M.E.(cvs)-wetenschap

maart 14, 2020

Uitgebreide metabolomica-studie bij M.E.(cvs): ontregeld metabolisme van acyl-lipiden & steroïden

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:35 am
Tags: , , , , ,

Onderstaande studie is een vervolg op ‘Metabolomica-biomerkers voor M.E.(cvs) impliceren een redox-onevenwicht’.

De researchers bekeken de waarden van verschillende metabolieten (molekulen aangemaakt tijdens verscheidene metabole reakties) in het bloed van 26 vrouwen met M.E.(cvs) en vergeleken ze met die van 26 gezonde vrouwen. Ze onderzochten deze die significant verschilden (hogere of lagere waarden) ook verder. Metabolieten die bleken te verschillen waren: acyl-cholinen, dipeptiden en and steroïden (androgene, progestine & corticosteroïden); de waarden of sfingolipiden en ceramiden waren verhoogd. Ze onderzochten dan de mechanismen (metabole paden) at waarbij deze metabolieten betrokken zijn om een idee te hebben omtrent hoe deze verschillende waarden een invloed op het lichaam kunnen hebben en hoe ze verband kunnen houden met de symptomen van M.E.(cvs). Verstoringen in het metabolisme van deze molekulen kan gelinkt worden aan veel van de M.E.(cvs)-symptomen. Er zijn wel nog grotere studies nodig om dit alles te bevestigen.

De auteurs stellen: “We hebben nog geen plasma-biomerker of set biomerkers ondubbelzinnig geïndenticifeerd met hoeveelheden die drastisch verschillen tussen controls en M.E.(cvs)-patiënten. Niettemin dienen de metabolieten die door onze analyse naar voorkomen (specifiek acyl-cholinen en steroïden) in acht worden genomen.

Enige verder informatie over specifieke molekulen:

Acyl-cholinen maken deel uit van het verzuren-metabolisme. Meerdere bleken meer dan dubbel zo laag bij de patiënten. Verlaagde waarden kunnen een verklaring zijn voor verstoorde bloeddruk-regulering (o.a. orthostatische intolerantie). Ze zijn ook gelinkt aan darm-problemen en betrokken bij de regulering van het zenuwstelsel en de cognitieve funktie.

Dipeptiden zijn kleine proteïnen. Eén dat verlaagd bleek, is betrokken bij het hersen-metabolisme en een ander bij het vitamine-B6 metabolisme. De kennis omtrent variaties in het plasma is echter nog beperkt.

Steroïden zijn betrokken bij veel lichamelijke funkties (stress-respons, regulering van zout en water, immuun-response, regulering van inflammatie, proteïnen-metabolisme en hormoon-regulering). Ze zijn ook betrokken bij de hypothalamus-hyposyse-bijnieren as (reguleert o.a. energie-verbruik, temperatuur, immuun-systeem, vertering en stemming).

Sfingolipiden worden aangetroffen in hersen-weefsel en hebben een grote impact op neuraal weefsel wanneer ze uit evenwicht zijn.

————————-

Metabolites Vol 10, #1, p 34 (January 2020)

Comprehensive circulatory metabolomics in ME/CFS reveals disrupted metabolism of acyl lipids and steroids

Arnaud Germain (1), Dinesh K. Barupal (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

 

Samenvatting

De laatste prevalentie-meting wereldwijd stelt dat meer dan 65 miljoen patiënten lijden aan Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), een ziekte met gekende effekten op de funktie van het immuunsysteem en het centraal zenuwstelsel. We voerden een uitgebreide metabolomica-analyse uit op het plasma van 52 vrouwelijke individuen, evenredig verdeeld over controles en M.E./CVS-patiënten, wat gegevens verschafte voor ca. 1.750 molekulen in het bloed van 20 super-mechanismen, onderverdeeld in 113 sub-mechanismen. Statistische analyse gecombineerd met ‘pathway enrichment analysis’ duidt op enkele ontregelde metabole mechanismen met veel ononderzochte molekulen. De meest intrigerende bevinding betreft acyl-cholinen, die behoren tot het vetzuren-metabolisme sub-mechanisme van lipiden, waarvan alle molekulen consistent verminderd bleken in twee afzonderlijke groepen M.E./CVS-patiënten. We verzamelden de erg beperkte kennis omtrent deze molekulen en beschouwen ze al veelbelovend bij de zoektocht om veel van de M.E./CVS-symptomen te verklaren. Een andere klasse van lipiden met ver-reikende aktiviteit aangaande bijna alle orgaan-systemen zijn steroïden; androgene, progestine en corticosteroïden zijn in brede lijnen verminderd in onze patiënten-groep. We rapporteren ook over gedaalde dipeptiden en gestegen sfingolipiden hoeveelheden bij patiënten vergeleken met controles. Verstoringen van het metabolisme van veel van deze molekulen kunnen worden gelinkt aan de diepgaande symptomen die M.E./CVS-patiënten ondervinden.

1. Inleiding

[…]

De circulatie is fundamenteel voor alle andere systemen aangezien het hen voorziet van de noodzakelijke molekulen terwijl metabool afval wordt verwijderd. De inspanning om het bloed-metaboloom van M.E./CVS-patiënten te karakteriseren, met het dubbel doel van het vastleggen van een routinematige diagnostische strategie en het inwinnen van verder inzicht omtrent de onderliggende oorzaak van de ziekte, werd door meerdere groepen bij afzonderlijke populaties van beperkte grootte uitgevoerd […]. De belangrijkste besluiten van deze rapporten, inclusief de onze, draaien over het algemeen om verschillen qua aminozuren, lipiden, en een onevenwicht qua energy- en redox-metabolismen. Hoewel deze studies informatief zijn, bleek tot op heden niet één enkel metaboliet consistent significant gewijzigd bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles – een verbijsterend resultaat gezien de ernst van de ziekte-symptomen.

Deze studie omvatte plasma-stalen van 52 vrouwelijke individuen, gelijk verdeeld over controles en patiënten, die werden geanalyseerd d.m.v. Metabolon®’s massa-spectrometrie. De metabole panels leverden gegevens op voor ca. 1.750 bloed-molekulen met een sterke nadruk op lipiden (meer dan 70%). Onze analyse biedt nieuwe inzichten aangaande plasma-metabolomica bij M.E./CVS op meerdere beloftevolle gebieden. Allereerst tonen we een reproduceerbare ontregeling van het acyl-choline metabolisme, een klasse lipiden dat grotendeels onbestudeerd is gebleven maar waarvan theoretisch wordt gedacht dat het een fundamentele werking heeft. Een andere belangrijke observatie, mogelijks relevant voor het ontwricht centraal zenuwstelsel bij M.E./CVS, heeft betrekking met sfingolipiden, die ook breed getroffen bleken in onze patiënten-groep. We vonden ook, voor de tweede keer, dat dipeptiden gewijzigd zijn. Ten slotte bleken drie klassen steroïden (androgene, progestine en corticoïde) consistent gedaald in onze groep M.E./CVS-patiënten, een stoornis die belangrijke repercussies kan hebben voor het welzijn van patiënten.

2. Resultaten

2.1. Populatie-statistieken en behandeling van de gegevens

2.1.1. Groep-statistieken

De groep vrouwen opgenomen in deze studie bestaat uit 26 gezonde controles en 26 M.E./CVS-patiënten (leeftijd 22-72 jaar) met een vergelijkbare ‘body-mass-index’ (BMI). […] 58% met plotse ziekte onmiddellijk voorafgaand aan de start van de ziekte, 42% graduele aanvang.

De helft van de patiënten maakte ook melding van darm-inflammatie symptomen en 69% rapporteerde een diagnose van orthostatische intolerantie. De Bell-scores geven de ernst van de symptomen van de patiënten aan (bijna allemaal onder 50, ver onder de score van 100 die wordt verwacht bij gezonde individuen). Bovendien toonden de SF‐36 gegroepeerde samenvattingen (fysieke & mentale componenten) voor beide groepen dat de stoornissen van de patiënten (SF‐36 PCS score van 26), ver beneden de norm van de algemene bevolking in de V.S. (50) ligt.

2.1.2. Globaal metabolomica-panel

Het globaal metabolomica-panel onderzocht in het plasma levered metingen op voor 768 geïdentificeerde molekulen, onderverdeel in 9 metabole super‐mechanismen, volgens de standaarden van Metabolon®. De opdeling is als volgt: aminozuren (196), koolhydraten (25), co-factoren & vitaminen (29), energie (10), lipiden (259), nucleotiden (33), gedeeltelijk gekarakteriseerde molekulen (2), peptiden (33) en xenobiotica [lichaamsvreemde stoffen] (181). Voor de 52 individuen zijn er 39.936 gegevens-elementen, die verder onderverdeel kunnen worden in 94 sub‐mechanismen. Bv.: als we focussen op de 7 sub‐mechanismen in het xenobiotica super‐mechanisme, vinden we bakterieel/schimmel-metabolisme (3), benzoaat-metabolisme (21), chemicaliën (23), medicijnen (64), voedsel-componenten/planten (49), tabak-metabolieten (6) en xanthine-metabolisme (15).

Een dergelijke detaillering is cruciaal bij het omgaan met ontbrekende gegevens (afwezigheid van een molekule of aanwezigheid in hoeveelheden onder de detektie-drempel). Voor deze gegevens-set ontbraken 15,5% van de waarden (6.170), gelijkaardig met de 14% bij onze eerdere studie [Germain A, Hanson MR et al. Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology. Metabolites (2018) 8: 90]. Het omgaan met ontbrekende gegevens zal afhangen van het feit of een metaboliet vereist is voor het menselijk metabolisme of een substantie ingenomen door enkele individuen in onze studie. Zodoende veronderstellen we dat ontbrekende waarden voor tabak-metabolieten en medicijnen (3.138 of 50,9% ontbrekende waarden) te wijten zijn aan de echt ontbrekende molekulen in het bloed van die individuen en kunnen worden gezien als nul-waarden. In tegenstelling daarmee omvatten andere sub‐mechanismen metabolieten die biologisch vereist zijn ook al worden ze niet gedetekteerd. Onze strategie was daarom verschillend en volgde de aanbevelingen van Metabolon® om de minimum waarde van elke biochemische molekule in het project aan te geven. Van de 698 overblijvende metabolieten, werden er 418 gemeten bij alle individuen, hadden 163 ontbrekende waarden bij minder dan 20% van de individuen en werden 657 toeschrijven uitgevoerd (10,5% van de ontbrekende waarden), terwijl 117 metabolieten ontbrekende waarden hadden bij meer dan 20% van de individuen, voor een totaal van 2.375 toeschrijvingen (38,4%). De mate van toeschrijving is gelijkaardig voor elke groep.

2.1.3. Panel complexe lipiden

In tegenstelling met de relatieve hoeveelheden die werden gerapporteerd in het globaal metabolomica-panel, genereerde het complex lipiden panel gegevens voor 1.007 complexe lipiden in 11 super‐mechanismen en 19 sub-mechanismen, volgens de nomenclatuur van Metabolon®. Dit omvatte de volgende super‐mechanismen: cholesterol-esters (26), diacyl-glycerolen (58), vrije vetzuren (25), lysofosfatidyl-cholinen (18), lysofosfatidyl-ethanolaminen (17), monacyl-glycerolen (26), fosfatidyl-cholinen (103), fosfatidyl-ethanolaminen (127), fosfatidyl-inositolen (28), sfingolipiden (61) en (de grootste) triacyl-glycerolen (518). Deze gegevens-set had 3.472 ontbrekende gegevens-elementen (50,7% bij de controles en 49,3% bij de patiënten), voornamelijk bij de volgende super‐mechanismen: lysofosfatidyl-ethanolaminen, fosfatidyl-cholinen, fosfatidyl-ethanolaminen en fosfatidyl-inositolen (respectievelijk 23, 20, 37 & 14% ontbrekende gegevens). De strategie beschreven voor het globaal metabolomica-panel was identiek voor deze set gegevens.

2.2. Statistische analyse van de globale metabolomica gegevens

2.2.1. Analyse van de totale gegevens

* Niet‐parametrische testen: We vonden 41 metabolieten op 768 (5,3%) die significant verschilden tussen controles en patiënten (p < 0.05). Slechts 8 daarvan (20%) komen in hogere hoeveelheden voor bij de patiënten t.o.v. de controles. Meer dan 60% behoort tot het lipiden super‐mechanisme, 20% zijn aminozuren, en de overblijvende 20% zijn evenredig verdeeld over peptiden en xenobiotica. […].

* Analyse van ‘fold-change’ [“mate van verandering”; maatstaf voor het beschrijven hoeveel een hoeveelheid/grootheid verandert (oorspronkelijke vs. volgende meting), gedefinieerd als verhouding tussen de twee; dikwijls gebruikt bij het analyseren van meerdere metingen in een biologisch systeem]: Deze analyse vond dat 25 metabolieten veranderingen qua absolute waarden tussen de twee groepen hebben met een drempel van 2. Slechts 5 daarvan (20%) vertonen hogere metingen in de patiënten-groep vergeleken met de controles. De helft van de 25 metabolieten behoort bij de xenobiotica, waarbij de verschillen kunnen worden teruggebracht tot enkele uitschieters, soms bij controles en soms bij patiënten.

Het meest opmerkenswaardig is de aanwezigheid van meerdere lipiden die behoren tot het sub‐mechanisme van het vetzuren-metabolisme (acyl-cholinen). Inderdaad: de gemiddelden van oleoyl-choline, dihomo‐linoleoyl‐choline, linoleoyl-choline, stearoyl-choline & palmitoyl-choline lagen meer dan tweemaal lager bij patiënten. Daarnaast tonen we dat de gegevens-distributie van alle 7 metabolieten behorend tot dit sub‐mechanisme lager liggen in de patiënten-groep t.o.v. de controles. […]

Het ander lipide dat meer dan 3-maal gereduceerd is in de patiënten-groep, is cholaat, een belangrijk galzuur dat geproduceerd wordt in de lever en gekend is om het feit dat het de vet-absorptie faciliteert […]. Alle andere metabolieten die in dat sub‐mechanisme worden geklassificeerd lagen ook lager in de patiënten-groep (1,3 tot 1,6 maal).

Ook pyridoxaat [verbinding van de vitamine-B6 groep] is meer dan 3-maal verminderd in de patiënten-groep. Het enig ander gemeten metaboliet behoort tot het vitamine-B6 sub‐mechanisme is pyridoxal (2,3 maal gedaald bij patiënten).

* ‘Volcano-plot’ analyse [statistische methode; grafiek die wordt gebruikt om snel veranderingen in grote gegevens-sets te identificeren]: […] Dit levert weerom geen significant verschillende metabolieten op. Wanneer echter ‘fold-change’ wordt gecombineerd met een p < 0.1, blijkt dat 5 op de 10 metabolieten die significant worden geacht, behoren tot het acyl-choline mechanisme: dihomo‐linoleoyl‐choline, oleoyl-choline, stearoyl-choline, linoleoyl-choline & palmitoyl-choline.

4 van de andere metabolieten zijn xenobiotica verbonden met het dieet. Bv.: erythritol is een zoetstof [suiker-vervanger], die over het algemeen meer overvloedig is bij patiënten […]; piperine en z’n gesulfateerde vorm zijn verbonden met peper-consumptie en minder overvloedig bij patiënten (die waarschijnlijk gekruid voedsel vermijden omwille van spijsvertering-problemen); dimethyl-sulfon is gekend als een organische zwavel-verbinding in het plasma die gedeeltelijk voortkomt van het intestinaal bakterieel metabolisme, (wat verstoord is bij M.E./CVS-patiënten) [Hanson MR; Giloteaux L. The gut microbiome in Myalgic Encephalomyelitis. Biochemist (2017) 39: 10-1; zie ook ‘Verminderde diversiteit & gewijzigde samenstelling van het darm-microbioom bij M.E.(cvs)]. Ten slotte bleek 4‐hydroxy-glutamaat dubbel zo hoog bij patiënten. Dit metaboliet maakt deel uit van het glutamaat-metabolisme (dat substantiële implicaties heeft voor de hersen-funktie.

2.2.2. Super‐mechanisme analyse

Zoals bij onze eerdere studie, splitsten we onze gegevens-set op (gebaseerd op de super‐mechanisme nomenclatuur van Metabolon®) met de bedoeling meer statistische ‘power’ te verkrijgen. Het super‐mechanisme der peptiden omvat 3 dipeptiden die significant lager liggen bij patiënten. Dipeptiden zijn produkten van de onvolledige afbraak van proteïnen en van enkele is geweten dat ze een effekt hebben op lichaam-funkties. […]

2.3. Statistische analyse van de lipidomica-gegevens

Een niet‐parametrische statische test vond 3 metabolieten (van 1.007) die significant (p < 0.05) verschillend zijn tussen controles en patiënten. Alle 3 behoren tot het sfingolipiden super‐mechanisme, namelijk de ceramiden CER (18:0), CER (18:1) & CER (20:0), die hogere waarden vertoonden in de patiënten-groep. Ceramiden zijn gemaakt van een sfingosine (d18:1) […] en hoewel ze een meerderheid van de dubbel-laag van het het cel-membraan opmaken, komen ze vooral overvloedig voor in de myeline-schede. Ze dragen ook bij tot signalisering bij cel-differentiatie, proliferatie en cel-dood.

Een analyse van de ‘fold-change’ leverde 5 molekulen op die allen deel uitmaken van het triacyl-glycerol mechanisme maar zorgvuldig kritisch onderzoek toont dat dit te wijten is aan extreme uitschieter bij de controles en enkele minder extreme bij de patiënten. Deze individuen zijn specifiek uitschieters voor een aantal triacyl-glycerolen (TAG) maar niet allemaal, en kunnen niet als uitschieters worden beschouwd voor onze gegevens-sets.

Een ‘volcano-plot’ analyse onthulde geen verschil tussen controles en patiënten.

2.4. Inzichten wat betreft metabolomica-gegevens

Als we proberen om de biologische relevantie na te gaan, is het cruciaal om onze gegevens-sets vanuit een ander en uitgebreider perspectief te interpreteren. Daartoe gebruikten we ‘MetaboAnalyst Pathway Enrichment’ alsook ‘ChemRICH’ (een ‘Chemical Similarity Enrichment’ Analyse voor metabolomica) om onze gegevens verder te exploreren.

2.4.1. Mechanisme-aanrijking

* Globaal metabolomica-panel: voor deze module worden molekulen in kaart gebracht om mechanismen te definiëren op basis van hun HMDB identificatie (ID) (‘Human Metabolome Database’). Van de 768 geanalyseerde metabolieten hadden er 527 een dergelijke ID en 477 waren geschikt na ID-standardisatie. Ten gevolge daarvan maakten 38% van de metabolieten geen deel uit van deze analyse, inclusief alle molekulen van het acyl-choline mechanisme bv. Sommige super‐mechanismen waren meer aangetast dan andere: ca. 50% van de peptiden- en xenobiotica-metabolieten afwezig, ca. 40% van de energie- en lipiden-metabolieten afwezig, en ca. 20% van de metabolieten in de overblijvende super‐mechanismen.

Filter- en normalisatie-stappen […] op deze gereduceerde HMDB gegevens-set gaf 61 mechanismen maar slechts 3 hebben significante aanrijking (p < 0.05): het glutathion-metabolisme, de steroïd-hormonen biosynthese en het propanoaat-metabolisme [metabolisme van propionzuur; dit komt voort uit de produktie van microben in de darm of op de huid]. Geen enkel daarvan zijn echter significant aangerijkt na correctie voor ‘multiple testing’ [in de statistiek: simultaan testen van meer dan één hypothese] en hun impact-score is zeer laag (onder 0,08). 4 mechanismen hadden een relatief hoge impact-score (boven 0,4) […]: het alanine-, aspartaat- & glutamaat-metabolisme, taurine- & hypotaurine-metabolisme, cafeïne-metabolisme en linol-metabolisme. Hoewel weinig van deze mechanismen werd besproken in gepubliceerd werk, en gelinkt kunnen worden aan redox-onevenwicht en aminozuur-metabolisme bv., voldeed geen enkele daarvan aan de drievoudige criteria […].

* Complexe lipiden panel: Van de 1.007 geanalyseerde lipiden, hebben er 392 een HMDB ID en 380 werden opgenomen in de mechanisme-aanrijking analyse (38% van de gegevens-set. De output omvat 8 mechanismen en het sfingolipiden-metabolisme had een impact-score van 0,34 […]. […].

In deze module komen alle molekulen van belang meer overvloedig voor bij patiënten, zo ook de besproken ceramiden. Deze met het grootste belang zijn sfingomyelinen (KEGG = C00550), gevolgd door ceramiden (KEGG = C00195) en ten slotte glucosyl-ceramiden (KEGG = C01190) alsook lactosyl-ceramiden (KEGG = C01290). Het is belangrijk om op te merken dat elk KEGG-nummer [‘Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes’; verzameling databases die betrekking hebben op genomen, systeembiologie, ziekten, geneesmiddelen en biochemische stoffen] hierboven 8 tot 9 molekulen elk (struktuur van een sfingosine (d18:1) en vetzuur-ketens inclusief verzadigd of onverzadigd C16, C18, C20, C22, C24 & C26) omvat. Ceramiden, ook bekend als N‐acyl-sfingosine, zijn één van de hydrolyse-nevenprodukten van sfingomyelinen. Glucosyl-ceramiden en lactosyl-ceramiden zijn betrokken bij talrijke mechanismen en dysfunkties die voorkomen bij meerdere ziekten.

2.4.2. Statistische Aanrijking

* Globaal metabolomica panel: Anders dan bij mechanisme-‘mapping’, is de ‘ChemRICH’ benadering gebaseerd op strukturele overéénkomsten en chemische ontologieën om studie‐specifieke metabolieten in kaart te brengen. Om die te bereiken, is ‘Pubchem ID’ één van de gebruikte identificatoren om chemische molekulen en hun aktiviteiten in biologische testen te labelen. De informatie vereist voor dit online-instrument omvatte de naam van de molekule, de ‘InChiKeys’ (internationaal Chemisch identificatie-systeem), de ‘Pubchem ID’, de SMILES (vereenvoudigd molekulair input-systeem) identiteit (een nummering-systeem voor het in- en weergeven van molekulen) en ten slotte p‐waarden […]. Van de 768 metabolieten met gegevens van Metabolon® waren er 623 geschikt voor analyse. Dit betekent dat 19% van de metabolieten geen deel uitmaakten van deze analyse en, hier, 3 van de molekulen geklassificeerd als deel van het acyl-choline mechanisme werden opgenomen (oleoyl-choline, palmitoyl-choline & stearoyl-choline).

Slechts één van de 86 cluster-namen die via deze analyse werd gegeneerd wordt als significant beschouwd (p = 0.025) […]. De cluster-naam kreeg het label ‘dipeptiden’ en omvat 52 molekulen, waarvan er 9 gewijzigd zijn. De sleutel-molekule van deze cluster is 4‐hydroxy-glutamaat (eerder vernoemd), dat toegenomen is bij patiënten, net zoals 2 andere metabolieten in dezelfde cluster (hydroxy-asparagine & gamma-glutamyl-tyrosine). Anderzijds zijn 6 molekulen met klassificatie als dipeptiden (via ‘ChemRICH’) afgenomen bij patiënten (fenyl-alanyl-alanine & fenyl-alanyl-glycine, cysteinyl-glycine, valyl-leucine, 3‐hydroxy-lauraat & etiocholanolon-glucuronide.[…]

Geen enkele van de andere 85 cluster-namen verschillen significant. De cluster genaamd ‘New Cluster 16’ (p = 0.057) bevat echter 2 acyl-carnitinen (arachidoyl-carnitine (C20) & adipoyl-carnitine (C6‐DC)) die overvloediger voorkomen bij patiënten.

* Complexe lipiden panel: Zoals eerder gesteld hebben 392 van de lipiden een HMDB ID, wat werd gebruikt om de ‘ChemRICH’ analyse uit te voeren. Uiteindelijk werden er 347 opgenomen in de mechanisme-aanrijking analyse (slechts 34% van de gegevens-set). Geen enkel van de 26 monoacyl-glycerolen en geen enkel van de 518 triacyl-glycerolen had een HMDB ID en werden daarom niet opgenomen in deze analyse.

2 clusters (van 20 cluster-namen) zijn significant verschillend . De eerste ‘Onverzadigde Ceramiden’ genoemd (p = 0.0004) omvat 3 op 9 molekulen die verhoogd zijn bij M.E./CVS-patiënten (CER (18:0), CER (18:1) & CER (24:1)). De eerste 2 werden reeds vermeld, terwijl CER (20:0) niet in deze analyse werd opgenomen omdat het niet voldoet aan de veresiten voor ‘ChemRICH’. De tweede cluster-naam is ‘Sfingomyelinen’ (p = 0.035), waar 2 op 9 molekulen verhoogd zijn bij M.E./CVS (SM (18:0) & SM (18:1)). Sfingomyelinen werd reeds vernoemd als deel van de ‘MetaboAnalyst’ mechanisme analyse-resultaten. Volgens de Metabolon® nomenclatuur zijn alle 5 de metabolieten die hier werden besproken als onderdeel van het super‐mechanisme sfingolipiden, voor het eerst ontdekt in hersen-extracten in de jaren 1870 en hebben een ernstige impact op neuraal weefsel wanneer zich een onevenwicht voordoet.

* Sub‐mechanisme aanrijking-analyse: Om de hierboven beschreven beperkingen te omzeilen, werd een op sub‐mechanisme gebaseerde analyse uitgevoerd (gebruikmakend van het ‘ChemRICH’ concept). Deze analyse combineerde beide volledige gegevens-sets om te zoeken naar verschillen in patronen tussen onze controle- en patiënten-groepen […]. 6 van de 7 hadden een significante (p < 0.05) impact op metabolieten-clusters (niet geklassificeerd als medicijnen). Deze 6 zijn androgene steroïden, acyl-cholinen, ceramiden, dipeptiden, acyl-carnitinen & sfingomyelinen. […] Al deze clusters kwamen naar voor in onze analyse als we enkel naar de p‐waarden keken maar, voor het eerst, bleven er 3 significant na correctie […]. De trend binnen elke cluster is uniek: alle gewijzigde androgene steroïden en acyl-cholinen daalden bij patiënten, alle gewijzigde ceramiden stegen, terwijl van de 8 veranderde acyl-carnitinen afgenomen waren. Corticosteroïden zijn een andere klasse steroïden en die waren de volgende significante cluster […]. Net zoals androgene steroïden zijn beide veranderde corticosteroïden gedaald bij patiënten.

2.4.3. Inclusieve observatie van de metabolomica-gegevens

Een opvallende observatie is dat er geen groot verschil wordt gezien bij het vergelijken van de controle-groep met de patiënten. Dit is, op zich, een opmerkelijk resultaat dat we later zullen bespreken. Niettemin is het ook essentieel om na te denken over de gebruikte methodes en hun beperkingen, in het bijzonder in het licht van de talrijke genegeerde (19 tot 66%) bij ‘MetaboAnalyst’ én ‘ChemRICH’. Hoewel de ‘ChemRICH’ sub‐mechanisme analyse waardevolle en statistisch sterke inzichten in onze gegevens-set biedt, opteerden we voor een eenvoudig ontwerp dat evenzeer uitgebreide berekeningen toelaat om onze gegevens-sets te analyseren met minder strikte statistische nauwkeurigheid om ons toe te laten de metabolomica-toestand van M.E./CVS-patiënten volledige te begrijpen. Daarom besloten we de verhouding (controles/patiënten) van de mediaan voor elk metaboliet (geanalyseerd met Metabolon®) te becijferen. De mediaan werd gekozen boven het gemiddelde omdat sommige metabolieten een groot bereik overspannen en sommige gemiddelden vooringenomen bleken wanneer er geen verdere statistische controle werd toegepast […]. Verder groepeerden we de metabolieten overéénkomstig Metabolon®’s sub‐mechanisme verdelingen, door het gemiddelde te maken van de verhouding van de medianen voor alle molekulen van een bepaald sub‐mechanisme; wat resulteerde in 94 gegevens-punten voor het globaal metabolomica-panel. Hetzelfde proces werd geïmplementeerd gebruikmakend van het complexe lipiden panel (gegevens niet getoond), zonder meldenswaardige verschillen.

Binnen de super-mechanismen hebben de meerderheid van de sub‐mechanismen een gemiddelde ‘fold-change’ van de mediaan dicht bij 1, wat een weerspiegeling is van het feit dat er geen algemene ontregeling bestaat tussen de controle- en patiënten-groepen. Niettemin sprongen enkele sub‐mechanismen eruit omdat een meerderheid van (zo niet alle) hun metabolieten in dezelfde richting ontregeld waren voor een bepaalde groep t.o.v. de ander.

De meest opvallende wijziging zijn de acyl-cholinen met een verhouding van 1,9. Alle leden daarvan liggen lager in de M.E./CVS-groep, en 5 daarvan zijn significant verschillend volgens onze ‘volcano-plot’ analyse.

Deze analyse vestigt ook de aandacht op androgene steroïden (verhouding = 1,7). Opnieuw liggen alle leden van dit sub‐mechanisme lager bij M.E./CVS vs. controles. Zeven hebben p‐values < 0.05, zelfs al negeerden we ze initieel op basis van correctie voor ‘multiple testing’. Androgene steroïden werden reeds benadrukt in de ‘ChemRICH’ analyse. Alle 18 metabolieten komen minder overvloedig voor bij in M.E./CVS (verhoudingen variërend van 1,1 tot 4). Androgene steroïden omvatten DHEA (dehydro-epiandrosteron) en zijn overvloedig circulerende steroïden met wisselende biologische funkties, inclusief belangrijke effekten op het centraal zenuwstelsel. Twee andere steroïd-mechanismen lijk ook ge-downreguleerd bij M.E./CVS: progestine steroïden & corticosteroïden. Van de 6 metabolieten van het eerste sub‐mechanisme, hadden er 5 een verhouding tussen 1,3 en 1,7 en de zesde lag op 0,94. Progestine steroïden zijn nauwer betrokken bij de vrouwelijke menstruele cyclus. Aan de andere kant zijn corticosteroïden betrokken bij een zeer brede waaier aan fysiologische processen, inclusief maar niet beperkt tot de immuun-respons, de inflammatie-regulering en het proteïnen-katabolisme. Terwijl één een verhouding van 0,98 had, lagen de andere 3 op 1,36, 1,46 en 1,65 (2 groepen van elk 26 vrouwelijke individuen).

Dipeptiden maken ook deel uit van de sub‐mechanismen met een hoge gemiddelde verhouding van ‘fold-change’ medianen. Van de 6 dipeptiden in onze gegevens-set werden er 4 vernoemd in onze gegevens-analyse. Valyl-glycine kwam niet naar voor gezien z’n mediane ‘fold-change’ van 1 en ook leucyl-glutamine niet, zelfs al had dit een ‘fold-change’ van 1,48. Over het algemeen is het dipeptide sub‐mechansime ge-upreguleerd bij M.E./CVS-patiënten.

Twee andere sub‐mechanismen dienen te worden vermeld: het pyrimidine-metabolisme (cytidine-bevattend) en het vitamine-B6 metabolisme aangezien dit terugkerende resultaten zijn in de M.E./CVS-metabolomica literatuur [Nagy‐Szakal D et al. Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics. Sci. Rep. (2018) 8: 10056 /// Germain A, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 13: 371)379 /// Germain A, Hanson MR et al. Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology. Metabolites (2018) 8: 90] en eerder vernoemd.

Ten slotte: één molecule geklassificeerd als een acyl-glutamine (hexanoyl-glutamine) had de laagste verhouding (0,77). Een hogere concentratie van dit metaboliet bij patiënten zou wijzen op een toename qua mitochondriale vetzuren β‐oxidatie (FAO) en zou het energie-niveau bij patiënten kunnen beïnvloeden. Dergelijke veranderingen werden ook gelinkt aan Parkinson’s, hoewel niet als enige biomerker.

3. Bespreking

3.1. Acyl-cholinen zijn gedaald

Deze klasse molekulen is zeer intrigerend in de context van M.E./CVS. Hoewel dit slechts de tweede keer is dat acyl-cholinen werden bepaald bij M.E./CVS, zijn de resultaten reproduceerbaar tussen twee afzonderlijke groepen. Onze eerdere studie bevat gegevens over vier acyl-cholinen (arachidonoyl-choline, linoleoyl-choline, oleoyl-choline & palmitoyl-choline), en ze bleken allemaal ook gedaald in de patiënten-groep vergeleken met controles. […]

Acyl-cholinen zijn een onduidelijke klasse molekulen die voor het eerst werden beschreven in 1911: in combinatie met bloeddruk, bleek uit een opmerkelijk uitgebreide studie dat korte-keten choline-esters een verlagend effekt hadden terwijl lange-keten choline-esters neigden naar een verhogend effekt. Deze bevindingen werden tussen 1914 & 1956 verder bekrachtigd door meerdere groepen. Op dat moment werden farmacologische effekten van acyl-cholinen aangetoond […]. De molekulen die door ons werden gemeten (beschouwd als lange-keten acyl-cholinen) bleken het effekt van acetylcholine op weefsels (van konijn en cavia) te blokkeren, en onderdrukten de spontane zoutzuur-sekretie door rat-maag. Bloeddruk-problemen zijn één van de vele symptomen bij M.E./CVS-patiënten, bijzonderlijk wanneer we de courante dysfunktie orthostatische intolerantie in overweging nemen. Een afname qua lange-keten acyl-cholinen kan een ontregeling van de bloeddruk-controle (welke zich manifesteert via duizeligheid, lichthoofdigheid, troebel zicht, en neigende syncope bij staan) verklaren. We weten ook dat patiënten prikkelbare darm syndroom kunnen hebben, naast veel andere intestinale stoornissen. Een daling van lange-keten acyl-cholinen kan de zoutzuur-sekretie ontregelen met gevolgen zoals ‘leaky gut’ [lekke(nde) darm] symptomen en gewijzigde darm-microbioom populaties. Ten slotte, en hoewel acetyl-choline niet tot de gemeten metabolieten behoort, noteren we dat lange-keten acyl-cholinen antagonistische aktiviteit voor acetyl-choline vertonen. Acetyl-choline was de eerste neurotransmitter die werd geïdentificeerd en staat bekend als cruciaal voor het centraal zenuwstelsel (CZS) en het perifeer zenuwstelsel (PZS). In het CZS ondersteunt het de cognitieve funkties van de hersenen (waaronder kennis-verwerving en begrijpen via gedachten, ervaringen en bewustzijn). Dit zijn allemaal vaardigheden waarvan M.E./CVS-patiënten melden dat ze verminderd zijn; hun cognitieve problemen, die dikwijls worden beschreven als ‘hersen-mist’, omvatten – om er maar enkele op te noemen – concentratie-problemen, dyscalculie [problemen met vlot en accuraat oproepen en toepassen van het rekenen], geheugen-verlies, ruimtelijke desoriëntatie. In het PZS werkt acetyl-choline in de neuromusculaire verbindingen. Acetyl-choline fungeert in het autonoom zenuwstelsel, zowel als een interne transmitter voor het sympathisch zenuwstelsel (SZS), ook het ‘fight or flight’ system genaamd, en als het uiteindelijk produkt afgegeven door het parasympathisch zenuwstelsel (PZS), ook ‘rest & digest’ systeem genaamd. Inderdaad: naast de talrijke hierboven vernoemde digestieve problemen, is het kenmerkend symptoom van M.E./CVS de overweldigende vermoeidheid die niet verbetert door rust en die tot uiting komt na aktiviteit, beschreven als post-exertionele malaise (PEM).

Acyl-cholinen zijn enorm verwaarloosd sinds de jaren ‘50. Linoleoyl-choline, oleoyl-choline, palmitoyl-choline en stearoyl-choline werden slecht karig besproken als versterkers van medicijn-absorptie door het gastro-intestinaal kanaal (een farmacologisch experiment vond dat arachidonoyl-choline cholinomimetische aktiviteit [cholinomimetica = parasympaticomimetica] vertoont, wat het PZS stimuleert). Vooral omwille van Metabolon®’s expertise werden acyl-cholinen vernoemd in enkele nutritionele metabolomica-studies (plasma & serum). In één geval werd het effekt van koffie-consumptie op het bloed-metabolisme van individuen geëvalueerd, en hoewel zes acyl-cholinen significant geassocieerd bleken met koffie-inname, waren er 99 bijkomende ongerelateerde metabolieten met dezelfde associatie. Zoals verwacht was cafeïne er één van, met een ‘fold-change’ van 73 maal; onze groep toont echter geen enkel verschil tussen controles en patiënten (1,1 maal). Er werden door dezelfde groep gelijkaardige resultaten gerapporteerd bij het focussen op lipidomica. In een ander geval bleek een invloed van de consumptie van rijst-zemelen en kleine witte bonen op 71 plasma-molekulen t.o.v. controles, inclusief enkele acyl-cholinen. Opnieuw bleek geen enkel van de andere door ons gemeten metabolieten zich op dezelfde manier te gedragen, wat laat doorschemeren dat de haast exclusieve acyl-choline verschillen tussen controles en M.E./CVS-patiënten niet te wijten zijn aan nutritionele verschillen maar i.p.v. daarvan aan specifieke aan acyl-choline gerelateerde mechanismen. Een andere studie, bij een andere populatie, beperkt tot de consumptie van rijst-zemelen, leidde tot hetzelfde besluit.

3.2. Dipeptiden zijn gedaald

Dipeptiden zijn een andere klasse molekulen waarvan de waarden bleken te zijn afgenomen in onze patiënten-groep, zowel via statistisch testen als ‘ChemRICH’ analyse. Ons begrip omtrent variaties in plasma dipeptide-waarden is nog beperkt maar we merken op dat de meeste van de in onze eerdere studie bepaalde dipeptiden, zij het niet dezelfde, ook minder overvloedig waren in de patiënten-groep dan bij de controles. Als we focussen op de literatuur en symptomen van M.E./CVS-patiënten, wordt onze aandacht getrokken op het therapeutisch potentieel van sommige dipeptiden voor vermoeidheid, veroudering en spier-herstel.

3.3. Sfingolipiden zijn gedaald

Ceramiden en sfingomyelinen werden op verschillende tijdstippen opgemerkt: beide bleken significant verhoogd (statistische en aanrijking-analyse) voor het complex lipiden-panel gebruikmakend van ‘MetaboAnalyst’ én ‘ChemRICH’. Er werden bij M.E./CVS-patiënten reeds mechanisme-abnormaliteiten beschreven voor sfingolipiden maar de resultaten zijn inconsistent. In een groep van gelijkaardige grootte, vonden Naviaux et al. dat ceramiden en sfingomyelinen verhoogd waren bij de patiënten, ongeacht het geslacht [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480]. Dit resultaat kon niet worden gereproduceerd door Nagy‐Szakal et al. [zie hierboven]: zij zagen geen consistente daling qua ceramide-waarden maar meldden verminderde waarden van langere ceramiden bij patiënten zonder IBS. Onze gegevens toonden in plaats daarvan een toename van de ceramiden bij onze patiënten t.o.v. controles. Wanneer we onze patiënten-groep opsplitsten op basis van darm-symptomen, neigden de ceramide-waarden van patiënten zonder darm-symptomen zelfs verder gestegen voor CER (18:0), CER (18:1) & CER (20:0).

De inconsistenties die tussen de studies over ceramide-metabolisme, en meer algemeen sfingolipiden, naar voor kwamen, wijzen op een ingewikkeld landschap bij M.E./CVS. Hun prevalentie in cel-membranen, en hun betrokkenheid bij vele cel-processen, alsook de talrijke ongerelateerde pathologieën gelinkt aan een onevenwicht wat betreft hun waarden, suggereert dat veranderingen met betrekking tot sfingolipiden niet direct gelinkt zijn met M.E./CVS, maar eerder een gevolg zijn van de ziekte en de levensstijl dat het de patiënten oplegt (verstoord dieet, gebrek aan fysieke aktiviteit en medicatie).

3.4. Drie klassen steroïden gedaald

De hieronder besproken steroïden worden aangemaakt in de bijnier-schors, de geslachtsorganen en de placenta. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van de water- en zout-balans, het metabolisme en de stress-respons, alsook sexuele differentiatie en reproduktie. Via onze analyse vonden we dat drie categorieën steroïden gemiddeld minder overvloedig waren bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles. Er werden achttien androgene steroïden gemeten, inclusief enkele afgeleiden van dehydro-epiandrosteron (DHEA), maar geen enkele bleek de meest overvloedige in de circulatie. DHEA is gekend voor een waaier aan biologische effekten (van intermediair voor de biosynthese van geslacht-steroïden tot direct bindend op cel-receptoren en werkzaam als een neuro-steroïd). Drie van de vier gemeten corticosteroïden (cortisol, cortison & corticosteron) waren lager bij patiënten. Ze hebben rollen bij de stress-respons, het geheugen en inflammatie. Ten slotte waren vijf van de zes gemeten progestine-steroïden ook lager bij patiënten. Deze categorie van steroïden is voornamelijk gelinkt met het vrouwelijk reproduktief systeem, met gekende gevolgen als er onevenwichten optreden, bv. de maandelijkse pijn die vrouwen ervaren wanneer dit systeem zich reset, of tijdens de menopauze.

Het gebruik van steroïden om te proberen de symptomen van M.E./CVS-patiënten te verlichten werd vele malen geprobeerd; met merkbare verbeteringen voor sommige patiënten. De medische consensus is echter dat de meerdere risico’s en nevenwerkingen die deze krachtige metabolieten meebrengen, niet opwegen tegen hun voordelen. Niettemin suggereren sommige onderzoeken dat M.E./CVS gecorreleerd is met een verminderde funktie van de hypothalamus‐hypofyse‐bijnier (HPA) as en een hypersensitiviteit van het CZS [de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Med Genom. (2017) 10: 11]. De rol van de HPA-as is wordt niet helemaal begrepen omdat het zoveel funkties in het lichaam reguleert (energie-verbruik, temperatuur, immuunsystem, vertering, stemming en sexualiteit). In de context van steroïden zijn de implicaties van de HPA-as bij M.E./CVS erg breed en de daling van drie klassen steroïden zou gelinkt kunnen worden met een meerderheid van de symptomen en aangetaste systemen bij M.E./CVS-patiënten.

3.5. Acylen en M.E./CVS

Acyl-groepen zijn een deel van een molekule met een dubbel‐gebonden zuurstof-atoom en een alkyl-groep (RCO-); wat betekend dat de acyl-groep verbonden is aan een grotere molekule zoals het geval is voor al de acyl-molekulen in deze analyse. Hoewel de acetyl-groep een subtype van acyl is, bleek geen acetyl-molekule verschillend tussen controles en patiënten. In plaats daarvan legden we een klasse lipiden bloot behorend tot het acyl-choline sub‐mechanisme als één van de zeldzame molekulen die consistent lager waren bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles. Dit zette ons aan de analyse te dupliceren bij onze eerdere gepubliceerde gegevens. Hoewel het tocoferol-metabolisme en keton-lichamen oorspronkelijk werden besproken, worden de andere vier opnieuw bekeken. Onder hen zijn acyl-cholinen en acyl-glutamine gemeenschappelijk, terwijl mono-acyl-glycerolen als bijkomend acyl‐gerelateerd sub‐mechanisme opduikt. Mono-acyl-glycerolen maken geen deel uit van de gegevens van deze laatste analyse. Het disaccharide en oligosaccharide [suikers] sub-mechanisme is onderdeel van het koohydraten super‐mechanisme en verwijst enkel naar sucrose, dat verminderd was bij patiënten vergeleken controles. Acyl-carnitinen bleken ook gewijzigd.

We hebben een zeer beperkte kennis van zowel het synthese-pad als de funkties van de meerderheid van deze molekulen, maar ze maken deel uit van het lipiden super‐mechanisme en er kunnen enkele links tussen hen worden gevonden. Bv.: mono-acyl-glycerolen komen voort uit diacyl-glycerolen via verscheidene lipasen, inclusief hormoon-sensitieve lipasen die in sommige gevallen betrokken zijn bij steroïden-produktie. Een ander voorbeeld is de lengte van de vetzuur-keten van praktisch alle gemarkeerde molekulen, tussen 16 en 28 koolstoffen.

3.6. Reproduceerbaarheid

In onze eerdere studie werd het bloed anders verwerkt: de bloedstalen werden ‘s nachts verstuurd […] vergeleken met de snelle verwerking in deze studie. Het bewaren van levende cellen gedurende gemiddeld 24 h heeft toen wellicht een invloed gehad op de hoeveelheden van sommige metabolieten, wat mogelijks een verklaring is voor verschillen in sommige metabolieten van beide studies. Cellen die overnacht geïncubeerd zijn in plasma geven wellicht metabolieten af in het plasma, of absorberen deze uit het plasma. Onze huidige studie is meer representatief voor de metabolieten die circuleren in het bloed van M.E./CVS-individuen en controles. Resultaten van de twee studies kunnen ook niet exact worden vergeleken omdat niet allemaal dezelfde metabolieten werden gedetekteerd via Metabolon®. Bv.: 458 metabolieten met een HMDB-identificatie zijn gemeenschappelijk voor de studies, waarbij 25% van de gegevens van onze eerdere studie niet aanwezig zijn in deze set gegevens, en omgekeerd: 13% van de gegevens in deze set zijn niet aanwezig.

4. Materialen & Methodes

4.1. Studiegroep & bloedafname

52 vrouwelijke individuen, 26 gezonde controles, 26 patiënten met M.E./CVS diagnose door een specialist (dr Susan Levine), CDC criteria. […]. Er werd een inspanning geleverd om te matchen voor leeftijd en BMI.

[…].

4.2. Metabolomica-panels

[…] Metabolon® […] globale-metabolomica en lipidomica-panels […].

4.3. Gegevens-analyse

Twee online diensten. ‘MetaboAnalyst’ (statistische analyse en pad-analyse) modules […]. ‘ChemRICH’ (statistische verbetering). […].

4.4. Beschikbaarheid van gegevens

[…]

4.5. Goedkeuring voor de studie

[…]

5. Besluiten

We rapporteren hier over het grootste aantal metabolieten bij M.E./CVS tot op heden: ca. 1.750 plasma-molekulen, die 20 super‐mechanismen en 113 sub‐mechanismen beslaan. We hebben echter geen plasma-biomerker of set biomerkers ondubbelzinnig kunnen identificeren waarbij de hoeveelheden drastisch zouden verschillen tussen controles en M.E./CVS-patiënten, ondanks het feit dat onze klinische gegevens er op wijzen dat onze patiënten-groep een substantiële mate van invaliditeit vertoonde. Dezelfde conclusie kan worden getrokken uit het onderzoek-rapporten van verscheidene research-groepen, inclusief het onze, waarbij afzonderlijke populaties werden gerecruteerd, andere instrumenten werden gebruikt, of zelfs serum werd geanalyseerd i.p.v. plasma.

Niettemin dienen de metabolieten die op basis van onze analyse werden beklemtoond, vooral acyl-cholinen en steroïden, te worden beschouwd in het licht van de metabole impact die zelf bescheiden veranderingen kunnen hebben te samen met de complexiteit van de bronnen die metabolieten in de circulatie brengen. Inderdaad: de geobserveerde veranderingen kunnen het resultaat zijn van een stoornis die optreedt in een ander deel van het lichaam (bv. hersenen, spieren), met een impact die ‘verdund’ optreedt in het plasma. Het verkrijgen van stalen onder omstandigheden die de symptomen van patiënten (bv. PEM) versterken, zouden de geobserveerde kloof tussen het plasma-metaboloom van patiënten en controles verder kunnen verbreden. Omdat bloeistof-biopten zoals plasma en serum de meest toegankelijke bron blijven bij mensen, zullen onze resultaten gecombineerd met meer exploratieve metabolomica onze inspanningen help stimuleren vooraleer evolueren naar andere, meer invasieve staal-name technieken. Bovendien kan een controle voor vals-positieven worden aangewend om chemische groepen te identificeren i.p.v. individuele metabolieten die geassocieerd kunnen zijn met een ziekte of fenotype. Follow‐up studies kunnen nieuwe doelgerichte analytische methodes ontwikkelen om die chemische groepen te meten […].

februari 29, 2020

Diagnostische waarde van microRNAs (uit PBMCs & extracellulaire vesikels) bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:50 am
Tags: , , , ,

Onderstaande studie (door Dr Elisa Oltra’s research-team, Universiteit van Valencia, Spanje), werd gefinancierd door het ‘MEA Ramsey Research Fund’ en gebruikte stalen van de ‘UK ME Biobank’. De onderzoekers analyseerden microRNAs in PBMCs (perifeer bloed mononuclaire cellen) & EVs (extracellulaire vesikels) in het bloed van mensen met ernstige M.E.(cvs) om te bekijken of ze een diagnostische biomerker konden identificeren. Ze bevestigden de dalingen qua creatine-fosfokinase (zie ‘Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)’) en vonden verschillen (met gezonde controles) van het aantal en de grootte van extracellulaire vesikels.

M.E.(cvs)-patiënten hadden méér maar kleinere EVs, overéénkomstig met andere studies (zie ‘Extracellulaire vesikels: potentiële biomerkers voor M.E.(cvs)?’ en lees voor meer uitleg ook de stukken waar naar wordt gerefereerd in de inleiding van het artikel).

27 miRNAs (17 miRNA’s in PBMCs & 10 miRNA’s in EVs) bleken significant verschillend. 15 van die 27 miRNAs zouden mogelijks aangewend kunnen worden als diagnostische biomerkers voor M.E.(cvs). Maar er zijn verdere studies vereist om dit na te gaan (o.a. vergelijkingen met andere ziekten zoals bv. Multipele Sclerose).

————————–

Scientific Reports Vol 10, #1, article number 2064 (February 2020)

Assessing diagnostic value of microRNAs from peripheral blood mononuclear cells and extracellular vesicles in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eloy Almenar-Perez (1), Leonor Sarria (2), Lubov Nathanson (2), Elisa Oltra (3)

1 Escuela de Doctorado, Universidad Catolica de Valencia San Vicente Martir, Valencia, Spain

2 Institute for Neuro Immune Medicine, Dr. Kiran C. Patel College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, Florida, USA

3 School of Medicine, Universidad Catolica de Valencia San Vicente Martir, Valencia, Spain

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een slopende multi-systemische ziekte met een onbekende etiologie, die wereldwijd duizenden individuen treft. De diagnostiek steunt nog op het uitsluiten van medische problemen die leiden tot onverklaarde vermoeidheid, dit omwille van een compleet gebrek aan ziekte-specifieke biomerkers.

Onze groep en anderen hebben de potentiële waarde van microRNA-profielen (miRNomen) als diagnostische instrumenten voor deze ziekte verkend. De heterogeniteit van en de lage aantallen deelnemers, de variëteit van de geteste stalen en andere pre-analytische variabelen hebben echter de identificatie van met ziekte geassocieerde miRNomen belemmerd.

In deze studie heeft ons team, voor het eerst, M.E./CVS miRNomen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en extracellulaire vesikels (EVs) van ernstig zieke patiënten – gerecruteerd door ‘UK ME biobank’ – geëvalueerd, om – gebruikmakend van standaard procedures – bloed-frakties te bepalen met een optimale diagnostische ‘power’ voor een snelle vertaling van een op miR gebaseerde diagnostische methode naar de kliniek.

Onze resultaten tonen dat creatine-kinase (CK) waarden in het bloed, fysieke kenmerken van plasma-EVs (tellingen, grootte en zeta-potentiaal), en een beperkt aantal differentieel tot expressie komende PBMC & EV miRNAs significant geassocieerd blijken met ernstige M.E./CVS (p < 0.05).

Genen-aanrijking analyse wijst epigenetische en neuro-immune ontregelde mechanismen aan, in overéénstemming met eerdere rapporten. Populatie-validatie via een kosten-effektieve benadering beperkt tot deze enkele potentieel discriminerende variabelen is aangewezen.

Inleiding

[…]

Ondanks het aanzienlijk aantal studies die significante verschillen op immuun en metabool niveau tonen, en het rapport door het ‘Institute of Medicine (IOM)’ van de ‘Academy of Sciences USA’ dat beklemtoont dat de aard van M.E./CVS fysiologisch/medisch is en niet een psychiatrische ziekte, steunen de huidige diagnostische methodes nog steeds op het uitsluiten van andere ziekten met gelijkaardige symptomen.

MicroRNAs, miRNAs of miRs zijn korte niet-coderende RNAs (20-24 nucleotiden [bouwstenen voor DNA & RNA] lang) met gen-expressie regulerende funkties. Hun abnormale expressie bij ziekte ligt al behoorlijk goed vast [kanker, neuro-inflammatie, …], wat hen tot aantrekkelijke biomerker-kandidaten maakt in menig scenario, inclusief M.E./CVS.

Onze groep en anderen hebben in het verleden de mogelijkheid onderzocht om miRNomen of molekulaire miRNA-profielen te identificeren voor M.E./CVS en co-morbide ziekten, via het analyseren van de inhoud van PBMCs (perifeer bloed mononucleaire cellen) of het bewijzen van hun aanwezigheid in lichaamsvochten (plasma, serum & cerebrospinaal vocht) [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J. Affect Disord. (2012) 141: 261-269 /// Cerdá-Olmedo G, Oltra E et al. Identification of a microRNA signature for the diagnosis of fibromyalgia. PLoS One. (2015) 10: e0121903 /// Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One. (2014) 9: e102783 /// Petty RD, Kerr JR et al. MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: potential diagnostic biomarkers in natural killer (NK) cells of patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One. (2016) 11: e0150904 /// Baraniuk JN et al. Exercise-induced changes in cerebrospinal fluid miRNAs in gulf war illness, Chronic Fatigue Syndrome and sedentary control subjects. Sci. Rep. (2017) 7, 15338 /// Al-Rawaf HA et al. MicroRNAs as biomarkers of pain intensity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain Pract. (2019) 19: 848-860]. Alle lichaamsvochten bevatten vrije miRNAs, met proteïnen gecomplexeerde miRNAs maar ook miRNAs verpakt in extracellulaire vesikels (EVs). De ‘International Society for Extracellular Vesicles’ (ISEV) ondersteunt “extracellulair vesikel (EV) als de generische term voor partikels die worden afgegeven door de cellen die worden omgeven door een lipiden-dubbellaag en niet kunnen repliceren, d.w.z. geen funktionele kern bevatten”. Het is geweten dat EV een mengeling van exosomen, microvesikels, micropartikels, ectosomen, oncosomen, apoptotische lichaampjes en vele membraneuze strukturen met andere namen omvatten.

De aanwezigheid van de beschermende lipiden-dubbellag van EVs vormt een fysieke barrière tegen RNA-afbrekende enzymen, wat mogelijks leidt tot betere repliceerbaarheid van testen gebaseerd op RNA-kwantificatie. Daarnaast is geweten dat sommige van deze vesikels, exosomen [vesikels met dubbel membraan gekenmerkt door de expressie van merkers zoals tetraspaninen], op een gerichte manier miRNAs verpakken, en ziekte onderhouden en verspreiden, en daarom kunnen ze biomerker-voordelen bieden voor op vloeistof-bioptie gebaseerde diagnostische methodes. Aangezien EVs in het bloed hun oorsprong kunnen vinden in eender welke lichaam-cel, inclusief het microbioom en andere organismen, kan hun inhoud mogelijks informeren over dysbiose in het algemeen, naast immuun-dysfunkties. Dit laatste lijkt van bijzonder belang bij multi-systemische ziekten, zoals M.E./CVS, waarbij patiënten zich aandienen met neuro-immune veranderingen, hormonale onevenwichten, uitgeputte spieren, lekke darmen, enz. Ondanks het potentieel, is er nog geen studie uitgevoerd om bepaalde miRNAs in EVs geassocieerd met M.E./CVS systematisch te evalueren.

Het doel van deze studie het, voor de eerste maal, evalueren van M.E./CVS miRNomen in EVs bij ernstig zieke patiënten en ze vergelijken met die van hun PBMCs, als een manier om bloed-frakties te bepalen met optimale diagnostische ‘power’, voor een snelle vertaling van een miR-gebaseerde methode om de diagnose van M.E./CVS te stellen in de kliniek. Ter zelfder tijd kan de informatie verkregen uit de analyse van EV-inhoud leiden tot de identificatie van molekulaire doelwitten, om ons begrip omtrent de communicatie tussen een dysfunktioneel immuunsysteem en de rest van het organisme bij M.E./CVS-pathofysiologie te verbeteren.

Resultaten

Populatie-demografie. Bloedstalen van 30 deelnemers (15 patiënten met ernstige M.E./CVS & 15 voor leeftijd gematchte gezonde individuen), verkregen via de ‘UK ME Biobank’. M.E./CVS-diagnose op basis van de Canadese Consensus en/of CDC-1994 (‘Fukuda’) criteria. De opgenomen individuen waren allemaal vrouwen […]. Mediaan 48 jaar voor de M.E./CVS-groep en 47 voor de gezonde controles (HC). Gemiddelde tijd sinds ziekte-aanvang mediaan 18,4 jaar.

Verschillen in klinische variabelen. De SF-36 en ‘General Health Questionnaire’ (GHQ) scores […] indicatief voor de ernstig aangetaste gezondheid van de M.E./CVS-deelnemers.

Van de 30 klinische parameters die men evalueerde bij de ‘UK Biobank’ vertoonden enkel de creatine-fosfokinase (CPK) waarden statistisch significante verschillen tussen de groepen (p < 0.05): deze van de M.E./CVS-patiënten lagen ca. 1,5 maal hoger. […]

Kenmerken van plasma-EV verschillen tussen M.E./CVS & HCs. Aangezien het uiteindelijk doel van de studie was om de diagnostische waarde van miRNA-profielen van PBMCs en plasma-EVs te bepalen bij ernstige M.E./CVS, en aangezien de miRNA-lading in EVs afhankelijk is van de geïsoleerde vesikel-subpopulaties, besloten we dat het nodig was de geïsoleerde EVs die zouden worden gebruikt voor RNA-extractie te karakteriseren.

Op basis van eerdere rapporten die de superioriteit (in termen van of EV-opbrengst) toonde van op precipitatie [vorming van een neerslag, bezinksel] gebaseerde methodes t.o.v. andere, meer arbeid-intensieve klassieke methodes, en onze interesse voor een snelle, technisch eenvoudige diagnostische methode (in een klinische context), besloten we dat het gebruik van een precipitatie-benadering voor EV-isolatie het meest geschikt was. […]

De verkregen EV-opbrengsten uit equivalente volumes plasma waren hoger bij M.E./CVS dan HCs, hoewel niet statistisch significant (p < 0.1). Interessant: de geïsoleerde EVs vertoonden statistisch significante grootte-verschillen; ze waren gemiddeld kleiner bij de M.E./CVS-groep. Om uit te sluiten dat de geobserveerde resultaten te wijten konden zijn aan verschillen qua plasma-proteïnen die interfereren met de isolatie-methode, herhaalden we de procedure met een voor-behandeling met proteinase-K […]. We konden zo bevestigen dat er kwalitatieve verschillen bestaan, zowel qua aantal vesikels als hun grootte, in het plasma van M.E./CVS-patiënten t.o.v. HCs (p < 0.05).

Om de gepaste diverse geïsoleerde EVs verder te karakteriseren, hebben we hun zeta-potentiaal gemeten, een parameter die een weerspiegeling is van de oppervlakte-lading van het vesikel die informatief kan zijn voor verschillende membraan-samenstelling en indicatief voor vesikel-stabiliteit of de kans dat deze colloïdale oplossingen [colloïde (of colloïdaal deeltje = klein partikel dat groter is dan een molekule, met een diameter tussen 1 en 1000 nm] zouden aggregeren. Hoewel de verkregen waarden, over het algemeen, passen bij deze gerapporteerd in de literatuur (zeta-potentiaal van EVs geïsoleerd uit menselijk plasma: -10 to -50 mV), werden significante verschillen gevonden. In het bijzonder: EVs van M.E./CVS-patiënten gaven meer negatieve waarden dan deze van HCs (met of zonder proteinase-K). Dit suggereert dat er verschillen qua lipiden en/of andere membraan-componenten bestaan en dat, over het algemeen, M.E./CVS EVs mogelijks lichtjes stabieler zijn dan deze van HCs. Bovendien werden er, wanneer de EVs van elke groep onafhankelijk werden vergeleken, met betrekking tot voor-behandeling met of zonder proteinase-K, significante verschillen gezien voor zowel HCs als de M.E./CVS-groep. Aangezien in beide gevallen de proteinase-K voor-behandeling leidde tot meer positieve resultaten (minder negatieve zeta-waarden), werden de resultaten geïnterpreteerd als bewijs voor de rol van proteïne-factoren aanwezig in plasma-EVs bepalend voor membraan-elektronegativiteit, stabiliteit in oplossing en, mogelijks, hun werking.

Geïsoleerde plasma-EVs vertonen exosoom-kenmerken. TEM (Transmissie Elektronen Microscopie) beelden van geïsoleerde EVs en ‘western-blot’ analyse [immun-detektie van proteïnen] tonen dat de geïsoleerde EV-frakties (uit M.E./CVS- & HC-plasma’s), meerdere exosoom-kenmerken vertonen, inclusief morfologie (dubbel-lagig membraan ‘schotel-vormig’ [met een deuk in het centrum]), grootte (diameter 30-100 nm), en aanwezigheid van de tetraspaninen [familie van membraan-proteïnen] CD9 & CD81. Deze vesikel-subset medieert lange-afstand communicatie, draagt naar verluidt differentiële miRNA-ladingen bij ziekte, bleken potentiële diagnostische waarde te hebben in andere contexten en waren, daarom, van belang voor ons project. Aangezien het echter ons uiteindelijk doel was om een technisch eenvoudige diagnostische strategie te vinden onafhankelijk van de gekozen methode voor isolatie van EV-subsets, deden we geen verdere inspanningen naar detektie van exosomale merkers toe; er werden ook geen bijkomende zuivering-stappen uitgevoerd.

RNA-stalen in miRNA-profilering testen. De RNA-opbrengsten voor de 30 PBMC-stalen varieerden tussen 810-2.800 ng, en die voor de EVs tussen 102-514 ng. Enkel PBMC RNA-stalen met RIN (‘RNA integrity number’ [methode om de integriteit/kwaliteit van RNA na te gaan; schaal 1-10, waarbij 10 staat voor ‘intact’]) -waarden boven 7 werden meegnomen voor verdere analyse. 28 van de 30 stalen voldeden aan dit criterium, duidend op een globale aanvaardbare kwaliteit van de PBMC-stalen van de ‘UK ME Biobank’. Beide stalen met een lage RIN behoorden tot de HC-groep. Daardoor was het uiteindelijk aantal RNA-stalen van PBMCs die we geschikt achten voor verdere analyse 28 (15 M.E./CVS & 13 HCs).

Aangezien er geen kwaliteit-controle kan worden toegepast op totaal klein RNA verkregen uit EVs, en hun RNA-profielen gelijkaardige kenmerken vertoonden – onafhankelijk van het EV-isolatie protocol (met of zonder proteinase-K voor-behandeling) of de geanalyseerde groep (M.E./CVS or HC) – werden alle 30 RNA-stalen uit EVs (15 M.E./CVS & 15 HCs) opgenomen voor de microRNA-profilering.

Verschillen qua RNA-voorraden tussen PBMCs and plasma-EVs. De totale inhoud klein RNA in EVs vertoonde gelijkaardige patronen ongeacht de groep (M.E./CVS of HCs). Er werden geen belangrijke soorten (pieken met betrekking tot grootte) gedetekteerd voor deze van 4 tot > 150 nucleotiden. In tegenstelling daarmee werd een brede piek gezien voor de 20-40 nt en een tweede smalle piek voor deze rond a 60 nt voor totaal RNA uit PBMCs; dit ondersteunt differentiële sortering van klein RNA in vesikels (zoals eerder door andere auteurs werd beschreven).

Na toepassing van aanbevolen normalisatie-parameters, werden slechts 136 miRNAs uit PBMCs en 639 van 798 uit EVs gebruikt voor differentiële expressie analyse. Daarna verwijderden we de stalen met tellingen onder de achtergrond in 40% of meer van de genormaliseerde miRNAs. Bij de PMBCs verloren we er 3 (2 M.E./CVS & 1 HC) en bij de EVs nog es 3 (toevallig ook 2 M.E./CVS a 1 HC). Deze nieuwe filter verminderde het totaal aantal geanalyseerde stalen tot 13 M.E./CVS & 12 HCs voor PBMCs, en tot 13 M.E./CVS & 14 HCs voor EVs. De stalen die geëlimineerd werden, correspondeerden niet met dezelfde donoren voor PBMC- en EV-frakties, wat aangeeft dat de kwaliteit van de oorspronkelijke biobank-stalen geen verband hield met deze bevinding.

Er werd een derde filter toegepast om nauwkeurig miRNAs af te bakenen met ‘readings’ in minstens 75% van de stalen van de groepen: dit gaf slechts 91 miRNAs uit PBMCs en 150 uit EVs die voldeden aan deze criteria. Daarvan waren er 49 aanwezig in beide sets stalen, terwijl 42 en 101 exclusief waren voor PBMCs of EVs, respectievelijk. Deze miRNAs werden beschouwd als zijnde robuust en reproduceerbaar tot expressie komend in PBMCs & EVs. De beperkingen die werden ingesteld, leidden tot klassificatie van 606 miRNAs uit de 798 geteste als zijnde niet sterk tot expressie komend in PBMCs of EVs.

M.E./CVS PBMC miRNomen. Daarna onderwierpen we al deze 241 miRNAs aan een differentiële expressie (DE) analyse. Aangezien het gedaald aantal stalen aanleiding kon geven tot het verwijderen van miRNAs die, hoewel ze geen statistische significantie bereikten, toch relevant kunnen zijn voor de ziekte, gingen we verder met het detekteren en filteren van mogelijke uitschieters onder de DE miRNAs (p < 0.1) […]. De methode bestaat uit de detektie van een acceptabele band van gegevens rond het gemiddelde. Waarden buiten die band (> 2-maal SD) werden als uitschieters beschouwd.

Statistische analyse van de DE miRNAs uit PBMCs toonde, na deze aanpassing, 17 miRNAs met significante verschillen (p < 0.05), waarvan 9 met over-expressie en 8 met onder-expressie in de M.E./CVS-groep. De miRNAs met significant verhoogde waarden (p < 0.05) waren: hsa-miR-374a-5p, hsa-miRNA-4516, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p & hsa-miR-106b (dalende significantie). De verschillen varieerden tussen 20 en 65%. De miRNAs die significant gedaalde waarden toonden, waren: hsa-miR-644a, hsa-miR-451a, hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, hsa-miR-549a, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-1253 and hsa-miR-590-5p (dalende significantie). De verschillen expressie bij deze laatste groep varieerde tussen 13 en meer dan 200%. Daarnaast vertoonde hsa-miR-21-5p een p-value > 0.05 en < 0.1, wijzend op een tendens tot over-expressie bij M.E./CVS PBMCs t.o.v. HCs.

Interessant genoeg waren 3 van de geïdentificeerde DE miRNAs (hsa-miRNA-146a-5p, hsa-miR-17-5p & hsa-miRNA-451a) eerder als ontregeld gerapporteerd door andere auteurs, bij zowel M.E./CVS of fibromyalgie (FM) -patiënten. [zie hierboven & Leinders M, et al. Increased cutaneous miR-let-7d expression correlates with small nerve fiber pathology in patients with fibromyalgia syndrome. Pain. (2016) 157: 2493-2503]

M.E./CVS plasma-EV miRNomen. Op dezelfde manier vonden we bij M.E./CVS 10 DE (p < 0.05) miRNAs in EVs: 8 met over-expressie en 2 met onder-expressie. De miRNAs met significant verhoogde waarden (p < 0.05) waren: hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, hsa-miR-150-5p; hsa-miR-15a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-374a-5p & hsa-miR-130a-3p. De verschillen qua expressie in deze groep varieerden tussen 17 en 243%. De 3 miRNAs met significante onder-expressie bij M.E./CVS EVs (p < 0.05) waren: hsa-miR-183-3p & hsa-miR-33a-5p. De berekende onder-expressie waarden waren respectievelijk 47 en 17%. Er werden grote verschillen voor bepaalde miRNA-waarden opgemerkt tussen patiënten, wat kan wijzen op het bestaan van patiënten-subgroepen.

Daarnaast vertoonden hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320e, hsa-miR-203a-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-607, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-369-3p & hsa-miR-93-5p allemaal p-waarden > 0.05 & < 0.1 (oplijsting met dalende significantie). Hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320e, hsa-miR-185-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-223-3p & hsa-miR-93-5p vertoonden over-expressie, terwijl hsa-miR-203a-5p, hsa-miR-607 & hsa-miR-369-3p onder-expressie vertoonden in M.E./CVS EVs t.o.v. die van HCs.

Drie van de miRNAs met significante DE in PBMCs waren ook DE in EVs (hsa-miR-374a, hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, en één ervan vertoonde een tendens (p < 0.1): hsa-miRNA-21-5p. Bij deze ontregelde miRNAs, zowel in PBMCs als EVs, vertoonden hsa-miR-374a & hsa-miRNA-21-5p over-expressie in beide frakties, terwijl voor hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 onder-expressie werd gevonden in PBMCs en over-expressie in EVs. De betekenis van deze verschillen wordt nog niet begrepen.

De ‘heatmap’s [grafische voorstelling, met kleuren, van gegevens in een matrix] van miRNAs met DE tussen M.E./CVS en HCs (p < 0.05) in PBMCs of EVs illustreert de beschreven verschillen in miRNA-waarden.

Er werd altijd een minimum van 10 stalen per groep opgenomen voor alle miRNAs die werden geëvalueerd in PBMCs, terwijl een minimum van 11 werd opgenomen voor die in EVs.

Potentiële mechanismen en molekulaire funkties aangegeven door DE miRNAs. In een poging om de fysiologische betekenis van de geïdentificeerde DE miRNAs bij M.E./CVS te bepalen, voerden we Gen Ontologie (GO) aanrijking analyse uit op basis van de genen die mogelijks aangeduid werden door de DE miRNAs met p-waarden < 0.05, gebruikmakend van de miRDIP en ‘Reactome pathway’ databases (zie methodes).

Interessant: de voornaamste getroffen mechanismen in PBMCs omvatten post-transcriptionele ‘silencing’ [regulering van de gen-expressie om de expressie van een bepaald gen te voorkomen; in dit geval na translatie (vertaling in proteïnen)] door kleine RNAs, circadiaanse klok, chromatine-organisatie en chromatine-modificerende enzymen, naast meerdere mechanismen verbonden met het X-chromosoom gecodeerd MECP2 (methyl-CpG bindend proteïne 2 [essentieel voor de normale werking van zenuwcellen]) gen, beiden bij de miRNAs met over- en onder-expressie bij M.E./CVS. Het feit dat MECP2 onderwerp is van X-chromosoom inaktivatie [proces waarbij één van de kopieën van het X chromosoom geïnaktiveerd wordt bij vrouwen, door het te verpakken zodat het een transcriptioneel inaktieve struktuur krijgt] ondersteunt mogelijke geslacht-bepaalde omgeving-effectoren voor de ziekte.

Daarnaast vonden we ook MECP2-mechanismen bij de ‘top hits’ in DE miRNAs met over-expressie in EVs met p < 0.05. De bevinding dat er neuronale en endocriene mechanismen bij de DE miRNA hits bij M.E./CVS EVs zijn, kan wijzen op defekten in het funktioneren van endocrien weefsel, zoals velen melden. Neurotrofe receptor tyrosine-kinase (NTRK [zenuw-groeifactor receptor]) signalisering lijkt ook een impact te ondervinden van significante DE miRNAs (p < 0.05), zowel in PBMCs als EVs, wat verband kan houden met de symptomen zoals cognitieve stoornissen en zintuigelijke dysfunkties (veranderde pijn-sensitiviteit).

Bepaling van de diagnostische waarde van geëvalueerde variabelen. Aangezien het voornaamste doel van studie was om de mogelijke diagnostische waarde van de gemeten variabelen te bepalen, voerden we ‘response operating characteristic’ (ROC) analyses uit voor elk van de miRNAs met significante DE (p < 0.05), op individueel niveau.

15 van de 27 significante DE miRNAs die in deze studie werden gedetekteerd, vertonen waarden voor de ‘area under the curve’ (AUC) boven 0.75, wat er op wijst dat ze een acceptabel vermogen hebben om bloedstalen van M.E./CVS-patiënten te onderscheiden van HCs met betrekking tot hun miRNAs. De microRNAs met beter onderscheidend vermogen zijn: hsa-miR-374a-5p (AUC: 0.876), hsa-miR-4516 (AUC:0.865), hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 (AUC: 0.847) en hsa-miR-340 (AUC: 0.8106), allemaal uit PBMCs, met uitzondering van hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 die kunnen worden beschouwd als de beste potentiële biomerker-kandidaat uit EVs (AUC boven 0.8).

Validatie van door DE miRNAs voorspelde doelwit-genen. Om de impact te bepalen van DE miRNAs op het PBMC-transcriptoom, ontwierpen we een set ‘primers’ [primer = startplaats voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’)] om de waarden van representatieve genen binnen courant aangetaste mechanismen te kwantificeren via RT-qPCR. Meer bepaald kozen we voor: het AGO2 gen ([coderend voor een proteïne dat is vereist bij RNA-] ‘silencing’ door kleine RNAs, incl. R-HSA-426496 & R-HSA-426486), het MECP2 gen van MECP2-gerelateerde mechanismen [zie hierboven] (incl. R-HSA-9022707, R-HSA-9022699, R-HSA-9022692, R-HSA-8986944, R-HSA-9022534, R-HSA-9005891, R-HSA-9022538, R-HSA-9022927, R-HSA-9022537 & R-HSA-9022702) en het NTRK1 gen [zie hierboven] (R-HSA-187037 & R-HSA-9028731 neurotrofine-signalisering [inductie van overleving, ontwikkeling & funktie van neuronen]). AGO2 en MECP2 vertoonden onder-expressie, terwijl NTRK1 was toegenomen in M.E./CVS PBMCs. Zoals hierboven besproken, suggereert de connectie van deze mechanismen met symptomen hun bijdrage in de pathofysiologie van M.E./CVS.

Bespreking

Researchers en klinici zijn het eens dat er een dringende nood is aan onbevooroordeelde, specifieke diagnostische biomerkers voor M.E./CVS om de diagnose en behandeling te bespoedigen, en voor goed een einde te maken aan ziekte-stigma’s. Er bestaat ook een consensus aangaande voordelen die miRNA-profielen van verschillende bloed-frakties, inclusief EVs, vertonen als molekulaire diagnostische kandidaten, en toch wordt er een schaarste wat betreft studies die focussen op M.E./CVS miRNA profilering gezien.

Een beperking voor biomerker-ontdekking studies bij M.E./CVS is dat het tot op heden bij piloot-studies met een klein aantal deelnemers is gebleven, en ons huidig werk (30 deelnemers), is geen uitzondering. Het belang van ons ontwerp, steunt echter op het feit dat, voor het eerst, miRNomen in PBMCs en EVs werden bestudeerd bij dezelfde individuen, naast 34 analytische variabelen in het bloed en 6 bijkomende EV-kenmerken (opbrengst, grootte en zeta-waarden, met of zonder proteinase-K behandeling), en meerdere gezondheid-vragenlijsten (SF-36 & GHQ28), leidend tot de meest volledige fenotype-registratie van individuen met ernstige M.E./CVS waar we weet van hebben.

Om bijkomende beperkingen die biomerker-ontdekking in M.E./CVS belemmeren te voorkomen, probeerden we patiënten-heterogeniteit en bevooroordeling geassocieerd met pre-analytische variabelen te minimaliseren door enkel stalen op te nemen uit de ‘UK ME biobank’, die procedures gebruikt die voldoen aan die van de NINDS (‘National Institute of Neurological Disorders and Stroke’) voor de studie van M.E./CVS. […]

Creatine-fosfokinase (CK) waarden in het bloed bleken significant gedaald in onze M.E./CVS-groep […], overéénkomstig het rapport door Nacul L et al. [Evidence of clinical pathology abnormalities in people with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) from an analytic cross-sectional study. Diagnostics (2019) 9: E41] […]. Serum-CK kan daarom een biomerker zijn voor ernstige M.E./CVS-gevallen (96% sensitiviteit) ook al hebben ze een lage specificiteit (< 50%). Hoewel een bias omwille van patiënten-inaktiviteit op dit moment niet kan worden uitgesloten, rechtvaardigt het feit dat een multi-variaat model dat controleert voor aktiviteit significant blijft, naast z’n potentieel om PEM bij M.E./CVS te verklaren, verdere exploratie.

Omdat technische eenvoud wenselijk is voor klinische testen, besloten we dat i.p.v. het betrachten van de isolatie van sterk gezuiverde EV-subpopulaties op basis van lange protocollen, het gebruik van geoptimaliseerde commerciële kits die hoge EV-opbrengsten geven via eenvoudige/snelle procedures te verkiezen is.

Er dient te worden opgemerkt de beschikbaarheid van deze zeer waardevolle stalen nogal beperkt is. Dat was een bijkomende reden om te kiezen voor TEIR reagent [zie methodes] als isolatie-methode voor EVs, aangezien het de hoogste (vergeleken met andere commerciële produkten of andere isolatie-methodes) opbrengsten geeft uit slechts 0,5 ml plasma. Daardoor kon het totaal volume staal beperkt worden gehouden. Auteurs zijn het eens dat EVs geïsoleerd met polyethyleen-glycol (PEG [een polymeer; zorgt voor minder enzyme-afbraak en gedaalde immunogeniciteit van proteïnen]) 6000 (zoals bij TEIR) partikels van vergelijkbare grootte geven als andere methodes (ultracentrifugatie, ultrafiltratie en gel-chromatografie), en met verhoogde opbrengsten […].

Het was de intentie van de huidige studie om de weg te effenen voor de exploratie van bloed-EV kenmerken bij M.E./CVS en, zodoende, de mogelijkheid te openen voor het evalueren van miRNA-netwerken aangetast door M.E./CVS-pathofysiologie in het ganse organisme. Een ander hoofd-aspect van het project was om te bepalen of EVs mogelijks een meer sensitieve, of anderzijds betere fraktie dan PBMCs, vormen voor het detekteren van miRNA-veranderingen bij M.E./CVS, voor diagnostische doeleinden. ROC-analyse wijst echter op superieure diagnostische waarde van miRNomen uit PBMCs vergeleken met EVs. De hoge variabiliteit en het laag miRNA ‘copy-number’ in EVs t.o.v. PBMCs (17 vs. 69) kan, ten minste gedeeltelijk, deze bevinding verklaren. Verrassend genoeg bleken opbrengsten, grootte en zeta-waarden van EVs ziekte-onderscheidende parameters.

Overéénkomstig met bevindingen bij andere pathologieën, inclusief kanker [melanoma] en neurodegeneratieve ziekten [Alzheimer’s], vonden we hogere aantallen EVs. Interessant: een piloot-studie die het aantal en de grootte van EVs in serum evalueerde, vond ook verhoogde aantallen bij M.E./CVS-patiënten [Castro-Marrero J et al. Circulating extracellular vesicles as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an exploratory pilot study. J Extracell Vesicles. (2018) 7: 1453730]. Naast de verhoogde EV-opbrengsten zagen we ook dat de gemiddelde grootte van M.E./CVS EVs gedaald is: een gemiddelde diameter onder 100 nm. Dit is ook in overéénstemming met de bevindingen van Castro-Marrero J et al. Hoewel we plasma gebruikten i.p.v. serum, leken de gevonden parameter-verschillen samen te vallen, wat bewijs is voor reproduceerbaarheid in meer dan één type staal en bij verschillende groepen. De vraag of één cel EVs produceert van verschillende groottes of dat het grootte-verschil EV-produktie door verschillende cellen weerspiegelt, blijft tot op heden onbeantwoord.

EV-grootte hangt niet enkel af van het type membraan-fosfolipiden maar ook van de aan- of afwezigheid van bepaalde membraan-proteïnen en het verschil kan funktionele gevolgen hebben. Bv.: er werd voorgesteld dat cytokinen op het EV-oppervlak kunnen dienen als ‘bar-code’ molekulen die worden herkend door overvloedige cel-specifieke cytokine-receptoren. Massa-spectrometrie (MS) dient zeker te worden opgenomen in follow-up studies ter evaluatie van mogelijke kwalitatieve verschillen geassocieerd met M.E./CVS.

Aangezien het proces van invriezen/ontdooien de eigenschappen van de vesikels – inclusief vesikel-flocculatie [vlok-vorming; proces waarbij de vesikels zich aan elkaar hechten] – kan beïnvloeden, werden al onze experimenten uitgevoerd met één enkele ontdooi-stap. We kunnen echter niet uitsluiten dat vesikel-‘collaps’ [proces waarbij een vesikel zijn inhoud afgeeft] bij HCs een verklaring is voor hun toegenomen grootte. In feite vertoonden EVs van patiënten een hogere stabiliteit (binnen een initieel instabiliteit-bereik) overéénkomstig hun hogere aboslute zeta-potentiaal waarden.

De observatie dat M.E./CVS EV zeta-waarden meer negatief zijn dan die van de HCs suggereert dat de buitenste laag fosfolipiden, of de membraan-proteïnen (of beide), een hogere negatieve lading dragen. Siaalzuur [familie van derivaten van neuraminezuur, ook de naam voor het meest voorkomende lid van deze groep, N-acetylneuraminezuur; komen voor aan het eind van suiker-ketens verbonden met de oppervlakken van cellen en oplosbare eiwitten] op membraan-gebonden oligosacchariden leidt tot een verhoogde netto negatieve lading van door tumor-cellen gesekreteerde vesikels. Het zal interessant zijn om te bepalen of er een aanrijking is van siaalzuur in M.E./CVS EVs.

Het feit dat voor-behandeling met proteinase-K de membraan-elektronegativiteit reduceert bij zowel M.E./CVS als HC wijst op een bijdrage van proteïnen in de netto vesikel-lading. Er dient echter te worden opgemerkt dat de globale lading van M.E./CVS EVs hoger blijft na proteinase-K behandeling, in vergelijking met behandelde EVs van HCs; wat lipiden en koolhydraten als belangrijkste kandidaten aanduidt als verklaring voor de geobserveerde lading-verschillen tussen M.E./CVS en HCs. Onbevooroordeelde distributie van lipiden in vesikel-omhulsels en/of verschillen qua suiker-verhoudingen zijn interessante mogelijkheden om na te gaan, aangezien ze indicatief kunnen zijn voor verschillende subpopulaties bij ziekte vs. gezondheid.

Ondanks het feit dat EVs geïsoleerd met TEIR-reagent vesikels met exosomale morfologie […] omvatten, en de aanwezigheid van exosomale merkers CD9 & CD81 werd bevestigd d.m.v. ‘western blotting’, waren onze procedures beperkt wat betreft het schatten van de relatieve hoeveelheden exosomen en andere vesikel-subgroepen in het algemeen, en daarom is enige mogelijke bijdrage van exosomen of ander vesikel-subtype bij M.E./CVS enkel speculatief.

Het uiteindelijk totaal aantal miRNAs met expressie hoger dan de achtergrond leek opvallend laag: slechts 91 in PBMCs en 150 in EVs, van de ca. 800 opgenomen in het ‘nCounter Human miRNA Panel v3’ (NanoString Technologies). Aangezien de stalen veeleisende kwaliteit-controles ondergingen, moet het laag aantal ‘hits’ in PBMCs te wijten zijn aan de beperkte bloedcel-type expressie, zoals beschreven door andere auteurs, samen met de strikte selektieve criteria in deze studie. Van de 27 miRNAs DE bij M.E./CVS (p < 0.05) (17 in PBMCs & 10 in EVs), vonden we, na een database-‘search’ die eerder door onze groep werd beschreven, dat hsa-miR-18a-5p ge-upreguleerd kan zijn door het anti-psychotisch medicijn desipramine [antidepressivum], terwijl hsa-miR-146a-5p & hsa-miR-150-5p expressie geïnduceerd kan worden door morfine, wat de mogelijkheid opwerpt dat de geobserveerde over-expressie van deze miRNAs kan voortkomen uit blootstelling aan medicijnen en niet de ziekte zelf. Dit beklemtoont het enorm belang van een gedetailleerde registratie bij het bestuderen van molekulaire veranderingen bij deze patiënten, zoals aanbevolen door de NINDS [zie hierboven] CDEs [‘Common Data Elements’; gemeenschappelijke gegevenselementen] voor M.E./CVS.

Het feit dat het aantal in EVs gedetekteerde miRNAs met expressie boven de achtergrond groter is dan in PBMCs werd enigszins verwacht aangezien de verschillende bronnen [cel-types] van EVs aanleiding zou geven tot hogere miRNA-complexiteit. Omwille van de selektieve verpakking van miRNAs zouden EV-miRNomen nuttig kunnen zijn voor het traceren van de cellen maar we dienen eerst de ‘regels’ voor dit proces te begrijpen. In tegenstelling daarmee suggereren sommige gegevens niet-selekteive miRNA-verpakking in EVs. Interessant was dat een Duits research-team toonde, gebruikmakend van een elegant genetisch tracering systeem […], dat het niet enkel het cel-type is dat van belang is, maar dat ook de gezondheid-toestand van het individu dat de gerichte verpakking van molekulen en funktie van EVs bepaalt. In hun experimenten bewezen de auteurs dat de transfer van signalisering-RNA tussen immuun-cellen en het brein, de darm en bijkomende weefsels wordt bevorderd door inflammatoire letsels [Ridder K et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of genetic information between the hematopoietic system and the brain in response to inflammation. PLoS Biol. (2014) 12: e1001874].

MiRNA weefsel-specifieke expressie zou hints kunnen bieden betreffende de cellulaire oorsprong van plasma-EVs. In dit opzicht bepaalden andere Duitse onderzoekers de relatieve hoeveelheden van 1.997 miRNAs in 61 weefsel-biopten van verschillende organen die post-mortem bij twee individuen werden genomen. Op basis van een weefsel-specificiteit index (TSI), vonden de auteurs dat de meerderheid van de miRNAs (82,9%) bij de middenste TSI-waarden behoorde, wat betekent dat ze niet specifiek waren voor één enkel weefsel (TSI > 0.85) noch voor ‘housekeeping’ [huishoudelijke (referentie/controle)] miRNAs (TSI < 0.5). De expressie van veel verschillende miRNAs en miRNA-families was echter overheersend in bepaalde weefsels. Bovendien waren miRNAs TSI-waarden van menselijke weefsels goed gecorreleerd met die van ratten, wat ondersteuning is voor bewaarde weefsel-aangerijkte miRNAs binnen soorten. Er waren slechts 5 miRNAs die zeer specifiek bleken voor haematopoïetische cellen: miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 & miR-223. Enkel miRNA-150 was DE (p < 0.05) bij onze EV-profilering, en voor miR-223 was er een DE-tendens (0.05 > p < 0.1). Gebruikmakend van een zoek-instrument […], vonden we dat EV DE miRNAs (p < 0.05) – hsa-miR-150-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR33a-5p, let-7d-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-374a-5p & hsa-miR-130a-3p – voornamelijk tot expressie kwamen in spieren en fascia, hersenen en zenuwen, en hormonale klieren (voornamelijk schildklier) […]. Allen correspondeerden met weefsels die aangetast zijn bij M.E./CVS.

Hoewel hsa-miR-4454 & hsa-miR-7875 niet in de vernoemde database voorkomen, rapporteerde men de detektie van hsa-miR-4454 in serum, als een potentiële marker voor colitis ulcerosa [chronische ontsteking van de dikke darm met zweer-vorming] met een hogere sensitivieit en specificiteit dan C-reaktief proteïne. Dit past bij het feit dat inflammatie dikwijls verband houdt met M.E./CVS [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc Natl Acad Sci USA (2017) 114: E7150-E7158]. Misschien relateren de grote verschillen voor dit miRNA die worden gezien bij EVs van patiënten, met de intestinale dysbiose die bij sommige patiënten aanwezig is. De registratie van een gedetailleerde klinische geschiedenis van de deelnemers zal belangrijk zijn om deze vraag te beantwoorden, zoals aangegeven door de M.E./CVS CDEs.

Er waren slechts 4 miRNAs die werden gevonden in beide frakties (PBMCs & EVs). Daarvan waren er 2 (hsa-miR-21-5p & hsa-miR-374a-5p) die dezelfde trend volgden – over-expressie in beide frakties – terwijl de nauw verwante hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 onder-expressie bleken te vertonen in PBMCs en over-expressie in EVs, wat kan worden verklaard door gerichte verpakking in immuun-cellen. Het lijkt bijzonder interessant dat hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, door sommige auteurs gelinkt met inflammatie, bij de top DE miRNAs met mogelijke diagnostische waarde lijkt te behoren volgens ROC-analyse. Op dit moment kunnen we echter enkele speculeren over de potentiële betekenis van deze bevindingen. Resultaten van GO mechansime analyse en RT-qPCR wijzen op potentiële epigenetische en signaal-transductie mechanismen die verband houden met M.E./CVS, wat goed overéénstemt met de differentiële methylatie-patronen die eerder door onze groep werden gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten [Trivedi MS, Oltra E et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome associated DNA methylation patterns. PLoS One. (2018) 13: e0201066].

Ten slotte: anders dan bij micro-chips, vereist NanoString-technologie geen validatie van de resultaten verkregen via andere methodes. We gingen niettemin verder met het testen of differentiële expressie-profielen die op deze manier werden gedetekteerd, in onze stalen konden worden vastgesteld d.m.v. kosten-efficiënte RT-qPCR. Zowel miRNAs die willekeurig werden gekozen uit de groep met over-expressie (hsa-miR-106b) als die met onder-expressie (hsa-miR-549a) werden als statistisch DE bevestigd in M.E./CVS PBMCs. Dit opent de opwindende mogelijkheid voor een richtgevende lage-kosten screening-methode, met slechts enkele miRNAs te samen met routine analytische parameters van het bloed en enkele EV-kenmerken, ter evaluatie van grotere M.E./CVS-groepen en populatie-validatie van de hier gedetekteerde potentiële biomerkers voor M.E./CVS. Inclusie van ziekte-controles, zoals Multiple Sclerose (MS), Systemische Lupus Erythematosus (SLE) of andere ziekten met overlappende symptomen zullen van belang zijn.

Methodes

Stalen & verwante klinische gegevens. […] ‘UK ME Biobank’.

[…] PBMCs (> 106 cellen) en plasma van 15 ernstig zieke vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 15 vrouwelijk, voor leeftijd gematchte gezonde individuen, […].

[…] Canadese Consensus en/of CDC-1994 (‘Fukuda’) criteria […]. Exclusie-criteria: (i) antivirale medicatie of medicijnen die de immuun-funktie veranderen in de 3 voorafgaande maanden (ii) vaccinaties in de 3 voorafgaande maanden; (iii) geschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekten (hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV; maar niet herpes-virus of andere retrovirus-infektie); (iv) een andere chronische ziekte zoals kanker, coronaire hart-ziekte of ongecontroleerde diabetes; (v) een ernstige stemming-aandoening; (vi) zwangerschap of borstvoeding in de 12 voorafgaande maanden; of (vii) morbide obesitas (BMI ≥ 40). […]

[…]

RNA-isolatie & RNA kwaliteit-controle. […]

EV-purificatie. […] plasma […] ‘Total Exosome Isolation Reagent’ (TEIR) […] met of zonder proteinase-K voor-behandeling.

EV-karakterisatie. Opbrengst en grootte-distributie: ‘Nanoparticle Tracking Analysis’ (NTA), licht-verstrooing […]. Zeta-potentiaal: ‘Dynamic Light Scattering’ (DLS) […]. Transmissie elektronen-microscopie (TEM) […].

‘Western-blotting’ […] anti-CD9 antilichaam, anti-CD81 antilichaam, anti-HSP70 antilichaam & anti-β-actine antilichaam […].

NanoString miRNA-profilering & analyse. […] evaluatie van 800 miRNAs […].

[…]

Stalen met tellingen boven vastgestelde drempel-waarden in minder dan 40% van de miRNAs werden geëlimineerd. Enkel miRNAs met waarden boven de drempel in minstens 75% van de stalen, in beide groepen (M.E./CVS & HCs), werden gebruikt voor de differentiële expressie analyse (PBMCs of EVs). […].

[…]

RT-qPCR validatie. […].

Gen-aanrijking & mechanisme-analyse. Bij gen-aanrijking analyse warden potentiële doelwit-genen van de DE miRNAs met statistische significantie (p < 0.05) geïdentificeerd d.m.v. de miRDIP database [‘microRNA Data Integration Portal’] en de ‘Human miRNA-gene interaction (adjacency) matrix setting’. […] De ‘pathway’-analyse van de doelwit-genen werd bepaald d.m.v. de ‘Reactome’ database [‘Reactome pathway Knowledgebase’, een ‘peer-reviewed’ mechanisme-database]. Enkel doelwit-paden met p-waarden < 0.05 werden als potentiële effectoren van de statistisch significante DE miRNAs beschouwd.

ROC-curves, statistische analyse & plotting. ‘Response Operating Characteristic’ voor elk van de miRNAs met significante DE tussen M.E./CVS & HC (p < 0.05) […].

[…]

februari 1, 2020

Circulerend GDF15 bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , ,

Journal of Translational Medicine (Pre-print november 2019)

Circulating levels of GDF15 in patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Audrey Melvin (1), Eliana Lacerda (2), Hazel Dockrell (2,3), Stephen O’Rahilly (1), Luis Nacul (1)

1 MRC Metabolic Diseases Unit, Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge, Addenbrookes Treatment Centre, Cambridge, UK

2 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

3 Department of Immunology and Infection, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

4 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door vermoeidheid en post-exertionele malaise. De pathogenese wordt niet goed begrepen. GDF15 is een circulerend proteïne dat door cellen wordt gesekreteerd in respons op verscheidene stressoren. De receptor voor GDF15 komt tot expressie in de hersenen, waar z’n aktivatie resulteert in een waaier aan responsen. De aandoeningen met sterk gestegen GDF15-waarden zijn o.a. mitochondriale aandoeningen, waarbij skelet-spier vermoeidheid een sleutel symptoom is. Onze hypothese was dat GDF15 een merker voor cellulaire stress bij M.E./CVS zou kunnen zijn.

Methodes GDF15 werd gemeten in het serum van patiënten met M.E./CVS (n = 150; 100 met milde/matige en 50 met ernstige symptomen), ‘gezonde vrijwilligers’ (n = 150) en een groep patiënten met Multipele Sclerose (n = 50).

Resultaten Circulerend GDF15 bleef stabiel in een subset M.E./CVS-patiënten waarbij stalen op twee momenten met ca. 7 maanden tussentijd werd afgenomen […]: 720 pg/ml (95% CI = 625-816) vs. 670 pg/ml (95% CI = 598-796), P = 0.5. De GDF15-waarden waren 491 pg/ml bij controles (95% CI = 429-553), 546 pg/ml (95% CI = 478-614) bij MS-patiënten, 560 pg/ml (95% CI = 502-617) bij patiënten met milde/matige M.E./CVS en 602 pg/ml (95% CI = 531-674) bij ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten. Rekening houdend met mogelijke storende factoren, hadden patiënten met ernstige M.E./CVS GDF15-concentraties die significant verhoogd waren vergeleken met gezonde controles (P = 0.01). De GDF15-waarden waren positief gecorreleerd (P = 0.026) met vermoeidheid-scores bij M.E./CVS.

Besluiten Ernstige M.E./CVS is geassocieerd met verhoogde warden van GDF15, een circulerende biomerker voor cellulaire stress die stabiel blijkt te blijven gedurende meerdere maanden over.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met een geschatte populatie-prevalentie tussen 0,2 en 2,6% en de meest courante schattingen liggen tussen 0,2 en 0,7%. M.E./CVS wordt gedefinieerd dor de aanwezigheid van onverklaarde persistente of terugkerende vermoeidheid gedurende een periode van meer dan 6 maanden, die resulteert in een daling van de capaciteit van het individu om voorheen getolereerde niveaus van werk-gerelateerde, sociale, onderwijs- en persoonlijke aktiviteit te behouden. De aktiviteit-beperkende symptomatologie is heterogeen en blijft niet beperkt tot vermoeidheid. De etiologie van M.E./CVS blijft moeilijk en hoewel een reeks mechanismen werd voorgesteld, is de voornaamste focus voor onderzoek gericht op ontregeling van het immuunsysteem hoewel er geen consensus bestaat. Er is steeds meer interesse omtrent de mogelijke bijdrage van abnormaliteiten qua spier bio-energetica aan het fenotype van spier-vermoeidheid [Rutherford G et al. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) /// Nacul L et al. Evidence of clinical pathology abnormalities in people with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) from an analytic cross-sectional study. Diagnostics. (2019) 9: 41]. Oxidatieve stress, mitochondriale dysfunktie, acidose en verstoorde AMP-kinase aktiviteit werden allemaal voorgesteld als mogelijke mechanismen die bijdragen aan spier-vermoeidheid bij M.E./CVS [Tomas C, Newton J. Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a mini-review. Biochem Soc Trans. (2018) 46: 547-53; zie ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]. Abnormale vermoeidheid en post-exertionele malaise zijn invaliderende symptomen van M.E./CVS, die mogelijks kunnen worden verklaard door abnormaliteiten van het energie-metabolisme. De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op klinische parameters en vooralsnog is er geen biochemische merker voor de aandoening: pogingen om ziekte-specifieke biomerkers te identificeren werden belemmerd door het onvolledig begrijpen van de ziekte-pathofysiologie. Groei-differentiatie factor 15 (GDF15) is een circulerend peptide dat een gewicht-verlagend effekt bleek te hebben wanneer het werd toegediend aan knaagdieren en niet-menselijke primaten. Een aantal observaties hebben ons er toe geleid te speculeren over de rol van GDF15 bij M.E./CVS, waarbij we het beschouwen als een mogelijke biomerker voor de ziekte en misschien een bijdragende factor tot de symptomatologie. Ten eerste is er bewijsmateriaal opgedoken dat GDF15 geëvolueerd is als een signaal voor cellulaire stress, met groeiende interesse omtrent z’n rol als een biomerker voor aandoeningen van de mitochondriale funktie. Ten tweede werd ook aangetoond dat GDF15 verhoogt na lichamelijke aktiviteit, wat interessant is wanneer we het beschouwen in de context van de post-exertionele symptomen die worden beschreven bij M.E./CVS. Ten derde: bij knaagdier-modellen wordt gerapporteerd dat stijgingen qua circulerend GDF15 geassocieerd zijn met verminderde fysieke aktiviteit. Tot op heden werd GDF15 nog niet formeel bestudeerd in de context van M.E./CVS. Om dit aan te pakken, hebben we circulerende waarden van GDF15 gemeten in een klinisch en biochemische gefenotypeerde M.E./CVS-groep, en die vergeleken met afzonderlijke groepen gezonde individuen en patiënten met Multipele Sclerose (MS); allemaal deelnemers van de ‘UK ME/CFS Biobank’ (UKMEB).

Methodes

Recrutering van de deelnemers

Mogelijke deelnemers van de ‘UK ME/CFS Biobank’ (UKMEB) werden uitgenodigd […] en de mensen met ernstige symptomen kwamen voornamelijk via steun-groepen. […]. Inclusie-criteria: (i) tussen de 18 en 60 jaar oud & (ii) een klinische diagnose van of M.E./CVS, volgens CDC-1994 of Canadese consensus criteria, bevestigd door een klinisch onderzoeker (beoordeling en laboratorium-testen) […]. Exclusie: (i) gebruik van medicijnen die de immuune-funktie wijzgigen (bv. azathioprine, cyclosporine, methotrexaat, steroïden), en/of anti-virale medicatie en vaccinaties in de voorafgaand 3 maanden; (ii) voorgeschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekten zoals hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV (maar niet herpes-virussen); en/of (iii) andere ziekte en stemming-aandoeningen. […]

Klinische beoordeling assessments

Vragenlijsten

[…] (i) persoonlijke en familiale geschiedenis, (ii) socio-demografische gegevens, (iii) mogelijke risico-factoren (o.a. roken en aktiviteit-niveau) en (iv) symptomen de voorbije week. Dit laatste omvatte gestandardiseerde beoordeling instrumenten zoals de ‘Medical Outcomes Survey Short Form’ – SF-36v2™ (funktionele capaciteit), de analoge pijn-schaal (pijn-ernst) en de vermoeidheid-ernst schaal […]. […]

Antropometrie

[…] (i) bloeddruk (liggend en staand), (ii) handgreep-sterket test […], (iii) lende- en heup-omtrek, (iv) lengte, (v) gewicht, BMI en bio-impedantie [meting van lichaamsvet & spier-massa], (vi) spirometrie [meting van long-funktie/capaciteit], (vii) puls-oxymetrie [meting van de zuurstofsaturatie].

Afname en analyse van de bloedstalen

[…] GDF15: elektro-chemiluminescentie immuno-assay […], detektie-bereik 3,0 tot 32.000 pg/ml […].

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Waarden van circulerend GDF15 blijven stabiel met verloop van tijd

Bij het beschouwen van GDF15 als een potentiële ziekte-biomerker wilden we z’n stabiliteit met verloop van tijd onderzoeken. We analyseerden circulerend GDF15 bij ‘baseline’ beoordeling en follow-up bij een groepje 100 willekeurig geselekteerde individuen, inclusief 40 gezonde vrijwilligers, 40 deelnemers met M.E./CVS en 20 MS-patiënten. De mediane tijd tussen de metingen was 7,4 maand […]. Bij de gezonde deelnemers bleven de GDF15-waarden opmerkelijk stabiel met een gemiddelde waarde bij ‘baseline’ van 491 pg/ml (95% CI 429-553) en bij follow-up of 495 pg/ml (95% CI 434-556), p = 0.7. Er werd een gelijkaardig patroon geobserveerd bij M.E./CVS, met GDF15-waarden van 720 pg/ml (95% CI 625-816) & 670 pg/ml (95% CI 598-796) (p = 0.5). Bij de deelnemers met MS (een progressieve neurologische ziekte) zagen we een toename (baseline naar follow-up) met een gemiddeld circulerend GDF15 van 677 pg/ml (95% CI 580-776) & 729 pg/ml (95% CI 619-839) (p = 0.01).

GDF15 is verhoogd bij patiënten met ernstige M.E./CVS

Wat betreft de ‘baseline’ karakteristieken van de studie-populatie: deze omvatte M.E./CVS-patiënten (n = 150) met milde/matige ziekte (n = 100) en ernstig aangetasten (aan huis gebonden of bedlegerig, n = 50), mensen met MS (n = 50) en ‘gezonde controles’ (n = 100). De MS-groep werd in de studie opgenomen als een vergelijking-groep met patiënten die ook een chronische ziekte geassocieerd met vermoeidheid hadden. De groep met MS was gemiddeld ouder (49 jaar), vergeleken met zowel M.E./CVS & ‘gezonde controles (gemiddeld ca. 42 jaar). Een groter deel van de individuen met MS rookten (26%), vergeleken met 7,5% bij M.E./CVS en 4% bij de gezonde controles. Wanneer de mensen met ersntige en niet-ernstige M.E./CVS vergeleken, vonden we een lagere BMI en hogere eGFR (‘estimated Glomerular Filtration Rate’ [glomerulaire filtratiesnelheid = totaal volume urine gefilterd door beide nieren; geeft een idee van de nier-funktie]) bij die met ernstige ziekte. De andere geanalyseerde parameters waren gelijkaardig tussen de groepen. De gemiddelde ‘baseline’ GDF15-waarden waren 491 pg/ ml (95% CI 429-553) voor gezonde controles, 546 pg/ml (95% CI 478-614) voor mensen met MS, 560 pg/ml (95% CI 502-617) voor de M.E./CVS-patiënten met milde/matige ziekte en 602 pg/ml (95% CI 531-674) voor de ernstig zieke M.E./CVS-patiënten. Er was geen significant verschil tussen de groepen bij univariate analyse [één variabele]. Het is goed geweten dat GDF15 verhoogd is bij een aantal fysiologische en pathologische toestanden. We voerden zodoende een multi-variate analyse uit om te bepalen of er mogelijke verschillen waren qua GDF15-waarden tussen de groepen, na controle voor onafhankelijke variabelen, zoals geslacht, leeftijd, body-mass-index, aktiviteit-niveau, rook-status, ‘estimated Glomerular Filtration Rate’ (eGFR) & C-reaktief proteïne (CRP) – een frequent gebruikte merker voor inflammatie. We vonden een significant direct verband met de leeftijd, BMI & CRP, en een omgekeerde relatie met eGFR. De resultaten van de multi-variate analyse tonen dat gevallen van ernstige M.E./CVS (maar niet van milde/matige) waarden voor GDF15 hebben die significant hoger zijn dan de gezonde groep (P = 0.01). Er waren geen significante verschillen qua GDF15 tussen M.E./CVS-patiënten met milde/matige ziekte, MS-individuen en gezonde vrijwilligers.

Circulerend GDF15 is geassocieerd met zelf‑gerapporteerde vermoeidheid

Om het verband tussen GDF15 en symptoom-ernst verder af te lijnen, onderzochten we de correlatie tussen de waarden van circulerend GDF15 en een reeks zelf-gerapporteerde uitkomsten bij onze patiënten en controles. Deze omvatten de vermoeidheid-ernst schaal (FSS), analoge pijn-schaal, en de genormaliseerde lichamelijke en mentale opgetelde scores van het SF-36v2™ instrument. De FSS-scores variëren van 9 (geen vermoeidheid) tot 63 (zeer ernstige vermoeidheid). De analoge pijn-schaal beslaat scores tussen 0 en 100, waarbij ‘0’ staat voor afwezigheid van symptomen en ‘100’ voor extreme pijn. Wat betreft de opgetelde scores van de SF-36v2™: hoe lager de genormaliseerde scores, hoe slechter de levenskwaliteit (lichamelijke en mentale domeinen). [] Er was een directe correlatie tussen zowel vermoeidheid & pijn-intensiteit, en GDF15-concentraties in alle gevallen van M.E./CVS, MS en controles. Er was een omgekeerde relatie tussen lichamelijk welzijn en GDF15: een lagere score op de SF-36v2™ wijst op verminderde lichamelijke gezondheid. In deze [totale] groep zagen we geen significant verband tussen GDF15 en de opgetelde score van de SF-36v2™ mentale gezondheid. [] Wat betreft de impact van veranderingen qua GDF15-waarden op de ernst-scores van de symptomen: bij de M.E./CVS-deelnemers zagen we een [significant] directe correlatie tussen vermoeidheid en GDF15-waarden.

Bespreking

GDF15 werd initieel geïsoleerd als een transcript geproduceerd door geaktiveerde macrofagen, coderend voor een proteïne dat enige homologie vertoont met de transformerende groei-factor beta (TGFβ) superfamilie. Verhoogde waarden circulerend GDF15 werden gezien na fysieke aktiviteit en tijdens de zwangerschap (stijgingen tot zelfs 40 maal bij dit laatste). Toenames qua GDF15 blijven niet beperkt tot deze fysiologische toestanden en gedurende de 20 jaar sinds z’n ontdekking, werden stijgingen van het peptide gerapporteerd bij een waaier aan pathologische aandoeningen (inclusief veroudering, hart-falen, chronische nier-ziekte, mitochondriale ziekte en kwaadaardigheid). Het was echter de identificatie van GFRAL, een transmembraan-receptor in de achterste hersenen, als vermoedelijk doelwit voor GDF15 en mediator van z’n gewicht-verlagende effekten bij knaagdieren, dat GDF15 kaderde als een mogelijke anti-obesitas behandeling.

Naar gelang het bestuderen van de gewicht-verlagende effekten van GDF15 verder ging, was het intrigerend om te zien dat GDF15 niet wordt gereguleerd door nutritionele stimuli waarvan is geweten dat ze andere hormonen (geïmpliceerd bij de energie-homeostase) beïnvloeden. Dit suggereert dat GDF15 niet voor dit biologisch doel is geëvolueerd. Het spectrum aandoeningen waarvan werd gerapporteerd dat ze geassocieerd zijn met stijgingen van GDF15 delen een rode draad van cellulaire stress, wat de mogelijkheid opwerpt dat GDF15 geëvolueerd kan zijn als deel van een stress-respons signaal dat de energie-balans zou kunnen beïnvloeden. Inzichten omtrent de rol van GDF15 als signaal van cellulaire stress werden ondersteund door de studie van aandoeningen van de mitochondriale funktie. Een studie door Zuid-Koreaanse onderzoekers illustreerde dat bij muizen met een spier-specifieke ‘knock-out’ [met uitgeschakeld gen] voor crif1 [GADD45GIP1, ‘Growth arrest and DNA-damage-inducible proteins-interacting protein 1’], een proteïne dat een geheel vormt met de mito-ribosomale subunit 39S [mitochondriaal ribosoom: proteïnen-complex aktief in mitochondrieën betrokken bij de vertaling van mitochondriale mRNAs gecodeerd door het mtDNA], [] verhoogde GDF15-expressie medieert []. Zo ook reageert, in vitro, GDF15-expressie op aktivatie van de geïntegreerde stress-respons (IRS), een adaptieve respons op een stressvolle stimulus in eukaryote cellen [eukaryoten = cellen met een echte kern die het DNA bevat en door een membraan omlijnd is]. Duidelijk verhoogde waarden van circulerend GDF15 werden gerapporteerd bij een reeks erfelijke mitochondriale ziekten. De klaarblijkelijke symptoom-overlap tussen patiënten met M.E./CVS en met mitochondriale aandoeningen heeft discussie gegenereerd omtrent de mogelijkheid van een gedeelde pathofysiologie tussen deze aandoeningen [Fulle S et al. Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis. J Muscle Res Cell Motil. (2007) 28: 355-62]. Gezien GDF15’s potentieel als een nieuwe merker voor mitochondriale dysfunktie, hypothiseerden we dat het een biomerker voor mitochondriale stress bij M.E./CVS kan vertegenwoordigen.

Onze analyse omvatte zowel gezonde controle-individuen als een groep patiënten met de diagnose van Multipele Sclerose. De observatie dat GDF15-metingen niet significant veranderen na follow-up van patiënten met M.E./CVS verzekert ons van z’n waarde als een potentiële biomerker. Het is interessant dat we in de subgroep van deelnemers met MS zagen dat GDF15 significant steeg t.o.v. ‘baseline’. De GDF15-waarden zijn significant verhoogd in een groep patiënten met ernstige M.E./CVS bij vergelijking met een groep gezonde controles. De observatie dat GDF15-waarden verband houden met ernstige, eerder dan milde/matige, ziekte wijst op een verband tussen de ernst van M.E./CVS en GDF15. Deze bevindingen zijn een afspiegeling van de studie bij primaire mitochondriale aandoeningen: Japanse researchers toonden een positieve correlatie tussen GDF15 en de ‘Japanese Mitochondrial Disease Rating Scale’ en de ‘Newcastle Mitochondrial Scale for Adults’ [Yatsuga S et al. Growth differentiation factor 15 as a useful biomarker for mitochondrial disorders. Ann Neurol. (2015) 78: 814-23], wat semi-kwantitatieve klinische beoordeling-schalen zijn. In het geval van onze M.E./CVS studie-groep vertoonde de vermoeidheid-ernst schaal correlatie met GDF15-waarden. Deze bevindingen bieden verdere ondersteuning voor een rol van GDF15 als merker voor de ernst van de symptomen bij M.E./CVS.

Het is echter belangrijk om op te merken dat, in tegenstelling tot de geobserveerde waarden bij primaire stoornissen van de mitochondriale funktie, de gemiddelde GDF15-waarden die werden gemeten in onze M.E./CVS-groep vele keren lager liggen. Dit is niet verrassend gezien de wijdverspreide mitochondriale dysfunktie die wordt gezien bij aandoeningen zoals Leigh’s syndroom [neurologische afwijking omschreven als sub-acute necrotiserende encefalopathie; de hersencellen worden aangetast omdat ze niet genoeg energie krijgen] maar het suggereert dat significante verstoring van de mitochondriale funktie wellicht niet zo’n prominent kenmerk van M.E./CVS is. Aanrijking voor pathogene mutaties in het mitochondriaal DNA werd dan ook niet gezien bij patiënten met M.E./CVS [Schoeman EM, Newton JL et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Med Genet. (2017) 18: 29]. Er zijn echter een aantal tegenstrijdige meldingen betreffende het verband tussen mitochondriale dysfunktie en ziekte-ernst bij M.E./CVS [zie Tomas C, Newton J hierboven]. We verwachten dat het opduiken van GDF15 als een biomerker voor mitochondriale dysfunktie, de inspanning om dit verband te bestuderen zal ondersteunen.

Bij M.E./CVS is het niet duidelijk welk weefsel of weefsels bijdragen aan de gestegen GDF15-waarden die werden vastgesteld bij ernstige ziekte. We weten dat bij mensen GDF15 tot expressie komt verscheidene weefsels, waarbij die het hoogst is in de lever, nieren, prostaat, colon, vet-weefsel en placenta. Interessant: GDF15 of MIC-1 [‘macrophage inhibitory factor 1’] werd initieel gekloond uit een macrofagen cel-lijn. Sweetman E et al. [Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2019) 33] rapporteerden echter geen significante verandering qua GDF15-transcriptie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We hebben bij primaire mitochondriale stoornissen geassocieerd met duidelijke myopathie gezien dat GDF15-expressie massief ge-upreguleerd is in skelet-spieren en dit is geassocieerd met een toename qua circulerende waarden. Er bestaan echter geen rapporten over GDF15-expressie in spieren of andere weefsels van mensen met M.E./CVS. Er is verder onderzoek vereist om de bron te bepalen van het gestegen circulerend GDF15 dat wordt gezien in een subgroep of M.E./CVS-patiënten.

Tot hier toe hebben we GDF15 beschouwd als een potentiële biomerker bij M.E./CVS, eerder dan een bijdragende factor tot de symptomatologie die bij deze groep wordt gezien. Vermoeidheid wordt frequent gerapporteerd bij de aandoeningen geassocieerd met verhoogd GDF15, hoewel het verband tussen vermoeidheid en deze ziekte-toestanden en GDF15 niet formeel werd bestudeerd bij mensen. Er werd gedaalde locomotor-aktiviteit gerapporteerd bij transgene muizen met een over-expressie van GDF15 en ‘wild-type’ dieren blootgesteld aan farmacologische dosissen van het peptide. De reden voor de gedaald aktiviteit werd niet opgehelderd. Er wordt echter gespeculeerd dat dit een weerspiegeling kan zijn van verminderd voedsel-zoekend gedrag. Bij mensen zal het begrijpen of GDF15 bijdraagt tot de vermoeidheid-symptomen of eenvoudigweg een circulerende merker is voor het onderliggend ziekte-proces, verdere studies vereisen. Na verloop van tijd kan de toediening van GDF15 aan mensen en/of farmacologische manipulatie van de GDF15/GFRAL-as bij specifieke ziekten die toename van GDF15 kunnen geven, echter waardevol inzicht bieden omtrent de bijdrage van GDF15 aan vermoeidheid-symptomen. Bij M.E./CVS is de biologische relevantie van de circulerende waarden van GDF15 die we hebben gezien nog onduidelijk.

Besluiten

We hebben aangetoond dat in rust het circulerend GDF15 verhoogd is bij patiënten met ernstige M.E./CVS en dat de waarden van GDF15 stabiel blijven voor een periode van maanden. Verdere studies zijn vereist om de weefsel(s) vast te stellen die bijdragen tot de stijgingen van GDF15, en het mechanisme waarmee het verhoogd is bij M.E./CVS. Het zal ook belangrijk zijn na te gaan of een stijging qua GDF15-waarden kan bijdragen tot de symptomatologie van M.E./CVS, zelfs al is het maar bij een subgroep patiënten.

december 20, 2019

Identificatie van actine-netwerk proteïnen in circulerende extracellulaire vesikels als biomerkers voor M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 2:59 pm
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel (door het team rond Nakatomi en Watanabe, de auteurs van de neuro-inflammatie-studie) is een bevestiging van en aanvulling op eerdere bevindingen van een andere (Spaanse) onderzoeksgroep (zie ‘Extracellulaire vesikels: potentiële biomerkers voor M.E.(cvs)?’) over het feit dat de EV-fraktie bij mensen met M.E.(cvs) significant hoger was dan bij gezonden en dat hun EVs significant kleiner waren…

Verder werd hier geconstateerd dat de proteïnen in de extracullaire vesikels verschillen tussen M.E. (cvs), gezonde controles, mensen met idiopathische (zonder gekende oorzaak) chronische vermoeidheid of depressieve individuen. Dit alles zou dan kunnen worden aangewend als merkers voor de ziekte.

————————-

Brain, Behavior and Immunity (Pre-print november 2019)

Identification of actin network proteins, talin-1 and filamin-A, in circulating extracellular vesicles as blood biomarkers for human Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eguchi A1, Fukuda S2, Kuratsune H3, Nojima J4, Nakatomi Y5, Watanabe Y6, Feldstein AE7

1 Department of Gastroenterology and Hepatology, School of Medicine, Mie University, Japan; Department of Pediatrics, University of California San Diego (UCSD), La Jolla, CA, USA

2 Department of Health Welfare Sciences, Kansai University of Welfare Sciences, Kashiwara, Japan; Department of Endocrinology, Metabolism and Molecular Medicine, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan; RIKEN, Centre for Biosystems Dynamics Research, Kobe, Japan

3 Department of Health Welfare Sciences, Kansai University of Welfare Sciences, Kashiwara, Japan; Department of Endocrinology, Metabolism and Molecular Medicine, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan

4 Department of Laboratory Science, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Yamaguchi, Japan

5 Nakatomi Fatigue Care Clinic, Osaka, Japan

6 Department of Endocrinology, Metabolism and Molecular Medicine, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan; RIKEN, Center for Biosystems Dynamics Research, Kobe, Japan; RIKEN Compass to Healthy Life Research Complex Program, Kobe, Japan

7 Department of Pediatrics, University of California San Diego (UCSD), La Jolla, CA, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ernstige, invaliderende aandoening met een breed spectrum aan symptomen, inclusief pijn, depressie en neurocognitieve verslechtering. Meer dan 17 miljoen mensen ter wereld hebben M.E./CVS, voornamelijk vrouwen, waarvan bij de meesten de ziekte aanvangt tussen 30-50 jaar. Gezien het brede spectrum aan symptomen onduidelijke etiologie, ontbreken specifieke biomerkers voor diagnose en stratificatie. Hier tonen we dat actine-netwerk proteïnen in circulerende extracellulaire vesikels (EVs) specifieke niet-invasieve biomerkers voor M.E./CVS kunnen zijn. We vonden dat circulerende EVs significant waren verhoogd bij M.E./CVS-patiënten en correleerden met C-reaktief proteïne, alsook met het biologisch anti-oxidant potentieel. De ‘area under the receiver operating characteristic’ [AUC; zie verder] grafiek voor circulerende EVs was 0.80, wat een correcte diagnose toeliet in 90-94% van de M.E./CVS-gevallen. Uit twee onafhankelijke proteoom-analyses gebruikmakend van circulerende EVs van M.E./CVS, gezonde controles, idiopathische chronische vermoeidheid en depressie, bleek dat proteïnen van M.E./CVS-patiënten betrokken zijn bij focale adhesie, actine-skeletale regulering [actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], PI3K-Akt signalisering en Epstein-Barr virus infektie. In het bijzonder taline-1, filamine-A & 14-3-3 familie proteïnen waren de meest overvloedige proteïnen en deze kunnen zeer specifieke M.E./CVS-biomerkers vertegenwoordigen. Onze resultaten identificeerden het aantal circulerende EVs en EV-specifieke proteïnen als nieuwe biomerkers voor de diagnose van M.E./CVS; deze bieden belangrijke informatie van de pathogene mechanismen van M.E./CVS.

1. Inleiding

[…] Potentiële M.E./CVS-biomerkers die warden voorgesteld, omvatten wijzigingen qua werking van het autonoom zenuwstelsel [Van Cauwenbergh D, Nijs J et al. Malfunctioning of the autonomic nervous system in patients with Chronic Fatigue Syndrome: a systematic literature review. Eur. J. Clin. Invest. (2014) 44: 516-526], circulerende cytokinen […], Epstein-Barr (EB) virus [Loebel M., Scheibenbogen C et al. Serological profiling of the EBV immune response in Chronic Fatigue Syndrome using a peptide microarray. PLoS ONE (2017) 12: e0179124], energie-metabolisme [Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxid. Redox Signal. (2013) 19, 1855-1860 /// Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern. Ther. Health Med. (2012) 18, 36-40], oxidatieve stress […] en de slaap/waak-cyclus […], maar er zijn bijkomende biomerkers nodig om M.E./CVS te onderscheiden van andere ziekten geassocieerd met vermoeidheid, zoals idiopathische chronische vermoeidheid (ICF) en depressie. M.E/CVS-behandelingen zoals cognitieve gedrag therapie en graduele oefen therapie zijn niet effektief. De ontdekking van objectieve M.E./CVS-biomerkers, alsook M.E./CVS pathogene mechanismen inclusief M.E./CVS-etiologie, zouden een lang verwachte, cruciale doorbraak op gebied van M.E./CVS betekenen.

Extracellulaire vesikels (EVs) worden afgegeven door beschadigde of gestresseerde cellen; ze bevatten cellulaire inhoud, zoals proteïnen, en circuleren in de bloedstroom. EVs worden zodoende erkend als niet-invasieve biomerkers voor verscheidene ziekten. Bovendien dragen EVs bij tot ziekte-pathogenese via hun funktie bij cel-naar-cel communicatie en het afgeven van EV-inhoud van de cel of oorsprong aan doelwit-cellen, resulterend in het moduleren van cel-signalisering in doelwit-cellen. Het aantal circulerende EVs en hun samenstelling kunnen worden aangewend voor de diagnose van menselijke ziekten, inclusief chronische lever-ziekten, alsook voor metabole toestand.

2. Materialen en methodes

2.1. Individuen en studie-ontwerp

[…] Alle individuen – M.E./CVS-patiënten (n = 99), ICF-patiënten (n = 6), depressie-patiënten (n = 8) en gezonde individuen (n = 56) – gaven hun schriftelijke toestemming […]. De gezonde individuen hadden geen abnormale labo-resultaten (hemoglobine, CRP, albumine, triglyceriden, glucose, AST, ALT of cholesterol, enz.), geen BMI ≥ 30 of < 17, geen subjectieve slaap-problemen […]. […] M.E./CVS en ICF diagnose was gebaseerd op de 1994 CDC criteria (Fukuda) en Canadese Definitie […] Exclusie-criteria: 1) neuro-inflammatoire of immune aandoeningen op basis van klinische laboratorium-testen en magnetische resonantie beeldvorming; 2) aktieve medische aandoeningen die de aanwezigheid van chronische vermoeidheid kunnen verklaren; 3) aanwezigheid zoals sommige types kwaadaardige cellen of chronische gevallen van hepatitis-B or -C; 4) alkohol- drug-misbruik; 5) ernstige obesitas (body-mass-index ≥ 30 kg/m2; 6) zwangerschap; 7) borstvoeding. De aanwezigheid van majeure depressie, fibromyalgie of somatoforme aandoening was géén criterium voor exclusie. […]

2.2. Flow-cytometrie analyse van circulerende EVs

EVs werden geteld gebruikmakend van calceïne [fluorescerende kleurstof] via flow-cytometrie. […]

2.3. Bepaling van de grootte van EVs

[…] ‘dynamic light-scattering analysis’ [techniek om de grootte van kleine partikels in oplossing te bepalen op basis van het licht dat ze verstrooien] […]; transmissie elektronen-microscopie [elektronen worden door een dun preparaat heen geschoten en vervolgens op een fluorescerende plaat geprojecteerd om ze zichtbaar te maken] […].

2.4. Oxidatieve stress

[…] Oxidatieve aktiviteit werd bepaald via het meten van d-ROMs [‘diacron-reactive oxygen metabolites’; zie ‘Mogelijke biomerker voor vermoeidheid: oxidatieve stress & anti-oxidatieve aktiviteit] en anti-oxidatieve aktiviteit via het meten van het Biologisch Anti-oxidant Potentieel (BAP) […].

2.5. Analyse van de proteïnen-samenstelling in circulerende EVs via nanoLC-MS/MS

Circulerende EVs werden geïsoleerd uit plasma […]. […] Groep 1 (CVS & HC; n = 3 elk) […]. Groep 2 (CVS, ICF & depression; leeftijd 20-40 jaar; n = 4 elk) […]. Scheiding d.m.v. nanoLC-MS/MS [‘nano liquid chromatography tandem-mass spectrometry’; koppeling van 2 analytische technieken; combineert de fysische scheiding van vloeistof-chromatografie en de analyse op basis van massa]. […]

2.6. Statistiek

[…]

3. Resultaten

Bewijsmateriaal van ons eigen en andere laboratoria heeft ons er toe geleid te onderzoeken of het aantal circulerende EVs gestegen is bij M.E./CVS. Een eerste groep (M.E./CVS 1) omvatte 33 gezonde controles (HC) en 39 M.E./CVS-patiënten (diagnose op basis van de klinische criteria van het ‘Centre for Disease Control’), gematcht voor leeftijd, geslacht, gewicht en BMI. Circulerende EVs werden gekleurd met calceïne om de intacte circulerende EVs te tellen, met uitsluiting van contaminerende proteïnen in het plasma en kwantificatie van de calceïne-positieve circulerende EVs op basis van de intensiteit van ongekleurde circulerende EVs via flow-cytometrie. Wat betreft de geselekteerde populatie: het aantal circulerende EVs was significant verhoogd bij de M.E./CVS-patiënten (P < 0.001). Om deze resultaten te bevestigen, recruteerden we 30 andere M.E./CVS-patiënten (M.E./CVS 2), waarbij rokers en obese individuen werden uitgesloten. Het aantal circulerende EVs was ook daar significant verhoogd bij de M.E./CVS-patiënten (P < 0.001) en het gemiddelde aantal circulerende EVs was gelijkaardig bij M.E./CVS 1 & M.E./CVS 2. Het gestegen aantal circulerende EVs bij M.E./CVS werd verder gevalideerd bij bijkomende HCs (n = 20) en M.E./CVS-patiënten (n = 30) (P < 0.001). De circulerende EVs bestonden uit kleine EVs (diameter < 100 nm) en grote EVs (diameter 100-1000 nm) bij zowel M.E./CVS-patiënten als HCs – bepaald via ‘dynamic light-scattering analysis’ [zie hierboven] – en bij M.E./CVS-patiënten via transmissie elektronen-microscopie (TEM). Het aantal circulerende EVs correlereerde significant met serum c-reaktief proteïne (CRP) (P = 0.0007), en deze correlatie bleef zelfs bestaan bij gevallen met normale CRP-waarden (0 to 0,1) (P = 0.032) en BAP als anti-oxidant potentieel (P = 0.007), twee gekende merkers die toegenomen zijn bij M.E./CVS. Om de specificiteit en sensitiviteit na te gaan, bepaalden we de ROC curve [ROC-analyse is een statistische methode om de voorspellende waarde van een variabele of instrument te toetsen; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid (sensitiviteit) tegen de specificiteit /// ‘area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] gebruikmakend van aantal circulerende EVs, CRP, d-ROMs & BAP [zie hierboven]. De ‘area under curve’ (AUC) voor aantal circulerende EVs in M.E./CVS 1 was 0.802 (P < 0.0001) (EVs vs. CRP: P < 0.001; EVs vs. BAP: P < 0.05), significant hoger dan de AUC voor CRP (0.641), AUC voor d-ROMs (0.540) & AUC voor BAP (0.710; P = 0.002). De M.E./CVS 2 groep kreeg de diagnose M.E./CVS in 90-94% gebruikmakend van ‘cut-off’ waarden van de M.E./CVS 2 groep.

Verhoogde aantallen circulerende EVs met een AUC van 0.802 voor de diagnose van M.E./CVS leidde er ons toe om verder te onderzoeken of het beoordelen van de EV-lading zou leiden tot de ontdekking van specifieke EV-signaturen bij M.E./CVS-patiënten die nieuwe biomerkers voor deze ziekte kunnen vertegenwoordigen. Gezuiverde circulerende EVs van 3 HCs en 3 M.E./CVS-patiënten werden bekeken wat betreft het EV-proteoom d.m.v. nano vloeistof-chromatografie/tandem massa-spectrometrie (nanoLC-MS/MS) analyse. Er waren in het totaal 124 proteïnen aanwezig in EVs van zowel M.E./CVS-patiënten als HCs, maar een significant aantal proteïnen was enkel aanwezig in EVs van M.E./CVS-patiënten, terwijl 22 proteïnen enkel aanwezig waren in EVs van HCs. Verder waren 75 proteïnen significant gewijzigd in EVs van M.E./CVS-patiënten t.o.v. deze van HCs (P < 0.05), inclusief 66 ge-upreguleerde proteïnen (inclusief actine netwerk proteïnen zoals taline-1, filamine-A, actine, myosine-9, vinculine, gelsoline & tubuline) en 9 ge-downreguleerde proteïnen. In het bijzonder: 63 ge-upreguleerde proteïnen vormden een cluster proteïne/proteïne-interakties gerelateerd aan meerdere mechanismen (focale adhesie [(cel–matrix adhesie) grote macromolekulaire strukturen waardoor mechanische krachten en regulerende signalen worden doorgegeven tussen de extracellulaire matrix (ECM; 3-dimensioneel netwerk van extracellulaire macromolekulen – zoals collageen, enzymen & glycoproteïnen – die strukturele en biochemische ondersteuning bieden aan omringende cellen) en een interagerende cel; sub-cellulaire strukturen die de regulerende effekten (‘signalerende gebeurtenissen’) van een cel mediëren in respons op ECM-adhesie], regulering van het actine-cytoskelet, fosfo-inositide-3-kinase (PI3K)-Akt signalisering mechanisme [intracellulair signalisering-mechanisme dat belangrijk is voor het reguleren van de cel-cyclus ] en EB-virus infektie).

We exploreerden verder of de geïdentificeerde proteïnen in EVs M.E./CVS kunnen onderscheiden van ICF en depressie, twee aandoeningen die ook geassocieerd zijn met vermoeidheid. Het aantal circulerende EVs was gelijkaardig voor de drie groepen. Gezuiverde circulerende EVs van 4 ICF-, 4 depressie- en 4 M.E./CVS-patiënten werden nagegaan wat betreft het EV-proteoom d.m.v. nanoLC-MS/MS analyse. Er waren in het totaal 579 proteïnen aanwezig in EVs van M.E./CVS-, ICF- en depressie-patiënten. Een significant aantal proteïnen (176 op 579) waren enkel aanwezig in EVs van M.E./CVS-patiënten, terwijl 20 en 32 proteïnen enkel aanwezig waren in EVs van ICF- en depressie-patiënten, respectievelijk. Daarnaast waren 134 proteïnen significant veranderd in EVs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met die van ICF- en depressie-patiënten (P < 0.05), en waren er 111 ge-upreguleerd en 23 ge-downreguleerde proteïnen. In het bijzonder: actine [familie multi-funktionele proteïnen die microfilamenten vormen] -netwerk proteïnen zoals taline-1, filamine-A, actine, myosine-9, vinculine, gelsoline & tubuline, waren ook significant ge-upreguleerd in EVs van M.E./CVS-patiënten t.o.v. deze van ICF en depressie. Van de 111 ge-upreguleerde proteïnen waren er 105 geassocieerd met kern proteïne/proteïne-interakties, en betrokken bij focale adhesie, regulering van het actine-cytoskelet, PI3K-Akt signalisering mechanisme en EB-virus infektie.

Een specifiek profiel van circulerend EVs, van twee onafhankelijke experimenten (M.E./CVS & HC of M.E./CVS, ICF & depressie) liet ons toe specifieke proteïnen in EVs in het bloed te identificeren voor de diagnose van M.E./CVS. In de lijst van significant gewijzigde proteïnen in EVs van M.E./CVS-patiënten werden 31 proteïnen geïdentificeerd als courante proteïnen in EVs van M.E./CVS-patiënten, inclusief 30 ge-upreguleerde en 1 ge-downreguleerd. Van deze 31 geïdentificeerde proteïnen vormden 29 een cluster in proteïne/proteïne-interakties, betrokken bij de regulering van het actine-cytoskelet, focale adhesie, PI3K-Akt signalisering mechanisme en EB-virus infektie. De 12 meest overvloedige proteïnen in EVs waren nauw verbonden in de twee onafhankelijke experimenten en onderdeel van de familie van actine-netwerk proteïnen (taline-1, filamine-A, actine, actinine, vinculine, gelsoline & integrine) en proteïnen van de 14-3-3 familie [groep regulerende molekulen die het vermogen hebben om te binden op meerdere funktoneel diverse signalisering-proteïnen]. In het bijzonder: de top drie proteïnen in EVs – taline-1, filamine-A & actine – was exact dezelfde in de twee onafhankelijke experimenten. Deze resultaten onthulden dat actine-netwerk proteïnen in EVs nieuwe niet-invasieve biomerkers zijn voor de diagnose van M.E./CVS.

4. Bespreking

Dit is het eerste rapport dat vindt dat actine-netwerk proteïnen, met in begrip van taline-1 en filamine-A, in circulerende EVs kunnen worden aangewend voor specifieke M.E./CVS-diagnose, en het onderscheid te maken met ICF en depressie. We toonden ook dat het aantal circulerende EVs significant was verhoogd bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles, wat eerder gerapporteerde bevindingen [Castro-Marrero J. Circulating extracellular vesicles as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an exploratory pilot study. J. Extracellular Vesicles (2018) 7: 1453730] bevestigt. Potentiële biomerkers waarvoor een AUC van 0.7-0.8 voor de diagnose van M.E./CVS werden gerapporteerd, omvatten perifeer bloed mononucleaire cellen gen-expressie [Frampton D., Kerr J et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS ONE (2011) 6: e16872], plasma neuropeptide-Y voor symptoom-ernst [Fletcher MA, Klimas NG et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav. Brain Functions (2010) 6: 76], ‘natural killer’ cel funktie [Fletcher MA, Klimas NG et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS ONE (2010) 5: e10817], cytokinen bij vrouwen [Fletcher MA, Klimas NG et al. Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J. Transl. Med. (2009) 7: 96], metagenomica of metabolomica [Nagy-Szakal D, Klimas NG et al. Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics. Sci. Rep. (2018) 8, 10056] en bloeddruk/perifere puls karakteristieken [Allen J, Newton JL et al. Chronic Fatigue Syndrome and impaired peripheral pulse characteristics on orthostasis – a new potential diagnostic biomarker. Physiol Meas. (2012) 33: 231-24 /// Frith J, Newton JL et al. Impaired blood pressure variability in Chronic Fatigue Syndrome – a potential biomarker. QJM (2012) 105: 831-838], die ook veranderd waren bij orthostatische stoornis en hartziekten. Globaal suggereert de huidige ‘evidence-base’ aangaande veel M.E./CVS-studies die cytokinen hebben gemeten dat wijzigingen qua circulerende cytokinen de kern-kenmerken van M.E./CVS niet lijken te verklaren. We ontdekten nieuwe mechanismen die het actine-cytoskelet en focale adhesie reguleren, en detekteerden meerdere andere mechanismen (PI3K-Akt signalisering en EB-virus infektie) die werden gerapporteerd in M.E./CVS-studies [Navaneetharaja N et al. A role for the intestinal microbiota and virome in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)? J. Clin. Med. (2016) 5]. De actine-netwerk proteïnen, taline-1, actine, alfa-actinine-1, vinculine, gelsoline & integrine zijn essentieel voor cytoskeletale connecties, en verbindingen met ion-kanalen resulterend in een effekt op intracellulaire signalisering; dit wijst er op dat dit profiel gekoppeld kan worden met een brede waaier aan M.E./CVS-symptomen (o.a. spier-zwakte/pijn, endocriene stoornissen en hersen-inflammatie). Actine-netwerk proteïnen spelen ook belangrijke rollen in skelet-spieren, op deze manier: 1) taline-1 reguleert de stabiliteit van ‘myotendinous junctions’ [verbindingen tussen spieren en pezen] via het vinculine-taline-integrine systeem in skelet-spieren; & 2) menselijk gelsoline in serum komt hoofdzakelijk van skelet-spieren. Onze resultaten suggereren dat schade aan skelet-spieren betrokken kunnen zijn bij M.E./CVS-pathologie, aangezien M.E./CVS-patiënten aan beweeglijkheid verliezen bij het vorderen van de ziekte […]. Actine-netwerk proteïnen inclusief taline, vinculine-filamine, actine & actinine, hebben ook een belangrijke rol in hart-myocyten en -funktie; de resultaten in deze studie kunnen bijkomend ook een weerspiegeling zijn van een potentiële abnormaliteit van de werking van het bij M.E./CVS-patiënten. Bovendien detekteerden we ook proteïnen van de 4-3-3 familie die geassocieerd zijn met virus-infekties inclusief EB-virus. Interessant is dat EB-virus componenten gedetekteerd werden bij een grote groep M.E./CVS-patiënten. EB-virus componenten triggeren systemische auto-immune ziekten en er werden ontoereikende EBV-specifieke B- en T-cel responsen geobserveerd bij M.E./CVS-patiënten [Loebel M et al. Deficient EBV-specific B- and T-cell response in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE. (2014) 9: e85387]. Dit bewijsmateriaal leidde tot onze hypothese dat EVs betrokken kunnen zijn bij M.E./CVS-progressie of -etiologie via EB-virus infektie en daaropvolgend triggeren van auto-immune ziekte in skelet-spieren; maar toekomstige studies dienen deze hypothese verder te onderzoeken.

5. Besluit

We onthulden dat het aantal circulerende EV significant gestegen is bij M.E./CVS-patiënten. Deze EVs bevatten een specifieke proteïnen-lading, in het bijzonder actine netwerk proteïnen en 14-3-3 familie proteïnen, die nieuwe specifieke M.E./CVS-biomerkers vertegenwoordigen en deze aandoening kunnen onderscheiden van ICF en klinische depressie, twee zeer uitdagende differentiële diagnoses. Toekomstige studies met grotere groepen die het matchen van de verscheidene aandoeningen met belangrijke variabelen zoals leeftijd en geslacht, alsook externe validatie studies zijn gerechtvaardigd.

De nieuwe bevindingen van deze studie kunnen wegen openen om de pathogene mechanismen van M.E./CVS te onthullen en helpen bij het ontwikkelen van betere M.E./CVS-biomerkers en doeltreffende behandelingen.

————————-

Maureen Hanson (Professor Molekulaire Biologie & Genetica), de oprichtster en directeur van het ‘Cornell Centre for Enervating NeuroImmune Disease’ (ze heeft een zoon met de ziekte…), dat M.E.(cvs)-research promoot, legt nu ook nadruk op extracellulaire vesikels (EVs): “Ze lijken een mechanisme te zijn voor signalisering tussen cellen want ze bevatten o.a. cytokinen die signalisering-proteïnen zijn…” Ze vonden al “veranderde cytokine-correlaties in plasma en in EVs” (nog geen publicaties).

Hun studies zoeken verder naar hoe EV-inhoud (cytokinen, RNA en andere proteïnen) verandert tijdens inspanning en bij post-exertionele malaise. “We hopen dat we een signaal in de immuun-respons vinden dat aantoont wat de oorzaak is of een gevolg is van iets dat post-exertionele malaise veroorzaakt.” Een ander project heeft tot doel verschillen in gen-expressie en lading van extracellulaire vesikels te identificeren (baseline en na inspanning)…

oktober 19, 2019

HERV-K & HERV-W transcriptie-aktiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Infektie — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , ,

Retrovirussen zijn RNA-virussen die bij alle gewervelde dieren worden gevonden. Een retrovirus reproduceert/copieert zijn RNA naar DNA door ‘reverse (omgekeerde) transcriptie’, wat dan wordt geïntegreerd in het genoom van een gastheer zodat het kan worden overgeschreven in virussen. Veel retrovirale sequenties blijven permanent geïntegreerd in het menselijk genoom als humane endogene retrovirussen of HERVs. Het menselijk genoom (alle genomen) bevatten ook retrovirus-achtige retrotransposons, mobiele elementen die zich vermenigvuldigen door RNA-copieën te maken die via ‘reverse’ transcriptie in DNA geïntegreerd worden op nieuwe plaatsen in het genoom. Het voornaamste verschil tussen een retrovirus en een retrotransposon is dat het laatste geen enveloppe (omhulsel) heeft. De meeste HERVs en retrotransposons zijn defekt (er ontbreken één of meerdere gen-funkties) maar kunnen zich niettemin vermenigvuldigen en ‘bewegen’ m.b.v. andere elementen of infekterende virussen.

Prof. Brigitte Huber van de ‘Tufts University School of Medicine’ – de persoon die aantoonde dat XMRV bij M.E.(cvs) niet bestaat en het als een contaminant bestempelt) – presenteerde op de ‘Invest in ME’ conferentie in London (2010) bewijsmateriaal dat suggereerde dat een geaktiveerd aloud retrovirus dat in het menselijk genoom is ingebed (HERV-K18), aktief zou kunnen zijn bij M.E.(cvs). In een later artikel (2013) waarvan ze mede-auteur is (zie Oakes B et al. in onderstaande tekst) kon niet worden aangetoond dat er een verschil is qua HERV-K18 enveloppe (proteïne-omhulsel) transcripten tussen M.E.(cvs) en controles, en dat die ook niet werden gereaktiveerd door humaan herpes-virus 6 of 7. Het bleef dan lange tijd stil rond deze kwestie…

Een nieuwe studie gepubliceerd met Luis Nacul (‘Associate Professor, Faculty of Infectious and Tropical Diseases’ van de ‘London School of Hygiene & Tropical Medicine’) als co-auteur, steunend op een ‘bredere’ techniek en uitgevoerd op materiaal van de Britse ‘M.E./CVS Biobank’ (UKMEB), toont aan dat er een over-expressie is van een bepaalde famile (HERV-K) maar enkel bij de matig zieke individuen. De studie werd mede gefinancierd door de amerikaanse ‘National Institutes of Health’ (NIH).

————————-

BioRxiv [“bio-archive” – gratis online archief voor ongepubliceerde pre-prints (vóór peer-review en formele publicatie)] (juli 2019)

HERV-K and HERV-W transcriptional activity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Lucas S Rodrigues (1), Luiz H da Silva Nali (1,2), Cibele O D Leal (1), Ester C Sabino (1,3), Eliana M Lacerda (4), Caroline C Kingdon (4), Luis Nacul (4), Camila M Romano (1,5)

1 Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

2 Universidade Santo Amaro, Pos-Graduacao em Ciencias da Saude

3 Departamento de Molestias Infecciosas e Parasitarias, Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

4 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, United Kingdom

5 Hospital das Clinicas HCFMUSP (LIM52), Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende chronische ziekte die de levenskwaliteit dramatisch compromitteert. De M.E./CVS-pathogenese is multifactorieel en er wordt gedacht dat immunologische, metabole en omgeving-factoren een rol spelen. Er is goede documentering van een verhoogde aktiviteit van humane endogene retrovirussen (HERVs) van verschillende families bij auto-immune en neurologische ziekten, wat er voor zorgt dat deze elementen goede kandidaten voor biomerkers of zelfs triggers voor dergelijke ziekten zijn. Hier werden de expressie van endogene retrovirussen K en W (HERV-K & HERV-W) bepaald in het bloed van matig en ernstig zieke M.E./CVS-patiënten. voor HERV-K was er over-expressie enkel bij de matig zieke individuen en HERV-W vertoonde geen verschil. Dit is de eerste melding omtrent differentiële expressie van HERV-K bij matige M.E./CVS.

Inleiding

[…] De pathofysiologie van M.E./CVS wordt nog niet begrepen en er is geen diagnostische biomerker beschikbaar. Er is nog controverse over de etiologie maar er is echter brede acceptatie dat meerdere immunologische veranderingen aanwezig zijn bij M.E./CVS-patiënten. Daarnaast is er steeds meer bewijs voor een associatie van M.E./CVS met virale infekties en veel patiënten melden dat hun symptomen begonnen tijdens of net na een griep-achtige ziekte [Rasa S et al. Chronic viral infections in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). J Transl Med. (2018) 16: 268]. Daarna zou een ongewone auto-immune respons tegen de infektie verantwoordelijk zijn voor de bestendiging van de M.E./CVS-symptomen. Tenslotte wordt de deelname van virussen ondersteund door het bewijs van klinisch nut van valganciclovir [antiviraal medicijn; synthetisch analoog van 2′-deoxy-guanosine, wordt ingebouwd in viraal DNA waardoor dit niet meer kan worden overgeschreven] voor patiënten. Jammer genoeg belemmert de afwezigheid van studies bij grote groepen die de bijdrage van infektueuze agentia aan de M.E./CVS-pathogenese op molekulair niveau onderzoeken ons begrip van deze ziekte.

Humane Endogene Retrovirussen (HERVs) komen voort uit exogene retrovirale infekties, die optraden vroeg in de evolutie van gewervelden. Door aktieve replicatie- en transpositie-gebeurtenissen, worden HERVs uitgebreid verspreid over het gastheer-genoom en vormen ze ca. 8% van het menselijke genoom. Omwille van geaccumuleerde mutaties doorheen de evolutie van primaten en mensen, zijn de meeste HERVs niet-funktioneel, maar er blijven intacte ‘open-reading frames’ [delen van het RNA ‘lees-raam’ die kunnen worden vertaald; ORF = een doorlopende reeks codons beginnend met een start- en eindigend met een stop-codon] van enkele HERVs bestaan en deze kunnen gereaktiveerd worden in respons op systemische en omgeving-factoren (zoals hormonen, stress en infektie door exogene virussen, inclusief bijna alle menselijke herpes-virussen, HIV en andere). Gezien hun potentiële pathogene effekten (inclusief ‘molecular mimicry’ [‘mimic’ = imiteren of nabootsen; een deel van een bepaald proteïne (peptide) gelijkt sterk op een deel van een totaal verschillend proteïne; speelt een rol bij auto-immuniteit] en immune ontregeling), wordt dikwijls gepostuleerd dat HERVs mogelijke oorzaken zijn van auto-immune ziekten. Onder de meer dan 30 families, zijn het de K & W families die het meest recent geïntegreerd werden, die meest aktief zijn en frequent geassocieerd werden met neurologische en auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes mellitus, S.L.E., A.L.S. en Reumatoïde Artritis.

Naar ons weten zijn er slechts twee studies die de participatie van endogene retrovirussen in M.E./CVS hebben onderzocht; dit met tegenstrijdige resultaten. Gezien de uitgebreid beschreven gewijzigde patronen van HERVs bij meerdere ziekten en het gebrek aan kennis omtrent hun expressie bij M.E./CVS, onderzochten we de expressie van de HERVs K & W bij patiënten met een diagnose van M.E./CVS.

Methodes

Deelnemers

We gebruikten PBMC-stalen van 100 patiënten met de diagnose van M.E./CVS opgeslagen in de ‘UK M.E./CVS Biobank’ (UKMEB) aan de ‘London School of Hygiene and Tropical Medicine’. […]. Er werden 75 stalen gevraagd van deelnemers met een diagnose van matige vermoeidheid (M.E./CVSm) en 25 van deelnemers met ernstige vermoeidheid (M.E./CVS). Er werden ook stalen van 70 gezonde controles (ook geleverd door de UKMEB) opgenomen. […].

RNA-extractie & ‘real-time’ PCR

[…]

[…] De HERV-aktiviteit werd kwalitatief (aan-/afwezigheid) en kwantitatief (mate van expressie) geëvalueerd. Als positieve controle gebruikten we een plasmide dat zowel HERV-W enveloppe en HERV-K polymerase fragmenten corresponderend met het gebied tussen de primers. […] De stalen werden enkel positief voor HERVs beschouwd en onderworpen aan de analyses als de expressie van de endogene controle ook werd gedetekteerd.

Resultaten

[…] Zoals verwacht waren er 4 maal meer vrouwen dan mannen [bij de patiënten]. Daarom pastten we de controle-groep aan zodat deze dezelfde gender-prevalentie had.

[Kwalitatief] De expressie van HERV-K & -W werd geëvalueerd bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles; en er werd enig niveau van expressie van HERV-W gedetekteerd bij alle patiënten met ernstige vermoeidheid [100%] en bij 72/75 M.E./CVSm (96%). HERV-K werd ook gedetekteerd bij alle ernstige gevallen [100%] maar bij 65/75 van de matige gevallen (86,6%). De gezonde controle-groep was zeer gelijkend met de matige groep: 68/70 (97%) en 60/70 (85,7%) met expressie van HERV-W & HERV-K respectievelijk. Slechts één patient met matige vermoeidheid en één controle-individu vertoonden helemaal geen HERV-aktiviteit. Er werd geen verband gezien betreffende HERV-detektie en ziekteduur.

Betreffende de mate van expressie (kwantitatieve analyse), onthulden ‘real-time’ resultaten dat HERV-W geen significante verschillen vertoonde wanneer de gezonde controles (HCs) of de twee M.E./CVS-groepen met elkaar werden vergeleken: M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.89), M.E./CVSm vs. HCs (p = 0.77), M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.95), alle M.E./CVS-patiënten vs. HCs (p = 0.78).

Anderzijds was er een significant verschil voor HERV-K expressie tussen de M.E./CVSm-groep en de HCs (p = 0.050). HERV-K aktiviteit was niet verschillend tussen de M.E./CVS-groepen: M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.12), M.E./CVS vs. HCs (p = 0.17). M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.97).

Bespreking

De meest erkende en veel-gebruikte definities (Fukuda & Canadese Consensus criteria) zijn gebaseerd op zelf-gerapporteerde symptomen. Studies aangaande energie-metabolisme, oxidatieve stress en immunologische wijzigingen bij M.E./CVS hebben een onevenwicht in al deze mechanismen aangetoond, maar het gebruik van dergelijke informatie voor diagnostische doeleinden is nog geen realiteit.

Hier werden HERV-K & -W transcripten gedetekteerd in alle onderzochte groepen, en we vonden dat HERV-K over-expressie vertoonde bij matige M.E./CVS. Het is mogelijk dat de immunologische, genetische expressie en metabole veranderingen verschillen naargelang de ernst van de ziekte.

De interaktie tussen endogene retrovirussen en het immuunsysteem is complex. ERVs maken deel uit van het gastheer-genoom en in theorie worden ze verondersteld te worden herkend als zelf-antigenen, en er zou een immuun-tolerantie moeten gevestigd zijn tijdens de vroege stadia van de ontwikkeling van het organisme. HERV-produkten kunnen echter interageren met componenten van het aangeboren immuunsysteem, leidend tot de aktivatie van pro-inflammatoire mechanismen of, in sommige bijzondere gevallen, hun suppressie. Bv. het syncytin-2 proteïne [van belang bij de ontwikkeling van de placenta] is een produkt van het ERV-FRD [endogeen retrovirus groep FRD] Enveloppe gen dat een immunosuppressieve rol speelt bij het voorkomen van de maternale immuun-respons tegen de foetus. In een ander scenario werd aangetoond, gebruikmakend van een psoriasis-model, dat een pro-inflammatoir milieu in staat kan zijn de expressie van repetitieve elementen, inclusief HERVs, te onderdrukken. Het zou redelijk zijn om te suggereren dat de immunologische intensifiëring die wordt gezien bij ernstiger M.E./CVS werkt via het verstillen van de HERV trans-aktivatie [gen-expressie getriggered door biologische of kunstmatige processen, via de expressie van een intermediair trans-aktivator proteïne] die optreedt bij matige gevallen. Dergelijke trans-aktivatie zou veroorzaakt kunnen worden door exogene virale replicatie of een ander nog niet gekende factor. Overéénkomstig hiermee vonden Montoya en z’n collega’s (2017) een cytokine-signatuur voor de ernst bij mensen met M.E./CVS. Ze toonden aan dat van de 17 cytokinen die met ernst gerelateerd zijn, er 13 pro-inflammatoir zijn en die (naast het verslechteren van de symptomen) de terugval van de HERV-K aktiviteit, naar waarden gelijkaardig aan deze die worden gezien bij gezonde individuen, kunnen veroorzaken. Het kan evenzo gebeuren met HERV-W, waarvan – ondanks het feit dat er geen significante waarden werden gevonden – er een lichte daling was bij mensen die ernstige M.E./CVS hadden, vergeleken met degene die matig waren aangetast.

Infektie wordt dikwijls beschouwd als een trigger voor M.E./CVS. Veel patiënten melden dat de vermoeidheid begon tijdens of kort na een een infektueuze ziekte. Een aantal pathogenen, inclusief virussen, werden geassocieerd met deze ziekte [zie Rasa S et al. hierboven]. En, omwille van de levenslange persistentie en breed cel-tropisme, werd de herpes-virus familie (bijzonderlijk HHV-6) door velen beschouwd als een mogelijke trigger voor M.E./CVS, zelfs al bleek een dergelijk verband niet consistent [Oakes B, Komaroff AL et al. Human Endogenous Retrovirus-K18 Superantigen Expression and Human Herpesvirus-6 and Human Herpesvirus-7 Viral Loads in Chronic Fatigue Patients. Clin Infect Dis. (2013) 56: 1394-1400]. Interessant: HHV-6 is net zoals andere herpes-virussen, ook in staat om HERVs te trans-aktiveren, bijzonderlijk HERV-K. Een dergelijke trans-aktivatie kan direct (door LTR-aktivatie door virale produkten [een ‘long terminal repeat’, lange DNA-sequentie dat een gen aan beide zijden flankeert; zorgt er voor dat het gen in het genoom wordt opgenomen; bij retrovirussen zorgt voor de integratie van het pro-virus (virus-DNA dat in het genoom van de gastheer is opgenomen)] of indirect (via transcriptionele binding-factoren en cytokinen geproduceerd bij virale replicatie) gebeuren. Het is mogelijk dat naar mate de ziekte vordert, wat ook de exogene infektie was die als triggerende factor kon optreden, deze gecontroleerd raakt, en bijgevolg, de trans-aktivatie van HERVs vermindert. Jammer genoeg hebben we geen serologische of molekulaire testen voor exogene virussen uitgevoerd.

Er werden eerder twee rapporten over HERV-aktiviteit bij M.E./CVS gepubliceerd maar de resultaten waren tegenstrijdig. In 2013 vonden een team rond Prof. Komaroff [Oakes et al.; zie hierboven] geen verschil qua expressie van HERV-K18 enveloppe bij mensen met M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. In hetzelfde jaar vonden een research-team rond een commercieel privé lab d.m.v. immunohistochemische methodes, immunoreaktiviteit [antilichamen; dus niet de sequenties zelf] tegen HERV-proteïnen (HERV-K, HERV-18, HERV-R & HERV-FRD) in dendritische cellen van de twaalfvingerige darm van individuen met de diagnose van het syndroom, suggestief voor het feit dat veranderingen qua expressie-patroon van endogene retrovirussen kunnen optreden bij M.E./CVS. De verschillen tussen de resultaten van Oakes et al. en de onze kunnen te wijten zijn aan de gebruikte methodes om HERV-K te detekteren. Hoewel het huidig werk gebruikt maakte van generische primers voor HERV-K (die de detektie van honderden elementen van de meeste sub-families toelaat), zocht het team van Oakes enkel naar transcripten van de HERV-K 18 enveloppe, met een methode specifiek voor dit bepaald element, waarbij alle resterende pro-virussen van de K-familie werden genegeerd. Aan de andere kant waren wij niet in staat na te gaan welke K-familie pro-virussen betrokken zijn bij de geobserveerde differentiële expressie.

De molekulaire methode die hier werd gebruikt om HERV-W te detekteren, was ook generisch en werd alom gebruikt in meerdere studies die differentiële expressie van dit element vonden bij pathologische aandoeningen, waaronder in het bloed, de hersenen en het cerebrospinaal vocht van patiënten met Multipele Sclerose (M.S.). Daarom, ondanks de gelijkenissen van een aantal symptomen en de sterke immunologische component van M.E./CVS en M.S., zijn de mechanismen verantwoordelijk voor HERV-reaktivatie bij die ziekten waarschijnlijk verschillend.

Tot besluit: dit is het eerste rapport dat verhoogde expressie van een endogeen retrovirus aantoont in het bloed van individuen met matige M.E./CVS. Hoewel de verhoogde expressie van deze retro-elementen niet direct geassocieerd is met de M.E./CVS-pathogeniteit, kan de observatie van dit fenomeen niet worden genegeerd.

————————-

In een ‘review-artikel’ (‘Epigenetic Components of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Uncover Potential Transposable Element Activation’ in Clinical Therapeutics; 2019) vonden Spaanse en Amerikaanse onderzoekers via een zoektocht in de literatuur met betrekking tot de epigenitica bij M.E.(cvs) bepaalde verbanden tussen ‘transposable elements’ (TEs) en epigenetische kenmerken. Ze bedachten een model met betrekking tot transcriptionele inductie van endogene ‘slapende’ transposons en gestruktureerde cellulaire RNA interakties, die de aktivatie van het aangeboren immuunsysteem triggeren zonder bijbehorende aktieve infektie.

Als voorbeelden voor het feit dat TE-aktiviteit een rol speelt bij belangrijke biologische funkties vermelden ze: HERV-H bij de handhaving en differentiatie van stamcel-pluripotentie, HERV-W & HERV-FRD enveloppe proteïnen bij immuun-tolerantie van de foetus, HERV-K gecodeerd Rec proteïne voor de bescherming van het embryo tegen virale infekties, enz.

Ze verwijzen ook naar studies die toonden dat uitdagingen zoals infekties, stress en veroudering TE-transcriptie aktiveren door het destabiliseren van epigenetische merktekens met mogelijks pathogene gevolgen. Het is dus plausibel dat afwijkende TE-aktivatie de kern is van de molekulaire mechanismen betrokken bij M.E.(cvs). Dit dient verder te worden onderzocht.

juli 19, 2019

Verhoogd hsCRP bij fibromyalgie en CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:18 am
Tags: , , , ,

In 2007 lieten Vance Spence en z’n medewerkers al optekenen (zie ‘Arteriële Stijfheid en Inflammatie bij CVS’): “Terwijl verhoogde CRP-waarden beperkte diagnostische waarde hebben bij CVS, zijn hsCRP-waarden indicatief voor chronische, laag-gradige, sub-klinische inflammatie en kunnen fungeren als een potentieel hulpmiddel bij de voorspelling van cardiovasculair risico.”.

De hsCRP: ‘high sensitivity’ (ultra-gevoelige) immuno-assay voor CRP (zie ‘Verband tussen CRP en vermoeidheid’) is een laboratorium-test met hogere gevoeligheid (kan waarden lager dan 10 mg/l meten) dan het gewone C-Reaktief Proteïne. Een hsCRP > 10 mg/l duidt op een acute ontsteking. Lagere waarden duiden op laag-gradige inflammatie. Het eigenlijk gebruik is om het risico op hart- en/of vaatziekte na te gaan (1-3 mg/l: licht verhoogd risico, > 3 mg/l: hoog risico).

Het Noorse research-team die de studie hieronder uitvoerde, vond ook dat de hsCRP-waarden significant hoger lagen (t.o.v. controles) bij de CVS- én de FM-groep die ze onderzochten, en dit ook na aanpassing voor ‘body-mass-index’. Tussen de CVS en FM onderling was er echter geen verschil. Er wordt nogmaals aangegeven dat bij beide aandoeningen inflammatie dus aanwezig is (zie tekst voor referenties met betrekking tot CVS). Het zou op basis van de hsCRP echter niet mogelijk zijn om CVS & FM van elkaar te onderscheiden. Maar het verdient zeker aandacht om verder onderzoek te doen naar deze klinisch relevante inflammatie.

————————-

Brain, Behavior and Immunity (Pre-print juni 2019)

Patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome show increased hsCRP compared to healthy controls

Nina Groven (a,c), Egil A. Fors (b), Solveig Klaebo Reitan (a,c)

a Department of Mental Health, Faculty of Medicine and Health Sciences Norwegian University of Science and Technology (NTNU), Trondheim, Norway

b Department of Public Health and Nursing, General Practice Research Unit, Faculty of Medicine and Health Sciences, Norwegian University of Science and Technology (NTNU), Trondheim, Norway

c Department of Mental Health, St. Olav’s University Hospital, Trondheim, Norway

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FM) zijn allebei chronische aandoeningen die een desastreus effekt hebben op de levens van de aangetaste patiënten en hun families. Beide aandoeningen vertonen overlappende klinische kenmerken die gedeeltelijk gemeenschappelijk zijn met inflammatoire aandoeningen. De etiologie wordt nog niet goed begrepen en er wordt gesuggereerd dat het immuunsysteem mogelijks een bijdragende factor is. Tot op heden zijn de resultaten niet éénduidig. Het doel van deze studie was het vergelijken van de twee aandoeningen en het onderzoeken van de concentratie van de inflammatoire merker ‘high-sensitivity’ CRP (hsCRP) bij CVS- en FM-patiënten t.o.v. gezonde controles.

Vrouwelijke deelnemers met een leeftijd van 18-60 jaar werden in deze studie opgenomen. De groep omvatte 49 CVS-patiënten, 57 FM-patiënten en 54 gezonde controles. De hsCRP-waarden lagen significant hoger voor zowel de CVS- als de FM-groep vergeleken met de gezonde controles, ook na aanpassing voor leeftijd, roken en BMI (p < .001). Er was geen verschil tussen de twee patiënten-groepen. De waarde van hsCRP werd beïnvloed door BMI maar niet door leeftijd en roken.

Patiënten met CVS en FM hebben hogere hsCRP-concentraties t.o.v. gezonde controles. Dit blijft significant zelfs na aanpassing voor BMI. CVS en FM kunnen in deze studie echter niet van elkaar worden onderscheiden op basis hsCRP.

1. Inleiding

De aandoeningen Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FM) zijn twee afzonderlijke diagnostische groepen; ze vertonen echter overlappende symptomen. CVS wordt gekenmerkt door ernstige vermoeidheid met een gekende duidelijke aanvang, die meer dan 6 maanden aanhoudt, niet noodzakelijkerwijs verband houdt met inspanning, niet wordt beïnvloed door rust en verminderd funktioneren veroorzaakt. Daarnaast worden vier van de acht volgende symptomen gezien: verstoring van het korte-termijn geheugen of de concentratie, pijnlijke keel, gevoelige hals of oksel lymfeknopen, spierpijn, pijn in meerdere gewrichten, nieuwe type/patroon/ernst qua hoofdpijn, niet-verfrissende slaap, en post-exertionele malaise die meer dan 24 h aanhoudt. Zowel de diagnoses van CVS en FM zijn gebaseerd op specifieke inclusie-criteria en uitsluiting van andere diagnoses die dezelfde symptomen veroorzaken […]. Deze twee aandoeningen veroorzaken lijden voor de patiënten en verhogen mogelijks de kosten voor het gezondheidszorg-systeem. Er is dus meer kennis nodig om de problemen die door CVS en FM worden veroorzaakt te verlichten.

Pijn en vermoeidheid zijn courante kenmerken bij meerdere inflammatoire aandoeningen. Inflammatie aktiveert pijn-systemen op een directe manier en veroorzaakt vermoeidheid. Een ander kenmerk van meerdere inflammatoire aandoeningen is ‘ziekte-gedrag’, refererend naar niet-specifieke symptomen zoals anorexie, neerslachtigheid, verlies van interesse en verdwijnen van lichaamszorg. Ziekte-gedrag kan worden veroorzaakt door immuun-mediatoren (bv. IL-1). Zodoende is het immuunsysteem een voor de hand liggende kandidaat die dient te worden onderzocht voor z’n rol bij CVS en FM. Tot op heden zijn de studies niet éénduidig. We [Groven N et al.] hebben eerder een tendens naar verhoogde inflammatie aangetoond via de meting van gestegen TNF-α bij CVS-patiënten (t.o.v. controles).

Omdat de etiologie van FM net zo vaag is als die van CVS, wilden we de gelijkenissen en verschillen tussen de twee aandoeningen bestuderen. In deze huidige studie wordt de algemeen gebruikte immuun-merker hsCRP onderzocht bij patiënten met CVS en FM, en bij gezonde controles. hsCRP is een meer accurate methode voor het meten van de CRP-waarden.

2. Methodiek

2.1. Populatie

2.1.1. Patiënten-groepen

De patiënten waren vrouwen, niet-zwanger, met een leeftijd van 18-60 jaar […]. Elke deelnemer werd uitgebreid klinisch onderzocht en grondig geëvalueerd door een experten-team (artsen, fysiotherapeuten en psychologen). De FM-patiënten (n= 58) kregen de diagnose op basis van de 1990 ACR criteria; CVS-patiënten (n = 49) op basis van de Fukuda criteria. Exclusie-criteria waren overéénkomstig diagnostische criteria voor gekende inflammatoire ziekte.

2.1.2. Gezonde controles

[…]

2.2. Procedure

[…]

2.3. Studie-ontwerp en ethiek

Beoordeling (30-40): interview, vragenlijsten en bloed-afname. […]

2.4. Vragenlijsten

‘Hospital Anxiety and Depression Scale’ (HADS, FM 2011 & 2016 criteria, ‘Chalder Fatigue Scale’ & ‘Brief Pain Inventory’ (BPI).

2.5. Interview

[…] Voorgeschiedenis betreffende infekties, immune aandoeningen, ziekte in het algemeen (somatisch & psychiatrisch), co-morbide ziekte, medicatie, menstruatie-cyclus, gebruik van contraceptiva, status van de menopause, ziekte-duur en fysieke aktiviteit de voorbije twee weken.

2.6. Bloedafname

[…] De stalen werden ook gescreend op tekenen van infektie en inflammatie (bv. microbiologische serologie, telling van de witte bloedcellen, enz.). Abnormaliteiten leidden tot exclusie.

2.7.Statistische analyse

[…]

3. Resultaten

[…] Het totaal aantal deelnemers was 160, als volgt verdeeld over de drie groepen: CVS (n = 49), FM (n = 58) & gezonde controles (n = 53). De mediane hsCRP-concentratie was 0,94 mg/l voor CVS, 1,30 mg/l voor FM & 0,60 mg/l voor de controle-groep. De hsCRP-waarden waren niet normaal verdeeld en daarom werden ze omgezet naar hun natuurlijke logaritme (lnCRP) voor verdere analyses.

Statistisch bleken er significante verschillen qua leeftijd & BMI tussen de groepen. […]

De BMI droeg aanzienlijk bij tot het model en was verantwoordelijk voor 23,1% van de variantie qua lnCRP (p < .001), terwijl dit voor de groep-parameter 6,9% was (p = .001). De leeftijd had geen effekt op de uitkomst (p = .200).

Er was geen verband tussen roken en hsCRP-concentraties (p = .925). Er was een sterke positieve correlatie tussen hsCRP & BMI voor de totale populatie (N = 150, p < .001). We zagen ook een correlatie tussen diagnostische groep & hsCRP (N = 153, p = .019).

Het verschil in lnCRP was significant hoger bij de FM- en CVS-groepen vergeleken met de controle-groep (p = .004 & p = .009, respectievelijk). Er was geen verschil tussen de twee patiënten-groepen (p = .902).

4. Bespreking

De CVS- en FM-groepen vertoonden significant hogere waarden qua hsCRP dan de gezonde controle-groep (p = .009 & p= .004, respectievelijk) maar konden niet van elkaar worden onderscheiden (p = .902). hsCRP bleek gecorreleerd met BMI maar niet met leeftijd of roken. Na aanpassing voor BMI was de gestegen hsCRP in beide patiënten-groepen (t.o.v. controles) nog steeds significant.

Hoewel er een rapport is dat geen associatie tussen inflammatie en CVS vond, werden een substantieel aantal rapporten gepubliceerd die een verband aangeven [Patarca-Montero R et al. Cytokine and other immunologic markers in Chronic Fatigue Syndrome and their relation to neuropsychological factors. Appl. Neuropsychol. (2001) 8: 51-64 /// Patarca R. Cytokines and Chronic Fatigue Syndrome. Ann. N. Y. Acad. Sci. (2001) 933: 185-200 /// Raison CL et al. Association of peripheral inflammatory markers with chronic fatigue in a population-based sample. Brain Behav. Immun. (2009) 23: 327-337 /// Russell A et al. Persistent fatigue induced by interferon-alpha: a novel, inflammation-based, proxy model of Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology. (2019) 100: 276-285]. Een ‘review’ aangaande CVS en auto-immuniteit maakt geen melding van CRP, hoewel andere immuun-merkers worden besproken [Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609]. Een ander rapport [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4, 30] over een vergelijking van CVS-patiënten met gezonde controles vond een lichtjes, maar niet significant, hogere hsCRP bij de patiënten, terwijl een eerdere studie met CVS-patiënten (gerecruteerd op gastro-enterologie en reumatologie afdelingen) significant gestegen hsCRP-waarden vond bij CVS-patiënten vergeleken met controles [Groeger D et al. Bifidobacterium infantis 35624 modulates host inflammatory processes beyond the gut. Gut Microb. (2013) 4 325-339]. Beide studies omvatten mensen van beide geslachten en een breed leeftijd-bereik, en er werden niet aangepast voor BMI. Ook genetische studies bij adolescenten hebben een link aangegeven tussen immuun-aktiviteit en CVS [Nguyen CB et al. Associations between clinical symptoms, plasma norepinephrine and deregulated immune gene networks in subgroups of adolescent with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2019) 76: 82-96]. Raison CL et al. [zie hierboven] vonden dat een verhoogd hsCRP bij patiënten met CVS niet meer significant was na aanpassing voor leeftijd, geslacht, ras, woonplaats, BMI, depressie en immuun-modulerende medicatie. Wij hadden echter slechts één geslacht in onze studie en geen enkele deelnemer nam immuun-modulerende medicijnen, er was geen co-morbiditeit en we vonden geen effekt van de leeftijd in onze groepen. Betreffende ras en woonplaats: we registreerden deze gegevens niet maar al onze deelnemers werden gerecruteerd uit eerdere homogene gebieden in en rond Trondheim (Noorwegen). De rol en het type inflammatie bij CVS dient te worden opgehelderd om preventie en behandeling van de aandoening te verbeteren. Onze studie is een bijdrage op dit vlak omdat het fenomeen wordt onderzocht tussen groepen waarbij er weinig verschillen zijn buiten de aanwezigheid van CVS (t.t.z. anderzijds gezond, slechts één geslacht, socio-economisch homogene groep en klein leeftijd-bereik), en er werd aangepast voor BMI.

Een rapport dat CRP heeft gemeten bij FM-patiënten vond geen verschillen tussen patiënten en controles betreffende hsCRP, hoewel er een effekt werd vastgesteld voor leptine [door vetcellen gesecreteerd en nutritioneel gereguleerd hormoon dat de eetlust onderdrukt en een belangrijke regulator van de neuro-endocriene, metabole en immuun-funktie is]. Een grote populatie-studie vond verhoogd CRP bij deelnemers met een zelf-gerapporteerde FM-diagnose en suggereerde dat dit gedeeltelijk werd verklaard door BMI en co-morbiditeit. Verder vond een ‘review’ van studies die rapporteerden over het effekt van niet-farmacologische interventies bij FM-patiënten geen consistent effekt van CRP. Toch lagen de ‘baseline’ CRP-waarden hoger dan de referentie-waarde in drie van de opgenomen studies. Een subgroep FM-patiënten met inflammatoire veranderingen, inclusief gewijzigd CRP, werd ook gesuggereerd. Zoals door anderen werd aangetoond, vonden wij dat hsCRP geassocieerd is met BMI bij alle FM-patiënten alsook gezonde controles. Na aanpassen voor BMI was er echter nog een significant hogere hsCRP bij de patiënten t.o.v. de controles. Naar ons weten werd dit nog niet eerder consistent gerapporteerd en het fenomeen dient verder te worden onderzocht.

In onze studie vertonen beide patiënten-groepen significant hogere hsCRP-waarden dan gezonde controles. De patiënten-groepen wijken echter niet van elkaar af. CVS & FM worden als twee afzonderlijke aandoeningen gedefinieerd hoewel er een hoge co-morbiditeit is, en er zijn meerdere overlappende symptomen en bevindingen tussen de twee aandoeningen. Raison CL et al. [zie hierboven] vonden dat mensen met CVS en een groep met CVS-achtige ziekte niet van elkaar konden worden onderscheiden op basis van hsCRP-concentraties. Het is belangrijk om deze biologische gelijkenissen in gedachten te houden omdat er afwijkende rapporten zijn over de verschillen tussen CVS en FM betreffende klinische symptomen zoals persoonlijkheid, cognitie en evenwicht.

BMI had een duidelijk effekt op hsCRP. Dit komt overéén met bevindingen van meerdere andere studies en met het gekende effekt van vetweefsel op de produktie van CRP. Onze studie bevestigt dat studies aangaande CRP alsook inflammatie in het algemeen dienen te worden gecorrigeerd voor BMI.

We vonden geen effekt van leeftijd op CRP. Dit komt overéén met de studie van Xiao Y et al. [Elevated serum high-sensitivity C-reactive protein levels in fibromyalgia syndrome patients correlate with body mass index, interleukin-6, interleukin-8, erythrocyte sedimentation rate. Rheumatol. Int. (2013) 33: 1259-1264]. Dit kan verrassend zijn aangezien over het algemeen wordt verondersteld dat inflammatie verhoogt met de leeftijd. Onze populatie zou echter globaal te jong kunnen zijn om dit effekt te onthullen. CRP lijkt enkel verhoogd met de leeftijd bij mannen maar manifesteert zich bij vrouwen na de menopause. Er werd ook geen effekt of van roken gezien.

Er zouden verschillen kunnen zijn qua inflammatoire merkers tussen CVS van korte of lange duur. In een studie over FM leek weer-gevoeligheid en pijn, en de duur ook van belang; er werd besloten dat patiënten met FM van korte duur gevoeliger waren voor het weer. De duur van de ziekte beïnvloedde echter in het huidige materiaal de bevindingen niet (gegevens niet getoond).

4.1. Zwaktes & sterktes

De studie betreft informatie gebaseerd op een beperkte populatie, t.t.z. vrouwelijke individuen tussen 18 en 60 die wonen in een homogeen gebied met goed ontwikkelde sociale en gezondheid-diensten. Het zou kunnen dat voor andere groepen (mannen, kinderen en adolescenten, ouderen, en somatisch zowel als psychiatrisch zeer zieke mensen), de onthulde mechanismen misschien niet belangrijk zijn voor vermoeidheid en pijn. Geen enkele van de patiënten waren klinisch depressief. In onze studie registreerden we ook de symptomen angst en depressie d.m.v. de HADS. Aanpassing voor deze scores had geen effekt op hsCRP (gegevens niet getoond).

Een verondersteld laag aktiviteiten-niveau voor de patiënten en hoog aktiviteiten-niveau voor de gezonde controles zou een verstorende factor kunnen zijn die de resultaten beïnvloedt. De CVS-patiënten meldden de laagste aktivteit; die van de FM-patiënten was hoger; en de gezonde controle-groep rapporteerde de hoogste aktiviteit (gegevens niet getoond). Het verrast niet dat patiënten met CVS een hogere mate van inaktiviteit rapporteren omdat dit een deel van de karakteristieken van de aandoening uitmaakt. Toch waren meer dan de helft van de CVS-patiënten inderdaad aktief (gegevens niet getoond) en we geloven niet dat dit een bijdragende factor is tot de hogere mate van inflammatie die we in onze studie vonden. We namen ook de BMI op en controleerden zodoende voor de indirecte link tussen lage aktiviteit-niveaus en BMI.

De studie-populatie is eerder homogeen wat betreft leeftijd, geslacht en socio-economische status, en anderzijds gezond en niet gemediceerd. Dit laat ons toe verschillen te onthullen onafhankelijk van veel verstorende factoren. De studie heeft ook voldoende ‘power’ door de behoorlijke hoeveelheid klinisch materiaal. De patiënten kregen de diagnose volgens de Fukuda criteria in een gespecialiseerde multidisciplinaire eenheid van een universitair ziekenhuis, daarnaast werd nota genomen van de nieuwe FM-criteria, wat de klinische diagnoses valideert in vergelijking van wat kan worden gezien bij grotere populatie-studies.

5. Besluiten

CVS- & FM-patiënten hebben hogere hsCRP-concentraties vergeleken met gezonde controles. Dit blijft significant na aanpassing voor leeftijd en BMI. CVS & FM kunnen in onze studie niet van elkaar worden onderscheiden op basis van hsCRP.

Globaal levert onze studie een belangrijke bijdrage tot de kennis omtrent CVS & FM. Er lijkt een biologische inflammatoire aktiviteit aanwezig te zijn bij patiënten met CVS & FM die niet wordt gevonden bij gezonde controles van dezelfde leeftijd en geslacht. De inflammatoire veranderingen, of ze nu primair of secundair aan andere symptomen zijn, zouden verstorende symptomen kunnen zijn. Inflammatie is een bekende oorzaak voor vermoeidheid en pijn, en kan worden aangepakt via medicatie [inhibitie van NALP3 inflammasoom aktiviteit d.m.v. coenzyme Q10 (zie ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie: effekt van Coenzyme Q10’) & AMPK aktivatoren] of een merker zijn voor het monitoren van een behandeling voor deze aandoeningen. Overéénkomstig de aanbevelingen van de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ en de ‘American Heart Association’ voor hsCRP, en bepaling van risico-factoren, waren de hsCRP-concentraties van onze patiënten-groepen matig tot hoog. Als zodanig heeft dit klinische relevantie die verder gaat dan het bepalen van de oorzaak van CVS & FM.

juli 6, 2019

Is insuline-resistentie de oorzaak van fibromyalgie?

Insuline-resistentie (IR) is een fysiologische toestand waarbij cellen niet in staat zijn te reageren op de normale werking van het hormoon insuline. Het lichaam maakt insuline aan maar de cellen in het lichaam worden er resistent voor en kunnen het niet doeltreffend gebruiken, wat leidt tot hyperglycemie. Beta-cellen in de pancreas verhogen daarop hun produktie van insuline, wat verder bijdraagt tot hyperinsulinemie (te hoge waarden insuline in het bloed). Dit wordt dikwijls niet gedekteerd…

Hemoglobine A1c (HbA1c) is een vorm van (de bloed-kleurstof) hemoglobine die ontstaat door binding met circulerend glucose. Het is een normaal-voorkomende vorm maar een langdurige verhoogde glucose in het bloed (zoals bij diabetes) geeft aanleiding tot het feit dat de gemeten hoeveelheid HbA1c (uitgedrukt in % van het totaal) hoger zal zijn. Het is dus een aanduiding voor langere periodes van hyperglycemie daar waar een enkele meting van de bloedsuiker-spiegel maar een moment-opname is.

Bij een orale glucose-tolerantie test (GTT) geeft men een suiker-oplossing en meet over een bepaalde tijd (meestal 2h) de glucose-concentratie in het bloed om na te gaan hoe snel de glucose ‘verdwijnt’ (in de cellen wordt opgenomen). Het is een eerder rudimentaire, niet altijd even accurate test voor diabetes (of insuline-resistentie, verstoorde werking van de insuline-producerende beta-cellen).

Een team van het CDC maakten in hun artikel ‘Chronic Fatigue Syndrome is associated with metabolic syndrome: results from a case-control study in Georgia (Metabolism: Clinical and Experimental (2010) 59: 1351-7) al melding van het feit dat personen met ‘CVS’, alsook personen met ‘ISF’ (“met onvoldoende symptomen of vermoeidheid voor CVS”), “significant hogere prevalenties van insuline-resistentie vertonen vergeleken met controles.

Prof. Neil McGregor, de Australische metaboloom-specialist, suggereerde op het EMERGE 2019 ‘ME/CFS International Research Symposium’ dat hoewel z’n gegevens er op wijzen dat een derde van de M.E.(cvs)-patiënten insuline-resistentie vertonen, de meeste feitelijk een vorm van hyperinsulinemie (dikwijls gezien bij type-2 diabetes en bij het metabool syndroom – chronisch stofwisselingsprobleem met o.a. verhoogd nuchtere glucose-spiegel) hebben.

Een italiaanse onderzoeksgroep (Fava te al.; zie hieronder Metabolic Brain Disease. (2013) 28: 619-27) rapporteerde eerder dat de prevalentie van abnormaliteiten van het glucose-metabolisme significant hoger lag bij een groep fibromyalgie (FM) -patiënten met geheugen-probelemen. Ze evalueerden glucose en insuline na een orale glucose-tolerantie test, en de insuline-resistentie. De resultaten van deze studie gaven aan dat IR een risico-factor kan zijn voor geheugen-stoornissen bij FM-patiënten.

Eerdere observaties (door de huidige onderzoeksgroep) gaven aan dat insuline-resistentie problemen met de hersen-doorbloeding veroorzaken. Dergelijke abnormale brein-perfusie is ook aanwezig bij fibromylagie, vandaar de hypothese van de auteurs van onderstaande studie dat IR betrokken zou kunnen zijn. Daarom gingen ze met terugwerkende kracht kijken naar laboratorium-waarden van FM-patiënten. De enige abnormaliteit die ze vonden was verhoogd HbA1c bij 23 patiënten, en dit bij controle voor de leeftijd. 16 van hen kregen metformine en dit had een dramatisch effekt op de pijn… De lezer vindt hieronder een weergave van het artikel. Grote conclusies kunnen nog niet worden getrokken maar het is evident dat ook de M.E.(cvs)-gemeenschap dit dient te volgen.

Metformine is een medicijn ter behandeling van diabetes type-2; het verlaagt de bloed-glucose via verschillende wegen (o.a. remming van de gluconeogenese, de glycogenolyse en de omzetting uit lactaat, verhoging van de insuline-gevoeligheid, vertraging van de opname in glucose in de darmen). Verder zogrt het ook voor upregulering van de fosforylatie van AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK; zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’ & ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen’). Het is ook een inhibitor van mitochondriale complex-I gemedieerde respiratie (gebruikmakend van pyruvaat en malaat).

Onderstaand artikel werd door de redactie van het tijdschrift (PLoS ONE) teruggetrokken omdat er bezorgdheid werd geuit omtrent de ethische goedkeuring en de kwestie of het studie-ontwerp wel voldoende rigoureus was. De redacteurs vonden dat de studie niet meer voldeed aan de vereisten van het tijdschrift.

De academische redacteur die bij de beoordeling na de publicatie werd geraadpleegd, toonde zich ook bezorgd over het feit dat het onderzoek geen passende controles omvatte. De HbA1c-waarden van deelnemers aan de studie werden vergeleken met gemiddelde HbA1c-waarden in gepubliceerde gegevens-sets en de academische redacteur adviseerde dat de studie voor leeftijd, geslacht en etniciteit overeenkomende controles (uit dezelfde kliniek-populatie als degenen die metformine kregen) had moeten omvatten. Deze informatie werd niet gevraagd tijdens het pre-publicatie ‘review’-proces en de auteurs merkten op dat dit in principe had kunnen worden besproken voorafgaand aan de publicatie of post-publicatie door toevoeging van aanvullende gegevens en herziening van het artikel…

————————-

PLoS ONE 14 (2019): e0216079

Is insulin resistance the cause of fibromyalgia? A preliminary report

Pappolla MA1,2, Manchikanti L3, Andersen CR4, Greig NH5, Ahmed F2, Fang X1, Seffinger MA6, Trescot AM7

1 Department of Neurology, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, United States of America

2 St. Michael’s Pain & Spine Clinics, Houston, Texas, United States of America

3 Department of Anesthesiology, LSU School of Medicine Health Sciences Centre, New Orleans, Louisiana, United States of America

4 Office of Biostatistics, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, United States of America

5 Drug Design and Development Section, National Institute on Aging, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, United States of America

6 Department of Neuromusculoskeletal Medicine, College of Osteopathic Medicine of the Pacific, Pomona, California, United States of America

7 Pain and Headache Centre, Eagle River, Alaska, United States of America

Samenvatting

Fibromyalgie (FM) is één van de meest frequente aandoeningen met veralgemeende pijn, met slecht begrepen neurobiologische mechanismen. Deze aandoening is verantwoordelijk voor een enorm aandeel in de kosten voor de gezondheidszorg. Ondanks uitgebreide research, is de etiologie van FM onbekend en dus is er geen therapie beschikbaar voor deze aandoening. We tonen dat de meeste (mogelijks alle) patiënten met FM behoren tot een afzonderlijke populatie die kan worden afgescheiden van een controle-groep via het bepalen van geglycosyleerd hemoglobine-A1c (HbA1c), een alternatieve merker voor insuline-resistentie (IR). Dit werd aangetoond via de analyse van gegevens na stratificatie volgens leeftijd in een lineaire regressie model. Deze strategie toonde zeer significante verschillen tussen FM-patiënten en controle-individuen (p < 0.0001 & p = 0.0002, voor twee afzonderlijke controle-populaties, respectievelijk). Een subgroep patiënten die voldeden aan de criteria voor pre-diabetes of diabetes (patiënten met HbA1c-waarden van 5,7% of hoger) die een behandeling met metformine kregen, vertoonden dramatische verbeteringen van hun wijdverspreide myofasciale [myo = spier, fascia = bindweefsel-band onder de huid] pijn, zoals werd aangetoond via hun scores op een pre- en post-behandeling numerieke pijn-schaal (NPRS). Hoewel preliminair, suggereren deze een pathogeen verband tussen FM en IR, wat kan leiden tot een ingrijpende paradigma-verschuiving wat betreft het management van deze aandoening.

Inleiding

[…]

FM wordt beschouwd als een pijn-aandoening met centrale sensitiviteit die wordt gekenmerkt door abnormale verwerking van nociceptieve stimuli. Daarnaast wordt ook gedacht dat perifere mechanismen (zie bespreking aangaande ‘small-fibre’ neuropathie) bijdragen tot de wijdverspreide pijn. Er werden veel hypothesen vooropgesteld om de uitgebreide waaier aan symptomen (inclusief erfelijke abnormaliteiten, dysfunktie van neurotransmitter-mechanismen zoals substantie-P, immuun-ontregeling en meerdere andere) te verklaren. Jammer genoeg heeft geen enkele van deze voorstellen geleid tot praktische vooruitgang die verder gaat dan symptomatische behandeling. Eigenlijk hebben overzichten over FM […] geconcludeerd dat er geen substantiële vooruitgang werd geboekt wat betreft ons begrip over deze ziekte.

Eerdere observaties geven aan dat IR dysfunkties in de microvasculatuur van de hersenen veroorzaakt, leidend tot focale cerebrale hypo-perfusie. Aangezien gelijkaardige hersen-perfusie abnormaliteiten aanwezig zijn bij patiënten met FM, hypothiseerden we dat IR de ontbrekende schakel zou kunnen zijn bij deze aandoening. Om te zoeken naar initieel bewijsmateriaal ter ondersteuning van deze hypothese, voerden we een retrospectieve verkenning uit bij gegevens van FM-patiënten, met de focus op potentiële laboratorium-abnormaliteiten. In tegenstelling tot eerdere studies kwamen, na toepassing van een leeftijd-correctie op de voor de analyse beschikbare gegevens – specifiek voor de HbA1c-waarden, onverwachte bevindingen aan licht. We maken hier melding van een reeks patiënten met FM die behoren tot een afzonderlijke populatie die kan worden onderscheiden van een controle-groep via de HbA1c-waarden, een biomerker voor verstoord glucose-metabolisme, gekenmerkt door insuline-resistantie.

Om deze bevinding aan te vullen, bekeken we ook de evolutie van pijn-scores van patiënten met FM waarvan hun IR farmacologisch werd behandeld. Deze subgroep patiënten rapporteerde dramatische verbeteringen van hun myofasciale pijn na behandeling met metformine.

Dit bewijsmateriaal, hoewel preliminair, suggereert een pathogenetisch verband tussen FM en IR, wat kan leiden tot een paradigma-verschuiving bij het management van deze aandoening.

Materialen & methodes

Beschrijving van het staal

23 patiënten […] voldeden aan de 1990 alsook de 2010/2011 criteria van de ‘American College of Rheumatology’ voor de diagnose van FM (d.w.z. ‘tender-points’ bleven behouden bij de evaluatie). Co-morbide aandoeningen (inclusief voorgeschiedenis van cerebrovasculaire ziekte, Reumatoïde Artritis, onbehandelde endocriene abnormaliteiten, auto-immune aandoeningen, neuromusculaire ziekten, aktieve maligniteit, immunodeficiëntie of drug/alkohol-misbruik) werden uitgesloten. Medicatie geassocieerd met IR (glucocorticoïden, thiazide-diuretica [‘vochtafdrijvers’], atypische anti-psychotica, beta-blokkers, niacine [vitamine-B3], statinen [cholesterol-syntheseremmers], enz.) werden ook uitgesloten.

Aangezien er een gekend verband is tussen ‘small-fibre’ neuropathie en FM [Oaklander AL et al. Objective evidence that small-fibre polyneuropathy underlies some illnesses currently labeled as fibromyalgia. Pain. (2013) 154: 2310-6; zie ook ‘Fibromyalgie potentiële ‘small-fibre’ neuropathie’ /// Grayston R et al. A systematic review and meta-analysis of the prevalence of small fibre pathology in fibromyalgia: Implications for a new paradigm in fibromyalgia etiopathogenesis. Semin Arthritis Rheum. (2019) 48: 933-940], hadden vele van deze patiënten een laboratorium-onderzoek ondergaan in een geaccrediteerd lab. […]

[…]

Omdat perifere neuropathieën (inclusief ‘small-fibre’ neuropathie) die geassocieerd zijn met IR in de zeer vroege stadia van pre-diabetes kunnen beginnen, bestaat er bij experten een groeiende trend om vroege farmacologische interventies te starten om deze abnormaliteit te corrigeren, bijzonderlijk wanneer IR geassocieerd is met neuropathie of andere risico-factoren. Dit uitgangspunt volgend, werden patiënten die voldoen aan de criteria voor pre-diabetes (HbA1c-waarden van 5,7 of hoger) of voorheen nog niet gediagnostiseerde diabetes mellitus type-2, routinematig behandeling aangeboden en werd metformine 500 mg tweemaal per dag geïnitieerd. In ons patiënten-staal werd metformine toegevoegd aan ‘standaard behandeling’ voor wijdverspreide myofasciale pijn. Standaard behandeling (ST) bestond uit norepinefrine reuptake inhibitoren (amitriptyline, duloxetine of milnacipran) en/of membraan-stabiliserende agentia (gabapentine of pregabaline), afhankelijk van de verdraagbarheid of de voorkeur van de patiënten.

De ‘Numeric Pain Rating Scale’ (NPRS) is een uni-dimensionele meting van de pijn-intensiteit bij volwassenen die bestaat uit een of een 11-punten schaal voor de zelf-rapportering van pijn. Het is één van de meest courant gebruikte instrumenten in klinische en research-settings waarvan de validiteit is bewezen. De pijn-scores na initiële evaluatie, na ST en na toediening van metformine.

Statistische analyses

Om de door patiënten bijgedragen variatie te karakteriseren, werden sets van gesimuleerde HbA1c-gegevens gegenereerd om de populaties te emuleren die bron waren van de HbA1c-waarden bij de controles. Daarvoor gebruikten we mensen uit de FOS (‘Framingham Offspring Study’) met normale glucose-tolerantie [Effect of aging on A1C levels in individuals without diabetes: evidence from the Framingham Offspring Study and the National Health and Nutrition Examination Survey 2001-2004. Diabetes Care. (2008)] en de NHANES (‘National Health and Nutrition Examination Survey’) niet-diabeten, met leeftijden tussen 40 en 69. Aan de hand van het aantal, het gemiddelde en de ‘standard error’ van elke leeftijd-groep berekenden we de standaard-deviatie voor elke groep […]. De gemiddelden en ‘standard errors’ van de resulterende gesimuleerde gegevens voor elk leeftijd-bereik werden geverifieerd (gemiddelden binnen 0,1% en ‘standard errors’ binnen 4%). De HbA1c-gegevens van de gesimuleerde FOS met normale glucose-tolerantie en NHANES niet-diabeten werden gepaard met de HbA1c-metingen van de FM-patiënten, en er werd lineaire regressie uitgevoerd met betrekking tot leeftijd en groep (FOS met normale glucose-tolerantie (n = 1.350), NHANES niet-diabeten (n = 1.592) vs FM-patiënten (n = 23). […]

Resultaten

1. Verband tussen FM en HbA1c-waarden

Van alle gereviewde analyten, bleek enkel de HbA1c-waarde FM-patiënten te onderscheiden van controle-individuen. Ondanks het feit dat van veel patiënten met FM de HbA1c-waarden binnen de normale grenzen (gelijk aan of lager dan 5,6 %) lagen, wanneer we de gegevens volgens leeftijd werden opgedeeld en analyseerden, kwam een scherp omlijnd verschil tussen de groepen (FM-patiënten versus controles) aan het licht. De vergelijking aangaande het verband tussen HbA1c en groep – FOS met normale glucose-tolerantie, NHANES niet-diabeten & fibromyalgie – toonde dat voor de patiënten met FM de HbA1c gemiddeld 0,59 eenheden hoger lag dan FOS met normale glucose-tolerantie (p < 0.0001) en 0,39 eenheden hoger dan NHANES niet-diabeten (p = 0.0002).

De pijn-scores verschilden significant voor alle groepen (initieel, standaard behandeling, metformine-behandeling): p < 0.0001 […].

De HbA1c-waarden [tussen 5,1 & 6,5 %] van 23 patiënten met FM [35-60 jaar] (8 latinos; 11 blanken; 4 afro-amerikanen; 21 vrouwen, 2 mannen) werden vergeleken met de gemiddelden van twee controle-populaties: een niet-diabete populatie met normale glucose-tolerantie (FOS) en een niet-diabete populatie van de NHANES data-set. […] De HbA1c-waarden bij patiënten met FM werden geschat op gemiddeld 0,59 +/- 0,1 eenheden hoger dan FOS met normale glucose-tolerantie (p < 0.001) en 0,39 eenheden hoger dan NHANES niet-diabeten (p = 0.0002). […]

2. Daling van de pijn-scores na behandeling van IR

De subgroep patiënten die een farmacologische behandeling met metformine kregen voor IR, in combinatie met de standaard behandeling (ST), ondervonden een dramatische daling van de pijn-scores. De respons op metformine plus ST was een complete resolutie van de pijn (0 op 10 bij de NPRS) bij 8 van 16 patiënten die behandeld werden met metformine (50%), een mate van verbetering die nooit eerder werd gezien bij een dergelijke grote proportie FM-patiënten onderworpen aan eender welke beschikbare behandeling. In tegenstelling daarmee verbeterden patiënten die enkel ST kregen maar een compleet verdwijnen van de pijn werd over het algemeen niet vastgesteld. Interessant was dat sommige patiënten enkel op metformine reageerden en niet op ST (NSRIs of membraan-stabiliserende agentia). Belangrijk: er was een langdurig behoud van het analgetisch effekt van metformine.

Bespreking

De resultaten tonen een zeer significant verband tussen FM en HbA1c. Stratificatie van de waarden in een leeftijd-continuüm, tonen een duidelijk verschil tussen de patiënten en de controle-groepen. Bijna alle patiënten in de FM-groep vertoonden waarden op of boven het gemiddelde van de FOS controles, met zeer significante verschillen tussen de FM-patiënten en beide controle-groepen (p < 0.0001 & p = 0.0002 voor de FOS en NHANES controle-populaties, respectievelijk). Daarnaast vertoonden patiënten met FM waarvan IR farmacologisch werd behandeld dramatische en statistisch significante dalingen van de pijn-scores (p < 0.0001 voor alle groepen).

HbA1c meet IR niet op een directe manier; het wordt echter alom erkend als een alternatieve merker voor deze abnormaliteit. Niet-diabete individuen met matig gestegen HbA1c-waarden (5,7 – 6,4 %), behoren tot een stadium dat dikwijls ‘pre-diabetes’ wordt genoemd en lopen een hoger risico op het ontwikkelen van perifere neuropathieën, cardiovasculaire voorvallen, neurologische ziekten [Alzheimer’s, Parkinson’s, depressie] en mortaliteit door alle oorzaken.

In het licht van de wezenlijke research-inspanningen bij FM, inclusief deze door de farmaceutische industrie, waren we verward over het feit dat eerdere onderzoeken deze simpele bevindingen over het hoofd had gezien. De belangrijkste reden om hier op te letten, is het feit dat veel FM-patiënten HbA1c-waarden vertonen die momenteel wordt beschouwd als binnen de normale waarden; dit hier is echter de eerste studie die de gegevens op een leeftijd-gestratificeerde manier heeft geanalyseerd. Dit is belangrijk, gezien het effekt van het ouder-worden op HbA1c-waarden. Een waarde van 5,5%, bijvoorbeeld (als normaal beschouwd volgens de huidige criteria), kan dit daarom misschien niet zijn bij veel jonge mensen. Een bijkomende reden voor het missen van deze associatie zou als volgt kunnen zijn: eerdere studies hebben een verband vastgesteld tussen FM en ‘small-fibre’ neuropathie [zie Oaklander AL et al. & Grayston R et al. hierboven]. Hoewel IR een frequente oorzaak is van ‘small-fibre’ neuropathie, maakte de evaluatie van HbA1c geen onderdeel uit van het diagnostisch onderzoek van deze aandoening door de onderzoekers. In plaats daarvan werden andere methodes aangewend bij sommige studies (bv. orale glucose-tolerantie testen [zie Oaklander AL et al. hierboven]). Onze gegevens zouden, indien ze worden bevestigd, niet enkel de mechanismen kunnen verklaren die eigen zijn voor centrale pijn bij FM, maar ook het verband tussen deze aandoening en ‘small-fibre’ neuropathie.

Het is belangrijk eer te geven aan de inspanning van andere onderzoekers die ook naar dit verband hebben gezocht. Tishler M et al. [Fibromyalgia in diabetes mellitus. Rheumatol Int. (2003) 23: 171-3] vonden dat de incidentie van FM hoger lag bij patiënten met diabetes mellitus type-2 dan in hun controle-groep (18% vs 2%) en suggereerde een mogelijke relatie tussen deze twee aandoeningen. In een afzonderlijke studie rapporteerden Yanmaz MN et al. [The prevalence of fibromyalgia syndrome in a group of patients with diabetes mellitus. Rheumatol Int. (2012) 32: 871-4] gelijkaardige bevindingen.

Fava A et al. [Insulin resistance possible risk factor for cognitive impairment in fibromialgic patients. Metab Brain Dis. (2013) 28: 619-27] toonden dat IR een risico-factor was voor cognitieve stoornissen bij in FM-patiënten maar deze associatie bleef enkel beperkt tot cognitief verstoorde patiënten. Deze resultaten zouden problematisch zijn voor eender welke oorzakelijke hypothese omdat men geen oorzakelijkheid kan claimen voor een factor die slechts bij een kleine subgroep van de aangetaste populatie aanwezig is. Door het toepassen van de data-analyse strategie van onze studie, tonen we nu echter aan dat abnormaliteiten die waarschijnlijk gerelateerd zijn met IR veel meer voorkomen dan eerder werd gedacht en aanwezig kunnen zijn bij de meeste (als niet alle) patiënten met FM. Interessant is dat in de studie van Fava A et al. [zie hierboven], de body-mass-index van de individuen en de lende/heup-verhouding niet geassocieerd waren met een toename van het risico voor het ontwikkelen van cognitieve stoornissen, wat suggereert dat het voorkomen van IR bij deze patiënten niet noodzakelijk geassocieerd is met de verhoogde body-mass-index die dikwijls wordt vastgesteld bij patiënten met FM.

Op basis van onze gegevens willen we graag voorstellen dat IR pathogenetisch gelinkt is met FM. Er zijn echter meerdere waarschuwingspunten bij ons voorstel, die zorgvuldig moeten worden overwogen bij het ontwerpen van toekomstige klinische testen die deze hypothese proberen te bevestigen. Eén er van is de beperking die intrinsiek is voor een retrospectieve ‘cross-sectionele’ studie. Omdat IR en FM simultaan werden beoordeeld, is bewijs voor causaliteit moeilijker vast te stellen bij afwezigheid van een tijd-relatie. Ten tweede: FM-patiënten hebben courant overgewicht of zijn obees, factoren die kunnen voorbestemmen tot het ontwikkelen van IR. Ten derde: de resultaten van de farmacologische interventie werden bekomen door retrospectieve observaties van behandelde patiënten en geïnterpreteerd buiten de context van een gerandomiseerde placebo-gecontroleerde klinische proef. Ten laatste: metformine kan een effekt op chronische pijn hebben dat onafhankelijk is van z’n werking op IR. Het is gekend dat metformine mitochondriaal AMPK doet stijgen, wat kan resulteren in gedaalde mechanische allodynia [ervaring van pijn bij een gewoonlijk niet-pijnlijke prikkel] en nociceptor [pijn-receptor] -aktivatie. Een andere groep suggereerde trouwens dat metformine nuttig kan zijn bij FM [door de effekten op mitochondrieën], hoewel een verband met IR niet werd vermoed of onderzocht door de auteurs [Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and inflammation common events in skin of patients with Fibromyalgia. Mitochondrion. (2015) 21: 69-75 /// Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients. Biochim Biophys Acta. (2015) 1852: 1257-67]. In dit opzicht is het belangrijk voor toekomstige testen om medicijnen op te nemen die zich via andere mechanismen richten op IR. Tenslotte: andere merkers voor IR, zoals het ‘homeostasis model assessment for insulin-resistance’ (HOMA-IR) [computer-model voor de kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van insuline-resistentie en deficiënte beta-cel werking tot nuchtere hyperglycemie] en verwante testen dienen te worden onderzocht gebruikmakend van gelijkaardige analytische strategieën voor leeftijd-correctie en vergelijking met normale individuen. Fava A et al. [zie hierboven] konden in hun studie geen verschillen vinden voor deze test (HOMA-IR) tussen FM-patiënten en een controle-populatie maar er werden echter geen leeftijd-correcties toegepast.

Ondanks al deze waarschuwingpunten, spoort dit initieel rapport ons aan antwoorden te zoeken voor enkele uitdagende vragen die deze hypothese oproept. Het is onwaarschijnlijk dat een placebo-effekt alleen zou resulteren in de indrukwekkende mate van verbetering van langdurige pijn die werd ervaren door de patiënten die de combinatie van medicijnen (metformine plus ST) kregen. Het is opmerkelijk dat ‘non-responders’ opvallend afwezig waren in ons patiënten-staal; een dergelijk ongewoon en atypisch laag ‘number needed to treat’ (NNT [aantal patiënten dat (gedurende een zekere periode) moet worden behandeld om één gunstige uitkomst extra te bereiken of één ongunstige uitkomst extra te voorkomen]) zou eerder overéénkomen met een ziekte-modifiërende therapie.

Tot besluit: IR blijkt steeds meer geassocieerd met een brede waaier van neurologische aandoeningen en FM zou wel eens een bijkomende dergelijke aandoening kunnen zijn. Onze gegevens bieden preliminair bewijsmateriaal suggestief voor het feit dat IR een pathologische onderlaag bij FM kan zijn en dit vormt het decor voor toekomstige studies ter bevestiging van deze initiële observaties. Indien ze worden bevestigd, kunnen onze bevindingen zich niet enkel vertalen naar een ingrijpende paradigma-verschuiving voor het management van FM maar kan dit ook miljarden dollars besparen in de gezondsheidszorg-systemen wereldwijd.

juni 23, 2019

Abnormale accumulatie van bloed-lactaat bij herhaalde inspanning bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Inspanning — mewetenschap @ 6:20 am
Tags: , , , ,

Lees in verband met het gebruik van herhaalde inspanningstesten als diagnostisch instrument ook de volgende stukken op onze pagina’s ‘Dubbele fietstest’, ‘Post-exertionele malaise bij vrouwen met CVS’, ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’ & ‘M.E./CVS-patiënten niet in staat maximale VO2 te herhalen bij 2daagse fietstest’.

Voor onderstaande studie ondergingen de (vrouwelijke) deelnemers ook twee cardiopulmonaire inspanning testen (CPETs) met een tussentijd van 24 uur. De researchers vonden dat de zuurstof-opname (VO2) bij piek inspanning (VO2peak) lager lag bij de patiënten dan bij de controles voor de eerste test  en nog daalde bij de patiënten voor de tweede. Het verschil in VO2peak tussen de twee testen verschilde echter niet significant bij vergelijking van de groepen.

De voornaamste bevinding bij onderstaande studie is dat bij vergelijking van de eerste en de tweede fietstest werd vastgesteld dat er een toename van melkzuur (in het arterieel bloed) bij de vrouwen met M.E.(cvs) was, terwijl dit bij de controles was afgenomen. Voorafgaande lichamelijke aktiviteit doet dus de lactaat-accumulatie bij M.E.(cvs) stijgen, terwijl deze daalt bij gezonde mensen.

Er wordt door de auteurs gesuggereerd dat een verstoorde regulering van pyruvaat-dehydrogenase-kinase (PDK) – zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’ – mogelijks de opruimin van lactaat kan beïnvloeden. Onder andere ook de Belgische endocrinoloog Frank Comhaire heeft al geopperd dat de aktiviteit van dit enzyme verhoogd zou kunnen zijn en de werking van pyruvaat-dehydrogenase zou kunnen inhiberen. Andere (Noorse en Britse) onderzoekers dit contesteren (zie bv. ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’). De research gaat verder…

————————-

Physiological Reports Vol 11, e1413 (2019)

Abnormal blood lactate accumulation during repeated exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Katarina Lien (1,2), Bjorn Johansen (3), Marit B. Veierod (4), Annicke S. Haslestad (1), Siv K. Bohn (1), Morten N. Melsom (5), Kristin R. Kardel (1), Per O. Iversen (1,6)

1 Department of Nutrition, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, Oslo, Norway

2 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

3 Department of Respiratory Diseases, Rikshospitalet, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

4 Oslo Centre for Biostatistics and Epidemiology, Department of Biostatistics, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, Oslo, Norway

5 Department of Pulmonary Medicine, The Glittre Clinic, Hakadal, Norway

6 Department of Hematology, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

Samenvatting

Post-exertionele malaise en vertraagd herstel zijn karakeristieke symptomen van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Studies aangaande herhaalde cardiopulmonaire inspanning testen (CPET) tonen dat eerdere inspanning de zuurstof-opname (VO2) en kracht-ontwikkeling (power-output, PO) bij M.E./CVS negatief beïnvloedt. Of dit de arteriële lactaat-concentraties ([Laa]) beïnvloedt, is niet geweten. We bestudeerden 18 vrouwelijke patiënten (18-50 jaar) die voldoen aan de Canadese Consensus Criteria voor M.E./CVS en 15 gezonde vrouwen (18-50 jaar) die twee CPETs ondergingen met een tussentijd van 24 h (CPET1 & CPET2) waarbij de [Laa] elke 30 seconden werd gemeten. De VO2 bij piek inspanning (VO2peak) was lager bij patiënten dan bij controles voor CPET1 (P < 0.001) en daalde bij patiënten voor CPET2 (P < 0.001). Het verschil in VO2peak tussen de CPETs verschilde echter niet significant tussen de groepen. De [Laa] per PO was hoger bij patiënten tijdens beide CPETs (Pinteraction < 0.001), maar daalde bij patiënten en steeg bij controles van CPET1 naar CPET2 (Pinteraction < 0.001). Patiënten hadden een lagere VO2 (P = 0.02) en PO (P = 0.002) bij de gas-uitwisseling drempel (GET, het punt waar de CO2-produktie stijgt in relatie tot VO2), maar de relatieve intensiteit (%VO2peak) en [Laa] bij GET verschilden niet significant van controles voor CPET1. Patiënten vertoonden een reductie qua VO2 (P = 0.02) en PO (P = 0.01) bij GET voor CPET2, maar geen significante verschillen qua %VO2peak en [Laa] bij GET tussen de CPETs. Controles vertoonden geen significante verschillen qua VO2, PO of %VO2peak bij GET tussen CPETs, maar de [Laa] bij GET was gedaald voor CPET2 (P = 0.008). We besluiten: voorafgaande inspanning verslechtert de fysieke prestaties en verhoogt de [Laa] tijdens inspanning bij patiënten met M.E./CVS terwijl dit de [Laa] verlaagt bij gezonde individuen.

Inleiding

[…] De Canadese Consensus Criteria (CCC) en de Internationale Consensus Criteria (ICC) lijken allebei een subgroep patiënten te identificeren met ernstiger funktionele beperkingen, alsook uitgesproken fysieke en cognitieve symptomen. PEM [post-exertionele malaise] wordt gedefinieerd als een substantiële verergering van symptomen na milde tot matige lichamelijke, mentale of emotionele inspanning. PEM en vertraagd herstel na inspanning zijn verplichte criteria bij zowel de CCC als de ICC.

Een cardiopulmonaire inspanning test (CPET) geeft een accurate en objectieve beoordeling van de funktionele capaciteit. Herhaalde CPETs [‘dubbele fiestesten’] hebben aangetoond dat M.E./CVS-patiënten niet in staat zijn tot herhaling van de zuurstof-opname en power-output bij piek inspanning (VO2peak) en/of bij gas-uitwisseling drempel (gedefinieerd volgens de ‘V-slope’ methode [zie verder]), bij testen op twee opéénvolgende dagen [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492 /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J. Transl. Med. (2014) 12: 104 /// Nelson MJ et al. Diagnostic sensitivity of 2-day cardiopulmonary exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J. Transl. Med. (2019) 17: 80]. De gas-uitwisseling drempel is het punt waar VCO2 stijgt in relatie tot VO2, en wordt traditioneel gezien als een overgang van aërobe naar anaërobe energie-produktie, samenvallend met het begin van lactaat-accumulatie. De notie van weefsel-hypoxie [zuurstofgebrek] als voornaamste oorzaak van lactaat-accumulatie wordt echter niet meer aanvaard is. Lactaat is altijd het eind-resultaat van glycolyse, ook onder aërobe omstandigheden. Glycolyse stijgt tijdens inspanning en lactaat wordt snel uit de circulatie verwijderd, voornamelijk door oxidatie en gluconeogenese [vorming van glucose uit niet-koolhydraat bronnen]. Tijdens een oplopende inspanning test, treedt bloed lactaat accumulatie op wanneer de snelheid van het verschijnen van lactaat de snelheid van lactaat-verwijdering overschrijdt. Getrainde individuen hebben een lagere lactaat-concentratie in het bloed en een verhoogde lactaat verwijdering-snelheid voor een absolute inspanning-intensiteit, vergeleken met ongetrainde individuen. De snelheid waarmee lactaat verschijnt, bleek echter gelijkaardig voor getrainde en ongetrainde individuen bij dezelfde relatieve intensiteit, gedefinieerd als percentage VO2peak (%VO2peak).

Eerdere studies hebben geen consistente resultaten aangetoond wat betreft fysieke prestatie en lactaat-accumulatie bij M.E./CVS, maar lactaat-accumulatie tijdens herhaalde inspanning testen werd nog niet onderzocht. Het doel van deze studie was daarom te onderzoeken of VO2 en concentraties arterieel plasma lactaat bij verscheidene inspanning-intensiteiten verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles tijdens twee CPETs met een tussentijd van 24 h.

Materialen & methodes

Goedkeuringen

[…]

Individuen

[…] Alle in de studie opgenomen patiënten voldeden aan de CCC voor M.E./CVS. Uitgesloten: zwangere of bedlegerige patiënten of degenen met co-morbiditeiten die met CPET-resultaten kunnen interfereren (long- en hart-aandoeningen), of gebruikers van medicijnen waarvan is geweten dat ze fysieke prestaties beïnvloeden. De controles hadden geen eerdere of huidige ernstige ziekte, gebruikten geen regelmatige medicatie (orale contraceptiva waren toegelaten), hadden geen eerste-graads verwantschap met iemand met M.E./CVS en deden minder dan tweemaal per week een fysieke inspanning. Om PEM te wijten aan het reizen naar de studieplaats tot een minimum te herleiden, werd de patiënten aangeboden ter plaatse te blijven tijdens de test-periode. 18 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 15 vrouwelijke gezonde controles […].

Inspanning-testen

[…] Er werd de deelnemers gevraagd zich te onthouden van lichamelijke inspanning 72 h vóór de eerste CPET en ze werden getest na overnacht vasten (water-consumptie toegelaten). […] Spirometrie [meting van long-funktie/capaciteit] en elektrocardiogram bij ‘baseline’ op de eerste dag. Vóór elke test werd een katheter in de pols-slagader ingebracht voor bloedafname.

De deelnemers voerden twee maximale testen met oplopende inspanningen (CPET1 & CPET2) uit, met een tussentijd van 24 h, op een fiets-ergometer […] De snelheid waarmee de inspanning werd opgedreven werd individueel ingesteld, met de bedoeling VO2peak te bereiken binnen 8 à 12 min inspanning. Die snelheid was gebaseerd op eerdere en huidige aktiviteit-graad, lichamelijk onderzoek, leeftijd, lengte en gewicht, en varieerde van 10 tot 24 W/min voor de M.E./CVS-patiënten, en 15-30 W/min voor de controles. Het protocol omvatte een rust-fase van 2 min en 2 min onbelast pedaleren (60-75 rpm), gevolgd door een lineaire toename van de power-output tot vrijwillige uitputting of totdat de deelnemer niet meer in staat was de fiets-frequentie boven 45 rpm te houden. Ze werden sterk vocaal aangemoedigd tijdens de testen. […] Criteria om de inspanning-test te beëindigen, waren: tekenen van nood (bleekheid of duizeligheid, pijn op de borst, significante ritme-stoornissen) of van ischemie (ECG). Na het bereiken van VO2peak bleven de deelnemers door het masker ademen gedurende een herstel-periode van 3 min.

Analyses van biochemische merkers

Er werden arteriële bloedstalen afgenomen in rust vóór elke CPET en om de 30 seconden tijdens inspanning. De test-tubes bevatten een antiglycolytisch middel om verdere glycolyse te voorkomen. […] Er werden controle-sera gebruikt om de test-procedures te monitoren. Er werden ook arteriële bloedstalen genomen voor hemoglobine-analyse in rust vóór elke CPET en binnen de 90 seconden na piek-inspanning […].

Analyses van inspanning-variabelen

Er werd een gemiddelde gemaakt van de variabelen (gemeten per ademhaling) voor elke 30 seconden. De gas-uitwisseling drempel werd visueel vastgesteld via de ‘V-slope’ methode [uitzetten van de koolstofdioxide output (VCO2) tegen de zuurstof-opname (VO2) en vaststellen van een omslagpunt in grafieklijn; de overeenkomstige inspanning-intensiteit wordt beschouwd als de gas-uitwisseling drempel; wanneer lactaat accumuleert en aanleiding geeft tot acidose, versnelt VCO2 ten opzichte van VO2]; onafhankelijk door twee onderzoekers. De relatieve inspanning-intensiteit werd gedefinieerd als percentage van VO2peak (%VO2peak). Het punt waar [Laa] begon te accumuleren werd gedefinieerd als het lactaat-‘turnpoint’ (LT) en werd bepaald via log-log transformatie van [Laa] vs power-output […]. [Oorspronkelijk werd een grafiek van de log([Laa]) t.o.v. de log(VO2) uitgezet; deze werd lineair beschouwd en kan worden aangewend om de lactaat-drempel (beter) vast te stellen.] De power-output (lineair stijgend tijdens de test) werd verkozen boven zuurstof-opname om de noodzaak voor het afvlakken van zuurstof-curves voorafgaandelijk aan de log-log transformatie te vermijden, gezien het feit dat de zuurstof-opname niet noodzakelijkerwijs strikt lineair stijgt. We schatten ook de power-output voor een vastgelegde [Laa] van 4 mmol/l, dikwijls de ‘onset of blood lactate accumulation’ (OBLA) genoemd. Tijdens elke individuele CPET werd een aangepaste lijn voor [Laa] visueel geïnspecteerd om de corresponderende power-output (dichtstbijzijnde 0,5 W) te vinden.

Staal-grootte

[…]

Statistiek

[…]

Resultaten

Individu-karakteristieken

[…] Leeftijd en lengte waren gelijkaardig voor de twee studie-groepen maar de patiënten hadden een hoger lichaamsgewicht en BMI dan de controles. Spirometrie vóór CPET lag binnen normale grenzen voor beide groepen en er waren geen aanwijzingen voor long-aandoeningen. De hemoglobine-concentratie was gelijkaardig tussen de groepen voor CPET1 en CPET2.

Piek-inspanning responsen

VO2peak lag significant lager bij de patiënten t.o.v. controles voor beide CPETs. De VO2peak bleek verder gedaald van CPET1 naar CPET2 bij de patiënten maar het verschil qua VO2peak tussen de CPETs verschilde niet significant voor de twee groepen. De maximum hartslag en ‘respiratory exchange rate’ [RER; verhouding tussen het volume afgegeven CO2 en het volume opgenomen O2 = ca. 0,8 bij rust; kan groter dan 1 worden bij intense inspanning; dit vertegenwoordigt een objectieve meting voor fysiologische inspanning] verschilde niet significant tussen de groepen of tussen de twee CPETs. De power-output bij piek inspanning (POpeak) lag significant lager bij de patiënten t.o.v. controles voor beide CPETs, ook wanneer de power-output per lichaamsgewicht (POkg) werd bekeken. Beide groepen vertoonden een significante verandering qua POpeak van CPET1 naar CPET2. Het verschil in POpeak tussen de twee CPETs was niet significant verschillend tussen de groepen.

Lactaat-concentraties bij ‘baseline’ en tijdens de testen

[Laa] in rust verschilde niet tussen patiënten en controles vóór CPET1 maar bleken significant verschillend vóór CPET2. [Laa] per power-output en POkg lagen significant hoger bij patiënten dan bij controles voor beide CPETs (Pinteraction < 0.001). Verder steeg het verschil in [Laa] per power-output en POkg tussen de groepen van CPET1 naar CPET2 (Pinteraction < 0.001). De [Laa] curve bij CPET2 was significant verschoven naar links bij de patiënten (P < 0.001) en naar rechts bij de controles (P < 0.001), vergeleken met de [Laa] curves bij CPET1.

Gas-uitwisseling drempel

De VO2 bij de gas-uitwisseling drempel (GET) lag significant lager bij de patiënten dan de controles voor beide CPETs. De VO2 bij GET was verder gedaald bij de patiënten van CPET1 naar CPET2, maar het verschil qua VO2 bij GET verschilde niet significant tussen de groepen. De power-output bij GET was significant lager bij de patiënten t.o.v. de controles voor beide CPETs en was verder verminderd bij CPET2. Het verschil qua power-output bij GET was significant verschillend tussen de groepen. De relatieve inspanning-intensiteit (%VO2peak) verschilde niet significant tussen de patiënten en de controles voor eender welke CPET. De [Laa] bij GET was niet significant verschillend tussen de groepen bij CPET1 maar was significant gedaald bij de controles bij CPET2, en het verschil qua [Laa] bij GET van CPET1 naar CPET2 was significant verschillend tussen de patiënten en de controles. Noch de ‘respiratory exchange rate’ of de hartslag bij GET verschilde significant tussen de groepen of de CPETs.

Het lactaat-omslagpunt en aanvang van bloed lactaat accumulatie

Het lactaat-‘turnpoint’ (LT) trad op bij een significant lagere power-output bij de patiënten voor beide CPETs maar geen van beide groepen vertoonde enig significant verschil qua power-output tussen de CPETs. De [Laa] bij LT was niet significant verschillend tussen de groepen bij CPET1 maar was significant gedaald bij de controles van CPET1 naar CPET2. Het verschil qua [Laa] bij LT tussen de CPETs was significant verschillend tussen de groepen. De aanvang van de of bloed lactaat accumulatie (OBLA) trap op bij een significant lagere power-output bij patiënten verleken met controles voor beide CPETs. De power-output bij OBLA verhoogde significant bij de controles en verlaagde significant in de patiënten van CPET1 naar CPET2, en het verschil qua power-output bij OBLA van CPET1 naar CPET2 was significant verschillend tussen de groepen.

Bespreking

Uit deze studie over herhaalde CPETs bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles, bleek VO2peak en VO2 bij GET significant gedaald bij de patiënten, maar niet bij de controles, van CPET1 naar CPET2, maar de verschillen qua VO2peak en VO2 bij GET tussen de CPETs verschilde niet significant tussen de twee studie-groepen. De patiënten hadden echter verhoogde [Laa] voor elke absolute power-output in vergelijking met de gezonde controles, en zowel GET & LT trad op bij een significant lagere VO2 en absolute power-output bij de patiënten. Beide studie-groepen vertoonden gelijkaardige relatieve inspanning-intensiteit (%VO2peak) bij GET voor beide CPETs. Wanneer we her-testten na 24 h, vertoonden de controles geen significante vermindering qua power-output bij GET maar de [Laa] bij GET was significant gedaald. In tegenstelling daarmee vertoonden de patiënten een significante daling qua power-output bij GET voor CPET2, terwijl er geen significante vermindering qua [Laa] bij GET bleek. De power-output bij OBLA toonde hetzelfde patroon, met een daling bij de patiënten en een stijging bij de controles van CPET1 naar CPET2. De pre-inspanning [Laa] was ook significant verschillend tussen de twee studie-groepen voor CPET2. Vermits voorafgaande inspanning (CPET1) leidde tot lagere [Laa] per absolute power-output (verschuiving van de curve naar rechts) tijdens CPET2 door controles, steeg de [Laa] per absolute power-output en verschoof de curve naar links tijdens CPET2 door patiënten.

Herhaalde metingen van variabelen bij een cardiopulmonaire inspanning test tonen over het algemeen een goede reproduceerbaarheid bij patiënten met een matige inspanning-stoornis te wijten aan chronische ziekte, en ze kunnen ook op een betrouwbare en reproduceerbare manier worden bepaald bij patiënten met ernstige inspanning-intolerantie. Hoewel onze patiënten een verminderd aktiviten-niveau vertoonden, vergeleken met hun capaciteit van voor hun ziekte, was er geen enkele bedlegerig of ernstig lichamelijk beperkt. Alle deelnemers hadden een normale hemoglobine-concentratie, normale spirometrie-waarden vóór de CPETs, alsook een normale tot hoge ademhaling-reserve bij piek inspanning. De hoeveelheid afgenomen bloed tijdens CPET1 liep op tot ca. 150-200 ml wat de daling qua hemoglobine-concentraties in rust tussen de twee CPETs kan verklaren. De gemiddelde ‘respiratory exchange ratio’ en maximum hartslag waren gelijkaardig voor beide groepen tijdens beide CPETs, en de bevindingen zijn daarom waarschijnlijk niet te verklaren door opzettelijke onder-prestatie of gebrek aan moeite. De groepen patiënten en gezonde controles waren gelijkaardig qua geslacht, leeftijd en lengte, maar de patiënten waren zwaarder dan de controles. We rapporteerden daarom de resultaten voor power-output ook per lichaamsgewicht, maar dit had geen invloed op de resultaten.

In tegenstelling tot wat anderen vonden, verschilde het vermogen om VO2peak te reproduceren niet significant tussen de twee studie-groepen. Hoewel VO2peak significant daalde bij de patiënten, was de absolute verandering – naar onze mening – te klein om enige majeure verandering qua inspanning-tolerantie aan te geven of PEM te verklaren. Bovendien dient de daling van de hemoglobine-concentratie in rust (0,7 g/dl) bij beide studie-groepen van CPET1 naar CPET2 in overweging te worden genomen. Als een gemiddelde, is een daling qua hemoglobine-concentratie van 1 g/dl verantwoordelijk voor een vermindering qua VO2peak van 0,97 ml/kg/min. In onze studie zou dit overéénkomen met een verwachte gemiddelde daling qua peak VO2 van 0,68 ml/kg/min van CPET1 naar CPET2.

Het test-protocol toonde wel degelijk verschillen aan qua [Laa] tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor beide CPETs, en dit verschil steeg bij CPET2. Ongetrainde individuen zullen snel hun vermogen om lactaat te verwijderen verbeteren als ze regelmatig hun uithouding trainen, waarbij ze zodoende de lactaat-concentraties in het bloed voor een bepaalde belasting verlagen. Een dergelijke verschuiving naar rechts op de lactaat-curve kan worden aangetoond vanaf 24 h na eerdere inspanning en past goed bij de bevindingen bij onze controle-groep tijdens CPET2. [Laa] per absolute power-output is verhoogd bij ongetrainde vergeleken met getrainde individuen, en kan het verschil in [Laa] tussen patiënten en controles tijdens CPET1 verklaren. Men zou echter ook bij de patiënten nog steeds een verschuiving naar rechts hebben verwacht tijdens de tweede dag; zoals werd gezien bij de controles.

GET trad op bij een gelijkaardige relatieve inspanning-intensiteit (gedefinieerd als % van VO2peak) voor elke CPET bij zowel patiënten als controles. Tijdens CPET1 hadden de patiënten een lagere power-output bij GET dan de controles maar [Laa] was gelijkaardig voor de groepen. Tijdens CPET2 vertoonden de patiënten een daling qua power-output bij GET maar gelijkaardige [Laa], terwijl controles een gelijkaaridge power-output bij GET hadden maar gedaalde [Laa]. Dit onvermogen om power-output bij GET te reproduceren lijkt een consistente bevinding bij patiënten met CVS/M.E. [VanNess JM et al. Postexertional malaise in women with Chronic Fatigue Syndrome. J. Women’s Health (2010) 19: 239-244 /// zie ook ‘inleiding’: Vermeulen RC et al., Snell CR et al., Keller BA et al.]. Als dit enkel door deconditionering zou worden veroorzaakt, zou men gelijkaardige resultaten verwachten bij andere aandoeningen waar deconditionering, lage inspanning-tolerantie en vermoeidheid prevalent zijn. Patiënten met sarcoïdose en Multipele Sclerosis zijn echter in staat hun power-output bij GET te reproduceren, ondanks hun lage inspanning-capaciteit.

LT trad op bij een lagere absolute power-output bij de patiënten t.o.v. controles. De power-output bij LT verschilde niet tussen de twee CPETs bij geen van beide groepen, in tegenstelling tot onze bevindingen wanneer we de ‘V-slope’ methode [zie hierboven] toepasten. Een verklaring zou kunnen zijn dat sommige patiënten waarschijnlijk hun LT bereikten tijdens onbelast pedaleren tijdens CPET2, waarbij we geen lactaat-metingen verrichten. Dit zou de berekende regressie-lijnen beïnvloeden. Niettemin vertoonde [Laa] hetzelfde patroon, met gelijkaardige [Laa] voor CPET1 en significante [Laa]-verschillen tussen de twee studie-groepen tijdens CPET2.

Er werd een verschuiving naar links op de lactaat-curve bij M.E./CVS-patiënten gesuggereerd door Lane RJ et al. [Lactate responses to exercise in Chronic Fatigue Syndrome. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (1994) 57: 662-663] maar daaropvolgende studies bleken niet overtuigend. Bijvoorbeeld: maximale inspanning testen bij gezonde individuen en M.E./CVS-patiënten (diagnose via Fukuda criteria) toonde geen abnormaliteiten qua maximale zuurstof-opname, lactaat-accumulatie of verschillen in LT (bepaald via de log-log methode), of in veneus lactaat vs VO2. Anderen vonden verhoogde lactaat-accumulatie bij submaximale inspanning bij patiënten met een diagnose volgens de CDC 1988 definitie [Riley MS et al. Aerobic work capacity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. BMJ (1990) 301: 953-956], alsook in een deel van de M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de eerder onspecifieke Oxford criteria, waar individuen met normale lactaat-concentraties meer waarschijnlijk leden aan psychiatrische co-morbiditeiten. Twee andere studies vonden geen verschillen qua rust of maximale lactaat-concentraties, maar wel significant lagere lactaat-concentraties bij patiënten na inspanning [Gibson HN et al. Exercise performance and fatiguability in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (1993) 56: 993-998]. De discrepanties kunnen worden verklaard door de verschillende diagnostische criteria en inspanning-protocollen. Naar ons weten zijn er geen studies over herhaalde inspanning testen met lactaat-profielen op twee opéénvolgende dagen bij M.E./CVS-patiënten die voldoen aan definities waarbij PEM een verplicht symptoom is.

LT lijkt overéén te komen met een beperking wat betreft de snelheid van de metabole ‘clearance’ waarbij het verschijnen van lactaat de lactaat-verwijdering overstijgt, ongeacht de training-toestand; en het opkomen van lactaat lijkt nauw verwant te zijn met %VO2peak. Bovendien zijn lactaat-concentraties in het bloed bij dezelfde relatieve intensiteit gelijkaardig bij getrainde en ongetrainde mensen. Training verhoogt de intramusculaire lactaat-opruiming voornamelijk door het verhogen van de oxidatie door upregulering van mitochondriale proteïnen, en reduceert de netto lactaat-produktie in spieren dankzij gefaciliteerde lactaat-uitwisseling van glycolytische en oxidatieve vezels. Patiënten en controles hadden gelijkaardige [Laa] bij gelijke relatieve inspanning-intensiteit tijdens CPET1, maar de controles hadden een daling qua [Laa] bij zowel relatieve en absolute intensiteit tijdens CPET2 die niet werd gezien bij de patiënten. We stellen voor dat de voorafgaande inspanning leidde tot een verbeterde lactaat-verwijdering bij de controles tijdens CPET2, aangezien hun [Laa] gedaald was bij rust, bij de gas-uitwisseling drempel en bij het lactaat-keerpunt, en aangezien de aanvang van bloed lactaat accumulatie op 4 mmol/l gebeurde aan een hogere absolute power-output.

Er werd een verstoord energie-metabolisme bij M.E./CVS aangetoond door meerdere onderzoekers. Myoblasten opgegroeid in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertonen verhoogde mitochondriale ademhaling en lactaat-sekretie [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van M.E./CVS-patiënten hebben een verstoorde maximale respiratie-capaciteit vergeleken met gezonde PBMCs, wat een onvermogen om de respiratie adequaat te verhogen in respons op verhoogde metabole stress suggereert [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017) 12: e0186802]. In vitro elektrische puls stimulatie van spiercellen als een model om metabole veranderingen tijdens inspanning te onderzoeken, heeft verstoorde AMPK-fosforylatie en glucose-opname getoond in cellen van M.E./CVS-patiënten, en verminderde afgifte van IL-6 vergeleken met gezonde spiercellen [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10: e0122982]. Inspanning leidt tot een voorbijgaande upregulering van pyruvaat-dehydrogenase-kinase (PDK), bijzonderlijk tijdens herstel, maar keert terug naar rust-waarden binnen 24 h. PBMCs van M.E./CVS-patiënten tonen ge-upreguleerde expressie van PDK [zie Fluge O et al. hierboven], wat een verstoorde PDK-regulering suggereert die de pyruvaat-flux kan beperken met het potentieel de ‘clearance’ van lactaat te beïnvloeden via oxidatie. M.E./CVS-patiënten hebben verhoogde lipopolysaccharide (LPS) waarden in het bloed vergeleken met gezonde controles [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30]. Inspanning leidt tot verhoogde bakteriële translocatie bij M.E./CVS-patiënten en dit wordt voorgesteld als een mogelijke oorzaak van PEM [Shukla SK et al. Changes in gut and plasma microbiome following exercise challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS ONE (2015) 10: e0145453]. LPS zou het metabolisme kunnen beïnvloeden, ofwel via inflammatie en/of gestegen catecholaminen. Meerdere aandoeningen bleken geassocieerd met verhoogd lactaat en gestegen lactaat zou een poging kunnen zijn om de effekten van letsel en stress te lenigen eerder dan deze te veroorzaken.

Deze studie werd uitgevoerd bij vrouwelijke patiënten met milde tot matige M.E./CVS. De diagnose van patiënten op basis van klinische criteria i.p.v. door een valide biomerker draagt het risico van het opnemen van een minder representatieve groep. Een dergelijke biomerker bestaat nu echter nog niet. Idealiter zou men patiënten en controles met een gelijkaardig aktiviteit-niveau alsook gelijkaardig lichaamsgewicht moeten hebben. De sterktes van onze studie hier zijn het feit dat de patiënten voldeden aan de Canadese criteria waarbij PEM een vereist symptoom is, en dat alle patiënten door dezelfde arts werden geëvalueerd voorafgaandelijk inclusie. Alle opgenomen deelnemers bereikten vooraf gedefinieerde test-criteria voor maximale inspanning testen en arterieel lactaat werd elke 30 seconden geanalyseerd. Alle testen werden door dezelfde staf gesuperviseerd, en de test-condities waren voor alle deelnemers dezelfde, inclusief het tijdstip van de dag, metabole toestand vóór de testen (vasten), en dat de meeste patiënten in het test-centrum bleven om bijkomende inspanning tussen de testen te vermijden. Er dient te worden opgemerkt dat de patiënten aanzienlijke symptoom-verergering ervaarden na de testen, die dikwijls weken duurde.

Inspanning-intolerantie, PEM en vertraagd herstel zijn prominente symptomen bij M.E./CVS. Intrigerend is dat deze studie aangeeft dat voorafgaande inspanning de lactaat-accumulatie verhoogt bij M.E./CVS in tegenstelling tot de vermindering die wordt gezien bij gezonde controles, hoewel het mechanisme hiervoor nog moet worden vestgesteld. We weten niet of deze bevinding wijst op een centraal pathofysiologisch mechanisme bij M.E./CVS of dat het een secundair fenomeen is. Het zou zelfs een poging kunnen zijn om de negatieve impact te verlichten die inspanning lijkt te hebben bij deze patiënten. Verdere research is nodig om de oorzaken van deze abnormale respons op inspanning op te helderen.

mei 10, 2019

Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 11:57 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel (gefinancierd door de ‘National Institutes of Health’, de ‘ME Association’ & de ‘Medical Research Council UK’) is gebaseerd op stalen die door patiënten aan de Britse M.E./CVS Biobank werden gedoneerd. De tekst spreekt voor zichzelf. Er komen verdere aanwijzingen naar boven voor een abnormaal energie-metabolisme bij M.E.(cvs).

————————-

Diagnostics Vol 9, #2, p. 41 (2019)

Evidence of clinical pathology abnormalities in People with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome from an analytic cross-sectional study

Luis Nacul (1), Barbara de Barros (1), Caroline C. Kingdon (1), Jacqueline M. Cliff (1), Taane G. Clark (1,2), Kathleen Mudie (1), Hazel M. Dockrell (1), Eliana M. Lacerda (1)

1 Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, WC1E 7HT, UK

2 Faculty of Epidemiology and Population Health, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London,WC1E 7HT, UK

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende ziekte met extreme vermoeidheid, post-exertionele malaise en andere symptomen. Door de afwezigheid van een diagnostische biomerker wordt de diagnose van M.E./CVS klinisch gesteld, hoewel laboratoriumtesten routinematig worden aangewend om alternatieve diagnoses uit te sluiten. In deze analytische ‘cross-sectionele’ studie hadden we tot doel potentiële haematologische en biochemische merkers voor M.E./CVS en ziekte-graad te exploreren. We deden een review van laboratorium-test resultaten van 272 mensen met M.E./CVS en 136 gezonde controles participerend in de Britse M.E./CVS Biobank [UKMEB]. Na correcties voor multipele vergelijkingen lagen de meeste resultaten binnen de normale waarden, maar mensen met ernstige M.E./CVS vertoonden lagere mediane waarden (p < 0.001) van serum creatine-kinase (CK; mediaan = 54 U/l), vergeleken met gezonde controles (HCs; mediaan = 101,5 U/l) en minder-ernstige M.E./CVS (mediaan = 84 U/l). De verschillen qua CK-concentraties hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd, body-mass-index, spiermassa, ziekte-duur en aktiviteit-niveau […]. Dit is het eerste rapport over het feit dat serum CK-concentraties uitgesproken gedaald zijn bij ernstige M.E./CVS en deze resultaten suggereren dat serum-CK verder onderzoek verdient als een biomerker voor ernstige M.E./CVS.

1. Inleiding

[…] Hoewel ontregeling van de zenuw-, immuun- en endocriene stelsels met verstoord cellulair energie-metabolisme en ionen-transport werd gesuggereerd, wordt de pathofysiologie van M.E./CVS nog niet helemaal begrepen, en er zijn geen biologische merkers die alom gebruikt worden voor de diagnose, subgroepering of prognose.

[…] Een belangrijke doelstelling van klinische research bij M.E./CVS is het verbeteren van de diagnose-stelling, en het vinden van klinische en laboratorium-testen die kunnen worden gebruikt als ziekte-merkers. In 2011 lanceerden we de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB) als een hulpmiddel om M.E./CVS-research te versnellen. Een rigoureuze beoordeling, naast uitgebreide klinische fenotypering van de deelnemers, is essentieel om te verzekeren dat M.E./CVS-diagnose accuraat is volgens erkende klinische criteria. De analyse van deze klinische gegevens in relatie met molekulaire merkers ondersteunt verder het beter begrijpen van de ziekte-etiologie en -pathofysiologie. In deze studie vergeleken we resultaten van ‘baseline’ laboratorium-testen van UKMEB-deelnemers met M.E./CVS, inclusief mild/matig en ernstig aangetasten (d.i. aan huis gebonden en bedlegerige) individuen, en gezonde controles […]

2. Materialen en methodes

Deze analytische ‘cross-sectionele’ studie [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] werd uitgevoerd als een subgroep van de UKMEB-deelnemers die toestemming. De recrutering – inclusief opname-criteria, gegevens- en staal-collectie, en behandeling van bio-stalen voor de UKMEB – werden elders in detail beschreven [The UK ME/CFS Biobank for biomedical research on Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) and Multiple Sclerosis. Open J. Bioresour. (2017) 4: 4]. Volwassen deelnemers met M.E./CVS die eerder de diagnose kregen via huisartsen en/of M.E./CVS-specialisten en gezonde controles werden gerecruteerd via de Britse ‘National Health Service’ (NHS). De inclusie-criteria voor de deelnemers met M.E./CVS omvatten het beantwoorden aan de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ criteria (CDC 1994) of Canadese Consensus Criteria, wat werd vastgesteld door de klinici van het research-team. Ervaren research-verpleegsters beoordeelden alle deelnemers en er werd bloed afgenomen voor onmiddellijke ‘baseline’ klinische laboratorium-testen, alsook voor research-doeleinden en bewaring op langere termijn. De bloedafnames vonden plaats in de participerende klinieken of bij de deelnemers thuis (voor de ernstig geïnvalideerden), en de stalen werden binnen 6 uur overgebracht voor verwerking en bewaring. Gegevens-input, transport van de stalen, voorbereiding, verwerking en opslag van de stalen gebeurde volgens ‘standard operating procedures’ (SOPs).

De ‘baseline’ laboratorium-testen werden in de eerste plaats gebruikt om deelnemers met M.E./CVS uit te sluiten waarvan de chronische vermoeidheid door andere aandoeningen zou kunnen worden verklaard. Deze testen omvatten: bloedcel-tellingen, erythrocyten-sedimentatie (ESR), serum vitamine-B12 en folaat; biochemische testen met inbegrip van elektrolyten, creatinine [afbraakprodukt van creatine-fosfaat in spierweefsel; creatine is een tussenprodukt bij de energie-voorziening van spier- en zenuw-cellen], ureum, serum creatine-kinase (CK), lever-funktie testen, C-reaktief proteïne, reumatoïde factor, schildklier-funktie testen; transglutaminase-antilichamen [geassocieerd met coeliakie, artritis, inflammatoire darm ziekte]; en urine-analyse (proteïne, glucose & bloed). CK iso-enzymen, voornamelijk aangemaakt in skeletspieren (CK-MM) en hartspier (CK-MB), en aldolase [enzyme van het glycolyse-pad] werden geanalyseerd in een subgroep met 50 patiënten (25 ernstige & 25 niet-ernstige) en 25 controles. De bloedstalen werden in laboratoria geanalyseerd naargelang de afstand van de plaats van afname; er werden standaard NHS laboratorium-protocollen gebruikt voor alle testen. Het personeel van de NHS [Brits ‘National Health System’] laboratoria was geblindeerd wat betreft de status van de studie-deelnemers.

Deze studie omvatte een staal van 272 bevestigde M.E./CVS-gevallen en 136 gezonde controles. De M.E./CVS-patiënten werden verder geklassificeerd als mild/matig (n = 216) of ernstig ziek (n = 56). Het vaststellen van de ziektegraad gebeurde bij de recrutering op basis van het feit of de patient hoodzakelijk aan huis gebonden of bedlegerig (ernstig) or ambulant (mild/matig) was. We inspecteerden visueel de vorm van de distrubutie van de continue variabelen en, wanneer afwijkingen van normaalwaarden werd vastgesteld, gebruikten we wiskundige bewerkingen om gegevens te bekomen die een normale distributie benaderden voor [statistische] regressie-analyse. […]

We voerden ook regressie-analyses uit met leeftijd bij recrutering, geslacht, body-mass-index, ziekteduur, spiermassa index (percentage van totaal lichaamsgewicht) en recente aktiviteit als co-variaten. De aktiviteit-niveaus werden opgemaakt uit antwoorden op specifieke vragen (op maat gemaakte vragenlijst): er werd de deelnemers gevraagd hun ervaren aktiviteit-niveau van de 7 dagen vóór de bloedafname te categoriseren, gaande van “helemaal niet aktief” tot “zeer aktief”. Voor enkele analyses werden de twee extreme aktiviteit-categorieën samengevoegd en had de gebruikte variabele drie resulterende categorieën. [uitleg over statistische verwerking]

[…]

3. Resultaten

[…] Het aantal vrouwen was hoger bij de patiënten, die gemiddeld minder aktief waren en een lagere spiermassa hadden. De milde gevallen hadden de hoogste ‘body-mass-index’ (BMI) vergeleken met de ernstige gevallen (laagste) en gezonde controles.

Er werden 19 biochemische en 10 haematologische testen uitgevoerd. Zoals verwacht waren er correlaties tussen veel van de test-resultaten […], inclusief tussen: (i) creatinine & ureum, en beide met CK […]; (ii) CK & aspartaat-aminotransferase (AST [ASAT of SGOT; enzyme van belang voor de diagnostiek en follow-up van lever-aandoeningen en van myocard-infarct]) […]; (iii) albumine & vrij-T4, totaal proteïne & globuline […]; (iv) C-reaktief proteïne (CRP) & erythrocyten-sedimentatie-snelheid […]; (v) monocyten met witte bloedcellen, lymfocyten en neutrofielen […]. […] De verdelingen van de analyten werden vergeleken tussen patiënten en controles, en tussen ernstige en niet-ernstige M.E./CVS-gevallen. ESR, bloedplaatjes en CRP waren verhoogd bij de patiënten, terwijl CK en ureum verlaagd waren […]. Vergeleken met de milde gevallen hadden die met ernstige ziekte gestegen albumine, vrij-T4 en serum-folaat, en lager CK, CRP, kalium, creatinine en bilirubine […].

De gedaalde CK-waarden waren hoofdzakelijk te wijten aan lage waarden qua CK-MM iso-enzyme (gemiddeld 44 U/l […]) bij de ernstige gevallen, vergeleken met 73 […] bij de milde/matige en bij gezonde controles (p = 0.03). De waarden van CK-MB en aldolase waren ook laagst bij de ernstige gevallen […]. De verhouding CK-MB/CK-totaal was het hoogst bij de ernstig aangetaste gevallen: 0,26 […], t.o.v. 0,20 […] bij de niet-ernstige en 0,14 […] voor de gezonde controles (p = 0.03); wat een bevestiging is van de belangrijke bijdrage van gereduceerd CK-MM aan de lage concentratie van totaal CK bij de patiënten, en bijzonderlijk de ernstige gevallen. Totaal CK correleerde zeer sterk met CK-MM […] in alle studie-groepen, maar er werden zwakkere correlaties gevonden tussen totaal CK en CK-MB ([…]. Dit wijst verder CK-MM aan als de voornaamste bepalend factor van de gedaalde concentraties totaal CK bij M.E./CVS.

Uit de multivariate logistische regressie bleek dat (ln) CK-waarden omgekeerd geassocieerd waren met het risico voor M.E./CVS […]. Als we focussen op ernstige gevallen (vs. controles) onthulde dezelfde analyse dat verhoogde risicos geassocieerd zijn met lager (ln) bilirubine […] en lager (ln) CK […], alsook met hoger albumine […] en T4 […]. Op dezelfde manier waren lagere waarden voor creatinine […], (ln) bilirubine […] en (ln) CK […] geassocieerd met verhoogd risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS. [ln = natuurlijk logaritme; wiskundige bewerking, hier voor statistische verwerking]

Consistent met het bovenstaande, waren gestegen albumine-waarden geassocieerd met een groter risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS […].

De verschillen qua CK waren het meest consistent; er waren uitgesproken verschillen tussen patiënten en gezonde controles, waarbij ernstige gevallen veel lagere waarden vertoonden dan milde/matige gevallen of gezonde controles. Bij het her-aanpassen van de verschillende uitkomst-modellen met ofwel ureum, creatinine, bilirubine, albumine, T4 en CK, of met CK alleen, konden we een schatting maken van de waarde van CK als een potentiële merker voor M.E./CVS. Uit de analyse van de ROC-curve [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] voor routine serum-CK bleek een beperkte rol ter onderscheiding van M.E./CVS-gevallen van gezonde controles (AUC = 67%) maar een potentiële rol bij het onderscheiden tussen ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten en deze met milde/matige M.E./CVS (AUC = 75%) en van gezonde controles (AUC = 84%). Een compleet model met CK, bilirubine, albumine, T4, creatinine en CRP verbeterde de voorspellingen, bijzonderlijk wanneer ernstige gevallen werden vergeleken met niet-ernstige en gezonde controles (AUC = 91%; verbetering door enkel CK p << 0.001), en een gereduceerd model met CK, bilirubine, albumine en T4 gaf gelijkaardige resultaten (AUC = 90%).

We vonden dat een ‘cut-off’ waarde van 51 U/l voor serum-CK hoge gevoeligheid voor beide M.E./CVS-groepen vertoonde vergeleken met controles (sensitiviteit = 96%) en voor ernstige M.E./CVS-patiënten vergeleken met milde/matige gevallen (sensitiviteit = 88,7%). Deze hebben echter een lage specificiteit (< 50%).

Gezien het sterk verband tussen aktiviteit-graad en deelnemer-categorie – patient of controle – onderzochten we verder de associatie tussen (ln) CK en deelnemer-categorie in drie verschillende klassen van aktiviteit-niveau: “niet zo erg aktief or eerder niet-aktief”, “noch aktief noch inaktief” en “eerder aktief of zeer aktief”. De resultaten tonen duidelijk trends tot lagere CK-waarden bij patiënten, bijzonderlijk wanneer de ernstig aangetasten worden vergeleken met gezonde controles. De hoogste significantie (p < 0.001) wordt gezien bij degenen die verklaarden dat ze inaktief waren.

4. Bespreking

Routine laboratorium-testen blijken gewoonlijk normaal bij M.E./CVS-patiënten, wanneer ze worden aangewend ter uitsluiting van andere ziekten die chronische vermoeid veroorzaken. Eén van die routine laboratorium-testen voor M.E./CVS is serum-CK, waarbij studies typisch rapporteren dat CK-resultaten binnen normale waarden liggen als ze al worden gerapporteerd. We vonden dat M.E./CVS-patiënten lagere CK-waarden hadden dan gezonde controles, en dat CK significant lager was bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. degenen die mild/matig zijn aangetast. De verbanden hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd-groep, BMI, spiermassa of recente fysieke aktiviteit (die allemaal het potentieel hebben om de CK-concentratie in het serum te beïnvloeden), alsook ziekteduur waar dit geschikt was (t.t.z. wanneer gevallen met verschillende ziekte-graad worden vergeleken). Creatinine en bilirubine bleken ook significant lager bij ernstig-aangetaste patiënten t.o.v. gevallen met milde/matige M.E./CVS, terwijl albumine hoger lag bij ernstige gevallen. Er was een trend naar hoge waarden qua CRP en ESR bij M.E./CVS, en bijzonderlijk bij mild/matig zieken. CK-waarden bleken goede voorspellers voor ernstige M.E./CVS vergeleken met de minder ernstig aangetasten of gezonde controles; dit werkt versterkt door het opnemen van de resultaten van andere laboratorium-testen in het model.

4.1.Het fysiologisch en klinisch belang van CK

CK is een sleutel enzyme betrokken bij energie-produktie en homeostase-processen, bijzonderlijk in weefsels met zeer dynamische en fluctuerende energie-vereisten waaraan snel dient te worden voldaan, zoals de hersenen, skeletspieren en het hart. Het is ook aanwezig in veel andere cellen, zoals immuun- en epitheliale cellen, waar het ook een cruciale rol speelt bij in energie-produktie.

Cellulaire energie wordt hoofdzakelijk gegenereerd via de afbraak van het hoog-energetische molekule adenosine-trifosfaat (ATP). Hoewel de complexe mechanismen voor cellulair energie evenwicht niet volledig worden begrepen, is er bewijs voor het feit dat spiercellen afhankelijk zijn van meerdere processen om de energie-beschikbaarheid te verhogen en complete energie-depletie te voorkomen door gebruik te maken van ATP-voorraden. CK speelt een cruciale rol bij deze processen: ten eerste door het aanleggen van efficiënte voorraden hoog-energetische fosfaten in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] voor snelle ATP-heraanvulling, het katalyseert de re-lokatie van γ-fosfaat van ATP naar creatine om fosfocreatine en adenosine-difosfaat (ADP) te genereren, in een omkeerbaar proces; en ten tweede is het betrokken bij de transfer van hoog-energetische fosfaten van de mitochondrieën naar het cytoplasma van de spiercellen, waar het wordt aangewend tijdens spier-contractie. Zodoende kunnen metingen van CK in serum de beschikbaarheid van cellulaire energie aangeven.

CK serum-concentraties worden alom gebruikt om een waaier aan spierziekten te diagnostiseren en monitoren wanneer hoge waarden klinisch relevant zijn. Het is geweten dat CK-waarden stijgen bij spierletsels en inflammatie, en ze kunnen ook hoger zijn bij hypothyroïde myopathie [veralgemeende spierpijn en spierzwakte door tekort aan schildklier-hormonen] en secundair aan behandelingen met statinen [cholesterol-syntheseremmers]; verhoogde waarden van CK in het serum kunnen worden gezien bij getrainde atleten en individuen na extreme inspanning. Er zijn drie types CK, de zgn. iso-enzymen: CK-MM (in spieren en verhoogd bij vele spierziekten), CK-MB (bijzonderlijk in de hartspier) en CK-BB (meestal gevonden in de hersenen maar gewoonlijk niet te detekteren in perifeer bloed). CK-MB werd alom gebruikt bij de diagnose van ischemisch hart [verminderde bloeddoorstroming naar de hartspier], hoewel het nu werd verdrongen door andere ziekte-merkers.

Lage CK-concentraties in het serum werden minder frequent gerapporteerd maar ze kunnen klinisch van betekenis zijn bij sommige reumatologische en bindweefsel-ziekten. De oorzaken en significantie van deze bevindingen is onduidelijk maar er werd gesuggereerd dat serum-CK omgekeerd verband kan houden met inflammatoire processen, en lage CK-waarden bleken geassocieerd met spierzwakte, onafhankelijk van spier-atrofie. Een studie bij patiënten met ernstig nier-falen meldde een significant verband tussen lager serum-CK en een verhoogd sterfte-risico, en suggereerde dat de serologische bevindingen zouden kunnen worden verklaard door de verspilde spiermassa en slechte voeding-status van de patiënten, maar er was geen verdere suggestie om serum-CK aan te wenden voor de diagnose of het management van deze aandoeningen. In studies over Huntington’s, een ernstige degeneratieve neurologische ziekte, werd gesuggereerd dat gedaalde hersen-energie het resultaat kan zijn van de gereduceerde aktiviteit van het CK-systeem, en dat verlies van CK-BB een belangrijke onherkende biomerker van deze ziekte kan zijn.

De lage concentraties serum-CK die wordt gevonden bij mensen met M.E./CVS suggereren een abnormaal energie-metabolisme, wat door afzonderlijke auteurs werd gerapporteerd [Vernon SD et al. Preliminary evidence of mitochondrial dysfunction associated with post-infective fatigue after acute infection with Epstein Barr virus. BMC Infect. Dis. (2006) 6: 15 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Med. Genet. (2017) 18: 29 /// Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017) 12: e0186802 /// Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 12: 371-379] en kan de inspanning-intolerantie verklaren die courant wordt gemeld door de patiënten, en daaropvolgende verminderde aktiviteit. Een alternatieve of bijkomende verklaring is dat het gedaald serum-CK, minstens gedeeltelijk, het resultaat zou zijn van lichamelijke inaktiviteit. Niettemin suggereert het consistent significant verband tussen lager serum-CK en ziektegraad in het multivariaat model – dat controleert voor aktiviteit – dat deze resultaten niet volledig kunnen worden verklaard door verminderde lichamelijke aktiviteit maar dat er andere factoren betrokken zijn. Om een mogelijke verstorende rol van het aktiviteit-niveau verder te verkennen, vergeleken we de mediane serum-waarden van CK in verschillende aktiviteit-categoriën. De waarden waren in alle klassen gedaald bij de ernstige gevallen. Niettemin is er nog een potentieel voor bijkomende verstoring en differentiële mis-klassificatie qua aktiviteit, met overschatting van de aktiviteit bij ernstige M.E./CVS, blijft een mogelijke verklaring (ten minste gedeeltelijk), voor het geobserveerde verschil qua CK-waarden. Met het stijgend aantal rapporten over een abnormaal energie-metabolisme bij mensen met M.E./CVS is verdere verkenning van deze associatie echter gerechtvaardigd.

Naast de intolerantie voor fysieke inspanning rapporteren M.E./CVS-patiënten gewoonlijk ook mentale vermoeidheid en ‘hersen-mist’, alsook subjectieve spierzwakte. Als we het belang van CK bij zowel het spier- als hersen-metabolisme in overweging nemen, kunnen de lage concentraties van dit enzyme, minstens gedeeltelijk, deze symptomen verklaren.

Sommige researchers hebben eerder melding gemaakt van intrigerende bevindingen aangaande serum-CK bij M.E./CVS-patiënten. Bijvoorbeeld: twee studies met 30 en 33 individuen vergeleken de CK serum-concentratie van M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de CDC-1994 criteria) met deze van gezonde controles vóór en na inspanning, om de fysieke capaciteit te evalueren [Riley MS et al. Aerobic work capacity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. BMJ (1990) 301: 953-956 /// Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93]. De gemiddelde CK bij M.E./CVS-patiënten lag lager (hoewel niet significant) dan bij controles, en steeg niet door inspanning bij degenen met M.E./CVS (zoals wordt gezien bij gezonde individuen). De resultaten suggereren dat tekort aan acute lichamelijke inspanning niet de voornaamste factor was die de CK-waarden bij M.E./CVS bepaalt. Een andere studie bij M.E./CVS-patiënten vond hoger serum-CK bij deelnemers met enterovirus-specifiek RNA (detektie via spierbioptie) dan degenen zonder bewijs voor enterovirale infekties. Die studie suggereerde dat een subgroep M.E./CVS-patiënten spierschade zou kunnen vertonen secundair aan enterovirus-infektie maar jammer genoeg specifieerden de auteurs de CK-concentraties in de groep patiënten met lagere waarden niet [Archard C et al. Postviral fatigue syndrome: persistence of enterovirus RNA in muscle and elevated creatine kinase. J. Royal Soc. Med. (1988) 81: 326-329].

Andere studies overwogen mogelijke verstoring van de mitochondriale funktie bij M.E./CVS, wat de geloofwaardigheid van metabole dysfunktie in het energie-systeem bekrachtigt, zoals onze bevindingen aangeven.

4.2. Andere studie-bevindingen

De creatinine-waarden bleken significant lager bij ernstige M.E./CVS. Creatine-fosfaat (CP) wordt omgezet naar creatinine in spieren en creatinine wordt uitgescheiden in de urine, dus is laag CP het resultaat van mindere omzetting van creatine naar CP door CK en dit zou de lage creatinine-waarden kunnen verklaren die worden gevonden bij ernstige M.E./CVS. Lage urine-concentratie van creatinine werd ook gerapporteerd [???] [Lidbury BA et al. Activin B is a novel biomarker for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME) diagnosis: A cross sectional study. J. Transl. Med. (2017) 15, 1-10].

We vonden ook dat ureum gedaald was en bloedplaatjes, CRP & ESR verhoogd bij M.E./CVS, hoewel dit niet significant bleek bij de multivariate analyse. Er werd een omgekeerd verband tussen bloedplaatjes en CK gevonden in één studie aangaande Reumatoïde Artritis, samen met verhogingen van inflammatoire klinische merkers zoals ESR & CRP. Bloedplaatjes hebben ook de neiging te stijgen bij inflammatoire processen. Niettemin brengt het patroon van inflammatoire merkers in onze studie er ons toe te speculeren dat een bepaalde graad van inflammatie gerelateerd kan zijn met symptomen bij mensen met milde/matige M.E./CVS. Voor mensen met een ernstige graad van de ziekte, lijkt het dat de inflammatoire respons geïnhibeerd kan zijn, ofwel omwille van een gebrek aan blijvende stimuli of verstoring van sommige aspecten van de inflammatoire respons, wat kan duiden op chronische ziekte met gevestigde complicaties. Het is echter belangrijk om op te merken dat de wijzigingen qua inflammatoire merkers relatief bescheiden waren, en verdere veronderstellingen dienen op gepaste manier te worden getest en bevestigd in andere groepen. We vonden lagere ureum-waarden bij milde/matige gevallen maar niet bij degenen die ernstig zijn aangetast. Dit zou verband kunnen houden met creatinine-waarden, die ook lager waren bij M.E./CVS t.o.v. controles; voor creatinine waren de laagste waarden echter te vinden bij de patiënten met ernstige M.E./CVS. Abnormaliteiten in de ureum-cyclus werden ook al gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamano E et al. Index Markers of Chronic Fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990 /// Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv. Clin. Chem. (2014) 66: 121-172]

Onze bevindingen aangaande verhoogd albumine en T4 zijn moeilijk te verklaren. Gestegen albumine suggereert dat malnutritie geen belangrijke factor is bij M.E./CVS. De lichtjes verhoogde T4 kan kleine veranderingen gerelateerd met het schildklier-hormoon metabolisme suggereren […] (zoals eerder gesuggereerd door Ruiz-Núñez B et al. Higher prevalence of “low T3 syndrome” in patients with Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Front. Endocrinol. (2018) 9, 1-13). Deze hypothese werd echter niet bevestigd door andere bevindingen, die gelijkaardige T3- en TSH-waarden tussen de groepen toonden; ook zijn bevindingen niet typisch voor ‘euthyroid sick syndrome’ [abnormaal T3 en/of T4 maar de schildklier lijkt niet dysfunktioneel]. Er werd in het verleden een hogere prevalentie van Gilbert’s syndroom [lever-aandoening met verstoorde verwerking van bilirubine (afbraakprodukt van haem)] bij M.E./CVS voorgesteld [Cleary KJ & White PD. Gilbert’s and chronic fatigue syndromes in men. Lancet (1993) 341: 842] maar dit werd in deze studie niet gevonden: er werden gelijkaardige bilirubine-waarden getoond voor patiënten en controles, en gedaalde bilirubine-waarden bij mensen met ernstige M.E./CVS vergeleken met niet-ernstige gevallen.

Er zullen verdere onderzoeken bij grotere groepen en meer gedetailleerde exploraties nodig zijn om te bevestigen of lage CK-aktiviteit een primaire of secundair gebeurtenis is bij M.E./CVS of dat het, inderdaad, één of andere metabole dysfunktie weerspiegelt. Dit zou voordeel kunnen halen uit ge gebruik van “zieke” controle-groepen, zoals bepaalde orthopedische patiënten met langdurige immobiliteit. Ondertussen suggereren we dat CK kan worden aangewend als een potentiële merker voor ernstige M.E./CVS. Het is belangrijk de klinische anamnese en bevindingen van lichamelijk onderzoek in acht te nemen, alsook aktiviteit-metingen (bv. accelerometer [toestel dat de versnelling van het lichaam meet]) op het tijdstip van de bloedafname voor serum-CK. Bovendien moet een ‘hoog-normaal’ resultaat bij mensen die dikwijls sedentair of bedlegerig zijn, bijzonderlijk individuen met ernstige M.E./CVS, omzichtig geïnterpreteerd worden, aangezien het de aanwezigheid van spierletsel kan aangeven.

4.3. Studie-sterktes en zwakheden

De studie onderzocht een groep mensen met goed-gekarakteriseerde M.E./CVS op basis van robuuste standaarden voor gegevens- en staal-collectie zoals beschreven in het ‘UK M.E./CVS Biobank’ protocol. In termen van M.E./CVS-onderzoek was dit een groot staal: er werden 272 M.E./CVS-patiënten getest, inclusief 56 die ernstig waren aangetast. De beoordeling van het aktiviteit-niveau geschiedde echter via zelf-rapportering. Indien dit leidde tot een over-schatting van de aktiviteit-graad bij sommige groepen, dan zou tot differentiële mis-klassificatie kunnen hebben geleid, bv. als de minder aktieve en ernstig-aangetastte M.E./CVS-gevallen hun aktiviteit hebben overschat.

Het opnemen van ernstig-aangetastte M.E./CVS-individuen, die typisch afwezig waren in de meeste eerdere studies, kan belangrijk zijn voor het aantonen van niet eerdere gerapporteerde abnormaliteiten. De hier voorgestelde resultaten komen voort uit routine laboratorium-testen bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Het doel van de bloed-testen was voornamelijk het uitsluiten van andere ziekten die zich zouden kunnen voordoen met gelijkaardige symptomen; het onderzoeken van spier-gerelateerde biochemische abnormaliteiten was niet in respons op een specifieke hypothese die werd opgemerkt wanneer alle resultaten werden getest voor ‘null’-hypotheses ([geen verband tussen 2 gemeten fenomenen] van geen groep-verschillen tussen de studie-groepen op basis van laboratorium-testen). Dit betekent dat we niet in staat zijn abnormaliteiten in spier/energie-metabolisme meer gedetailleerd te onderzoeken. Ons vermogen om bevindingen verder te onderzoeken (bv. door verbeterde metaboloom-studies en via bio-bank stalen van de groep, inclusief op andere tijdstippen), zal echter bevorderlijk zijn voor een verder begrijpen van de hier gerapporteerde veranderingen.

5. Besluiten

Dit is de eerste studie die significant lagere concentraties qua CK bij M.E./CVS-patiënten toont. Sommige indicaties voor lage CK-waarden lijken eerder over het hoofd te zijn gezien wanneer de trend naar lagere waarden werd afgedaan als niet significant en niet verder werd onderzocht. Een enkelvoudige meting van serum-CK heeft wellicht onvoldoende sensitiviteit en specificiteit om als een biomerker voor M.E./CVS-diagnose te worden gebruikt maar, indien aangewend naast andere klinische en laboratorium-merkers, zouden routinematige CK bloed-testen kunnen helpen om de diagnose van M.E./CVS accuraat te stellen, maar ook om patiënten onder te verdelen volgens ziektegraad. Het zou mogelijks ook kunnen worden aangewend als een prognostische merker, en als een uitkomst-meting voor observationele studies en klinische proeven, alsook in de klinische praktijk, in afwachting van verdere longitudinale studies die de correlatie van klinische en op lab-testen gebaseerde fenotypes onderzoeken. Of mensen met ernstige M.E./CVS die een laag CK vertonen een unieke subgroep vormen met afzonderlijke patronen qua biochemische/pathofysiologische abnormaliteiten en symptomen, of dat ze een andere fase of een extreem spectrum van de ziekte vertegenwoordigen, dient nog te worden opgehelderd.

Onze bevindingen bieden betekenisvolle ondersteuning voor het groeiend bewijs aangaande metabole abnormaliteiten bij M.E./CVS, en we suggereren voldoende grote studies om een diepgaander onderzoek van specifieke metabole mechanismen ter opheldering van het feit of CK een primaire of secundaire abnormaliteit is bij alle of een subgroep van M.E./CVS-patiënten. Dergelijke studies kunnen ook helpen om de oorzaken van dergelijke abnormaliteiten op te helderen. Het correleren van serum CK-concentraties met objectief gemeten aktiviteit en andere energie-metabolisme parameters kan leiden tot een beter begrip van de pathofysiologische abnormaliteiten betrokken bij spier-gebruik en -herstel, en hun verband met symptomen zoals post-exertionele malaise en vermoeidheid.

januari 12, 2019

Metabolomica-biomerkers voor M.E.(cvs) impliceren een redox-onevenwicht

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 9:40 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel kwam mede tot stand door financiering van de ‘National Institutes of Health’ en het ‘Solve ME/CFS Initiative’. Het onderzoek werd mede uitgevoerd door gerenommeerde M.E.(cvs)-onderzoekers. Maureen Hanson heeft overigens een zoon met de ziekte…

De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. De research hier bekeek deze problematiek gebruikmakend van een andere methodologie en de resultaten werden vergeleken met die van een paar andere groepen (in de tekst wordt dan ook veelvuldig verwezen naar Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 & Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480) en naar eerder werk van de eigen groep (Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9).

Het lijkt ons een zeer belangrijk artikel gebaseerd op degelijke wetenschap en waar een brede waaier aan metabolieten (mogelijke biomerkers) wordt bekeken. Ook al is het aantal onderzochte individuen niet ontzettend groot, toch werden enkele interessante bevindingen vastgesteld. Sommige van de biomerkers blijken weerom betrokken bij energie-produktie. Er werden ook vergelijkingen gemaakt met enkele andere ziekten en er blijkt weinig overlapping; d.w.z. M.E.(cvs) is anders dan die aandoeningen, de bevindingen lijken specifiek. Ook de gelijkenissen met resultaten van andere onderzoeksgroepen geeft het werk extra draagkracht; ook al betreft geen ‘echte replicatie’.

De researchers besluiten dat ze meer bewijsmateriaal aandragen voor een dysfunktioneel metabolisme bij M.E.(cvs), en meer bepaald een redox-onevenwicht. Bij redox (een samentrekking van reductie/oxidatie) -reakties verandert de oxidatie-toestand (lees: lading) van atomen. Er worden bij dit proces elektronen overgedragen/uitgewisseld. Eénvoudig gezegd: een atoom ondergaat ‘oxidatie’ (verliest elektronen), een ander ondergaat een ‘reductie’ (neemt elektronen op). In de tekst verwijst men naar de reeds veelvuldig vermelde oxidatieve stress bij ME.(cvs)…

————————-

Metabolites Vol 8, #4, p 90 (december 2018)

Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology

Arnaud Germain (1), David Ruppert (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

2 Department of Statistical Science and School of Operations Research and Information Engineering, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ziekte met een enigmatische oorsprong en zonder vastgestelde geneeswijze. De constellatie van symptomen ruïneert de levens van miljoenen mensen overal ter wereld. Er werd de laatste jaren een plethora aan hypothesen tevergeefs onderzocht: de biologische basis van deze invaliderende aandoening blijft een mysterie. In deze studie onderzochten we of er een verstoring is in de homeostase van metabole netwerken in het plasma van een groep met 32 vrouwelijke patiënten vergeleken met 19 gezonde vrouwelijke controles. Een uitgebreide analyse van de dataset met 832 metabolieten gegenereerd d.m.v. Metabolon®, (die 8 biologische klassen beslaat), leverde belangrijke inzichten op wat betreft metabole ontregelingen die voorkomen bij M.E./CVS. We rapporteren over 14 metabolieten die in verschillende hoeveelheden voorkomen, wat ons toelaat een theorie te ontwikkelen omtrent een omvangrijk redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten, dat consistent is met bevindingen van eerder werk op het gebied van M.E./CVS. Bovendien biedt de analyse informatie betreffende gelijkenissen tussen metabolieten-ontregelingen bij M.E./CVS en deze die voorkomen bij andere ziekten, terwijl de biomerker-analyse ervan toekomstige plasma-biomerkers voor M.E./CVS opleverden. Dit werk voegt belangrijke elementen toe aan de ontwikkeling van M.E./CVS-diagnostiek, een cruciale stap die nodig is voor het ontdekken van een behandeling.

1. Inleiding

[…] Hoewel gegevens die M.E./CVS-deficiënties beschrijven zich blijven opstapelen, is er nog steeds geen verklaring voor de vele symptomen van de ziekte.

We onderzochten de hypothese dat de homeostase van metabole netwerken bij M.E./CVS-patiënten is ontregeld in vergelijking met gezonde controles. Vele studies, o.a. door ons lab, hebben reeds gebruik gemaakt van de snel-evoluerende massa-spectrometrie voor de identificatie van metabolieten en hebben de samenstelling van metabolieten in het bloed bij meerdere afzonderlijke populaties bekeken. Er begint zich een consensus af te tekenen, waarbij gewijzigde mechanismen worden gemeld in verscheidene studies. Namelijk: meerdere studies hebben vastgesteld dat het metabolisme van lipiden, oxidatieve stress and energie relevant is bij M.E./CVS. Jammer genoeg werd niet één enkele of redelijk kleine set metabolieten bepaald als zijnde de basis metabole signatuur van deze aandoening. Niettemin werden statistisch significante verschillen qua plasma- of serum-metabolieten in meerdere groepen aangetoond, gebruikmakend van verscheidene metabolomica-instrumenten, door een reeks deskundige teams. Er werden ook verschillen tussen metabolieten-profielen van vrouwen en mannen met M.E./CVS gezien [Naviaux RK et al.].

In dit rapport werken we verder op 14 metabolieten die verschillend qua hoeveelheid bleken tussen onze vrouwelijke patiënten en gezonde controles, en connecteren deze bevinding met een groter beeld qua dysfunktie van metabole mechanismen. De in de kijker lopende mechanismen sturen ons begrip over de ziekte naar een effekt op redox-reakties, die een focus in verscheidene studies bleken [bv. Richards RS et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox. Rep. (2000) 5: 35-41 /// Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: acute infection and history of physical activity affect resting levels and response to exercise of plasma oxidant/antioxidant status and heat-shock proteins. J. Intern. Med. (2012) 272: 74-84 (zie ook ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’) /// Fenouillet E et al. Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients. J. Transl. Med. (2016) 14: 251]. We tonen aan dat we onze eigen studies kunnen kruis-valideren met gegevens van gepubliceerde rapporten van andere onderzoekers. Het is onze bedoeling dieper onderzoek naar metabolomica bij M.E./CVS te inspireren, met het ontwikkelen van diagnostische testen als doel.

2. Resultaten

2.1. Onderzoeksgroepen

De stalen in deze studie zijn een subset van de populatie die werd geselekteerd voor onze darm-microbioom analyse en een uitbreiding van de piloot-groep die werd gebruikt in onze eerste metabolieten-analyse [Germain A et al.]. Het betreft in het totaal 19 controles en 32 patiënten, allen vrouwen, gematcht voor leeftijd [mediaan controles & patiënten: 50 jaar] en ‘body-mass-index’ (BMI) [mediaan: controles 26,1 – patiënten 24,4]. Alle patiënten voldeden aan de 1994 Fukuda definitie voor M.E./CVS […].

De demografische gegevens waren gelijkaardig met deze van de datasets van Naviaux et al. en Germain et al. wat betreft leeftijd en BMI. De populatie van Armstrong et al. was 15 jaar jonger (geen info over BMI).

2.2. Metabolieten-gegevens en statistische verwerking

Het Metabolon® platform liet de identificatie en meting toe van in het totaal 832 metabolieten […]. De metabolieten-klassen waren: aminozuren (177), koolhydraten (26), co-factoren & vitaminen (28), energie (10), lipiden (353), nucleotiden (29), peptiden (33) en xenobiotica (176). Deze acht super-mechanismen, zoals door Metabolon® gedefinieerd, kunnen verder worden onderverdeeld in 83 sub-mechanismen. […] Hoewel de namen van de meeste super-mechanismen duidelijk zijn, is het relevant om op te merken dat de categorie xenobiotica wordt gevormd door metabolieten behorend tot de volgende sub-mechanismen: benzoaat-metabolisme (11%), chemische stoffen (14%), medicijnen (40%), voeding-componenten/plantaardig (24%), tabak-metabolisme (2%) en xanthine-metabolisme (9%).

[…]

[…] Metabolon® super-mechanismen worden door Metabolon® gedefinieerd volgens uitgebreide ‘review’ van de literatuur maar uiteindelijk ‘in house’, aangezien er vanzelfsprekend meerdere mechanismen zijn waar een molekule kan worden gecategoriseerd. Super-mechanismen zijn het resultaat van een groepering van sub-mechanismen volgens hun belangrijkste kenmerk […]. Sub-mechanismen zijn het resultaat van de klassificatie van metabolieten in de voornaamste metabole mechanismen waartoe ze behoren, zoals overééngekomen bij metabolomica-normen. […]

Statistische verwerking vond 60 metabolieten (7% van de metabolieten-netwerken) met significante verschillen (p < 0.05). […] 50% van deze 60 behoren tot de lipiden-categorie en 15% tot de aminozuren-categorie.

Er werd een correctie uitgevoerd op de p-waarden om te controleren voor ‘false discovery rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]). […] Toegepast op elke biologische klasse metabolieten volgens Metabolon®’s nomenclatuur, kwamen we uit op 9 significant verschillende metabolieten (controles vs. patiënten) [zie hieronder].

2.3. Metabolieten die meest aangetast zijn bij M.E./CVS behoren tot 4 klassen

De 9 metabolieten die hieronder worden besproken, behoren tot de volgende 4 super-mechanismen: co-factoren & vitaminen, energie, nucleotiden en peptiden. […].

Vier van deze metabolieten worden geklassificeerd bij co-factoren & vitaminen. Haem, het pigment dat bloed z’n rode kleur geeft, is één van de meest statistisch verschillende metabolieten, dat veel meer voorkomt bij patiënten t.o.v. controles. Haem bestaat uit een ijzer-ion in het centrum van een grote organische ring en wordt vooral in haemoglobine gevonden, maar ook in enkele andere haemoproteïnen, met wisselende funkties die allemaal verband houden met redox-chemie. Vrij haem is zeer cytotoxisch en schadelijk voor weefsels door z’n pro-oxidatieve en pro-inflammatoire eigenschappen, aangezien het in staat is de vorming van vrije radikalen te katalyseren.

De andere drie metabolieten zijn onderdeel van het vitamine-E mechanisme en waren significant lager bij de patiënten. Vitamine-E [tocoferol] is een vet-oplosbaar anti-oxidant dat de verspreiding van reaktieve zuurstof-soorten door lipiden-membranen te belemmeren. Gamma-CEHC [carboxyethyl-hydrochroman] is de geoxideerde vorm van gamma-tocoferol uit de voeding en is anti-inflammatoir, de andere twee zijn glucuronide-conjugaten van alfa-CEHC en gamma-CEHC, allebei significant circulerend in het bloed.

Een andere metaboliet van belang is alfa-ketoglutaraat, één van de tien energie-metabolieten waar we gegevens over hebben in deze studie. Onze gegevens geven aan dat het hoger is bij de patiënten. Alfa-ketoglutaraat is een essentiële biologische molekule die wordt gevonden in veel biologische mechanismen, verbonden met het aminozuren-metabolisme en onderdeel van de TCA-cyclus, die zich afspeelt in de mitochondrieën, waar chemische energie wordt geproduceerd door de oxidatie van pyruvaat.

De volgende drie metabolieten behoren tot de klasse nucleotiden en komen alle drie minder voor bij patiënten vergeleken met controles. Er is niet veel geweten over 2’-O-methylcytidine, buiten het feit dat het onderdeel is van het pyrimidine-metabolisme. Aan de ander kant zijn adenosine-3’,5’-cyclisch monofosfaat (cAMP) en inosine-5’-monofosfaat (IMP) een deel van het purine-metabolisme, en beide geassocieerd met ATP/AMP, respectievelijk, en zijn zodoende gelinkt met het energie-metabolisme. Hoewel over de funktie van IMP in het bloed nog wordt gediscussieerd, staat cAMP bekend als een a centrale intracellulaire regulator die hormonale mechanismen beïnvloedt.

Ten slotte werd gamma-glutamyl-threonine, een dipeptide [2 aminozuren] uit de klasse peptiden, waarvan significant hogere bloed-waarden werden gedetekteerd bij de patiënten. Afgezien van het feit dat deze molekule een intermediair afbraak-produkt van proteïnen is, is weinig bekend aangaande z’n fysiologisch effekt in het bloed. Het wordt echter geciteerd in een patent als een potentiële biomerker voor lever-toxiciteit.

2.4. De MetaboAnalyst statistische analyse biedt bijkomend waardevol inzicht in de dataset

Dit instrument […] brengt enige biologische significantie in de statistische analyse. Een totaal van 7 metabolieten sprong er boven uit […], twee overlappen met de statistisch significante metabolieten hierboven beschreven: haem en IMP.

Alle andere hiermee geïdentificeerde metabolieten kwamen meer voor bij patiënten dan controles. Deze omvatten tauroursodeoxycholaat (TUDCA; zowel een cytoprotectief agens als een chemisch chaperone [molekule die helpt bij het vouwen of ontvouwen en het op- of afbouwen van macromolekulaire strukturen (proteïnen/DNA)]), 3-hydroxybutyrylcarnitine-1 & 3-hydroxybutyraat (BHBA; allebei betrokken bij ketose [verhoogde concentratie ketonen, veroorzaakt door afbraak van vetzuren], een metabool proces geassocieerd met energie en glucose), piperine (een alkaloïd dat wordt gevonden in kruiden en specerijen) en histamine (een molekule waarvan de betrokkenheid bij veel aspecten in het menselijke lichaam is gekend, inclusief lokale immuun-responsen, een werking als centrale neurotransmitter en een vasodilator).

2.5. De MetaboAnalyst aanrijking-analyse biedt ovetuigende met ziekte geassocieerde plasma metaboliten-sets

Het aanrijking-analyse instrument laat vergelijking toe tussen een te onderzoeken metabolieten-dataset […] en gekende, met ziekte geassocieerde metabolieten-sets. […] Hoewel dit instrument metabolieten identificeert die op de zelfde manier variëren als bij andere ziekten [o.a. obesitas, hart-falen, diabetes-ketoacidose, anoxie, …], is het niet de intentie dit te gebruiken om te impliceren dat alle metabolieten-veranderingen bij M.E./CVS identiek zijn met deze die voorkomen bij bepaalde andere ziekten.

[…] Eén van de intrigerende patronen is dat bij 4 van de 10 beschreven ziekten (40%), een dehydrogenase-, oxidase- of transferase-deficiëntie betrokken is. Die zijn allen mogelijks gelinkt met enig onevenwicht in de redox-toestand aangezien het zeer onwaarschijnlijk is dat ze het resultaat zijn van gen-mutaties in de verscheidene aangetaste mechanismen.

Omdat de statistische betrouwbaarheid van deze module na correctie slecht is […], voerden we dezelfde analyse uit op gepubliceerde datasets, inclusief ons eerder werk, waar een dergelijk instrument nog niet werd gebruikt. Dergelijke navorsingen gaven gelijkaardige resultaten maar met een grotere statistische ‘power’ voor sommige. We namen enkel de ziekten op waar minstens de helft van de metabolieten-veranderingen geassocieerd waren met het patient-fenotype, aangezien het instrument ook resultaten oplevert betreffende wijzigingen die enkel pertinent zijn voor de verschillen qua controle metaboliet-waarden. We hebben opzettelijk gekozen de afzonderlijke metabolieten die door deze module worden gebruikt niet te bespreken (aangezien het niet onze intentie is M.E./CVS te linken met deze ziekten) maar in plaats daarvan mogelijke trends wat ziekte-associatie te bekijken. We bespreken de mogelijke links tussen M.E./CVS-symptomen en gekende fysiologische dysfunkties hieronder.

Van de 10 metabolieten-sets van de Metabolon® dataset, waren er 6 aanwezig bij Armstrong et al. of Germain et al. Dit toont een sterke gemeenschappelijkheid, een kenmerk dat we verder zullen verkennen in 2.7.

Ons eerder werk geeft overvloedige voorbeelden van dehydrogenase-, carboxylase-, hydrolase- & transferase-aktiviteit deficiënties, enkele spier-gerelateerde aandoeningen door varianten van carnitine-deficiënties, en enkele suiker-gerelateerde onevenwichten. De Armstrong et al. dataset levert ook talrijke dehydrogenase- & carboxylase-defekten op. Globaal overheersen dehydrogenase-, transferase- & oxidase-deficiënties, en een dergelijk patroon leidt tot onze suggestie dat een algemeen onevenwicht een dergelijk type reakties belemmert.

Een opvallende aandoening die werd gevonden in de dataset-analyse is anoxie (samen met asfyxie [zuurstof-tekort/verstikking]), een extreme vorm van hypoxie, wanneer het lichaam (of een gebied) over extreem weinig zuurstof beschikt. Bij een gezonde persoon die lijdt onder hypoxie, treedt vermoeidheid, verwarring, hoofdpijn en dof gevoel in de ledematen op, allemaal symptomen die optreden bij M.E./CVS-patiënten. De zuurstof-status van weefsels kan mogelijks aangetast worden door de ontwrichting van de hoeveelheid haem die we beschreven. Gedaalde cerebrale bloeddoorstroming, die kan resulteren in inadequate brein-oxygenatie, is een hypothese gelinkt met de cognitieve stoornissen bij M.E./CVS-patiënten [Biswal B et al. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J. Neurol. Sci. (2011) 301: 9-11 /// Staud R et al. Task related cerebral blood flow changes of patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin labeling study. Fatigue (2018) 6: 63-79].

Veel ziekten gerelateerd met ketose keren ook terug in de analyse en zijn het gevolg van een overmatige toename van ketonen in het bloed, een proces dat hierboven werd vernoemd bij het bespreken van 3-hydroxybutyraat (BHBA) en 3-hydroxybutyrylcarnitine-1. Bv.: diabetes-ketoacidose resulteert uit een onvermogen om koolhydraten te gebruiken voor energie-voorziening, leidend tot metabolisme van vetten en zodoende enige verstoring van het gebruik van koolhydraten bij M.E./CVS.

Ten slotte: persistente hyperinsulinemische [te veel insuline in het bloed] hypoglycemie bij kinderen (PHHI) was een andere ziekte die werd gevonden in twee datasets en die mogelijks kan worden gelinkt met hersen-aktiviteit. Andere ziekten die het vermelden waard zijn met betrekking tot hersen-funktie betreffen correlaties met metabolieten die worden gevonden bij schizofrenie, toevallen en epilepsie, alsook meerdere syndromen waarbij de gezondheid van de ogen betrokken is. In het bijzonder: een courant symptoom bij M.E./CVS-patiënten is de extreme gevoeligheid voor licht.

2.6. De MetaboAnalyst biomerker-analyse levert toekomstige (plasma)biomerkers op voor M.E./CVS

Het ‘machine-learning’ attribuut dat wordt gebruikt om het diagnostisch vermogen te illustreren is de ‘receiver operating characteristic’ curve (ROC-curve), die echt-positieven en vals-positiven integreert. De resulterende grafiek laat de berekening toe van een ‘area under the curve’ (AUC): hogere waarden wijzen op een hogere waarschijnlijkheid van accurate klassificatie van een staal.

De hoogste voorspellende waarden werden bereikt met pyroglutamine [metaboliet in de glutathion-cyclus] en haem: AUCs van 0.75.

Globaal waren er 24 metabolieten met een AUC boven 0.70 [AUC (maat voor diagnostische accuraatheid = 1 betekent perfekt; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] (inclusief haem, tauroursodeoxycholaat, gamma-CEHC, gamma-CEHC-glucuronide, IMP, alfa-ketoglutaraat, terwijl veel van de andere molekulen lipiden zijn).

2.7. Analyse geeft aan dat bijna 100% van de kruis-geïdentificeerde metabolieten een gelijkaardig statistisch gedrag vertoont tussen studies

De toepassing van metabolomica op M.E./CVS-stalen staat nog in z’n kinderschoenen: er zijn nog maar enkele studies gepubliceerd. Om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen research-teams, met afzonderlijke populaties en metabolieten-identificatie technologieën, te beoordelen, besloten we paarsgewijze vergelijkingen uit te voeren. Er dient te worden opgemerkt dat als de ziekte geen effekt vertoont in elk van de twee studies, dat onze test dan niet-significant zal zijn.

De eerste vergelijking was deze tussen onze Metabolon® dataset en Germain et al., die een kleinere maar gedeeltelijk overlappende populatie op een verschillende massa-spectrometrie platform gebruikte. De vergelijking betrof 149 metabolieten met dezelfde HMDB [‘Human Metabolome Database’] -identiteit. De hypothese die werd getest was dat het gemiddeld verschil […] tussen controles en patiënten dezelfde is voor beide studies. Geen van de gevonden metabolieten-patronen bleek te verschillen tussen de twee studies.

We gingen dan over tot het vergelijken van de volledige Metabolon® dataset met alle gegevens van Germain et al. In dit geval bleken 145 van de 149 metabolieten zich anders te gedragen […] op 4 uitzonderingen na: dihydrothymine [intermediair in het metabolisme van het nucleotide thymine], taurine [zwavel-bevattend organisch zuur met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie; bleek al van belang voor de differentiatie tussen FM en controles], spermidine [inhibeert stikstofoxide-synthase] en acetylcarnosine [anti-oxidant], die allen significant verschillend bleken tussen controles en patiënten bij Germain et al.

De volgende vergelijking betrof de volledige Metabolon® dataset en de vrouwen-dataset van Naviaux et al. Van de 154 metabolieten met dezelfde HMDB-identiteiten bleken er slechts twee, adenosine en flavine-adenine-dinucleotide (FAD), statistisch verschillend tussen de twee studies. Dit verschil kan te wijten zijn aan de afname-methode van het plasma (EDTA voor onze stalen, lithium-heparine bij Naviaux et al.).

Een andere vergelijking was een dataset van Armstrong et al. en de volledige Metabolon® dataset. Alhoewel slechts 26 metabolieten gemeenschappelijke HMDB-IDs hadden, gedroegen er zich 14 statistisch op dezelfde manier.

De uiteindelijke combinaties omvatten Germain et al. & Armstrong et al., Germain et al. & Naviaux et al., en Armstrong et al. & Naviaux et al.; en de resultaten waren zeer gelijkaardig: respectievelijk 87%, 98% en 91% van de metabolieten die zich statistisch niet verschillend gedroegen.

Belangrijk is het terugkerend verschijnen van hypoxanthine [afgeleide van purinen, bouwstenen van nucleïnezuren], een metaboliet dat significant verschillende bleek tussen de studies, samen met enkele andere metabolieten, altijd bij vergelijkingen met de Armstrong et al. dataset. Het is belangrijk om op te merken dat de Armstrong dataset werd verkregen via analyse van serum i.p.v. plasma (wat werd gebruikt bij alle andere studies). Alhoewel plasma en serum onderdelen van totaal bloed zijn, werden significante verschillen qua metabolieten-profielen aangetoond.

2.8. Hiërarchische clustering levert geen definitieve subgroep-identificatie op

Eén van de hypotheses betreffende M.E./CVS is dat verschillende fundamentele ontwrichtingen optreden in verschillende groepen patiënten die dezelfde invaliderende symptomen blijken te vertonen. De aanwezigheid van patiënten-subsets kan verklaren waarom statistische significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten als groep en een groep gezonde individuen soms niet worden gezien. Het bestaan van subgroepen patiënten-types werd ook gesuggereerd ter verklaring van het feit waarom tegenstrijdigheid tussen studies wordt vastgesteld voor sommige metingen en waarom de responsen op behandeling verschillen tussen patiënten-populaties.

Er werd een ‘clustering’-analyse op de Metabolon® dataset uitgevoerd in een poging om potentiële onderscheidende metabole signaturen binnen de patiënten-populaties te identificeren. Er werd geen significant resultaat gevonden: noch bij gebruik van de volledige set metabolieten, noch bij de individuele super-mechanismen. Hetzelfde besluit werd bereikt wanneer de analyse geïmplementeerd werd op de controle-groep (gegevens niet getoond).

Er werd een identieke ‘clustering’-analyse uitgevoerd op elk van de andere drie beschikbare datasets, voor dewelke geen super-mechanisme klassificatie beschikbaar was. Bij gebruik van enkel de patiënten van Germain et al., lagen de p-waarden tussen 0.940 en 0.954 (mediaan 0.946). Voor de Naviaux et al. dataset lagen de p-waarden tussen 0.990 en 0.998 (mediaan 0.992). Voor Armstrong et al. lagen de p-waarden tussen 0.008 en 0.032 (mediaan 0.020), wat maakte dat dit de enige dataset was waar subgroepering evident was. Om deze bevinding verder te onderzoeken, werd hiërarchische ‘clustering’ toegepast op de Armstrong at al. dataset […]. We zagen slechts twee individuen die zich ietwat onderscheiden van de rest; […] er was slechts zwak bewijs voor subgroepering. […]

3. Bespreking

De grootte van de populatie van deze studie is vergelijkbaar met gepubliceerd werk zoals door Naviaux et al. & Armstrong et al., en is een uitbreiding van de groep die we gebruikten voor onze eerdere poging. Bovendien is het substantieel aantal gekwantificeerde metabolieten (832) opmerkelijk groter dan de 420 molekulen van Naviaux et al., de 361 van Germain et al. of de 29 van Armstrong et al. Ongetwijfeld werd de statistische ‘power’ van onze analyse verzwakt door de combinatie van een populatie van 51 individuen en een reeks van 832 metabolieten, wat het beperkt aantal metabolieten verklaart die we als significant verschillend kunnen bestempelen […]. Niettemin werpen onze bevindingen, door de uitgebreide analyse van onze dataset, een licht op een intrigerend aspect van het dysfunktioneel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten, met betrekking tot de redox-toestand.

Van de vier verstoorde biologische klassen in onze groep, bevatten de categorieën ‘nucleotiden’ en ‘peptiden’ metabolieten die potentieel brede repercussies hebben op biologische funkties. Bv.: cAMP en IMP zijn molekulen waarvan is geweten dat ze betrokken zijn bij veel aspecten van het funktioneren van het menselijk lichaam, zoals purine-metabolisme, opslag van chemische energie in spieren en intracellulaire signaal-overdracht. Het is daarom ontzettend moeilijk een uniek mechanisme gelinkt met M.E./CVS-toestand of -symptomen op basis van dergelijke molekulen of, anderzijds, molekulen waarvan weinig of niets is geweten (zoals 2’-O-methylcytidine of gamma-glutamylthreonine) aan te wijzen. Deze laatste molekule wordt echter in een patent genoemd als potentieel belangrijke molekule (onder andere biomerkers) ter bepaling van lever-toxiciteit. De resultaten van ons eerder werk focusten op biomerkers voor lever-letsel.

Een ander zeer belangrijk metaboliet is alfa-ketoglutaraat omdat het deel uitmaakt van het ‘energie’ super-mechanisme en de TCA cyclus. Inderdaad: de Krebs-cyclus is een mechanisme dat consistent aan de oppervlakte komt bij M.E./CVS-metabolomica analyse. Omdat vermoeidheid een belangrijk uitputtend symptoom van deze ziekte is, werd lang gespeculeerd dat het energie-metabolisme van de patiënten dysfunktioneel is. Verscheidene studies wijzen op een directe manier naar een abnormaal energie-metabolisme te wijten aan falende TCA- en ureum-cycli of indirect via een vermoedelijke stoornis van pyruvaat-dehydrogenase [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Een piloot-studie met een gepatenteerd voedingsupplement waarvan wordt gesteld dat het de aktiviteit van dit enzyme – en bijgevolg de Krebs-cyclus – aanwakkert, beschrijft substantiële verbeteringen van de gezondheid en conditie van behandelde patiënten [Comhaire F. A novel nutriceutical treatment of Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”. Intern. Med. (2017) 7: 5 (zie ook ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’)]. Niettemin is alfa-ketoglutaraat betrokken bij talrijke metabole mechanismen (zoals het carnitine-metabolisme, lysine-metabolisme en dat van de vertakte aminozuren, om er enkele te noemen), zodat een focus op één enkel mechanisme als basis voor de invaliderende symptomen van M.E./CVS tot nu toe niet gerechtvaardigd is.

De categorie ‘co-factoren en vitaminen’ omvat metabolieten met ongelijksoortige eigenschappen, zoals geïllustreerd door haem & gamma-CEHC. In onze groep werden hogere waarden van haem, onderdeel van het haemoglobine- en porfyrine-metabolisme, en lagere waarden van gamma-CEHC, onderdeel van het tocoferol-metabolisme, gemeten bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Haem is een vitale component van vele metalloproteïnen (met haemoglobine als best bekende) en wordt gesynthetiseerd in de lever en het beenmerg. Aangezien de staal-voorbereiding bij Metabolon® op methanol is gebaseerd, wordt precipitatie van proteïnen verwacht maar aan proteïnen gebonden haem kan dan nog worden afgegeven […]. Omdat we plasma (cel-vrij) gebruikten, wordt er een grotere bijdrage van ‘vrij haem’ aan de meting van de hoeveelheid haem geanticipeerd, tenzij er substantiële haemolyse [kapotgaan van rode bloedcellen waardoor haemoglobine in het bloed terecht komt] optrad. Een hoge concentratie vrij haem in het plasma is een biomerker voor de ernst van sikkelcel-ziekte [rode bloedcellen hebben een abnormale vorm door abnormaal haemoglobine], waarbij gestegen waarden qua inflammatoire biomerkers zoals lactaat-dehydrogenase, bilirubine, een hoog aantal reticulocyten [voorlopers van rode bloedcellen] en lipiden worden gedetekteerd. We bepaalden drie vormen van bilirubine en biliverdine [afbraakprodukten van haemoglobine] in onze stalen die ook meer aanwezig bleken bij patiënten vs. controles; wat wijst op een algemene verstoring van het haem-afbraak mechanisme, waarvan de laatste stap in de lever gebeurt. Alle vijf molekulen hebben sterk nadelige effekten die verbonden zijn met het genereren van vrije radikalen en er wordt beweerd dat hun afbraak onderdeel is van een cel-beschermende feedback in respons op oxidatieve stress. In tegenstelling daarmee zijn gamma-CEHC, samen met gamma-CEHC-glucuronide en alfa-CEHC-glucuronide (metabolieten van het vitamine-E mechanisme), dat anti-inflammatoire kenmerken heeft (zoals een werking als lipofiel anti-oxidant). Ons eerder werk [piloot-studie; zie ref. in onze inleiding] suggereerde ook een ontwrichting van het vitamine-E metabolisme ten gevolge de detektie van [z’n metaboliet] 13’-carboxy-alfa-tocoferol, wat jammer genoeg niet aanwezig is in deze dataset.

Veel M.E./CVS-patiënten rapporteren zelf dat gespecialiseerde diëten en supplementen hun symptomen verlichten. Dergelijk gedrag is wijdverspreid in patiënten-gemeenschappen van veel ziekten, inclusief M.E./CVS, fibromyalgie en kanker (om er maar enkele te noemen) [bv. Craig C. Mitoprotective dietary approaches for Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome: Caloric restriction, fasting and ketogenic diets. Med. Hypotheses. (2015) 85: 690-693 /// Lopez-Rodriguez MM et al. Patterns of food avoidance and eating behavior in women with fibromyalgia. Endocrinol. Diab. Nutr. (2017) 64: 480-490]. Gezien de exclusie van voorgeschreven farmaceutica, kunnen dergelijke voeding-benaderingen worden gedefinieerd als voeding-restricties of geassocieerd met specifieke supplementen waarvan wordt gedacht dat ze voordelige effekten tegen inflammatie, cardiovasculaire problemen of veroudering opleveren. Er werd door andere patiënten gerapporteerd dat het diëten om een mogelijke tarwe-gevoeligheid bij sommigen te verbeteren of ketogene dieten en vasten, nuttig zijn. Veel patiënten beschouwen enkele supplementen (inclusief NADH, coenzyme-Q10 of polyfenolen) nuttig, hoewel systematisch beoordeling van studie-uitkomsten geen aanleiding geeft tot duidelijke aanbevelingen. Een gemeenschappelijk iets in al het geciteerde werk aangaande voeding bij M.E./CVS kan echter worden gevonden in het redox-metabolisme. Het is duidelijk dat ons huidig werk en andere rapporteren suggereren dat nutritionele veranderingen van nut kunnen zijn voor patiënten, hoewel verder onderzoek nodig is vooraleer aanbevelingen kunnen worden gemaakt.

Een ambitieus doel wat betreft de toepassing van ongerichte metabolomica op M.E./CVS-stalen is het peilen naar een patroon dat ons beperkt begrip van deze ziekte kan uitbreiden. De aanrijking-analyse ‘unit’ van MetaboAnalyst onthulde een mogelijk onevenwicht in de redox-toestand van de patiënten, aangezien hun metabole profielen overéénkwamen met meerdere aandoeningen die niet gerelateerd zijn met elkaar, maar waar bij alle redox enzymatische reakties betrokken zijn. Onze hypothese is dat een verstoring van de redox-toestand de status van donoren en acceptoren van chemische reakties aslook hun co-enzymen (zoals NAD+/NADH, FAD+/FADH voor dehydrogenasen) beïnvloedt. Oxidasen zouden vanzelfsprekend ook aangetast zijn als katalysatoren van redox-reakties. Veel transferase katalytische aktiviteiten kunnen worden beïnvloed door de redox-toestand van hun omgeving en veel ziekten worden veroorzaakt door transferase-deficiënties. Bv.: succinyl-CoA:3-ketoacid-CoA transferase deficiëntie leidt tot een toename van ketonen en diabetes-ketoacidose […]. Carnitine-palmitoyl-transferase deficiëntie II (CPT II) is een ander voorbeeld waarbij het vetzuren-metabolisme ontwricht is door het gebrek aan transport van lange-keten vetzuren naar de mitochondrieën, waar ze worden gebruikt als brandstof-bron.

Anoxie is één van de met ziekte geassocieerde metabolieten-sets, een aandoening die ook opdook gebruikmakend van de Armstrong et al. dataset (gegevens niet getoond), en samen met asfyxie in de Germain et al. dataset (gegevens niet getoond). Het M.E./CVS metabolieten-profiel vertoont ook gelijkenissen met dat van kinderen die hypoxisch-ischemische encefalopathe (HIE) ontwikkelen door zuurstof-deprivatie. Anoxie en asfyxie zijn beide verbonden met het gebrek aan zuurstof, wat duidelijk ernstige repercussies kan hebben op spier- en lichamelijke aktiviteit. Het onvermogen om adequaat zuurstof te leveren aan spieren is evident in studies van de respons op inspanning bij in M.E./CVS-patiënten [bv. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492]. Bovendien is de oxygenatie van de pre-frontale cortex in het brein verminderd bij inspanning in M.E./CVS-patiënten [Neary JP et al. Prefrontal cortex oxygenation during incremental exercise in Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Physiol. Funct. (2008) 28: 364-372]. Veel personen met M.E./CVS vertonen een gedaald bloed-volume, wat de oxygenatie van veel weefsels aantast [Streeten DHP et al. The roles of orthostatic hypotension, orthostatic tachycardia and subnormal erythrocyte volume in the pathogenesis of the Chronic Fatigue Syndrome. Am. J. Med. Sci. (2000) 320: 1-8 /// Streeten DHP & Bell DS. Circulating blood volume in Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2011) 4: 3-11]. Verstoringen van de circulatie en zuurvoorziening naar de weefsels kan aan de basis liggen van veel symptomen van M.E./CVS. Hypoxie resulteert in het genereren van reaktieve zuurstof-soorten in de mitochondrieën, met als gevolg de aktivatie van beschermende systemen.

Er werd een verband van oxidatieve stress met M.E./CVS gerapporteerd in een aantal M.E./CVS-studies. Van belang: bij het meten van gekende merkers voor oxidatieve stress, vonden Richards et al. [zie ref. hierboven] dat methaemoglobine [ontstaat als het tweewaardig ijzer (Fe2+) in haemoglobine door oxidatie wordt omgezet in driewaardig ijzer (Fe3+)] één van de voornaamste componenten was die hun M.E./CVS-patiënten van controles differentieerden. Deze vorm van haemoglobine draagt de geoxideerde vorm of het ijzer-ion […] die nodig is opdat haemoglobine zuurstof kan binden. Zelfs al maken methaemoglobine-metingen geen deel uit van onze dataset, is het intrigerend om de oxidatie-toestand te verbinden met een verstoord redox-milieu, terwijl het effekt van het onvermogen zuurstof te binden zich kan vertalen naar anoxie en asfyxie.

M.E./CVS-biomerkers, als een middel voor ondubbelzinnige diagnose en monitoring van de doeltreffendheid van behandelingen, zijn één van de dringend noodzakelijke ontwikkelingen op dit gebied. Er werden ROC-analyse gegevens gegenereerd met doel in gedachten. De hoogste voorspellende waarde bleek 0.75 AUC [zie resultaten]. Toekomstig werk waarbij een grotere en onafhankelijke groep wordt geanalyseerd en vergeleken met andere vermoeiende ziekten zal waarschijnlijk de voorspellende waarde verhogen en onthullen of plasma metabolomica kunnen dienen als betrouwbaar instrument voor objectieve identificatie en monitoring van M.E./CVS-patiënten.

4. Materialen & methodes

4.1. Staalname & metabolomica-platform

[…] Metabolon® ‘Global Metabolomics’: ‘ultra-high-performance’ vloeistof-chromatografie/ tandem massa-spectrometrie (UHPLC/MS/MS) laat accurate relatieve kwantificatie van honderden metabolieten uit verscheidene categorieën molekulen.

4.2. Gegevens-analysis via MetaboAnalyst

[] Een uitgebreid instrument voor metabolomica-analyse en -interpretatie (www.metaboanalyst.ca).

4.3. Interne gegevens-analysis

[]

5. Besluiten

In deze studie rapporteren we over een metabolomica-profiel van een relatief kleine groep. Ondanks statistische uitdagingen, leveren we toch meer bewijsmateriaal voor een redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten. De rationale achter onze theorie wordt ondersteund door parallellen met onze eerdere studie en beschikbare datasets van andere teams. De patiënten-groepen die in onze studies en die van anderen werden gebruikt, verschillen qua geografische ligging, dieet, behandel-regimes, maar toch zijn er opmerkelijke gelijkenissen bij de bevindingen. Zodoende kunnen metabolomica een fundamenteel kenmerk onthullen van de ontwrichting die optreedt in slachtoffers van M.E./CVS.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.