M.E.(cvs)-wetenschap

mei 17, 2020

HHV-6 reaktivatie, mitochondriale fragmentatie en antivirale & metabole fenotypes bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Infektie — mewetenschap @ 6:44 am
Tags: , , , , , , , ,

Onderstaand onderzoek (o.a. gefinancierd door ‘Solve M.E. Initiative’) toont een connectie tussen het courant voorkomend humaan herpes virus-6 (dat DNA-materiaal achterlaat in de cellen) en veel van de symptomen van M.E.(cvs).

Een team researchers van de ‘University of California San Diego School of Medicine’ en drie Duitse universiteiten illustreert hoe de inspanningen die het lichaam levert om de bescherming door het immuunsysteem op te krikken, kunnen leiden tot fysiologische uitputting. Ze focusten daartoe op Humaan Herpes Virus 6 (HHV-6), dat kan sluimeren (virale latentie) door te integreren in de chromosomen.

Eén van de auteurs, Robert Naviaux (de bedenker van de ‘cell-danger response’) stelt voor dat cellen al hun energie aanwenden voor hun verdediging en overleving, zodat ze er niet genoeg over hebben voor een normale cellulaire aktiviteit) liet optekenen: “Deze bevindingen zijn belangrijk omdat ze voor ‘t eerst tonen dat er antivirale aktiviteit in het serum van M.E.(cvs)-patiënten werd aangetroffen die nauw verbonden is met een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verminderde cellulaire energie (ATP-produktie).”. En “Het biedt een verklaring voor de observatie dat M.E.(cvs)-patiënten minder virale infekties ervaren nadat ze de ziekte kregen. Ons werk helpt ook de link met eerdere infektie met Humaan Herpes Virus-6 (HHV-6) of HHV-7 begrijpen.”.

90 % van de bevolking wordt vóór de leeftijd van drie blootgesteld aan HHV-6. Het virus-DNA nestelt zich dan in een chromosoom en blijft er jaren lang latent in slechts enkele cellen. Voor de meeste mensen geeft dit geen problemen.

Hier werd echter gevonden dat blootstelling aan nieuwe metabole of chemische stressoren de cellen (met een geïntegreerde copie van of HHV-6), aanzet om naburige cellen te waarschuwen voor een bedreiging. De aktiviteit (een substantie die door HHV-6 geïnfekteerde cellen wordt gesekreteerd) beschermt andere cellen tegen nieuwe infekties (“super-infektie”) met RNA- & DNA-virussen maar veroorzaakt ook een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verlaagt hun intracellulaire ATP-reserve (energie-voorraad). De researchers dienden cultuur-medium van cellen met HHV-6 reaktivatie toe aan gezonde cellen: ze zagen wijzigingen in mitochondriale strukturen geassocieerd met een lage metabole toestand. Dezelfde strukturele veranderingen werden ook gevonden als gezonde cellen werden gekweekt in medium met serum van M.E.(cvs)-patiënten. Cellen zonder een geïntegreerde copie van of HHV-6 sekreteren die antivirale activiteit niet.

De resultaten tonen, volgens de auteurs, dat de cellulaire bio-energetische vermoeidheid en cellulaire verdediging twee zijden van hetzelfde muntstuk zijn bij M.E.(cvs): Wanneer energie wordt verbruikt voor de verdediging van de cellen, is die niet meer beschikbaar voor normale cel-funkties (groei, herstel, en de werking van het neuro-endocrien systeem en het autonoom zenuwstelsel).

De bevindingen belichten verder het concept (de ‘cell-danger response’ (CDR) theorie) dat Naviaux al jaren onderzoekt. Deze theorie stelt dat chronische ziekte het gevolg is van de blokkage van een cyclus van natuurlijk herstel door ontwrichtingen op metabool en cellulair niveau. Bij M.E.(cvs) leidt dit alles tot levenslange ziekte.

HHV-6 & HHV-7 spelen dus misschien een rol bij de ziekte maar of ze dé (enige) oorzaak zijn …? Er wordt getoond dat met HHV-6 geïnfekteerde of gereaktiveerde celllen een krachtige metabole en mitochondriale her-modelerende respons kunnen opwekken die zelfs de cellen die geen virus bevatten kunnen leiden naar een hypo- (abnormaal lage) metabole toestand. Dus: zelfs (virus-gereaktiveerde) cellen met een laag aantal copieën van het virus in het bloed hebben nog een impact op de energie-produktie van andere cellen bij M.E.(cvs). De auteurs geloven dat dit mechanisme ook geldt voor gevallen die getriggerd zijn geweest door andere virussen.

Er zijn nu grotere studies nodig om de resultaten te valideren. De vraag blijft ook waarom reaktivatie van latent HHV-6 DNA in slechts enkele cellen genoeg zou om een signaal af te geven dat andere cellen doet ‘slapen’ en waarom dat enkel bij M.E.(cvs) gebeurt? Is er misschien een genetische factor in het spel? Er dient ook te worden gezocht naar de substantie die de cellen in ‘alarm’ zet en hun energie-produktie ondermijnt; en naar manieren om het signaal (waarvan de auteurs denken dat het niet-geïnfekteerde cellen in de ‘cell danger’ modus zet) te blokkeren…

————————-

ImmunoHorizons Vol 4, #4, pp 201-215 (april 2020)

Human Herpesvirus-6 reactivation, mitochondrial fragmentation, and the coordination of antiviral and metabolic phenotypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Philipp Schreiner (1), Thomas Harrer (2), Carmen Scheibenbogen (3), Stephanie Lamer (4), Andreas Schlosser (4), Robert K. Naviaux (5), Bhupesh K. Prusty (1,5,6)

1 Lehrstuhl fur Mikrobiologie, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

2 Medizinische Klinik 3, Universitatsklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nurnberg, Germany

3 Institut fur Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum, Germany

4 Rudolf-Virchow-Zentrum fur Experimentelle Biomedizin, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

5 Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

6 Department of Pediatrics, School of Medicine, University of California, San Diego

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een multi-factoriële aandoening met veel mogelijke triggers. Humaan herpesvirus (HHV)-6 & HHV-7 zijn twee infektueuze triggers waarvoor het bewijsmateriaal omvangrijker werd. Om de mogelijke oorzakelijke rol van HHV-6 bij M.E./CVS te begrijpen, werden metabole en antivirale fenotypes van U2-OS cellen bestudeerd met en zonder chromosomaal geïntegreerde HHV-6, en met en zonder virus-reaktivatie gebruikmakend van de histoon-deacetylase inhibitor trichostatine-A [TSA]. Er werd proteoom-analyse uitgevoerd d.m.v. isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur analyse. De door HHV-6 transaktivatie geïnduceerde antivirale eigenschappen werden bestudeerd in virus-naïeve A549 cellen belast door infektie met influenza-A (H1N1) of HSV-1. Fragmentatie van mitochondrieën, en 1-koolstof metabolisme, dUTPase en thymidylaat-synthase bleken sterk geïnduceerd door HHV-6 reaktivatie, terwijl superoxide-dismutase-2 en proteïnen vereist voor mitochondriale oxidatie van vetzuren, aminozuren en glucose-metabolisme, inclusief pyruvaat-dehydrogenase, sterk waren geïnhibeerd. Transfer van supernatanten van U2-OS cellen na reaktivatie van HHV-6A leidde tot een antivirale toestand in A549 cellen zodat superinfektie met influenza-A en HSV-1 werden voorkomen. Adoptieve transfer van serum van 10 patiënten met M.E./CVS veroorzaakte een gelijkaardige fragmentatie van mitochondrieën en de geassocieerde antivirale toestand in de A549 cel test. Tot besluit: HHV-6 reaktivatie bij M.E./CVS-patiënten aktiveert een multisystemische, pro-inflammatoire, ‘cell-danger’ respons die beschermt tegen bepaalde RNA- en DNA-virus infekties maar ten koste van mitochondriale fragmentatie en ernstig verstoord energie-metabolisme.

INLEIDING

Humaan herpesvirus (HHV)-6A & -6B zijn neurotrope virussen [gericht op het zenuwstelsel] die reeksen telomeer- ‘repeats’ [herhaalde DNA-sequenties] dragen aan beide uiteinden van hun lineair genoom, wat hun genoom-integratie in menselijke chromosomen vergemakkelijkt en leidt tot latentie [virale latentie = de fase in de levenscyclus van een virus waarbij, na initiële infektie, de proliferatie van virus-partikels ophoudt]. Chromosomaal geïntegreerd HHV-6 (ciHHV-6) wordt nu en dan genetisch overgeërfd (iciHHV-6). Ca. 0,2-1% van de bevolking draagt iciHHV-6 en 90-100% is geïnfekteerd op de leeftijd van 3 jaar. HHV-7 is een ander lid van de beta-herpesvirus familie dat gelijkaardige genoom-integratie kenmerken heeft als HHV-6. HHV-6 & HHV-7 zijn dikwijls geassocieerd met meerdere menselijke ziekten, inclusief Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), waar ook mitochondriale dysfunktie bij betrokken is. Er wordt al lang voorspeld dat mitochondriale dysfunktie een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van en/of progressie van M.E./CVS. Een gewijzigde mitochondriale dynamiek, deficiënte mitochondriale ATP-aanmaak en verhoogde oxidatieve stress werden bij M.E./CVS gerapporteerd. Biofysische veranderingen in cellen van M.E./CVS-patiënten die onder osmotische stress werden geplaatst werden gebruikt als een [mogelijke] vernieuwende diagnostische test voor M.E./CVS [Davis RW et al. A nanoelectronics-blood-based diagnostic biomarker for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2019- 116: 10250-10257]. De exacte antecedent voor mitochondriale modulatie bij M.E./CVS is echter grotendeels onbekend. We hebben aangetoond dat HHV-6A reaktivatie mitochondriale fragmentatie induceert [Prusty BK et al. HHV-6 encoded small non-coding RNAs define an intermediate and early stage in viral reactivation. NPJ Genom. Med. (2018) 3: 25]. In deze studie hier onderzochten we potentiële infektueuze oorzaken en molekulaire mechanismen van mitochondriale dysfunktie, die wellicht resulteren in de ontwikkeling en/of progressie van M.E./CVS, gebuikmakend van HHV-6A reaktivatie als model. Onze resultaten tonen een serum-transfereerbare aangeboren immuun-aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten die een toestand van lage mitochondriale aktiviteit gepaard met veranderingen qua mitochondriale dynamiek induceert, wat kan bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte.

MATERIALEN & METHODES

Cel-culturen en virale infektie

A549 [long-carcinoom] cellen […]. U2-OS [beender-osteosarcoom] cellen […] dragen latent HHV-6A.

[…]

Bloed-afname, DNA-extractie en kwantitatieve PCR van HHV-6 & HHV-7 DNA

[…]

RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

[…]

ATP-test

[…]

Microscopie van de mitochondrieën en kwantificaties

[…] Meting van mitochondriale oppervlakte. […]

Fluorescentie in situ hybridisatie analyse

FISH [fluorescentie in-situ hybridisatie; techniek waarbij (delen van) chromosomen gekleurd worden en vervolgens onder een fluorescentie-microscoop worden bekeken] ter detektie van HHV-6A klein niet-coderend RNA-U14 (sncRNA-U14) [volgens Prusty BK et al. (zie hierboven), een merker voor virale reaktivatie].

Cytokine-analyse in PBMCs

De diagnose van M.E./CVS werd gesteld aan de Charité kliniek voor immunodeficiënties op basis van de Canadese Consensus Criteria en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Gezonde controles (HCs) gematcht voor leeftijd en geslacht werden gerecruteerd bij het personeel […].

Cytokine-produktie door monocyten […] en T-lymfocyten […]: kwantificatie van TNF-α & IL-1β in met LPS-gestimuleerde, en Il-5 & IFN-γ in met ConA gestimuleerde stalen, d.m.v. ELISA […].

Gepulseerde stabiele isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur

[op massa-spectrometie gebaseerde techniek die verschillen qua hoeveelheden proteïnen detekteert gebruikmakend van labeling met niet-radioaktieve isotopen] […]

MS en MS gegevens-analyse

[…]

Statistiek

[…]

Toegankelijkheid van de gegevens

[…]

RESULTATEN

HHV-6A reaktivatie induceert mitochondriale dysfunktie

Verscheidene pathogene infekties wijzigen de mitochondriale dynamiek en funktie ten voordele van hun eigen vereisten. In het bijzonder virale infekties richten zich tegen mitochondrieën om de aangeboren immuniteit te ondergraven. Daarom dachten we dat een virale oorzaak achter de ontwikkeling van M.E./CVS zit, minstens bij een subgroep patiënten. Gebruikmakend van een uniek in-vitro model met menselijke U2-OS cellen, hebben we eerder getoond dat HHV-6A transaktivatie mitochondriale fissie [splijting] induceert, wat geassocieerd is met gewijzigingen van microRNAs (miRNA) alsook van het mRNA-transcriptoom van de gastheer. HHV-6 reaktivatie in U2-OS cellen is niet-produktief [Er worden geen infektueuze virussen aangemaakt.] en wordt gemarkeerd door de initiatie van transcriptie van meerdere virale kleine niet-coderende RNAs [sncRNA] in afwezigheid van substantiële virale DNA-replicatie en virale proteïne-synthese. Het viraal polymerase [enzyme dat DNA- of RNA-molekulen synthetiseert/copieert] is niet detekteerbaar, en er kunnen slechts heel weinig selektieve virale ‘onmiddellijk vroege’ (I.E.) [‘immediate-early’] en ‘vroege’ transcripten en proteïnen [van genen die (heel) vroeg worden overgeschreven] in deze cellen worden gedetekteerd na virus-reaktivatie.

Om de potentiële effekten van HHV-6A transaktivatie op de mitochondriale funktie in U2-OS cellen verder te begrijpen, voerden we onderzoek naar veranderingen in het gastheer-proteoom na virus-reaktivatie in deze cellen. Daartoe werd HHV-6A reaktivatie eerst geïnduceerd d.m.v. TSA [trichostatine-A; kan gen-expressie wijzigen (interfereren met histoon-deacetylasen) door de toegang van transcriptie-factoren tot DNA-molekulen te veranderen] en de mitochondriale fragmentatie werd gedocumenteerd d.m.v. microcopie: we zagen een overheersende gestippelde vorm van mitochondrieën na HHV-6A reaktivatie. Gebruikmakend van kwantitatieve proteomica (gebaseerd op isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur), observeerden we een effekt van virus-reaktivatie op de proteïnen-dynamiek van de gastheer-cel. Gegevens afgeleid van twee biologische gerepliceerde experimenten toonden sterke reproduceerbaarheid van de identificatie van de proteïnen waarvan de expressie gewijzigd was na virale reaktivatie. We detekteerden veranderingen qua expressie-dynamiek van meerdere belangrijke cellulaire proteïnen. Omwille van onze interesse in HHV-6 gemedieerde mitochondriale dysfunktie, analyseerden we verder de mitochondrieën-specifieke proteïnen. Meerdere belangrijke mitochondriale proteïnen betrokken bij glycolytische mechansimen, foliumzuur- en 1-koolstof metabolisme [groep biochemische reakties die de the transfer van 1-koolstof groepen gemeenschappelijk hebben; speelt een belangrijke rol bij o.a. biosynthese, aminozuur-homeostase, enz.], vetzuur-oxidatie, en aminonozuren-metabolisme bleken gewijzigd na HHV-6A transaktivatie, suggestief voor een potentieel effekt op het cellulair alsook het mitochondriaal metabolisme. De meest interessante observatie was de downregulering qua expressie van de mitochondriale proteïnen [enzymen] pyruvaat-dehydrogenase fosfatase katalytische subunit 1 (PDP1) en mangaan-afhankelijk superoxide-dismutase-2 (SOD2). [zie bespreking] Verhoogde oxidatieve stress – waar dikwijls naar wordt verwezen als de oxidatieve bescherming respons [Naviaux RK. Oxidative shielding or oxidative stress? J. Pharmacol. Exp. Ther. (2012) 342: 608-618; oxidatieve stress is niet het resultaat van een falend anti-oxidant systeem maar een intentionele en beschermende respons] – en gewijzigde pyruvaat-dehydrogenase funktie [Fluge Ø. et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376] zijn sleutel-kenmerken van M.E./CVS. Verminderde SOD2-waarden kunnen bijdragen tot verhoogde reaktieve zuurstof-soorten (ROS) in de cel. In een eerdere studie hebben we verhoogde ROS getoond in HHV-6 geïnfekteerde cellen. Vandaar dat we speculeerden over een directe rol van HHV-6 infektie bij de pathofysiologie van M.E./CVS.

Om de gevolgen te begrijpen van HHV-6 gemedieerde mitochondriale veranderingen op het gastheer-metabolisme, focusten we op de verhoogde mitochondriale fissie in HHV-6 gereaktiveerde cellen. Verhoogde mitochondriale fissie vermindert de respiratoire capaciteit van de cel, met als gevolg verlaging van de cellulaire ATP-produktie. Lagere cellulaire energie kan ook mitochondriale fragmentatie induceren. Vandaar dat we ons afvroegen of HHV-6A transaktivatie ook leidt tot een lagere ATP-inhoud van de cel. We hebben de ATP-inhoud van U2-OS cellen gemeten in aan- of afwezigheid van latent HHV-6A. Bovendien reaktiveerden we HHV-6A in deze cellen d.m.v. de histoon-deacetylase inhibitor TSA en bestudeerden de ATP-inhoud na virus-reaktivatie. Om de mitochondriale ATP-generatie enkel in afwezigheid van de glycolytische ATP-machinerie te meten, vervingen we glucose-bevattende media met een galactose-bevattend in parallelle experimenten. Galactose kan niet efficiënt worden gemetaboliseerd naar pyruvaat op een anaërobe manier en dwingt cellen te verschuiven naar mitochondriale oxidatieve fosforylatie voor energie-metabolisme en overleving. Onze resultaten toonden een afname qua cytoplasmisch én mitochondriaal ATP na HHV-6A reaktivatie. De mogelijkheid van verlies van ATP omwille van een produktieve virale levenscyclus werd uitgesloten, aangezien HHV-6A een niet-produktieve levenscyclus heeft in deze cellen.

HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen zou leiden tot een aangeboren immuun-respons. Zoals veel andere virussen zou HHV-6A echter ook een mechanisme kunnen ontplooien om mitochondriale fissie te induceren. Mitochondriale fissie reduceert het vermogen van cellen om een aangeboren immuun-respons op te zetten. Om dit te controleren, evalueerden we de IFN-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie via qRT-PCR: mRNA-waarden van IFN-β, IFN-responsief en viraal RNA-bindend gen IFIT-1 en TNF-α respons gen ICAM-1 werden gekwantificeerd. Er werden U2-OS cellen na transfektie met een RNA-sequentie van influenza-A (H1N1) virus gebruikt als positieve controle. Onze resultaten tonen een verminderde aangeboren immuun-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie, met lagere waarden qua IFN-β en TNF-α mRNA. Interessant: we zagen in vergelijking hogere IFIT-1 mRNA waarden in aanwezigheid van latent HHV-6A vóór stimulatie met TSA. Een verhoogde ISG [IFN-gestimuleerd gen; proteïne-produkten van ISGs controleren pathogeen-infekties] -respons […] in latent virus bevattende cellen, versterkt ons argument dat mitochondriale fragmentatie een aanpassing van het virus kan zijn om aangeboren immuun-respons te vermijden op het moment van virale reaktivatie wanneer virale ‘I.E.’ RNAs vrij beschikbaar zijn in het gastheer-cytoplasma. Gefragmenteerde mitochondrieën zijn inefficiënt wat betreft het opwekken van een sterke aangeboren immunieit respons, aangezien ze de interaktie voorkomen tussen mitochondriaal antiviraal signalisering (MAVS) proteïne en stimulator van IFN-genen (STING) op mitochondriale membranen. De mogelijkheid van een produktieve virale levenscyclus in U2-OS cellen werden uitgesloten via het kwantificeren van P41 & U94 mRNAs in dezelfde mRNA-preparaties. HHV-6 P41, een ‘I.E.’ viraal proteïne dat betrokken bleek bij de vroege fases van de virale replicatie, werd gedetekteerd na TSA-behandeling, wat onze eerdere gegevens ondersteunt. Ter zelfder tijd werd het viraal proteïne U94 niet gedetekteerd 48 h na TSA-behandeling, wat aantoont dat de virus-reaktivatie incompleet was. We toonden eerder ook een ontbreken van U94 transcriptie na HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen. Zodoende tonen onze resultaten dat partiële reaktivatie van HHV-6A genoeg is om mitochondriale fragmentatie te induceren die leidt tot een lagere ATP-inhoud gepaard met een verlaagde aangeboren immune respons.

Pro-inflammatoire mitochondriale architectuur kan worden overgedragen via gesekreteerde factoren van HHV-6 gereaktiveerde cellen

Er werd gesuggereerd dat een dergelijke gewijzigde respiratoire toestand van de cel, vergezeld van een afname qua mitochondriale oxidatieve fosforylatie en gefragmenteerde mitochondriale architectuur (M1 mitochondrieën) de pro-inflammatoire ‘cell-danger’ respons (CDR) verhoogt [Naviaux RK. Incomplete healing as a cause of aging: the role of mitochondria and the cell danger response. Biology (2019) 8: E27 /// Naviaux RK. Metabolic features and regulation of the healing cycle – A new model for chronic disease pathogenesis and treatment. Mitochondrion (2019) 46: 278-297] en een kritische rol vervult in de cellulaire verdediging tegen microbiële pathogenen. Om deze hypothese te testen, ontwikkelden we een test-systeem gebruikmakend van menselijke A549 long-carcinoom cellen. A549 cellen werden voor-behandeld met cultuur-supernatant van U2-OS cellen met en zonder geïntegreerd HHV-6A gedurende 48 h. De cellen werden dan grondig gewassen en belast met een RNA- (influenza-A) of DNA-virus (HSV-1) infektie […]. 24 h na infektie werden de cellen verzameld en de virale infektie werd gekwantificeerd via qRT-PCR voor één van de vroeger virale RNAs. Viraal M1 RNA werd gebruikt als indicator voor influenza-virus infektie en ICP0 RNA als indicator voor HSV-1 infektie. Onze resultaten toonden dat cultuur-supernatanten enkel van cellen met ciHHV-6 DNA dat getransaktiveerd was, bescherming konden bieden tegen HSV-1 én influenza-A. Indirecte effekten van virale reaktivatie medicijnen werden uitgesloten door cellen te gebruiken die geen latent viraal genoom droegen maar wel behandeld waren met het reaktiverend agens (TSA). Deze resultaten tonen dat cellen die latent HHV-6A DNA bevatten dat was getransaktiveerd door TSA, een krachtige aktiviteit sekreteren die kan worden overgedragen en een mitochondriale fragmentatie en pro-inflammatoire CDR induceren in naïeve responder-cellen, en zo sterke bescherming tegen DNA- én RNA-virus infekties verlenen. Het is echter niet nodig dat zowel de mitochondriale fragmentatie als de antivirale bescherming fenotypes van elkaar afhankelijk zijn en worden veroorzaakt door dezelfde factor.

Op basis van de bovenstaande resultaten, stelden we ons de volgende vraag: kan een cel-vrij cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen gelijkaardige veranderingen veroorzaken in de mitochondriale architectuur van nabijgelegen cellen? Daartoe verzamelden we cel-vrij cultuur-supernatant van U2-OS cellen na 2 dagen virale reaktivatie en incubeerden ze met verse U2-OS cellen zonder enig virus maar met expressie van een oplosbaar mitochondriaal GFP (mitoGFP) [Groen Fluorescerend Proteïne; gebruikt om andere proteïnen te labelen en visualiseren; merker voor virale reaktivatie]. Oplosmiddel-gecontroleerd behandeld cel-vrij cultuur-supernatant én cel-vrij cultuur-supernatant van niet virus-dragende cellen dienden als controle. Bij analyse van de mitochondriale architectuur, detekteerden we significante wijzigingen qua mitochondriale morfologie na incubatie van gezonde cellen met cel-vrij cultuur-supernatant verkregen van HHV-6A gereaktiveerde cellen. Er werd verhoogde mitochondriale fragmentatie, leidend tot gedaalde gemiddelde mitochondriale oppervlakte gezien in de cellen die waren behandeld met cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen t.o.v. controles. Dit effekt van virale reaktivatie op de mitochondriale morfologie van nabijgelegen cellen biedt een interessant scenario dat kan worden aangewend om M.E./CVS-pathofysiologie te bestuderen. Een transfereerbaar hypo-metabool fenotype in responder-cellen werd verder ondersteund door observaties omtrent verminderde intracellulaire ATP-inhoud. Een potentiële rol van verhoogde immuun-respons in responder-cellen die dient als een antivirale factor werd uitgesloten door het kwantificeren van de IFN-respons in deze cellen. Er werd een zeer milde (2-3 voudige) toename van IFN-β & TNF-α respons gedetekteerd in de U2-OS cellen met latent virus, onafhankelijk van TSA. Een mogelijke door viraal RNA geïnduceerde immuun-respons werd echter uitgesloten in U2-OS én A549 cellen omwille van het ontbreken van geïnduceerd IFIT-1 mRNA. Deze resultaten suggereren dat een onbekende en IFN-onafhankelijke transfereerbare factor van HHV-6A gereaktiveerde cellen een hypo-metabool, gefragmenteerd mitochondriaal fenotype kan induceren in responder-cellen.

HHV-6 & HHV-7 als potentiële oorzakelijke factor voor M.E./CVS

Aangezien onze in-vitro HHV-6A reaktivatie studies wezen in de richting van mogelijke gelijkenissen tussen virale reaktivatie en M.E./CVS-pathofysiologie, bekeken we de mogelijkheid van een virale oorzaak achter M.E./CVS bij 25 M.E./CVS-patiënten (n = 25) en 10 controles (n = 10) gebruikmakend van DNA qPCR. We argumenteerden dat een hoge virale lading dient te worden gedetekteerd in het bloed van M.E./CVS-patiënten om virale infektie te to associëren met de ziekte. Patiënten met een M.E./CVS-diagnose gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria werden willekeurig geselekteerd (leeftijd 21-59 jaar). De controles waren individuen zonder M.E./CVS alsook personen met andere klinische aandoeningen. Er werd DNA verkregen uit totaal bloed, geïsoleerde PBMCs, serum en haar-follikels van alle patiënten. De haar-folikels werden getest op viraal DNA om te zoeken naar potentiële iciHHV-6 [zie inleiding] gevallen, die een hoge virale lading dragen (één tot twee copieën per cel). Serum werd getest op extracellulair viraal DNA dat het resultaat zou kunnen zijn van viremie [aanwezigheid van virus in het bloed], suggestief voor een mogelijke virale aktivatie/infektie.

qPCR-studies detekteerden geen viraal DNA in geen enkel van de 25 M.E./CVS haar-follikel stalen. Twee controles hadden echter ca. 1 copie van HHV-6A of HHV-6B in hun haar-follikels, suggestief voor, respectievelijk, mogelijks iciHHV-6A en iciHHV-6B. Er werden gelijkaardige hoeveelheden viraal DNA gedetekteerd in bloed, PBMCs en serum van deze twee controles, wat latente virale integratie bevestigt. De afwezigheid van enig viraal mRNA bij deze twee gevallen bevestigde ook de latente virale toestand. Serum-stalen van deze twee werd gebruikt als controle in alle volgende experimenten. Drie M.E./CVS-patiënten bleken positief voor HHV-6 in totaal-bloed alsook PBMCs. Een andere M.E./CVS-patient bleek ook HHV-6 positief in PBMCs maar niet in totaal-bloed, dus slechts 16% (4 op 25) van de M.E./CVS-patiënten had HHV-6 DNA in het bloed. Een zeer lage hoeveelheid viraal DNA in het bloed kan te wijten zijn aan latent virus of potentiële virale aktivatie in zeer weinig cellen, die kunnen resulteren in het verminderen van viraal DNA en RNA in totaal-bloed. We hebben HHV-6 gecodeerd sncRNA-U14 geïdentificeerd als krachtige merker voor virale reaktivatie. Aangezien we verwachtten dat de hoeveelheid viraal RNA bij reaktivatie/infektie hoger kan zijn dan de hoeveelheid viraal DNA en dat het makkelijker detekteerbaar zou zijn, voerden we FISH-studies uit gebruikmakend van geconcentreerde PBMCs of bloedklonters van een deel van deze M.E./CVS-gevallen (n = 20). FISH-analyse verhoogde het aantal HHV-6 positieve gevallen tot 40% (8 op 20). FISH beeld-analyse bevestigde onze hypothese dat slechts een klein deel van de HHV-6 sncRNA-U14 droeg. Geen enkele van de controles, inclusief de twee iciHHV-6 gevallen, kleurde positief voor sncRNA-U14. 36% van de M.E./CVS-patiënten testte positief voor HHV-7 DNA, (gemiddeld 1.835-26.056 copieën viraal DNA per miljoen cellen). We karakteriseerden latente of aktieve HHV-7 infektie niet. Tot besluit: we detekteerden een zeer laag aantal copieën viraal genoom bij M.E./CVS-patiënten, niet genoeg om te duiden op een directe rol van aktieve virale infektie bij de ziekte.

Serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles induceerde veranderingen in de mitochondriale architectuur van gezonde cellen

Een laag aantal copieën van virus-DNA en -RNA in het bloed van M.E./CVS-patiënten leidde tot een verwarrend scenario waarbij de oorzakelijke rol van deze virussen bij ziekte-progressie moeilijk te begrijpen is. Een plausibele verklaring kan gelokaliseerde virale infektie/aktivatie in afgelegen delen van het lichaam zijn, waarbij enige geïnfekteerde cellen die geaktiveerd virus dragen worden vrijgesteld of enkele aktivatie-gemedieerde cellulaire factoren in het bloed worden afgegeven. Interessant is dat eerder werk [Fluge Ø et al; zie hierboven] heeft getoond dat serum van M.E./CVS-patiënten met ernstige ziekte het mitochondriaal oxidatief metabolisme en respiratie verhoogt in gezonde spiercellen onder belasting. We vroegen ons zodoende af of serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale morfologie in gezonde cellen op een zelfde manier kan wijzigen, zoals werd gezien bij HHV-6 infektie. We kweekten zodoende U2-OS cellen die oplosbaar mitoGFP hebben maar geen HHV-6, in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten alsook van controles. De mitochondriale dynamiek werd geanalyseerd via microscopie. Onze resultaten toonden verhoogde mitochondriale fragmentatie (gekwantificeerd door gemiddelde mitochondriale oppervlakte) in gezonde gecultiveerde cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten maar niét van gezonde controles. Directe kwantificatie van de mitochondriale oppervlakte in PBMCs van M.E./CVS-patiënten was niet nuttig, aangezien PBMCs kleiner zijn en een ronde vorm hebben, wat […] kwantificatie van de mitochondriale grootte hindert. Onze resultaten suggereren dat wijzigingen qua mitochondriale architectuur om een meer pro-inflammatoire vorm van de mitochondrieën te verkrijgen, een belangrijk kenmerk bij M.E./CVS-patiënten is en geen directe viral infektie in elke cel vereist.

Serum-transfereerbare aangeboren immuniteitbij M.E./CVS-patiënten

Aangezien verhoogde CDR een transfereerbaar kenmerk van HHV-6A reaktivatie in vitro was, testten we of een gelijkaardige pro-inflammatoire aktiviteit kon worden gemeten in het bloed of M.E./CVS-patiënten. Als test-systeem kweekten we A549 cellen in aanwezigheid van serum van 10 M.E./CVS-patiënten en 5 controles. Na 2 dagen blootstelling aan serum, werden de cellen gewassen en blootgesteld aan influenza-A of HSV-1 […]. Kwantificatie van virale infektie onthulde tot 99% afname van virale infektie voor zowel HSV-1 als influenza na behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten. Slechts 1 van de 10 M.E./CVS-patiënten had geen negatief effekt van influenza-A infektie. In feite zagen we een toename van 2,5 maal qua influenza-infektie in aanwezigheid van serum van deze patient. 4 van de 5 controle-sera gaf geen negatief effekt op influenza-A infektie. Slechts 1 van de controle-sera verminderde influenza-infektie tot 50%. Deze afname was echter vergelijkbaar met de mate van bescherming die we zagen in aanwezigheid van M.E./CVS sera. In het geval van HSV-1 infektie gaf geen enkel van de controle-sera bescherming. Statistische analyse toonde sterke significantie en uitstekende prestatie-karakteristieken voor de diagnostische bruikbaarheid van dit test-systeem. De positieve voorspellende waarde voor de influenza-A inhibitie test om serum van M.E./CVS-patiënten te identificeren was 0.9 (95% CI = 0.6-0.99; p = 0.017). De positieve voorspellende waarde voor de HSV-1 inhibitie test was 1.0 (95% CI = 0.72-1.0; p = 0.0003). Om de mogelijkheid te testen van een hypo-metabole toestand in de responder A549 cellen, hebben we intracellulaire ATP-waarden gemeten in A549 cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten of HCs. We zagen een lager intracellulair ATP in deze cellen. Omwille van de kleinere grootte van het staal konden we echter geen statistisch significant verschil qua ATP-inhoud zien.

Uitsluiten van TNF-α & IFN respons

Eén van de meest prominente kandidaat-molekulen die een sterke antivirale verdediging kan bieden, is IFN [interferon]. Vandaar dat we de IFN-respons testten in A549 cellen na behandeling met M.E./CVS- of HC-serum. We zagen een sterke afname qua mRNA-waarden van IFN-β, IFIT-1 & ICAM-1 in de A549 cellen in aanwezigheid van M.E./CVS-serum in vergelijking met HC-serum. Dan vroegen we ons af of de sekretorische IFN-respons in geïsoleerde PBMCs hoger is bij M.E./CVS-patiënten. Daartoe gebruikten we een andere groep van 22 M.E./CVS-patiënten en 22 HCs. Na behandeling met LPS vonden we lagere waarden qua gesekreteerd TNF-α (p < 0.01) & IFN-γ (p < 0.05) voor M.E./CVS-patient PBMCs vergeleken met die van HCs. Er werden geen significante verschillen gezien voor IL-1β & IL-5. Deze resultaten sluiten een potentiële rol uit voor IFN-respons wat betreft de mitochondriale fragmentatie en antivirale respons bij M.E./CVS-patiënten.

BESPREKING

HHV-6 infektie en reaktivatie wijzigen het gastheer-cel transcriptoom, inclusief het miRNAoom. miRNAs reguleren de intra-organel mechanismen, waarbij ze de job uitoefenen van het fijnregelen van de funkties die vereist zijn om de metabole vereisten van een orgaan of cel-type te vervullen. Onze ‘deep-sequencing’ benadering eerder onthulde belangrijke veranderingen in de expressie van een groot panel menselijke miRNAs na HHV-6A reaktivatie dat wijst op een brede waaier aan effekten op mitochondrieën en geassocieerde metabole funkties na virale aktivatie. Hier bestudeerden we kwantitatieve veranderingen in cellulaire en mitochondriale proteomica na HHV-6A reaktivatie en vonden meerdere significante wijzigingen sterk lijkend op M.E./CVS-pathofysiologie. PDP1 was ge-downreguleerd in respons op HHV-6A reaktivatie. PDP1 helpt bij het terugdraaien van de negatieve effekten van pyruvaat-dehydrogenase kinasen op pyruvaat-dehydrogenase. Een afname van PDP1 suggereert een mogelijke daling qua funkties van pyruvaat-dehydrogenase, die ook wordt gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten [Fluge Ø et al; zie hierboven].We vonden ook een daling van de SOD2-waarde die kan leiden tot hoge hoeveelheden ROS in de cel. We hebben eerder getoond dat HHV-6 infektie ROS induceert in gastheer-cellen en de expressie van of glutathion-reductase wijzigt. Deze observaties ondersteunen sterk een pathologische link tussen HHV-6 reaktivatie en M.E./CVS.

Hypo-metabole toestand van bloedcellen is een kenmerk van M.E./CVS [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-E5480]. Hoewel we geen metabole studies deden, heeft onze studie omtrent de mitochondriale architectuur in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles transfereerbare aktiviteit in M.E./CVS-serum onthuld die mitochondrieën fragmenteert en een gecoördineerde antivirale toestand in naïeve responder cellen in vitro. Deze test was zeer gevoelig (0.9-1.00; 95% CI = 0.6-1.0) en specifiek (0.8-1.0; 95% CI = 0.38-1.0) wat betreft de identificatie van serum van M.E./CVS-patiënten. In onze studies bleek virale reaktivatie alsook behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten een typische (M1) toestand van de mitochondrieën te induceren [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] in gastheer-cellen, wat ook gepaard ging met een sterke pro-inflammatoire toestand van de cel die de gastheer-cellen beschermde tegen binnenkomende DNA- én RNA-virussen, consistent met oxidatieve bescherming. Er zijn veel mogelijke manieren waarop een nabijgelegen gezonde cel een potentieel infektueus risico in de omgeving kan voelen. Een verhoogde IFN-respons van de virus-getransaktiveerde cellen kan resulteren in gesekreteerd IFN dat kan worden gevoeld door nabijgelegen cellen, leidend tot een hypo-metabole toestand. Er werd gerapporteerd dat meerdere type-I [o.a. IFN-α & IFN-β] en type-II [IFN-γ] IFNs [cytokinen], alsook IFN respons genen, sterk aanwezig zijn in het serum van M.E./CVS-patiënten [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158 /// Moss RB et al. TNF-alpha and Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Immunol. (1999) 19: 314-316]. We zagen echter geen toename qua IFN-γ in PBMCs van een kleine groep M.E./CVS-patiënten. Daarnaast zagen we een significante daling qua ISG-expressie na behandeling met M.E./CVS-serum. Vandaar dat het sterk antiviraal fenotype in ons test-systeem IFN-onafhankelijk lijkt te zijn. Gefragmenteerde mitochondrieën kunnen kapot mitochondriaal DNA in het cytoplasma en de extracellulaire ruimte afgeven, dat TLR-gemedieerde cytokine-produktie in nabijgelegen cellen kan induceren. Nieuw gesynthetiseerd, 8-hydroxyguanosine [biomerker voor oxidatieve stress] bevattend mitochondriaal DNA (ox-mtDNA) kan direct de assemblage van het NLRP3 inflammasoom [lees: ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie]. aktiveren. Interessant is dat een overmaat aan bepaalde cytokinen ook het mitochondriaal metabolisme kan veranderen om verdere groei van pathogenen te voorkomen. Bepaalde complexe aandoeningen, zoals Amyotrofe Laterale Sclerose, zijn geassocieerd met een hypo-metabole toestand die wordt gekenmerkt door een kleinere grootte en hoeveelheid mitochondrieën.

Auto-immuniteit is courant bij M.E./CVS [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609]. Meerdere auto-antilichamen zijn in staat een pro-inflammatoire toestand te induceren in doelwit-cellen. Interessant: HHV-6 is gelinkt met meerdere auto-immune ziekten, inclusief Multipele Sclerose en Hashimoto thyroïditis. Auto-antilichamen tegen β2-adrenerge receptoren (β2R) bleken ge-upreguleerd in een subgroep M.E./CVS-patiënten [Loebel M, Fluge Ø et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52: 32-39]. Dergelijke antilichamen behoren tot een netwerk van natuurlijke antilichamen tegen adrenerge, acetylcholine (cholinerge) en andere GPCR-receptoren die dysfunktioneel bleken bij verscheidene auto-immune ziekten. [lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie] Autonome ontregeling is een hoofdkenmerk van M.E./CVS. Er is bewijsmateriaal voor het feit dat de β2R-gemedieerde regulering van cytokinen door terbutaline [β₂-adrenerge receptor agonist] wordt verstoord in totaal-bloed immuuncellen van M.E./CVS-patiënten [Kavelaars A, Heijnen CJ et al. Disturbed neuroendocrine-immune interactions in Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. (2000) 85: 692-696]. Een artikel toonde dat influenza-replicatie wordt geïnhibeerd door α2-adrenerge stimulatie via cAMP-inhibitie. In tegenstelling daarmee staat β2R-stimulatie bekend cAMP te stimuleren. Zodoende: een onevenwicht van adrenerge stimulatie die cAMP-downregulering begunstigt, zou ook een verklaring kunnen zijn voor onze bevindingen. Gelijkenissen tussen transfer van HHV-6A reaktivatie cultuur-supernatant en M.E./CVS-serum suggereert echter een potentiële metabole rol naast andere mogelijkheden.

Het ontbreken van een sterke HHV-6 en HHV-7 infektie bij M.E./CVS-patiënten in meerdere studies heeft twijfel gezaaid omtrent de betrokkenheid van deze virussen bij M.E./CVS. In deze studie tonen we echter dat onvolledige HHV-6 reaktivatie, zelfs in een klein aantal latent geïnfekteerde cellen, er de oorzaak van is dat gereaktiveerde cellen een aktiviteit sekreteren die kan worden getransfereerd in serum, en mitochondriale fragmentatie veroorzaakt en een krachtig programma coördineert in reagerende cellen. Onze studies toonden dat enkel ‘I.E.’-gebeurtenissen, zoals de transcriptie van meerdere kleine niet-coderende virale RNAs, nodig waren om de aanmaak en sekretie van de mitochondriale fragmentatie-factor en transfereerbare antivirale toestand te triggeren. Er worden geen HHV-6 proteïnen gemaakt tijdens de onvolledige reaktivatie die hier in dit artikel wordt beschreven. Specifiek: er werd geen belangrijke wijziging qua HHV-6 replicatie geobserveerd. Dit verklaart het falen van anti-herpesvirus medicijnen in een subgroep patiënten, omdat het HHV-6 polymerase niet tot expressie komt tijdens een onvolledige virus-reaktivatie, en medicijnen gericht tegen het viraal DNA-polymerase dus geen viraal doelwit hebben.

De virus-reaktivatie experimenten die in deze studie werden beschreven, tonen dat een antivirale toestand ontstaat zowel in cellen met ongereaktiveerd en gereaktiveerd HHV-6. Dit lijkt in te gaan tegen de virale groei en kan daarom dus de korte-termijn voordelen van virale reaktivatie vanuit pathogeen standpunt niet verklaren, tenzij passieve transmissie van viraal genoom naar dochter-cellen na mitose een belangrijke rol speelt in HHV-6 genoom propagatie. Een gedaalde IFN-respons in virus-gereaktiveerde cellen kan een voordeel bieden voor het overleven van ‘I.E.’ RNAs in het gastheer-cel cytoplasma. In deze studie hebben we echter enkel de niet-produktieve transaktivatie-toestand van het virus getest. Produktieve virale infektie, met virion [compleet virus-partikel met een buitenste proteïnen-omhulsel (capside) en in de kern nucleïnezuur] -aanmaak en -afgifte, zou bijkomende virale factoren kunnen binnenbrengen die het vermogen van de cel schaden om een hypo-metabole toestand te ondergaan om succesvolle virus-groei te bewerkstelligen. Bijkomend: mitochondriale fragmentatie laat het virus dikwijls toe een persistente of latente toestand onder hypo-metabole toestand te verwerven.

In deze studie vonden we dat geen enkele van de 25 patiënten met M.E./CVS bewijs van een volledig gereaktiveerde HHV-6 of HHV-7 infektie in het perifeer bloed had en slecht 8 op 20 (40%; 95% CI = 0.19-0.64) vertoonden partiële reaktivatie gemeten via FISH-analyse van HHV-6 klein niet-coderend RNA U14 in totaal-bloed. Gebruikmakend van een in-vitro reporter-cel test, toonden we echter dat serum van M.E./CVS-patiënten een aktiviteit bevatte die mitochondriale fragmentatie, gedaalde mitochondriale ATP-produktie verzaakt, en een krachtige antivirale toestand induceert. In 2016 onthulde een metaboloom-analyse bij ME./CVS-patiënten een chemische signatuur die gelijkaardig is met de evolutionair bewaarde, hypo-metabole toestand die bekend staat als ‘dauer’ [zie Naviaux RK (2016) hierboven]. Deze ‘dauer’-achtige toestand bleef behouden door versperringen van genezing, voortkomend uit een abnormale persistentie van CDR. De CDR bleek direct betrokken bij zowel genezing als de biologie van het ouder-worden. In dit eerder werk, was de hypothese dat de metabole kenmerken van de CDR bij M.E./CVS-patiënten kan beschermen tegen bepaalde infekties, maar de antivirale aktiviteit werd niet direct getest [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] []. Onze huidige gegevens tonen dat slechts een klein deel cellen latent geïnfekteerd moet zijn met HHV-6 om een sekretorisch fenotype te triggeren dat sterk beschermt tegen sommige RNA- en DNA-virussen in nabij- en af-gelegen cellen zonder HHV-6 DNA. Er dienen in de toekomst grotere studies met meerdere groepen M.E./CVS-patiënten van verschillende leeftijden te worden uitgevoerd, en met methodes die zowel produktieve als non-produktieve (incomplete) virale reaktivatie gebeurtenissen detekteren en kwantificeren. Bovendien zouden potentiële factoren die de mitochondriale dynamiek bij M.E./CVS-patiënten aantasten systematisch moeten worden geëvalueerd wat betreft hun vermogen om een krachtige antivirale toestand te induceren. Ons mitochondriaal, reporter-gebaseerd cel-systeem zal de mogelijkheid bieden om een diagnostische test voor M.E./CVS te ontwikkelen alsook een platform te bieden voor verdere identificatie van potentiële factoren die M.E./CVS-pathofysiologie definiëren.

januari 18, 2020

Verstoring van effector & regulerende T-cel subsets bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 8:18 am
Tags: , , , , , , , , , ,

In onderstaande gedetailleerde studie werden de immunologische verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles geanalyseerd. Er werden meerdere belangrijke verschillen gevonden wat betreft de frequenties (aantallen) en werking van subgroepen van T-cellen. Deze zijn zowat de regulatoren van een immuun-respons.

Men vond geen verschillen qua globale aantallen monocyten, B-cellen of T-cellen, maar de verhouding van twee belangrijke subsets van T-cellen, namelijk de CD4+ / CD8+ ratio (verhouding T-helper of T4 cellen op cytotoxische of T8 cellen), was verhoogd bij de M.E./CVS-patiënten. Het is geweten dat deze verhouding wijzigt bij het ouder worden. De onderzoekers splitsten de studie-groepen op in mensen jonger en ouder dan 50, en vonden dat het verschil in CD4+ / CD8+ ratio enkel optrad bij individuen jonger dan 50. Dit is suggestief voor een versnelde veroudering bij M.E./CVS.

Er werd ook een belangrijk verschil gevonden wat betreft de Th17-cel subgroep (subgroep T-helper cellen die pro-inflammatoir interleukine-17 produceren), die betrokken is bij de respons tegen bakterieën en die ook betrokken is bij meerdere auto-immune en chronische inflammatoire aandoeningen. Deze cellen zijn te vinden in slijmvliezen en spelen een belangrijke rol bij bv. M.S., psoriasis, juveniele diabetes, Reumatoïde Artritis, ziekte van Crohn, …). De frequentie van deze cellen was significant hoger bij M.E./CVS maar hun funktionaliteit was verminderd. De auteurs vatten samen: “We denken dat dit betekent dat er een chronische aktivatie van Th17-cellen is bij M.E./CVS, die een toestand van ‘uitputting’ induceert waarbij de cellen slechter werken omwille van hun chronische stimulatie.”.

Er was ook een belangrijk verschil qua ‘mucosal-associated invariant T’ (MAIT) cellen (mucosa = slijmvliezen) bij de patiënten. Deze MAIT-cellen reageren selektief op een brede waaier aan bakterieën. Hoewel hun frequentie niet verschilde, was de funktionaliteit helemaal anders, met o.a. een gedaalde aanmaak van cytokinen. Het is volgens de onderzoekers “ mogelijk dat deze veranderingen wat betreft Th17- & MAIT-cellen verband houden met verschillen qua microbioom-samenstelling, en dat een verstoring daarvan chronische aktivatie van deze subgroepen en een toestand van uitputting veroorzaakt bij M.E./CVS”.

Er werd ook opgemerkt dat regulerende T cellen (Tregs) waren verhoogd bij de patiënten. De funktie van Tregs is het onderdrukken van buitensporige chronische immuun-responsen, wat consistent is met de bevinding dat er chronische aktivatie van belangrijke T-cel subsets lijkt te zijn…

Ten slotte gebruikte het research-team de immuun-profilering parameters voor een ‘machine-learning’ (ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten voorspellingen te maken op basis van empirische gegevens) klassificatie-model en hiermee kom men M.E.(cvs)-patiënten correct identificeren en onderscheiden van gezonde controles, met een hoge sensitiviteit en accuraatheid. Aangezien patiënten dikwijls jaren op een diagnose moeten wachten en er momenteel nog geen duidelijke diagnostische instrumenten zijn, zou dit kunnen helpen als biomerker.

In ons stuk ‘Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)’ maakten we al melding van research aangaande MAIT-cellen bij M.E.(cvs). Prof. dr Derya Unutmaz (immunoloog) van het ‘Jackson Laboratory ME/CFS Collaborative Research Centre’ – ook co-auteur van ‘Tuning of human MAIT cell activation by commensal bacteria species and MR1-dependent T-cell presentation’ (Mucosal Immunology (2018) 11, 1591-1605) – speculeerde (‘Nature News Feature’ 3 Januari 2018) dat de inflammatie die wordt gezien bij M.E.(cvs) het resultaat zou kunnen zijn van een probleem bij de T-cel respons op onschadelijke virussen, schimmels en andere stimuli. Hij en z’n team zetten het werk dus verder…

————————-

BioRxiv (Pre-print december 2019)

Perturbation of effector and regulatory T cell subsets in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS)

Ece Karhan (1), Courtney Gunter (1), Vida Ravanmehr (1), Meghan Horne (1), Lina Kozhaya (1), Stephanie Renzullo (1), Lindsey Placek (1), Joshy George (1), Peter N. Robinson (1), Suzannne D Vernon (2), Lucinda Bateman (2), Derya Unutmaz (1,3)

1 Unutmaz Laboratory, Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, USA

2 Bateman Horne Centre, Salt Lake City, Utah, USA

3 Department of Immunology, University of Connecticut School of Medicine, Farmington, Connecticut, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met onbekende etiologie en de diagnose is grotendeels gebaseerd op klinische symptomen. Onze hypothese was dat immunologische verstoring de belangrijkste aandrijvende factor van deze ziekte is, en analyseerden bloedstalen van een grote groep M.E./CVS-patiënten en controles op zoek naar verschillen qua T-cel subset frequenties en funkties. We vonden dat de verhouding CD4+ op CD8+ T-cellen en het aandeel CD8+ effector geheugen T-cellen verhoogd waren, terwijl NK-cellen verminderd waren bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50, vergeleken met een gezonde controle-groep. Opmerkelijk: er werden belangrijke verschillen gezien wat betreft de funkties van Th1, Th2, Th17 en ‘mucosal-associated invariant’ T (MAIT) T-cel subsets (alle leeftijden) van patiënten, t.o.v. gezonde individuen. Hoewel CCR6+ Th17-cellen bij M.E./CVS minder IL-17 sekreteerden vergeleken met controles, was hun frequentie hoger. Ook MAIT-cellen van patiënten sekreteerden minder IFNgamma, Granzyme-A en IL-17 na aktivatie. Te samen suggereren deze bevindingen chronische stimulatie van deze T-cel populaties bij M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee was de frequentie regulerende T-cellen (Tregs), die buitensporige immuun-aktivatie controleren, hoger bij M.E./CVS-patiënten. Ten slotte bepaalden we, gebruikmakend van een ‘machine-learning’ algoritme (‘random forest’), dat de geanalyseerde set T-cel parameters meer dan 90% van de mensen in de M.E./CVS-groep als patiënten kon identificeren (93% ‘true positive rate’ [aantal echte positieve waarden] of sensitiviteit). Tot besluit: deze verschillende en belangrijke verstoringen of dysfunkties qua T-cel subsets bij M.E./CVS-patiënten suggereert potentiële chronische infekties of microbioom-dysbiose. Deze bevindingen hebben ook implicaties voor de ontwikkeling van specifieke immune biomerkers voor M.E./CVS en onthullen potentiële doelwitten voor nieuwe therapeutische interventies.

Inleiding

[…]

Hoewel de oorzaken van M.E./CVS waarschijnlijk multifactorieel zijn, werd een geschiedenis van initiële infektueuze agentia, inclusief virale (bv. EBV) en bakteriële (bv. ziekte van Lyme) infekties, geassocieerd met het triggeren van de ziekte. Inderdaad: steeds meer bewijsmateriaal impliceert een significante rol voor immunologische abnormaliteiten waarvan wordt gedacht dat ze bijdragen tot ziekte-progressie en/of de chronische symptomatische toestand [Fletcher MA, Klimas NG et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome /Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88 /// Curriu M et al. Screening NK-, B- and T-cell phenotype and function in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2013) 11: 68 /// Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome /Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol (2014) 26: 233-242]. Studies van het immuunsysteem bij M.E./CVS hebben vele abnormaliteiten onthuld, waaronder verstoringen qua aantal en funktie van T-cel subsets, B-cellen en ‘natural killer’ (NK) cellen [referenties hierboven]; veranderingen qua cytokine-sekretie [Torres-Harding S, Fletcher MA et al. Evidence for T helper 2 shift and association with illness parameters Chronic Fatigue Syndrome (CFS). Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33 /// Broderick G et al. A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun (2010) 24: 1209-1217 /// Bansal AS et al. Chronic Fatigue Syndrome, the immune system and viral infection. Brain Behav Immun (2012) 26: 24-31]; wijzigingen in de humorale immuniteit, en inflammatoire immuun-signalisering [Aspler AL, Vernon SD et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct (2008) 4: 44] en hogere frequenties van verscheidene auto-antilichamen [Ortega-Hernandez OD & Shoenfeld Y. Infection, vaccination and auto-antibodies in Chronic Fatigue Syndrome, cause or coincidence? Ann N Y Acad Sci (2009) 1173: 600-609; zie ‘Vaccinatie en CVS]. T-cellen zijn verantwoordelijk voor het orkestreren en moduleren van een optimale immuun-respons, via hun effector of regulerende werkingen. Verstoringen qua T-cel subsets, of effector of regulerende funkties bij M.E./CVS [Lorusso L et al. Immunological aspects of Chronic Fatigue Syndrome. Autoimmun Rev (2009) 8: 287-291] kunnen zodoende resulteren in een immune ontregeling of ongewenste immuun-responsen.

Hier vonden we verstoringen wat betreft CD8+ T-cellen, NK-cellen, Treg cel frequenties en effector-funkties van Th17- en MAIT-cellen bij M.E./CVS-patiënten. Sommige van de verschillen in immuun-parameter, zoals CD8+ effector geheugen T-cellen en NK-cellen, bleken relatief verschillend bij jongere patiënten maar niet bij patiënten ouder dan 50, in vergelijking met gezonde controles. Daarnaast konden we, gebruikmakend van significante immune kenmerken en een ‘machine-learning’ algoritme, M.E./CVS-patiënten identificeren en onderscheiden met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Te samen onthullen onze bevindingen meerdere chronische T-cel dysfunkties bij M.E./CVS, suggestief voor een link met chronische infekties of een ontwrichting van de microbiomen.

Materialen en methodes

Deelnemers

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Gezonde controles werden gematcht met 85 patiënten voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en afname-seizoen. Patiënten of controles die antibiotica/ immunomodulerende medicijnen namen of infekties hadden in de voorafgaande maanden werden uitgesloten. […]

PBMC-isolatie & bewaring

[…]

Oppervlakte & intracellulaire kleuring, en flow-cytometrie analyse

[…]

‘Machine-learning’ & statistische analyse

[…]

Resultaten

[wellicht eerder voor experten (een cursus immunologie is hier niet aan de orde); leken kunnen de bespreking hieronder lezen]

Veranderingen qua subsets T-cellen in het bloed van M.E./CVS-patiënten

Om de fenotypische en funktionele veranderingen in subsets immuun-cellen van M.E./CVS-patiënten te bepalen, ontwikkelden we meerdere merker-combinaties voor flow-cytometrie analyse en voerden immuun-profilering uit bij 198 M.E./CVS-patiënten, en and 91 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles. We analyseerden eerst de voornaamste immune subsets in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs), namelijk T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten. Er was geen significant verschil qua percentage van monocyten (p = 0.9), B-cellen (p = 0.9) of T-cellen (p = 0.1) maar het voorkomen van NK-cellen binnen de lymfocyten was sterk gedaald (p = 0.0005) bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Binnen de T-cellen zagen we dat het aantal CD4+ T-cellen hoger was (p = 0.0193) en, overéénkomstig daarmee, waren CD8+ T-cellen lager (p = 0.0052) bij M.E./CVS; dit werd gereflekteerd in een hogere CD4:CD8 verhouding (p = 0.0078). Er was geen verschil qua CD4CD8 (dubbel-negatieve; DN [nog niet ontwikkelde]) T-cellen (p = 0.9) (gegevens niet getoond).

Het is goed geweten dat veranderingen in de CD4:CD8 verhouding geassocieerd zijn met ouder worden. Inderdaad: de aantallen CD4+ & CD8+ T-cellen en de CD4:CD8 verhouding correleerden met leeftijd bij zowel gezonde controles […] als M.E./CVS-patiënten […]. De leeftijd vertoonde ook een significante correlatie met DN T-cellen bij de controles […] maar niet bij de patiënten […]. Interessant: wanneer we de M.E./CVS-patiënten onderverdeelden op basis van hun mediane leeftijd (jonger of ouder dan 50 jaar), bleef het verschil in percentage CD8+ T-cellen en CD4:CD8 verhouding slechts significant voor M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0082 & 0.0131 respectievelijk) maar niet voor deze ouder dan 50 (p = 0.6 & 0.6 respectievelijk). Leeftijd vertoonde ook een significante correlatie met NK-cellen bij de M.E./CVS-patiënten […] maar niet bij de gezonde controles […]. Deze verandering qua NK-cel frequentie werd ook gezien bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p < 0.0001).

Daarna deelden we de CD4+ & CD8+ T-cellen op in naïeve [rijp maar nog niet geaktiveerd] en ‘memory’ [met ‘geheugen’ of ‘ervaring’; zijn een antigen tegengekomen en hebben er op gereageerd, kunnen bij een nieuwe ontmoeting sneller en sterker een immuun-respons opzetten] subsets op basis van hun differentiatie (funktionele en fenotypische kenmerken). Om de proportie van deze subgroepen bij M.E./CVS te bepalen, gebruikten we de gevestigde CD45RO & CCR7 cel-oppervlakte molekulen als merkers voor CD4+ en CD8+ T-cel subsets. Binnen de CD4+ cellen was er geen significant verschil tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor de CD45ROCCR7+ (naïeve; N) (p = 0.5), CD45RO+CCR7+ (centraal ‘memory’; CM) (p = 0.7), CD45RO+CCR7 (effector ‘memory’; EM) (p = 0.2) of CD45ROCCR7 (effector ‘memory’ RA; EMRA) (p = 0.06) subsets. Er was ook geen verschil qua CD8+ N (p = 0.4), CM (p = 0.1) of EMRA (p = 0.0509) populaties; de CD8+ EM T-cel subset was echter sterk gestegen (p = 0.0001) bij M.E./CVS.

De aantallen of N, CM, EM & EMRA binnen de CD8+ T-cellen correleerden met leeftijd voor beide groepen en dit werk ook gezien in de CD4+ subsets. Er was echter geen significant verschil qua CD8+ N of CM T-cellen voor individuen (controles & M.E./CVS) jonger of ouder dan 50, of voor CD4+ N, CM of EM subsets in verschillende leeftijd-groepen. Interessant: het verschil qua CD8+ EM subset tussen M.E./CVS en controles bleef beperkt tot individuen jonger dan 50. De CD8+ & CD4+ EMRA subsets waren ook enkel significant lager bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50.

Veranderingen qua Th17-cel frequentie en funktie bij M.E./CVS

Onze hypothese was dat M.E./CVS-patiënten ook verstoringen kunnen vertonen binnen de effector T-cel subsets in mucosale weefsels (zoals Th17-cellen), die reageren op bakteriële infekties of microbiomen en ook gelinkt zijn met auto-immune ziekten. Om Th17-cellen te identificeren, gebruikten we eerst CD3, CD4, CD45RO & CCR6 expressie, aangezien bijna alle van deze subset een geheugen-fenotype hebben en ook de chemokine-receptor CCR6 tot expressie brengen. Om de cytokine-sekretie van T-cellen te analyseren, ontdooiden we ingevroren PBMCs en cultiveerden die een dag in IL-7 (d1) om er voor te zorgen dat de cellen herstelden en dat dode cellen duidelijk konden worden geïdentificeerd. We aktiveerden dan de cellen met PMA & ionomycine [mitogene cocktail; molekulen die cellen aanzetten tot delen]. De cellen werden dan intracellulair gelabeld voor IL-17 & IFNγ, en geselekteerd op cel-oppervlakte expressie gebaseerd op CD4+CD45RO+CCR6+ & CD4+CD45RO+CCR6. Binnen de CD4+CD45RO+ (‘memory’ T-cel) populatie was de frequentie van IL-17+ (p = 0.0378), IFNγ+ (p = 0.0231) & IL-17+IFNγ+ (p = 0.0378) sekreterende cellen significant gedaald bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles.

Eerder hadden we getoond dat een deel van de Th17-cellen ‘gereed-gemaakt’ zijn om IL-17 of IL-22 te produceren na ‘priming’ [voorbereiding] met γc [‘common gamma chain’; cytokine-receptor sub-unit gemeenschappelijk voor minstens zes interleukine-receptoren] -cytokinen (namelijk IL-2, IL-15 of IL-7), die hun volledig potentieel van hun IL-17 sekretie onthullen. Daarom cultiveerden we PBMCs van M.E./CVS-patiënten en controles gedurende 6 dagen (d6) met IL-7 om Th17-cellen aan te zetten tot IL-17 sekretie. De PBMCs werden dan gestimuleerd met PMA & ionomycine, en de expressie van cytokinen in de T-cel subsets werd bepaald. Deze test toonde bij de T-cellen van M.E./CVS-patiënten een veel lagere expressie van totaal IL-17+ (p < 0.0001), IFNγ+ (p < 0.0001), IL-17+IFNγ+ (p < 0.0001) & IL-17+ IFNγ (p < 0.0001) cellen, wat een belangrijke dysfunktie van Th17-cellen bij de patiënten onthult.

Na 6 dagen cultuur met IL-7, bleek het deel IL-17 & IFNγ sekreterende cells binnen de CD4+CD45RO+ ‘memory’ populatie van gezonde controles niet te correleren met leeftijd voor de IL-17+, IFNγ+, IL-17+IFNγ+ noch IL-17+IFNγ subsets […]. Bij M.E./CVS, correleerde leeftijd ook niet met IFNγ+ […] maar de IL-17+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ subsets toonde een significante correlatie […]. Wanneer patiënten werden opgedeeld in groepen jonger of ouder dan 50, werden significante verschillen gezien voor de IL-17+, IFNγ+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ subsets tussen controles en M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0017, 0.0018, 0.0009 & 0.0009 respectievelijk), alsook bij die ouder dan 50 (p = 0.0002, 0.0047, 0.0008 & 0.0001 respectievelijk).

Om de ontregeling in de Th17-cel subgroep verder te onderzoeken, vergeleken we de frequentie van CD4+CD45RO+CCR6+ cellen, controles vs. M.E./CVS. In tegenstelling tot IL-17 expressie, vonden we dat CCR6+ cellen significant hoger waren bij M.E./CVS (p = 0.0009). Na 6 dagen cultuur met IL-7 was er echter geen verschil tussen de groepen (p = 0.2), zelfs al lag de gemiddelde frequentie hoger in beide groepen. De frequentie van CCR6+ cellen binnen de ‘memory’ CD4 T-cellen correleerde met leeftijd voor gezonde controles […] maar niet voor M.E./CVS-patiënten […]. Wanneer de patiënten werden gegroepeerd (jonger/ouder dan 50), werd enkel een significant verschil gezien voor het deel CCR6+ bij de individuen jonger dan 50 (p = 0.0002).

Opmerkelijk: M.E./CVS-patiënten vertoonden lagere expressie (t.o.v. controles) van IL-17+ (p = 0.0035), IL-17+IFNγ+ (p = 0.0055) & IL-17+IFNγ (p = 0.0084) maar niet voor totaal IFNγ+ (p = 0.3), binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen. Na 6 dagen cultuur in IL-7, stegen de verschillen verder en kwamen ze voor bij alle cytokine-sekreterende cellen (IL-17+ (p < 0.0001), IFNγ+ (p = 0.0010), IL-17+IFNγ+ (p < 0.0001) IL-17+IFNγ (p < 0.0001) cellen als deel van de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen).

We bepaalden dan de verhoudingen tussen de CCR6+ T-cellen op CD4+ ‘memory’ T-cellen met expressie van IL-17 of IFNγ. Inderdaad: de verhouding CCR6+ cellen op IL-17+ (p < 0.0001) en op IFNγ+ (p < 0.0001) CD4+ ‘memory’ T-cellen waren significant bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Deze verhoudingen tussen CCR6+ cellen en cytokinen aangemaakt door CD4+ cellen bleef ook hoger bij M.E./CVS na 6 dagen cultuur met IL-7, voor de verhouding CCR6+ op IL-17+ cellen (p = 0.0015), maar waren slechts in beperkte mate verschillend voor de verhouding CCR6+ op IFNγ+ cellen (p = 0.0366).

We hebben eerder getoond dat CD161 [‘killer’ cel lectine-achtige receptor] binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen deze cellen verder kunnen worden opgedeeld in subsets met verschillen qua IL-17 & IFNγ sekretie. Dus verdeelden we verder de CCR6+ cellen op basis van CD161 expressie. Het deel CD161+ cellen binnen de CCR6+ subgroep was slechts lichtjes verschillend bij M.E./CVS t.o.v. controles (p = 0.0439). We analyseerden dan IL-17 & IFNγ expressie binnen de CD161+ & CD161 subsets van de CD4+CD45RO+CCR6+ cellen na 6 dagen cultuur. Binnen de CD4+CCR6+CD161+ cellen was er een significant verschil qua expressie van IL-17+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ cellen tussen M.E./CVS en controles (p < 0.0001 voor allemaal), maar niet voor IL-17IFNγ+ cellen (p = 0.06). CD161 cellen binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ subgroep vertoonden ook lagere IL-17+, IL-17+IFNγ+, IL-17+IFNγ & IL-17IFNγ+ bij M.E./CVS (p ≤ 0.0001, < 0.0001, 0.0001 & 0.0042 respectievelijk).

Bij CD4+ ‘memory’ T-cellen bepaalden we ook, naast IL-17 expressie, de frequentie van T-cellen die enkel of IFNγ (IFNγ+IL-4) of IL-4 (IFNγIL-4+) tot expressie brachten, welke respectievelijk Th1 en Th2 T-cel subsets definiëren. We vonden dat het deel van IFNγ+IL-4 & IFNγIL-4+ binnen de CD4+ ‘memory’ T-cellen significant lager (p = 0.0157 & p < 0.0001 respectievelijk) lag bij M.E./CVS. De verhouding van Th1 (IFNγ+IL-4) op Th2 (IFNγIL-4+) was echter hoger bij M.E./CVS (p = 0.0196), suggestief voor een onevenwicht van Th1 op Th2 cellen. Te samen accentueren deze bevindingen belangrijke funktionele verstoringen binnen de CD4+ T-cel subgroep in de groep M.E./CVS-patiënten.

Veranderingen qua frequentie MAIT-cellen bij M.E./CVS

‘Mucosal-associated invariant’ T (MAIT) cellen zijn een subgroep van de niet-klassieke T-cel populatie en worden gedefinieerd door een invariante T-cel receptor die wordt getriggerd door riboflavine [vitamine-B2] -metabolieten geproduceerd door bakterieën, inclusief commensale microben. Net als bij de Th17-subset, hypothiseerden we dat dysbiose van het darm-microbioom of voorafgaande bakteriële infekties kunnen resulteren in veranderingen qua MAIT-cel frequenties of funktie. Om MAIT-cellen in PBMCs te identificeren, gebruikten we de oppervlakte-molekulen Vα7.2 [deel van T-cel recpetor] & CD161. We bepaalden dan de frequentie van MAIT-cellen binnen de CD4+, CD8+ & CD4CD8 (dubbel negatief of DN) T-cel compartimenten bij M.E./CVS en controles. Er was geen significant verschil tussen patiënten en controles voor CD4+ (p = 0.7), CD8+ (p = 0.7) of dubbel negatieve (DN) MAIT-cellen (p = 0.2) als deel van de CD4+, CD8+ & DN T-cellen respectievelijk. De CD4+ & CD8+ MAIT-cel frequenties in PBMCs na 6 dagen cultuur in IL-7 toonden echter een significant verschil (p = 0.0250 & p = 0.0221 respectievelijk) (M.E./CVS vs. controles) maar de frequentie DN MAIT-cellen verschilde niet (p = 0.3). Wanneer de verhouding van MAIT-cel frequentie op dag 0 (d0) vs. dag 6 werd bepaald, vonden we dat deze van de CD8+ MAIT-cellen in M.E./CVS PBMCs sterk gereduceerd was na 6 dagen cultuur (p = 0.0008) maar er was geen significant verschil voor CD4+ (p = 0.06) of DN MAIT-cellen (p = 0.8) (M.E./CVS vs. controles). In overéénstemming met deze bevinding, was de verhouding van CD8+ op DN MAIT-cellen bij M.E./CVS en controles slechts lichtjes significant op dag 0 (p = 0.0364) maar deze werd sterk significant na 6 dagen cultuur (p < 0.0001). Te samen suggereren deze bevindingen dat CD8+ MAIT cellen van M.E./CVS-patiënten minder overleefden in cultuur met IL-7.

Omdat CD27 [receptor van de TNF-superfamilie; vereist voor het genereren en onderhouden van T-cel immuniteit] -expressie op MAIT-cellen een recent geaktiveerde of gedifferentieerde subset kan aangeven, zoals bij andere CD8 T-cellen, evalueerden we CD27-expressie in MAIT-subsets. We vonden dat M.E./CVS-patiënten een significant verschil hadden: hoewel er meer CD45RO+CD27 cellen waren (p = 0.0045) werd, interessant genoeg, dit verschil niet gezien bij de DN MAIT-cellen (p = 0.7). De verhouding dag0:dag6 CD8+ MAIT-cellen vertoonde ook een licht positieve correlatie met de frequentie qua CD27CD8+ MAIT-cellen bij patiënten […] maar niet bij controles […]. In tegenstelling daarmee correleerden CD27 DN MAIT-cellen niet met de dag0:dag6 verhouding, noch voor controles […] noch voor patiënten […].

We vroegen ons dan af in welke mate MAIT-cellen funktioneel verschillend waren tussen M.E./CVS en controles. Daartoe stimuleerden we eerst PBMCs met een cocktail van drie cytokinen (IL-12+IL-15+IL18), aangezien van deze combinatie uniek is gebleken dat ze de expressie van IFNγ door MAIT-cellen induceert. Bijgevolg werd IFNγ samen met Granzyme-A expressie aangewend om de respons te evalueren van CD8+ MAIT en CD8+ non-MAIT cellen in PBMCs na stimulatie met de IL-12+IL-15+IL18 cocktail. PBMCs van M.E./CVS-patiënten die waren gestimuleerd met de cytokine-cocktail vertoonden veel minder IFNγ+ MAIT-cellen (p ≤ 0.0001) maar de inductie van IFNγ+ door non-MAIT CD8+ T-cellen was vergelijkbaar (p = 0.1) bij gezonde mensen. MAIT-cellen die Granzyme-A tot expressie brengen waren ook veel talrijker bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar non-MAIT cellen die Granzyme-A tot expressie brengen bleken niet te verschillen (p = 0.8). Daarnaast waren CD27CD8+ MAIT-cellen en IFNγ+ MAIT-cellen na cytokine-stimulatie negatief gecorreleerd bij M.E./CVS-patiënten […] maar niet bij controles […]. CD27CD8+ MAIT-cellen waren niet gecorreleerd met CD8+ non-MAIT IFNγ+ cellen, noch bij controles […] noch bij M.E./CVS […].

Aangezien ook werd getoond dat MAIT-cellen IL-17 tot expressie brengen, zoals Th17-cellen, probeerden we daarna de produktie van IL-17 en IFNγ door MAIT-cellen in respons op PMA & ionomycine stimulatie te bepalen. Er was zeer weinig tot ondetekteerbare IL-17 expressie door MAIT-cellen na een dag in cultuur (gegevens niet getoond). Na 6 dagen in IL-7, was het aantal MAIT-cellen dat IL-17 tot expressie bracht echter sterk toegenomen na stimulatie. IL-17 door non-MAIT CD8+ T-cellen bleef echter ondetekteerbaar. Deze bevinding suggereert dat MAIT-cellen ook ‘priming’ kunnen ondergaan met cytokinen, net zoals de klassieke Th17-cellen […].

Daarnaast bepaalden we ook IFNγ en TNFα sekretie door CD8+ MAIT en CD8+ non-MAIT CD45RO+ (‘memory’) T-cellen na 6 dagen in cultuur met IL-7. Er was geen significant verschil bij M.E./CVS voor IFNγ+ MAIT-cellen (p = 0.5) maar we vonden sterk gereduceerde IL-17+IFNγ+ MAIT-cellen bij de patiënten vergeleken met controles (p = 0.0075). De frequentie van IFNγ+ sekreterende cellen was ook verminderd binnen de CD8+ non-MAIT cellen (p = 0.0057) en binnen de CD8+CD45RO+ ‘memory’ T-cellen (p = 0.0002), in M.E./CVS PBMCs na 6 dagen cultuur met IL-7.

Veranderingen qua regulerende T (Treg) cellen bij M.E./CVS

Regulerende T (Tregs) cellen zijn cruciaal voor het controleren van auto-reaktieve of buitensporige immuun-responsen. Gezien de geobserveerde verstoring van effector-funkties van T-cel subsets die chronische immuun-aktivatie suggereert, hypothiseerden we dat er een corresponderende toename qua Tregs zou optreden bij M.E./CVS-patiënten. Voor dit experiment gebruikten we Foxp3 [‘forkhead box P3’, een proteïne betrokken bij immuun-responsen; belangrijke regulator bij de ontwikkeling en werking Tregs] & Helios [transcriptie-factor] als merkers, om de Treg-cel frequenties na te gaan binnen zowel naïeve als ‘memory’ CD4+ T-cellen. De frequenties van naïeve Tregs (p = 0.0005) en ‘memory’ Tregs (p = 0.0094) waren inderdaad verhoogd bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Na opdeling in groepen (jonger of ouder dan 50) vertoonden naïeve Tregs een zeer significant verschil bij de M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0083) en een lichtjes significant verschil bij deze ouder dan 50 (p = 0.0209). Het verschil in ‘memory’ Tregs was er ook significant verschil bij een leeftijd < 50 (p = 0.0116) maar niet bij > 50 (p = 0.6). Er was geen correlatie met de leeftijd bij M.E./CVS of controles voor naïeve […] of ‘memory’ Tregs […].

De verhouding van Th17-cellen op Tregs is een belangrijk kenmerk dat verstoord is bij chronische inflammatoire aandoeningen of auto-immune ziekten. We bepaalden daarom ook deze verhouding bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Hoewel de Th17 (CCR6+ IL-17-sekreterende cellen) frequentie niet correleerde met ‘memory’ Treg-cellen bij M.E./CVS […] of controles […] was opmerkelijk dat de verhouding van deze twee verwante subsets ook zeer verschillend waren tussen M.E./CVS en controles (p < 0.0001).

‘Machine-learning’ analyse ter identificatie van voorspellende immuun-parameters voor M.E./CVS

Onze immuun-profilering analyse identificeerde veel T-cel subgroep parameters die verschillend waren bij M.E./CVS-patiënten vs. gezonde controles. Van het totaal van 65 immuun-profiel kenmerken, werden er 40 als verschillend geïdentificeerd bij een 5% ‘false discovery rate’ [FDR; aantal vals positieve resultaten]. Hoewel sommige daarvan zeer significant waren, zouden ze echter, gezien de hoge variabiliteit het groot bereik bij mensen, op zichzelf geen klinisch relevante specificiteit en sensitiviteit hebben om patiënten van gezonde mensen te onderscheiden. Daarom beslisten we een klassificeer-model te gebruiken op basis van een ‘machine-learning’ algoritme genaamd de ‘random forest’ (RF) classifier’ [een (computer) leer-methode voor klassificatie die werkt via het construeren van meerdere beslissing-‘bomen’ via training, die dan een klassificatie of voorspelling oplevert].

De ‘RF-classifier’ of algoritme is een methode die afhankelijk is van een groot aantal individuele klassificatie-‘bomen’ [methodiek waarmee informatica-systemen beslissingen nemen]. Elke klassificatie-‘boom’ bepaalt een voorspelde klasse en de klasse met de meeste stemmen wordt de model-voorspelling. De individuele ‘bomen’ worden ontworpen gebruikmakend van een willekeurig geselekteerd aantal stalen [] en een willekeurig geselekteerde set kenmerken om correlatie tussen de ‘bomen’ te minimaliseren. Een groot aantal relatief ongecorreleerde klassificatie-‘bomen’ (modellen) worden gecombineerd om een robuuste klassificatie van het individueel staal te verschaffen. We implementeerden een RF-model om M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te klassificeren gebruikmakend van immuun-profilering gegevens. De prestaties van de RF werden geëvalueerd d.m.v. de ‘receiver operating characteristic’ (ROC) curve [grafiek], die wordt opgemaakt door het uitzetten van de ‘true positive rate’ (TPR) [aantal echt positieve resultaten] tegen de ‘false positive rate’ (FPR) [aantal vals positieve resultaten]. De klasse-voorspelling probabiliteit [waarschijnlijkheid] van een staal kan worden berekend […]. De ‘area under the ROC curve’ (AUC) is gelijk aan de probabiliteit […]. Een perfecte ‘classifier’ zal als maximale ‘area under the curve’ waarde 1 hebben. […] De AUC van de ‘RF-classifier’ gebruikmakend van alle 65 kenmerken is ~0.93, wat betekent dat er een kans is van 93% dat de ‘classifier’ een correct onderscheid zal maken tussen patiënten en controles. De 40 significant verschillende kenmerken of top 10 kenmerken met de hoogste belangrijkheid-score onder deze 40 significant verschillende immuun-parameters hadden lichtjes lagere AUC-scores (~0.92 & ~0.88 respectievelijk), terwijl de top 10 significant verschillende kenmerken een lagere AUC-score (~0.82) hadden.

Bespreking

Meerdere studies van het immuunsysteem bij M.E./CVS hebben ontregelingen onthuld van het aantal en de funktie van of T-cel subsets, B-cellen en ‘natural killer’ (NK) cellen in het bloed [referenties: zie inleiding]. Hier breiden wij deze bevindingen uit en tonen een zeer significante ontregeling wat betreft meerdere belangrijke T-cel subgroep frequenties en, belangrijk, hun effector-funkties. Onze bevindingen onthullen diepgaande veranderingen qua funktionele capaciteit van ‘mucosal associated’ T-cellen (MAIT) & Th17-cellen, Tregs, en tekenen van CD8+ T-cel & NK-cel ontregeling in een subgroep jongere individuen. Gezien het feit dat deze cel-types betrokken zijn bij het reguleren van virale of bakteriële infekties, of de microbiomen, suggereren onze bevindingen dat sommige M.E./CVS-patiënten meerdere immune verstoringen vertonen die waarschijnlijk worden getriggerd door chronische infekties of verband houden met wijzigingen in het microbioom.

Onze observatie dat CD8+ T-cellen én NK-cellen proportioneel gedaald zijn bij M.E./CVS kunnen een weerspiegeling zijn van chronische virale infektie of persistentie (zoals CMV- of EBV-infekties) die een chronische geaktiveerde toestand van deze cellen triggert. Het is belangrijk om op te merken dat dit verschil hoofdzakelijk werd gezien bij individuen jonger dan 50, aangezien gezonde mensen van ouder dan 50 ook een gelijkaardig fenotype beginnen te vertonen als de patiënten die niet statistisch verschilden. Inderdaad: dit is consistent met de toename qua chronische virale infekties die wordt gezien bij normale veroudering, zoals CMV-seropositiviteit. Gezien deze verdeling is het echter onwaarschijnlijk dat deze subset-verschillen alleen de hoofd-oorzaak zijn van M.E./CVS-symptomen omdat het evident is dat er ook meerdere en ernstige veranderingen zijn qua effector-funkties van andere T-cel subsets. Daarnaast was het aandeel van CMV-/EBV-infekties bij gezonde controles en M.E./CVS-patiënten niet significant verschillend in beide leeftijd-groepen (gegevens niet getoond).

Een andere T-cel subgroep die sterk ontregeld bleek bij M.E./CVS waren de Th17-cellen, die worden gekenmerkt door de sekretie van IL-17, expressie van de chemokine-receptor CCR6 en de transcriptie-factor RORC. Th17-cellen spelen een belangrijke rol bij de immuun-respons op bakteriële of schimmel-infekties en bij de pathogenese van auto-immune of chronische inflammatoire ziekten. We vonden eerder dat een significant deel van de cellen die geprogrammeerd worden naar het Th17-fenotype niet onmiddellijk IL-17 sekreteren maar een ‘priming’-fase met IL-7 of IL-15 vereisen, wat we noemen ‘gereed-gemaakte’ Th17-cellen. Inderdaad: wanneer we een test uitvoerden waarbij we PBMCs in cultuur zetten met IL-7 gedurende 6 dagen vooraleer de IL-17 produktie van deze ‘gereed-gemaakte’ CCR6+ Th17-cellen te analyseren, bleken de verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en controles zeer groot. Hoewel er minder Th17-cellen zijn die IL-17 produceren bij M.E./CVS, was het aandeel van CCR6+ Th17-cellen echter paradoxaal significant hoger vergeleken met controles. Te samen suggereren deze bevindingen chronische aktivatie van de Th17-subset die mogelijks een toestand van “uitputting” induceert, op een manier dat wanneer hun aantal gestegen is omwille van chronische stimulatie, ze meer dysfunktioneel worden. Een mogelijke schuldige voor chronische Th17-cel stimulatie zou de veranderingen qua samenstelling van het microbioom kunnen zijn, of dysbiose die wordt veroorzaakt door het verschuiven van het evenwicht van voordelige of schadelijke bakterie-soorten, zoals wordt gezien tijdens HIV-infektie en wat bijdraagt tot auto-immune ziekten. Er is ook bewijsmateriaal voor het feit dat Th17-cellen kunnen reageren op specifieke met het microbioom geassocieerde bakterieën zoals Prevotella. Inderdaad: meerdere rapporten hebben microbioom-wijzigingen bij M.E./CVS geïdentificeerd [Shukla SK, Vernon SD et al. Changes in Gut and Plasma Microbiome following Exercise Challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS One (2015) 10: e0145453 /// Giloteaux L, Hanson MR et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Navaneetharaja N et al. A Role for the Intestinal Microbiota and Virome in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)? J Clin Med (2016) 5:55 /// Nagy-Szakal D, Hornig M et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44].

Regulerende T-cellen (Tregs) hebben als taak het onderdrukken van auto-immune en buitensporige chronische inflammatoire responsen. Onze bevinding dat Tregs verhoogd zijn bij M.E./CVS-patiënten is consistent met onze andere resultaten omtrent het feit dat er een chronische aktivatie (met nog te identificeren stimuli) van belangrijke T-cel subsets blijkt te zijn. Gestegen Tregs bij patiënten kan een weerspiegeling zijn van de verstoring van de Th17 en Th1/Th2 cytokine balans, suggestief voor een belangrijke ontwrichting van de homeostatische handhaving van immuun-responsen. Inderdaad, bv. het evenwicht tussen Th17-cellen en Tregs is ook cruciaal voor de regulering van inflammatie, bijzonderlijk gerelateerd met de darm en het microbioom. Opmerkelijk is dat we een correlatie vonden tussen Th17- en Treg-cellen bij M.E./CVS-patiënten en dat de verhouding zelfs meer significant verschillend was bij patiënten t.o.v. controles. Deze bevindingen onthullen potentiële biomerkers die kunnen worden aangewend bij toekomstige klinische interventies om het microbioom en de mucosale immuun-responsen terug in evenwicht te brengen. Bij toekomstige studies zal het ook belangrijk zijn verder (meer gedetailleerd) de onderdrukkende capaciteit van de verschillende subsets van Tregs te onderzoeken en, zoals bij andere subsets, de mechanismen te identificeren die leiden tot hun stijging bij M.E./CVS.

In onze analyse bleek een andere T-cel subgroep die zeer verschillend was, zowel fenotypisch als funktioneel, de MAIT-cellen. MAIT-cellen reageren selektief op een brede waaier aan bakterieën die beschikken over het biosynthetisch mechanisme voor riboflavine-metabolisme. Een studie vond significante veranderingen wat betreft de frequentie van CD8+ MAIT-cellen bij Multipele Sclerose en patiënten met ernstige M.E./CVS [Cliff JM, Nacul L et al. Cellular Immune Function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol (2019) 10: 796]. We zagen geen significante veranderingen van de frequentie MAIT-cellen (als percentage van PBMCs of T-cellen), wat te wijten kan zijn aan het feit dat deze T-cel subset zeer variabel is en tot 40 maal kan verschillen, zelfs bij gezonde mensen, en dat de meesten van onze patiënten-groep niet als ernstig ziek werd gekenmerkt. We zagen echter sterke verschillen qua funktie en differentiatie-toestand van MAIT-cellen bij M.E./CVS, zoals gedaalde aanmaak van cytokinen (IFNγ, IL-17) of de cytotoxische molekule Granzyme-A, en een toegenomen proportie CD27-negatieve CD8+ MAIT-cellen, wat correleerde met hun lagere overleving in cultuur met IL-7 in vitro. Gezien het feit dat MAIT-cellen specifiek worden geaktiveerd door riboflavine (vitamine-B2, metaboliet geproduceerd door bakterieën), redeneren we dat deze verstoring in MAIT-cellen ook geassocieerd kan zijn met verschillen in de samenstelling van het microbioom van de patiënten. Inderdaad: we toonden dat MAIT-cellen kunnen reageren op een waaier aan microbioom-gerelateerde bakterieën en dat een mogelijke funktie is: het harmoniëren of waarnemen van het microbieel ecosysteem van de mucosale weefsels. Er zijn ook artikels die tonen dat de ontwikkeling en expansie van MAIT-cellen ook direct afhankelijk is van het microbioom. In één artikel tonen de auteurs dat CD4CD8 (dubbel negatieve, of DN) MAIT-cellen een funktioneel verschillende subset zijn die door de huid migreert (bij muizen) en mogelijks betrokken is bij weefsel-herstel. Dus is het interessant om op te merken dat we bij M.E./CVS verschillen qua CD8+ observeerden maar niet in DN MAIT-cellen, suggererend dat deze verschillende nakomelingen of subsets zijn. Te samen genomen is het denkbaar dat een verstoring van het microbioom resulteert in chronische aktivatie van MAIT-cellen en een toestand van uitputting bij M.E./CVS-patiënten, wat gelijkaardig is met wat werd gezien bij de Th17-subset [zie Cliff JM et al. hierboven].

Ten slotte was ons ‘machine-learning’ klassificatie-model op basis van immune parameters, in staat de M.E./CVS-patiënten te identificeren met een hoge sensitiviteit en accuraatheid, gebruikmakend van alle 65 kenmerken, alle 40 significant-verschillende kenmerken en de 10 kenmerken van deze 40 significant-verschillende met de hoogste score. We zagen voor alle patiënten zagen we een hogere waarde qua sensitiviteit dan qua specificiteit, wat er op wijst dat het deel patiënten dat werd geïdentificeerd als M.E./CVS-patiënten hoger is dan gezonde controles die correct worden geïdentificeerd als zijnde gezond. Een mogelijke reden daarvoor kan verband houden met kenmerken zoals leeftijd, die er voor zorgt dat de immuun-profielen van oudere individuen meer gaan lijken op die van M.E./CVS-patiënten, en waardoor het RF klassificatie-model gezonde controles gaat klassificeren als patiënten. Momenteel is de diagnose van M.E./CVS gebaseerd op enkel klinische symptomen en geeft aanleiding tot vals-positieven en -negatieven. Een klassificatie-model op basis van immuun-profielen kan een objectieve oplossing voor een betere diagnose zijn maar bijkomend onderzoek bij grotere en meer diverse klinische groepen zal nodig zijn om de mogelijke klinische bruikbaarheid van een dergelijke benadering na te gaan.

Tot besluit: onze bevindingen openen een opwindend pad voor de ontwikkeling van een set biomerkers die kunnen worden aangewend om te helpen bij de diagnose en het stratificeren van de patiënten-populatie voor doelgerichte of precisie-geneeskundige therapeutica.

januari 5, 2020

Veranderd T-cel metabolisme & cytokine-verbanden bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 8:28 am
Tags: , , , , , , , , , ,

Hier volgt een studie door de groep van Prof. Maureen Hanson, ondersteund door het ‘M.E./CVS Collaborative Research Network’, een consortium van meerdere instituten en centra van het NIH. De bevindingen suggereren dat specifieke immuun-cellen van mensen met M.E.(cvs) verstoringen vertonen wat betreft de manier waarop ze energie produceren. Deze research biedt bijkomend bewijs voor de rol van het immuunsysteem bij de ziekte.

De onderzoeksgroep rond Donald Staines (uit Australië) publiceerde reeds preliminaire resultaten voor een reductie van de glycolytische reserve (meting die aangeeft hoe dicht de glycolyse – een belangrijke vorm van energie-produktie in de cel – bij het theoretisch maximum van de cel zit) in rustende geïsoleerde NK-cellen (een type immuun-cellen) van M.E.(cvs)-patiënten (referentie – Nguyen T et al. – zie tekst) en dat leidde hen er toe te postuleren dat deze NK-cellen het wellicht moeilijk hebben de glycolyse aan te zwengelen als ze (immunologisch) belast worden of bij stress. Ze besloten dat dit verder dient te worden onderzocht.

Anderen (zie Tomas C et al. in de tekst) vonden ook al verminderde mitochondriale respiratie (“cellulaire ademhaling” in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs; mix van lymfocyten – T-cellen, B-celen & NK-cellen – en monocyten) van mensen met M.E.(cvs) maar geen verschil qua glycolyse.

Men weet echter nog niet hoe het metabolisme van specifieke immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast is bij M.E.(cvs). Daarom werd hier werd het metabolisme onderzocht van CD4 T-cellen (die andere immuun-cellen alarmeren bij invaderende pathogenen) en CD8 T-cellen (die geïnfekteerde cellen aanvallen). Het team van Hanson vond geen significante verschillen wat betreft mitochondriale ademhaling tussen de cellen van gezonde individuen en mensen met M.E.(cvs), in rust of na aktivatie. De glycolyse (een minder efficiënte methode van energie-produktie) bleek echter ontregeld te zijn: vergeleken met die van gezonden, vertoonden CD4 en CD8 cellen van M.E.(cvs)-patiënten een mindere mate van glycolyse. Daarnaast vertoonden M.E.(cvs) CD8 cellen minder glycolyse na aktivatie. Prof. Hanson stelt: “Ons werk toont het belang aan van het bekijken van verschillende types immuun-cellen met verschillende taken, i.p.v. ze allemaal te samen te onderzoeken; dit kan problemen verbergen die specifiek zijn voor afzonderlijke cellen.”

Haar groep bekeek ook de grootte van de mitochondrieën en het membraan-potentiaal, indicatoren voor de gezondheid van T-cel mitochondrieën. Bij gezonde controles en M.E.(cvs)-patiënten bleken deze van CD4 cellen niet significant te verschillen qua grootte of funktie. Deze van CD8 cellen van mensen met M.E.(cvs)-patiënten vertoonden een verlaagd membraan-potentiaal t.o.v. gezonde cellen (in rust en geaktiveerd).

Ook verbanden tussen cytokinen en T-cel metabolisme werden onderzocht. Men vond verschillende, en dikwijls tegengestelde, patronen tussen gezonde cellen en die bij M.E.(cvs). Dit suggereert veranderingen in het immuunsysteem. Daarnaast bleek (onverwacht) dat de aanwezigheid van cytokinen die inflammatie veroorzaken correleerden met een verminderd metabolisme in T-cellen.

————————-

Journal of Clinical Investigation (Pre-print December 2019)

Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients exhibit altered T cell metabolism and cytokine associations

Alexandra H. Mandarano (1), Jessica Maya (1), Ludovic Giloteaux (1), Daniel L. Peterson (2), Marco Maynard (3), C. Gunnar Gottschalk (3) & Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

2 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

3 Simmaron Research Institute, Incline Village, NV, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ingewikkelde ziekte waarvan het mechanisme niet is gekend. Er is steeds meer erkenning voor de rol van immuun en metabool dysfunktioneren. M.E./CVS heeft zich historisch gepresenteerd in uitbraken, heeft dikwijls een griep-achtige aanvang en resulteert in inflammatoire symptomen. Patiënten lijden onder ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. Er is weinig bekend omtrent het metabolisme van specifieke immuun-cellen van M.E./CVS-patiënten. Om het immune metabolisme bij M.E./CVS te onderzoeken, isoleerden we CD4+ & CD8+ T-cellen van 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles. We analyseerden de glycolyse en mitochondriale respiratie van rustende en geaktiveerde T-cellen, samen met merkers verbonden met het cellulair metabolisme, en plasma-cytokinen. We vonden dat M.E./CVS CD8+ T-cellen een gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal hebben vergeleken met gezonde controles. Zowel CD4+ als CD8+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vertoonden verminderde glycolyse in rust, terwijl CD8+ T-cellen ook verminderde glycolyse na aktivatie. Bij M.E./CVS-patiënten bleken significante correlaties tussen metingen van het T-cel metabolisme en hoeveelheid plasma-cytokinen die verschilden van de gezonde controles. Onze gegevens wijzen er op dat patiënten een verstoord T-cel metabolisme vertonen dat consistent is met immune veranderingen bij M.E./CVS die het mechanisme achter de ziekte kunnen ophelderen.

Inleiding

[…]

Historisch zijn er wereldwijd clusters van uitbraken van M.E./CVS geweest […]. Om die reden, en de aanvang van de ziekte en de symptomen, is de potentiële identificatie van een pathogeen een research-prioriteit. Desondanks is er nog geen viraal, bakterieel of eukaryoot pathogeen geïdentificeerd als oorzaak voor de ziekte.

Het karakteriseren van het immuunsysteem is een alternatieve methode om mogelijke immune of infektueuze componenten bij M.E./CVS te exploreren. Er is substantieel bewijsmateriaal voor het feit dat het immuunsysteem een rol speelt en ontregeld is. Veel studies hebben de hoeveelheden van cytokinen of immuun-cel subpopulaties onderzocht, dikwijls met tegenstrijdige resultaten. Er werden echter wijzigingen qua cytokinen geïdentificeerd met verloop van de ziekte of tussen patiënten met een verschillende ziektegraad [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1 /// Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc Natl Acad Sci USA. (2017) 114: E7150-E8 /// Patarca R. Cytokines and Chronic Fatigue Syndrome. Ann N Y Acad Sci. (2001) 933: 185-200]. Cytokinen die veranderd bleken, omvatten: TNFα, TGFβ, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-6 & IL-4. Sommige studies rapporteerden ook verschillen qua CD4+ vs. CD8+ T-cellen, regulerende T-cellen en/of geheugen T-cellen bij M.E./CVS-patiënten.

Interessant is ook dat consistent werd gerapporteerd dat Natural Killer (NK) cellen van individuen met M.E./CVS verminderde cytotoxiciteit vertonen vergeleken met NK-cellen van gezonde controles. Er zijn ook meldingen van gedaalde CD8+ T-cel cytotoxiciteit bij M.E./CVS-patiënten, alsook verminderd granzyme-A en perforine in CD8+ T-cellen van patiënten [Brenu EW, Staines D et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Maher KJ, Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Anderen hebben verhoogde gevoeligheid voor dexamethason en verlaagde proliferatie van CD4+ T-cellen gerapporteerd, maar geen verschil qua cel-dood bij CD4+ of CD8+ T-cellen [bv. Visser J et al. CD4 T lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4]. Globaal blijft ons begrip omtrent funktionele stoornissen in M.E./CVS T cellen beperkt.

Omwille van de symptomen van vermoeidheid en post-exertionele malaise, werd degelijk onderzoek uitgevoerd omtrent het metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Er is bewijsmateriaal voor oxidatieve stress en voor verminderd coenzyme-Q10 bij M.E./CVS. Er zijn tegenstrijdige bevindingen aangaande cellulaire mitochondriale inhoud bij M.E./CVS, maar meerdere studies vonden geen verschil qua specifieke mitochondriale complex aktiviteiten. Ons laboratorium rapporteerde eerder dat er geen verband is tussen mitochondriale ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en M.E./CVS, hoewel sommige SNPs correleerden met specifieke symptomen bij patiënten [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2016) 14: 19]. Anderen vonden ook dat er geen klinisch relevante mitochondriale SNPs waren bij M.E./CVS-patiënten.

Er werden meerdere metabolomica-analyses op plasma, serum of urine van M.E./CVS-patiënten uitgevoerd. Deze toonden talrijke differentiële metabolieten behorend tot mechanismen zoals vetzuren-metabolisme, de TCA-cyclus, glucose- en aminozuren-metabolisme. Wijzigingen qua plasma-metabolieten betekenen waarschijnlijk dat het cellulair metabolisme is ook veranderd is bij M.E./CVS.

Metabolisme is cruciaal voor de werking van alle cellen maar is bijzonder noodzakelijk voor de correcte werking van het immuunsysteem. Immunometabolisme, of de studie van hoe het metabolisme van immuun-cellen ten grondslag ligt aan de werking en respons van het immuunsysteem, speelt een rol bij veel ziekten. In het bijzonder: slapende T-cellen vertonen weinig anabool metabolisme [opbouwen van molekulen uit kleinere eenheden; dit vereist energie]. In respons op een immune belasting verhogen T-cellen hun gebruik van oxidatieve fosforylatie, glycolyse en glutaminolyse [omzetting van het aminozuur glutamine], terwijl ze vetzuur-oxidatie verminderen. Deze verschuivingen qua metabolisme vereisen vereisen veranderingen in de oppervlakte-expressie van substraat-transporters. Veranderingen in T-cel metabolisme worden aangedreven door specifieke signalisering-mechanismen en zijn zeer sterk gereguleerd. Gepaste metabole programmas in rust en volgend op een immune belasting zijn essentieel voor optimale T-cel effector funktie, proliferatie en levensvatbaarheid.

Dysfunktie van het immunometabolisme kan bijdragen tot het ontstaan en/of handhaven van ziekte. Verhoogd T-cel metabolisme of aanmaak van reaktieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bijdragen tot inflammatie en/of auto-immuniteit. Omgekeerd kan hypometabolisme, het onvermogen om het metabolisme te verhogen na een immune belasting, een chronische infektie of kanker-progressie helpen onderhouden. Specifiek: chronische infektie kan leiden tot T-cel uitputting, waarbij metabolisme en effector-funkties verstoorden worden.

De karakterisatie van immunometabolisme bij M.E./CVS kan inzicht bieden omtrent het mechanisme van de ziekte, potentiële oorzaken en doelwitten voor behandeling. Er werd eerder mitochondriale dysfunktie in neutrofielen van individuen met M.E./CVS gerapporteerd [Myhill S et al. – gecontesteerd]. Een piloot-studie maakte melding van gedaalde glycolytische reserve in M.E./CVS NK-cellen [Nguyen T, Staines D et al. Reduced glycolytic reserve in isolated natural killer cells from Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients: A preliminary investigation. Asian Pac J Allergy Immunol. (2019) 37: 102-108]. Anderen vonden verminderde mitochondriale respiratie in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-individuen, maar geen verschil qua glycolyse [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. We weten echter nog niet hoe het metabolisme van andere immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast zijn bij M.E./CVS. Daarnaast is de capaciteit van specifieke M.E./CVS immuun-cellen om hun metabolisme te her-programmeren onbekend.

Om T-cel metabolisme en z’n potentiële rol bij M.E./CVS te onderzoeken, probeerden we het metabolisme in M.E./CVS CD4+ & CD8+ T-cellen in rust en na aktivatie te karakteriseren. We verzamelden stalen van 45 gezonde controles en 53 patiënten, waaruit we CD4+ & CD8+ T-cellen isoleerden. We verkregen uitgebreide informatie van elke individu. We testten dan zowel het mitochondriaal metabolisme en de glycolyse in rustende en gestimuleerde T-cellen. We karakteriseerden ook de mitochondrieën en keken naar de hoeveelheid GLUT1 [glucose-transporter; zorgt voor diffusie door celmembranen] van deze cellen. Ten slotte bepaalden we de hoeveelheid cytokinen in plasma van dezelfde individuen en analyseerden onze gegevens wat betreft correlaties.

Resultaten

[eerder voor experten; leken kunnen de bespreking hieronder lezen]

Individuen van de studie-populatie

De individuen werden gerecruteerd via Simmaron Research (Incline Village, Nevada) door Dr. Daniel Peterson en ze voldeden aan de Canadese Consensus Criteria. Er werden 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles opgenomen in de. De groepen waren gelijkaardig qua geslacht en leeftijd. […] De patiënten hadden een gemiddelde ziekte-duur van 21,7 jaar en de meeste waren langer dan 10 jaar ziek. […]

[…]

CD4+ T-cel mitochondriaal metabolisme is niet veranderd bij M.E./CVS-patiënten

[…]

Om te onderzoeken of de mitochondriale respiratie gewijzigd is gebruikten we een ‘Agilent Seahorse XFe96’ extracellulaire flux analyser [zie ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS] en de Mito Stress Test kit [voor het meten van de mitochondriale funktie]. […] Om de mitochondriale ademhaing in rust te vergelijken, alsook het vermogen van de T-cellen om het mitochondriaal metabolisme na aktivatie te her-modeleren, deden we de Mito Stress Test ook na stimulatie (met anti-CD3/anti-CD28 en IL-2). We bevestigden onze aktivatie-methode via flow-cytometrie (op basis van de aktivatie-merker CD69 [trans-membraan proteïne]). De T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles vertoonden significant verhoogde CD69 fluorescente intensiteit na stimulatie overnacht. […]

Wat betreft de CD4+ T-cellen was er geen significant verschil qua basale mitochondriale ademhaling in rust tussen de groepen. Er was een kleine maar niet significante afname van de maximale respiratie [men bootst een fysiologische “vraag naar energie” na door de respiratoire keten aan z’n maximum capaciteit te laten werken] van de M.E./CVS CD4+ T-cellen t.o.v. controle CD4+ T-cellen, maar niet voor de reserve respiratoire capaciteit. Zowel de maximale respiratie als de reserve respiratoire capaciteit [meting van het vermogen van de cel om te beantwoorden aan de energie-vraag] varieerden sterk (controles & and M.E./CVS) in rust. Er was geen significant verschil qua in proton-lek [overblijvende basale respiratie die niet voor ATP-produktie zorgt; dit kan een teken voor mitochondriale schade zijn]. De ATP-produktie [het aandeel van de basale respiratie dat gebruikt wordt om ATP (energie) aan te maken, de hoeveelheid ATP die wordt geproduceerd door de mitochondrieën om te voldoen aan de energie-behoeften van de cel] in rust was lichtjes gereduceerd in CD4+ T-cellen van patiënten […].

Er was geen significant verschil wat betreft basale mitochondriale respiratie na stimulatie tussen de groepen. Er was ook geen verschil qua maximale respiratie of ATP-produktie. Er was een kleine toename qua reserve respiratoire capaciteit en afname van het proton-lek maar geen van deze beide verschillen was statistisch significant.

CD4+ T-cellen van zowel controles als M.E./CVS vertoonden hogere, hoewel niet-significante, basale en maximale mitochondriale ademhaling na aktivatie t.o.v. rust. In beide groepen was er substantiële variatie in het metabolisme na aktivatie. De ATP-produktie na aktivatie was significant gestegen in de controle CD4+ T-cellen en er was een trend naar toename in M.E./CVS CD4+ T-cellen.

Globaal vertoonden CD4+ T-cellen van patiënten geen significante verschillen wat betreft mitochondriale respiratie, noch in rust, noch na stimulatie. Dit suggereert dat er geen belangrijke defekten zijn qua mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4+ T-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS CD4+ T-cellen geen defekt in hun respons na aktivatie via mitochondriale respiratie te vertonen.

M.E./CVS CD8+ T-cellen vertonen een gedaald proton-lek en ATP-produktie

We analyseerden mitochondriale respiratie in CD8+ T-cellen. In rust was er geen significant verschil voor basaal of maximaal mitochondriaal metabolisme van CD8+ T-cellen tussen de groepen. Het proton-lek was echter significant gereduceerd voor de M.E./CVS-patiënten, suggestief voor verhoogde mitochondriale efficiëntie. De ATP-produktie was lichtjes gedaald maar deze was zeer variabel in beide groepen. Er was geen verschil wat betreft reserve respiratoire capaciteit in rust.

Na aktivatie was er een kleine reductie qua basale mitochondriale respiratie in M.E./CVS CD8+ T-cellen. M.E./CVS CD8+ T-cellen vertoonden ook een kleine maar niet-significante daling qua maximale respiratie. Er was geen verschil in reserve respiratoire capaciteit na aktivatie. Het proton-lek vertoonde een trend naar lagere waarden in gestimuleerde M.E./CVS CD8+ T-cellen, consistent met de afname in rustende cellen. De ATP-produktie was echter significant verlaagd in M.E./CVS CD8+ T-cellen na aktivatie, suggestief voor het feit dat het verminderd proton-lek niet resulteert in verbeterde ATP-produktie.

Het metabolisme van gezonde CD8+ T-cellen vertoonde een kleine verhoging qua basale respiratie van rust naar aktivatie. Daarentegen vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen geen verandering of daling van het basaal mitochondriaal metabolisme na aktivatie t.o.v. rustende cellen. Het zelfde patroon werd gevonden voor maximale respiratie en ATP-produktie. Dus: CD8+ T-cellen zijn wellicht minder in staat het metabolisme te induceren na aktivatie.

Globaal duiden deze gegevens er op dat mitochondriale dysfunktie in M.E./CVS CD8+ T-cellen mogelijk is. Het ontbreken van verhoging van het metabolisme in M.E./CVS CD8+ T-cellen bijkomende verschillen tussen controles en patiënten na aktivatie suggereert een verstoord vermogen om het metabolisme te her-programmeren.

CD4+ T-cel mitochondriale massa en membraan-potentiaal verschilt niet tussen patiënten en controles

Om de mitochondrieën van M.E./CVS T-cellen verder te onderzoeken, wilden we de mitochondriale morfologie en het membraan-potentiaal in T-cellen karakteriseren. Zowel CD4+ als CD8+ T-cellen werden simultaan gekleurd met ‘MitoTracker Green’ (MTG) & ‘MitoTracker Red’ (MTR) CMXRos. MTG geeft de mitochondriale massa [totaal mitochondriaal membraan binnen het dynamisch netwerk van mitochondrieën in de cel] aan, terwijl MTR CMXRos sensitief is voor het mitochondriaal membraan-potentiaal [de lading-gradient over het binnenste mitochondriaal membraan, spanning-verschil tussen buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]. De mitochondrieën werden beoordeeld via microscopie, alsook via flow-cytometrie. […]

We zagen geen verschil voor MTG noch MTR CMXRos in CD4+ T-cellen. Zowel in rust en na aktivatie was er een goede kleuring voor de CD4+ T-cellen van patiënten en controles. We zagen geen morfologische verschillen in de mitochondriën in CD4+ T-cellen van patiënten en controles, hoewel de fluorescentie resolutie beperkt is.

Bij flow-cytometrie was er geen significant verschil te zien met MTG voor de CD4+ T-cellen, in rust noch na stimulatie, wat er op wijst dat er geen verschil is in mitochondriale massa in geen van beide toestanden. Er waren ook geen significante verschillen met MTR CMXRos. Op zich lijkt er ook geen verschil te zijn qua mitochondriaal membraan-potentiaal tussen patiënten en controle CD4+ T-cellen.

M.E./CVS CD8+ T-cellen vertonen een gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal

We visualiseerden microscopisch ook de mitochondriale morfologie, massa en membraan-potentiaal van CD8+ T-cellen. We zagen geen verschil in mitochondrieën via MTG. We observeerden echter, zowel in rust als na stimulatie, M.E./CVS CD8+ T-cellen met mitochondriën die waren gekleurd door MTG maar weinig of niet met MTR CMXRos. Daarentegen vertoonden CD8+ T-cellen van gezonde controles co-kleuring, zoals bij de CD4+ T-cellen. We zagen geen observeerbaar verschil in mitochondriale morfologie van CD8+ T-cellen tussen controles en M.E./CVS-patiënten in geen van beide toestanden. Verdere experimenten (elektronen-microscopie) zullen nodig zijn om te onderzoeken of er verschillen zijn die niet detekteerbaar zijn met fluorescentie-microscopie.

We wenden dan flow-cytometrie aan om de fluorescentie van de twee mitochondriale kleurstoffen te kwantificeren in CD8+ T-cellen. Consistent met de microscopische beelden was er geen significant verschil voor MTG bij CD8+ T-cellen in rust. Er was een kleine maar niet-significante toename voor MTG na stimulatie bij zowel controle- als patiënten-cellen. MTR CMXRos was ook lichtjes gestegen in CD8+ T-cellen van controles en M.E./CVS na aktivatie. M.E./CVS CD8+ T-cellen vertoonden echter significant minder MTR CMXRos zowel in rust als na aktivatie. Dus: CD8+ T-cellen van patiënten vertonen geen verschil qua mitochondriale massa (beide toestanden) maar hebben wel een verminderd mitochondriaal membraan-potentiaal vergeleken met controle-cellen.

M.E./CVS CD4+ T-cel glycolyse is gereduceerd in rust vergeleken cellen van gezonde controles

Het tweede belangrijk, hoewel minder efficiënt, energie-producerend mechanisme voor de cel is glycolyse [omzetting van glucose naar lactaat]. Glycolyse speelt een significante rol bij de werking van immuun-cellen en is cruciaal voor T-cel aktivatie. We onderzochten daarom of de glycolyse in T-cellen bij M.E./CVS op een vergelijkbare manier funktioneert als bij gezonde controles. Bijkomend bepaalden we of M.E./CVS T-cellen de glycolyse gepast kunnen stimuleren na aktivatie. We gingen de glycolyse na zowel CD8+ als CD4+ T-cellen in rust en na at rest stimulatie m.b.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser. Voor rustende T-cellen (‘Seahorse Glycolytic Rate Assay’) verkregen we kwantitatieve metingen van de basale glycolyse, compenserende glycolyse [glycolyse na toevoeging van mitochondriale inhibitoren (die de oxidatieve fosforylatie inhiberen) en compenserende veranderingen in de cel induceren om glycolyse te gerbuiken om aan de energie-behoeften te voldoen] en post-2DG verzuring [extracellulaire verzuring niet veroorzaakt door glycolyse of mitochondriale TCA-aktiviteit alsook door residuele glycolyse die niet wordt geïnhibeerd door 2-DG (2-deoxyglucose stopt de glycolyse)]. Door het beperkt aantal cellen die beschikbaar waren voor het testen van de glycolyse na aktivatie, gebruikten we in plaats daarvan een combinatie van molekulen die simultane metingen van de glycolyse en mitochondriale respiratie toeliet. […] Omwille van deze strategie, vergeleken we in gestimuleerde cellen de basale glycolyse, alsook de glycolytische capaciteit, of de glycolyse geïnduceerd door de injektie van oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], en post-2DG verzuring. We maakten geen directe vergelijking tussen compenserende glycolyse en glycolytische capaciteit, maar we waren in staat basale glycolyse tussen rust en aktivatie te vergelijken.

Wanneer we de glycolyse bepaalden in CD4+ T-cellen in rust, was de basale glycolyse significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controle cellen. De compenserende glycolyse was ook significant gedaald in rust in M.E./CVS CD4+ T-cellen. De post-2DG verzuring was lichtjes, maar niet significant verminderd in M.E./CVS CD4+ T-cellen vergeleken met gezonde controles. Interessant: er was geen verschil qua basale glycolyse tussen voor CD4+ T-cellen na stimulatie, suggererend dat de aktivatie voldoende is om de gedaalde glycolyse in rust te boven te komen. Er was echter substantiële variatie qua glycolyse in gestimuleerde M.E./CVS-cellen. Zo ook was de glycolytische capaciteit niet significant verschillend tussen controle M.E./CVS CD4+ T-cellen na aktivatie, ondanks een kleine toename in de cellen van patiënten. De post-2DG verzuring was significant hoger in M.E./CVS CD4+ T-cellen vergeleken met gezonde controles, ondanks het feit dat we een lichte afname zagen in rustende cellen. Dit kan duiden op extracellulaire verzuring uit niet-glycolytische bronnen in geaktiveerde M.E./CVS CD4+ T-cellen. Daarnaast kan dit de kleine toename van de glycolyse in vergelijking met controle-cellen verklaren.

De basale glycolyse steeg bij gezonde controle en M.E./CVS CD4+ T-cellen (van rust naar stimulatie) maar dit verschil was enkel significant in M.E./CVS-cellen. De post-2DG verzuring was niet verschillend in gezonde controle CD4+ T-cellen maar was significant hoger in CD4+ T-cellen van patiënten na aktivatie, suggestief voor verhoogde extracellulaire bronnen van verzuring na stimulatie.

Aangezien de glycolyse afhangt van de opname van glucose via de voornaamste glucose-transporter GLUT1, bepaalden we ook de aanwezigheid van of GLUT1 op het cel-oppervlak d.m.v. flow-cytometrie. Het percentage GLUT1+ cellen was significant gestegen bij gezonde individuen en er was een trend tot toename bij M.E./CVS-patiënten na stimulatie, vergeleken met cellen in rust. Er waren geen significante verschillen qua percentage GLUT1+ cellen tussen gezonde en M.E./CVS CD4+ in rust of na aktivatie. Er was echter een kleine toename van GLUT1+ cellen in M.E./CVS CD4+ T-cellen t.o.v. controles in rust, ondanks de daling qua glycolyse.

M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse is verminderd in rust en na aktivatie

Dan onderzochten we de glycolyse in CD8+ T-cellen. Gelijkaardig met CD4+ T-cellen was de basale glycolyse significant gedaald in M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust. De compenserende glycolyse was ook significant verminderd in M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust. De post-2DG verzuring was gereduceerd, hoewel dit verschil niet significant was. Anders dan onze resultaten voor CD4+ T-cellen, vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen ook significant lagere basale glycolyse t.o.v. gezonde controle CD8+ T-cellen na aktivatie. Er was geen significant verschil qua glycolytische capaciteit of post-2DG verzuring in gestimuleerde CD8+ T-cellen (M.E./CVS vs. controle). We stelden een sterke variabiliteit vast qua glycolytische capaciteit in beide groepen.

Er waren minimale veranderingen qua glycolyse (rust vs. aktivatie) in CD8+ T-cellen (controle of M.E./CVS). Interessant: er was een lichte, niet-significante toename qua post-2DG verzuring in M.E./CVS CD8+ T-cellen na stimulatie, overéénkomstig met de respons die we zagen in M.E./CVS CD4+ T-cellen. De gereduceerde basale glycolyse na aktivatie kan wijzen op een verstoord vermogen van CD8+ T-cellen om glycolyse te her-modeleren na aktivatie, zoals we zagen voor de mitochondriale respiratie.

We kwantificeerden ook GLUT1+ cellen (flow-cytometrie) op M.E./CVS en gezonde CD8+ T-cellen. Zoals bij de CD4+ T-cellen, hadden CD8+ T-cellen van beide groepen een hoger percentage GLUT1+ cellen na stimulatie. Daarnaast waren er weer geen significante verschillen qua GLUT1+ cellen, in rust of na aktivatie. Niettemin was er een kleine afname qua GLUT1+ cellen bij de patiënten (in rust).

Plasma-cytokinen correleren op een unieke manier met het T-cel metabolisme van M.E./CVS-patiënten

Naast PBMCs namen we EDTA-plasma af bij alle individuen. Om de immuun-funktie bij M.E./CVS verder te onderzoeken, w analyseerden de de hoeveelheden plasma-cytokinen in stalen van 37 gezonde controles en 36 M.E./CVS-patiënten […]. Van de 48 gemeten cytokinen/chemokinen, warden er 44 gedetekteerd. […] We vonden geen significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor geen enkele van de 44 gedetekteerde cytokinen.

Hoewel we geen verschillen zagen qua hoeveelheden plasma-cytokinen tussen patiënten en controles, waren we geïnteresseerd om te bepalen of het T-cel metabolisme correleerde met de waarden van plasma-cytokinen of bevragings-gegevens. We bepaalden ook of het T-cel metabolisme verschilde tussen patiënten met of zonder IBS [prikkelbare darm] of inflammatoire darm ziekte (IBD).

We vonden geen significante correlaties tussen T-cel metabolisme en bevragings-gegevens bij M.E./CVS-patiënten of gezonde controles. Daarnaast bleek het T cel-metabolisme niet significant verschillend bij IBS- of IBD-patiënten t.o.v. mensen zonder deze ziekten. We zagen echter wel een aantal significante correlaties tussen plasma-cytokinen en het metabolisme. Zeer interessant: deze correlaties waren uniek bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met de controle-groep. Bij M.E./CVS-patiënten vonden we significante negatieve correlaties tussen basale glycolyse in CD8+ T-cellen, en de hoeveelheden IL-2, IL-8, IL-10, IL-12 p70 & SCGFβ [‘stem cell growth factor beta’]. Geen van deze correlaties waren significant bij gezonde controle-individuen. Omgekeerd: we vonden een significante positieve correlatie tussen basale glycolyse in CD8+ T-cellen en IL-9. Dezelfde trend was aanwezig bij gezonde in controles maar dit was niet significant. De compenserende glycolyse van rustende CD8+ T-cellen bleek significant negatief correlerend met M-CSF [‘macrophage colony-stimulating factor’] en TNFα. Interessant was dat tegengestelde trends werden vastgesteld bij gezonde controles. Na stimulatie correleerden in CD8+ T-cellen van patiënten de post-2DG verzuring en glycolytische capaciteit allebei negatief met de hoeveelheid M-CSF. Bij gezonde controles kwamen dezelfde verbanden voor maar deze waren niet significant. Aangezien veel van deze cytokinen pro-inflammatoir zijn, is het verrassend dat ze correleren met gedaald metabolisme in M.E./CVS CD8+ T-cellen.

Er waren vier significante correlaties tussen cytokinen en metingen van het metabolisme bij controles, voornamelijk in geaktiveerde CD4+ T-cellen. De basale mitochondriale respiratie en maximale respiratie van gestimuleerde CD4+ T-cellen waren positief gecorreleerd met het pro-inflammatoir cytokine IL-17. Daarentegen waren bij M.E./CVS-patiënten deze correlaties niet-significant en de maximale respiratie was negatief geassocieerd met IL-17. Er was een significante negatieve correlatie tussen plasma IL-9 en geaktiveerde basale respiratie van CD4+ T-cellen, welke niet aanwezig was bij M.E./CVS-patiënten. Ten slotte was er een significante negatieve correlatie tussen de reserve mitochondriale respiratoire capaciteit in rustende CD8+ T-cellen en GCSF bij gezonde controles, maar niet bij M.E./CVS-patiënten. Globaal vertoonden mensen met M.E./CVS en gezonde controles unieke correlaties tussen plasma-cytokinen en het T-cel metabolisme, wat een verdere indicatie is voor immune veranderingen bij M.E./CVS.

Bespreking

T-cellen bleken eerder al betrokken bij M.E./CVS (funktie-testen en karakterisatie van oppervlakte-merkers). De cluster-uitbraken van M.E./CVS, de ziekte-aanvang en immuun-gerelateerde symptomen suggereren allemaal een infektueuze trigger. Gewijzigde cytokine-profielen, gedaalde NK-cel cytotoxiciteit en succesvolle behandelingen impliceren verder het mechanisme. In onze studie-populatie zagen we bewijs voor immune betrokkenheid bij M.E./CVS. Van de 53 M.E./CVS-patiënten rapporteerden er 41 een gekende virale infektie of een virus-achtige ziekte als trigger voor hun ziekte. M.E./CVS-patiënten hadden een hogere prevalentie van gastro-intestinale symptomen of aandoeningen, wat eerder al werd gerapporteerd en gelinkt met veranderingen qua darm-bakterieën [Giloteaux L, Hanson MR et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Nagy-Szakal D et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44]. Bovendien ondersteunt de toegenomen co-morbide diagnose bij patiënten of van familieleden met immuun-gerelateerde aandoeningen, een rol voor het immuunsysteem en potentiële genetische voorbestemdheid voor de ziekte.

Onze studie-populatie was evenwichtig qua geslacht, wat ons toeliet T-cellen te karakteriseren bij zowel mannen als vrouwen. […] Onze studie-groep omvatte voornamelijk patiënten met langdurige ziekte, wat niet verrassend is, gezien het feit dat de gemiddelde tijd tot de diagnose die wordt gemeld bijna zeven jaar bedraagt. Een analyse van het T-cel metabolisme van patiënten met korte vs. lange ziekte was dus niet mogelijk in deze studie, maar een toekomstig onderzoek met meer patiënten met ziekte van kort duur zou bijkomend inzicht kunnen verstrekken.

Op basis van het bewijsmateriaal voor een dysfunktioneel immuunsysteem bij M.E./CVS-patiënten en de toenemende erkenning voor de rol die het immuun-metabolisme speelt bij de werking van T-cellen, wilden we het metabolisme van M.E./CVS CD4+ & CD8+ T-cellen onderzoeken. Een eerdere studie [zie Tomas C et al. hierboven] vond gedaalde mitochondriale respiratie in M.E./CVS PBMCs t.o.v. gezonde controles, maar onze studie is het eerste specifiek onderzoek van het T-cel metabolisme bij M.E./CVS. We karakteriseerden de twee voornaamste energie-producerende mechanismen, oxidatieve fosforylatie en glycolyse, in cellen en hun onderliggende cellulaire componenten. Onze studie van mitochondriale respiratie vond geen dysfunktie van het mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4+ T-cellen, noch enige moeilijkheid omtrent het verhogen van de respiratie in respons op aktivatie. De brede variatie bij veel van de metingen voor het metabolisme was verwacht, maar beperkte differentiatie tussen patiënten- en controle-cellen. Onze voornaamste beperking was de grootte van de groep, vooral wat betreft de experimenten met overnacht stimulatie. Zoals verwacht en eerder aangetoond, vonden we een verhoogde mitochondriale respiratie in CD4+ T-cellen van zowel M.E./CVS-patiënten als gezonde controles na aktivatie. Er waren ook geen verschillen qua mitochondriale massa of membraan-potentiaal tussen CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Verrassend: er was geen significante stijging qua mitochondriale massa na aktivatie, wat eerder werd aangetoond. Dit kan verband houden met de gebruikte stimulatie-methodes. Het is het vermelden waard dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MitoTracker ook sterk varieerde in alle populaties.

In CD8+ T-cellen zagen we enkel een significante reductie qua proton-lek in rust bij M.E./CVS-cellen vergeleken met gezonde controles. Een verminderd proton-lek zou verhoogde mitochondriale respiratoire efficiëntie suggereren, maar toch waren de basale respiratie, maximale respiratie en ATP-produktie niet significant verschillend in CD8+ T-cellen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Na aktivatie zagen we een gelijkaardig fenotype. Als geheel verhoogden M.E./CVS CD8+ T-cellen hun basale respiratie niet in dezelfde mate als cellen van gezonde controles na stimulatie, suggestief voor een stoornis van het vermogen tot metabole her-programmering.

Ons onderzoek van mitochondrieën in CD8+ T-cellen via beeldvorming onthulde een significante reductie qua mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS CD8+ T-cellen, zowel in rust als na aktivatie. Dit was verrassend gezien de afname van het proton-lek dat we zagen in patiënten-cellen, Maar wordt niettemin ondersteund door andere observaties van hypo-metabolisme in immuun-cellen bij M.E./CVS [bv. Mensah FFK, Armstrong CW et al. CD24 Expression and B cell maturation shows a novel link with energy metabolism: potential implications for patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front Immunol. (2018) 9: 2421]. Bovendien had een subgroep M.E./CVS CD8+ T-cellen meer mitochondriale massa dan gezonde controle-individuen in rust. CD8+ T-cellen van zowel gezonde controles als M.E./CVS-patiënten vertoonden de verwachte toenames qua mitochondriale massa en membraan-potentiaal na aktivatie, hoewel dit verschil niet significant was en niet volstond om het gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS-cellen te boven te komen. In feite was het verschil qua mitochondriaal membraan-potentiaal groter na overnacht stimulatie. Dit kan een verstoorde metabole respons na aktivatie en grotere observeerbare verschillen qua mitochondriale respiratie in gestimuleerde cellen helpen verklaren. Er werd gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal gezien na chronische virale infektie, en dit is een courant kenmerk van of T-cel uitputting.

Bij zowel CD4+ als CD8+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vonden we significante dalingen van de basale glycolyse en compenserende glycolyse in rust. Interessant is dat eerder al gedaald plasma-glucose bij M.E./CVS werd gerapporteerd [Germain A, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst. (2017) 13: 371-9. Verminderingen qua glucose-metabolisme, zonder overéénkomende verhogingen qua mitochondriale respiratie, duiden op hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Na stimulatie was er geen significant verschil wat betreft CD4+ T-cel basale glycolyse of glycolytische capaciteit, wat er op duidt dat aktivatie voldoende is om defekten in de glycolyse in rust te boven te komen. M.E./CVS en controle CD4+ T-cellen verhoogden allebei de glycolyse (rust naar aktivatie) zoals verwacht, wat weer suggereert dat M.E./CVS CD4+ T-cellen in staat zijn tot gepaste metabole her-programmering. In tegenstelling daarmee vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen nog significant gedaalde basale glycolyse vergeleken met gezonde controles na aktivatie. Samen met onze bevindingen in CD8+ T-cellen over mitochondriale respiratie na aktivatie, ondersteunt dit een verstoring van de metabole respons op aktivatie in CD8+ T-cellen bij M.E./CVS. Niettemin waren er minimale wijzigingen wat betreft glycolyse in CD8+ T-cellen van patiënten of gezonde controles in rust vs. geaktiveerde toestand.

In zowel CD4+ als CD8+ T-cellen was het percentage GLUT1+ cellen verhoogd na stimulatie, zoals eerder werd getoond in T-cellen. Er waren geen significante verschillen tussen patiënten en controles. Er was een lichte toename qua percentage CD4+ GLUT1+ cellen bij M.E./CVS (t.o.v. controles). Er was echter een kleine afname van het percentage GLUT1+ cellen bij de M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust vergeleken met controles, wat consistent is met de verminderde glycolyse in rust. Een eerdere studie omtrent T-cel uitputting toonde gestegen, in plaats van gedaalde, GLUT1 bij verstoorde glycolyse. Daarnaast kan glucose worden aangewend voor alternatieve mechanismen die niet worden gemeten met de Seahorse bepalingen.

Wanneer we al onze gegevens analyseerden wat betreft correlaties, vonden we significante correlaties tussen hoeveelheden plasma-cytokinen en metingen van het T-cel metabolisme, die uniek waren bij M.E./CVS-patiënten in vergelijking met controles. M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse vertoonde meerdere significante correlaties met cytokinen die bekend staan als pro-inflammatoir of als groeifactoren. Het is bijzonder interessant gezien de gedaalde basale glycolyse die we zagen bij M.E./CVS-patiënten. Bijzonderlijk IL-2 zou worden verwacht glycolyse in T-cellen te induceren, in plaats van glycolyse te verstoren. Er zou kunnen worden verwacht dat pro-inflammatoire cytokinen positief gecorrelereerd zijn met T-cel metabolisme, maar ze bleken negatief gecorrelereerd met het T-cel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Bij gezonde controles was het pro-inflammatoir cytokine IL-17 positief gecorrelereerd met basale en maximale respiratie in gestimuleerde CD4+ T-cellen. Interessant: dezelfde verbanden vertoonden negatieve trends bij M.E./CVS-patiënten.

Andere cytokinen die van belang kunnen zijn, vertoonden uniek verbanden met M.E./CVS en controle T-cel metabolisme. IL-10, dat ook negatief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse, is een immunosuppressief cytokine dat eerder werd gelinkt met chronische infektie, immuun-cel uitputting en inhibitie van T-cel aktivatie. Bij deze voorbeelden zou verminderd T-cel metabolisme worden voorspeld zodat een negatieve correlatie met glycolyse in M.E./CVS CD8+ T-cellen wordt verwacht. Niettemin is de afwezigheid van deze correlatie bij gezonde controles opvallend. IL-9, dat positief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse, is een T-cel groeifactor maar heeft complexe effekten. Bij borstkanker-patiënten leidden IL-9 producerende Th9-cellen tot verbeterde CD8+ T-cel cytotoxiciteit, wat een toename qua cellulair metabolisme zou vereisen. IL-9 was negatief gecorrelereerd met de basale respiratie van geaktiveerde CD4+ T-cellen bij gezonde controles, wat verband zou kunnen houden met verbetering van de funktie van regulerende T cellen door IL-9. Cytokinen aangemaakt door andere immuun-cellen of T-cel subsets worden ook gesekreteerd in het plasma en droegen bij tot onze metingen. Niettemin vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen meerdere negatieve correlaties tussen het metabolisme and plasma-cytokinen daar waar positieve correlaties kunnen worden verwacht. Dit suggereert dat het verband tussen pro-inflammatoire cytokinen in plasma en T-cel metabolisme gewijzigd is bij M.E./CVS-patiënten en impliceert specifieke cytokinen voor verder onderzoek bij M.E./CVS. Het is duidelijk dat het immuunsysteem een rol speelt bij M.E./CVS. Onze gegevens wijzen er op dat er reductie qua rustend T-cel metabolisme bij patiënten bestaat. In het bijzonder: CD8+ T-cellen vertonen een gewijzigd mitochondriaal membraan-potentiaal en een verstoring van hun metabole respons op aktivatie. CD4+ en CD8+ T-cellen vertonen beide significante dalingen qua glycolyse. Dit hypo-metabolisme in T-cellen ligt in dezelfde lijn als andere bevindingen aangaande hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS-patiënten veranderde verbanden te vertonen tussen plasma cytokine-hoeveelheden en T-cel metabolisme, waarbij pro-inflammatoire cytokinen onverwacht correleren met hypo-metabolisme. Een dergelijke ontregeling kan aangeven dat M.E./CVS T-cellen responsiviteit voor sommige pro-inflammatoire cytokinen hebben verloren. Tesamen met een hypo-metabolisme in immuun-cellen, is dit consistent met een aanhoudende infektie, hoewel een dergelijk agens nog niet werd geïdentificeerd. Om vooruit te komen zal het bepalen van het mechanisme achter een hypo-metabolisme in M.E./CVS T-cellen hoge prioriteit moeten krijgen, alsook het nagaan van hoe een gewijzigd metabolisme de funktie van deze cellen beïnvloedt.

Methodes

Studie-populatie

M.E./CVS diagnose door Dr. Daniel Peterson (Simmaron Research in Incline Village, Nevada) op basis van vragenlijsten zoals de SF-36 & ‘Bell Scale’, inventaris van specifieke symptomen en bijkomende vragen (bv. co-morbiditeiten en familiale geschiedenis).

Afname ne verwerking van stalen

[…]

Isolatie van immuun-cellen

[…]

Extracellulaire flux analyse

[…] Seahorse XFe96 […] Seahorse ‘Mito Stress kit’, Seahorse ‘Glycolytic Rate Assay’ (oligomycine, FCCP, rotenon/antimycine-A, 2-DG). Aktivatie: stimulatie met STEMCELL ImmunoCult™ (anti-CD3 & anti-CD28), plus IL-2. [zie hierboven] […]

Flow-cytometrie

[…]

Confocale microscopie

[…]

Analayse van plasma-cytokinen

[…] 48 cytokinen & chemokinen (‘Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel’) […]

Statistiek

[…]

oktober 19, 2019

HERV-K & HERV-W transcriptie-aktiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Infektie — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , ,

Retrovirussen zijn RNA-virussen die bij alle gewervelde dieren worden gevonden. Een retrovirus reproduceert/copieert zijn RNA naar DNA door ‘reverse (omgekeerde) transcriptie’, wat dan wordt geïntegreerd in het genoom van een gastheer zodat het kan worden overgeschreven in virussen. Veel retrovirale sequenties blijven permanent geïntegreerd in het menselijk genoom als humane endogene retrovirussen of HERVs. Het menselijk genoom (alle genomen) bevatten ook retrovirus-achtige retrotransposons, mobiele elementen die zich vermenigvuldigen door RNA-copieën te maken die via ‘reverse’ transcriptie in DNA geïntegreerd worden op nieuwe plaatsen in het genoom. Het voornaamste verschil tussen een retrovirus en een retrotransposon is dat het laatste geen enveloppe (omhulsel) heeft. De meeste HERVs en retrotransposons zijn defekt (er ontbreken één of meerdere gen-funkties) maar kunnen zich niettemin vermenigvuldigen en ‘bewegen’ m.b.v. andere elementen of infekterende virussen.

Prof. Brigitte Huber van de ‘Tufts University School of Medicine’ – de persoon die aantoonde dat XMRV bij M.E.(cvs) niet bestaat en het als een contaminant bestempelt) – presenteerde op de ‘Invest in ME’ conferentie in London (2010) bewijsmateriaal dat suggereerde dat een geaktiveerd aloud retrovirus dat in het menselijk genoom is ingebed (HERV-K18), aktief zou kunnen zijn bij M.E.(cvs). In een later artikel (2013) waarvan ze mede-auteur is (zie Oakes B et al. in onderstaande tekst) kon niet worden aangetoond dat er een verschil is qua HERV-K18 enveloppe (proteïne-omhulsel) transcripten tussen M.E.(cvs) en controles, en dat die ook niet werden gereaktiveerd door humaan herpes-virus 6 of 7. Het bleef dan lange tijd stil rond deze kwestie…

Een nieuwe studie gepubliceerd met Luis Nacul (‘Associate Professor, Faculty of Infectious and Tropical Diseases’ van de ‘London School of Hygiene & Tropical Medicine’) als co-auteur, steunend op een ‘bredere’ techniek en uitgevoerd op materiaal van de Britse ‘M.E./CVS Biobank’ (UKMEB), toont aan dat er een over-expressie is van een bepaalde famile (HERV-K) maar enkel bij de matig zieke individuen. De studie werd mede gefinancierd door de amerikaanse ‘National Institutes of Health’ (NIH).

————————-

BioRxiv [“bio-archive” – gratis online archief voor ongepubliceerde pre-prints (vóór peer-review en formele publicatie)] (juli 2019)

HERV-K and HERV-W transcriptional activity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Lucas S Rodrigues (1), Luiz H da Silva Nali (1,2), Cibele O D Leal (1), Ester C Sabino (1,3), Eliana M Lacerda (4), Caroline C Kingdon (4), Luis Nacul (4), Camila M Romano (1,5)

1 Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

2 Universidade Santo Amaro, Pos-Graduacao em Ciencias da Saude

3 Departamento de Molestias Infecciosas e Parasitarias, Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

4 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, United Kingdom

5 Hospital das Clinicas HCFMUSP (LIM52), Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende chronische ziekte die de levenskwaliteit dramatisch compromitteert. De M.E./CVS-pathogenese is multifactorieel en er wordt gedacht dat immunologische, metabole en omgeving-factoren een rol spelen. Er is goede documentering van een verhoogde aktiviteit van humane endogene retrovirussen (HERVs) van verschillende families bij auto-immune en neurologische ziekten, wat er voor zorgt dat deze elementen goede kandidaten voor biomerkers of zelfs triggers voor dergelijke ziekten zijn. Hier werden de expressie van endogene retrovirussen K en W (HERV-K & HERV-W) bepaald in het bloed van matig en ernstig zieke M.E./CVS-patiënten. voor HERV-K was er over-expressie enkel bij de matig zieke individuen en HERV-W vertoonde geen verschil. Dit is de eerste melding omtrent differentiële expressie van HERV-K bij matige M.E./CVS.

Inleiding

[…] De pathofysiologie van M.E./CVS wordt nog niet begrepen en er is geen diagnostische biomerker beschikbaar. Er is nog controverse over de etiologie maar er is echter brede acceptatie dat meerdere immunologische veranderingen aanwezig zijn bij M.E./CVS-patiënten. Daarnaast is er steeds meer bewijs voor een associatie van M.E./CVS met virale infekties en veel patiënten melden dat hun symptomen begonnen tijdens of net na een griep-achtige ziekte [Rasa S et al. Chronic viral infections in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). J Transl Med. (2018) 16: 268]. Daarna zou een ongewone auto-immune respons tegen de infektie verantwoordelijk zijn voor de bestendiging van de M.E./CVS-symptomen. Tenslotte wordt de deelname van virussen ondersteund door het bewijs van klinisch nut van valganciclovir [antiviraal medicijn; synthetisch analoog van 2′-deoxy-guanosine, wordt ingebouwd in viraal DNA waardoor dit niet meer kan worden overgeschreven] voor patiënten. Jammer genoeg belemmert de afwezigheid van studies bij grote groepen die de bijdrage van infektueuze agentia aan de M.E./CVS-pathogenese op molekulair niveau onderzoeken ons begrip van deze ziekte.

Humane Endogene Retrovirussen (HERVs) komen voort uit exogene retrovirale infekties, die optraden vroeg in de evolutie van gewervelden. Door aktieve replicatie- en transpositie-gebeurtenissen, worden HERVs uitgebreid verspreid over het gastheer-genoom en vormen ze ca. 8% van het menselijke genoom. Omwille van geaccumuleerde mutaties doorheen de evolutie van primaten en mensen, zijn de meeste HERVs niet-funktioneel, maar er blijven intacte ‘open-reading frames’ [delen van het RNA ‘lees-raam’ die kunnen worden vertaald; ORF = een doorlopende reeks codons beginnend met een start- en eindigend met een stop-codon] van enkele HERVs bestaan en deze kunnen gereaktiveerd worden in respons op systemische en omgeving-factoren (zoals hormonen, stress en infektie door exogene virussen, inclusief bijna alle menselijke herpes-virussen, HIV en andere). Gezien hun potentiële pathogene effekten (inclusief ‘molecular mimicry’ [‘mimic’ = imiteren of nabootsen; een deel van een bepaald proteïne (peptide) gelijkt sterk op een deel van een totaal verschillend proteïne; speelt een rol bij auto-immuniteit] en immune ontregeling), wordt dikwijls gepostuleerd dat HERVs mogelijke oorzaken zijn van auto-immune ziekten. Onder de meer dan 30 families, zijn het de K & W families die het meest recent geïntegreerd werden, die meest aktief zijn en frequent geassocieerd werden met neurologische en auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes mellitus, S.L.E., A.L.S. en Reumatoïde Artritis.

Naar ons weten zijn er slechts twee studies die de participatie van endogene retrovirussen in M.E./CVS hebben onderzocht; dit met tegenstrijdige resultaten. Gezien de uitgebreid beschreven gewijzigde patronen van HERVs bij meerdere ziekten en het gebrek aan kennis omtrent hun expressie bij M.E./CVS, onderzochten we de expressie van de HERVs K & W bij patiënten met een diagnose van M.E./CVS.

Methodes

Deelnemers

We gebruikten PBMC-stalen van 100 patiënten met de diagnose van M.E./CVS opgeslagen in de ‘UK M.E./CVS Biobank’ (UKMEB) aan de ‘London School of Hygiene and Tropical Medicine’. […]. Er werden 75 stalen gevraagd van deelnemers met een diagnose van matige vermoeidheid (M.E./CVSm) en 25 van deelnemers met ernstige vermoeidheid (M.E./CVS). Er werden ook stalen van 70 gezonde controles (ook geleverd door de UKMEB) opgenomen. […].

RNA-extractie & ‘real-time’ PCR

[…]

[…] De HERV-aktiviteit werd kwalitatief (aan-/afwezigheid) en kwantitatief (mate van expressie) geëvalueerd. Als positieve controle gebruikten we een plasmide dat zowel HERV-W enveloppe en HERV-K polymerase fragmenten corresponderend met het gebied tussen de primers. […] De stalen werden enkel positief voor HERVs beschouwd en onderworpen aan de analyses als de expressie van de endogene controle ook werd gedetekteerd.

Resultaten

[…] Zoals verwacht waren er 4 maal meer vrouwen dan mannen [bij de patiënten]. Daarom pastten we de controle-groep aan zodat deze dezelfde gender-prevalentie had.

[Kwalitatief] De expressie van HERV-K & -W werd geëvalueerd bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles; en er werd enig niveau van expressie van HERV-W gedetekteerd bij alle patiënten met ernstige vermoeidheid [100%] en bij 72/75 M.E./CVSm (96%). HERV-K werd ook gedetekteerd bij alle ernstige gevallen [100%] maar bij 65/75 van de matige gevallen (86,6%). De gezonde controle-groep was zeer gelijkend met de matige groep: 68/70 (97%) en 60/70 (85,7%) met expressie van HERV-W & HERV-K respectievelijk. Slechts één patient met matige vermoeidheid en één controle-individu vertoonden helemaal geen HERV-aktiviteit. Er werd geen verband gezien betreffende HERV-detektie en ziekteduur.

Betreffende de mate van expressie (kwantitatieve analyse), onthulden ‘real-time’ resultaten dat HERV-W geen significante verschillen vertoonde wanneer de gezonde controles (HCs) of de twee M.E./CVS-groepen met elkaar werden vergeleken: M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.89), M.E./CVSm vs. HCs (p = 0.77), M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.95), alle M.E./CVS-patiënten vs. HCs (p = 0.78).

Anderzijds was er een significant verschil voor HERV-K expressie tussen de M.E./CVSm-groep en de HCs (p = 0.050). HERV-K aktiviteit was niet verschillend tussen de M.E./CVS-groepen: M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.12), M.E./CVS vs. HCs (p = 0.17). M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.97).

Bespreking

De meest erkende en veel-gebruikte definities (Fukuda & Canadese Consensus criteria) zijn gebaseerd op zelf-gerapporteerde symptomen. Studies aangaande energie-metabolisme, oxidatieve stress en immunologische wijzigingen bij M.E./CVS hebben een onevenwicht in al deze mechanismen aangetoond, maar het gebruik van dergelijke informatie voor diagnostische doeleinden is nog geen realiteit.

Hier werden HERV-K & -W transcripten gedetekteerd in alle onderzochte groepen, en we vonden dat HERV-K over-expressie vertoonde bij matige M.E./CVS. Het is mogelijk dat de immunologische, genetische expressie en metabole veranderingen verschillen naargelang de ernst van de ziekte.

De interaktie tussen endogene retrovirussen en het immuunsysteem is complex. ERVs maken deel uit van het gastheer-genoom en in theorie worden ze verondersteld te worden herkend als zelf-antigenen, en er zou een immuun-tolerantie moeten gevestigd zijn tijdens de vroege stadia van de ontwikkeling van het organisme. HERV-produkten kunnen echter interageren met componenten van het aangeboren immuunsysteem, leidend tot de aktivatie van pro-inflammatoire mechanismen of, in sommige bijzondere gevallen, hun suppressie. Bv. het syncytin-2 proteïne [van belang bij de ontwikkeling van de placenta] is een produkt van het ERV-FRD [endogeen retrovirus groep FRD] Enveloppe gen dat een immunosuppressieve rol speelt bij het voorkomen van de maternale immuun-respons tegen de foetus. In een ander scenario werd aangetoond, gebruikmakend van een psoriasis-model, dat een pro-inflammatoir milieu in staat kan zijn de expressie van repetitieve elementen, inclusief HERVs, te onderdrukken. Het zou redelijk zijn om te suggereren dat de immunologische intensifiëring die wordt gezien bij ernstiger M.E./CVS werkt via het verstillen van de HERV trans-aktivatie [gen-expressie getriggered door biologische of kunstmatige processen, via de expressie van een intermediair trans-aktivator proteïne] die optreedt bij matige gevallen. Dergelijke trans-aktivatie zou veroorzaakt kunnen worden door exogene virale replicatie of een ander nog niet gekende factor. Overéénkomstig hiermee vonden Montoya en z’n collega’s (2017) een cytokine-signatuur voor de ernst bij mensen met M.E./CVS. Ze toonden aan dat van de 17 cytokinen die met ernst gerelateerd zijn, er 13 pro-inflammatoir zijn en die (naast het verslechteren van de symptomen) de terugval van de HERV-K aktiviteit, naar waarden gelijkaardig aan deze die worden gezien bij gezonde individuen, kunnen veroorzaken. Het kan evenzo gebeuren met HERV-W, waarvan – ondanks het feit dat er geen significante waarden werden gevonden – er een lichte daling was bij mensen die ernstige M.E./CVS hadden, vergeleken met degene die matig waren aangetast.

Infektie wordt dikwijls beschouwd als een trigger voor M.E./CVS. Veel patiënten melden dat de vermoeidheid begon tijdens of kort na een een infektueuze ziekte. Een aantal pathogenen, inclusief virussen, werden geassocieerd met deze ziekte [zie Rasa S et al. hierboven]. En, omwille van de levenslange persistentie en breed cel-tropisme, werd de herpes-virus familie (bijzonderlijk HHV-6) door velen beschouwd als een mogelijke trigger voor M.E./CVS, zelfs al bleek een dergelijk verband niet consistent [Oakes B, Komaroff AL et al. Human Endogenous Retrovirus-K18 Superantigen Expression and Human Herpesvirus-6 and Human Herpesvirus-7 Viral Loads in Chronic Fatigue Patients. Clin Infect Dis. (2013) 56: 1394-1400]. Interessant: HHV-6 is net zoals andere herpes-virussen, ook in staat om HERVs te trans-aktiveren, bijzonderlijk HERV-K. Een dergelijke trans-aktivatie kan direct (door LTR-aktivatie door virale produkten [een ‘long terminal repeat’, lange DNA-sequentie dat een gen aan beide zijden flankeert; zorgt er voor dat het gen in het genoom wordt opgenomen; bij retrovirussen zorgt voor de integratie van het pro-virus (virus-DNA dat in het genoom van de gastheer is opgenomen)] of indirect (via transcriptionele binding-factoren en cytokinen geproduceerd bij virale replicatie) gebeuren. Het is mogelijk dat naar mate de ziekte vordert, wat ook de exogene infektie was die als triggerende factor kon optreden, deze gecontroleerd raakt, en bijgevolg, de trans-aktivatie van HERVs vermindert. Jammer genoeg hebben we geen serologische of molekulaire testen voor exogene virussen uitgevoerd.

Er werden eerder twee rapporten over HERV-aktiviteit bij M.E./CVS gepubliceerd maar de resultaten waren tegenstrijdig. In 2013 vonden een team rond Prof. Komaroff [Oakes et al.; zie hierboven] geen verschil qua expressie van HERV-K18 enveloppe bij mensen met M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. In hetzelfde jaar vonden een research-team rond een commercieel privé lab d.m.v. immunohistochemische methodes, immunoreaktiviteit [antilichamen; dus niet de sequenties zelf] tegen HERV-proteïnen (HERV-K, HERV-18, HERV-R & HERV-FRD) in dendritische cellen van de twaalfvingerige darm van individuen met de diagnose van het syndroom, suggestief voor het feit dat veranderingen qua expressie-patroon van endogene retrovirussen kunnen optreden bij M.E./CVS. De verschillen tussen de resultaten van Oakes et al. en de onze kunnen te wijten zijn aan de gebruikte methodes om HERV-K te detekteren. Hoewel het huidig werk gebruikt maakte van generische primers voor HERV-K (die de detektie van honderden elementen van de meeste sub-families toelaat), zocht het team van Oakes enkel naar transcripten van de HERV-K 18 enveloppe, met een methode specifiek voor dit bepaald element, waarbij alle resterende pro-virussen van de K-familie werden genegeerd. Aan de andere kant waren wij niet in staat na te gaan welke K-familie pro-virussen betrokken zijn bij de geobserveerde differentiële expressie.

De molekulaire methode die hier werd gebruikt om HERV-W te detekteren, was ook generisch en werd alom gebruikt in meerdere studies die differentiële expressie van dit element vonden bij pathologische aandoeningen, waaronder in het bloed, de hersenen en het cerebrospinaal vocht van patiënten met Multipele Sclerose (M.S.). Daarom, ondanks de gelijkenissen van een aantal symptomen en de sterke immunologische component van M.E./CVS en M.S., zijn de mechanismen verantwoordelijk voor HERV-reaktivatie bij die ziekten waarschijnlijk verschillend.

Tot besluit: dit is het eerste rapport dat verhoogde expressie van een endogeen retrovirus aantoont in het bloed van individuen met matige M.E./CVS. Hoewel de verhoogde expressie van deze retro-elementen niet direct geassocieerd is met de M.E./CVS-pathogeniteit, kan de observatie van dit fenomeen niet worden genegeerd.

————————-

In een ‘review-artikel’ (‘Epigenetic Components of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Uncover Potential Transposable Element Activation’ in Clinical Therapeutics; 2019) vonden Spaanse en Amerikaanse onderzoekers via een zoektocht in de literatuur met betrekking tot de epigenitica bij M.E.(cvs) bepaalde verbanden tussen ‘transposable elements’ (TEs) en epigenetische kenmerken. Ze bedachten een model met betrekking tot transcriptionele inductie van endogene ‘slapende’ transposons en gestruktureerde cellulaire RNA interakties, die de aktivatie van het aangeboren immuunsysteem triggeren zonder bijbehorende aktieve infektie.

Als voorbeelden voor het feit dat TE-aktiviteit een rol speelt bij belangrijke biologische funkties vermelden ze: HERV-H bij de handhaving en differentiatie van stamcel-pluripotentie, HERV-W & HERV-FRD enveloppe proteïnen bij immuun-tolerantie van de foetus, HERV-K gecodeerd Rec proteïne voor de bescherming van het embryo tegen virale infekties, enz.

Ze verwijzen ook naar studies die toonden dat uitdagingen zoals infekties, stress en veroudering TE-transcriptie aktiveren door het destabiliseren van epigenetische merktekens met mogelijks pathogene gevolgen. Het is dus plausibel dat afwijkende TE-aktivatie de kern is van de molekulaire mechanismen betrokken bij M.E.(cvs). Dit dient verder te worden onderzocht.

juni 9, 2019

Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:44 am
Tags: , , , , , , ,

Hieronder volgt nog een artikel van de groep rond Luis Nacul van de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB). Lees o.a. ook: ‘Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)’, ‘Blijvende vereiste voor een accurate M.E.(cvs)-diagnose & -definitie’ & ‘Selektie-bias & mis-klassificatie ondermijnen M.E.(cvs)’.

Er wordt al lang een dysfunktie van het immuunsysteem vermoed bij M.E.(cvs) maar de resultaten van immuun-studies spreken elkaar tegen. In onderstaande studie werd gekeken naar meerdere aspecten van de immuun-funktie van bloedcellen bij een grote groep mensen met de ziekte (waaronder zowat een vijfde die ernstig ziek zijn) en vergeleken met gezonde controles en mensen met Multipele Sclerose.

Er werd gecontroleerd op antilichamen tegen een aantal herpesvirussen (bv. Epstein-Barr) en er werd geen verschil gevonden tussen M.E.(cvs) en controles. Er werd ook gekeken naar immuun-cellen (o.a. T-cellen en NK-cellen). In tegenstelling tot wat andere onderzoekers vonden, bleken er geen verschillen wat betreft NK-cellen (M.E.(cvs) versus controles). Lees de op onze pagina’s besproken artikels over andere studies omtrent ‘Natural Killer’ cellen… Er zijn enkele verschillen (misschien te wijten aan het aanwenden van andere methodologieën en kleinere onderzoeksgroepen). Er wordt echter ook gewezen op het belang van blootstelling aan cytomegalovirus die significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie veroorzaakt.

Er werden ook geen verschillen gevonden in het globaal aantal T-cellen maar wel wat betreft de hoeveelheden van verschillende types T-cellen (M.E.(cvs) versus controles); wat dit betekent moet nog worden onderzocht. De meest betekenisvolle bevinding was het sterk gestegen aantal van een bepaald subtype T-cel, de zgn. ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT), bij de mensen met ernstige M.E.(cvs) t.o.v. controles. Deze bevinding alleen kan echter niet worden aangewend als een diagnostische merker maar het zou daartoe wel kunnen bijdragen, samen met andere factoren. MAIT-cellen worden voornamelijk in de lever, longen en darm gevonden en richten zich tegen cellen die geïnfekteerd zijn met bepaalde types bakterieën. Ze reageren ook op en produceren pro-inflammatoire cytokinen (cel-signalisering proteïnen), die al verhoogd bleken bij M.E.(cvs). MAIT-cellen zijn ook betrokken bij auto-immune ziekten. Het is interessant dat gestegen aantallen MAIT-cellen gezien werden na inspanning bij gezonde individuen. Dit suggereert dat M.E.(cvs)-patiënten een post-exercitionele toestand vertonen in rust. Het is mogelijk dat de toename in MAIT-cellen bij M.E.(cvs) wordt gestuurd door veranderingen van het darm-microbioom, maar dit dient ook nog te worden onderzocht.

De resultaten tonen een gewijzigde immunologische toestand aan bij M.E.(cvs). Het is de eerste keer dat sterk verhoogde aantallen MAIT-cellen bij ME.(cvs) worden gemeld en meer research is nodig om eventueel uit te wijzen of deze bijdragen tot de pathologie van de ziekte.

Ter herinnering: CD4 wordt gevonden op T helper cellen (en monocyten, macrofagen en and dendritische cellen), het is een co-receptor voor de T-cel (TCR) en helpt bij de communicatie met antigen-presenterende cellen. CD8 dient als co-receptor voor the T-cel receptor en komt voornamelijk tot expressie op cytotoxische T-cellen. De zgn. ‘memory’ T-cellen zijn een subset van de T-lymfocyten die infektie en kanker bestrijden die eerder het betreffend antigen zijn tegengekomen, en er dus ‘geheugen’ voor hebben…

————————-

Frontiers in Immunology (Pre-print Mei 2019)

Cellular immune function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

Jacqueline M. Cliff (1), Elizabeth C. King (1), Ji-Sook Lee (1), Nuno Sepulveda (1,2), Asia-Sofia Wolf (1), Caroline Kingdon (1), Erinna Bowman (1), Hazel M. Dockrell (1), Luis C. Nacul (1), Eliana Lacerda (1), Eleanor Riley (3)

1 Immunology and Infection Department, London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM), United Kingdom

2 Centro de Estatistica e Aplicacoes, Faculdade de Ciencias, Universidade de Lisboa, Portugal

3 Roslin Institute, University of Edinburgh, United Kingdom

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met onbekende etiologie, onduidelijke pathofysiologie en zonder beschikbare diagnostische test of biomerker. Veel patiënten melden dat hun M.E./CVS begon na een acute infektie, en een daaropvolgende hogere frequentie van infekties (zoals verkoudheden, griep) is courant. Deze factoren impliceren dat er een immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, ten minsten bij een deel van de patiënten, maar toch bleken eerdere studies aangaande de perifere immuniteit tegenstrijdig en niet éénduidig.

De Britse ‘ME/CFS Biobank’, die bloedstalen verzamelde van 300 klinisch-bevestigde M.E./CVS-patiënten, laat grootschalige studies toe van de immunologische funktie fenotypisch goed-gekarakteriseerde deelnemers. In deze studie werden de herpesvirus serologische toestand, en populaties T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten van 251 M.E./CVS-patiënten onderzocht, inclusief 54 die ernstig aangetast zijn, en vergeleken met die van 107 gezonde deelnemers en46 patiënten met Multipele Sclerose. Er waren geen verschillen qua seroprevalentie voor zes menselijke herpesvirussen tussen M.E./CVS en gezonde controles, hoewel de seroprevalentie voor het Epstein-Barr virus hoger was bij Multipele Sclerose patiënten. In tegenstelling met andere rapporten, werden geen significante verschillen gezien qua aantallen NK-cellen, hoeveelheden subtypes of in vitro responsiviteit tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Anderzijds was het T-cel compartiment veranderd bij M.E./CVS, met gedaalde hoeveelheden effector ‘memory’ CD8+ T-cellen en intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen. Omgekeerd was er een significant verhoogd deel ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) [zie hieronder], in het bijzonder bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten.

Deze abnormalitieiten tonen aan dat een gewijzigde immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, bijzonderlijk bij de mensen die ernstig zijn aangetast. Dit zou eenvoudigweg een lopende of recente infektie kunnen weerspiegelen, of toekomstige verhoogde vatbaarheid voor infektie kunnen aangeven. Er zijn longitudinale studies bij M.E./CVS-patiënten nodig om oorzaak en gevolg, en zodoende potentiële voordelen van immuun-modulerende behandelingen voor M.E./CVS te helpen bepalen.

INLEIDING

[…:] Ondanks de significante vooruitgang, blijft M.E./CVS nog slecht begrepen. Jammer genoeg blijken veel schijnbaar interessante research-bevindingen niet reproduceerbaar, ten dele omwille van de kleine groepen en de ‘cross-sectionele’ aard van veel studies, en de variabiliteit tussen studies wat betreft research-methodes en hun kwaliteit.

Acute virale infekties bleken frequent geassocieerd met de aanvang van M.E./CVS maar er is geen bevestiging van specifieke virale etiologie en er is geen consistent verband tussen persistente of chronische virus-infektie en M.E./CVS. Eén mogelijkheid is dat mensen met M.E./CVS (PWME) vatbaar zijn voor acute virale infekties ten gevolge een onderliggende immuun-dysfunktie. Er werden talrijke immuun-abnormaliteiten, inclusief gewijzigde plasma cytokine-profielen, abnormale T-lymfocyt aktivatie en verstoorde cytotoxische respons, beschreven bij individuen met M.E./CVS maar systematische en observationele studies waren niet in staat om robuuste en reproduceerbare immuun-biomerkers voor ziekte of ziektegraad te identificeren [bv. Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116].

Er zijn een aantal rapporten over inconsistente abnormaliteiten qua ‘natural killer’ (NK) cel funktie. NK-cellen zijn grote granulaire lymfocyten die funktioneren als effectoren van de aangeboren immuniteit die, d.m.v. cytokine-produktie of cytotoxiciteit, infekties (of neoplasieën [vorming van goed- of kwaadaardige gezwellen door cel-vermeerdering]) binnen de perken houden tot een doeltreffende adaptieve respons kan worden opgezet. Individuen met overgeërfde NK-cel aandoeningen zijn zeer vatbaar voor systemische herpesvirus- en andere opportunistische infekties. Directe NK-cel aktivatie volgt op interaktie met cellen waarop ‘major histocompatibility complex’ (MHC [genen die coderen voor membraan-proteïnen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]) klasse-I liganden voor inhiberende NK-cel receptoren ontbreken en/of waarop stress-geïnduceerde liganden voor NK-cel aktiverende receptoren tot expressie komen. Indirecte NK-cel aktivatie treedt op na microbiële ligatie van patroon-herkenning receptoren [binding van bakterie-antigenen op receptoren die bepaalde proteïnen herkennen] […] en wordt gemedieerd door cytokinen (IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α) en contact-afhankelijke stimuli. Er werd meermaals gerapporteerd dat PWME verhoogde, gedaalde of normale aantallen circulerende NK (CD16+ of CD56+ [menselijke NK-cellen kunnen worden onderverdeeld in verschillende populaties op basis van de expressie van de oppervlakte-merkers CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG) & CD56 (neurale cel-adhesie molekule)], CD3[T cel co-receptor die cytotoxische T-cellen en T helper cellen helpt aktiveren]) cellen vertonen; hun NK-cellen zijn naar verluidt ontoereikend [Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11] of vertonen versterkte expressie van het cytotoxisch perforine [Brenu EW et al. Pilot study of natural killer cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis. Scand J Immunol. (2016) 83: 44-51]; zijn minder (of onvolledig) in staat MHC klasse-I deficiënte ‘target’-cellen te lyseren [bv. Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]; en vertonen een defekte of geen upregulering van aktivatie-merkers na in vitro stimulatie. Nogmaals: de reproduceerbaarheid van veel van deze studies werd beperkt door hun relatief beperkte grootte, de diverse klinische presentaties van de gevallen of de beperkte mate immunologische karakterisatie.

Belangrijk: slechts één van deze immunologische studies [Rivas JL et al. Association of T and NK cell phenotype with the diagnosis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol. (2018) 9:1028.] hield rekening met de prevalentie van menselijk cytomegalovirus (CMV) infektie bij gevallen en controles. CMV-infektie laat een permanente voetafdruk op het immuunsysteem na, inclusief oligoclonale expansie [proliferatie afgeleid van één of enkele cellen] en terminale differentiatie [cellen stoppen de celcyclus permanent en brengen genen tot expressie die karakteristiek zijn voor de uiteindelijke funktie van die cellen] van CD8+ T-cellen, en expansie van een subset sterk gedifferentieerde NKG2C+ NK-cellen [NKG2C = membraan-proteïne; binding met z’n ligand HLA-E stuurt de expansie van een subset NK-cellen in respons op virale infekties]; deze NK-populatie wordt verder uitgebreid door latere virale infektie. Het blijft daarom mogelijk dat de gerapporteerde verschillen qua T-cel & NK-cel fenotype en funktionele capaciteit tussen PWME en gezonde controles het resultaat kunnen zijn van verschillen wat betreft de prevalentie van immuun-modulerende virussen zoals CMV. We rapporteren hier over een diepgaande analyse van perifeer bloed leucocyten-fenotype en -funktie bij een klinisch goed-gedefinieerde groep matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-gevallen vergeleken met niet-vermoeide gezonde controles en, ter controle voor verminderde fysieke aktiviteit, mensen met Multipele Sclerose. Alle deelnemers werden gescreend voor serologisch bewijsmateriaal voor infekties met humaan cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), herpes simplex virus 1 (HSV1), Herpes simplex virus 2 (HSV2), varicella-zoster virus (VZV) en humaan herpesvirus (HHV6).

MATERIALEN & METHODES

Recrutering en klinische evaluatie

[…] Alle potentiële deelnemers werden rigoureus beoordeeld om te verzekeren dat ze voldeden aan de definities voor M.E./CVS. […]

Alle deelnemers met M.E./CVS of MS hadden voorafgaandelijk een bevestigde medische diagnose gekregen. […] De PWME werden opnieuw beoordeeld door de klinische research staf op het voldoen aan de Canadese Consensus en/of CDC-1994 (“Fukuda”) criteria (de definities van de studie) [punt van kritiek: de Fukuda definitie vereist geen post-exertionele malaise; anderzijds: we verwachten dat ernstig zieken wel PEM hebben], vóór recrutering. De deelnemers werden uitgesloten al ze (i) 3 maand voorafgaand aan de studie antivirale medicatie hadden genomen die de immuun-funktie wijzigt; (ii) 3 maand voorafgaand aan de studie vaccinaties hadden gekregen; (iii) een voorgeschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekte zoals hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV (maar niet herpesvirus- of andere retrovirus-infektie) hadden; (iv) een andere chronische ziekte zoals kanker, coronaire hart ziekte of ongecontroleerde diabetes hadden; (v) een ernstige stemming-aandoening hadden; (vi) zwanger waren of borstvoeding gaven 12 maanden voorafgaand aan de studie; of (vii) morbide obees (BMI ≥ 40) waren. […] De ernstig zieke deelnemers werden thuis bezocht. […]

Berekening van de statistische ‘power’

404 deelnemers: 251 met M.E./CVS (54 ernstig en 197 matig zieken), 46 met MS en 107 gezonde controles. […]

Afname & verwerking van de stalen

[…]

Fenotypering van de leukocyten

[cultuur / trypaan-blauw vitaliteit-kleuring / fenotypering (flow-cytometrie) of cultuur voor funktionele analyse]

Funktionele testen

[cel-stimulatie / incubatie met antilichamen / flow-cytometrie]

Analyse van de gegevens

De primaire gegevens analyse omvatte vier groepen: mensen met milde/matige M.E./CVS (ME-M), mensen met ernstige M.E./CVS (ME-S), gezonde controles (C) en mensen met Multipele Sclerose (MS). Alle gegevens-analyses werden blind uitgevoerd (groepen geïdentificeerd d.m.v. een code-number; code verbroken enkel nadat alle analyses compleet waren).

[…]

RESULTATEN

Karakteristieken van de deelnemers aan de studie

De uiteindelijke groep omvatte 251 mensen met M.E./CVS (197 mild/matig & 54 ernstig), 46 mensen met MS en 107 gezonde controles. […] Symptomen die typisch verbonden zijn met infektie of inflammatie kwamen frequenter voor en waren ernstiger bij PWME dan bij MS-patiënten, hoewel er milde inflammatie-symptomen aanwezig waren bij bijna 50% van de mensen met MS. De meeste gezonde controle vertoonden geen enkel symptoom (P < 0.0001). De vermoeidheidgraad-scores lagen, zoals verwacht, hoger bij PWME, met een trend voor hogere scores bij de ernstig zieken, gevolgd door mensen met milde/matige M.E./CVS, dan MS-patiënten en gezonde controles met zeer lage vermoeidheid-scores (P < 0.001). De erythrocyten-sedimentatie-snelheid (ESR), een niet-specifieke merker voor inflammatie, was lichtjes verhoogd bij mensen met milde/matige M.E./CVS, en er waren gelijkaardige mediane waarden voor alle andere groepen (P = 0.01). Mensen met MS waren ietsje ouder vergeleken met de andere studie-groepen maar de verdeling per geslacht, deprivatie-index [maat voor de socio-economisch status] en totale witte bloedcellen en lymfocyten was gelijkaardig voor de groepen.

Serologie

De plasma-stalen werden getest (kwantitatieve ELISA) voor zes humane herpesvirussen: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV & HHV6. Er waren geen significante verschillen tussen de groepen qua aantallen individuen die seropositief waren voor deze virussen. De concentraties anti-EBV VCA varieerden echter significant onder de groepen (P = 0.016) en dit was te wijten aan hogere concentraties anti-EBV VCA antilichamen bij de mensen met MS.

Leucocyten-fenotypering

Ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen werden ontdooid en geanalyseerd d.m.v. flow-cytometrie […]. Er werd een ruim leucocyten-venster ingesteld om alle levende cellen te omvatten en daarna een meer beperkend lymfocyten-venster. Binnen het leucocyten-venster werden de monocyten […] en dendritische cellen [DC; antigen-presenterende die antigenen verwerken en deze aanbieden aan T-cellen; ze fungeren als boodschappers tussen het aangeboren en adaptief immuunsysteem] – myeloïde [van het aangeboren immuunsysteem] of plasmacytoïde [sekreteren interferon in respons op virale infektie; circuleren in het bloed en worden gevonden in perifere lymfoïde organen] […] – geïdentifceerd. Binnen het lymfocyten-venster: de T-cellen […], B-cellen […] en ‘natural killer’ (NK) cellen […]. De NK-cellen werden daarna geanalyseerd voor expressie van of NKG2C [zie hierboven], NKp46 [‘Natural cytotoxicity triggering receptor 1’] en CD57 [antigen dat terminaal gedifferentieerde cellen met gereduceerd proliferatie-vermogen identificeert].

Uit een statistische analyse bleek dat er significante verschillen waren tussen de groepen qua hoeveelheden levende leucocyten die monocyten (P = 0.0133), myeloïde DCs (P < 0.0121) en plasmacytoïde DCs (P < 0.0001) waren: deze verschillen waren te wijten aan veranderde frequenties bij de MS-patiënten, en verdwenen na aanpassing voor geslacht, leeftijd en herpesvirus seropositiviteit (niet getoond). In tegenstelling daarmee bleken de hoeveelheden leucocyten die B-cellen, T-cellen of NK-cellen waren, niet significant verschillend tussen de groepen (noch bij aangepaste of niet-aangepaste analyse).

Binnen het lymfocyten-venster waren de hoeveelheden cellen CD4+ T-cellen of CD8+ T-cellen (en, bijgevolg, de CD4/CD8-verhouding) significant verschillend tussen de groepen bij niet-aangepaste analyse (P < 0.0001) en deze verschillen beleven na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren (P < 0.0001). Deze verschillen waren echter volledig te wijten aan de significant hogere hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere hoeveelheden CD8+ T-cellen en dus hogere CD4/CD8-verhouding bij de MS-patiënten; er waren geen significante verschillen qua lymfocyten-distributie tussen ME/CFS-patiënten en gezonde controles. Ook waren er geen significante verschillen tussen de groepen qua absolute aantallen van de verschillende leucocyten- en lymfocyten-populaties.

Een meer gedetailleerde fenotypering van de circulerende T-cel populatie onthulde geen belangrijke verschillen qua verdeling van CD45RA [CD45 = merker voor naïeve T-cellen] en CCR7 [C-C chemokine receptor type 7] -gedefinieerde naïeve en ‘memory’ T-cel populaties. Bij een meer gedetailleerde fenotype-analyse van de CD4+ en CD8+ T-cellen op basis van CD28 [zorgt voor co-stimulatie signalen vereist voor T-cel aktivatie en overleving] en CD57 [zie eerder] naast CCR7 en CD45RA, vonden we dat er geen verschillen waren qua CD4+ T-cel differentiatie subpopulaties bij mensen met M.E./CVS, hoewel er veranderde cel-populatie frequenties waren bij mensen met MS. Er werden echter bescheiden verschillen gezien in meerdere differentiatie-populaties van de CD8+ T-cellen, met een kleine toename van de hoeveelheid EM [effector ‘memory’ (zie onze inleiding)] -cellen […] en een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde cytotoxische effector TEMRA-cellen [effector ‘memory’ T-cel die CD45RA tot expressie brengt] […] bij mensen met M.E./CVS. Er waren ook kleine veranderingen in andere [minder belangrijke] CD8+ T-cel populaties […].

Van groter potentieel belang echter, was dat we – gebruikmakend van TCR Vα7.2 [deel van T-cel recpetor] en CD161 [‘killer’ cel lectine-achtige receptor subfamilie-B, lid-1] om circulerende populaties ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) te definiëren – zeer significante verschillen zagen tussen de groepen wat betreft de hoeveelheid T-cellen die MAIT-cellen zijn en de hoeveelheid MAIT-cellen die CD8 tot expressie brengen (P < 0.001). Na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren, onthulde statistische analyse dat dit te wijten was aan verhoogde hoeveelheden MAIT-cellen (P < 0.001) en bijzonderlijk CD8+ MAIT-cellen, bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. gezonde controles (P < 10-5). Belangrijk is echter dat, hoewel de globale hoeveelheden MAIT-cellen niet hoger waren bij mensen met MS dan bij gezonde controles, hun MAIT-cellen ook sterk scheefgetrokken waren naar de CD8+ subset; wat aangeeft dat dit is geen diagnostisch kenmerk voor ernstige M.E./CVS is. ROC-analyse toonde dat de totale MAIT-cel frequentie in de T-cel populatie een zwak vermogen had om patiënten met ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonde controles, maar dat de patiënten met milde/matige M.E./CVS niet door deze meting konden worden voorspeld. Mogelijks belangrijker: de hoeveeheid MAIT-cellen die CD8+ waren, hadden een groter vermogen om ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonden (AUC 0.756). [ROC-analyse is een statistische methode om de voorspellende waarde van een variabele of instrument te toetsen; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] Overéénkomstig met eerdere rapporten had de overgrote meerderheid van de MAIT-cellen bij alle individuen een ongedifferentieerd (CD28+ CD57 [zie hierboven]) fenotype.

Als we in meer detail kijken naar het fenotype van de NK-cel populatie, zagen we geen significante verschillen qua hoeveelheden CD56bright cellen, verdeling van CD57, CD57+ of CD57++ cellen of hoeveelheden cellen die NKG2C of NKp46 tot expressie brengen, of wat betreft expressie van zes verschillende ‘killer’ cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIR [receptoren op het oppervlak van NK-cellen waarmee ze ‘self’ MHC klasse-I molekulen (KIR-liganden) op het cel-oppervlak herkennen om dan een inhiberend signaal te geven om zo de eliminatie van normale cellen te voorkomen]) (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

T-cel & NK-cel funktie

We vergeleken daarna het vermogen van T-cellen en NK-cellen om te reageren op in vitro stimulatie, van gezonde controles, mensen met MS en PWME. Voor het bepalen van de of T-cel responsiviteit, werden PBMCs gedurende 4 h gecultiveerd met de mitogene cocktail [molekulen die cellen aanzetten tot delen] van PMA en ionomycine, en dan gekleurd voor intracellulaire cytokinen. De hoeveelheid cellen die IL-2, IFN-γ of een combinatie van de twee produceren, werd beoordeeld voor de CD3+ CD4+ en de CD3+ CD8+ cel-populaties maar er werden geen significante verschillen geobserveerd (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

De NK-cel funktie werd beoordeeld via het cultiveren van PBMCs gedurende 18 h […]. De CD3/CD56+ NK-cellen werden geïsoleerd en geanalyseerd voor intracellulair IFN-γ, of voor cel-oppervlakte expressie van de aktivatie-merker CD25 [IL-2 receptor α-keten] of de degranulatie-merker CD107a (LAMP-1 [lysosomaal geassociaeerd membraan proteïne 1]). Weerom werden geen significante verschillen gedetekteerd tussen mensen met M.E./CVS en controles, voor geen enkele van de responsen.

Interaktie tussen herpesvirus-infektie toestand en lymfocyten-fenotype en -funktie

Herpesvirus-infektie, vooral infektie met CMV, staat er om bekend zowel het maturatie-fenotype en de funktie van menselijke CD8+ T-cellen en NK-cellen te beïnvloeden. Daarom vergeleken we lymfocyten-fenotype en funktie bij die individuen die seropositief of niet voor CMV waren. In alle studie-groepen hadden deelnemers die CMV-seropositief waren, significant minder CD4+ en meer of CD8+ T-cellen bij hun PBMCs. Na stimulatie met PMA en ionomycine, produceerden meer CD4+ en CD8+ T-cellen IFN-γ, en meer cellen waren IL-2 en IFN-γ dubbel-positief, bij de CMV-seropositieve individuen. Het deel van de PBMCs die CD3+CD56+ (‘NKT-like’) cellen waren, was zeer significant verhoogd bij de CMV-positieve deelnemers. In de NK-cel populatie, waren meer cellen NKG2C+, en er waren gedaalde hoeveelheden CD56dimCD57intermediate en verhoogde hoeveelheden CD56dimCD57bright bij de CMV-seropositieve deelnemers. Bij de CMV-seropositieve individuen was er een verminderde in vitro respons na IL-12 en IL-18 stimulatie, met significant gedaalde CD25, CD107 en IFN-γ expressie.

BESPREKING

In een groep van 250 goed-gekarakteriseerde mensen met M.E./CVS, waaronder een aantal die ernstig ziek zijn, hebben we verschillen geïdentificeerd qua fenotype van perifere immuun-cellen in vergelijking met gezonde controles. Deze omvatten zeer significant verhoogde hoeveelheden ‘mucosal associated invariant’ T-cellen, bijzonderlijk CD8+ MAIT cellen, in PWME t.o.v. gezonde controles, en deze waren verder gestegen bij ernstig zieke individuen. We vonden ook een verhoogd aandeel van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen, een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde effector TEMRA cellen en kleine veranderingen qua CD8+ T-cel differentiatie subcompartimenten bij PWME. De funktionele rol en consequentie van de wijziging binnen deze CD8+ T-cel subpopulaties dient nog te worden bepaald. We vonden geen bewijs voor veranderde funktie van T-cellen bij PWME. Van belang: we vonden geen verschillen qua hoeveelheden NK-cellen bij PWME noch wat betreft differentiatie-toestand, hun expressie van KIR-receptoren of aktivatie-merkers ex vivo of na in vitro stimulatie. Op basis van eerdere rapporten over abnormale NK-cel funktie bij M.E./CVS was dit een onverwachte bevinding, hoewel het consistent is met een klein aantal eerdere rapporten over normale NK-cel hoeveelheden en funktie. In ons systeem, cultiveerden we PBMCs gedurende 18 h om genoeg tijd te geven voor directe en indirect cel-aktivatie: het is mogelijk dat verschillen qua degranulatie of cytokine-produktie worden gezien bij een kortere stimulatie-periode. We vonden echter significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie bij deelnemers in alle klinische groepen die CMV-positief waren, detekteerbaar na de 18 h cultuur. CMV heeft een dramatisch effekt op NK-cellen en het is mogelijk dat een onzekere CMV-status een verstorende factor was die ten gronde ligt aan eerdere meldingen van NK-cel dysfunktie bij M.E./CVS. Belangrijk: de verschillen die we zagen qua MAIT-cellen en CD8+ T-cellen bij PWME waren consistent wanneer we CMV sero-status in rekening brachten.

M.E./CVS wordt dikwijls beschouwd te worden getriggerd door een acute virale infektie en verscheidene leden van de herpesvirus-familie bleken betrokken. Hier vonden we geen verschil qua prevalentie van de seropositiviteit voor zes herpesvirussen (CMV, EBV, HSV-1, HSV-2, VZV, HHV6) tussen PWME en gezonde controles, noch qua concentratie van aanwezige anti-virus antilichamen. Niettemin blijft de mogelijkheid bestaan dat herpesvirussen belangrijk zijn voor de M.E./CVS-pathogenese, dat virus-reaktivatie een verslechtering van symptomen kan triggeren, en dat meting van antilichaam-titers tegen andere virale antigenen een meer relevante meting kunnen betekenen [Loebel M et al. Deficient EBV-specific B- and T-cell response in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE. (2014) 9: e85387]. Dus: hoewel de sero-prevalentie van EBV niet verschilde tussen MS-patiënten, PWME of gezonde controles, hadden MS-patiënten significant hogere titers van antilichamen tegen EBV ‘Viral Capsid Antigen’, overéénkomstig met eerdere rapporten en een mogelijke aanwijzing voor recente virus-reaktivatie.

De verhoogde frequentie van of CD8+ MAIT-cellen bij individuen met ernstige M.E./CVS die hier werd gezien, werd niet eerder gerapporteerd. In het bijzonder: een klein aantal ernstig zieke M.E./CVS-patiënten had buitengewoon hoge hoeveelheden van deze cellen. Er werd gemeld dat de hoeveelheden perifere MAIT-cellen bij gezonde vrijwilligers verdubbelen na acute inspanning, suggererend dat het perifeer immuun-fenotype in rust bij sommige PWME lijkt op een post-exertionele toestand. Meer opmerkelijk was echter de overweldigende overheersing van CD8+ cellen in de MAIT-cel populatie bij ernstig zieke PWME. Daarenoven: hoewel de globale frequenties van MAIT-cellen niet verschilden tussen MS-patiënten en gezonde controles, waren hun MAIT-cellen ook sterk aangerijkt voor CD8+ cellen, wat een eerder rapport over hoge frequenties CD8+ CD161+ T-cellen bij MS-patiënten bevestigt. MAIT-cellen zijn aangeboren-achtige T-cellen die met vitamine-B gerelateerde antigenen van microben (gepresenteerd in de context van het MHC klasse-I gerelateerd molekule ‘MR1’) herkennen en ook kunnen reageren op cytokine-stimulatie. CD8+ MAIT-cellen zijn in staat geïnfekteerde cellen te doden via perforine/granzyme-sekretie en hebben daarom een beschermende rol bij microbiële infekties, maar ze bleken ook geïmpliceerd bij de pathologie van verscheidene niet-infektueuze ziekten zoals kanker, colitis en auto-immune ziekten zoals Reumatoïde Artritis en type-1 diabetes. Bij MS werden deze cellen beschreven als pro-inflammatoir en pathogeen. Het is mogelijk dat de toename qua MAIT-cellen bij sommige PWME wordt aangedreven door veranderingen in het darm-microbioom of, alternatief, gerelateerd kunnen zijn met andere, nog niet gekarakteriseerde wijzigingen in het immuunsysteem. In toekomstige studies kan het funktioneel fenotype van deze CD8+ MAIT-cellen bij PWME worden nagegaan, om te bepalen of ze misschien bijdragen tot de ziekte-pathologie. Het darm-microbioom bij M.E./CVS dient ook verder te worden onderzocht. Er kan eventueel een biomerker-signatuur worden ontwikkeld voor de diagnose van M.E./CVS: in deze context had het aandeel CD8+ MAIT-cellen in het perifeer bloed op zich een bescheiden onderscheidend maar het zou kunnen bijdragen tot combinatie-factor signatuur. In dit opzicht zal het testen van kandidaat biomerker-signaturen in grote, onafhankelijke, longitudinale validatie-groepen essentieel zijn; bijzonderlijk als we de gemengde rapporten over het biologisch fenotype van M.E./CVS in overweging nemen.

De reden voor de gewijzigde frequenties van verscheidene intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen bij M.E./CVS is onduidelijk en is waarschijnlijk funktioneel gelinkt met de begeleidende vermindering van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen. Aangezien er geen verschil was in de frequentie van of naïeve of terminaal gedifferentieerde CD8+ T-cellen, is het mogelijk dat bij M.E./CVS de cellen snel door deze intermediaire fase naar terminale differentiatie wordt gestuurd en dan verloren gaan via cel-dood. Het studie-ontwerp liet ons niet toe om de interaktie tussen het versterkt MAIT-cel compartiment en de gewijzigde globale T-cel differentiatie status na te gaan: dit kan worden aangepakt in toekomstige studies. De aandrijvende factor achter de snellere transitie naar terminale differentiatie zou een aan de gang zijnde antigen-stimulatie kunnen zijn, mogelijks te wijten aan persistente virale infektie of auto-immuniteit. De gereduceerde effector ‘memory’ T-cel populaties bij PWME kunnen gedeeltelijk de verhoogde vatbaarheid voor infektie, die courant wordt gerapporteerd bij ME./CVS, verklaren.

De hoeveelheden CD4+ en CD8+ T-cellen waren normaal bij PWME. Bij MS-patiënten was er echter een significante verschuiving naar verhoogde hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere CD8+ T-cellen een daardoor een verhoogde CD4+/CD8+ T-cel verhouding. Voorheen waren er tegenstrijdige rapporten bij PWME, met verhoogde of verlaagde CD4+/CD8+ T-cel ratios, hoewel heterogeniteit courant is en mogelijks verstoring door de CMV-infektie status optreedt.

Samengevat: in een grote groep zorgvuldig gefenotypeerde mensen met M.E./CVS, hebben we significante verschillen qua perifere T-lymfocyt fenotypes vastgesteld maar we waren niet in staat eerdere rapporten over verstoord NK-cel fenotype of funktie te bevestigen. Belangrijk: voor deze studie waren individuen met bewijs voor een aan de gang zijnde acute infektie uitgesloten, alsook deze met voor de hand liggende co-morbiditeiten en deze die immuun-modulerende medicijnen nemen. We bevestigden ook dat CMV-seropositiviteit een belangrijke impact heeft op het fenotype en funktie van NK-cellen en T-cellen, wat het opperste belang onderlijnt van het beoordelen van de status van CMV- en andere herpesvirus-infektie bij studies betreffende de menselijke immune toestand. Elk van deze factoren had de analyse van eerdere studies kunnen verstoren. De meest opvallende bevinding van deze studie – de verhoogde hoeveelheid circulerende MAIT-cellen bij mensen met ernstige M.E./CVS, en de zeer grote proportie CD8+ MAIT-cellen bij patiënten met ernstige M.E./CVS en MS – rechtvaardigt verder onderzoek. Deze observatie onderstreept ook het belang van het opnemen van niet-vermoeide individuen met andere invaliderende ziekten (zoals MS-patiënten) in studies omtrent M.E./CVS, om te controleren voor de fysiologische effekten van verminderde lichamelijke aktiviteit. Hoewel men kan discussiëren over het feit of MS-patiënten de meeste geschikte dergelijke groep is, vergemakkelijkt de zeer grote immunologische database voor MS het evalueren van observaties en kan het inzicht verschaffen in de pathogenese-mechanismen van M.E./CVS door vergelijking met een meer uitgebreid gedocumenteerde ziekte.

————————-

Prof. dr Derya Unutmaz (immunoloog) van het ‘Jackson Laboratory ME/CFS Collaborative Research Centre’ – co-auteur van ‘Tuning of human MAIT cell activation by commensal bacteria species and MR1-dependent T-cell presentation’ (Mucosal Immunology (2018) 11, 1591-1605) – speculeerde (‘Nature News Feature’ 3 Januari 2018) dat de inflammatie die wordt gezien bij M.E.(cvs) het resultaat zou kunnen zijn van een probleem bij de T-cel respons op onschadelijke virussen, schimmels en andere stimuli. Een andere co-auteur van dit artikel, Dr. Julie Oh, sprak op de ‘Accelerating Research on ME/CFS Meeting’ (NIH conferentie, 2019) over research naar welke bakterie-soorten/-stammen de aanmaak van die bepaalde T-cellen, MAIT-cellen, zouden kunnen triggeren en hoe die ev. kan worden afgezet. Unutmaz kreeg van het ‘National Institutes of Health’ geld ter beschikking om onderzoek te verrichten bij M.E.(cvs). Publicaties bij M.E.(cvs) zijn er op dit moment nog niet…

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

juni 23, 2017

EBV in ectopische lymfoïde aggregaten als pathogenese voor M.E.(cvs)?

Filed under: Immunologie,Neurologie — mewetenschap @ 3:07 pm
Tags: , , , , , , , ,

Willy Bjarne Eriksen, een arts/onderzoeker van het ‘Norwegian Institute of Public Health’, heeft mensen met M.E.(cvs) in z’n familie, vandaar dat hij “duizenden” wetenschappelijke publicaties over de aandoening heeft gelezen. Dat heeft geleid tot de hypothese die hij in onderstaand artikel publiceerde. In een interview liet hij optekenen: “Dit zou de meerderheid van de gevallen die voldoen aan de Canadese criteria kunnen verklaren. Het cruciaal gegeven is dat lymfoïde aggregaten (zeg maar opéénhopingen van cellen uit de lymfocyten-famile) in zenuw-strukturen van de patiënten gekoloniseerd worden door lymfocyten die geïnfekteerd zijn met het Epstein-Barr virus.”.

De hypothese is consistent met de resultaten van metaboloom-studies (bv. Naviaux et al.) alsook met de (preliminaire) bevindingen van prof. Ron Davis (De vader van een M.E.(cvs)-patient en directeur van het ‘Stanford Genome Technology Centre’ die bezig is met de ontwikkeling van een diagnostische test, de zgn. “nano-naald biosensor”. De werk-hypothese van het team van Davis is dat er bij M.E.(cvs) een probleem is met de glycolyse en ze vermoeden dat er iets mis is met het enzyme pyruvaat-kinase. – Een Noors team denkt aan pyruvaat-dehydrogenase)…

De zenuw-strukturen waarvan sprake (voor de aggregatie van lymfoïde cellen) zijn de zgn. ‘dorsal root’ ganglia. Dr Abhijit Chaudhuri (een neuroloog gespecialiseerd in M.E.) vond ooit al ernstige inflammatie van de ‘dorsal root ganglia’ (de plaats waar zenuwen het ruggemerg binnenkomen) bij een overleden persoon met M.E.(cvs). Deze en andere veranderingen maakten het voor hem duidelijk dat er sprake is van een neurologische aandoening; ze komen niet voor bij psychiatrische aandoeningen.

Nancy Klimas en haar collega’s hebben gepubliceerd (Journal of Chronic Fatigue Syndrome in 2001) over een mogelijkheid om het probleem op te lossen (een “interessante maar ongecontroleerde test”) en ook deze bevindingen zijn consistent met de hypothese. Het betreft een methode waarbij de immuuncellen van de patient zelf (“autoloog”) in het lab worden voorbereid/getraind om tegen EBV te vechten en dan teruggegeven (EBV-specifieke T-lymfocyten). In het kort: er wordt bloed afgenomen, de cellen worden geïsoleerd en geaktiveerd met synthetische EBV-antigenen; de cellen gaan in cultuur om ze te laten prolifereren (vermenigvuldigen); de T-lymfocyten worden geïsoleerd (ev. bewaard) en dan intraveneus terug toegediend.

————————-

Med Hypotheses. (2017) 102: 8-15

The spread of EBV to ectopic lymphoid aggregates may be the final common pathway in the pathogenesis of ME/CFS

Eriksen W

Domain for Mental and Physical Health, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway

Samenvatting

Volgens de hypothese die hier wordt gepresenteerd, beslaat de ontwikkeling van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) 3 stappen: Stap 1 wordt gekenmerkt door de aggregatie van lymfoïde cellen in ‘dorsal root ganglia’ [enk. ‘ganglion’; plaats waar sensorische zenuwen het ruggemerg binnenkomen; nodule in een dorsale ruggemerg-zenuwtak met cel-lichamen van neuronen die impulsen van receptoren of organen naar het CZS sturen] of andere zenuw-strukturen. Deze formatie van ectopische [op andere plaatsen dan normaal] lymfoïde aggregaten [groepjes lymfocyt-achtige cellen] kan worden veroorzaakt door een acute infektie, asymptomatische reaktivaties van courate neurotropische virussen, blootstelling aan een neurotoxine of fysiek letsel aan perifere zenuwen. Stap 2: met Epstein-Barr virus (EBV)-geïnfekteerde lymfocyten of monocyten brengen EBV van de circulatie naar één of meerdere van deze lymfoïde aggregaten, waarna cel-naar-cel transmissie van EBV en proliferatie van latent EBV-geïnfekteerde lymfocyten leiden tot de aanwezigheid van veel EBV-geïnfekteerde cellen in de lymfoïde aggregaten. De EBV-geïnfekteerde cellen in de aggregaten doen een inflammatie ontbranden in het omringende zenuw-weefsel. Deze lokale inflammatie lokt, op zijn beurt een golf uitvan gliale cel aktivatie die zich verspreidt van het EBV-geïnfekteerd gebied naar delen van het zenuwstelsel die niet met EBV geïnfekteerd zijn, waardoor de neuron-glia interaktie in zowel het perifeer als het centraal wordt verstoord. Stap 3: immuun-cel uitputting draagt bij tot het consolideren van de pathologische processen. Er is wellicht een geneeswijze: infusie van autologe EBV-specifieke T-lymfocyten kan misschien de EBV-geïnfekteerde cellen uit het zenuwstelsel verwijderen.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een aandoening (of misschien 2 of meerdere aandoeningen) die wordt gekenmerkt door ernstige vermoeidheid en meerdere andere symptomen (pijn, concentratie-problemen, post-exertionele malaise, en een persistent of terugkerend ‘griep-achtig’ gevoel. Het begint gewoonlijk in de adolescentie of bij jong-volwassenen. De etiologie is onduidelijk maar er werden veel hypothesen naar voor gebracht. Meerdere auteurs hebben gesuggereerd dat M.E./CVS het finaal gemeenschappelijk pad kan zijn van processen die worden aangezet door verscheidene triggers [HPA-as dysfunktie, neuromuscuaire belasting, enz.].

Tijdens de jaren ‘80 en ’90 was er een sterke interesse voor de mogelijke rol van het Epstein-Barr virus (EBV) in de pathogenese van M.E./CVS. Studies toonden aan dat ongewone antilichaam-titers tegen EBV-antigenen frequenter voorkwamen bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles, suggestief voor verhoogde EBV-aktiviteit. Men was er zich ook bewust van geworden dat een significant deel van de patiënten met infektueuze mononucleose [I.M.; ‘klierkoorts’, ‘kissing-disease’, ziekte van Pfeiffer; infektie-ziekte die wordt veroorzaakt door het Epstein-Barr virus] een M.E./CVS-achtige aandoening ontwikkelden, hoewel de link tussen I.M. en M.E./CVS pas meerdere jaren later grondig werd gedocumenteerd.

De interesse voor de EBV-connectie taande, omwille van meerdere redenen: 1) Verschillen qua EBV-serologie tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden niet in alle studies vastgesteld. 2) Ongewone EBV-serologie werd ook gezien bij sommige gezonde personen en veel M.E./CVS-patiënten hadden een normale EBV-serologie. 3) Enkele studies suggereerden dat EBV in de keel en het bloed niet méér werden gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles. 4) Sommige studies suggereerden dat M.E./CVS-patiënten verhoogde antilichaam-titers kunnen hebben, ook tegen meerdere andere courante virussen, wat de mogelijkheid oproept dat een “niet-specifieke polyclonale B-lymfocytische respons” aanwezig was. 5) Een placebo-gecontroleerde studie met 24 M.E./CVS-patiënten toonde geen effekten na 5 weken acyclovir. 6) Het kan moeilijk vallen te geloven dat een hoofdzakelijk lymfotroop virus zoals EBV alle M.E./CVS-symptomen zou veroorzaken. 7) Het werd steeds duidelijker dat M.E./CVS kan beginnen in connectie met veel soorten gebeurtenissen, inclusief acute infekties met meerdere verschillende microben en niet-infektueuze zaken zoals lichamelijke letsels en chirurgische ingrepen.

In delen van de medische gemeenschap bleef de interesse voor de EBV-connectie echter en meerdere research-bevindingen van de laatste 15 jaar hielden de interesse voor EBV-connectie gaande. Daarnaast werd de potentiële rol van ectopische lymfoïde strukturen bij chronische infekties en auto-immune ziekten onderzocht, en research betreffende gliale cellen bood nieuwe kennis over de cellulaire mechanismen achter neuro-inflammatie en chronische pijn.

Hypothese

Stap 1

De eerste stap wordt gekenmerkt door de aggregatie van lymfoïde cellen (B- & T-lymfocyten en dendritische cellen) in zenuw-strukturen. De ‘dorsal root’ ganglia zijn de meest courante plaats voor deze aggregatie van lymfoïde cellen maar autonome ganglia, de achterste zenuw-wortels, ruggemerg-zenuwen en het CZS kunnen ook aangetast zijn. De factor die aggregatie induceert, varieert van patient tot patient. In veel gevallen zitten er a-symptomatische reaktivaties van humaan herpesvirus-6 (HHV-6) in de gliale cellen achter. In andere gevallen zijn dat acute of sub-acute infekties met andere microben, blootstelling aan neurotoxinen uit het milieu, of lichamelijke letsels (uitrekken, samendrukken of scheuren van perifere zenuwen).

Stap 2

Ergens tijdens of na de vorming van lymfoïde aggregaten, brengen EBV-geïnfekteerde lymfocyten of monocyten EBV van de circulatie naar één of meerdere van deze ectopische lymfoïde aggregaten, waarna cel-naar-cel transmissie van EBV en proliferatie van latent EBV-geïnfekteerde lymfocyten leiden tot de aanwezigheid van veel EBV-geïnfekteerde cellen in de aggregaten. De EBV-geïnfekteerde lymfocyten ontwijken apoptose en vomen lang-levende klonen omwille van overleving-signalen van het virus.

De EBV-geïnfekteerde lymfocyten in de ectopische lymfoïde aggregaten ontsteken een inflammatie in het omringende zenuw-weefsel. Deze lokale inflammatie ontbrandt via verscheidene mechanismen: a) via molekulen die worden gesekreteerd door latent EBV-geïnfekteerde lymfocyten, zoals niet-coderende RNAs (EBERs [‘Epstein-Barr virus encoded small RNAs’, geproduceerd tijdens de latente cyclus van het virus, wanneer geen virus-partikels worden aangemaakt; ze zijn niet-coderend en interageren met proteïnen van de gastheer]); b) via immuun-reakties tegen lytische replicaties van EBV (replicatie van het volledig virus-partikel); c) via EBV-gecodeerde proteïnen die worden aangemaakt en gesekreteerd in connectie met abortief-lytische reaktivaties (onvolledige lytische replicaties); en d) via auto-immune processen met geen of zwakke elementen van cytotoxiciteit. Het relatief belang van elk van deze mechanismen varieert van patient tot patient en met verloop van tijd.

Deze lokale inflammatie lokt, op z’n beurt, een golf van gliale cel aktivatie uit die zich verspreidt van het EBV-geïnfekteerd gebied naar delen van het zenuwstelsel die niet EBV-geïnfekteerd zijn. Er kunnen meerdere types gliale cellen geaktiveerd zijn. Onder andere: satelliet-cellen [met een beschermende rol] in de perifere ganglia, microglia en astrocyten in het CZS, en Schwann-cellen in de perifere zenuwen, inclusief de niet-myeliniserende Schwann-cellen die de sensorische en de post-ganglionische sympathische zenuw-vezels omhullen [de zgn. myeline-schede]. Deze gliale aktivatie beïnvloedt de neuronen chemisch (verstoring van de neuron-glia communicatie, sekretie van inflammatoire cytokinen) of mechanisch (door zwelling binnenin de zenuw), en lokt de M.E./CVS-symptomen uit. De mechanische stress waar de perifere zenuwen aan blootgesteld worden tijdens fysieke aktiviteit verhoogt de gliale cel aktivatie en veroorzaakt post-exertionele malaise.

Stap 3

De lokale door EBV veroorzaakte inflammatie, de wijdverspreide gliale aktivatie en, indien aanwezig, reaktivaties van HHV-6 hebben de tendens om nieuwe lymfoïde aggregaten te induceren. De nieuwe lymfoïde aggregaten krijgen EBV uit de circulatie zowel als van de naburige lymfoïde aggregaten. Op die manier wordt het gebied dat geïnfiltreerd is door EBV-geïnfekteerde lymfoïde aggregaten groter en kan het, bijvoorbeeld, ‘dorsal root’ ganglia op meerdere ruggemerg-niveaus en delen van het ruggermerg of hersenstam omvatten. Tezelfdertijd verdwijnen sommige van de ‘oude’ lymfoïde aggregaten. De situatie is dus dynamisch. De antigen-specificiteit van de lymfoïde cellen kan variëren van aggregaat tot aggregaat, en kan specificiteit omvatten tegen virale antigenen en een brede waaier aan antigenen die door de inflammatie niet worden geproduceerd. Bijvoorbeeld: B-lymfocyten in één aggregaat kunnen in staat zijn antilichamen tegen HHV-6 te produceren, terwijl B-lymfocyten in een ander aggregaat antilichamen tegen een auto-antigen kunnen aanmaken. Als het immuunsysteem van de patient in staat is de EBV-geïnfekteerde cellen te verwijderen, kan een volledig verdwijnen van de aandoening optreden. Maar als de EBV-geïnfekteerde cellen niet worden verwijderd uit de zenuw-weefsels binnen enkele jaren, is de tendens dat de pathologische processen geconsolideerd worden omwille van uitputting van de immuun-cellen die betrokken zijn bij de immuun-respons tegen het virus.

Vergelijking met enkele andere hypothesen

Michael Pender [Niet over M.E./CVS maar over auto-immune aandoeningen: immuun-processen uitgelokt en georkestreerd door auto-reaktieve lymfocyten spelen een centrale rol. EBV geeft deze overleving-signalen zodat ze apoptose ontwijken en zich opstapelen in het doelwit-orgaan.] In de hypothese hier wordt verondersteld dat de effekten van EBV en de gevolgen van EBV-infektie veel meer gedifferentieerd en veelzijdiger zijn.

Bansal et al. [zie ‘Immuun-geheugen & virale infektie bij M.E.(cvs)] [Infekties of stress zouden kunnen leiden tot immuun-dysfunktie en deze zou reackivatie en “brede verspreiding” van EBV of een ander latent virus kunnen uitlokken.] Zij hebben het niet over een mogelijke rol van ectopische lymfoïde strukturen en gliale aktivatie.

Jose Montoya, Andreas Kogelnik et al. [Verhoogde antilichaam-titers tegen HHV-6 & EBV bij M.E./CVS.] Zij adresseren ook de mogelijke rol ectopische lymfoïde strukturen en gliale aktivatie niet.

Daugherty et al. [Een “synergistisch effekt tussen HHV-6 & EBV” op de lymfocyten-funktie bij M.E./CVS, resulterend in een verzwakte immuun-respons.]

Martin Lerner [Lerner AM, Beqaj S. A paradigm linking herpesvirus immediate-early gene expression apoptosis and Myalgic Encephalomyelitis / Chronic Fatigue Syndrome. Virus Adapt Treat (2011) 3: 19-24] [Meent dat “niet-permissieve replicaties” van EBV, HHV-6 en/of CMV een verklaring kunnen zijn voor M.E./CVS; virale componenten zouden de gastheer-cellen ontregelen en immunologische stoornissen in het omringend weefsel induceren.] Hij adresseert ook de mogelijke rol ectopische lymfoïde strukturen en gliale aktivatie niet.

Morris et al. [Erkennen het belang van gliale cel aktivatie bij M.E./CVS.] De mechanismen die volgens hen virale blootstelling linken aan gliale cel aktivatie, zijn niet dezelfde als hier beschreven. Ectopische lymfoïde aggregaten lijken geen rol te spelen in hun model.

Judith Shapiro [Stelt voor dat M.E./CVS start wanneer een neurotroop herpesvirus (bv. Varizella Zoster virus) reaktiveert in de perifere ganglia.] Zij zegt niks over de mogelijke rol van ectopische lymfoïde aggregaten en gliale aktivatie, en niets over auto-immuniteit.

VanElzakker [Nervus vagus infektie hypothese voor CVS; legt de focus op de gliale cellen die nervuw vagus en z’n ganglia omhullen.] Dit staat in contrast met de veel meer wijdverspreide gliale aktivatie die hier wordt beschreven.

Arnett et al. [Suggereren dat neuro-immunologische reakties in de hersenen opgewekt door “perifere inflammatoire voorvallen” aan de basis van M.E./CVS liggen. Volgens hen niet het resultaat van een bepaald pathogen maar van een abnormale respons op infektie.]

Evaluatie van de hypothese

Vorming van ectopische lymfoïde aggregaten

Ectopische lymfoïde aggregaten zijn aggregaten van lymfoïde cellen (B- & T-lymfocyten, dendritische cellen) in niet-lymfoïde weefsels. Sommige van deze aggregaten zijn slechts verzamelingen van lymfoïde cellen binnen een bepaald gebied, terwijl andere aggregaten georganiseerde strukturen met kiem-centra [plaatsen in lymfeknopen waar rijpe B-cellen prolifereren, differentiëren en van antilichaam-klasse (bv. IgM naar IgG) switchen] zijn. De ectopische lymfoïde aggregaten lijken zich te vormen in respons op antigene stimuli. Ze ontwikkelen zich dikwijls in weefsels met inflammatie door infektueuze, auto-reaktieve of neoplastische processen [neoplasie = vorming van goed- of kwaadaardige gezwellen door cel-vermeerdering], en kunnen worden gezien als “induceerbare kernen voor het genereren van antigen-specifieke immuun-responsen in weefsels”.

In veel gevallen van M.E./CVS lijken de symptomen uit het niets op te komen, zonder enige kennelijke triggerende gebeurtenis. In dergelijke gevallen zouden a-symptomatische reaktivaties van latente virussen in de ‘dorsal root’ ganglia een opbouw van ectopische lymfoïde aggregaten kunnen hebben geïnduceerd, weken en maanden voor de aanvang van M.E./CVS. Een mogelijke schuldige is HHV-6. Bijna 100% van alle kinderen is blootgesteld aan HHV-6 voor de leeftijd van 2 jaar en na de initiële infektie vestigt HHV-6 een levenslange latentie. HHV-6 kan gliale cellen infekteren en veel volwassenen dragen latent HHV-6 in hun hersenen en ‘dorsal root’ ganglia. Reaktivaties van HHV-6 lijken zeer courant, niet enkel bij immunologisch gecompromitteerde individuen [die geen immuun-respons kunnen opwekken] maar ook bij immunocompetente en gezonde personen. Deze reaktivaties zijn dikwijls a-symptomatisch maar kunnen gepaard gaan met ernstige complicaties in immuno-gecompromitteerde transplant-recipiënten. Eén van de door HHV-6 gecodeerde proteïnen beschikt over chemokine-achtige, leucocyten-aantrekkende eigenschappen.

In veel andere gevallen van M.E./CVS, is de aanvang geassocieerd met een acute infektie of een acuut infektie-achtig voorval. Sommige van die infekties worden veroorzaakt door neurotrope micro-organismen (bv. Coxsackie-B virus en Borrelia Burgdorferi), terwijl andere infekties het zenuwstelsel indirect kunnen hebben aangetast via neurotoxische cytokinen in het bloed. De infekties kunnen dus de vorming van ectopische lymfoïde aggregaten in zenuw-weefsels hebben geïnduceerd.

Wanneer M.E./CVS zich ontwikkelt in de nasleep van infektueuze mononucleose, zouden ectopische lymfoïde aggregaten geïnduceerd kunnen geweest zijn door a-symptomatische reaktivaties van latente neurotrope virussen, voor de infektueuze mononucleose begon. Een ander mogelijkheid is dat ectopische lymfoïde aggregaten geïnduceerd zouden kunnen geweest zijn door de EBV-infektie zelf, tijdens het verloop van de infektueuze mononucleose. Dit is omdat de primaire infektie met EBV zowel het centraal zenuwstelsel als het perifeer zenuwstelsel kan aantasten. Er werden veranderingen in het cerebrospinaal vocht gerapporteerd in 26,5% van de gevallen van infektueuze mononucleose, dus zou lage-intensiteit neuro-pathologie vrij courant kunnen zijn bij infektueuze mononucleose. Een studie toonden aan dat lytische replicatie van EBV plaats kan vinden in neuronen, ten minste in het laboratorium.

In sommige gevallen van M.E./CVS werden niet-infektueuze voorvallen zoals chirurgische ingrepen verkeersongelukken gerapporteerd als mogelijke precipiterende factoren. Dergelijke fysieke letsels kunnen ook inflammatie uitlokken. Dit zou misschien ectopische lymfoïde aggregaten in zenuw-weefsels kunnen induceren. Bijvoorbeeld: een letsel dat een distaal deel van een perifere zenuw aantast, kan inflammatie in de ‘dorsal root’ ganglia uitlokken. Dit kan misschien ectopische lymfoïde aggregaten in zenuw-weefsels induceren.

We weten eigenlijk niet of ectopische lymfoïde aggregaten aanwezig zijn bij M.E./CVS. In 4 van de 5 autopsies bij overleden M.E./CVS-patiënten die publiek werd beschreven, waren er echter tekenen van inflammatie en/of overmatige lymfocyten in de ‘dorsal root’ ganglia.

EBV in ectopische lymfoïde aggregaten

In ontwikkelingslanden zijn bijna 100% van de kinderen blootgesteld aan EBV voor hun 5 jaar. In ontwikkelde landen, waar de primaire infektie dikwijls pas in de adolescentie of bij jong-volwassenen plaatsvindt, is de sero-prevalentie 80%-90% op de leeftijd van 20 jaar en deze stijgt verder bij volwassenheid. Na de initiële infektie, blijft het EBV-genoom (latent EBV) in het lichaam voor de rest van het leven. Het voornaamste reservoir van latent virus zijn de ‘memory’ B-lymfocyten [subtype dat na primaire infektie wordt gevormd en van belang is om snel een ferme immuun-respons te genereren bij her-infektie], hoewel EBV ook epitheliale cellen, T-lymfocyten, monocyten en macrofagen in de amandelen kan infekteren en er misschien latent blijven. Lytische reaktivaties [Lytische replicatie resulteert in de vernietiging van de geïnfekteerde cel en z’n membraan.] van het virus treden occasioneel op, wellicht wanneer latent EBV-geïnfekteerde B-lymfocyten worden geaktiveerd door blootstelling aan andere microben.

Bij sommige personen werden latent EBV-geïnfekteerde B-lymfocyten geobserveerd in ectopische lymfoïde aggregaten. Bijvoorbeeld: EBV werd gezien in ectopische lymfoïde strukturen in de hersenen van patiënten met Multipele Sclerose (MS), in het synovium [slijmvlies van gewrichtsholte] van patiënten met Reumatoïde Artritis en in de speekselklieren van patiënten met Sjögren’s syndroom. In deze EBV-geïnfekteerde lymfoïde strukturen werden proteïnen geobserveerd die worden geproduceerd in de vroede fase van de lytische replicatie van EBV, samen met latentie-geassocieerde produkten zoals EBERs. Volgens 2 onderzoekers van de ‘The London School of Medicine’ lijken de ectopische lymfoïde strukturen in de doelwit-organen van orgaan-specifieke auto-immune ziekten te werken als “preferentiële niches voor EBV-latentie en reaktivatie”.

EBV-geïnfekteerde cellen zouden het micro-milieu in de omringende weefsels op meerdere manieren kunnen beïnvloeden: 1) Latent EBV-geïnfekteerde cellen kunnen een waaier aan molekulen (bv. EBERs) sekreteren die inflammatie kunnen veroorzaken. 2) “Abortief-lytische reaktivaties” [Abortieve infektie produceert geen infektueuze virussen; de virus-proteïnen die tot expressie komen, vormen geen compleet virus-partikel.] kunnen wellicht optreden, en proteïnen die via dit proces worden geproduceerd kunnen worden afgegeven en kunnen inflammatie veroorzaken. 3) Lytische replicaties van EBV kunnen immunologische reakties uitlokken. 4) EBV-infektie kan auto-immune processen versterken door het geven van overleving-signalen aan auto-reaktieve B- & T-lymfocyten.

Vele studies hebben ongewone titers van antilichamen tegen EBV-antigenen bij M.E./CVS-patiënten aangetoond, wat voortdurende EBV-aktiviteit van de één of andere aard suggereert. Bijvoorbeeld: er werd een verhoogde frequentie van detekteerbaar IgM tegen het [virus]kapsel-antigen gerapporteerd [Lerner AM et al. IgM serum antibodies to Epstein-Barr virus are uniquely present in a subset of patients with the Chronic Fatigue Syndrome. In Vivo (2004) 18: 101-6]. Ook ongewone waarden van IgG tegen een reeks EBV-antigenen [Lerner AM et al. Antibody to Epstein-Barr virus deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase and deoxyribonucleotide polymerase in a Chronic Fatigue Syndrome subset. PLoS One (2012) 7: e47891.]. Meerdere auteurs hebben correct aangegeven dat deze serologische bevindingen niet consistent waren over verschillende studies. Men zou echter verwachten dat – in een scenario beschreven zoals in de hier gepresenteerde hypothese – serologische responsen op EBV zouden variëren tussen patiënten en met verloop van tijd, afhankelijk van het overheersend type EBV-aktiviteit (t.t.z. latentie-gerelateerde aktiviteit, lytische replicatie of abortief-lytische replicatie) en van de mate van EBV-specifieke immuun-cel uitputting. Enkele auteurs hebben correct aangegeven dat ongewone EBV-serologie ook wordt gezien bij sommige gezonde personen. Men kan zich echter makkelijk inbeelden dat de gevolgen van EBV-aktiviteit kan variëren naar gelang de lokatie van de EBV-geïnfekteerde cellen in het lichaam. EBV-aktiviteit in de (keel-)amandelen kan bv. misschien a-symptomatisch verlopen of slechts nu en dan een pijnlijke keel geven, terwijl EBV-aktiviteit in lymfoïde strukturen in zenuw-weefsels ernstigere gevolgen kunnen hebben.

M.E./CVS bleek ook geassocieerd met een aktivatie van genen waarvan is geweten dat ze geaktiveerd zijn tijdens EBV-infektie en bij aktivatie van genen coderend voor cellulaire mechanismen die EBV exploiteert om z’n overleving te bevorderen in geïnfekteerde B-cellen [Vernon SD, Whistler T, Cameron B, Hickie IB, Reeves WC, Lloyd A. Preliminary evidence of mitochondrial dysfunction associated with post-infective fatigue after acute infection with Epstein Barr Virus. BMC Infect Dis (2006) 6: 15]. Dit verhoogt de argwaan omtrent het feit dat er een soort EBV-aktiviteit aan de gang kan zijn bij M.E./CVS-patiënten.

Bij gezonde dragers van EBV, bevat het bloed 1-50 copieën van het EBV-DNA per miljoen witte bloedcellen. Bij patiënten die niet in staat zijn het virus te beheersen, is de lading EBV-DNA in het bloed dikwijls aanzienlijk hoger. Een chronische en symptomatische EBV-aktiviteit gaat echter niet noodzakelijkerwijs gepaard met een verhoogde virale lading in het perifeer bloed. Bijvoorbeeld: bij 4 van de 5 patiënten met een chronisch aktieve EBV-infektie en met doeltreffende EBV-specifieke T-cel therapie, lag de hoeveelheid EBV-DNA in het perifeer bloed binnen normale waarden. Er werd gevonden dat 55% van de M.E./CVS-patiënten en 15% van de gezonde controles meer dan 35 EBV-copieën per mg DNA in perifere mononucleaire cellen hadden [Loebel M et al. Deficient EBV-specific B- and T-cell response in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e85387], terwijl anderen geen dergelijk verschil hadden gevonden tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles [Wallace HL, Natelson B et al. Human herpesviruses in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Diagn Lab Immunol (1999) 6: 216-23].

Er werden veel verschillende auto-antilichamen gerapporteerd als zijnde verhoogd bij M.E./CVS-patiënten [bv. Loebel M et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun (2016) 52: 32-9]. Dit heeft geleid tot speculaties omtrent het feit of M.E./CVS een auto-immune ziekte zou kunnen zijn. De auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden echter ook het resultaat kunnen zijn van auto-reaktieve B-lymfocyt klonen die apoptose ontwijken omwille van overleving-signalen van latent EBV. De variatie qua antigen-specificiteit van de auto-antilichamen zou een weerspiegeling kunnen zijn van een variatie qua antigen-specificiteit van de B-lymfocyt klonen die behoren tot verschillende ectopische lymfoïde aggregaten. De auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden ook fysiologische rol kunnen spelen bij het opruimen van het afval ontstaan door een inflammatoir proces.

Zowel EBV als HHV-6 kunnen selektieve immuun-suppressie veroorzaken en zouden de reaktivatie van elkaar kunnen stimuleren. Dit zou ten dele kunnen verklaren waarom reaktivaties van HHV-6 de neiging hebben meer voor te komen bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles [Buchwald D et al. A chronic illness characterized by fatigue, neurologic and immunologic disorders, and active human herpesvirus Type 6 infection. Ann Intern Med (1992) 116: 103-13 /// Patnaik M, Komaroff AL et al. Prevalence of IgM antibodies to human herpesvirus 6 early antigen (p41/38) in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Infect Dis (1995) 172: 1364-7 /// Ablashi DV et al. Frequent HHV-6 reactivation in Multiple Sclerosis (MS) and Chronic Fatigue Syndrome (CFS) patients. J Clin Virol (2000) 16: 179-91]. Het zou ook kunnen bijdragen tot het consolideren en verspreiden van EBV-geïnfekteerde ectopische lymfoïde aggregaten in zenuw-weefsel.

Gliale aktivatie

Gliale cellen spelen een sleutelrol bij het behouden van de homeostase in het zenuwstelsel. Wanneer ze worden blootgesteld aan pathologische gebeurtenissen, zoals inflammatie en fysieke zenuw-letsels, reageren ze met een reeks cellulaire responsen, gezamenlijk bekend als ‘gliale aktivatie’ [zie ‘Bewijs voor gliale aktivatie in de hersenen bij chronische pijn]. Deze gliale cel respons manifesteert zich op verscheidene manieren, inclusief sekretie van inflammatoire cytokinen en immuun-cel aantrekkende chemokinen. De gliale cellen beslaan een netwerk van anatomisch en funktioneel onderling verbonden cellen over gans het zenuwstelsel. De gliale cellen communiceren ook uitgebreid met aanpalende neuronen. Een pathologische gebeurtenis op een bepaalde plaats van het zenuwstelsel kan dus niet enkel aktivatie van gliale cellen veroorzaken op dezelfde plaats, maar kan ook gliale aktivatie induceren in verder weg gelegen gebieden van het zenuwstelsel. Bijvoorbeeld: een letsel aan een perifere zenuw kan gliale aktivatie uitlokken in ‘dorsal root’ ganglia, het ruggemerg en de hersenen. De gliale aktivatie kan gedurende weken en maanden na het letsel aanhouden. Er is steeds meer bewijsmateriaal voor het feit dat gliale aktivatie betrokken kan zijn bij chronische pijn aandoeningen. Omdat gliale aktivatie echter niet noodzakelijkerwijs geassocieerd is met myeline-degeneratie of ernstige pathologie in de axonen, kunnen onconventionele onderzoek-technieken nodig zijn om de diagnose te stellen van de aandoeningen.

De meeste M.E./CVS-patiënten rapporteren cognitieve symptomen, zoals moeilijkheden om de aandacht te blijven houden. Neuropsychologische testen onthullen dikwijls vertraagde informatie-verwerking en aandacht-gebreken bij M.E./CVS-patiënten. Een PET-scan studie toonde gliale aktivatie in wijdverspreide gebieden van het brein bij M.E./CVS-patiënten [zie ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie]. De meeste M.E./CVS-patiënten hebben ook symptomen die kunnen voortkomen uit het perifeer zenuwstelsel. Bijvoorbeeld: veel patiënten rapporteren abnormale sensaties in de ledematen, de romp of het hoofd, die ze dikwijls beschrijven als spelden-prikken, brandering gevoel, en een koud of dof gevoel. Een verhoogde frequentie van fasciculaties [kleine spiertrekkingen] wordt ook dikwijls vermeld. Net zoals uitstralende pijn. De meeste patiënten hebben symptomen van het autonoom zenuwstelsel en studies met orthostatische testen suggereren dat rechtop-staan gedurende meer dan 10 min frequenter ‘neuraal gemedieerde hypotensie’ uitlokt bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles. Zodoende suggereren symptomen en research-bevindingen dat alle belangrijke delen van het zenuwstelsel aangetast zijn bij M.E./CVS en dat het pathologisch proces van die aard is dat het de neiging heeft onder de ‘radar’ van de conventionele onderzoek-technieken te vallen – wat men zou verwachten bij een gliale aktivatie zonder myeline-degeneratie of ernstige neuron-pathologie.

De grote meerderheid van de M.E./CVS-patiënten ervaren meer symptomen na fysieke aktiviteit, de zgn. post-exertionele malaise. Herhaalde inspanning-testen (24h interval) hebben aangetoond dat bij M.E./CVS-patiënten het maximaal zuurstof-verbruik en/of de maximale arbeid gereduceerd zijn bij de tweede test t.o.v. de eerste. Deze effekten van fysieke aktiviteit bij M.E./CVS zou een gevolg kunnen zijn van gliale aktivatie: bij alle soorten fysieke aktiviteit worden de perifere zenuwen blootgesteld aan mechanische stress, zoals uitrekking en samendrukking [zie ‘Neuromusculaire belasting als bijdrage tot symptomen bij CVS’ (Rowe et al.)]. Zo lang de zenuwen gezond zijn, verzekert de strukturele organisatie van de zenuwen (beschermende lagen bindweefsel, enz.) dat deze zich kunnen aanpassen aan deze mechanische stressoren en normaal blijven funktioneren. Bijvoorbeeld: een perifere zenuw kan een substantiële verandering in de lengte ondergaan ten gevolgde de reikwijdte van de beweging van het lidmaat. Als het vermogen van de zenuw om ‘aanpassende wijzigingen’ te maken echter verminderd door een pathologisch proces (bv. door zwelling binnenin de zenuw), zou mechanische stress spanning en ischemie [zuurstof-tekort] in de zenuw kunnen veroorzaken. Het is wel-bekend dat perifere neuropathieën gevoelig zijn voor mechanische stress. Rowe et al. [Neuromuscular strain increases symptom intensity in Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2016) 11: e0159386.] toonden bij M.E./CVS-patiënten dat meerdere symptomen (bv. ‘hersen-mist’) kunnen worden uitgelokt door ze bloot te stellen aan ‘neuromusculaire spanning’, zoals ‘straight leg raise’ [opheffen gestrekt been]. Het is zodoende denkbaar bij M.E./CVS dat de mechanische stress op de perifere zenuwen tijdens fysieke aktiviteit de aktivatie van gliale cellen (die aanwezig zou kunnen zijn in deze zenuw-strukturen) accentueert, en een golf van verhoogde gliale aktivatie start over gans het zenuwstelsel. Dit zou zorgen voor een verslechtering van de symptomen die reeds aanwezig zijn (pijn, cognitieve stoornissen en het griep-achtig gevoel). Het zou ook resulteren in een verhoogde verstoring van de sympathische zenuw-vezels, die meerdere funktie reguleren in skelet-spieren (bloeddoorstroming, metabolisme, ionen-stromen door membranen en samentrekbaarheid). Er zijn enkele indicaties dat de verwijdering van de H+-ionen (zuur) uit de spiercellen verstoord is bij M.E./CVS-patiënten en dat deze verstoring geassocieerd kan zijn met die van de sympathische zenuwen [zie ‘Abnormale zuur-verwerking in spieren bij CVS & ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS]. Als dit correct is, zou het een diepgaande impact kunnen hebben op de fysieke capaciteiten van M.E./CVS-patiënten.

Immuun-cel uitputting

Frequente blootstelling aan virale antigenen gedurende een lange periode kan een ‘uitputting’ veroorzaken van de immuun-cellen die betrokken zijn bij de immuun-respons tegen het virus. Dit fenomeen is het best gedocumenteerd bij T-lymfocyten maar andere types immuun-cellen, zoals B-lymfocyten en ‘natural killer’ cellen (NK-cellen), kunnen er ook onder lijden.

Loebel et al. (2014) [zie hierboven] ontdekten dat de grote meerderheid van hun M.E./CVS-patiënten een ontoereikende EBV-specifieke B- en T-lymfocyten-respons hadden. Een gebrek in de immuun-respons op cytomegalovirus en herpes simplex virus-1 werd niet gezien, dus de onvolkomen immuun-respons tegen EBV maakte geen deel uit van een gebrekkige immuun-respons tegen herpes-virussen in het algemeen. Deze bevinding kan een indicatie zijn voor EBV-specifieke immuun-cel uitputting veroorzaakt door frequente EBV-reaktivatie.

Veel studies geven aan dat de cytotoxiciteit van T-lymfocyten en NK-cellen bij M.E./CVS-patiënten gereduceerd is [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol (2005) 142: 505-11 /// zie o.a. ook: ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS]. Deze bevindingen kunnen een weerspiegeling zijn van immuun-cel uitputting veroorzaakt door frequente blootstelling aan virale antigenen (bv. EBV en HHV-6 antigenen), of een effekt van chemische substanties gesekreteerd door EBV-geïnfekteeerde B-lymfocyten en macrofagen. Het is ook denkbaar dat de dysfunktie van T-lymfocyten en NK-cellen zich zou ontwikkeld kunnen hebben voor de aanvang van M.E./CVS, en dat dit het vermogen van de patiënten om de verspreiding van EBV te beperken kan hebben gereduceerd.

Geaktiveerde immuun-cellen en geaktiveerde gliale cellen produceren en sekreteren cytokinen. De concentraties van verschillende cytokinen in het bloed van M.E./CVS-patiënten werd in veel studies onderzocht. De meeste van de studies zijn klein en de resultaten zijn gemengd. Bevindingen van een grote studie [Hornig M, Montoya JG, Klimas NG et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv (2015) 1: e1400121] kunnen gedeeltelijk de inconsistenties van eerdere rapporten verklaren. Deze studie toonde dat M.E./CVS-patiënten die minder dan 3 jaar ziek waren een significant hogere waarde qua pro- én anti-inflammatoire cytokinen in het bloed hadden dan gezonde controles. Bij M.E./CVS-patiënten die langer dan 3 jaar ziek waren, lagen dezelfde cytokinen echter significant lager dan bij gezonde controles. De auteurs suggereren dat een sterke stimulatie van cytokine-producerende cellen in de eerste jaren van de aandoening kan hebben geleid tot een “uitputting van de cytokine-producerende cellen” daarna.

Getuigenissen van klinische testen

Meerdere types interventies werden getest in klinische proeven bij M.E./CVS-patiënten. Sommige waren gebaseerd op medicijnen met potentiële effekten op EBV of HHV-6 aktiviteit:

Rituximab is een monoclonaal antilichaam tegen het proteïne CD20. CD20 wordt voornamelijk gevonden op het oppervlak van B-lymfocyten en rituximab vernietigt deze cellen. Rituximab vernietigt dus het voornaamste reservoir van latent EBV. Een gerandomiseerde, placebo-gecontroleerde, dubbel-blinde studie [Fluge O et al. Benefit from B-lymphocyte depletion using the anti-CD20 antibody rituximab in Chronic Fatigue Syndrome. A double-blind and placebo- controlled study. PloS one (2011) 6: e26358; zie o.a. ook ‘Screening van NK-, B- & T-cel fenotype en funktie bij CVS], gevolgd door een ‘open-label’, één-armige studie [Fluge O et al. B-lymphocyte depletion in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. An Open-Label Phase II Study with Rituximab Maintenance Treatment. PLoS One (2015) 10: e0129898], toonde dat infusies met rituximab geassocieerd waren met een vermindering qua M.E./CVS-symptomen. Terwijl de auteurs de mogelijkheid open houden dat het ogenschijnlijk effekt van rituximab te wijten kan zijn aan de verwijdering van een virus dat de B-lymfocyten infekteert (bv. EBV), lijkt hun voornaamste uitleg dat het kan liggen aan de eliminatie van auto-antilichaam. Beide werking-mechanismen zijn echter consistent met de hypothese die ik hier heb gepresenteerd. Het feit dat de klinische respons begon meerdere weken nadat de B-lymfocyten werden uitgeput, kan worden verklaard door de tijd nodig voor geaktiveerde gliale cellen om terug te keren naar hun normale toestand.

Langdurige behandeling met valganciclovir bleek geassocieerd met verbetering bij subsets van M.E./CVS-patiënten [zie Montoya & Kogelnik hierboven]. Omdat valganciclovir lytische replicaties van EBV en HHV-6 kan inhiberen, is het klaarblijkelijk effekt van valganciclovir consistent met de hypothese die hier wordt gepresenteerd.

Hoge dosissen acyclovir of z’n orale ‘pro-drug’, valacyclovir, kunnen waarschijnlijk lytische replicaties van EBV inhiberen. Langdurig gebruik van valaciclovir kan misschien het aantal latent EBV-geïnfekteerde B-lymfocyten reduceren. De effekten van acyclovir of valaciclovir bij M.E./CVS-patiënten werden in enkele studies onderzocht [Lerner et al.], maar de resultaten zijn tegenstrijdig en moeilijk te interpreteren omwille van methodologische problemen. Er zijn lange placebo-gecontroleerde studies nodig om een besluit te kunnen trekken.

Rintatolimod (Ampligen) stimuleert het aangeboren (niet-specifiek) immuunsysteem en kan worden beschouwd als een breed-spectrum antiviraal middel. Er werden 2 gerandomiseerde, placebo-gecontroleerde studies uitgevoerd om de effekten van rintatolimod te testen bij M.E./CVS-patiënten. De studies suggereren dat rintatolimod-infusies (2 maal per week gedurende 6 maanden of meer) kunnen gepaard gaan met een toename qua inspanning-tolerantie bij M.E./CVS. De antivirale effekten van rintatolimod zouden deze resultaten kunnen verklaren.

Finale bemerkingen

De hypothese die hier wordt gepresenteerd kan alle M.E./CVS-symptomen verklaren. Ze is ook consistent met belangrijke research-bevindingen. Dit betekent echter niet noodzakelijk dat de hypothese valide is. Toekomstige testen zijn vereist.

Eén manier om de hypothese te testen, zou kunnen zijn om de effekten te onderzoeken van het transfereren van ex-vivo [buiten het lichaam] aangepaste autologe EBV-specifieke T-lymfocyten naar de patiënten. Er is steeds meer bewijsmateriaal voor het feit dat EBV-specifieke T-cel infusies goede effekten zouden hebben op meerdere EBV-gerelateerde aandoeningen, inclusief deze waarbij EBV-latentie een cruciale rol speelt [Savoldo B, Huls MH, Liu Z et al. Autologous Epstein-Barr virus (EBV)-specific cytotoxic T cells for the treatment of persistent active EBV infection. Blood (2002) 100: 4059-66 /// Babel N, Hammer MH, Reinke P. Adoptive transfer of Epstein-Barr virusspecific T-lymphocytes in chronic active Epstein-Barr infection. Dtsch Med Wochenschr (2003) 128:548-50 /// Gottschalk S, Rooney C. Adoptive T-cell immunotherapy. Curr Top Microbiol Immunol (2015) 391:427-54]. Positieve effekten van een dergelijke behandeling bij M.E./CVS zouden niets zeggen over de lokatie van de EBV-geïnfekteerde cellen, maar het zou tonen dat EBV een belangrijke bestendigende factor is bij M.E./CVS. EBV-specifieke T-cel infusies bleken een laag risico op significante nevenwerkingen te dragen. Het zou echter niet zonder risico zijn. Het risico op infusie-gerelateerde reakties (bv. allergische reakties) is niet nul, hoewel het zeer laag is. En, theoretisch, zou de transfer van EBV-specifieke T-lymfocyten omstander-effekten kunnen uitlokken in het weefsel dat de EBV-geïnfekteerde cellen omringt, effekten van cytokinen die worden vrijgegeven wanneer EBV-geïnfekteerde cellen worden vernietigd en effekten van EBV-specifieke T-lymfocyten die kruis-reageren met ‘self’ [lichaamseigen; die normaal gezien die immunologisch worden aangevallen] -antigenen [studie bij M.S.].

Autopsie-studies kunnen EBV-geïnfekteerde lymfoïde aggregaten in ‘dorsal root’ ganglia of andere zenuw-strukturen aantonen. Volgens de hier gepresenteerde hypothese kunnen echter zelfs kleine plekken met lymfoïde aggregaten, her en der in één van de talrijke zenuw-strukturen in het lichaam, volstaan om wijdverspreide gliale aktivatie op te wekken. Het kan dus moeilijk zijn de lymfoïde aggregaten te vinden. Bovendien zal de detektie van EBV in het autopsie-materiaal sterk afhankelijk zijn van de kwaliteit van het materiaal dat wordt onderzocht en van de gebruikte onderzoek-techniek. Men zou ook in gedachten moeten houden dat het vinden van EBV-geïnfekteerde lymfocyten in ectopische lymfoïde aggregaten niet noodzakelijk betekent dat ze de oorzaak van de symptomen zijn.

De hier gepresenteerde hypothese is belangrijk omdat, als ze juist is, er reeds een geneeswijze voor M.E./CVS kan bestaan: de transfer van autologe EBV-specifieke T-lymfocyten kan misschien de EBV-geïnfekteerde cellen uit het zenuwstelsel verwijderen.

oktober 20, 2016

Een rol voor het intestinaal microbioom & viroom bij M.E.(cvs)?

Filed under: Infektie — mewetenschap @ 6:40 am
Tags: , , , , , , , , ,

Een review door researchers – geneeskunde-studenten Navena Navaneetharaja & Verity Griffiths, en professor Simon Carding & professor Tom Wileman van de ‘University of East Anglia Norwich Medical School’ & het ‘Institute of Food Research’ (Gut Health and Food Safety Research Programme) – aangaande het bewijsmateriaal voor een rol van darm-microbiota en viroom (de verzameling virussen in en op het menselijk lichaam; deze infekteren menselijke cellen en/of andere microben) bij M.E.(cvs) die wijst in de richting van een infektueuze en auto-immune basis voor de aandoening. De darm is, gezien de continue blootstelling aan microben, een belangrijke plaats voor auto-immune aktiviteit die zou kunnen leiden tot chronische ziekte. Niettegenstaande menen wij, zoals andere onderzoekers, dat er niet één enkelvoudig infektueus agens voor M.E.(cvs) zal kunnen worden aangeduid; maar dat de eigenheid (genetische aanleg) van het individu en dus zijn respons op infektueuze agentia de ontwikkeling van de ziekte bepalen… Lees bv. ‘Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS’ … Naviaux (zie ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’) geeft ook mee dat het metaboloom-profiel dat hij heeft gevonden bij M.E.(cvs) tegengesteld was aan de metabole respons op infektie…

Op haar blog schrijft Naveena Navaneetharaja: >>We focusten op de oorzaak van de aanhoudende immuun-gerelateerde symptomen, en beschrijven de mechanismen die de onderliggende immuniteit-stoornissen en mogelijke auto-immune processen bij M.E./CVS zouden kunnen verklaren. (…) We namen de discrepanties van research-bevindingen onder de loep wat betreft de problemen bij het detekteren van aktieve infekties en het onderscheid met reaktivatie van latente infektie. (…) We stellen voor dat de darm een aantrekkelijke en belangrijke bron van auto-reaktiviteit is. (…) Studies geven veelal enkel een moment-opname van de of microbiota-samenstellingen. (…) Het is nog niet mogelijk om te zeggen dat een specifieke microbiële signatuur bestaat bij M.E./CVS. (…) Microbioom-studies hebben tot nu toe enkel gekeken naar veranderingen qua bakteriële populaties maar de opdracht zou ook moeten zijn de virale componenten van de microbiota te bepalen. (…) Het is mogelijk dat bakteriofagen [kort ‘fagen’; klein virussen die enkel een specifieke bakterie infekteren] indirecte veranderingen in bakteriële populaties kunnen induceren of directe gevolgen nadat ze door het darm-epitheel zijn gegaan en het immuunsysteem stimuleren. We stellen voor dat fagen de bakteriële microbiota vormgeven via aktieve replicatie of het lyseren (‘kapot maken’) van de bakteriële gastheren door reaktiverende fagen. (…) De volgende stap in het lab van prof. Simon Carding (‘Programme Research Leader’ van het ‘Institute of Food Research’) is het correleren van de faag-populaties van patiënten met ernstige ziekte met deze van controles uit hetzelfde huishouden.<<

Volgens ons is dit een heel interessante en vernieuwende insteek. Dit werd al opgepikt door Maureen Hanson et al. die in hun artikel ‘A pair of identical twins discordant for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome differ in physiological parameters and gut microbiome composition’ (The American Journal of Case Reports (2016) 17: 720-729) rapporteerden dat bij een M.E.(cvs)-geval minder van de nuttige bakterieën Faecalibacterium & Bifidobacterium voorkwamen, en dat er meer bakteriofagen van de Caudovirales orde (dubbel-strengig DNA fagen met een ‘staart’) werden gevonden. Ze besloten dat er sprake was van dysfunktionele immuun-aktivatie en dat bakteriofagen zouden kunnen bijdragen tot inflammatie van de darm-slijmvliezen en bakterieel onevenwicht.

Lees ook over andere microbioom-studies: ‘Verminderde diversiteit & gewijzigde samenstelling van het darm-microbioom bij M.E.(cvs)’, ‘Microbioom sekse-verschillen bij M.E.(cvs)’, ‘Gewijzigd darm-microbioom na inspanning bij M.E.(cvs)’, enz.

————————-

Journal of Clinical Medicine Vol. 5, #6, p 55 (2016)

A role for the intestinal microbiota and virome in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)?

Navaneetharaja N, Griffiths V, Wileman T, Carding SR

The Gut Health and Food Safety Research Programme, The Institute of Food Research, University of East Anglia, Norwich, UK

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een heterogene aandoening met een significante maatschappelijke impact, waarvan wordt gedacht dat zowel gastheer en milieu betrokken zijn bij de etiologie die mogelijks auto-immuun van aard is. Met immuniteit gerelateerde symptomen van minstens matige ernst die lange perioden aanhouden, zijn courant bij M.E./CVS-patiënten en B-cel depletie therapie heeft een significant therapeutisch voordeel [Dit dient nog te worden bevestigd.]. Het is onduidelijk wat de oorsprong is van deze symptomen en of ze infektueus of inflammatoir van aard zijn; daarbij is het zoeken naar bewijsmateriaal voor acute of chronische virus-infekties die bijdragen tot de inductie van auto-immune processen bij M.E./CVS een gebied dat veel interesse krijgt. Dit artikel biedt een uitgebreid overzicht van het bewijsmateriaal dat een infektueuze etiologie voor M.E./CVS ondersteunt; wat ons leidt tot het voorstellen van het nieuw concept dat het intestinaal microbioom en in het bijzonder leden van het viroom een bron zijn van de ‘infektueuze’ trigger van de ziekte. Een dergelijke benadering heeft het potentieel ziekte-biomerkers te identificeren en therapeutica aan te wijzen, wat de erg noodzakelijke benaderingen biedt naar preventie en management van de ziekte toe.

1. Inleiding

Wat is M.E./CVS?

[We onthouden uit dit hoofdstuk:] […] De Fukuda en de Oxford klassificaties worden niet als zo M.E.-specifiek beschouwd als de Canadese definitie, die symptoom-clusters van M.E. (met nadruk op neurosensorische, immune, gastro-intestinale en genito-urinaire manifestaties) identificeert […] We presenteren een gedetailleerde analyse van de kennis en het begrip van infektueuze agentia m.b.t. de pathogenese van M.E./CVS, met als doel een focus te bieden voor verdere research, wat betreft de mogelijke impact van het intestinaal microbioom en viroom.

2. Infekties & M.E./CVS

[…] M.E./CVS-patiënten vertonen dikwijls griep-achtige symptomen waarbij een acute aanvang meer courant is dan bij zij die enkel chronische vermoeidheid hebben. Populatie-studies tonen echter een overheersing van een graduele i.p.v. acute infektueuze aanvang, wat meer samenhangt met een chronische infektie of reaktivatie van een latente infektie. In dit opzicht en door de overlappende symptomen van M.E./CVS met chronische virus-infekties, is het niet verrassend dat er veel pogingen werden ondernomen om virussen te identificeren als trigger voor M.E./CVS.

2.1. Virale Infektie

[…] EBV wordt het meest frequent geïdentificeerd als een mogelijke virale trigger voor M.E./CVS. […], niet alle studies konden deze bevindingen repliceren.

Daarnaast is de aanwezigheid van serum-antilichamen tegen EBV, HHV-6 & CMV virussen niet specifiek voor M.E./CVS […]. Verhoogde waarden van deze antilichamen kunnen ook het resultaat zijn van ongerelateerde aandoeningen bij individuen met een gewijzigd immuunsysteem dat aanleiding geeft tot virus-reaktivatie. […]

Het succesvol gebruik van antivirale medicijnen bij M.E./CVS-patiënten zou ook een virus-infektie als trigger voor M.E./CVS kunnen ondersteunen, of eerder een bestendigende factor voor de ziekte. [Hierbij worden bedenkingen geformuleerd zoals het klein aantal behandelde patiënten en het hoog aantal ‘drop-outs’.]

[Ook studies over andere behandelingen – Valacyclovir, Isoprinosine, Rintatolimod (“Ampligen”) wachten op replicatie].

Bewijsmateriaal voor het tegenovergestelde van het feit dat virus-infektie een etiologische factor is bij M.E./CVS komt uit de analyse van monozygote tweelingen waarvan de ene ziek is en de andere niet: er waren geen verschillen qua virus-profiel en -expressie [Buchwald D et al. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis (2002) 35: 518-525]. […]. De redenen voor de klaarblijkelijke discrepanties zijn onduidelijk maar het kan verband houden met de inherente moeilijkheid wat betreft het detekteren van aktieve infekties en het onderscheid met reaktivatie van latente infektie […]. Veel studies die steunen op bloedstalen voor de detektie zouden wel eens enterovirus, parvovirus of herpes-virus infekties kunnen missen die voorkomen in de darm, het brein of het hart.

[…]

2.2. Niet-virale Infektie

Bewijs voor een bakteriële infektie als trigger voor M.E./CVS werd slechts beschreven in meldingen van gevallen met Q-koorts en Chlamydia pneumonia […]. Het verband tussen M.E./CVS en parasieten [m.n. Giardia] of schimmels [m.n. Candida] was ook beperkt en niet-overtuigend. Tot op heden is er onvoldoende bewijs om te besluiten dat M.E./CVS veroorzaakt wordt door bakteriële infektie of dat de ziekte wordt bestendigd door een voortdurende infektie.

3. Immuniteit-stoornissen bij M.E./CVS

[…] De meest consistente bevinding is een vermindering qua funktie van NK-cellen die een belangrijke rol spelen in immune bewaking en virale immuniteit. Verstoorde NK-cel funktie een courante bevinding bij patiënten [Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: Evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010), 5: e10817 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic encephalomyelitis. J Transl Med (2012), 10: 88 /// enz.] hoewel het absoluut aantal NK-cellen niet is aangetast door ziekte-toestanden. Globaal gezien ontbraken consistentie en reproduceerbaarheid bij studies, waarbij verschillende studies focusten op verschillende merkers en indicatoren voor cytotoxische aktiviteit. De literatuur geeft dus geen overtuigende correlatie aan tussen NK-cel funktie en ziekte-ernst.

De bruikbaarheid van lage NK-cel cytotoxiciteit als een biomerker voor M.E./CVS wordt verder in vraag gesteld door de aanwezigheid van een gelijkaardig fenomeen en verstoorde NK-cel funktie bij Reumatoïde Artritis, kanker en endometriose; alsook bij gezonde individuen die ouder zijn, roken, psychologische stress ervaren, fysiek gedeconditioneerd zijn of slaap-tekort hebben. Bewijs voor specifieke veranderingen in de NK-funktie (inclusief gewijzigde perforine- en granzyme-concentraties [Klimas N et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol (2005) 142: 505-511]) werden ook beschreven maar deze bevindingen werden niet onafhankelijk geverifieerd.

Andere indicatoren voor immune veranderingen bij M.E./CVS-patiënten komen van de vergelijkende analyse van cytokine-waarden in het bloed of, zeldzamer, cerebrospinaal vocht. De meerderheid van de studies zijn beperkt doordat slechts enkele cytokinen werden onderzocht bij kleine aantallen patiënten, waarvan de meeste geen significante bevindingen opleverden. Desondanks hebben enkele studies verhoogde waarden aan TNF-α bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd [bv. Broderick G, Klimas N, Vernon SD et al. Cytokine expression profiles of immune imbalance in post-mononucleosis chronic fatigue. J Transl Med (2012) 10: 191]; wat van bijzonder belang is aangezien het een mediator is voor malaise en een kenmerk van inflammatoire aandoeningen van het CZS, en via zijn werking op vasovagale reflex circuits [uitlopers van de nervus vagus coördineren responsen op stimuli van de darm] in de hersenstam de autonome controle kan ontregelen. De significantie van dergelijke wijzigingen qua TNF-α of enig ander cytokine bij M.E./CVS-patiënten is echter onzeker aangezien ze éénvoudigweg de immuun-aktivatie kunnen weerspiegelen en gewijzigd kunnen zijn bij verscheidene chronische inflammatoire aandoeningen, en daarom waarschijnlijk niet specifiek zijn voor M.E./CVS. Consistent met deze interpretatie zijn de resultaten van een studie met monozygote tweelingen met en zonder M.E./CVS, waarbij geen bewijs werd gevonden voor verschillen qua pro-inflammatoire cytokinen in [Vollmer-Conna U, Vernon SD, Reeves WC, et al. Dubbo Infective Outcomes Study Group: Post-infective fatigue syndrome is not associated with altered cytokine production. Clin Infect Dis (2007) 45: 732-735]. Het gebruik van verschillende staalname-methodes, diagnostische en inclusie-criteria, en bronnen van patiënten en controles kan een reden zijn voor de contrasterende resultaten bij immuun-funktie studies bij M.E./CVS-patiënten, bij sommige studies zijn er ook geen geschikte gematchte controles. Bovendien waren relatief weinig studies longitudinaal […].

3.1. Is M.E./CVS een Auto-immune Ziekte?

Het is nog bediscussieerbaar of de positieve uitkomst van klinische testen met Rituximab – een monoclonaal antilichaam dat het B-cel oppervlakte-antigen CD20 herkent – bij Noorse groepen M.E./CVS-patiënten, het sterkste bewijs tot op heden biedt voor de immune veranderingen en dysfunktie bij M.E./CVS, en voor het feit dat de ziekte auto-immuun van aard kan zijn. Het medicijn werd succesvol aangewend bij de behandeling van Reumatoïde Artritis. Met Rituximab behandelde M.E./CVS-patiënten rapporteren een algemene respons van 67% t.o.v. 13% bij placebo, met significante dalingen van de vermoeidheid-scores na 8 maanden. De voorbijgaande symptoom-verbetering is consistent met een manier van werken waarbij Rituximab auto-antilichaam-producerende B-cellen uitput, en met een op een auto-immuniteit gebaseerde pathogenese voor M.E./CVS. Het bevestigen van deze bevindingen en positieve resultaten bij Rituximab-behandeling in bijkomende grotere, multi-centra proeven zouden dit (het feit dat M.E./CVS een auto-immune aandoening is) overtuigender maken. Andere immunofenotypering-studies met M.E./CVS-patiënten die wijzigingen qua B-cel populaties hebben beschreven en grotere aantallen naïeve B-cellen, leveren bijkomend indirect bewijsmateriaal ter ondersteuning van deze interpretatie. Het identificeren van de oorzaak en aard van de auto-antigenen die de auto-immune responsen aansturen, zijn belangrijk voor het vaststellen dat M.E./CVS een auto-immune aandoening is. Meerdere vermoedelijke ‘zelf’-reaktieve antigenen werden geïdentificeerd (inclusief serotonine, dopamine en cholinerge neurotransmitters. […] Hoe en waar in het lichaam auto-reaktieve immuun-cellen worden geaktiveerd is een kwestie van gissen. Gezien de continue blootstelling aan een enorm aantal microben, immuun-cellen en immuun-processen, stellen we echter de darm als een aanlokkelijke en belangrijke bron van auto-reaktiviteit voor met het potentieel om een chronische uitputtende ziekte te veroorzaken.

3.2. Een Oorzaak in de Darm voor Auto-immuniteit?

Een nieuwe premisse waarbij een auto-immuun verband bij M.E./CVS betrokken is, is die van een microbiële trigger die niet wordt geïntroduceerd door een extern verworven pathogen en infektie, maar door microben die reeds binnen de gastheer verblijven (microbioom), waarvan het overgrote deel de intestinale microbiota beslaat. Terwijl wijzigingen in de samenstelling van de of intestinale microbiota (dysbiose [dysbakteriose; microbieel onevenwicht]) werden beschreven en in verband gebracht met verschillende ziekten (dieren en mensen), komt het meest overtuigende causaal bewijsmateriaal – voor de directe betrokkenheid en een vereiste van de intestinale microbiota bij ziekte-initiatie – voort uit het gebruik van steriele, kiem-vrije dier (muis) -modellen voor auto-immune ziekte. In de meeste maar niet alle ziekte-modellen (inflammatoire darm ziekte, auto-immune artritis, type-1 diabetes en systemische lupus erythematosus) wordt de ernst en/of incidentie van de ziekte gereduceerd of afwezig onder kiem-vrije omstandigheden – consistent met microbiota als ‘trigger’ voor ziekte-progressie. Het is echter belangrijk om op te merken dat de identiteit van de pathobionten [potentieel pathologische organismen die, onder normale omstandigheden, in symbiose leven] die in staat zijn ziekte in gang te zetten na kolonisatie (‘conventionalisering’) van de kiem-vrije muizen [met normale microbiota] niet werd vastgesteld voor deze ziekten. Het ontbreken van een muizen-model dat betrouwbaard de kenmerkende eigenschappen van menselijke M.E./CVS reproduceert is een beperkende factor bij het bepalen of en hoe de microbiota bijdragen tot de pathogenese van M.E./CVS.

Hoe worden leden van de intestinale microbiota blootgesteld aan het immuunsysteem van de gastheer? Er wordt gedacht dat intestinale dysbiose geassocieerd is met veranderde permeabiliteit van de intestinale epitheliale barrière (‘leaky gut syndrome’ [lekke darm syndroom]). Ontwrichting van epitheliale ‘tight-junctions’ [membranen van cellen komen samen en vormen een soort barrière zodat substanties verplicht worden de cel binnen te dringen om door het weefsel te raken, zodat er controle is over welke toegelaten worden en welke niet] – die normaal de aangrenzende cellen strak binden – in het begrenzende epitheel, biedt een toegangspoort voor de translocatie van bakterieën of bakteriële componenten naar mesenteriale lymfe-knopen [mesenterium = buikvlies] of de systemische circulatie. Dit kan, als de ontwrichting uitgebreid is en niet doeltreffend terug wordt afgesloten, leiden tot lokale en systemische immuun-cel aktivatie, en de aanmaak van pro-inflammatoire mediatoren en cytokinen die de epitheliale ‘tight-junction’ verder kan ontwrichten. Een pertinent voorbeeld is de etiologie van het Guillain-Barré syndroom [immuun-gemedieerde neuromusculaire aandoening van de perifere zenuwen], waar Campylobacter jejuni [veroorzaakt courant gastro-enteritis] lipopolysaccharide (LPS) – dat struktureel lijkt op gangliosiden [molekulen die zich bevinden aan de buitenzijde van de zenuwbanen, met name op de plek waar een zenuwvezel contact maakt met een spiervezel; ze spelen een cruciale rol bij het overbrengen van de boodschap] van de gastheer – leidt tot de produktie van kruis-reagerende antilichamen die zich richten tegen gastheer-neuronen en deze beschadigen, met verlamming tot gevolg.

De intestinale epitheliale ‘tight junctions’ vertonen ook opvallende gelijkenissen met endotheliale ‘tight-junctions’ in de bloed-hersen-barrière (BBB) […]. […] Er kan aktivatie van microglia optreden door LPS via z’n binding op CD14 en TLR-4, wat een inflammatoire reaktie initieert in de craniale circumventriculaire organen [CVO; gelegen op bepaalde plaatsen rond de rand van het ventrikel-stelsel van de hersenen, hebben als één van de weinige plekken in de hersenen een onvolledige bloed-hersenbarrière waardoor hun neuronen direct de concentratie van verschillende hormonen, neurotransmitters en cytokinen kunnen regelen]. Experimentele studies toonden dat chronische intestinale inflammatie uitgelokt door bakteriële produkten kan resulteren in neurologische ziekte, waarbij wordt gedacht dat bakterieel LPS een rol speelt bij het opwekken van antilichamen die kruis-reageren met gastheer-lipoproteïnen en de etiologie van Multipele Sclerose. Van belang voor M.E./CVS is een studie die significant hogere concentraties serum-antilichamen tegen LPS in M.E./CVS-patiënten met abdominale klachten dan bij controles rapporteerde, en besloot dat gastro-intestinale symptomen geassocieerd waren met verhoogde bakteriële translocatie, wat een mogelijke aandrijvende factor is voor systemische inflammatoire processen. Ondersteuning voor deze hypothese werd verkregen via onafhankelijke studies die rapporteren over een correlatie tussen de translocatie van darm-bakterieën en ziekte-aktiviteit in subsets M.E./CVS-patiënten. De intestinale microbiota kunnen daarom een rol spelen bij het in gang zetten of bestendigen van immuun-aktivatie, bakteriële translocatie en auto-immune processen, die allemaal betrokken bleken bij de pathogenese van M.E./CVS [theorie van Maes M et al.].

4. Kan het Intestinaal Microbioom een Rol spelen in de Ontwikkeling van M.E./CVS?

De co-existentie van M.E./CVS en gastro-intestinale symptomen is goed gedocumenteerd. Een studie rapporteerde dat 92% van de M.E./CVS-patiënten ook prikkelbare darm syndroom (IBS) hebben; en andere studies aangaande het immunologisch verband tussen de 2 aandoeningen toonden verhoogde mucosale [mucosa = slijmvlies; dunne laag cellen die slijm produceert ter bescherming] en systemische waarden van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6, IL-8, IL-1β & TNF-α. Initiële analyses van bakteriële populaties in stoelgang-stalen van M.E./CVS-patiënten vonden meer Escherichia coli (percentage van de totale aërobe microben) t.o.v. gezonde controles (92,3% versus 49%); deze bevindingen werden echter gerapporteerd op een wetenschappelijk bijeenkomst, en de methodologie werd niet gespecificeerd [Butt H, McGregor N et al. ‘Bacterial colonosis’ in patients with persistent fatigue (Abstract). In Proceedings of the AHMF International Clinical and Scientific Meeting, Sydney, Australia, 2001]. D-melkzuur producerende Enterococcen en Streptococcen bleken ook significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten (bevestigd d.m.v. culturen); metabole profielen toonden dat stalen van M.E./CVS-patiënten geassocieerd waren met minder Bifidobacteria [Sheedy JR, McGregor N et al. Increased D-lactic acid intestinal bacteria in patients with Chronic Fatigue Syndrome. In Vivo (2009) 23: 621-8]. Andere studies hebben deze observaties uitgebreid en er werd een associatie aangetoond tussen Enterococcen en de ernst van de gerapporteerde neurologische en cognitieve gebreken [Logan AC et al. Chronic Fatigue Syndrome: Lactic acid bacteria may be of therapeutic value. Med. Hypotheses (2003), 60: 915-923]. Een grotere studie beschreef een verband tussen significante verminderingen qua Bifidobacteria, hogere aërobe/anaërobe verhoudingen en ernstiger gastro-intestinale funktionele gebreken [Butt H, McGregor N et al. Faecal microbial growth inhibition in chronic fatigue/pain patients (Abstract). In Proceedings of the AHMF International Clinical and Scientific Meeting, Sydney, Australia, 1998]. Verder bleken 77% van de M.E./CVS-patiënten ‘small intestinal bacterial overgrowth’ [SIBO; overmatige bakteriële groei in de dunne darm] te hebben [Pimentel M et al. Eradication of small intestinal bacterial overgrowth decreases symptoms in Chronic Fatigue Syndrome: A double blind, randomized study. Gastroenterology (2000) 118: A414], wat enkele gelijkaardige klinische symptomen met M.E./CVS deelt.

Tot op heden heeft slechts één studie de gevoelige ‘next-generation’ sequentie-bepaling technologie aangewend om de microbiota bij M.E./CVS te profileren (vergelijking van Belgische en Noorse patiënten met gezonde controles). Dit onthulde distincte microbiota-populaties bij patiënten en controles in beide landen op basis van bakteriële geslachten (p = 0.022). De Noorse patiënten vertoonden zeer significante verschillen qua samenstelling van de intestinale microbiota vergeleken met Noorse controles (p < 0.001) – getypeerd door significante variaties qua Firmicutes-populaties, met een 50-voudige toename (p = 0.00001) van het Firmicutes geslacht Holdemania en een 20-voudige toename (p = 0.003) qua Lactonifactor. De geografische verschillen qua microbiota-samenstellingen werden toegeschreven aan het feit dat de Noorse patiënten een langere ziekte-duur rapporteerden, wat suggereert dat de intestinale samenstelling van M.E./CVS-patiënten veranderd is. Verschillen qua experimentele protocollen en bakteriële DNA-extractie technieken zouden de contrasterende uitkomsten van deze studies kunnen verklaren, en dit benadrukt de noodzaak om grotere groepen te vergelijken met betrouwbaar gematchte individuen. Meerdere factoren bepalen waarom microbiota-profilering studies bij M.E./CVS klaarblijk consistentie missen: patient-gerelateerde kwesties zoals inconsistente fenotypische klassificaties, kleine stalen met onvoldoende statistische kracht en technische kwesties gerelateerd met verschillen in de betrouwbaarheid, sensitiviteit en omvang van de detektie van de microbiële sequenties […], verschillende sequentie-bepaling-platformen en het betrouwen op enkelvoudige stalen en tijdstippen – dit kan enkel een moment-opname van de samenstelling van de microbiota geven. Ondanks het aantonen van gewijzigde diversiteit en stabiliteit van de intestinale microbiota bij M.E./CVS, is het nog niet mogelijk om te zeggen dat een specifieke microbiële signatuur bestaat bij M.E./CVS. Er dient zorg gedragen te worden bij het proberen vaststellen van een dergelijke ziekte microbiota-signatuur in het licht van de heterogene symptomen en subgroepen.

5. Hoe verder met M.E./CVS Microbioom Studies?

Microbioom-studies waren tot op heden bijna exclusief gefocust op het definiëren van veranderingen in de intestinale bakteriële populatie; het gebied heeft zich echter uitgebreid tot het bepalen van de niet-bakteriële micro-organismen van de ingewanden. Van bijzonder belang zijn de virale componenten van de microbiota. Componenten van het viroom, specifiek bakteriofagen, die 90% van het darm-viroom uitmaken, zijn primarire aandrijvende factoren van de bakteriële diversiteit en beïnvloeden de gemeenschap-struktuur door zowel het elimineren en introduceren van karakteristieken in hun gastheer via de overdracht van genen.

Tot nu toe heeft de impact van het intestinaal viroom bij gezonden en zieken weinig aandacht gekregen maar niettegenstaande het beperkt onderzoek naar de werking ervan is het mogelijk dat de fagen in het viroom wel degelijk een effekt hebben. Dit kunnen indirecte gevolgen zijn die het resultaat zijn van veranderingen aan bakteriële populaties, of directe effekten na stimulatie van het immuunsysteem als ze doorheen de epitheliale barrières van de darm gaan en de gastheer binnendringen.

5.1. Het Intestinaal Viroom

Er werd aangetoond dat het viroom meer gepersonaliseerd en stabiel is dan bakteriële intestinale gemeenschappen. De profilering van virale gemeenschappen bij vrouwelijke monozygote tweelingen en hun moeders gaf als resultaat een beperkte intra-persoonlijke variatie vergeleken met de hoge inter-persoonlijke virale variatie. Deze variabiliteit werd toegeschreven aan de aanwezigheid van individuele intestinale bakterieën én de snel evoluerende aard van virale populaties. De longitudinale staalname van een gezonde man gedurende een periode van 2,5 jaar onthulde dat 80% van de virale aangesloten stukken DNA-sequentie gedurende deze periode bleven bestaan. Variaties over tijd werden toegeschreven aan diversiteit-genererende retro-elementen – een familie van genetische elementen die dienen ter diversificatie van DNA-sequenties – en korte segmenten prokaryoot [eukaryoten = cellen met een echte kern die het DNA bevat en door een membraan omlijnd is -prokaryoten = bakterieën] DNA in bakteriële en archaeale [van oer-bakterieën] genomen, die kunnen vaststellen of een microbiële populatie eerder werd geïnfekteerd door fagen.

Viroom-sequentiebepaling is achtergebleven bij bakteriële microbioom studies; hoofdzakelijk ten gevolge technische beperkingen. Virale metagenomische studies etaleerden beperkte capaciteiten om virale sequenties aan klassen toe te schrijven: de databases hebben niet de geschikte diepgang om virussen te identificeren, laat staan specifieke bacteriofagen te linken aan individuele bakterieën of ziekte-toestanden. ‘Shotgun’-metagenomica [metagenomica = studie aangaande de genetische informatie van de bakterieën en die van de gastheer] is een techniek die directe analyse van willekeurige stukken van DNA-sequenties toelaat […]; er werden complete genomen van fagen en virussen die mensen infekteren geassembleerd. Metagenome sequentiebepaling analyses hebben echter dikwijls RNA-virussen genegeerd; hun rol in het intestinaal microbioom blijft onduidelijk en isolatie-procedures die in de eerste plaats werden ontworpen om DNA-virussen te isoleren, zouden de aanwezigheid van RNA-virussen over het hoofd kunnen hebben gezien in het intestinaal viroom. Pogingen tot karakterisatie van het viroom bleken slechts in staat 15% tot 87% virus-achtige partikel sequenties of ‘contigs’ in sequentie-databases toe te wijzen. Deze variabiliteit is een beperking van de taxonomische toewijziging-criteria en we kunnen enkel rapporteren over bakteriofagen die het nauwst verwant zijn met klassen in huidige databases. Er wordt gedacht dat dit het gevolg is van de snelle evolutie van fagen en hun sequenties, hoewel het ook kan komen door de initiële kwaliteit van de sequenties en het deel dat werd bijgeknipt vóór de analyse. Het is duidelijk dat elk individu een verschillende virale sequentie diversiteit vertoont, waarvan de volledige vertegenwoordiging van de aanwezige virussen enkel kan worden bekomen d.m.v. meer diepgaande sequentie-bepaling. Dergelijke technieken zijn vereist om ons in staat te stellen de gebieden van virale diversiteit, die verband houden met de virulentie van specifieke virussen of ziekte, te identificeren. Dit is een proces dat het opzetten van complete referentie-databases voor genen-families vereist, naast ‘reads’ die lang genoeg zijn om identificeerbaar te zijn.

Met de steeds groter wordende interesse en uitbreidend bewijsmateriaal aangaande de rol van fagen bij ziekte-toestanden, en het potentieel gebruik van fagen bij ziekte-bestrijding, is er belangstelling gekomen naar de rol van virussen bij normale menselijke fysiologie, met als een belangrijk research-gebied de bijdrage van de intestinale microbiota die de hersenen en het gedrag beïnvloeden als deel van de as darm-microbiota/brein.

5.2. De Darm-Microbioom/Brein As

Een mogelijk pathofysiologisch mechanisme voor de ontwikkeling van M.E./CVS kan worden verklaard via de geïntegreerde as darm-microbioom/brein [Lakhan SE, Kirchgessner A. Gut inflammation in Chronic Fatigue Syndrome. Nutr. Metab. (2010) 7: 79], die de fysiologische links tussen het microbioom en het centraal zenuwstelsel (CZS), het autonoom en darm- (enteraal) zenuwstelsel en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as beschrijft. Steeds meer bewijsmateriaal geeft aan dat de microbiota, via nog niet volledig gedefinieerde mechanismen en molekulaire mediatoren, kunnen communiceren met het CZS via immune, neurale en endocriene mechanismen, die waarschijnlijk effekten hebben op de cognitieve funktie en het gedrag.

Microbiële interakties met het darm-zenuwstelsel aangetoond werden uitgebreid aangetoond d.m.v. kiem-vrije muizen, wat toelaat de impact van koloniserende bakterieën (conventionalisering) op de stemming en cognitieve funktie te testen. Er wordt gedacht dat de fysiologische mechanismen waarmee stress de microbiota kan wijzigen, te wijten zijn aan z’n effekten op de intestinale fysiologie: verandering van de gastro-intestinale beweeglijkheid en secreties via verminderde golven van elektrische aktiviteit […] die door de ingewanden deinen in een regelmatige cyclus en de peristaltiek [knijpende beweging van de darm die ervoor zorgt dat het voedsel vooruitkomt] triggeren, de intestinale permeabiliteit verhogen en de regeneratieve capaciteit van de intestinale mucosa reduceren. Dit alles zorgt voor verandering in het natuurlijk milieu van intestinale microbiota. Verschillende microbiële niches binnen het intestinaal milieu initiëren de afgifte van stress-hormonen zoals norepinefrine, die de inter-bakteriële signalisering, de groei van specifieke pathogenen, naast hun vermogen om aan de intestinale mucosa te kleven, kunnen beïnvloeden. Er werden verschillen qua hersen-funktie aangetoond bij kiem-vrije en ‘specific pathogen free’ [SPF; term gebruikt voor laboratorium-dieren die gegarandeerd vrij zijn van bepaalde pathogenen] muizen; waarbij de kiem-vrije muizen overdreven hypothalamus-hypofyse responsen op milde stress vertonen, via verhoogde waarden adrenocorticotroop hormoon (ACTH) en corticosteron-afgifte, in vergelijking met SPF muizen. Dit werd daarna omgekeerd na conventionalisering bij kiem-vrije muizen d.m.v. faecale stalen van de SPF muizen. De onderzoekers toonden ook gestegen stress-responsen bij kiem-vrije muizen gekoloniseerd met enteropathogene E. coli, met daaropvolgende omkering van de door stress geïnduceerde ACTH- en corticosteron-waarden, wanneer kiem-vrije muizen gekoloniseerd werden met de menselijke commensaal [onschadelijk voor het gastheer-organisme] Bifidobacterium infantis [immunomodulerend potentieel]; het effekt werd gedeeltelijk omgekeerd wanneer kiem-vrije muizen werden gekoloniseerd met intestinale microben van SPF muizen. Interessant: Ze toonden deze omkeerbaarheid bij zeer jonge muizen, wat duidt op een potentieel stadium waarbij neuronen die stress-responsen regelen gevoelig zijn voor stimulatie door de microbiota. Er werd aangetoond dat stress geïnduceerd op jonge leeftijd leidt tot dysbiose bij kiem-vrije muizen en dat wordt geacht een kritieke determinant te zijn voor abnormale gedragingen. Bovendien toonde een ander onderzoek-team de invloed van de intestinale microbiota op synaptische brein aktiviteit aan: kiem-vrije muizen hadden verhoogde motor-aktiviteit en verminderde angst t.o.v. SPF muizen met normale microbiota, wat wijst op de invloed van intestinale microben op hersen-aktiviteit.

Verdere studies hebben de impact van gastheer-microbiota aangetoond op het controleren van de rijping en werking van microglia in het CZS. Heel significant: Een groep [‘McMaster University’ in Canada] voerde de eerste studie uit om het potentieel aan te tonen voor het transfereren van gedrag-kenmerken tussen muizen-stammen met angst en agressief gedrag, d.m.v. faecale microbiota transplantatie (FMT [“stoelgang-transplantatie”]). Het bestuderen van verbanden tussen autistisch spectrum aandoening (ASD) en de intestinale microbiota heeft mogelijkheden aangeduid voor de exploratie van M.E./CVS-groepen. Patiënten met ASD hebben, net zoals bij M.E./CVS, een hoge prevalentie qua gastro-intestinale dysfunktie, wat ook werd gelinkt aan veranderingen in de microbiota-samenstelling. Een studie die de connectie tussen de microbiota en hersen-funktie onderzocht bij ASD, toonde dat patiënten uitgesproken veranderingen qua microbiota vertonen, met specifieke wijzigingen wat betreft Clostridium soorten. Een team [‘California Institute of Technology’] toonde een darm-microbiota/brein connectie in een ASD-model met adolescente muizen (maternale immuun-aktivatie, MIA), waarbij defekten van de intestinale barrière en microbiota-veranderingen voorkomen. Na behandeling van de MIA bij het nageslacht met Bacteroides fragilis [anaërobe Gram-negatieve bakterie die deel uitmaakt van de normale commensale darm-flora], werd de intestinale permeabiliteit gecorrigeerd, en de microbiële samenstelling veranderd en met ASD gerelateerde gebreken (qua communicatie en gedrag) verminderd. Het MIA nageslacht vertoonde ook een gewijzigd serum metaboloom-profiel; specifiek: sleutel-molekulen in een tryptofaan-metabolisme mechanisme, met inbegrip van een verhoogde waarde serotonine, werden genormaliseerd na behandeling met B. fragilis. Dit werk wijst op de rol van probiotische bakterieën en bakteriële metabolieten bij het vermijden of veroorzaken van aandoeningen van de neurale ontwikkeling, suggestief voor een belangrijke rol voor de microbiota in de ontwikkeling van sociaal gedrag bij ASD. Van mogelijk belang bij M.E./CVS-research is de slaap-inducerende substantie afgeleid van bakteriële celwanden, Factor-S [slaap-bevorderende factor S]. Studies hebben gesuggereerd dat intestinale bakterieën een belangrijke bron van Factor-S vormen; in het bijzonder nadat werd aangetoond dat normale slaap-patronen ontregeld zijn na verstoring van de microbiota door orale antibiotica.

Stress, of de capaciteit van een organisme om het hoofd te bieden aan omgeving-vereisten, staat er om bekend de vatbaarheid voor ziekten (ook gastro-intestinale aandoeningen) te verhogen. Het is ook bekend dat voeding- en omgeving-stressoren op hun beurt verschillende microbiële niches creëeren die de lokalisatie van de verschillende microbiota-populaties beïnvloeden, wat pathogene bakteriële soorten kan bevoordelen. Dit kan leiden tot de afgifte van stress-hormonen en cytokinen zoals IL-6. Ook bakterieën kunnen reageren op hormonen en neurotransmitters of deze aanmaken – bv. Lactobacillus en Bifidobacteria soorten die acetylcholine en/of gamma-amino boterzuur (GABA) produceren; Escherichia soorten die norepinefrine, serotonine en dopamine aanmaken; en serotonine geproduceerd door Streptococcus en Enterococcus soorten. Deze kunnen allemaal tussenkomen in de regulering van stemming, cognitie, pijn en angst bij de gastheer.

Er valt duidelijk nog veel te leren over de molekulaire connecties en mechanismen betrokken bij de darm-microbiota/brein signalisering en hoe verstoringen van dit communicatie-mechanisme aanleiding zou kunnen geven tot ziekte-toestanden. Het effekt van de intestinale microbiota op het CZS en cognitieve funktie vertegenwoordigt opwindende en potentieel vruchtbare opportuniteiten voor toekomstig onderzoek en het verklaren van de manifestatie van de kern-symptomen van M.E./CVS. Ook de opkomst van ‘biotica’ (probiotica en/of prebiotica) en FMT biedt opportuniteiten om de microbiota te manipuleren om de gezondheid van de darm te verbeteren of herstellen, en de impact op hoe het de werking van andere orgaan-systemen, inclusief het immuunsysteem en het CZS, beïnvloedt.

6. Een Voorstel voor Toekomstige Research: Intestinale Dysbiose drijft Auto-immuniteit bij M.E./CVS

Het is aannemelijk dat M.E./CVS een niet-klassiek auto-immuun pad volgt en er werd reeds beschreven dat het idiopathische immuun-ontregeling omvat. Gebaseerd op bewijsmateriaal dat in dit overzicht hier werd gepresenteerd, zou een kandidaat voor chronische stimulatie van het immuunsysteem die auto-immune processen triggert kunnen worden gevonden in het intestinaal viroom. Het is waardevol te benadrukken dat als fylogenetische verschillen [fylogenie = studie van verwantschap van organismen] in het viroom en microbioom kunnen worden gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten, toekomstige research dient gericht te zijn op het bepalen van de gevolgen van dergelijke veranderingen en hun impact op de funktionaliteit van de microbiota. Dit zou dan inzicht kunnen bieden in de adaptieve mechanismen van commensalen en mogelijke pathogene micro-organismen die vereist zijn voor persistentie in het gastro-intestinaal kanaal, naast het beschrijven van hoe de microbiota de ontwikkeling en werking van het immuunsysteem bij deze patiënten vormgeeft.

Het viroom speelt klaarblijkelijk een aanzienlijke rol in het microbioom, waarbij bakteriofagen een grote impact op de dynamiek en evolutionaire processen van hun gastheer-populaties bleken te hebben, en de identificatie van nieuwe virussen is van duidelijk belang. Onderzoekers toonden dat microbiële gastheren specifiek geassocieerd waren met bepaalde virussen, suggestief voor een langdurige co-evolutie tussen de virussen en hun gastheer, en indicatief voor het feit dat het profileren van bakteriële gemeenschappen enige connectie tussen viroom-samenstelling en M.E./CVS zal versterken. Zoals andere onderzoekers toonden in een studie van het darm-viroom bij inflammatoire darm ziekte: de kracht van de detektie van met ziekte geassocieerde veranderingen in het viroom werd slechts geobserveerd via vergelijking van patiënten en controles uit hetzelfde huishouden, waardoor kan worden gecontroleerd voor de invloed van genetica en omgeving. Toekomstige studies zullen dienen rekenschap te geven voor variabiliteit op species-niveau in de gastheer via analyse bij voor leeftijd en geslacht gematchte controle-deelnemers.

De samenstelling van het menselijk darm-viroom toont dat de significante variatie afhankelijk is van de bakteriële populatie en beklemtoont de voordelen van de gelijktijdige profilering van virale en bakteriële gemeenschappen bij toekomstige microbioom-studies. We stellen voor dat fagen vormgeven aan de bakteriële microbiota via […] een mechanisme waarbij aktief replicerende of reaktiverende fagen hun bakteriële gastheren lyseren, de proporties van specifieke bakteriële soorten wijzigen en dysbiose induceren. Op het moment dat gelyseerde bakterieën hun cel-inhoud – bestaande uit of proteïnen en nucleïnezuren – afgeven, dienen deze produkten als antigenen en ‘microbe-associated molecular patterns’ (MAMPs) [molekulen geassocieerd met pathogenen, die worden herkend door cellen van het aangeboren immuunsysteem] die mucosale gastheer-responsen triggeren […]. De capaciteit van virussen om mucosale responsen te stimuleren, werd ook overwogen omwille van de constante re-infektie van virussen met lage virulentie en mensen die chronisch drager waren van virussen, wat geassocieerd is gebleken met een verhoogd risico op het ontwikkelen van ziekten zoals astma en type-1 diabetes.

Door virussen geïnduceerde inflammatie kan leiden tot verhoogde epitheliale doorlaatbaarheid in de darm resulterend in translocatie van fagen doorheen het slijmvlies-oppervlak en meer systemische blootstelling aan microbiële epitopen [epitoop = deel van een macromolekule (meestal proteïne) dat kan worden herkend door antilichamen of cellen van het immuunsysteem]. Orale toediening van fagen in dier-studies hebben translocatie van fagen naar de weefsels aangetoond en experimentele studies naar faag-interakties met het immuunsysteem hebben gevonden dat vrije faag-partikels zich verspreiden via breuken in de intestinale mucosa [slijmvlies; dunne laag cellen die slijm produceert ter bescherming] of door transport door dendritische cellen [type witte bloedcellen, antigen-presenterende cellen die immuun-responsen initiëren en reguleren], waarbij fagen immunogeen genoeg zijn om antilichamen te genereren bij kinderen. Deze studies suggereren dat zoogdieren beschikken over mechanismen voor de opname en afgifte van fagen, die intestinale fagen toelaten om aangeboren en adaptieve immuun-responsen uit te lokken. Daarom zouden fagen kunnen optreden als liganden voor de aangeboren immuniteit die gastheer-immuniteit en inflammatie stimuleren, kenmerkend voor een milieu van dysbiose en auto-immuniteit.

Testen op basis van culturen die de bakteriële componenten van M.E./CVS-patiënten karakteriseren, hebben een vermindering van de proporties qua Bifidobacteria soorten gerapporteerd die kan bijdragen tot het handhaven van de epitheliale integriteit in de darm. Een reductie van deze nuttige Gram-positive bakterieën kan de ontwikkeling en interaktie van schadelijke Gram-negatieve bakterieën in de intestinale slijmvlies-oppervlakken begunstigen, of door het wegwerken van de voordelige kenmerken van Bifidobacteria soorten de symptomen van M.E./CVS bespoedigen. Bv.: een toename van Bifidobacteria bleek geassocieerd met verhoogde tryptofaan-waarden in het plasma, en serotonine- en dopamine-aanmaak in hersen-gebieden die verbonden zijn met depressie en angst [Bifidobacteria infantis; bij ratten]. Andere studies hebben getoond dat bepaalde Bifidobacteria-soorten een significante impact hebben op funktionele verbeteringen qua NK-cel aktiviteit en lagere waarden qua IL-4, IL-5 & IL-10 cytokinen [Bifidobacterium lactis HN019]. Deze effekten ondersteunen de aanwezigheid van Th1 cel-gemedieerde immuniteit, belangrijk voor de controle van virussen en bakterieën. NK-cellen interageren ook met dendritische cellen, die in nauw contact staan met het darm-epitheel en tolerogene [aanleiding gevend tot immunologische tolerantie; tolerantie is het proces waarbij het immuun-systeem een antigen niét aanvalt] responsen opzetten om immuun-homeostase in de darm te bewaren. Elke ontregeling van deze fijn afgestelde interface tussen bakteriële soorten, immuun-funktie en epitheliale cel barrière zou aanleiding kunnen geven tot ongepaste immuun-responsen. Gezien de gesuggereerde immuun-modulerende eigenschappen van Bifidobacterium, is het mogelijk dat de fagen geassocieerd met Bifidobacteria-soorten, via hun invloed op diversiteit en funktie van hun gastheer-bakterieën, dergelijke immunologische effekten kunnen initiëren. Verdere studies, die de interakties onderzoeken tussen de bepalende bakterie-soorten, fagen en de mucosale immuun-respons, om een completer beeld van het intestinaal milieu bij M.E./CVS te schetsen, zijn vereist. De identificatie van de genen geassocieerd met leden van de microbiota kan waardevolle informatie bieden over gastheer-microbiota interakties. Nu zou de focus zou moet liggen op het begrijpen hoe faag-genomen verband houden met elkaar en met hun gastheren, en de evolutionaire mechanismen die faag-populaties vorm geven. In vivo studies en dier-modellen zullen metagenomische bevindingen in kracht doen toenemen, en zo inzicht bieden omtrent hoe fagen en eukaryote virussen de commensale bakterieën modelleren, en over hun impact op gastheer-immuniteit en gen-expressie. Een ‘bacteriophage adherence to mucus’ model werd aangewend om te tonen dat de binding van fagen aan de intestinale slijmlaag resulteert in een dramatische afname van de bakteriële hechting aan de slijmlaag, en significant de schade aan gecultiveerde cellen vermindert. Meer diepgaande, gedetailleerde sequentie-bepaling benaderingen en uitgebreidere databases zullen zeker de identificatie van virussen, verantwoordelijk voor de niet-gekarakteriseerde ‘dark matter’ van het menselijk darm-viroom, verbeteren.

7. Concluderende Opmerkingen

Hoewel studies tot op heden niet in staat bleken één bepaalde microbiële signatuur te identificeren die een pathogenetische rol van de intestinale microbiomen bij M.E./CVS vaststelt, karakteriseert een cyclus van chronische intestinale dysfunktie en instabiliteit van de microbiomen zeker een subgroep M.E./CVS-patiënten. Het verder zoeken naar de rol van intestinale microbiële dysbiose in de pathofysiologie van M.E./CVS zal wellicht bepalen hoe immunologische ontregeling zich manifesteert. Het gebruik van ‘next-generation’ sequentie-bepaling technieken en metagenomische instrumenten zouden voorspellers voor ziekte-herval en chroniciteit kunnen identificeren, gezien de technologie continu wordt aangepast voor gebruik bij virale ecosystemen. Analoog met IBD-studies, kunnen karakterisatie van microbiomen wellicht een duidelijker subpopulatie toelichten binnen de huidige M.E./CVS-klassificaties. Uiteindelijk zal het observeren van een verband tussen microbiële fylogenie en het M.E./CVS ziekte-fenotype de impact van de microbiële gemeenschap op de menselijke gezondheid kunnen onderlijnen, en heeft het potentieel om ziekte-biomerkers te identificeren en therapeutica aan te duiden, om zo de broodnodige benadering te bieden ter voorkoming of beheersing van een ziekte als deze die dringend het hoofd dient te worden geboden.

oktober 6, 2016

Verband tussen biomerkers met levenskwaliteit en stressoren bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 6:28 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel is een verderzetting van het werk door de Franse onderzoeksgroep rond Prof. dr Jammes (fysioloog). Zie: ‘Infektie vóór CVS: oxidante status, kalium-uitstroom en spier-prikkelbaarheid bij inspanning’, ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ & ‘Oxidatieve stress’.

Voor info betreffende CD26: lees ‘Neuropeptide-Y en CD-26’ & ‘‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?’.

————————-

Journal of Translational Medicine (2016) 14: 251

Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients

Emmanuel Fenouillet (1,2), Aude Vigouroux (3), Jean Guillaume Steinberg (1), Alexandre Chagvardieff (4), Frederique Retornaz (5), Regis Guieu (1), Yves Jammes (1,6)

1 DS-ACI UMR MD2, Faculty of Medicine, Aix-Marseille University

2 CNRS, Institut des Sciences Biologiques

3 Clinical Respiratory Physiology Laboratory, Nord Hospital

4 Emergency Unit, Nord Hospital

5 Internal Medicine Department, European Hospital

6 Clinical Respiratory Physiology Laboratory, Nord Hospital

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een courante invaliderende aandoening met een intense vermoeidheid, verminderde fysieke aktiviteit en gedaalde levenskwaliteit. Er zijn geen biologische merkers voor het syndroom. De etiologie is onbekend en de pathogenese lijkt multi-factorieel. Verscheidene stressoren, inclusief intense lichamelijke aktiviteit, ernstige infektie en emotionele stress worden gerapporteerd in de medische geschiedenis van M.E./CVS-patiënten; wat de vraag doet rijzen of de fysiologische en biologische abnormaliteiten die gewoonlijk bij deze patiënten worden gevonden indicatief zouden kunnen zijn voor de etiologie en/of gedaalde levenskwaliteit.

Methodes Er werden 36 patiënten en 11 voor leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. De volgende variabelen werden hier bestudeerd: (1) spier-vermoeidheid tijdens inspanning werd onderzocht via het monitoren van de ‘compound muscle action potential’ (‘M-wave’) [ook ‘evoked compound muscle-potential’; een zenuw wordt elektrisch gestimuleerd en de opgewekte respons kan worden gemeten; een manier om perifere spier-vermoeidheid bij inspanning te meten]; (2) de overmatige oxidatieve stress-respons op inspanning werd gemeten via 2 plasma-merkers (thiobarbituurzuur reaktieve substanties: TBARS [bepaling van de lipiden-peroxidatie]; gereduceerd ascorbinezuur: RAA [vitamine-C]); (3) een potentiële inflammatoire component werd bekeken via de expressie van CD26 [aktivatie-merker dipeptidyl-peptidase-IV (DPP-IV of DPP-4); een trans-membraan glycoproteïne en enzyme dat polypeptiden, inclusief chemokinen en neuropeptiden, splitst] op perifeer bloed mononucleaire cellen; (4) verminderde levenskwaliteit werd beoordeeld gebruikmakend van de ‘London Handicap Scale’ (LHS) en de ‘Medical Outcome Study Short Form-36’ (SF-36). De medische voorgeschiedenis van elke patient, met inbegrip van de aanwezigheid van stressoren zoals intens sporten, ernstige acute infektie en/of ernstige emotionele stress, werd gedocumenteerd.

Resultaten We zagen dat: (1) er opvallende verschillen waren tussen de patiënten en de controles wat betreft 3 biologische variabelen: ‘M-wave’ na inspanning, TBARS-variaties & CD26-expressie in rust; (2) elk van deze 3 variabelen correleerde met de andere 2; (3) abnormaliteiten van de biomerkers geassocieerd met gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit: de LHS-score was negatief gecorreleerd met de inspanning-geïnduceerde TBARS-toename en positief gecorreleerd met CD26-expressie, terwijl de pijn-component van de SF-36 negatief was gecorreleerd met CD26-expressie; (4) de TBARS-toename en de afname qua ‘M-wave’ waren het grootst, en het niveau van de CD26-expressie het laagst bij patiënten die infektueuze stressoren ondergingen.

Besluit Bij M.E./CVS-patiënten zijn ernstige veranderingen van de spier-exciteerbaarheid, de redox-toestand, alsook het niveau van de CD26-expressie gecorreleerd met een uitgesproken verstoring van de levenskwaliteit. Ze zijn bijzonder significant wanneer infektueuze stressoren werden gerapporteerd in de medische voorgeschiedenis.

Achtergrond

[…] De definities van M.E./CVS gebruiken geen biologische merkers. […]

Sporten induceert een matige oxidatieve stress bij gezonde individuen terwijl bij M.E./CVS-patiënten een sterke door inspanning geïnduceerde produktie van reaktieve zuurstof soorten (ROS) wordt gevonden [o.a. Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome combines increased exercise-induced oxidative stress and reduced cytokine and Hsp responses. J Intern Med. (2009) 266: 196-206 /// Fulle S et al. Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis. J Muscle Res Cell Motil. (2007) 28: 355-62 /// Moorkens G et al. Antioxidant status and lipoprotein peroxidation in Chronic Fatigue Syndrome. Life Sci. (2001) 68: 2037-49]. De anti-oxidante respons is ook veranderd in rust, zoals wordt aangetoond door een verhoogde waarde qua thiobarbituurzuur reaktieve substanties (TBARS: een merker voor lipiden-peroxidatie) en een gedaalde concentratie gereduceerd ascorbinezuur (RAA: een endogeen anti-oxidant). Omdat de gestegen ROS-aanmaak de spier-exciteerbaarheid aantast, zou de verhoogde redox-stress bij M.E./CVS kunnen bijdragen tot de spier-vermoeidheid (welke werd aangetoond via een verandering van ‘compound evoked muscle action potential’, ‘M-wave’) [Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle excitability in response to incremental exercise. J Int Med. (2005) 257: 299-310].

De significante ontregeling van het immuunsysteem die wordt gevonden bij M.E./CVS-patiënten combineerde verhoogde waarden pro-inflammatoire cytokinen (bv. interleukine-1, tumor necrose factor-α), een ‘natural killer’ cel cytokine-produktie en mitogen-geaktiveerd proteïne-kinase [MAP-kinase reageert op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleert verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose.] [bv. Brenu EW, Staines DR, Klimas NG et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Staines D et al. ERK1/2, MEK 1/2 and p38 downstream signaling molecules impaired in CD56(dim)CD16(bright)CD16(dim/-) natural killer cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients. J Transl Med. (2016) 14: 97]. Een studie identificeerde ook een verband tussen immune abnormaliteiten en de ernst van M.E./CVS-symptomen & een veranderde levenskwaliteit [Hardcastle SL, Brenu EW, Johnston S, Nguyen T, Huth T, Ramos S, Staines D, Marshall-Gradisnik S. Longitunical analysis of immune abnormalities in varying severities of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2015) 13: 299]. Deze immunologische abnormaliteiten omvatten ook verminderde expressie van de T-cel aktivatie-merker CD26 op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) [Fletcher MA, Zeng XR, Maher K, Levis S, Hurwitz B, Antoni M, Broderick G, Klimas NG. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817]. Deze observatie, samen met de meldingen dat CD26-expressie verhoogd is bij patiënten met fibromyalgie [Guieu R et al. High cell surface CD26-associated activities and low plasma adenosine concentration in fibromyalgia. Ann Rheum Dis. (2012) 71: 1427-8] of metabool syndroom, geeft aan dat veranderingen qua CD26-expressie aanwezig zijn bij sommige musculaire aandoeningen.

Naast T-cel aktivatie en inflammatie-controle, zou CD26 ook betrokken kunnen zijn bij M.E./CVS door zijn endoproteolytische aktiviteit [splitsing van de peptide-verbindingen binnen in proteïnen] die de circulerende waarden van verscheidene effectoren betrokken bij angst, chronische pijn en spier-metabolisme controleren. Zodoende zou CD26 stemming, pijn en spier-componenten van M.E./CVS kunnen beïnvloeden. De daling qua CD26-expressie bij M.E./CVS zou ook geassocieerd kunnen zijn met een gewijzigde redox-toestand.

Bij het zoeken naar hulp bij de diagnose van M.E./CVS, werd in studies gezocht naar een correlatie tussen symptomen (gemonitord via analoge vermoeidheid-schalen) en merkers, in het bijzonder, voor oxidatieve stress en immuniteit [McGregor NR et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox Rep. (2000) 5:35-44 /// Vecchiet J et al. Relationship between musculoskeletal symptoms and blood markers of oxidative stress in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neurosci Lett. (2003) 335:151-4 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med. (2005) 39:584-9]. Andere studies rapporteerden een verandering van de gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit bij M.E./CVS-patiënten maar onderzochten het verband met biologische veranderingen niet.

Zoals hierboven aangegeven zijn de huidige definities voor M.E./CVS gebaseerd op symptomen en gebruikt men geen biomerkers. Dit werpt de vraag op of mensen met M.E./CVS enige biologische abnormaliteiten delen. Als dat zo is, dan zouden de bij deze patiënten gevonden fysiologische en biologische abnormaliteiten diagnostische merkers kunnen worden.

Methodes

Patiënten

[…] 36 M.E./CVS-patiënten en 11 voor leeftijd gematchte gezonde controles. De M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd: 41 ± 6 jaar; gemiddeld gewicht: 66 ± 3 kg; 22 vrouwen) […] voldeden aan de criteria gedefinieerd door het ‘Institute of Medicine’: (1) ernstige chronische vermoeidheid gedurende > 6 opéénvolgende maanden (36/36); (2) een verslechtering van de ziekte na verhoogde fysieke of cognitieve aktiviteit (36/36); (3) problemen met korte-termijn geheugen of concentratie (36/36), (4) spierpijn (24/36); (5) niet-verfrissende slaap (21/36). In de meeste gevallen begon de M.E./CVS plots (30/36), dikwijls met een griep-achtige ziekte (28/36). Uitsluitende diagnoses: medische en psychiatrische oorzaken van aanhoudende vermoeidheid.

De gegevens van de M.E./CVS-patiënten werden vergeleken met deze van een voor leeftijd gematchte controle-groep (leeftijd: 48 ± 5 jaar; gewicht: 71 ± 4 kg; 6 vrouwen; dezelfde socio-economische klasse. […]

Gezien hun medische voorgeschiedenis werden patiënten retrospectief in 4 groepen opgedeeld: (1) patiënten die rapporteren intens aan sport te hebben gedaan (> 6 h/week) (n = 10), (2) patiënten die rapporteren de diagnose van een ernstige acute infektie (peritonitis, sepsis, vogel-griep, …) te hebben gekregen (3-7 maand vóór de aanvang van M.E./CVS (n = 7), (3) patiënten die rapporteren ernstige emotionele stress (moeilijke echtscheiding, sterfte van een kind, …) te hebben ondervonden (n = 11) of (4) patiënten met een combinatie van ernstige infektie en emotionele stress (n = 8).

[…]

Resultaten

Biochemische variabelen en spier-exciteerbaarheid in rust en bij VO2max

Er werden significante biochemische verschillen gezien tussen M.E./CVS-patiënten en controles in rust: de RAA/TBARS verhouding en de expressie van CD26 op PBMCs was lager bij de patiënten.

De inspanning-geïnduceerde veranderingen van de ‘M-wave’ amplitude (Δ‘M-wave’) waren significant hoger bij de patiënten dan bij controles. Er werd enkel bij de patiënten een significante toename gevonden qua TBARS na inspanning. Omdat de duur van de of inspanning-test (10-12 min) onder de tijd ligt die nodig is voor de synthese en expressie van CD26, onderzochten we niet bij alle patiënten of de fiets-inspanning de CD26-expressie kon beïnvloeden (we bekeken de situatie bij 10 patiënten en vonden geen verschillen).

De gegevens verkregen in rust en bij VO2max tonen dat de redox-toestand, CD26-expressie en spier-exciteerbaarheid veranderd waren bij M.E./CVS. Wanneer we onderzochten of deze karakteristieken geassocieerd zijn, vonden we (1) een negatieve correlatie tussen Δ‘M-wave’ en ΔTBARS, (2) een positieve correlatie tussen Δ‘M-wave’ en CD26-expressie, en (3) een negatieve correlatie tussen ΔTBARS en CD26-expressie. We vonden geen correlatie in rust tussen TBARS, RAA/TBARS-verhouding en CD26-expressie.

Verband tussen biologische merkers en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

De scores van gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit werden bij de patiënten uitgezet t.o.v. de ΔTBARS-waarde of de CD26-expressie. De LHS-score was negatief gecorreleerd met ΔTBARS en positief gecorreleerd met CD26-expressie. De pijn-component van de SF-36 vragenlijst was negatief gecorreleerd met CD26-expressie.

Verband tussen biologische merkers en stressoren

Bij opdeling van de 4 groepen naar gelang hun medische geschiedenis, zagen we dat: (1) de ‘M-wave’ significant gereduceerd bleek wanneer infektie en omgeving-stressoren werden gecombineerd; (2) ΔTBARS-waarden en CD26-expressie uitgesproken waren veranderd bij patiënten die een ernstige infektie hadden, ongeacht de aanwezigheid van ernstige emotionele stress; (3) de LHS-score uitgesproken laag was bij patiënten die een ernstige infektie hadden ongeacht de aanwezigheid van ernstige emotionele stress, terwijl de score voor de pijn-component van SF-36 enkel hoog was bij een combinatie van infektie en emotionele stressoren. Deze resultaten ondersteunen het belang van infektueuze stressoren bij deze variabelen.

Bespreking

Bij M.E./CVS-patiënten vonden we dat (1) de veranderingen qua ‘M-wave’ amplitude na inspanning, de wijzigingen in de redox-toestand geïnduceerd door spier-inspanning en de CD26-expressie gecorreleerd zijn; (2) de LHS-score gecorreleerd was met de wijzigingen in de redox-toestand geïnduceerd door inspanning en CD26-expressie; (3) de pijn-component van de MOS SF-36 gecorreleerd was met de CD26-expressie. Deze variabelen waren voornamelijk veranderd bij patiënten met een geschiedenis van infektueuze ziekte.

De oxidatieve stress wijst op een onevenwicht tussen pro- en anti-oxidante toestand, in de richting van het eerste. Bij gezonde individuen is een dergelijke situatie courant in skelet-spieren na inspanning omdat de anti-oxidante verdediging in spieren zwak is. Bij M.E./CVS-patiënten blijken – uit dit werk en dat van anderen – verhoogde waarden van bloed-merkers voor oxidatieve stress (hier TBARS) en een verlaagde anti-oxidante verdediging (hier RAA); een situatie die oxidatieve stress bevordert, en eventueel de membraan-exciteerbaarheid van de spieren aantast. De correlatie die hier werd gevonden tussen het niveau oxidatieve stress en de ‘M-wave’ verandering is consistent met deze gegevens.

Ons werk rapporteert ook de correlatie van de redox-merkers met LHS-score voor levenskwaliteit. Dit verband is in overéénstemming met studies die de impact onderzochten van een veranderde oxidante/anti-oxidante status bij M.E./CVS en vonden dat de bloed-waarden in rust van malondialdehyde [merker voor oxidatieve stress] [zie McGregor NR et al. hierboven] en TBARS [zie Vecchiet J et al. hierboven] geassocieerd zijn met variaties qua cognitieve symptomen en slaap-stoornissen, terwijl de totale symptoom-score, gewricht-pijn en post-exertionele malaise gecorreleerd zijn met de isoprostaan-waarden [zie Kennedy G, Spence VA et al. hierboven].

Wat betreft CD26 vonden we dat de expressie gedaald was bij M.E./CVS-patiënten. Deze observatie ondersteunt een rapport [zie Fletcher et al. hierboven] maar contrasteert met een studie bij M.E./CVS-patiënten die werden onderzocht na een infektie met Giardia [darm-parasiet]. De CD26 protease-aktiviteit controleert de circulerende waarden van meerdere mediatoren voor pijn en stemming. Omdat stemming-wijzigingen en spierpijn dikwijls voorkomen bij M.E./CVS, werden de concentraties van CD26-peptide substraten bekeken bij patiënten, en er werden discrepante besluiten bereikt wat betreft Neuropeptide-Y en Substantie-P [Broderick G, Klimas NG et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76 /// Evengard B et al. Chronic Fatigue Syndrome differs from fibromyalgia. No evidence for elevated substance P levels in cerebrospinal fluid of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain (1998) 78: 153-5]. Hier vonden we dat de scores die de levenskwaliteit weerspiegelen gecorreleerd zijn met CD26-expressie. Dit resultaat is in overéénstemming met de observaties dat spierpijn dikwijls werd gemeld door onze patiënten (24/36), met een impact op hun levenskwaliteit-scores. We zagen ook dat de CD26-expressie daalde, wat kan leiden tot stijging van de circulerende pro-nociceptieve [pijn-gevoeligheid verhogende] peptiden en spierpijn bevorderen.

Twee studies onderzochten de CD26-expressie in een context van redox-wijzigingen. Bij acute lymfoblastische leukemie [een vorm van ‘bloedkanker’] is het CD26-niveau gecorreleerd met de aktiviteiten van myeloperoxidase [enzyme dat helpt om ROS te elimineren], glutathion-s-transferase [beschermt cellen tegen oxidatieve schade] en xanthine-oxidase [ROS-genererend enzyme]. Bovendien werd aangetoond dat een langdurig verlies van CD26-expressie de capaciteit verhoogt om te beschermen tegen de oxidatieve stress [in cardiomyocyten van ratten]. Het lage CD26-expressie niveau dat hier werd gerapporteerd bij M.E./CVS kan daarom een adaptieve respons vormen op het chronisch redox-onevenwicht dat wordt gevonden bij M.E./CVS-patiënten; deze hypothese wordt ondersteund door de correlatie die we vonden tussen de CD26-aktiviteit en de redox-toestand.

Ten slotte: wanneer patiënten werden gesorteerd op basis van de aanwezigheid van infektie/ intense lichamelijke aktiviteit/ emotionele stress, zagen we dat de individuen die episode(s) ernstige infektie rapporteerden, waarden voor biomerkers en scores voor levenskwaliteit hadden die meer gewijzigd bleken t.o.v. deze gemeten bij patiënten die geen ernstige infekties hadden vermeld. Deze resultaten ondersteunen verder de rol van infektueuze stressoren bij M.E./CVS.

We geloven dat deze studie 3 beperkingen heeft: (1) we kwantificeerden de emotionele stress niet correct omdat slechts de aanwezigheid van één belangrijke stressvolle levensgebeurtenis werd beschouwd; (2) om het effekt van CD26-aktiviteit op z’n peptide-substraten te bekijken, ondernamen we metingen van de circulerende waarden van Neuropeptide-Y en Substantie-P bij de patiënten maar we detekteerden geen correlatie met het CD26-expressie niveau, wat kan worden verklaard door het feit dat slechts plaatselijke concentraties van pijn- en stemming-mediatoren in vivo werken en het onmogelijk is ze in situ te bepalen; (3) zoals in eerdere M.E./CVS-studies was de bevinding van een gewijzigd redox-evenwicht bij onze individuen enkel gebaseerd op metingen van TBARS (een kwantificatie van de waarden van membraan-lipoperoxiden resulterend uit een overmatige ROS-produktie) en van gereduceerd ascorbinezuur (een belangrijke plasma anti-oxidant). Zodoende kan de werkelijke verbetering van intracellulaire ROS-produktie bij M.E./CVS niet worden geëvalueerd; ten eerste omdat er spier-biopten nodig zouden zijn en ten tweede omdat er een tegengewicht wordt gevormd door de intracellulaire anti-oxidanten die in de huidige studie niet werden onderzocht.

Besluit

In overéénkomst met een rapport dat stelt dat patiënten met ernstige M.E./CVS met verloop van tijd verschillen van mensen met matige M.E./CVS en significante immune abnormaliteiten vertonen, geven onze resultaten aan dat de simultane monitoring van de spier-funktie, redox-respons en CD26-expressie zouden kunnen bijdragen, samen met gezondheidtoestand-schalen, tot het identificeren van M.E./CVS en het beoordelen van de ernst ervan. Deze resultaten zouden ook kunnen helpen bij het maken van het onderscheid tussen M.E./CVS en fibromyalgie, omdat de CD26-aktiviteit op PBMCs stijgt bij fibromyalgie terwijl deze daalt bij M M.E./CVS-patiënten.

februari 18, 2016

‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie

Filed under: Immunologie,Infektie — mewetenschap @ 10:00 am
Tags: , , , ,

In ‘Heterologe immuniteit – overzicht’ lazen we al dat auto-immune ziekten kunnen worden geïnitieerd door infektie met virussen die coderen voor T-cel epitopen die kruis-reaktief zijn met ‘zelf’-antigenen, of geïnfekteerd met virussen die voor ‘zelf’-epitopen coderen. De aanwezigheid van kruis-reaktieve responsen die ‘zelf’ pathogeen-antigenen herkennen leidt niet noodzakelijkerwijs tot auto-immuniteit. Er moet een uitlokkende gebeurtenis, zoals een virale infektie, plaatsvinden…

Donald R. Staines (Australië) schreef in ‘Is Chronic Fatigue Syndrome an auto-immune disorder of endogenous neuropeptides, exogenous infection and molecular mimicry?’ (Medical Hypotheses (2004) 62: 646-652) reeds over een mogelijk mechanisme voor de ontwikkeling van CVS dat gebaseerd is op het verlies van immunologische tolerantie voor vaso-aktieve neuropeptiden (die werken als hormonen, neurotransmitters, immuun-modulatoren en neurotrofen (substanties die de overleving/groei van neuronen beschermen en bevorderen); en een rol spelen bij bloeddoorstroming in organen, thermoregulering, geheugen en concentratie) na infektie of significante lichamelijke inspanning.

Wellicht omwille van de complexiteit van de behandelde materie kreeg deze hypothese niet de aandacht die ze wellicht verdiende. In onderstaand artikel benaderen Britse onderzoekers dit alles iets breder en proberen ze de zaken wat éénvoudiger uit te leggen. Hopelijk wordt dit nu opgepikt en is dit een aanzet voor meer onderzoek op dit gebied.

Eenvoudig uitgelegd betekent ‘molecular mimicry’ (‘mimic’ = imiteren of nabootsen) dat een deel van een bepaald proteïne (peptide) sterk gelijkt op een deel van een totaal verschillend proteïne. De types proteïnen die een rol kunnen spelen bij auto-immune ziekte zijn ‘self’-proteïnen (‘eigen’, deel uitmakend van het menselijk lichaam; bv. myeline bij MS), proteïnen van infektueuze agentia (virus/bakterie) en voedsel-proteïnen. Het immuunsysteem herkent een deel van het proteïne van een indringer d.m.v. T-cellen – die receptoren (TCR) dragen die korte segmenten herkennen – geholpen door zgn. antigen-presenterende cellen (zoals macrofagen; die de indringer afbreken). De macrofaag gaat dan een proteïne-fragment (peptide) op zijn oppervlak dragen en ‘presenteert’ het dan aan de miljoenen circulerende T-cellen. Een T-cel met een passende receptor hecht zich aan het gepresenteerde proteïne-fragment, waardoor deze geaktiveerd wordt en andere delen van het immuunsysteem stimuleert (immuun-respons). Er is gebleken dat verscheidene gelijkaardige, maar ietwat verschillende fragmenten, door dezelfde T-cel kunnen worden herkend. Zo kan ‘molecular mimicry’ een auto-immune reaktie triggeren. Als het proteïne-fragment van een vreemde indringer, dat aan de T-cel wordt gepresenteerd, nauw verwant is met een deel van een ‘self’-proteïne (autoreaktive T-cel) dan zal het geaktiveerde immuunsysteem dit ook aanvallen (kruis-aktivatie => auto-immune respons). Het auto-immuniteit mechanisme kan ook via een antilichaam (i.p.v een T-cel) verlopen. En soms is het nog wat ingewikkelder dan dit maar dat zou ons te ver brengen… Auto-immuniteit is dus het resultaat van verlies van de immunologische tolerantie, de capaciteit van een individu om het onderscheid te maken tussen ‘self’ (eigen aan het lichaam) en ‘non-self’.

Merk op dat ook deze hypothese aangeeft dat niet één enkel micro-organisme de oorzaak van M.E.(cvs) zou zijn…

————————-

Med Hypotheses (2016) 87: 40-3

Microbes, molecular mimicry and molecules of mood and motivation

Morris JA (1), Broughton SJ (2), Wessels Q (2)

1 Department of Pathology, Royal Lancaster Infirmary, Lancaster LAI 4RP, UK

2 Faculty of Health and Medicine, Lancaster University, Lancaster LA1 4YQ, UK

De hypothese stelt dat funktionele aandoeningen [‘functional disorder’ of ‘functional somatic syndrome’ = lichamelijk syndroom zonder een verklaring voor organische ziekte, aantoonbare strukturele veranderingen of vastgestelde biochemische abnormaliteiten”. O.i. eigenlijk niet van toepassing op M.E.(cvs) waar wel degelijk abnormaliteit worden gevonden!], zoals prikkelbare darm syndroom, Chronische Vermoeidheid Syndroom en anorexia nervosa worden veroorzaakt door auto-antilichamen tegen neuronale proteïnen geïnduceerd door molekulaire ‘mimicry’ [nabootsing] met microbiële antigenen. De leeftijd-incidentie [voorkomen per leeftijd] van deze aandoeningen, het uitgesproken overwicht bij vrouwen, toename bij economische en technologische vooruitgang, het versneld worden door infektie en het ontbreken van histologische veranderingen zijn allemaal consistent met de hypothese. Ze kan direct worden getest aan de hand van menselijke serum-stalen, door te zoeken naar kruis-reaktie met hersen-proteïnen in model-systemen zoals Drosophila melanogaster [fruitvlieg]. De aandoeningen zouden in aanmerking kunnen komen voor behandeling met gepoold immunoglobuline. Identificatie en eliminatie van bakterieën die de kruis-reagerende antigenen tot expressie brengen, zou mogelijk moeten zijn.

Inleiding

Funktionele aandoeningen, zoals prikkelbare darm syndroom, Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en anorexia nervosa (AN) zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit. Ze vormen een aanzienlijk deel van de belasting van de gemiddelde huisarts maar de pathogenese blijft een mysterie. Anders dan de meeste ziekten die bij mensen voorkomen, zijn er geen consistente microscopische veranderingen in lichaamsweefsels die een aanwijzing zijn voor de oorzaak. Deze funktionele aandoeningen hebben echter een aantal gemeenschappelijke kenmerken:

  1. Ze komen veel meer voor bij vrouwen dan bij mannen.
  2. De aanvang van de aandoening is meestal rond middelbare leeftijd. De leeftijd-incidentie bereikt een piek tussen de 20 en de 40, afhankelijk van de specifieke aandoening. De incidentie neemt dan af en een aanvang op oudere leeftijd is ongewoon.
  3. Er is bewijsmateriaal dat ze meer courant voorkomen bij technologische, sociale en economische vooruitgang in de maatschappij.
  4. Er wordt gesuggereerd dat infektie de aandoeningen kan versnellen en verergeren maar de verbanden blijven vaag.
  5. Diagnostische histologische veranderingen in weefsels zijn afwezig.
  6. Psychologische factoren kunnen belangrijk zijn maar zijn niet overtuigend als primaire of belangrijke oorzaak.

De hypothese die hier wordt onderzocht is dat deze kenmerken kunnen worden verklaard door molekulaire ‘mimicry’ tussen onze microbiële flora en neuronale proteïnen van de hypothalamus en darm; wat leidt tot auto-antilichamen die stemming en motivatie beïnvloeden.

De microbiële flora

Er zijn ongeveer 10 keer meer bakteriële cellen aanwezig in de darm dan dat er menselijke cellen in het lichaam zijn. Het aantal verschillende bakterie-soorten die kunnen aanwezig zijn, ligt in de grootte-orde van 400-800 […]. Elke bakterie heeft, gemiddeld, 3.000-5.000 genen die coderen voor 3.000-5.000 proteïnen. De grootte en complexiteit van het bakterieel proteoom is daarom immens maar kan niet precies bepaald worden omdat er genetische overlap is tussen verschillende soorten en genetische diversiteit binnen een soort.

Het menselijk genoom telt ongeveer 20.000 genen. Het aantal proteïnen bedraagt echter meer dan 250.000. Menselijke genen hebben meerdere exonen en differentiële ‘splicing’ [verandering van genetische informatie na transcriptie van DNA naar mRNA: tijdens het RNA-processing worden ‘introns’ (overbodige, niet-coderende stukken) uit het pre-mRNA geknipt en de resterende ‘exons’ van het pre-mRNA aan elkaar geplakt] van de RNA-transcripten van de exonen kan meerdere verschillende proteïnen opleveren. Verder zijn er menselijke enzymen die chemische groepen toevoegen en afsplitsen waardoor de proteïne-diversiteit verhoogt.

Het verwerven van immuniteit en het genereren van specifieke antilichamen vergt de gecoördineerde werking van macrofagen, T-lymfocyten en B-lymfocyten. Macrofagen fagocyteren bakterieën, doden ze d.m.v. intracellulaire enzymen en splitsen hun proteïnen in polypeptiden van 8-12 aminozuren. De polypeptiden worden dan op het oppervlak van de macrofaag geplaatst in de gleuf van een oppervlakte-proteïne genaamd MHC2 (‘major histocompatibility’ proteïne type-2). De taak van de T- en B-lymfocyten, die samenwerken, is het polypeptide te gebruiken als een code voor het proteïne waarvan het werd afgeleid. Als wordt geoordeeld dat proteïne verschillend is van ‘zelf’ [‘Self’ antigenen worden gewoonlijk getolereerd door het immuunsysteem, ‘Non-self’ antigenen worden als indringers geïdentificeerd en aangevallen. Auto-immuniteit is wanneer een organisme niet is staat is om de eigen onderdelen als ‘self’ te herkennen, waardoor een immuun-respons tegen de eigen cellen en weefsels toegelaten wordt.] en als het van een potentieel pathogeen organisme komt, dan zullen antilichaam-molekulen worden gegenereerd die het proteïne herkennen. Maar als het proteïne lijkt op ‘zelf’-proteïnen zal de produktie van antilichamen schadelijk zijn. Het precieze mechanisme wordt niet volledig begrepen maar een belangrijk deel is de vorming van een complex tussen de T-cel oppervlakte-receptor, het polypeptide en de MHC2 molekule. De herkenning is daarom afhankelijk van de vorm van de specifieke T-cel receptor. Er zijn zowel helper en suppressor T-cellen, en op een bepaalde manier leiden de helper T-cellen tot antilichaam-produktie door B-cellen, terwijl de T-cel suppressor antilichaam-produktie inhibeert.

De taak van het immuunsysteem is extreem ingewikkeld en kan worden geanalyseerd in statistische termen [Morris JA. Autoimmunity; a decision theory model. J Clin Pathol, 40 (1987) 40: 210-215]. Er zijn 10 triljoen mogelijke manieren waarop 20 aminozuren kunnen combineren om een polypeptide-keten van 10 aminozuren lang te vormen (2010 = 1013). Het totaal aantal proteïnen in het gecombineerd menselijk en bakterieel proteoom is waarschijnlijk minder dan een miljoen en met een gemiddelde proteïne-lengte van 300 aminozuren, is het totaal aantal polypeptiden van 10 aminozuren lang minder dan 109. Zodoende volstaan polypeptide-ketens van 7 aminozuren (207 = 1,28 x 109) waarschijnlijk om te coderen voor elk mogelijk proteïne. De belangrijkste receptor is de T-cel receptor en de sleutel-beslissing is de differentiatie tussen lijkend op en verschillend van ‘zelf’.

Een belangrijk probleem bij het beslissing-proces is dat er een omvangrijke overlapping is tussen bakteriële genen en proteïnen, en menselijke genen en proteïnen. Proteïne-strukturen die essentiële funkties hebben blijven behouden tijdens in evolutie en we delen letterlijk ons genoom en proteoom met de rest van de biologische wereld. Als een pathogeen proteïnen deelt met een menselijke gastheer dan zal de taak om antilichamen op te wekken die enkel de niet-gemeenschappelijke proteïnen veel moeilijker zijn. Als de eerste blootstelling aan het pathogeen een hoge dosis heeft en een levensbedreigende infektie optreedt, dan moet de beslissing vlot verlopen en het risico op fouten zal verhogen. Ook als de eerste blootstelling later in het leven (wanneer het immuunsysteem verslechterd) optreedt, zal het risico op vergissing verhogen.

Gender-verschillen

Beslissingen worden in onzekerheid genomen en zelfs een zeer gesofisticeerd beslissing-systeem op basis van een optimale beslissing-strategie is vatbaar voor fouten; hoe ingewikkelder het systeem, hoe meer overbodigheid in het systeem wordt ingebouwd, hoe lager de fouten-marge zal zijn. Maar fouten kunnen niet volledig worden geëlimineerd.

Laat ons het falen om te reageren op een vreemd proteïne op een pathogeen als een vals-negatieve beslissing definiëren. Omgekeerd is het reageren op een proteïne dat lijkt op ‘zelf’ een vals-positieve beslissing. Aanpassing van de beslissing-criteria om vals-negatieven automatisch te reduceren, verhoogt het aantal vals-positieven en vice versa. Dit is wederom een eigenschap van de zgn. ‘statistical decision theory’. Een vals-negatieve respons zal het risico op infektie verhogen. Een vals-positieve repsons zal het risico op auto-immune ziekte verhogen. Sommige individuen zullen fouten maken aan de ene kant en sommigen aan de andere kant. Het is daarom opmerkenswaardig dat mannen over het algemeen meer neigen tot infektie terwijl vrouwen een verhoogd risico op auto-immune ziekte hebben. Dit is in het bijzonder van toepassing op orgaan-specifieke auto-immune ziekten waarvan wordt gedacht dat auto-antilichamen een rol spelen, bv. schildklier-ziekte, pernicieuze anemie [kwaadaardige bloedarmoede veroorzaakt door een vitamine-B12 opname-probleem], myasthenia gravis [ernstige spierzwakte] en primaire biliaire cirrhose [PBC, een auto-immune lever-aandoening]. De vrouw/man-verhouding bij deze aandoening ligt rond 10. De overmaat vrouwen bij prikkelbare darm syndroom, CVS en AN is even extreem en daarom past dit bij het idee dat auto-antilichamen tegen zenuw-cellen deel zouden kunnen uitmaken van de pathogenese van deze aandoeningen.

Voorkomen per leeftijd

Morbiditeit en mortaliteit komen meer voor bij stijgende leeftijd omdat de meerderheid van de ziekten een gevolg zijn van een graduele verslechtering van de prestaties van onze complexe informatie-verwerking systemen. Ziekte veroorzaakt door courante pathogenen bij de eerste blootstelling genereert echter een verschillende leeftijd-incidentie curve. De waarschijnlijkheid van een eerste blootstelling aan courante organismen daalt exponentieel na de geboorte. Hoe couranter het organisme, hoe sneller de exponentiële afname. Maar de waarschijnlijkheid op fouten na eerste blootstelling zal stijgen in funktie van de leeftijd omdat het immuunsysteem veroudert, net zoals andere lichaam-systemen. Dus zal de leeftijd-incidentie curve die we zouden voorspellen voor een auto-immuun ziekte (optredend ten gevolge ‘molecular mimicry’) er één zijn die piekt op middelbare leeftijd en dan daalt. Verder zal hoe couranter het organisme is, hoe vroeger de piek zal optreden; hoe minder courant het organisme, hoe later de piek.

Deze vorm van leeftijd-incidentie wordt gezien bij de funktionele aandoeningen. AN piekt rond de 20, terwijl prikkelbare darm syndroom en CVS pieken rond de 30-40. Deze aandoeningen ontstaan niet op latere leeftijd omdat men tegen dan vrijwel geen nieuwe bakterieën tegenkomt.

Veranderingen met de tijd

De verspreiding van microben wordt beïnvloed door technologische, sociale en economische verandering. Een opvallend historisch voorbeeld is lepra. Lepra is een ziekte van armoede, overbevolking en slechte hygiëne; die wordt verspreid door langdurig persoonlijk contact. De ziekte was niet ongewoon in Europa in de Middeleeuwen maar is nu zeer zeldzaam. Een ander voorbeeld, relevanter voor deze hypothese, is poliomyelitis [polio, kinderverlamming]. Epidemieën van paralytische poliomyelitis kwamen voor bij zij die het beter stelden in de maatschappij, tegen het einde van de 19e eeuw. In dit geval veroorzaakten armoede, overbevolking en slechte hygiëne een snelle verspreiding van het virus en kinderen met deze aandoening werden blootgesteld tijdens het eerste levensjaar. Verbeterde sociale omstandigheden vertraagden de verspreiding van het virus en onder deze omstandigheden trad de eerste blootstelling later in de kindertijd op. Om redenen die niet volledig worden begrepen, leidde latere blootstelling tot een verhoogd risico op verlamming.

Een ander voorbeeld is klierkoorts veroorzaakt door het Epstein-Barr virus. De ziekte klierkoorts is zeldzaam bij Afrikaanse kinderen en bij de lagere sociale klassen in Europa en Noord-Amerika. Deze kinderen worden op vroege leeftijd aan het virus blootgesteld en vertonen slechts een milde ziekte. Midden-klasse kinderen in Europa Noord-Amerika kunnen de leeftijd van teenager bereiken zonder aan het virus te zijn blootgesteld. Eerste blootstelling als teenager zal meer waarschijnlijk leiden tot een ernstige ziekte.

Er zijn waarschijnlijk meerdere factoren betrokken bij de stijgende ernst van ziekte bij latere blootstelling:

  1. Kinderen blootgesteld tijdens de eerste 6 maand van hun leven zullen gedeeltelijke bescherming hebben door maternale IgG en, indien ze borstvoeding kregen, door IgA in de moeder-melk.
  2. Een verminderde circulatie van organismen leidt tot een wijziging van endemische naar epidemische verspreiding. Epidemische verspreiding leidt tot latere blootstelling en een hogere dosis bij eerste blootstelling.
  3. Het Epstein-Barr virus wordt verspreid via lichaamsvochten en nauw contact als teenager zou geassocieerd kunnen zijn met een hogere dosis bij eerste blootstelling.
  4. Het immuunsysteem verslechtert met de leeftijd, net zoals alle lichaam-systemen, zodat fouten meer waarschijnlijk worden. Dit betekent zowel vals-positieven als vals-negatieven. Een verstoorde respons zal meer waarschijnlijk leiden tot een ernstige infektie alsook auto-immune ziekte.

Een ganse reeks van immuun-gemedieerde ziekten komen meer voor in technologisch geavanceerde landen de voorbije 50 jaar. Deze omvatten: astma, hooikoorts, eczema, type-1 diabetes mellitus en Multipele Sclerose. De term ‘hygiëne-hypothese’ wordt dikwijls gebruikt. Dit impliceert dat sociale vooruitgang leidt tot een gewijzigd patroon van blootstelling aan microben en dit leidt op z’n beurt tot een verhoogd risico op immuun-gemedieerde ziekte.

Prikkelbare darm syndroom, CVS en AN nemen ook toe in technologisch geavanceerde landen. Eens te meer past dit bij het concept van een auto-immuun mechanisme.

Infektie

Er is bewijs dat infektie funktionele aandoeningen kunnen teweegbrengen of verergeren. De aanvang van prikkelbare darm syndroom volgt gewoonlijk na een episode van infektueuze diarree. CVS kan getriggerd worden door infektueuze mononucleose en virale hepatitis. Er is een toenemende interesse in het concept van ‘cross-talk’ tussen de microbiële flora en het darm-, autonoom en centraal zenuwstelsel. Er zijn een aantal manieren waarop bakteriële secretorische produkten neuronale funktie zouden kunnen beïnvloeden maar die werken bij zowel mannen als vrouwen van alle leeftijden. Slechts de vorming van auto-antilichamen is overheersend vrouwelijk en ontstaat op middelbare leeftijd.

Histologische veranderingen afwezig

Infektie veroorzaakt normalerwijs schade aan de weefsels en triggert inflammatie. Bakterieën en virussen kunnen cellen direct beschadigen en ze stimuleren een immuun-respons die ook cellulaire schade veroorzaakt en inflammatie uitlokt. Inderdaad: veel van onze kennis over ziekte en onze klassificatie-systemen van ziekten hangen af van het voorkomen van pathologische veranderingen vastgesteld via licht-microscopie.

De aanwezigheid van histologische veranderingen is een aanwijzing voor de oorzaak maar een afwezigheid van histologische veranderingen betekent niet noodzakeljk een afwezigheid van aanwijzingen voor de oorzaak. Molekulen, zoals bakteriële toxinen of auto-antilichamen, kunnen funktionele effekten veroorzaken zonder histologische verandering. Er is steeds meer bewijs dat bakteriële toxinen kunnen inwerken op de neurale systemen die de ademhaling controleren voor de oorzaak van ‘sudden infant death syndrome’ [wiegedood]. Dit resulteert in sterfte zonder diagnostische histologische bij autopsie. Een ander voorbeeld, meer direct relevant voor de hypothese van dit artikel, is myasthenia gravis. Een auto-antilichaam tegen het acetylcholine-receptor proteïne veroorzaakt spierzwakte. De ziekte is meer courant bij vrouwen dan bij mannen en de piek-incidentie ligt rond de 30 jaar. Er werden auto-antilichamen, die circulerende regulerende peptiden en neuronale proteïnen in de hypothalamus herkennen, gevonden bij patiënten met anorexia nervosa. Er zijn ook meldingen van auto-antilichamen tegen serotonine bij CVS. Post-streptococcen chorea [een neurologisch symptoom: plotse, snelle en ongerichte bewegingen] wordt veroorzaakt door auto-antilichamen tegen basale ganglia proteïnen die kruis-reageren met streptococcen oppervlakte-antigenen. In al deze gevallen is er een afwezigheid van of een gebrek aan histologische veranderingen, zeker wat betreft diagnostische microscopische veranderingen.

Auto-antilichamen tegen darm-, autonome of centrale neuronen zijn een plausibele verklaring voor funktionele aandoeningen. De bloed-hersen-barrière zal de toegang verhinderen tot een groot deel van het centraal zenuwstelsel maar capillairen in de hypothalamus laten IgG-antilichamen door [via poriën in de endotheliale cellen] tot de plaats die de autonome respons en emotionele responsen controleert.

Psychologische theorieën

De funktionele aandoeningen worden dikwijls ‘psychosomatische ziekten’ genoemd. Deze term heeft 2 betekenissen. In oudere literatuur was de term synoniem met ‘psychogeen’ (wat ‘tussen de oren’ of ingebeelde ziekte impliceert). De modernere betekenis is echter dat psychosomatische aandoeningen worden veroorzaakt door de interaktie van psychologische en lichamelijke factoren.

[Funktionele somatische syndromen (FSS) – multipele chemische sensitiviteit, ‘sick building’ syndroom, repetitieve stress letsel, bijwerkingen van siliconen borst-implantaten, Golf Oorlog syndroom, chronische ‘whiplash’, Chronische Vermoeidheid Syndroom, prikkelbare darm syndroom, fibromyalgie, enz. – worden door de aanhangers van de psychologische school verkeerdelijk gelijkgesteld met psychosomatisch. Een aantal klinici aanvaarden dat deze aandoeningen reëel zijn. Psychologen/psychiaters stellen echter (pseudo-wetenschappelijk): “Hoewel discrete pathofysiologische oorzaken uiteindelijk kunnen worden aangetoond; wordt bij sommige patiënten met FSS hun lijden verergerd door een zichzelf in stand houdende, zelf-bevestigende cyclus, waarbij courante symptomen foutief worden toegeschreven aan een ernstige abnormaliteit en waardoor het geloof van de patient dat zij/hij een ernstige ziekte heeft, wordt versterkt. Enz.”… Een funktioneel symptoom is een medisch symptoom dat wordt beschouwd als ontstaan door een probleem in de werking van het zenuwstelsel en niet veroorzaakt door een struktureel probleem of pathologische gedefinieerde ziekte. Het mag uit onze bijdragen hier duidelijk zijn dat er bij M.E.(cvs) wel degelijk strukturele/organische/somatische problemen zijn. FSS is, zoals cvs, een ‘vuilbak-diagnose’. De term wordt door sommigen gebruikt als synoniem voor ‘onverklaard’ (men erkent de symptomen maar er lijkt niets abnormaals te worden gevonden).]

Het is het eerste idee dat leidt tot niet-overtuigende verklaringen. Er zou, bijvoorbeeld, een verhoogde incidentie van lichamelijk en sexueel misbruik in de kindertijd geweest kunnen zijn bij mensen die funktionele aandoeningen gaan vertonen. Het is makkelijk om te begrijpen hoe dit symptomen bij volwassen zou kunnen beïnvloeden maar het is lichtgelovig te bedenken dat misbruik de enige en afdoende oorzaak voor de funktionele aandoeningen zou zijn. Zo zullen moderne concepten voor de perfecte lichamelijke vorm die wordt gepromoot door de mode-industrie, teenagers beïnvloeden om te gaan diëten maar er moet zeker iets meer diepgaand en fundamenteel aan de hand zijn om vermagering/uithongering of zelfmoord te induceren.

Bespreking

Auto-antilichamen tegen neuronale proteïnen geïnduceerd door blootstelling aan microbiële antigenen zijn een plausibele verklaring voor funktionele aandoeningen zoals prikkelbare darm syndroom, CVS en AN. De leeftijd-incidentie, verhoogde frequentie bij vrouwen, veranderingen van de incidentie met de tijd, ontbreken van histologische veranderingen en bewijs voor microbiële precipitatie passen allemaal bij een auto-immune aandoening. […] Auto-antilichamen die op het limbisch systeem werken, zouden extreme emoties kunnen induceren, leidend tot afkeer en angst. […].

Er werden auto-antilichamen tegen regulerende peptiden en serotonine gevonden bij patiënten met AN en CVS. Verder werd er in publicaties gesproken over het concept van bakteriële translocatie [passage van (bestanddelen) van bakterieën door het darm-slijmvlies naar het bloed, lymfeklieren en organen] en ‘molecular mimicry’ leidend tot de produktie van auto-antilichamen. Er is dus reeds enige directe experimentele ondersteuning voor de hypothese die we voorstellen.

Om deze hypothese te onderzoeken, moeten we zoeken naar antilichamen tegen neuronale proteïnen bij patiënten met bovenstaande funktionele aandoeningen. Een belangrijk aspect voor de hypothese is dat genen en proteïnen evolutionair behouden blijven, zodat diverse dieren (vliegen, muizen en mensen) gelijkaardige neuronale proteïnen zullen hebben. De gedetailleerde anatomie van de hersenen van vliegen, muizen en mensen is duidelijk verschillend maar de bouwstenen zijn gelijkaardig. Dit betekent dat we vliegen, zoals Drosophila melanogaster, kunnen gebruiken als een primair model-organisme om menselijke auto-antilichamen te detekteren. D. melanogaster werd in feite al meer dan 100 jaar gebruikt in veel research-gebieden van menselijke ziekten en funktie. In de neurowetenschappen is research, die gebruikmaakt van een waaier aan genetische en molekulaire instrumenten in die vlieg, fundamenteel gebleken voor ons begrip van, bijvoorbeeld, leren en geheugen, slaap, circadiaanse ritmes en de neuro-endocriene regulering van ouder-worden. Als menselijke auto-antilichamen binden op neuronale proteïnen van D. melanogaster kan dit gevisualiseerd worden d.m.v. immunofluorescentie en microscopie. De proteïnen kunnen daaropvolgend worden geïdentificeerd en hun sequentie bepaald m.b.v. een brede waaier aan technieken die beschikbaar zijn voor dit model-organisme.

Als auto-antilichamen een significante rol spelen dan zou immunotherapie op basis van gepoold IgG van gezonde individuen een behandel-optie kunnen zijn bij ernstige, in het bijzonder levensbedreigende, gevallen (zoals AN). Op langere termijn dient men de specifieke kruis-reagerende proteïnen van bakterieën in de microbiële flora (die de auto-antilichamen induceren) te identificeren. De bakterieën van de microbiële flora van een individu zijn slechts een subset van alle bakterieën en het zou mogelijk moeten zijn het verantwoordelijk organisme [kan voor elk individu anders zijn] te verdringen en te vervangen met een nauw verwant organisme dat het oorzakelijk proteïne niet vertoont. Verder zijn we steeds meer de mening toegedaan dat enkel bakterieën die het lichaam binnendringen waarschijnlijk hoge concentraties IgG auto-antilichamen opwekken en onderhouden, en daarom is de identificatie van de verantwoordelijke bakterieën en hun vervanging wellicht niet zo moeilijk als op het eerste zicht lijkt.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.