M.E.(cvs)-wetenschap

april 21, 2018

NIR-spectroscopie screening ter detektie van pathogene mitochondriale DNA-varianten bij ‘onverklaarde vermoeidheid’

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , , , ,

Op onze pagina’s hadden we het al over M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte. We gaven er daaromtrent de mening van M.E.(cvs)-specialisten weer. Een Italiaans onderzoeksteam schreef dienaangaande ook: “Een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong zou de daling in funktionele mogelijkheden van de spier kunnen verklaren, zowel als een vermindering in kracht maar, vooral, een vermindering in weerstand.” (‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’). Oproepen tot verder onderzoek bleven niet uit; zie ‘Rol van mitochondriale dysfunkties bij pijn (CVS & FM)’ & ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’. Er werd ook gewag gemaakt van “extreem zware of uitputtende inspanning die mitochondriale stoornissen bevordert, die de werking ervan permanent kunnen beschadigen” (zie ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’)…

Onderstaande publicatie over onderzoek uitgevoerd door researchers en artsen verbonden aan de Universiteit Gent zou een respons op de vraag naar meer onderzoek kunnen vertegenwoordigen maar jammer genoeg toont het de ongemakkelijke spreidstand aan tussen verschillende ‘stromingen’ betreffende onverklaarde vermoeidheid. Sommigen (bv. Prof. Van Coster) gaan hier voor de hypothese dat M.E.(cvs) elementen van een mitochondriale myopathie heeft, terwijl de adepten van de biopsychosociale school (bv. psychiater dr Mariman) alle langdurige vermoeiden op één hoop gooit, brede definities hanteren en een mengelmoes van patiënten (waarvan misschien slechts enkelen die M.E.(cvs) hebben) in één studie opnemen. Dat deze zoektocht slechts bij 1/3 aanwijzingen voor een eventuele mitochondriale myopathie oplevert, lijkt ons dan ook maar evident. Men zal argumenteren dat dit een piloot-studie betreft met maar een klein aantal patiënten maar ons lijkt dit een quasi amateuristische aanpak die van bij aanvang gedoemd is te mislukken en/of dergelijke halfslachtige resultaten op te leveren. Verder blijft de noodzakelijkheid van (invasieve) biopten een bijkomend obstakel. Ook hierbij is het amateurisme niet ver weg, te meer daar we vernemen dat spierbiopt-materiaal van sommige deelnemers gewoon is ‘verdwenen’…

De waarde van de nieuwe methodiek kan o.i. enkel worden nagegaan bij patiënten die beoordelen aan de geschikte criteria voor M.E.(cvs).

————————-

Appl Spectrosc. (2018) [pre-print]

Near-Infrared Spectroscopy Screening to Allow Detection of Pathogenic Mitochondrial DNA Variants in Individuals with Unexplained Abnormal Fatigue: A Preliminary Study

Celie BM1, Mariman A2,3, Boone J1,4, Delesie L2, Tobback E2,3, Seneca S5, De Paepe B6, Vogelaers D2,3, Van Coster RN6, Bourgois JG1,4

1 Department of Movement and Sports Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium

2 Department of General Internal Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

3 Centre for Neurophysiologic Monitoring, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

4 Centre of Sports Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

5 Centre for Medical Genetics, University Hospital Brussels, Neurogenetics Research Group, Reproduction Genetics and Regenerative Medicine Research Group, Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium.

6 Department of Pediatrics, Division of Pediatric Neurology and Metabolism, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

Samenvatting

Onverklaarde abnormale vermoeidheid wordt gekenmerkt door chronische vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand en onvoldoende wordt verklaard door enige erkende medische aandoening. In deze piloot-studie, werden 12 individuen met abnormale vermoeidheid die onverklaard bleef na een grondige screening, onderzocht m.b.v. een ‘near-infrared’ [elektromagnetische straling net buiten het zichtbaar licht; golflengte > 780 nm] (NIR) spectroscopie handgreep-test. Daarvan bleken er 4 een abnormaal zuurstof-extractie patroon te vertonen dat lijkt op dat van individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [MM]. Bij 3 van deze 4 individuen werden diverse mitochondriale abnormaliteiten gedocumenteerd via spectrofotometrische, immunocytologische, fluorescente en morfologische analyses uitgevoerd op skeletspier[biopten] en gecultiveerde huid-fibroblasten. Bij 3 van de 4 mensen met verminderde musculaire zuurstof-extractie werd een verschillende homoplasmatische pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie (m.961T > C, m.1555A > G, m.14484T > C) getoond. [homoplasmie = enkel identieke mtDNA-kopieën aanwezig; alle cellen hetzelfde mitochondriaal genoom] Bij de vierde werd de aanwezigheid van meerdere grote mitochondriaal-DNA deleties [ontbrekende fragmenten] in spierweefsel vermoed. In tegenstelling daarmee hadden geen enkele van de 8 abnormaal vermoeide individuen met normale NIR-spectroscopie resultaten een pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie of grote deleties (P < 0.001). Deze piloot-studie geeft aan dat NIR-spectroscopie kan dienen als een niet-invasief screening-instrument om een subgroep (patiënten) met mitochondriale dysfunktie af te bakenen bij de grote groep individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid.

Inleiding

Onverklaarde abnormale vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand vormt een significant probleem dat leidt tot ernstige dalingen qua beroeps- en sociale aktiviteiten. De diagnostische benadering van onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist een zorgvuldige uitsluiting van andere verklarende aandoeningen, zoals psychiatrische, farmacologische, endocriene, neoplastische, hematologische, infektueuze, metabole (inclusief mitochondriale), cardiopulmonaire, bindweefsel ziekten en slaap-stoornissen. Meerdere van deze aandoeningen kunnen makkelijk worden uitgesloten door gebruik te maken van de gepaste klinische onderzoeken. Sommige vormen onverklaarde abnormale vermoeidheid worden als idiopathisch [zonder bekende oorzaak] beschouwd, t.t.z. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie, en de diagnose hangt af van de exclusie van andere ziekten en het voldoen aan diagnostische criteria (bv. de Fukuda criteria).

De uitsluiting van een mitochondriaal defekt als de onderliggende oorzaak voor vermoeidheid ligt niet altijd voor de hand. Bij jongere individuen zijn de klinische en biochemische abnormaliteiten overduidelijk. Uiteindelijk wordt de diagnose weerhouden na de geschikte biochemische, radiologische en genetische testen. In sommige gevallen, bijzonderlijk bij volwassenen, kunnen de klinische symptomen van mitochondriale defekten subtieler zijn. Sommige individuen met mitochondriale defekten vertonen zelfs geen tekenen van een myopathie of andere orgaan-betrokkenheid vooraleer ze ouder zijn geworden of symptomatisch worden na het innemen van medicatie die toxisch is voor de mitochondriale werking (natrium-valproaat [anti-epilepticum], aminoglycosiden [antibiotica], linezolid [antibioticum]). Hoewel inspanning-intolerantie, spierpijn en spierzwakte sleutel-symptomen zijn voor de erkende entiteit mitochondriale myopathie, kan onverklaarde abnormale vermoeidheid het enige of overwegende symptoom zijn bij een persoon met een mitochondriaal defekt. Bovendien kan het klinisch beeld CVS nabootsen. In een studie […] rapporteerden 62% van patiënten met gedocumenteerde mitochondriale ziekte overmatige symptomatische vermoeidheid (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 40), terwijl 32% ernstige, funktioneel beperkende vermoeidheid-symptomen meldden (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 80), vergelijkbaar met de vermoeidheid die wordt ervaren door patiënten met Myalgische Encefalopathie/CVS. Volgens de auteurs is subjectieve vermoeidheid een prominent symptoom bij individuen met mitochondriale ziekte maar de prevalentie, impact en etiologie ervan wordt nog niet goed begrepen.

In een eerdere studie toonden we dat ondubbelzinnig onderscheid gemaakt kan worden tussen gezonde controles en individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [Celie B, Boone J, Smet J et al. Forearm Deoxyhemoglobin and Deoxymyoglobin (Deoxy[Hb+Mb]) Measured by Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Using a Handgrip Test in Mitochondrial Myopathy. Appl. Spectrosc. (2015) 69: 342-347] d.m.v. NIR-spectroscopie in voorarm-spieren tijdens een ‘incremental cyclic contractions protocol’ [cyclus van spier-samentrekkingen met oplopende intensiteit] (ICCP) [Celie B, Boone J, Van Coster R, Bourgois J. Reliability of Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for Measuring Forearm Oxygenation During Incremental Handgrip Exercise’’. Eur. J. Appl. Physiol. (2012) 112: 2369-2374]. Het doel van de huidige studie was om NIR-spectroscopie te gebruiken als een niet-invasief screening-instrument voor mitochondriale dysfunktie bij individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid zonder co-morbiditeit en geselekteerd na multidisciplinaire beoordeling [Vraag is: hoe onbevooroordeeld dit gebeurde wetende dat de artsen van het Gentse ‘CVS referentiecentrum’ de biopsychosociale school’ aanhangen…]. De deelnemers waarbij abnormale NIR-spectroscopie resultaten werden gevonden werden verder onderzocht d.m.v. spier- en huid-biopten [niet allemaal, zie ook onze inleiding] alsook bloed-onderzoeken om morfologische, biochemische of genetische abnormaliteiten in hun mitochondrieën en mitochondriaal DNA (mtDNA) te documenteren. Er werd ook bloed afgenomen van individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid en normale NIR-spectroscopie resultaten.

Methodes

Deelnemers

Er werden 2 groepen individuen vergeleken. Een eerste bestond uit 12 patiënten met de diagnose ‘ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid, zonder co-morbiditeit’ [niet noodzakelijk ME.(cvs)]. De tweede bestond uit 12 voor leeftijd en geslacht gematchte ongetrainde gezonde controles. De patiënten met ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ werden gerecruteerd via de Afdeling Algemene Interne Geneeskunde van het Universitair Ziekenhuis van Gent, België. […] De leeftijd, lengte en gewicht van de patiënten (11 vrouwen, 1 man) waren 45 ± 8 jaar, 165 ± 6 cm & 71 ± 17 kg (gemiddelde ± standaard-deviatie). De controles (11 vrouwen, 1 man) waren gematcht voor leeftijd en geslacht. Hun leeftijd, lengte en gewicht waren 46 ± 8 jaar, 168 ± 7 cm & 70 ± 15 kg.

Diagnostisch beslissingmaking-proces voor Onverklaarde Abnormale Vermoeidheid

Voor de beoordeling van tot dusver onverklaarde en langdurige abnormale vermoeidheid, volgden we een holistische benadering gebaseerd op het biopsychosociaal model van Wessely et al. [!!!] Het geïntegreerd diagnostisch pad omvatte een internistische beoordeling, psycho-diagnostische screening, revalidatie-beoordeling en polysomnografie gecombineerd met een multipele slaap-latentie-test [EEG-registraties met een tussentijd van ongeveer 2 uur om het slaap-patroon overdag te onderzoeken]. De internistische beoordeling bestond uit een uitgebreide anamnese, met oog voor eerdere medische diagnoses of onderzoeken, en een lichamelijk onderzoek met bijkomende onderzoeken indien daar indicatie voor was. Een revalidatie-arts evalueerde de aanwezigheid van musculoskeletale co-morbiditeit waarvoor fysiotherapie voor bestaat. De psycho-diagnostische werd uitgevoerd door een klinisch psycholoog en omvatte anamnese, gevalideerde vragenlijsten en psychologische testen. Er had een psychiatrisch consult plaats wanneer de voorgeschiedenis suggestief was voor eerdere of huidige psychiatrische problemen, en wanneer er hints voor de aanwezigheid van een psychiatrische aandoening opdoken uit de psycho-diagnostische evaluatie of de multidisciplinaire bespreking. De uitkomst van deze multidisciplinaire bespreking was een diagnostische klassificatie in: (1) ‘ondubbelzinnige onverklaarde abnormale vermoeidheid’, (2) onverklaarde abnormale vermoeidheid met co-morbiditeit of (3) een aandoening die onverklaarde abnormale vermoeidheid uitsluit. Bij ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid waren naast elkaar bestaande slaap- of psychiatrische aandoeningen uitgesloten. Zodoende werd het diagnostisch proces niet beperkt tot enkel tekenen en symptomen. Zonder de discussie te willen aangaan omtrent de controversiële syndroom-definities, hebben we geopteerd voor het gebruik van de benaming ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ om deze patiënten te beschrijven. [M.a.w. dit artikel handelt niet over M.E.(cvs) per se.]

‘Incremental Cyclic Contraction Protocol’ (ICCP)

Het ICCP bestond uit ritmische handgreep-samentrekkingen met oplopende intensiteit […]. Deze test werd uitgevoerd in ruglig m.b.v. een handgreep-dynamometer. Na bepaling van de maximale vrijwillige contractie kracht (MVC) […] werd de NIR-spectroscopie sonde op de M. flexor carpi ulnaris [spier die het polsgewricht laat buigen] & de M. flexor digitorum superficialis [onderarm-spier die zorgt voor buiging van alle vingers behalve de duim] geplaatst om de microvasculaire zuurstof-extractie te bepalen. Dit protocol startte met het afsluiten van de voorarm-arterie door het opblazen van een manchet tot 260 mmHg (onbepaalde duur, tot een evenwicht-toestand in deoxy[Hb+Mb] [deoxy-haemoglobine/ -myoglobine = haemoglobine/myoglobine dat niet gecombineerd is met zuurstof; het verschil qua weefsel absorptievermogen tussen de 2 geeft de balans tussen de aan- en afvoer van zuurstof in kleine bloedvaten] werd bereikt). De taak bestond uit periodes van 2 min waar oplopende samentrekkingen werden uitgevoerd (1 sec contractie, 1 sec relaxatie), met verschillende intensitieiten van de vrijwillige contractie kracht (% MVC). De samentrekking-periodes werden onderbroken door 60 sec rust. De arbeid-intensiteit begon aan 20% MVC en verhoogde per stap met 10% MVC. Het ICCP werd uitgevoerd tot er uitputting optrad. […] Het onderscheid tussen normale en abnormale NIR-spectroscopie responsen was overwegend gebaseerd op de resultaten van eerdere research; waarbij gezonde controles in staat bleken tot een funktionele toename van hun microvasculaire O2-extractie tot 72,8 % van hun maximale ‘gedwongen’ O2-extractie (tijdens arteriële occlusie [afsluiting]), terwijl MM-patiënten een gemiddelde maximale O2-extraction van 26 % bereikten. MM-patiënten vertoonden een homogene respons op deze handgreep-inspanning met een zeer klein deoxy[Hb+Mb] bereik van 17,2-34,4% van de gedwongen maximale O2-extractie. Eerder hebben we een goede test-hertest betrouwbaarheid van deze NIR-spectroscopische metingen bij gezonde controles getoond […]. Er werd enkel een hertest bij de patiënten uitgevoerd om de resultaten van de eerste test te bevestigen.

Metingen en analyse van de gegevens

NIR-spectroscopie. De skelet-spier weefsel-oxygenatie werd non-invasief gemeten d.m.v. een systeem gebaseerd op absorptie van infrarood (IR) licht, waarbij IR licht van verschillende golflengten wordt uitgezonden. De veranderingen in deoxyhaemoglobine en deoxymyoglobine (deoxy[Hb+Mb]) tijdens het ICCP (t.t.z. het gemiddelde van de hoogste 10 sec) werden uitgedrukt in verhouding met de arteriële occlusie, om mogelijke invloeden van de dikte van het vetweefsel in de voorarm en eventuele deconditionering-effekten te verminderen.

Analyses van skeletspier[biopt]en en huid-fibroblasten

Biopten. 4 individuen met abnormale deoxy[Hb+Mb] waarden (in %) tijdens het ICCP werden uitgenodigd om weefsel-biopten ondergaan om mitochondriale abnormaliteiten te documenteren. 3 daarvan (S1, S2 & S3) gaven toestemming voor skeletspier- (quadriceps) en huid-biopten. […] De spier-biopten werden verwerkt voor licht- en elektronen-microscopie & spectrofotometrische analyse, terwijl de huid-biopten dienden voor primaire fibroblast culturen. […]

Microscopische evaluatie van skeletspier[biopten]

[…]

Funktionele evaluatie van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)

Er werd een standaard spectrofotometrische analyse gebruikt voor de meting van de aktiviteiten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) complexen (I, II, II+III, III & IV) en citraat-synthase in skeletspieren. Dezelfde enzymen werden getest in gecultiveerde huid-fibroblasten (uitgezonderd complex-I). Z-score [gestandaardiseerde waarde] = aktiviteit van het patient-staal min de gemiddelde aktiviteit van de controle-stalen gedeeld door de standaard-deviatie van de controle-stalen. De patient-aktiviteit wordt als deficiënt beschouwd als de Z-score < -3.0 is.

Immuno- en fluorescente kleuring van gecultiveerde huid-fibroblasten

[…]

Sequentie-bepaling van het volledig mitochondriaal genoom

[…]

Statistische Analyse

[…]

Resultaten & bespreking

Er werden significante verschillen gevonden qua deoxy[Hb+Mb] in de groep met onverklaarde abnormale vermoeidheid in vergelijking met een groep gezonde controles (P = 0.019). […] De gemiddelde deoxy[Hb+Mb] waarden tijdens de ICCP waren significant beïnvloed door een subgroep van 4 individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid. Bij deze individuen konden geen significante toenames qua deoxy[Hb+Mb] worden gevonden (test & hertest). Analyse van deze individuele resultaten toonde dat 3 individuen (S1, S2 & S4) een identiek, abnormaal deoxy[Hb+Mb] profiel hadden (test & hertest), wat gelijkaardig was met eerdere observaties bij patiënten met mitochondriale myopathie (MM). Volgens de resultaten van deze laatste studie, konden mitochondriale defekten bij gezonde controles worden uitgesloten, op basis van hun deoxy[Hb+Mb] profiel in de huidige studie. Bij 1 patient (S3) werd dit gewijzigd profiel slechts gevonden bij de hertest (normale deoxy[Hb+Mb] respons tijdens de eerste test), wat aangeeft dat de deoxy[Hb+Mb] respons van dit individu tijdens ICCP niet dezelfde was bij test en hertest.

Voor het testen van het mitochondriaal membraan potentiaal (ΔΨ [ΔΨmt; het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]) werden JC-1 [fluorescente kleurstof die aktieve (rood) en inaktieve (groen) mitochondrieën kleurt; mitochondriale depolarisatie wordt aangegeven door een afname van de rood/groene fluorescentie-intensiteit] en MitoTracker [fluorescente kleurstof die afhankelijk van het membraan-potentiaal de mitochondrieën labelt] testen aangewend, welke geen wijzigingen qua ΔΨ opbouw oppikten. Hoewel de JC-1 fluorescente kleuring homogeen was bij controles en in fibroblasten van S2, vertoonden cellen van S1 & S3 een mozaïek-patroon [doordat de aanwezigheid van mtDNA-afwijkingen varieert van cel tot cel] aangezien een subset cellen voornamelijk inaktieve (groene) mitochondrieën bevatte. Dit mozaïek-patroon doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (e.g. punt-mutatie, deletie of depletie van het mtDNA). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. In tegenstelling daarmee was de immunokleuring voor het oxidatieve fosforylatie complex-II (een complex dat enkel nucleair gecodeerde strukturele subunits bevat) normaal voor alle cel-lijnen (gegevens niet getoond), wat verder duidt op een onderliggend mtDNA-gerelateerd defekt.

De 4 abnormaal vermoeide individuen waarbij gedaalde zuurstof-extractie werd gedocumenteerd, droegen een pathogene mtDNA-variant. Het eerste individu (S1) bleek homoplasmatisch voor de m.961 T>C variant in gecultiveerde huid-fibroblasten en skeletspier. [homoplasmie voor een mutatie wil zeggen: alleen afwijkend mtDNA] Uit de literatuur is bekend dat de m.961 T>C variant gelinkt is met ‘non-syndromic hearing impairment’ [gedeeltelijk of totaal gehoor-verlies dat niet gepaard gaat met andere tekenen en symptomen]. De patient klaagde daadwerkelijk over gehoor-verlies sinds de vroege kindertijd en haar audiogram toonde significant gehoor-verlies in de hoge frequenties. Zoals verwacht op basis van het maternaal overerving-patroon of mtDNA, was haar moeder ook homoplasmatisch voor deze m.961 T>C variant. Er is weinig geweten over de prevalentie van deze mtDNA-wijziging. Poolse onderzoekers vonden dat slechts 2 op 500 gezonde individuen (0,4%) deze variant droegen in Polen. Onze tweede deelnemer (S2) had de m.1555A>G variant in homoplasmie, zoals haar moeder. Deze m.1555 A>G variant is geassocieerd met aminoglycoside-geïnduceerde doofheid welke maternaal wordt overgedragen […] Naar ons weten zijn er geen meldingen over de incidentie [mate van voorkomen] van de m.1555 A>G variant in de algemene bevolking. Er zijn slechts studies beschikbaar die prevalenties variërend tussen 0-0,70% tonen. De vierde deelnemer (S4) in onze studie bleek homoplasmatisch voor de m.14484 T>C variant in het MT-ND6 gen, wat één van de mtDNA-varianten is die geassocieerd zijn met Leber hereditaire optische neuropathie (LHON [plots verlies van gezichtsvermogen door afsterven van cellen in de oogzenuw]). Zoals verwacht waren alle onderzochte matrilineaire [in vrouwelijke lijn] verwanten (moeder en 6 nakomelingen) homoplasmatisch voor deze LHON-mutatie. LHON wordt veroorzaakt door een mitochondriaal overgeërfde degeneratie van de retinale ganglion cel-laag [type neuronen van het netvlies] en optische zenuw, leidend tot sub-acuut of acuut pijnloos, bilateraal visueel falen bij jong-volwassenen, voornamelijk mannen. De m.14484 T>C die de p.(Met64Val) substitutie [door de mutatie bepaalde omwisseling van het betreffend aminozuur in het proteïne] in de MT-ND6 subunit van complex-I veroorzaakt, is 1 van de 3 belangrijke mtDNA primaire mutaties van LHON. Ca. 50% van de mannen en 10% van de vrouwen met deze mutaties ontwikkelen optische neuropathie. Prevalentie-studies aangaande Leber hereditaire optische neuropathie werden meestal in West-Europa uitgevoerd: de prevalenties lagen tussen 1,36-3,22 per 100.000 voor de 3 meest frequente LHON-mutaties tesamen. Er werd een rigoureuze klinische en genetische studie betreffende LHON uitgevoerd in het noord-oosten van Engeland: in een populatie van 2,2 miljoen werden alle patiënten met onverklaard visueel falen en hun familieleden gescreend. Stamboom-analyse onthulde een minimum prevalentie voor m.14484 T>C van 0,3 per 100.000. Bij deelnemer 3 (S3) werden geen pathogene punt-mutaties gedetekteerd maar er werden meerdere deleties gevonden in het mitochondriaal genoom. De incidentie van multipele mtDNA-deleties in de algemene bevolking is onbekend. Als we voor de m.961 T>C mutatie een incidentie van 4/1.000 aannemen, voor de m.1555 A>G mutatie een incidentie van 7/1.000 en voor de m.14484 T>C mutatie een incidentie van 0,003/1000, is de kans dat een individu één van deze mitochondriale punt-mutaties draagt 0,011 [(4.000+7.000+3)/1.000.000]. In tegenstelling daarmee werd gevonden dat 3 van de 12 (0,25) individuen in onze studie één van deze pathogene punt-mutaties droegen. […] Geen enkele van de 8 patiënten met onverklaarde abnormale vermoeidheid waarbij normale NIR-spectroscopie resultaten werden verkregen, bleken een pathogene variant in hun mtDNA te dragen [sequentie-bepaling].

In de literatuur zijn er geen meldingen van NIR-spectroscopie abnormaliteiten gedetekteerd bij individuen die een uiteindelijke diagnose van CVS kregen. In een studie waarbij 16 patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/CVS werden vergeleken met 16 gezonde controles (handgreep-test/NIR-spectroscopie) [Miller RR, Reid WD, Mattman A, Yamabayashi C et al. Submaximal Exercise Testing with Near-Infrared Spectroscopy in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Patients Compared to Healthy Controls: A Case-Control Study. J. Transl. Med. (2015) 13: 159], werd geen significant verschil tussen de 2 groepen gevonden. In een andere studie werden bloedstalen van 193 CVS-patiënten (Canadese criteria) genetisch geanalyseerd voor mogelijke mtDNA-variaties d.m.v. sequentie-bepaling van het ganse mitochondriaal genoom. [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. J. Transl. Med. (2016) 14: 19] In deze laatste studie werd de sequentie van gans het mtDNA bepaald en geen enkele van de bekende pathogene mitochondriaal DNA mutaties werden gedetekteerd bij de individuen met CVS. Men zou een mogelijke heterogeniteit in verschillende groepen gelabeld als CVS in gedachten moeten houden, gezien de variabiliteit qua gebruikte definities, en verschillen qua diepgang van zowel somatische als psychiatrische diagnostische screening en het verstrekken van gegevens over de familiale geschiedenis.

Aangezien de 4 individuen werden gescreend via een gedaalde zuurstof-extractie tijdens inspanning van de voorarm-spieren, had een in vitro zuurstof-consumptie test moeten worden uitgevoerd in voorarm-skeletspier stalen om de gedaalde zuurstof-consumptie te bevestigen. Omwille van ethische redenen was het echter niet mogelijk om een skeletspier-biopt te nemen in voorarm-spieren gezien de hoge concentratie zenuwen en capillairen. In plaats daarvan werd een batterij diagnostische testen aangewend om aan te tonen dat de mtDNA-abnormaliteiten inderdaad een negatieve funktionele impact op de mitochondrieën hadden. Er werd een afname of complex-I aktiviteit en van complex-II+III aktiviteit in skeletspieren, en een daling van complex-IV aktiviteit in gecultiveerde huid-fibroblasten gedetekteerd in S2 m.b.v. spectrofotometrische analyse. In skeletspieren van S3 werd een vermindering van OXPHOS complex-IV aktiviteit gedetekteerd (uitgedrukt t.o.v. OXPHOS complex-II aktiviteit). De JC-1 groene en rode fluorescente kleuring van […] cellen van S1 & S3 toonde een mozaïek-patroon dat doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (punt-mutatie, deletie, depletie). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. […] Bij elk van de 3 patiënten [die toestemmming gaven voor een biopt] werden één of meer mitochondriale abnormaliteiten gedetekteerd. Bij S4 waren bijkomende testen niet mogelijk aangezien de patient een huid/spier-biopt had afgewezen. S4 was echter homozygoot voor de m.14484 T>C mutatie die onbetwijfeld als een pathogene mutatie wordt beschouwd.

Besluit

Via niet-invasieve screening met NIR-spectroscopie en een ICCP, identificeerden we een subgroep [sterk uitgedrukt voor maar 4 op 12 patiënten…] individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid die drager zijn van een pathogene mtDNA variant. NIR-spectroscopie zou een krachtige techniek kunnen zijn om deze individuen te detekteren. Het spreekt vanzelf dat verdere studies met grotere groepen met onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist zijn om onze bevindingen te bevestigen en hun klinische significantie te evalueren.

————————-

We herinneren er ook nog eens aan dat het meten van de ‘baseline’ spier-pH (via magnetische resonantie spectroscopie) metabole onevenwichten bij rust kan aantonen (bv. bij ernstige mitochondriale myopathieën). In ‘Abnormale zuur-verwerking in spieren bij CVS’ kan men lezen dat deze niet significant verschilde tussen controle- en CVS/M.E.-groepen…

Men weet ook dat bij bepaalde myopathieën het ryanodine receptor gen is aangetast (mutaties). Daarom willen we, n.a.v. het bovenstaande nog es oproepen tot meer research hieromtrent (zie ‘Ryanodine receptor & inspanning’)…

Advertenties

april 6, 2018

Extracellulaire vesikels: potentiële biomerkers voor M.E.(cvs)?

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 6:38 am
Tags: , ,

Exocytose is het proces waarbij een cel stoffen overbrengt naar het celmembraan of het extracellulair milieu. De af te geven stoffen worden verpakt in blaasjes (vesikels) die naar het celmembraan worden getransporteerd en er mee samensmelten. Endocytose is het proces waarbij de cel stoffen opneemt die door het celmembraan werden ingesloten. De stoffen die er door mogen, worden ingesloten doordat het celmembraan verder naar binnen toe instulpt tot dat het uiteindelijk een vesikel (endosoom) vormt.

Extracellulaire vesikels – microvesikels (circulerende, extracellulaire vesikels, 50-1000 nm), exosomen (intracellulair gegenereerde, door cellen afgegeven vesikels; 30-100 nm) en apoptotische lichamen (door apoptose geproduceerde fragmenten) – worden door veel, zo niet alle, celtypes afgegeven in het extracellulair milieu. Deze gesekreteerde vesikels bereiken lichaamsvochten en circuleren door het ganse lichaam waardoor ze kunnen interageren met veel verschillende cellen. Ze blijken een rol te spelen in de intercellulaire communicatie omwille van het doorgeven van de molekulen die er in zitten (via directe interaktie tussen een proteïne op het vesikel-membraan en één op het membraan van de ontvanger, of door internalisatie van de vesikel-inhoud door de recipient-cel) en de eigenschap om de werking van de ontvangende cel te veranderen.

Het zijn vehikels voor intercellulaire transfer van funktionele membraan- en cytosol-proteïnen, lipiden en nucleïnezuren. Naar gelang hun oorsprong, samenstelling, grootte en densiteit worden ze microvesikels, ectosomen (extracellulaire vesikels afgesplitst van het plasma-membraan), ‘shedding’ (afgeworpen) vesikels, micropartikels of exosomen genoemd.

In onderstaande studie werd voor het eerst (m.b.v. vrij eenvoudige technieken) maar bij een zeer beperkt aantal M.E.(cvs)-patiënten gekeken naar het voorkomen van extracellulaire vesikels; de resultaten geven dus zeer preliminaire indicaties…

————————-

Journal of Extracellular Vesicles Vol 7, #1 (maart 2018)

Circulating extracellular vesicles as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: An exploratory pilot study

Jesús Castro-Marrero (a), Esther Serrano-Pertierra (b), Myriam Oliveira-Rodríguez (b), Maria Cleofé Zaragozá (a,c), Alba Martínez-Martínez (a), María del Carmen Blanco-López (b) & José Alegre (a)

(a) CFS/ME Unit, Internal Medicine Service, Vall d’Hebron University Hospital Research Institute, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain

(b) Department of Physical and Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Oviedo, Oviedo, Spain

(c) Clinical Research Department, Laboratorios Viñas [farmaceutisch bedrijf], Barcelona, Spain

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) is een verworven, complexe en multi-systeem aandoening met een onbekende etiologie, zonder gevestigde diagnostische laboratorium-testen en zonder universeel erkende medicijnen voor behandeling. CVS/M.E. wordt gekenmerkt door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en wordt dikwijls vergezeld door talrijke kern-symptomen. Steeds meer bewijsmateriaal suggereert dat extracellulaire vesikels (EVs) een rol spelen bij de communicatie tussen cellen, en betrokken zijn bij fysiologische en pathologische processen. Tot op heden zijn geen gegevens beschikbaar betreffende EV-biologie bij CVS/M.E. Het doel van deze studie het isoleren en karakteriseren van EVs in het bloed bij CVS/M.E. Er werden bloedstalen afgenomen bij 10 Spaanse CVS/M.E.-patiënten en 5 gematchte gezonde controles (HCs), en er werden EVs geïsoleerd uit het serum. Ook de proteïnen-lading, grootte en concentratie werd gemeten. Verder werden EVs onderworpen aan een immuno-assay voor de biomerkers CD9 & CD63. We vonden dat de EV-fraktie significant hoger was bij de CVS/M.E.-individuen dan bij de HCs (p = 0.007) en dat EVs significant kleiner waren bij de CVS/M.E.-patiënten (p = 0.014). Circulerende EVs zouden een nieuw instrument kunnen zijn bij biomedische research omtrent CVS/M.E. Deze bevindingen leveren preliminair bewijs dat EVs uit het bloed CVS/M.E.-patiënten kunnen onderscheiden van HCs. Dit zou nieuwe opportuniteiten kunnen bieden en een nieuwe deur kunnen open naar de identificatie van nieuwe potentiële biomerkers en therapeutische benaderingen voor de aandoening.

Inleiding

[…]

Er werden veel studies uitgevoerd omtrent Extracellulaire Vesikels (EVs) in de biomedische research. Sekretie van EVs en EV-gemedieerde mechanismen staan bekend als belangrijke spelers bij een waaier aan biologische processen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De lading van EVs van donor-cellen zouden kunnen interageren met die van recipient-cellen, wat hen tot potentiële intercellulaire mediatoren maakt. Er worden meerdere proteïnen zoals ‘heat-shock’ proteïnen [de ‘heat-shock’ respons is een universeel en essentieel adaptief mechanisme dat cellen toelaat te reageren op een brede waaier van schadelijke condities], integrinen [extracellulaire matrix proteïnen betrokken bij cel-adhesie, aktiveren ook signalisering-mechanismen voor cel-groei en -regulering in het cytosol] en tetraspaninen [familie van membraan-proteïnen] aangetroffen in alle EVs. Bovendien worden de tetraspaninen CD9 [adhesie-molekule op het cel-oppervlak], CD63 [trans-membraan-proteïne] & CD81 [ook een cel-oppervlakte proteïne] courant gebruikt als conventionele EV-merkers aangezien deze aangerijkt zijn in hun membranen.

Daarnaast kunnen EVs in gewijzigde aantallen en samenstellingen voorkomen bij meerdere aandoeningen [o.a. kanker] en ze duiken op als potentiële biomerkers voor diagnose en prognose. Tot op heden zijn er geen publicaties aangaande de isolatie en karakterisatie van EVs bij CVS/M.E. Aangezien de patho-mechanismen van CVS/M.E. die in de literatuur worden beschreven de afgifte van EVs kunnen bevorderen, stellen we voor circulerende EVs bij CVS/M.E. te karakteriseren om hun potentieel als biomerkers voor deze aandoening te bepalen.

In deze ‘proof of concept’ studie, isoleerden we serum-EVs van CVS/M.E.-individuen en gezonde controles (HCs) om ze te karakteriseren qua grootte en concentratie. We analyseerden ook hun samenstelling d.m.v. een immuno-assay (LFIA [‘lateral flow immuno-assay’; zie methodes]) dat werd geoptimaliseerd voor een snelle detektie.

Patiënten & methodes

[…]

Deelnemers

Er werden 10 in aanmerking komende Kaukasische vrouwen met CVS/M.E. (gemiddelde leeftijd 46,3 ± 8,5 jaar) gerecruteerd op basis van de 1994 CDC/Fukuda definitie […]. Er werden ook 5 gematchte sedentaire niet-vermoeide gezonde controles (HCs) (gemiddelde leeftijd 44,2 ± 6,2 jaar) in de studie opgenomen. De exclusie-criteria waren co-morbide psychiatrische ziekte, endocrino-metabole, haematologische en auto-immune aandoeningen, cardiovasculaire ziekte, zwangerschap of borstvoeding, drug-misbruik, roken of CVS/M.E.-symptomen die niet overéénstemmen met de 1994 CDC/Fukuda definitie.

Staal-afname & -verwerking

[…] 12 h vasten. […]

Isolatie van EVs

[…]

EV-karakterisatie

Proteïnen-kwantificatie en ‘western blot’ analyse

[methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen; de proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom, op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten]

[…]

‘Nanoparticle-tracking’ analyse (NTA)

[methode voor het visualiseren en analyseren van partikels in vloeistoffen op basis van de Brownse beweging – willekeurige beweging die het resultaat is van botsingen van snel-bewegende molekulen; zo kan men de grootte-distributie-profiel bepalen van partikels met een diameter van ca. 10-1000 nm]

[…]

‘Lateral flow’ immuno-test

Bepaling van CD9 & CD63 in gezuiverde EVs d.m.v. monoclonale antilichamen […] op een immunostrip [‘papier’-strookje waarop lijntjes verschijnen voor een positieve test en controle] […].

Statistische analyse

[…] p < 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten & bespreking

Bepaling van de hoeveelheid proteïnen en detektie van CD63 EV-frakties

[…] We vonden een significant hogere hoeveelheid proteïnen bij de CVS/M.E.-patiënten dan in bij de controles (65,49 ± 10,75 mg/ml vs. 43,62 ± 5,10 mg/ml; p = 0.001). […]. De analyse van de hoeveelheid EV-proteïnen kan differentiëren tussen CVS/M.E.-individuen en controles. Er werd gerapporteerd dat de inhoud van EVs hoger is bij bepaalde aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. Dit zou kunnen dienen als een biomerker bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor vroege stadia van CVS/M.E. Onze studie toonde een significante overvloed van bloed-EVs bij CVS/M.E.-individuen: gemiddeld een 1,5-voudige toename t.o.v. HCs.

We bepaalden ook de aanwezigheid van de courant gebruikte merker CD63 in de gezuiverde EV-frakties. Aangezien ons LFIA-systeem voor de detektie van EVs anti-CD63 als detektie-antilichaam gebruikt, checkten we daarnaast of de waarden van dit tetraspanine in onze CVS/M.E.-groep voldeden om deze benadering te gebruiken. We analyseerden gelijke volumes van elk staal d.m.v. ‘western blot’. De waarden van CD63 waren ook hoger bij CVS/M.E.-patiënten dan voor de controle-groep, hoewel het verschil niet statistisch significant was.

Karakterisatie van EVs van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles

Geïsoleerde EV-frakties werder verder gekarakteriseerd d.m.v. analyse van grootte-distributie en concentratie via NTA. Op basis van de gemiddelde diameter gemeten in beide groepen, zien we dat de populatie partikels nogal homogeen was qua grootte van circulerende EVs bij CVS/M.E.-patiënten (103-183 nm) maar de EVs geïsoleerd bij HCs waren meer heterogeen verdeeld (diameters van 140 tot 271 nm). EVs van de controle-groep waren significant groter dan deze van CVS/M.E.-individuen (p = 0.014). Betreffende de concentratie geïsoleerde EV-frakties vonden we een groter aantal partikels bij CVS/M.E.-patiënten dan bij controles (1015 partikels/ml vs. 4,88×1012 partikels/ml; p = 0.007).

Er wordt momenteel aanvaard dat de grootte van EVs van endocytische oorsprong (exosomen) typisch 30-150 nm is. Onze resultaten geven aan dat EV-frakties van CVS/M.E.-patiënten rijk zijn aan exosomen in vergelijking met HCs, waarbij we grotere diameters vonden die kunnen grotendeels met microvesikels overéénkomen. EVs zijn naar voren tredende doelwitten voor biomedische research en deze bevindingen betekenen het eerste bewijs voor het feit dat het aantal circulerende EVs CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles kan onderscheiden.

Detektie van EVs die het tetraspanine CD9 tot expressie brengen

Bij het bestuderen van EV-biologie is hun isolatie even uitdagend als hun detektie. In dit opzicht biedt LFIA een krachtig instrument voor goedkope ‘on-site’ detektie. In deze studie werd LFIA-analyse uitgevoerd om een snelle detektie van circulerende EVs na isolatie toe te laten. Als detektie-antilichaam werd anti-CD63 gebruikt en anti-CD9 als het capterend antilichaam geprint in de test-lijn, anti-IgG werd gebruikt voor de controle-lijn. […] Serum dat werd ontdaan van EVs werd gebruikt als een negatieve controle. […]

[…] Het is meldenswaardig dat slechts 1 μl van de frakties nodig was om een zichtbaar signaal te verkrijgen (rode lijn) en zodoende EVs te detekteren. We vonden geen significante verschillend qua intensiteit van het CD9-signaal voor de EV-aangerijkte frakties tussen CVS/M.E.-patiënten en HCs. Dit impliceert vragen omtrent het gebruik van CD9 als een standaard exosomale merker voor CVS/M.E. EVs; aangezien het expressie-niveau van dit tetraspanine niet significant verschillend was tussen beide groepen. Het LFIA-platform werd gebruikt als een initiële benadering en het is geschikt voor snelle detektie van EVs, zoals eerdere gerapporteerd. Ons LFIA-systeem kan verder worden geoptimaliseerd of aangepast om andere biomerkers te detekteren. Daarom beschouwen we het als een goed startpunt. Niettemin zijn verdere studies met meer CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles nodig om mogelijke verschillen betreffende de aanwezigheid van andere tetraspaninen of andere in EV ingekapselde merkers (o.a. DNA, RNA, lipiden, proteïnen, cytokinen en metabolieten) te exploreren.

Besluiten

Dit rapport is het eerste dat aantoont dat de aantallen bloed-EVs verhoogd zijn bij patiënten met CVS/M.E., wat wijst op hun mogelijke betrokkenheid bij ziekte-pathogenese. Deze beloftevolle bevinding biedt wellicht niet enkel inzichten in de mechanismen betrokken bij de ziekte maar toont ook dat EVs nuttig kunnen zijn bij de vroege diagnose. Bovendien kan de isolatie van circulerende EVs gekoppeld aan ons prototype voor de detektie ervan via LFIA een krachtig (één enkele stap en in minuten) diagnostisch instrument vormen. We besloten dat EVs een cruciale rol kunnen spelen bij CVS/M.E. Studies met grotere groepen, meer uitkomst-metingen en verschillende studie-ontwerpen (cross-sectioneel vs. longitudinaal) zijn nu dringend vereist. Deze studies zouden subgroepen moeten opdelen volgens ziekte-aanvang en -progressie, en patiënten beoordelen bij ‘baseline’ en na inductie van post-exertionele malaise (via de 2-dagen cardiopulmonaire inspanning test [‘fiets-test’ op 2 opéénvolgende dagen]).

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.