M.E.(cvs)-wetenschap

oktober 19, 2019

HERV-K & HERV-W transcriptie-aktiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Infektie — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , ,

Retrovirussen zijn RNA-virussen die bij alle gewervelde dieren worden gevonden. Een retrovirus reproduceert/copieert zijn RNA naar DNA door ‘reverse (omgekeerde) transcriptie’, wat dan wordt geïntegreerd in het genoom van een gastheer zodat het kan worden overgeschreven in virussen. Veel retrovirale sequenties blijven permanent geïntegreerd in het menselijk genoom als humane endogene retrovirussen of HERVs. Het menselijk genoom (alle genomen) bevatten ook retrovirus-achtige retrotransposons, mobiele elementen die zich vermenigvuldigen door RNA-copieën te maken die via ‘reverse’ transcriptie in DNA geïntegreerd worden op nieuwe plaatsen in het genoom. Het voornaamste verschil tussen een retrovirus en een retrotransposon is dat het laatste geen enveloppe (omhulsel) heeft. De meeste HERVs en retrotransposons zijn defekt (er ontbreken één of meerdere gen-funkties) maar kunnen zich niettemin vermenigvuldigen en ‘bewegen’ m.b.v. andere elementen of infekterende virussen.

Prof. Brigitte Huber van de ‘Tufts University School of Medicine’ – de persoon die aantoonde dat XMRV bij M.E.(cvs) niet bestaat en het als een contaminant bestempelt) – presenteerde op de ‘Invest in ME’ conferentie in London (2010) bewijsmateriaal dat suggereerde dat een geaktiveerd aloud retrovirus dat in het menselijk genoom is ingebed (HERV-K18), aktief zou kunnen zijn bij M.E.(cvs). In een later artikel (2013) waarvan ze mede-auteur is (zie Oakes B et al. in onderstaande tekst) kon niet worden aangetoond dat er een verschil is qua HERV-K18 enveloppe (proteïne-omhulsel) transcripten tussen M.E.(cvs) en controles, en dat die ook niet werden gereaktiveerd door humaan herpes-virus 6 of 7. Het bleef dan lange tijd stil rond deze kwestie…

Een nieuwe studie gepubliceerd met Luis Nacul (‘Associate Professor, Faculty of Infectious and Tropical Diseases’ van de ‘London School of Hygiene & Tropical Medicine’) als co-auteur, steunend op een ‘bredere’ techniek en uitgevoerd op materiaal van de Britse ‘M.E./CVS Biobank’ (UKMEB), toont aan dat er een over-expressie is van een bepaalde famile (HERV-K) maar enkel bij de matig zieke individuen. De studie werd mede gefinancierd door de amerikaanse ‘National Institutes of Health’ (NIH).

————————-

BioRxiv [“bio-archive” – gratis online archief voor ongepubliceerde pre-prints (vóór peer-review en formele publicatie)] (juli 2019)

HERV-K and HERV-W transcriptional activity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Lucas S Rodrigues (1), Luiz H da Silva Nali (1,2), Cibele O D Leal (1), Ester C Sabino (1,3), Eliana M Lacerda (4), Caroline C Kingdon (4), Luis Nacul (4), Camila M Romano (1,5)

1 Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

2 Universidade Santo Amaro, Pos-Graduacao em Ciencias da Saude

3 Departamento de Molestias Infecciosas e Parasitarias, Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

4 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, United Kingdom

5 Hospital das Clinicas HCFMUSP (LIM52), Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende chronische ziekte die de levenskwaliteit dramatisch compromitteert. De M.E./CVS-pathogenese is multifactorieel en er wordt gedacht dat immunologische, metabole en omgeving-factoren een rol spelen. Er is goede documentering van een verhoogde aktiviteit van humane endogene retrovirussen (HERVs) van verschillende families bij auto-immune en neurologische ziekten, wat er voor zorgt dat deze elementen goede kandidaten voor biomerkers of zelfs triggers voor dergelijke ziekten zijn. Hier werden de expressie van endogene retrovirussen K en W (HERV-K & HERV-W) bepaald in het bloed van matig en ernstig zieke M.E./CVS-patiënten. voor HERV-K was er over-expressie enkel bij de matig zieke individuen en HERV-W vertoonde geen verschil. Dit is de eerste melding omtrent differentiële expressie van HERV-K bij matige M.E./CVS.

Inleiding

[…] De pathofysiologie van M.E./CVS wordt nog niet begrepen en er is geen diagnostische biomerker beschikbaar. Er is nog controverse over de etiologie maar er is echter brede acceptatie dat meerdere immunologische veranderingen aanwezig zijn bij M.E./CVS-patiënten. Daarnaast is er steeds meer bewijs voor een associatie van M.E./CVS met virale infekties en veel patiënten melden dat hun symptomen begonnen tijdens of net na een griep-achtige ziekte [Rasa S et al. Chronic viral infections in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). J Transl Med. (2018) 16: 268]. Daarna zou een ongewone auto-immune respons tegen de infektie verantwoordelijk zijn voor de bestendiging van de M.E./CVS-symptomen. Tenslotte wordt de deelname van virussen ondersteund door het bewijs van klinisch nut van valganciclovir [antiviraal medicijn; synthetisch analoog van 2′-deoxy-guanosine, wordt ingebouwd in viraal DNA waardoor dit niet meer kan worden overgeschreven] voor patiënten. Jammer genoeg belemmert de afwezigheid van studies bij grote groepen die de bijdrage van infektueuze agentia aan de M.E./CVS-pathogenese op molekulair niveau onderzoeken ons begrip van deze ziekte.

Humane Endogene Retrovirussen (HERVs) komen voort uit exogene retrovirale infekties, die optraden vroeg in de evolutie van gewervelden. Door aktieve replicatie- en transpositie-gebeurtenissen, worden HERVs uitgebreid verspreid over het gastheer-genoom en vormen ze ca. 8% van het menselijke genoom. Omwille van geaccumuleerde mutaties doorheen de evolutie van primaten en mensen, zijn de meeste HERVs niet-funktioneel, maar er blijven intacte ‘open-reading frames’ [delen van het RNA ‘lees-raam’ die kunnen worden vertaald; ORF = een doorlopende reeks codons beginnend met een start- en eindigend met een stop-codon] van enkele HERVs bestaan en deze kunnen gereaktiveerd worden in respons op systemische en omgeving-factoren (zoals hormonen, stress en infektie door exogene virussen, inclusief bijna alle menselijke herpes-virussen, HIV en andere). Gezien hun potentiële pathogene effekten (inclusief ‘molecular mimicry’ [‘mimic’ = imiteren of nabootsen; een deel van een bepaald proteïne (peptide) gelijkt sterk op een deel van een totaal verschillend proteïne; speelt een rol bij auto-immuniteit] en immune ontregeling), wordt dikwijls gepostuleerd dat HERVs mogelijke oorzaken zijn van auto-immune ziekten. Onder de meer dan 30 families, zijn het de K & W families die het meest recent geïntegreerd werden, die meest aktief zijn en frequent geassocieerd werden met neurologische en auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes mellitus, S.L.E., A.L.S. en Reumatoïde Artritis.

Naar ons weten zijn er slechts twee studies die de participatie van endogene retrovirussen in M.E./CVS hebben onderzocht; dit met tegenstrijdige resultaten. Gezien de uitgebreid beschreven gewijzigde patronen van HERVs bij meerdere ziekten en het gebrek aan kennis omtrent hun expressie bij M.E./CVS, onderzochten we de expressie van de HERVs K & W bij patiënten met een diagnose van M.E./CVS.

Methodes

Deelnemers

We gebruikten PBMC-stalen van 100 patiënten met de diagnose van M.E./CVS opgeslagen in de ‘UK M.E./CVS Biobank’ (UKMEB) aan de ‘London School of Hygiene and Tropical Medicine’. […]. Er werden 75 stalen gevraagd van deelnemers met een diagnose van matige vermoeidheid (M.E./CVSm) en 25 van deelnemers met ernstige vermoeidheid (M.E./CVS). Er werden ook stalen van 70 gezonde controles (ook geleverd door de UKMEB) opgenomen. […].

RNA-extractie & ‘real-time’ PCR

[…]

[…] De HERV-aktiviteit werd kwalitatief (aan-/afwezigheid) en kwantitatief (mate van expressie) geëvalueerd. Als positieve controle gebruikten we een plasmide dat zowel HERV-W enveloppe en HERV-K polymerase fragmenten corresponderend met het gebied tussen de primers. […] De stalen werden enkel positief voor HERVs beschouwd en onderworpen aan de analyses als de expressie van de endogene controle ook werd gedetekteerd.

Resultaten

[…] Zoals verwacht waren er 4 maal meer vrouwen dan mannen [bij de patiënten]. Daarom pastten we de controle-groep aan zodat deze dezelfde gender-prevalentie had.

[Kwalitatief] De expressie van HERV-K & -W werd geëvalueerd bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles; en er werd enig niveau van expressie van HERV-W gedetekteerd bij alle patiënten met ernstige vermoeidheid [100%] en bij 72/75 M.E./CVSm (96%). HERV-K werd ook gedetekteerd bij alle ernstige gevallen [100%] maar bij 65/75 van de matige gevallen (86,6%). De gezonde controle-groep was zeer gelijkend met de matige groep: 68/70 (97%) en 60/70 (85,7%) met expressie van HERV-W & HERV-K respectievelijk. Slechts één patient met matige vermoeidheid en één controle-individu vertoonden helemaal geen HERV-aktiviteit. Er werd geen verband gezien betreffende HERV-detektie en ziekteduur.

Betreffende de mate van expressie (kwantitatieve analyse), onthulden ‘real-time’ resultaten dat HERV-W geen significante verschillen vertoonde wanneer de gezonde controles (HCs) of de twee M.E./CVS-groepen met elkaar werden vergeleken: M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.89), M.E./CVSm vs. HCs (p = 0.77), M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.95), alle M.E./CVS-patiënten vs. HCs (p = 0.78).

Anderzijds was er een significant verschil voor HERV-K expressie tussen de M.E./CVSm-groep en de HCs (p = 0.050). HERV-K aktiviteit was niet verschillend tussen de M.E./CVS-groepen: M.E./CVSs vs. M.E./CVSm (p = 0.12), M.E./CVS vs. HCs (p = 0.17). M.E./CVSs vs. HCs (p = 0.97).

Bespreking

De meest erkende en veel-gebruikte definities (Fukuda & Canadese Consensus criteria) zijn gebaseerd op zelf-gerapporteerde symptomen. Studies aangaande energie-metabolisme, oxidatieve stress en immunologische wijzigingen bij M.E./CVS hebben een onevenwicht in al deze mechanismen aangetoond, maar het gebruik van dergelijke informatie voor diagnostische doeleinden is nog geen realiteit.

Hier werden HERV-K & -W transcripten gedetekteerd in alle onderzochte groepen, en we vonden dat HERV-K over-expressie vertoonde bij matige M.E./CVS. Het is mogelijk dat de immunologische, genetische expressie en metabole veranderingen verschillen naargelang de ernst van de ziekte.

De interaktie tussen endogene retrovirussen en het immuunsysteem is complex. ERVs maken deel uit van het gastheer-genoom en in theorie worden ze verondersteld te worden herkend als zelf-antigenen, en er zou een immuun-tolerantie moeten gevestigd zijn tijdens de vroege stadia van de ontwikkeling van het organisme. HERV-produkten kunnen echter interageren met componenten van het aangeboren immuunsysteem, leidend tot de aktivatie van pro-inflammatoire mechanismen of, in sommige bijzondere gevallen, hun suppressie. Bv. het syncytin-2 proteïne [van belang bij de ontwikkeling van de placenta] is een produkt van het ERV-FRD [endogeen retrovirus groep FRD] Enveloppe gen dat een immunosuppressieve rol speelt bij het voorkomen van de maternale immuun-respons tegen de foetus. In een ander scenario werd aangetoond, gebruikmakend van een psoriasis-model, dat een pro-inflammatoir milieu in staat kan zijn de expressie van repetitieve elementen, inclusief HERVs, te onderdrukken. Het zou redelijk zijn om te suggereren dat de immunologische intensifiëring die wordt gezien bij ernstiger M.E./CVS werkt via het verstillen van de HERV trans-aktivatie [gen-expressie getriggered door biologische of kunstmatige processen, via de expressie van een intermediair trans-aktivator proteïne] die optreedt bij matige gevallen. Dergelijke trans-aktivatie zou veroorzaakt kunnen worden door exogene virale replicatie of een ander nog niet gekende factor. Overéénkomstig hiermee vonden Montoya en z’n collega’s (2017) een cytokine-signatuur voor de ernst bij mensen met M.E./CVS. Ze toonden aan dat van de 17 cytokinen die met ernst gerelateerd zijn, er 13 pro-inflammatoir zijn en die (naast het verslechteren van de symptomen) de terugval van de HERV-K aktiviteit, naar waarden gelijkaardig aan deze die worden gezien bij gezonde individuen, kunnen veroorzaken. Het kan evenzo gebeuren met HERV-W, waarvan – ondanks het feit dat er geen significante waarden werden gevonden – er een lichte daling was bij mensen die ernstige M.E./CVS hadden, vergeleken met degene die matig waren aangetast.

Infektie wordt dikwijls beschouwd als een trigger voor M.E./CVS. Veel patiënten melden dat de vermoeidheid begon tijdens of kort na een een infektueuze ziekte. Een aantal pathogenen, inclusief virussen, werden geassocieerd met deze ziekte [zie Rasa S et al. hierboven]. En, omwille van de levenslange persistentie en breed cel-tropisme, werd de herpes-virus familie (bijzonderlijk HHV-6) door velen beschouwd als een mogelijke trigger voor M.E./CVS, zelfs al bleek een dergelijk verband niet consistent [Oakes B, Komaroff AL et al. Human Endogenous Retrovirus-K18 Superantigen Expression and Human Herpesvirus-6 and Human Herpesvirus-7 Viral Loads in Chronic Fatigue Patients. Clin Infect Dis. (2013) 56: 1394-1400]. Interessant: HHV-6 is net zoals andere herpes-virussen, ook in staat om HERVs te trans-aktiveren, bijzonderlijk HERV-K. Een dergelijke trans-aktivatie kan direct (door LTR-aktivatie door virale produkten [een ‘long terminal repeat’, lange DNA-sequentie dat een gen aan beide zijden flankeert; zorgt er voor dat het gen in het genoom wordt opgenomen; bij retrovirussen zorgt voor de integratie van het pro-virus (virus-DNA dat in het genoom van de gastheer is opgenomen)] of indirect (via transcriptionele binding-factoren en cytokinen geproduceerd bij virale replicatie) gebeuren. Het is mogelijk dat naar mate de ziekte vordert, wat ook de exogene infektie was die als triggerende factor kon optreden, deze gecontroleerd raakt, en bijgevolg, de trans-aktivatie van HERVs vermindert. Jammer genoeg hebben we geen serologische of molekulaire testen voor exogene virussen uitgevoerd.

Er werden eerder twee rapporten over HERV-aktiviteit bij M.E./CVS gepubliceerd maar de resultaten waren tegenstrijdig. In 2013 vonden een team rond Prof. Komaroff [Oakes et al.; zie hierboven] geen verschil qua expressie van HERV-K18 enveloppe bij mensen met M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. In hetzelfde jaar vonden een research-team rond een commercieel privé lab d.m.v. immunohistochemische methodes, immunoreaktiviteit [antilichamen; dus niet de sequenties zelf] tegen HERV-proteïnen (HERV-K, HERV-18, HERV-R & HERV-FRD) in dendritische cellen van de twaalfvingerige darm van individuen met de diagnose van het syndroom, suggestief voor het feit dat veranderingen qua expressie-patroon van endogene retrovirussen kunnen optreden bij M.E./CVS. De verschillen tussen de resultaten van Oakes et al. en de onze kunnen te wijten zijn aan de gebruikte methodes om HERV-K te detekteren. Hoewel het huidig werk gebruikt maakte van generische primers voor HERV-K (die de detektie van honderden elementen van de meeste sub-families toelaat), zocht het team van Oakes enkel naar transcripten van de HERV-K 18 enveloppe, met een methode specifiek voor dit bepaald element, waarbij alle resterende pro-virussen van de K-familie werden genegeerd. Aan de andere kant waren wij niet in staat na te gaan welke K-familie pro-virussen betrokken zijn bij de geobserveerde differentiële expressie.

De molekulaire methode die hier werd gebruikt om HERV-W te detekteren, was ook generisch en werd alom gebruikt in meerdere studies die differentiële expressie van dit element vonden bij pathologische aandoeningen, waaronder in het bloed, de hersenen en het cerebrospinaal vocht van patiënten met Multipele Sclerose (M.S.). Daarom, ondanks de gelijkenissen van een aantal symptomen en de sterke immunologische component van M.E./CVS en M.S., zijn de mechanismen verantwoordelijk voor HERV-reaktivatie bij die ziekten waarschijnlijk verschillend.

Tot besluit: dit is het eerste rapport dat verhoogde expressie van een endogeen retrovirus aantoont in het bloed van individuen met matige M.E./CVS. Hoewel de verhoogde expressie van deze retro-elementen niet direct geassocieerd is met de M.E./CVS-pathogeniteit, kan de observatie van dit fenomeen niet worden genegeerd.

————————-

In een ‘review-artikel’ (‘Epigenetic Components of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Uncover Potential Transposable Element Activation’ in Clinical Therapeutics; 2019) vonden Spaanse en Amerikaanse onderzoekers via een zoektocht in de literatuur met betrekking tot de epigenitica bij M.E.(cvs) bepaalde verbanden tussen ‘transposable elements’ (TEs) en epigenetische kenmerken. Ze bedachten een model met betrekking tot transcriptionele inductie van endogene ‘slapende’ transposons en gestruktureerde cellulaire RNA interakties, die de aktivatie van het aangeboren immuunsysteem triggeren zonder bijbehorende aktieve infektie.

Als voorbeelden voor het feit dat TE-aktiviteit een rol speelt bij belangrijke biologische funkties vermelden ze: HERV-H bij de handhaving en differentiatie van stamcel-pluripotentie, HERV-W & HERV-FRD enveloppe proteïnen bij immuun-tolerantie van de foetus, HERV-K gecodeerd Rec proteïne voor de bescherming van het embryo tegen virale infekties, enz.

Ze verwijzen ook naar studies die toonden dat uitdagingen zoals infekties, stress en veroudering TE-transcriptie aktiveren door het destabiliseren van epigenetische merktekens met mogelijks pathogene gevolgen. Het is dus plausibel dat afwijkende TE-aktivatie de kern is van de molekulaire mechanismen betrokken bij M.E.(cvs). Dit dient verder te worden onderzocht.

juli 19, 2019

Verhoogd hsCRP bij fibromyalgie en CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:18 am
Tags: , , , ,

In 2007 lieten Vance Spence en z’n medewerkers al optekenen (zie ‘Arteriële Stijfheid en Inflammatie bij CVS’): “Terwijl verhoogde CRP-waarden beperkte diagnostische waarde hebben bij CVS, zijn hsCRP-waarden indicatief voor chronische, laag-gradige, sub-klinische inflammatie en kunnen fungeren als een potentieel hulpmiddel bij de voorspelling van cardiovasculair risico.”.

De hsCRP: ‘high sensitivity’ (ultra-gevoelige) immuno-assay voor CRP (zie ‘Verband tussen CRP en vermoeidheid’) is een laboratorium-test met hogere gevoeligheid (kan waarden lager dan 10 mg/l meten) dan het gewone C-Reaktief Proteïne. Een hsCRP > 10 mg/l duidt op een acute ontsteking. Lagere waarden duiden op laag-gradige inflammatie. Het eigenlijk gebruik is om het risico op hart- en/of vaatziekte na te gaan (1-3 mg/l: licht verhoogd risico, > 3 mg/l: hoog risico).

Het Noorse research-team die de studie hieronder uitvoerde, vond ook dat de hsCRP-waarden significant hoger lagen (t.o.v. controles) bij de CVS- én de FM-groep die ze onderzochten, en dit ook na aanpassing voor ‘body-mass-index’. Tussen de CVS en FM onderling was er echter geen verschil. Er wordt nogmaals aangegeven dat bij beide aandoeningen inflammatie dus aanwezig is (zie tekst voor referenties met betrekking tot CVS). Het zou op basis van de hsCRP echter niet mogelijk zijn om CVS & FM van elkaar te onderscheiden. Maar het verdient zeker aandacht om verder onderzoek te doen naar deze klinisch relevante inflammatie.

————————-

Brain, Behavior and Immunity (Pre-print juni 2019)

Patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome show increased hsCRP compared to healthy controls

Nina Groven (a,c), Egil A. Fors (b), Solveig Klaebo Reitan (a,c)

a Department of Mental Health, Faculty of Medicine and Health Sciences Norwegian University of Science and Technology (NTNU), Trondheim, Norway

b Department of Public Health and Nursing, General Practice Research Unit, Faculty of Medicine and Health Sciences, Norwegian University of Science and Technology (NTNU), Trondheim, Norway

c Department of Mental Health, St. Olav’s University Hospital, Trondheim, Norway

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FM) zijn allebei chronische aandoeningen die een desastreus effekt hebben op de levens van de aangetaste patiënten en hun families. Beide aandoeningen vertonen overlappende klinische kenmerken die gedeeltelijk gemeenschappelijk zijn met inflammatoire aandoeningen. De etiologie wordt nog niet goed begrepen en er wordt gesuggereerd dat het immuunsysteem mogelijks een bijdragende factor is. Tot op heden zijn de resultaten niet éénduidig. Het doel van deze studie was het vergelijken van de twee aandoeningen en het onderzoeken van de concentratie van de inflammatoire merker ‘high-sensitivity’ CRP (hsCRP) bij CVS- en FM-patiënten t.o.v. gezonde controles.

Vrouwelijke deelnemers met een leeftijd van 18-60 jaar werden in deze studie opgenomen. De groep omvatte 49 CVS-patiënten, 57 FM-patiënten en 54 gezonde controles. De hsCRP-waarden lagen significant hoger voor zowel de CVS- als de FM-groep vergeleken met de gezonde controles, ook na aanpassing voor leeftijd, roken en BMI (p < .001). Er was geen verschil tussen de twee patiënten-groepen. De waarde van hsCRP werd beïnvloed door BMI maar niet door leeftijd en roken.

Patiënten met CVS en FM hebben hogere hsCRP-concentraties t.o.v. gezonde controles. Dit blijft significant zelfs na aanpassing voor BMI. CVS en FM kunnen in deze studie echter niet van elkaar worden onderscheiden op basis hsCRP.

1. Inleiding

De aandoeningen Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FM) zijn twee afzonderlijke diagnostische groepen; ze vertonen echter overlappende symptomen. CVS wordt gekenmerkt door ernstige vermoeidheid met een gekende duidelijke aanvang, die meer dan 6 maanden aanhoudt, niet noodzakelijkerwijs verband houdt met inspanning, niet wordt beïnvloed door rust en verminderd funktioneren veroorzaakt. Daarnaast worden vier van de acht volgende symptomen gezien: verstoring van het korte-termijn geheugen of de concentratie, pijnlijke keel, gevoelige hals of oksel lymfeknopen, spierpijn, pijn in meerdere gewrichten, nieuwe type/patroon/ernst qua hoofdpijn, niet-verfrissende slaap, en post-exertionele malaise die meer dan 24 h aanhoudt. Zowel de diagnoses van CVS en FM zijn gebaseerd op specifieke inclusie-criteria en uitsluiting van andere diagnoses die dezelfde symptomen veroorzaken […]. Deze twee aandoeningen veroorzaken lijden voor de patiënten en verhogen mogelijks de kosten voor het gezondheidszorg-systeem. Er is dus meer kennis nodig om de problemen die door CVS en FM worden veroorzaakt te verlichten.

Pijn en vermoeidheid zijn courante kenmerken bij meerdere inflammatoire aandoeningen. Inflammatie aktiveert pijn-systemen op een directe manier en veroorzaakt vermoeidheid. Een ander kenmerk van meerdere inflammatoire aandoeningen is ‘ziekte-gedrag’, refererend naar niet-specifieke symptomen zoals anorexie, neerslachtigheid, verlies van interesse en verdwijnen van lichaamszorg. Ziekte-gedrag kan worden veroorzaakt door immuun-mediatoren (bv. IL-1). Zodoende is het immuunsysteem een voor de hand liggende kandidaat die dient te worden onderzocht voor z’n rol bij CVS en FM. Tot op heden zijn de studies niet éénduidig. We [Groven N et al.] hebben eerder een tendens naar verhoogde inflammatie aangetoond via de meting van gestegen TNF-α bij CVS-patiënten (t.o.v. controles).

Omdat de etiologie van FM net zo vaag is als die van CVS, wilden we de gelijkenissen en verschillen tussen de twee aandoeningen bestuderen. In deze huidige studie wordt de algemeen gebruikte immuun-merker hsCRP onderzocht bij patiënten met CVS en FM, en bij gezonde controles. hsCRP is een meer accurate methode voor het meten van de CRP-waarden.

2. Methodiek

2.1. Populatie

2.1.1. Patiënten-groepen

De patiënten waren vrouwen, niet-zwanger, met een leeftijd van 18-60 jaar […]. Elke deelnemer werd uitgebreid klinisch onderzocht en grondig geëvalueerd door een experten-team (artsen, fysiotherapeuten en psychologen). De FM-patiënten (n= 58) kregen de diagnose op basis van de 1990 ACR criteria; CVS-patiënten (n = 49) op basis van de Fukuda criteria. Exclusie-criteria waren overéénkomstig diagnostische criteria voor gekende inflammatoire ziekte.

2.1.2. Gezonde controles

[…]

2.2. Procedure

[…]

2.3. Studie-ontwerp en ethiek

Beoordeling (30-40): interview, vragenlijsten en bloed-afname. […]

2.4. Vragenlijsten

‘Hospital Anxiety and Depression Scale’ (HADS, FM 2011 & 2016 criteria, ‘Chalder Fatigue Scale’ & ‘Brief Pain Inventory’ (BPI).

2.5. Interview

[…] Voorgeschiedenis betreffende infekties, immune aandoeningen, ziekte in het algemeen (somatisch & psychiatrisch), co-morbide ziekte, medicatie, menstruatie-cyclus, gebruik van contraceptiva, status van de menopause, ziekte-duur en fysieke aktiviteit de voorbije twee weken.

2.6. Bloedafname

[…] De stalen werden ook gescreend op tekenen van infektie en inflammatie (bv. microbiologische serologie, telling van de witte bloedcellen, enz.). Abnormaliteiten leidden tot exclusie.

2.7.Statistische analyse

[…]

3. Resultaten

[…] Het totaal aantal deelnemers was 160, als volgt verdeeld over de drie groepen: CVS (n = 49), FM (n = 58) & gezonde controles (n = 53). De mediane hsCRP-concentratie was 0,94 mg/l voor CVS, 1,30 mg/l voor FM & 0,60 mg/l voor de controle-groep. De hsCRP-waarden waren niet normaal verdeeld en daarom werden ze omgezet naar hun natuurlijke logaritme (lnCRP) voor verdere analyses.

Statistisch bleken er significante verschillen qua leeftijd & BMI tussen de groepen. […]

De BMI droeg aanzienlijk bij tot het model en was verantwoordelijk voor 23,1% van de variantie qua lnCRP (p < .001), terwijl dit voor de groep-parameter 6,9% was (p = .001). De leeftijd had geen effekt op de uitkomst (p = .200).

Er was geen verband tussen roken en hsCRP-concentraties (p = .925). Er was een sterke positieve correlatie tussen hsCRP & BMI voor de totale populatie (N = 150, p < .001). We zagen ook een correlatie tussen diagnostische groep & hsCRP (N = 153, p = .019).

Het verschil in lnCRP was significant hoger bij de FM- en CVS-groepen vergeleken met de controle-groep (p = .004 & p = .009, respectievelijk). Er was geen verschil tussen de twee patiënten-groepen (p = .902).

4. Bespreking

De CVS- en FM-groepen vertoonden significant hogere waarden qua hsCRP dan de gezonde controle-groep (p = .009 & p= .004, respectievelijk) maar konden niet van elkaar worden onderscheiden (p = .902). hsCRP bleek gecorreleerd met BMI maar niet met leeftijd of roken. Na aanpassing voor BMI was de gestegen hsCRP in beide patiënten-groepen (t.o.v. controles) nog steeds significant.

Hoewel er een rapport is dat geen associatie tussen inflammatie en CVS vond, werden een substantieel aantal rapporten gepubliceerd die een verband aangeven [Patarca-Montero R et al. Cytokine and other immunologic markers in Chronic Fatigue Syndrome and their relation to neuropsychological factors. Appl. Neuropsychol. (2001) 8: 51-64 /// Patarca R. Cytokines and Chronic Fatigue Syndrome. Ann. N. Y. Acad. Sci. (2001) 933: 185-200 /// Raison CL et al. Association of peripheral inflammatory markers with chronic fatigue in a population-based sample. Brain Behav. Immun. (2009) 23: 327-337 /// Russell A et al. Persistent fatigue induced by interferon-alpha: a novel, inflammation-based, proxy model of Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology. (2019) 100: 276-285]. Een ‘review’ aangaande CVS en auto-immuniteit maakt geen melding van CRP, hoewel andere immuun-merkers worden besproken [Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609]. Een ander rapport [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4, 30] over een vergelijking van CVS-patiënten met gezonde controles vond een lichtjes, maar niet significant, hogere hsCRP bij de patiënten, terwijl een eerdere studie met CVS-patiënten (gerecruteerd op gastro-enterologie en reumatologie afdelingen) significant gestegen hsCRP-waarden vond bij CVS-patiënten vergeleken met controles [Groeger D et al. Bifidobacterium infantis 35624 modulates host inflammatory processes beyond the gut. Gut Microb. (2013) 4 325-339]. Beide studies omvatten mensen van beide geslachten en een breed leeftijd-bereik, en er werden niet aangepast voor BMI. Ook genetische studies bij adolescenten hebben een link aangegeven tussen immuun-aktiviteit en CVS [Nguyen CB et al. Associations between clinical symptoms, plasma norepinephrine and deregulated immune gene networks in subgroups of adolescent with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2019) 76: 82-96]. Raison CL et al. [zie hierboven] vonden dat een verhoogd hsCRP bij patiënten met CVS niet meer significant was na aanpassing voor leeftijd, geslacht, ras, woonplaats, BMI, depressie en immuun-modulerende medicatie. Wij hadden echter slechts één geslacht in onze studie en geen enkele deelnemer nam immuun-modulerende medicijnen, er was geen co-morbiditeit en we vonden geen effekt van de leeftijd in onze groepen. Betreffende ras en woonplaats: we registreerden deze gegevens niet maar al onze deelnemers werden gerecruteerd uit eerdere homogene gebieden in en rond Trondheim (Noorwegen). De rol en het type inflammatie bij CVS dient te worden opgehelderd om preventie en behandeling van de aandoening te verbeteren. Onze studie is een bijdrage op dit vlak omdat het fenomeen wordt onderzocht tussen groepen waarbij er weinig verschillen zijn buiten de aanwezigheid van CVS (t.t.z. anderzijds gezond, slechts één geslacht, socio-economisch homogene groep en klein leeftijd-bereik), en er werd aangepast voor BMI.

Een rapport dat CRP heeft gemeten bij FM-patiënten vond geen verschillen tussen patiënten en controles betreffende hsCRP, hoewel er een effekt werd vastgesteld voor leptine [door vetcellen gesecreteerd en nutritioneel gereguleerd hormoon dat de eetlust onderdrukt en een belangrijke regulator van de neuro-endocriene, metabole en immuun-funktie is]. Een grote populatie-studie vond verhoogd CRP bij deelnemers met een zelf-gerapporteerde FM-diagnose en suggereerde dat dit gedeeltelijk werd verklaard door BMI en co-morbiditeit. Verder vond een ‘review’ van studies die rapporteerden over het effekt van niet-farmacologische interventies bij FM-patiënten geen consistent effekt van CRP. Toch lagen de ‘baseline’ CRP-waarden hoger dan de referentie-waarde in drie van de opgenomen studies. Een subgroep FM-patiënten met inflammatoire veranderingen, inclusief gewijzigd CRP, werd ook gesuggereerd. Zoals door anderen werd aangetoond, vonden wij dat hsCRP geassocieerd is met BMI bij alle FM-patiënten alsook gezonde controles. Na aanpassen voor BMI was er echter nog een significant hogere hsCRP bij de patiënten t.o.v. de controles. Naar ons weten werd dit nog niet eerder consistent gerapporteerd en het fenomeen dient verder te worden onderzocht.

In onze studie vertonen beide patiënten-groepen significant hogere hsCRP-waarden dan gezonde controles. De patiënten-groepen wijken echter niet van elkaar af. CVS & FM worden als twee afzonderlijke aandoeningen gedefinieerd hoewel er een hoge co-morbiditeit is, en er zijn meerdere overlappende symptomen en bevindingen tussen de twee aandoeningen. Raison CL et al. [zie hierboven] vonden dat mensen met CVS en een groep met CVS-achtige ziekte niet van elkaar konden worden onderscheiden op basis van hsCRP-concentraties. Het is belangrijk om deze biologische gelijkenissen in gedachten te houden omdat er afwijkende rapporten zijn over de verschillen tussen CVS en FM betreffende klinische symptomen zoals persoonlijkheid, cognitie en evenwicht.

BMI had een duidelijk effekt op hsCRP. Dit komt overéén met bevindingen van meerdere andere studies en met het gekende effekt van vetweefsel op de produktie van CRP. Onze studie bevestigt dat studies aangaande CRP alsook inflammatie in het algemeen dienen te worden gecorrigeerd voor BMI.

We vonden geen effekt van leeftijd op CRP. Dit komt overéén met de studie van Xiao Y et al. [Elevated serum high-sensitivity C-reactive protein levels in fibromyalgia syndrome patients correlate with body mass index, interleukin-6, interleukin-8, erythrocyte sedimentation rate. Rheumatol. Int. (2013) 33: 1259-1264]. Dit kan verrassend zijn aangezien over het algemeen wordt verondersteld dat inflammatie verhoogt met de leeftijd. Onze populatie zou echter globaal te jong kunnen zijn om dit effekt te onthullen. CRP lijkt enkel verhoogd met de leeftijd bij mannen maar manifesteert zich bij vrouwen na de menopause. Er werd ook geen effekt of van roken gezien.

Er zouden verschillen kunnen zijn qua inflammatoire merkers tussen CVS van korte of lange duur. In een studie over FM leek weer-gevoeligheid en pijn, en de duur ook van belang; er werd besloten dat patiënten met FM van korte duur gevoeliger waren voor het weer. De duur van de ziekte beïnvloedde echter in het huidige materiaal de bevindingen niet (gegevens niet getoond).

4.1. Zwaktes & sterktes

De studie betreft informatie gebaseerd op een beperkte populatie, t.t.z. vrouwelijke individuen tussen 18 en 60 die wonen in een homogeen gebied met goed ontwikkelde sociale en gezondheid-diensten. Het zou kunnen dat voor andere groepen (mannen, kinderen en adolescenten, ouderen, en somatisch zowel als psychiatrisch zeer zieke mensen), de onthulde mechanismen misschien niet belangrijk zijn voor vermoeidheid en pijn. Geen enkele van de patiënten waren klinisch depressief. In onze studie registreerden we ook de symptomen angst en depressie d.m.v. de HADS. Aanpassing voor deze scores had geen effekt op hsCRP (gegevens niet getoond).

Een verondersteld laag aktiviteiten-niveau voor de patiënten en hoog aktiviteiten-niveau voor de gezonde controles zou een verstorende factor kunnen zijn die de resultaten beïnvloedt. De CVS-patiënten meldden de laagste aktivteit; die van de FM-patiënten was hoger; en de gezonde controle-groep rapporteerde de hoogste aktiviteit (gegevens niet getoond). Het verrast niet dat patiënten met CVS een hogere mate van inaktiviteit rapporteren omdat dit een deel van de karakteristieken van de aandoening uitmaakt. Toch waren meer dan de helft van de CVS-patiënten inderdaad aktief (gegevens niet getoond) en we geloven niet dat dit een bijdragende factor is tot de hogere mate van inflammatie die we in onze studie vonden. We namen ook de BMI op en controleerden zodoende voor de indirecte link tussen lage aktiviteit-niveaus en BMI.

De studie-populatie is eerder homogeen wat betreft leeftijd, geslacht en socio-economische status, en anderzijds gezond en niet gemediceerd. Dit laat ons toe verschillen te onthullen onafhankelijk van veel verstorende factoren. De studie heeft ook voldoende ‘power’ door de behoorlijke hoeveelheid klinisch materiaal. De patiënten kregen de diagnose volgens de Fukuda criteria in een gespecialiseerde multidisciplinaire eenheid van een universitair ziekenhuis, daarnaast werd nota genomen van de nieuwe FM-criteria, wat de klinische diagnoses valideert in vergelijking van wat kan worden gezien bij grotere populatie-studies.

5. Besluiten

CVS- & FM-patiënten hebben hogere hsCRP-concentraties vergeleken met gezonde controles. Dit blijft significant na aanpassing voor leeftijd en BMI. CVS & FM kunnen in onze studie niet van elkaar worden onderscheiden op basis van hsCRP.

Globaal levert onze studie een belangrijke bijdrage tot de kennis omtrent CVS & FM. Er lijkt een biologische inflammatoire aktiviteit aanwezig te zijn bij patiënten met CVS & FM die niet wordt gevonden bij gezonde controles van dezelfde leeftijd en geslacht. De inflammatoire veranderingen, of ze nu primair of secundair aan andere symptomen zijn, zouden verstorende symptomen kunnen zijn. Inflammatie is een bekende oorzaak voor vermoeidheid en pijn, en kan worden aangepakt via medicatie [inhibitie van NALP3 inflammasoom aktiviteit d.m.v. coenzyme Q10 (zie ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie: effekt van Coenzyme Q10’) & AMPK aktivatoren] of een merker zijn voor het monitoren van een behandeling voor deze aandoeningen. Overéénkomstig de aanbevelingen van de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ en de ‘American Heart Association’ voor hsCRP, en bepaling van risico-factoren, waren de hsCRP-concentraties van onze patiënten-groepen matig tot hoog. Als zodanig heeft dit klinische relevantie die verder gaat dan het bepalen van de oorzaak van CVS & FM.

juli 6, 2019

Is insuline-resistentie de oorzaak van fibromyalgie?

Insuline-resistentie (IR) is een fysiologische toestand waarbij cellen niet in staat zijn te reageren op de normale werking van het hormoon insuline. Het lichaam maakt insuline aan maar de cellen in het lichaam worden er resistent voor en kunnen het niet doeltreffend gebruiken, wat leidt tot hyperglycemie. Beta-cellen in de pancreas verhogen daarop hun produktie van insuline, wat verder bijdraagt tot hyperinsulinemie (te hoge waarden insuline in het bloed). Dit wordt dikwijls niet gedekteerd…

Hemoglobine A1c (HbA1c) is een vorm van (de bloed-kleurstof) hemoglobine die ontstaat door binding met circulerend glucose. Het is een normaal-voorkomende vorm maar een langdurige verhoogde glucose in het bloed (zoals bij diabetes) geeft aanleiding tot het feit dat de gemeten hoeveelheid HbA1c (uitgedrukt in % van het totaal) hoger zal zijn. Het is dus een aanduiding voor langere periodes van hyperglycemie daar waar een enkele meting van de bloedsuiker-spiegel maar een moment-opname is.

Bij een orale glucose-tolerantie test (GTT) geeft men een suiker-oplossing en meet over een bepaalde tijd (meestal 2h) de glucose-concentratie in het bloed om na te gaan hoe snel de glucose ‘verdwijnt’ (in de cellen wordt opgenomen). Het is een eerder rudimentaire, niet altijd even accurate test voor diabetes (of insuline-resistentie, verstoorde werking van de insuline-producerende beta-cellen).

Een team van het CDC maakten in hun artikel ‘Chronic Fatigue Syndrome is associated with metabolic syndrome: results from a case-control study in Georgia (Metabolism: Clinical and Experimental (2010) 59: 1351-7) al melding van het feit dat personen met ‘CVS’, alsook personen met ‘ISF’ (“met onvoldoende symptomen of vermoeidheid voor CVS”), “significant hogere prevalenties van insuline-resistentie vertonen vergeleken met controles.

Prof. Neil McGregor, de Australische metaboloom-specialist, suggereerde op het EMERGE 2019 ‘ME/CFS International Research Symposium’ dat hoewel z’n gegevens er op wijzen dat een derde van de M.E.(cvs)-patiënten insuline-resistentie vertonen, de meeste feitelijk een vorm van hyperinsulinemie (dikwijls gezien bij type-2 diabetes en bij het metabool syndroom – chronisch stofwisselingsprobleem met o.a. verhoogd nuchtere glucose-spiegel) hebben.

Een italiaanse onderzoeksgroep (Fava te al.; zie hieronder Metabolic Brain Disease. (2013) 28: 619-27) rapporteerde eerder dat de prevalentie van abnormaliteiten van het glucose-metabolisme significant hoger lag bij een groep fibromyalgie (FM) -patiënten met geheugen-probelemen. Ze evalueerden glucose en insuline na een orale glucose-tolerantie test, en de insuline-resistentie. De resultaten van deze studie gaven aan dat IR een risico-factor kan zijn voor geheugen-stoornissen bij FM-patiënten.

Eerdere observaties (door de huidige onderzoeksgroep) gaven aan dat insuline-resistentie problemen met de hersen-doorbloeding veroorzaken. Dergelijke abnormale brein-perfusie is ook aanwezig bij fibromylagie, vandaar de hypothese van de auteurs van onderstaande studie dat IR betrokken zou kunnen zijn. Daarom gingen ze met terugwerkende kracht kijken naar laboratorium-waarden van FM-patiënten. De enige abnormaliteit die ze vonden was verhoogd HBA1c bij 23 patiënten, en dit bij controle voor de leeftijd. 16 van hen kregen metformine en dit had een dramatisch effekt op de pijn… De lezer vindt hieronder een weergave van het artikel. Grote conclusies kunnen nog niet worden getrokken maar het is evident dat ook de M.E.(cvs)-gemeenschap dit dient te volgen.

Metformine is een medicijn ter behandeling van diabetes type-2; het verlaagt de bloed-glucose via verschillende wegen (o.a. remming van de gluconeogenese, de glycogenolyse en de omzetting uit lactaat, verhoging van de insuline-gevoeligheid, vertraging van de opname in glucose in de darmen). Verder zogrt het ook voor upregulering van de fosforylatie van AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK; zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’ & ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen’). Het is ook een inhibitor van mitochondriale complex-I gemedieerde respiratie (gebruikmakend van pyruvaat en malaat).

————————-

PLoS ONE 14(5): e0216079

Is insulin resistance the cause of fibromyalgia? A preliminary report

Pappolla MA1,2, Manchikanti L3, Andersen CR4, Greig NH5, Ahmed F2, Fang X1, Seffinger MA6, Trescot AM7

1 Department of Neurology, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, United States of America

2 St. Michael’s Pain & Spine Clinics, Houston, Texas, United States of America

3 Department of Anesthesiology, LSU School of Medicine Health Sciences Centre, New Orleans, Louisiana, United States of America

4 Office of Biostatistics, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, United States of America

5 Drug Design and Development Section, National Institute on Aging, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, United States of America

6 Department of Neuromusculoskeletal Medicine, College of Osteopathic Medicine of the Pacific, Pomona, California, United States of America

7 Pain and Headache Centre, Eagle River, Alaska, United States of America

Samenvatting

Fibromyalgie (FM) is één van de meest frequente aandoeningen met veralgemeende pijn, met slecht begrepen neurobiologische mechanismen. Deze aandoening is verantwoordelijk voor een enorm aandeel in de kosten voor de gezondheidszorg. Ondanks uitgebreide research, is de etiologie van FM onbekend en dus is er geen therapie beschikbaar voor deze aandoening. We tonen dat de meeste (mogelijks alle) patiënten met FM behoren tot een afzonderlijke populatie die kan worden afgescheiden van een controle-groep via het bepalen van geglycosyleerd hemoglobine-A1c (HbA1c), een alternatieve merker voor insuline-resistentie (IR). Dit werd aangetoond via de analyse van gegevens na stratificatie volgens leeftijd in een lineaire regressie model. Deze strategie toonde zeer significante verschillen tussen FM-patiënten en controle-individuen (p < 0.0001 & p = 0.0002, voor twee afzonderlijke controle-populaties, respectievelijk). Een subgroep patiënten die voldeden aan de criteria voor pre-diabetes of diabetes (patiënten met HbA1c-waarden van 5,7% of hoger) die een behandeling met metformine kregen, vertoonden dramatische verbeteringen van hun wijdverspreide myofasciale [myo = spier, fascia = bindweefsel-band onder de huid] pijn, zoals werd aangetoond via hun scores op een pre- en post-behandeling numerieke pijn-schaal (NPRS). Hoewel preliminair, suggereren deze een pathogeen verband tussen FM en IR, wat kan leiden tot een ingrijpende paradigma-verschuiving wat betreft het management van deze aandoening.

Inleiding

[…]

FM wordt beschouwd als een pijn-aandoening met centrale sensitiviteit die wordt gekenmerkt door abnormale verwerking van nociceptieve stimuli. Daarnaast wordt ook gedacht dat perifere mechanismen (zie bespreking aangaande ‘small-fibre’ neuropathie) bijdragen tot de wijdverspreide pijn. Er werden veel hypothesen vooropgesteld om de uitgebreide waaier aan symptomen (inclusief erfelijke abnormaliteiten, dysfunktie van neurotransmitter-mechanismen zoals substantie-P, immuun-ontregeling en meerdere andere) te verklaren. Jammer genoeg heeft geen enkele van deze voorstellen geleid tot praktische vooruitgang die verder gaat dan symptomatische behandeling. Eigenlijk hebben overzichten over FM […] geconcludeerd dat er geen substantiële vooruitgang werd geboekt wat betreft ons begrip over deze ziekte.

Eerdere observaties geven aan dat IR dysfunkties in de microvasculatuur van de hersenen veroorzaakt, leidend tot focale cerebrale hypo-perfusie. Aangezien gelijkaardige hersen-perfusie abnormaliteiten aanwezig zijn bij patiënten met FM, hypothiseerden we dat IR de ontbrekende schakel zou kunnen zijn bij deze aandoening. Om te zoeken naar initieel bewijsmateriaal ter ondersteuning van deze hypothese, voerden we een retrospectieve verkenning uit bij gegevens van FM-patiënten, met de focus op potentiële laboratorium-abnormaliteiten. In tegenstelling tot eerdere studies kwamen, na toepassing van een leeftijd-correctie op de voor de analyse beschikbare gegevens – specifiek voor de HbA1c-waarden, onverwachte bevindingen aan licht. We maken hier melding van een reeks patiënten met FM die behoren tot een afzonderlijke populatie die kan worden onderscheiden van een controle-groep via de HbA1c-waarden, een biomerker voor verstoord glucose-metabolisme, gekenmerkt door insuline-resistantie.

Om deze bevinding aan te vullen, bekeken we ook de evolutie van pijn-scores van patiënten met FM waarvan hun IR farmacologisch werd behandeld. Deze subgroep patiënten rapporteerde dramatische verbeteringen van hun myofasciale pijn na behandeling met metformine.

Dit bewijsmateriaal, hoewel preliminair, suggereert een pathogenetisch verband tussen FM en IR, wat kan leiden tot een paradigma-verschuiving bij het management van deze aandoening.

Materialen & methodes

Beschrijving van het staal

23 patiënten […] voldeden aan de 1990 alsook de 2010/2011 criteria van de ‘American College of Rheumatology’ voor de diagnose van FM (d.w.z. ‘tender-points’ bleven behouden bij de evaluatie). Co-morbide aandoeningen (inclusief voorgeschiedenis van cerebrovasculaire ziekte, Reumatoïde Artritis, onbehandelde endocriene abnormaliteiten, auto-immune aandoeningen, neuromusculaire ziekten, aktieve maligniteit, immunodeficiëntie of drug/alkohol-misbruik) werden uitgesloten. Medicatie geassocieerd met IR (glucocorticoïden, thiazide-diuretica [‘vochtafdrijvers’], atypische anti-psychotica, beta-blokkers, niacine [vitamine-B3], statinen [cholesterol-syntheseremmers], enz.) werden ook uitgesloten.

Aangezien er een gekend verband is tussen ‘small-fibre’ neuropathie en FM [Oaklander AL et al. Objective evidence that small-fibre polyneuropathy underlies some illnesses currently labeled as fibromyalgia. Pain. (2013) 154: 2310-6; zie ook ‘Fibromyalgie potentiële ‘small-fibre’ neuropathie’ /// Grayston R et al. A systematic review and meta-analysis of the prevalence of small fibre pathology in fibromyalgia: Implications for a new paradigm in fibromyalgia etiopathogenesis. Semin Arthritis Rheum. (2019) 48: 933-940], hadden vele van deze patiënten een laboratorium-onderzoek ondergaan in een geaccrediteerd lab. […]

[…]

Omdat perifere neuropathieën (inclusief ‘small-fibre’ neuropathie) die geassocieerd zijn met IR in de zeer vroege stadia van pre-diabetes kunnen beginnen, bestaat er bij experten een groeiende trend om vroege farmacologische interventies te starten om deze abnormaliteit te corrigeren, bijzonderlijk wanneer IR geassocieerd is met neuropathie of andere risico-factoren. Dit uitgangspunt volgend, werden patiënten die voldoen aan de criteria voor pre-diabetes (HbA1c-waarden van 5,7 of hoger) of voorheen nog niet gediagnostiseerde diabetes mellitus type-2, routinematig behandeling aangeboden en werd metformine 500 mg tweemaal per dag geïnitieerd. In ons patiënten-staal werd metformine toegevoegd aan ‘standaard behandeling’ voor wijdverspreide myofasciale pijn. Standaard behandeling (ST) bestond uit norepinefrine reuptake inhibitoren (amitriptyline, duloxetine of milnacipran) en/of membraan-stabiliserende agentia (gabapentine of pregabaline), afhankelijk van de verdraagbarheid of de voorkeur van de patiënten.

De ‘Numeric Pain Rating Scale’ (NPRS) is een uni-dimensionele meting van de pijn-intensiteit bij volwassenen die bestaat uit een of een 11-punten schaal voor de zelf-rapportering van pijn. Het is één van de meest courant gebruikte instrumenten in klinische en research-settings waarvan de validiteit is bewezen. De pijn-scores na initiële evaluatie, na ST en na toediening van metformine.

Statistische analyses

Om de door patiënten bijgedragen variatie te karakteriseren, werden sets van gesimuleerde HbA1c-gegevens gegenereerd om de populaties te emuleren die bron waren van de HbA1c-waarden bij de controles. Daarvoor gebruikten we mensen uit de FOS (‘Framingham Offspring Study’) met normale glucose-tolerantie [Effect of aging on A1C levels in individuals without diabetes: evidence from the Framingham Offspring Study and the National Health and Nutrition Examination Survey 2001-2004. Diabetes Care. (2008)] en de NHANES (‘National Health and Nutrition Examination Survey’) niet-diabeten, met leeftijden tussen 40 en 69. Aan de hand van het aantal, het gemiddelde en de ‘standard error’ van elke leeftijd-groep berekenden we de standaard-deviatie voor elke groep […]. De gemiddelden en ‘standard errors’ van de resulterende gesimuleerde gegevens voor elk leeftijd-bereik werden geverifieerd (gemiddelden binnen 0,1% en ‘standard errors’ binnen 4%). De HbA1c-gegevens van de gesimuleerde FOS met normale glucose-tolerantie en NHANES niet-diabeten werden gepaard met de HbA1c-metingen van de FM-patiënten, en er werd lineaire regressie uitgevoerd met betrekking tot leeftijd en groep (FOS met normale glucose-tolerantie (n = 1.350), NHANES niet-diabeten (n = 1.592) vs FM-patiënten (n = 23). […]

Resultaten

1. Verband tussen FM en HbA1c-waarden

Van alle gereviewde analyten, bleek enkel de HbA1c-waarde FM-patiënten te onderscheiden van controle-individuen. Ondanks het feit dat van veel patiënten met FM de HbA1c-waarden binnen de normale grenzen (gelijk aan of lager dan 5,6 %) lagen, wanneer we de gegevens volgens leeftijd werden opgedeeld en analyseerden, kwam een scherp omlijnd verschil tussen de groepen (FM-patiënten versus controles) aan het licht. De vergelijking aangaande het verband tussen HbA1c en groep – FOS met normale glucose-tolerantie, NHANES niet-diabeten & fibromyalgie – toonde dat voor de patiënten met FM de HbA1c gemiddeld 0,59 eenheden hoger lag dan FOS met normale glucose-tolerantie (p < 0.0001) en 0,39 eenheden hoger dan NHANES niet-diabeten (p = 0.0002).

De pijn-scores verschilden significant voor alle groepen (initieel, standaard behandeling, metformine-behandeling): p < 0.0001 […].

De HbA1c-waarden [tussen 5,1 & 6,5 %] van 23 patiënten met FM [35-60 jaar] (8 latinos; 11 blanken; 4 afro-amerikanen; 21 vrouwen, 2 mannen) werden vergeleken met de gemiddelden van twee controle-populaties: een niet-diabete populatie met normale glucose-tolerantie (FOS) en een niet-diabete populatie van de NHANES data-set. […] De HbA1c-waarden bij patiënten met FM werden geschat op gemiddeld 0,59 +/- 0,1 eenheden hoger dan FOS met normale glucose-tolerantie (p < 0.001) en 0,39 eenheden hoger dan NHANES niet-diabeten (p = 0.0002). […]

2. Daling van de pijn-scores na behandeling van IR

De subgroep patiënten die een farmacologische behandeling met metformine kregen voor IR, in combinatie met de standaard behandeling (ST), ondervonden een dramatische daling van de pijn-scores. De respons op metformine plus ST was een complete resolutie van de pijn (0 op 10 bij de NPRS) bij 8 van 16 patiënten die behandeld werden met metformine (50%), een mate van verbetering die nooit eerder werd gezien bij een dergelijke grote proportie FM-patiënten onderworpen aan eender welke beschikbare behandeling. In tegenstelling daarmee verbeterden patiënten die enkel ST kregen maar een compleet verdwijnen van de pijn werd over het algemeen niet vastgesteld. Interessant was dat sommige patiënten enkel op metformine reageerden en niet op ST (NSRIs of membraan-stabiliserende agentia). Belangrijk: er was een langdurig behoud van het analgetisch effekt van metformine.

Bespreking

De resultaten tonen een zeer significant verband tussen FM en HbA1c. Stratificatie van de waarden in een leeftijd-continuüm, tonen een duidelijk verschil tussen de patiënten en de controle-groepen. Bijna alle patiënten in de FM-groep vertoonden waarden op of boven het gemiddelde van de FOS controles, met zeer significante verschillen tussen de FM-patiënten en beide controle-groepen (p < 0.0001 & p = 0.0002 voor de FOS en NHANES controle-populaties, respectievelijk). Daarnaast vertoonden patiënten met FM waarvan IR farmacologisch werd behandeld dramatische en statistisch significante dalingen van de pijn-scores (p < 0.0001 voor alle groepen).

HbA1c meet IR niet op een directe manier; het wordt echter alom erkend als een alternatieve merker voor deze abnormaliteit. Niet-diabete individuen met matig gestegen HbA1c-waarden (5,7 – 6,4 %), behoren tot een stadium dat dikwijls ‘pre-diabetes’ wordt genoemd en lopen een hoger risico op het ontwikkelen van perifere neuropathieën, cardiovasculaire voorvallen, neurologische ziekten [Alzheimer’s, Parkinson’s, depressie] en mortaliteit door alle oorzaken.

In het licht van de wezenlijke research-inspanningen bij FM, inclusief deze door de farmaceutische industrie, waren we verward over het feit dat eerdere onderzoeken deze simpele bevindingen over het hoofd had gezien. De belangrijkste reden om hier op te letten, is het feit dat veel FM-patiënten HbA1c-waarden vertonen die momenteel wordt beschouwd als binnen de normale waarden; dit hier is echter de eerste studie die de gegevens op een leeftijd-gestratificeerde manier heeft geanalyseerd. Dit is belangrijk, gezien het effekt van het ouder-worden op HbA1c-waarden. Een waarde van 5,5%, bijvoorbeeld (als normaal beschouwd volgens de huidige criteria), kan dit daarom misschien niet zijn bij veel jonge mensen. Een bijkomende reden voor het missen van deze associatie zou als volgt kunnen zijn: eerdere studies hebben een verband vastgesteld tussen FM en ‘small-fibre’ neuropathie [zie Oaklander AL et al. & Grayston R et al. hierboven]. Hoewel IR een frequente oorzaak is van ‘small-fibre’ neuropathie, maakte de evaluatie van HbA1c geen onderdeel uit van het diagnostisch onderzoek van deze aandoening door de onderzoekers. In plaats daarvan werden andere methodes aangewend bij sommige studies (bv. orale glucose-tolerantie testen [zie Oaklander AL et al. hierboven]). Onze gegevens zouden, indien ze worden bevestigd, niet enkel de mechanismen kunnen verklaren die eigen zijn voor centrale pijn bij FM, maar ook het verband tussen deze aandoening en ‘small-fibre’ neuropathie.

Het is belangrijk eer te geven aan de inspanning van andere onderzoekers die ook naar dit verband hebben gezocht. Tishler M et al. [Fibromyalgia in diabetes mellitus. Rheumatol Int. (2003) 23: 171-3] vonden dat de incidentie van FM hoger lag bij patiënten met diabetes mellitus type-2 dan in hun controle-groep (18% vs 2%) en suggereerde een mogelijke relatie tussen deze twee aandoeningen. In een afzonderlijke studie rapporteerden Yanmaz MN et al. [The prevalence of fibromyalgia syndrome in a group of patients with diabetes mellitus. Rheumatol Int. (2012) 32: 871-4] gelijkaardige bevindingen.

Fava A et al. [Insulin resistance possible risk factor for cognitive impairment in fibromialgic patients. Metab Brain Dis. (2013) 28: 619-27] toonden dat IR een risico-factor was voor cognitieve stoornissen bij in FM-patiënten maar deze associatie bleef enkel beperkt tot cognitief verstoorde patiënten. Deze resultaten zouden problematisch zijn voor eender welke oorzakelijke hypothese omdat men geen oorzakelijkheid kan claimen voor een factor die slechts bij een kleine subgroep van de aangetaste populatie aanwezig is. Door het toepassen van de data-analyse strategie van onze studie, tonen we nu echter aan dat abnormaliteiten die waarschijnlijk gerelateerd zijn met IR veel meer voorkomen dan eerder werd gedacht en aanwezig kunnen zijn bij de meeste (als niet alle) patiënten met FM. Interessant is dat in de studie van Fava A et al. [zie hierboven], de body-mass-index van de individuen en de lende/heup-verhouding niet geassocieerd waren met een toename van het risico voor het ontwikkelen van cognitieve stoornissen, wat suggereert dat het voorkomen van IR bij deze patiënten niet noodzakelijk geassocieerd is met de verhoogde body-mass-index die dikwijls wordt vastgesteld bij patiënten met FM.

Op basis van onze gegevens willen we graag voorstellen dat IR pathogenetisch gelinkt is met FM. Er zijn echter meerdere waarschuwingspunten bij ons voorstel, die zorgvuldig moeten worden overwogen bij het ontwerpen van toekomstige klinische testen die deze hypothese proberen te bevestigen. Eén er van is de beperking die intrinsiek is voor een retrospectieve ‘cross-sectionele’ studie. Omdat IR en FM simultaan werden beoordeeld, is bewijs voor causaliteit moeilijker vast te stellen bij afwezigheid van een tijd-relatie. Ten tweede: FM-patiënten hebben courant overgewicht of zijn obees, factoren die kunnen voorbestemmen tot het ontwikkelen van IR. Ten derde: de resultaten van de farmacologische interventie werden bekomen door retrospectieve observaties van behandelde patiënten en geïnterpreteerd buiten de context van een gerandomiseerde placebo-gecontroleerde klinische proef. Ten laatste: metformine kan een effekt op chronische pijn hebben dat onafhankelijk is van z’n werking op IR. Het is gekend dat metformine mitochondriaal AMPK doet stijgen, wat kan resulteren in gedaalde mechanische allodynia [ervaring van pijn bij een gewoonlijk niet-pijnlijke prikkel] en nociceptor [pijn-receptor] -aktivatie. Een andere groep suggereerde trouwens dat metformine nuttig kan zijn bij FM [door de effekten op mitochondrieën], hoewel een verband met IR niet werd vermoed of onderzocht door de auteurs [Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and inflammation common events in skin of patients with Fibromyalgia. Mitochondrion. (2015) 21: 69-75 /// Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients. Biochim Biophys Acta. (2015) 1852: 1257-67]. In dit opzicht is het belangrijk voor toekomstige testen om medicijnen op te nemen die zich via andere mechanismen richten op IR. Tenslotte: andere merkers voor IR, zoals het ‘homeostasis model assessment for insulin-resistance’ (HOMA-IR) [computer-model voor de kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van insuline-resistentie en deficiënte beta-cel werking tot nuchtere hyperglycemie] en verwante testen dienen te worden onderzocht gebruikmakend van gelijkaardige analytische strategieën voor leeftijd-correctie en vergelijking met normale individuen. Fava A et al. [zie hierboven] konden in hun studie geen verschillen vinden voor deze test (HOMA-IR) tussen FM-patiënten en een controle-populatie maar er werden echter geen leeftijd-correcties toegepast.

Ondanks al deze waarschuwingpunten, spoort dit initieel rapport ons aan antwoorden te zoeken voor enkele uitdagende vragen die deze hypothese oproept. Het is onwaarschijnlijk dat een placebo-effekt alleen zou resulteren in de indrukwekkende mate van verbetering van langdurige pijn die werd ervaren door de patiënten die de combinatie van medicijnen (metformine plus ST) kregen. Het is opmerkelijk dat ‘non-responders’ opvallend afwezig waren in ons patiënten-staal; een dergelijk ongewoon en atypisch laag ‘number needed to treat’ (NNT [aantal patiënten dat (gedurende een zekere periode) moet worden behandeld om één gunstige uitkomst extra te bereiken of één ongunstige uitkomst extra te voorkomen]) zou eerder overéénkomen met een ziekte-modifiërende therapie.

Tot besluit: IR blijkt steeds meer geassocieerd met een brede waaier van neurologische aandoeningen en FM zou wel eens een bijkomende dergelijke aandoening kunnen zijn. Onze gegevens bieden preliminair bewijsmateriaal suggestief voor het feit dat IR een pathologische onderlaag bij FM kan zijn en dit vormt het decor voor toekomstige studies ter bevestiging van deze initiële observaties. Indien ze worden bevestigd, kunnen onze bevindingen zich niet enkel vertalen naar een ingrijpende paradigma-verschuiving voor het management van FM maar kan dit ook miljarden dollars besparen in de gezondsheidszorg-systemen wereldwijd.

juni 23, 2019

Abnormale accumulatie van bloed-lactaat bij herhaalde inspanning bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Inspanning — mewetenschap @ 6:20 am
Tags: , , , ,

Lees in verband met het gebruik van herhaalde inspanningstesten als diagnostisch instrument ook de volgende stukken op onze pagina’s ‘Dubbele fietstest’, ‘Post-exertionele malaise bij vrouwen met CVS’, ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’ & ‘M.E./CVS-patiënten niet in staat maximale VO2 te herhalen bij 2daagse fietstest’.

Voor onderstaande studie ondergingen de (vrouwelijke) deelnemers ook twee cardiopulmonaire inspanning testen (CPETs) met een tussentijd van 24 uur. De researchers vonden dat de zuurstof-opname (VO2) bij piek inspanning (VO2peak) lager lag bij de patiënten dan bij de controles voor de eerste test  en nog daalde bij de patiënten voor de tweede. Het verschil in VO2peak tussen de twee testen verschilde echter niet significant bij vergelijking van de groepen.

De voornaamste bevinding bij onderstaande studie is dat bij vergelijking van de eerste en de tweede fietstest werd vastgesteld dat er een toename van melkzuur (in het arterieel bloed) bij de vrouwen met M.E.(cvs) was, terwijl dit bij de controles was afgenomen. Voorafgaande lichamelijke aktiviteit doet dus de lactaat-accumulatie bij M.E.(cvs) stijgen, terwijl deze daalt bij gezonde mensen.

Er wordt door de auteurs gesuggereerd dat een verstoorde regulering van pyruvaat-dehydrogenase-kinase (PDK) – zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’ – mogelijks de opruimin van lactaat kan beïnvloeden. Onder andere ook de Belgische endocrinoloog Frank Comhaire heeft al geopperd dat de aktiviteit van dit enzyme verhoogd zou kunnen zijn en de werking van pyruvaat-dehydrogenase zou kunnen inhiberen. Andere (Noorse en Britse) onderzoekers dit contesteren (zie bv. ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’). De research gaat verder…

————————-

Physiological Reports Vol 11, e1413 (2019)

Abnormal blood lactate accumulation during repeated exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Katarina Lien (1,2), Bjorn Johansen (3), Marit B. Veierod (4), Annicke S. Haslestad (1), Siv K. Bohn (1), Morten N. Melsom (5), Kristin R. Kardel (1), Per O. Iversen (1,6)

1 Department of Nutrition, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, Oslo, Norway

2 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

3 Department of Respiratory Diseases, Rikshospitalet, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

4 Oslo Centre for Biostatistics and Epidemiology, Department of Biostatistics, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, Oslo, Norway

5 Department of Pulmonary Medicine, The Glittre Clinic, Hakadal, Norway

6 Department of Hematology, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

Samenvatting

Post-exertionele malaise en vertraagd herstel zijn karakeristieke symptomen van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Studies aangaande herhaalde cardiopulmonaire inspanning testen (CPET) tonen dat eerdere inspanning de zuurstof-opname (VO2) en kracht-ontwikkeling (power-output, PO) bij M.E./CVS negatief beïnvloedt. Of dit de arteriële lactaat-concentraties ([Laa]) beïnvloedt, is niet geweten. We bestudeerden 18 vrouwelijke patiënten (18-50 jaar) die voldoen aan de Canadese Consensus Criteria voor M.E./CVS en 15 gezonde vrouwen (18-50 jaar) die twee CPETs ondergingen met een tussentijd van 24 h (CPET1 & CPET2) waarbij de [Laa] elke 30 seconden werd gemeten. De VO2 bij piek inspanning (VO2peak) was lager bij patiënten dan bij controles voor CPET1 (P < 0.001) en daalde bij patiënten voor CPET2 (P < 0.001). Het verschil in VO2peak tussen de CPETs verschilde echter niet significant tussen de groepen. De [Laa] per PO was hoger bij patiënten tijdens beide CPETs (Pinteraction < 0.001), maar daalde bij patiënten en steeg bij controles van CPET1 naar CPET2 (Pinteraction < 0.001). Patiënten hadden een lagere VO2 (P = 0.02) en PO (P = 0.002) bij de gas-uitwisseling drempel (GET, het punt waar de CO2-produktie stijgt in relatie tot VO2), maar de relatieve intensiteit (%VO2peak) en [Laa] bij GET verschilden niet significant van controles voor CPET1. Patiënten vertoonden een reductie qua VO2 (P = 0.02) en PO (P = 0.01) bij GET voor CPET2, maar geen significante verschillen qua %VO2peak en [Laa] bij GET tussen de CPETs. Controles vertoonden geen significante verschillen qua VO2, PO of %VO2peak bij GET tussen CPETs, maar de [Laa] bij GET was gedaald voor CPET2 (P = 0.008). We besluiten: voorafgaande inspanning verslechtert de fysieke prestaties en verhoogt de [Laa] tijdens inspanning bij patiënten met M.E./CVS terwijl dit de [Laa] verlaagt bij gezonde individuen.

Inleiding

[…] De Canadese Consensus Criteria (CCC) en de Internationale Consensus Criteria (ICC) lijken allebei een subgroep patiënten te identificeren met ernstiger funktionele beperkingen, alsook uitgesproken fysieke en cognitieve symptomen. PEM [post-exertionele malaise] wordt gedefinieerd als een substantiële verergering van symptomen na milde tot matige lichamelijke, mentale of emotionele inspanning. PEM en vertraagd herstel na inspanning zijn verplichte criteria bij zowel de CCC als de ICC.

Een cardiopulmonaire inspanning test (CPET) geeft een accurate en objectieve beoordeling van de funktionele capaciteit. Herhaalde CPETs [‘dubbele fiestesten’] hebben aangetoond dat M.E./CVS-patiënten niet in staat zijn tot herhaling van de zuurstof-opname en power-output bij piek inspanning (VO2peak) en/of bij gas-uitwisseling drempel (gedefinieerd volgens de ‘V-slope’ methode [zie verder]), bij testen op twee opéénvolgende dagen [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492 /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J. Transl. Med. (2014) 12: 104 /// Nelson MJ et al. Diagnostic sensitivity of 2-day cardiopulmonary exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J. Transl. Med. (2019) 17: 80]. De gas-uitwisseling drempel is het punt waar VCO2 stijgt in relatie tot VO2, en wordt traditioneel gezien als een overgang van aërobe naar anaërobe energie-produktie, samenvallend met het begin van lactaat-accumulatie. De notie van weefsel-hypoxie [zuurstofgebrek] als voornaamste oorzaak van lactaat-accumulatie wordt echter niet meer aanvaard is. Lactaat is altijd het eind-resultaat van glycolyse, ook onder aërobe omstandigheden. Glycolyse stijgt tijdens inspanning en lactaat wordt snel uit de circulatie verwijderd, voornamelijk door oxidatie en gluconeogenese [vorming van glucose uit niet-koolhydraat bronnen]. Tijdens een oplopende inspanning test, treedt bloed lactaat accumulatie op wanneer de snelheid van het verschijnen van lactaat de snelheid van lactaat-verwijdering overschrijdt. Getrainde individuen hebben een lagere lactaat-concentratie in het bloed en een verhoogde lactaat verwijdering-snelheid voor een absolute inspanning-intensiteit, vergeleken met ongetrainde individuen. De snelheid waarmee lactaat verschijnt, bleek echter gelijkaardig voor getrainde en ongetrainde individuen bij dezelfde relatieve intensiteit, gedefinieerd als percentage VO2peak (%VO2peak).

Eerdere studies hebben geen consistente resultaten aangetoond wat betreft fysieke prestatie en lactaat-accumulatie bij M.E./CVS, maar lactaat-accumulatie tijdens herhaalde inspanning testen werd nog niet onderzocht. Het doel van deze studie was daarom te onderzoeken of VO2 en concentraties arterieel plasma lactaat bij verscheidene inspanning-intensiteiten verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles tijdens twee CPETs met een tussentijd van 24 h.

Materialen & methodes

Goedkeuringen

[…]

Individuen

[…] Alle in de studie opgenomen patiënten voldeden aan de CCC voor M.E./CVS. Uitgesloten: zwangere of bedlegerige patiënten of degenen met co-morbiditeiten die met CPET-resultaten kunnen interfereren (long- en hart-aandoeningen), of gebruikers van medicijnen waarvan is geweten dat ze fysieke prestaties beïnvloeden. De controles hadden geen eerdere of huidige ernstige ziekte, gebruikten geen regelmatige medicatie (orale contraceptiva waren toegelaten), hadden geen eerste-graads verwantschap met iemand met M.E./CVS en deden minder dan tweemaal per week een fysieke inspanning. Om PEM te wijten aan het reizen naar de studieplaats tot een minimum te herleiden, werd de patiënten aangeboden ter plaatse te blijven tijdens de test-periode. 18 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 15 vrouwelijke gezonde controles […].

Inspanning-testen

[…] Er werd de deelnemers gevraagd zich te onthouden van lichamelijke inspanning 72 h vóór de eerste CPET en ze werden getest na overnacht vasten (water-consumptie toegelaten). […] Spirometrie [meting van long-funktie/capaciteit] en elektrocardiogram bij ‘baseline’ op de eerste dag. Vóór elke test werd een katheter in de pols-slagader ingebracht voor bloedafname.

De deelnemers voerden twee maximale testen met oplopende inspanningen (CPET1 & CPET2) uit, met een tussentijd van 24 h, op een fiets-ergometer […] De snelheid waarmee de inspanning werd opgedreven werd individueel ingesteld, met de bedoeling VO2peak te bereiken binnen 8 à 12 min inspanning. Die snelheid was gebaseerd op eerdere en huidige aktiviteit-graad, lichamelijk onderzoek, leeftijd, lengte en gewicht, en varieerde van 10 tot 24 W/min voor de M.E./CVS-patiënten, en 15-30 W/min voor de controles. Het protocol omvatte een rust-fase van 2 min en 2 min onbelast pedaleren (60-75 rpm), gevolgd door een lineaire toename van de power-output tot vrijwillige uitputting of totdat de deelnemer niet meer in staat was de fiets-frequentie boven 45 rpm te houden. Ze werden sterk vocaal aangemoedigd tijdens de testen. […] Criteria om de inspanning-test te beëindigen, waren: tekenen van nood (bleekheid of duizeligheid, pijn op de borst, significante ritme-stoornissen) of van ischemie (ECG). Na het bereiken van VO2peak bleven de deelnemers door het masker ademen gedurende een herstel-periode van 3 min.

Analyses van biochemische merkers

Er werden arteriële bloedstalen afgenomen in rust vóór elke CPET en om de 30 seconden tijdens inspanning. De test-tubes bevatten een antiglycolytisch middel om verdere glycolyse te voorkomen. […] Er werden controle-sera gebruikt om de test-procedures te monitoren. Er werden ook arteriële bloedstalen genomen voor hemoglobine-analyse in rust vóór elke CPET en binnen de 90 seconden na piek-inspanning […].

Analyses van inspanning-variabelen

Er werd een gemiddelde gemaakt van de variabelen (gemeten per ademhaling) voor elke 30 seconden. De gas-uitwisseling drempel werd visueel vastgesteld via de ‘V-slope’ methode [uitzetten van de koolstofdioxide output (VCO2) tegen de zuurstof-opname (VO2) en vaststellen van een omslagpunt in grafieklijn; de overeenkomstige inspanning-intensiteit wordt beschouwd als de gas-uitwisseling drempel; wanneer lactaat accumuleert en aanleiding geeft tot acidose, versnelt VCO2 ten opzichte van VO2]; onafhankelijk door twee onderzoekers. De relatieve inspanning-intensiteit werd gedefinieerd als percentage van VO2peak (%VO2peak). Het punt waar [Laa] begon te accumuleren werd gedefinieerd als het lactaat-‘turnpoint’ (LT) en werd bepaald via log-log transformatie van [Laa] vs power-output […]. [Oorspronkelijk werd een grafiek van de log([Laa]) t.o.v. de log(VO2) uitgezet; deze werd lineair beschouwd en kan worden aangewend om de lactaat-drempel (beter) vast te stellen.] De power-output (lineair stijgend tijdens de test) werd verkozen boven zuurstof-opname om de noodzaak voor het afvlakken van zuurstof-curves voorafgaandelijk aan de log-log transformatie te vermijden, gezien het feit dat de zuurstof-opname niet noodzakelijkerwijs strikt lineair stijgt. We schatten ook de power-output voor een vastgelegde [Laa] van 4 mmol/l, dikwijls de ‘onset of blood lactate accumulation’ (OBLA) genoemd. Tijdens elke individuele CPET werd een aangepaste lijn voor [Laa] visueel geïnspecteerd om de corresponderende power-output (dichtstbijzijnde 0,5 W) te vinden.

Staal-grootte

[…]

Statistiek

[…]

Resultaten

Individu-karakteristieken

[…] Leeftijd en lengte waren gelijkaardig voor de twee studie-groepen maar de patiënten hadden een hoger lichaamsgewicht en BMI dan de controles. Spirometrie vóór CPET lag binnen normale grenzen voor beide groepen en er waren geen aanwijzingen voor long-aandoeningen. De hemoglobine-concentratie was gelijkaardig tussen de groepen voor CPET1 en CPET2.

Piek-inspanning responsen

VO2peak lag significant lager bij de patiënten t.o.v. controles voor beide CPETs. De VO2peak bleek verder gedaald van CPET1 naar CPET2 bij de patiënten maar het verschil qua VO2peak tussen de CPETs verschilde niet significant voor de twee groepen. De maximum hartslag en ‘respiratory exchange rate’ [RER; verhouding tussen het volume afgegeven CO2 en het volume opgenomen O2 = ca. 0,8 bij rust; kan groter dan 1 worden bij intense inspanning; dit vertegenwoordigt een objectieve meting voor fysiologische inspanning] verschilde niet significant tussen de groepen of tussen de twee CPETs. De power-output bij piek inspanning (POpeak) lag significant lager bij de patiënten t.o.v. controles voor beide CPETs, ook wanneer de power-output per lichaamsgewicht (POkg) werd bekeken. Beide groepen vertoonden een significante verandering qua POpeak van CPET1 naar CPET2. Het verschil in POpeak tussen de twee CPETs was niet significant verschillend tussen de groepen.

Lactaat-concentraties bij ‘baseline’ en tijdens de testen

[Laa] in rust verschilde niet tussen patiënten en controles vóór CPET1 maar bleken significant verschillend vóór CPET2. [Laa] per power-output en POkg lagen significant hoger bij patiënten dan bij controles voor beide CPETs (Pinteraction < 0.001). Verder steeg het verschil in [Laa] per power-output en POkg tussen de groepen van CPET1 naar CPET2 (Pinteraction < 0.001). De [Laa] curve bij CPET2 was significant verschoven naar links bij de patiënten (P < 0.001) en naar rechts bij de controles (P < 0.001), vergeleken met de [Laa] curves bij CPET1.

Gas-uitwisseling drempel

De VO2 bij de gas-uitwisseling drempel (GET) lag significant lager bij de patiënten dan de controles voor beide CPETs. De VO2 bij GET was verder gedaald bij de patiënten van CPET1 naar CPET2, maar het verschil qua VO2 bij GET verschilde niet significant tussen de groepen. De power-output bij GET was significant lager bij de patiënten t.o.v. de controles voor beide CPETs en was verder verminderd bij CPET2. Het verschil qua power-output bij GET was significant verschillend tussen de groepen. De relatieve inspanning-intensiteit (%VO2peak) verschilde niet significant tussen de patiënten en de controles voor eender welke CPET. De [Laa] bij GET was niet significant verschillend tussen de groepen bij CPET1 maar was significant gedaald bij de controles bij CPET2, en het verschil qua [Laa] bij GET van CPET1 naar CPET2 was significant verschillend tussen de patiënten en de controles. Noch de ‘respiratory exchange rate’ of de hartslag bij GET verschilde significant tussen de groepen of de CPETs.

Het lactaat-omslagpunt en aanvang van bloed lactaat accumulatie

Het lactaat-‘turnpoint’ (LT) trad op bij een significant lagere power-output bij de patiënten voor beide CPETs maar geen van beide groepen vertoonde enig significant verschil qua power-output tussen de CPETs. De [Laa] bij LT was niet significant verschillend tussen de groepen bij CPET1 maar was significant gedaald bij de controles van CPET1 naar CPET2. Het verschil qua [Laa] bij LT tussen de CPETs was significant verschillend tussen de groepen. De aanvang van de of bloed lactaat accumulatie (OBLA) trap op bij een significant lagere power-output bij patiënten verleken met controles voor beide CPETs. De power-output bij OBLA verhoogde significant bij de controles en verlaagde significant in de patiënten van CPET1 naar CPET2, en het verschil qua power-output bij OBLA van CPET1 naar CPET2 was significant verschillend tussen de groepen.

Bespreking

Uit deze studie over herhaalde CPETs bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles, bleek VO2peak en VO2 bij GET significant gedaald bij de patiënten, maar niet bij de controles, van CPET1 naar CPET2, maar de verschillen qua VO2peak en VO2 bij GET tussen de CPETs verschilde niet significant tussen de twee studie-groepen. De patiënten hadden echter verhoogde [Laa] voor elke absolute power-output in vergelijking met de gezonde controles, en zowel GET & LT trad op bij een significant lagere VO2 en absolute power-output bij de patiënten. Beide studie-groepen vertoonden gelijkaardige relatieve inspanning-intensiteit (%VO2peak) bij GET voor beide CPETs. Wanneer we her-testten na 24 h, vertoonden de controles geen significante vermindering qua power-output bij GET maar de [Laa] bij GET was significant gedaald. In tegenstelling daarmee vertoonden de patiënten een significante daling qua power-output bij GET voor CPET2, terwijl er geen significante vermindering qua [Laa] bij GET bleek. De power-output bij OBLA toonde hetzelfde patroon, met een daling bij de patiënten en een stijging bij de controles van CPET1 naar CPET2. De pre-inspanning [Laa] was ook significant verschillend tussen de twee studie-groepen voor CPET2. Vermits voorafgaande inspanning (CPET1) leidde tot lagere [Laa] per absolute power-output (verschuiving van de curve naar rechts) tijdens CPET2 door controles, steeg de [Laa] per absolute power-output en verschoof de curve naar links tijdens CPET2 door patiënten.

Herhaalde metingen van variabelen bij een cardiopulmonaire inspanning test tonen over het algemeen een goede reproduceerbaarheid bij patiënten met een matige inspanning-stoornis te wijten aan chronische ziekte, en ze kunnen ook op een betrouwbare en reproduceerbare manier worden bepaald bij patiënten met ernstige inspanning-intolerantie. Hoewel onze patiënten een verminderd aktiviten-niveau vertoonden, vergeleken met hun capaciteit van voor hun ziekte, was er geen enkele bedlegerig of ernstig lichamelijk beperkt. Alle deelnemers hadden een normale hemoglobine-concentratie, normale spirometrie-waarden vóór de CPETs, alsook een normale tot hoge ademhaling-reserve bij piek inspanning. De hoeveelheid afgenomen bloed tijdens CPET1 liep op tot ca. 150-200 ml wat de daling qua hemoglobine-concentraties in rust tussen de twee CPETs kan verklaren. De gemiddelde ‘respiratory exchange ratio’ en maximum hartslag waren gelijkaardig voor beide groepen tijdens beide CPETs, en de bevindingen zijn daarom waarschijnlijk niet te verklaren door opzettelijke onder-prestatie of gebrek aan moeite. De groepen patiënten en gezonde controles waren gelijkaardig qua geslacht, leeftijd en lengte, maar de patiënten waren zwaarder dan de controles. We rapporteerden daarom de resultaten voor power-output ook per lichaamsgewicht, maar dit had geen invloed op de resultaten.

In tegenstelling tot wat anderen vonden, verschilde het vermogen om VO2peak te reproduceren niet significant tussen de twee studie-groepen. Hoewel VO2peak significant daalde bij de patiënten, was de absolute verandering – naar onze mening – te klein om enige majeure verandering qua inspanning-tolerantie aan te geven of PEM te verklaren. Bovendien dient de daling van de hemoglobine-concentratie in rust (0,7 g/dl) bij beide studie-groepen van CPET1 naar CPET2 in overweging te worden genomen. Als een gemiddelde, is een daling qua hemoglobine-concentratie van 1 g/dl verantwoordelijk voor een vermindering qua VO2peak van 0,97 ml/kg/min. In onze studie zou dit overéénkomen met een verwachte gemiddelde daling qua peak VO2 van 0,68 ml/kg/min van CPET1 naar CPET2.

Het test-protocol toonde wel degelijk verschillen aan qua [Laa] tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor beide CPETs, en dit verschil steeg bij CPET2. Ongetrainde individuen zullen snel hun vermogen om lactaat te verwijderen verbeteren als ze regelmatig hun uithouding trainen, waarbij ze zodoende de lactaat-concentraties in het bloed voor een bepaalde belasting verlagen. Een dergelijke verschuiving naar rechts op de lactaat-curve kan worden aangetoond vanaf 24 h na eerdere inspanning en past goed bij de bevindingen bij onze controle-groep tijdens CPET2. [Laa] per absolute power-output is verhoogd bij ongetrainde vergeleken met getrainde individuen, en kan het verschil in [Laa] tussen patiënten en controles tijdens CPET1 verklaren. Men zou echter ook bij de patiënten nog steeds een verschuiving naar rechts hebben verwacht tijdens de tweede dag; zoals werd gezien bij de controles.

GET trad op bij een gelijkaardige relatieve inspanning-intensiteit (gedefinieerd als % van VO2peak) voor elke CPET bij zowel patiënten als controles. Tijdens CPET1 hadden de patiënten een lagere power-output bij GET dan de controles maar [Laa] was gelijkaardig voor de groepen. Tijdens CPET2 vertoonden de patiënten een daling qua power-output bij GET maar gelijkaardige [Laa], terwijl controles een gelijkaaridge power-output bij GET hadden maar gedaalde [Laa]. Dit onvermogen om power-output bij GET te reproduceren lijkt een consistente bevinding bij patiënten met CVS/M.E. [VanNess JM et al. Postexertional malaise in women with Chronic Fatigue Syndrome. J. Women’s Health (2010) 19: 239-244 /// zie ook ‘inleiding’: Vermeulen RC et al., Snell CR et al., Keller BA et al.]. Als dit enkel door deconditionering zou worden veroorzaakt, zou men gelijkaardige resultaten verwachten bij andere aandoeningen waar deconditionering, lage inspanning-tolerantie en vermoeidheid prevalent zijn. Patiënten met sarcoïdose en Multipele Sclerosis zijn echter in staat hun power-output bij GET te reproduceren, ondanks hun lage inspanning-capaciteit.

LT trad op bij een lagere absolute power-output bij de patiënten t.o.v. controles. De power-output bij LT verschilde niet tussen de twee CPETs bij geen van beide groepen, in tegenstelling tot onze bevindingen wanneer we de ‘V-slope’ methode [zie hierboven] toepasten. Een verklaring zou kunnen zijn dat sommige patiënten waarschijnlijk hun LT bereikten tijdens onbelast pedaleren tijdens CPET2, waarbij we geen lactaat-metingen verrichten. Dit zou de berekende regressie-lijnen beïnvloeden. Niettemin vertoonde [Laa] hetzelfde patroon, met gelijkaardige [Laa] voor CPET1 en significante [Laa]-verschillen tussen de twee studie-groepen tijdens CPET2.

Er werd een verschuiving naar links op de lactaat-curve bij M.E./CVS-patiënten gesuggereerd door Lane RJ et al. [Lactate responses to exercise in Chronic Fatigue Syndrome. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (1994) 57: 662-663] maar daaropvolgende studies bleken niet overtuigend. Bijvoorbeeld: maximale inspanning testen bij gezonde individuen en M.E./CVS-patiënten (diagnose via Fukuda criteria) toonde geen abnormaliteiten qua maximale zuurstof-opname, lactaat-accumulatie of verschillen in LT (bepaald via de log-log methode), of in veneus lactaat vs VO2. Anderen vonden verhoogde lactaat-accumulatie bij submaximale inspanning bij patiënten met een diagnose volgens de CDC 1988 definitie [Riley MS et al. Aerobic work capacity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. BMJ (1990) 301: 953-956], alsook in een deel van de M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de eerder onspecifieke Oxford criteria, waar individuen met normale lactaat-concentraties meer waarschijnlijk leden aan psychiatrische co-morbiditeiten. Twee andere studies vonden geen verschillen qua rust of maximale lactaat-concentraties, maar wel significant lagere lactaat-concentraties bij patiënten na inspanning [Gibson HN et al. Exercise performance and fatiguability in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (1993) 56: 993-998]. De discrepanties kunnen worden verklaard door de verschillende diagnostische criteria en inspanning-protocollen. Naar ons weten zijn er geen studies over herhaalde inspanning testen met lactaat-profielen op twee opéénvolgende dagen bij M.E./CVS-patiënten die voldoen aan definities waarbij PEM een verplicht symptoom is.

LT lijkt overéén te komen met een beperking wat betreft de snelheid van de metabole ‘clearance’ waarbij het verschijnen van lactaat de lactaat-verwijdering overstijgt, ongeacht de training-toestand; en het opkomen van lactaat lijkt nauw verwant te zijn met %VO2peak. Bovendien zijn lactaat-concentraties in het bloed bij dezelfde relatieve intensiteit gelijkaardig bij getrainde en ongetrainde mensen. Training verhoogt de intramusculaire lactaat-opruiming voornamelijk door het verhogen van de oxidatie door upregulering van mitochondriale proteïnen, en reduceert de netto lactaat-produktie in spieren dankzij gefaciliteerde lactaat-uitwisseling van glycolytische en oxidatieve vezels. Patiënten en controles hadden gelijkaardige [Laa] bij gelijke relatieve inspanning-intensiteit tijdens CPET1, maar de controles hadden een daling qua [Laa] bij zowel relatieve en absolute intensiteit tijdens CPET2 die niet werd gezien bij de patiënten. We stellen voor dat de voorafgaande inspanning leidde tot een verbeterde lactaat-verwijdering bij de controles tijdens CPET2, aangezien hun [Laa] gedaald was bij rust, bij de gas-uitwisseling drempel en bij het lactaat-keerpunt, en aangezien de aanvang van bloed lactaat accumulatie op 4 mmol/l gebeurde aan een hogere absolute power-output.

Er werd een verstoord energie-metabolisme bij M.E./CVS aangetoond door meerdere onderzoekers. Myoblasten opgegroeid in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertonen verhoogde mitochondriale ademhaling en lactaat-sekretie [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van M.E./CVS-patiënten hebben een verstoorde maximale respiratie-capaciteit vergeleken met gezonde PBMCs, wat een onvermogen om de respiratie adequaat te verhogen in respons op verhoogde metabole stress suggereert [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017) 12: e0186802]. In vitro elektrische puls stimulatie van spiercellen als een model om metabole veranderingen tijdens inspanning te onderzoeken, heeft verstoorde AMPK-fosforylatie en glucose-opname getoond in cellen van M.E./CVS-patiënten, en verminderde afgifte van IL-6 vergeleken met gezonde spiercellen [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10: e0122982]. Inspanning leidt tot een voorbijgaande upregulering van pyruvaat-dehydrogenase-kinase (PDK), bijzonderlijk tijdens herstel, maar keert terug naar rust-waarden binnen 24 h. PBMCs van M.E./CVS-patiënten tonen ge-upreguleerde expressie van PDK [zie Fluge O et al. hierboven], wat een verstoorde PDK-regulering suggereert die de pyruvaat-flux kan beperken met het potentieel de ‘clearance’ van lactaat te beïnvloeden via oxidatie. M.E./CVS-patiënten hebben verhoogde lipopolysaccharide (LPS) waarden in het bloed vergeleken met gezonde controles [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30]. Inspanning leidt tot verhoogde bakteriële translocatie bij M.E./CVS-patiënten en dit wordt voorgesteld als een mogelijke oorzaak van PEM [Shukla SK et al. Changes in gut and plasma microbiome following exercise challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS ONE (2015) 10: e0145453]. LPS zou het metabolisme kunnen beïnvloeden, ofwel via inflammatie en/of gestegen catecholaminen. Meerdere aandoeningen bleken geassocieerd met verhoogd lactaat en gestegen lactaat zou een poging kunnen zijn om de effekten van letsel en stress te lenigen eerder dan deze te veroorzaken.

Deze studie werd uitgevoerd bij vrouwelijke patiënten met milde tot matige M.E./CVS. De diagnose van patiënten op basis van klinische criteria i.p.v. door een valide biomerker draagt het risico van het opnemen van een minder representatieve groep. Een dergelijke biomerker bestaat nu echter nog niet. Idealiter zou men patiënten en controles met een gelijkaardig aktiviteit-niveau alsook gelijkaardig lichaamsgewicht moeten hebben. De sterktes van onze studie hier zijn het feit dat de patiënten voldeden aan de Canadese criteria waarbij PEM een vereist symptoom is, en dat alle patiënten door dezelfde arts werden geëvalueerd voorafgaandelijk inclusie. Alle opgenomen deelnemers bereikten vooraf gedefinieerde test-criteria voor maximale inspanning testen en arterieel lactaat werd elke 30 seconden geanalyseerd. Alle testen werden door dezelfde staf gesuperviseerd, en de test-condities waren voor alle deelnemers dezelfde, inclusief het tijdstip van de dag, metabole toestand vóór de testen (vasten), en dat de meeste patiënten in het test-centrum bleven om bijkomende inspanning tussen de testen te vermijden. Er dient te worden opgemerkt dat de patiënten aanzienlijke symptoom-verergering ervaarden na de testen, die dikwijls weken duurde.

Inspanning-intolerantie, PEM en vertraagd herstel zijn prominente symptomen bij M.E./CVS. Intrigerend is dat deze studie aangeeft dat voorafgaande inspanning de lactaat-accumulatie verhoogt bij M.E./CVS in tegenstelling tot de vermindering die wordt gezien bij gezonde controles, hoewel het mechanisme hiervoor nog moet worden vestgesteld. We weten niet of deze bevinding wijst op een centraal pathofysiologisch mechanisme bij M.E./CVS of dat het een secundair fenomeen is. Het zou zelfs een poging kunnen zijn om de negatieve impact te verlichten die inspanning lijkt te hebben bij deze patiënten. Verdere research is nodig om de oorzaken van deze abnormale respons op inspanning op te helderen.

mei 10, 2019

Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 11:57 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel (gefinancierd door de ‘National Institutes of Health’, de ‘ME Association’ & de ‘Medical Research Council UK’) is gebaseerd op stalen die door patiënten aan de Britse M.E./CVS Biobank werden gedoneerd. De tekst spreekt voor zichzelf. Er komen verdere aanwijzingen naar boven voor een abnormaal energie-metabolisme bij M.E.(cvs).

————————-

Diagnostics Vol 9, #2, p. 41 (2019)

Evidence of clinical pathology abnormalities in People with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome from an analytic cross-sectional study

Luis Nacul (1), Barbara de Barros (1), Caroline C. Kingdon (1), Jacqueline M. Cliff (1), Taane G. Clark (1,2), Kathleen Mudie (1), Hazel M. Dockrell (1), Eliana M. Lacerda (1)

1 Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, WC1E 7HT, UK

2 Faculty of Epidemiology and Population Health, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London,WC1E 7HT, UK

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende ziekte met extreme vermoeidheid, post-exertionele malaise en andere symptomen. Door de afwezigheid van een diagnostische biomerker wordt de diagnose van M.E./CVS klinisch gesteld, hoewel laboratoriumtesten routinematig worden aangewend om alternatieve diagnoses uit te sluiten. In deze analytische ‘cross-sectionele’ studie hadden we tot doel potentiële haematologische en biochemische merkers voor M.E./CVS en ziekte-graad te exploreren. We deden een review van laboratorium-test resultaten van 272 mensen met M.E./CVS en 136 gezonde controles participerend in de Britse M.E./CVS Biobank [UKMEB]. Na correcties voor multipele vergelijkingen lagen de meeste resultaten binnen de normale waarden, maar mensen met ernstige M.E./CVS vertoonden lagere mediane waarden (p < 0.001) van serum creatine-kinase (CK; mediaan = 54 U/l), vergeleken met gezonde controles (HCs; mediaan = 101,5 U/l) en minder-ernstige M.E./CVS (mediaan = 84 U/l). De verschillen qua CK-concentraties hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd, body-mass-index, spiermassa, ziekte-duur en aktiviteit-niveau […]. Dit is het eerste rapport over het feit dat serum CK-concentraties uitgesproken gedaald zijn bij ernstige M.E./CVS en deze resultaten suggereren dat serum-CK verder onderzoek verdient als een biomerker voor ernstige M.E./CVS.

1. Inleiding

[…] Hoewel ontregeling van de zenuw-, immuun- en endocriene stelsels met verstoord cellulair energie-metabolisme en ionen-transport werd gesuggereerd, wordt de pathofysiologie van M.E./CVS nog niet helemaal begrepen, en er zijn geen biologische merkers die alom gebruikt worden voor de diagnose, subgroepering of prognose.

[…] Een belangrijke doelstelling van klinische research bij M.E./CVS is het verbeteren van de diagnose-stelling, en het vinden van klinische en laboratorium-testen die kunnen worden gebruikt als ziekte-merkers. In 2011 lanceerden we de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB) als een hulpmiddel om M.E./CVS-research te versnellen. Een rigoureuze beoordeling, naast uitgebreide klinische fenotypering van de deelnemers, is essentieel om te verzekeren dat M.E./CVS-diagnose accuraat is volgens erkende klinische criteria. De analyse van deze klinische gegevens in relatie met molekulaire merkers ondersteunt verder het beter begrijpen van de ziekte-etiologie en -pathofysiologie. In deze studie vergeleken we resultaten van ‘baseline’ laboratorium-testen van UKMEB-deelnemers met M.E./CVS, inclusief mild/matig en ernstig aangetasten (d.i. aan huis gebonden en bedlegerige) individuen, en gezonde controles […]

2. Materialen en methodes

Deze analytische ‘cross-sectionele’ studie [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] werd uitgevoerd als een subgroep van de UKMEB-deelnemers die toestemming. De recrutering – inclusief opname-criteria, gegevens- en staal-collectie, en behandeling van bio-stalen voor de UKMEB – werden elders in detail beschreven [The UK ME/CFS Biobank for biomedical research on Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) and Multiple Sclerosis. Open J. Bioresour. (2017) 4: 4]. Volwassen deelnemers met M.E./CVS die eerder de diagnose kregen via huisartsen en/of M.E./CVS-specialisten en gezonde controles werden gerecruteerd via de Britse ‘National Health Service’ (NHS). De inclusie-criteria voor de deelnemers met M.E./CVS omvatten het beantwoorden aan de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ criteria (CDC 1994) of Canadese Consensus Criteria, wat werd vastgesteld door de klinici van het research-team. Ervaren research-verpleegsters beoordeelden alle deelnemers en er werd bloed afgenomen voor onmiddellijke ‘baseline’ klinische laboratorium-testen, alsook voor research-doeleinden en bewaring op langere termijn. De bloedafnames vonden plaats in de participerende klinieken of bij de deelnemers thuis (voor de ernstig geïnvalideerden), en de stalen werden binnen 6 uur overgebracht voor verwerking en bewaring. Gegevens-input, transport van de stalen, voorbereiding, verwerking en opslag van de stalen gebeurde volgens ‘standard operating procedures’ (SOPs).

De ‘baseline’ laboratorium-testen werden in de eerste plaats gebruikt om deelnemers met M.E./CVS uit te sluiten waarvan de chronische vermoeidheid door andere aandoeningen zou kunnen worden verklaard. Deze testen omvatten: bloedcel-tellingen, erythrocyten-sedimentatie (ESR), serum vitamine-B12 en folaat; biochemische testen met inbegrip van elektrolyten, creatinine [afbraakprodukt van creatine-fosfaat in spierweefsel; creatine is een tussenprodukt bij de energie-voorziening van spier- en zenuw-cellen], ureum, serum creatine-kinase (CK), lever-funktie testen, C-reaktief proteïne, reumatoïde factor, schildklier-funktie testen; transglutaminase-antilichamen [geassocieerd met coeliakie, artritis, inflammatoire darm ziekte]; en urine-analyse (proteïne, glucose & bloed). CK iso-enzymen, voornamelijk aangemaakt in skeletspieren (CK-MM) en hartspier (CK-MB), en aldolase [enzyme van het glycolyse-pad] werden geanalyseerd in een subgroep met 50 patiënten (25 ernstige & 25 niet-ernstige) en 25 controles. De bloedstalen werden in laboratoria geanalyseerd naargelang de afstand van de plaats van afname; er werden standaard NHS laboratorium-protocollen gebruikt voor alle testen. Het personeel van de NHS [Brits ‘National Health System’] laboratoria was geblindeerd wat betreft de status van de studie-deelnemers.

Deze studie omvatte een staal van 272 bevestigde M.E./CVS-gevallen en 136 gezonde controles. De M.E./CVS-patiënten werden verder geklassificeerd als mild/matig (n = 216) of ernstig ziek (n = 56). Het vaststellen van de ziektegraad gebeurde bij de recrutering op basis van het feit of de patient hoodzakelijk aan huis gebonden of bedlegerig (ernstig) or ambulant (mild/matig) was. We inspecteerden visueel de vorm van de distrubutie van de continue variabelen en, wanneer afwijkingen van normaalwaarden werd vastgesteld, gebruikten we wiskundige bewerkingen om gegevens te bekomen die een normale distributie benaderden voor [statistische] regressie-analyse. […]

We voerden ook regressie-analyses uit met leeftijd bij recrutering, geslacht, body-mass-index, ziekteduur, spiermassa index (percentage van totaal lichaamsgewicht) en recente aktiviteit als co-variaten. De aktiviteit-niveaus werden opgemaakt uit antwoorden op specifieke vragen (op maat gemaakte vragenlijst): er werd de deelnemers gevraagd hun ervaren aktiviteit-niveau van de 7 dagen vóór de bloedafname te categoriseren, gaande van “helemaal niet aktief” tot “zeer aktief”. Voor enkele analyses werden de twee extreme aktiviteit-categorieën samengevoegd en had de gebruikte variabele drie resulterende categorieën. [uitleg over statistische verwerking]

[…]

3. Resultaten

[…] Het aantal vrouwen was hoger bij de patiënten, die gemiddeld minder aktief waren en een lagere spiermassa hadden. De milde gevallen hadden de hoogste ‘body-mass-index’ (BMI) vergeleken met de ernstige gevallen (laagste) en gezonde controles.

Er werden 19 biochemische en 10 haematologische testen uitgevoerd. Zoals verwacht waren er correlaties tussen veel van de test-resultaten […], inclusief tussen: (i) creatinine & ureum, en beide met CK […]; (ii) CK & aspartaat-aminotransferase (AST [ASAT of SGOT; enzyme van belang voor de diagnostiek en follow-up van lever-aandoeningen en van myocard-infarct]) […]; (iii) albumine & vrij-T4, totaal proteïne & globuline […]; (iv) C-reaktief proteïne (CRP) & erythrocyten-sedimentatie-snelheid […]; (v) monocyten met witte bloedcellen, lymfocyten en neutrofielen […]. […] De verdelingen van de analyten werden vergeleken tussen patiënten en controles, en tussen ernstige en niet-ernstige M.E./CVS-gevallen. ESR, bloedplaatjes en CRP waren verhoogd bij de patiënten, terwijl CK en ureum verlaagd waren […]. Vergeleken met de milde gevallen hadden die met ernstige ziekte gestegen albumine, vrij-T4 en serum-folaat, en lager CK, CRP, kalium, creatinine en bilirubine […].

De gedaalde CK-waarden waren hoofdzakelijk te wijten aan lage waarden qua CK-MM iso-enzyme (gemiddeld 44 U/l […]) bij de ernstige gevallen, vergeleken met 73 […] bij de milde/matige en bij gezonde controles (p = 0.03). De waarden van CK-MB en aldolase waren ook laagst bij de ernstige gevallen […]. De verhouding CK-MB/CK-totaal was het hoogst bij de ernstig aangetaste gevallen: 0,26 […], t.o.v. 0,20 […] bij de niet-ernstige en 0,14 […] voor de gezonde controles (p = 0.03); wat een bevestiging is van de belangrijke bijdrage van gereduceerd CK-MM aan de lage concentratie van totaal CK bij de patiënten, en bijzonderlijk de ernstige gevallen. Totaal CK correleerde zeer sterk met CK-MM […] in alle studie-groepen, maar er werden zwakkere correlaties gevonden tussen totaal CK en CK-MB ([…]. Dit wijst verder CK-MM aan als de voornaamste bepalend factor van de gedaalde concentraties totaal CK bij M.E./CVS.

Uit de multivariate logistische regressie bleek dat (ln) CK-waarden omgekeerd geassocieerd waren met het risico voor M.E./CVS […]. Als we focussen op ernstige gevallen (vs. controles) onthulde dezelfde analyse dat verhoogde risicos geassocieerd zijn met lager (ln) bilirubine […] en lager (ln) CK […], alsook met hoger albumine […] en T4 […]. Op dezelfde manier waren lagere waarden voor creatinine […], (ln) bilirubine […] en (ln) CK […] geassocieerd met verhoogd risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS. [ln = natuurlijk logaritme; wiskundige bewerking, hier voor statistische verwerking]

Consistent met het bovenstaande, waren gestegen albumine-waarden geassocieerd met een groter risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS […].

De verschillen qua CK waren het meest consistent; er waren uitgesproken verschillen tussen patiënten en gezonde controles, waarbij ernstige gevallen veel lagere waarden vertoonden dan milde/matige gevallen of gezonde controles. Bij het her-aanpassen van de verschillende uitkomst-modellen met ofwel ureum, creatinine, bilirubine, albumine, T4 en CK, of met CK alleen, konden we een schatting maken van de waarde van CK als een potentiële merker voor M.E./CVS. Uit de analyse van de ROC-curve [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] voor routine serum-CK bleek een beperkte rol ter onderscheiding van M.E./CVS-gevallen van gezonde controles (AUC = 67%) maar een potentiële rol bij het onderscheiden tussen ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten en deze met milde/matige M.E./CVS (AUC = 75%) en van gezonde controles (AUC = 84%). Een compleet model met CK, bilirubine, albumine, T4, creatinine en CRP verbeterde de voorspellingen, bijzonderlijk wanneer ernstige gevallen werden vergeleken met niet-ernstige en gezonde controles (AUC = 91%; verbetering door enkel CK p << 0.001), en een gereduceerd model met CK, bilirubine, albumine en T4 gaf gelijkaardige resultaten (AUC = 90%).

We vonden dat een ‘cut-off’ waarde van 51 U/l voor serum-CK hoge gevoeligheid voor beide M.E./CVS-groepen vertoonde vergeleken met controles (sensitiviteit = 96%) en voor ernstige M.E./CVS-patiënten vergeleken met milde/matige gevallen (sensitiviteit = 88,7%). Deze hebben echter een lage specificiteit (< 50%).

Gezien het sterk verband tussen aktiviteit-graad en deelnemer-categorie – patient of controle – onderzochten we verder de associatie tussen (ln) CK en deelnemer-categorie in drie verschillende klassen van aktiviteit-niveau: “niet zo erg aktief or eerder niet-aktief”, “noch aktief noch inaktief” en “eerder aktief of zeer aktief”. De resultaten tonen duidelijk trends tot lagere CK-waarden bij patiënten, bijzonderlijk wanneer de ernstig aangetasten worden vergeleken met gezonde controles. De hoogste significantie (p < 0.001) wordt gezien bij degenen die verklaarden dat ze inaktief waren.

4. Bespreking

Routine laboratorium-testen blijken gewoonlijk normaal bij M.E./CVS-patiënten, wanneer ze worden aangewend ter uitsluiting van andere ziekten die chronische vermoeid veroorzaken. Eén van die routine laboratorium-testen voor M.E./CVS is serum-CK, waarbij studies typisch rapporteren dat CK-resultaten binnen normale waarden liggen als ze al worden gerapporteerd. We vonden dat M.E./CVS-patiënten lagere CK-waarden hadden dan gezonde controles, en dat CK significant lager was bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. degenen die mild/matig zijn aangetast. De verbanden hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd-groep, BMI, spiermassa of recente fysieke aktiviteit (die allemaal het potentieel hebben om de CK-concentratie in het serum te beïnvloeden), alsook ziekteduur waar dit geschikt was (t.t.z. wanneer gevallen met verschillende ziekte-graad worden vergeleken). Creatinine en bilirubine bleken ook significant lager bij ernstig-aangetaste patiënten t.o.v. gevallen met milde/matige M.E./CVS, terwijl albumine hoger lag bij ernstige gevallen. Er was een trend naar hoge waarden qua CRP en ESR bij M.E./CVS, en bijzonderlijk bij mild/matig zieken. CK-waarden bleken goede voorspellers voor ernstige M.E./CVS vergeleken met de minder ernstig aangetasten of gezonde controles; dit werkt versterkt door het opnemen van de resultaten van andere laboratorium-testen in het model.

4.1.Het fysiologisch en klinisch belang van CK

CK is een sleutel enzyme betrokken bij energie-produktie en homeostase-processen, bijzonderlijk in weefsels met zeer dynamische en fluctuerende energie-vereisten waaraan snel dient te worden voldaan, zoals de hersenen, skeletspieren en het hart. Het is ook aanwezig in veel andere cellen, zoals immuun- en epitheliale cellen, waar het ook een cruciale rol speelt bij in energie-produktie.

Cellulaire energie wordt hoofdzakelijk gegenereerd via de afbraak van het hoog-energetische molekule adenosine-trifosfaat (ATP). Hoewel de complexe mechanismen voor cellulair energie evenwicht niet volledig worden begrepen, is er bewijs voor het feit dat spiercellen afhankelijk zijn van meerdere processen om de energie-beschikbaarheid te verhogen en complete energie-depletie te voorkomen door gebruik te maken van ATP-voorraden. CK speelt een cruciale rol bij deze processen: ten eerste door het aanleggen van efficiënte voorraden hoog-energetische fosfaten in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] voor snelle ATP-heraanvulling, het katalyseert de re-lokatie van γ-fosfaat van ATP naar creatine om fosfocreatine en adenosine-difosfaat (ADP) te genereren, in een omkeerbaar proces; en ten tweede is het betrokken bij de transfer van hoog-energetische fosfaten van de mitochondrieën naar het cytoplasma van de spiercellen, waar het wordt aangewend tijdens spier-contractie. Zodoende kunnen metingen van CK in serum de beschikbaarheid van cellulaire energie aangeven.

CK serum-concentraties worden alom gebruikt om een waaier aan spierziekten te diagnostiseren en monitoren wanneer hoge waarden klinisch relevant zijn. Het is geweten dat CK-waarden stijgen bij spierletsels en inflammatie, en ze kunnen ook hoger zijn bij hypothyroïde myopathie [veralgemeende spierpijn en spierzwakte door tekort aan schildklier-hormonen] en secundair aan behandelingen met statinen [cholesterol-syntheseremmers]; verhoogde waarden van CK in het serum kunnen worden gezien bij getrainde atleten en individuen na extreme inspanning. Er zijn drie types CK, de zgn. iso-enzymen: CK-MM (in spieren en verhoogd bij vele spierziekten), CK-MB (bijzonderlijk in de hartspier) en CK-BB (meestal gevonden in de hersenen maar gewoonlijk niet te detekteren in perifeer bloed). CK-MB werd alom gebruikt bij de diagnose van ischemisch hart [verminderde bloeddoorstroming naar de hartspier], hoewel het nu werd verdrongen door andere ziekte-merkers.

Lage CK-concentraties in het serum werden minder frequent gerapporteerd maar ze kunnen klinisch van betekenis zijn bij sommige reumatologische en bindweefsel-ziekten. De oorzaken en significantie van deze bevindingen is onduidelijk maar er werd gesuggereerd dat serum-CK omgekeerd verband kan houden met inflammatoire processen, en lage CK-waarden bleken geassocieerd met spierzwakte, onafhankelijk van spier-atrofie. Een studie bij patiënten met ernstig nier-falen meldde een significant verband tussen lager serum-CK en een verhoogd sterfte-risico, en suggereerde dat de serologische bevindingen zouden kunnen worden verklaard door de verspilde spiermassa en slechte voeding-status van de patiënten, maar er was geen verdere suggestie om serum-CK aan te wenden voor de diagnose of het management van deze aandoeningen. In studies over Huntington’s, een ernstige degeneratieve neurologische ziekte, werd gesuggereerd dat gedaalde hersen-energie het resultaat kan zijn van de gereduceerde aktiviteit van het CK-systeem, en dat verlies van CK-BB een belangrijke onherkende biomerker van deze ziekte kan zijn.

De lage concentraties serum-CK die wordt gevonden bij mensen met M.E./CVS suggereren een abnormaal energie-metabolisme, wat door afzonderlijke auteurs werd gerapporteerd [Vernon SD et al. Preliminary evidence of mitochondrial dysfunction associated with post-infective fatigue after acute infection with Epstein Barr virus. BMC Infect. Dis. (2006) 6: 15 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Med. Genet. (2017) 18: 29 /// Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017) 12: e0186802 /// Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 12: 371-379] en kan de inspanning-intolerantie verklaren die courant wordt gemeld door de patiënten, en daaropvolgende verminderde aktiviteit. Een alternatieve of bijkomende verklaring is dat het gedaald serum-CK, minstens gedeeltelijk, het resultaat zou zijn van lichamelijke inaktiviteit. Niettemin suggereert het consistent significant verband tussen lager serum-CK en ziektegraad in het multivariaat model – dat controleert voor aktiviteit – dat deze resultaten niet volledig kunnen worden verklaard door verminderde lichamelijke aktiviteit maar dat er andere factoren betrokken zijn. Om een mogelijke verstorende rol van het aktiviteit-niveau verder te verkennen, vergeleken we de mediane serum-waarden van CK in verschillende aktiviteit-categoriën. De waarden waren in alle klassen gedaald bij de ernstige gevallen. Niettemin is er nog een potentieel voor bijkomende verstoring en differentiële mis-klassificatie qua aktiviteit, met overschatting van de aktiviteit bij ernstige M.E./CVS, blijft een mogelijke verklaring (ten minste gedeeltelijk), voor het geobserveerde verschil qua CK-waarden. Met het stijgend aantal rapporten over een abnormaal energie-metabolisme bij mensen met M.E./CVS is verdere verkenning van deze associatie echter gerechtvaardigd.

Naast de intolerantie voor fysieke inspanning rapporteren M.E./CVS-patiënten gewoonlijk ook mentale vermoeidheid en ‘hersen-mist’, alsook subjectieve spierzwakte. Als we het belang van CK bij zowel het spier- als hersen-metabolisme in overweging nemen, kunnen de lage concentraties van dit enzyme, minstens gedeeltelijk, deze symptomen verklaren.

Sommige researchers hebben eerder melding gemaakt van intrigerende bevindingen aangaande serum-CK bij M.E./CVS-patiënten. Bijvoorbeeld: twee studies met 30 en 33 individuen vergeleken de CK serum-concentratie van M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de CDC-1994 criteria) met deze van gezonde controles vóór en na inspanning, om de fysieke capaciteit te evalueren [Riley MS et al. Aerobic work capacity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. BMJ (1990) 301: 953-956 /// Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93]. De gemiddelde CK bij M.E./CVS-patiënten lag lager (hoewel niet significant) dan bij controles, en steeg niet door inspanning bij degenen met M.E./CVS (zoals wordt gezien bij gezonde individuen). De resultaten suggereren dat tekort aan acute lichamelijke inspanning niet de voornaamste factor was die de CK-waarden bij M.E./CVS bepaalt. Een andere studie bij M.E./CVS-patiënten vond hoger serum-CK bij deelnemers met enterovirus-specifiek RNA (detektie via spierbioptie) dan degenen zonder bewijs voor enterovirale infekties. Die studie suggereerde dat een subgroep M.E./CVS-patiënten spierschade zou kunnen vertonen secundair aan enterovirus-infektie maar jammer genoeg specifieerden de auteurs de CK-concentraties in de groep patiënten met lagere waarden niet [Archard C et al. Postviral fatigue syndrome: persistence of enterovirus RNA in muscle and elevated creatine kinase. J. Royal Soc. Med. (1988) 81: 326-329].

Andere studies overwogen mogelijke verstoring van de mitochondriale funktie bij M.E./CVS, wat de geloofwaardigheid van metabole dysfunktie in het energie-systeem bekrachtigt, zoals onze bevindingen aangeven.

4.2. Andere studie-bevindingen

De creatinine-waarden bleken significant lager bij ernstige M.E./CVS. Creatine-fosfaat (CP) wordt omgezet naar creatinine in spieren en creatinine wordt uitgescheiden in de urine, dus is laag CP het resultaat van mindere omzetting van creatine naar CP door CK en dit zou de lage creatinine-waarden kunnen verklaren die worden gevonden bij ernstige M.E./CVS. Lage urine-concentratie van creatinine werd ook gerapporteerd [???] [Lidbury BA et al. Activin B is a novel biomarker for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME) diagnosis: A cross sectional study. J. Transl. Med. (2017) 15, 1-10].

We vonden ook dat ureum gedaald was en bloedplaatjes, CRP & ESR verhoogd bij M.E./CVS, hoewel dit niet significant bleek bij de multivariate analyse. Er werd een omgekeerd verband tussen bloedplaatjes en CK gevonden in één studie aangaande Reumatoïde Artritis, samen met verhogingen van inflammatoire klinische merkers zoals ESR & CRP. Bloedplaatjes hebben ook de neiging te stijgen bij inflammatoire processen. Niettemin brengt het patroon van inflammatoire merkers in onze studie er ons toe te speculeren dat een bepaalde graad van inflammatie gerelateerd kan zijn met symptomen bij mensen met milde/matige M.E./CVS. Voor mensen met een ernstige graad van de ziekte, lijkt het dat de inflammatoire respons geïnhibeerd kan zijn, ofwel omwille van een gebrek aan blijvende stimuli of verstoring van sommige aspecten van de inflammatoire respons, wat kan duiden op chronische ziekte met gevestigde complicaties. Het is echter belangrijk om op te merken dat de wijzigingen qua inflammatoire merkers relatief bescheiden waren, en verdere veronderstellingen dienen op gepaste manier te worden getest en bevestigd in andere groepen. We vonden lagere ureum-waarden bij milde/matige gevallen maar niet bij degenen die ernstig zijn aangetast. Dit zou verband kunnen houden met creatinine-waarden, die ook lager waren bij M.E./CVS t.o.v. controles; voor creatinine waren de laagste waarden echter te vinden bij de patiënten met ernstige M.E./CVS. Abnormaliteiten in de ureum-cyclus werden ook al gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamano E et al. Index Markers of Chronic Fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990 /// Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv. Clin. Chem. (2014) 66: 121-172]

Onze bevindingen aangaande verhoogd albumine en T4 zijn moeilijk te verklaren. Gestegen albumine suggereert dat malnutritie geen belangrijke factor is bij M.E./CVS. De lichtjes verhoogde T4 kan kleine veranderingen gerelateerd met het schildklier-hormoon metabolisme suggereren […] (zoals eerder gesuggereerd door Ruiz-Núñez B et al. Higher prevalence of “low T3 syndrome” in patients with Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Front. Endocrinol. (2018) 9, 1-13). Deze hypothese werd echter niet bevestigd door andere bevindingen, die gelijkaardige T3- en TSH-waarden tussen de groepen toonden; ook zijn bevindingen niet typisch voor ‘euthyroid sick syndrome’ [abnormaal T3 en/of T4 maar de schildklier lijkt niet dysfunktioneel]. Er werd in het verleden een hogere prevalentie van Gilbert’s syndroom [lever-aandoening met verstoorde verwerking van bilirubine (afbraakprodukt van haem)] bij M.E./CVS voorgesteld [Cleary KJ & White PD. Gilbert’s and chronic fatigue syndromes in men. Lancet (1993) 341: 842] maar dit werd in deze studie niet gevonden: er werden gelijkaardige bilirubine-waarden getoond voor patiënten en controles, en gedaalde bilirubine-waarden bij mensen met ernstige M.E./CVS vergeleken met niet-ernstige gevallen.

Er zullen verdere onderzoeken bij grotere groepen en meer gedetailleerde exploraties nodig zijn om te bevestigen of lage CK-aktiviteit een primaire of secundair gebeurtenis is bij M.E./CVS of dat het, inderdaad, één of andere metabole dysfunktie weerspiegelt. Dit zou voordeel kunnen halen uit ge gebruik van “zieke” controle-groepen, zoals bepaalde orthopedische patiënten met langdurige immobiliteit. Ondertussen suggereren we dat CK kan worden aangewend als een potentiële merker voor ernstige M.E./CVS. Het is belangrijk de klinische anamnese en bevindingen van lichamelijk onderzoek in acht te nemen, alsook aktiviteit-metingen (bv. accelerometer [toestel dat de versnelling van het lichaam meet]) op het tijdstip van de bloedafname voor serum-CK. Bovendien moet een ‘hoog-normaal’ resultaat bij mensen die dikwijls sedentair of bedlegerig zijn, bijzonderlijk individuen met ernstige M.E./CVS, omzichtig geïnterpreteerd worden, aangezien het de aanwezigheid van spierletsel kan aangeven.

4.3. Studie-sterktes en zwakheden

De studie onderzocht een groep mensen met goed-gekarakteriseerde M.E./CVS op basis van robuuste standaarden voor gegevens- en staal-collectie zoals beschreven in het ‘UK M.E./CVS Biobank’ protocol. In termen van M.E./CVS-onderzoek was dit een groot staal: er werden 272 M.E./CVS-patiënten getest, inclusief 56 die ernstig waren aangetast. De beoordeling van het aktiviteit-niveau geschiedde echter via zelf-rapportering. Indien dit leidde tot een over-schatting van de aktiviteit-graad bij sommige groepen, dan zou tot differentiële mis-klassificatie kunnen hebben geleid, bv. als de minder aktieve en ernstig-aangetastte M.E./CVS-gevallen hun aktiviteit hebben overschat.

Het opnemen van ernstig-aangetastte M.E./CVS-individuen, die typisch afwezig waren in de meeste eerdere studies, kan belangrijk zijn voor het aantonen van niet eerdere gerapporteerde abnormaliteiten. De hier voorgestelde resultaten komen voort uit routine laboratorium-testen bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Het doel van de bloed-testen was voornamelijk het uitsluiten van andere ziekten die zich zouden kunnen voordoen met gelijkaardige symptomen; het onderzoeken van spier-gerelateerde biochemische abnormaliteiten was niet in respons op een specifieke hypothese die werd opgemerkt wanneer alle resultaten werden getest voor ‘null’-hypotheses ([geen verband tussen 2 gemeten fenomenen] van geen groep-verschillen tussen de studie-groepen op basis van laboratorium-testen). Dit betekent dat we niet in staat zijn abnormaliteiten in spier/energie-metabolisme meer gedetailleerd te onderzoeken. Ons vermogen om bevindingen verder te onderzoeken (bv. door verbeterde metaboloom-studies en via bio-bank stalen van de groep, inclusief op andere tijdstippen), zal echter bevorderlijk zijn voor een verder begrijpen van de hier gerapporteerde veranderingen.

5. Besluiten

Dit is de eerste studie die significant lagere concentraties qua CK bij M.E./CVS-patiënten toont. Sommige indicaties voor lage CK-waarden lijken eerder over het hoofd te zijn gezien wanneer de trend naar lagere waarden werd afgedaan als niet significant en niet verder werd onderzocht. Een enkelvoudige meting van serum-CK heeft wellicht onvoldoende sensitiviteit en specificiteit om als een biomerker voor M.E./CVS-diagnose te worden gebruikt maar, indien aangewend naast andere klinische en laboratorium-merkers, zouden routinematige CK bloed-testen kunnen helpen om de diagnose van M.E./CVS accuraat te stellen, maar ook om patiënten onder te verdelen volgens ziektegraad. Het zou mogelijks ook kunnen worden aangewend als een prognostische merker, en als een uitkomst-meting voor observationele studies en klinische proeven, alsook in de klinische praktijk, in afwachting van verdere longitudinale studies die de correlatie van klinische en op lab-testen gebaseerde fenotypes onderzoeken. Of mensen met ernstige M.E./CVS die een laag CK vertonen een unieke subgroep vormen met afzonderlijke patronen qua biochemische/pathofysiologische abnormaliteiten en symptomen, of dat ze een andere fase of een extreem spectrum van de ziekte vertegenwoordigen, dient nog te worden opgehelderd.

Onze bevindingen bieden betekenisvolle ondersteuning voor het groeiend bewijs aangaande metabole abnormaliteiten bij M.E./CVS, en we suggereren voldoende grote studies om een diepgaander onderzoek van specifieke metabole mechanismen ter opheldering van het feit of CK een primaire of secundaire abnormaliteit is bij alle of een subgroep van M.E./CVS-patiënten. Dergelijke studies kunnen ook helpen om de oorzaken van dergelijke abnormaliteiten op te helderen. Het correleren van serum CK-concentraties met objectief gemeten aktiviteit en andere energie-metabolisme parameters kan leiden tot een beter begrip van de pathofysiologische abnormaliteiten betrokken bij spier-gebruik en -herstel, en hun verband met symptomen zoals post-exertionele malaise en vermoeidheid.

januari 12, 2019

Metabolomica-biomerkers voor M.E.(cvs) impliceren een redox-onevenwicht

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 9:40 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel kwam mede tot stand door financiering van de ‘National Institutes of Health’ en het ‘Solve ME/CFS Initiative’. Het onderzoek werd mede uitgevoerd door gerenommeerde M.E.(cvs)-onderzoekers. Maureen Hanson heeft overigens een zoon met de ziekte…

De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. De research hier bekeek deze problematiek gebruikmakend van een andere methodologie en de resultaten werden vergeleken met die van een paar andere groepen (in de tekst wordt dan ook veelvuldig verwezen naar Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 & Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480) en naar eerder werk van de eigen groep (Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9).

Het lijkt ons een zeer belangrijk artikel gebaseerd op degelijke wetenschap en waar een brede waaier aan metabolieten (mogelijke biomerkers) wordt bekeken. Ook al is het aantal onderzochte individuen niet ontzettend groot, toch werden enkele interessante bevindingen vastgesteld. Sommige van de biomerkers blijken weerom betrokken bij energie-produktie. Er werden ook vergelijkingen gemaakt met enkele andere ziekten en er blijkt weinig overlapping; d.w.z. M.E.(cvs) is anders dan die aandoeningen, de bevindingen lijken specifiek. Ook de gelijkenissen met resultaten van andere onderzoeksgroepen geeft het werk extra draagkracht; ook al betreft geen ‘echte replicatie’.

De researchers besluiten dat ze meer bewijsmateriaal aandragen voor een dysfunktioneel metabolisme bij M.E.(cvs), en meer bepaald een redox-onevenwicht. Bij redox (een samentrekking van reductie/oxidatie) -reakties verandert de oxidatie-toestand (lees: lading) van atomen. Er worden bij dit proces elektronen overgedragen/uitgewisseld. Eénvoudig gezegd: een atoom ondergaat ‘oxidatie’ (verliest elektronen), een ander ondergaat een ‘reductie’ (neemt elektronen op). In de tekst verwijst men naar de reeds veelvuldig vermelde oxidatieve stress bij ME.(cvs)…

————————-

Metabolites Vol 8, #4, p 90 (december 2018)

Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology

Arnaud Germain (1), David Ruppert (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

2 Department of Statistical Science and School of Operations Research and Information Engineering, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ziekte met een enigmatische oorsprong en zonder vastgestelde geneeswijze. De constellatie van symptomen ruïneert de levens van miljoenen mensen overal ter wereld. Er werd de laatste jaren een plethora aan hypothesen tevergeefs onderzocht: de biologische basis van deze invaliderende aandoening blijft een mysterie. In deze studie onderzochten we of er een verstoring is in de homeostase van metabole netwerken in het plasma van een groep met 32 vrouwelijke patiënten vergeleken met 19 gezonde vrouwelijke controles. Een uitgebreide analyse van de dataset met 832 metabolieten gegenereerd d.m.v. Metabolon®, (die 8 biologische klassen beslaat), leverde belangrijke inzichten op wat betreft metabole ontregelingen die voorkomen bij M.E./CVS. We rapporteren over 14 metabolieten die in verschillende hoeveelheden voorkomen, wat ons toelaat een theorie te ontwikkelen omtrent een omvangrijk redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten, dat consistent is met bevindingen van eerder werk op het gebied van M.E./CVS. Bovendien biedt de analyse informatie betreffende gelijkenissen tussen metabolieten-ontregelingen bij M.E./CVS en deze die voorkomen bij andere ziekten, terwijl de biomerker-analyse ervan toekomstige plasma-biomerkers voor M.E./CVS opleverden. Dit werk voegt belangrijke elementen toe aan de ontwikkeling van M.E./CVS-diagnostiek, een cruciale stap die nodig is voor het ontdekken van een behandeling.

1. Inleiding

[…] Hoewel gegevens die M.E./CVS-deficiënties beschrijven zich blijven opstapelen, is er nog steeds geen verklaring voor de vele symptomen van de ziekte.

We onderzochten de hypothese dat de homeostase van metabole netwerken bij M.E./CVS-patiënten is ontregeld in vergelijking met gezonde controles. Vele studies, o.a. door ons lab, hebben reeds gebruik gemaakt van de snel-evoluerende massa-spectrometrie voor de identificatie van metabolieten en hebben de samenstelling van metabolieten in het bloed bij meerdere afzonderlijke populaties bekeken. Er begint zich een consensus af te tekenen, waarbij gewijzigde mechanismen worden gemeld in verscheidene studies. Namelijk: meerdere studies hebben vastgesteld dat het metabolisme van lipiden, oxidatieve stress and energie relevant is bij M.E./CVS. Jammer genoeg werd niet één enkele of redelijk kleine set metabolieten bepaald als zijnde de basis metabole signatuur van deze aandoening. Niettemin werden statistisch significante verschillen qua plasma- of serum-metabolieten in meerdere groepen aangetoond, gebruikmakend van verscheidene metabolomica-instrumenten, door een reeks deskundige teams. Er werden ook verschillen tussen metabolieten-profielen van vrouwen en mannen met M.E./CVS gezien [Naviaux RK et al.].

In dit rapport werken we verder op 14 metabolieten die verschillend qua hoeveelheid bleken tussen onze vrouwelijke patiënten en gezonde controles, en connecteren deze bevinding met een groter beeld qua dysfunktie van metabole mechanismen. De in de kijker lopende mechanismen sturen ons begrip over de ziekte naar een effekt op redox-reakties, die een focus in verscheidene studies bleken [bv. Richards RS et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox. Rep. (2000) 5: 35-41 /// Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: acute infection and history of physical activity affect resting levels and response to exercise of plasma oxidant/antioxidant status and heat-shock proteins. J. Intern. Med. (2012) 272: 74-84 (zie ook ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’) /// Fenouillet E et al. Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients. J. Transl. Med. (2016) 14: 251]. We tonen aan dat we onze eigen studies kunnen kruis-valideren met gegevens van gepubliceerde rapporten van andere onderzoekers. Het is onze bedoeling dieper onderzoek naar metabolomica bij M.E./CVS te inspireren, met het ontwikkelen van diagnostische testen als doel.

2. Resultaten

2.1. Onderzoeksgroepen

De stalen in deze studie zijn een subset van de populatie die werd geselekteerd voor onze darm-microbioom analyse en een uitbreiding van de piloot-groep die werd gebruikt in onze eerste metabolieten-analyse [Germain A et al.]. Het betreft in het totaal 19 controles en 32 patiënten, allen vrouwen, gematcht voor leeftijd [mediaan controles & patiënten: 50 jaar] en ‘body-mass-index’ (BMI) [mediaan: controles 26,1 – patiënten 24,4]. Alle patiënten voldeden aan de 1994 Fukuda definitie voor M.E./CVS […].

De demografische gegevens waren gelijkaardig met deze van de datasets van Naviaux et al. en Germain et al. wat betreft leeftijd en BMI. De populatie van Armstrong et al. was 15 jaar jonger (geen info over BMI).

2.2. Metabolieten-gegevens en statistische verwerking

Het Metabolon® platform liet de identificatie en meting toe van in het totaal 832 metabolieten […]. De metabolieten-klassen waren: aminozuren (177), koolhydraten (26), co-factoren & vitaminen (28), energie (10), lipiden (353), nucleotiden (29), peptiden (33) en xenobiotica (176). Deze acht super-mechanismen, zoals door Metabolon® gedefinieerd, kunnen verder worden onderverdeeld in 83 sub-mechanismen. […] Hoewel de namen van de meeste super-mechanismen duidelijk zijn, is het relevant om op te merken dat de categorie xenobiotica wordt gevormd door metabolieten behorend tot de volgende sub-mechanismen: benzoaat-metabolisme (11%), chemische stoffen (14%), medicijnen (40%), voeding-componenten/plantaardig (24%), tabak-metabolisme (2%) en xanthine-metabolisme (9%).

[…]

[…] Metabolon® super-mechanismen worden door Metabolon® gedefinieerd volgens uitgebreide ‘review’ van de literatuur maar uiteindelijk ‘in house’, aangezien er vanzelfsprekend meerdere mechanismen zijn waar een molekule kan worden gecategoriseerd. Super-mechanismen zijn het resultaat van een groepering van sub-mechanismen volgens hun belangrijkste kenmerk […]. Sub-mechanismen zijn het resultaat van de klassificatie van metabolieten in de voornaamste metabole mechanismen waartoe ze behoren, zoals overééngekomen bij metabolomica-normen. […]

Statistische verwerking vond 60 metabolieten (7% van de metabolieten-netwerken) met significante verschillen (p < 0.05). […] 50% van deze 60 behoren tot de lipiden-categorie en 15% tot de aminozuren-categorie.

Er werd een correctie uitgevoerd op de p-waarden om te controleren voor ‘false discovery rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]). […] Toegepast op elke biologische klasse metabolieten volgens Metabolon®’s nomenclatuur, kwamen we uit op 9 significant verschillende metabolieten (controles vs. patiënten) [zie hieronder].

2.3. Metabolieten die meest aangetast zijn bij M.E./CVS behoren tot 4 klassen

De 9 metabolieten die hieronder worden besproken, behoren tot de volgende 4 super-mechanismen: co-factoren & vitaminen, energie, nucleotiden en peptiden. […].

Vier van deze metabolieten worden geklassificeerd bij co-factoren & vitaminen. Haem, het pigment dat bloed z’n rode kleur geeft, is één van de meest statistisch verschillende metabolieten, dat veel meer voorkomt bij patiënten t.o.v. controles. Haem bestaat uit een ijzer-ion in het centrum van een grote organische ring en wordt vooral in haemoglobine gevonden, maar ook in enkele andere haemoproteïnen, met wisselende funkties die allemaal verband houden met redox-chemie. Vrij haem is zeer cytotoxisch en schadelijk voor weefsels door z’n pro-oxidatieve en pro-inflammatoire eigenschappen, aangezien het in staat is de vorming van vrije radikalen te katalyseren.

De andere drie metabolieten zijn onderdeel van het vitamine-E mechanisme en waren significant lager bij de patiënten. Vitamine-E [tocoferol] is een vet-oplosbaar anti-oxidant dat de verspreiding van reaktieve zuurstof-soorten door lipiden-membranen te belemmeren. Gamma-CEHC [carboxyethyl-hydrochroman] is de geoxideerde vorm van gamma-tocoferol uit de voeding en is anti-inflammatoir, de andere twee zijn glucuronide-conjugaten van alfa-CEHC en gamma-CEHC, allebei significant circulerend in het bloed.

Een andere metaboliet van belang is alfa-ketoglutaraat, één van de tien energie-metabolieten waar we gegevens over hebben in deze studie. Onze gegevens geven aan dat het hoger is bij de patiënten. Alfa-ketoglutaraat is een essentiële biologische molekule die wordt gevonden in veel biologische mechanismen, verbonden met het aminozuren-metabolisme en onderdeel van de TCA-cyclus, die zich afspeelt in de mitochondrieën, waar chemische energie wordt geproduceerd door de oxidatie van pyruvaat.

De volgende drie metabolieten behoren tot de klasse nucleotiden en komen alle drie minder voor bij patiënten vergeleken met controles. Er is niet veel geweten over 2’-O-methylcytidine, buiten het feit dat het onderdeel is van het pyrimidine-metabolisme. Aan de ander kant zijn adenosine-3’,5’-cyclisch monofosfaat (cAMP) en inosine-5’-monofosfaat (IMP) een deel van het purine-metabolisme, en beide geassocieerd met ATP/AMP, respectievelijk, en zijn zodoende gelinkt met het energie-metabolisme. Hoewel over de funktie van IMP in het bloed nog wordt gediscussieerd, staat cAMP bekend als een a centrale intracellulaire regulator die hormonale mechanismen beïnvloedt.

Ten slotte werd gamma-glutamyl-threonine, een dipeptide [2 aminozuren] uit de klasse peptiden, waarvan significant hogere bloed-waarden werden gedetekteerd bij de patiënten. Afgezien van het feit dat deze molekule een intermediair afbraak-produkt van proteïnen is, is weinig bekend aangaande z’n fysiologisch effekt in het bloed. Het wordt echter geciteerd in een patent als een potentiële biomerker voor lever-toxiciteit.

2.4. De MetaboAnalyst statistische analyse biedt bijkomend waardevol inzicht in de dataset

Dit instrument […] brengt enige biologische significantie in de statistische analyse. Een totaal van 7 metabolieten sprong er boven uit […], twee overlappen met de statistisch significante metabolieten hierboven beschreven: haem en IMP.

Alle andere hiermee geïdentificeerde metabolieten kwamen meer voor bij patiënten dan controles. Deze omvatten tauroursodeoxycholaat (TUDCA; zowel een cytoprotectief agens als een chemisch chaperone [molekule die helpt bij het vouwen of ontvouwen en het op- of afbouwen van macromolekulaire strukturen (proteïnen/DNA)]), 3-hydroxybutyrylcarnitine-1 & 3-hydroxybutyraat (BHBA; allebei betrokken bij ketose [verhoogde concentratie ketonen, veroorzaakt door afbraak van vetzuren], een metabool proces geassocieerd met energie en glucose), piperine (een alkaloïd dat wordt gevonden in kruiden en specerijen) en histamine (een molekule waarvan de betrokkenheid bij veel aspecten in het menselijke lichaam is gekend, inclusief lokale immuun-responsen, een werking als centrale neurotransmitter en een vasodilator).

2.5. De MetaboAnalyst aanrijking-analyse biedt ovetuigende met ziekte geassocieerde plasma metaboliten-sets

Het aanrijking-analyse instrument laat vergelijking toe tussen een te onderzoeken metabolieten-dataset […] en gekende, met ziekte geassocieerde metabolieten-sets. […] Hoewel dit instrument metabolieten identificeert die op de zelfde manier variëren als bij andere ziekten [o.a. obesitas, hart-falen, diabetes-ketoacidose, anoxie, …], is het niet de intentie dit te gebruiken om te impliceren dat alle metabolieten-veranderingen bij M.E./CVS identiek zijn met deze die voorkomen bij bepaalde andere ziekten.

[…] Eén van de intrigerende patronen is dat bij 4 van de 10 beschreven ziekten (40%), een dehydrogenase-, oxidase- of transferase-deficiëntie betrokken is. Die zijn allen mogelijks gelinkt met enig onevenwicht in de redox-toestand aangezien het zeer onwaarschijnlijk is dat ze het resultaat zijn van gen-mutaties in de verscheidene aangetaste mechanismen.

Omdat de statistische betrouwbaarheid van deze module na correctie slecht is […], voerden we dezelfde analyse uit op gepubliceerde datasets, inclusief ons eerder werk, waar een dergelijk instrument nog niet werd gebruikt. Dergelijke navorsingen gaven gelijkaardige resultaten maar met een grotere statistische ‘power’ voor sommige. We namen enkel de ziekten op waar minstens de helft van de metabolieten-veranderingen geassocieerd waren met het patient-fenotype, aangezien het instrument ook resultaten oplevert betreffende wijzigingen die enkel pertinent zijn voor de verschillen qua controle metaboliet-waarden. We hebben opzettelijk gekozen de afzonderlijke metabolieten die door deze module worden gebruikt niet te bespreken (aangezien het niet onze intentie is M.E./CVS te linken met deze ziekten) maar in plaats daarvan mogelijke trends wat ziekte-associatie te bekijken. We bespreken de mogelijke links tussen M.E./CVS-symptomen en gekende fysiologische dysfunkties hieronder.

Van de 10 metabolieten-sets van de Metabolon® dataset, waren er 6 aanwezig bij Armstrong et al. of Germain et al. Dit toont een sterke gemeenschappelijkheid, een kenmerk dat we verder zullen verkennen in 2.7.

Ons eerder werk geeft overvloedige voorbeelden van dehydrogenase-, carboxylase-, hydrolase- & transferase-aktiviteit deficiënties, enkele spier-gerelateerde aandoeningen door varianten van carnitine-deficiënties, en enkele suiker-gerelateerde onevenwichten. De Armstrong et al. dataset levert ook talrijke dehydrogenase- & carboxylase-defekten op. Globaal overheersen dehydrogenase-, transferase- & oxidase-deficiënties, en een dergelijk patroon leidt tot onze suggestie dat een algemeen onevenwicht een dergelijk type reakties belemmert.

Een opvallende aandoening die werd gevonden in de dataset-analyse is anoxie (samen met asfyxie [zuurstof-tekort/verstikking]), een extreme vorm van hypoxie, wanneer het lichaam (of een gebied) over extreem weinig zuurstof beschikt. Bij een gezonde persoon die lijdt onder hypoxie, treedt vermoeidheid, verwarring, hoofdpijn en dof gevoel in de ledematen op, allemaal symptomen die optreden bij M.E./CVS-patiënten. De zuurstof-status van weefsels kan mogelijks aangetast worden door de ontwrichting van de hoeveelheid haem die we beschreven. Gedaalde cerebrale bloeddoorstroming, die kan resulteren in inadequate brein-oxygenatie, is een hypothese gelinkt met de cognitieve stoornissen bij M.E./CVS-patiënten [Biswal B et al. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J. Neurol. Sci. (2011) 301: 9-11 /// Staud R et al. Task related cerebral blood flow changes of patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin labeling study. Fatigue (2018) 6: 63-79].

Veel ziekten gerelateerd met ketose keren ook terug in de analyse en zijn het gevolg van een overmatige toename van ketonen in het bloed, een proces dat hierboven werd vernoemd bij het bespreken van 3-hydroxybutyraat (BHBA) en 3-hydroxybutyrylcarnitine-1. Bv.: diabetes-ketoacidose resulteert uit een onvermogen om koolhydraten te gebruiken voor energie-voorziening, leidend tot metabolisme van vetten en zodoende enige verstoring van het gebruik van koolhydraten bij M.E./CVS.

Ten slotte: persistente hyperinsulinemische [te veel insuline in het bloed] hypoglycemie bij kinderen (PHHI) was een andere ziekte die werd gevonden in twee datasets en die mogelijks kan worden gelinkt met hersen-aktiviteit. Andere ziekten die het vermelden waard zijn met betrekking tot hersen-funktie betreffen correlaties met metabolieten die worden gevonden bij schizofrenie, toevallen en epilepsie, alsook meerdere syndromen waarbij de gezondheid van de ogen betrokken is. In het bijzonder: een courant symptoom bij M.E./CVS-patiënten is de extreme gevoeligheid voor licht.

2.6. De MetaboAnalyst biomerker-analyse levert toekomstige (plasma)biomerkers op voor M.E./CVS

Het ‘machine-learning’ attribuut dat wordt gebruikt om het diagnostisch vermogen te illustreren is de ‘receiver operating characteristic’ curve (ROC-curve), die echt-positieven en vals-positiven integreert. De resulterende grafiek laat de berekening toe van een ‘area under the curve’ (AUC): hogere waarden wijzen op een hogere waarschijnlijkheid van accurate klassificatie van een staal.

De hoogste voorspellende waarden werden bereikt met pyroglutamine [metaboliet in de glutathion-cyclus] en haem: AUCs van 0.75.

Globaal waren er 24 metabolieten met een AUC boven 0.70 [AUC (maat voor diagnostische accuraatheid = 1 betekent perfekt; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] (inclusief haem, tauroursodeoxycholaat, gamma-CEHC, gamma-CEHC-glucuronide, IMP, alfa-ketoglutaraat, terwijl veel van de andere molekulen lipiden zijn).

2.7. Analyse geeft aan dat bijna 100% van de kruis-geïdentificeerde metabolieten een gelijkaardig statistisch gedrag vertoont tussen studies

De toepassing van metabolomica op M.E./CVS-stalen staat nog in z’n kinderschoenen: er zijn nog maar enkele studies gepubliceerd. Om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen research-teams, met afzonderlijke populaties en metabolieten-identificatie technologieën, te beoordelen, besloten we paarsgewijze vergelijkingen uit te voeren. Er dient te worden opgemerkt dat als de ziekte geen effekt vertoont in elk van de twee studies, dat onze test dan niet-significant zal zijn.

De eerste vergelijking was deze tussen onze Metabolon® dataset en Germain et al., die een kleinere maar gedeeltelijk overlappende populatie op een verschillende massa-spectrometrie platform gebruikte. De vergelijking betrof 149 metabolieten met dezelfde HMDB [‘Human Metabolome Database’] -identiteit. De hypothese die werd getest was dat het gemiddeld verschil […] tussen controles en patiënten dezelfde is voor beide studies. Geen van de gevonden metabolieten-patronen bleek te verschillen tussen de twee studies.

We gingen dan over tot het vergelijken van de volledige Metabolon® dataset met alle gegevens van Germain et al. In dit geval bleken 145 van de 149 metabolieten zich anders te gedragen […] op 4 uitzonderingen na: dihydrothymine [intermediair in het metabolisme van het nucleotide thymine], taurine [zwavel-bevattend organisch zuur met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie; bleek al van belang voor de differentiatie tussen FM en controles], spermidine [inhibeert stikstofoxide-synthase] en acetylcarnosine [anti-oxidant], die allen significant verschillend bleken tussen controles en patiënten bij Germain et al.

De volgende vergelijking betrof de volledige Metabolon® dataset en de vrouwen-dataset van Naviaux et al. Van de 154 metabolieten met dezelfde HMDB-identiteiten bleken er slechts twee, adenosine en flavine-adenine-dinucleotide (FAD), statistisch verschillend tussen de twee studies. Dit verschil kan te wijten zijn aan de afname-methode van het plasma (EDTA voor onze stalen, lithium-heparine bij Naviaux et al.).

Een andere vergelijking was een dataset van Armstrong et al. en de volledige Metabolon® dataset. Alhoewel slechts 26 metabolieten gemeenschappelijke HMDB-IDs hadden, gedroegen er zich 14 statistisch op dezelfde manier.

De uiteindelijke combinaties omvatten Germain et al. & Armstrong et al., Germain et al. & Naviaux et al., en Armstrong et al. & Naviaux et al.; en de resultaten waren zeer gelijkaardig: respectievelijk 87%, 98% en 91% van de metabolieten die zich statistisch niet verschillend gedroegen.

Belangrijk is het terugkerend verschijnen van hypoxanthine [afgeleide van purinen, bouwstenen van nucleïnezuren], een metaboliet dat significant verschillende bleek tussen de studies, samen met enkele andere metabolieten, altijd bij vergelijkingen met de Armstrong et al. dataset. Het is belangrijk om op te merken dat de Armstrong dataset werd verkregen via analyse van serum i.p.v. plasma (wat werd gebruikt bij alle andere studies). Alhoewel plasma en serum onderdelen van totaal bloed zijn, werden significante verschillen qua metabolieten-profielen aangetoond.

2.8. Hiërarchische clustering levert geen definitieve subgroep-identificatie op

Eén van de hypotheses betreffende M.E./CVS is dat verschillende fundamentele ontwrichtingen optreden in verschillende groepen patiënten die dezelfde invaliderende symptomen blijken te vertonen. De aanwezigheid van patiënten-subsets kan verklaren waarom statistische significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten als groep en een groep gezonde individuen soms niet worden gezien. Het bestaan van subgroepen patiënten-types werd ook gesuggereerd ter verklaring van het feit waarom tegenstrijdigheid tussen studies wordt vastgesteld voor sommige metingen en waarom de responsen op behandeling verschillen tussen patiënten-populaties.

Er werd een ‘clustering’-analyse op de Metabolon® dataset uitgevoerd in een poging om potentiële onderscheidende metabole signaturen binnen de patiënten-populaties te identificeren. Er werd geen significant resultaat gevonden: noch bij gebruik van de volledige set metabolieten, noch bij de individuele super-mechanismen. Hetzelfde besluit werd bereikt wanneer de analyse geïmplementeerd werd op de controle-groep (gegevens niet getoond).

Er werd een identieke ‘clustering’-analyse uitgevoerd op elk van de andere drie beschikbare datasets, voor dewelke geen super-mechanisme klassificatie beschikbaar was. Bij gebruik van enkel de patiënten van Germain et al., lagen de p-waarden tussen 0.940 en 0.954 (mediaan 0.946). Voor de Naviaux et al. dataset lagen de p-waarden tussen 0.990 en 0.998 (mediaan 0.992). Voor Armstrong et al. lagen de p-waarden tussen 0.008 en 0.032 (mediaan 0.020), wat maakte dat dit de enige dataset was waar subgroepering evident was. Om deze bevinding verder te onderzoeken, werd hiërarchische ‘clustering’ toegepast op de Armstrong at al. dataset […]. We zagen slechts twee individuen die zich ietwat onderscheiden van de rest; […] er was slechts zwak bewijs voor subgroepering. […]

3. Bespreking

De grootte van de populatie van deze studie is vergelijkbaar met gepubliceerd werk zoals door Naviaux et al. & Armstrong et al., en is een uitbreiding van de groep die we gebruikten voor onze eerdere poging. Bovendien is het substantieel aantal gekwantificeerde metabolieten (832) opmerkelijk groter dan de 420 molekulen van Naviaux et al., de 361 van Germain et al. of de 29 van Armstrong et al. Ongetwijfeld werd de statistische ‘power’ van onze analyse verzwakt door de combinatie van een populatie van 51 individuen en een reeks van 832 metabolieten, wat het beperkt aantal metabolieten verklaart die we als significant verschillend kunnen bestempelen […]. Niettemin werpen onze bevindingen, door de uitgebreide analyse van onze dataset, een licht op een intrigerend aspect van het dysfunktioneel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten, met betrekking tot de redox-toestand.

Van de vier verstoorde biologische klassen in onze groep, bevatten de categorieën ‘nucleotiden’ en ‘peptiden’ metabolieten die potentieel brede repercussies hebben op biologische funkties. Bv.: cAMP en IMP zijn molekulen waarvan is geweten dat ze betrokken zijn bij veel aspecten van het funktioneren van het menselijk lichaam, zoals purine-metabolisme, opslag van chemische energie in spieren en intracellulaire signaal-overdracht. Het is daarom ontzettend moeilijk een uniek mechanisme gelinkt met M.E./CVS-toestand of -symptomen op basis van dergelijke molekulen of, anderzijds, molekulen waarvan weinig of niets is geweten (zoals 2’-O-methylcytidine of gamma-glutamylthreonine) aan te wijzen. Deze laatste molekule wordt echter in een patent genoemd als potentieel belangrijke molekule (onder andere biomerkers) ter bepaling van lever-toxiciteit. De resultaten van ons eerder werk focusten op biomerkers voor lever-letsel.

Een ander zeer belangrijk metaboliet is alfa-ketoglutaraat omdat het deel uitmaakt van het ‘energie’ super-mechanisme en de TCA cyclus. Inderdaad: de Krebs-cyclus is een mechanisme dat consistent aan de oppervlakte komt bij M.E./CVS-metabolomica analyse. Omdat vermoeidheid een belangrijk uitputtend symptoom van deze ziekte is, werd lang gespeculeerd dat het energie-metabolisme van de patiënten dysfunktioneel is. Verscheidene studies wijzen op een directe manier naar een abnormaal energie-metabolisme te wijten aan falende TCA- en ureum-cycli of indirect via een vermoedelijke stoornis van pyruvaat-dehydrogenase [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Een piloot-studie met een gepatenteerd voedingsupplement waarvan wordt gesteld dat het de aktiviteit van dit enzyme – en bijgevolg de Krebs-cyclus – aanwakkert, beschrijft substantiële verbeteringen van de gezondheid en conditie van behandelde patiënten [Comhaire F. A novel nutriceutical treatment of Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”. Intern. Med. (2017) 7: 5 (zie ook ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’)]. Niettemin is alfa-ketoglutaraat betrokken bij talrijke metabole mechanismen (zoals het carnitine-metabolisme, lysine-metabolisme en dat van de vertakte aminozuren, om er enkele te noemen), zodat een focus op één enkel mechanisme als basis voor de invaliderende symptomen van M.E./CVS tot nu toe niet gerechtvaardigd is.

De categorie ‘co-factoren en vitaminen’ omvat metabolieten met ongelijksoortige eigenschappen, zoals geïllustreerd door haem & gamma-CEHC. In onze groep werden hogere waarden van haem, onderdeel van het haemoglobine- en porfyrine-metabolisme, en lagere waarden van gamma-CEHC, onderdeel van het tocoferol-metabolisme, gemeten bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Haem is een vitale component van vele metalloproteïnen (met haemoglobine als best bekende) en wordt gesynthetiseerd in de lever en het beenmerg. Aangezien de staal-voorbereiding bij Metabolon® op methanol is gebaseerd, wordt precipitatie van proteïnen verwacht maar aan proteïnen gebonden haem kan dan nog worden afgegeven […]. Omdat we plasma (cel-vrij) gebruikten, wordt er een grotere bijdrage van ‘vrij haem’ aan de meting van de hoeveelheid haem geanticipeerd, tenzij er substantiële haemolyse [kapotgaan van rode bloedcellen waardoor haemoglobine in het bloed terecht komt] optrad. Een hoge concentratie vrij haem in het plasma is een biomerker voor de ernst van sikkelcel-ziekte [rode bloedcellen hebben een abnormale vorm door abnormaal haemoglobine], waarbij gestegen waarden qua inflammatoire biomerkers zoals lactaat-dehydrogenase, bilirubine, een hoog aantal reticulocyten [voorlopers van rode bloedcellen] en lipiden worden gedetekteerd. We bepaalden drie vormen van bilirubine en biliverdine [afbraakprodukten van haemoglobine] in onze stalen die ook meer aanwezig bleken bij patiënten vs. controles; wat wijst op een algemene verstoring van het haem-afbraak mechanisme, waarvan de laatste stap in de lever gebeurt. Alle vijf molekulen hebben sterk nadelige effekten die verbonden zijn met het genereren van vrije radikalen en er wordt beweerd dat hun afbraak onderdeel is van een cel-beschermende feedback in respons op oxidatieve stress. In tegenstelling daarmee zijn gamma-CEHC, samen met gamma-CEHC-glucuronide en alfa-CEHC-glucuronide (metabolieten van het vitamine-E mechanisme), dat anti-inflammatoire kenmerken heeft (zoals een werking als lipofiel anti-oxidant). Ons eerder werk [piloot-studie; zie ref. in onze inleiding] suggereerde ook een ontwrichting van het vitamine-E metabolisme ten gevolge de detektie van [z’n metaboliet] 13’-carboxy-alfa-tocoferol, wat jammer genoeg niet aanwezig is in deze dataset.

Veel M.E./CVS-patiënten rapporteren zelf dat gespecialiseerde diëten en supplementen hun symptomen verlichten. Dergelijk gedrag is wijdverspreid in patiënten-gemeenschappen van veel ziekten, inclusief M.E./CVS, fibromyalgie en kanker (om er maar enkele te noemen) [bv. Craig C. Mitoprotective dietary approaches for Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome: Caloric restriction, fasting and ketogenic diets. Med. Hypotheses. (2015) 85: 690-693 /// Lopez-Rodriguez MM et al. Patterns of food avoidance and eating behavior in women with fibromyalgia. Endocrinol. Diab. Nutr. (2017) 64: 480-490]. Gezien de exclusie van voorgeschreven farmaceutica, kunnen dergelijke voeding-benaderingen worden gedefinieerd als voeding-restricties of geassocieerd met specifieke supplementen waarvan wordt gedacht dat ze voordelige effekten tegen inflammatie, cardiovasculaire problemen of veroudering opleveren. Er werd door andere patiënten gerapporteerd dat het diëten om een mogelijke tarwe-gevoeligheid bij sommigen te verbeteren of ketogene dieten en vasten, nuttig zijn. Veel patiënten beschouwen enkele supplementen (inclusief NADH, coenzyme-Q10 of polyfenolen) nuttig, hoewel systematisch beoordeling van studie-uitkomsten geen aanleiding geeft tot duidelijke aanbevelingen. Een gemeenschappelijk iets in al het geciteerde werk aangaande voeding bij M.E./CVS kan echter worden gevonden in het redox-metabolisme. Het is duidelijk dat ons huidig werk en andere rapporteren suggereren dat nutritionele veranderingen van nut kunnen zijn voor patiënten, hoewel verder onderzoek nodig is vooraleer aanbevelingen kunnen worden gemaakt.

Een ambitieus doel wat betreft de toepassing van ongerichte metabolomica op M.E./CVS-stalen is het peilen naar een patroon dat ons beperkt begrip van deze ziekte kan uitbreiden. De aanrijking-analyse ‘unit’ van MetaboAnalyst onthulde een mogelijk onevenwicht in de redox-toestand van de patiënten, aangezien hun metabole profielen overéénkwamen met meerdere aandoeningen die niet gerelateerd zijn met elkaar, maar waar bij alle redox enzymatische reakties betrokken zijn. Onze hypothese is dat een verstoring van de redox-toestand de status van donoren en acceptoren van chemische reakties aslook hun co-enzymen (zoals NAD+/NADH, FAD+/FADH voor dehydrogenasen) beïnvloedt. Oxidasen zouden vanzelfsprekend ook aangetast zijn als katalysatoren van redox-reakties. Veel transferase katalytische aktiviteiten kunnen worden beïnvloed door de redox-toestand van hun omgeving en veel ziekten worden veroorzaakt door transferase-deficiënties. Bv.: succinyl-CoA:3-ketoacid-CoA transferase deficiëntie leidt tot een toename van ketonen en diabetes-ketoacidose […]. Carnitine-palmitoyl-transferase deficiëntie II (CPT II) is een ander voorbeeld waarbij het vetzuren-metabolisme ontwricht is door het gebrek aan transport van lange-keten vetzuren naar de mitochondrieën, waar ze worden gebruikt als brandstof-bron.

Anoxie is één van de met ziekte geassocieerde metabolieten-sets, een aandoening die ook opdook gebruikmakend van de Armstrong et al. dataset (gegevens niet getoond), en samen met asfyxie in de Germain et al. dataset (gegevens niet getoond). Het M.E./CVS metabolieten-profiel vertoont ook gelijkenissen met dat van kinderen die hypoxisch-ischemische encefalopathe (HIE) ontwikkelen door zuurstof-deprivatie. Anoxie en asfyxie zijn beide verbonden met het gebrek aan zuurstof, wat duidelijk ernstige repercussies kan hebben op spier- en lichamelijke aktiviteit. Het onvermogen om adequaat zuurstof te leveren aan spieren is evident in studies van de respons op inspanning bij in M.E./CVS-patiënten [bv. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492]. Bovendien is de oxygenatie van de pre-frontale cortex in het brein verminderd bij inspanning in M.E./CVS-patiënten [Neary JP et al. Prefrontal cortex oxygenation during incremental exercise in Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Physiol. Funct. (2008) 28: 364-372]. Veel personen met M.E./CVS vertonen een gedaald bloed-volume, wat de oxygenatie van veel weefsels aantast [Streeten DHP et al. The roles of orthostatic hypotension, orthostatic tachycardia and subnormal erythrocyte volume in the pathogenesis of the Chronic Fatigue Syndrome. Am. J. Med. Sci. (2000) 320: 1-8 /// Streeten DHP & Bell DS. Circulating blood volume in Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2011) 4: 3-11]. Verstoringen van de circulatie en zuurvoorziening naar de weefsels kan aan de basis liggen van veel symptomen van M.E./CVS. Hypoxie resulteert in het genereren van reaktieve zuurstof-soorten in de mitochondrieën, met als gevolg de aktivatie van beschermende systemen.

Er werd een verband van oxidatieve stress met M.E./CVS gerapporteerd in een aantal M.E./CVS-studies. Van belang: bij het meten van gekende merkers voor oxidatieve stress, vonden Richards et al. [zie ref. hierboven] dat methaemoglobine [ontstaat als het tweewaardig ijzer (Fe2+) in haemoglobine door oxidatie wordt omgezet in driewaardig ijzer (Fe3+)] één van de voornaamste componenten was die hun M.E./CVS-patiënten van controles differentieerden. Deze vorm van haemoglobine draagt de geoxideerde vorm of het ijzer-ion […] die nodig is opdat haemoglobine zuurstof kan binden. Zelfs al maken methaemoglobine-metingen geen deel uit van onze dataset, is het intrigerend om de oxidatie-toestand te verbinden met een verstoord redox-milieu, terwijl het effekt van het onvermogen zuurstof te binden zich kan vertalen naar anoxie en asfyxie.

M.E./CVS-biomerkers, als een middel voor ondubbelzinnige diagnose en monitoring van de doeltreffendheid van behandelingen, zijn één van de dringend noodzakelijke ontwikkelingen op dit gebied. Er werden ROC-analyse gegevens gegenereerd met doel in gedachten. De hoogste voorspellende waarde bleek 0.75 AUC [zie resultaten]. Toekomstig werk waarbij een grotere en onafhankelijke groep wordt geanalyseerd en vergeleken met andere vermoeiende ziekten zal waarschijnlijk de voorspellende waarde verhogen en onthullen of plasma metabolomica kunnen dienen als betrouwbaar instrument voor objectieve identificatie en monitoring van M.E./CVS-patiënten.

4. Materialen & methodes

4.1. Staalname & metabolomica-platform

[…] Metabolon® ‘Global Metabolomics’: ‘ultra-high-performance’ vloeistof-chromatografie/ tandem massa-spectrometrie (UHPLC/MS/MS) laat accurate relatieve kwantificatie van honderden metabolieten uit verscheidene categorieën molekulen.

4.2. Gegevens-analysis via MetaboAnalyst

[] Een uitgebreid instrument voor metabolomica-analyse en -interpretatie (www.metaboanalyst.ca).

4.3. Interne gegevens-analysis

[]

5. Besluiten

In deze studie rapporteren we over een metabolomica-profiel van een relatief kleine groep. Ondanks statistische uitdagingen, leveren we toch meer bewijsmateriaal voor een redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten. De rationale achter onze theorie wordt ondersteund door parallellen met onze eerdere studie en beschikbare datasets van andere teams. De patiënten-groepen die in onze studies en die van anderen werden gebruikt, verschillen qua geografische ligging, dieet, behandel-regimes, maar toch zijn er opmerkelijke gelijkenissen bij de bevindingen. Zodoende kunnen metabolomica een fundamenteel kenmerk onthullen van de ontwrichting die optreedt in slachtoffers van M.E./CVS.

oktober 6, 2018

Gewijzigde samenstelling & funktie van het oraal microbioom bij CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 6:05 am
Tags: , , ,

Er werden al wijzigingen in de microbiële gemeenschappen van M.E.(cvs)-patiënten gedetekteerd. Nu vond men deze (weliswaar andere) ook in de mondholte. Wederom waren er aanwijzingen voor een verstoord metabolisme.

Of dit een oorzaak of gevolg is blijft nog open… Het blijft momenteel nog te voorbarig om verregaande conclusies te trekken – dat geven de auteurs zelf aan – maar het vinden van indicaties over metabole verstoringen blijkt consistent.

————————-

Plos One Vol 13, #9, p e0203503 (september 2018)

Chronic Fatigue Syndrome patients have alterations in their oral microbiome composition and function

Taiwu Wang (1,2), Lei Yu (1), Cong Xu (1), Keli Pan (1), Minglu Mo (1), Mingxiang Duan (1), Yao Zhang (1), Hongyan Xiong (1)

1 Department of Epidemiology, College of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, People’s Republic of China

2 Research Institute for Medicine of Nanjing Command, Nanjing, P.R. China, Nanjing, China

Samenvatting

Gastheer/microben interakties bleken geïmpliceerd bij de pathogenese van Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), maar of het oraal microbioom gewijzigd is bij CVS-patiënten is ongeweten. We verkenden veranderingen van het oraal microbioom bij Chinese Han CVS-patiënten gebruikmakend van 16S rRNA gen sequentie-bepaling en wijzigingen qua funktioneel potentieel van het oraal microbioom d.m.v. PICRUSt. We vonden dat de Shannon & Simpson diversiteit-indexen niet verschillend waren bij CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, maar de globale samenstelling van het oraal microbioom was anders (p < 0.01). CVS-patiënten hadden een hogere relatieve hoeveelheid Fusobacteria vergeleken met gezonde controles. Verder waren de geslachten Leptotrichia, Prevotella & Fusobacterium aangerijkt, en Haemophilus, Veillonella & Porphyromonas verminderd bij CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Funktionele analyse van afgeleide metagenomen toonde dat de bij CVS gewijzigde bakteriële geslachten voornamelijk waren geassocieerd met het aminozuren- en energie-metabolisme. Onze bevindingen tonen aan dat het oraal microbioom bij CVS-patiënten verschillend is van dat bij gezonde controles, en deze verschillen leiden tot verschuivingen qua funktionele mechanismen met implicaties voor CVS-pathogenese. Deze bevindingen verhogen onze kennis over de relatie tussen de orale microbiota en CVS, wat ons begrip omtrent CVS-pathogenese zal vooruit helpen en kan bijdragen aan toekomstige verbeteringen naar behandeling en diagnose toe.

Inleiding

Bakterieën koloniseren de mondholte snel na de geboorte en deze worden stabiel in meerdere niches binnen dit ecosysteem. Deze orale bakteriële gemeenschappen, of microbioom, bevatten 1.000 verschillende soorten en zijn zeer complex. Het oraal microbioom is de tweede meest complexe bakteriële gemeenschap in het lichaam, na dat van de dikke darm. Het oraal microbioom is geassocieerd met orale ziekten, alsook tand-bederf, endodontische infekties [van het tand-wortelkanaal], gingivitis [ontsteking van het tandvlees] en periodontitis [paradontitis; ontsteking van het weefsel rond de tanden], en ook met niet-orale ziekten [pancreas]. In een […] ‘case’-controle studie bleken Porphyromonas gingivalis & Aggregatibacter actionmycetemcomitans, leden van het oraal microbioom, geassocieerd met een verhoogd risico op pancreas-kanker, terwijl het fylum [de stam] Fusobacteria en z’n geslacht Leptotrichia geassocieerd bleken met een verlaagd risico op pancreas-kanker. Verder zijn veranderingen qua samenstelling van bakterieën aanwezig in het oraal microbioom geassocieerd met intestinale dysbiose in muis-modellen voor colitis [inflammatie van de darmwand]. Bijkomend bewijsmateriaal heeft aangetoond dat het oraal microbioom niet enkel een belangrijke rol speelt bij ziekte-toestanden maar bij de gezondheid van mensen, inclusief bij de immuun-respons, het metabolisme en vertering van nutriënten.

[…] De oorzaak van CVS blijft onbekend.

Hoewel de etiologie van CVS nog ongekend is, suggereert bewijsmateriaal dat een complexe wisselwerking tussen genetische, milieu- en microbiële factoren betrokken is bij de oorzaak. CVS is een systeem-ziekte die kan optreden met inflammatoire symptomen; bv. inflammatie van de orale mucosa [slijmvlies; in dit geval van de mondholte] wordt courant beschreven bij patiënten met CVS. Hoewel wijzigingen van de darm-microbiota geassocieerd bleken met CVS [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Mandarano AH et al. Eukaryotes in the gut microbiota in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. PeerJ. (2018) 6: e4282], werden veranderingen qua orale microbiota bij CVS-patiënten niet bestudeerd. Het oraal microbioom verdient te worden verkend omdat deze microbiële gemeenschap kan bijdragen tot CVS-symptomen en omdat bakterieën van het oraal microbioom een bron kunnen zijn van niet-invasieve biomerkers voor CVS. Om te begrijpen of er wijzigingen optreden in het oraal microbioom van CVS-patiënten voerden we daarom een uitgebreide beoordeling uit van de samenstelling van het oraal microbioom en de hoeveelheden van individuele taxa [meervoud van taxon – taxonomische groepen; organismen die samen een éénheid vormen] d.m.v. sequentie-bepaling van bakterieel 16S rRNA bij CVS-patiënten en gematchte controles. Daarnaast voorspelde een analyse uitgevoerd d.m.v. PICRUSt [‘phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states’; een computer-techniek om de funktionele samenstelling van een metagenoom te voorspellen, gebruikmakend van merker-genen uit een database met referentie-genomen] de funktionaliteit van het bakterieel metagenoom op basis van de 16S rRNA genen. Deze studie zal wijzigingen in de samenstelling van het oraal microbioom en de funktie bij CVS-patiënten in de Chinese Han populatie [grootste etnische groep van China] blootleggen.

Materialen & methodes

Recrutering

[…] Fukuda criteria voor CVS […]. Patiënten met epilepsie, inflammatoire darm-ziekte, type-1 diabetes, chronische obstructieve long-ziekte, psoriasis, Reumatoïde Artritis en Lupus Erythematosus werden uitgesloten. Controles werden gematcht voor leeftijd, geslacht en body-mass-index […]. De gezonde controles werden ook uitgesloten op basis van de volgende criteria: individuen met symptomen gelijkaardig als bij een CVS-diagnose en met een virale infektie, aktieve bakteriële, schimmel- of orale ziekte zoals gingivitis en/of periodontitis. De controles hadden geen antibiotica, probiotica, prebiotica of synbiotica genomen 2 maanden voor speeksel-stalen werden verzameld.

[…]

DNA-extractie, amplificatie van bakterieel 16S rRNA & sequentie-bepaling

[…]

Bio-informatica & statistische analyse

[…]

We wenden een ‘machine-learning’ benadering aan om CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles. Voor deze analyses gebruikten we taxon-hoeveelheden gebaseerd op ‘operational taxonomic units’ [OTUs; refereert naar clusters van organismen gegroepeerd op basis van DNA-sequentie gelijkenis van een specifiek merker-gen] op verschillende niveaus. Er werd logistische regressie [een statistische methode] aangewend om de CVS-patiënten te klassificeren en ‘area under the curve’ (AUC [maatstaf voor de diagnostische accuraatheid]) om de prestaties te evalueren […]. We gebruikten PICRUSt om de bakteriële metagenoom-inhoud van op 16S rRNA gen gebaseerde microbiële samenstellingen te voorspellen en funkties te voorspellen […]. Funkties worden afegeleid op basis van de ‘Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes’ (KEGG) [een database die genomische, chemische systemische funktionele informatie bevat]. Er werd ‘statistical analysis of metagenomic profiles’ (STAMP [grafische software voor de analyse van taxonomische en funktionele profielen] gebruikt om verschillen qua in KEGG-funkties te bepalen.

Resultaten

Deelnemers aan de studie

De 91 deelnemers (46 CVS-patiënten en 45 gezonde controles) verschilden niet qua leeftijd (37,43 ± 7,53 vs. 36,98 ± 7,23, p = 0.31), geslacht (man/vrouw) (32/14 vs. 30/15, p = 0.94) of BMI (24,53 ± 3,23 vs 23,86 ± 3,58, p = 0.35). […]

Overzicht van 16S rRNA sequentie-bepaling: sequenties, kwaliteit-analyse & geïdentificeerde taxa

Sequentie-bepaling van het 16s rRNA gen uit de mondholte van onze 91 individuen leverde 2.753.405 ruwe sequenties op (18.615 tot 44.950 ‘reads’ [een ‘read’ is het resultaat van een sequentie-bepaling (volgorde van de base-paren of nucletioden)] van 420-460 baseparen met een gemiddelde lengte van 445 bp). […] Na kwaliteit-controle bleven 15.340 ‘reads’ van hoge kwaliteit per staal over voor verdere analyse. De omvang in de 2 groepen voor alle stalen was ca. 99,6%, wat suggereert dat de meeste kenmerken werden in beslag genomen en dat de diepte van de sequentie-bepaling voor het onderzoeken van met CVS geassocieerde orale microbiota voldoende is.

Wijzigingen in de globale samenstelling

Na de kwaliteit-controles werd de bakteriële diversiteit bepaald op basis van de Shannon & Simpson indexen [kwantitatieve metingen die weerspiegelen hoeveel verschillende types er in een gemeenschap aanwezig zijn en hoe gelijkmatig ze verdeeld zijn], die de gemiddelde rijkdom qua bakteriële diversiteit aangeven. We vonden gelijkenissen tussen CVS-patiënten en gezonde controles wat betreft hun orale microbiota maar de gezonde controles vertoonden een lichtjes hogere diversiteit (niet statistisch significant). Om te weten of de globale microbioom-samenstelling anders was bij de CVS-patiënten t.o.v. de gezonde controles, voerden we een [statistische] bewerking uit […]. Op basis van deze meting vonden we een significant verschil qua samenstelling tussen CVS-patiënten en gezonde controles (p < 0.01).

CVS-patiënten verschillen qua relatieve hoeveelheden van sommige bakteriële stammen in de mond t.o.v. gezonde controles

Analyses van OTUs uit de mondholte van CVS-patiënten en gezonde controles onthulde dat hun bakterieën zich groepeerden binnen 5 bakteriële stammen: Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria & Proteobacteria. Van alle stammen met een relatieve hoeveelheid groter dan 1% waren echter slechts Fusobacteria significant gewijzigd bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde controles. Vergelijkingen van bakteriële geslachten tussen CVS-patiënten en gezonde controles legden complexere resultaten bloot dan deze die werden gezien op fylum-niveau. Op het niveau van de geslachten waren de 5 meest overvloedige bij CVS-patiënten: Neisseria (19,77%), Veillonella (9,81%), Fusobacterium (9,39%), Streptococcus (9,28%) & Prevotella-7 (9,06%), te samen goed voor 57,31% van de orale bakteriële gemeenschap bij CVS-patiënten. De 5 meest overvloedige geslachten bij de gezonde controles waren Neisseria (18,75%), Veillonella (13,97%), Haemophilus (9,04%), Streptococcus (8,52%) & Prevotella-7 (8,35%), samen goed voor 58,63% van de orale bakteriëen bij gezonde controles. Van deze was de hoeveelheid Veillonella significant verschillende tussen de 2 groepen: 9,81 ± 8,26% (CVS) & 13,97 ± 8,91% (controles) (p = 0.02). Daarnaast waren veel van de geslachten met een relatieve hoeveelheid groter dan 1% significant verschillend tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Bv.: Fusobacterium, Prevotella, Leptotrichia & Campylobacter hadden verhoogde hoeveelheden bij CVS t.o.v. controles, terwijl Haemophilus, Porphyromonas & Moraxella verhoogde hoeveelheden hadden bij CVS vergeleken met controles.

We onderzochten deze significante verschillen verder gebruikmakend van LEfSe [‘linear discriminant analysis (LDA) effect-size’; bepaalt de kenmerken (organismen, groepen organismen afstammend van een gemeenschappelijke evolutionaire voorouder, OTUs, genen of funkties) van een metagenoom dat het meest waarschijnlijk de verschillen verklaart, door het koppelen van standaard-testen voor statistische significantie met bijkomende testen voor biologische consistentie en effekt-relevantie] analyse. LEfSe gebruikt een statistische test om kenmerken te detekteren in een gemeenschap die significant verschillende hoeveelheden vertonen en het gebruikt dan LDA [lineaire discriminant analyse; methode bij ‘machine-learning’, gebruikt wanneer groepen a priori gekend zijn – het resultaat is een LDA-score] om de effekt-grootte van elk of differentieel kenmerk te schatten. De output van deze analyse is een cladogram [‘afstammingsboom’; weergave van de evolutionaire relaties tussen organismen] dat de verschillen tussen de mondholte-microbiota van CVS-patiënten en gezonde individuen visueel voorstelt, en een staaf-grafiek die de bakterieën met een LDA-score > 3.0 vertegenwoordigt [aangerijkte taxa bij CVS: positieve LDA-score; aangerijkte taxa bij gezonden: negatieve LDA-score]. De LEfSe resultaten identificeerden de volgende groepen als verschillen qua orale microbiota tussen CVS-patiënten en gezonde controles: Fusobacteria op fylum-niveau; Epsilonproteobacteria, Fusobacteria, Gammaproteobacteria & Negativicutes op klasse-niveau; Campylobacterales, Fusobacteriales, Pasteurellales & Selenomonadales op orde-niveau; Bacteroidaceae, Campylobacteraceae, Family-XI, Fusobacteriaceae, Pasteurellaceae, Porphyromonadaceae, Pseudomonadaceae & Veillonellaceae op familie-niveau; Alkalibacillus, Bacteroides, Campylobacter, Fusobacterium, Gemella, Haemophilus, Moraxella, Porphyromonas, Prevotella, Prevotella-2, Pseudomonas & Veillonella geslacht-niveau.

‘Machine-learning’ & voorspelling van het bakterieel metagenoom

We wilden de diagnostische mogelijkheden van de bakteriële taxa die significant verschilden tussen CVS-patiënten en gezonde controles verder onderzoeken. Voor deze analyses kozen we Fusobacteria, Gammaproteobacteria, Veillonellaceae & Fusobacterium omdat ze verschillende taxon-niveuas vertegenwoordigden met hoge LDA-scores en aanzienlijke verschillen tussen de groepen. Om het diagnostisch vermogen van elk taxon te bepalen, gebruikten we de AUC. Alle taxa hadden AUC-values van ca. 0.7 (0.73, 0.72, 0.65 & 0.68), wat zou kunnen aangeven dat één enkel taxon niet volstaat om de diagnose van CVS te stellen. Het kan zijn dat het opnemen van meer taxa in de analyse het diagnostisch vermogen van het microbioom zal verhogen.

Om de in het microbioom voorgestelde funkties te voorspellen uit hun metagenoom, wenden we het PICRUSt algoritme aan. Van de 236 geteste mechanismen (uit KEGG [zie hierboven]), waren 40 mechanismen verschillend qua hoeveelheid tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Deze 40 mechanismen vertegenwoordigen verschillende niveaus. Specifiek: geen mechanismen van niveau-1 [chemische reakties], 6 mechanismen van niveau-2 [molekulaire interakties, post-translationele proteïne-modificaties] en 55 mechanismen van niveau-3 [biologische reakties, inclusief regulering van gen-expressie] bleken significant verschillend. De niveau-2 mechanismen die CVS-patiënten onderscheidden, waren ‘Biosynthese van Andere Secundaire Metabolieten’, ‘Energie Metabolisme’, ‘Milieu Adaptatie’, ‘Enzyme Families’, ‘Metabole Ziekten’ en ‘Metabolisme van Andere Aminozuren’. Sommige geslachten waren geassocieerd met mechanismen op verschillende niveaus; bv. Prevotella, dat aangerijkt was bij CVS-patiënten, was significant geassocieerd met vele niveau-2 mechanismen. Prevotella was positief geassocieerd met [gen-categorieën] koolhydraten-metabolisme, cel-motiliteit en immuunsysteem ziekte, en negatief geassocieerd met biosynthese van ander secundair metabolisme, enzyme-families en nucleotide-metabolisme.

KEGG funktionele mechanismen gerelateerd met metabolisme bleken gewijzigd in de microbiota van CVS-patiënten. Vermoeidheid in het bijzonder is een symptoom van CVS en er wordt gedacht dat het metabolisme een sleutelrol speelt in de CVS-pathogenese. Daarom analyseerden we verder het verband tussen bakteriële geslachten die via LEfSe een LDA > 3.0 hadden en KEGG mechanismen gerelateerd met het metabolisme. De meeste geslachten correleerden met KEGG mechanismen die verband houden met het metabolisme; de funkties bij geslachten die aangerijkt of verminderd zijn bij CVS-patiënten waren echter inconsistent en complex, wat een afspiegeling is van de complexiteit van CVS-pathogenese.

Bespreking

Omwille van de implicatie van de microbiota bij menselijke gezondheid en ziekte-toestanden, zijn ze niet enkel een doelwit voor therapeutische interventies voor een waaier aan ziekten, maar er zijn therapeutische effekten vastgesteld [allergieën, inflammatoire darm ziekte]. Eerdere studies focusten op darm-microbiota, welke de meest dominante microbiële gemeenschap is bij mensen. De mondholte, die ook wemelt van een grote microbiële gemeenschap die een belangrijke rol speelt bij de menselijke gezondheid, krijgt echter meer en meer aandacht van de research-gemeenschap.

Terwijl wijzigingen van darm-microbiota geassocieerd bleken met CVS, werden veranderingen van de orale microbiota bij CVS-patiënten nog niet bestudeerd. Eerdere studies rapporteerden dat het microbioom van de mondholte bij de mens meer wordt beïnvloed door de omgeving dan door genetica en de voornaamste stammen die voorkomen in het oraal microbioom zijn Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes & Proteobacteria, variërend van individu tot individu, wat correspondeert met onze resultaten. Hier vonden we, overéénkomstig met studies over de intestinale microbiota van CVS-patiënten, wijzigingen in de microbiota van de montholte bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Specifiek: we vonden significante aanrijking van de Fusobacteria bij CVS-patiënten. Verder waren veel geslachten ofwel verminderd of aangerijkt bij CVS-patiënten in vergelijking met gezonde controles. Ondanks deze observaties bleken Shannon & Simpson diversiteit-indexen geen verschillen aan te geven. We onderzochten ook associaties tussen deze veranderde geslachten en KEGG mechanismen, en vonden dat er enkele trends waren wat betreft funktioneel potentieel tussen de microbiota van CVS-patiënten en gezonde controles. Analyse van afgeleide metagenomen gaf aan dat de microbiota van CVS-patiënten verschillende funkties in de categorieën ‘Biosynthese van Andere Secundaire Metabolieten’, ‘Energie Metabolisme’, ‘Milieu Adaptatie’, ‘Enzyme Families’, ‘Metabole Ziekten’ & ‘Metabolisme van Andere Aminozuren’ kan hebben.

Er werden eerder verschillen geobserveerd qua menselijke intestinale microbiota van CVS-patiënten [zie hierboven en Nagy-Szakal D et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44]. De samenstelling van faecale microbiota in het bijzonder is enorm verschillend van deze van de orale microbiota, dus zijn de wijzigingen die we zagen betreffende orale microbiota substantieel verschillend van wat eerder werd gerapporteerd omtrent wijzigingen in de intestinale microbiota van CVS-patiënten. In vergelijking met gepubliceerde studies over veranderingen in de intestinale microbiota van CVS-patiënten, zijn de wijzigingen die we opmerkten in de mondholte minder significant. Bv.: de intestinale microbiota van CVS-patiënten heeft een significant gedaalde diversiteit-index t.o.v. de gezonde controles, wat we niet zagen in de orale microbiota. Daarnaast waren de specifieke taxa die veranderd waren in de intestinale microbiota verschillend van deze die veranderd waren in de orale microbiota. Bv.: in een LEfSe analyse van CVS-patiënten waren de intestinale microbiota van CVS-patiënten aangerijkt voor Oscillospira, Lactococcus & Anaerotruncus van het Firmicutes fylum, en Coprobacillus & Eggerthella van het Actinobacteria fylum. Verder waren 18 geslachten met leden die voornamelijk behoren tot de Firmicutes verminderd, vergeleken met gezonde controles. In een andere studie vertoonden de intestinale microbiota van Noorse CVS-patiënten verhoogde hoeveelheden Lactonifactor & Alistipes, en verlaagde hoeveelheden Holdemania & Syntrophococcus, terwijl de intestinale microbiota van Belgische CVS-patiënten gestegen Lactonifactor en gedaalde Asaccharobacter vertooden. CVS-patiënten onderinden dus wijzigingen in de microbiota zowel de mondholte als de darm, maar de veranderingen die optreden in de mondholte en de darm van CVS-patiënten zijn anders. We vonden echter enkele geslachten waarvan de hoeveelheden gewijzigd waren de mondholte als het darm-kanaal. Bv.: Haemophilus was verminderd in onze studie en Giloteaux’s studie van de intestinale microbiota van CVS-patiënten. Haemophilus, samen met Veillonella & Prevotella, bleken ook veranderd bij mond-letsels en in het oraal microbioom van HIV-positieve individuen. Hoewel de pathogenese van CVS onbekend blijft, kunnen gewijzigde microbiota, van de darm en de mondholte, een belangrijke rol spelen bij de etiologie. Omdat we veel geslachten vonden die veranderd waren bij CVS-patiënten, is verder onderzoek vereist omtrent de verbanden van deze veranderingen en of ze allemaal evenveel betekenis hebben bij de CVS-etiologie.

CVS is een agnogene [van ongekende oorsprong] ziekte, waarvan de symptomen veel systemen en systemische inflammatoire factoren omvatten. Zodoende zijn wijzigingen van het oraal microbioom bij CVS wellicht slecht één klinische indicator voor CVS-pathogenese. Het kan zijn dat wijzigingen van het oraal microbioom de ernst van de symptomen verhogen en zodoende leiden tot of veranderingen versnellen van inflammatorire factoren. Maar ook het omgekeerde kan waar zijn: door CVS geïnduceerde orale symptomen kunnen het gevolg zijn van wijzigingen in het oraal microbioom. Ongeacht het oorzakelijk verband tussen veranderingen in het oraal microbioom en orale CVS-symptomen, zijn deze 2 kenmerken samen met gewijzigde inflammatoire factoren echter geassocieerd met infekties. Zodoende kunnen infekties ook bijdragen tot CVS-symptomen, hoewel verdere research vereist is om deze hypothese te testen.

Daarnaast vonden we dat het 16s rRNA bakterieel profiel van gezonde controles in onze studie lichtjes verschillend was van andere publicaties. Deze discrepanties kunnen o.a. ook te wijten zijn aan verschillen qua etniciteit en methodes. Microbioom-profielen van het speeksel worden niet significant beïnvloed door de afname-methode of DNA-extractie protocollen, dus matchten we de stalen van onze controles en CVS-individuen om verschillen in hun oraal microbioom te identificeren.

We gebruikten een gecontroleerde ‘machine-learning’ benadering om CVS-patiënten te identificeren op basis van hun oraal microbioom, een methode die bij meerdere microbioom-studies werd gebruikt om patiënten van gezonde controles te onderscheiden [bv. inflammatoire darm ziekte]. Via deze benadering klassificeerden we patiënten met een middelmatige accuraatheid (AUC ROC waarde ca. 0.7). Om de AUC ROC waarde te verhogen, dienen toekomstige studies inflammatoire factoren en intestinale microbiomen met orale microbiomen te combineren. De grootte van het staal is een bijkomende verstorende factor die de accuraatheid van deze analyse kan beïnvloeden, te samen met etniciteit en enkele methodische verschillen; een grote groep CVS-patiënten en gezonde controles is dus nog nodig. Met deze verbeteringen, kan dit type benadering verder dienen als een aanvulling op andere niet-invasieve methodes om patiënten met een waaier aan, inclusief CVS, te onderscheiden.

We gebruikten PICRUSt om genoom-funkties aanwezig in het oraal microbioom te voorspellen en vonden een verschil. Een correlatie-analyse van voorspelde funkties en geslachten met een LDA groter dan 3.0, identificeerde dat deze geslachten verschillende funkties zouden hebben. Prevotella bv., aangerijkt bij CVS-patiënten, vertoonde de meest significante correlaties met KEGG mechanismen. Gezien hoe significant Prevotella gewijzigd is bij CVS-patiënten, kunnen ze een rol spelen in de pathogenese van CVS of een indicator zijn voor wijzingen in de orale microbiota bij CVS. Verder bleken van de geanalyseerde gen-mechanismen, deze die gerelateerd zijn met het immuunsysteem en infektueuze ziekten significant geassocieerd met vele geslachten die veranderde hoeveelheden vertoonden bij CVS-patiënten, bijzonderlijk Prevotella, Haemophilus & Veillonella (p ≤ 0.001). Dit zou kunnen suggereren dat deze 3 geslachten bijzonder belangrijk zijn voor CVS-pathogenese.

Omdat vermoeidheid het voornaamste symptoom is van CVS, waren we vooral geïnteresseerd in correlaties waarbij mechanismen betrokken zijn die verband houden met het metabolisme. Gedetailleerde analyse van deze mechanismen onthulde significante verschillen in het koolhydraten-metabolisme, energie-metabolisme, xenobiotica-biodegradatie [afbraak van lichaamsvreemde stoffen] en -metabolisme, en glycaan [polysaccharide] -biosynthese en -metabolisme. We merken echter op dat sommige veranderingen beperkt waren; wat te wijten kan zijn aan de complexiteit van CVS, hoe de diagnose is gebaseerd op symptomen en hoe voor elk geval de symptomen een verschillende oorzaak kunnen hebben. Ondanks deze complexiteit, zijn er wijzigingen qua voorspelde funktie in het oraal microbioom van CVS-patiënten en deze corresponderen met CVS-symptomen – bijzonderlijk ernstige vermoeidheid.

Onze studie had enkele beperkingen, vooral verband houdend met de complexe symptomen van CVS. We identificeerden enkel variatie in het oraal microbioom tussen CVS-patiënten en gezonde controles maar we namen geen verstorende factoren zoals ziekte-ernst, ziekte-duur en gekregen medische behandeling in acht. We lieten geen patiënten toe die verbeterd waren na een behandeling, of letten niet op pre- of post-behandeling, wat de conclusies die we uit deze studie kunnen trekken beperkt. Het oorzakelijk verband en mechanisme van de gerapporteerde met de ziekte geassocieerde microben vereist daarnaast verder onderzoek. Er zijn geen andere studies die wijzigingen van het oraal microbioome bij CVS-patiënten bekeek, er zijn dus verdere studies nodig om onze resultaten te bevestigen. Hoewel we het metagenoom voorspelden op basis van onze 16s rRNA gen sequentie-bepaling, zou deze analyse verbeterd kunnen worden met gegevens van het volledige metagenoom ter bepaling van de eigenlijke gen-inhoud van bakterieën die gewijzigd zijn bij de ziekte. Andere ziekten met gelijkaardige symptomen zouden bij toekomstige analyse ook kunnen worden opgenomen om ons begrijpen van het verband tussen veranderingen van het oraal microbioom en CVS-symptomen te verbeteren.

Samengevat: we onderzochten hier wijzigingen in het menselijk oraal microbioom bij CVS en bevestigden dat de samenstelling ervan kleine maar significante verschillen vertoont in vergelijking met gezonde controles. De geslachten waarvan de hoeveelheden zijn veranderd zijn gecorreleerd met KEGG mechanismen, in het bijzonder deze die verband houden met het metabolisme. Deze studie biedt nieuwe inzichten betreffende de CVS-pathogenese en we denken dat het begrijpen van het verband tussen ontwrichting van het oraal microbioom en CVS-symptomen kan leiden tot betere behandeling en in diagnose.

september 22, 2018

Biomerker voor M.E.(cvs) d.m.v. ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:43 am
Tags: , , , , , ,

‘Single’ cel Raman spectroscopie (SCRS – Raman is een Indiaans fysicus) is een niet-invasieve technologie waarbij geen labeling nodig is en die analyse van individuele levende cellen toelaat ‘in vivo’. Spectroscopie is een wetenschappelijke techniek om stoffen te onderzoeken aan de hand van hun spectrum, een beschrijving van de in een signaal voorkomende golflengtes en hun sterkte. Dit wordt dikwijls gebruikt in de scheikunde. Een ‘single’ cel Raman spectrum omvat gewoonlijk 1.000 Raman-banden die informatie geven over de cel (bv. over nucleïnezuren, proteïnen, koolhydraten en lipiden) en een weerspiegeling zijn van cellulaire genotypes, fenotypes en fysiologische toestanden. Een Raman-spectrum fungeert als een molekulaire/strukturele ‘fingerprint’ van een individuele cel, waardoor het mogelijk wordt verscheidene cellen te identificeren/differentiëren zonder voorafgaande kennis over de cellen. Een belangrijk nadeel van SCRS is het feit dat spontane Raman-signalen van nature zwak zijn…

Monochromatisch licht (één golflengte), gewoonlijk van een laser interageert met de molekulaire vibraties, herschikkingen van atomen/molekulen of excitaties, waardoor de energie van de laser-fotonen (fotonen zijn elementaire deeltjes waaruit licht en alle andere elektromagnetische straling bestaat) wordt verschoven. Deze verschuiving geeft informatie over de vibraties in het systeem. De zgn. Raman ‘scattering’ (verstrooing/verspreiding) of het Raman effekt is de niet-elastische (de kinetische energie van een partikel blijft niet behouden) ‘scattering’ van een foton door molekulen waarbij het wordt geëxciteerd tot een hoger energie-niveau. Wanneer fotonen door een atoom of molekule worden verstrooid, is dat meestal ‘elastisch’: de verspreide fotonen hebben dezelfde energie (frequentie & golflengte) als de verstorende fotonen. Een klein deel (ca. 1 op 10 miljoen) wordt niet-elastisch verstrooid door een excitatie (frequentie en energie is anders en gewoonlijk lager dan die van de veroorzakende fotonen).

Het gebruik van deze techniek in onderstaande piloot-studie gaf (weerom) aanwijzingen voor metabole stoornissen bij M.E.(cvs).

————————-

Analyst (Pre-print augustus 2018)

A new approach to find biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CVS/ME) by single-cell Raman micro-spectroscopy

Jiabao Xu (1), Michelle Potter (2), Cara Tomas (3), Jo Elson (3), Karl J. Morten (2), Joanna Poulton (2), Ning Wang (4), Hanqing Jin (4), Zhaoxu Hou (4) & Wei E. Huang (1)

1. Department of Engineering Science, University of Oxford, Begbroke Science Park, Woodstock Road, Oxford, OX5 1PF, United Kingdom

2. Nuffield Department of Women’s and Reproductive Health, University of Oxford, the Women Centre, John Radcliffe Hospital, Headley Way, Headington, Oxford, OX3 9DU, United Kingdom

3. Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, United Kingdom

4. Mathematical Institute, University of Oxford, Andrew Wiles Building, Radcliffe Observatory Quarter, Woodstock Road, Oxford, OX2 6GG, United Kingdom

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) genaamd, is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door lichamelijke en mentale uitputting. Er werd onderzoek verricht naar mitochondriale en energetische dysfunktie bij CVS-patiënten omwille van een kenmerkend verband met vermoeidheid; er werd echter nog geen consistent besluit getrokken. ‘Single’ cel Raman spectra (SCRS) zijn label-vrije biochemische profielen, die fenotypische ‘fingerprints’ van individuele cellen aangeven. In deze studie pasten we een nieuwe benadering op basis van ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om ρ0 cellen die mitochondriaal DNA (mtDNA) missen en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te onderzoeken van CVS-patiënten en gezonde controles. De resultaten van de experimenten tonen dat Raman-banden geassocieerd met fenylalanine in ρ0 cellen en PBMCs van CVS-patiënten significant hoger waren dan in het ‘wild type’ model en bij gezonde controles. Opmerkenswaardig is dat er ook een toename van de intensiteiten van Raman fenylalanine banden werd gezien bij CVS-patiënten. Aangezien gelijkaardige veranderingen werden gezien in het ρ0 cel model met een gekende deficiëntie in de mitochondriale respiratoire keten alsook bij CVS-patiënten, suggereren onze resultaten dat de stijging qua cellulair fenylalanine verband kan houden met mitochondriale/energetische dysfunktie in beide systemen. Interessant is dat fenylalanine kan worden gebruikt als een potentiële biomerker voor de diagnose van CVS d.m.v. SCRM. Een ‘machine-learning’ klassificatie-model bereikte een accuraatheid van 98% wat betreft het correct toewijzen van Raman-spectra aan de CVS- of de controle-groep. SCRM gecombineerd met een ‘machine-learning’ algoritme heeft daarom het vermogen om een diagnostisch instrument voor CVS te worden.

Inleiding

[…] Het blijft een uitdaging voor artsen en researchers, en een onvolledig gekarakteriseerde ziekte, ten dele omwille van de controversiële definitie, pathogenese en diagnose. Daarom is het vinden van potentiële biomerkers van groot belang voor het begrijpen van de ziekte en het ontwikkelen van een doelgerichte behandeling.

Mitochondrieën bleken van groot belang voor CVS-onderzoek omwille van nieuw bewijsmateriaal voor mitochondriale dysfunktie als een vermoedelijk biologisch mechanisme voor vermoeidheid. De onderliggende hypothese is dat vermoeidheid en andere vergezellende symptomen ten dele te wijten zijn aan een verstoord energie-metabolisme op cellulair niveau, dat grotendeels wordt bepaald door mitochondrieën als energie-fabriek en z’n ATP-produktie. Het ATP-profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd aangewend als een diagnostisch instrument voor CVS maar de resultaten waren echter controversieel. Meerdere studies hebben gedaald ATP-niveau getoond in patiënten-groepen [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxid Redox Signal. (2013) 19: 1855-60], terwijl andere geen verschillen konden detekteren of verrassend genoeg een verhoogde energie-produktie vonden bij CVS-patiënten [bv. Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93].

Hier, in een poging om mitochondriale dysfunktie en CVS-pathogenese te linken, probeerden we ‘single’ cel Raman-spectra (SCRS) te analyseren en universele biomerkers in cellen te identificeren. Een SCRS kan worden beschouwd als een intrinsieke chemische ‘fingerprint’ van een cel met zeer doorslaggevende Raman-banden voor belangrijke cellulaire bouwstenen zoals proteïnen, aminozuren, lipiden en fosfolipiden, en koolhydraten. Daarom zijn SCRS biochemische profielen van individuele cellen die fysiologische toestanden en metabole veranderingen weerspiegelen. Door de rijke en semi-kwantitatieve metabole informatie van afzonderlijke cellen, kan SCRS worden gebruikt om het cellulair metabolisme te beschrijven en ziekte-gerelateerde biomerkers te tonen.

In deze studie gebruikten we ten eerste ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) om fenotypische profielen van menselijke ρ0 cel-lijnen volledig ontdaan van mitochondriaal DNA (mtDNA) te bekomen om het effekt te bestuderen van ernstige mitochondriale dysfunktie. Ten tweede vergeleken we SCRS van PBMCs van 5 CVS-patiënten en 5 gezonde controles als piloot-studie om potentiële biomerkers voor CVS-diagnose te vinden. De vergelijking van de 2 resultaten biedt inzichten omtrent het verband van mitochondriale dysfunktie met de pathofysiologie van CVS en toont een coherente en consistente benadering voor de diagnose van de ziekte.

Experiment

Cel-cultuur, generatie van WT cybriden en PicoGreen-kleuring

De gebruikte 143B ρ0 cel-lijn zonder mtDNA […] wordt veelvuldig gebruikt bij studies die het pathogeen effekt van mtDNA-mutaties onderzoeken. […] De wild-type (WT) lijn werd gegenereerd door 143B ρ0 cellen te fuseren met normaal mtDNA […]. Het ‘herbevolken’ van de ρ0 lijn is een beter controle-systeem dan de originele 143B wild-type cellen […].

De aanwezigheid van mtDNA werd bevestigd d.m.v. kleuring met PicoGreen. […] Het mtDNA ‘copy-number’ van de ρ0 cellen en de WT cellen werd ook bepaald via ‘real-time’ PCR (vergelijking van celkern en mitochondriaal DNA). […]

ATP-metingen van WT en ρ0 cellen

[…]

Ethiek

[…]

Isolatie van PBMCs uit bloed-stalen

[…] Er werden morfologisch 2 types cellen met verschillende groottes (5-7 µm & 15-20 µm) in de PBMC-fractie gezien. Enkel de cellen met grotere afmetingen werden geselekteerd voor de Raman-experimenten na vergelijking van de resultaten (gegevens niet getoond), om de heterogeniteit door de verschillende cell-types te minimaliseren. Er dienen verdere experimenten te worden gedaan om de identiteit van de cellen te bevestigen (nu geloven we dat het monocyten zijn, op basis van de cel-populatie en grootte).

Metingen van ‘single’-cel Raman-spectra (SCRS)

[…] De gefixeerde cellen werden op een specifiek behandeld microscopisch plaatje gelegd (dat geen achtergrond Raman-signaal geeft). SCRS m.b.v. een Raman-microscpop en een 532 nm […] laser. […] Spectraal bereik: 330 tot 1900 cm-1 […] 5 s per spectrum, 10 spectra per cel & 20-30 ‘single’ cellen per conditie.

Voor-verwerking en analyse van Raman-gegevens

[…] Kwantificering van intracellulaire bio-molekulen via integratie van de corresponderende Raman-banden in SCRS. Banden geassocieerd met fenylalanine tussen 993-1013 cm-1 & 1022-1036 cm-1 werden gebruikt om de intracellulaire concentratie te kwantificeren. […]

‘Machine-learning’ klassificatie-model

Er werd een ‘machine-learning’ [wetenschappelijke discipline over het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen op basis van empirische gegevens (bv. van sensoren of uit databases; ook wel ‘data-mining’] klassificatie-model geconstrueerd op basis van SCRS van 5 CVS-patiënten en 5 controles (80 & 126 SCRS respectievelijk). Er werd een niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM [een ‘binaire klassificeerder’; wijst, aan de hand van een aantal kenmerken, objecten toe aan één van twee klassen – daarvoor moet ze eerst een numeriek model van deze objecten maken als punten in een wiskundige struktuur; in de training (inoefening) -fase brengt de SVM op basis van een verzameling van voorbeelden, waarvan is aangegeven tot welke klasse ze behoren, een scheiding aan die de twee klassen zo goed mogelijk van elkaar scheidt (die scheiding is een hyper-vlak); nadien kan de SVM dan voor een nieuw te klasseren object beslissen tot welke klasse het behoort door te kijken langs welke kant van het hyper-vlak het corresponderende punt in de ruimte ligt]) algoritme gebruikt om het model op te bouwen […]. Er werden niet-lineaire hyper-vlakken gebruikt om de gegevens te scheiden. ‘Leave-one-out’ kruis-validatie [kruis-validatie = techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] (LOOCV [zie hieronder]) werd aangewend om het model te evalueren en de sensitiviteit werd voor elke conditie en globaal berekend.

Extracellulaire flux analyse

De OXPHOS van PBMCs werd bepaald d.m.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser [zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’] […] Daarbij wordt de zuurstof-consumptie (OCR) opgenomen na opéénvolgende toediening van 1 μM oligomycine, 3 μM carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)-fenylhydrazone (FCCP), en een combinatie van 0,5 μM rotenon en 0,5 μM antimycine-A. […]

Resultaten en bespreking

Cellen zonder mtDNA hebben specifieke ‘single’-cel Raman spectra (SCRS)

PicoGreen kan specifiek worden aangewend om mitochondriaal DNA (mtDNA) te kleuren in levende cellen. Na incubatie met de kleurstof vertoonden ρ0 cellen waarin opnieuw wild-type mtDNA werd geïntroduceerd (WT cellen) helder gekleurde cel-kernen omgeven door talrijke heldere cytoplasmatische spikkels, terwijl ρ0 cellen slechts helder gekleurde cel-kernen zonder de omringende spikkels vertoonden, wat de depletie van mtDNA in ρ0 cellen bevestigt.

Aangezien mitochondrieën de primaire energie-fabriek van de meest eukaryote cellen zijn en de cel bevoorraden met metabole energie onder de vorm van ATP, hebben we de ATP-produktie van WT cellen en ρ0 cellen gemeten bij 50.000 of 75.000 cellen. Verrassend was dat bij beide cel-aantallen, ρ0 cellen gelijkaardige hoeveelheden ATP aanmaakten in vergelijking met WT cellen, als de toegevoegde glucose-concentraties hoog waren (11 mM & 25 mM). Aan de andere kant was de ATP-concentratie in ρ0 cellen significant lager dan in WT cellen bij lage glucose-concentraties (0 mM tot 5 mM). Onze resultaten suggereren dat, als er voldoende glucose is, ρ0 cellen zich kunnen aanpassen om ATP-produktie te stimuleren via niet-mitochondriale glycolyse ter compensatie voor de slechte mitochondriale respiratoire keten. Wanneer de glucose laag en ATP-produktie uit glycolyse beperkt is, is de WT cel-lijn in staat om switchen naar een mitochondriale manier van ATP-produktie gebruikmakend van de respiratoire keten via elektronen-transport gekoppelde fosforylatie (ETCP). De ρ0 cellen zijn echter niet in staat de ETCP te gebruiken omwille van de defekte mitochondrieën.

We pasten ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om de WT cellen en de ρ0 cellen bij hoog glucose te onderzoeken en de verschillen qua bio-energetisch mechanisme (ondanks een gelijkaardige ATP-aanmaak in de 2 cel-lijnen) te verklaren. […] Er werd een relatief lage standaard-deviatie gezien omwille van de beperkte heterogeniteit bij het in vitro bestuderen van de cel-lijnen. Vergeleken met WT cellen, vertonen ρ0 cellen een verschillend spectraal patroon in het ‘fingerprint’-gebied van hun SCRS (600-1.800 cm-1), wat typisch kan worden gebruikt als een fenotypische ‘fingerprint’ van cellen die de belangrijkste biochemische informatie bevatten.

Er werd dan ongecontroleerde ‘principal component analysis’ (PCA [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.]) aangewend om de vele dimensies van SCRS (omwille van de aanwezigheid van meer dan 1.500 Raman-banden) te reduceren. Een PCA-grafiek […] illustreert 2 duidelijk afscheidbare clusters die de WT cellen en ρ0 cellen weergeven. Er werd een diagram opgesteld voor de karakterisatie van de belangrijke Raman-banden. Het meest prominente kenmerk werd gezien bij 1003 cm-1, wat kan worden toegeschreven aan de aromatische ring [benzeen-ring; zes koolstof-atomen die in een vlakke ring liggen] van fenylalanine. Andere banden gerelateerd met fenylalanine bleken ook een grote bijdrage te leveren, inclusief 1.609 […], 1.030 […] en 618 […] cm-1. Alle banden gerelateerd met fenylalanine waren hoger in de ρ0 cellen vergeleken met de WT cellen, wat een belangrijke rol van het aminozuur fenylalanine in het metabolisme van cellen met mitochondriale dysfunktie aangeeft.

Andere verschillen omvatten banden rondom 1.658 […] en 1.440 […] cm-1, die beide hoger zijn in WT cellen t.o.v. ρ0 cellen. Dit suggereert dat, ondanks een hogere accumulatie van cellulair fenylalanine, ρ0 cellen een globale gedaalde intracellulaire concentratie van proteïnen lipiden te wijten aan een verstoord metabolisme hebben. Aangezien fenylalanine alleen wellicht onvoldoende is om het pathomechanisme te karakteriseren, dienen meer biomerkers te worden geïdentificeerd om mitochondriale dysfunktie simultaan en meer betrouwbaar te identificeren.

PBMCs van CVS-patiënten kunnen worden onderscheiden via één enkele Raman-merker

[…] Aangezien fenylalanine een potentiële biomerker in ρ0 cellen bleek, werd gehypothiseerd dat het een geschikte kandidaat kan zijn om bij CVS-patiënten – waarvan wordt gedacht dat ze een gelijkaardige bio-energetische dysfunktie hebben – te onderzoeken. Van de 5 patiënten vertoonden er 4 Raman-spectra met verhoogde fenylalanine-band op 1.003 cm-1 (CVS 1-4), terwijl de andere (CVS 5) een gelijkaardige intensiteit vertoonde i.v.g. met de controles. Door het gemiddelde te maken van 80 SCRS van de patiënten en 126 spectra van de controles, is het zichtbaarder dat de fenylalanine-band een uitgesproken stijging in de cellen van patiënten vertoont.

PCA van SCRS van 10 stalen toonde een aanzienlijke afscheiding tussen de CVS- en de controle-groep. Terwijl CVS 1-4 kleinere ellipsoïden vertoonden met weinig overlapping met de controles, had CVS 5 een hogere ‘single’ cel verspreiding en overlapte grotendeels met de ellipsoïden van de controles; wat correleert met de observatie aangaande fenylalanine. Om te verifiëren dat de afscheiding tussen de groepen in de PCA-clustering toe te schrijven was aan fenylalanine, zetten we het Raman golfgetal [hoeveel golven (golflengtes) per lengte-eenheid] uit tegenover de componenten die de grootste afscheiding tussen de groepen toonden. Raman-banden rond 1.003 en 1.030 cm-1 werden geïdentificeerd voor het beschrijven van de maximum varianties […]. De intracellulaire concentratie van fenylalanine werd semi-gekwantificeerd door het integreren van de Raman-banden op 1.003 en 1.030 cm-1, respectievelijk. Beide signatuur-banden voor fenylalanine bleken significant hoger bij de patiënten t.o.v. controles (p < 0.0001).

Eerdere research ondersteunt de mogelijkheid dat het pathomechanisme van CVS gelinkt is met veranderingen qua aminozuren. Er werden reducties van de concentraties van bepaalde aminozuren, inclusief fenylalanine, in het serum en urine van CVS-patiënten gerapporteerd [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta. (2012) 413: 1525-31 /// Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Fluge Ø, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight. (2016) 1: e89376]. Deze bevindingen ondersteunen een mogelijk metabool defekt verbonden met het aminozuren-metabolisme bij CVS-patiënten, d.m.v. de analyse van de metabolomica van biologsiche vloeistoffen van de patiënten. Ons werk is, naar ons weten, het eerste dat melding maakt van de veranderingen in ‘single’ perifere bloedcellen van CVS-patiënten. Onze resultaten suggereren dat cellen van patiënten meer aminozuren (bv. fenylalanine) kunnen accumuleren, wat resulteert in een vermindering in de lichaamsvochten die wordt gezien in andere studies. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een inductie van secundaire redding-mechanismen om intracellulair meer aminozuren te accumuleren en een normale ATP-produktie te behouden in de metabool dysfunktionele patiënten-cellen [zie Fluge Ø, Mella O et al. hierboven]. Verder toont onze bevinding de impact van fenylalanine in zowel ρ0 cellen zonder mtDNA en bloedcellen van CVS-patiënten, die mitochondriale defekten ook kan linken met CVS. Niettemin: hoe de gestegen fenylalanine-waarden in PBMCs in verband staan met andere weefsels bij de patiënten is nog onduidelijk. Raman-benaderingen die fenotypische spectra kunnen leveren van weefsels zou zeer nuttig kunnen zijn bij toekomstige onderzoeken.

Er werd een extracellulaire flux analyse uitgevoerd bij 4 CVS-patiënten die het meest ongelijk waren van de controles wat betreft SCRS-resultaten (CVS 1-4), om te onderzoeken of er een correlatie bestaat tussen abnormaliteiten qua oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) en de SCRS-analyse wanneer PBMCs geïncubeerd worden in laag- en hoog-glucose. Twee van de patiënten hadden een zeer lage OXPHOS in beide condities (CVS 2 & 4) en de andere 2 hadden veel hogere OXPHOS-profielen (CVS 1 & 3). Hoewel bij de OXPHOS-analyse er mitochondriale deficiëntie uitgesproken werd gedetekteerd in 2 van de 4 patiënten, was SCRS van PBMCs in staat bij alle 4 de abnormaliteiten op te pikken. Niettemin is het staal patiënten en controles klein als we de mogelijks grote heterogeniteit bij CVS-individuen in acht nemen. Onze resultaten dienen als een piloot-studie om het potentieel te verkennen van SCRM als instrument om biomerkers voor CVS te identificeren. Er wordt een studie op grotere schaal voorbereid om de resultaten van dit werk te consolideren.

‘Machine-learning’ modellen kunnen CVS-patiënten met succes en met hoge accuraatheid klassificeren

Bij Raman-benaderingen is, naast het afleiden van kenmerken om informatieve biomerkers te vinden, de klassificatie gebaseerd op spectra dikwijls wenselijk voor diagnostische doeleinden. ‘Machine-learning’ benaderingen zijn gewoonlijk geschikt om de gecompliceerde Raman gegevens-set op te delen in componenten. Niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM) [uitgelegd bij ‘Experiment’] is een gesuperviseerd [input en output duidelijk gedefinieerd] leer-algoritme […] om verschillende klassen te scheiden die d.m.v. lineaire klassificatie niet te scheiden zijn. Er werd een klassificatie-model ingeoefend via niet-lineaire SVM om het onderscheid te maken tussen de CVS-groep en controle-groep op basis van hun SCRS (80 SCRS voor de CVS-groep, 126 SCRS voor de controle-groep). Er werd ‘leave-one-out’ kruis-validatie gebruikt om het model te evalueren door éénder welke van 205 spectra te gebruiken om het model te trainen en dan te testen of het model het ene weggelaten spectrum correct kan klassificeren. Dit model was in staat de CVS-groep met succes te klassificeren met een sensitiviteit van 96,3% (77 van de 80) en de controle-groep met een sensitiviteit van 99,2% (125 van de 126). De lagere sensitiviteit die wordt gezien voor de patiënten-groep kan worden verklaard door de aanwezigheid van hogere heterogeniteit bij de CVS-patiënten. Er werd een totale accuraatheid van 98,1% bereikt op basis van 206 Raman-spectra. Opmerkenswaardig: bij een groter wordend staal en aantal Raman-spectra om de referentie-database op te bouwen, kunnen klassificatie-modellen met betere deugdelijkheid worden bereikt. Aangezien één Raman-spectrum binnen luttele seconden kan worden verkregen, kan één patient-staal bestaande uit meerdere spectra en meerdere cellen worden gekarakteriseerd en geklassificeerd binnen enkele minuten, wat een enorm potentieel en haalbaarheid in de klinische praktijk impliceert.

Besluiten

Deze studie werd uitgevoerd om de haalbaarheid van of ‘single’ cel Raman-analyse te evalueren bij de detektie van biomerkers gerelateerd met mitochondriale dysfunktie en CVS. Zodoende identificeerden we een verhoogde intracellulaire concentratie van het aromatisch aminozuur fenylalanine [essentieel aminozuur dat nodig is voor diverse biochemische processen; onder andere voor de aanmaak van de neurotransmitters dopamine, adrenaline en noradrenaline] en toonden dat het kan worden gebruikt als een potentiële biomerker in ρ0 cellen zonder mitochondriaal DNA, alsook in perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS-patiënten. Bovendien gaf een ‘machine-learning’ model een accuraatheid van 98,1% correct te klassificeren van patiënten en controles op basis van hun Raman-spectra. De combinatie van Raman-biomerkers en klassificatie-modellen zou kunnen leiden tot verbeteringen omtrent het begrijpen van CVS-pathogenese en het potentieel hebben te worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor CVS.

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

juli 29, 2018

Uitgebreide metaboloom-studie bij M.E.(cvs)

Aankondigingen als “Nieuwe CVS-test is 84 percent accuraat’ klinken natuurlijk hoopgevend maar de realiteit is toch ietsje ingewikkelder… Als men het artikel hier onder leest, zal men te weten komen dat het niet over één (snel) test(je) gaat maar een complexe analyse die op lange termijn inzichten zou kunnen verschaffen over de pathologie, subgroepen en een mogelijke therapeutische aanpak daarvan. ‘Inzichten over metabolieten brengen ons dichter naar een test voor CVS’ klinkt al wat genuanceerder…

Onderstaande studie, door een research-team o.l.v. onderzoekers van het ‘Centre for Infection and Immunity’ (CII) van de Columbia Universiteit (New York City), levert dus geen kant-en-klare diagnostische test op. D.m.v. hoog-technologische technieken (die bijlange niet in elk routine-lab beschikbaar zijn) werden 562 metabolieten (zeg maar produkten die ontstaan bij menselijke en of microbiële processen die suikers/vetten/eiwitten verwerken) gevonden die bij M.E.(cvs)-patiënten al dan niet anders waren. Een aantal daarvan bleken te wijzen op mogelijk slecht funktioneren van de mitochondrieën (de energie-fabriekjes van cellen) – wat overéénkomt met wat andere research-teams vonden. Ook hun eerdere vondst van een onderscheidend metabolieten-patroon tussen M.E.(cvs) en prikkelbare darm syndroom werd bevestigd. Combinatie van de gegevens (metaboloom) met de eerder gevonden biomerkers (microbioom) leverde een voorspellend model op en statistische analyse gaf aan dat de accuraatheid daarvan om de diagnose M.E.(cvs) te kunnen stellen 84% is.

Dr. W. Ian Lipkin, directeur van het CII en het ‘National Institutes of Health Centre for Solutions for ME/CFS’ liet optekenen: “We beginnen te begrijpen hoe de ziekte in z’n werk gaat. We zouden dieren-modellen kunnen gaan ontwikkelen die ons in staat kunnen stellen om hypotheses en potentiële therapieën (bv. probiotica de darm-flora regelen of medicijnen die bepaalde neurotransmitter-systemen aktiveren) te testen.”.

————————-

Scientific Reports Vol 8, #1, article 10056 (juli 2018)

Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics

Dorottya Nagy-Szakal (1), Dinesh K. Barupal (2), Bohyun Lee (1), Xiaoyu Che (1), Brent L. Williams (1), Ellie J.R. Kahn (1), Joy E. Ukaigwe (1), Lucinda Bateman (3), Nancy G. Klimas (4,5), Anthony L. Komaroff (6), Susan Levine (7), Jose G. Montoya (8), Daniel L. Peterson (9), Bruce Levin (10), Mady Hornig (1), Oliver Fiehn (11), W. Ian Lipkin (12)

1 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

3 Bateman Horne Center, Salt Lake City, UT, USA

4 Institute for Neuro Immune Medicine, College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, USA

5 Miami VA Medical Centre, Miami, FL, USA

6 Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA

7 Levine Clinic, New York, NY, USA

8 Stanford University, Palo Alto, CA, USA

9 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

10 Department of Biostatistics, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

11 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

12 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

Samenvatting

De pathogenese van M.E./CVS, een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, slaap-stoornissen, orthostatische intolerantie, koorts, prikkelbare darm syndroom (IBS) en lymfadenopathie [afwijkingen/vergroting van de lymfeklieren], wordt niet goed begrepen. We rapporteren over biomerkers en topologische analyse van het plasma metaboloom, faecaal bakterieel metagenoom en klinische gegeven van 50 M.E./CVS-patiënten & 50 gezonde controles. We bevestigen meldingen van gewijzigde plasma-waarden van choline, carnitine en complexe lipiden, en tonen aan dat patiënten met M.E./CVS & IBS verhoogde plasma-waarden van ceramide hebben. Integratie van faecal metagenoom en plasma metaboloom gegevens resulteerde in een sterker voorspellend model voor M.E./CVS (kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom (kruis-validatie AUC = 0.745) of metaboloom (kruis-validatie AUC = 0.820) -analyse apart. Onze bevindingen kunnen inzicht bieden in de pathogenese van M.E./CVS en z’n subtypes, en suggereren mechanismen voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën.

Inleiding

[…]

Metaboloom-studies over M.E./CVS hebben onregelmatigheden onthuld aangaande het energie-, aminozuren-, nucleotiden- en stiktstof-metabolisme [Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172], alsook inconsistente verstoringen in neurotransmitter-gerelateerde mechanismen en het lipiden-metabolisme. In een massa-spectrometrische studie met 45 M.E./CVS-individuen en 39 gezonde controles, rapporteerden Naviaux et al. abnormaliteiten qua niveaus van fosfo- en sfingolipiden, cholesterol, ‘vertakte’ aminozuren, vitaminen, proline/glutamaat en mitochondriale metabolieten. [Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480] In een studie met 67 M.E./CVS-patiënten en 66 gezonde controles bepaalden Yamano en z’n collega’s 144 metabolieten en rapporteerden abnormaliteiten qua waarden van metabolieten gerelateerd met glycolyse, de TCA-cyclus en de ureum-cyclus, maar niet van het glutamine-metabolisme. [Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep (2016) 6: 34990] Fluge et al. brachten bewijsmateriaal aan voor afwijkingen die consistent zijn met verstoorde funktie van pyruvaat-dehydrogenase die gelinkt is met verstoringen van de (TCA-cyclus gebaseerde) energie-produktie. [Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1] Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie heeft ook metaboloom-abnormaliteiten onthuld die consistent zijn met veranderde gluconeogenese, mogelijke inhibitie van de glycolyse en een verstoorde respons op oxidatieve stress. [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] Een andere NM-studie vond dat bij M.E./CVS (t.o.v. controles) de waarden van glutamine en ornithine in het serum lager waren, en correleerden met metabolieten verbonden met de ureum-cyclus. [Armstrong CW et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531] Een piloot-studie (met de focus op plasma van vrouwen met M.E./CVS) onthulde wijzigingen qua energie-gerelateerde metabole molekulen en mechanismen. [Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst (2017) 13: 371-379] We hebben melding gemaakt van analyses van het faecaal microbioom en stelden een model voor waarbij intestinale dysbiose kan bijdragen tot bakteriële metabole stoornissen die verschillen tussen M.E./CVS-subgroepen met of zonder IBS. [Nagy-Szakal D. et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5, 44]

Hier rapporteren we over gerichte en ongerichte analyses van 562 molekulen die primaire metabolieten, biogene aminen, lipiden-complexen en oxylipinen [molekulen ontstaan door oxidatie van vetzuren] vertegenwoordigen, in het plasma van M.E./CVS-patiënten en controles. We beschreven ook de verbondenheid van de resulterende metaboloom-gegevens met faecaal metagenoom en klinische gegevens. Zoals bij onze eerder gerapporteerde metagenoom-analyses, vonden we dat metaboloom-profielen niet enkel verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en controles maar ook tussen M.E./CVS-patiënten die al dan niet IBS hebben.

Methodes

Studie-ontwerp

[…]

Studie-populatie en plasma-collectie

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Controles gematcht voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en seizoen van afname. […]

[…]

Klinische beoordeling & medische anamnese

[…]

Zelf-gerapporteerd diagnose van IBS […] 24/50 M.E//CVS-patiënten (48%), 1/50 controle-individuen (2%). […]

Metabolomica

Er werden 3 ongerichte metaboloom-testen en 1 gerichte test uitgevoerd voor 562 metabolieten van 20 biochemische mechanismen [massa-spectrometrie]. […].

Statistische analyses

[…]

MetaMapp

[Methode om verbanden tussen biochemische en chemische verbanden te integreren om alle gedetekteerde metabolieten d.m.v. in netwerk-diagrammen in kaart te brengen. Deze diagrammen visualiseren op een efficiënte manier de op massa-spectrometrie gebaseerde metaboloom-gegevens. Een knooppunt vertegenwoordigt een metaboliet. Ge-upreguleerde en ge-downreguleerde knooppunten krijgen een verschillende kleur. De grootte van een knooppunt weerspiegelt de grootte-orde van het effekt.] […] Struktureel geïdentificeerde metabolieten werden gegroepeerd in 21 chemische groepen [carnitine-choline * tryliceriden (TG) * ceramide * fosfatidylethanolminen (PE) * aminozuren * oxylipinen * exposoom * vetzuren * sfingomyelinen (SM) * energie * complexe lipiden (LPC) * carnitine * suiker * suiker-alkohol * cholesterol * neutrale lipiden * één-koolstof/nicotinaat * neurotransmitter * nucleotide * vitamine]. De metabolieten werden manueel geklassificeerd omdat dit voor veel molekulen, inclusief complexe lipiden, niet altijd even goed gebeurt in bestaande databases. […]

Analyses van topologische gegevens

Metagenoom- en metaboloom-gegevens, inclusief plasma-waarden van de metabolieten, bakteriële samenstelling en afgeleide metabole mechanismen, plasma immuun-profielen en symptoom-ernst-scores, werden gebruikt voor TDA [‘topological data analysis’, topologische gegevens analyse]. De aangewende methodiek geeft de complexe biologische sets gegevens weer als gestruktureerde 3-dimensionele netwerken [knooppunten verbonden met lijnen]. […] De lijnen verbinden netwerk-knooppunten die gemeenschappelijke gegevenspunten bevatten. […] De grootte van een knooppunt in het topologisch netwerk was proportioneel met het aantal variabelen met een gelijkaardig profiel. We construeerden een netwerk bestaande uit 100 stalen en 1.900 variabelen (562 plasma-metabolieten, 574 faecale bakteriële relatieve aantallen […], 586 voorspelde bakteriële metabole mechanismen, 61 immuun-molekulen, 81 variabelen met betrekking tot M.E./CVS-vermoeidheid en andere symptoom-scores/vragenlijst-items, en informatie over co-morbiditeiten en 36 demografische variabelen). […]

Resultaten

Karakteristieken van de studie-populatie

[…] 41 vrouwelijke en 9 mannelijke M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 51,1 ± 1,6 jaar); 41 vrouwelijke en 9 mannelijke controle-individuen (gemiddelde leeftijd 51,3 ± 1,6 jaar). […] Prikkelbare darm syndroom (IBS) diagnose bij 24 van de 50 M.E./CVS-patiënten (48%). Eén van de 50 controle-individuen meldde een diagnose van IBS (2%).

Metaboloom-gegevens

Gerichte en ongerichte massa-spectrometrie leverde gegevens op voor 562 metabolieten: 111 primaire metabolieten (PM), inclusief deze gerelateerd met het tryptofaan-metabolisme, suikers, hydroxyzuren, keton-lichamen en andere molekulen van het energie-metabolisme; 103 biogene aminen (BA) inclusief vertakte en onvertakte acylcarnitinen, trimethylamine N-oxidase (TMAO [osmolyt (molekule bijdragend tot de (regulering van) osmotische druk in cellen en weefsels); ook gerapporteerd significant verhoogd te zijn bij fibromyalgie]), choline [organische stof die belangrijk is voor de struktuur van cel-membranen en andere membraan-strukturen, en voor neurotransmissie] en aminozuren; 302 complexe lipiden (CL) inclusief mono- en di-acylglyceriden [molekulen van glycerol gelinkt met 1 of 2 vetzuren], vetzuren, ceramide [(sfingo)lipide-molekule in het celmembraan waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood; Naviaux rapporteerde bij M.E.(cvs) gedaalde waarden] sfingomyelinen [sfingolipiden die voornamelijk voorkomen in de myeline-schede rond axonen] en fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden]; en 46 bio-aktieve oxylipinen (OL), steroïden en galzuren. […]

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel

Exposoom- en vitamine-metabolieten (exogene milieu-stoffen) [Het exposoom is het geheel van menselijke (d.i. niet-genetische) blootstellingen aan het milieu vanaf de conceptie.]) werden uitgesloten [lijst beschikbaar op aanvraag] bij onze biomerker-analyse omdat vitamine-supplementen, medicijnen en dieet een impact kunnen hebben op de concentraties metabolieten onafhankelijk van de ziekte-toestand. [514 overblijvende metabolieten] We selekteerden de top 10 potentiële M.E./CVS-biomerkers. […] 5-methoxytryptamine (5-MT) werd uitgesloten aangezien het in 50% van de gevallen wordt verstoord door het gebruik van antidepressiva. […]

Bij de top plasma-biomerkers die M.E./CVS-patiënten differentiëren van controles waren gedaalde waarden van betaïne [osmolyt], complexe lipiden (lysofosdatidylcholine [LPC], fosfatidylcholinen [PC]) en sfingomyelinen (SM), en gestegen waarden van triglyceriden (TG), α-N-fenylacetyl-glutamine [metaboliet van de ureum-cyclus], ε-caprolactam [cyclisch amide] en urobiline [afbraakprodukt van oude erythrocyten; kleurstof in de urine]. [complete lijst beschikbaar op aanvraag] Analyse leerde dat M.E./CVS-individuen verminderde waarden qua PC en ontregeling van het of choline-carnitine mechanisme vertoonden.

MetaMapp-analyse van alle metabolieten, inclusief vitaminen en neurotransmitters, bracht de biochemische en chemische relaties in kaart in een metabool netwerk-diagram. De diagrammen beschrijven verhoogde TG en vetzuren, en verlaagde carnitinen, ceramiden, SM en fosfatidylcholinen bij M.E./CVS i.v.m. controles. De analyse toonde ook verminderd 5-MT, tyrosine en indol-3-lactaat [tryptofaan-metaboliet], en verhoogd vitamine-B5 (pantotheenzuur) bij de M.E./CVS-individuen. [In detail: MetaMapp identificeerde verstoringen in het tryptofaan-metabolisme, de carnitine-‘shuttle’ (enzymen-mechanisme verantwoordelijk voor de transfer van lange-keten vetzuren door het binnenste mitochondriaal membraan om te worden afgebroken) / energie-homeostase en de complexe lipiden. Metabolieten die het tryptofaan- en carnitine-mechanisme vertegenwoordigen waren gedaald bij M.E./CVS (t.o.v. controles). In tegenstelling daarmee waren threonzuur (metaboliet van ascorbinezuur of vitamine-C), aminozuren (tyrosine, methionine & lysine), fenylacetyl-glutamine, pantotheenzuur, hexa-ethyleen-glycol (metaboliet) & ε-caprolactam gestegen bij M.E./CVS. Lipiden-analyses toonden dat terwijl metabolieten die de SM, Cer/CE (ceramide) & PC/LPC mechanismen vertegenwoordigen verminderd waren bij M.E./CVS, de TG-mechanismen waren verhoogd.]

IBS co-morbiditeit is geassocieerd met veranderde metabole profielen bij M.E./CVS-patiënten

In eerder werk (met dezelfde individuen) bleek IBS co-morbiditeit de sterkste factor die bepalend was voor de topologische netwerken gebaseerd op faecaal metagenoom gegevens (bakteriële relatieve hoeveelheden en voorspelde bakteriële metabole mechanismen). Analyse van plasma-metabolieten onthulde dat metaboloom-profielen van M.E./CVS-patiënten met IBS zich onderscheiden van controles door waarden van TG, ceramiden, fosfatidylethanolminen (PE) [membraan-fosfolipiden] en metabolieten van het carnitine-choline mechanisme.

M.E./CVS-patiënten zonder IBS co-morbiditeit vertoonden verstoringen qua PCs en het carnitine-choline mechanisme, gelijkaardig met die gevonden bij de globale M.E./CVS-groep. Statistische analyses van de plasma-metabolieten identificeerden verhoogde waarden qua ceramiden, TG, PE, 5-methylthio-adenosine [een nucleoside; zie hieronder], mannitol [een een polyol of suiker-alkohol] en betaïne, alsook gedaalde waarden LPCs en γ-butyrobetaïne [voorloper van carnitine] bij M.E./CVS-patiënten met IBS t.o.v. controles. Bij M.E./CVS-patiënten zonder IBS vonden we verminderde waarden qua tyrosine en PC, en verhoogde waarden qua TG en Tyr-Met-Lys [de 3 aminozuren tyrosine, methionine & lysine] t.o.v. controles. In vergelijking met controles hadden alle M.E./CVS-groepen (globaal, met IBS en zonder IBS) gedaalde waarden van carnitine-choline metabolieten. M.E./CVS-patiënten met IBS hebben een onderscheidend metaboloom-profiel.

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel bij vrouwen

De metabole profielen bij vrouwen met M.E./CVS waren gelijkaardig met deze die worden gezien bij alle M.E./CVS-gevallen. De waarden van complexe lipiden (LPC & PC) waren gedaald en de TG-waarden waren verhoogd bij M.E./CVS vs. controles. Bij de top 10 plasma biomerkers die de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten differentieerden van de vrouwelijke controles waren verlaagd indol-3-lactaat en γ-butyrobetaïne. Deze bleken ook gereduceerd bij de globale M.E./CVS-groep maar behoorden niet tot de top 10.

Geselekteerde metabolieten als potentieel diagnostisch instrumetn bij M.E./CVS

M.E./CVS vs. controles

We testten de sensitiviteit en de specificiteit van de top 10 M.E./CVS-biomerkers […]. Deze metabolieten onderscheiden de M.E./CVS-individuen van de controles met een accuraatheid (‘receiver operating characteristic’ (ROC) [ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit] & ‘area under the curve’ (AUC) [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] van 0.960 (kruis-validatie [een techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] AUC = 0.820). Er bleken in onze eerder studie 8 bakteriële soorten M.E./CVS te voorspellen […] (Coprococcus (C.) catus, Pseudoflavonifractor (P.) capillosus, Dorea (D.) formicigenerans, Faecalibacterium (F.) prausnitzii, Clostridium (C.) asparigiforme, Sutterella (S.) wadsworthensis, Alistipes (A.) putredinisand Anaerotruncus (A.) colihominis; kruis-validatie AUC = 0.745). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (ROC AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart. […]

IBS-subgroepen vs. controles

[…] De top 10 metabolieten onderscheiden M.E./CVS met IBS van de controles met een accuraatheid van AUC = 0.877 (kruis-validatie AUC = 0.754). In onze eerdere studie werden 9 bakteriële soorten geselekteerd om M.E./CVS+IBS te voorspellen […] (F. cf., F. prausnitzii, Bacteroides (B.) vulgatus, A. putredinis, C. catus, Anaerostipes (A.) caccae, D. formicigenerans, A. colihominis & C. asparagiforme; kruis-validatie AUC = 0.791. Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.824) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Bij M.E./CVS zonder IBS zorgden de top 10 metabolieten ook voor een onderscheid met een hoge accuraatheid (AUC = 0.975, kruis-validatie AUC = 0.839). In onze eerdere studie werden 7 bakteriële soorten geselekteerd om ME/CFS-IBS te voorspellen (B. caccae, P. capillosus, Parabacteroides (P.) distasonis, B. fragilis, Prevotella (P.) buccalis, B. xylanisolvens & D. formicigenerans; kruis-validatie AUC = 0.754). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (MET+BACT: AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.880) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Plasma metaboloom-profielen, faecale bakteriële profielen en symptoom-scores bij M.E./CVS

[lijst met unieke en gedeelde metabolieten in de M.E./CVS-subgroepen beschikbaar op aanvraag]

De relatieve aantallen van bakteriële soorten in faeces van de individuen varieerden met hun plasma metaboloom-profielen. Verminderd betaïne bleek geassocieerd met minder A. colihominis. Gedaald PC 30:0 correleerde met minder A. putredinis, een bakterie die sulfonolipiden – ongewone sfingolipiden die struktureel gerelateerd zijn met ceramiden – produceert. Van sfingolipiden is geweten dat ze bakterieën helpen overleven en stress-resistentie bevorderen.

Bij M.E./CVS met IBS was 5-methylthio-adenosine (een metaboliet afgeleid van S-adenosylmethionine als neven-produkt van de polyamine-biosynthese, dat toxisch kan zijn voor zoogdier-cellen) geassocieerd met funktionele stoornissen. Ceramide was geassocieerd met verhoogde lichamelijke vermoeidheid. Gedaald γ-butyrobetaïne correleerde met meer Faecalibacterium, een bakterie die een belangrijke rol speelt bij de aanmaak in de dikke-darm van butyraat [boterzuur], een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten.

In M.E./CVS zonder IBS correleerde gedaald tyrosine met minder P. distasonis. Verhoogd TG 54:6 A was gecorreleerd met D. formicigenerans, en TG 54:8 was gecorreleerd met minder B. caccae & D. formicigenerans. Parabacteroides & Bacteroides soorten hebben het vermogen complexe polysacchariden om te zetten in energie-bronnen. D. Formicigenerans is een koolhydraten-fermenterende bakterie die mierenzuur en lactaat produceert.

TDA-analyse voor netwerk-identificatie

‘Topological data analysis’ (TDA) [zie methodes] van plasma metaboloom- en faecaal metagenoom-gegevens, en klinische symptoom-ernst identificeerde netwerken die M.E./CVS van controles onderscheiden. Profielen van bakteriële relatieve aantallen waren sterkere bepalende factoren voor netwerk-onderscheid dan plasma-metabolieten.

Bespreking

We rapporteerden eerder dat M.E./CVS-patiënten met IBS, M.E./CVS-patiënten zonder IBS en normale controle-individuen groep-specifieke verschillen vertonen qua faecale microflora. We hebben de karakterisatie van dezelfde individuen uitgebreid d.m.v. gerichte en ongerichte metaboloom-analyses van het plasma en geïntegreerde analyse van plasma metaboloom-, faecal metagenoom- en klinische gegevens.

De groep van Naviaux rapporteerde eerder gedaalde plasma-waarden van sfingomyelinen, ceramiden en fosfolipiden (met uitzondering van 18:1 & PC 22:6, die gestegen waren). Tomic et al. rapporteerden verhoogde plasma-waarden TG. [Lipid and protein oxidation in female patients with Chronic Fatigue Syndrome. Arch Med Sci (2012) 8: 886-891] Germain et al. rapporteerden over metabolome biomerkers voor het verstoorde aminozuren-, energie-, suiker- en vetzuren-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [zie hierboven] Geen van deze research-groepen onderzocht de impact van IBS op metaboloom-profien bij M.E./CVS. Onze analyse bevestigde de gedaalde waarden van fosfolipiden en SM, en de gestegen waarden van TG, maar verschilde met betrekking tot specifieke molekulen. We vonden bij de gevallen geen verschillen qua PC 18:1 & PC 22:6. We vonden ook geen consistente afname qua ceramide-waarden. Terwijl M.E./CVS zonder IBS verminderde waarden van de ceramiden d43:1 & d42:1 vertoonden, bleken bij M.E./CVS met IBS verhoogde waarden van 6 ceramiden: d36:1, d40:0, d42:0, d 34:1, d38:1 & d40:1.

Ceramide is een was-achtig lipide dat betrokken is bij de suppressie van elektronen-transport, insuline- & leptine-resistentie, en apoptose. Eerdere studies meldden dat ceramiden betrokken zouden kunnen zijn bij de pathologie van IBS en metabole aandoeningen. Verhoogde waarden van lipopolysacchariden (LPS) geassocieerd met een gewijzigd darm-microbioom [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30] kunnen de aktivatie van sfingomyelinase (SMAse [enzyme]) en de hydrolyse [splitsing] van SM triggeren om ceramide te produceren. Ceramiden zijn toxisch voor veel cel-subtypes via de aanmaak van reaktieve zuurstof-soorten en zou een rol kunnen spelen bij darm-barrière-dysfunktie en verhoogde darm-permeabiliteit. Er werden gestegen waarden van ceramide gerapporteerd in mucosa [(darm)slijmvlies] -stalen van IBS-patiënten alsook in plasma- en weefsel-stalen bij diabetes, cardiomyopathie, insuline-resistentie, atherosclerose [‘aderverkalking’] en steatohepatitis [‘vette lever’; veroorzaakt levercirrose]. Het blokkeren van SMAse om ceramide-waarden te doen dalen kan therapeutisch zijn door inflammatie te reduceren. Patiënten met M.E./CVS en IBS hadden ook hogere plasma mannitol-concentraties. We speculeren dat mannitol de permeabiliteit kan verhogen van de darm-mucosa en de bloed-hersen-barrière resulterend in het doorlaten van molekulen zoals cytokinen en neurotransmitters, wat bijdraagt tot de ziekte.

Net als Armstrong en z’n collega’s, vinden we wijzigingen qua metabolieten geassocieerd met het mitochondriaal energie-metabolisme. Een eerdere studie meldde significante dalingen van TCA-cyclus metabolieten gerelateerd met het energie-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [Yamano E et al.] De gerapporteerde dysfunktie had een impact op het carnitine-metabolisme en ATP/energie-metabolisme in de spieren van M.E./CVS-patiënten. [Armstrong CW et al. (2015)] Carnitine is een belangrijk supplement dat acyl-CoA transfereert naar de mitochondriale matrix en deelneemt aan vetzuur β-oxidatie (TCA-cyclus, ATP-produktie en energie-metabolisme). Studies omtrent carnitine-waarden in het serum en plasma bij M.E./CVS bleken niet overtuigend: sommige teams meldden reducties terwijl andere normale waarden vonden. In een open-label studie met 30 patiënten, bleken acetyl-carnitine supplementen de vermoeidheid en cognitieve funktie verbeteren bij 59% van de M.E./CVS-patiënten. [Vermeulen RC & Scholte HR. Exploratory open label, randomized study of acetyl- and propionylcarnitine in Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom Med (2004) 66: 276-282; zie ook ‘Lange-keten acylcarnitine deficiëntie bij CVS] In onze studie waren molekulen van het choline-carnitine mechanisme gedaald bij M.E./CVS-patiënten ongeacht hun IBS-status.

Onze resultaten zijn consistent met vroegere rapporten die suggereren dat metabolieten gelinkt met het lipiden- en energie-metabolisme aangetast zijn bij M.E./CVS. Ze breiden vroeger werk uit door aan te tonen dat M.E./CVS-individuen met IBS co-morbiditeit een duidelijk verschillend metaboloom-profiel hebben t.o.v. M.E./CVS-individuen zonder IBS en controles.

Veel M.E./CVS-patiënten in onze groep namen vitamine-B supplementen (26/50, 52%) die het potentieel hebben de waarden van pantotheenzuur te doen stijgen. Het gebruik van vitamine-B supplementen was geassocieerd met hogere waarden van pantotheenzuur en lagere vermoeidheid-scores (gegevens niet getoond). Het aantal stalen was echter onvoldoende groot om een significant verband te testen. Plasma-waarden van 5-MT, een molekule gerelateerd met het tryptofaan-, serotonine- en melatonine-metabolisme, waren gedaald bij M.E./CVS; deze bevinding werd echter verstoord door het gebruik van selektieve serotonine heropname inhibitoren (SSRIs) of andere antidepressiva (serotonine-norepinefrine heropname inhibitoren en tricyclische antidepressiva) bij 25 van de 50 (50%) M.E./CVS-individuen vs. 6 of 50 (12%) gezonde controles. Voorafgaande metaboloom-studies hebben gereduceerde waarden van 5-MT in het plasma aangetoond bij chronische, maar niet acute, SSRI-toediening. In menselijke cellen is 5-MT een belangrijk metaboliet dat betrokken is bij de omzetting van serotonine (5-hydroxytryptamine) en melatonine (N-acetyl-5-methoxytryptamine). Er werden eerder al gedaalde waarden van serotonine-transporters, die een rol spelen bij het reguleren van serotonine-waarden in de synapsen, gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamamoto S. et al. Reduction of serotonin-transporters of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neuroreport (2004) 15: 2571-2574]

Correlatie-studies suggereerden mogelijke verbanden tussen 5-MT neurotransmitter metabolieten en de ernst van M.E./CVS, inclusief verstoorde cognitieve funktie, slaap-stoornissen en globaal verhoogde vermoeidheid-scores bij M.E./CVS. Bijkomende studies met grotere aantallen individuen zullen nodig zijn om te bekijken of plasma-waarden van pantotheenzuur of 5-MT gecorreleerd kunnen worden met symptomen en om te bepalen of er een subgroep M.E./CVS-patiënten is waarvan kan worden voorspeld dat ze voordeel haalt uit medicijnen die de geassocieerde mechanismen moduleren.

In onze studie waren 41 van de 50 M.E./CVS-individuen (82%) vrouwen, net zoals 41 op 50 (82%) controle-individuen. Gezien het feit dat de overgrote meerderheid patiënten en controles vrouwen waren, is het niet verrassend dat de bevindingen bij vrouwen met M.E./CVS gelijkaardig waren met de bevindingen in de globale M.E./CVS-groep. Beide hadden lage waarden complexe lipiden (LPC & PC) en hogere waarden TG dan controles. De studie-groep omvatte slechts 9 M.E./CVS mannen en 9 mannelijke controles; dus is er onvoldoende ‘power’ om ev. verschillen tussen vrouwen en mannen te bekijken. Dit verschil qua prevalentie per geslacht is kenmerkend voor M.E./CVS (typisch 4:1 vrouwen:mannen).

Ons voorspellend model onderscheidt M.E./CVS-patiënten van controles met hoge accuraatheid; maar dit dient echter te worden geverifieerd via een onafhankelijke studie.

M.E./CVS is een heterogene aandoening. Identificatie van M.E./CVS-subgroepen die worden gekarakteriseerd d.m.v. specifieke metaboloom-profielen die primaire metabolieten, biogene aminen, complexe lipidomica [studie van mechanismen en netwerken van cellulaire lipiden in biologische systemen] en oxylipinen integreren, zouden de aflijning van subtypes moeten mogelijk maken en leiden tot specifieke diagnostische en therapeutische strategieën.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.