren) om de glycolyse, de glycolytische reserve, de glycolytische capaciteit (som van de eerste 2) en de niet-glycolytische verzuring te berekenen.

Het feit dat PMBCs van M.E.(cvs)-patiënten hun energie-output niet kunnen verhogen om aan de behoeften te voldoen voor routine taken lijkt er op te wijzen dat ze metabool uitgeput zijn. Het is een belangrijke bevinding maar de vraag blijft of dit enkel in deze witte bloedcellen is of ook in andere weefsels voorkomt. Het research-team liet optekenen dat ze ook spiercellen op dezelfde manier wil testen…

————————-

PLoS ONE (2017) 12: e0186802

Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Cara Tomas (1), Audrey Brown (1), Victoria Strassheim (2,3), Joanna L. Elson (4,5), Julia Newton (1,3), Philip Manning (1)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

5 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een zeer uitputtende ziekte met een ongekende etiologie. Abnormaliteiten qua bio-energetische funktie werden genoemd als een mogelijke oorzaak voor CVS. Er werden preliminaire studies uitgevoerd om cellulaire bio-energetische abnormaliteiten bij CVS-patiënten te onderzoeken. Er werd een reeks testen uitgevoerd op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten en gezonde controles.

Deze experimenten onderzochten cellulaire patronen met betrekking tot de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS) en glycolyse. De resultaten toonden consistent lagere metingen van de OX-FOS-parameters in PBMCs van CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Er werden 7 sleutel-parameters van de OX-FOS berekend: basale respiratie, ATP-produktie, protonen-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiration en koppeling-efficiëntie. Hoewel veel van de parameters verschilden tussen de CVS- en controle-groep, werd maximale respiratie aangeduid als sleutel-parameter met betrekking tot de mitochondriale funktie die verschilde tussen CVS- en controle-PBMCs omwille van de consistentie van de stoornis bij CVS-patiënten die werd gevonden doorheen de studie (p ≤ 0.003). De lagere maximale respiratie in CVS-PBMCs suggereert dat wanneer de cellen fysiologische stress ondervinden, ze minder in staat zijn om hun respiratie te verhogen om te compenseren voor stijgende stress en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften. De ontdekte metabole verschillen benadrukken het overmogen van CVS-patient PBMCs om de cellulaire energetische eisen te bevredigen onder basale omstandigheden zowel als wanneer de mitochondrieën onder druk komen te staan tijdens periodes met hoge metabole behoeften.

Inleiding

[…]

Er werd voorgesteld dat abnormaliteiten in de bio-energetische werking de oorzaak kan zijn van de ernstige vermoeidheid die wordt ervaren door CVS-patiënten. Factoren zoals mitochondriale dysfunktie, adenosine-monofosfaat geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK [een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt]) verstoring, oxidatieve stress en skeletspier-cel acidose [‘verzuring’] werden allemaal in verband gebracht met het CVS-fenotype [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10 /// Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Chronic Fatigue Syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2009) 2: 1-16 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radical Biology and Medicine (2005) 39: 584-9]. Een abnormaal energie-metabolisme werd geïdentificeerd als een belangrijk interesse-gebied in de CVS-research, met een aantal studies die plasma- en serum-metabolomica onderzochten en wijzigingen qua metabolieten toonden, en de hypothese dat CVS een hypometabool syndroom is [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39 /// Yamano ES et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA- and urea-cycles. Scientific Reports (2016) 6 /// Naviaux RN et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. PNAS (2016) 113 /// Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9 /// Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1].

Verworven mitochondriale dysfunktie (bv. post-virale infektie) is ook een research-gebied van belang [o.a. Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J. Mitochondrial dysfunction and the pathophysiology of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2012) 5: 208-20 /// Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Mitochondrieën fungeren als het energie-overdracht centrum van de cel en zijn verantwoordelijk voor de produktie van cellulair ATP via respiratie [‘ademhaling’; metabole reakties en processen in de mitochondrieën die de energie uit voedingsstoffen omzetten naar ATP]. Mitochondriale respiratie kan door meerdere factoren worden geïnhibeerd: van cytokine-veranderingen tot oxidatieve stress. Studies omtrent CVS hebben sleutel-indicatoren voor mitochondriale dysfunktie zoals verlaagde aanmaak van ATP [Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – A clinical audit. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2013) 6: 1-15 /// Castro-Marrero J, Cordero MD et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants and Redox Signaling (2013) 19: 1855-60] en een verstoring van de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS [zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie; het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen in de mitochondrieën]) mechanismen getoond. Bijkomend komen cruciale symptomen die geassocieerd zijn met CVS (zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en spierpijn) ook voor bij patiënten met primaire mitochondriale ziekten waarvan is geweten dat ze worden veroorzaakt door mitochondriale dysfunktie die het resultaat is van mutaties van het kern- of mitochondriaal DNA (mtDNA) [Newton JL et al. Perceived fatigue is highly prevalent and debilitating in patients with mitochondrial disease. Neuromuscular Disorders. (2015) 25: 563-6]. Er werd gesuggereerd dat mitochondriale dysfunktie voorkwam bij een subgroep van de CVS-populatie. Door een gebrek aan definitief bewijs voor gans de CVS-populatie hebben anderen echter gesuggereerd dat een dergelijk verband niet significant is [o.a. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8]. Twee research-groepen hebben onafhankelijk van elkaar getoond dat klinisch gevalideerde pathogene mtDNA-mutaties waarschijnlijk zeer zeldzaam zijn in CVS-groepen [Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Translational Medicine (2016) 14 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18]. Eén studie vond geen enkele klinisch gevalideerde mtDNA-mutatie die voldoende significant heteroplasmie [aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom] vertoont, terwijl de andere er slechts één vond: een LHON (‘Leber hereditary optic neuropathy’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast]) mutatie. Daarnaast verschillen de sub-klinische waarden van gekende mtDNA-mutaties niet van deze in de algemene bevolking.

De studie hier richtte zich specifiek op het onderzoeken van sleutel-parameters van de mitochondriale funktie, inclusief de twee belangrijkste energie-producerende mechanismen in de cel – glycolyse en OX-FOS. Veranderingen in deze parameters kunnen wijzen op een mitochondriale basis voor CVS, en mechanismen in de etiopathogenese van de ziekte ophelderen en mogelijke doelwitten voor toekomstige studie identificeren.

De doelstelling van deze studie was het detekteren en vaststellen van veranderingen qua mitochondriale funktie en cellulaire energie-profielen (in PBMCs) van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom en gezonde controles. PBMCs kunnen relatief makkelijk worden verkregen via bloed-afname en werden gebruikt om systemisch de mitochondriale funktie na te gaan in controles en CVS-patiënten omwille van hun systemische blootstelling.

Abnormale PBMC bio-energetica werden al onderzocht bij andere chronische ziekten zoals obesitas, type-2 diabetes mellitus (T2DM) en Reumatoïde Arthitis. Er werd een hogere basale respiratie en maximale respiratie getoond bij T2DM-patiënten. Zoals CVS-patiënten ervaren patiënten met T2DM dikwijls vermoeidheid. Eerdere research heeft getoond dat maximale respiratie en reserve-capaciteit in PBMCs correleert met lichamelijk funktioneren en kracht [bij obesitas]. De symptomen beschreven in die studie (zoals spierpijn, zwakte en inspanning-intolerantie zijn ook courante symptomen bij CVS-patiënten. Gezien de gelijkenissen qua symptoom-profielen van deze 2 ziekten, hadden we in deze studie tot doel te onderzoeken of er ook PBMC-abnormaliteiten qua bio-energetische funktie bestaan bij CVS.

Methodes

[…] patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria voor CVS […]

Bereiding van PBMCs

[…]

Extracellulaire flux-analyse

[Flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex]

Werking van OX-FOS en glycolyse werden bepaald gebruikmakend van een ‘extracellular flux analyser’ […] De mitochondriale respiratie wordt gemeten via de afname van de zuurstof-concentratie in het test-medium. […] Veranderingen qua zuurstof- en proton-concentratie worden gedetekteerd. De glycolyse in de cellen wordt gemeten via de daling van de protonen-concentratie in het test-medium (ook gekend als ‘extracellular acidification [verzuring] -rate’, ECAR). Zuurstof-verbruik (OCR) werd gebruikt als een indicator voor OX-FOS, terwijl ECAR werd gebruikt als een indicator voor glycolytische omzetitng van glucose naar lactaat.

De OCR en ECAR werden gemeten na de opéénvolgende toevoeging van test-reagentia. Voor de mitochondriale stress test: oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP [ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS]), en rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] en antimycine-A [inhibeert de cellulaire respiratie]. Daaruit werden de basale respiratie, ATP-produktie, proton-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie berekend. Voor de glycolyse stress-test: glucose, oligomycine en 2-deoxyglucose [stopt de glycolyse]. Dit liet toe glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring te berekenen. […]

Trypaan-blauw

Na toevoeging van [de kleurstof] trypaan-blauw worden dode cellen blauw om dat ze doorlaatbaar zijn voor de kleurstof en levende cellen blijven ongekleurd. Het percentage levende cellen (t.o.v. het totaal aantal cellen) geeft de cel-viabiliteit.

Statistiek

[…]

Resultaten

[…]

Effekt van het invriezen op PBMC-OCR

De afname van bloedstalen van de patiënten gebeurde sporadisch en was onvoorspelbaar, daarom werd het nodig geacht dat de stalen werden ingevroren om ze op hetzelfde moment te kunnen testen en de variatie te niet te doen. Om die reden werden mitochondriale stress testen uitgevoerd op vers geïsoleerde en ingevroren (-80˚C) PBMCs om het effekt na te gaan van het invriezen (omwille van eerdere tegenstrijdige resultaten). […]

Er werden significante verschillen gezien tussen CVS-patiënten en controles voor zowel verse als ingevroren PBMCs voor dezelfde 4 parameters: basale respiratie (p ≤ 0.043), proton-lek (p ≤ 0.013), maximale respiratie (p ≤ 0.003) en reserve-capaciteit (p ≤ 0.012).

Wanneer we verse en ingevroren PBMC-stalen van CVS-patiënten vergeleken, verschilden de basale respiratie (p = 0.006), ATP-produktie (p = 0.003), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) significant. Ook bij de gezonde controles werden significante verschillen gezien voor basale respiratie (p = 0.008), ATP-produktie (p = 0.047), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) tussen verse en ingevroren stalen. Er wordt gedacht dat de consistent significante afname qua basale respiratie en maximale respiratie voor de ingevroren stalen t.o.v. de verse PMBCs freshly isolated PBMCs te wijten is aan de stress ten gevolgde het invries-proces.

Effekt van glucose-concentratie op PBMCs

OCR mitochondriale stress testen werden uitgevoerd in medium met laag (1 mM) en hoog (10 mM) glucose, met de bedoeling te kijken of veranderingen qua cellulaire ATP-produktie konden worden gedetekteerd bij deze 2 concentraties. De hypothese was dat inculatie van PBMCs in laag-glucose de cellen van energie-transductie via glycolyse zou sturen in de reichting van het OX-FOS-mechanisme, en zo een toename qua mitochondriale respiratie zou veroorzaken. Deze hypothese voorspelt een hogere zuurstof-consumptie bij laag-glucose t.o.v. van hoog-glucose. Laag-glucose werd aangewend om een natuurlijke stressor (hypoglycemie) na te bootsen die PBMCs in vivo kunnen ondervinden (en die anders is dan de stress van het invriezen, wat niet voorkomt in vivo).

Bij laag-glucose vertoonde de CVS-populatie significant lagere resultaten dan de controles voor 6 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), maximale respiratie (p < 0.001), reserve-capaciteit (p < 0.001), niet-mitochondriale respiratie (p < 0.001) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Wanneer cellen werden geïncubeerd in hoog-glucose, verschilden CVS- en controle-PBMCs voor 5 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p = 0.013), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001).

De parameters die significante verschillen vertoonden wanneer de resultaten werden vergeleken tussen laag- en hoog-waren ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p < 0.001), maximale respiratie (p = 0.025), niet-mitochondriale respiratie (p = 0.004) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Deze verschillen werden echter enkel in de controle-groep gevonden. De glucose-concentratie had geen enkel effekt op de parameters in de CVS-groep.

[Leeftijd bleek geen verstorende factor voor mitochondriale funktie. Ook geslacht kon worden geëmlimineerd als verstorende factor.]. De duur van het invriezen correleerde niet met de cell-viabiliteit (p = 0.100) of maximale respiratie (p = 0.722) en is dus geen verstorende factor. Zelfs een korte periode invriezen veroorzaakt veranderingen qua OX-FOS-funktie, wat bewijst dat het proces van invriezen/ontdooien deze veranderingen veroorzaakt en niet de duur van het invriezen.

[…]

Glycolytische aktiviteit

De resultaten van een glycolyse stress test met PBMCs vertoonden geen verschillen qua glycolyse tussen de patiënten en controles. Geen enkele van de 5 berekende parameters verschilde significant tussen CVS- en controle-stalen (p ≥ 0.075).

De cel-viabiliteit van verse en ingevroren stalen verschilde niet significant en er was geen significant verschil wat betreft de viabiliteit van de CVS- en controle-stalen, vers noch ingevroren (p ≥ 0.346).

Bespreking

Ondanks de grote aantallen mensen met CVS in de bevolking, blijven de oorzaken er van onverklaard. Dit is de eerste studie die gevallen-controle gebruikt om de mitochondriale funktie te onderzoeken in PBMCs bij CVS. Er werden PBMCs gebruikt in deze preliminaire studie aangezien het toelaat potentiële abnormaliteiten te bekijken op systemsch niveau.

Significant gewijzigde mitochondriale stress test parameters in de CVS-groep t.o.v. de gezonde controle groep suggereren dat CVS-patiënten systemische abnormaliteiten qua energie-overdracht kunnen vertonen, bijzonderlijk wanneer geïsoleerde PBMCs onder mitochondriale stress komen te staan. De lagere reserve-capaciteit die wordt gezien bij CVS-patiënten wijst er op dat hun cellen al hun capaciteit aanwenden onder normale omstandigheden (zonder stress) dan gezonde controles. De verlaagde maximale respiratie suggereert dat de PBMCs van CVS-patiënten niet in staat zijn tot dezelfde mate van respiratie als gezonde controles. De resultaten tonen dat CVS-patiënten hun respiratoire capaciteit slechts met 47% (± 37%) kunnen verhogen (van baseline tot maximaal gestimuleerd door FCCP), wat significant (p < 0.001) lager is dan de 98% (± 32%) toename qua respiratoire capaciteit bereikt door controle-PBMCs. De consistent lagere maximale respiratie in de CVS-groep toont het onvermogen van CVS-patiënten tot dezelfde mate van respiratie als de controle-groep onder cellulaire stress. De lagere reserve-capaciteit suggereert dat wanneer CVS-PBMCs onder stress komen te staan, ze minder in staat zijn hun respiratie te verhogen om te compenseren voor de toegenomen stress waardoor patiënten minder in staat zijn om te voldoen aan de cellulaire energie-vereisten. Er wordt gedacht dat gelijkaardige abnormaliteiten qua reserve-capaciteit bijdragen aan een waaier van andere ziekte-pathologieën zoals hart-ziekte, neurodegeneratieve ziekten bij het ouder-worden en gladde-spiercel sterfte.

Het invries-proces had een significante impact op de cellulaire bio-energetica van PBMCs bij zowel de controle- als de CVS-groep. Vier van de onderzochte parameters vertoonden significante verschillen tussen de verse en ingevroren stalen in beide groepen: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. De resultaten tonen dat het invries-proces dezelfde invloed op beide groepen had, met dezelfde dalingen van elk van de vermelde parameters. Het invriezen van PBMCs kan talrijke cellulaire wijzigingen veroorzaken die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de gedaalde OCR die in deze experimenten werd opgetekend. Mogelijke veranderingen veroorzaakt door invriezen omvatten oxidatieve schade, een verlies qua membraan-integriteit door de vorming van ijs-kristallen en wijzingingen in de ion-homeostase.

Hoewel bleek dat invriezen een impact had op bepaalde parameters, werd gezien dat dezelfde parameters significant verschillend waren tussen de controle- en de CVS-groep bij verse en ingevroren stalen. Dit toont aan dat zelfs al zijn de absolute waarden van sommige parameters beïnvloed door het invries-proces, het patroon in beide groepen kan worden gezien en dat daarom verse of ingevroren stalen kunnen worden gebruikt om verschillen te detekteren tussen controles en CVS-patiënten. Voor toekomstige studies waarbij men wil kijken naar de absolute OCR-waarden zouden verse stalen moeten worden gebruikt, voor andere experimenten volstaan echter ingevroren stalen om adequaat de verschillen tussen groepen te tonen cohorts. Er werden ingevroren stalen gebruikt voor de hoge- en lage-glucose experimenten omwille van de sporadische staalnames gedurende een relatief lange periode maar deze bevinding valideert het gebruik van ingevroren stalen voor deze experimenten en suggereert dat het invriezen van stalen het vermogen om groepen te vergelijken niet verandert. Er dient te worden opgemerkt dat tijdens eerdere analyse met ≤ 12 stalen, het moeilijk was om verschillen tussen de 2 groepen te detekteren met ingevroren stalen, daarom is voor een kleiner aantal stalen het gebruik van verse stalen gewenst.

De hypothese was dat PBMC-incubatie in laag-glucose de energie-transductie van cellen van glycolyse zou leiden naar het OX-FOS-mechanisme, wat een toename van de mitochondriale respiratie veroorzaakt. Deze hypothese voorspelt een hogere basale respiratie en maximale respiratie in laag-glucose. Een hogere maximale respiratie in laag-glucose werd enkel gezien in de controle-groep maar niet in de CVS-groep, terwijl de basale respiratie niet significant steeg in om het even welke groep bij lage-glucose omstandigheden. Daarenboven steeg in de controle-groep de ATP-produktie, de niet-mitochondriale respiratie en de koppeling-efficiëntie, en daalde het proton-lek, bij laag-glucose. De CVS-groep vertoonde geen verschillen tussen laag- en hoog-glucose condities voor om het even welke parameter. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de controle-cellen zich beter kunnen aanpassen aan hun omgeving en beschikken over het vermogen om hun ATP-produktie te verhogen via mitochondriale respiratie indien nodig – iets waar de CVS-cellen wellicht niet toe in staat zijn.

Vier van de parameters bleken verschillend tussen de controle- en CVS-groepen bij zowel laag- als hoog-glucose: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. Dit toont aan dat de verschillen voor deze parameters tussen de 2 groepen die hier werden gezien, kunnen worden gereproduceerd in verschillende glucose-condities en bevestigt het onvermogen van de CVS-PBMCs om hun respiratoire capaciteit te verhogen tot het niveau van de controle-PBMCs zowel bij ‘baseline’ als wanneer ze tot het maximum worden gestimuleerd (door FCCP), zelfs bij laag-glucose wanneer de cellen worden naar ATP-produktie via mitochondriale respirate worden gepusht en weg van de glycolyse als energie-bron. Niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie verschilden enkel tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, terwijl het proton-lek enkel verschilde bij hoog-glucose.

De koppeling-efficiëntie toonde dat ATP-produktie enkel efficiënter werd in de controle-groep wanneer er stress ontstond door laag-glucose, en niet in de CVS-groep. Er werden verschillen qua koppeling-efficiëntie gezien tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, wat suggereert dat de CVS-cellen reeds aan de maximum efficiënctie zitten wat betreft de aanmaak van ATP wanneer controle-cellen nog in staat zijn die efficiëntie te verhogen en ATP produceren wanneer dit vereist is (bv. bij laag-glucose).

[…] De statistische significante resultaten wijzen op robuste statistische gegevens, ondanks de relatief beperkte grootte van de groepen.

Deze experimenten helpen bij het identificeren van de richting die toekomstige research omtrent cellulaire bio-energetica bij CVS zou moeten nemen voor het detekteren van verschillen betreffende sommige, maar niet alle, parameters van de mitochondriale funktie. Verschillen qua mitochondriale parameters tonen het onvermogen van CVS-PBMCs om het OX-FOS-mechanisme aan te wenden om energie te produceren in dezelfde mate als controle-PBMCs dat doen, zowel onder basale omstandigheden als wanneer ze worden gedwonen tot maximale respiratie. De consistent significante verschillen tussen de 2 groepen bij basale respiratie en maximale respiratie tonen hun belang aan als potentiële merkers voor CVS, een bevinding die kan worden gebruikt om richting te geven aan toekomstig onderzoek omtrent de mitochondriale dysfunktie bij CVS.

In tegenstelling tot eerdere literatuur [zie bv. Armstrong et al. hierboven] die suggereerde dat abnormaliteiten qua PBMC ATP-concentraties kunnen worden veroorzaakt door glycolyse, tonen resultaten van de glycolyse stress test dat glycolyse bij CVS-patiënten niet significant verschilt van de gezonde groep. Dit kan te wijten zijn aan de relatief kleine groepen die in deze studie werden gebruikt. De combinatie van de detektie van significante verschillen in OX-FOS naast het ontbreken van detekteerbare verschillen in glycolyse heeft mogelijks een voorheen ongekend fenotype van CVS-PBMCs blootgelegd, hoewel grotere stalen nodig zullen zijn om dit te bevestigen. Hoewel de belangrijkste beperking van deze studie de grootte van het staal was, resulterend in een minder krachtige analyse (bijzonderlijk voor de vers geïsoleerde controle-groep), dient te worden opgemerkt dat de hier gepresenteerde gegevens enkel preliminaire bevindingen zijn. Grotere stalen en longitudinale afnames zijn nodig om de hier verkregen reulstaten te valideren en te zorgen voor de statistische ‘power’ die vereist is om verschillen in andere parameters te detekteren. Een andere beperking van deze studie is het gebrek aan karakteristieken van de CVS-groep. Demografische, antropometrische en symptoom-gegevens zouden nuttig zijn om te kijken naar links met de mitochondriale abnormaliteiten die in deze studie werden geobserveerd. Het zou interessant zijn om te analyseren of CVS-symptomen – in het bijzonder vermoeidheid-graad – correleerden met de gemeten mitochondriale parameters. Er zouden bijkomende experimenten en technieken kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de mitochondriale inhoud en morfologie, mitochondriale funktie in doorlaatbaar-gemaakte cellen en geïsoleerde mitochondrieën, en metingen van het mitochondriaal membraan potentiaal om deze resultaten verder te valideren. Stratificatie van PBMCs op basis van fluorescentie-gektiveerde cel-sortering (FACS) is een techniek die kan worden aangewend om de cel-types PBMCs verder onder te verdelen om te identificeren welke specifieke cel-populaties verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde OX-FOS-verschillen. Het is momenteel nog niet geweten of factoren zoals recente aktiviteit en dieet voor de bloed-afname een effekt heeft op PBMC bio-energetica en dit is iets dat dient te worden onderzocht. Het gebruik van sedentaire controles en aktiviteit-monitors zou nuttig zijn om het effket op PBMC bio-energetica te tonen. Deze studie maakte gebruik van PBMCs als een voorspeller voor de systemische mitochondriale funktie maar er zounden andere cel-types kunnen worden gebruikt om te onderzoeken of de hier geoberveerde verschillen kunnen worden gezien in andere weefel-types bij CVS-patiënten.

De resultaten van deze studie weerspiegelen de resultaten gevonden bij T2DM-patiënten (een link tussen een andere ziekte met vermoeidheid als kern-symptoom en OX-FOS-parameters: basale respiratie en maximale respiratie. Dit geeft aan dat de PBMC bio-energetische abnormaliteiten een consistente link met vermoeidheid vertonen, maar of de abnormaliteiten optreden ten gevolge de vermoeidheid of de oorzaak van de ziekte zijn blijft onbekend.

Deze preliminaire research heeft duidelijk statistisch significante verschillen in het bio-energetisch profiel van PBMCs van CVS-patiënten getoond in vergelijking met cellen van gezonde controles. Belangrijk: deze resultaten leggen niet vast of de verschillen qua PBMC energie-mechanismen een oorzaak of gevolg van CVS zijn; deze gegevens impliceren echter duidelijk dat deze cellen een rol kunnen spelen in het ziekte-mechanisme. Verder kan het gerbuik van PBMCs een nieuw en waardevol model zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen ter behandeling van CVS.

oktober 27, 2017

Fibromyalgie en microgliaal TNF-α

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:05 am
Tags: , , , , , , , ,

Microglia – we hebben het op deze pagina’s al veelvuldig over dit specifiek type of brein-immuuncellen (de “macrofagen van het CZS”) gehad. Een Japanese groep researchers ontwikkelde een techniek om deze aan te maken uit witte bloedcellen uit het bloed zodat ze hun cellulaire eigenschappen bij ziekte kunnen onderzoeken. Ze rapporteren hier over initieel werk dat ze deden bij fibromylagie (niet hetzelfde als M.E.(cvs) maar zoals men weet overlappend).

Wellicht kunnen deze resultaten aanwijzingen geven voor verder onderzoek bij M.E(cvs)…

De met deze technologie gecreëerde microglia van fibromyalgie-patiënten blijken hyper-responsief voor ATP (‘energie-molekule’ maar ook neurotransmitter met een effekt op o.a. microglia) te zijn en meer van het pro-inflammatoir cytokine TNF-α tot expressie te brengen en af te geven (d.w.z. dat ze naburige cellen beïnvloeden). Dit cytokine was ook gelinkt met (subjectieve) pijn en er was een negatief verband met levenskwaliteit. De vraag blijft of de respons op ATP specifiek is voor deze aandoening… Anderzijds werd al gerapporteerd dat een ontoereikende adenosine-trifosfaat (ATP) produktie verband kan houden met de pathofysiologie van M.E.(cvs) door een inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie (zie bv. ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ en ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’)

Lees (o.a.) ook ‘Gliale aktivatoren: doelwit voor de behandeling van centrale sensitisatie (chronische pijn)?’.

————————-

Sci Rep. (2017) 7: 11882

Fibromyalgia and microglial TNF-α: Translational research using human blood induced microglia-like cells

Ohgidani M1, Kato TA2, Hosoi M3, Tsuda M4, Hayakawa K1, Hayaki C5, Iwaki R3, Sagata N1, Hashimoto R6, Inoue K4, Sudo N3,5, Kanba S1

1 Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

2 Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

3 Department of Psychosomatic Medicine, Kyushu University Hospital, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

4 Department of Life Innovation, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

5 Department of Psychosomatic Medicine, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

6 Research Centre for Children’s Mental Development, United Graduate School of Child Development, Osaka University, Yamadaoka 1-1, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Samenvatting

Fibromyalgie is een hardnekkige ziekte die wordt gekenmerkt door chronische oncontroleerbare pijn en psychologisch lijden, en waarvan de oorzaak nog niet werd opgehelderd omwille van de complexe pathologie. Aktivatie van immuun-cellen in de hersenen – microglia genaamd – heeft de aandacht getrokken als een potentieel onderliggend pathologisch mechanisme bij chronische pijn. Technologische en ethische bezwaren hebben echter het vermogen om research met menselijke microglia uit te voeren beperkt. Om deze beperking te overwinnen, hebben we een techniek ontwikkeld om menselijke ‘induced microglia-like’ (iMG) [geïnduceerde mircroglia-achtige] cellen te creëren vertrekkende van menselijke perifeer bloed monocyten. In deze studie creëerden we iMG-cellen van 14 patiënten met fibromyalgie en 10 gezonde individuen, en vergeleken de aktivatie van iMG-cellen tussen de 2 groepen op cellulair niveau. De expressie van tumor necrose factor (TNF)-α was qua mRNA- en proteïne-waarden significant verhoogd in ATP-gestimuleerde iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie in vergelijking met cellen van gezonde individuen. Interessant: er was een matige correlatie tussen ATP-geïnduceerde upregulering van de TNF-α expressie en klinische parameters van subjectieve pijn en andere mentale manifestaties van fibromyalgie. Deze bevindingen suggereren dat microglia van patiënten met fibromyalgie hypersensitief zijn voor ATP. TNF-α van microglia kunnen een sleutel-factor zijn die aan de basis ligt van de complexe pathologie van fibromyalgie.

Rapport

Fibromyalgie, een vorm van niet-organische pijn, is een chronische ziekte die ernstige systemische pijn met psychologisch lijden veroorzaakt, resulterend in funktie-beperkingen en een verminderde levenskwaliteit. Het klinisch beeld werd sinds lang gedocumenteerd; toch blijft fibromyalgie tot op heden een hardnekkige ziekte met ongekende etiologie. In een klinische studie die gebruik maakte van fMRI vertoonden patiënten met fibromyalgie hyper-responsiviteit op stimuli t.o.v. gezonde deelnemers. Daarnaast suggereren rapporten dat neuro-inflammatie veroorzaakt door immuun-cellen en inflammatoire cytokinen gerelateerd is met de pathofysiologie van fibromyalgie. Er werd gesuggereerd dat fibromyalgie wordt veroorzaakt door ingewikkelde bio-psycho-sociale factoren met het centraal zenuwstelsel (CZS) als de pathologische basis.

Microglia zijn immuun-cellen in het CZS en zijn gekend voor hun inflammatoire funkties via de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen zoals as tumor necrose factor (TNF)-α en interleukine (IL)-1β. Op basis van studies bij knaagdieren rapporteerden we over de abnormaliteiten van microglia als pathologicshe basis van chronische pijn [Tsuda M et al. P2X(4) receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury. Nature. (2003) 424: 778-783 /// Masuda T. et al. Transcription factor IRF5 drives P2X4R(+)-reactive microglia gating neuropathic pain. Nat Commun. (2014) 5: 3771]. Deze knaagdieren-studies wezen op de over-aktivatie van microgliale cellen bij patiënten met chronische pijn, klinische molekulaire gegevens ontbreken echter omwille van ethische en technische kwesties. Zodoende zijn technieken ter ontwikkeling van menselijke microglia-achtige cellen uit niet-hersen weefsels gerechtvaardigd. Er werd gerapporteerd over een techniek om microglia-achtige cellen te induceren uit menselijke pluripotente [die kunnen uitgroeien tot bijna alle celtypes] stamcellen (iPS). De iPS-technologie maakt cel-gebaseerde testen mogelijk in gebieden zoals de embryologie, de farmacologie en de regeneratieve geneeskunde; de iPS-technologie heeft echter enkele beperkingen wat betreft het modelleren van niet-genetische ziekten en vereist veel tijd en uitgaven. Anderzijds hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld om microglia-achtige (iMG) cellen te induceren direct uit menselijk perifeer bloed (monocyten) door gebruik te maken van de 2 cytokinen IL-34 en ‘granulocyte macrophage colony stimulating factor’ (GM-CSF) [fungeert als een groeifactor voor witte bloed-cellen, stimuleert stamcellen tot vorming van granulocyten/monocyten], binnen de 2 weken en zonder enige gen-modificiaties. Vergeleken met de iPS-cellen is onze iMG-techniek eenvoudiger en heeft de voordelen van tijd- en kosten-beheersing. Een andere verdienste is dat we iMG-cellen kunnen produceren zonder enige gen-modificatie. Er is vers bloed vereist om iMG-cells te produceren en we kunnen de iMG-cellen nu nog niet stockeren, wat een belangrijke beperking is. We hebben reeds abnormaliteiten bevestigd qua cellulaire responsen van iMG-cellen van patiënten met ziekte van Nasu-Hakola [zeldzame erfelijke aandoening met neurodegeneratie die leidt tot dementie en vroegtijdige dood], wat een gekende primaire microglia ziekte is. Verder hebben we de gen-expressie patronen geanalyseerd van iMG-cellen in de manische en depressieve fase van patiënten met bipolaire aandoeningen, en onthulden fase-afhankelijke microgliale experessie-patronen. Gen-expressie analyse door een andere research-groep legde bloot dat iMG-cellen de meeste gelijkaardige kenmerken vertonen met primaire menselijke microglia in vergelijking met andere cel-types zoals onsterfelijk gemaakte menselijke microglia en menselijke macrofagen. Onze eerdere studies en dit rapport suggereren sterk dat de iMG-techniek een krachtig instrument is voor het analyseren van dynamische molekulaire pathofysiologieën van microglia, niet enkel bij genetische ziekten maar ook niet-organische ziekten (inclusief fibromyalgie en meerdere psychiatrische aandoeningen).

Hier creëerden we iMG-cellen van gezonde vrijwilligers als controle-groep (HC) en patiënten met fibromyalgie [1990 ‘American College of Rheumatology’ klassificatie-criteria; duur van de pijn = 87 (59-146) maand] om de hypothese te testen dat microglia hyperaktief zijn in patiënten met fibromyalgie.

Het is geweten dat extracellulair ATP als een neurotransmitter en/of neuromodulator funktioneert in het CZS en verscheidene fysiologische funkties van microglia moduleert [Illes P, Ribeiro JA. Molecular physiology of P2 receptors in the central nervous system. Eur J Pharmacol. (2004) 483: 5-17]. We rapporteerden eerder een verband tussen chronische pijn en ATP in dieren-modellen [zie Tsuda M et al. hierboven] en ATP bleek geïmpliceerd in het chronische pijn mechanisme [Milligan ED, Watkins LR. Pathological and protective roles of glia in chronic pain. Nat Rev Neurosci. (2009) 10: 23-36]. We vergeleken door ATP uitgelokte responsen in iMG-cellen van gezonde vrijwilligers en patiënten met fibromyalgie. De gen-expressie van TNF-α was significant hoger in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Daarnaast bleken de TNF-α proteïne-waarden ook significant hoger in het cultuur-supernatant van iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. In tegenstelling daarmee waren er geen statistisch significante verschillen qua gen-expressie van IL-1β. De proteïne-waarden van IL-1β waren echter significant hoger in het cultuur-supernatant van iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Daarnaast waren er geen significante verschillen tussen de 2 groepen qua secretie van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en IL-8, en van het anti-inflammatoir cytokine IL-10. Op basaal niveau lag de TNF-α gen-expressie significant lager in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Anderzijds waren er geen significante verschillen qua fagocytische aktiviteit, en gen-expressie van TNF-α en IL-1β tijdens fagocytose [in de hier gebruikte test nemen de cellen latex-parels (als ‘vreemd’ lichaam) op] tussen gezonde vrijwilligers en patiënten met fibromyalgie. Deze resultaten suggereren dat microglia van patiënten met fibromyalgie hyper-responsief zijn voor ATP-stimulatie, wat kan resulteren in verhoogde afgifte van TNF-α in het CZS.

We voerden verder correlationele analyses uit tussen TNF-α gen-expressie in ATP-gestimuleerde iMG-cellen en verscheidene klinische parameters, inclusief de pijn-graad. We vonden een matig positieve correlatie tussen TNF-α expressie en subjectieve pijn-intensiteit [Visuele Analoge Schaal; FM: 79,1 ± 18,2 vs. controle: 5,6 ± 8,8]. De pijn-intensiteit [FM: 7,2 ± 1,7 vs. controle: 0,5 ± 0,8] en pijn-interferentie [‘BPI Interference Scale’; bepaalt de mate waarop pijn interfereert met aktiviteiten, stemming en slaap; FM: 7,1 ± 2,3 vs. controle: 0,3 ± 0,8] waren ook matig positief gecorreleerd met de TNF-α expressie. Fibromyalgie is een ziekte die dikwijls co-morbide is met psychiatrische aandoeningen. In het bijzonder werd een verband tussen fibromyalgie en psychiatrische symptomen zoals depressie en angst gerapporteerd. Hier tonen we een matig positieve correlatie tussen TNF-α expressie en ernst van angst en depressie. In tegenstelling daarmee was IL-1β niet significant gecorreleerd met eender welke klinische score. Anderzijds werd een matig negatieve correlatie geobserveerd tussen TNF-α expressie en levenskwaliteit. Deze bevindingen suggereren de mogelijkheid dat de ernst van de subjectieve pijn, psychiatrische symptomen (depressie en angst) en levenskwaliteit bij patiënten met fibromyalgie gecontroleerd wordt door de waarden van microglia TNF-α. Inderdaad: studies met knaagdieren hebben getoond dat TNF-α een belangrijke factor bij neuropathische pijn is en we toonden eerder aan dat TNF-α pijn-gerelateerd gedrag opwekt wanneer het wordt toegediend in de hersenen van ratten. TNF-α wordt ook beschouwd als een belangrijke factor in psychiatrische aandoeningen zoals depressie. Daarnaast wordt gesuggereerd dat modulatie van microgliaal TNF-α één van de therapeutische doelwitten is bij psychiatrische aandoeningen [Kato TA et al. Neurotransmitters, psychotropic drugs and microglia: clinical implications for psychiatry. Current medicinal chemistry. (2013) 20: 331-344 /// Sato-Kasai M et al. Aripiprazole inhibits polyI: C-induced microglial activation possibly via TRPM7. Schizophr Res. (2016) 178: 35-43]. Fibromyalgie is dikwijls co-morbide met psychiatrische aandoeningen (in het bijzonder depressie) omwille van de gedeelde pathologische karakteristieken.

Dit is de eerste studie die abnormale aktivatie van microglia bij fibromyalgie op cellulair niveau bij mensen suggereert. De huidige gegevens geven een positief verband aan tussen microgliale abnormaliteiten en klinische symptomen van fibromyalgie. Interessant is dat iMG-cellen van fibromyalgie-patiënten hyper-responsiviteit voor extracellulair ATP en verhogingen qua pro-inflammatoir cytokine TNF-α vertonen. IL-1β is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine in het proces van microgliale aktivatie via inflammasoom-signalisering [inflammasomen = multi-proteïne molekulaire complexen die een brede waaier aan pathogenen ‘voelen’ en een rol spelen bij de inflammatoire respons]. In de huidige studie is de gen-expressie van IL-1β (mRNA) onveranderd, terwijl de proteïne-concentratie van IL-1β in het supernatant gestegen is. Deze gegevens suggereren dat microgliaal IL-1β geaktiveerd wordt in eerdere stadia vergeleken met TNF-α. Gelijkaardig met iMG-cellen was de TNF-α expressie versterkt door ATP-stimulatie in uit PBMC afgeleide macrofagen. Daarom zou ‘t kunnen dat de versterkte TNF-α expressie door iMG-cellen van patiënten door ATP misschien niet specifiek is voor iMG-cellen. Er dient verder onderzoek te worden uitgevoerd om de responsen op ATP tussen iMG-cellen en uit PBMC afgeleide macrofagen te vergelijken. Anderzijds werd gerapporteerd dat fractalkine ([chemokine] CX3CL1) betrokken is bij chronische pijn [zie ‘Systemische inflammatie & neuro-inflammatie bij fibromyalgie] alsook ATP. Het zou dus kunnen dat niet enkel ATP maar ook fractalkine iMG-cellen moduleren. Er zijn verdere studies nodig om op te helderen hoe fractalkine iMG-cellen moduleert bij patiënten met fibromyalgie. Daarnaast dient verdere research op te helderen of inflammasoom-gerelateerde molekulen zoals IL-18 en oppervlakte-expressie van HLA-DR, CD80 en CD86 worden gemoduleerd in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Van bijzonder belang is dat statistisch matige correlaties worden gezien tussen ATP-geïnduceerde TNF-α expressie en meerdere subjectieve parameters van pijn, depressie, angst en levenskwaliteit. Tot besluit: microgliaal TNF-α kan een mogelijke belangrijke modulerende factor zijn bij fibromyalgie en er is research nodig om een nieuw diagnostisch systeem en therapeutische strategieën aangaande fibromyalgie vast te stellen. We konden het oorzaak/effekt via het huidig studie-ontwerp niet bekrachtigen, dus zijn er prospectieve studies nodig. Bijvoorbeeld: het met verloop van tijd testen, bij verschillende pijn-gradaties in dezelfde patient, kan onthullen of iMG-analyse kan worden gebruikt als een instrument voor de beoordeling van de ernst van de pijn. We geloven dat de iMG-technolgie een nieuw licht werpt op de dynamische molekulaire pathologieën van microglia en op het ontwikkelen van objectieve meet-instrumenten bij een waaier van niet-organische [“zonder lichamelijke oorzaak”] hersen-ziekten [Jammer dat de auteurs deze gedateerde term gebruiken. Het verwijst naar “funktionele” of “psychogene” neurologische aandoeningen waarbij de neurologische symptomen te wijten zouden zijn aan een psychologische dysfunktie i.p.v. een onderliggend neurologisch probleem. Dit is voorbijgestreefd: de consensus is/zou moeten zijn dat non-organische aandoeningen niet onafhankelijk zijn van hersen-processen of brein-funktie.], en verdere studies zijn gerechtvaardigd.

januari 7, 2017

Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:37 am
Tags: , , , , , , , , ,

Samen met medewerkers van 5 Noorse ziekenhuizen brachten Oystein Fluge & Olav Mella – die de immunosuppressiva rituximab (en cyclofosfamide) test(t)en als mogelijke (momenteel nog preliminair/experimenteel; want niet bevestigd) behandeling bij M.E.(cvs) – het metabolisme van een behoorlijk grote groep patiënten (en gezonde controles) gedetailleerd in kaart. We geven het uitgebreid artikel hier zo compleet mogelijk weer om (mede-)patiënten zo goed mogelijk te informeren en het belang ervan te onderstrepen naar behandelaars/onderzoekers toe…

De researchers detekteerden specifieke biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. De waarden van bepaalde aminozuren waren gedaald. Het patroon gaf belangrijke informatie over de mechanismen die de symptomen veroorzaken en vooral over het energie-metabolisme bij de patiënten.

De reductie van de specifieke aminozuren werd voornamelijk gevonden bij vrouwen met M.E.(cvs). De verschillen bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten waren minder significant (vergeleken met gezonde mannen). De onderzoekers vonden echter dat de waarden van een bepaald aminozuur dat de afbraak van proteïnen in spierweefsel weerspiegelt gestegen waren bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten. Aangezien mannen meer spiermassa hebben dan vrouwen, zouden proteïnen van spierweefsel kunnen worden gebruikt als extra energie-reserve.

Onder normale omstandigheden gebruiken mensen koolhydraten, vetten (lipiden) en proteïnen (opgebouwd uit aminozuren) als energie-bronnen, in de katabole (afbraak-) processen in de mitochondrieën. Wanneer intense lichamelijke inspanning wordt gevergd, ontstaat een tekort aan zuurstof in de spier-mitochondrieën (anaërobe inspanning), zodat glucose wordt omgezet naar melkzuur (lactaat). Het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) speelt een belangrijke rol bij de regulering van de processen die zorgen voor de omzetting van koolhydraten naar energie. Onderstaande studie suggereert dat PDH geïnhibeerd (onderdrukt) is bij M.E.(cvs)-patiënten.

Als de aktiviteit van PDH verstoord is, kunnen de cellen reageren door het verbruik van alternatieve ‘brandstoffen’ te verhogen, wat de veranderingen in het aminozuren-profiel in het bloed bij M.E.(cvs) kan verklaren. Ondanks de pogingen tot compensatie van het lichaam, zou deze situatie het vermogen van de cellen om de metabole processen aan te passen (om een geschikt antwoord te bieden voor de steeds veranderende vereisten qua energie-produktie) kunnen compromitteren. Lichamelijke aktiviteit kan dan leiden tot een plots energie-gebrek in de spieren, samen met een accumulatie van melkzuur. Bij ernstig zieke M.E.(cvs)-patiënten kan dit worden gezien na een minimale belasting.

Na meting van de gen-expressie (mRNA) in witte bloedcellen (PBMCs) van een aantal factoren die PDH reguleren, vonden de onderzoekers dat meerdere belangrijke factoren die de werking van PDH remmen, verhoogd waren bij de M.E.(cvs)-patiënten. Deze veranderingen waren aanwezig bij de vrouwelijk en mannelijke patiënten. Dit geeft aan dat de PDH-inhibitie zelf optreedt bij de beide geslachten maar dat de effekten op het metabolisme geslacht-specifiiek kunnen zijn.

Het is zeer waarschijnlijk dat M.E.(cvs) ook regulatie-problemen in andere delen van het metabolisme (bv. het verwerken van vetten) omvat en dat wordt verder onderzocht. Er wordt ook onderzoek verricht om te begrijpen hoe een vermoedelijk defekte immuun-respons (Auto-immuniteit?) een inhibitie van het cellulair metabolisme zou kunnen veroorzaken (Welke auto-antilichamen hinderen welke signalisering-mechanismen?).

De resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van Robert Naviaux in de V.S., McGregor & Armstrong et. al. in Australië, Ruud Vermeulen in Nederland, Emi Yamano et al. in Japan en anderen… (zie links in de tekst) Lees ook ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Computer-model voor inspanning-intolerantie bij M.E.(cvs)’ & ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ alhier.

————————-

Journal of Clinical Investigation Vol. 1, #2 (december 2016)

Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome

Oystein Fluge (1), Olav Mella (1,2), Ove Bruland (1,3), Kristin Risa (1), Sissel E. Dyrstad (4), Kine Alme (1), Ingrid G. Rekeland (1), Dipak Sapkota (1), Gro V. Rosland (4), Alexander Fossa (5), Irini Ktoridou-Valen (1), Sigrid Lunde (1), Kari Sorland (1), Katarina Lien (6), Ingrid Herder (6), Hanne Thurmer (7), Merete E. Gotaas (8), Katarzyna A. Baranowska (8), Louis M.L.J. Bohnen (9), Christoph Schafer (9), Adrian McCann (10), Kristian Sommerfelt (11), Lars Helgeland (12), Per M. Ueland (2,10), Olav Dahl (1,2), Karl J. Tronstad (4)

1 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

2 Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

3 Department of Medical Genetics and Molecular Medicine, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

4 Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, Norway

5 Department of Oncology, Norwegian Radium Hospital, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

6 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 Telemark Hospital, Department of Medicine, Notodden, Norway

8 Department of Pain and Complex Disorders, St. Olav’s Hospital, Trondheim, Norway

9 Division of Rehabilitation Services, University Hospital of Northern Norway, Tromso, Norway

10 Bevital AS, Bergen, Norway

11 Department of Pediatrics Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

12 Department of Pathology, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

[Oystein Fluge & Olav Mella hebben mogelijks een belangen-conflict omwille van hun patenten m.b.t. de B-cel depletie bii M.E./CVS.]

Samenvatting

Myalgische Encefalopathie/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een uitputtende ziekte zonder gekende etiologie, met als kenmerkende symptomen post-exertionele malaise en een slecht herstel. Metabole dysfunktie is een plausibele bijdragende factor. We hypothiseerden dat wijzingen qua aminozuren in het serum specifieke defekten in het energie-metabolisme kunnen blootleggen bij M.E./CVS. Een analyse van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde individuen toonde een specifieke daling van de aminozuren die het oxidatief metabolisme via de TCA-cyclus voeden, voornamelijk bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. De concentratie in het serum van 3-methylhistidine, een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme, was significant gedaald bij mannelijke patiënten. Het aminozuren-patroon suggereerde een funktionele verstoring van pyruvaat-dehydrogenase (PDH), wat werd ondersteund door verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende PDH-kinasen 1, 2 & 4; sirtuine-4 en PPARδ in perifeer bloed mononucleaire cellen [PBMCs] bij beide geslachten. Myoblasten opgekweekt in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertoonden metabole aanpassingen, inclusief verhoogde mitochondriale ademhaling en overmatige lactaat-sekretie. De aminozuren-veranderingen konden niet worden verklaard door symptoom-ernst, ziekte-duur, leeftijd, BMI of niveau van fysieke aktivteit. Deze bevindingen zijn in overéénstemming met de manier waar op de ziekte zich klinisch presenteert: met inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie en excessieve lactaat-produktie bij inspanning.

Inleiding

[…] Research suggereert dat M.E./CVS gepaard gaat met wijzigingen in fundamentele processen van het energie-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531 /// Filler K et al. Association of Mitochondrial Dysfunction and Fatigue: A Review of the Literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]. Dergelijke metabole veranderingen kunnen ontstaan door ontregelde fysiologische respons-mechanismen (immuun-aktivatie, inflammatie en receptor-gemedieerde signalisering) [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: 1]. Er zijn echter geen consistente gegevens die een gemeenschappelijk metabool defekt aangeven die de symptomen van deze patiënten zouden kunnen verklaren. […]

[…] Observaties suggereren dat de systemische inspanning-intolerantie bij M.E./CVS, minstens gedeeltelijk, een omschakeling naar anaërobe glycolyse, waarbij lactaat wordt gegenereerd bij een significant lagere belasting dan bij gezonde mensen, zou kunnen inhouden. Er werden verhoogde lactaat-waarden gevonden in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Murrough JW et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome measured by 1H MRS imaging at 3.0 T. NMR Biomed. (2010) 23: 643-650 /// Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed. (2012) 25: 1073-1087; zie ook ‘Lactaat in Ventriculair Cerebrospinaal Vocht is verhoogd bij CVS]. Het vinden van defekten in glucose-gebruik en lactaat-produktie is echter niet evident op basis van routine bloed-analyses, wellicht omdat de afname gebeurt in rust zonder voorafgaande lichamelijke inspanning.

Er werden wijzigingen qua serum- (of plasma-) concentraties van bepaalde aminozuren gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten. Een studie over aminozuren in het serum […] toonde significant lagere waarden glutamine & ornithine, wijzend op een mogelijke stoornis in het aminozuren- en stikstof-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al.; zie hierboven]. Dezelfde onderzoekers vonden significant gedaalde serum-waarden voor glutamaat & fenylalanine [vrouwelijke M.E./CVS-patiënten] en ze stelden voor dat verminderde glucose-oxidatie leidt tot toegenomen gebruik van aminozuren als substraat in de TCA-cyclus [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics. (2015) 11: 1626-1639]. In een andere studie werden significante dalingen voor meerdere aminozuren en metabolieten gezien in de urine van M.E./CVS-patiënten [Niblett SH et al. Hematologic and urinary excretion anomalies in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Exp Biol Med (2007) 232: 1041-1049]. Deze gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een metabool defekt maar de specifieke oorzaak werd nog niet geïdentificeerd.

De anaërobe drempel en herstel-tijd na inspanning hangen af van de hoeveelheid geproduceerd lactaat en de opruiming ervan. Lactaat wordt gemaakt uit pyruvaat, hoofdzakelijk door glucose-katabolisme via glycolyse, of de afbraak van bepaalde aminozuren. Onder normale aërobe omstandigheden wordt pyruvaat getransporteerd naar de mitochondrieën waar het wordt omgezet naar acetyl-CoA d.m.v. het pyruvaat-dehydrogenase (PDH) complex. Daarnaast wordt acetyl-CoA geproduceerd zonder tussenkomst van PDH, via degradatie van vetzuren en ketogene aminozuren [die kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA]. Het gevormd acetyl-CoA wordt verder geoxideerd in de TCA-cyclus en dient als brandstof voor de mitochondriale ademhaling en aanmaak van adenosine-trifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylatie. Onder anaërobe omstandigheden, wanneer tekort aan zuurstof mitochondriale ademhaling verhindert, stapelt het pyruvaat zich op in het cytosol, wat leidt tot verhoogde aanmaak en cellulaire excretie van lactaat. Mitochondriale dysfunktie leidt tot overmatige lactaat-produktie én een gebrekkige toevoer van ATP, en werd gesuggereerd een rol te spelen bij M.E./CVS [werk door Myhill]. PDH werkt als een toegangsweg in het oxidatief metabolisme door het coördineren van de afbraak van energie-substraten afgeleid van koolhydraten, vetten en aminozuren. Een daling qua PDH enzymatische aktiviteit kan leiden to accumulatie van pyruvaat en daardoor over-produktie van lactaat, zelfs in aanwezigheid van toereikende zuurstof. De PDH-aktiviteit wordt verder gecontroleerd door PDH-kinasen (PDKs) die de PDH enzyme-aktiviteit remmen via fosforylatie [verbinding met een fosfaat-groep; dergelijke enzymatische reaktie speelt dikwijls een rol bij signaal-overdracht], en PDH-fosfatasen die defosforylatie katalyseren. Sirtuine-4 (SIRT4) werd geïdentificeerd als een mitochondriaal lipoamidase [enzyme] dat de PDH-aktiviteit inhibeert [sirtuinen zijn NAD+-afhankelijke enzymen betrokken bij gen-regulering en het metabolisme]. PDK1-PDK4 worden gereguleerd op transcriptie-niveau via signalisering-aanwijzingen waarbij factoren zoals AMP-afhankelijk proteïne kinase (AMPK [zie link in de ‘Bespreking’]), PPARs [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren; groep van receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] en HIF1 [hypoxie-induceerbare factoren zijn transcriptie-factoren die reageren op dalingen van de beschikbare zuurstof in het cellulair milieu] betrokken zijn. Er werd een mogelijke rol van een verstoorde werking van PDH en abnormale AMPK-aktivatie bij M.E./CVS voorgesteld [Rutherford G, Manning P, Newton JL. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) 2497348].

Samengevat: eerdere bevindingen ondersteunen dat ontregeling van PDH en veranderingen qua aminozuren in het serum betrokken kunnen zijn bij het pathomechanisme voor M.E./CVS. Onze hypothese was dat M.E./CVS geassocieerd is met een defekt oxidatief metabolisme waarbij PDH betrokken is, leidend tot verhoogd gebruik van ketogene aminozuren om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien. Om deze hypothese te controleren, bestudeerden we de concentraties van aminozuren in serum-stalen van 200 M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de ‘Canadian consensus criteria’ en 102 gezonde controles. Om mogelijke ziekte-mechanismen na te gaan, hebben we de mRNA-expressie van relevante genen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles gemeten. We stelden gecultiveerde spiercellen bloot aan serum van M.E./CVS-patiënten om te bepalen of bestanddelen in het bloed het cellulair energie-metabolisme kunnen beïnvloeden.

Methodes

ME/CVS-patiënten en gezonde controles. Alle deelnemende patiënten voldeden aan de Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. […] 162 vrouwen [gemiddeld 37,8 jaar oud] en 38 mannen [gemiddeld 36,3 jaar oud]. BMI (kg/m2) gemiddeld 24,9 voor de vrouwelijke & 25,0 voor de mannelijke patiënten. Controles (bloed-donoren en medisch personeel): 67 vrouwen [gemiddeld 34,5 jaar oud] en 35 mannen [gemiddeld 36,2 jaar oud] […].

Van de 200 M.E./CVS-patiënten waren er 47 die overnacht vastten voor de bloed-afname en 153 die dat niet deden. Alle 102 gezonde controles vastten niet. We vergeleken de serum-concentraties van alle aminozuren, van overnacht-vastende en niet-vastende patiënten, per geslacht. […]

Metabolieten-analyse. De 20 standaard aminozuren werden geanalyseerd d.m.v. gas-chromatografie & massa-spectrometrie […] Arg, hArg, ADMA, SDMA, 1-Mhis & 3-MHis d.m.v. vloeistof- chromatografie & massa-spectrometrie […]. […]

Kwantitatieve RT-PCR. Alle M.E./CVS-patiënten en gezonde controles in de gen-expressie studie waren niet-vastend. […] Beoordeling van PDK1, PDK2, PDK3, PDK4, PPARA, PPARD, PPARG, PDHA, MPC1, MPC2, ACOX1, HIF1A & SIRT4 mRNAs van 75 M.E./CVS-patiënten en 43 gezonde controles. […]

Cel-cultuur. […] Om te onderzoeken of blootstelling aan serum van M.E./CVS-patiënten het energie-metabolism in gecultiveerde myoblasten [voorlopers van spier-cellen] beïnvloedde […]. De experimenten werden geblindeerd uitgevoerd wat betreft de groepen (M.E./CVS of gezonde controle).

Cellulair metabolisme. OCR [zuurstof-verbruik] & ECAR [extracellulaire verzuring] [zie ‘Resultaten’] werden gemeten om, respectievelijk, de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie (glycolyse) te beoordelen. […] OCR & ECAR werden gedurende het experiment (waarbij sequentieel specifieke metabole modulatoren werden toegediend) simultaan opgenomen. […] De volgende cellulaire energetische omstandigheden werden gedefinieerd. Conditie-I “Rustend (alleen aminozuren)” (cellen heb enkel energie nodig voor basale fysiologische vereisten.): enkel aminozuren (niet Gln) als energie-substraten toegediend in het test-medium. Conditie-II “Rustend (aminozuren & glucose)”: cellen krijgen glucose (maar nog steeds in rust aangezien de vraag naar ATP onveranderd is). Conditie-III “Anaërobe belasting”: ATP-synthase geïnhibeerd d.m.v. oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme geen ATP meer kan aanmaken] (cellen vertrouwen op glycolytische ATP-produktie; gelijkaardig aan het anaëroob energie-metabolisme, waarbij de mitochondriale ATP-produktie geïnhibeerd is door zuurstof-depletie). Hier wordt de maximale glycolytische capaciteit gemeten. Deze OCR wordt ‘leak activity’ [‘lek-aktiviteit’] genoemd aangezien het niet is gelinkt aan ATP-produktie via oxidatieve fosforylatie. Een lage ‘leak’-ademhaling betekent dat de integriteit van het mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem intact is. Conditie-IV “Aërobe belasting”: toevoeging van CCCP [carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone; chemische inhibitor van de oxidatieve fosforylatie, vernietigt het mitochondriaal membraan-potentiaal] liet het inhiberend effekt van oligomycine op het mitochondriaal zuurstof-verbruik los […]. Dit weerspiegelt een situatie van ernstige energie-depletie (mitochondriale ademhaling en glycolyse maximaal). […] Tenslotte werden rotenon [blokkeert NADH-dehydrogenase (complex-I) en zodoende de respiratoire keten] & antimycine-A [blokkeert complex-III en zodoende de respiratoire ademahaling] toegediend om (respectievelijk) respiratoir complex-I & -III te inhiberen, en zo de niet-mitochondriale zuurstof-consumptie te bepalen […].

Statistiek. […]

De studie is exploratief en hypothese-genererend […]. […]

Studie-goedkeuring. […]

Resultaten

Serum-concentraties van de 20 standaard aminozuren […]. De initiële analyses toonden een duidelijk patroon bij vergelijking van aminozuren met verschillende startpunten voor oxidatie via de mitochondriale pyruvaat/TCA-cyclus as. Daarom werden de aminozuren onderverdeeld in 3 categorieën […]:

Categorie-I aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat en daarom afhankelijk van PDH zijn voor verdere oxidiatie: alanine (Ala), cysteïne (Cys), glycine (Gly), serine (Ser) & threonine (Thr).

Categorie-II aminozuren treden het oxidatie-mechanisme binnen als acetyl-CoA, dat direct en onafhankelijk van PDH de TCA-cyclus voedt […]: isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenylalanine (Phe), tryptofaan (Trp) & tyrosine (Tyr).

Categorie-III bestaat uit anaplerotische aminozuren [anaplerotische reakties zijn er waar tussenprodukten van een metabool mechanisme worden gevormd; simpel uitgedrukt: “ze vullen de voorraden aan”] die worden omgezet naar TCA-cyclus intermediairen (en zo de metabole capaciteit van de cyclus aanvullen en ondersteunen): enkel aminozuren die niet tot categorieën-I of -II behoren; methionine (Met) & valine (Val) […]; histidine (His), glutamine (Gln), glutamaat/glutaminezuur (Glu), (Gln + Glu = Glx) & proline (Pro) […] en asparagine (Asn) & aspartaat/asparaginezuur (Asp), (Asn + Asp = Asx) […]. […]

Deze klassificatie is een vereenvoudigd model. Verscheidene aminozuren kunnen meerdere afbraak-mechanismen hebben afhankelijk van de fysiologische context. De aminozuren in categorie-I & -III zijn uitsluitend glucogeen [kunnen worden omgezet tot glucose], terwijl die in categorie-II ketogeen [kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA] zijn of beide. […]

Aminozuren die voorzien in pyruvaat als substraat voor PDH (categorie-I). Er waren geen significante verschillen qua gemiddelde serum-waarden voor categorie-I aminozuren (Cys, Gly, Ser, Thr) tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles, uitgezonderd voor Ala (kleine maar statistisch significante daling bij de patiënten; P = 0.027). Er waren geen verschillen voor Gly & Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. vrouwelijke controles maar geringe dalingen voor Ser & Thr (telkens P = 0.010). Bij de mannen waren er geen verschillen voor deze aminozuren (M.E./CVS-patiënten versus controles). De som van de serum-concentraties van deze 4 categorie-I aminozuren (zonder Ala) verschilde niet tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles (ook niet per geslacht).

Aminozuren die zorgen voor acetyl-CoA toevoer in de TCA-cyclus (categorie-II). Alle 6 aminozuren in categorie-II waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde (P-waarden < 0.001 voor Ile, Leu, Phe & Tyr; 0.001 & 0.009 voor Lys & Trp). De dalingen waren zeer significant bij vrouwen met M.E./CVS (t.o.v. gezonde vrouwen) […]. Vergelijking van mannelijke M.E./CVS-patiënten met mannelijke controles toonde geen significante verschillen […] (trend tot vermindering voor Tyr; P = 0.086). De som van de serum-concentraties van de 6 categorie-II aminozuren was significant lager voor M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (ook bij vrouwen maar niet bij mannen). […]

Anaplerotische aminozuren (categorie-III). De gemiddelde serum-waarden voor anaplerotische (categorie-III) aminozuren waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles […]. […]  De dalingen qua anaplerotische aminozuren werden vastgesteld bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten maar niet bij mannen, t.o.v. controles. De som van de serum-concentraties van de anaplerotische aminozuren was gedaald voor de ganse groep M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. […]

Vergelijking tussen niet-vastende en vastende M.E./CVS-patiënten. […] De serum-concentraties waren lager bij overnacht-vastende patiënten voor categorie-II aminozuren Ile, Phe, Trp & Tyr, naast Ala. Er waren trends voor lagere gemiddelde serum-waarden voor Pro, Met & Arg in serum van overnacht-vastende patiënten maar geen verschillen voor de andere aminozuren of metabolieten.

Andere gemodificeerde aminozuren. Op basis van een studie die endotheliale dysfunktie [endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten] bij M.E./CVS-patiënten aantoonde [Newton DJ et al; zie ‘Bespreking’], beslisten we serum-concentraties te meten van aminozuren en afgeleiden waarvan is geweten dat ze de endotheliale funktie beïnvloeden. Arginine, asymmetrisch dimethylarginine (ADMA) en homo-arginine (hArg) vertoonden gelijkaardige serum-waarden tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen én mannen). Voor symmetrisch dimethylarginine (SDMA) was er een significant gedaald gemiddelde serum-waarde bij vrouwen met M.E./CVS maar niet bij mannen, vergeleken met controles. Voor 1-methylhistidine (1-MHis), een merker voor inname van (voornamelijk dierlijke) proteïnen, was er geen verschil tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen noch mannen). De concentraties van 3-methylhistidine (3-MHis), een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme (bv. spier-atrofie), waren significant hoger bij met M.E./CVS t.o.v. gezonde mannen (P = 0.003), terwijl er geen verschil qua 3-MHis was voor vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde vrouwen.

Aminozuren en hun verband met andere karakteristieken van M.E./CVS-patiënten. Bij de niet-vastende vrouwen met M.E./CVS werden zeer significante correlaties gevonden voor alle combinaties met de categorie-II aminozuren (Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr) (P < 0.001). Bij de mannelijke M.E./CVS-patiënten werden gelijkaardige correlatie-patronen gezien. In tegenstelling daarmee vonden we minder en zwakkere correlaties met categorie-I & categorie-II aminozuren. Er waren voor Thr echter meerdere uitgesproken correlaties met categorie-II aminozuren; mogelijks een weerspiegeling van het feit dat er alternatieve oxidatie-paden (zonder omzetting naar pyruvaat) zijn voor Thr. Verder waren er zeer significante correlaties voor alle combinaties met de categorie-II en -III aminozuren maar minder significante correlaties met de categorie-I en -III aminozuren.

Geslacht bleek een belangrijke factor bij de interpretatie van de resultaten: er waren significante dalingen voor gemiddelde serum-waarden van categorie-II en -III aminozuren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Om de mogelijkheid te evalueren dat de geobserveerde veranderingen qua aminozuur-patronen veroorzaakt zouden kunnen zijn door andere verstorende factoren, voerden we statistische analyses uit om aminozuur-waarden in het serum te vergelijken met klinische variabelen (leeftijd, BMI, lichamelijke aktiviteit, M.E./CVS-ernst en ziekte-duur). Hogere leeftijd correleerde significant met verhoogde waarden voor Cys, Gly, Ile, Leu, Lys & Tyr bij vrouwen met M.E./CVS maar bij M.E./CVS-mannen enkel met Cys. Er waren geen significante correlaties tussen serum-waarden van aminozuren en fysieke aktiviteit (aantal elektronisch geregistreerde stappen per 24 uur) bij de M.E./CVS-groep, uitgezonderd een significante negatieve correlatie met Cys bij vrouwen. Bij de M.E./CVS-vrouwen waren er significante positieve correlaties tussen BMI en Cys, Ile, Leu, Phe & Tyr, en significante negatieve correlaties tussen BMI en Ser & Thr. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat verschillen qua BMI verantwoordelijk zouden zijn voor de vastgestelde verschillen in aminozuur-waarden in het serum bij vrouwen met M.E./CVS, werden de patiënten onderverdeeld in 4 BMI-groepen (ondergewicht tot obees). Bij vergelijking bleken er significante verbanden tussen hogere BMI en hogere serum-waarden van de categorie-II aminozuren Leu, Phe, Tyr & Ile. Bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten waren in alle BMI-groepen (ook de obese) de gemiddelde serum-waarden van deze aminozuren echter lager dan bij gezonde vrouwen. Bij de mannen met M.E./CVS werden geen significante verbanden gezien tussen BMI-groepen en aminozuren van categorie-I of -II, uitgezonderd een significante positieve associatie tussen Cys en BMI. […]

Verder werden de patiënten ook onderverdeeld in groepen volgens ziekte-ernst, ziekte-duur, lichamelijke aktiviteit en leven-kwaliteit. De serum-waarden van categorie-I of categorie-II aminozuren waren niet geassocieerd met M.E./CVS-ernst. Er werd een significant positief verband gevonden tussen ziekte-duur en serum-waarden van aminozuren enkel voor Phe bij vrouwelijke patiënten. Er waren geen significante associaties tussen gemiddelde aminozuur-waarden (categorie-I & -II) en fysieke aktiviteit, uitgezonderd een negatief verband met Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren significante associaties tussen hogere ADMA-waarden en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.036) en tussen hoger 1-MHis en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.024) bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (een trend bij mannelijke patiënten; P = 0.086). […] Er was een significant verband tussen een hogere “SF36mean5” score [leven-kwaliteit] en een hogere gemiddelde serum-waarde van het categorie-I aminozuur Ser (P = 0.023); er waren trends voor Gly (P = 0.056) en Thr (P = 0.065) maar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten.

PDH-gerelateerde gen-expressie (mRNA) in PBMCs. Om te onderzoeken of de effekten op de aminozuren-profiel in het serum bij M.E./CVS-patiënten kan worden verklaard door veranderingen qua PDH-funktie, vergeleken we mRNA-waarden van PDH-gerelateerde genen in PBMCs van niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles. We vonden significant verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende kinasen PDK1 (P = 0.002), PDK2 (P = 0.022) & PDK4 (P = 0.006) bij M.E./CVS-patiënten, terwijl PDK3 onveranderd bleef. Ook het mitochondriaal lipoamidase en PDH-inhibitor SIRT4 was significant ge-upreguleerd (P = 0.013). Bij de PPAR transcriptie-factoren was PPARδ (PPARD) ge-upreguleerd (P = 0.001). Er waren geen verschillen voor PPARα (PPARA), het PPAR transcriptioneel doelwit en peroxisomaal vetzuur β-oxidatie enzyme acyl-coenzyme-A oxidase 1 (ACOX1) of de transcriptie-factor HIF1α (HIF1A). Pyruvaat-dehydrogenase-E1α (PDHA) mRNA was lichtjes ge-upreguleerd (P = 0.037). De expressie van PPARγ (PPARG) mRNA lag onder de detektie-limiet van de analyse. Analyses van de mitochondriale pyruvaat-dragers (MPCs [mediëren de opname van pyruvaat in de mitochondrieën]) onthulden een nipt-significante upregulering van MPC1 (P = 0.046) maar MPC2 verschilde niet.

Hoewel er geslacht-specifieke verschillen werden vastgesteld qua gemiddelde serum-waarden van aminozuren bij M.E./CVS-patiënten, waren de gestegen mRNA-waarden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten versus gezonde controles gelijkaardig bij mannen en vrouwen wat betreft PDK1, PDK4, PPARA, PPARD & SIRT4.

Wat betreft PDK1 gen-expressie waren er significante verbanden met ziekte-ernst (gestegen PDK1 mRNA in matige/ernstige versus milde/mild-matige groepen), met ziekte-duur (gestegen PDK1 mRNA bij langere duur) en met lichamelijke aktiviteit […] (gestegen PDK1 mRNA bij lagere aktiviteit). De associaties werden niet gevonden voor PDK4 mRNA, PPARA, PPARD of SIRT4.

De mRNA-expressie van PDK1 correleerde sterk met PPARD (P < 0.0001), met SIRT4 (P = 0.003) en zwak, maar significant, met PPARA (P = 0.028). Er was geen significante correlatie tussen PDK1 & PDK4 (P = 0.12). Verder waren er zeer significante correlaties tussen SIRT4 & PPARD (P < 0.0001), en SIRT4 & PPARA (P < 0.0001) maar geen significante correlatie tussen SIRT4 & PDK4 (P = 0.15). Deze gegevens werden onderbouwd met een zeer significante correlatie tussen PPARA & PPARD mRNA (P < 0.0001). Voor expressie van PDK1, PDK4, PPARA of waren er geen significante correlaties met leeftijd of BMI. Bij de 75 niet-vastende M.E./CVS-patiënten waren er geen significante correlaties tussen serum-waarden van categorie-I of -II aminozuren en mRNA-expressie van PDKs, SIRT4, PPARA of PPARD.

Effekten van M.E./CVS-patiënten serum op de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie in gecultiveerde skeletspier-cellen. Bij de verklaring van de kenmerkende M.E./CVS-symptomen (post-exertionele malaise en slecht herstel) zou men relevante metabole defekten in skeletspier-cellen kunnen verwachten. We konden het energie-metabolisme in het spier-weefsel van onze patiënten niet op een directe manier meten. Om de invloed van mogelijke substanties in het bloed op M.E./CVS te bestuderen, onderzochten we het energie-metabolisme in gecultiveerde menselijke skeletspier-cellen blootgesteld aan serum van 12 M.E./CVS-patiënten (waaronder 3 patienten met zeer ernstige ziekte en 6 met ernstige M.E./CVS) en 12 gezonde controles. Deze studie was ontworpen voor het beoordelen van de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie via het meten van (respectievelijk) het zuurstof-verbruik (‘oxygen-consumption rate’, OCR) en extracellulaire verzuring (‘extracellular acidification rate’, ECAR), in aanwezigheid van aminozuren en glucose als substraten. […]

Basale (in rust) aminozuren-gedreven mitochondriale ademhaling (conditie-I) was matig verhoogd in spiercellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum voor 6 dagen en dit effect was ook aanwezig wanneer glucose werd toegevoegd (conditie-II). Daaropvolgende toediening van de ATP-synthase inhibitor oligomycine (conditie-III) toonde aan dat bijna alle respiratoire aktiviteit gelinkt was met ATP-produktie; wat bevestigt dat de integriteit van het oxidatieve fosforylatie systeem intact was. Er was echter een minieme toename qua overgebleven OCR (‘lek-aktiviteit’). Daarna werd via toediening van de ‘ontkoppeler’ carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone [CCCP; ontkoppelt het elektron-transport-systeem van de ATP-produktie] een significant toegenomen respiratoire capaciteit (conditie-IV) onthuld. De gegevens gaven ook aan dat de ATP-gelinkte ademhaling (verschil conditie-II/-III) en de reserve respiratoire capaciteit (verschil conditie-IV/-II) verhoogd waren na blootstelling aan M.E./CVS-serum.

De basale glycolyse (conditie-II) was gelijkaardig tussen cellen blootgesteld aan M.E./CVS- en controle-serum. […] De maximum glycolyse in aanwezigheid van oligomycine neigde lichtjes verhoogd te zijn in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum (conditie-III) en deze trend was ook aanwezig na toediening van CCCP. Verdere analyse onthulde dat de lactaat-productie veroorzaakt door oligomycine (verschil conditie-III/-II) en door CCCP (verschil conditie-IV/-II) significant verhoogd waren in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum versus controle. Daarom: de cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum vertonen een metabole wijziging waarbij versterkte lactaat-produktie is betrokken bij energetische belasting.

Samengevat: serum van patiënten met ernstige M.E./CVS bleek het mitochondriaal oxidatief metabolisme en de ademhaling in spiercellen te doen stijgen, bijzonderlijk bij energetische belasting. Bijkomende experimenten met kortere blootstelling toonden dat het effekt van M.E./CVS-serum op de mitochondriale ademhaling geleidelijk aan verhoogde afhankelijk van de duur van de blootstelling.

Bespreking

Deze studie vond dat het serum aminozuren-profiel veranderd was in een grote en goed-gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten, op een manier die verstoorde mitochondriale pyruvaat-oxidatie suggereert. Deze bevinding wijst, in combinatie met verhoogde mRNA-expressie van PDK1, PDK2 & PDK4 en SIRT4, in PBMCs van patiënten, op abnormaliteiten qua PDH-regulering als een potentiële belangrijke factor bij de pathogenese van M.E./CVS. Blootstelling van gecultiveerde spiercellen aan serum van M.E./CVS-patiënten wees op de aanwezigheid van bloed-bestanddelen die het energie-metabolisme beïnvloeden.

Analyse van het serum van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde controles onthulde dat de concentraties van aminozuren die deelnemen aan het mitochondriaal oxidatief metabolisme op het niveau van acetyl-CoA (categorie-II) significant gedaald waren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee waren er geen grote wijzigingen qua aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat (categorie-I). [lees: “de pyruvaat-produktie zelf is in orde”] M.E./CVS lijkt zodoende een specifieke daling te veroorzaken van energetische substraten die worden geoxideerd downstream van PDH [“na de aanmaak van pyruvaat”]. Dit suggereert dat het pyruvaat-katabolisme wordt belemmerd bij M.E./CVS-patiënten [m.a.w. wellicht ligt het probleem bij het PDH enzyme-complex dat pyruvaat omzet naar acetyl-CoA], leidend tot verhoogd gebruik van acetyl-CoA producerende aminozuren als alternatieve substraten die het aëroob metabolisme via de TCA-cyclus van brandstof voorzien. De anaplerotische aminozuren, die dienen om de capaciteit van de TCA-cyclus op peil te houden (categorie-III), waren gedaald bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen komen overéén met eerdere rapporten [door Armstrong et al.] over dalingen qua Gln, Glu & Phe […]. Interessant: een studie bij M.E./CVS-patiënten vond veranderingen qua aminozuren-concentraties in urine die consistent zijn met het specifiek aminozuren-patroon dat we vonden in serum, en een gedaalde urinaire excretie van de TCA-cyclus intermediairen barnsteenzuur [succinaat] en citroenzuur [citraat] werd ook gerapporteerd [zie Niblett SH et al. hierboven]. Een metaboloom-studie rapporteerde gedaalde concentraties TCA-cyclus intermediairen, samen met een gedaalde pyruvaat/isocitraat verhouding, in plasma bij M.E./CVS [Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990]. Dit ondersteunt verder de hypothese dat het bevoorraden van de TCA-cyclus met pyruvaat belemmerd is bij M.E./CVS-patiënten, wat in lijn is met de gesuggereerde PDH-inhibitie.

We vonden significante mRNA-upregulering van of PDK1, PDK2 en PDK4 in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. De expressie van PDK1 mRNA was geassocieerd met klinische kenmerken zoals langere ziekte-duur, ernstiger M.E./CVS en verminderde lichamelijke aktiviteit. De werking van de PDKs is het inhiberen van PDH via fosforylatie onder omstandigheden waar pyruvaat-oxidatie moet worden onderdrukt (bv. uithongering). Een afwijkende toename qua PDK-expressie kan daarom een verstoorde PDH-funktie bij M.E./CVS veroorzaken, mogelijks via aktiviteit van transcriptie-factoren. PPARD mRNA was significant ge-upreguleerd in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, terwijl PPARA niet verschilde van gezonde controles. Er was echter een positieve correlatie tussen de expressie van PDK1 en allebei deze PPARs. Zelfs als expressie van het PPAR target-gen ACOX1 [codeert voor het enzyme peroxisomaal acyl-coenzyme-A oxidase-1 van het vetzuren beta-oxidatie pad] gelijkaardig was bij M.E./CVS-patiënten en controles, kan niet worden uitgesloten dat de PPARs bijdragen tot de regulering van PDKs op een bepaald stadium van de ontwikkeling van de ziekte. Het mitochondriaal enzyme SIRT4 bleek PDH-aktiviteit te inhiberen via hydrolyse van een component van het PDH-complex. We vonden dat SIRT4 mRNA-expressie ge-upreguleerd was in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en significant correleerde met mRNA-expressie van PDK1, PPARA & PPARD. Dit suggereert dat PDH-aktiviteit geïnhibeerd is door gecoördineerde regulerende mechanismen bij deze patiënten. Er was een kleine maar significante toename in PBMC mRNA-expressie van MPC1 maar niet van MPC2. Deze MPCs [zie hierboven] bleken belangrijke rollen te spelen in het mitochondriaal oxidatief metabolisme. De geringe upregulering van MPC1 en van PDH-E1α (PDHA [Het PDH-complex bestaat uit meerdere copieën van 3 enzymatische componenten: pyruvaat-dehydrogenase (E1), dihydrolipoamide-acetyltransferase (E2) & lipoamide-dehydrogenase (E3); E1 enzyme bestaat uit 2 alfa- & 2 beta- subunits.]) mRNAs zou compenserende mechanismen kunnen weerspiegelen die de pyruvaat-accumulatie (te wijten aan gedaalde PDH-aktiviteit) tegenwerken.

De oxidatie-paden van pyruvaat en aminozuren zijn nauw verbonden met de vetzuur-oxidatie machinerie, samenkomend op het niveau van acetyl-CoA in het mitochondriaal compartment. Er zou kunnen worden verwacht dat bij een adaptieve respons op een toestand van lage energie (veroorzaakt door een beperkte acetyl-CoA bevoorrading) meerdere signalisering-factoren betrokken zijn om de energie-homeostase te redden. Dergelijke signalisering-factoren omvatten AMPK, PPARs & HIF1, die context-afhankelijke regulering van vele metabole mechanismen mediëren. Het uibreiden van onze kennis omtrent de relatieve bijdragen van specifieke katabole paden tot de pathogenese van M.E./CVS zal belangrijk zijn om de ontwikkeling van biomerkers en behandelingen te vergemakkelijken.

Er zou kunnen worden verwacht dat de PDH-inhibitie bij M.E./CVS die hier wordt gesuggereerd, met compenserend gebruik van aminozuren als substraten voor TCA-oxidatie, ook de mitochondriale vetzuur β-oxidatie beïnvloedt in een poging om de energie-homeostase te redden. Een studie beoordeelde 612 metaboliteten bij 45 M.E./CVS-patiënten en 39 gezonde controles, en rapporteerde meerdere abnormaliteiten in verscheidene mechanismen betrokken bij het lipiden-metabolisme en het mitochondriaal energie-metabolisme [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480]. De meest prominente veranderingen bij M.E./CVS-patiënten waren uitgebreide dalingen qua sfingolipiden, glycosfingolipiden en fosfolipiden. Deze bevindingen waren consistent met een lagere ATP- en GTP-turnover, en met dalingen qua metabole intermediairen van vertakte aminozuren. Er waren echter ook indicaties voor een gereduceerde mitochondriale vetzuur-oxidatie, mar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Voegen we daarbij de PDH-inhibitie, dan zou verminderde mitochondriale vetzuur-oxidatie mogelijkerwijs de toevoer van acetyl-CoA verder compromitteren en zodoende de afhankelijkheid van categorie-II aminozuren als alternatieve brandstof voor de TCA-cyclus verhogen, zoals aangetoond in onze studie.

Geslacht-specifieke verschillen betreffende veranderingen in serum aminozuren-patronen waren duidelijk bij onze M.E./CVS-patiënten. Terwijl all 6 de aminozuren die kunnen worden omgezet naar acetyl-CoA significant waren gedaald bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (t.o.v. gezonde vrouwen), vertoonden mannelijke M.E./CVS-patiënten geringe en niet-significante dalingen van Tyr & Phe. Omwille van het relatief laag aantal mannelijke M.E./CVS-patiënten en mannelijke gezonde controles in de studie, was de statistische ‘power’ om een verschil te detekteren lager. De effekt-groottes waren echter groter bij vrouwen. Daarnaast werden bij de 124 niet-vastende vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 67 gezonde vrouwen afzonderlijke analyses uitgevoerd (2 niet-overlappende willekeurige groepen van 33 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 33 gezonde vrouwen) die dezelfde patronen aantoonden, met een significante daling van de som van de serum-concentraties van zowel categorie-II als categorie-III aminozuren bij vrouwen met M.E./CVS. Dit is een argument voor een differentieel en geslacht-specifiek gebruik van aminozuren. Een eerdere studie rapporteerde een significant verhoogde urinaire excretie van 3-Mhis (een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme) in een groep van 100 M.E./CVS-patiënten (waaronder 73 vrouwen) [zie Niblett SH et al.; hierboven]. Wanneer we echter serum 3-MHis per geslacht analyseerden, vonden we enkel bij mannelijke M.E./CVS-patiënten een verhoging. Dit suggereert dat mannen, meer dan vrouwen, endogeen proteïnen-katabolisme [eiwit-afbraak/spier-atrofie] aanwenden om te voorzien in substraten voor de TCA-cyclus. Geslacht-specifieke verschillen qua metabolisme [compensatie-mechanismen anders bij vrouwen dan bij mannen] werden aangetoond en kunnen bij M.E./CVS-patiënten in werking zijn, waarbij vetzuren, aminozuren, oxidatieve fosforylatie en het steroïden-metabolisme betrokken zijn. In tegenstelling met de geslacht-specifieke effekten betreffende aminozuren, was de verhoogde expressie van PDKs & PPARD (mRNA in PBMCs) gelijkaardig bij vrouwen en mannen met M.E./CVS. Tesamen geeft dit aan dat het ziekte-veroorzakende mechanisme verschillende compenserende effekten triggert bij vrouwen en mannen. Een gemeenschappelijk effector-systeem voor het bestendigen van symptomen zou dus de PDK-PDH-lactaat as kunnen omvatten, met gedeeltelijk geslacht-specifieke compenserende (secundaire) effekten gerelateerd met aanpassingen in het energie-metabolisme.

Onze studies met gecultiveerde menselijke spiercellen geven aan dat blootstelling aan M.E./CVS-serum leidde tot verhoogde mitochondriale ademhaling, aaangedreven door aminozuren, alleen of in combinatie met glucose. Dit effekt was bijzonder duidelijk onder omstandigheden van energie-uitputting, wanneer de mitochondriale ademhaling aan een maximum werkt (conditie-IV). Hoewel de lactaat-produktie laag neigde te zijn in rust, was deze buitensporig geïnduceerd bij energetische belasting. Deze observaties zijn compatibel met een metabole belemmering op het niveau van PDH, met een verhoogde omzetting van pyruvaat naar lactaat tot gevolg, en versterkte vraag naar alternatieve substraten downstream van PDH. Het is denkbaar dat de effekten van een dergelijke PDH-ontregeling significant escaleren onder omstandigheden met een verhoogde metabole flux, in overéénstemming met de cel-studies die hier worden gerapporteerd. Er werden ondersteunende bevindingen aangetoond na uitschakeling van PDH in gecultiveerde spiercellen. Op basis van deze observaties lijkt er een substantie(s) aanwezig in serum van M.E./CVS-patiënten die een cellulaire respons induceert ter ondersteuning van de mitochondriale energie-produktie. In overéénstemming daarmee zou optimalisering van de mitochondriale ademhaling kunnen worden beschouwd als een beschermende respons om energie-depletie veroorzaakt door PDH-dysfunktie te vermijden. Het energetisch rendement van zo’n metabole adaptatie zal echter afhangen van de toevoer van energetische substraten als brandstof voor de mitochondriale ademhaling – die gelimiteerd blijkt bij M.E./CVS-patiënten. De huidige bevindingen suggereren dat de mitochondriale brandstof-voorziening gecompromiteerd is door verminderde flux via PDH, wat leidt tot over-consumptie van alternatieve substraten zoals aminozuren gelinkt met de TCA-cyclus. Er zijn bijkomende studies vereist om de substantie(s) in M.E./CVS-serum – die de effekten op gecultiveerde spiercellen mediëren, die direct op het metabool apparaat kunnen werken of indirect via signalisering-factoren – te identificeren.

Onze gegevens – die suggereren dat M.E./CVS geassocieerd is met verminderde efficiëntie van het energie-metabolisme gecombineerd met over-produktie van lactaat – kunnen verklaren waarom veel M.E./CVS-patiënten de anaërobe drempel bereiken bij een lage belasting [Vermeulen RC. Decreased oxygen extraction during cardiopulmonary exercise test in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2014) 12: 20 /// Snell CR, Stevens SR, Davenport TE, Van Ness JM. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys Ther. (2013) 93: 1484-1492 (lees ook ‘Dubbele fietstest’) /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J Transl Med. (2014) 12: 104]. Dit wordt ondersteund door een individueel patient-verslag [Vink M. The aerobic energy production and the lactate excretion are both impeded in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Neurol Neurobiol. (2015) 1: 4] en onze eigen observaties bij patiënten met ernstige M.E./CVS die lactaat-waarden van boven 8 mM [normaalwaarden bij volwassenen: 0,5-1,7 mM] hadden, enkel en alleen door 10 min rechtop staan. Aangezien M.E./CVS-patiënten normaal gezien geen verhoogde lactaat-waarden in rust vertonen, kan er worden gespeculeerd dat het metabolisme zich aanpast aan de vermoedelijke verstoorde PDH-werking door het verhogen van de oxidatie van acetyl-CoA opleverende aminozuren en misschien ook vetzuren. [zie piloot-studie van Hanson et al. in epiloog] Zodoende kan het PDH-afhankelijk metabolisme toereikend funktioneren om over-produktie van lactaat te vermijden bij rustende patiënten maar niet in staat zijn adequaat te reageren op verhoogde glycolyse wanneer het systeem wordt belast bij inspanning. Er wordt geschat dat de TCA-cyclus 70- tot 100-voud stijgt bij zware inspanning om voldoende ATP te genereren. Dit zou een situatie creëeren met ontoereikende toevoer van acetyl-CoA om de oxidatieve ATP-produktie van brandstof te voorzien alsook accumulatie van pyruvaat en vervolgens lactaat, ondanks aërobe omstandigheden met voldoende zuurstof. Een slechte werking van PDH kan daarom consistent zijn met de verlaging van de aërobe drempel, het slecht herstel en de post-exertionele malaise die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten. Een dergelijk mechanisme zou in overéénstemming zijn met het geobserveerde verschil in inspanning-intolerantie versus ziekte-ernst bij M.E./CVS-patiënten, door het in verband brengen van de symptomen met de grootte-orde van de metabole belemmering.

De bevinding dat PDKs ge-upreguleerd zijn in PBMCs van M.E./CVS-patiënten is suggestief voor metabole ontregeling op systeem-niveau. Deze cellen hebben een funktionele PPAR-PDK interaktie en kunnen daarom een afspiegeling zijn van geassocieerde effekten die optreden in andere weefsels (die verantwoordelijk zijn voor het klinisch beeld en de symptomen van M.E./CVS). Belangrijk: zelfs al waren de verminderingen qua aminozuren zeer significant bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten, de effekt-groottes bleken gematigd. De serum-waarden van de acetyl-CoA producerende en anaplerotische aminozuren lagen binnen het normaal bereik, ook in de meeste vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren zodoende geen tekenen voor een aminozuren-deficiëntie, en er is geen voor de hand liggende noodzaak voor voeding-supplementen. De bij M.E./CVS-patiënten geobserveerde verminderingen qua aminozuren kan louter een weespiegeling zijn van een gewijzigd metabolisme bij pogingen om te adapteren aan een metabole belemmering. Het patroon van aminozuren-wijzigingen kan niet worden verklaard door andere variabelen zoals leeftijd, mate van inaktiviteit (beoordeeld via het aantal stappen per dag), ziekte-ernst of -duur. Zelfs al waren er significante correlaties met BMI: alle categorieën M.E./CVS-vrouwen (inclusief obese vrouwen) hadden lagere gemiddelde waarden qua ketogene aminozuren dan gezonde vrouwen, d.w.z. de BMI-verschillen konden de vastgestelde verminderde serum-waarden van categorie-II aminozuren niet verklaren. We vergeleken de serum-waarden van aminozuren van overnacht-vastende en niet-vastende M.E./CVS-patiënten en vonden hetzelfde patroon van veranderingen qua aminozuren-profielen. Er waren echter significante dalingen van meerdere categorie-II aminozuren bij de overnacht-vastende patiënten. Dus: zelfs al was het effekt van het vasten beperkt, toch sloten we de overnacht-vastende patiënten uit bij de analyses om te vermijden dat deze variabele werd verstoord.

Deze studie identificeert metabole veranderingen die meerdere van de klinische symptomen bij M.E./CVS-patiënten kunnen verklaren; het onderliggend mechanisme(n) voor de oorzaak van deze effekten blijft echter onduidelijk. Onze eerdere bevindingen bij proeven van B-lymfocyten depletie-therapie (monoclonaal anti-CD20 antilichaam rituximab) [momenteel nog geen bevestigingen] suggereren dat M.E./CVS in een subgroep patiënten een variant van een auto-immune ziekte zou kunnen zijn. Verdere research zou de hier gerapporteerde metabole effekten bij M.E./CVS moeten aanpakken in de context van een potentieel immunologisch mechanisme. Auto-antilichamen kunnen mogelijks interfereren met cel-oppervlakte receptoren alsook met andere factoren die betrokken zijn bij cel-signalisering. Een studie toonde dat serum-waarden van auto-antilichamen tegen meerdere autonome receptoren hoger waren bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles [Loebel M et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-39]. Er werden gelijkaardige auto-antilichamen gedetekteerd bij posturaal orthostatische tachycardie syndroom [POTS] en bij complex regionaal pijn syndroom [CRPS], aandoeningen met enkele gelijkenissen met M.E./CVS […]. Auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden kunnen interfereren met belangrijke metabole signalisering-mechanismen waarbij factoren zoals HIF1 & PPARs, alsook AMPK – dat abnormaal geaktiveerd bleek skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982] – betrokken zijn. Deze factoren zijn geassocieerd met PDK & SIRT4 bij de regulering van het oxidatief metabolisme. Bij dergelijke signalisering-mechanismen zijn factoren betrokken die eerder met M.E./CVS werden gelinkt, zoals reaktieve zuurstof soorten geassocieerd met signalisering- en mitochondriale dysfunktie, en stikstof-oxide gerelateerd met endotheliale dysfunktie, wat werd aangetoond bij M.E./CVS [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-336]. AMPK aktiveert het enzyme endotheliaal stikstof-oxide-synthase (eNOS) en foutieve AMPK-signalisering kan een mechanisme zijn bij endotheliale dysfunktie. In de huidige studie was de gemiddelde serum-waarde van de endogene eNOS-inhibitor en L-Arg analoog ADMA gelijkaardig bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. ADMA is gewoonlijk verhoogd bij cardiovasculaire endotheliale dysfunktie, wat er op wijst dat de mechanismen voor endotheliale dysfunktie bij M.E./CVS […] verschillen van die bij cardiovasculaire ziekten.

Er werd PDH-deficiëntie aangetoond bij ernstige metabole aandoeningen veroorzaakt door mutaties, waarbij progressieve neurologische degeneratie/acidose/energie-tekort betrokken bleek en associaties met epilepsie te wijten aan gewijzigde neuronale prikkelbaarheid. Bij de auto-immune zieke primaire biliare cirrose [PBC; ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)], die gepaard gaat met ernstige vermoeidheid, richten anti-mitochondriale auto-antilichamen zich tegen componenten van het PDH-complex, wat leidt tot inflammatie en weefsel-vernietiging. Bij M.E./CVS is er geen overtuigend bewijsmateriaal voor histologische inflammatie of weefsel-vernietiging, Maar toch zijn er gegevens die aktivatie van pro-inflammatoire én anti-inflammatoire mechanismen tonen (cytokine-analyses), bijzonderlijk tijdens de eerste jaren van de ziekte [Hornig M et al.; zie ‘Inleiding’]. […] Verder werk zal focussen op hoe abnormale immuun-responsen bij M.E./CVS cellulaire signalisering aantast en PDH-inhibitie veroorzaakt.

Tot besluit: deze studie suggereert dat M.E./CVS geassocieerd is met PDH-verstoring, leidend tot verhoogd verbruik van aminozuren die alternatieve paden voor de aanmaak van ATP van brandstof voorzien. Er werd gevonden dat serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale ademhaling in gecultiveerde spiercellen verhoogt, mogelijks ter compensatie of adaptatie van een inhibitie van metabole energie-mechanismen. De fysiologische gevolgen van dergelijke defekten omvatten waarschijnlijk energie- (ATP) deficiëntie en overmatige lactaat-produktie, wat strookt met de invaliderende inspanning-intolerantie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten.

————————-

Ongeveer terzelfder tijd als bovenstaand artikel verscheen er ook één van Maureen R. Hanson et al. (‘Cornell University’, New York) in het tijdschrift Molecular BioSystems, getiteld ‘Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism’. Het betreft een piloot-studie (17 M.E./CVS-patiënten & 15 gematchte controles) waar de ‘metabole signatuur’ in het plasma wordt vergeleken en mogelijke metabole verstoring worden geëxploreerd. Er werden 74 “differentieel accumulerende metabolieten” gevonden op een toaal van 361 onderzochte (35 significant gewijzigd na statistische correctie). Daarbij meerdere “essentiële energie-gerelateerde molekulen” die theoretisch gelinkt kunnen worden aan het algemeen gebrek aan energie dat wordt gezien bij M.E./CVS. Er werden “enkele mechanismen aangewezen met een hoge impact: het taurine-metabolisme (taurine is een zwavel-bevattend organisch zuur, een belangrijk bestanddeel van gal, met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie, modulatie van calcium-signalisering, enz.), het glycerofosfolipiden-metabolisme (of fosfoglyceriden; belangrijkste component van biologische membranen), die in combinatie met het primaire (gesynthetiseerd in de lever) galzuren (ontstaan uit cholesterol) -metabolisme, alsook het glyoxylaat & dicarboxylaat -metabolisme (de glyoxylaat-cyclus is een serie reakties betrokken bij de biosynthese van carbohydraten/suikers uit vetzuren of voorlopers met 2 koolstoffen die het systeem binnenkomen als acetyl-coenzyme A) en enkele andere, allemaal betrokken zijn bij het vetzuren-metabolisme”. Purinen (includsief ADP & ATP), pyrimidines en meerdere metabole aminozuren-mechanismen bleken significant verstoord…

december 3, 2016

Differentiële expressie van mitochondriale proteïnen bij CVS

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 8:25 am
Tags: , , , , , , ,

Een artikel dat voor zichzelf spreekt… Er worden hier 2 proteïnen (betrokken bij de cellulaire energie-produktie) aangeduid die (in combinatie) een diagnostische merker zouden kunnen zijn voor M.E.(cvs).

Over aconitase (aconitaat-hydratase; omzetting van citraat naar isocitraat in de TCA-cyclus) werd ook al gesproken in onze stukken ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’ & ‘Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS’…

Er werd tevens afwijkende expressie van ACON en ATPB in het speeksel gevonden. Dit zou een afname bij een eventuele test veel makkelijker maken.

Lees ook ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’ & ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’.

————————-

Transl Psychiatry. (2016) 6: e904

Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome

Ciregia F1, Kollipara L2, Giusti L1, Zahedi RP2, Giacomelli C3, Mazzoni MR1, Giannaccini G1, Scarpellini P4, Urbani A5,6, Sickmann A2,7,8, Lucacchini A1, Bazzichi L3

1Department of Pharmacy, University of Pisa, Pisa, Italy

2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften-ISAS, Dortmund, Germany

3Division of Rheumatology, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

4Division of Psychiatry, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

5Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica, Rome, Italy

6Proteomics and Metabonomics Unit, IRCCS-Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

7Department of Chemistry, College of Physical Sciences, University of Aberdeen, Aberdeen, UK

8Medizinische Fakultät, Medizinische Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende en complexe aandoening die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verbetert door rust. Dysfunktie van de mitochondrieën is een research-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS. In eerder werk onderzochten we het proteoom-profiel in speeksel van een monozygote tweeling met en zonder CVS. Hierna analyseerden we mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. We gebruikten een gesofisticeerde techniek (nano-LC-MS) om de mitochondrieën uit bloedplaatjes te bestuderen. Daarna selekteerden we 3 proteïnen die waren gevalideerd d.m.v. ‘western blot’ analyse bij een grote groep individuen (n = 45 CVS; n = 45 gezond), in het speeksel. De gekozen proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). De resultaten voor ATPB & ACON bevestigden hun upregulering bij CVS. De MDHM-verandering werd echter niet bevestigd. Daarna beslisten we, gezien de grote variabiliteit qua klinische kenmerken van CVS-patiënten, de expressie van onze proteïnen te analyseren na opsplitsing van de patiënten volgens klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger bij de groep patiënten die klinische kenmerken vertoonden die gelijkaardig waren met de zieke tweeling-helft. We besluiten dat deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de criteria zou kunnen zijn die in rekening kunnen worden gebracht bij het helpen stellen van de diagnose. Bovendien zou de identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kunnen helpen bij het werpen van een licht op de complexe aandoening CVS. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van aangepaste behandelingen.

Inleiding

[…] De moeilijkheden bij het definiëren van CVS, door het gebrek aan diagnostische merkers, maakt epidemiologische studies ingewikkeld. […] Tot nu toe blijft de etiologie van CVS onduidelijk; waarschijnlijk is het een heterogene aandoening die kan worden verklaard via een multi-factorieel model waar genetische, infektueuze, neuro-endocriene en psychologische factoren samenkomen. […]

Een ander onderzoek-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS is een gebrekkige mitochondriale funktie. Studies betreffende het metabolisme bij CVS suggereren onregelmatigheden qua energie-metabolisme en oxidatieve stress. [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172; zie ook referenties onze inleiding] Er wordt in het bijzonder steeds meer erkend dat mitochondriale dysfunkties aan de basis van CVS kunnen liggen [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J]; bovendien is vermoeidheid een prominent symptoom bij patiënten met mitochondriale ziekte. Dit is een aantrekkelijke hypothese, aangezien een metabole wijziging op mitochondriaal niveau een energie-deficiëntie met zich mee kan brengen en de uitzonderlijke vermoeidheid verklaren.

Er werd dikwijls gesuggereerd dat een genetische voorbestemdheid aan de basis van CVS kan liggen; daarom voorziet het bestuderen van tweelingen de best gematchte controles. Zodoende onderzochten we in eerder werk het proteoom-profiel in van een monozygote tweeling, waarvan één met en één zonder CVS. [Ciregia F et al. A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the Chronic Fatigue Syndrome: a focus on potential salivary biomarkers. J Transl Med (2013) 11: 243] Onze resultaten beklemtoonden de betrokkenheid van de inflammatoire respons bij de pathogenese van CVS. Na de bemoedigende resultaten verkregen via deze preliminaire studie, wilden we meer kennis verwerven betreffende mechanismen bij CVS via het analyseren van mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. De verwachting was dat onze bevindingen bewijs zouden kunnen leveren voor een mitochondriale rol bij de pathogenese van CVS.

Met dit doel isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes. Dit zijn circulerende bloedcellen die essentieel zijn voor de hemostase [preventie van bloedverlies] en coagulatie [bloedstolling] maar ook voor de aangeboren en adaptieve immuniteit. Bloedplaatjes hebben funktioneel aktieve mitochondrieën, waarvan de betrokkenheid bij de cel-fysiologie en bij pathologische aandoeningen werden aangetoond. De beoordelingen van de mitochondriale funktie in bloedplaatjes bieden meerdere voordelen voor diagnostische doeleinden: hun overvloed in het perifeer bloed, het betrekkelijk gemak om ze te verkrijgen, hun beperkte complexiteit, het aanzienlijk aantal mitochondrieën in de bloedplaatjes en de mogelijkheid voor herhaalde metingen bij elke patient.

Bloedplaatjes werden reeds aangewend bij onderzoeken naar de mitochondriale betrokkenheid bij enkele aandoeningen, bv. sepsis, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze studies bleven echter beperkt tot analyse van het mitochondriaal DNA en elektron-transfer aktiviteiten, terwijl er geen onderzoek werd verricht naar de totale proteïnen-inhoud van de mitochondrieën. Daarom analyseerden we de mitochondrieën uit bloedplaatjes via ‘nano-liquid chromatography electrospray-ionization mass-spectrometry’ (nano-LC-MS [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]) bij hetzelfde tweeling-paar als in de eerdere studie. Daarna werden de meest beloftevolle biomerkers gevalideerd via ‘western blot’ [WB] analyse [Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.] bij een grote groep patiënten, gebruikmakend van speeksel, dat op een niet-invasieve, eenvoudige, veilige en stress-vrije manier kan worden gecollecteerd en die makkelijk toepasbaar is bij grote groepen individuen.

Gezien de heterogeniteit van de ziekte was het doel biomerkers te suggereren om gevallen van CVS te stratificeren, eerder dan het selekteren van enkele biomerkers voor de identificatie van CVS. Dit kan helpen de behandeling op maat van de patient te snijden.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

Deze studie werd opgedeeld in 3 verschillende stappen. De eerste ‘ontdekking’-fase was gericht op het karakteriseren van het mitochondriaal proteoom-profiel van een CVS-patient in vergelijking met z’n gezonde monozygote tweeling-helft. Dit doel werd bereikt d.m.v. een proteoom-benadering (nano-LC-MS). De tweede ‘verkennende’ fase was gericht op het onderzoeken van de veranderende proteïnen (Ingenuity Pathway Analysis – IPA [software om expressie-profielen te analyseren]). Dit platform laat toe de mogelijke interakties te visualiseren tussen de geïdentificeerde biomerker-signaturen in mitochondrieën, wat ons helpt enkele kandidaten te selekteren voor de ‘validatie’-fase. De geselekteerde proteïnen werden eerst gezocht in het speeksel van de tweeling-broers en, eens de verschillen bevestigd werden, werd de validatie verbreed naar een groter aantal patiënten en controles. Tenslotte hebben we onze analyse versterkt door te kijken naar klinische gegevens, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers correleren met de klinische parameters van de patiënten. Dit leidt ons tot de identificatie van mitochondriale proteïnen die bruikbaar zijn bij het subtyperen van CVS-patiënten.

Patiënten

[…] 45 CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 38,6 ± 11,9 jaar); 45 gezonde controles (36,4 ± 10,9) 25 vrouwen, 20 mannen […]. De patiënten werden geklassificeerd op basis van de criteria volgens Fukuda et al. […] De individuen vulden de ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) in […]. Vermoeidheid werd ook beoordeeld d.m.v. de ‘Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue Scale’ (FACIT). […] Om de individuen beter te klassificeren, werden de volgende parameters geëvalueerd: anti-nucleaire antilichamen, ‘extraheerbare nucleaire antigenen’ [ENA] antilichamen [voor auto-immuunziekten], reumatoïde factor & anti-cardiolipine antilichamen (immunologische parameters); cortisol en adrenocorticotroop hormoon, serotonine, groei-hormoon, IGF-1 & vitamine-D3 (hormoon-profiel); tumor necrose factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, interleukine (IL)-6, IL-10, IL-2, IL-8 & IL-1b (cytokine-profiel).

Speeksel-stalen

[…]

Bloedplaatjes & aanrijking mitochondrieën

[…]

Kwantificatie op basis van LC-MS

[…]

LC-MS stalen

[…]

LC-MS analyse

[…]

Analyse van signalisering-mechanismen

[…] Alle proteïnen met differentiële expressie gelijk aan of meer dan 2 maal (CVS t.o.v. controle) werden opgenomen voor de bio-informatische analyse, om de molekulaire funkties te identificeren die het sterkt geassocieerd waren met de proteïnen-lijst.

WB voor validatie

Om de expressie-veranderingen in speeksel te valideren, gebruikten we ‘western blot’ analyse. De geselekteerde proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). […]

[…]

Statistische analyse

[…]

Klinische correlaties

[…]

Resultaten

Proteoom-analyse

Om het profiel op te maken van de mitochondriale proteïnen bij CVS, isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes van hetzelfde tweeling-koppel met en zonder CVS dat eerder werd onderzocht. Om de kwaliteit te evalueren van de geïsoleerde mitochondrieën gebruikten we enzymatische testen en WB-analyse: de mitochondriale aanrijking was bevredigend. We verkregen een mitochondriale fractie van 450 μg proteïnen startend van ca. 5×109 bloedplaatjes. Met als doel de grens van reproduceerbaarheid van het mitochondriaal preparaat te overwinnen, werden de experimenten in 3-voud uitgevoerd. De mitochondrieën die werden verkregen uit elk van de 3 experimenten werden samengevoegd en geanalyseerd in drievoud.

De proteïnen-samenstelling van de mitochondrieën werd geanalyseerd via nano-LC-MS en er werd een differentiële analyse tussen de CVS-patient en z’n gezonde broer uitgevoerd. Globaal identificeerden we 1.007 proteïnen […]. Van die 1.007 gedetekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant gemodificeerd bij CVS. Van deze 194 proteïnen waren er 41 met een variatie bij CVS t.o.v. controle groter dan 2,0: 34 waren ge-upreguleerd bij CVS en 7 waren ge-downreguleerd. […] Deze 41 proteïnen werden opgenomen in de IPA. Van elk geïdentificeerd proteïne werd het overéénkomstig gen in de IPA kennis-databank gezocht.

We gebruikten IPA om de gekende funkties van elk proteïne terug te vinden. Aangezien één proteïne meerder funkties kan hebben, selekteerden we de funkties met de hoogste statistische significantie. De eerste 3 hoogst-gerangschikte biologische funkties waren: metabolisme van isocitraat, metabolisme van NADH & metabolisme van nucleïnezuur-componenten of afgeleiden. […] Voor de validatie selekteerden we een proteïne uit elke categorie op basis van de hoeveelheid variatie en de P-waarde [indicatie voor de statistische significantie] van proteïnen uit de proteoom-analyse.

Expressie van biomerkers in speeksel

We selekteerden 3 mitochondriale proteïnen voor de validatie via WS – ACON, ATPB & MDHM. We beoordeelden eerst of hun variatie bij CVS t.o.v. controle bevestigd werd via de WS van de tweelingbroers. De upregulering bij CVS werd via WB bekrachtigd voor al de proteïnen. ACON, ATPB & MDHM vertoonden een toename van 3,1, 1,5 & 4,7. […]

Vervolgens gingen we over tot de analyse van deze proteïnen in een ruime groep CVS-patiënten (n = 45) en gezonde individuen (n = 45). We begonnen met een globale analyse van de expressie van deze proteïnen in het speeksel om dan verder te gaan met het onderzoek van verschillende CVS-subtypes. De veranderingen voor ACON & ATPB waren consistent met de resultaten van de nano-LC-MS, maar niet voor MDHM.

Dan klassificeerden we patiënten volgens hun klinische kenmerken (vragenlijsten): FACIT, FIQ, VAS-pijn, VAS-vermoeidheid & VAS-slaap. De CVS-patiënten werden in 2 groepen gesplitst met als referentie de tweeling-helft met CVS: een groep met de klinische kenmerken waarvan de waarden overéénkwamen met (of groter dan) die van de zieke tweeling-helft (groep A) en de tweede met de patiënten met lagere waarden (groep B). De intensiteiten waren hoger voor elk van de 3 merkers in groep A t.o.v. groep B.

ROC-curves

Er werden ROC-curves [grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] berekend ter beoordeling van het klinisch potentieel van onze geselekteerde en gevalideerde proteïnen om CVS te onderscheiden van gezonde individuen (in speeksel). De AUCs [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden] werden voor elk proteïne individueel berekend, om aan te tonen of elke merker apart dit onderscheid kan maken. ATPB & ACON bleken betere differentiërende biomerkers dan MDHM. ATPB: sensitiviteit 54% en specificiteit 78%; ACON: sensitiviteit 61% en specificiteit = 78%. Daarenboven onderzochten we via logistische regressie analyse of het onderscheidend vermogen van elke merker mogelijks verhoogd was door combinatie van meerdere merkers. Met deze doelstelling testten we alle verschillende combinaties om de beste combinatie van biomerkers te selekteren die bruikbaar is om mensen met CVS te onderscheiden van gezonde individuen. Zodoende vonden we dat het onderscheidend vermogen lichtjes steeg als ATPB werd gecombineerd met ACON. De sensitiviteit steeg tot 85% maar de specificiteit was 72%. Tenslotte berekenden we ook ROC-curves om te testen of de biomerkers patiënten en controles kunnen differentiëren volgens de klinische parameters – enkel FACIT gaf goeie resultaten. Wanneer we patiënten opsplitsen volgens FACIT, gaven ATPB en ACON ROC-curves (groep A versus controles) met een AUC van 0.780 en 0.722, respectievelijk, terwijl de gecombineerde ROC-curve een AUC had van 0.844 (sensitiviteit = 93%, specificiteit = 70%).

Klinische correlaties

Tenslotte bekeken we statistische correlaties voor de volgende klinische parameters: leeftijd, leeftijd bij aanvang, ziekte-duur en de hematochemische parameters (bv. TNF-α, IL-6, enz.). ACON correleerde negatief met IL-2 […]. ATPB correleerde positief met TNF-α & IFN-γ. […] MDHM correleerde ook met TNF-α […].

Bespreking

De ontdekking en validatie van meer objectieve merkers kunnen een belangrijke ondersteuning betekenen voor het stellen van de diagnose en behandeling van CVS. Aangezien bewijsmateriaal suggereert dat mitochondriale dysfunkties aan de grondslag liggen van CVS, analyseerden we mitochondriale proteïnen verkregen uit bloedplaatjes. Deze kwamen van een monozygoot tweeling-koppel met en zonder CVS. Nano-LC-MS markeerde de wijzigingen qua expressie van 41 proteïnen met een P < 0.05 en een vermenigvuldiging met meer dan 2. Voor de validatie selekteerden we hieruit 3 proteïnen van elk van de 3 meest significante ‘biologische funkties’ die met onze proteïnen geassocieerd bleken na IPA-analyse.

Deze 3 proteïnen waren: ACON (‘metabolisme van isocitraat’), MDHM (‘metabolisme van NADH’) en ATPB (‘metabolisme nucleïnezuur-componenten of afgeleiden’). De validatie van onze kandidaat proteïne-biomerkers werd beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die de detektie van proteïnen in speeksel-stalen toelaten.

Ondanks het feit dat deze studie slechts 2 individuen analyseerde, kunnen de verschillen qua proteïne-expressie gelinkt worden aan de ziekte, aangezien de tweeling slechts verschilde wat betreft de aanwezigheid van CVS. Op deze manier liet onze studie toe te focussen op enkele biomerkers die kunnen worden onderzocht bij een groter aantal patiënten om hun bruikbaarheid bij de diagnose van CVS te bevestigen. We beslisten speeksel van CVS-patiënten te onderzoeken (een niet-invasieve procedure). Hoewel speeksel een minder complex vocht is, werd bewezen dat het een beloftevol diagnostisch instrument is, dat de fysiologische werking van het lichaam weerspiegelt. Eerst was het aangewezen om te controleren of de significante toename van deze proteïnen bij CVS (t.o.v. de controle) kon worden geverifieerd in het speeksel van de tweeling-broers. We bevestigden de resultaten.

De analyse van de mechanismen markeerde het ‘metabolisme van NADH’ als één van de meest belangrijke biologische funkties betrokken bij CVS. De verhouding NAD+/NADH speelt een alomtegenwoordige rol bij het reguleren van de intracellulaire redox-status en vertegenwoordigt daardoor een funktie van de metabole toestand. Enkele studies suggereren dat NADH-concentraties significant lager liggen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid Redox Signal (2015) 22: 679-685 /// Castro-Marrero J et al. Effect of coenzyme-Q10 plus nicotinamide adenine dinucleotide supplementation on maximum heart rate after exercise testing in Chronic Fatigue Syndrome – a randomized, controlled, double-blind trial. Clin Nutr (2015) 35: 826-834] Het is waarschijnlijk dat de hoge waarden MDHM en isocitraat-dehydrogenase die worden gezien bij CVS een adaptieve verandering kunnen zijn voor deficiënties qua NADH dat, op z’n beurt, een cruciale rol speelt bij ATP-produktie in de mitochondrieën.

ATPB is de subunit-beta van ATP-synthase, het belangrijkste enzyme voor de aanmaak van ATP. Naast de toename van ATPB bij CVS, detekteerden we (d.m.v. nano-LC-MS) ook significante verhogingen van de subunit-alfa en -gamma (P = 0.005 & 0.001, respectievelijk). Moeheid en energie zijn nauw verbonden; daarom is een aantrekkelijke hypothese dat er een metabole dysfunktie is met als resultaat dat er niet genoeg energie wordt geproduceerd. In dit perspectief kan de toename worden verklaard als een poging om de ATP-produktie te verhogen. Er zijn inderdaad studies die suggereren dat daling qua mitochondriale ATP-synthese bij CVS-patiënten niet wordt veroorzaakt door een defekt in de enzyme-complexen die de oxidatieve fosforylatie katalyseren maar in een andere factor. [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93] Opdat ADP kan worden gerecycleerd en ATP naar het cytosol van de matrix kan gaan, is de uitwisseling van cytoplasmatisch ADP met mitochondriaal ATP via het binnenste membraan nodig. Deze funktie wordt voorzien door een translocator-proteïne. Consistent met ander werk is de expressie van mitochondriaal ADP/ATP-translocase [transporter-proteïnen die zorgen voor de uitwisseling van ADP in het cytosol en mitochondriaal ATP via het binnenste membraan] gewijzigd in onze studie: translocase-2 & -3 daalde [x 0,65 & x 0,80 t.o.v. controle] bij CVS (P = 0.009 & 0.002, respectievelijk).

Samen met ATPB lijkt ACON de meest beloftevolle biomerker. Dit is de mitochondriale vorm van aconitase, een enzyme dat de omzetting van citraat naar isocitraat katalyseert via cis-aconitaat in de TCA-cyclus. [inhibitie van dit enzyme vermindert de cellulaire energie-voorraad] ACON wordt courant gebruikt als een biomerker voor oxidatieve stress en werd gesuggereerd dienst te doen als een sensor voor de redox-status. Inderdaad: de reaktie tussen ACON en superoxide genereert vrije hydroxyl-radikalen. Het is waarschijnlijk dat de reaktie tussen superoxide en ACON de mitochondriale oxidatieve schade geassocieerd met de pathofysiologie van CVS kan versterken. De buitensporige produktie van ROS en stikstof-soorten wordt trouwens gewoonlijk in verband gebracht met CVS en we vonden een significante upregulering [x 2,2 t.o.v. controle] van superoxide-dismutase [SOD; enzyme dat zuurstof-radikalen ‘opruimt’] (P = 0.001).

Na de validatie in het speeksel van de tweeling, hebben we de validatie uitgebreid naar een grote groep CVS-patiënten. De resultaten voor ATPB & ACON bevestigen de upregulering bij CVS en hun klinisch potentieel om patiënten van controles te onderscheiden werd geëvalueerd. De ROC-curves gaven een goede specificiteit maar lage sensitiviteit aan. Als de biomerkers geombineerd werden, verkregen we een betere diagnose en de sensitiviteit verhoogde tot 85%, met een kleine daling qua specificiteit.

Anderzijds werd de gevonden MDHM-wijziging niet bevestigd in de grotere groep patiënten maar we konden een stijging zien wanneer we enkel de patiënten beschouwden met gelijkaardige of hogere klinische parameters dan de tweeling-helft met CVS. Deze bevinding bracht ons ertoe te bekijken of andere vermoedelijke biomerkers ook duidelijke CVS-subgroepen zouden kunnen afbakenen, gezien de grote variabiliteit van de klinische kenmerken van onze patiënten. Daarom hebben we onze analyse opgedreven door de klinische gegevens van dichterbij te bekijken, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers gelinkt zijn met de klinische kenmerken van de patiënten. We analyseerden de expressie van onze proteïnen na de patiënten te hebben opgesplitst volgens de klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger in de groep patiënten met klinische kenmerken die gelijkaardig waren met die van de zieke tweeling-helft. Het leek er op dat de toename qua expressie van deze proteïnen overéénkwam met een slechte patiënten-uitkomst.

Daarnaast gaf de combinatie van ATPB met ACON een sensitiviteit van 93% en specificiteit van 70% wanneer we de FACIT-waarden gebruikten van de patiënten die groter dan deze van de tweeling-helft met CVS.

Het valt op te merken dat CVS-patiënten met co-morbide bipolaire stoornis (en niet met andere psychiatrische co-morbiditeiten) een significante upregulering van de ATPB-expressie vertoonden (P = 0.03). In onze groep CVS-patiënten waren er slechts 8 met een co-morbide bipolaire aandoening; maar dit aspect verdient verder onderzoek gezien het feit dat een belemmerde mitochondriale funktie bij bipolaire patiënten werd besproken.

Tenslotte onderzochten we de correlatie van onze proteïnen met hematochemische parameters. Cytokine-abnormaliteiten zijn courant bij CVS maar de bevindingen zijn gemengd en er wordt geen individuele merker gebruikt als een objectieve biomerker voor de diagnose of het management van CVS. Het is opmerkenswaardig dat de toename van bij CVS positief correleerde met de stijging van IFN-γ & TNF-α. Immunologische ontregeling werd altijd voorgesteld als een significante component van CVS en CVS-patiënten hebben gewoonlijk hoge waarden pro-inflammatoire cytokinen, zoals IFN-γ & TNF-α. [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Klimas NG et al. Biomarkers for chronic fatigue. Brain Behav Immun (2012) 26: 1202-1210] Daarnaast was er een positieve correlatie van MDHM met TNF-α. Deze correlaties brengen ons iets bij, aangezien al deze variabelen als merkers kunnen worden beschouwd. Het is interessant aan te geven dat de ACON-waarden negatief correleerden met IL-2, in lijn met het feit dat de tweeling-helft met CVS lagere waarden van IL-2 had t.o.v. zijn gezonde tweeling-broer.

Besluit: deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de te overwegen criteria kunnen zijn bij het helpen stellen van de diagnose. Daarenboven: zelfs als deze proteïnen niet noodzakelijk bruikbaar blijken voor een universele CVS-diagnose (gezien de enorme heterogeniteit van de ziekte), bieden ze een sterk potentieel om subsets te karakteriseren. De identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kan helpen de complexe entiteit die CVS is, op te helderen. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van op maat gemaakte behandelingen. Op die manier zou dit werk kunnen bijdragen aan de gestage ontwikkeling van een duidelijker kader voor een ingewikkelde en genuanceerde ziekte zoals CVS.

november 19, 2016

Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie

Filed under: Celbiologie,Inspanning — mewetenschap @ 8:02 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand literatuur-overzicht, geschreven door een professor/arts met een post-graduaat inspanning-geneeskunde -hij is o.a. directeur van het ‘Human Performance Laboratory’ van de univeristeit van Belgrado; zijn research focust op de fysiologische responsen op maximale en sub-maximale inspanning – handelt niet zo zeer over M.E.(cvs) maar geeft o.i. wel aanwijzingen over wat er mogelijks gebeurt in de mitochondrieën wanneer mensen met deze aandoening zich inspannen (oefenen/trainen) in een mate die hun grenzen overschrijdt. Het bevestigt naar onze mening dat oefen-therapie die niet om maat is van de patient wel degelijk nog meer schade kan aanrichten en dus niet is aangewezen. Een duidelijke boodschap naar de dames en heren kine-/fysiotherapeuten! De auteur geeft ook enkele behandel-strategieën mee om schade aan de mitochondrieën te voorkomen/herstellen…

Lees – onder andere – ook: ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’, ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)’, ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’, …

————————-

Clinical Science (2016) 130: 1407-16

Exercise-induced mitochondrial dysfunction: A myth or reality?

Sergej M. Ostojic

Faculty of Sport and Physical Education, University of Novi Sad, Serbia School of Medicine, University of Belgrade, Serbia

Samenvatting

De voordelige effekten van lichamelijke aktiviteit op mitochondriale gezondheid – waarbij regelmatige inspanning de kwaliteit en de kwantiteit van de mitochondrieën verbetert in de normale gezonde populatie – zijn goed onderbouwd in de wetenschappelijke literatuur, alsook bij cardiometabole en neurodegeneratieve aandoeningen, en ouder-worden. Meerder studies stelden echter vragen bij dit paradigma, suggererend dat extreem zware of uitputtende inspanning mitochondriale stoornissen bevordert die permanente schade kunnen toebrengen aan de werking ervan bij gezondheid en ziekte. Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie (‘exercise-induced mitochondrial dysfunction’, EIMD) zou een bepalende factor kunnen zijn voor negatieve gevolgen van uitputtende inspanning, als pathofysiologisch substraat van hart-abnormaliteiten, Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) of spier-degeneratie. Hier geven we een overzicht van de mogelijke factoren die negatieve effekten van uitputtende inspanning op de mitochondriale funktie en struktuur mediëren, en opperen we alternatieve oplossingen voor het management van EIMD.

Inleiding

Mitochondrieën worden al lang erkend als een sleutel-element van cellulaire levensvatbaarheid; het organel bleek betrokken bij een overvloed aan fundamentele levensprocessen. Het zijn de voornaamste cellulaire energie-bronnen (oxidatieve fosforylatie), belangrijke regulatoren van de redox-produktie en -signalisering, modulatoren van de calcium-homeostase, haem-biosynthese en gebruik van aminozuren, en belangrijke spelers bij de controle van stress-responsen en apoptotische cel-dood. Het behouden van de mitochondriale werking lijkt de belangrijkste determinant te zijn voor een lange levensduur, terwijl een dysfunktie myopathieën, neurodegeneratieve en cardiometabole aandoeningen, kanker en veroudering vergezelt of triggert. Het organel wordt zo een belangrijk doelwit voor verschillende farmacologische en niet-farmacologische interventies om mitochondriale dysfunktie aan te pakken, waarbij inspanning dikwijls gesuggereerd wordt als de te kiezen therapie. Veel studies hebben gerapporteerd over voordelige effekten van lichamelijke inspanning op mitochondriale inhoud en funktie, waarbij regelmatige inspanning tekenen en symptomen van mitochondriale dusfunktie bij veroudering, diabetes en hersen-aandoening verlicht. Meerdere studies stelden echter vraagtekens bij dit paradigma, suggererend dat extreem zware of langdurige inspanning eigenlijk mitochondriale stoornissen zou induceren die de werking permanent zouden aantasten. Een groep van de ‘University of Cape Town Medical School’ rapporteerden over een geval van een klaarblijkelijk gezonde top-atleet die een onomkeerbare mitochondriale dysfunktie ontwikkelde na jaren van uitputtende training. [St Clair Gibson et al. Exercise-induced mitochondrial dysfunction in an elite athlete. Clin. J. Sport Med. (1998) 8: 52-55] Daarnaast suggereerden meerdere studies bij knaagdieren dat uitputtende inspanning een inhibitie van mitochondriale fosforylatie-aktiviteit zou kunnen induceren en moeilijk te herstellen mtDNA-deleties en cel-dood. Het lijkt er op dat inspanning de mitochondriale struktuur en werking sterk aantast, maar toch blijft de richting en de graad van verandering open voor discussie. In dit artikel zal ik mogelijke factoren die de negatieve effekten van inspanning op mitochondriale funktie mediëren bespreken en alternatieve oplossingen voor het managen van inspanning-geïnduceerde mitochondriale schade naar voor brengen.

Voordelige effekten van inspanning op mitochondriale funktie

Eén van de klassieke responsen op inspanning is een verhoogd aantal en betere funktie van mitochondrieën, waarbij een verbeterde kwaliteit en kwantiteit nauw verband houdt met meerdere positieve gezondheid-effekten die worden gerapporteerd na training. Na de voorbijgaande daling qua mitochondriale prestaties die worden gezien onmiddellijk na een inspanning, verhoogt de mitochondriale biogenese – met gunstige veranderingen qua mitochondriaal volume en aantal [na 7 à 10 dagen 2u/dag fiets-training bij gezonde mensen!]. De organellen vermeerderen in grootte en densiteit, het verbruik van mitochondriale brandstof verschuift naar een toegenomen verbruik van lipiden en de capaciteit qua mitochondriale enzymen breidt uit [7 weken uithouding-training door gezonde mensen!]. Bijgevolg verhogen de oxidatieve capaciteit en de inspanning-prestaties. Het lijkt dat regelmatige inspanning een positieve invloed heeft op de expressie van PGC-1α [‘peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α’; lid van een familie van transcriptie co-aktivatoren die een centrale rol speelt bij de regulering van het cellulair energie-metabolisme], een belangrijke regulator van de mitochondriale biogenese en funktie. Uithouding-training lijkt hiervoor bijzonder doeltreffend: zelfs een enkele aërobe inspanning van 60 min induceert wijzigingen qua gen-expressie die de mitochondrieën in inspannende en niet- inspannende spieren van gezonde mannen positief beïnvloedt. Gunstige mitochondriale aanpassingen na regelmatige inspanningen werden ook gerapporteerd bij patiënten met verschillende aandoeningen [diabetes en Alzheimer’s & Parkinson’s] of ouder-wordenden [4-6 sessies/week van 30-40 min, gedurende 12 weken]. Na regelmatige aërobe inspanning verbetert zelfs de funktie van ernstig beschadigde mitochondrieën [mitochondriale myopathie]. Er is echter veel minder geweten over het dosis-respons verband tussen gunstige mitochondriale veranderingen en de intensiteit/volume inspanning. Meerdere studies brachten zeer intensieve inspanning naar voor als een doeltreffend model voor het verbeteren van de mitochondriale biogenese en funktie. Aan de andere kant rapporteerde een studie dat PGC-1α mRNA-expressie negatief gecorreleerd was met inspanning-intensiteit [Mille-Hamard L et al. Transcriptional modulation of mitochondria biogenesis pathway at and above critical speed in mice. Mol. Cell. (2015) Biochem. 405: 223-232], wat suggereert dat de transcriptie-aktiviteit van de mitochondriale biogenese signalisering-cascade gevoelig is voor inspanning-intensiteit. Optimalisatie van de inspanning-belasting kan van cruciaal belang zijn voor specifieke mitochondriale aanpassingen, maar of verschillende intensiteiten biologisch verschillende mechanismen betrokken bij ‘acclimatisatie aan inspanning’ opleveren, blijft momenteel nog onbekend.

Mitochondriale dysfunktie geïnduceerd door inspanning

De term ‘dysfunktionele mitochondrieën’ wordt veel gebruikt in de cel-biologie, bio-energetische research en klinische geneeskunde. De precieze definitie is echter nogal moeilijk, en hangt af van het feit of dysfunktie bepaald dient te worden via geïsoleerde organellen, intacte cellen of in vivo, en welke biomerkers (klinische of experimentele) beschikbaar zijn voor de beoordeling van mitochondriale prestaties. Gewoonlijk wordt mitochondriale dysfunktie gedefinieerd als een verstoord vermogen van de mitochondrieën om ATP – de belangrijkste energie-drager in de cel – aan te maken, op de juiste manier in respons op energie-behoeften, hoewel abnormaliteit bij andere processen die worden bestuurd door mitochondrieën ook mitochondriale dysfunktie kunnen worden genoemd. Diagnostische strategieën voor mitochondriale aandoeningen/dysfunktie vereisen een multi-disciplinaire evaluatie, en steunen op een combinatie van klinische observaties, laboratorium-testen, beeldvorming van de hersenen en skeletspier-biopten, waarbij momenteel niet één enkele ‘golden standard’ test beschikbaar is om de diagnose van mitochondriale dysfunktie te stellen. Mitochondriale dysfunktie treedt vroeg op en werkt oorzakelijk bij veel ziekten en aandoeningen, waarbij meerdere factoren werden geïdentificeerd die de aandoening induceren, en het energie-metabolisme of vorming van vrije radikalen in het lichaam storen [statinen, sertraline, antibiotica]. Het begrijpen van de etiologie zou kunnen helpen bij de identificatie van kwetsbaarheid-eigenschappen en het vermijden van uitlokkende stoffen, inclusief verschillende medicijnen en toxische agentia of andere tegen mitochondrieën gerichte beschadigende interventies. Er is speculatie dat excessieve uithouding-training schadelijk kan zijn voor verscheidene biologische systemen en subcellulaire strukturen [O’Keefe JH et al. Potential adverse cardiovascular effects from excessive endurance exercise. Mayo Clin. Proc. (2012) 87: 587-595], waarbij mitochondriale dysfunktie een rol zou kunnen spelen [Feng Z et al. Mitochondrial dynamic remodeling in strenuous exercise-induced muscle and mitochondrial dysfunction: regulatory effects of hydroxytyrosol. Free Radical Biol. Med. (2011) 50: 1437-1446].

Ernstige modificaties van de mitochondriale struktuur in het myocard [hartspier(weefsel)] van honden onderworpen aan uitputtende inspanning werden al in 1966 gerapporteerd: frequent geobserveerde reuzen-mitochondrieën […] en ontwrichting van de cristae [instulpingen van het binnenste membraan in een mitochondrium]. De jaren daarna evalueerden andere onderzoekers de fijne struktuur van hart- en skeletspier na uitputtende inspanning in een reeks studies uitgevoerd bij ratten en mensen. De auteurs rapporteerden mitochondriale zwelling bij de ratten die ca. 450 h waren onderworpen aan uitputtend zwemmen, waarbij de veranderingen grotendeels normaliseerden door een herstel-periode van 15-18 h. Enkele mitochondrieën waren echter erg gezwollen en hadden verstoorde en gedegenereerde cristae (het meest prominent in myocardiale mitochondrieën), waarbij de metabole capaciteit van de dysfunktionele organellen op een nadelige manier leek te zijn veranderd na langdurige ernstige inspanning. Deze observaties suggereren dat uitputtende inspanning de mitochondriale funktie en/of struktuur sterk kan aantasten, ten minste in een bepaald gebied of weefsel. Anderen [Gohil K et al. Effects of training and exhaustive exercise on the mitochondrial oxidative capacity of brown adipose tissue. Biosci. Rep. (1984) 4: 987-993] bevestigden bovenstaande bevindingen: ze rapporteerden een inspanning-geïnduceerde afname van de mitochondriale aktiviteit in bruin vet-weefsel [vet-cellen met een grote hoeveelheid mitochondrieën] van ratten onderworpen aan een slopende loop-test, waarbij mitochondriale oxidatieve mechanismen meer gestresseerd waren bij ongetrainde ratten t.o.v. getrainde. De laatste 20 jaar rapporteerden meerdere studies gelijkaardige schadelijke effekten van extreem zware inspanning op mitochondriale prestaties, met permanente of langdurige inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie (EIMD) die werd gevonden in de hersenen, skeletspieren, hart, lever en bloedcellen van knaagdieren en mensen [Bijvoorbeeld: Rasmussen UF et al. The effect of high-intensity exhaustive exercise studied in isolated mitochondria from human skeletal muscle. Pflugers Arch. (2001) 443: 180-187 /// Hsu TG et al. Leukocyte mitochondria alterations after aerobic exercise in trained human subjects. Med. Sci. Sports Exerc. (2002) 34: 438-442 /// Tuan TC et al. Deleterious effects of short-term, high-intensity exercise on immune function: evidence from leucocyte mitochondrial alterations and apoptosis. Br. J. Sports Med. (2008) 42: 11-15 /// Layec G et al. Impact of age on exercise-induced ATP supply during supramaximal plantar flexion in humans. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. (2015) 309: R378-R388 /// Layec G et al. Effects of exercise-induced intracellular acidosis on the phosphocreatine recovery kinetics: a 31P MRS study in three muscle groups in humans. NMR Biomed. (2013) 26: 1403-1411].

Uitputtende inspanning lijkt verschillende merkers voor mitochondriale gezondheid negatief te beïnvloeden, inclusief een verstoring van de aktiviteit en/of expressie van mitochondriale enzymen (cyclo-oxygenase, citraat-synthase, malondialdehyde), met mitochondrieën gerelateerde groei-factoren (PGC-1α, MAP (‘mitogen-activated protein’) -kinase [reageert op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleert verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose], BDNF), meer mtDNA-deleties [ontbrekende stukken in het mitochondriaal DNA], expressie van mitochondriale apoptotische factoren (DRPs [‘dynamin-related proteins’; betrokken bij mitochondriale splitsing], transcriptie-factor A [aktivator van mtDNA-transcriptie, verpakt mtDNA in DNA/proteïne-aggregaten (mitochondriale nucleoïden)]), een daling van het mitochondriaal membraan-potentiaal (ΔΨmt [het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste membraan]) en verhoogde aanmaak van mitochondriale reaktieve oxidatieve soorten (ROS). Anderzijds is het moeilijk om meerdere biomerkers voor de mitochondriale funktie in studies bij mensen te interpreteren: een daling qua leucocyten mitochondriaal trifunktioneel proteïne (mtMTP [enzyme op het binnenste mitochondriaal membraan dat 3 van de 4 stappen van de vetzuur-afbraak katalyseert]) of een toename van het NAD(P)H-oxidase [katalyseert de produktie van super-oxide] systeem van spier-mitochondrieën duidt niet noodzakelijk op mitochondriale schade na uitputtende inspanning. Tenslotte induceert een krachtige inspanning ernstige ultrastrukturele veranderingen in het organel, inclusief een onevenwichtige mitochondriale distributie […], en een hoge prevalentie van grote en gezwollen mitochondrieën met dense matrixen en ruwe of abnormale cristae. EIMD komt voor bij zowel mannen als vrouwen die verschillende vormen van inspanning tot uitputting krijgen te verwerken (bv. lopen, fietsen, zwemmen), bij zowel acute als chronische inspanning-modellen. Er zijn momenteel geen duidelijke richtlijnen betreffende diagnostische criteria voor EIMD. Het lijkt er op dat de ernst (en geïmpliceerde onomkeerbaarheid) van dit fenomeen een belangrijk aspect is dat zou moeten worden aangewend om het onderscheid te maken tussen voorbijgaande afname qua mitochondriale prestaties en ernstiger EIMD. Dit kan verband houden met cruciale veranderingen in het mtDNA of nucleair DNA (nDNA) (bv. grote deleties geïnduceerd door uitputtende inspanning) die de gen-expressie op het niveau van de transcriptie en/of translatie permanent wijzigen. Een extreme produktie van mitochondriale ROS en stikstof-soorten tijdens uitputtende inspanning lijkt inspanning-gerelateerde DNA-schade te induceren [Neubauer O et al. Exercise-induced DNA damage: is there a relationship with inflammatory responses? Exerc. Immunol. Rev. (2008) 14: 51-72], wat mtDNA bijzonder vatbaar maakt voor oxidatieve stress en een pathofysiologisch doelwit voor EIMD. mtDNA lijkt een veel hogere mutatie-graad te hebben in vergelijking met nDNA, aangezien het makkelijk wordt blootgesteld aan ROS-schade terwijl de beschermende histonen [histoon-proteïnen = kleine eiwitten met een hoog aantal positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA binden; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt] en andere DNA-herstel-mechanismen ontbreken. Daarom zou het monitoren van mtDNA-deleties in specifieke gebieden […] en wijzigingen in genetische profielen na inspanning (d.m.v. ‘hoge-resolutie digitale profilering’) kunnen worden gebruikt als nieuw instrument om de ernst en de progressie van EIMD te evalueren. Hoewel ROS-gemedieerde mtDNA-wijzigingen EIMD kunnen induceren, zouden ook andere mechanismen verantwoordelijk kunnen zijn. […]

Verhoogde produktie van ROS en reaktieve stikstof-soorten (RNS) tijdens lichamelijke inspanning treedt op ten gevolge zuurstof-afhankelijke bio-energetica in de mitochondrieën, waarbij de elektronen-transport-keten en mitochondriale xanthine-oxidase [ROS-genererend enzyme] aktiviteit de voornaamste bronnen zijn. Een andere inspanning-gerelateerde bron van ROS is de inflammatoire respons op weefsel-letsels (zoals die worden geïnduceerd door achteréénvolgende spier-contracties) met aktivatie van neutrofielen en macrofagen-infiltratie. Hyperthermie, dehydratatie en osmotische stress werden ook geïdentificeerd als onconventionele bronnen van ROS gegenereerd tijdens inspanning, waarbij de effekten van inspanning op ROS-produktie intensiteit-afhankelijk lijkt te zijn. Hoewel matige inspanning de mitochondrieën-gerelateerde ROS-aanmaak in evenwicht blijkt te houden en gunstige ROS-geassocieerde aanpassingen induceert, stimuleert uitputtende of langdurige inspanning een over-produktie van ROS. Vandaar: te veel ROS kan subcellulaire bio-molekulen, zoals lipiden, proteïnen & DNA beschadigen [Powers SK & Jackson MJ. Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production. Physiol. Rev. (2008) 88: 1243-1276], en de mitochondriale funktie erg in gevaar brengen, leidend tot EIMD.

Hoewel EIMD bij alle leeftijden voorkomt, lijkt het er op dat een gevorderde leeftijd een voorbestemmende factor kan zijn voor EIMD. Ouder-worden per se induceert diepgaande veranderingen qua mitochondriale vorm en funktie, inclusief DNA-deleties, verhoogde oxidatieve stress en verstoorde mitochondriale bio-energetica. Bij blootstelling aan krachtige inspanning, lijkt het dat oudere individuen makkelijker mitochondriale dysfunktie en versneld verval ontwikkelen. Onderzoekers evalueerden de effekten van zware inspanning in skeletspieren van muizen van 2 maand (jonge groep) en 24 maand (oude groep), onderworpen aan 5 dagen inspanning (rennen in een gemotoriseerde loopband tot uitputting). Deze uitputtende inspanning resulteerde bij oudere muizen in een daling van zowel fusie- en splitsing- (respectievelijk mitofusine-2 & DNM1L) proteïnen [mitochondrieën ondergaan verlenging, fusie en splitsing; wat de recyclage van membranen toelaat en het herwinnen van onbeschadigd mtDNA om de mitochondriale funktie te behouden] die zouden kunnen bijdragen tot wijziging van mitochondriale morfologie, en verminderde PGC-1α nucleaire translocatie [verplaatsing naar de cel-kern]. Verder was er een 69% toename qua interleukine-1β (een belangrijke mediator van de inflammatoire respons) in de oude groep, terwijl uitputtende inspanning deze biomerker niet beïnvloedde in jonge muizen. De auteurs concludeerden dat uitputtende inspanning in verouderende spieren mitochondriale schade verergert en dat het een ongeschikte manier van inspannen is voor het behandelen van veroudering en ouderdom-gerelateerde mitochondriale ziekten.

Een andere factor die de vatbaarheid voor EIMD zou kunnen bepalen, is de voorafgaande training-status. EIMD treft zowel getrainde als ongetrainde individuen maar toch lijkt dit fenomeen frequenter bij over-getrainde mensen, wat een dosis-respons voor EIMD suggereert. Herhaalde blootstelling aan extreem zware of langdurige inspanning-aktiviteit kan bij vatbare individuen mitochondriale schade induceren die met verloop van tijd accumuleert, en uiteindelijk chronisch wordt en niet meer te herstellen, met lange-termijn implicaties voor inspanning-prestaties en gezondheid [St Clair Gibson A et al. Chronic exercise activity and the fatigued athlete myopathic syndrome (FAMS). Int. SportMed. J. (2000) 1: 1-7]. Er werd tot hier toe echter geen duidelijke blootstelling-respons verband tussen uitputtende inspanning-belasting (bv. frequentie, intensiteit, duur en type inspanning) en EIMD beschreven. Inspanning-intensiteit zou echter een cruciale rol kunnen spelen bij de etiolgie van EIMD, aangezien de expressie van het stress-proteïne ‘heat-shock’ proteïne (Hsp70) – dat de mitochondriale funktie mee reguleert – afhankelijk is van inspanning-intensiteit [Milne KJ & Noble EG. Exercise-induced elevation of Hsp70 is intensity dependent. J. Appl. Physiol. (2002) 93, 561-568]. Tenslotte blijkt EIMD weefsel-specifieke responsen te vertonen, waarbij myocardiale mitochondrieën het meest te lijden hebben van uitputtende inspanning, in vergelijking met die van de de hersenen, lever of skeletspieren. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het hoger zuurstof-verbruik per milligram proteïnen in hart-mitochondrieën en de daaruitvolgende hyper-produktie van organel-beschadigende ROS.

Mogelijke gevolgen van EIMD voor de gezondheid

Hoewel regelmatige fysieke aktiviteit gezondheid-risico’s voor vele ziekten vermindert, hebben studies gedocumenteerd dat uitputtende inspanning – zelfs bij gezonde individuen – een waaier aan gevaren voor de gezondheid oplevert; een feit dat bezorgdheid opwekte omtrent de schadelijke gevolgen van dergelijke inspanning. Naast andere mogelijke factoren, zou EIMD een belangrijke factor kunnen zijn voor de negatieve resultaten van uitputtende inspanning, omwille van het feit dat het een pathofysiologisch substraat is voor hart-abnormaliteiten, chronische vermoeidheid en over-training syndroom of spier-degeneratie. Er werd [bij ratten] aangetoond dat belastende inspanning biochemische veranderingen in myocardiale mitochondrieën (bv. verminderde mitochondriale accumulatie van Ca2+) kan opleveren die de hart-funktie nadelig kan beïnvloeden na opéénvolgende uitputtende inspanningen. Anderen vonden opgezwollen mitochondrieën in cardiomyocyten van uitgeputte ratten, met mogelijke hart-ritme-verstorende veranderingen […]. Chinese researchers evalueerden door inspanning geïnduceerde hart-letsels bij ratten na herhaalde uitputtende inspanning. Er werd ook geschreven over significante mitochondriale veranderingen, vergezeld door ischemische wijzigingen, cellulaire schade aan het cytoskeleton en ‘gap-junctions’ [eiwit-kanalen die het cytoplasma van naburige cellen met elkaar verbinden, waardoor ionen en ‘boodschapper-molekulen’ kunnen stromen], en weefsel-fibrose in het cardiaal geleiding-systeem, waarbij de mitochondriale stoornissen hart-ritme-stoornissen induceren. Er werd ook gerapporteerd over dysfunktionele mitochondrieën-gerelateerde cardiale stress bij ratten die werden gedwongen 3 h te zwemmen, inclusief een ontregeling van het matrix metalloproteinase-systeem [matrix-metalloproteïnasen of MMPs zijn enzymen die in staat zijn de extracellulaire matrix (bindweefsel) af te breken], verhoogde nitro-oxidatieve stress en sporadische fragmentatie van de myocard-struktuur. Klinisch relevante stoornissen van de haemodynamiek (bv. verhoogd eind-systolisch volume, verminderde ejectie-fractie, gestoorde samentrekbaarheid en mechano-energetica van het linker-ventrikel na inspanning) gingen samen met histologische veranderingen. Er zijn ons geen studies bij mensen bekend die EIMD linken met cardiale dysfunktie maar sommige hart-ritme-stoornissen bij atleten zouden een mitochondriale oorsprong kunnen hebben en op mitochondrieën gerichte anti-oxidanten kunnen een nieuwe anti-arythmische behandeling zijn [Yang KC et al. Mitochondria and arrhythmias. Free Radical Biol. Med. (2014) 71: 351-361].

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een complexe medische aandoening met aanhoudende post-exertionele malaise, wijdverspreide musculoskeletale pijn, en mentale en fysieke uitputting die niet substantieel verbetert door rust, is een aandoening met onbekende etiologie, die wereldwijd tot 5% van de algemene bevolking treft. Meerdere studies suggereren dat mitochondriale dysfunktie betrokken is bij de pathofysiologie van CVS [Myhill S, Booth NE & McLaren-Howard J]. Daarnaast kan langdurige zware inspanning CVS induceren bij atleten of uitputting aanzwengelen bij CVS-patiënten [Staud R et al. Evidence for sensitized fatigue pathways in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain (2015) 156: 750-759], wat suggereert dat EIMD een co-factor zou kunnen zijn die CVS triggert. Over-training is een andere aandoening die gerelateerd kan zijn met EIMD. Over-training wordt gewoonlijk beschreven als een langdurige excessieve belasting met ontoereikend herstel die gepaard gaat met verminderde prestaties. De diagnose blijft moeilijk te stellen en omwille van de ongekende oorzaak zo ook het management. Een bepalend artikel door St Clair Gibson et al. [zie hierboven] beschreef meerdere gevallen van mitochondriale pathologie in schijnbaar gezonde maar over-trainde top-atleten, met schadelijke veranderingen qua skeletspier-struktuur en -funktie geassocieerd met vele jaren excessieve training en competitie. De auteurs suggereerden dat de spier-regeneratie na uitputtende inspanning wel eens niet eindig zou kunnen zijn en dat die, wanneer die wordt overschreden, over-training en verslechtering van de atletische prestaties initieert. Anderen [Wang X et al. Mitochondrial dysfunction-associated OPA1 cleavage contributes to muscle degeneration: preventative effect of hydroxytyrosol acetate. Cell Death Dis. (2014) 5, e1521] suggereerden daarom ook dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de ontwikkeling van spier-aandoeningen, inclusief wegkwijnen van spieren, spier-atrofie en -degeneratie. Vorming van ROS en oxidatieve stress in de skeletspieren zijn cruciaal voor mitochondriale dysfunktie die wordt gekenmerkt door downregulering van OPA1 (een belangrijk proteïne bij de regulering van fusie en her-modelering van het mitochondriaal binnenste membraan) en verlies van myosine zware-keten proteïne [‘myosin heavy chains’, MyHC; van belang bij spier-samentrekking], dat uiteindelijk leidt tot significante morfologie-wijzigingen in myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] en spiercel-degeneratie. De rol van mitochondrieën bij spier-beschadigende inspanning werd bevestigd via een andere proef [zie Feng Z et al. hierboven] – waarbij door krachtige inspanning geïnduceerde spier-dysfunktie gepaard ging met verhoogde mitochondriale splitsing, gestegen merkers voor spier-atrofie […] en cel-autofagie triggerede. Interessant is dat in deze studie meer mitochondriale splisting in beschadigde myocyten na zware inspanning (geëvalueerd via een toename van DRP1 [‘dynamin-related protein 1’, enzyme dat zorgt voor de splisting in 2 dochter-mitochondrieën]) gelijkaardig was met de DRP1-respons in skeletspieren na een dieet met een hoog vet-gehalte [muizen], wat misschien suggestief is voor een gelijkaardig mechanisme van mitochondriale dysfunktie in een inspanning-geïnduceerd model en obesitas. Ondanks het beperkt begrip aangaande mechanismen verantwoordelijk voor met mitochondrieën gerelateerde spier-aandoeningen, zou EIMD echter verder moeten worden onderzocht als een mogelijk pathogene factor voor myocyten-schade in vivo. Hoewel EIMD meer voorkomt in skeletspieren, rapporteerden andere onderzoekers dat uitputtende inspanning ook mitochondriale dysfunktie in de hersenen bevordert [bij muizen], waarschijnlijk omwille van inspanning-geïnduceerde inhibitie van de BDNF-produktie in de frontale cortex. Dit kan de cognitieve stoornissen verklaren die worden gezien bij CVS en over-training syndroom. Er zijn echter meer studies nodig om een link tussen EIMD en gevolgen voor de gezondheid van uitputtende inspanning bij atleten en de klinische populaties op lange-termijn vast te stellen.

Management-strategieën voor EIMD

Naast inspanning-interventies, die waarschijnlijk het sleutel-element vertegenwoordigen bij de preventie van en het omgaan met dysfunktionele mitochondrieën, kunnen wellicht meerdere op mitochondrieën gerichte agentia worden overwogen om EIMD te overwinnen of minstens te verminderen. Het ondersteunen van mitochondriale bio-energetica en het helpen herstellen van mtDNA na uitputtende inspanning, en het behouden van een hoog anti-oxidant vermogen om toxische ROS in het organel op te ruimen, zijn mogelijke behandel-opties voor mitochondriale dysfunktie geïnduceerd door extreem zware of langdurige inspanning. Anti-oxidanten en verwante ‘nutraceuticals’ worden alom besproken in de klinische en voeding-literatuur. Er zijn echter slechts een beperkt aantal studies die de doeltreffendheid van op mitochondrieën gerichte interventies bij EIMD evalueerden d.m.v. organel-specifieke biomerkers. De beschermende effekten van salidroside, een molekule uit de plant Rhodiola rosea op mitochondriale dysfunktie en cardiomyocyten-beschadiging (geïnduceerd door een uitputtend zwem-inspanning) bij ratten werd gëevalueerd. Toediening van salidroside (100-300 mg/kg per dag gedurende 2 weken) verminderde myocard-letsels en ultrastrukturele mitochondriale misvormingen, bewaarde de mitochondriale respiratoire funktie, en ging onaangepaste gen-expressie van PGC-1α en nucleaire respiratoire factoren (NRF-1 & NRF-2) [regelen cel-groei en nucleaire genen die vereist zijn voor de cellurlaire ademhaling] tegen, vergeleken met de controle-groep die een placebo kreeg. In een andere studie rapporteerden over de beschermende effekten van hydroxytyrosol, een natuurlijk polyfenol uit olijven, bij spier- en mitochondriale dysfunktie (geïnduceerd door krachtige inspanning) in ratten. Behandeling met hydroxytyrosol (25 mg/kg per dag gedurende 8 weken) inhibeerde de toename van autofagie en mitochondriale splitsing, en de afname van PGC-1α expressie geïnduceerd door excessieve inspanning. Daarnaast versterkte hydroxytyrosol mitochondriale fusie en aktiviteiten van mitochondriaal complex-I & -II. Een studie onderzocht de effekten van Galdieria sulphuraria microalgen op EIMD opgewekt door acute krachtige inspanning (6 h zwemmen) bij ratten. Behandeling met G. sulphuraria (10 g/kg per dag gedurende 10 dagen) verminderde de door inspanning toegenomen protiëne-carbonyl inhoud, een indicator voor oxidatieve schade, in mitochondrieën van het hart en de spieren van ratten na zware inspanning. Daarnaast werden gunstige effekten gerapporteerd van oraal quercetine (100 mg/kg per dag gedurende 4 weken) op myocardiale mitochondriale oxidatieve stress en dysfunktie bij muizen onderworpen aan zware inspanning; waarschijnlijk door z’n anti-oxidatief effekt en aconitase [enzyme dat citraat naar isocitraat omzet; inhibitie ervan vermindert de cellulaire energie-voorraad] -aktivatie, wat een beloftevolle strategie voor EIMD door dit natuurlijk flavonoïd benadrukt. Een Chinees team meldde gunstige effekten van een mitochondriale cocktail van nutriënten (α-liponzuur, acetyl-L-carnitine, biotine, nicotinamide, riboflavine, pyridoxine, creatine, coenzyme-Q10, resveratrol & taurine) op de mitochondriale gezondheid bij ratten na uitputtende inspanning. Supplementering met nutriënten verhoogde de proteïnen-expressie van mitochondriaal complex-I, -II & -III, mtDNA-aantal en transcriptie-factoren betrokken bij mitochondriale biogenese en funktie in skeletspieren. Dezelfde groep rapporteerde gelijkaardige resultaten met een combinatie van nutriënten gericht op mitochondrieën (α-liponzuur, creatine, B-vitaminen, polyfenolen) die verbetering van complex-V en aktiviteit van een FAD-bindend flavoproteïne enzyme brachten, en versterking van de aktiviteiten van complex-I & -IV in lever-mitochondrieën van ratten die gedurende 4-weken werden onderworpen aan krachtige inspanning. Deze 2 studies suggereren dat supplementering met een multi-component nutriënten-preparaat EIMD kan verminderen, hoewel de bijdrage van elk nutrient onbekend blijft. Aan de andere kant rapporteerden bleek een L-arginine-rijk dieet (2%) geen significante impact te hebben op courante mtDNA-deleties in spier- en lever-mitochondrieën van ratten na uitputtende inspanning. Er zijn geen studies beschikbaar betreffende andere op mitochondrieën gerichte nutraceuticals bij EIMD, inclusief kleine anti-oxidante molekulen (bv. mitoquinon [MitoQ of MitoQ10], mito-tocopherol [MitoVitE; “beschermt mitochondrieën tegen oxidatieve stress via inhibitie van lipiden-peroxidatie”], mito-apocynin [Mito-Apo; “beschermt tegen oxidatieve schade en glia-gemedieerde inflammatie”]) en molekulaire waterstof, die werden ontworpen om zich op te stapelen in de mitochondrieën in vivo [Ostojic SM. Targeting molecular hydrogen to mitochondria: barriers and gateways. Pharmacol. Res. (2015) 94, 51-53]. Daarom zijn verdere studies vereist om alle op mitochondrieën gerichte interventies voor EIMD – inclusief nieuwe behandelingen (bv. ketogeen dieet, sirtuinen [klasse van HDACs – histoon-deacetylasen, enzymen die acetyl-groepen (O=C-CH3) verwijderen; van belang bij de vertaling van RNA], protopanaxadiol [molekule uit ginseng]) [Rai PK et al. Potential compounds for the treatment of mitochondrial disease. Br. Med. Bull. (2015) 116: 5-18] – te evalueren.

Een ander controversieel aspect van het eventueel gebruik van anti-oxidanten bij EIMD dient ook te worden besproken. Er is steeds meer bewijsmateriaal dat eerder schadelijke effekten van supplementering met anti-oxidanten bij training suggereert, waarbij een hoge dosis anti-oxidanten nadelig zou kunnen interfereren met belangrijke door ROS gemedieerde fysiologische processen (zoals proteïne-signalisering, mitochondriale biogenese of vasodilatie. Er werden negatieve uitkomsten van supplementering met anti-oxidanten gevonden bij fietsers, trialeten, marathon-loper, kayakers en ongetrainde individuen die verschillende anti-oxidanten – zowel water- als vet-oplosbare – kregen toegediend. Aangezien het potentieel voor langdurende schade van supplementering met anti-oxidanten bestaat, dient het gebruik van hoge dosissen anti-oxidanten bij EIMD misschien te worden beperkt tot dat er ‘evidence-based’ richtlijnen zijn.

Besluit

Mitochondrieën kunnen zichzelf doeltreffend beschermen tegen de accumulatie van externe en interne stress via verscheidene mechanismen. Wanneer de bescherming-mechanismen echter uitgeput raken door of gewijzigd omwille van repetitieve herhaalde inspanning en onvoldoende herstel na inspanning, kan EIMD ontstaan. Hoewel er geen studie bestaat die de mitochondriale gezondheid (en herstel na inspanning) op lange termijn volgde na één enkele sessie uitputtende inspanning, is het zeer onwaarschijnlijk dat één enkelvoudige inspanning tot onherstelbare mitochondriale stoornissen leidt – ten minste bij ongetrainde individuen. Frequente uitputtende inspanningen laten mitochondrieën echter misschien wel niet toe zich volledig te herstellen van inspanning-stress, en ernstige DNA-deleties en ultrastrukturele schade (voornaamste merkers voor EIMD) te repareren. Hypothetisch gezien kan uitputtende inspanning een regelmatige mitochondriale levenscyclus – bestaande uit ca. 5 fusie/splitsing-cycli per uur per mitochondrion – in gevaar brengen, leidend tot langdurige slechte mitochondriale prestaties en gevolgen voor de gezondheid. Dit literatuur-overzicht identificeerde mogelijke verbanden tussen uitputtende inspanning en mitochondriale dysfunktie bij mensen; de bevindingen waren echter beperkt tot ‘cross-sectionele’ studies [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] (geen longitudinale effekt-studies), waarbij de definitie van uitputtende inspanning soms onduidelijk is. Er zijn in vivo inspanning-studies nodig bij klinische en atletische populaties die de drempel – die moet worden overschreden om het organel onomkeerbaar te beschadigen – beschrijven.

Klinische Perspectieven

Extreem zware of uitputtende inspanning bevordert mitochondriale stoornissen die de werking ervan permanent kunnen beschadigen. Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie kan een belangrijke factor zijn voor hart-abnormaliteiten, chronische vermoeidheid en over-training syndroom, of spier-degeneratie bij atleten. Het ondersteunen van mitochondriale bio-energetica en het helpen om mitochondriaal DNA te herstellen na uitputtende inspanning, en het behouden van een optimaal anti-oxidant vermogen om toxische reaktieve zuurstof-soorten in het organel op te ruimen, omvat mogelijke behandel-opties voor inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.