M.E.(cvs)-wetenschap

januari 19, 2017

Post-exertionele malaise versus vermoeidheid

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 2:31 pm
Tags: , , , , , ,

Tijdens de 12e ‘IACFS/ME Conference’ (Oktober 2016; Fort Lauderdale, Florida) werd nieuwe research gepresenteerd die focust op het fenomeen van post-exertionele malaise (PEM). Er werd daar (nog maar eens) geopperd dat de benaming ‘Chronische Vermoeidheid Syndroom’ niet correct is en de aandoening trivialiseert. M.E./CVS wordt gekenmerkt door verscheidene symptomen, waarvan PEM (het ‘crashen’ of fel verslechteren van de reeds aanwezige symptomen) bijna altijd voorkomt. Co-voorzitter van de conferentie Dr Lily Chu (Stanford University, Palo Alto, California) zei daarover: “Veel studies tonen aan dat fysieke inspanning de symptomen van M.E./CVS-patiënten verergert. De manier waarop deze patiënten voorkomen is heel verschillend van gezonde mensen of patiënten met andere aandoeningen.”. Het ‘Institute of Medicine’ rapporteerde (in 2015) al dat PEM (naast andere symptomen) vereist/verplicht is om de diagnose van M.E. of M.E./CVS te kunnen stellen en dat het géén optioneel/facultatief criterium is (zoals bij de definitie van de ‘Centres for Disease Control and Prevention’).

PEM kan optreden na een fysieke of cognitieve inspanning (bij een minderheid door emotionele belasting/stress). Hoewel vermoeidheid het meest courant verslechtert, worden ook dikwijls meer cognitieve problemen, verstoorde slaap, hoofdpijn, spierpijn en een griep-achtig gevoel gerapporteerd. Soms ook gastro-intestinale, orthostatische en met stemming gerelateerde verergeringen. De timing en de duur van de symptomen varieert: PEM kan optreden 24h na de trigger; bij anderen is dit 3 of meer dagen. Soms is PEM moeilijk te identificeren en daarom wordt aangeraden een dagboek bij te houden waarin de symptomen en de aktiviteit worden genoteerd.

Er zijn een aantal studies die de biologische verbanden van PEM documenteren. Tijdens deze ‘IACFSME conference’ werden er een ook aantal voorgesteld. We geven er hier een paar interessante mee (uit het de conferentie-syllabus)…

Lees ook ‘Dubbele fietstest’, ‘M.E./CVS-patiënten niet in staat maximale VO2 te herhalen bij 2daagse fietstest’, ‘Verminderde zuurstof-extractie tijdens een cardiopulmonaire inspanning-test bij CVS’, ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’ & ‘Vertraagd herstel na Inspanning bij CVS’.

————————-

Blood lactate increases more rapidly after a previous exercise challenge in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME) than in healthy subjects

Katarina Lien et al.

University of Oslo, Norway

Achtergrond: Eerdere bevindingen op basis van herhaalde cardiopulmonaire inspanning-testen (CPET) suggereren dat inspanning op dag 1 de piek zuurstof-opname (piek VO2) op dag 2 negatief beïnvloedt bij patiënten met CVS/M.E. Accumulatie van lactaat geeft de overgang aan naar anaërobe glycolyse, een beperkende factor voor maximale prestaties.

Doelstellingen: Het belangrijkste doel was het effekt te onderzoeken van een inspanning op piek VO2 en lactaat-accumulatie bij CVS/M.E.-patiënten die een CPET uitvoerden op 2 opéénvolgende dagen.

Methodes: 18 vrouwelijke patiënten (18-50 jaar) die voldeden aan de Canadese Consensus Criteria en de Internationale Consensus Criteria voor CVS/M.E., en 15 controles (gezonde, sedentaire vrouwen; 18-50 jaar) voerden 2 CPET uit met een tussentijd van 24 uur. We maten de zuurstof-opname en namen arterieel bloed af voor lactaat-analyse, bij ‘baseline’ en elke 30ste seconde tijdens de testen. Er werden statistische analyses toegepast voor herhaalde metingen.

Resultaten: De lactaat-waarden per hoeveelheid arbeid waren hoger bij patiënten dan bij controles voor beide testen (p < 0.001). Verder trad de lactaat-accumulatie vroeger op bij test 2 bij de patiënten en later bij de gezonde individuen, vergeleken met hun respectievelijke lactaat-accumulatie bij test 1 (p < 0.001). Bij test 1 was de gemiddelde (± SD) piek VO2 (ml/kg/min) lager bij de patiënten dan bij de controles (24,2 ± 4,9) vs. 36,6 ± 6,2; p < 0.001). Het gemiddeld verschil qua test/her-test piek VO2 was -1,4 ± 1.1 bij de patiënten (p < 0.001), terwijl er geen verschil werd gevonden bij de controles (-0,9 ± 1,8; p = 0.07). Het gemiddelde test/her-test verschil qua piek VO2 verschilde echter niet tussen de groepen (p = 0.33).

Besluit: CVS/M.E.-patiënten hadden hogere lactaat-waarden dan gezonde individuen bij ‘baseline’ en per hoeveelheid arbeid voor beide testen. Daarnaast lijkt de eerste inspanning een vroegere lactaat-accumulatie te induceren bij patiënten wanneer die de volgende dag werden her-test. Dit is niet zo bij gezonde individuen. Verder bevestigt deze studie dat CVS/M.E.-patiënten een gedaalde fysieke capaciteit hebben vergeleken met gezonde individuen maar de verandering qua piek VO2 bij herhaalde CPET onderscheidde de patiënten niet van gezonde controles.

————————-

Cardiopulmonary Exercise Testing Demonstrates Post-Exertional Chronotropic Incompetence

Haylee Bettencourt (1), Todd E. Davenport (2), Jared Stevens (3), Staci R. Stevens (3), Christopher R. Snell (3) & J. Mark Van Ness (1)

(1) Department of Health, Exercise and Sport Science, University of the Pacific, Stockton, CA, United States

(2) Department of Physical Therapy, University of the Pacific, Stockton, CA, United States

(3) Workwell Foundation, Ripon, CA, United States

Achtergrond: Chronotropische incompetentie (CI) is het onvermogen van het hart om z’n tempo evenredig te verhogen bij gestegen funktionele vereisten. CI is courant bij patiënten met cardiovasculaire ziekte en geassocieerd met inspanning-intolerantie die leven-kwaliteit aantast. In eerdere studies toonden we aan dat CVS/M.E.-patiënten post-exertionele inspanning-intolerantie ervaren.

Doelstelling: Deze studie onderzocht de hartslag-respons bij inspanning om te bepalen of CI geassocieerd is met post-exertionele inspanning-intolerantie.

Methodes: 39 vrouwen met CVS/M.E. en 39 voor leeftijd en gewicht gematchte controle-individuen (CON). De individuen voerden een graduele inspanning test uit ‘wilskrachtige vermoeidheid’ op een fiets-ergometer (Test 1). 24 uur later voerde een subgroep van 17 individuen met CVS/M.E. en 18 controle-individuen een tweede inspanning-test uit 24 om de hartslag-respons bij inspanning te onderzoeken in de post-exertionele toestand (Test 2). De hartslag (HR) werd continu geregistreerd gedurende de inspanning-test. De gegevens werden geanalyseerd in rust, bij de anaërobe drempel (AT) en bij inspanning-piek. Enkel de individuen die de criteria voor maximale inspanning bereikten, werden opgenomen voor de analyse. […]

Resultaten: De HR in de CON-groep was niet significant verschillend tussen Test 1 & 2 bij om ‘t even welke inspanning-intensiteit (rust: 88 ± 11 vs 89 ± 19; AT: 126 ± 17 vs 121 ± 12; piek: 182 ± 12 vs 180 ± 15; waarden uitgedrukt als gemiddelde ± standaard-deviatie). De responsen van de CVS/M.E.-groep waren niet significant verschillend van CON voor Test 1 (rust: 90 ± 15; AT: 120 ± 13; piek: 170 ± 10). De CVS/M.E.-groep vertoonde echter significant lagere piek hartslag-waarden voor Test 2 (rust: 100 ± 18; AT: 116 ± 10; piek: 165 ± 10; p < .05) t.o.v. Test 1. De HR-metingen waren niet significant verschillend tussen de groepen of inspanning-testen, uitgezonderd de gedaalde piek-waarde tijdens de tweede inspanning-test bij individuen van de CVS/M.E.-groep.

Besluit: Patiënten met CVS/M.E. lijken post-exertionele dalingen qua piek HR-respons op inspanning te vertonen, wat kan bijdragen tot inspanning-intolerantie en de geobserveerde dalingen qua zuurstof-verbruik tijdens post-exertionele malaise. De combinatie van een verhoogde hartslag in rust en gedaalde hartslag bij piek-inspanning kan bijdragen tot de gedaalde leven-kwaliteit.

[Dr Jose G. Montoya (Division of Infectious Diseases, Stanford Univeristy) zegt hier over: “Het verschil is significant (niet subtiel). Bijzonderlijk omdat de mensen in de studie fysiek in staat waren om de inspanning-testen uit te voeren; in een grotere populatie zouden de resultaten waarschijnlijk nog veel slechter geweest zijn…”]

december 3, 2016

Differentiële expressie van mitochondriale proteïnen bij CVS

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 8:25 am
Tags: , , , , , , ,

Een artikel dat voor zichzelf spreekt… Er worden hier 2 proteïnen (betrokken bij de cellulaire energie-produktie) aangeduid die (in combinatie) een diagnostische merker zouden kunnen zijn voor M.E.(cvs).

Over aconitase (aconitaat-hydratase; omzetting van citraat naar isocitraat in de TCA-cyclus) werd ook al gesproken in onze stukken ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’ & ‘Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS’…

Er werd tevens afwijkende expressie van ACON en ATPB in het speeksel gevonden. Dit zou een afname bij een eventuele test veel makkelijker maken.

Lees ook ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’ & ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’.

————————-

Transl Psychiatry. (2016) 6: e904

Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome

Ciregia F1, Kollipara L2, Giusti L1, Zahedi RP2, Giacomelli C3, Mazzoni MR1, Giannaccini G1, Scarpellini P4, Urbani A5,6, Sickmann A2,7,8, Lucacchini A1, Bazzichi L3

1Department of Pharmacy, University of Pisa, Pisa, Italy

2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften-ISAS, Dortmund, Germany

3Division of Rheumatology, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

4Division of Psychiatry, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

5Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica, Rome, Italy

6Proteomics and Metabonomics Unit, IRCCS-Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

7Department of Chemistry, College of Physical Sciences, University of Aberdeen, Aberdeen, UK

8Medizinische Fakultät, Medizinische Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende en complexe aandoening die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verbetert door rust. Dysfunktie van de mitochondrieën is een research-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS. In eerder werk onderzochten we het proteoom-profiel in speeksel van een monozygote tweeling met en zonder CVS. Hierna analyseerden we mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. We gebruikten een gesofisticeerde techniek (nano-LC-MS) om de mitochondrieën uit bloedplaatjes te bestuderen. Daarna selekteerden we 3 proteïnen die waren gevalideerd d.m.v. ‘western blot’ analyse bij een grote groep individuen (n = 45 CVS; n = 45 gezond), in het speeksel. De gekozen proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). De resultaten voor ATPB & ACON bevestigden hun upregulering bij CVS. De MDHM-verandering werd echter niet bevestigd. Daarna beslisten we, gezien de grote variabiliteit qua klinische kenmerken van CVS-patiënten, de expressie van onze proteïnen te analyseren na opsplitsing van de patiënten volgens klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger bij de groep patiënten die klinische kenmerken vertoonden die gelijkaardig waren met de zieke tweeling-helft. We besluiten dat deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de criteria zou kunnen zijn die in rekening kunnen worden gebracht bij het helpen stellen van de diagnose. Bovendien zou de identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kunnen helpen bij het werpen van een licht op de complexe aandoening CVS. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van aangepaste behandelingen.

Inleiding

[…] De moeilijkheden bij het definiëren van CVS, door het gebrek aan diagnostische merkers, maakt epidemiologische studies ingewikkeld. […] Tot nu toe blijft de etiologie van CVS onduidelijk; waarschijnlijk is het een heterogene aandoening die kan worden verklaard via een multi-factorieel model waar genetische, infektueuze, neuro-endocriene en psychologische factoren samenkomen. […]

Een ander onderzoek-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS is een gebrekkige mitochondriale funktie. Studies betreffende het metabolisme bij CVS suggereren onregelmatigheden qua energie-metabolisme en oxidatieve stress. [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172; zie ook referenties onze inleiding] Er wordt in het bijzonder steeds meer erkend dat mitochondriale dysfunkties aan de basis van CVS kunnen liggen [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J]; bovendien is vermoeidheid een prominent symptoom bij patiënten met mitochondriale ziekte. Dit is een aantrekkelijke hypothese, aangezien een metabole wijziging op mitochondriaal niveau een energie-deficiëntie met zich mee kan brengen en de uitzonderlijke vermoeidheid verklaren.

Er werd dikwijls gesuggereerd dat een genetische voorbestemdheid aan de basis van CVS kan liggen; daarom voorziet het bestuderen van tweelingen de best gematchte controles. Zodoende onderzochten we in eerder werk het proteoom-profiel in van een monozygote tweeling, waarvan één met en één zonder CVS. [Ciregia F et al. A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the Chronic Fatigue Syndrome: a focus on potential salivary biomarkers. J Transl Med (2013) 11: 243] Onze resultaten beklemtoonden de betrokkenheid van de inflammatoire respons bij de pathogenese van CVS. Na de bemoedigende resultaten verkregen via deze preliminaire studie, wilden we meer kennis verwerven betreffende mechanismen bij CVS via het analyseren van mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. De verwachting was dat onze bevindingen bewijs zouden kunnen leveren voor een mitochondriale rol bij de pathogenese van CVS.

Met dit doel isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes. Dit zijn circulerende bloedcellen die essentieel zijn voor de hemostase [preventie van bloedverlies] en coagulatie [bloedstolling] maar ook voor de aangeboren en adaptieve immuniteit. Bloedplaatjes hebben funktioneel aktieve mitochondrieën, waarvan de betrokkenheid bij de cel-fysiologie en bij pathologische aandoeningen werden aangetoond. De beoordelingen van de mitochondriale funktie in bloedplaatjes bieden meerdere voordelen voor diagnostische doeleinden: hun overvloed in het perifeer bloed, het betrekkelijk gemak om ze te verkrijgen, hun beperkte complexiteit, het aanzienlijk aantal mitochondrieën in de bloedplaatjes en de mogelijkheid voor herhaalde metingen bij elke patient.

Bloedplaatjes werden reeds aangewend bij onderzoeken naar de mitochondriale betrokkenheid bij enkele aandoeningen, bv. sepsis, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze studies bleven echter beperkt tot analyse van het mitochondriaal DNA en elektron-transfer aktiviteiten, terwijl er geen onderzoek werd verricht naar de totale proteïnen-inhoud van de mitochondrieën. Daarom analyseerden we de mitochondrieën uit bloedplaatjes via ‘nano-liquid chromatography electrospray-ionization mass-spectrometry’ (nano-LC-MS [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]) bij hetzelfde tweeling-paar als in de eerdere studie. Daarna werden de meest beloftevolle biomerkers gevalideerd via ‘western blot’ [WB] analyse [Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.] bij een grote groep patiënten, gebruikmakend van speeksel, dat op een niet-invasieve, eenvoudige, veilige en stress-vrije manier kan worden gecollecteerd en die makkelijk toepasbaar is bij grote groepen individuen.

Gezien de heterogeniteit van de ziekte was het doel biomerkers te suggereren om gevallen van CVS te stratificeren, eerder dan het selekteren van enkele biomerkers voor de identificatie van CVS. Dit kan helpen de behandeling op maat van de patient te snijden.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

Deze studie werd opgedeeld in 3 verschillende stappen. De eerste ‘ontdekking’-fase was gericht op het karakteriseren van het mitochondriaal proteoom-profiel van een CVS-patient in vergelijking met z’n gezonde monozygote tweeling-helft. Dit doel werd bereikt d.m.v. een proteoom-benadering (nano-LC-MS). De tweede ‘verkennende’ fase was gericht op het onderzoeken van de veranderende proteïnen (Ingenuity Pathway Analysis – IPA [software om expressie-profielen te analyseren]). Dit platform laat toe de mogelijke interakties te visualiseren tussen de geïdentificeerde biomerker-signaturen in mitochondrieën, wat ons helpt enkele kandidaten te selekteren voor de ‘validatie’-fase. De geselekteerde proteïnen werden eerst gezocht in het speeksel van de tweeling-broers en, eens de verschillen bevestigd werden, werd de validatie verbreed naar een groter aantal patiënten en controles. Tenslotte hebben we onze analyse versterkt door te kijken naar klinische gegevens, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers correleren met de klinische parameters van de patiënten. Dit leidt ons tot de identificatie van mitochondriale proteïnen die bruikbaar zijn bij het subtyperen van CVS-patiënten.

Patiënten

[…] 45 CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 38,6 ± 11,9 jaar); 45 gezonde controles (36,4 ± 10,9) 25 vrouwen, 20 mannen […]. De patiënten werden geklassificeerd op basis van de criteria volgens Fukuda et al. […] De individuen vulden de ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) in […]. Vermoeidheid werd ook beoordeeld d.m.v. de ‘Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue Scale’ (FACIT). […] Om de individuen beter te klassificeren, werden de volgende parameters geëvalueerd: anti-nucleaire antilichamen, ‘extraheerbare nucleaire antigenen’ [ENA] antilichamen [voor auto-immuunziekten], reumatoïde factor & anti-cardiolipine antilichamen (immunologische parameters); cortisol en adrenocorticotroop hormoon, serotonine, groei-hormoon, IGF-1 & vitamine-D3 (hormoon-profiel); tumor necrose factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, interleukine (IL)-6, IL-10, IL-2, IL-8 & IL-1b (cytokine-profiel).

Speeksel-stalen

[…]

Bloedplaatjes & aanrijking mitochondrieën

[…]

Kwantificatie op basis van LC-MS

[…]

LC-MS stalen

[…]

LC-MS analyse

[…]

Analyse van signalisering-mechanismen

[…] Alle proteïnen met differentiële expressie gelijk aan of meer dan 2 maal (CVS t.o.v. controle) werden opgenomen voor de bio-informatische analyse, om de molekulaire funkties te identificeren die het sterkt geassocieerd waren met de proteïnen-lijst.

WB voor validatie

Om de expressie-veranderingen in speeksel te valideren, gebruikten we ‘western blot’ analyse. De geselekteerde proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). […]

[…]

Statistische analyse

[…]

Klinische correlaties

[…]

Resultaten

Proteoom-analyse

Om het profiel op te maken van de mitochondriale proteïnen bij CVS, isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes van hetzelfde tweeling-koppel met en zonder CVS dat eerder werd onderzocht. Om de kwaliteit te evalueren van de geïsoleerde mitochondrieën gebruikten we enzymatische testen en WB-analyse: de mitochondriale aanrijking was bevredigend. We verkregen een mitochondriale fractie van 450 μg proteïnen startend van ca. 5×109 bloedplaatjes. Met als doel de grens van reproduceerbaarheid van het mitochondriaal preparaat te overwinnen, werden de experimenten in 3-voud uitgevoerd. De mitochondrieën die werden verkregen uit elk van de 3 experimenten werden samengevoegd en geanalyseerd in drievoud.

De proteïnen-samenstelling van de mitochondrieën werd geanalyseerd via nano-LC-MS en er werd een differentiële analyse tussen de CVS-patient en z’n gezonde broer uitgevoerd. Globaal identificeerden we 1.007 proteïnen […]. Van die 1.007 gedetekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant gemodificeerd bij CVS. Van deze 194 proteïnen waren er 41 met een variatie bij CVS t.o.v. controle groter dan 2,0: 34 waren ge-upreguleerd bij CVS en 7 waren ge-downreguleerd. […] Deze 41 proteïnen werden opgenomen in de IPA. Van elk geïdentificeerd proteïne werd het overéénkomstig gen in de IPA kennis-databank gezocht.

We gebruikten IPA om de gekende funkties van elk proteïne terug te vinden. Aangezien één proteïne meerder funkties kan hebben, selekteerden we de funkties met de hoogste statistische significantie. De eerste 3 hoogst-gerangschikte biologische funkties waren: metabolisme van isocitraat, metabolisme van NADH & metabolisme van nucleïnezuur-componenten of afgeleiden. […] Voor de validatie selekteerden we een proteïne uit elke categorie op basis van de hoeveelheid variatie en de P-waarde [indicatie voor de statistische significantie] van proteïnen uit de proteoom-analyse.

Expressie van biomerkers in speeksel

We selekteerden 3 mitochondriale proteïnen voor de validatie via WS – ACON, ATPB & MDHM. We beoordeelden eerst of hun variatie bij CVS t.o.v. controle bevestigd werd via de WS van de tweelingbroers. De upregulering bij CVS werd via WB bekrachtigd voor al de proteïnen. ACON, ATPB & MDHM vertoonden een toename van 3,1, 1,5 & 4,7. […]

Vervolgens gingen we over tot de analyse van deze proteïnen in een ruime groep CVS-patiënten (n = 45) en gezonde individuen (n = 45). We begonnen met een globale analyse van de expressie van deze proteïnen in het speeksel om dan verder te gaan met het onderzoek van verschillende CVS-subtypes. De veranderingen voor ACON & ATPB waren consistent met de resultaten van de nano-LC-MS, maar niet voor MDHM.

Dan klassificeerden we patiënten volgens hun klinische kenmerken (vragenlijsten): FACIT, FIQ, VAS-pijn, VAS-vermoeidheid & VAS-slaap. De CVS-patiënten werden in 2 groepen gesplitst met als referentie de tweeling-helft met CVS: een groep met de klinische kenmerken waarvan de waarden overéénkwamen met (of groter dan) die van de zieke tweeling-helft (groep A) en de tweede met de patiënten met lagere waarden (groep B). De intensiteiten waren hoger voor elk van de 3 merkers in groep A t.o.v. groep B.

ROC-curves

Er werden ROC-curves [grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] berekend ter beoordeling van het klinisch potentieel van onze geselekteerde en gevalideerde proteïnen om CVS te onderscheiden van gezonde individuen (in speeksel). De AUCs [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden] werden voor elk proteïne individueel berekend, om aan te tonen of elke merker apart dit onderscheid kan maken. ATPB & ACON bleken betere differentiërende biomerkers dan MDHM. ATPB: sensitiviteit 54% en specificiteit 78%; ACON: sensitiviteit 61% en specificiteit = 78%. Daarenboven onderzochten we via logistische regressie analyse of het onderscheidend vermogen van elke merker mogelijks verhoogd was door combinatie van meerdere merkers. Met deze doelstelling testten we alle verschillende combinaties om de beste combinatie van biomerkers te selekteren die bruikbaar is om mensen met CVS te onderscheiden van gezonde individuen. Zodoende vonden we dat het onderscheidend vermogen lichtjes steeg als ATPB werd gecombineerd met ACON. De sensitiviteit steeg tot 85% maar de specificiteit was 72%. Tenslotte berekenden we ook ROC-curves om te testen of de biomerkers patiënten en controles kunnen differentiëren volgens de klinische parameters – enkel FACIT gaf goeie resultaten. Wanneer we patiënten opsplitsen volgens FACIT, gaven ATPB en ACON ROC-curves (groep A versus controles) met een AUC van 0.780 en 0.722, respectievelijk, terwijl de gecombineerde ROC-curve een AUC had van 0.844 (sensitiviteit = 93%, specificiteit = 70%).

Klinische correlaties

Tenslotte bekeken we statistische correlaties voor de volgende klinische parameters: leeftijd, leeftijd bij aanvang, ziekte-duur en de hematochemische parameters (bv. TNF-α, IL-6, enz.). ACON correleerde negatief met IL-2 […]. ATPB correleerde positief met TNF-α & IFN-γ. […] MDHM correleerde ook met TNF-α […].

Bespreking

De ontdekking en validatie van meer objectieve merkers kunnen een belangrijke ondersteuning betekenen voor het stellen van de diagnose en behandeling van CVS. Aangezien bewijsmateriaal suggereert dat mitochondriale dysfunkties aan de grondslag liggen van CVS, analyseerden we mitochondriale proteïnen verkregen uit bloedplaatjes. Deze kwamen van een monozygoot tweeling-koppel met en zonder CVS. Nano-LC-MS markeerde de wijzigingen qua expressie van 41 proteïnen met een P < 0.05 en een vermenigvuldiging met meer dan 2. Voor de validatie selekteerden we hieruit 3 proteïnen van elk van de 3 meest significante ‘biologische funkties’ die met onze proteïnen geassocieerd bleken na IPA-analyse.

Deze 3 proteïnen waren: ACON (‘metabolisme van isocitraat’), MDHM (‘metabolisme van NADH’) en ATPB (‘metabolisme nucleïnezuur-componenten of afgeleiden’). De validatie van onze kandidaat proteïne-biomerkers werd beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die de detektie van proteïnen in speeksel-stalen toelaten.

Ondanks het feit dat deze studie slechts 2 individuen analyseerde, kunnen de verschillen qua proteïne-expressie gelinkt worden aan de ziekte, aangezien de tweeling slechts verschilde wat betreft de aanwezigheid van CVS. Op deze manier liet onze studie toe te focussen op enkele biomerkers die kunnen worden onderzocht bij een groter aantal patiënten om hun bruikbaarheid bij de diagnose van CVS te bevestigen. We beslisten speeksel van CVS-patiënten te onderzoeken (een niet-invasieve procedure). Hoewel speeksel een minder complex vocht is, werd bewezen dat het een beloftevol diagnostisch instrument is, dat de fysiologische werking van het lichaam weerspiegelt. Eerst was het aangewezen om te controleren of de significante toename van deze proteïnen bij CVS (t.o.v. de controle) kon worden geverifieerd in het speeksel van de tweeling-broers. We bevestigden de resultaten.

De analyse van de mechanismen markeerde het ‘metabolisme van NADH’ als één van de meest belangrijke biologische funkties betrokken bij CVS. De verhouding NAD+/NADH speelt een alomtegenwoordige rol bij het reguleren van de intracellulaire redox-status en vertegenwoordigt daardoor een funktie van de metabole toestand. Enkele studies suggereren dat NADH-concentraties significant lager liggen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid Redox Signal (2015) 22: 679-685 /// Castro-Marrero J et al. Effect of coenzyme-Q10 plus nicotinamide adenine dinucleotide supplementation on maximum heart rate after exercise testing in Chronic Fatigue Syndrome – a randomized, controlled, double-blind trial. Clin Nutr (2015) 35: 826-834] Het is waarschijnlijk dat de hoge waarden MDHM en isocitraat-dehydrogenase die worden gezien bij CVS een adaptieve verandering kunnen zijn voor deficiënties qua NADH dat, op z’n beurt, een cruciale rol speelt bij ATP-produktie in de mitochondrieën.

ATPB is de subunit-beta van ATP-synthase, het belangrijkste enzyme voor de aanmaak van ATP. Naast de toename van ATPB bij CVS, detekteerden we (d.m.v. nano-LC-MS) ook significante verhogingen van de subunit-alfa en -gamma (P = 0.005 & 0.001, respectievelijk). Moeheid en energie zijn nauw verbonden; daarom is een aantrekkelijke hypothese dat er een metabole dysfunktie is met als resultaat dat er niet genoeg energie wordt geproduceerd. In dit perspectief kan de toename worden verklaard als een poging om de ATP-produktie te verhogen. Er zijn inderdaad studies die suggereren dat daling qua mitochondriale ATP-synthese bij CVS-patiënten niet wordt veroorzaakt door een defekt in de enzyme-complexen die de oxidatieve fosforylatie katalyseren maar in een andere factor. [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93] Opdat ADP kan worden gerecycleerd en ATP naar het cytosol van de matrix kan gaan, is de uitwisseling van cytoplasmatisch ADP met mitochondriaal ATP via het binnenste membraan nodig. Deze funktie wordt voorzien door een translocator-proteïne. Consistent met ander werk is de expressie van mitochondriaal ADP/ATP-translocase [transporter-proteïnen die zorgen voor de uitwisseling van ADP in het cytosol en mitochondriaal ATP via het binnenste membraan] gewijzigd in onze studie: translocase-2 & -3 daalde [x 0,65 & x 0,80 t.o.v. controle] bij CVS (P = 0.009 & 0.002, respectievelijk).

Samen met ATPB lijkt ACON de meest beloftevolle biomerker. Dit is de mitochondriale vorm van aconitase, een enzyme dat de omzetting van citraat naar isocitraat katalyseert via cis-aconitaat in de TCA-cyclus. [inhibitie van dit enzyme vermindert de cellulaire energie-voorraad] ACON wordt courant gebruikt als een biomerker voor oxidatieve stress en werd gesuggereerd dienst te doen als een sensor voor de redox-status. Inderdaad: de reaktie tussen ACON en superoxide genereert vrije hydroxyl-radikalen. Het is waarschijnlijk dat de reaktie tussen superoxide en ACON de mitochondriale oxidatieve schade geassocieerd met de pathofysiologie van CVS kan versterken. De buitensporige produktie van ROS en stikstof-soorten wordt trouwens gewoonlijk in verband gebracht met CVS en we vonden een significante upregulering [x 2,2 t.o.v. controle] van superoxide-dismutase [SOD; enzyme dat zuurstof-radikalen ‘opruimt’] (P = 0.001).

Na de validatie in het speeksel van de tweeling, hebben we de validatie uitgebreid naar een grote groep CVS-patiënten. De resultaten voor ATPB & ACON bevestigen de upregulering bij CVS en hun klinisch potentieel om patiënten van controles te onderscheiden werd geëvalueerd. De ROC-curves gaven een goede specificiteit maar lage sensitiviteit aan. Als de biomerkers geombineerd werden, verkregen we een betere diagnose en de sensitiviteit verhoogde tot 85%, met een kleine daling qua specificiteit.

Anderzijds werd de gevonden MDHM-wijziging niet bevestigd in de grotere groep patiënten maar we konden een stijging zien wanneer we enkel de patiënten beschouwden met gelijkaardige of hogere klinische parameters dan de tweeling-helft met CVS. Deze bevinding bracht ons ertoe te bekijken of andere vermoedelijke biomerkers ook duidelijke CVS-subgroepen zouden kunnen afbakenen, gezien de grote variabiliteit van de klinische kenmerken van onze patiënten. Daarom hebben we onze analyse opgedreven door de klinische gegevens van dichterbij te bekijken, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers gelinkt zijn met de klinische kenmerken van de patiënten. We analyseerden de expressie van onze proteïnen na de patiënten te hebben opgesplitst volgens de klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger in de groep patiënten met klinische kenmerken die gelijkaardig waren met die van de zieke tweeling-helft. Het leek er op dat de toename qua expressie van deze proteïnen overéénkwam met een slechte patiënten-uitkomst.

Daarnaast gaf de combinatie van ATPB met ACON een sensitiviteit van 93% en specificiteit van 70% wanneer we de FACIT-waarden gebruikten van de patiënten die groter dan deze van de tweeling-helft met CVS.

Het valt op te merken dat CVS-patiënten met co-morbide bipolaire stoornis (en niet met andere psychiatrische co-morbiditeiten) een significante upregulering van de ATPB-expressie vertoonden (P = 0.03). In onze groep CVS-patiënten waren er slechts 8 met een co-morbide bipolaire aandoening; maar dit aspect verdient verder onderzoek gezien het feit dat een belemmerde mitochondriale funktie bij bipolaire patiënten werd besproken.

Tenslotte onderzochten we de correlatie van onze proteïnen met hematochemische parameters. Cytokine-abnormaliteiten zijn courant bij CVS maar de bevindingen zijn gemengd en er wordt geen individuele merker gebruikt als een objectieve biomerker voor de diagnose of het management van CVS. Het is opmerkenswaardig dat de toename van bij CVS positief correleerde met de stijging van IFN-γ & TNF-α. Immunologische ontregeling werd altijd voorgesteld als een significante component van CVS en CVS-patiënten hebben gewoonlijk hoge waarden pro-inflammatoire cytokinen, zoals IFN-γ & TNF-α. [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Klimas NG et al. Biomarkers for chronic fatigue. Brain Behav Immun (2012) 26: 1202-1210] Daarnaast was er een positieve correlatie van MDHM met TNF-α. Deze correlaties brengen ons iets bij, aangezien al deze variabelen als merkers kunnen worden beschouwd. Het is interessant aan te geven dat de ACON-waarden negatief correleerden met IL-2, in lijn met het feit dat de tweeling-helft met CVS lagere waarden van IL-2 had t.o.v. zijn gezonde tweeling-broer.

Besluit: deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de te overwegen criteria kunnen zijn bij het helpen stellen van de diagnose. Daarenboven: zelfs als deze proteïnen niet noodzakelijk bruikbaar blijken voor een universele CVS-diagnose (gezien de enorme heterogeniteit van de ziekte), bieden ze een sterk potentieel om subsets te karakteriseren. De identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kan helpen de complexe entiteit die CVS is, op te helderen. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van op maat gemaakte behandelingen. Op die manier zou dit werk kunnen bijdragen aan de gestage ontwikkeling van een duidelijker kader voor een ingewikkelde en genuanceerde ziekte zoals CVS.

november 4, 2016

Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 1:36 pm
Tags: , , , , , ,

Een team Japanse researchers onderzocht het metaboloom – het geheel van molekulen in ons bloed die ontstaan in de verscheidene stappen en als bijprodukten van ons metabolisme – bij M.E.(cvs). Ze bekeken meerdere onderdelen: de glycolyse (glucose => pyruvaat => lactaat), de glutamine-glutamaat-cyclus, de TCA-cyclus (citroenzuur- of Krebs-cyclus; pyruvaat + acetyl-CoA => citraat, enz.; levert energie) en de ureum-cyclus (vorming van ureum uit ammoniak, stelt ons in staat de overtollige stikstof uit te scheiden via de urine). Bij de laatste 2 vonden ze afwijkingen en gebruikten telkens (de verhouding van) 2 molekulen: pyruvaat/isocitraat als indicator voor de werking van de TCA-cyclus, en ornithine/citrulline als indicator voor de werking van de ureum-cyclus. Als deze ontregelingen onafhankelijk worden bevestigd worden, dan zou de combinatie van de verhoudingen pyruvaat/isocitraat- en ornithine/citrulline een goede diagnostische biomerker voor M.E.(cvs) kunnen worden.

We rapporteerden hier ook al over het werk van Robert Naviaux. Deze vond dat de waarden van citrulline, ornithine, proline, glutamine & glutamaat allemaal normaal waren (met een andere scheidingsmethode dan hieronder weliswaar)…

————————-

Scientific Reports Vol. 6, p. 34990 (October 2016)

Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles

Emi Yamano (1), Masahiro Sugimoto (2), Akiyoshi Hirayama (2), Satoshi Kume (3), Masanori Yamato (3), Guanghua Jin (3), Seiki Tajima (3,4), Nobuhito Goda (5), Kazuhiro Iwai (6), Sanae Fukuda (1,7), Kouzi Yamaguti (1,8), Hirohiko Kuratsune (7,8), Tomoyoshi Soga (2), Yasuyoshi Watanabe (1,9), Yosky Kataoka (1,3)

1 Department of Physiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan

2 Institute for Advanced Biosciences, Keio University, Tsuruoka Yamagata, Japan

3 Cellular Function Imaging Team, Division of Bio-function Dynamics Imaging, RIKEN Centre for Life Science Technologies, Kobe, Japan

4 Hyogo Children’s Sleep and Development Medical Research Centre, Hyogo Rehabilitation Centre Central Hospital, Kobe, Japan

5 Department of Life Science and Medical Bio-Science, School of Advanced Science and Engineering, Waseda University, Tokyo, Japan

6 Department of Molecular and Cellular Physiology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto, Japan

7 Department of Health Science, Kansai University of Welfare Sciences, Osaka, Japan

8 Department of Endocrinology, Metabolism and Molecular Medicine, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan

9 Pathophysiological and Health Science Team, RIKEN Centre for Life Science Technologies, Kobe, Japan

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een aanhoudende en onverklaarde pathologische toestand die wordt gekenmerkt door ernstig invaliderende vermoeidheid, met/zonder infektueuze of neuropsychiatrische symptomen, die minstens 6 opéénvolgende maanden duren. De pathogenese wordt niet volledig begrepen. Hier voerden we uitgebreide metaboloom-analyses uit op 133 plasma-stalen verkregen van CVS-patiënten en gezonde controles om een objectieve diagnose van CVS te stellen. De CVS-patiënten vertoonde significante verschillen qua concentraties van metabolieten uit de TCA- en ureum-cycli. De combinatie van ornithine/citrulline en pyruvaat/isocitraat verhoudingen onderscheidde CVS-patiënten van gezonde controles, wat ROC- [‘receiver operating characteristic’; statistische analyse waarbij men in een grafiek de gevoeligheid (sensitiviteit) in funktie van de specificiteit uitzet; gebruikt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] waarden opleverde van 0,801 en 0,750 voor de training- (n = 93) en bevestiging- (n = 40) datasets, respectievelijk. Deze bevindingen bieden overtuigend bewijs dat een klinisch diagnostisch instrument voor CVS kan worden ontwikkeld op basis van de verhoudingen van metabolieten in het plasma.

Inleiding

[…] De pathogenese van CVS wordt niet volledig begrepen maar er wordt gedacht dat het multi-factorieel is, met inbegrip van abnormaliteiten van het centraal zenuwstelsel, het immuunsysteem en de hypothalamus-hypofyse-bijnier as.

[…] Het feit dat de diagnose van CVS niet objectief en op een betrouwbare manier kan worden gesteld, resulteert in incorrecte of vertraagde diagnostisering, wat een behoorlijke last op de psychologische en fysieke gezondheid van de patiënten, alsook op hun economisch welzijn, is. Omwille van het feit dat we de etiologie niet volledig begrijpen en de diagnostische onzekerheid, zijn er geen degelijk bewezen behandelingen voor CVS. In de praktijk zijn behandelingen – farmacologisch of niet-farmacologisch – gericht op het verlichten van de symptomen en het verbeteren van de funktie. Daarom is de ontwikkeling van objectieve diagnostische criteria voor CVS noodzakelijk.

Eerdere studies hebben geprobeerd biomerkers te identificeren [Vernon SD & Reeves WC. Evaluation of auto-antibodies to common and neuronal cell antigens in Chronic Fatigue Syndrome. J Autoimmune Dis (2005) 2: 5 /// Shishioh-Ikejima N. et al. The increase of alpha-melanocyte-stimulating hormone in the plasma of Chronic Fatigue Syndrome patients. BMC Neurol (2010) 10: 73 /// Fletcher MA. et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/ CD26. Plos One (2010) 5: e10817] of geaktiveerde virussen (inclusief enterovirussen, Epstein-Barr virus en humaan herpes virus) die zouden kunnen worden gebruikt voor de objectieve diagnose van CVS; tot op heden werd echter geen betrouwbaar diagnosticum gevonden.

Meerdere studies hebben zich gefocust op de metabole veranderingen die optreden bij lichamelijke of mentale vermoeidheid bij gezonde individuen. Wanneer fysieke vermoeidheid werd geïnduceerd door uitputtende of aangehouden inspanning, waren de waarden van vertakte-keten aminozuren (BCAAs) in het bloed gedaald na inspanning t.o.v. vóór de inspanning. Daarnaast waren de waarden van BCAAs en tyrosine, cysteine, methionine, lysine & arginine gedaald bij mentale vermoeidheid. Deze bevindingen toonden echter metabole wijzigingen geïnduceerd door acute vermoeidheid onder experimentele omstandigheden bij gezonde individuen; het is geen weerspiegeling van de pathofysiologie van CVS (exertionele en ernstig invaliderende vermoeidheid van minsten 6 opéénvolgende maanden). Daarom is het noodzakelijk het specifieke metabolieten-profiel bij CVS te verduidelijken om een ‘evidence-based’ strategie voor de objectieve diagnose en behandeling van deze ziekte te ontwikkelen.

Metabolieten-profilering biedt directe funktionele informatie over metabole fenotypes en indirecte funktionele informatie over een waaier aan fenotypes die worden bepaald door kleine molekulen. Daarom werd de uitgebreide analyse van metabolieten aangewend om de pathofysiologie van ziekte-toestanden te karakteriseren en zodoende te helpen bij het vinden van medicijnen, diagnostieken en behandelingen. Daarnaast kan de opheldering van het metabool profiel bijdragen tot de preventie van chronische vermoeidheid veroorzaakt door metabole dysfunktie, via een dieet dat op maat gemaakt is van het individu. We valideerden eerder de bruikbaarheid van plasma metaboloom-analyse in een rat-model voor relatief langdurige vermoeidheid d.m.v. capillaire elektroforese massa-spectrometrie [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden] (CE-MS), en vonden een daling van het energie-metabolisme samen met wijzigingen in de ureum-cyclus, alsook wijzigingen wat betreft de waarden van of aminozuren met ingebrip van BCAAs. [Kume S. et al. Potential biomarkers of fatigue identified by plasma metabolome analysis in rats. Plos One (2015) 10: e0120106] Andere eerdere studies rapporteerden aminozuren stoornissen bij CVS d.m.v. nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, wat nuttig is voor een eenvoudige screening met een beperkt aantal gedetekteerde metabolieten. [Armstrong CW et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino-acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531 /// McGregor NR., Butt H.L et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy-metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] Deze studies hadden een aantal beperkingen: m.n. een klein aantal bestudeerde individuen en het ontbreken van bevestiging via datasets van meerdere groepen.

In de huidige studie voerden we een metaboloom-analyse uit met plasma verkregen van CVS-patiënten en gezonde controles d.m.v. CE-MS, een zeer gevoelige methode voor de detektie van metabolieten. Deze benadering maakte een uitgebreide analyse van het metabool profiel van verschillende mechanismen mogelijk met een hoge reproduceerbaarheid. De doelstellingen van onze studie waren het uitgebreid onderzoeken van het metaboloom-profiel bij CVS, samen met een bevestiging-proces, en het karakteriseren van z’n pathofysiologie, met als doel het vastleggen van een objectieve index om patiënten met CVS te onderscheiden van gezonde controles.

Methodes

Individuen. 133 Japanse volwassenen: 67 CVS-patiënten & 66 gezonde controles [allen 20-60 jaar oud] – 47 CVS-patiënten & 46 gezonde controles voor de training-set, 20 CVS-patiënten & 20 gezonde controles voor de bevestiging-set. […] CVS-diagnose […] CDC-criteria. Individuen met psychiatrische aandoeningen of met chronische ziekten die soms gepaard gaan met vermoeidheid (bv. kanker, diabetes) en personen die medicijnen namen waarvan is geweten dat ze het autonoom zenuwstelsel beïnvloeden, werden uitgesloten. […]

Verwerking biologische stalen. […]

Metaboloom-studie. […]

CE-TOFMS condities. […]

Verwerking van gegevens en statistische analyse. […]

Om metabolieten te selekteren met een sterk potentieel om CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles, werden metabolieten gekozen die een hoge signaal/ruis verhouding (10) hadden bij zowel de training- als de bevestiging-gegevens, en met weinig ontbrekende waarden. Van deze metabolieten werden deze die consistent bleken bij zowel de training- als de bevestiging-gegevens gebruikt als biomerker-kandidaten. Er werd dan SVM-FS (‘support vector machine’ [algoritme op het gebied van gecontroleerd machinaal/automatisch leren] – ‘feature selection[selektie van een bepaald kenmerk]) [methode om een klassement op te stellen wat betreft het onderscheidend vermogen van biomerker-kandidaten] aangewend: uit de top-metabolieten werden er 2 (een substraat en een produkt) geselekteerd (op basis van hun metabool pad) en gebruikt als indexen om de aktiviteit te beoordelen in het deel van het pad tussen de 2 metabolieten. We gebruikten de verhoudingen van 2 metabolieten om de diurnale [de dagelijkse cyclus volgende] variatie van de concentratie van de metabolieten te elimineren.

Er werd een MLR [‘multipele logistische regressie’; een statische methode] -model ontwikkeld gebruikmakend van deze indexen. […] Dit model moest toelaten voorspellingen te doen voor een onafhankelijke bevestiging-groep. Het onderscheidend vermogen van het model werd beoordeeld d.m.v. ROC-analyse [zie samenvatting]. De veelzijdigheid van het model werd gevalideerd d.m.v. 200 testen met 10-voudige ‘cross-validation’ (CV [‘kruis-validatie’; een techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens]): (1) De gegevens-sets werden willekeurig opgesplitst in groepen met 90% & 10% van de individuen. (2) Deze werden gebruikt voor de ontwikkeling van het model en de bevestiging, respectievelijk. (3) Deze procedure werd 10 maal herhaald en de accuraatheid van het model werd geëvalueerd d.m.v. de voorspellingen van de bevestiging-gegevens. Om optimistische vooringenomenheid bij de voorspelling te elimineren, deden we ook 200 testen met 10-voudige CV […].

Resultaten

We analyseerden het metaboloom-profiel van de gegevens 2 groepen: één voor training (n = 93) en één voor validatie (n = 40). […] Capillaire elektroforese ‘time-of-flight’ massa-spectrometrie (CE-TOFMS) identificeerde en kwantificeerde op een succesvolle manier 144 metabolieten. Om de metabolieten te identificeren die CVS-patiënten zouden kunnen onderscheiden van gezonde controls, selekteerden we metabolieten met een grote signaal/ruis verhouding (10) en weinig ontbrekende waarden. Dit resulteerde in 53 en 33 metabolieten in de training- en bevestiging-groep, respectievelijk. Daarvan werden 31 metabolieten consistent geobserveerd en gebruikt voor verdere analyses.

De statistische significantie van de verschillen tussen CVS-patiënten en gezonde controles werd bepaald. Eerst selekteerden we metabolieten met een grote marge tussen CVS en gezonde controles […] (SVM-FS [zie methodiek]), en vervolgens maakten we indexen op basis van de verhoudingen van 2 metabolieten om de 2 groepen te onderscheiden. Dan werd – op basis van deze indexen – een MLR-model [zie methodiek] ontwikkeld m.b.v. de gegevens van de training-groep en dit werd gevalideerd via gegevens van een onafhankelijke groep.

Representatieve metabolieten uit de training-gegevens werden gevisualiseerd in ‘paden’ [glycolyse, TCA-cyclus, ureum-cycus, glutamine-metabolisme]. Er werd geen significant verschil gezien wat betreft glucose-concentratie bij vergelijking van de 2 groepen. Bij glycolyse vertoonde de mediane concentratie van pyruvaat [ontstaat uit glucose] van de CVS-patiënten een neiging tot verhoging (P < 0.10) in verhouding tot deze van de gezonde controles. Tijdens de eerste stappen van de TCA-cyclus, vertoonden de concentraties van organische zuren bij de CVS-patiënten significante dalingen in verhouding tot deze van de gezonde controles: citraat (P < 0.05) & isocitraat (P < 0.05); cis-aconitaat bij CVS-patiënten neigde te dalen (P < 0.10). Het volgende metaboliet in de TCA-cyclus, malaat daalde significant (P < 0.05) bij CVS-patiënten. De verhouding pyruvaat/isocitraat was significant hoger bij CVS-patiënten dan bij gezonde controles (P < 0.01), wat een verstoring van de link tussen glycolyse en de TCA-cyclus weerspiegelt. In de ureum-cyclus waren er een significante daling van de concentraties van ureum (P < 0.01) en citrulline (P < 0.01) t.o.v. die bij gezonde controles, en een significante verhoging van de ornithine-concentratie (P < 0.05) bij CVS-patiënten. De verhouding ornithine/citrulline, die de metabole aktiviteit in de ureum-cyclus weerspiegelt, was significant hoger bij CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles (P < 0.001). De verschillen van deze verhoudingen tussen CVS-patiënten en gezonde controles waren consistent bij de training- en bevestiging-datasets.

Bij het glutamine-metabolisme vertoonden glutamaat en glutamine geen significant verschil tussen de 2 groepen. De BCAAs (inclusief valine, leucine & isoleucine) bij CVS-patiënten vertoonden geen significant verschil t.o.v. deze bij gezonde controles.

SVM-FS rangschikte ornithine, citrulline, lactaat, isocitraat en pyruvaat als de top-5 metabolieten voor het onderscheiden van CVS-patiënten van gezonde controles. Van deze molekulen zijn ornithine en citrulline respectievelijk het substraat en het produkt van [het enzyme] ornithine-carbamoyl-transferase in de ureum-cyclus, dus gebruikten we de ornithine/citrulline verhouding als een index om de aktiviteit van dit mechanisme te bepalen. Op dezelfde manier gebruikten we ook de pyruvaat/isocitraat verhouding als een andere index om de aktiviteit van de glycolyse en de TCA-cyclus te bepalen. Een MLR-model dat deze indexen combineert, toonde ROC-analyse waarden van 0,801 [95% confidentie-interval (CI [zie bespreking]): 0,711-0,890; P < 0.0001] & 0,750 (95% CI: 0,584-0,916; P = 0.0069) voor de training- en bevestiging-datasets, respectievelijk. […] De 200 testen 10-voudige CV die we deden voor een rigoureuze validatie, leverden een hoge mediane waarde op voor de ROC: 0,784 (95% CI: 0,783-0,785), en ook 200 precisie-testen leverden ook hoge waarden op: 0,790 (95% CI: 0,783-0,796) en 0,758 (95% CI: 0,741-0,768) voor de training- en bevestiging-datasets, respectievelijk. Deze resultaten geven aan dat de combinatie van de ornithine/citrulline en pyruvaat/isocitraat verhoudingen CVS-patiënten duidelijk onderscheidde van gezonde controles.

Bespreking

In deze studie onthulden metaboloom-analyses van CVS-patiënten en gezonde controles dat de concentraties van organische zuren gerelateerd met de TCA-cyclus en het energie-metabolisme (zoals citraat, isocitraat en malaat), significant lager waren bij CVS-patiënten dan bij gezonde controles, hoewel de concentratie van glucose niet significant verschilde tussen de 2 groepen. Wat betreft de ureum-cyclus was de concentratie van ornithine bij CVS-patiënten significant hoger dan bij gezonde controles, terwijl die van citrulline significant lager was bij CVS-patiënten dan bij gezonde controles. De metabolieten van het glutamine-metabolisme en de BCAAs vertoonden geen significante verschillen tussen de CVS-patiënten en de gezonde controles. De gedaalde concentraties van organische zuren gerelateerd met de TCA-cyclus en het energie-metabolisme bij de CVS-patiënten suggereert dat ze gebreken hebben wat betreft de aanmaak van adenosine-trifosfaat (ATP), secundair aan ontregeling van de flow van pyruvaat naar citraat via acetyl-CoA; en abnormaliteiten bij de omzetting van citraat naar isocitraat door aconitase [enzyme]. Er wordt gedacht dat dit profiel de pathofysiologie weerspiegelt van het energie-metabolisme bij CVS. Aangezien meer dan 90% van de cellulaire energie wordt geproduceerd via de elektronen-transport-keten, wat een proces is waarmee ATP wordt gegenereerd gebruikmakend van O2 en elektron-donoren (zoals NADH2+) in de mitochondrieën, suggereren dalingen van de concentraties van organische zuren die betrokken zijn bij de TCA-cyclus een deficiëntie van de ATP-aanmaak bij CVS-patiënten [zie bv. Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93]. Aconitase-aktiviteit is nauw verbonden met ATP-produktie; de inhibitie van aconitase vermindert de cellulaire energie-voorraad en induceert cel-dood. Aconitase bevat een 4Fe-4S cluster [motief van 4 ijzer- en 4 zwavel-ionen dat substraten kan binden] en is kwetsbaar voor oxidatieve stress. Naast een eerdere studie [Kennedy G et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39: 584-589] ondersteunen de bevindingen – dat CVS-patiënten (gerecruteerd via hetzelfde ziekenhuis als in deze studie hier) hogere oxidatieve stress vertonen t.o.v. gezonde controles [Fukuda S. et al. A potential biomarker for fatigue: Oxidative stress and anti-oxidative activity. Biological Psychology (2016) 118, 88-93] – de hypothese dat de daling van isocitraat kan voortvloeien uit de inaktivatie van aconitase via chronische oxidatieve stress. Inderdaad: er werd gerapporteerd dat spierpijn, één van de belangrijke symptomen van CVS, wordt geïnduceerd door oxidatieve stress. [Jammes Y. Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle excitability in response to incremental exercise. Journal of Internal Medicine (2005) 257: 299-310] De gedaalde concentraties van metabolieten in de eerste stappen van de TCA-cyclus bij CVS-patiënten weerspiegelen waarschijnlijk de pathofysiologie van vermoeidheid, wat de funktionele ontregeling van de flow van pyruvaat naar citraat aantoont. De plasma pyruvaat/isocitraat verhouding zou dus een geschikte merker voor dit type ontregeling kunnen zijn.

Wat betreft de BCAAs: er was geen significant verschil bij CVS t.o.v. gezonde controles. We rapporteerden al dat een model met vermoeide dieren stijgingen qua BCAAs (valine, leucine & isoleucine) toonde, wat zou kunnen worden geïnduceerd door de proteolyse van skelet-spieren na het ontzeggen van rust. [Jin G et al. Changes in plasma and tissue amino acid levels in an animal model of complex fatigue. Nutrition (2009) 25: 597-607] Dit in acht nemenende zou het kunnen dat aanhoudende spier-stress niet betrokken is bij CVS.

Een eerdere NMR metaboloom studie bij CVS rapporteerde een toename van het bloed-glucose en -lactaat alsook een daling van het urine-pyruvaat en -alanine bij CVS-patiënten, suggestief voor een mogelijke inhibitie van de glycolyse door de verminderde voorziening van adequate hoeveelheden acetyl-CoA vereist voor de citroenzuur-cyclus. [zie McGregor NR., Butt H.L et al. hierboven] Er waren enkele verschillen tussen deze studies en die van ons, waarschijnlijk te wijten aan de verschillende analytische methodes die werden gebruikt, t.t.z. NMR en CE-MS detekteren verschillende types metabolieten op basis van hun chemische eigenschappen. De ziekte-ernst bij individuen met CVS is een andere factor die verschillende wijzigingen van de metabolieten kan veroorzaken. Ondanks deze discrepanties, gaf de eerdere studie aan dat een dysfunktioneel energie-metabolism via de citroenzuur-cyclus een vermoeidheid-fenotype is. [zie ook McGregor NR., Butt H.L et al. hierboven] Deze hypothese is in overéénstemming met onze bevindingen dat de getoonde funktionele ontregeling van de flow in de TCA-cyclus de pathofysiologie van vermoeidheid zou kunnen weerspiegelen.

Onze bevindingen kunnen worden toegeschreven aan een kenmerkend metabool mechanisme bij een vermoeide toestand: de metabole flow van ornithine en glutamine naar succinaat in de TCA-cyclus via gamma-aminoboterzuur (GABA). Verhoogd ornithine in de ureum-cyclus bij vermoeidheid zou de upregulering van de flow van glutamaat naar de TCA-cyclus via GABA en het succinaat-pad kunnen veroorzaken. In de huidige studie waren de concentraties van citraat en isocitraat in de eerste stappen van de TCA-cyclus (gerelateerd met het energie-metabolisme) verminderd bij CVS-patiënten t.o.v. deze bij gezonde controles. Er was geen significant verschil qua succinaat-concentratie, die deze metabolieten van de TCA-cyclus volgt, tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Dit suggereert dat aktivatie van het vermoeidheid-metabolisme bijdraagt tot de gedaalde energie-voorziening bij vermoeidheid.

Een eerdere studie rapporteerde dat de ornithine/citrulline verhouding een merker is die kan worden gebruikt om de aktiviteit van de ureum-cyclus te evalueren. [na hart-chirurgie]. Een toename van de ornithine/citrulline verhouding geeft een vertraging aan bij het start-punt van de ureum-cyclus waar ornithine wordt omgezet tot citrulline […], wat het eerste tussen-produkt is in deze cyclus […]. Onze resultaten tonen ook dat de ornithine/citrulline verhouding significant hoger was bij CVS-patiënten dan bij gezonde controles. Dit kan de enzymatische dysfunktie van carbamoyl-fosfaat-synthetase-I [enzyme in de mitochondrieën betrokken bij de aanmaak van ureum] […] of ornithine-transcarbamylase weerspiegelen bij CVS. Ornithine en citrulline (aangemaakt uit ornithine en carbamoyl-fosfaat door ornithine-transcarbamylase) zijn betrokken bij de detoxificatie in de lever – een belangrijke funktie. Er werd eerder [bij ratten] gerapporteerd dat citrulline ook wordt aangemaakt uit arginine via het NO-produktie pad en wordt gekatalyseerd door stikstof-oxide-synthase, dat ge-upreguleerd wordt door AMP-geaktiveerd (proteïne)-kinase [AMPK; een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt] in respons op een ADP/ATP-onevenwicht. Er zijn ook meldingen [patiënten met diabetes mellitus] dat het metabool evenwicht van citrulline en arginine de waarden van intracellulaire en extracellulaire lipiden-peroxidatie beïnvloedt. Een eerdere studie bij vermoeide ratten vond dat stikstof-oxiden en oxidatieve waarden in het plasma waren gestegen. Een andere studie rapporteerde dat thiobarbituurzuur-reaktieve lipoperoxiden verhoogd waren in lever-weefsel van vermoeide dieren. [Tanaka M. et al. Effects of epigallocatechin gallate in liver of an animal model of combined (physical and mental) fatigue. Nutrition (2008) 24: 599-603] Als men deze bevindingen tesamen beschouwt dan zouden de hogere waarden oxidatieve stress in het plasma & serum bij CVS een metabole ontregeling (zoals de inaktivatie van aconitase) kunnen veroorzaken, wat waarschijnlijk resulteert in de daling van isocitraat in de TCA-cyclus en de inhibitie van de metabole flow van ornithine naar citrulline in de ureum-cyclus.

Met ROC-waarden van 0,801 & 0,750 voor the training- en bevestiging-datasets, kunnen de 2 verhoudingen (pyruvaat/isocitraat & ornithine/citrulline in plasma) gebruikt worden om een onderscheid te maken tussen CVS-patiënten en gezonde controles. [De statistische analyses – kruis-validatie & precisie-testen – toonden een goede 95% CI (confidentie/betrouwbaarheid-interval; interval van betrouwbare waarden (schattingen) voor een bepaalde parameter) … wat de veelzijdigheid van het model bevestigt. De ROC-waarden van één enkele index (pyruvaat/isocitraat of ornithine/citrulline) … lagen lager dan deze van de 2 gecombineerde indexen.] We suggereren dat deze 2 verhoudingen objectieve index-merkers vertegenwoordigen die de snelle screening voor CVS kunnen vergemakkelijken.

In de huidige studie onthulde metaboloom-analyse gedaalde aktiviteit in de TCA-cyclus en de ureum-cyclus bij CVS-patiënten. Toepassing van de 2 verhoudingen (pyruvaat/isocitraat & ornithine/citrulline) welke een dergelijke ontregeling in deze 2 cycli bij CVS-patiënten kunnen weerspiegelen, maakten een onderscheid tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Omdat onze bevindingen de pathofysiologische toestand van CVS zouden kunnen weerspiegelen, zouden ze kunnen bijdragen tot de objectieve diagnose maar ook tot de behandeling van tussen CVS-patiënten door het aanduiden van geschikte nutriënten (in te nemen via de voeding of supplementen).

Er waren meerdere beperkingen bij deze studie. Er zouden aanvullende studies met meer patiënten moeten worden uitgevoerd om de metabole ontregeling in de TCA-cyclus en de ureum-cyclus bij CVS te bevestigen. Het hier ontwikkelde onderscheiding-model dient verder te worden bevestigd bij een grotere populatie. Daarnaast zijn longitudinale metingen nodig om de veralgemeenbaarheid te bewijzen. Om CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles, is het mogelijk dat andere combinaties van gemeten metabolieten ook kunnen worden gebruikt. Het gebruik van de verhouding van 2 metabolieten als een index, i.p.v. één enkele metaboliet-concentratie, zou echter de inconsistentie wat betreft globale concentratie (diurnale variatie) elimineren. In deze studie gebruikten we enkel de gegevens die werden geïdentificeerd via onze standaard ‘bibliotheek’ [de gevonden massa-spectrometie (MS) pieken werden vergeleken met die van gekende molekulen] terwijl TOF-MS ‘onbekende’ gegevens biedt. De pieken waar geen ‘gekende’ molekule voor bekend is maar die wel potentieel onderscheidend kunnen zijn, zouden ook moeten worden geanalyseerd in toekomstige studies, om andere merkers te identificeren en een accurater onderscheid te bieden. Het aantal pieken met signaal/ruis ≥ 10 verschilde tussen de training- en bevestiging-gegevens. […] Verschillende factoren [technische instellingen van de instrumenten] kunnen de gevoeligheid [van de MS-detektie] van de gegevens beïnvloeden. Er zou een meer rigoureuze kwaliteit-controle moeten worden toegepast bij toekomstige studies. Tijdsverloop-analyses van het metaboloom-profiel bij individuele patiënten gedurende korte en lange periodes kunnen helpen om de diagnose accurater te stellen.

Samengevat: onze studie toonde een abnormaal energie-metabolisme profiel voortvloeiend uit deficiënties qua aconitase-aktiviteit in de TCA-cyclus en ontregeling in de ureum-cyclus bij CVS-patiënten. Twee verhoudingen (pyruvaat/isocitraat & ornithine/citrulline), waarvan de veranderingen inaktiviteit van de 2 vermelde cycli bij CVS kunnen weerspiegelen, zouden bruikbare index-merkers kunnen zijn om CVS-patiënten van gezonde controles te onderscheiden. Hoewel een verder grootschalig onderzoek nodig is, biedt de index die werd geïdentificeerd in deze studie overtuigend bewijs dat een klinisch diagnostisch instrument voor CVS kan worden ontwikkeld op basis van de verhoudingen van kleine molekulen in het plasma.

oktober 6, 2016

Verband tussen biomerkers met levenskwaliteit en stressoren bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 6:28 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel is een verderzetting van het werk door de Franse onderzoeksgroep rond Prof. dr Jammes (fysioloog). Zie: ‘Infektie vóór CVS: oxidante status, kalium-uitstroom en spier-prikkelbaarheid bij inspanning’, ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ & ‘Oxidatieve stress’.

Voor info betreffende CD26: lees ‘Neuropeptide-Y en CD-26’ & ‘‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?’.

————————-

Journal of Translational Medicine (2016) 14: 251

Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients

Emmanuel Fenouillet (1,2), Aude Vigouroux (3), Jean Guillaume Steinberg (1), Alexandre Chagvardieff (4), Frederique Retornaz (5), Regis Guieu (1), Yves Jammes (1,6)

1 DS-ACI UMR MD2, Faculty of Medicine, Aix-Marseille University

2 CNRS, Institut des Sciences Biologiques

3 Clinical Respiratory Physiology Laboratory, Nord Hospital

4 Emergency Unit, Nord Hospital

5 Internal Medicine Department, European Hospital

6 Clinical Respiratory Physiology Laboratory, Nord Hospital

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een courante invaliderende aandoening met een intense vermoeidheid, verminderde fysieke aktiviteit en gedaalde levenskwaliteit. Er zijn geen biologische merkers voor het syndroom. De etiologie is onbekend en de pathogenese lijkt multi-factorieel. Verscheidene stressoren, inclusief intense lichamelijke aktiviteit, ernstige infektie en emotionele stress worden gerapporteerd in de medische geschiedenis van M.E./CVS-patiënten; wat de vraag doet rijzen of de fysiologische en biologische abnormaliteiten die gewoonlijk bij deze patiënten worden gevonden indicatief zouden kunnen zijn voor de etiologie en/of gedaalde levenskwaliteit.

Methodes Er werden 36 patiënten en 11 voor leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. De volgende variabelen werden hier bestudeerd: (1) spier-vermoeidheid tijdens inspanning werd onderzocht via het monitoren van de ‘compound muscle action potential’ (‘M-wave’) [ook ‘evoked compound muscle-potential’; een zenuw wordt elektrisch gestimuleerd en de opgewekte respons kan worden gemeten; een manier om perifere spier-vermoeidheid bij inspanning te meten]; (2) de overmatige oxidatieve stress-respons op inspanning werd gemeten via 2 plasma-merkers (thiobarbituurzuur reaktieve substanties: TBARS [bepaling van de lipiden-peroxidatie]; gereduceerd ascorbinezuur: RAA [vitamine-C]); (3) een potentiële inflammatoire component werd bekeken via de expressie van CD26 [aktivatie-merker dipeptidyl-peptidase-IV (DPP-IV of DPP-4); een trans-membraan glycoproteïne en enzyme dat polypeptiden, inclusief chemokinen en neuropeptiden, splitst] op perifeer bloed mononucleaire cellen; (4) verminderde levenskwaliteit werd beoordeeld gebruikmakend van de ‘London Handicap Scale’ (LHS) en de ‘Medical Outcome Study Short Form-36’ (SF-36). De medische voorgeschiedenis van elke patient, met inbegrip van de aanwezigheid van stressoren zoals intens sporten, ernstige acute infektie en/of ernstige emotionele stress, werd gedocumenteerd.

Resultaten We zagen dat: (1) er opvallende verschillen waren tussen de patiënten en de controles wat betreft 3 biologische variabelen: ‘M-wave’ na inspanning, TBARS-variaties & CD26-expressie in rust; (2) elk van deze 3 variabelen correleerde met de andere 2; (3) abnormaliteiten van de biomerkers geassocieerd met gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit: de LHS-score was negatief gecorreleerd met de inspanning-geïnduceerde TBARS-toename en positief gecorreleerd met CD26-expressie, terwijl de pijn-component van de SF-36 negatief was gecorreleerd met CD26-expressie; (4) de TBARS-toename en de afname qua ‘M-wave’ waren het grootst, en het niveau van de CD26-expressie het laagst bij patiënten die infektueuze stressoren ondergingen.

Besluit Bij M.E./CVS-patiënten zijn ernstige veranderingen van de spier-exciteerbaarheid, de redox-toestand, alsook het niveau van de CD26-expressie gecorreleerd met een uitgesproken verstoring van de levenskwaliteit. Ze zijn bijzonder significant wanneer infektueuze stressoren werden gerapporteerd in de medische voorgeschiedenis.

Achtergrond

[…] De definities van M.E./CVS gebruiken geen biologische merkers. […]

Sporten induceert een matige oxidatieve stress bij gezonde individuen terwijl bij M.E./CVS-patiënten een sterke door inspanning geïnduceerde produktie van reaktieve zuurstof soorten (ROS) wordt gevonden [o.a. Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome combines increased exercise-induced oxidative stress and reduced cytokine and Hsp responses. J Intern Med. (2009) 266: 196-206 /// Fulle S et al. Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis. J Muscle Res Cell Motil. (2007) 28: 355-62 /// Moorkens G et al. Antioxidant status and lipoprotein peroxidation in Chronic Fatigue Syndrome. Life Sci. (2001) 68: 2037-49]. De anti-oxidante respons is ook veranderd in rust, zoals wordt aangetoond door een verhoogde waarde qua thiobarbituurzuur reaktieve substanties (TBARS: een merker voor lipiden-peroxidatie) en een gedaalde concentratie gereduceerd ascorbinezuur (RAA: een endogeen anti-oxidant). Omdat de gestegen ROS-aanmaak de spier-exciteerbaarheid aantast, zou de verhoogde redox-stress bij M.E./CVS kunnen bijdragen tot de spier-vermoeidheid (welke werd aangetoond via een verandering van ‘compound evoked muscle action potential’, ‘M-wave’) [Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle excitability in response to incremental exercise. J Int Med. (2005) 257: 299-310].

De significante ontregeling van het immuunsysteem die wordt gevonden bij M.E./CVS-patiënten combineerde verhoogde waarden pro-inflammatoire cytokinen (bv. interleukine-1, tumor necrose factor-α), een ‘natural killer’ cel cytokine-produktie en mitogen-geaktiveerd proteïne-kinase [MAP-kinase reageert op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleert verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose.] [bv. Brenu EW, Staines DR, Klimas NG et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Staines D et al. ERK1/2, MEK 1/2 and p38 downstream signaling molecules impaired in CD56(dim)CD16(bright)CD16(dim/-) natural killer cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients. J Transl Med. (2016) 14: 97]. Een studie identificeerde ook een verband tussen immune abnormaliteiten en de ernst van M.E./CVS-symptomen & een veranderde levenskwaliteit [Hardcastle SL, Brenu EW, Johnston S, Nguyen T, Huth T, Ramos S, Staines D, Marshall-Gradisnik S. Longitunical analysis of immune abnormalities in varying severities of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2015) 13: 299]. Deze immunologische abnormaliteiten omvatten ook verminderde expressie van de T-cel aktivatie-merker CD26 op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) [Fletcher MA, Zeng XR, Maher K, Levis S, Hurwitz B, Antoni M, Broderick G, Klimas NG. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817]. Deze observatie, samen met de meldingen dat CD26-expressie verhoogd is bij patiënten met fibromyalgie [Guieu R et al. High cell surface CD26-associated activities and low plasma adenosine concentration in fibromyalgia. Ann Rheum Dis. (2012) 71: 1427-8] of metabool syndroom, geeft aan dat veranderingen qua CD26-expressie aanwezig zijn bij sommige musculaire aandoeningen.

Naast T-cel aktivatie en inflammatie-controle, zou CD26 ook betrokken kunnen zijn bij M.E./CVS door zijn endoproteolytische aktiviteit [splitsing van de peptide-verbindingen binnen in proteïnen] die de circulerende waarden van verscheidene effectoren betrokken bij angst, chronische pijn en spier-metabolisme controleren. Zodoende zou CD26 stemming, pijn en spier-componenten van M.E./CVS kunnen beïnvloeden. De daling qua CD26-expressie bij M.E./CVS zou ook geassocieerd kunnen zijn met een gewijzigde redox-toestand.

Bij het zoeken naar hulp bij de diagnose van M.E./CVS, werd in studies gezocht naar een correlatie tussen symptomen (gemonitord via analoge vermoeidheid-schalen) en merkers, in het bijzonder, voor oxidatieve stress en immuniteit [McGregor NR et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox Rep. (2000) 5:35-44 /// Vecchiet J et al. Relationship between musculoskeletal symptoms and blood markers of oxidative stress in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neurosci Lett. (2003) 335:151-4 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med. (2005) 39:584-9]. Andere studies rapporteerden een verandering van de gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit bij M.E./CVS-patiënten maar onderzochten het verband met biologische veranderingen niet.

Zoals hierboven aangegeven zijn de huidige definities voor M.E./CVS gebaseerd op symptomen en gebruikt men geen biomerkers. Dit werpt de vraag op of mensen met M.E./CVS enige biologische abnormaliteiten delen. Als dat zo is, dan zouden de bij deze patiënten gevonden fysiologische en biologische abnormaliteiten diagnostische merkers kunnen worden.

Methodes

Patiënten

[…] 36 M.E./CVS-patiënten en 11 voor leeftijd gematchte gezonde controles. De M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd: 41 ± 6 jaar; gemiddeld gewicht: 66 ± 3 kg; 22 vrouwen) […] voldeden aan de criteria gedefinieerd door het ‘Institute of Medicine’: (1) ernstige chronische vermoeidheid gedurende > 6 opéénvolgende maanden (36/36); (2) een verslechtering van de ziekte na verhoogde fysieke of cognitieve aktiviteit (36/36); (3) problemen met korte-termijn geheugen of concentratie (36/36), (4) spierpijn (24/36); (5) niet-verfrissende slaap (21/36). In de meeste gevallen begon de M.E./CVS plots (30/36), dikwijls met een griep-achtige ziekte (28/36). Uitsluitende diagnoses: medische en psychiatrische oorzaken van aanhoudende vermoeidheid.

De gegevens van de M.E./CVS-patiënten werden vergeleken met deze van een voor leeftijd gematchte controle-groep (leeftijd: 48 ± 5 jaar; gewicht: 71 ± 4 kg; 6 vrouwen; dezelfde socio-economische klasse. […]

Gezien hun medische voorgeschiedenis werden patiënten retrospectief in 4 groepen opgedeeld: (1) patiënten die rapporteren intens aan sport te hebben gedaan (> 6 h/week) (n = 10), (2) patiënten die rapporteren de diagnose van een ernstige acute infektie (peritonitis, sepsis, vogel-griep, …) te hebben gekregen (3-7 maand vóór de aanvang van M.E./CVS (n = 7), (3) patiënten die rapporteren ernstige emotionele stress (moeilijke echtscheiding, sterfte van een kind, …) te hebben ondervonden (n = 11) of (4) patiënten met een combinatie van ernstige infektie en emotionele stress (n = 8).

[…]

Resultaten

Biochemische variabelen en spier-exciteerbaarheid in rust en bij VO2max

Er werden significante biochemische verschillen gezien tussen M.E./CVS-patiënten en controles in rust: de RAA/TBARS verhouding en de expressie van CD26 op PBMCs was lager bij de patiënten.

De inspanning-geïnduceerde veranderingen van de ‘M-wave’ amplitude (Δ‘M-wave’) waren significant hoger bij de patiënten dan bij controles. Er werd enkel bij de patiënten een significante toename gevonden qua TBARS na inspanning. Omdat de duur van de of inspanning-test (10-12 min) onder de tijd ligt die nodig is voor de synthese en expressie van CD26, onderzochten we niet bij alle patiënten of de fiets-inspanning de CD26-expressie kon beïnvloeden (we bekeken de situatie bij 10 patiënten en vonden geen verschillen).

De gegevens verkregen in rust en bij VO2max tonen dat de redox-toestand, CD26-expressie en spier-exciteerbaarheid veranderd waren bij M.E./CVS. Wanneer we onderzochten of deze karakteristieken geassocieerd zijn, vonden we (1) een negatieve correlatie tussen Δ‘M-wave’ en ΔTBARS, (2) een positieve correlatie tussen Δ‘M-wave’ en CD26-expressie, en (3) een negatieve correlatie tussen ΔTBARS en CD26-expressie. We vonden geen correlatie in rust tussen TBARS, RAA/TBARS-verhouding en CD26-expressie.

Verband tussen biologische merkers en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

De scores van gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit werden bij de patiënten uitgezet t.o.v. de ΔTBARS-waarde of de CD26-expressie. De LHS-score was negatief gecorreleerd met ΔTBARS en positief gecorreleerd met CD26-expressie. De pijn-component van de SF-36 vragenlijst was negatief gecorreleerd met CD26-expressie.

Verband tussen biologische merkers en stressoren

Bij opdeling van de 4 groepen naar gelang hun medische geschiedenis, zagen we dat: (1) de ‘M-wave’ significant gereduceerd bleek wanneer infektie en omgeving-stressoren werden gecombineerd; (2) ΔTBARS-waarden en CD26-expressie uitgesproken waren veranderd bij patiënten die een ernstige infektie hadden, ongeacht de aanwezigheid van ernstige emotionele stress; (3) de LHS-score uitgesproken laag was bij patiënten die een ernstige infektie hadden ongeacht de aanwezigheid van ernstige emotionele stress, terwijl de score voor de pijn-component van SF-36 enkel hoog was bij een combinatie van infektie en emotionele stressoren. Deze resultaten ondersteunen het belang van infektueuze stressoren bij deze variabelen.

Bespreking

Bij M.E./CVS-patiënten vonden we dat (1) de veranderingen qua ‘M-wave’ amplitude na inspanning, de wijzigingen in de redox-toestand geïnduceerd door spier-inspanning en de CD26-expressie gecorreleerd zijn; (2) de LHS-score gecorreleerd was met de wijzigingen in de redox-toestand geïnduceerd door inspanning en CD26-expressie; (3) de pijn-component van de MOS SF-36 gecorreleerd was met de CD26-expressie. Deze variabelen waren voornamelijk veranderd bij patiënten met een geschiedenis van infektueuze ziekte.

De oxidatieve stress wijst op een onevenwicht tussen pro- en anti-oxidante toestand, in de richting van het eerste. Bij gezonde individuen is een dergelijke situatie courant in skelet-spieren na inspanning omdat de anti-oxidante verdediging in spieren zwak is. Bij M.E./CVS-patiënten blijken – uit dit werk en dat van anderen – verhoogde waarden van bloed-merkers voor oxidatieve stress (hier TBARS) en een verlaagde anti-oxidante verdediging (hier RAA); een situatie die oxidatieve stress bevordert, en eventueel de membraan-exciteerbaarheid van de spieren aantast. De correlatie die hier werd gevonden tussen het niveau oxidatieve stress en de ‘M-wave’ verandering is consistent met deze gegevens.

Ons werk rapporteert ook de correlatie van de redox-merkers met LHS-score voor levenskwaliteit. Dit verband is in overéénstemming met studies die de impact onderzochten van een veranderde oxidante/anti-oxidante status bij M.E./CVS en vonden dat de bloed-waarden in rust van malondialdehyde [merker voor oxidatieve stress] [zie McGregor NR et al. hierboven] en TBARS [zie Vecchiet J et al. hierboven] geassocieerd zijn met variaties qua cognitieve symptomen en slaap-stoornissen, terwijl de totale symptoom-score, gewricht-pijn en post-exertionele malaise gecorreleerd zijn met de isoprostaan-waarden [zie Kennedy G, Spence VA et al. hierboven].

Wat betreft CD26 vonden we dat de expressie gedaald was bij M.E./CVS-patiënten. Deze observatie ondersteunt een rapport [zie Fletcher et al. hierboven] maar contrasteert met een studie bij M.E./CVS-patiënten die werden onderzocht na een infektie met Giardia [darm-parasiet]. De CD26 protease-aktiviteit controleert de circulerende waarden van meerdere mediatoren voor pijn en stemming. Omdat stemming-wijzigingen en spierpijn dikwijls voorkomen bij M.E./CVS, werden de concentraties van CD26-peptide substraten bekeken bij patiënten, en er werden discrepante besluiten bereikt wat betreft Neuropeptide-Y en Substantie-P [Broderick G, Klimas NG et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76 /// Evengard B et al. Chronic Fatigue Syndrome differs from fibromyalgia. No evidence for elevated substance P levels in cerebrospinal fluid of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain (1998) 78: 153-5]. Hier vonden we dat de scores die de levenskwaliteit weerspiegelen gecorreleerd zijn met CD26-expressie. Dit resultaat is in overéénstemming met de observaties dat spierpijn dikwijls werd gemeld door onze patiënten (24/36), met een impact op hun levenskwaliteit-scores. We zagen ook dat de CD26-expressie daalde, wat kan leiden tot stijging van de circulerende pro-nociceptieve [pijn-gevoeligheid verhogende] peptiden en spierpijn bevorderen.

Twee studies onderzochten de CD26-expressie in een context van redox-wijzigingen. Bij acute lymfoblastische leukemie [een vorm van ‘bloedkanker’] is het CD26-niveau gecorreleerd met de aktiviteiten van myeloperoxidase [enzyme dat helpt om ROS te elimineren], glutathion-s-transferase [beschermt cellen tegen oxidatieve schade] en xanthine-oxidase [ROS-genererend enzyme]. Bovendien werd aangetoond dat een langdurig verlies van CD26-expressie de capaciteit verhoogt om te beschermen tegen de oxidatieve stress [in cardiomyocyten van ratten]. Het lage CD26-expressie niveau dat hier werd gerapporteerd bij M.E./CVS kan daarom een adaptieve respons vormen op het chronisch redox-onevenwicht dat wordt gevonden bij M.E./CVS-patiënten; deze hypothese wordt ondersteund door de correlatie die we vonden tussen de CD26-aktiviteit en de redox-toestand.

Ten slotte: wanneer patiënten werden gesorteerd op basis van de aanwezigheid van infektie/ intense lichamelijke aktiviteit/ emotionele stress, zagen we dat de individuen die episode(s) ernstige infektie rapporteerden, waarden voor biomerkers en scores voor levenskwaliteit hadden die meer gewijzigd bleken t.o.v. deze gemeten bij patiënten die geen ernstige infekties hadden vermeld. Deze resultaten ondersteunen verder de rol van infektueuze stressoren bij M.E./CVS.

We geloven dat deze studie 3 beperkingen heeft: (1) we kwantificeerden de emotionele stress niet correct omdat slechts de aanwezigheid van één belangrijke stressvolle levensgebeurtenis werd beschouwd; (2) om het effekt van CD26-aktiviteit op z’n peptide-substraten te bekijken, ondernamen we metingen van de circulerende waarden van Neuropeptide-Y en Substantie-P bij de patiënten maar we detekteerden geen correlatie met het CD26-expressie niveau, wat kan worden verklaard door het feit dat slechts plaatselijke concentraties van pijn- en stemming-mediatoren in vivo werken en het onmogelijk is ze in situ te bepalen; (3) zoals in eerdere M.E./CVS-studies was de bevinding van een gewijzigd redox-evenwicht bij onze individuen enkel gebaseerd op metingen van TBARS (een kwantificatie van de waarden van membraan-lipoperoxiden resulterend uit een overmatige ROS-produktie) en van gereduceerd ascorbinezuur (een belangrijke plasma anti-oxidant). Zodoende kan de werkelijke verbetering van intracellulaire ROS-produktie bij M.E./CVS niet worden geëvalueerd; ten eerste omdat er spier-biopten nodig zouden zijn en ten tweede omdat er een tegengewicht wordt gevormd door de intracellulaire anti-oxidanten die in de huidige studie niet werden onderzocht.

Besluit

In overéénkomst met een rapport dat stelt dat patiënten met ernstige M.E./CVS met verloop van tijd verschillen van mensen met matige M.E./CVS en significante immune abnormaliteiten vertonen, geven onze resultaten aan dat de simultane monitoring van de spier-funktie, redox-respons en CD26-expressie zouden kunnen bijdragen, samen met gezondheidtoestand-schalen, tot het identificeren van M.E./CVS en het beoordelen van de ernst ervan. Deze resultaten zouden ook kunnen helpen bij het maken van het onderscheid tussen M.E./CVS en fibromyalgie, omdat de CD26-aktiviteit op PBMCs stijgt bij fibromyalgie terwijl deze daalt bij M M.E./CVS-patiënten.

september 9, 2016

Metabole kenmerken van M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 12:53 pm
Tags: , , , , ,

In ‘De ‘cell danger response’’ plaatsten we al het werk van Prof. Naviaux in de schijnwerper. We maakter er al gewag van een veelbelovend artikel (door sommigen aangekondigd als “truly spectacular … that will change the face of CFS-treatment”) dat van hem was aangekondigd. Hier is het dan. Het betreft een metaboloom-studie (‘metabolomics’); zeg maar het meten in ons bloed van de molekulen die ontstaan in de verscheidene stappen en als bijprodukten van ons metabolisme (het afbreken van voedingstoffen om energie en bouwstenen van de cellen aan te maken). De gebruikte technolgieën bieden een moment-opname van de cellulaire fysiologie. Het werk werd ondersteund en gefinancierd door verschillende fondsen en stichtingen (o.a. de ‘UCSD Mitochondrial Disease Research Fund) en mede mogelijk gemaakt door giften van privé-personen.

De researchers suggereren dat veel van de gevonden abnormaliteiten onderdeel kunnen zijn van de reaktie van het lichaam dat probeert de verspreiding en de effekten van een infektie (niet één bepaalde – zoals we hier al meermaals meegaven) te beperken via alternatieve mechanismen en zo andere molekulen creëert dan die het nodig heeft. Een toestand die blijft voortduren bij M.E.(cvs)-patiënten.

De gevonden ontwrichte processen beïnvloeden de cellulaire bouwstenen sfingolipiden en glycosfingolipiden (in het lichaam gebruikt om cel-membranen in hersen- en zenuw-weefsel te vormen), cholesterol (nodig voor de aanmaak van cel-membranen en steroïd-hormonen zoals cortisol of aldosteron), galzuren (belangrijk voor normale vet-vertering; onvoldoende galzuren in de darm kunnen leiden tot ‘leaky gut’), de mitochondrieën (gevolg: lage energie-reserve en een onvermogen om de energie-reserves na inspanning aan te vullen), het vermogen van het lichaam om vitaminen te vormen (vitamine-A en de B-vitaminen riboflavine (B2), niacine (B3), pyridoxine (B6), foliumzuur (B9) & cobalamine (B12); essentieel voor energie-produktie, cel-ontwikkeling en normale werking van het zenuwstelsel) & HICA (een anti-schimmel/ anti-bakteriële molekule die normaal door het lichaam wordt geproduceerd). De auteurs spreken over een opmerkelijke uniformiteit niettegenstaande het voorkomen van meerdere triggers en de heterogeniteit bij de aandoening.

De ‘cell danger response’ (CDR) is een evolutionair bewaarde metabole respons die cellen beschermt en de gastheer van schade vrijwaart. Maar zo zijn er nog in de biologische wereld. Zo is er ‘dauer’ (Duits voor ‘uithouding’), een toestand die voorkomt bij de rondworm Caenorhabditis elegans (een model dat uitgebreid bestudeerd wordt door biologen) wanneer deze barre omstandigheden probeert te overleven. Door het vermogen van deze wormen om een dergelijke situatie te verdragen kunnen ze 4 tot 8 maal langer leven dan gewoonlijk. Volgens Naviaux et al. is dit vergelijkbaar met wat bij M.E.(cvs) aan de hand is: milieu/omgeving-stressoren triggeren een vertraging van het metabolisme en dit geeft aanleiding tot een objectief identificeerbare chemische signatuur. Slechts 25% van de verstoorde metabolieten die bij elke persoon werden gevonden waren nodig voor de diagnose en ruw-weg 75% waren uniek voor elk individu, wat volgens hen nuttig is voor een gepersonaliseerde behandeling. Naviaux: “Onze bevindingen tonen dat de cellulaire metabole respons dezelfde is bij de patiënten.”.

Het valt ook op te merken dat de geobserveerde metabole respons tegengesteld is aan het patroon die bv. bij een acute infektie wordt gezien. Hoewel een infektie dikwijls wordt gemeld als initiërende gebeurtenis, draagt deze blijkbaar niet bij tot het voortduren van de ziekte. Prof Ronald W. Davis (directeur van de wetenschappelijke adviesraad van de ‘Open Medicine Foundation’) oppert dat in afwezigheid van bewijs voor een aktieve infektie, het aannemelijk is dat langdurige antimicrobiële behandelingen (antivirale middelen en antibiotica) – die dikwijls worden gebruikt bij M.E.(cvs)-patiënten – eigenlijk nog meer schade kunnen toebrengen.

Kritici halen aan dat het tot nu toe niet vast te stellen is of de gemelde veranderingen oorzaak of gevolg zijn van M.E.(cvs). Ron Davis (die Professor Biochemie & Genetica aan de Stanford Universiteit is) benadrukt echter het enorme belang van de studie. Verder onderzoek en validering via onafhankelijke studies zijn natuurlijk cruciaal. Daarom financiert de ‘Open Medicine Foundation’ een studie bij een grotere groep patiënten uit geografisch diverse plaatsen.

————————-

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) [Augustus 2016 pre-print]

Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome

Robert K. Naviaux (a,b,c,d), Jane C. Naviaux (a,e), Kefeng Li (a,b), A. Taylor Bright (a,b), William A. Alaynicka (b) Lin Wang (a,b), Asha Baxter (f), Neil Nathan (f), Wayne Anderson (f) & Eric Gordon (f)

aThe Mitochondrial and Metabolic Disease Centre, University of California, San Diego School of Medicine, San Diego, California

bDepartment of Medicine, cDepartment of Pediatrics, dDepartment of Pathology, eDepartment of Neurosciences, University of California, San Diego School of Medicine, San Diego, California

fGordon Medical Associates, Santa Rosa, California

Betekenis

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom is een multi-systeem ziekte die langdurige pijn en invaliditeit veroorzaakt. Het is moeilijk om een diagnose te stellen omwille van de veranderende symptomen en het gebrek aan een diagnostische laboratorium-test. We rapporteren dat doelgerichte, breed-spectrum metaboloom-studie van plasma niet enkel een kenmerkende chemische signatuur onthulde maar ook een onverwachte onderliggende biologie. Metaboloom-studie toonde dat Chronische Vermoeidheid Syndroom een zeer gecoördineerde hypometabole respons is op omgeving-stress die terug te voeren is naar de mitochondrieën en gelijkaardig is met de klassieke ontwikkeling-toestand ‘dauer’. Deze ontdekking opent een nieuw pad voor de rationele ontwikkeling van nieuwe therapeutica en identificeert metaboloom-studie als een krachtig instrument voor het identificeren van chemische verschillen die bijdragen tot gezondheid en ziekte.

Samenvatting

Meer dan 2 miljoen mensen in de V.S. hebben Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). We voerden een doelgerichte, breed-spectrum metaboloom-studie uit om inzichten te verwerven in de biologie van CVS. We bestudeerden een totaal van 84 individuen. 45 individuen (23 vrouwen en 22 mannen) voldeden aan de diagnostische criteria voor M.E./CVS: ‘Institute of Medicine’, Canadese & Fukuda. 39 individuen (21 vrouwen, 18 mannen) werden voor leeftijd en geslacht gematcht met normale controles. De vrouwen met M.E./CVS waren 52 (± 2,5) jaar oud (20-67); de mannen met M.E./CVS waren 53 (± 2,8) jaar oud (21-67). De Karnofsky prestatie-scores waren 54 (± 3,3) voor de vrouwen en 62 (± 3,2) voor de mannen. We bekeken 612 metabolieten van 63 biochemische mechanismen in het plasma d.m.v. hydrofiele-interaktie vloeistof-chromatografie, ‘electrospray’ ionisatie en tandem massa-spectrometrie [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]. Patiënten met M.E./CVS vertoonden abnormaliteiten in 20 metabole mechanismen. 80% van de diagnostische metabolieten waren gedaald, consistent met een hypometabool syndroom. De abnormale mechanismen omvatten: sfingolipiden, fosfolipiden, purine, cholesterol, microbioom, pyrroline-5-carboxylaat, riboflavine, vertakte-keten aminozuren, peroxisomaal en mitochondriaal metabolisme. […] Analyse toonde diagnostische accuraatheden van 96% […] bij de vrouwen (gebruikmakend van 13 metabolieten) en 94% […] bij de mannen (gebruikmakend van 8 metabolieten). Onze gegevens tonen dat, ondanks de heterogeniteit van de factoren die tot M.E./CVS leiden, de cellulaire metabole respons bij de patiënten homogeen, statistisch robust en chemische gelijkaardig was met de evolutionair bewaarde respons op omgeving-stress die bekend staat als ‘dauer’.

Inleiding

[…]

De diagnose van complexe ziekten zoals M.E./CVS zijn dikwijls moeilijk en vallen duur uit. Hoewel individuele testen betaalbaar kunnen zijn en mogelijks gedekt door de sociale zekerheid, maken veel patiënten een omzwerving door die resulteert in substantiële persoonlijke kosten en jaren van zoeken, zonder werk en met significant verminderde levenskwaliteit. De maatschappelijke kost door M.E./CVS is heel zwaar. Professionele gezondheidszorg-werkers zijn ook gefrustreerd door het ontbreken van objectieve technologie die de diagnose kan ondersteunen. Pogingen om een klein aantal biomerkers – molekulen in het bloed, cerebrospinaal vocht of een handvol genen – te gebruiken, leverden geen diagnostisch bruikbare testen voor M.E./CVS op.

Metaboloom-studies hebben meerdere voordelen t.o.v. genoom-studies voor de diagnose van complexe chronische ziekten […]. Ten eerste: minder dan 2.000 metabolieten vormen de meerderheid van de molekulen in het bloed die worden gebruikt voor cel-cel communicatie en metabolisme, vergeleken met de 6 miljard baseparen in het menselijk genoom. Ten tweede: metabolieten weerspiegelen de huidige funktionele toestand van het individu. De collectieve cellulaire chemie vertegenwoordigt de funktionele interaktie van genen en het milieu. Dit is het metabolisme. In tegenstelling: het genoom vertegenwoordigt een mengeling van voorouderlijke genotypes die geselekteerd werden voor hun geschiktheid in ancestrale omgevingen. De metabole toestand van een individu op het tijdstip van ziekte komt voort uit de huidige situatie, leeftijd en gezamelijke geschiedenis, timing en aantal blootstellingen aan lichamelijke en emotionele stress, trauma, dieet, inspanning, infekties en het microbioom – het metabool geheugen [Naviaux RK. Oxidative shielding or oxidative stress? J Pharmacol Exp Ther (2012) 342: 608-618 /// Naviaux RK. Metabolic features of the cell danger response. Mitochondrion (2014) 16: 7-17 (zie onze inleiding)]. Analyse van metabolieten kunnen een meer technische en bio-informatisch beheersbare, fysiologisch relevante, chemisch uitgebreide en kosten-efficiënte diagnose-methode voor complexe chronische ziekten bieden. Omdat metaboloom-studies directe informtaie over kleine molekulen bieden, kunnen de resultaten onmiddellijk aktie-gerichte behandeling-informatie bieden; gebruikmakend van beschikbare kleine voeding-molekulen, co-factoren en lifestyle-interventies. Onze resultaten tonen dat M.E./CVS een objectief identificeerbare chemische signatuur heeft bij zowel mannen als vrouwen en dat doelgerichte metaboloom-studies kunnen worden gebruikt om biologische inzichten bloot te leggen die bruikbaar kunnen zijn voor de diagnose en gepersonaliseerde behandeling.

Materialen & Methodes

[…]

Resultaten

Demografiek

De 84 individuen in deze studie kwamen uit plaatsen met 51 post-codes van de V.S. en Canada. 80 personen kwamen uit Californië. Alle M.E./CVS-patiënten voldeden aan de 2015 diagnostische criteria gepubliceerd door het IOM, de Canadese werk-groep en Fukuda et al. […] Hoewel het IOM een nieuwe naam heeft gesuggereerd (“systemic exertion intolerance disease”, SEID), blijven we de term “M.E./CVS” gebruiken. De gemiddelde leeftijd van de vrouwen met M.E./CVS was 52 (± 2,5) en van de mannen met M.E./CVS 53 (± 2,8). De gemiddelde leeftijd bij aanvang was 33 (± 2,3) voor de vrouwen en 30 (± 2,6) voor de mannen. De gemiddelde ziekte-duur was 17 (± 2,3) jaar voor de vrouwen en 21 (± 3,0) voor de mannen. De Karnofsky-score was 54 (± 3,3) voor de vrouwen, 62 (± 3,2) voor de mannen.

Een homogene metabole respons op heterogene triggers

Hoewel deze studie niet was ontworpen om de rol van triggerende gebeurtenissen te onderzoeken, verzamelden we enkele basis-gegevens. Mogelijke triggerende gebeurtenissen konden in 5 groepen worden ondergebracht: biologische (virale, bakteriële, schimmel- en parasitaire infekties), chemische blootstellingen, lichamelijk trauma, psychologisch trauma en ongekend. […] Meerdere patiënten hadden multipele triggers die samenliepen in hetzelfde jaar. Hoewel biologische triggers het meest courant waren, was er geen enkel infektueus agens of andere stressor statistisch meer prevalent. Uitgebreid testen voor biologische blootstellingen in de controle-groep viel buiten de scope van deze studie.

Ondanks de heterogeniteit van de triggers, was de cellulaire respons van deze omgeving-stressoren bij de M.E./CVS-patiënten homogeen en statistisch robust. Deze gegevens ondersteunen de notie dat het de overkoepelende cellulaire respons is en niet de specifieke trigger die aan de basis ligt van de metabole kenmerken van M.E./CVS.

Metaboloom-studies onthullen een chemische signatuur van M.E./CVS

Er werd multi-variate analyse aangewend om het patroon van de chemische abnormaliteiten bij M.E./CVS te identificeren in vergelijking met de gezonde controles. We vonden dat zowel mannelijke als vrouwelijke patiënten een chemische signatuur hadden die verschillend was van de gezonde controles. […] Er waren 9 verstoorde biochemische mechanismen die gemeenschappelijk waren voor zowel mannen en vrouwen met CVS. 11 mechanismen vertoonden metabolieten-stoornissen die een zekere graad van geslacht-specificiteit vertoonden. De biochemische mechanismen en metabolieten die gewijzigd waren bij M.E./CVS werden gerangschikt en opgelijst […]: de dominante bevinding van de analyse was dat sfingolipiden-abnormaliteiten bijna 50% van al de metabole stoornissen geassocieerd met M.E./CVS (mannen en vrouwen) vormden. Fosfolipiden-abnormaliteiten vormden 26% van de metabole stoornissen bij de vrouwen, 16% bij de mannen.

Metabolieten correleerden met de klinische ernst van M.E./CVS

We onderzochten dan hoe elk van de metabolieten-abnormaliteiten in de top-25 gerelateerd was met de klinische funktionele toestand […]. Elk van deze metabolieten bleek ‘false discovery-rates’ (FDRs [maat voor het aantal foute hypothesen]) van minder dan 10% te vertonen. […] 21 uit de top-25 (84%) onderscheidende metabolieten waren laag. Deze bevindingen waren consistent met de notie dat CVS een gecoördineerde hypometabole toestand is.

Sfingolipiden en glycosfingolipiden waren gedaald

De grootste stoornissen in de chemische signatuur van M.E./CVS kwamen door wijdverspreide daling qua plasma sfingo- en glycosfingolipiden. Er waren 30 molekulaire soorten van sfingolipiden gedaald bij de mannen en 21 bij de vrouwen. Sfingolipiden- en glycosfingolipiden-abnormaliteiten verklaarden 55% van de metabole impact bij de mannen en 44% bij de vrouwen. […] Van de verminderde sfingolipiden waren bij de mannen meer dan 50% (16/30) ceramiden en 47% (14/30) sfingomyeline-soorten. Bij de vrouwen waren 86% (18/21) ceramiden en 14% (3/21) sfingomyelinen. Over het algemeen bleven bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten meer sfingomyeline-soorten binnen de normale waarden dan bij de mannen. Het laag-sfingolipiden profiel bij M.E./CVS lijkt een adaptieve respons te zijn die tegengesteld aan de verhoogde sfingolipiden die worden gezien bij het metabool syndroom [abdominale (centrale) obesitas + hypertensie + verhoogd nuchter bloed-glucose + hoge triglyceriden in het bloed + lage hoge-densiteit lipoproteïnen (HDL)] en de acute ‘cell-danger-response’ (CDR), en uiteindelijk zou dit een fundamentele respons kunnen vertegenwoordigen om de verspreiding van aanhoudende virale en intracellulaire bakteriële infekies tegen te gaan.

Fosfolipiden waren gedaald

Meerdere plasma fosfatidylcholine (PC) fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden] waren verminderd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. In tegenstelling daarmee vonden we dat een zeer specifieke molekulaire soort fosfolipide, PC(18:1/22:6) – die essentieel omega-3 vetzuur docosahexaanzuur (DHA, C22:6) en oleïnezuur (C18:1) omvat – was gestegen. Dit patroon is tegengesteld aan wat wordt gezien in respons op acute infektie, en bij de CDR en het metabool syndroom.

Purinen waren verminderd

Urinezuur in het plasma was verminderd bij mannen met M.E./CVS. Het is het eindprodukt van het purine-metabolisme en een belangrijke anti-oxidante molekule. Plasma adenosine was gedaald bij de vrouwen. Dit wordt geproduceerd uit ATP en ADP dat wordt afgegeven door cel-oppervlakte ectonucleotidasen [bepaalde enzymen die tussenkomen bij het metabolisme van nucleotiden], en door S-adenosylhomocysteïne-hydrolase (SAHH [enzyme]), tijdens acute infektie, inflammatie of stress. De daling qua plasma-purinen bij M.E./CVS is consistent met verminderde synthese en/of turn-over (flux) van ATP & GTP, en de verlaagde reserve-capaciteit die wordt veroorzaakt (ten dele) door een veralgemeende daling van de capaciteit om hoge-energie fosfaat voorraden aan te vullen na inspanning.

Aromatische aminozuur metabolieten van het microbioom waren gedaald

4-hydroxyfenyl-melkzuur (HPLA) in het plasma was gedaald bij de mannen met M.E./CVS. Plasma fenyl-melkzuur (PLA) was gedaald bij de vrouwen. HPLA is een microbioom-metaboliet van tyrosine. PLA is een microbioom-metaboliet van fenylalanine. Dit patroon is ook tegengesteld aan wat wordt gevonden tijdens acute inflammatie en infektie.

Flavine-adenine-dinucleotide (FAD) was verminderd

Plasma FAD was verminderd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Het wordt gesynthetiseerd uit riboflavine (vitamine-B2) en ATP. De gastro-intestinale absorptie, distributie en transporter-gemedieerde opname van FAD worden zorgvuldig gereguleerd. FAD wordt gemobiliseerd uit weefsels, stijgt in het plasma en secretie door de nieren verhoogt bij stress of infektie. FAD is een belangrijke co-factor voor oxidatie van vetzuren en sterol-synthese, en is vereist voor aktivatie en oxidatie van vitamine-B6 (pyridoxine); het liponzuur-metabolisme (E3-subunit) nodig voor pyruvaat, alfa-ketoglutaraat en oxidatie van vertakte-keten aminozuren; vitamine-A aktivatie; 5-methyltetrahydro-foliumzuur synthese; niacine- & NAD-synthese; en glutathion-reductie. Funktionele deficiëntie van riboflavine kan ontstaan door by voeding- en milieu-factoren. […]

Cholesterol en galzuren synthese via het lathosterol-mechanisme was gedaald

Plasma-lathosterol was gedaald bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Totaal plasma cholesterol, desmosterol [voorloper van cholesterol], cortisol en aldosteron waren normaal bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Er worden 2 mechanismen gebruikt om cholesterol te synthetiseren in zoogdier-cellen: het Kandutsch-Russell (K-R) mechanisme (via lathosterol) en het Bloch mechanisme (via desmosterol). Het K-R mechanisme krijgt de voorkeur voor cholesterol-synthese in de hersenen, het hart, skelet-spieren en huid: onder basale omstandigheden 80% van de cholesterol-synthese in deze weefsels. Het Bloch mechanisme krijgt normaal de voorkeur bij bepaalde metabole stress respons weefsels zoals de geslachtsorganen, milt, bijnieren, nieren en vet-weefsel. Onder basale omstandigheden bij gezondheid gebruikt de lever de beide mechanismen bijna evenveel. Onze gegevens zijn consistent met een gedaalde flux door het desmosterol-mechanisme om normale cellulaire waarden voor cholesterol aan te houden. Het desmosterol-mechanisme correspondeert met de stress-induceerbare arm van de cholesterol- en sterolen-synthese.

Chenodeoxycholzuur (CDCA) was gedaald in het plasma van de vrouwen. Het is een primair galzuur dat wordt gemaakt uit cholesterol. Een gedaalde cholesterol-flux kan resulteren in minder substraat voor galzuur-synthese (vereist voor normale vet-vertering en microbioom-signalisering). De afwezigheid van voldoende galzuur kan leiden tot een verlies van de intestinale mucosale integriteit en ‘leaky gut’ […].

Pyrroline-5-carboxylaat en arginine waren verhoogd

Pyrroline-5-carboxylzuur (P5C) was verhoogd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. De aanmaak van P5C is een goed bestudeerde respons op stress in planten en zoogdieren. P5C kan worden aangemaakt via de stress-geïnduceerde oxidatie van [aminozuren] proline en hydroxyproline […]. P5C wordt omgezet tot glutamaat-semi-aldehyde (GSA) en dan tot ornithine onder stress. […] Hydroxyproline was verhoogd bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Het wordt omgezet tot proline, en dan tot P5C & GSA, wat dan wordt aangewend als de voorloper voor de synthese van arginine uit ornithine in het epitheel van de dunne-darm (bij gedaalde calorie- of proteïne-inname. Een ander metabool lot van hydroxyproline is glyoxylaat, wat in mitochondrieën wordt omgezet tot glycine en gemetaboliseerd in peroxisomen tot oxalaat en peroxide voor de cel-verdediging, en aangeboren en antivirale immuniteit.

De arginine-waarden in het plasma waren ook verhoogd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Arginine is een bron van ureum […] maar belangrijker: het is een aktivator van de Nacetylglutamaat (NAG) synthese. NAG is de onontbeerlijke aktivator van carbamoyl-fosfaat-synthetase-I (CPS-I). Dit enzyme is vereist voor de introductie van ammoniak in de ureum-cyclus via de synthese van citrulline uit ornithine en carbamoylfosfaat door ornithine-transcarbamoylase (OTC). De waarden van citrulline, ornithine, proline, glutamine & glutamaat waren allemaal normaal. Bij stress wordt proline uit de collageen-afbraak afgeleid naar de arginine-synthese om stikstof te besparen en verspilling te beperken tijdens periodes van gedaalde calorie- en/of proteïne-inname. […] Een ander metabool lot van arginine is de NO-inhibitor genaamd asymmetrisch dimethylarginine (ADMA). M.E./CVS-patiënten vertoonden geen toenname qua plasma-ADMA. Verhoogd arginine is verbonden met een verminderd risico op infektie na operatieve stress en wordt gebruikt om de antimicrobiële molekule agmatine te synthetiseren bij aktieve infektie.

Vertakte-keten aminozuur metabole intermediairen waren gedaald

2-Hydroxyisocapronzuur (HICA [metaboliet van het aminozuur leucine]) […] was gedaald bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Dit is consistent met verminderde darm-absorptie, verhoogde excretie door de nieren, verhoogde mitochondriale oxidatie of een combinatie van deze 3. HICA heeft antibakteriële en anti-schimmel aktiviteit.

Diagnostische versus gepersonaliseerde metabole stoornissen

We klassificeerden alle metaboliet-abnormaliteiten van elke patient bij één van de of abnormaliteiten die M.E./CVS-patiënten als een groep definieerden of als abnormaliteiten die verschilden van controles maar niet bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose. De M.E./CVS-patiënten hadden gemiddeld 10 (± 1,0) metaboliet-abnormaliteiten die bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose en 30 (± 2,0) metabolieten die abnormaal waren maar niet bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose. Dit betekent dat 75% van de chemische abnormaliteiten die werden geïdentificeerd via metaboloom-analyse gepersonaliseerd waren en 25% leverden diagnostische informatie. Onze klinische ervaring suggereert dat symptoom-verbeteringen op een meer betrouwbare manier kunnen worden bekomen via het aanpakken van de gepersonaliseerde abnormaliteiten i.p.v. uitgaande van een chemische abormaliteit zonder werkelijke meting.

Beoordeling van metaboloom-studie als een diagnostische test voor M.E./CVS

Na het identificeren van meer dan 60 metabolieten die verschilden tussen M.E./CVS en controles bij mannen én vrouwen, wilden we kleinere sets analyten vinden die zouden kunnen worden aangewend voor de diagnose. Stalen van 5-15 van de top-60 metabolieten werden manueel geselekteerd om in grote lijnen meerdere van de discriminerende biochemische mechanismen te onderzoeken. De prestaties van elke klassificerende set metabolieten werd dan getest […]. We vonden dat de exacte specificatie van de metabolieten per klassificerende set flexibel was. […] We vonden dat eens een set van 5-15 analyten werd gevonden, de toevoeging of verwijdering van één of enkele analyten weinig effekt had op de globale kwaliteit van de klassificerende set. Bij de mannen vonden we dat een set van 8 analyten goed werkte; bij de vrouwen was dat een set van 13 analyten. We vonden dat zelfs klassificatie-methodes met een enkel analyt het verrassend goed deed bij deze 84 individuen. Enkelvoudige biomerkers zijn echter biologisch onwaarschijnlijk als diagnostische test voor een complexe ziekte zoals M.E./CVS en die zullen het waarschijnlijk slecht doen bij grotere populaties. Door het gebruik van klassificerende sets bestaande uit 5 tot 15 metabolieten, is de natuurlijke biologische variatie gemakkelijker te klassificeren en is de diagnostische accuraatheid robuster. […]

Metabole gelijkenissen tussen CVS en ‘dauer’

Veel van de mechanismen en metabolieten die abnormaal waren bij M.E./CVS zijn ook gekend als kenmerken van ‘dauer’, een degelijk bestudeerde, langdurende toestand van overleving en volharding die wordt getriggerd door omgeving-stress. Interessant is dat we vonden dat de richting van de M.E./CVS-abnormaliteiten tegengesteld was aan het metabool syndroom en tegengesteld aan de metabole respons op infektie, inflammatie of omgeving-stress die de CDR werd genoemd. Het cholesterol-, fosfolipiden-, sfingolipiden- en purine-metabolisme zijn bv. allemaal gedaald bij M.E./CVS en ‘dauer’ maar zijn gestegen bij het metabool syndroom en de CDR. Deze feiten suggereren dat M.E./CVS een evolutionair bewaarde, genetische gereguleerde, hypometabole toestand is gelijkaardig met ‘dauer’, die overleving en volharding toelaat onder omstandigheden van omgeving-stress maar ten koste van een ernstig beknotte funktie en levenskwaliteit.

Bespreking

Het doelvan deze studie was het testen van de bruikbaarheid van doelgerichte metaboloom-studie bij de diagnose van M.E./CVS. We vonden dat patiënten die voldeden aan de criteria voor M.E./CVS aanbevolen door het IOM, de Canadese werk-groep en Fukuda et al. objectieve chemische abnormaliteiten vertoonden die hen duidelijk onderscheidde van controles. Daarnaast onthulde analyse dat alle 9 mechanismen die bij vrouwen en mannen met M.E./CVS verstoord bleken, gerelateerd waren met de CDR. In tegenstelling met een acute CDR, waarbij plasma-sfingolipiden en -fosfolipiden verhoogd zijn, waren deze mechansimen echter gedaald; wat een adaptatie na blootstelling of mitocellulaire hormese [Mitochondrieën helpen cellen adapteren aan metabole stress uit het verleden via wijzigingen van de cellulaire reaktiviteit. Wanneer zowel mitochondriale als cellulaire mechanismen zich aanpassen, spreekt men van mitocellulaire hormese.] suggereert in respons op pathologisch persistente of terugkerende ‘cell-danger’-signalisering.

Hypometabolisme, ‘dauer’ en M.E./CVS

Onze resultaten tonen dat de metabole kenmerken van M.E./CVS consistent zijn met een hypometabole toestand. Sfingolipiden, glycosfingolipiden, fosfolipiden, purinen, aromatische en vertakte-keten aminozuur metabolieten van het microbioom, FAD en lathosterol waren verminderd. De dalingen van deze metabolieten correleerden met de ziekte-ernst (gemeten via de Karnofsky-scores). Er is veel research gebeurd aangaande het hypometabool fenotype in andere biologische systemen (‘dauer’, diapause [tijdelijke opschorting van de ontwikkeling van het embryo], hibernatie [‘winterslaap’; toestand van inaktiviteit en metbole onderdrukking], estivatie [zgn. ‘zomerslaap’; langdurige sluimer-toestand tijdens een hete of droge periode], torpor [toestand van verminderde fysiologische aktiviteit, gekenmerkt door een sterk verlaagde lichaam-temperatuur, hartslag, ademhaling en stofwisseling], de ‘unfolded’ proteïnen respons [mitochondriale UPRmt; de UPR wordt geaktiveerd in respons op accumulatie van ongevouwen of verkeer opgevouwen proteïnen; de cel evalueert de werking van de mitochondrieën en reguleert de proteïnen-synthese tijdens stress], autofagie [mitochondriale autofagie (elimineert beschadigde mitochondrieën) = mitofagie; strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten], enz.). ‘Dauer’ – betekent ‘persistentie/volharding’ of ‘langdurig’ in het Duits – is één voorbeeld van een goed bestudeerd systeem. Het ontwikkeling-stadium van ‘dauer’ is een hypometabole toestand waar men in staat is efficient te leven door het wijzigen van een aantal basis mitochondriale funkties, brandstof-voorkeuren, gedrag en fysieke kenmerken. Dauer bestaat uit evolutionair bewaarde en synergistische programmas voor metabole en strukturele veranderingen die worden getriggerd bij blootstelling aan nadelige omgeving-omstandigheden. Het in werking treden van ‘dauer’ verleent overleving-voordelen bij zware omstandigheden. Als de ‘dauer’-respons wordt geblokkeerd door bepaalde mutaties (‘dauer’-gebrekkigen), leven dieren kort als ze blootgesteld worden aan omgeving-stress. Deze mutaties tonen dat het latent vermogen om in een hypometabole toestand te komen tijdens een bedreiging uit het milieu, adaptief is, zelfs als dit gaat ten koste van een verminderde optimale funktionele capaciteit. Gelijkaardig met ‘dauer’, lijkt M.E./CVS een hypometabole overleveing-toestand te vertegenwoordigen die wordt getriggerd door omgeving-stress. De metabole kenmerken van M.E./CVS & ‘dauer’ stemmen overéén met dezelfde mechanismen die de acute CDR en het metabool syndroom karakteriseren maar worden geregeld in de tegengestelde richting. Bv.: cholesterol, fosfolipiden en urinezuur zijn dikwijls gestegen bij de acute CDR en het metabool syndroom, maar deze metabolieten waren gedaald bij M.E./CVS-patiënten. Een voorspelling op basis van deze bevindingen is dat M.E./CVS-patiënten meer resistent zullen zijn tegen de constellatie van of hypertensie, dyslipidemie [abnormale hoveelheid van één of meer van de bloed-vetten (= lipiden, cholesterol, triglyceriden)], obesitas en insuline-resistantie die de mortaliteit geassocieerd met het metabool syndroom, maar ten koste van een significante langdurende invaliditeit, pijn en lijden.

Het belang van mitochondrieën, redox en NADPH-metabolisme bij M.E./CVS

Al de metabole abnormaliteiten die we identificeerden bij M.E./CVS werden ofwel direct geregeld via redox of de beschikbaarheid van NADPH. Ca. 60% van het NADPH wordt geproduceerd door het pentose-fosfaat mechansime [genereert naast NADPH ook pentosen (essentiële componenten van nucleotiden en nucleïnezuren)]. De ander 40% wordt aangemaakt via de gecombineerde werking van 5 NADP+ afhankelijke enzymen […]. Elk van deze enzymen heeft minstens één mitochondriale isoform en staat bekend geupreguleerd te zijn onder omstandigheden van omgeving- of ontwikkeling-stress. Er werd aangetoond dat mitochondriaal MTHFD2L [methyleen-tetrahydrofolaat-dehydrogenase 2-achtig proteïne] verantwoordelijk is voor de aanmaak van 20-40% van het cellulair NADPH via de oxidatie van methyleen-tetrahydrofoliumzuur naar 10-formyl-tetrahydrofolaat. Deze gegevens tonen dat folaten belangrijk zijn, niet enkele in methylatie-reakties maar ook bij het reguleren van de intracellulaire redox en NADPH. Er werd een aantal ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in het MTHFD2L gen dat correleert met de CDR en aanmaak van interleukine-1β (IL1β) getriggerd door pokken-vaccinatie. Mitochondriale voorraden van NADPH staan continu in communicatie met NADH-waarden via het enzyme NNT. NADPH werkt daarom als een globale barometer voor de status van de cellulaire brandstof d.m.v. het bekijken van de mitochondriale elektronen (NADH) consumptie en de beschikbaarheid van cytoplasmische reducerende equivalenten zoals NADPH. Als het mitochondriaal elektronen-transport om welke reden dan ook daalt, worden minder zuurstof-molekulen omgezet in water (H2O) door cytochroom-c-oxidase. Als de levering van zuurstof aan de cel onveranderd is, stijgt de concentratie opgelost zuurstof in de cel (zoals water in een kom) in respons op onmiddellijke dalingen van de mitochondriale zuurstof-consumptie. Dit aktiveert een groep enzymen die worden gereguleerd op basis van de beschikbarheid van opgelost zuurstof en als zuurstof-sensors kunnen werken. Sommige daarvan omvatten NADPH-oxidasen zoals Nox4 [NADPH-oxidase type 4] die waterstof-peroxide (H2O2) aanmaakt uit de overmaat zuurstof (O2) [oxidatieve beschermende respons; zie Naviaux’ artikel over de CDR]. Als de voorraden van gereduceerd (NADPH) en totaal (NADPH plus NADP+) laag staan, neigen de synthese van sterolen, vetzuren, proteïnen en nucleotiden naar basale overleving-waarden. Als de NADPH-waarden hoger zijn, verschuift het metabolisme van ‘persistentie’ naar normale cel-funktie en groei, anabole mechanismen worden gestimuleerd, er wordt biomassa gecreëerd en, koolstoffen en elektronen worden als biopolymeren opgeslagen voor cel-groei en herstel, onder de vorm van lipiden, proteïnen, glycogeen, glycanen en nucleïnezuren.

Het is belangrijk te benadrukken dat NADPH niet het probleem noch de oplossing zelf is. Het is een boodschapper en co-factor. NADPH kan niet funktioneren zonder de beschikbaarheid van honderden koolstof-skeletten van het intermediair metabolisme nodig om de boodschap uit te voeren – het signaal dat brandstof-voorraden vol of beperkt zijn, en dat het metabolisme navenant dient te worden aangepast. Specifiek: NADPH kan niet op een eenvoudige manier als voeding-supplement worden toegevoegd om de verschuiving van het metabolisme te geven welke nodig is om van de ‘dauer’ toestand bij M.E./CVS naar een normale gezonde toestand te gaan. Stap-voor-stap verbeteringen qua NADPH-produktie zouden theoretisch kunnen worden ondersteund door interventies gericht op folaat, B12, glycine- & serine-voorraden, en B6-metabolisme, maar de veiligheid en de doeltreffendheid van deze manipulaties dienen echter nog te worden uitgetest in een rigoreus ontworpen klinische proef. Doeltreffende behandelingen voor M.E./CVS zullen uiteindelijk waarschijnlijk worden bekomen via de zorgvuldige aandacht voor voeding, metabolisme, triggers, stressoren en lichamelijke aktiviteit – een geïntegreerd systeem – gecombineerd met een systeem-biologisch begrijpen van de van de CDR en ‘dauer’.

Besluiten

M.E./CVS heeft een chemische signatuur die kan worden geïdentificeerd d.m.v. doelgerichte plasma metaboloom-studies. Analyse toonde een diagnostische accuraatheid die de 90% overschreed. Het patroon en de richting van de veranderingen toonden dat M.E./CVS een geconserveerde, hypometabole respons op omgeving-stress is die gelijkaardig is met ‘dauer’. Slechts ca. 25% van de verstoorde metabolieten die bij elke persoon werden gevonden, waren nodig voor de diagnose van M.E./CVS. Ongeveer 75% van de metaboliet-abnormaliteiten waren uniek voor het individu en bruikbaar bij het begeleiden van gepersonaliseerde behandeling. Het bestuderen bij grotere groepen uit diverse geografische gebieden, en vergelijking met verwante medische aandoeningen (zoals depressie en post-traumatische stress aandoening), zullen nodig zij om de universaliteit en specificiteit van deze bevindingen te valideren. De ontdekking van een objectieve chemische signatuur bij M.E./CVS helpt om de diagnostische onzekerheden weg te nemen, zal klinici ondersteunen om geïndividualiseerde responsen op behandeling te monitoren en zal multi-centrum klinische proeven vergemakkelijken.

————————-

Zoals reeds medegedeeld in de inleiding, financiert de ‘Open Medicine Foundation’ een studie bij een grotere groep patiënten Prof. Ron Davies onderzoekt daarbij zelf de rol van genetica bij de individuele responsen.

Volgens M.E.(cvs)-aktivist Cort Johnson, zou Dr Maureen Hanson (Afdeling Molekulaire Biologie & Genetica, Cornell Universiteit) – die een familielid met M.E.(cvs) zou hebben en in de wetenschappelijke raad van de ‘Simmaron Research Foundation’ zetelt – in een ‘Solve ME/CFS’ webinar onthuld hebben dat ze Naviaux’ kern-bevindingen gerepliceerd heeft; weliswaar in een kleinere studie, enkel bij vrouwen, en met een verschillende een massa-spectrometer en andere behandeling van de stalen. Hanson’s bevindingen zouden opvallende gelijkenissen vertonen met die van Naviaux: 84% van de metabolieten gereduceerd, enkele mechanismen doken ook op (fosfolipiden, purinen, proline, vetzuren), andere – o.a. de sfingolipiden-reducties – dan weer niet. Dat zou te wijten kunnen zijn aan de verschillende methodiek (standardisatie is dus uiterst belangrijk) maar ook aan het feit dat de patiënten uit een andere geografische regio komen… Ze is ook van plan verder te zoeken en richtte daartoe een nieuw M.E.(cvs) research-centrum op (het ‘Centre for Enervating NeuroImmune Disease’ (CEND)’.

juli 6, 2016

Verminderde diversiteit & gewijzigde samenstelling van het darm-microbioom bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 8:35 am
Tags: , , , , , ,

We gaven hier al het artikel ‘Microbioom sekse-verschillen bij M.E.(cvs)’ mee waarin Australische onderzoekers vonden dat specifieke bakterieën verband hielden met ‘CVS’-symptomen. Anderen gaven bewijsmateriaal ter ondersteuning van het idee dat tijdelijke veranderingen qua microbiële samenstelling in de darm en translokatie van darm-microben naar het bloed de symptomen van M.E./CVS kunnen beïnvloeden. Zie ‘Gewijzigd darm-microbioom na inspanning bij M.E.(cvs)’…

In onderstaande studie, gefinancierd door het Amerikaanse ‘National Institutes of Health’, hebben researchers van de Cornell universiteit (o.l.v. Prof. Maureen Hanson) biologische merkers met betrekking tot darm-bakterieën en inflammatie onderzocht in het bloed, en de samenstelling van het microbioom (gezamelijke genomen van de micro-organismen die in een bepaalde omgeving leven) in de stoelgang. Er wordt aangetoond dat het darm-microbioom bij M.E.(cvs)-patiënten anders is (minder diversiteit, meer pro-inflammatoir), dat er sprake is van een biologische abnormaliteit. De researchers zeggen dat ze niet kunnen aangeven of dit oorzaak of gevolg is. De techniek zou een aanvulling kunnen zijn (op bv. de dubbele cardio-pulmonaire inspanning-test) om tot een diagnose te komen en klinici zouden dieet-wijzigingen kunnen overwegen, gebruikmakend van prebiotica (bv. voedingsvezels) of probiotica, om de ziekte te helpen behandelen.” Welke dit zouden kunnen zijn, is niet evident: uit andere studies leerden we al dat er verschillende factoren spelen in een ev. keuze daartoe en dat aanwijzingen niet éénduidig zijn.

De onderzoekers willen ook gaan kijken naar virussen en schimmels in de darm, om te bekijken of één of een combinatie van meerdere, samen met bakterieën, de ziekte kunnen veroorzaken of er toe bijdragen.

————————-

Microbiome Vol 4, page 30 (juni 2016)

Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Ludovic Giloteaux (1), Julia K. Goodrich (1,2), William A. Walters (1,2), Susan M. Levine (3), Ruth E. Ley (1,2) & Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

2 Department of Microbiology, Cornell University

3 Private Practice

Samenvatting

Achtergrond Gastro-intestinale stoornissen behoren tot de symptomen die courant worden gemeld door individuen die de diagnose Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) kregen. Of M.E./CVS geassocieerd is met een gewijzigd microbioom bleef echter onzeker. Hier brachten we de microbiële diversiteit van de darm in kaart via sequentie-bepaling van 16S ribosomaal ribonucleïnezuur (rRNA) genen uit de stoelgang. We onderzochten ook een set inflammatoire merkers in het bloed: C-reaktief proteïne (CRP [biomerker voor systemische inflammatie]), intestinaal vetzuur-bindend proteïne (I-FABP), lipopolysaccharide (LPS), LPS-bindend proteïne (LBP) en oplosbaar CD14 (sCD14 [co-receptor voor de detektie van bakterieel lipopolysaccharide]).

Resultaten We zagen gestegen waarden van enkele bloed-merkers voor microbiële translokatie bij M.E./CVS-patiënten; ook de niveaus van LPS, LBP & sCD14 waren verhoogd. De LBP-waarden correleerden met LPS & sCD14, en de LPS-waarden correleerden met sCD14. Via ‘deep-sequencing’ [meer gesofisticeerde methode voor sequentie-bepaling] van bakteriële rRNA merkers, identificeerden we verschillen tussen de darm-microbiomen van gezonde individuen en M.E./CVS-patiënten. We zagen dat de bakteriële diversiteit verminderd was in de M.E./CVS-stalen in vergelijking meet controles; in het bijzonder een daling van de relatieve aantallen en diversiteit van bakterieën van de stam Firmicutes. In de patiënten-groep vonden we minder diversiteit alsook stijgingen van specifieke soorten waarvan dikwijls wordt gerapporteerd dat ze pro-inflammatoir zijn en vermindering van soorten die frequent als anti-inflammatoir worden beschreven. Via een ‘machine-learning’ [wetenschappelijke discipline over het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen op basis van empirische gegevens (bv. van sensoren of uit databases; ook wel ‘data-mining’] benadering op basis van de gegevens verkregen uit de 16S rRNA en inflammatoire merkers, werden de individuen correct als M.E./CVS geklassificeerd (accuraatheid 82,93%).

Besluiten Onze resultaten wijzen op dysbiose van de darm-microbiomen bij deze ziekte en suggereren verder een verhoogde incidentie van microbiële translokatie [verplaatsing van microben van de darm naar de bloed-circulatie], die een rol kan spelen bij de inflammatoire symptomen van M.E./CVS.

Achtergrond

[…] Veel M.E./CVS-patiënten melden ook gastro-intestinale (GI) symptomen, inclusief maar niet beperkt tot prikkelbare darm syndroom (IBS). Intestinale ongemakken worden ook aangegeven in een overzicht van medicijn-gebruik bij individuen met CVS vergeleken met controles (waarbij significant meer gebruik van antaciden, H2-blokkers en proton-pomp inhibitoren [medicijnen die maagzuur-produktie afremmen] werd gevonden in de M.E./CVS-groep.

De prevalentie van darm-symptomen heeft geleid tot pogingen om de ziekte te behandelen met probiotische orale of rectale supplementen. Een studie [Borody TJ, Nowak A, Finlayson S. The GI microbiome and its role in Chronic Fatigue Syndrome: a summary of bacteriotherapy. ACNEM J (2012) 31: 3-8] rapporteerde verbeteringen bij een meerderheid van patiënten 4 weken na bakteriotherapie (rectaal infuus met 13 soorten darm-bakterieën), maar het aantal met een langdurige respons was echter niet goed gedocumenteerd. In 2 kleine studies werden marginale verbeteringen qua bepaalde symptomen gemeld na orale probiotica-therapie [Sullivan A, Nord CE, Evengard B. Effect of supplement with lactic-acid producing bacteria on fatigue and physical activity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Nutr J (2009) 8: 4 /// Rao AV, Bested AC, Beaulne TM, Katzman MA, Iorio C, Berardi JM et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of Chronic Fatigue Syndrome. Gut Pathog (2009)1: 6].

Twee rapporten suggereren gewijzigde darm-microbiomen bij M.E./CVS-patiënten. Gebruikmakend van culturen beschreven onderzoekers [Sheedy JR, Wettenhall RE, Scanlon D, Gooley PR, Lewis DP, McGregor N et al. Increased D-lactic acid intestinal bacteria in patients with Chronic Fatigue Syndrome. In Vivo (2009) 23: 621-8] hogere waarden qua D-melkzuur producerende Enterococcus & Streptococcus soorten bij M.E./CVS-patiënten vs. controles. Noorse M.E./CVS-patiënten en gezonde controles bleken verschillen te vertonen qua samenstelling van darm-microbiomen [studie door R.E.D. Laboratories]. Het is goed gedocumenteerd dat darm-microbiomen een significante impact hebben wat betreft pathologische intestinale aandoeningen zoals ulceratieve colitis (UC), ziekte van Crohn (CD) en systemische ziekten zoals diabetes. Omwille van het frequent voorkomen van of GI-stoornissen, alsook eerdere rapporten over abnormaliteiten, onderzochten we de diversiteit en samenstelling van darm-microbiomen bij M.E./CVS-patiënten in vergelijking met gezonde individuen.

Samen met GI-symptomen, lijken individuen met M.E./CVS zowel immuun-aktivatie en immuun-dysfunktie te vertonen. Vele van de courante symptomen die door M.E./CVS-patiënten worden gerapporteerd, zijn karakteristiek voor inflammatoire ziekten. De meeste rapporten met betrekking tot cytokine-waarden bij M.E./CVS-patiënten vs. controles zijn eerder beperkt en tegenstrijdig, maar verscheidene artikels – op basis van een 51-plex cytokine-test – geven abnormale immuun-signaturen in plasma en cerebrospinaal vocht [Hornig M, Gottschalk G, Peterson DL, Knox KK, Schultz AF, Eddy ML et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol Psychiatry (2016) 21: 261-9 /// Hornig M, Montoya JG, Klimas NG, Levine S, Felsenstein D, Bateman L et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv (2015) 1] aan. Abnormale immuun-aktivatie kan worden veroorzaakt door translokatie van microben uit een geïnflammeerde darm. Een rapport gaf verhoogde IgA & IgM tegen lipopolysaccharide (LPS) aan in het serum van M.E./CVS-patiënten [Maes M et al.]. Daarom maten we de plasma-waarden van LPS & LPS-bindend proteïne, alsook van de LPS/LBP receptor sCD14. We onderzochten ook de waarden van C-reaktief proteïne, een inflammatoire merker, en I-FABP als een merker voor de integriteit van het gastro-intestinaal kanaal.

Objectieve molekulaire merkers voor een diagnose van M.E./CVS ontbreken. We onderzochten de waarden van plasma-merkers en microbioom-samenstelling bij zieke en gezonde individuen om te bepalen of de gegevens M.E./CVS  zouden kunnen voorspellen.

Resultaten

Karakteristieken van de studie-populatie

[…] Fukuda diagnostische criteria. […] 48 patiënten & 39 controles […], 34 M.E./CVS-patiënten en 7 controles rapporteerden zelf gastro-intestinale stoornissen (constipatie, diarree of intestinaal ongemak). […] Van de 48 M.E./CVS-patiënten in de studie waren er 19 die een graduele aanvang en 25 die een plotse aanvang aangaven. […]

Metingen van microbiële translokatie merkers geven microbiële translokatie aan

We kwantificeerden de waarden in het plasma van hsCRP, lipopolysacchariden (LPS; merker voor microbiële translokatie (MT) en plasma intestinaal vetzuur-bindend proteïne (I-FABP; merker voor schade aan het gastro-intestinaal kanaal) in beide groepen. […] De waarden van hsCRP waren hoger in de M.E./CVS-populatie t.o.v. gezonde controles (1,38 & 1,21 mg/l, respectievelijk) maar het verschil was niet statistisch significant (P = 0.15).

M.E./CVS-patiënten hadden significant hogere plasma LPS-waarden dan gezonde individuen (mediaan: M.E./CVS 119,43 pg/ml vs. controles 74,74 pg/ml, P < 0.0005). De mediane plasma I-FABP waarde was 341,9 pg/ml in de M.E./CVS-groep & 301 pg/ml in de gezonde groep. Hoewel de mediane I-FABP waarden in de M.E./CVS-groep hoger was dan in de gezonde groep, was het verschil niet statistisch significant (P = 0.27).

Om meer informatie te verkrijgen omtrent chronische LPS-stimulatie in vivo, maten we in het plasma ook sCD14 en LBP, wat door gastro-intestinale en lever epitheliale cellen wordt geproduceerd. Gestegen LPS in de circulatie bevordert de lever-synthese van LBP, een plasma-proteïne dat de binding van LPS op CD14 bevordert. […] De mediane plasma sCD14-concentratie van de M.E./CVS-cohort was 1,97 µg/ml en de mediane plasma LBP-concentratie was 17,68 µg/ml. Deze waarden waren significant verschillend van deze van gezonde vrijwilligers (1,36 µg/ml; P < 0.0005 & 12,32 µg/ml; P < 0.0005, respectievelijk).

Daarna analyseerden we de verbanden tussen de biomerker-metingen in de M.E./CVS-populatie. De plasma LPS-waarden correleerden positief met die van sCD14 & LBP […], consistent met stimulatie van de sCD14-produktie door LPS in vivo. In Daarnaast vonden we een sterke significante correlatie tussen plasma sCD14 & hsCRP en sCD14 & LBP; hoge waarden qua sCD14 bleken geassocieerd met hoge hsCRP […] & LBP […]. We analyseerden ook of enterocyten [darmcellen] -schade (I-FABP waarden) geassocieerd was met de voorgestelde microbiële translokatie merkers LPS, sCD14 & LBP. We vonden geen verband tussen I-FABP & LPS-waarden […], I-FABP & sCD14-waarden […] of I-FABP & LBP-waarden […].

Stoelgang-microbiomen van M.E./CVS-patiënten vertonen gereduceerde diversiteit en verschillende samenstelling t.o.v. gezonde controles

De sequentie werd bepaald […] van 16S rRNA genen [16S ribosomaal RNA is een onderdeel van ribosomen (plaatsen waar de proteïne-synthese geschiedt); de genen die er voor coderen worden gebruikt om evolutie en verwantschap van organismen te bestuderen, omwille van de trage (genetische) evolutie in dit gebied] uit faecale stalen van M.E./CVS-patiënten (n = 48) en gezonde individuen (n = 39). […] [Analyse van de gegevens toonde] Een statistisch verschil qua diversiteit tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde individuen (P = 0.004).

We onderzochten het aantal “geobserveerde soorten” [het aantal OTUs – ‘operationele taxonomische eenheden’ op basis van DNA-sequentie gegevens; taxonomie = het beschrijven, benoemen en indelen van organismen en met hun onderlinge relaties], en de diveristeit-parameters ‘evenness’ [gelijkmatigheid (van soorten in een ‘gemeenschap’)] en ‘richness’ [totaal aantal soorten in een data-set] in de 2 groepen. M.E./CVS-stalen hadden een significante algemeen lagere microbiële diversiteit, met een lagere ‘evenness’ […] en lagere ‘richness’ […].

[…] Binnen de microbiële gemeenschap-cluster lijkt er geen duidelijk verschil te zijn qua ‘beta-diversiteit’ [‘echte’ diversiteit; differentiatie van diversiteit voor verschillende milieus] tussen de M.E./CVS-groep en gezonde controles […]. Geen enkele van de geteste parameters (geslacht, BMI of klinische gegevens) onthulde het bestaan van clusters (gegevens niet getoond). Omdat ‘beta-diversiteit’ clustering toont hoe ongelijk de globale gemeenschap-struktuur is tussen stalen, clusteren deze wellicht niet op een manier die de verschillen gedetekteerd op OTU-niveau of de algemene ‘alfa-diversiteit’ [de gemiddelde soorten-diversiteit in een bepaald milieu] binnen groepen weerspiegelt.

De globale microbiële samenstelling voor M.E./CVS en controles verschilde op stam- en familie-niveau, hoewel geen van deze verschillen statistisch significant waren na correctie. De 2 grootste stammen in elke set (gezonden en M.E./CVS-patiënten) waren Firmicutes & Bacteroidetes. Bij gezonde individuen correspondeerde dit met 46 & 45% respectievelijk […]. Proteobacteria vormden de volgende grootste stam (3,6%), met Verrucomicrobia & Actinobacteria in relatief lage aantallen (2,1 & 1,6%, respectievelijk). Op stam-niveau was het aantal Bacteroidetes vergelijkbaar (52%) in beide sets. M.E./CVS-stalen vertoonden lagere relatieve aantallen Firmicutes (35%) en hogere relatieve aantallen Proteobacteria (8%), bijna volledig te wijten aan een tweevoudige toename van de Proteobacteria-familie Enterobacteriaceae (6 vs. 3% voor M.E./CVS en gezonden, respectievelijk). Binnen de Firmicutes waren, op familie-niveau, de Ruminococcaceae lager in de M.E./CVS-stalen (16 vs. 11% voor M.E./CVS en gezonden, respectievelijk), terwijl de Lachnospiraceae gelijkaardig waren in beide sets (16%). Er werden enkele verschillen genoteerd tussen gevallen en controles qua leden van de familie Bacteroidetes, nl. Bacteroidaceae (35 vs. 43%), Rickenellaceae (3 vs. 4%) & Prevotellaceae (3,2 vs. 0,7%). Tenslotte waren, binnen de Actinobacteria, de Bifidobacteriaceae lager in de M.E./CVS-stalen (1 vs. 0,5%).

Op OTU-niveau bleken 40 OTUs significant verschillend na correctie. De meerderheid daarvan behoordetot de Firmicutes stam, inclusief leden van de Ruminococcaceae familie (zoals Oscillospira sp., Faecalibacterium prausnitzii & Ruminococcus sp., en leden van de Lachnospiraceae, zoals Coprococcus sp.). Andere OTUs omvatten leden van de Actinobacteria (zoals Eggerthella lenta & Collinsella aerofaciens).

Deze significante verschillen werden verder bevestigd [via andere analyses]. […] M.E./CVS-microbiomen waren aangerijkt met een niet-geklassificeerd lid van de Desulfohalobacteriaceae en geslachten van de Firmicutes stam (Oscillospira, Lactococcus, Anaerotruncus & Coprobacillus, en Eggerthella, een lid van de Actinobacteria stam (P < 0.05). 18 geslachten waren aangerijkt in de controle-groep vergeleken met de M.E./CVS-groep: de leden behoorden voornamelijk tot de Firmicutes stam. We zagen dat leden van de Ruminococcaeae & Bifidobacteriaceae (Faecalibacterium & Bifidobacterium, respectievelijk), significant verhoogd waren bij gezonde individuen (P = 0.03 & 0.04, respectievelijk).

Klassificeren van individuen bij patiënten of controles op basis van inflammatoire merkers en microbioom-gegevens

D.m.v. een ‘machine-learning’ benadering, konden stalen meestal succesvol geklassificeerd worden bij gezonde of M.E./CVS-groepen,; waarbij het grootste deel van de stalen correct werd geklassificeerd wanneer de gegevens van de microbe-geslachten samen met de inflammatoire merkers werden gebruikt voor de analyse. [Naar gelang de gebruikte methode 80 tot 82%.] […] Het verwerken van de gegevens van de microbiële sequentiebepaling zonder het opnemen van BMI en waarden van inflammatoire merkers resulteerde in 70, 75 & 72% correcte klassificatie (geslacht, soort en OTU, respectievelijk).

Bespreking

Onze analyse van het microbioom suggereert dat het gastro-intestinaal kanaal van M.E./CVS-patiënten een pro-inflammatoire omgeving is. Dit milieu zou schade kunnen veroorzaken aan het intestinaal epitheel [‘dekweefsel’; beschermt het weefsel tegen de buitenwereld], waardoor microbiële translokatie (MT) verhoogt en vervolgens een immuun-respons triggert. Er werd al gedocumenteerd dat ontwrichting van de funktie van de mucosale barrière [mucosa = slijmvlies; dunne laag cellen die slijm produceert ter bescherming] optreedt bij M.E./CVS (aangetoond door de verhoogde serum-concentraties IgA & IgM tegen LPS van Gram-negatieve darm-bakterieën [Maes M et al.]). Onze gegevens ondersteunen de hypothese van verhoogde MT in de M.E./CVS-groep door (i) significant gestegen waarden van plasma-LPS en (ii) significant hogere waarden van sCD14 & LBP, indicatoren voor directe LPS-stimulatie. Verhoogde doorlaatbarheid van de darm en verhoogde LPS-waarden werden ook al beschreven bij patiënten met lever-ziekten, alkoholische en niet-alkoholische steatohepatitis [‘vette lever’; veroorzaakt levercirrose], bij chronische HIV-infektie en bij inflammatoire darm ziekte (IBD), wat suggereert dat een aktivatie van pro-inflammatoire en endotoxine-signalisering belangrijk kan zijn voor ziekte-progressie bij M.E./CVS. Bijgevolg kunnen hoge plasma LPS-waarden bij M.E./CVS-het resultaat zijn van een verhoogde produktie van endotoxine door veranderingen in de darm-microbiomen. Verder observeerden we dat sCD14-waarden positief correleerden met de waarden van LPS, LBP & hsCRP. Als er schade aan de darm-mucosa is, kan microbiële translokatie verhogen, met als gevolg wijzigingen in de antimicrobiële regulatoren en ontregeling van het aangeboren immuunsysteem.

Als merker is LPS beperkt tot bepaalde microben, aaangezien het enkel anwezig is in Gram-negatieve bakterieën. sCD14 wordt hoofdzakelijk geproduceerd door macrofagen en hepatocyten in respons op LPS maar wordt ook gestimuleerd door andere bakteriële en virale agentia. LBP werkt als een co-factor samen met sCD14 en wordt constitutief [niet bepaald door één of andere behoefte] gesynthetiseerd in hepatocyten ter herkenning van LPS dat wordt afgegeven in de bloedbaan maar verscheidene inflammatoire factoren zoals IL-22, IL-6 & TNF-α kunnen zijn expressie induceren. Niettemin vonden we significant meer patiënten met verhoogde waarden van deze biomerkers in vergelijking met de gezonde groep, wat suggereert dat meer MT optreedt bij mensen met M.E./CVS.

Gebruikmakend van aërobe en anaërobe cultuur-methodes, hebben Australische onderzoekers voor het eerst bewijs geleverd van veranderde faecale microbiomen M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde individuen [Butt HL, Dunstan R et al. Bacterial colonosis in patients with persistent fatigue. In Proceedings of the AHMF international clinical and scientific conference Sydney, Australia: AHMF 2001]. Vervolgens verkregen anderen [Sheedy et al.; zie hierboven] (via cultuur-methodes en metaboliet-analyse) informatie betreffende het faecal microbioom in groepen patiënten en gezonde controles. Beiden vonden dat D-melkzuur producerende Enterococcus & Streptococcus soorten sterk over-vertegenwoordigd waren bij M.E./CVS-patiënten en dat bij de anaërobe bakterieën, Prevotella een bakterieel geslacht was dat in overmaat voorkwam bij individuen met M.E./CVS.

Een studie [R.E.D. Laboratories] onderzocht de aanwezigheid van specifieke veranderingen in de darm-microbiomen bij M.E./CVS-patiënten uit België & Noorwegen. [De methodiek was enigszins anders dan deze die her werd gebruikt.]. Onze analyse toonde dat de diversiteit binnen het staal lager is bij de M.E./CVS-monsters vergeleken met controles. [Dit was bij de R.E.D. Laboratories studie niet het geval, waarschijnlijk door de andere technologie.] Een lagere ‘richness’ werd ook gezien in ongezonde of inflammatoire aandoeningen en bleek geassocieerd met IBD, necroserende enterocolitis en grotere abdominale ongemakken bij patiënten met voedsel-intoleranties.

Ongeacht de ziekte-toestand vertegenwoordigden bakterieën die behoren tot de Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria & Actinobacteria stammen de overgrote meerderheid van de geïdentificeerde sequenties. We zagen minder leden van de dominante stam Firmicutes, wat ook herhaaldelijk werd opgemerkt bij patiënten met de ziekte van Crohn. Proteobacteria kwamen meer voor bij M.E./CVS-patiënten dan bij controles, wat ook wordt gezien bij IBD-patiënten. In een darm met inflammatie, geven infiltrerende macrofagen en neutrofielen van zwavel en stikstof afgeleide metabolieten (zoals tetrathionaat and nitraat) af. Opportunistische leden van de Proteobacteria kunnen profiteren van de inflammatoire respons van de gastheer […] om energie te genereren en hun eigen groei in de darm te bevorderen. We hebben geen informatie verzameld betreffende het dieet van de patiënten en we weten dus niet of deze factor de samenstelling en/of metabolisme van de microbiomen in onze groepen zou kunnen hebben beïnvloed.

We zagen significant lage aantallen uit het geslacht Faecalibacterium, een lid van de Ruminococcaceae, bij de M.E./CVS-populatie. Faecalibacterium prausnitzii, dat een anti-inflammatoir proteïne produceert, bv. is gedaald bij in M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Dit geslacht is ook verminderd bij IBD en ulceratieve colitis, en er werd aangetoond dat dit anti-inflammatoire eigenschappen in vitro en in vivo heeft. Faecalibacterium behoort tot een groep van butyraat (korte-keten vetzuur met gekende anti-inflammatoire eigenschappen en beschermende werking voor de darm) -producenten. Individuen met with IBD & IBS vertonen een gebrek aan butyraat-producerende bakterieën en lagere warden qua butyraat in hun darm, wat verschillende processen inclusief hormoon- & cytokine-secretie (bv. leptine, IL-10) en aktivatie van immune/inflammatoire responsen moduleert.

We vonden ook een daling qua Bifidobacterium, die reeds werd geobserveerd bij IBS, IBD en type-II diabetes. Bifidobacteria zijn een groep melkzuur-producerende bakterieën die veel worden gebruikt als probiotica [= micro-organismen waaraan een gezondheidsbevorderende werking wordt toegeschreven] en als doelwit voor prebiose [prebiotica = voeding-ingrediënten, die selektief de groei en/of de aktiviteit van één of meerdere soorten bakterieën in de darm stimuleren, en daardoor de gezondheid van de gastheer bevorderen]. Behandeling met Bifidobacterium infantis 35624 bleek CRP-waarden te doen dalen in een groep M.E./CVS-patiënten [Groeger D, O’Mahony L, Murphy EF, Bourke JF, Dinan TG, Kiely B et al. Bifidobacterium infantis 35624 modulates host inflammatory processes beyond the gut. Gut Microbes (2013) 4: 325-39].

We gebruikten een gecontroleerde ‘machine-learning’ benadering om de ziekte-toestand te helpen voorspellen basis van de microbioom-sequentie gegevens-sets. Hiermee waren we in staat ongelabelde stalen met een bepaalde accuraatheid te klassificeren. […] Een dergelijke benadering kan daarom dienen als een aanvulling op andere niet-invasieve diagnose-methodes of als een initiële diagnose om te bepalen of een individu misschien M.E./CVS heeft. Omdat dit hier een betrekkelijk kleine groep betreft, zal een grote groep individuen met M.E./CVS en gezonde controles nodig zijn om te verifiëren of de klassificatie zijn accuraatheid behoudt in een onafhankelijke studie, om zo tot een formele diagnostische klinische toepassing te komen.

Besluiten

Alles te samen suggereren onze resultaten een aanhoudende beschadiging aan de darm-mucosa, wat leidt tot verhoogde microbiële translokatie bij M.E./CVS, wat op z’n beurt de anti-microbiële regulatoren zou kunnen veranderen en het aangeboren immuunsysteem ontregelen. Er werden verschillen qua darm-microbiomen – wat betreft relatieve aantallen van specifieke geslachten – van gezonde individuen en patiënten met M.E./CVS geïdentificeerd. Er is niet één enkelvoudige precieze verandering van de darm-microbiomen van alle M.E./CVS-patiënten die we onderzochten maar onze gegevens komen samen in een ondersteuning van het concept van een minder diverse en onstabiele gemeenschap van bakterieën bij deze aandoening. Het beklemtoont de associatie van specifieke taxonomische groepen bakterieën bij M.E./CVS en de identificatie van de onderliggende rol van deze veranderde commensale darm-microbiomen [onschadelijk gast-organismen] zou kunnen leiden tot nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën die de klinische uitkomst zouden kunnen verbeteren. Toekomstige studies zouden dan bijkomende molekulaire merkers kunnen blootleggen die kunnen worden gecombineerd met informatie over het darm-microbioom om de sensitiviteit en specificiteit van of M.E./CVS diagnostische testen te verhogen.

De oorzaak van M.E./CVS is niet gekend maar darm-dysbiose kan bijdragen tot enkele van de symptomen en hun ernst. Therapeutische interventies gericht op het reduceren van lokale inflammatie, herstel van de immuniteit en integriteit van het gastro-intestinaal kanaal, en het modificeren van het intestinaal microbioom kan M.E./CVS-symptomen verbeteren in een aantal patiënten.

Methodes

[…]

juni 24, 2016

Mogelijke biomerker voor vermoeidheid: oxidatieve stress & anti-oxidatieve aktiviteit

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 2:41 pm
Tags: , , , ,

Biol Psychol. 2016 [pre- print]

A potential biomarker for fatigue: oxidative stress and anti-oxidative activity

Sanae Fukuda (a,b,c), Junzo Nojima (d), Yukari Motoki (d), Kouzi Yamaguti (c,e), Yasuhito Nakatomi (c,e), Naoko Okawa (a), Kazumi Fujiwara (a), Yasuyoshi Watanabe (b,c), Hirohiko Kuratsune (a,b,c,e)

(a) University of Kansai Welfare Sciences, Kashiwara, Osaka 582-0026, Japan

(b) RIKEN Centre for Life Science Technologies, Kobe, Hyogo 650-0047, Japan

(c) Department of Physiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka 545-8585, Japan

(d) Department of Laboratory Science, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Yamaguchi, 755-8505, Japan

(e) Department of Endocrinology, Metabolism and Molecular Medicine, Osaka City University Graduate School of Medicine, Osaka 545-8585, Japan

Samenvatting

We probeerden te bepalen of oxidatieve stress en anti-oxidatieve activiteit kunnen fungeren als biomerkers die patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kunnen onderscheiden van gezonde vrijwilligers, bij acute & sub-acute vermoeidheid en rust. We berekenden de oxidatieve stress index (OSI) uit ‘reactive oxygen metabolites-derived compounds’ [molekulen afgeleid van reaktieve zuurtsof metabolieten] (d-ROMs) en het ‘biological anti-oxidant potential’ [biologisch anti-oxidant vermogen] (BAP). We bekeken wijzigingen qua d-ROMs, BAP & OSI bij acute en sub-acute vermoeidheid in 2 gezonde groepen, en vergeleken de waarden in rust tussen patiënten met CVS (diagnose d.m.v. de Fukuda 1994 criteria) en een andere groep gezonde controles. Na acute vermoeidheid bij gezonde controles, waren de d-ROMs en OSI verhoogd, en het BAP gedaald. Hoewel d-ROMs en OSI significant hoger waren na sub-acute vermoeidheid, daalde het BAP niet. Bij rust waren de d-ROMs hoger, de OSI hoger en het BAP lager bij CVS-patiënten dan bij gezonde vrijwilligers, maar de d-ROMs en de OSI lager vergeleken met sub-acute controles. De BAP-waarden verschilden niet significant tussen CVS-patiënten en controles in de sub-acute conditie. De waarden waren echter significant hoger dan in rust voor de controles. Zodoende zouden metingen van de oxidative stress (d-ROMS) en anti-oxidatieve aktiviteit (BAP) nuttig kunnen zijn voor het onderscheiden van gezonde mensen en CVS-patiënten wat betreft acute & sub-acute vermoeidheid en rust, of voor het evalueren van vermoeidheid-niveaus bij gezonde mensen.

Inleiding

[…] inflammatoire en oxidatieve & nitrosatieve stress (IO&NS) zouden vermoeidheid en somatische symptomen kunnen genereren. […] Symptomen bij niet-obese CVS-patiënten met een normale bloeddruk bleken te correleren met oxidatieve stress, gemeten via isoprostaan-waarden [Kennedy G., Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radical Biology and Medicine (2005) 39: 584-589]. Ook verlaagde waarden qua anti-oxidatieve aktiviteit, coenzyme-Q10, vitamine-E en zink werden bij CVS gerapporteerd. [Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants & Redox Signaling (2013) 19: 1855-1860 /// Miwa K & Fujita M. Fluctuation of serum vitamin E (alpha-tocopherol) concentrations during exacerbation and remission phases in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Heart Vessels (2010) 25: 319-323]

Vermoeidheid wordt ook frequent ervaren door gezonde individuen (14,3% tot zelfs 60% in de gezonde Japanese bevolking). Er werd gerapporteerd over de impact van oxidatieve stress op vermoeidheid bij gezonde mensen. De totale anti-oxidatieve aktiviteit bleek te verhogen na een inspanning. Isoprostanen en glutathion/geoxideerd glutathion bleken te correleren met uitputting door over-training en er werd een stijging qua 8-hydroxydeoxyguanosine [8-OH-dG; een merker voor oxidatieve schade aan DNA] gemeld die gedurende 2 tot 3 dagen aanhield na slaap-onthouding. Job-stress en examens zijn psychologische omstandigheden die leiden tot fysieke vermoeidheid. 8-OHdG en malondialdehyde [MDA; merker voor oxidatieve stress] bleken te stijgen naar mate de job-stress en subjectieve stress. Daarnaast werd aangetoond dat de waarden van proteïne-carbonylen, MDA en 8-OH-dG allemaal stijgen tijdens en na examen-stress.

De evaluatie van het simultaan en accuraat meten van biomerkers voor oxidatieve stress en anti-oxidante aktiviteit is belangrijk omdat het toelaat meerdere vermoeidheid-condities bij gezonden mensen te differentiëren van CVS. Sommige biomerkers voor oxidatieve stress kunnen niet accuraat worden gemeten in vivo omdat reaktieve zuurstof soorten een kort biologisch half-leven hebben en zeer reaktief zijn. Diacron-Reaktieve Zuurstof Metabolieten (d-ROMs) zouden in tegenstelling daarmee een goede biomerker kunnen zijn omdat ze het niveau hydroperoxiden [afgeleiden van waterstof-peroxide] aangeven, welke relatief stabiele reaktieve zuurstof metabolieten zijn. Het doel van deze studie was te bepalen of dROMs en BAP biomerkers zijn die CVS-patiënten onderscheiden van gezonde vrijwilligers die acute en sub-acute vermoeidheid ervaren, en in rust.

Methodes

[…]

CVS-patiënten

121 patiënten (76 vrouwen & 45 mannen; gemiddelde leeftijd 37,3 ± 8,36 jaar) […] CVS-diagnose door specialisten op basis van de 1994 CDC klinische criteria. […] Exclusie-criteria: (1) neuro-inflammatoire of immune aandoeningen […]; (2) elke aktieve medische aandoening die de aanwezigheid van chronische vermoeidheid kan verklaren; (3) de aanwezigheid van elke ziekte die teruggekeerd of niet volledig opgelost kan zijn (bv. kwaadaardige ziekten of chronische gevallen van infektie met hepatitis-B or -C; (4) misbruik van alkohol of andere drugs; (5) ernstige zwaarlijvigheid (BMI ≥ 30; (6) zwangerschap; of (7) lactatie.

De aanwezigheid van majeure depressie, fibromyalgie of somatoforme aandoening [lees ‘Risico op mis-labeling als mentaal ziek door ‘somatic symptom disorder’ in DSM-5] was geen criterium voor exclusie. […] 88 patiënten namen anti-oxidanten (bv. vitamine-C of coenzyme-Q10). 71 patiënten namen psychotrope or slaap-medicatie. […] 66 patiënten hadden co-morbide psychiatrische aandoeningen […]. 53 patiënten hadden co-morbide fibromyalgie (FM) […].

Gezonde vrijwilligers

Er namen 3 groepen vrijwilligers (HVs) deel aan het experiment. De eerste groep (HV1) onderging acute stress en omvatte 12 gezonde vrouwelijke studenten (gemiddelde leeftijd 20,4 ± 0,5 jaar). Deze namen geen medicijnen of supplementen. De tweede groep (HV2) nam deel in de sub-acute vermoeidheid conditie en omvatte and 24 computer-programmeurs (12 mannen & 12 vrouwen, gemiddelde leeftijd 36,7 ± 8,8 jaar). De derde groep (HV3) nam deel in de rust-conditie en omvatte 656 vrijwilligers (274 mannen & 382 vrouwen, gemiddelde leeftijd 40,8 ± 12,4 jaar) zonder abnormale resultaten op enige belangrijke klinische laboratorium-test (hemoglobine, c-reaktief proteïne, albumine, triglyceriden, glucose, AST, ALT, röntgen-onderzoek of cholesterol) en een BMI niet ≥ 28. Uit deze 656 selekteerden we een groep van 121 die matchten qua leeftijd en geslacht met CVS-patiënten (76 vrouwen & 45 mannen; gemiddelde leeftijd 37,3 ± 8,43 jaar). […]

Studie-ontwerp

We bepaalden biomerkers voor oxidatieve stress en anti-oxidatieve activiteit bij patiënten met CVS en in de 3 groepen gezonde vrijwilligers. Er werden metingen uitgevoerd bij CVS-patiënten in rust, en bij gezonde vrijwilligers tijdens een acute experimentele taak, de sub-acute vermoeidheid conditie en bij rust. We definieerden de sub-acute vermoeidheid conditie als vermoeidheid die gepaard gaat met ernstig over-werk van vastgelegde duur.

De acute conditie

[…] (HV1) een 3-uur durende mentaal stresserende reken-taak op computer. […] Voor en na werd bloed afgenomen voor bepaling van serum-waarden d-ROMs en biologisch anti-oxidant vermogen (BAP). Vermoeidheid werd bepaald d.m.v. een visuele analoge schaal (VAS) voor en na de taak.

De sub-acute conditie

(HV2) Computer-programmeurs werkten gedurende 2 weken aan nieuwe computer-systemen op een afdeling van het ziekenhuis-laboratorium. Ze werkten van 8:00 a.m. tot 6:00 p.m. aan het nieuw systeem en programmeerden dan het systeem van 6:00 p.m. gedurende de nacht. Ze vertoonden geen vermoeidheid-symptomen en hadden geen abnormale laboratorium-resultaten […] of een BMI ≥ 28. […]

De rust-conditie

HV3 controle-groep en CVS-patiënten […].

Meting van d-ROMs & BAP

Oxidatie en anti-oxidatie aktiviteiten werden simultaan gemeten in het serum. Oxidatieve aktiviteit werd bepaald via het meten van d-ROMs en anti-oxidatieve aktiviteit via het meten van het Biologisch Anti-oxidant Vermogen […]. De concentratie ROMs wordt uitgedrukt in Carratelli Eénheden (1 CARR U = 0,08 mg waterstof-peroxide/dl).

De BAP-test […] geeft de anti-oxidante capaciteit van een serum-staal aan.

[…] We bepaalden de normale referenties voor d-ROMs en BAP bij 312 gezonde controles (164 vrouwen en 148 mannen; gemiddelde leeftijd 36,7 ± 8,8 jaar) die (op basis van een vragenlijst) voldeden aan bepaalde criteria (niet roken of zwaar drinken, niet lijden aan metabool syndroom, niet minder dan een jaar gelden bevallen, geen medicatie nemen of over-werkt zijn, geen abnormale slaap of voeding, en geen vermoeidheid-symptomen) en geen abnormale klinische laboratorium-testen vertoonden […]. De normale referentie-waarden waren […] 286,9 ± 100,2 CARR U (d-ROMs) & 2.541,3 ± 122,0 μmol/l (BAP).

Om een parameter te bekomen die een globale verschuiving naar oxidatieve stress vertegenwoordigt, gebruikten we een oxidatieve stress index (OSI), berekend met de volgende formule: OSI = C × (d-ROMs / BMP), waarbij C een standaardisatie-coefficiënt is om de OSI van de gezonde controles op 1,0 te brengen (C = 8,85 in deze studie). […].

Statistiek

[…]

Resultaten

[…] In de HV1-groep […] na controle voor leeftijd, waren d-ROMs & BAP significant hoger na de taak en de OSI neigde hoger te zijn.

[…] HV2-groep […] na controle voor geslacht en leeftijd, waren d-ROMs & OSI significant hoger na sub-acute vermoeidheid. Geen significante veranderingen qua BAP voor en na de werk-periode van 2 weken.

De d-ROMs, BAP & OSI bij rust van de 656 HVs waren 305,4 ± 109,2 CARR U, 2696,3 ± 398,8 μmol/l & 1,00 ± 0,34, respectievelijk. d-ROMs & OSI van vrouwelijke vrijwilligers lagen significant hoger dan bij mannen (d-ROMs: 318,3 ± 52,6 CARR U vs. 287,4 ± 52,3 CARR U, P < 0.001; OSI: 1,04 ± 0,16 vs. 0,95 ± 0,18, P < 0.001).

d-ROMs & OSI stegen significant met de leeftijd, terwijl de BAP-waarden daalden met de leeftijd. Deze met leeftijd gerelateerde verschillen waren niet significant beïnvloed door geslacht.

[…] d-ROMs & OSI waren significant hoger bij patiënten met CVS vergeleken met de voor leeftijd/geslacht gematchte HV3-groep. d-ROMs & OSI van werkkrachten die sub-acute vermoeidheid ervaarden (HV2-groep) waren echter zelfs hoger dan die van de CVS-patiënten in rust. De BAP-waarden van CVS-patiënten in rust waren niet significant verschillend van die van de HV2-groep in rust na sub-acute vermoeidheid, maar lagen significant lager dan die in rust van de voor leeftijd/geslacht gematchte HV3-groep.

Bespreking

Na het in acht nemen van de leeftijd, stegen d-ROMs & OSI en daalde het BAP na acute vermoeidheid. Na sub-acute vermoeidheid (2 weken overwerkt), stegen d-ROM waarden maar het BAP steeg enkel in één geval (rekening houdend met leeftijd en geslacht). Patiënten met CVS vertoonden hogere warden qua d-ROMs & OSI en lagere BAP-niveaus in rust vergeleken met voor leeftijd/geslacht gematchte controles. In tegenstelling daarmee: wanneer patiënten werden vergeleken met werkkrachten die sub-acute vermoeidheid ervaarden, waren de d-ROMs & OSI hoger bij de werkkrachten. BAP-waarden verschilden niet tussen CVS-patiënten en personen die sub-acute vermoeidheid ervaarden, maar vergelekenn met de patiënten, waren deze significant hoger bij voor leeftijd/geslachte gematchte controles. Het nemen van anti-oxidanten, medicatie, of co-morbiditeit met FM of psychiatrische ziekten had geen effekt op de waarden van oxidatieve merkers bij CVS-patiënten.

Na de acute vermoeidheid, stegen d-ROMs en daalde het BAP t.o.v. de waarden vóór de taak. Er werd een afname van d-ROMs aangetoond 2 uur na het experiment (gegevens hier niet getoond). Tijdens de acute vermoeidheid conditie, stegen oxidatieve stress en anti-oxidatieve aktiviteit simultaan, en herstelden dan onmiddellijk tot voorafgaande niveaus binnen 2 uur. Veranderingen qua d-ROMs & BAP werden eerder gerapporteerd na een fysieke belasting en in dier-modellen voor vermoeidheid. Experimenteel geïnduceerde kortstondige inflammatie had geen impact op plasma oxidatieve stress bij een mentale belasting-test. Daarom zou het kunnen dat onze resultaten niet direct gerelateerd zijn met inflammatie of immuun-funktie abnormaliteiten.

Na de 2 weken over-werk die zorgde voor de sub-acute vermoeidheid, waren de d-ROM waarden verhoogd, terwijl de BAP-waarden slechts in één geval daalden. Bij acute vermoeidheid condities, trad de toename van d-ROMs & BAP gelijktijdig op en herstel tot oorspronkelijke waarden gebeurde binnen 2 uur. De sub-acute vermoeidheid conditie duurde 2 weken. Daarom werden verhoogde BAP-waarden bij de werkkrachten aangetoond. De BAP-waarden keerden echter bij bijna alle werkkrachten terug naar normaal binnen 2 weken. Slechts één persoon vertoonde een gedaald BAP na 2 weken. Hoewel we geen herstel-gegevens verzamelden, speculeren we dat het BAP bij deze vrijwilliger zich niet kon herstellen omwille van een onderdrukking van het BAP. Er werd frequent gerapporteerd dat job-stress of subjectieve stress-waarden verscheidene metingen voor oxidatieve stress doen toenemen. Studenten vertonen toegenomen oxidatieve stress tijdens en na examen-periodes. We zagen dezelfde tendens wat betreft d-ROMs & BAP, hoewel de belasting en de vermoeidheid-evaluatie op een andere manier gebeurde.

d-ROM & OSI bij CVS-patiënten waren hoger en BAP-waarden waren lager dan bij voor leeftijd/geslacht gematchte controles. Er werd echter een lagere waarde qua d-ROM & OSI geobserveerd bij de patiënten in vergelijking met werkkrachten met sub-acute vermoeidheid. Het BAP van CVS-patiënten verschilde niet significant van dat van de werkkrachten. Spier-merkers voor oxidatieve stress bleken gelinkt met het pathologisch mechanisme voor CVS, en bloed-merkers voor oxidatieve stress dragen bij tot CVS-pathologie en -symptomen [Fulle S et al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biology and Medicine (2000) 29: 1252-1259], bijzonderlijk in respons op inspanning bij CVS-patiënten [Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exercise Immunology Review (2014) 20: 94-116]. Verder werden dalingen van de anti-oxidante niveaus, zoals CoQ10, gerapporteerd bij CVS.

[…] De waarden van dROMs & BAP van de HVs in de post-acute conditie waren dezelfde als de CVS-patiënten, maar deze waarden herstelden echter binnen 2 uur (gegevens hier niet getoond). dROM-waarden van de HVs in de post sub-acute vermoeidheid conditie waren lager dan deze van de CVS-patiënten in rust, terwijl de BAP-waarden van deze 2 groepen vergelijkbaar waren. Patiënten met CVS vertoonden hoger waarden qua d-ROMs & OSI dan de voor leeftijd/geslacht gematchte controles. CVS-patiënten vertoonden lagere BAP-waarden vergeleken met HVs in rust. d-ROMs stegen na acute en sub-acute vermoeidheid bij gezonde mensen. Deze resultaten suggereren dat bij het gebruik van een combinatie van d-ROMs, BAP & OSI, we de verschillende vermoeidheid-niveaus kunnen evalueren of patiënten met CVS kunnen onderscheiden van gezonde individuen die verschillende vermoeidheid-niveaus ervaren.

We hebben de verschillen qua oxidatieve stress en anti-oxidatieve aktiviteit duidelijk in een relatief groot staal CVS-patiënten. De pathologische mechanismen betrokken bij CVS zouden gelinkt kunnen zijn met inflammatie en abnormaliteiten van de immune en sympathische funkties zoals eerder gesuggereerd. Verhoogde sympathische aktiviteit na acute vermoeidheid werd onderzocht [mentale vermoeidheid na langdurige belasting bij gezonde vrijwilligers]: de hartslag-variabiliteit in de hoge-frequentie band [HF, parasympathisch; zie o.a. ‘Verminderde fysieke aktiviteit & autonome regulering bij CVS] was significant gedaald. Waarden van TNF-α waren hoger tijdens een lange periode van stress (sub-acuut) vergeleken met in rust [gezonde studenten]. CVS-patiënten bleken abnormaliteiten te vertonen qua sympathische aktiviteit [Yamaguti K, Tajima S & Kuratsune H. Autonomic dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Advances in Neuroimmune Biology (2013) 4: 281-289] en inflammatie [Nakatomi et al. Neuroinflammation in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a 11C-(R)-PK11195 positron emission tomography. Journal of Nuclear Medicine (2014) 55: 945-950] in vergelijking met HVs. De link tussen inductie van inflammatie en immuun-funktie, alsook tussen sympathische funktie bij CVS-patiënten vergeleken met HVs bij acute, sub-acute en rust condities kan worden aangetoond in de studie. Aangezien we echter de sympathische funktie en immune aktiviteit niet simultaan onderzochten, zijn verdere studies vereist om een eventuele link te verduidelijken.

Er waren meerdere beperkingen verbonden aan de studie. Ten eerste: roken en BMI zijn 2 risico-factoren waarvan is geweten dat ze oxidatieve stress kunnen beïnvloeden, en anti-oxidante supplementen zouden deze waarden ook kunnen beïnvloeden. We voerden geen analyses uit die deze factoren in overweging namen. De HVs in deze studie namen echter geen medicatie of anti-oxidante supplementen, en we sloten deelnemers met een abnormaal hoge BMI uit. Verder bleken de waarden van oxidatieve biomerkers niet te verschillen op basis van anti-oxidante supplementen. We herleiden de mogelijke effekten van deze verstorende factoren dus tot een minimum. Ten tweede: we hebben geen andere oxidatieve stress biomerkers, zoals hydroperoxiden, gemeten – waarvan is gebleken dat ze gerelateerd zijn met CVS en chronische vermoeidheid. Ten derde: we konden de sub-acute vermoeidheid groep niet opvolgen tijdens het herstel omdat ze van werk-omgeving veranderden na het beëindigen van de installatie van het computer-systeem. Ten vierde: we onderzochten de veranderingen qua oxidatieve stress biomerkers niet in de acute en sub-acute condities bij CVS-patiënten. Een laastste beperking is dat de duur van de of acute, sub-acute en chronische vermoeidheid niet duidelijk werden geïdentificeerd.

Samengevat: oxidatieve stress en anti-oxidatieve aktiviteit zou nuttig kunnen zijn voor het onderscheiden van acute, sub-acute en rust-vermoeidheid bij gezonde mensen en CVS-patiënten, door het combineren van metingen voor d-ROMs & BAP of door het evalueren van vermoeidheid-graad bij gezonde mensen. De studie-resultaten geven aan dat evaluatie van vermoeidheid via d-ROMs & BAP, gecombineerd met OSI nuttig kan zijn voor het onderscheiden van CVS en vermoeidheid-status (bv. overwerkt zijn) bij gezonde mensen.

april 1, 2016

MicroRNAs: Potentiële diagnostische biomerkers in NK-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 2:47 pm
Tags: , , , , , ,

Na het bestuderen van gen-expressie en SNPs bij M.E.(cvs) (‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’ / ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’), bekijkt Prof. Jonathan Kerr hier afwijkende gen-expressie van microRNAs in bloedcellen. Andere (Australische) onderzoekers bekeken dit al in het plasma (‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’) en zelfs in NK-cellen (‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’). Kerr et al. breiden dit laatste uit…

Eerst werd de miRNA gen-expressie geanalyseerd: 34 miRNAs bleken een afwijkende expressie te hebben. 4 konden via een andere techniek worden bevestigd. Daarna werd gekeken in welke immuun-cellen deze afwijkende gen-expressie voorkwam. Tenslotte werd nagegaan in welke effekten deze gewijzigde gen-expressie had bij NK-cellen. Er werden aanwijzingen gevonden voor een immuun-dysfunktie.

De lezer kan elders op deze paginas ook reeds één en ander bestuderen over bevindingen omtrent NK-cellen bij M.E.(cvs)…

 

“MicroRNA (of miRNA) hebben anders dan bv. mRNA (boodschapper-RNA, die een ‘positieve’ rol hebben bij het ontstaan van proteïnen) de neiging om mRNA-molekulen het ‘zwijgen’ op te leggen door ze te splitsen, ze te destabiliseren of er mee te interfereren. Ze bleken al betrokken bij verscheidene ziekten bij mensen (bv. een rol bij kanker) en bij het reguleren van de vorming van bloedcellen en het beïnvloeden van de immuniteit. Aangezien miRNAs ‘beschermd’ zijn en stabiel blijven in verscheidene lichaamsvochten en weefsels zijn ze erg in trek als mogelijke biomerkers (bij kanker maar ook epilepsie, malaria & Multipele Sclerose).” – Dr Neil Abbot; ‘ME Research UK’

————————-

PLoS One Vol 11, #3, e0150904 (maart 2016)

MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: Potential Diagnostic Biomarkers in Natural Killer (NK) Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome (CFS)/ Myalgic Encephalomyelitis (M.E.)

Robert D. Petty (1,2), Neil E. McCarthy (3), Rifca Le Dieu (2), Jonathan R. Kerr (1,4)

1 CFS Group, St George’s University of London, Cranmer Terrace, London, United Kingdom

2 Centre for Haemato-Oncology, Bart’s cancer institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

3 Centre for Immunobiology, The Blizzard institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

4 Grupo de Salud Publica, Escuela de Medicine y Ciencias de la Salud, Universidad del Rosario, Quinta de Mutis, Bogotá 111221, Colombia

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS/M.E.) is een complexe multisysteem ziekte met een onbekende etiologie die invaliderende symptomen veroorzaakt bij 1% van de globale bevolking. Hoewel een grote groep genen gewijzigde expressie bleek te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten, is het nog niet geweten microRNA (miRNA) molekulen die gen-translatie reguleren, bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. We hypothiseerden dat veranderingen qua microRNA-expressie in leukocyten van patiënten bijdragen tot de CVS/M.E.-pathogoloie, en daarom bruikbare diagnostische biomerkers kunnen zijn die kunnen worden gedetekteerd in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten.

Methodes miRNA-expressie in mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de Ambion Bioarray V1. miRNA die differentiële expressie bleken te vertonen werden gevalideerd d.m.v. qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] en daarna gerepliceerd in subgroepen bloed-leukocyten van een onafhankelijke patiënten-groep. De via deze experimenten geïdentificeerde, met CVS/M.E. geassocieerde miRNA werden dan getransfecteerd in primaire NK-cellen en er werden gen-expressie analyses uitgevoerd om hun gen-doelwitten te identificeren.

Resultaten Micro-array [‘gen-chips’] analyse identificeerde differentiële expressie van 34 miRNA, die allemaal ge-upreguleerd waren. Van 4 op de 34 miRNA werden expressie-wijzigingen bevestigd via qRT-PCR. Het fractioneren van PBMC-stalen (van een onafhankelijke patiënten-groep) in verschillende cel-types, identificeerde veranderingen qua miRNA-expressie in NK-cellen, B-cellen en monocyten waarbij de meest significante abnormaliteiten voorkwamen bij NK-cellen. Transfectie [inbrengen van DNA of RNA in cellen] van primaire NK-cellen met hsa-miR-99b of hsa-miR-330-3p, resulteerde in gen-expressie wijzigingen consistent met NK-cel aktivatie maar verminderde cytotoxiciteit, wat suggereert dat gebrekkige NK-cel funkie bijdraagt tot CVS/M.E.-pathologie.

Besluit Deze studie toont gewijzigde microRNA-expressie aan in de perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS/M.E.-patiënten, die potentiële diagnostische biomerkers zijn. De grootste miRNA-ontregeling werd geïdentificeerd in NK-cellen, met doelwitten die verband houden met cellulaire aktivatie en gewijzigde effector-funktie [een effector-cel pakt daadwerkelijk zijn doelwit-cel aan (herkenning en eliminatie)].

Inleiding

[…] Er is een echte klinische noodzaak om een diagnostische biomerker voor CVS/M.E. te identificeren. Een aantal studies hebben naar biomerkers voor CVS/M.E. gezocht in het mRNA [Frampton D, Kerr J et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD et al. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9] of serum [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76] van CVS/M.E.-patiënten, echter met beperkt succes. Research focust zich op het karakteriseren van immuniteit-defekten aangezien de aanvang van de symptomen dikwijls wordt voorafgegaan door een aanval op de immuniteit. Wijzigingen in populaties en aantallen leukocyten in het perifeer bloed van patiënten werden bevestigd. Onderzoek identificeerde significante immune ontregeling bij CVS/M.E.; met gewijzigde cytokine-expressie en vermindering van de dodende capaciteit van cytotoxische cellen als meest consistente bevinding. Veranderingen in mRNA-expressie in het perifeer bloed zijn goed gedocumenteerd bij CVS/M.E., met overwegend genen betrokken bij: immuun-funktie, apoptose, transcriptie, translatie en virus-infektie. mRNA gen-expressie studies waren ook succesvol bij het definiëren van CVS/M.E.-subtypes, elk met een afzonderlijk symptoom-profiel [Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84]. Een groep molekulen die een rol spelen bij het reguleren van de translatie van mRNA en die nog systematisch dienen te worden onderzocht in bloedcellen van CVS/M.E.-individuen zijn microRNAs (miRNAs).

miRNA zijn een groep kleine, niet-coderende RNAs (~23 nucleotiden) met als funktie het reguleren van de translatie van mRNA post-transcriptie via directe afbraak van mRNA-transcripten of onderdrukking van de translatie. miRNAs zijn cruciaal voor het behouden van een normale haematopoïese [vorming van bloedcellen] en als bemiddelaars bij immuun-signalisering cascades, wat hun nut als biomerkers voor deze ziekte suggereert.

In deze studie screenden we bloedstalen van patiënten met een vastgestelde klinische diagnose van CVS/M.E. t.o.v. gematchte gezonde controles, en identificeerden we ontregeling van miRNAs die funkties hebben overéénkomend met gepubliceerde veranderingen qua mRNA-expressie bij CVS/M.E. Om te bepalen in welk cel-type deze miRNA-expressie veranderingen optreden, werd de ontregeling bevestigd in gefractioneerde perifere bloedcellen van een onafhankelijke patiënten-groep. De expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p in ‘natural killer’ cellen vertoonde de meeste over-expressie. In NK-cellen bleken deze (door miRNA beïvloedde) genen betrokken bij aktivatie, effector-funktie, actine-cytoskeleton [actine is een proteïne, onderdeel van het cytoskelet dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren in cellen, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en beweeglijkheid. Dit werk is ondersteuning en uitbreiding van de concepten van immuniteit-ontregeling bij CVS/M.E. en identificeert vermeende biomerkers voor ziekte-diagnose.

Resultaten

34 miRNA met verhoogde expressie in CVS/M.E. perifeer bloed

Om miRNA met differentiële expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werd RNA gehaald uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en gescreend m.b.v. Ambion Bioarray micro-arrays (385 miRNA-sequenties). 15 stalen van CVS/M.E.-individuen (Fukuda diagnostische criteria) en 30 van voor leeftijd en geslacht gematchte controles werden geanalyseerd. Een vergelijking identificeerde 34 miRNAs met differentiële expressie (verandering > 1,5 maal) […].

Ongecontroleerde cluster-analyse van de micro-array gegevens groepeerde de stalen in 2 clusters. Deze analyse kon de CVS/M.E.- en controle-stalen niet volledig in afzonderlijke clusters opdelen. Ongeveer de helft van de controle-stalen (n = 14) en 4 CVS/M.E.-stalen vormen een groep met lage globale miRNA-expressie. De overblijvende controles clusterden met de meerderheid van de CVS/M.E.-individuen, die hogere miRNA-expressie bij de meerderheid van de geanalyseerde miRNAs vertoonden. Het niveau van homogeniteit tussen de stalen is hoog (gemiddelde correlatie-coëfficient of 0.922 +/- 0.068), wat kan bijdragen tot de onvolledige klassificatie van de stalen.

Onderzoek van deze gegevens per miRNA toonde de deugdelijkheid van de expressie-gegevens […]. We bekeken de correlatie tussen miRNA gen-expressie gegevens en scores van klinische vragenlijsten (5 vragenlijsten over algemene gezondheid) maar vonden er echter geen. Deze gegevens tonen aan dat miRNAs ontregeld waren in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten en dat de waarden van deze miRNAs onafhankelijk waren van de symptoom-ernst.

Significante upregulering van de microRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E.-bloedstalen

De veranderingen qua miRNA-expressie van 29 op 34 miRNAs werden in hetzelfde staal gevalideerd in d.m.v. Taqman kwantitatieve PCR. 5 miRNAs (ambi-miR-7058, hsa-miR-331, mmu-miR-140-AS, mmu-miR-409, rno-miR-151-AS) werden niet opgenomen aangezien de testen niet beschikbaar waren. 4 op 29 miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-30c & hsa-miR-126) vertoonden significante differentiële expressie (≥ 1,5 maal, CVS vs. Controle, p ≤ 0.05 […]).

4 miRNAs hebben het potentieel als doeltreffende biomerkers bij CVS/M.E. op basis van ROC-analyse

Om te weten te komen of de 4 met differentiële expressie bevestigde miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) zouden kunnen dienen als biomerkers bij de diagnose van CVS/M.E., werd ‘Receiver Operating Characteristics’ (ROC) [statistische analyse waarbij men in een grafiek de gevoeligheid (sensitiviteit) in funktie van de specificiteit uitzet; gebruikt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] uitgevoerd voor elke relatieve hoeveelheid van elk miRNA. Deze statistiek beschrijft de mogelijkheid van een variabele om een bepaald staal te klassificeren in 2 groepen en werd eerder al gebruikt om serum-biomerkers bij CVS/M.E.te definiëren. […] De 4 geteste miRNAs vertoonden statistische significante verschillen t.o.v. het de hypothese van toevalligheid. Hsa-miR-330-3p werd via deze analyse geïdentificeerd als de variabele die ‘t meest waarschijnlijk CVS/M.E.-patiënten van controles differentieert […]. Deze gegevens tonen aan dat (binnen de grenzen van deze studie) deze 4 miRNAs diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. zouden kunnen zijn.

Hsa-miR-99b is significant ge-upreguleerd in NK-cellen van in CVS/M.E.-patiënten

Om te onderzoeken of de miRNA-veranderingen gezien in vol-bloed stalen specifiek waren voor een bepaalde PBMC-populatie, werden 20 patiënten en 20 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde vrijwilligers gerecruteerd (dezelfde klinische diagnostische criteria als de eerdere studie). Er werden bloedstalen genomen en PBMCs geïsoleerd. De cellen werden gefractioneerd via positieve selektie op basis van CD14+ (monocyten), CD19+ (B-cellen), CD56+ (NK-cellen) en CD3+ (T-cellen) microparels. Flow-cytometrie van de gefractioneerde populaties gaf een zuiverheid aan van 96,9% (+/- 2,1%) voor monocyten, 88,9% (+/- 7,6% SD) voor NK-cellen, 84,4% (+/- 8,8%) voor B-cellen en 91,2% (+/- 5,3%) voor T-cellen. Absolute cel-tellingen na fractionatie kon geen statistisch significante verschillen aantonen tussen de populatie-groepen voor de 4 onderzochte leukocyt-subgroepen.

De 4 miRNAs waarvan differentiële expressie werd bevestigd – via array & qRT-PCR – (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) werden onderzocht in RNA uit deze 4 belangrijkste bloed-leukocyten populaties. 3 van de geteste miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-126 & hsa-miR-330-3p) vertoonden significante ge-upreguleerde expressie in één of meer PBMC-subsets bij de CVS/M.E.-populatie. Hsa-miR-30c vertoonde geen significant expressie-verschil. het grootste verschil in expressie was de expressie van hsamiR-99b in NK-cellen (2-voudige toename in CVS/M.E.-stalen). Dit miRNA was ook 1,6 maal ge-upreguleerd in B-cellen maar niet gewijzigd in T-cellen en monocyten. Hsa-miR-330-3p was ook significant ge-upreguleerd in NK-cellen maar in veel mindere mate (1,3-voudige toename). Hsa-miR-126 was 1,45-voudig ge-upreguleerd in monocyten in de CVS/M.E.-groep. Deze gegevens toonden dat de ontregeling van miRNAs bij CVS/M.E. specifiek is per leukocyten-populatie en suggereren dat de dysfunktie van B-cellen, NK-cellen en monocyten bijdragen tot de ziekte-pathologie.

Hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p reguleren mechanismen die bijdragen tot NK-cel aktivatie en effector-funktie

Om de gen-doelwitten van hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p in NK-cellen identificeren, werd precursor miRNA [enkelstrengige (ss) miRNAs komen van ‘pri-miRNAs’; de twee strengen worden enzymatisch gesplitst, resulterend in voorloper miRNA of ‘pre-miRNA’] getransfecteerd in NK-cellen (die werden geïsoleerd uit PBMCs). De NK-cel zuiverheid na de aanrijking was 89,6% (bepaald via flow-cytometrie).

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-99b identificeerde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle [mRNA dat leidt tot een afgebroken, onvolledig, niet-funktioneel proteïne]) 37 genen met differentiële expressie (volgens de inclusie-criteria; p ≤ 0.05, verandering ≥ 1,5 maal). 21 genen vertoonden downregulering tussen 1,5 en 1,8 maal. 16 genen vertoonden verhoogde expressie tussen 1,5 en 2,6 maal. Interferon-gamma (IFN-γ), een belangrijke mediator van NK-cel aktivatie, was het sterkst geïnduceerde gen (2,6 maal). Granzyme-B (GZMB), dat codeert voor een component van de cytotoxische granules die door NK-cellen worden afgegeven na herkenning van doelwit-cellen, was 1,6 maal meer geïnduceerd. Genen betrokken bij cellulaire aktivatie, vesikel-vorming [vesikels = kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], beweeglijkheid en modulatie van het actine-cytoskeleton waren ook ge-upreguleerd […]. Cathepsine-L (CTSL) [enzyme betrokken bij proteïne-afbraak] was het meest ge-downreguleerde gen door hsa-miR-99b. Dit proteïne is vereist voor splitsing en aktivatie van perforine & granzyme-B in de lytische vesikels [bevatten cel-afbrekende stoffen]. CD6 & IL-8 (interleukine-8) waren ook ge-downreguleerd (1,6 & 1,5 maal, respectievelijk). Verminderde expressie van deze genen is geassocieerd met NK-cel rijping na aktivatie. Er werd ook verminderde expressie geïdentificeerd bij genen betrokken bij autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten] en bepaalde signalisering-mechanismen […].

Om te bepalen of de genen die worden gereguleerd door hsa-miR-99b konden worden gegroepeerd in een specifieke funktionele klasse, voerden we een ‘over-representatie analyse’ uit [bekijkt de eventuele aanrijking van bepaalde mechanismen, molekulaire funkties en biologische processen]: dit identificeerde een significante aanrijking voor genen betrokken bij processen en mechanismen van de NK-cel funktie, inclusief cel-aktivatie, immuunsysteem-processen en cellulaire respons op een stimulus.

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-330-3p leverde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle) slechts 2 wijzigingen op: voor SOD2 [codeert voor mitochondriaal superoxide-dismutase-2] en MMP9 [codeert voor matrix-metallopeptidase 9] -expressie; ze waren allebei 1,6 maal gedownreguleerd. SOD2-expressie verstoort de normale T-cel differentiatie en cellulaire aktivatie, en verminderde expressie is geassocieerd met verstoorde neutrofiel effector-funktie. MMP9 reguleert NK-cel cytotoxiciteit en lymfocyten-beweeglijkheid.

Deze resultaten toonden aan dat verhoogde miRNAs expressie in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten gen-expressie wijzigingen bevordert die consistent zijn met cellulaire aktivatie maar verminderde effector-funktie.

Bespreking

De klinische diagnose van CVS/M.E. is gebaseerd op goed omschreven klinische criteria maar de diagnose omvat echter ook de uitsluiting van andere oorzaken voor vermoeidheid, wat kan leiden tot een langere diagnose-tijd. Zodoende is er een echte klinische noodzaak om diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. te identificeren. We wilden de rol van miRNA bij patiënten met een vastgestelde diagnose of CVS/M.E. bestuderen, om te bepalen of deze regulerende molekulen bijdragen tot de ziekte-pathogenese en of het kandidaat diagnostische biomerkers zijn.

We identificeerden over-expressie van 34 miRNA die niet eerder werden beschreven bij CVS/M.E. [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One (2014) 9: e102783; zie ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’ /// Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9; zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?] in stalen perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten. De micro-array analyse groepeert op een robuste manier de miRNAs met gecoördineerde expressie (hsa-miR-107 & hsa-miR-103) en levert zeer homogene resultaten. Wat gemeenschappelijk is met andere CVS/M.E.-studies is dat gen-expressie het miRNA-profiel CVS/M.E.-patiënten niet van controles onderscheidde Een studie van Brenu et al. [zie eerder] analyseerde plasma-stalen van CVS/M.E.-patiënten en identificeerde ontregeling van 19 menselijke miRNAs. Van deze 19, zaten er slechts 12 in onze array. Daarvan waren er 8 met een verschil van ≥ 1,5 maal (CVS/M.E. vs. normaal) maar allemaal met insignificante p-waarden; die werden niet verder onderzocht. Het feit dat de 2 studies niet overéénstemmen is niet verrassend, aangezien cellulaire en plasma miRNA-profielen van hetzelfde individu beperkt overlappen. Er werd voorgesteld dat deze beperkte overlap het resultaat is van het feit dat miRNAs opgeslagen zijn in vesikels die worden gesecreteerd met verschillende doeltreffendheid, of van de variabele stabiliteit van de verschillende miRNAs in het extracellulair milieu. De CVS/M.E.-populatie vertoonde een brede waaier aan klinische symptoom scores wijzend op subgroepen van de ziekte, die ook elders worden beschreven en kunnen bijdragen tot het niet volledig onderscheiden van de stalen in deze analyse. Deze observatie kan ook de slechte correlatie tussen klinische symptoom score en miRNA-expressie verklaren, en suggereert dat validatie in een meer uitgebreide patiënten-groep wenselijk is.

Bevestiging van de array-bevindingen d.m.v. qRT-PCR ondersteunde de upregulering van hsa-miR- 99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E. PBMCs. De mate van overéénkomst tussen de 2 methodes is bescheiden wat betreft het vergelijken van mRNA-expressie studies bij CVS/M.E. Er werd gesuggereerd dat deze discrepantie ten dele te wijten is aan de verschillen in methodologie: veranderingen onder +/- 2 maal en lagere transcriptie zouden kunnen gelinkt zijn met een slechtere overéénstemming tussen de methodes. Dit onderstreept een consistent probleem bij miRNA-studies aangezien de ‘cut-off’ die gewoonlijk wordt gehanteerd voor miRNA gen-expressie experimenten een verandering van 1,5 maal is, wat kan leiden tot uitsluiting van positieve gegevens.

De miRNAs met verhoogde expressie bij CVS/M.E. zouden mogelijks kunnen dienen als biomerkers voor de ziekte, die dan kunnen worden gebruikt om de diagnose te verbeteren en te bespoedigen. Dit werd eerder al geprobeerd in een aantal studies die potentiële biomerkers in het serum, cytokine-expressie, dipeptidyl-peptidase-4 (CD26) [Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817; zie ‘Natural Killer Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?] en lymfocyten gen-expressie [Steinau M, Unger ER et al. Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. J Mol Med (2004) 82: 750-5 /// Light AR et al. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS] identificeerden. Om te bepalen of de 4 ge-upreguleerde miRNAs geschikte merkers zijn om CVS/M.E.-individuen te onderscheiden van een gematchte controle-groep, werd een ROC-analyse uitgevoerd. Deze toonde aan dat alle 4 de merkers patiënten van controles konden onderscheiden, met een specificiteit vergelijkbaar met die van gepubliceerde studies. Deze miRNAs zouden specifiek voor CVS/M.E.-patiënten kunnen zijn […]. Validering bij grotere geblindeerde groepen patiënten is echter nodig vooraleer de diagnostische buikbaarheid van de in deze studie geïdentificeerde miRNAs volledig kan worden benut.

Lymfocyten uit perifeer bloed werden reeds intensief onderzocht bij CVS/M.E.-patiënten en dit identificeerde wijzigingen qua cytokine-secretie, en veranderingen in cellulaire populaties en aktiviteit [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]. De cellulaire mechanismen en processen die worden gereguleerd door miRNAs zijn dikwijls cel-specifiek. Om te proberen de leucocyten-populatie die bijdraagt tot gewijzigde miRNA-expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werden de 4 miRNAs met verhoogde expressie gekwantificeerd in PBMC-fracties van een nieuwe patiënten-groep. Hsa-miR-126 vertoonde verhoogde expressie in monocyten. Hoewel er tot op heden nog geen specifiek defekt in monocyten-aktiviteit werd aangetoond bij CVS/M.E., bleek hsamiR-126 CRK-proteïne expressie te downreguleren. Dit proteïne inhibeert cel-invasie en -migratie en bleek proliferatie in dendritische cellen te controleren, wat suggereert dat verhoogde monocyten-aktiviteit gemedieerd door miRNA kan bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E.

Hsa-miR-330-3p & hsa-miR-99b wijzen op verhoogde expressie in B-cel en NK-cel populaties. Deze miRNAs bleken geassocieerd met kanker, endometriose, beslissingen aangaande het lot van cellen en angiogenese. Hsa-miR-99b bleek gericht te zijn op componenten van NF-κB, mTOR en AKT signalisering-mechanismen. mTOR signalisering is cruciaal voor normale proliferatie, cytotoxische en cytokine-effector funkties in gezonde NK-cellen, en normale BCR (B-cel receptor) signalisering en proliferatie in B-cellen. Verhoogde hsa-miR-99b expressie die mTOR reguleert, ondersteunt de vermindering qua effector-funktie die wordt geobserveerd in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten die wordt gerapporteerd in de literatuur, en ondersteunt de ontregeling van genen betrokken bij B-cel rijping en ontwikkeling die werd geïdentificeerd via gen-expressie studies [Vernon SD, Broderick G et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct. (2008) 4: 44; zie ‘Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS]. Hsa-miR-330-3p bleek cellulaire beweeglijkheid te reguleren […] in prostaatkanker-celllen en proliferatie […] bij colorectale kanker.

Hsa-miR-30c vertoont geen veranderde expressie in de cellulaire fracties: dit suggereert dat de geobserveerde over-expressie in de oorspronkelijke PBMC-groep wellicht specifiek is voor die groep. Dit toont de noodzaak aan voor validering van de bevindingen bij afzonderlijke niet-gerelateerde groepen of patiënten.

Om de effekten van de gewijzigde miRNA-expressie geïdentificeerd bij CVS/M.E op cellulair mRNA te bestuderen, verkozen we transfectie van de miRNAs met de grootste over expressie (hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p) in gezonde NK-cellen (het meest consistent geïdentificeerd als zijnde funktioneel verstoord bij CVS/M.E.-patiënten). Interferon-gamma (IFN-γ) vertoonde de grootste expressie-wijziging in respons op introductie van hsa-miR-99b: een toename qua expressie van 2,6 maal. Dit gen codeert voor een cytokine gesecreteerd door NK-cellen met een cruciale rol in anti-virale, anti-tumor en immuun-regulerende effekten gecombineerd met het bevorderen van NK-cel aktiviteit. Meting van IFN-γ gaf in een aantal CVS/M.E.-studies variabele resultaten. Er werd verhoogd mRNA in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten aangetoond, ondersteund door een verhoging qua circulerende IFN-γ secreterende CD3 CD56+ NK-cellen beschreven bij CVS/M.E.-patiënten [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42; zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Plasma-concentraties van IFN-γ bleven echter onveranderd bij 40 vrouwelijke CVS/M.E.-patiënten t.o.v. gematchte controles [Fletcher MA et al. Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2009) 7: 96; zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS].

Eén consistente bevinding bij CVS/M.E.-patiënten is de vermindering qua cytotoxische aktiviteit van NK-cellen, dikwijls geassocieerd met een verandering qua niveau van componenten van cytotoxische granules – granzyme & perforine. In deze studie was Granzyme-B (GZMB) significant ge-upreguleerd door hsa-miR-99b, wat een versterkte cytotoxische capaciteit suggereert. CTSL (Cathepsine-L) vertoonde echter de grootste downregulering door hsa-miR-99b. Dit enzyme is nodig voor het verwerken (van precursor tot aktieve vormen) van componenten uit lytische granules (granzyme & perforine), wat een verklaring suggereert voor het verhoogd GZMB mRNA – dat hier en in de literatuur wordt gemeld – leidend tot verminderde effector-funktie. Dit mechanisme suggereert een opéénstapeling van precursor-proteïnen voor GZMB en perforine in lytische vesikels met verminderde cytotoxische werking, wat wordt ondersteund door gegevens die gedaalde NK-cel cytotoxiciteit identificeerden bij CVS/M.E.-patiënten zonder een geassocieerde verstoring van de degranulatie. Over-expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p induceerde een gen-expressie patroon dat consistent is met NK-cel aktivatie verhogende IFN-γ expressie en genen betrokken bij cellulaire beweeglijkheid, vesikel-vorming en modulatie van het actine-cytoskeleton (KLRF1, STOM, S100A4, FEZ1, ARPC3 & TPM3P5). Er werd gepostuleerd dat geaktiveerde NK-cellen in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten het resultaat kunnen zijn van een onvolledig verdwijnen van virale infektie, wat de meest geciteerde trigger is als aanvang van CVS/M.E.-symptomen. Deze gegevens tonen ook een molekulaire basis voor de vermindering qua NK-cytotoxiciteit, die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten, gemedieerd door miRNA, via directe downregulering van enzymen die vereist zijn voor het verwerken van componenten van cytotoxische vesikels, en downregulering van genen in autofagie-, WNT- en AKT-mechanismen [bepaalde signaal-traansductie mechanismen] (ULK1, ATG2A, PMEPA1, DKK3, PDCD4) vereist voor normale proliferatie en rijping van geaktiveerde NK-cellen. Bijkomende validering van de proteïne-doelwitten die worden gereguleerd door de geïdentificeerde miRNAs is wenselijk om de miRNA-gemedieerde NK-cel dysfunktie bij in CVS/M.E. volledig te definiëren.

De voorgestelde gegevens identificeren ontregeling van miRNA-expressie in cellen van het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten, bevestigd in 2 patiënten-groepen, in PBMCs en cellulaire subgroepen, en identificeert 4 mogelijke diagnostische biomerkers. ‘Natural killer’ cellen vertoonden de grootste veranderingen qua miRNA-expressie met upregulering van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p. Deze bevindingen zijn funktioneel consistent met het begrip van de pathogenese van CVS/M.E. Het werk dat hier wordt gepresenteerd levert nieuw bewijsmateriaal voor een gewijzigde NK-cel aktivatie-mechanisme bij CVS/M.E. waarbij hsa-miR-99b is betrokken en suggereert een mechanisme voor de verminderde effector-funktie die wordt gezien bij CVS/M.E., wat eerder nog niet werd aangetoond.

november 11, 2015

M.E. meer funktioneel verstoord en meer symptomen dan CVS

Filed under: Diagnostiek,M.E. - algemeen — mewetenschap @ 7:22 am
Tags: , ,

Op regelmatige basis duiken nieuwe criteria-definities op voor de aandoening waar wij op deze paginas naar verwijzen als M.E.(cvs). Wij blijven (voorlopig) opteren voor het gebruik van de Myalgische Encefalomyelitis International Consensus Criteria (zie ‘Myalgische Encefalomyelitis: Internationale Consensus Criteria’ & ‘Vergelijking empirische CVS-definitie vs Canadese M.E.(cvs) definitie’). Prof. Leonard Jason doet nauwgezet verder onderzoek naar het gebruik van M.E.(cvs)-criteria. In 2014 deed hij nog de oproep dat “Research verder moet zoeken naar empirische ondersteuning voor de kern-symptomen van M.E. & CVS om verder vooruitgang te boek in de zoektocht naar biologische merkers en behandelingen.” (‘Examining case definition criteria for Chronic Fatigue Syndrome and Myalgic Encephalomyelitis’, Fatigue (2014) 2: 40-56). Daarnaast moeten ook drempels worden gespecificeerd wat betreft de minimum frequentie/ernst van de symptomen om de kans op verkeerde klassificatie te verminderen.

Eerder had hij al gepubliceerd dat de M.E.-ICC definitie een meer homogene groep individuen met ernstiger symptomen en beperkingen identificeert. (referentie zie hieronder). Daar gaat hij hier nu op verder…

————————-

J Health Psychol. 2015

Are Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome different illnesses? A preliminary analysis

Leonard A Jason (1), Madison Sunnquist (1), Abigail Brown (1), Meredyth Evans (1) & Julia L Newton (2)

1 Centre for Community Research, DePaul University, USA

2 Institute for Ageing and Health, Newcastle University, UK

Samenvatting

Er is aanzienlijk wat discussie over het feit of Chronische Vermoeidheid Syndroom een afzonderlijke ziekte is van Myalgische Encefalomyelitis. Een eerdere studie vergeleek de Myalgische Encefalomyelitis International Consensus Criteria (M.E.-ICC; Carruthers et al. 2011) met de Fukuda et al. (1994) CVS criteria en vond dat de M.E.-ICC een subset van patiënten identificeerde met meer funktionele stoornissen, en lichamelijke, mentale en cognitieve problemen dan de grotere groep die voldeed aan de Fukuda et al. criteria. De huidige studie analyseerde 2 afzonderlijke gegevens-sets en vond dat de M.E.-ICC meer geïnvalideerde individuen met ernstiger symptomen identificeerde.

Inleiding

De term Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) werd voor het eerst gebruikt in een anoniem editoriaal in een nummer van de Lancet (1956). Gebruikmakend van deze term publiceerde Ramsay (1988) een definitie voor M.E. Daaropvolgend werd een definitie ontwikkeld gebruikmakend van de term Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS; Carruthers et al. 2003), die bekend staat als de 2003 ‘Canadian Clinical ME/CFS definition’. Deze criteria vereisen het voorkomen van 7 specifieke M.E./CVS-symptomen. Meerdere individuen die betrokken waren bij het creëeren van de ME/CVS-criteria publiceerden, samen met andere wetenschappers en klinici, de International Consensus Criteria voor Myalgische Encefalomyelitis (M.E.-ICC; Carruthers et al. 2011). Naast de vereiste voor de aanwezigheid van 8 symptomen uit 4 domeinen, specificeren deze criteria dat de impact van de ziekte moet resulteren in een reductie van 50% of meer wat betreft het aktiviteit-niveau van de patient van vóór de ziekte.

In tegenstelling daarmee hebben de meeste wetenschappers de Fukuda et al. (1994) definitie gebruikt bij research naar Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS). Deze definitie vereist dat een individu 6 maanden of meer chronische vermoeidheid ondervindt met nieuwe of duidelijk omschreven aanvang en die niet substantieel wordt verlicht door rust, niet het resultaat is van inspanning of, en die resulteert in een substantiële vermindering qua beroep-, sociale en persoonlijke aktiviteiten. De Fukuda et al. definitie maakt gebruik van een polythetische benadering [gedefinieerd op basis van meerdere karakteristieken] voor het beoordelen van de symptomatologie. In tegenstelling met de ME/CVS & M.E.-ICC definities, vereisen de Fukuda et al. criteria 4 symptomen van de 8 mogelijke, dus is het mogelijk dat individuen die voldoen aan de Fukuda et al. criteria geen kern CVS-symptomen zoals post-exertionele malaise vertonen.

In een studie met individuen die de diagnose via de Fukuda et al. (1994) CVS criteria kregen, werd onderzocht [Brown AA, Jason LA, Evans MA et al. Contrasting case definitions: The ME International Consensus criteria vs. the Fukuda et al. CFS criteria. North American Journal of Psychology (2013) 15: 103-120] of deze deelnemers ook voldeden aan de ME-ICC. De bevindingen gaven aan dat de ME-ICC individueren met een ernstiger symptomatologie en funktionele invaliditeit identificeerden dan deze die enkel aan de Fukuda et al. Criteria voldeden. Jammer genoeg waren er 2 beperkingen bij deze poging om CVS en M.E.-ICC te vergelijken. Ten eerste: de gerecruteerde individuen moesten de diagnose CVS hebben, dus deze vereiste zou tot een selektie-bias [vooringenomenheid] kunnen hebben geleid. Ten tweede: het instrument dat werd gebruikt om M.E.-ICC symptomen te meten, was ontworpen voorafgaand aan de publicatie van de criteria, zodat een aantal van de symptomen enkel indirect kon worden beoordeeld. De huidige studie gebruikte een nieuw instrument dat de M.E.-ICC symptomen beter beoordeelt en onderzocht 2 groepen deelnemers die werden gerecruteeerd via verschillende vaststelling-methodes om selektie-bias te verminderen. We hypothiseerden dat de M.E.-ICC een meer geïnvalideerde, symptomatische groep zou identificeren dan de Fukuda et al. criteria.

Bespreking

De huidige studie vergeleek de M.E.-ICC met de Fukuda et al. CVS-criteria door het analyseren van 2 afzonderlijke stalen. Hoewel de Fukuda et al. criteria de meest gebruikte zijn, hebben de Carruthers et al. criteria aanzienlijk wat aandacht gekregen door het groot aantal M.E.- en CVS-experten die er de auteurs van waren. Naar ons weten is er tot op heden slechts één enkele andere studie die deze 2 definities heeft vergeleken [Brown et al. 2013; zie hierboven] maar die was beperkt door de vaststelling-methode. De huidige studie vond dat de M.E.-ICC definitie patiënten identificeerde met meer funktionele beperkingen en ernstiger symptomen dan de groep patiënten die voldeden aan de Fukuda et al. criteria.

Gebruikmakend van de Fukuda et al. CVS-definitie, voldeden 96,3% in het DePaul staal [groep van Jason] en 86,5% in het Newcastle staal [groep van Newton]. Bij gebruik van de Carruthers et al. M.E.-ICC definitie voldeden echter slechts 57,1% in het DePaul staal en 58,3% in het Newcastle staal aan de criteria. Deze consistente bevindingen suggereren dat ca. 60% van de patiënten voldoen aan de M.E.-ICC definitie, terwijl de Fukuda et al. criteria een grotere groep patiënten identificeren.

De M.E.-ICC groep vertoonde significant slechtere scores op de subschalen die lichamelijke gezondheid meten maar er werden geen verschillen gevonden op de subschalen die mentale gezondheid meten. Daarnaast rapporteerde de M.E.-ICC groep ergere symptomen dan de CVS-groep. Deze bevindingen ondersteunen de notie dat de M.E.-ICC een staal met meer beperkingen identificeerde, zelfs bij gebruik van verschillende recrutering-methodes.

De eerste Amerikaanse definitie van Holmes et al. (1988) vereist dat patiënten minstens 8 van 11 mineure symptomen melden. De vereiste van 8 of meer mineure symptomen wekte de bezorgdheid dat deze definitie onbedoeld individuen met psychiatrische problemen zou selekteren. Enkele jaren later ontwikkelde een internationale werkgroep de verbeterde definitie voor CVS (Fukuda et al. 1994), die werd gevolgd door het creëeren van de M.E./CVS (Carruthers et al. 2003) en M.E.-ICC (Carruthers et al. 2011) definities die meer specifieke symptoom-vereisten opnamen. Anderen toonden het belang aan van de vereiste voor specifieke symptomen door individuen met Fukuda-gedefinieerde CVS onder te verdelen in 2 groepen: CVS met post-exertionele malaise en CVS zonder post-exertionele malaise. Deze studie toonde dat individuen met post-exertionele malaise ernstiger symptomen en meer more immuun-abnormaliteiten hadden dan deze zonder.

Hoewel post-exertionele malaise een vereist symptoom zou kunnen zijn voor definities, werd voor de Canadese M.E./CVS-criteria (Carruthers et al. 2003) 7 symptomen vereist, i.p.v. van de 4 gevraagd door de Fukuda et al. (1994) en de M.E.-ICC (Carruthers et al. 2011) vereiste 8 symptomen, hetzelfde aantal dat werd gevraagd door Holmes et al. (1988). De implicaties van de vereiste van grotere aantallen symptomen zou moeten worden overwogen, bijzonderlijk wat betreft psychiatrische co-morbiditeit. Hoewel de huidige studie geen verschillende psychiatrische co-morbiditeit vond tussen de CVS en de M.E.-ICC groepen, waren deze bevindingen niet gebaseerd op een gestruktureerd klinisch interview.

De auteurs van de M.E.-ICC definitie publiceerden een inleiding (Carruthers et al. 2012) waarin ze richtlijnen gaven om te bepalen of symptomen voldoen aan de drempels voor criteria. Als voorbeeld werd naar post-exertionele malaise verwezen als post-exertionele neuro-immune uitputting (PENE). In de zelf-rapportering vragenlijst opgenomen in de inleiding, wordt PENE gekarakteriseerd als (a) “Uitgesproken, snelle lichamelijke of cognitieve vermoeibaarheid in respons op inspanning” (b) “Symptomen die verergeren bij inspanning” (c) “Post-exertionele uitputting” (d) “Uitputting verlicht niet met rust” en (e) “Substantiële vermindering van het aktiviteit-niveau van voor de ziekte te wijten aan een lage drempel voor lichamelijke en mentale vermoeibaarheid”. Deze onnauwkeurige specificatie leidt tot een aantal problemen bij het operationaliseren van de criteria. Ten eerste: het is onduidelijk of alle 5 kenmerken moeten aanwezig zijn voor PENE. Verder is de precieze definitie van deze karakteristieken nog ambigu. Bv.: de omschrijving van de aanvang en duur van PENE is vaag, en ook de periode dat de individuen deze symptomen moeten ervaren om te voldoen aan de criteria wordt niet gespecificeerd.

Daarnaast gaf de M.E.-ICC inleiding ernst-graden aan voor de beoordeling van aktiviteit-reductie; deze waarden weken echter af van de oorspronkelijke definitie. In plaats van de 3 ernst-graden aangegeven in de M.E.-ICC, gebruikt de inleiding er 4 (mild, matig, ernstig en zeer ernstig): ‘mild’ betekent da teen individu “voldoet aan de criteria” en “significante” verminderingen qua aktiviteit ervaart; ‘matig’ betekent dat een persoon een 50 % reductie qua aktiviteit-niveau in vergelijking met voor de ziekte heeft ervaren; de ernstige graad betekent dat individuen niet in staat waren om buitenshuis te funktioneren; en zeer ernstig betekent dat individuen bedlegerig waren en moeilijkheden ondervinden om in hun eigen basisnoden te voorzien. Het is onduidelijk of de M.E. inleiding 4 ernst-graden voor aktiviteit-reductie implementeerde, terwijl er slechts 3 werden gespecifieerd in de M.E.-ICC. Belangrijker: de milde graad kwam overéén met een reductie van ca. 50 % qua aktiviteit in de Carruthers et al. (2011) criteria maar de matige graad kwam overéén met een reductie van 50 % in de Carruthers et al. (2012) criteria. Bovendien ontbraken bij het taalgebruik in de M.E.-ICC en de M.E. specifieke definities en beoordeling-instrumenten om consistent en accuraat de substantiële aktiviteit-reducties en symptoom-ernst bij individuen met de ziekte. Het is bv. onduidelijk op welke manier moet worden bepaald of iemand een “significante” reductie qua aktiviteit of 50 % reductie in ondervindt. Zonder duidelijk gedefinieerde criteria en adequate beoordeling-instrumenten, wordt het bepalen of een individu voldoet aan deze criteria overgelaten aan het klinisch goeddunken, iets wat sterk kan verschillen van klinicus tot klinicus. Zodoende kunnen wetenschappers en klinici betrouwbaarheid-problemen tegenkomen bij het gebruiken van deze nieuwe definitie.

Bronnen voor variantie kunnen worden onderverdeeld in de volgende 5 categorieën […]. Criterium-variantie is verantwoordelijk voor de grootste bron van diagnostische onbetrouwbaarheid en is treedt meest waarschijnlijk op wanneer operationeel expliciete criteria voor diagnostische categorieën niet bestaan. Met andere woorden: inclusie- en exclusie-criteria moeten consistent zijn om de vermoeidheid-toestanden bij patiënten adequaat te kunnen vergelijken. Wanneer diagnostische categorieën niet betrouwbaar zijn, is de validiteit (d.w.z. bruikbaarheid) van een diagnostische categorie inherent beperkt. Met andere woorden: de mate waarop een diagnostische categorie onbetrouwbaar is, bepaalt zijn mogelijke validiteit voor éénder welk klinisch, research of administratief gebruik.

Diagnostische criteria zouden moeten specificeren welk diagnostisch instrument dient te worden gebruikt, welke individuen dienen te worden geïnterviewd, en hoe de aanwezigheid en de ernst van symptomen dient te worden bepaald. Het is ook noodzakelijk om het aantal en het type symptomen, dat aanwezig moet zijn om een bepaalde diagnose te stellen, te specificeren. Definities van vermoeidheid zouden ook specifieke richtlijnen, behorende tot het belang van de symptoom-ernst in de diagnostische procedure, moeten omvatten. Bv.: als een patient een symptoom zoals post-exertionele malaise bevestigt, zouden gestandardiseerde vragen de duur, frequentie en ernst van het symptoom, inclusief de aanvang, het patroon, intensiteit en andere geassocieerde factoren, moeten identificeren.

Op basis van de huidige analyses, lijkt de M.E.-ICC een meer funktioneel verstoorde en symptomatische groep individuen te selekteren vergeleken met deze die voldeden aan de Fukuda et al. (1994) criteria. Gezien de grote interesse van klinici en wetenschappers betreffende de M.E.-ICC, zou meer research moeten worden gedaan om te onderzoeken hoe deze criteria, alsook de specifieke instrumenten ontwikkeld om deze criteria te bepalen, mogelijks patiënten-groepen verschillende van de Fukuda et al. criteria selekteren. Bijkomende studies zijn nodig om te bepalen of er biologische en psychiatrische verschillen bestaan tussen individuen die voldoen aan deze 2 definities. Daarnaast zouden researchers moeten verdergaan met het operationaliseren van de huidige criteria om de criterium-variantie te reduceren en meer gesofisticeerde analytische technieken gebruiken om de cruciale dimensie van deze ziekten te identificeren.

oktober 17, 2014

Variaties qua cytokinen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 8:14 am
Tags: , ,

In Volume 70, Nummer 1 van het wetenschappelijk tijdschrift Cytokine (November 2014) – het ‘ICIS Abstract Issue’ over de ‘ICIS Conference’ Melbourne, Australia (26-29 October 2014) staan 3 rapporten over de rol van cytokinen bij Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.). De ICIS, ‘International Cytokine and Interferon Society’, is een vzw van meer dan 600 wetenschappers die research doen met betrekking tot cytokine, interferon en chemokine cel-biologie, molekulaire biologie, biochemie en het klinisch gebruik van deze molekulen.

We hebben hier al meermaals aangegeven dat voorzichtig dient te worden omgesprongen met veralgemenende conclusies over cytokinen bij deze aandoening. De bepaling-techniek, het soort staal, het tijdstip van afname (zie ‘Cytokinen bij CVS ’s nachts’), de duur van de ziekte, de subgroep, diagnostische criteria, de relatie met inspanning, enz. kunnen de waarden heel erg beïnvloeden.

De hier beschreven onderzoeken zijn van de hand van het team rond Sonya Marshall-Gradisnik & Ekua Brenu van de Griffith University – die al heel erg productief bleken met publicaties aangaande het immuunsysteem bij M.E.(cvs) (zie bv. ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’, ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ of ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’) – breiden de mogelijke klassificaties nog verder uit. Dit betekent o.i. dat één (of zelfs meerdere) cytokine(n) ons niet in staat zullen stellen de diagnose M.E.(cvs) zomaar te stellen; M.E.(cvs)-patiënten en hun behandelaars kunnen dus maar beter voorzichtig zijn met de interpretatie van resultaten van cytokine-bepalingen. Zoals Prof. Klimas reeds stelde: “Ondanks bewijzen voor immunologische en molekulaire mediatoren, werd er geen individuele merker of combinatie of merkers gevonden die voldoende geassocieerd bleek met CVS om als een biomerker voor de diagnose of het management van CVS te gebruiken.” (zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS’).

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 31 November 2014

The role of cytokines in the cerebrospinal fluids of patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Sonya Marshall-Gradisnik (1), Gunnar Gottschalk (2), Sandra Ramos (1), Ekua Brenu (1), Don Staines (1), Dan Peterson (2)

1 Griffith University, Parklands, QLD, Australia

2 Simmaron Research, Incline Village, NV, USA

Doelstellingen Eerdere research leverde bewijs voor een ontregeling van de cytokine-concentraties in het perifeer bloed van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.). Weinig studies hebben cytokinen in het cerebrospinaal vocht onderzocht. Het doel van deze research is het bekijken van de rol van cytokinen bij de symptoom-presentering bij of CVS/M.E-patiënten.

Methodes Er werd cerebrospinaal vocht (CSV) van 18 CVS/M.E-patiënten en 5 gezonde controles verzameld. De CSV-stalen werd onderzocht wat betreft expressie van 27 cytokinen (IL-1beta, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17, ‘basic’ FGF [‘fibroblast growth factor’], eotaxine [een chemokine], G-CSF [granulocyt kolonie-stimulerende factor], GM-CSF [granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor], IFN-gamma, IP-10, MCP-1 [monocyten chemo-attractant proteïne; een inflammatoire mediator gesecreteerd door geaktiveerde microglia], [Macrofaag Inflammatoir Proteïne] MIP-1alfa, MIP-1beta, [platelet-derived growth factor’] PDGF-BB, RANTES [selektief chemotactisch cytokine voor T-lymfocyten en monocyten], TNF-alfa en VEGF [vasculaire endotheliale groeifactor]) d.m.v. de bioplex test voor 27 menselijk cytokinen.

Resultaten Van de onderzochte cytokinen waren er slechts vier significant gereduceerd bij de CVS/M.E.-patiënten in vergelijking met de controles.

Besluiten De resultaten tonen een daling qua pro-inflammatoire cytokinen in het CSV van CVS/M.E-patiënten en dit zou kunnen bijdragen tot de klinische ziekte-progressie.

[gerelateerd:

Lloyd A, Hickie I, Brockman A, Dwyer J, Wakefield D. Cytokine levels in serum and cerebrospinal fluid in patients with Chronic Fatigue Syndrome and control subjects. J Infect Dis. (1991) 164: 1023-4. (artikel niet on-line beschikbaar)

Natelson BH, Weaver SA, Tseng CL, Ottenweller JE. Spinal fluid abnormalities in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Diagn Lab Immunol. (2005) 12: 52-5. “11 cytokinen detekteerbaar in het CSV – GM-CSF lager bij patiënten t.o.v. controles – IL-8 hoger bij patiënten met plotse aanvang t.o.v. graduele aanvang – IL-10 hoger bij patiënten met abnormale CSV t.o.v. normale CSV of controles.”]

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 45 November 2014

Serum cytokines in patients with moderate and severe Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Sharni L. Hardcastle, Ekua Brenu, Naomi Wong, Samantha Johnston, Thao Nguyen, Teilah Huth, Ally Hawthorn, Rachel Passmore, Sandra Ramos, Ali Salajegheh, Don Staines, Sonya Marshall-Gradisnik

National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Doelstellingen Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een invaliderende ziekte met een ongekende etiologie en de diagnose is gebaseerd op symptoom-specifieke criteria. Immunologische ontregeling en cytokine-abnormaliteiten komen consistent voor bij CVS/M.E. Aangezien studies het belang hebben beklemtoond van het bepalen van ziekte-ernst subgroepen, was het doel van deze studie de relatie tussen ernst-subgroepen bij CVS/M.E. verder te onderzoeken, via het bepalen van Th1/Th2/Th17 en inflammatoire cytokinen bij patiënten met ernstige (bedlegerig) en matige (mobiel) CVS/M.E.

Methodes We gebruikten de 1994 CDC Criteria voor CVS/M.E. om de deelnemers te definiëren en ernst-schalen zoals de ‘Fatigue Severity Scale’ (FSS), ‘Dr. Bell’s Disability Scale’, de ‘FibroFatigue Scale’ en de ‘Karnofsky Performance Scale’ (KPS) werden aangewend ter bevestiging van subgroepen met matige (mobiel) of ernstige (bedlegerig) CVS/M.E. De deelnemers omvatten gezonde controles (n = 22; 40,14 ± 2,38 jaar), mobiele (n = 22; 42,09 ± 2,72 jaar) en bedlegerige (n = 19; 40,21 ± 1,57 jaar) CVS/M.E-patiënten. De serum-stalen werden beoordeeld d.m.v. de Bio-Plex Test voor cytokine-analyse. De cytokinen die werden gemeten, waren IL-1beta, IL-1ra, IL-2, IL-7, IL-10, IL-17, TNF-alfa en IFN-gamma.

Resultaten De resultaten toonden dat IL-1beta significant was gereduceerd bij ernstige CVS/M.E. vergeleken met matige CVS/M.E. (p = 0.002). IL-7 was significant verhoogd in de groep met ernstige CVS/M.E. vergeleken met controles en matige CVS/M.E. (p = 0.000, 0.000 respectievelijk). IFN-gamma was ook verhoogd bij ernstige CVS/M.E. vergeleken met matige CVS/M.E. (p = 0.025).

Besluit Dit is de eerste studie die variaties qua cytokinen aantoont bij matige en ernstige CVS/M.E.-patiënten waarbij alle significante verschillen liggen tussen de CVS/M.E.-ernst groepen. Deze studie ondersteunt de notie dat het noodzakelijk lijkt de CVS/M.E.-patiënten in subgroepen te klassificeren volgens ernst-graad, en dit zowel in research- als klinische settings.

[gerelateerd:

Stringer EA, Baker KS, Carroll IR, Montoya JG, Chu L, Maecker HT, Younger JW. Daily cytokine fluctuations, driven by leptin, are associated with fatigue severity in Chronic Fatigue Syndrome: evidence of inflammatory pathology. J Transl Med. (2013) 11: 93. (zie: ‘Leptine – verband met cytokinen & vermoeidheid bij CVS’)

White AT, Light AR, Hughen RW, Bateman L, Martins TB, Hill HR, Light KC. Severity of symptom flare after moderate exercise is linked to cytokine activity in Chronic Fatigue Syndrome. Psychophysiology (2010) 47: 615-24. (zie: Symptoom-opflakkering verbonden met cytokine-aktiviteit bij CVS’)]

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 76 November 2014

Cytokine profiles of Chronic Fatigue Syndrome and Multiple Sclerosis patients

Naomi Wong, Ekua Brenu, Sharni Hardcastle, Samantha Johnston, Thao Nguyen, Teilah Huth, Ally Hawthorn, Rachel Passmore, Sandra Ramos, Ali Salajegheh, Simon Broadley, Don Staines, Sonya Marshall-Gradisnik

National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, School of Medical Sciences, Griffith University, Gold Coast, Qld, Australia

Doelstellingen Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en Multipele Sclerose (MS) zijn aandoeningen met ernstige neuro-immune symptomen, inclusief cognitieve stoornissen, immuun-dysfunktie en abnormale cytokine-expressie. Het doel van deze studie was de T helper (Th) 1, Th2 en Th17 cytokine-profielen van CVS- en MS-patiënten te bepalen.

Methodes Deze studie heeft de cytokine-profielen van CVS-patiënten (n = 16; leeftijd 49,88 ± 9,542), MS-patiënten (n = 16; leeftijd 52,75 ± 12,809) en gezonde controles (n = 16; leeftijd 50,06 ± 11,846) gemeten. De diagnostische selektie-methode die werd gebruikt om CVS-patiënten te identificeren was de ‘International Consensus Criteria’. Cytokinen werden bepaald in het serum d.m.v. de Bio-Plex Pro(TM) kit voor Th1 (IFN-gamma, TNF-alfa), Th2 (IL-4, IL-6, IL-10, IL-13) en Th17 (IL-17) -cel cytokinen.

Resultaten Bij vergelijking van de 3 groepen, werd gevonden dat TNF-alfa (p = 0.011, p = 0.012), IL-4 (p = 0.000, p = 0.000), IL-6 (p = 0.039, p = 0.031), IL-13 (p = 0.000, p = 0.000) en IL-17 (p = 0.004, p = 0.038) allemaal significant hoger lagen bij de MS-patiënten vergeleken met de CVS-patiënten en de controles, respectievelijk. Bij de MS-patiënten en CVS-patiënten lagen de serum-waarden van IL-13 en IFN-gamma echter significant hoger (p =< 0.001) vergeleken met de controles. IFN-gamma was significant verschillend tussen MS en CVS (p = 0.001), waarbij MS hogere IFN-gamma serum-waarden vertoonde.

Besluit Cytokine-patronen ondersteunen Th1 én Th2 cytokine-profielen bij CVS en MS. Gelijkenissen qua cytokine-profielen bij MS en CVS, in combinatie met de reeds erkende overéénkomsten qua immuun-cel funktie en symptomen, suggereren een neuro-immune pathologie voor CVS die parallel loopt met die van MS. Bijkomende studies naar de cytokine-profielen van CVS én MS dienen te worden ondernomen, met grotere studie-groepen, om het begrip omtrent de pathologieën van beide aandoeningen verder uit te breiden.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.