M.E.(cvs)-wetenschap

augustus 28, 2014

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:04 am
Tags: , , , , ,

Prof. Patrick O. McGowan, Ph.D. is één van de door het ‘Solve ME/CFS Initiative’ (solvecfs.org) gefinancierde onderzoekers. Hij is assistent-professor aan het Departement Biologische Wetenschappen van de Universiteit van Toronto (Canada).

Onderstaande studie werd aangekondigd als de eerste die epigenetische modificaties (die de manier beïnvloeden waarop genen aan- en afgezet worden zonder de gen-sequenties zelf te veranderen) vond in het genoom van (vrouwelijke) M.E./CVS-patiënten. De auteurs hadden blijkbaar nog geen weet van een gelijkaardige studie waar we eerder over rapporteerden (zie ‘Methylatie-profiel van CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.’). De resultaten hier bevestigen (op een onafhankelijke manier) grotendeels deze van de Australische groep (“epigenetische veranderingen in CD4+ T-cellen kunnen een rol spelen bij de immunologische veranderingen die worden gezien bij CVS/M.E.-patiënten”). Er waren heel wat epigenetische modificaties in en rond immuun-genen en deze veranderingen kunnen de werking van immuun-cellen aantasten.

Deze research zou kunnen leiden tot de identificatie van diagnostische merkers en behandelingen voor M.E./CVS. Ze toont ook eens te meer onbetwistbaar aan dat er een biologische basis is voor de aandoening.

————————-

PLoS One. 9 (8): e104757 Aug 2014

DNA Methylation Modifications Associated with Chronic Fatigue Syndrome

Wilfred C. de Vega (1,2,3), Suzanne D. Vernon (4), Patrick O. McGowan (1,2,3)

1 Centre for Environmental Epigenetics and Development, University of Toronto, Scarborough, ON, Canada

2 Department of Biological Sciences, University of Toronto, Scarborough, ON, Canada

3 Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

4 CFIDS Association of America, Charlotte, North Carolina, United States of America

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook Myalgische Encefalomyelitis genoemd, is een complexe multifactoriële ziekte die wordt gekenmerkt door de aanhoudende aanwezigheid van vermoeidheid en andere symptomen gedurende minimum 6 maanden. De symptomen gaan niet weg na voldoende rust en hebben nefaste effekten op het dagdagelijks funktioneren van zij die lijden aan CVS. Het is een multi-systeem ziekte met een heterogene patiënten-populatie die een brede waaier aan funktionele gebreken vertoont en de biologische basis blijft slecht begrepen. Er werden stabiele wijzigingen van de werking van genen van het immuunsysteem gerapporteerd in meerdere studies bij CVS. Epigenetische modificaties bleken betrokken bij de de lange-termijn effekten op de werking van genen. Epigenetische modificaties, over gans het genoom, geassocieerd met CVS werden echter, naar ons weten, nog niet onderzocht. Wij keken naar het DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] in perifeer bloed mononucleaire cellen geïsoleerd bij CVS-patiënten en gezonde controles d.m.v. de ‘Illumina HumanMethylation450 BeadChip array’ […]. Er werd gen-ontologie (GO) en netwerk-analyse van differentieel gemethyleerde genen uitgevoerd om mogelijke biologische mechanismen te bepalen die veranderingen in DNA-methylatie vertonen bij CVS. We vonden een toegenomen aanwezigheid van differentieel gemethyleerde genen gerelateerd aan de immuun-respons, het cellulair metabolisme en kinase-aktiviteit. Genen geassocieerd met immuun-cel regulering, de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde mechanismen, vertoonden hypomethylatie in promoters en andere gen-regulerende elementen bij CVS. Deze gegevens zijn consistent met bewijs voor multi-systemische ontregeling bij CVS en impliceren de betrokkenheid van DNA-modificaties bij de CVS-pathologie.

Inleiding

[…]. Symptomen verbonden met immuun-ontregeling en abnormaliteiten in de werking van het immuunsysteem zijn een consistent kenmerk van CVS.

Studies die gen-regulering onderzoeken gebruikmakend van vol-bloed en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs), die voornamelijk zijn samengesteld uit lymfocyten en monocyten, geven abnormaliteiten aan wat betreft lymfocyten-funktie bij CVS. Mensen die lijden aan CVS vertonen een ontwrichting van de homeostase tussen de Th1- (cel-gemedieerde) en Th2- (humorale) immuun-respons, waarbij CVS geassocieerd is met een overwegende Th2-gemedieerde immuun-respons. Deze verschuiving naar Th2-responsen wordt vergezeld door gerapporteerde verhogingen qua anti-inflammatoire cytokinen bij CVS. De cytokine-profiel veranderingen bij CVS blijven echter onduidelijk, aangezien andere micro-array en cytokine-profilering studies bewijs hebben gevonden voor verhoogde pro-inflammatoire cytokine expressie bij CVS. Er werd gemeld dat de funktie van ‘natural killer’ verstoord is bij CVS. Een verschil in CD8+ T-cel aktivatie is ook een overheersende bevinding. Het blijft dus onduidelijk welk immuun-cel type het meest relevant is bij de CVS-pathologie, en discrepanties in de immunologische resultaten zouden verklaard kunnen worden door studie-parameters zoals methodologische verschillen, alsook heterogeniteit qua klinische kenmerken gelinkt aan CVS.

Een groeiend aantal studies heeft epigenetische modificaties geassocieerd met immuun-responsen onderzocht in de context van ziekte. Epigenetische modificaties, zoals DNA-methylatie, die voornamelijk voorkomen op de cytosines van CpG dinucleotide sites (CpG) doorheen het genoom, zouden gen-expressie kunnen reguleren zonder de onderliggende gen-sequentie te wijzigen en optreden door genetische, stochastische [door toeval bepaald] en milieu-factoren. Naar ons weten werden epigenomische veranderingen geassocieerd met CVS nog niet onderzocht. [zie referentie in onze inleiding]

Voor deze studie selekteerden we 12 vrouwelijke CVS-patiënten en 12 gezonde vrouwelijke controles (uit een groep van 231 patiënten gerecruteerd uit 4 klinische centra) gematcht voor leeftijd en ‘body-mass-index’ (BMI), waarbij obese individuen en personen die immunomodulerende medicatie namen, werden uitgesloten, aangezien dit epigenetische en immuun-profielen zou kunnen wijzigen. De methylomen werden onderzocht in PBMCs gebruikmakend van de ‘Illumina HumanMethylation450 Bead-Chip (450 K) array’, die meer dan 480.000 CpG-sites en 98,9% van RefSeq genen [De Referentie Sequentie database is een verzameling nucleotide-sequenties (DNA, RNA) en hun proteïnen die toegankelijk is voor het publiek.] in het menselijk genoom beslaat. We voerden gen-ontologie (GO) en gen-netwerk analyse uit op differentieel gemethyleerde genen om biologische mechanismen geassocieerd met methylatie-veranderingen bij CVS te bepalen.

Materialen & Methodes

Ethische verklaring

[…]

Individuen & selektie-criteria

[…] De RAND-36, een gevalideerde zelf-rapportering inventaris werd gebruikt om de met gezondheid gerelateerde levenskwaliteit te bepalen. CVS-diagnose was gebaseerd op de Fukuda- en de Canadese criteria. Mensen met AIDS, HIV en/of Hepatitis-C werden uitgesloten. […] We selekteerden blanke vrouwelijke individuen van 52 jaar of jonger, met een BMI < 30 en die geen immunomodulerende medicijnen en medicatie met gekende effekten op epigenetische mechanismen [6-mercaptopurine, 6-thioguanine, aldosteron, amitriptyline, azacitidine, betamethason, carbamazepine, cortison-acetaat, decitabine, deoxycorticosteron-acetaat (DOCA), dexamethason] innamen. […] Alle CVS-individuen hadden een infektie-fenotype (griep-achtige ziekte vóór de CVS-diagnose). Na toepassing van deze exclusie-criteria bleven 12 CVS-patiënten en 12 gematchte gezonde controles (23-52 jaar en een BMI tussen 18,6-29,8) over.

Bloed-afname en PBMC-isolatie

[…] [De Australische groep onderzocht CD4+ T-cellen]

Extractie en bereiding van genomisch DNA

[…]

Verzameling van gegevens van de epigenomische micro-array

[…] De ‘Infinium HumanMethylation450 BeadChip’ (450 K) array beslaat 480.000 CpG methylatie-sites inclusief promoters, onvertaalde gebieden (UTRs), gen-lichamen en CpG-eilanden. […]

Validering van de micro-array

[…]

Gen-ontologie (GO) en netwerk-analyse

[…]

Statistische analyses

[…]

Resultaten

[De Australische groep vond “overwegend hypomethylatie bij de CVS/M.E.-patiënten en die was overwegend in de promoter-gebieden van genen gelokaliseerd”.]

Demografie, kenmerken en RAND-36 scores van de individuen

[…] De groepen verschilden niet significant qua leeftijd en BMI. Er was een impact op meerdere aspecten van het lichamelijk en sociaal funktioneren van de CVS-patiënten, en dit was significant verschillend van de gematchte gezonde controles (RAND-36). De scores voor Emotionele Rol en Mentale Gezondheid waren gelijkaardig.

Identificatie van differentieel gemethyleerde CpG-sites bij CVS

[…] Er werden 1.192 CpG-sites geïdentificeerd als differentieel gemethyleerd […] corresponderend met 826 genen. […]

Een totaal van 934 differentieel gemethyleerde CpG-sites werden gevonden in of in de nabijheid van genen (gen-gerelateerde lokaties) en 448 differentieel gemethyleerde CpG-sites werden in kaart gebracht met betrekking tot hun ligging ten opzichte van CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. In de gen-gerelateerde gebieden vertoonde 30% van de differentieel gemethyleerde gebieden hypomethylatie en 70% hypermethylatie. Differentiële methylatie kwam overwegend voor in gebieden 1.500 bp en 200 bp proximaal aan transcriptie-startplaatsen [TSS] (31% in TSS1500 [binnen 1500 bp van een TSS] en TSS200 [binnen 1500 bp van een TSS]) en breder binnen gen-regulerende elementen (78% in TSS1500, TSS200, 5’UTR en 3’UTR [UTR = ‘untranslated regions’; geven start- en stop-signalen aan voor translatie]). Gen-lichamen bevatten 22% differentiële methylatie. […]

Validering van de micro-array resultaten d.m.v. ‘pyrosequencing’

Drie als significant verschillend geïdentificeerde CpG-sites werden geselekteerd voor ‘pyrosequencing’ [moderne vorm van sequentie-bepaling]. Ze lagen in de genen LY86, HIPK3 en LCN2. De methylatie-verschillen werden bevestigd […].

Gen-mechanisme aanrijking via differentiële DNA-modificatie bij CVS

[…] Er werden 4 cluster-groepen geïdentificeerd, bestaande uit 57 GO-termen: 4 GO-termen voor cellulaire componenten, 13 GO-termen voor positieve metabole regulering, 18 GO-termen voor kinase-aktiviteit en 22 GO-termen voor immuun-cel regulering. […]

Binnen de 4 cluster-groepen, waren 511 unieke genen met een totaal aantal van 637 CpG-sites significant ge-hypermethyleerd bij de CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles en 184 unieke genen met 237 CpGs significant ge-hypomethyleerd. […] Om de mogelijke biologische betekenis van de differentieel gemethyleerde CpG-sites te onderzoeken, bepaalden we de lokalisatie van de differentieel gemethyleerde CpGs in promoter-gebieden binnen 1500 bp en 200 bp van transcriptie-start sites, in gen-regulerende elementen en coderende gen-gebieden (gen-lichaam). Voor de ge-hypermethyleerde genen was het aandeel differentieel gemethyleerde CpGs in TSS, regulerende elementen en gen-lichaam gebieden 73,05%, 70,83% & 74,17%, respectievelijk. Voor ge-hypomethyleerde genen: 26,95%, 29,17% & 25.84%.

Daarna onderzochten we differentiële methylatie van specifieke genen in de immuun-cel regulering cluster, gezien deze de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde gen-mechanismen vertoonde, met 22 GO-termen. In het totaal bevatte de immuun-cel regulering cluster 124 unieke genen met 144 ge-hypermethyleerde CpG-sites en 68 unieke genen met 96 ge-hypomethyleerde CpG-sites bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. In genen van de immuun-cel regulering cluster was het aandeel ge-hypermethyleerde CpGs in TSS, regulerende elementen en gen-lichaam 52,73%, 54,9% & 63,77%, respectievelijk Voor ge-hypomethyleerd CpGs was dat 47,27%, 45,09% & 36,23%. Vergeleken met alle 4 GO-clusters vertoonden genen in de immuun-cel regulering cluster een significante aanrijking qua relatief aandeel ge-hypomethyleerde CpGs in TSS en gen-regulerende elementen […] maar niet in gen-lichaam gebieden. […] Over het algemeen was een groter deel van de differentieel gemethyleerde CpG-sites ge-hypomethyleerd bij genen in alle gebieden van de immuun-cel regulering cluster (40%) vergeleken met deze in alle 4 de cluster-groepen (27,12%), wat een verschuiving aangeeft naar ge-hypomethyleerde immuun- genen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles.

Bespreking

CVS is een ernstige en invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door een constellatie lichamelijke symptomen en waarvan bekend is dat ze optreedt na infektie. Deze studie focuste op een subgroep individuen die een plotse, infektueuze aanvang van hun CVS meldden en post-exertionele malaise langer dan 24 uur, cognitieve stoornissen en minstens 2 van deze RAND-36 scores (vitaliteit ≤ 35, sociaal funktioneren ≤ 62,5, rol lichamelijk funktioneren ≤ 50) vertoonden. Alle lichamelijke en sociale concepten die werden gemeten, waren significant verschillend tussen patiënten en controles, terwijl 2 sub-schalen van de mentale gezondheid niet verschilden. Er was een ernstige impact op het lichamelijk en sociaal funktioneren bij CVS […], een zeer consistente bevinding. Dit geeft ook aan dat zelfs al betrof het een kleine studie-groep, deze zorgvuldige geselekteerd was en hoogstwaarschijnlijk representatief voor CVS met een plotse aanvang.

Deze studie rapporteert meerdere belangrijke bevindingen. We identificeerden differentieel gemethyleerde CpG-sites in PBMCs van vrouwelijke CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, die waren gematcht om te controleren voor mogelijke invloeden op de epigenetische profielen van leeftijd, BMI en medicatie. We vonden significante verschillen qua DNA-methylatie tussen CVS-patiënten en gezonde controles op 1.192 CpG-sites in 826 genen, en differentiële DNA-methylatie aanwezig in promoters, gen-regulerende elementen en binnen coderende gebieden van genen. Er waren GO-termen gerelateerd met cellulaire processen, positieve metabole regulering, kinase-aktiviteit en de immuun-respons aangerijkt bij CVS-patiënten; gelijkaardige GO-termen werden gevonden via kwantitatieve kenmerken-analyse van de gen-expressie in een afgebakende populatie CVS-patiënten [Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene-expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405]. Het organiseren van de GO resulteert in een netwerk dat een over-representatie van termen die verband houden met immuun-cel regulering aangeeft, wat consistent is met eerdere studies die de funktionele veranderingen in immuun-profielen geassocieerd met CVS onderzochten. Differentieel gemethyleerde genen gerelateerd met immuun-cel regulering vertooden een verhoogd aandeel ge-hypomethyleerde CpG-sites bij de CVS-patiënten, in het bijzonder in promoters en in gen-regulerende elementen, met betrekking tot de verdeling van differentieel gemethyleerde sites in het netwerk als geheel.

Differentiële methylatie van gen-regulerende elementen wordt klassiek geassocieerd met veranderingen qua gen-expressie. In genen van de immuun-cel regulering cluster, vonden we een aantal differentieel gemethyleerde CpGs in gen-regulerende elementen die geassocieerd zijn met de immuun-respons. Deze gegevens zijn consistent met eerdere observaties van een Th1- naar Th2-gemedieerde verschuiving van de immuun-respons bij CVS [Broderick G, Fuite J, Kreitz A, Vernon SD, Klimas N, Fletcher MA: A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun (2010), 24: 1209-1217 – zie ‘Cytokine-netwerken bij CVS]. Een aantal studies hebben een veranderde werking van het immuunsysteem gelinkt met CVS, en hebben gevonden dat gen-expressie verschillen in sommige immuun-genen in PBMCs kunnen worden aangewend om CVS-patiënten en gezonde controles van elkaar te onderscheiden [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U et al. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-386. /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T et al. (2008) Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol (2008) 2: 95]. Transcriptie-profilering heeft aangegeven dat er verstoringen zijn in T-cel [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol (2005) 58: 826-832 /// Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S et al. Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients. Clin Exp Allergy (2003) 33: 1450-1456 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers (2002) 18: 193-199] en B-cel aktivatie [Aspler AL, Bolshin C, Vernon SD, Broderick G. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct (2008) 4: 44 = Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS], en ontregeling van de gen-expressie was in grote lijnen gerelateerd met immuun-responsen [Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis (2008) 197: 1171-1184]; veranderingen die parallel lopen met andere studies die een veranderde produktie van interleukine en interferon bij CVS-patiënten aantoonden. Consistent met deze observaties, zagen we ook veranderingen in DNA-methylatie binnen een aantal genen waarvan is geweten dat ze de adaptieve immuun-respons reguleren. Bv.: BCL10, FCER2 en IL1RL1/ST2 waren ge-hypermethyleerd bij de genen in de immune GO-cluster. BCL10 is een gekende aktivator van het NF-κB mechanisme, wat in lijn ligt met de immuun-respons verschillen die worden gezien bij CVS. FCER2 bleek betrokken bij B-cel aktivatie en er werden expressie-verschillen gezien in B-cellen geïnfekteerd met het Epstein-Barr virus. Ten slotte: IL1RL1/ST2 is een gekende Th2-cel merker die MAP-kinasen aktiveert. Op dit moment weten we niet of deze epigenetische modificaties homeostatische compensaties aangeven of het gevolg zijn van een adaptie van de immuun-respons aan milieu-blootstellingen. Deze resultaten zijn consistent met DNA-methylatie als een mogelijk mechanisme voor langdurige effekten op de regulering van gen-expressie en de bekende lange-termijn wijzigingen in de gen-expressie die werden gezien in eerdere studies bij CVS.

CpG-sites met hypomethylatie waren significant aangerijkt in promoters en gen-regulerende elementen van genen die verband houden met immuun-signalisering. Het is mogelijk dat deze immuun-genen verhoogde transcriptie of een verhoogd transcriptioneel potentieel vertonen, ten minste bij de CVS-groep die in deze studie werd geselekteerd; aangezien promoter-hypomethylatie over het algemeen geassocieerd is met een toename van de gen-expressie. Het is geweten dat CVS-symptomen erger worden en significante zwakte na inspanning veroorzaken, gepaard met een verhoging van de expressie van inflammatoire genen [Light AR, Bateman L, Jo D, Hughen RW, Vanhaitsma TA et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and Fibromyalgia Syndrome. J Intern Med (2012) 271: 64-81 = Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM]. Dergelijke gegevens suggereren dat latente wijzigingen in de werking van het immuunsysteem zouden kunnen ‘ontmaskerd’ worden onder belastende omstandigheden. Toekomstige studies gericht op het onderzoeken van het verband tussen epigenetische en gen-expressie profielen bij CVS-patiënten onder basale en uitdagende omstandigheden zullen informatief blijken bij het ophelderen van de relatie tussen epigenetische mechanismen en funktionele wijzigingen van de gen-regulering bij CVS.

Epigenomische studies gericht op het karakteriseren van de eigenschappen van immuun-cellen hebben duidelijke profielen tussen cellulaire subtypes gedocumenteerd. Epigenetische verstoringen in immuun-cellen kunnen leiden tot chronische stoornissen in de funktie van belangrijke immuun-cel subtypes en zijn betrokken bij verscheidene aandoeningen met een immunologische component, zoals chronische depressie, lupus en Reumatoïde Arthritis. Hoewel de gegevens verzameld in deze studie de mogelijkheid van verschillen qua epigenetische variatie van specifieke subtypes immuun-cellen binnen onze gemengde PBMC cel-populatie niet uitsluiten, is het vermeldenswaardig dat de relevante cel-populaties die zijn aangetast bij CVS nog onbekend blijven. Niettemin leveren onze gegeven bewijs dat epigenetische variatie bij CVS onderscheidend zou kunnen zijn, ten minste gedeeltelijk, van verwante aandoeningen met een immunologische component. Bijvoorbeeld: epigenomische analyse van totaal-bloed bij fibromyalgie- (FM) patiënten gaf differentiële methylatie aan in genen geassocieerd met strukturele en zenuwstelsel-ontwikkeling, en neuronale differentiatie. Hoewel FM een gelijkaardig symptoom-profiel heeft als en co-morbide is met CVS, dragen onze resultaten bij tot het groeiend aantal studies die biologische verschillen tussen de twee ziekten aangeven.

Hoewel het immuunsysteem de meeste veranderingen qua DNA-methylatie vertoonden, vonden we ook een aanrijking in genen-sets gelinkt met cellulaire componenten, kinase-aktiviteit en positieve metabole aktiviteit, wat eerdere gegevens, die verschillen aangeven in de expressie van genen geassocieerd met cellulair metabolisme en oxidatieve stress in PBMCs van CVS-patiënten, ondersteunt. Bij CVS zijn ontwrichtingen van mechanismen gerelateerd met strukturele componenten van de cel en metabole proteïnen, via cellulaire stress verbonden met gewijzigde funktionele uitkomsten. Bijvoorbeeld: er werd verhoogde apoptose in leukocyten gezien bij CVS, wat verklaard zou kunnen worden door stijgingen qua proteïne-kinase aktiviteit. De specifieke rol van kinasen bij CVS wordt echter nog niet goed begrepen en er is meer research vereist om hun bijdrage aan de CVS-pathologie op te helderen.

De resultaten van deze studie geven niet aan of deze geobserveerde epigenetische verschillen een oorzaak of een gevolg zijn van CVS. We leveren echter bewijs dat een mogelijke rol suggereert voor epigenetische wijzigingen bij de pathofysiologie van CVS. We controleerden voor genetische polymorfismen die gekend zijn voor hun overlap met array-sondes die worden gebruikt om DNA-methylatie direct te kwantificeren. Het blijft mogelijk dat genetische verschillen […] bijdragen tot verschillen in epigenetische signalisering. Een analyse van genetische verschillen over gans het genoom in een CVS-groep identificeerde 65 enkelvoudige nucleotide-polymorfismen (SNPs) geassocieerd met CVS, gelokaliseerd in 9 chromosomen, wat wijst op het feit dat genetische verschillen in het genoom kunnen bijdragen tot CVS-pathologie. Het feit echter dat genetische variaties slechts in twee van deze SNPs gelinkt waren met veranderingen in gen-expressie, suggereert dat andere mechanismen van gen-regulering waarschijnlijk betrokken zijn bij CVS. Er werden epigenetische effekten van het verband tussen genotype en fenotype voorgesteld en deze verbanden kunnen de moeite waard zijn om te onderzoeken via bepalingen van het ziekte-risico. Het onderzoeken van epigenetische modificaties bij CVS is van bijzonder belang aangezien epigenetische veranderingen lange-termijn effekten kunnen uitoefenen op gen-expressie en ze zijn potentieel vatbaar voor therapeutische interventie. Bijvoorbeeld: therapeutische interventies gericht op epigenetische mechanismen bij kanker waren succesvol wat betreft het wijzigen van inflammatorire mechanismen. Bijzondelijk 5-azacytidine, een DNA-hypomethylerend medicijn, bleek DNA-methylatie van immune mechanismen te veranderen in bepaalde long-kanker cel-lijnen, met inbegrip van genen betrokken bij virale verdediging, stress-respons en humaan leukocyten antigeen (HLA) klasse I verwerkende mechanismen. HLA-E en HLA-H, die een onderdeel zijn van het HLA klasse I verwerkend mechanisme, behoren tot deze die de grootste verschillen bij CVS vertoonden in de immuun-gen GO-cluster en zouden kunnen dienen als merkers voor toekomstige therapeutische studies bij CVS. Longitudinale studies die verschillen in de epigenomen van CVS-patiënten onderzoeken in de context van variatie met de tijd en CVS-symptomatologie, kunnen helpen met de identifcatie van deze interakties en de stabiliteit bepalen van de epigenomische verschillen die in deze studie werden gezien.

Besluiten

Naar ons weten is dit de eerste studie die epigenetische veranderingen over het ganse genoom geassocieerd met CVS heeft onderzocht. Netwerk-analyse van aangerijkte GO-termen geassocieerd met differentieel gemethyleerde genen identificeerde GO-clusters gerelateerd met cel-struktuur en -funktie, waarbij de grootste cluster gerelateerd was met de immuun-respons. Gen-regulerende elementen binnen de immuun-cluster waren significant ge-hypomethyleerd in verhouding tot het algemeen netwerk. Deze gegevens zijn consistent met eerder bewijs voor of immunologische ontregeling bij CVS en impliceren de betrokkenheid van DNA-modificaties bij de CVS-pathologie.

augustus 14, 2014

Methylatie-profiel van CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:52 pm
Tags: , , , , , , ,

Lees, ter inleiding, ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid.’

Epigenetica slaat op het bestuderen van veranderingen qua gen-expressie die wordt veroorzaakt door bepaalde base-paren in het DNA, of het ‘afzetten’ of terug ‘aanzetten’ van RNA, d.m.v. chemische reakties. Het slaat ook op de studie van erfelijke veranderingen die niet worden veroorzaakt door wijzigingen in de DNA-sequentie; en – in mindere mate – op langdurige wijzigingen in de transcriptie van een cel die niet noodzakelijk erfelijk zijn. De term verwijst ook naar de veranderingen zelf: funktioneel relevante wijzigingen in het genoom die zonder veranderde nucleotide-volgorde.

Methylatie van een gen maakt deel uit van een epigenetisch aanpassing-proces. Eenvoudig uitgedrukt: het verandert de expressie van dat gen en dus de aanmaak van het respectievelijk proteïne. Methylatie is een vorm van epigenetische modificatie en beïnvloedt de transcriptie (stilleggen of aktiveren), gen-stabiliteit en ‘imprinting’ (proces waardoor een bepaalde variant van een gen – een allel – alleen tot expressie komt (aktief is), wanneer het van één specifieke ouder – vader óf moeder – afkomstig is). Het heeft ook een directe impact op de struktuur van het chromatine (complex van DNA en proteïnen in de celkern). Het gen muteert niet maar er wordt een methyl (CH3) -groep toegevoegd. De mechanismen voor genetische controle zijn complex maar (te weinig) hypo- en (te veel) hyper-methylatie van DNA is betrokken bij veel ziekten. Er bestaat ook methylatie van proteïnen, die proteïne-proteïne interakties & proteïne-DNA interakties, en proteïne-aktivatie reguleert.

De zogenaamde cytosine-guanosine dinucleotide (CpG) ‘eilanden’ zijn DNA-fragmenten met soms tot honderden opéénvolgende cytosine-guanosine dinucleotiden (de 4 bouwstenen van DNA: A, C, G & T), meestal ‘upstream’ van genen, die voorkomen in ongeveer de helft van de gen-promoters (startplaatsen, “aanknopingspunten” voor DNA-transcriptie; plaatsen in het DNA, vóór een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie – overschrijving naar RNA – te starten).

Dit project werd gefinancierd door de ‘Alison Hunter Memorial Foundation’, de ‘Mason Foundation’ en via het ‘Queensland Government Co-Investment Funding Grant Program’.

————————-

Clin Cell Immunol 2014, 5:3

Methylation Profile of CD4+ T Cells in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis

Ekua W Brenu (1,2), Donald R Staines (2) & Sonya M Marshall-Gradisnik (1,2)

1 School of Medical Science, Griffith Health Centre, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Australia

Samenvatting

Doelstelling Van methylatie is geweten dat het biologische processen reguleert en een verandering qua methylatie-patronen bleek verband te houden met een aantal ziekten. Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een onverklaarde aandoening geassocieerd met immunologische en molekulaire veranderingen. CD4+ T-cellen – specifiek: regulerende T-cellen (Tregs) – bleken betrokken bij CVS/M.E.: er werden significante toenames qua Tregs geobserveerd bij deze patiënten. Daarom was de doelstelling van deze studie om methylatie in CD4+ T-cellen van CVS/M.E.-patiënten te onderzoeken.

Methodes De studie omvatte 25 CVS/M.E.-deelnemers en 18 controles tussen 25-60 jaar. Er werd een volume van 20 ml totaal-bloed afgenomen bij elke deelnemer en de perifeer bloed mononucleaire cellen werden geïsoleerd via densiteit-gradient centrifugatie [scheidingstechniek]. De CD4+ T-cellen werden daaruit geïsoleerd. Er werden methylatie-studies uitgevoerd over het ganse genoom van de CD4+ T-cellen (‘Illumina Infinium 450 K Human methylation array system’). Data-analyse geschiedde via’Genome studio’ en ‘Partek Enrichment’ software.

Resultaten Er werden 120 differentieel gemethyleerde CpGs bij de CVS/M.E.-patiënten geobserveerd in vergelijking met de controles. Daarvan bleken er 70 geassocieerd met gekende genen. De meerderheid van de differentieel gemethyleerde gebieden van de CVS/M.E.-patiënten waren gehypomethyleerd. Bovendien waren de meeste van de genen met differentieel gemethyleerde gebieden bij de CVS/M.E.-patiënten verantwoordelijk voor apoptose, cel-ontwikkeling, cel-funktie en metabole aktiviteit.

Besluit De huidige studie toont aan dat epigenetische veranderingen in CD4+ T-cellen mogelijks een rol kunnen spelen bij de immunologische veranderingen die worden gezien bij CVS/M.E.-patiënten.

Inleiding

[…] Bij CVS/M.E. is een ontwrichting van immunologische processen, inclusief verminderde cytotoxische aktiviteit en verhoogde waarden van regulerende T-cellen, betrokken [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ & ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’; ook: Brenu EW et al. Longitudinal investigation of Natural Killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88]. Verder kunnen CVS/M.E.-patiënten differentiële expressie in genen vertonen die verscheidene fysiologische processen reguleren die bekend staan abnormaal te zijn bij CVS/M.E. [Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol (2005) 58: 826-832 /// Frampton D, Kerr J, et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kerr JR. Gene profiling of patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. Curr Rheumatol Rep (2008) 10: 482-491 /// Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis (2008) 197: 1171-1184 /// Kerr JR et al. Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol (2008) 61: 730-739 /// ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiële biomerkers bij M.E.(cvs)]. Er werd tot op heden nog geen bondig pathomechanisme voor CVS/M.E. en concrete diagnostische biomerkers geïdentificeerd.

DNA-methylatie is een epigenetisch modificatie-proces waarbij DNA-methyltransferasen [enzymen] een methyl-groep toevoegen aan de 5’ positie [uiteinde waar fosfaat-groepen kunnen binden] van cytosinen van CpG-dinucleotiden. Dit proces heeft veel gevolgen op gen-expressie aangezien de mate en het patroon van de 5-methylcytosinen de hoeveelheid gen-expressie dicteert in een bepaald gebied. DNA-methylatie recruteert ‘transcriptionele co-repressors’ van de methyl-DNA bindende domein familie, die de transcriptie van bepaalde genen onderdrukt. Regulering van DNA-methylatie is belangrijk, in het bijzonder, tijdens embryonale ontwikkeling, chromatine-condensatie en genomische ‘imprinting’ [zie onze inleiding]. Epigenetische modificaties kunnen heel belangrijk zijn bij verscheidene ziekten, inclusief inflammatoire en auto-immuun ziekten. Belangrijk is dat werd gesuggereerd dat epigenetische modificaties verantwoordelijk zijn voor bepaalde immuun-gerelateerde ziekten. Toe- en afnames van DNA-methylatie bleken de expressie te reguleren van T-cel gerelateerde cytokine-genen zoals IL-2 en IL-6.

Bij CVS/M.E. werden veranderingen qua gen-expressie gerapporteerd voor een aantal mRNA en microRNA genen betrokken bij verscheidene immuun-processen. [microRNAs = kleine RNAs die een spil-funktie vervullen bij het reguleren van gen-expressie] Tot op heden werd de rol van cel-specifieke methylatie bij CVS/M.E. echter nog niet onderzocht. Deze studie voerde een analyse uit van differentiële methylatie over het ganse genoom van CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten en niet-vermoeide controles.

Materialen & Methodes

Ethische goedkeuring

[…]

CVS/M.E.-patiënten en controles

25 patiënten met CVS/M.E. (21 vrouwen en 4 mannen; leeftijd = 50,31 ± 2,27). 1994 CDC definitie. […]. Alle patiënten maakten melding van lage tot matige lichamelijke aktiviteit and voltijdse tewerkstelling. [Niet de meest geïnvalideerden dus… Bij ziekere patiënten zouden de methylatie-resultaten misschien nog dramatischer zijn…] Niet-vermoeide controle-groep:18 deelnemers zonder CVS/M.E. of andere medische aandoeningen (10 vrouwen en 8 mannen; leeftijd = 47,44 ± 2,16). Deelnemers met auto-immuun ziekten, psychose of die roken werden uitgesloten.

CD4+ T-cel isolatie

[…] Isolatie van CD4+ T-cellen d.m.v. magnetische ‘beads’ gelabeld met merkers die de CD4+ T-cel populatie uitsloten. […]

DNA-extractie en -methylatie

[…] EZ DNA Methylatie kit (Zymo Research) – bisulfiet [HSO3] behandeling van DNA [ongemethyleerd cytosine wordt omgezet naar uracil in DNA, gemethyleerd cytosine niet; via direct sequentie-bepaling kan dan de plaats van ongemethyleerde cytosinen en 5-methylcytosinen worden bepaald] […].

HRM-analyse

[‘High Resolution Melt’ (HRM) analyse is een techniek in de molekulaire biologie voor het opsporen van mutaties, polymorfismen en epigenetische verschillen in dubbelstrengig DNA. De ‘smelt-temperatuur’ (waarbij de 2 DNA-strengen van een nucleotide-sequentie uit elkaar gaan of ‘smelten’ verandert als er een mutatie aanwezig is.] Voor deze genen: NINJ2, HSPD1, TEX14, HLA-C, RAD51C, FMN2, DGKQ, LIPT1, GJA9 en MYCBP. […]

Statistische analyse

Kwaliteitscontrole voor de verschillende stappen. […]

Resultaten

Kenmerken van de deelnemers

[…] Geen significante verschillen voor leeftijd of parameters bij tellingen op vol-bloed tussen CVS/M.E. en controles.

Algemeen methylatie-patroon in CD4+ T-cellen

[…] Er werden in het totaal 485.577 methylatie-plaatsen in het genoom onderzocht. […] Er werd een overheersende trend van genoom-hypomethylatie vastgesteld in de CD4+ T-cellen van de CVS/M.E.-patiënten vergeleken met de controles. We detekteerden 120 CpGs die differentieel gemethyleerd waren en 85% daarvan vertoonden hypomethylatie (14,17% hypermethylatie). 75 van die gemethyleerde gebieden waren gelinkt met gekende genen (de rest waren ongekend). Deze differentieel gemethyleerde (dmCpG) sites werden gedetekteerd op chromosomen 1-22, zonder een bepaalde concentratie op één chromosoom. Struktureel waren deze dmCpGs gelokaliseerd op de 3’UTR, 5’UTR [speciale sequenties in het mRNA die einde en start van de translatie aangeven] en transcriptie-start-plaatsen; met een groot deel gelokaliseerd binnen het gen. 30% van de CpG-eilanden waren geassocieerd met gen-promoters.

Differentieel gemethyleerde genen

De dmCpGs werden gevonden in 75 genen in de CD4+ T-cellen. Het gen met de meeste dmCpG-sites was NINJ2 – 3 CpG-sites in dit gebied vertoonden hypomethylatie. Toevallig bevatte dit gen CpG-sites die zeer veel hypomethylatie vertoonden bij de CVS/M.E.-patiënten vergeleken met de controles. Dit gen werd voorheen niet geassocieerd met CVS/M.E. Daarenboven werd geen enkel van de genen die in de huidige studie werden geïdentificeerd eerder geassocieerd met CVS/M.E. De analyse van miRNA-methylatie leverde 176 miRNAs met significante dmCpGs op, daarvan vertoonden 82 miRNA-genen hypermethylatie en 94 hypomethylatie.

Gen-ontologie en mechanisme-aanrijking profiel

Om te bepalen of de dmCpGs biologisch significant waren, werd software (Partek) toegepast op alle genen met dmCpGs die significant gewijzigd waren (p < 0.05). [significante verschillen in expressie werden bepaald op een aanrijking ≥ 3] Gen-aanrijking analyse detekteerde 59 verschillende funktionele termen (p < 0.05) die geassocieerd waren met dmCpG-sites en deze kunnen geklassificeerd worden in 3 groepen: biologische, cellulaire en molekulaire processen. De meest bepalende factor om te suggereren dat deze genen werden aangetroffen in CD4+ T-cellen, was de waarneming dat sommige van deze genen gerelateerd waren met MHC Klasse-II receptor aktiviteit (HLA-DQB1 [MHC = genen die coderen voor membraan-proteïnen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]). Genetische mechanismen die specifiek zijn voor deze sites werden bepaald gebruikmakend van KEGG [‘Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes’; database met genomen, biologische mechanismen, ziekten, medicijnen en chemische substanties] mechanisme-analyse. Deze analyse identificeerde HLA-C en HLA-DQB1 als genen in het mechanisme met de hoogste aanrijking.

MicroRNA-methylatie patroon in CD4+ T-cellen

De microRNA-methylatie patronen werden onderzocht in the CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten en niet-vermoeide controles. Er werd een totaal van 2.291 methylatie-sites gezien. Daarvan waren er 133 differentieel gemethyleerd tussen de 2 groepen: 51,9% met hypomethylatie en 48,1% met hypermethylatie.

Validering van gemethyleerde genen via HRM

Van de genen die werden geselekteerd voor HRM-analyse, zagen we significante veranderingen in de ‘smelt-temperatuur’ van DGKQ.

Bespreking

Dit is de eerste studie die rapporteert over een genomische DNA-methylatie analyse in CD4+ T-cellen van CVS/M.E.-patiënten. Dit is ook de eerste studie die significante hypo- en hyper- methylatie sites in CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten aantoont. Er werd een overwegende hypomethylatie geobserveerd bij de CVS/M.E.-patiënten en die was overwegend in de promoter-gebieden van genen gelokaliseerd. De genen met dmCpG-sites waren geassocieerd met een aantal gen-ontologie termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] en mechanismen die significant aangerijkt waren in de CVS/M.E.-groep.

Mechanisme-aanrijking analyse toonde dat de meeste van de genen met significante dmCpG-sites betrokken waren bij 47 verschillende mechanismen. Van deze waren die met de significantste aanrijking betrokken bij type-I diabetes mellitus, auto-immune schildklier ziekte, virale myocarditis, antigen-verwerking en -presentatie, en cel-adhesie molekulen. De genen gerelateerd met deze mechanismen waren HLA-C en HLA-DQB1. HLA-C is een ‘major histocompatibility complex’ I (MHCI) gen dat geassocieerd bleek met de progressie van Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV). De HLA-C molekule wordt herkend door ‘Killer Immunoglobulin-like Receptors’ [KIRs; behoren tot de immunoglobuline super-familie en binden specifiek met MHC klasse-I eiwitten die voorkomen élke cel van het lichaam met een kern; zie ‘Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS], KIR2DL1 en KIR2DL2,3. Onder de CD4+T-cellen is er een subgroep die gekenmerkt wordt door ‘non-MHC restricted’ cytotoxiciteit [MHC-restrictie verwijst naar het feit dat een bepaalde T-cel een peptide-antigen enkel zal herkennen wanneer het gebonde is aan een MHC-molekule van de gastheer], met Natural Killer (NK)-achtige aktiviteit en HLA-Cw7 afhankelijke inhibitie van cytotoxische aktiviteit. Methylatie in HLA-C zou daarom de cytotoxische aktiviteit gemedieerd door CD4+ T-cellen kunnen aantasten en een rol voor HLA-C beperkte T-cel respons kunnen suggereren bij CVS/M.E. Bij CVS/M.E.-patiënten is geweten dat cytotoxische aktiviteit gereduceerd is in NK- én CD8+ T-cellen; een globale vermindering qua NK-aktiviteit zou kunnen aanhouden bij CVS/M.E.-patiënten en dit zou verband kunnen houden met veranderingen in de epigenetische patronen die cytotoxische aktiviteit reguleren. Daarenboven zou methylatie in HLA-C diversiteit in HLA-C ‘restricted’ T-cellen, als een gevolgd van verminderde HLA-C expressie op dendritische cellen in de thymus tijdens T-cel ontwikkeling in de thymus, kunnen aanduiden. HLA-DQB1 is een MHCII gen. Er bleken polymorfismen in een aantal HLA-DQB1 geassocieerd met vatbaarheid voor bepaalde types kankers. In het bijzonder: HLA-DQB1 werd geïdentificeerd als een risico-factor voor slokdarm-kanker. HLA-DQ allelen, vooral HLADQA1*01 en HLA-DQB1*06 bleken verhoogd bij CVS/M.E.-patiënten, hoewel de toename van HLA-DQB1*06 slechts minimaal was [Smith J, Fritz EL, Kerr JR et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol (2005) 58: 860-863].

Methylatie in genen gerelateerd met molekulaire processen zoals membraan-transport, kinase-aktiviteit, nucleotide- en ribonucleotide-binding, GTPase-aktiviteit en transferase-aktiviteit, zouden bij deze patiënten defekten in molekulaire processen kunnen suggereren die specifiek zijn voor CD4+ T-cellen. Bv. STK17B is betrokken bij calcium- en ROS-signalisering in CD4+ T-cellen en hypomethylatie in dit gen zou dit proces kunnen veranderen. Daarenboven zou methylatie in TXNRD1 de anti-oxidante capaciteit van T-cel kunnen aantasten. RPS6KA2 en SGK1 zijn geassocieerd met de regulering van mTOR-signalisering [TOR = ‘Target Of Rapamycin’; de ‘m’ staat voor ‘mammalian’ – van zoogdieren; mTOR is een centrale regulator van de cel-groei en proliferatie in respons op omgeving-stimuli zoals groei-factoren of nutriënten], die belangrijk is bij overleving/groei/differentiatie van lymfocyten en proliferatie van T-cellen om een doeltreffend metabolisme, cytoskeletale organisatie en apoptose te verzekeren. Belangrijk: RPS6KA2 bleek ook geassocieerd met het MAPK-signalisering-mechanisme [‘mitogen activated protein’ (MAP) kinasen reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleren verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose] en dit is van belang bij in T-cel gemedieerde responsen. Tijdens T-cel aktivatie vormen HSPE1 en HSPD1 een complex dat de aktiviteit van pro-caspase 3 [enzyme betrokken bij apapotose, ‘geprogrammeerde cel-dood’] reguleert. Differentiële methylatie in deze genen zou daarom schadelijk voor caspase-aktiviteit kunnen zijn. Belangrijk is dat werd voorgesteld dat mitochondriale dysfunktie betrokken is bij CVS/M.E. [bv. ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?]; dit zou geassocieerd kunnen zijn met veranderingen in NDUFA [gen coderend voor een subcomplex van NADH-dehydrogenase (mitochondriale ademhaling-keten)] en OXA1L [‘Oxidase (cytochrome-c) assembly 1-like’ (assemblage complexen van de mitochondriale ademhaling-keten)]. Zo waren ook genen verantwoordelijk voor DNA-herstel, inclusief ATM, RAD51 en RAD51C, ook differentieel gemethyleerd bij de CVS/M.E.-patiënten.

Hoewel de precieze werking van een aantal genen in T-cellen onbekend is (DOCK4, BRWD1, ASXL2, MED13, NPAT, C20ORF3 en PHF19), suggereert de observatie dat de meeste van deze genen verband houden met intracellulaire processen mogelijke abnormaliteiten binnenin de cel, die zich kunnen voordoen onder de vorm van verhoogde cel-aantallen en veranderingen qua cytokine-niveaus.

DGKζ (Diacylglycerol-kinase-theta) komt tot expressie in T-cellen en staat bekend als regulator van de grootte-orde van de TCR- [T-cel receptor] respons, door inhibitie van MAPK-aktivatie en de expressie van co-stimulerende molekulen zoals CD69 en CD25. Bij CVS/M.E. is weinig bekend over de status van de TCR. Aanpassingen in de expressie van DGKζ zouden echter belangrijk kunnen zijn bij de aandoening.

Van de 176 miRNAs met significante dmCpGs, waren er 8 CD4+T-cel specifieke miRNA-genen, inclusief miR-124, miR-155, miR-181a, miR-142, miR-27a, miR-339, miR-340 en miR-425. MiR-155 is noodzakelijk voor de differentiatie en proliferatie van CD4+ T-cellen naar 4 voornaamste subsets (Th1, Th2, Th17 en Tregs). In FOXP3-specifieke Tregs is miR-155 ge-upreguleerd en een daling van miR-155 doet het aantal van deze cellen verminderen. Veranderingen in miR-155 regulering zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de toenames in Tregs die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten en de verschuivingen in Th1/Th2 immuun-gerelateerde responsen [zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Bij aktivatie van de T-cel receptor zijn een aantal signalisering-mechanismen betrokken waarvan de genen gemethyleerd waren in de huidge studie. Belangrijk: TCR-signalisering wordt gemoduleerd door miR-181a, aangezien het autoreaktiviteit inhibeert via het bevorderen van immuun-tolerantie en het versterken van TCR-responsiviteit. In aanwezigheid van miR-181a komen autoreaktieve immuun-responsen voor die resulteren in auto-immuniteit. miR-124 en miR-27a komen tot over-expressie bij, respectievelijk, centrale en effector ‘memory’ CD4+ T-cellen tijdens differentiatie [Een antigen-specifieke ‘memory’ T-cel expandeert tot grote aantallen effector T-cellen bij her-blootstelling aan het oorspronkelijk antigen; zie o.a. ‘Heterologe immuniteit – overzicht]. Bij de CD4+ helper T-cellen is miR-425 gereduceerd in Th1-cellen, terwijl miR-142 verhoogd is bij expressie in Tregs.

Tot besluit: de huidige studie identificeerde voor het eerst een mogelijke ontwrichting van epigenetische mechanismen in CD4+ T-cellen en dit zou kunnen bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E. De belangrijkste bevinding in de huidige studie is de dmCpG in het DGKζ gen en CD4+ T-cel specifieke miRNAs. Aangezien in eerdere studies veranderingen bij CVS/M.E.-patiënten werden gezien, is het mogelijk te stellen dat deze molekulen belangrijk kunnen zijn bij het ontcijferen van een in mechanisme voor CVS/M.E. Epigenetische veranderingen in immuun-cellen kunnen een belangrijke component van CVS/M.E. zijn.

augustus 2, 2014

‘Heat-shock’ proteïne 60 herkenning bij M.E.

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 1:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Op de 9e ‘Invest in M.E. International Conference’ over research naar M.E. (30 Mei 2014) besprak Jonas Blomberg (Hij was degene die rapporteerde dat er géén XMRV bij Zweedse M.E.-patiënten werd aangetroffen.) de mogelijkheid tot door infektie geïnduceerde auto-immuniteit bij M.E. Zijn lab gebruikt een techniek die hen in staat stelt honderden antilichamen ter zelfder tijd te bekijken. Auto-immuniteit kan het centraal zenuwstelsel en de perifere zenuwen beschadigen. Bij M.E. zouden er “post-translationele modificaties” (veranderingen in de eiwitten na de vertaling vanuit RNA) of kruis-reagerende microbiële proteïnen kunnen voorkomen. Er zijn aanwijzingen dat M.E.-patiënten een verstoorde mitochondriale werking vertonen, wat verband zou kunnen houden met de post-exertionele malaise en uitputting. Een slechter werkend energie-metabolisme zou te wijten kunnen zijn aan een blokkage door bepaalde antilichamen. Er zijn veel neurologische ziekten die een auto-immune basis hebben (bv. M.S.). Er zijn ook veel voorbeelden van post-infektueuze auto-immuniteit (Mycoplasma, Chlamydia, EBV, CMV, Toxoplasmose, Borrelia, enz. (Wij gaven hier al meermaals mee dat wellicht niet één enkele verwekker verantwoordelijk is voor M.E.). Volgens Blomberg is het “beter te kijken naar antilichamen, dan naar de microbe zelf”.

Onderstaand artikel van Blomberg en zijn collegas van de afdeling Klinische Microbiologie van het ‘Uppsala Academic Hospital’ (Zweden) in het prestigieus wetenschappelijk tijdschrift PLoS ONE maakt melding van het feit dat bij M.E.-patiënten antilichamen in hun bloed werden aangetroffen, die gericht zijn tegen een proteïne dat voorkomt in menselijke cellen en in bakterieën. Omdat gezonde mensen zelden of nooit dit soort antilichamen hebben, zouden hun resultaten de theorie ondersteunen dat M.E. minstens in sommige gevallen een zogenaamde auto-immune ziekte is die wordt getriggerd door een courante infektie.

In deze studie construeerden de researchers op een synthetische manier kleinere delen (peptiden, ketens van aminozuren) van een proteïne genaamd Hsp60. Dit komt voor in de energiefabriekjes van cellen (de mitochondrieën; die evolutionair eigenlijk ‘intracellulaire bakterieën’ zijn die oorspronkelijk – meer dan een miljard jaren geleden – door onze cellen werd opgenomen) van multi-cellulaire organismen (zoals de mens) en in microben. Antilichamen tegen delen van het Hsp60-proteïne komen ook courant voor bij patiënten met diabetes, Multipele Sclerose en andere auto-immuun ziekten.

Met behulp van de geconstrueerde peptiden hebben de onderzoekers kunnen nagaan of patiënten met M.E. antilichamen in hun bloed hebben die gericht zijn tegen delen van Hsp60. Dat was het geval. Maar niet bij allemaal; het aantreffen van antilichamen tegen Hsp60 verklaart dus niet alles. De resultaten komen wel overéén met het idee dat M.E. een auto-immuun ziekte is. In 17 op 69 (ca. 25%) bloedstalen van M.E.-patiënten waren antilichamen aanwezig tegen een peptide aanwezig in het Hsp60-proteïne uit het micro-organisme Chlamydia pneumoniae (Hsp60 van mensen en microben lijken echter erg op mekaar dus dit betekent niet noodzakelijk dat C. pneumoniae aanleiding heeft gegeven tot de antilichamen; dat moet verder worden nagegaan.). Slechts 1 staal van 331 gezonde bloed-donoren en 68 patiënten met één van de twee auto-immuun ziekten M.S. of S.L.E. had dergelijke antilichamen.

Op basis van deze bevindingen brachten Blomberg et al. de hypothese naar voor dat antilichamen aangemaakt in respons op een infektie zou kunnen bijdragen tot de symptomen van M.E. en dit door een ontwrichting van de normale werking van Hsp60 in mitochondrieën. Dit dient echter nog verder te worden onderzocht.

Het artikel is vrij technisch en alles tot in detail uitleggen zou ons te ver leiden. Het is dan ook onze bedoeling om onderzoekers in te lichten zodat ze dit kunnen meenemen naar hun research. Patiënten kunnen het doorgeven aan hun behandelaars en pleitbezorgers kunnen er verder op bouwen.

————————-

PLoS One (2013) 8(11): e81155

Epitopes of microbial and human heat-shock protein 60 and their recognition in Myalgic Encephalomyelitis

Elfaitouri A, Herrmann B, Bölin-Wiener A, Wang Y, Gottfries CG, Zachrisson O, Pipkorn R, Rönnblom L, Blomberg J

Section of Clinical Microbiology, Department of Medical Sciences, Uppsala University, Uppsala, Sweden

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis (M.E., ook Chronische Vermoeidheid Syndroom genoemd), een ziekte met chronische vermoeibaarheid, cognitieve dysfunkties en spierpijn met een ongekende etiologie, begint dikwijls met een infektie. Het chaperonine [Chaperoninen behoren tot een grote klasse molekulen die helpen bij proteïne-opvouwing, genaamd molekulaire chaperones. Zie o.a. ‘‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS] menselijk ‘heat-shock’ proteïne 60 (Hsp60) voorkomend in mitochondrieën en in bakterieën, is evolutionair sterk geconserveerd gebleven, antigeen [d.w.z. kan aanzetten tot antilichaam-produktie] en een belangrijk auto-antigen. De anti-Hsp60 humorale immuun-respons (IgG en IgM) werd bestudeerd bij 69 M.E.-patiënten en 76 bloed-donoren (BD) (de ‘training-set’ [Van de 69 M.E.-patiënten waren er 29 met enkel M.E. (Canadese criteria 2007), 13 met M.E.+FM, 15 M.E.+IBS & 12 M.E.+FM+IBS. Bij de 7 niet-M.E. patiënten: 4 met FM & 3 met FM+IBS.]) met recombinant menselijk en E. coli [bakterie] Hsp60, en 136 overlappende en geselekteerde peptiden van Hsp60 van mensen, Chlamydia, Mycoplasma en 26 andere soorten in een Suspensie Multiplex Immuno Test (SMIA) [bepalen van meerdere antilichamen ter zelfder tijd]). Peptiden van de Hsp60 helix [spiraalvormige secundaire struktuur van proteïnen] hadden een chaperonine-achtige aktiviteit maar deze en andere Hsp60-peptiden bonden ook IgG en IgM met een M.E. voorkeur, wat er theoretisch op wijst op een competitie tussen Hsp60 funktie en antilichaam-binding. Er werd een op Hsp60 gebaseerd panel van 25 antigenen geselekteerd. Bij evaluatie met 61 andere M.E. [De ‘evaluatie-set’: 61 patiënten met hoofd-diagnose of M.E., maar 5 voldeden ook de criteria voor FM en 6 voor IBS.] en 399 niet-M.E. stalen (331 BD, 20 Multipele Sclerose en 48 Systemische Lupus Erythematosus patiënten), detekteerde een peptide van Chlamydia pneumoniae Hsp60 IgM in 15 op 61 (24%) bij M.E. en in 1 op 399 niet-M.E. aan een hoge ‘cut-off’ (p < 0.0001). IgM tegen specifieke kruis-reagerende epitopen van menselijk en microbieel Hsp60 komt voor in een subgroep van M.E., wat compatibel is met door infektie-geïnduceerde auto-immuniteit.

Inleiding

Chaperoninen zijn courante auto-antigenen. Hsp60 is uniek wat betreft de hoge conservatie bij pro- en eukaryoten [cellen zonder en met kern] en het feit dat ze zeer antigeen zijn. Multipele Sclerose (M.S.) patiënten hebben auto-antilichamen (overwegend IgM) tegen chaperoninen zoals Hsp60, Hsp70 en alfa-B-crystalline [ook een (klein) ‘heat-shock proteïne]. Antilichamen tegen peptiden van humaan Hsp60 komen ook courant voor bij type-1 diabetes. Antilichamen tegen een microbieel Hsp60 zullen waarschijnlijk kruis-reageren met menselijk Hsp60, wat ook kan kruis-reageren met andere humane proteïnen.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) – ook ‘Chronische Vermoeidheid Syndroom’ (CVS) genoemd, is een chronische invaliderende ziekte, gekenmerkt door chronische vermoeibaarheid, cognitieve dysfunktie en spierpijn. Talrijke onderzoeken hebben ook een onverklaarde langdurige chronische inflammatie en immuun-dysfunktie bij sommige M.E.-patiënten aangetoond, inclusief auto-immuniteit. Een mitochondriale dysfunktie bij M.E.-patiënten werd ook gerapporteerd maar dit vergt verder onderzoek. M.E. overlapt met fibromyalgie (FM) en prikkelbare darm syndroom (IBS). Het komt vaak naar boven na een ernstige virale of bakteriële infektie. Humaan herpes-virus 6 (HHV-6), Epstein-Barr virus (EBV), enterovirussen, parvovirus-B19, Chlamydia pneumoniae & Mycoplasma bleken betrokken bij M.E. maar er is geen bewijs dat ze de enige oorzaak van M.E. zijn. […] Hoewel er beperkingen zijn wat betreft de interpretatie van infektie-serologie [aantonen van antilichamen], is het in de praktijk dikwijls mogelijk voorbije of aanwezige microbiële aktiviteit vast te stellen door het bestuderen van de waarden van IgG en IgM [types antilichamen] gericht tegen de microbe. Het huidig onderzoek ontsprong uit een grote inspanning om serologische merkers die selektief zijn voor M.E. te vinden. Meer dan 1.000 virale, bakteriële en protozoale antigenen (volledige microben, recombinante proteïnen en synthetische peptiden) werden getest. We observeerden dan een tendens voor een selektief reageren van Hsp60-antigenen met M.E.-stalen vergeleken met controles. Dit was de aanleiding voor de huidige studie, waarbij SMIA werd gebruikt om simultaan IgG- en IgM-antilichamen tegen recombinante en peptide ‘heat-shock’ proteïne 60 (Hsp60) antigenen van mensen en vele microben te detekteren bij M.E. en controles. We vonden een belangrijk epitoop [deel van een macromolekule (meetsal proteïne) dat kan worden herkend door antilichamen of cellen van het immuunsysteem] dat overlapte met de peptide-bindende helix van Hsp60. Enkele van de Hsp60-epitopen bonden preferentieel antilichamen in M.E.-stalen. Bij het testen op een onafhankelijke evaluatie-groep van 61 M.E.-patiënten, reageerde één van de antigenen preferentieel met M.E.-, maar niet zoveel met BD-, M.S.- en S.L.E.-stalen.

Er werden abnormale Hsp60-waarden en een abnormale Hsp60-respons op inspanning gevonden bij M.E.-patiënten [Thambirajah AA, Sleigh K, Stiver HG, Chow AW. Differential heat-shock protein responses to strenuous standardized exercise in Chronic Fatigue Syndrome patients and matched healthy controls. Clin Invest Med (2008) 31: E319-E327; zie ‘‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS]. Het effekt van Hsp60-antilichamen op humaan Hsp60 en mitochondriale funkties, en hoe een mogelijk nadelig effekt van dergelijke antilichamen normaal wordt vermeden, dient nog te worden bepaald. Onze resultaten tonen Hsp60-epitopen aan die worden herkend door het immuunsysteem van gezonde individuen, meer bij IgM- dan bij IgG-antilichamen, alsook een selektieve immuun-respons gericht tegen enkele Hsp60-epitopen in een subgroep M.E.-patiënten. Het is waarschijnlijk dat Hsp60-antilichaam reakties te wijten aan infektie, de vorming van auto-antilichamen tegen humaan Hsp60 bevorderen. Of dit enige relevantie heeft voor de pathogenese en diagnose van M.E. is onzeker.

[…]

Bespreking

Hsp60 is een belangrijke molekule bij een aantal funkies, bv. als mitochondriaal chaperonine dat deelneemt aan cellulaire stress-reakties en het aanbieden van molekulen op het cel-oppervlak en extracellulair. Het zou ook NK-cel aktiviteit kunnen reguleren [Michaëlsson J, Teixeira de Matos C, Achour A, Lanier LL, Kärre K et al. A signal-peptide derived from Hsp60 binds HLA-E and interferes with CD94/NKG2A recognition. J Exp Med (2002) 196: 1403-1414]. Humaan Hsp60 ontstond waarschijnlijk uit Hsp60 van de alfa-proteobakterieën die de aanzet waren voor het ontstaan van mitochondrieën. De sterke conservatie in eu- en prokaryoten en hoge antigeniteit [capaciteit om specifiek te binden op antilichamen] bestemmen het voor tot immunologische kruis-reaktiviteit. Enkelvoudige nucleotide polymorfismen [kleine variaties in het DNA] in humaan Hsp60 veroorzaken ‘erfelijke spastische paraplegie’ [heterogene groep neurodegeneratieve aandoeningen gekenmerkt door progressieve spasticiteit en zwakte van de onderste ledematen]. Een verkeerde werking van Hsp60 kan zodoende theoretisch diverse effekten veroorzaken: mitochondriale dysfunktie, immune ontregeling en kwalen van het centraal zenuwstelsel. Het is een molekule die centraal staat bij auto-immuniteit. Auto-immune ziekten waar Hsp60-antilichamen werden gerapporteerd, zijn M.S., type-1 diabetes en atherosclerose. Dit artikel identificeert kruis-reagerende Hsp60-epitopen met een grote set van lange synthetische peptiden en hun selektieve herkenning bij sommige patiënten die lijden aan M.E. Het zou een toekomstige logische uitbreiding kunnen zijn om te onderzoeken of affiniteit-gezuiverde antilichamen tegen deze epitopen interfereren met Hsp60 of met de mitochondriale funktie.

Overlappende peptiden van humaan Hsp60 identificeerden een frequent herkend auto-epitoop (peptiden G20 en G20c) van humaan Hsp60, dat de helix, een belangrijke proteïne-bindende plaats van het Hsp60-chaperonine, overlapt. Epitopen die werden gedetekteerd met de IgM-test waren talrijker dan deze die werden gevonden met de IgG-test. Dit werd gezien bij de 3 epitoop-scans, met humaan, Chlamydia en Mycoplasma Hsp60. Dit duidelijk verschil in epitoop-repertoire tussen de IgG- en IgM-testen werd, naar ons weten, nog niet eerder veastgesteld. Bij de Ig-klasse ‘switch’ [wisseling van immuunglobuline-isotype] zou een epitoop-selektie kunnen betrokken zijn die gebaseerd is op de graad van auto-reaktiviteit en aviditeit [binding-neiging]. De manier van presentatie van peptiden aan het ‘bead’-oppervlak was ook belangrijk. [Bij de SMIA-test zijn de peptide-antigenen via een ‘spacer’-molekule gebonden op ‘beads’ (pareltjes)] Er werden verschillen gezien tussen reaktiviteit-patronen van Chlamydia Hsp60-peptiden met verschillende ‘spacer’-lengtes, het meest uitgesproken bij de IgG-test.

Enkele peptiden van humaan Hsp60 behielden een chaperonine-achtige, eerder gemengde proteïne-bindende aktiviteit. Deze niet-antilichaam-afhankelijke binding creëerde onzekerheid over hoeveel van het signaal van de antilichaam-afhankelijke binding specifiek was. In experimenten met blokkerende proteïnen en titraties vonden we echter dat de proteïne-inhoud van het patient-staal genoeg was om de algemene proteïne-binding van enkele Hsp60-peptiden te blokkeren. De verdunning-vloeistof van het test-systeem was proteïne-vrij. Dit liet ons toen de chaperonine-achtige peptide- en proteïne-binding van bepaalde Hsp60-peptiden te detekteren en evalueren. We gebruikten 5 [gelabelde] dodecapeptiden [peptide bestaande uit 12 aminozuren] die werden geselekteerd op hoge Hsp60-affiniteit. Twee daarvan bonden in onze SMIA-test op zowel recombinant humaan en E. coli Hsp60 en op peptiden homoloog met G20c die de helix bevatten. Zodoende was de binding-specificiteit van de G20c-peptiden gelijkaardig met die van het volledig Hsp60-proteïne. De proteïne-bindende aktiviteit kwam preferentieel voor dichtbij de helix, een primaire proteïne-bindende struktuur van het Hsp60 chaperonine.

Enkele humane Hsp60 peptiden reageerden selektief met M.E.-stalen vergeleken met deze van BD. IgM-reakties maakten meer onderscheid van IgG-reakties. Een humaan Hsp60-peptide (G20c), waarbij 3 aminozuren waren verschoven naar het amino-einde ten opzichte van het-G20 peptide, vertoonde een hogere verhouding antilichaam-binding/NTC-binding [NTC = ‘non-template control’; negative controle (zonder patiënten-staal); deze waarde kan worden beschouwd als ‘achtergrond’] in menselijke stalen dan het G20-peptide. Daarom kozen we het als basis voor verdere onderzoeken.

In een uitbreiding van de epitopen-scan vergeleken we peptiden die homoloog zijn met humaan G20c peptide, een ‘fyloscan’ [zoeken naar evolutionaire verbanden]. Bepaalde M.E.- en BD-stalen gaven hoge IgG en IgM antilichaam-reakties tegen Hsp60 peptides van Leishmania en Schistosoma. Net zoals Plasmodium, komen deze microben zelden voor in Zweden. De zeer sterk bewaarde sequentie van Hsp60 kan leiden tot onverwachte serologische kruis-reakties. De sterke correlatie-coefficiënten van enkele struktureel tegenstrijdige peptide-paren ondersteunt deze conclusie. Ondanks een duidelijk sequentie-verschil en een grote fylogenetische afstand [minder evolutionaire verwantschap], vertoonden peptiden van E. coli, Listeria, Burkholderia, Staphylococcus en Cryptosporidium [bakterieën] een bijna perfekte antigeniteit-correlatie voor de IgG-gegevens. Een minder perfekte, maar nog steeds sterke, correlatie werd gezien voor de antigeniteiten van vele G20c-homologen bij de IgM-test. De diversiteit van sequentie-herkenning was dus groter voor de IgM- dan voor de IgG-testen. Eén interpretatie is dat een grotere diversiteit qua IgM-herkenning wordt vervangen door een eenvoudiger IgG-herkenning tijdens maturatie van de humorale immuniteit; wat een “finaal gemeenschappelijk” anti-Hsp60 mechanisme suggereert. Dezelfde conclusie kan worden getrokken uit het hoger aantal epitopen herkend bij de IgM-test met overlappende peptiden van menselijk Hsp60, Chlamydia pneumoniae Hsp60 en Mycoplasma penetrans Hsp60. Een groot initieel aantal IgM epitopen zou kunnen vervangen zijn een klein aantal meer kruis-reacgerende IgG epitopen. Men kan redelijkerwijs veronderstellen dat herhaalde blootstellingen aan microbiële Hsp60-epitopen normaal gezien naar onschadelijke, meer of minder auto-reaktieve, antilichamen leidt. […]. Het fenomeen van ‘epitoop-spreiding’ [manier waarop auto-immuniteit kan optreden, gebruikmakend van een mechanisme van molekulaire nabootsing] zou een gelijkaardig iets kunnen zijn. De verregaande conservatie en kruis-reaktiviteit van bepaalde Hsp60 epitopen is van kritiek belang bij het onderscheiden van ‘self/non-self’, met een groot potentieel op fouten.

De observaties van de ‘fylo-scan’, en eerdere publicaties, leidden er ons toe 3 meer overlappende peptide-sets te synthetiseren: één met een tri-ethyleen-glycol ‘spacer’ [inerte molekule tussen antilichaam en drager om ruimtelijke afstand te scheppen] van Mycoplasma penetrans Hsp60 en 2 van Chlamydia pneumoniae Hsp60. De laatste 2 hadden ofwel een tri- of een hexa-ethyleen-glycol ‘spacer’. De ‘spacers’ leverden gelijkaardige, maar geen identieke, resultaten op. De relatief lange peptiden (30-meren) die hier werden aangewend, zouden enige secundaire struktuur en ‘mimicking’ [nabootsing] van conformationele epitopen kunnen toelaten. Dit ligt echter ver van de meer volledige epitoop-configuratie van een volledig proteïne.

Meerdere van de onderscheidende peptiden die werden gedefinieerd op basis van de training-set kwamen van Chlamydia pneumoniae en Mycoplasma penetrans. Drie belangrijke Hsp60-gebieden bevatten M.E.-selektieve epitopen, halverwege tussen het amino-einde en het midden, het midden, en halverwege tussen het midden en het carboxy-einde. Het helix-domein is dus niet het enige M.E.-specifieke domein. IgM-epitopen bleken meer frequent M.E. en niet-M.E. stalen te onderscheiden. Vele, maar niet alle, van de onderscheidende peptiden gaven ook hogere NTC-waarden. Het blokkerend effekt van de proteïnen in de stalen, en de subtractie-procedure [De waarden verkregen van de NTC en de ‘naakte pareltjes’ werden afgetrokken van de meet-waarden van de stalen.], waarbij de M.E. en niet-M.E. stalen op dezelfde manier werden behandeld, controleerde voor de chaperonine-achtige binding van die peptiden.

De meeste van de antigenen die werden gedefinieerd op basis van de ‘training-set’ waren niet zo M.E.-selektief in de ‘evaluatie-set’. Dit was te wijten aan de variërende IgM-reaktiviteit in de stalen van de bloed-donoren van verschillende jaren. Het is dus waarschijnlijk dat vele van de “M.E.-specifieke” IgM-reakties die werden gevinden in de ‘test-set’ te wijten waren aan de lage reaktiviteit in de bloed-donor stalen van 2010. Het Chlamydia pneumoniae G20c homoloog peptide in de IgM-test behield echter een uitgesproken M.E.-preferentie. Het verdient te worden overwogen als lid van een toekomstig M.E. biomerker-panel.

Reaktiviteit voor een waaier aan Hsp60-epitopen is courant bij zowel gezonde individuen als personen met gevarieerde ziekten. Er dient een bredere studie met inbegrip van meer stalen van verschillende soorten S.L.E.-patiënten en andere auto-immune ziekten (zoals T1D en Reumatoïde Arthritis) plus patiënten die lijden aan myocard-infarct en andere tekenen van atherosclerose, te worden uitgevoerd.

Overzicht van antigeniteiten van humaan, Chlamydia en Mycoplasma Hsp60-peptiden uit onze studie, in de context van resultaten van andere Hsp60-epitoop ‘mapping’-studies.

Onze resultaten vergeleken met eerder werk aangaande Hsp60-epitopen

Wanneer de resultaten van onze epitopen-scanning in de context van eerder gerappporteerde Hsp60-epitopen werden geplaatst, dook een complex beeld op. Er werden meerdere ziekte-correlaties en diagnostische toepassingen voor korte synthetische Hsp60-peptiden gemeld. Onze resultaten met 30-mer overlappende peptiden met menselijke, Chlamydia en Mycoplasma peptiden deden denken aan, maar waren verre van identiek met, eerdere resultaten.

Implicaties van de resultaten voor het begrijpen van de pathogenese van M.E.

Hsp60 is een belangrijk auto-antigen. De funktie van Hsp60 is het interageren met proteïnen op verschillende manieren, dus is het geen verrassing dat het naar voor komt als een kandidaat bij veel beschouwingen over het pathomechanisme. Hoewel we relatief hoge waarden van antilichamen tegen specifiieke Hsp60-epitopen vinden bij M.E., is de hoge frequentie van anti-HSP60 antilichamen in controle-stalen, en de hoge conservatie-graad en vele funkties van Hsp60, een argument tegen simplistische conclusies betreffende zijn etiologische rollen en mogelijke therapeutische implicaties [peptide-vaccins kunnen negatieve effekten geven]. Resultaten van anderen geven aan dat Hsp60 kruis-reakties ook epitopen van andere chaperoninen omvatten, en misschien virale kaspel proteïnen [coxsackie- en picorna-virussen]. Onze resultaten zijn compatibel met de aanwezigheid van door infektie opgewekte auto-antilichamen bij M.E. De bevinding dat auto-antilichamen voorkomen bij M.E. is niet nieuw [lees bv. ‘Vaccinatie en CVS]. Er werd een verhoogde frequentie van antilichamen tegen cardiolipine [belangrijk bestanddeel van het binnenste membraan van het mitochondrium] gerapporteerd [Hokama Y et al. Anticardiolipin antibodies in the sera of patients with diagnosed Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Lab Anal (2009) 23: 210-212]. Zoals Hsp60 is dit een molekule die voorkomt in zowel mitochondrieën als bakterieën. Het panorama aan auto-antilichamen bij M.E. zou verder onderzocht moeten worden.

Speculatie betreffende een mogelijke pathogene rol van anti-Hsp60

De verstrekkende vermoeibaarheid bij M.E. zou verband kunnen houden met een verstoord aëroob energie-metabolisme tijdens herstel van inspanning [Vanness JM, Snell CR et al. Subclassifying Chronic Fatigue Syndrome through exercise-testing. Medicine and science in sports and exercise (2003) 35: 908-913 /// White AT, Light AR et al. Severity of symptom-flare after moderate exercise is linked to cytokine-activity in Chronic Fatigue Syndrome. Psychophysiology (2010) 47: 615-624, zie Symptoom-opflakkering verbonden met cytokine-aktiviteit bij CVS] en mitochondriale dysfunktie [Plioplys AV, Plioplys S. Electron-microscopic investigation of muscle mitochondria in Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (1995) 32: 175-181 /// Lodi R, Taylor DJ, Radda GK. Chronic Fatigue Syndrome and skeletal muscle mitochondrial function. Muscle Nerve (1997) 20: 765-766]. Men kan speculeren dat anti-Hsp60 antilichamen bij M.E. ook interfereren met de werking van Hsp60, in mitochondrieën en elders. Auto-antilichamen tegen mitochondriale enzymen van de Krebs-cyclus komen voor bij primaire biliaire cirrhose [zie ookVerder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)]. Immunologische abnormaliteiten, zoals NK-cel dysfunktie, worden frequent gemeld bij M.E. [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of Natural Killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88. /// Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of Natural Killer cell function and dipeptidyl-peptidase IV/CD26. PLOS ONE (2010) 5: e10817]. Het is denkbaar dat een verstoring van de Hsp60 turn-over die wordt teweeggebracht door anti-Hsp60 de NK-cel aktiviteit zou kunnen beïnvloeden. […] Een auto-antilichaam afhankelijk mechanisme achter M.E. is ook in overéénstemming met de resultaten van behandeling met anti-CD20 monoklonaal antilichaam [zie ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)], waarbij B-cel depletie leidde tot substantiële verbetering bij ca. 60% van de M.E.-patiënten. Er zou moeten worden onderzocht of M.E. een gelijkaardige pathogenese heeft als de post-infektueuze neuro-immunologische ziekten.

Besluiten

Gebruikmakend van 3 sets van volledig overlappende synthetische 30mer peptiden in een multiplex suspensie test, definieerden we het patroon van IgG- en IgM-herkenning van Hsp60-epitopen van bloed-donoren en M.E.-patiënten. Bepaalde peptiden van Hsp60 van pro- en eukaryoten (inclusief mensen), voornamelijk van de helix, behielden een chaperonine-achtige proteïne-bindende aktiviteit maar bonden ook IgG en IgM in M.E.-stalen, en dit meer frequent en meer intens dan die van de controles. De IgM-epitopen waren taltijker dan de IgG-epitopen. Enkele van hen waren onderscheidend voor M.E. De overéénstemming van de resultaten van Hsp60-peptiden van diverse gastheren pleit voor een kruis-reagerende bron (via mimotopen [macromolekulen, dikwijls peptiden, die de struktuur van een epitoop nabootsen en een antilichaam-respons opwekken]) van de auto-antilichamen die voorkomen bij M.E. en controles. Er werd een consensus peptide-sequentie van een belangrijk kruis-reagerend epitoop, samenvallend met de helix, gedefinieerd. Of de anti-Hsp60 antilichamen van M.E.-patiënten en controles ontstaan na één of meerdere acute of chronische infekties kan niet worden vastgesteld via deze uitsluitend serologische studie. We identificeerden een synthetisch Hsp60-peptide dat mogelijks diagnostisch nuttig kan zijn, samen met andere merkers, in een toekomstig biomerker-panel voor M.E.-patiënten. Afgezien van de mogelijke relatie van anti-Hsp60 antilichamen met M.E., zijn de definitie van Hsp60-epitopen en hun kruis-reaktiviteiten belangrijke uitkomsten van dit werk.

Blog op WordPress.com.