M.E.(cvs)-wetenschap

augustus 14, 2014

Methylatie-profiel van CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:52 pm
Tags: , , , , , , ,

Lees, ter inleiding, ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid.’

Epigenetica slaat op het bestuderen van veranderingen qua gen-expressie die wordt veroorzaakt door bepaalde base-paren in het DNA, of het ‘afzetten’ of terug ‘aanzetten’ van RNA, d.m.v. chemische reakties. Het slaat ook op de studie van erfelijke veranderingen die niet worden veroorzaakt door wijzigingen in de DNA-sequentie; en – in mindere mate – op langdurige wijzigingen in de transcriptie van een cel die niet noodzakelijk erfelijk zijn. De term verwijst ook naar de veranderingen zelf: funktioneel relevante wijzigingen in het genoom die zonder veranderde nucleotide-volgorde.

Methylatie van een gen maakt deel uit van een epigenetisch aanpassing-proces. Eenvoudig uitgedrukt: het verandert de expressie van dat gen en dus de aanmaak van het respectievelijk proteïne. Methylatie is een vorm van epigenetische modificatie en beïnvloedt de transcriptie (stilleggen of aktiveren), gen-stabiliteit en ‘imprinting’ (proces waardoor een bepaalde variant van een gen – een allel – alleen tot expressie komt (aktief is), wanneer het van één specifieke ouder – vader óf moeder – afkomstig is). Het heeft ook een directe impact op de struktuur van het chromatine (complex van DNA en proteïnen in de celkern). Het gen muteert niet maar er wordt een methyl (CH3) -groep toegevoegd. De mechanismen voor genetische controle zijn complex maar (te weinig) hypo- en (te veel) hyper-methylatie van DNA is betrokken bij veel ziekten. Er bestaat ook methylatie van proteïnen, die proteïne-proteïne interakties & proteïne-DNA interakties, en proteïne-aktivatie reguleert.

De zogenaamde cytosine-guanosine dinucleotide (CpG) ‘eilanden’ zijn DNA-fragmenten met soms tot honderden opéénvolgende cytosine-guanosine dinucleotiden (de 4 bouwstenen van DNA: A, C, G & T), meestal ‘upstream’ van genen, die voorkomen in ongeveer de helft van de gen-promoters (startplaatsen, “aanknopingspunten” voor DNA-transcriptie; plaatsen in het DNA, vóór een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie – overschrijving naar RNA – te starten).

Dit project werd gefinancierd door de ‘Alison Hunter Memorial Foundation’, de ‘Mason Foundation’ en via het ‘Queensland Government Co-Investment Funding Grant Program’.

————————-

Clin Cell Immunol 2014, 5:3

Methylation Profile of CD4+ T Cells in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis

Ekua W Brenu (1,2), Donald R Staines (2) & Sonya M Marshall-Gradisnik (1,2)

1 School of Medical Science, Griffith Health Centre, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Australia

Samenvatting

Doelstelling Van methylatie is geweten dat het biologische processen reguleert en een verandering qua methylatie-patronen bleek verband te houden met een aantal ziekten. Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een onverklaarde aandoening geassocieerd met immunologische en molekulaire veranderingen. CD4+ T-cellen – specifiek: regulerende T-cellen (Tregs) – bleken betrokken bij CVS/M.E.: er werden significante toenames qua Tregs geobserveerd bij deze patiënten. Daarom was de doelstelling van deze studie om methylatie in CD4+ T-cellen van CVS/M.E.-patiënten te onderzoeken.

Methodes De studie omvatte 25 CVS/M.E.-deelnemers en 18 controles tussen 25-60 jaar. Er werd een volume van 20 ml totaal-bloed afgenomen bij elke deelnemer en de perifeer bloed mononucleaire cellen werden geïsoleerd via densiteit-gradient centrifugatie [scheidingstechniek]. De CD4+ T-cellen werden daaruit geïsoleerd. Er werden methylatie-studies uitgevoerd over het ganse genoom van de CD4+ T-cellen (‘Illumina Infinium 450 K Human methylation array system’). Data-analyse geschiedde via’Genome studio’ en ‘Partek Enrichment’ software.

Resultaten Er werden 120 differentieel gemethyleerde CpGs bij de CVS/M.E.-patiënten geobserveerd in vergelijking met de controles. Daarvan bleken er 70 geassocieerd met gekende genen. De meerderheid van de differentieel gemethyleerde gebieden van de CVS/M.E.-patiënten waren gehypomethyleerd. Bovendien waren de meeste van de genen met differentieel gemethyleerde gebieden bij de CVS/M.E.-patiënten verantwoordelijk voor apoptose, cel-ontwikkeling, cel-funktie en metabole aktiviteit.

Besluit De huidige studie toont aan dat epigenetische veranderingen in CD4+ T-cellen mogelijks een rol kunnen spelen bij de immunologische veranderingen die worden gezien bij CVS/M.E.-patiënten.

Inleiding

[…] Bij CVS/M.E. is een ontwrichting van immunologische processen, inclusief verminderde cytotoxische aktiviteit en verhoogde waarden van regulerende T-cellen, betrokken [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ & ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’; ook: Brenu EW et al. Longitudinal investigation of Natural Killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88]. Verder kunnen CVS/M.E.-patiënten differentiële expressie in genen vertonen die verscheidene fysiologische processen reguleren die bekend staan abnormaal te zijn bij CVS/M.E. [Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol (2005) 58: 826-832 /// Frampton D, Kerr J, et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kerr JR. Gene profiling of patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. Curr Rheumatol Rep (2008) 10: 482-491 /// Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis (2008) 197: 1171-1184 /// Kerr JR et al. Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol (2008) 61: 730-739 /// ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiële biomerkers bij M.E.(cvs)]. Er werd tot op heden nog geen bondig pathomechanisme voor CVS/M.E. en concrete diagnostische biomerkers geïdentificeerd.

DNA-methylatie is een epigenetisch modificatie-proces waarbij DNA-methyltransferasen [enzymen] een methyl-groep toevoegen aan de 5’ positie [uiteinde waar fosfaat-groepen kunnen binden] van cytosinen van CpG-dinucleotiden. Dit proces heeft veel gevolgen op gen-expressie aangezien de mate en het patroon van de 5-methylcytosinen de hoeveelheid gen-expressie dicteert in een bepaald gebied. DNA-methylatie recruteert ‘transcriptionele co-repressors’ van de methyl-DNA bindende domein familie, die de transcriptie van bepaalde genen onderdrukt. Regulering van DNA-methylatie is belangrijk, in het bijzonder, tijdens embryonale ontwikkeling, chromatine-condensatie en genomische ‘imprinting’ [zie onze inleiding]. Epigenetische modificaties kunnen heel belangrijk zijn bij verscheidene ziekten, inclusief inflammatoire en auto-immuun ziekten. Belangrijk is dat werd gesuggereerd dat epigenetische modificaties verantwoordelijk zijn voor bepaalde immuun-gerelateerde ziekten. Toe- en afnames van DNA-methylatie bleken de expressie te reguleren van T-cel gerelateerde cytokine-genen zoals IL-2 en IL-6.

Bij CVS/M.E. werden veranderingen qua gen-expressie gerapporteerd voor een aantal mRNA en microRNA genen betrokken bij verscheidene immuun-processen. [microRNAs = kleine RNAs die een spil-funktie vervullen bij het reguleren van gen-expressie] Tot op heden werd de rol van cel-specifieke methylatie bij CVS/M.E. echter nog niet onderzocht. Deze studie voerde een analyse uit van differentiële methylatie over het ganse genoom van CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten en niet-vermoeide controles.

Materialen & Methodes

Ethische goedkeuring

[…]

CVS/M.E.-patiënten en controles

25 patiënten met CVS/M.E. (21 vrouwen en 4 mannen; leeftijd = 50,31 ± 2,27). 1994 CDC definitie. […]. Alle patiënten maakten melding van lage tot matige lichamelijke aktiviteit and voltijdse tewerkstelling. [Niet de meest geïnvalideerden dus… Bij ziekere patiënten zouden de methylatie-resultaten misschien nog dramatischer zijn…] Niet-vermoeide controle-groep:18 deelnemers zonder CVS/M.E. of andere medische aandoeningen (10 vrouwen en 8 mannen; leeftijd = 47,44 ± 2,16). Deelnemers met auto-immuun ziekten, psychose of die roken werden uitgesloten.

CD4+ T-cel isolatie

[…] Isolatie van CD4+ T-cellen d.m.v. magnetische ‘beads’ gelabeld met merkers die de CD4+ T-cel populatie uitsloten. […]

DNA-extractie en -methylatie

[…] EZ DNA Methylatie kit (Zymo Research) – bisulfiet [HSO3] behandeling van DNA [ongemethyleerd cytosine wordt omgezet naar uracil in DNA, gemethyleerd cytosine niet; via direct sequentie-bepaling kan dan de plaats van ongemethyleerde cytosinen en 5-methylcytosinen worden bepaald] […].

HRM-analyse

[‘High Resolution Melt’ (HRM) analyse is een techniek in de molekulaire biologie voor het opsporen van mutaties, polymorfismen en epigenetische verschillen in dubbelstrengig DNA. De ‘smelt-temperatuur’ (waarbij de 2 DNA-strengen van een nucleotide-sequentie uit elkaar gaan of ‘smelten’ verandert als er een mutatie aanwezig is.] Voor deze genen: NINJ2, HSPD1, TEX14, HLA-C, RAD51C, FMN2, DGKQ, LIPT1, GJA9 en MYCBP. […]

Statistische analyse

Kwaliteitscontrole voor de verschillende stappen. […]

Resultaten

Kenmerken van de deelnemers

[…] Geen significante verschillen voor leeftijd of parameters bij tellingen op vol-bloed tussen CVS/M.E. en controles.

Algemeen methylatie-patroon in CD4+ T-cellen

[…] Er werden in het totaal 485.577 methylatie-plaatsen in het genoom onderzocht. […] Er werd een overheersende trend van genoom-hypomethylatie vastgesteld in de CD4+ T-cellen van de CVS/M.E.-patiënten vergeleken met de controles. We detekteerden 120 CpGs die differentieel gemethyleerd waren en 85% daarvan vertoonden hypomethylatie (14,17% hypermethylatie). 75 van die gemethyleerde gebieden waren gelinkt met gekende genen (de rest waren ongekend). Deze differentieel gemethyleerde (dmCpG) sites werden gedetekteerd op chromosomen 1-22, zonder een bepaalde concentratie op één chromosoom. Struktureel waren deze dmCpGs gelokaliseerd op de 3’UTR, 5’UTR [speciale sequenties in het mRNA die einde en start van de translatie aangeven] en transcriptie-start-plaatsen; met een groot deel gelokaliseerd binnen het gen. 30% van de CpG-eilanden waren geassocieerd met gen-promoters.

Differentieel gemethyleerde genen

De dmCpGs werden gevonden in 75 genen in de CD4+ T-cellen. Het gen met de meeste dmCpG-sites was NINJ2 – 3 CpG-sites in dit gebied vertoonden hypomethylatie. Toevallig bevatte dit gen CpG-sites die zeer veel hypomethylatie vertoonden bij de CVS/M.E.-patiënten vergeleken met de controles. Dit gen werd voorheen niet geassocieerd met CVS/M.E. Daarenboven werd geen enkel van de genen die in de huidige studie werden geïdentificeerd eerder geassocieerd met CVS/M.E. De analyse van miRNA-methylatie leverde 176 miRNAs met significante dmCpGs op, daarvan vertoonden 82 miRNA-genen hypermethylatie en 94 hypomethylatie.

Gen-ontologie en mechanisme-aanrijking profiel

Om te bepalen of de dmCpGs biologisch significant waren, werd software (Partek) toegepast op alle genen met dmCpGs die significant gewijzigd waren (p < 0.05). [significante verschillen in expressie werden bepaald op een aanrijking ≥ 3] Gen-aanrijking analyse detekteerde 59 verschillende funktionele termen (p < 0.05) die geassocieerd waren met dmCpG-sites en deze kunnen geklassificeerd worden in 3 groepen: biologische, cellulaire en molekulaire processen. De meest bepalende factor om te suggereren dat deze genen werden aangetroffen in CD4+ T-cellen, was de waarneming dat sommige van deze genen gerelateerd waren met MHC Klasse-II receptor aktiviteit (HLA-DQB1 [MHC = genen die coderen voor membraan-proteïnen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]). Genetische mechanismen die specifiek zijn voor deze sites werden bepaald gebruikmakend van KEGG [‘Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes’; database met genomen, biologische mechanismen, ziekten, medicijnen en chemische substanties] mechanisme-analyse. Deze analyse identificeerde HLA-C en HLA-DQB1 als genen in het mechanisme met de hoogste aanrijking.

MicroRNA-methylatie patroon in CD4+ T-cellen

De microRNA-methylatie patronen werden onderzocht in the CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten en niet-vermoeide controles. Er werd een totaal van 2.291 methylatie-sites gezien. Daarvan waren er 133 differentieel gemethyleerd tussen de 2 groepen: 51,9% met hypomethylatie en 48,1% met hypermethylatie.

Validering van gemethyleerde genen via HRM

Van de genen die werden geselekteerd voor HRM-analyse, zagen we significante veranderingen in de ‘smelt-temperatuur’ van DGKQ.

Bespreking

Dit is de eerste studie die rapporteert over een genomische DNA-methylatie analyse in CD4+ T-cellen van CVS/M.E.-patiënten. Dit is ook de eerste studie die significante hypo- en hyper- methylatie sites in CD4+ T-cellen bij CVS/M.E.-patiënten aantoont. Er werd een overwegende hypomethylatie geobserveerd bij de CVS/M.E.-patiënten en die was overwegend in de promoter-gebieden van genen gelokaliseerd. De genen met dmCpG-sites waren geassocieerd met een aantal gen-ontologie termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] en mechanismen die significant aangerijkt waren in de CVS/M.E.-groep.

Mechanisme-aanrijking analyse toonde dat de meeste van de genen met significante dmCpG-sites betrokken waren bij 47 verschillende mechanismen. Van deze waren die met de significantste aanrijking betrokken bij type-I diabetes mellitus, auto-immune schildklier ziekte, virale myocarditis, antigen-verwerking en -presentatie, en cel-adhesie molekulen. De genen gerelateerd met deze mechanismen waren HLA-C en HLA-DQB1. HLA-C is een ‘major histocompatibility complex’ I (MHCI) gen dat geassocieerd bleek met de progressie van Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV). De HLA-C molekule wordt herkend door ‘Killer Immunoglobulin-like Receptors’ [KIRs; behoren tot de immunoglobuline super-familie en binden specifiek met MHC klasse-I eiwitten die voorkomen élke cel van het lichaam met een kern; zie ‘Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS], KIR2DL1 en KIR2DL2,3. Onder de CD4+T-cellen is er een subgroep die gekenmerkt wordt door ‘non-MHC restricted’ cytotoxiciteit [MHC-restrictie verwijst naar het feit dat een bepaalde T-cel een peptide-antigen enkel zal herkennen wanneer het gebonde is aan een MHC-molekule van de gastheer], met Natural Killer (NK)-achtige aktiviteit en HLA-Cw7 afhankelijke inhibitie van cytotoxische aktiviteit. Methylatie in HLA-C zou daarom de cytotoxische aktiviteit gemedieerd door CD4+ T-cellen kunnen aantasten en een rol voor HLA-C beperkte T-cel respons kunnen suggereren bij CVS/M.E. Bij CVS/M.E.-patiënten is geweten dat cytotoxische aktiviteit gereduceerd is in NK- én CD8+ T-cellen; een globale vermindering qua NK-aktiviteit zou kunnen aanhouden bij CVS/M.E.-patiënten en dit zou verband kunnen houden met veranderingen in de epigenetische patronen die cytotoxische aktiviteit reguleren. Daarenboven zou methylatie in HLA-C diversiteit in HLA-C ‘restricted’ T-cellen, als een gevolgd van verminderde HLA-C expressie op dendritische cellen in de thymus tijdens T-cel ontwikkeling in de thymus, kunnen aanduiden. HLA-DQB1 is een MHCII gen. Er bleken polymorfismen in een aantal HLA-DQB1 geassocieerd met vatbaarheid voor bepaalde types kankers. In het bijzonder: HLA-DQB1 werd geïdentificeerd als een risico-factor voor slokdarm-kanker. HLA-DQ allelen, vooral HLADQA1*01 en HLA-DQB1*06 bleken verhoogd bij CVS/M.E.-patiënten, hoewel de toename van HLA-DQB1*06 slechts minimaal was [Smith J, Fritz EL, Kerr JR et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol (2005) 58: 860-863].

Methylatie in genen gerelateerd met molekulaire processen zoals membraan-transport, kinase-aktiviteit, nucleotide- en ribonucleotide-binding, GTPase-aktiviteit en transferase-aktiviteit, zouden bij deze patiënten defekten in molekulaire processen kunnen suggereren die specifiek zijn voor CD4+ T-cellen. Bv. STK17B is betrokken bij calcium- en ROS-signalisering in CD4+ T-cellen en hypomethylatie in dit gen zou dit proces kunnen veranderen. Daarenboven zou methylatie in TXNRD1 de anti-oxidante capaciteit van T-cel kunnen aantasten. RPS6KA2 en SGK1 zijn geassocieerd met de regulering van mTOR-signalisering [TOR = ‘Target Of Rapamycin’; de ‘m’ staat voor ‘mammalian’ – van zoogdieren; mTOR is een centrale regulator van de cel-groei en proliferatie in respons op omgeving-stimuli zoals groei-factoren of nutriënten], die belangrijk is bij overleving/groei/differentiatie van lymfocyten en proliferatie van T-cellen om een doeltreffend metabolisme, cytoskeletale organisatie en apoptose te verzekeren. Belangrijk: RPS6KA2 bleek ook geassocieerd met het MAPK-signalisering-mechanisme [‘mitogen activated protein’ (MAP) kinasen reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleren verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose] en dit is van belang bij in T-cel gemedieerde responsen. Tijdens T-cel aktivatie vormen HSPE1 en HSPD1 een complex dat de aktiviteit van pro-caspase 3 [enzyme betrokken bij apapotose, ‘geprogrammeerde cel-dood’] reguleert. Differentiële methylatie in deze genen zou daarom schadelijk voor caspase-aktiviteit kunnen zijn. Belangrijk is dat werd voorgesteld dat mitochondriale dysfunktie betrokken is bij CVS/M.E. [bv. ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?]; dit zou geassocieerd kunnen zijn met veranderingen in NDUFA [gen coderend voor een subcomplex van NADH-dehydrogenase (mitochondriale ademhaling-keten)] en OXA1L [‘Oxidase (cytochrome-c) assembly 1-like’ (assemblage complexen van de mitochondriale ademhaling-keten)]. Zo waren ook genen verantwoordelijk voor DNA-herstel, inclusief ATM, RAD51 en RAD51C, ook differentieel gemethyleerd bij de CVS/M.E.-patiënten.

Hoewel de precieze werking van een aantal genen in T-cellen onbekend is (DOCK4, BRWD1, ASXL2, MED13, NPAT, C20ORF3 en PHF19), suggereert de observatie dat de meeste van deze genen verband houden met intracellulaire processen mogelijke abnormaliteiten binnenin de cel, die zich kunnen voordoen onder de vorm van verhoogde cel-aantallen en veranderingen qua cytokine-niveaus.

DGKζ (Diacylglycerol-kinase-theta) komt tot expressie in T-cellen en staat bekend als regulator van de grootte-orde van de TCR- [T-cel receptor] respons, door inhibitie van MAPK-aktivatie en de expressie van co-stimulerende molekulen zoals CD69 en CD25. Bij CVS/M.E. is weinig bekend over de status van de TCR. Aanpassingen in de expressie van DGKζ zouden echter belangrijk kunnen zijn bij de aandoening.

Van de 176 miRNAs met significante dmCpGs, waren er 8 CD4+T-cel specifieke miRNA-genen, inclusief miR-124, miR-155, miR-181a, miR-142, miR-27a, miR-339, miR-340 en miR-425. MiR-155 is noodzakelijk voor de differentiatie en proliferatie van CD4+ T-cellen naar 4 voornaamste subsets (Th1, Th2, Th17 en Tregs). In FOXP3-specifieke Tregs is miR-155 ge-upreguleerd en een daling van miR-155 doet het aantal van deze cellen verminderen. Veranderingen in miR-155 regulering zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de toenames in Tregs die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten en de verschuivingen in Th1/Th2 immuun-gerelateerde responsen [zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Bij aktivatie van de T-cel receptor zijn een aantal signalisering-mechanismen betrokken waarvan de genen gemethyleerd waren in de huidge studie. Belangrijk: TCR-signalisering wordt gemoduleerd door miR-181a, aangezien het autoreaktiviteit inhibeert via het bevorderen van immuun-tolerantie en het versterken van TCR-responsiviteit. In aanwezigheid van miR-181a komen autoreaktieve immuun-responsen voor die resulteren in auto-immuniteit. miR-124 en miR-27a komen tot over-expressie bij, respectievelijk, centrale en effector ‘memory’ CD4+ T-cellen tijdens differentiatie [Een antigen-specifieke ‘memory’ T-cel expandeert tot grote aantallen effector T-cellen bij her-blootstelling aan het oorspronkelijk antigen; zie o.a. ‘Heterologe immuniteit – overzicht]. Bij de CD4+ helper T-cellen is miR-425 gereduceerd in Th1-cellen, terwijl miR-142 verhoogd is bij expressie in Tregs.

Tot besluit: de huidige studie identificeerde voor het eerst een mogelijke ontwrichting van epigenetische mechanismen in CD4+ T-cellen en dit zou kunnen bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E. De belangrijkste bevinding in de huidige studie is de dmCpG in het DGKζ gen en CD4+ T-cel specifieke miRNAs. Aangezien in eerdere studies veranderingen bij CVS/M.E.-patiënten werden gezien, is het mogelijk te stellen dat deze molekulen belangrijk kunnen zijn bij het ontcijferen van een in mechanisme voor CVS/M.E. Epigenetische veranderingen in immuun-cellen kunnen een belangrijke component van CVS/M.E. zijn.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: