M.E.(cvs)-wetenschap

mei 5, 2018

Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen

Filed under: Behandeling,Celbiologie — mewetenschap @ 7:52 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel betreffende AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) – niet te verwarren met ‘mitogen-activated protein kinase’ (MAPK) – is een vervolg op ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’. AMPK is een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt; een nutriënten- en energie-sensor die zorgt voor energie-homeostase. Het is ook betrokken bij de ‘cell danger response’, beschreven door Robert Naviaux: “AMPK optimaliseert de energie-efficiëntie en stimuleert de recyclage van cellulaire materialen bij autofagie (opruimen van beschadigde mitochondrieën). De mechanismen die geaktiveerd worden door AMPK ondersteunen regeneratie en zijn anti-inflammatoir omdat ze beschadigde proteïnen, lipiden, glycanen, RNA en DNA afbreken. AMPK faciliteert de her-synthese van deze macromolekulen via nieuw gesynthetiseerde monomeren en ververste bouwstenen.”.

Ook op te merken (zie ons stuk ‘Potentiële speeksel-biomerkers bij M.E.(cvs)’):“Er werd een een downregulering van ZAG (zink alfa-2-glycoproteïne; een belangrijke regulator van het energie-metabolisme in skelet-spieren) gevonden bij CVS. Dit adipokine (cytokine afgegeven door vet-weefsel) speelt een rol bij aktivatie AMPK, een belangrijke regulator van energie-metabolisme in cellen van menselijke skelet-spieren.”…

In een kort overzicht getiteld ‘Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis’ (Biochemical Society Transactions; 2018) Laat Prof. Julia Newton optekenen: “Studies die veranderingen qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS tonen, dienen omzichtig te worden geïnterpreteerd aangezien de mitochondriale veranderingen te wijten kunnen zijn aan de ontregeling van verdergelegen signalisering-mechanismen, zoals het AMPK-mechanisme, eerder dan een defekt in de mitochondrieën zelf.”

AMPK-aktivatie door metformine bleek al de respons op oxidatieve stress en het mitochondriaal metabolisme te verbeteren in fibromyalgie-fibroblasten (‘Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients’; Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease (2015) 1852: 1257-1267)…

————————-

Bioscience Reports (Pre-print April 2018)

Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with M.E./CVS

Audrey E Brown, Beth Dibnah, Emily Fisher, Julia L Newton, Mark Walker

Institute of cellular medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Achtergrond Vermoeide skeletspieren en post-exertionele malaise zijn sleutel-symptomen van Myalgische Encefalomyelitis (M.E./CVS). We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord zijn in celculturen van menselijke skeletspieren afkomstig van patiënten M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie, een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro. Het doel van deze studie was vaststellen of AMPK farmacologisch kan worden geaktiveerd bij M.E./CVS.

Methodes

Primaire skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden behandeld met metformine of ‘compound 991’. De AMPK-aktivatie werd beoordeeld via western-blot en de glucose-opname werd gemeten.

Resultaten Zowel metformine als ‘compound 991’ behandeling verhoogde de AMPK-aktivatie en glucose-opname in culturen van spiercellen significant bij controles en M.E./CVS. De cellulaire ATP-inhoud bleef onveranderd door de behandeling hoewel deze significant verminderd was bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Besluiten Farmacologische aktivatie van AMPK kan de glucose-opname in spiercel-culturen van patiënten met M.E./CVS verbeteren. Dit suggereert dat het feit dat elektrische puls stimulatie AMPK in dergelijke spiercel-culturen niet kon aktiveren, te wijten is aan een defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defect af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij M.E./CVS-patiënten verbetert.

Inleiding

[…]

AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) is een belangrijke mediator van de skeletspier-respons op inspanning. In respons op een energie-tekort, zoals tijdens spier-contractie, wordt AMPK geaktiveerd, resulterend in het uitschakelen van ATP-verbruikende processen en het opstarten van ATP-genererende processen. In skeletspieren omvat dit een verhoging van de opname van glucose in de spiercellen. We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie verstoord is in celculturen van skeletspieren afkomstig van patiënten met M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie (EPS), een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Deze abnormale AMPK-aktivatie resulteerde ook in een onvermogen op glucose-opname in de cellen in respons op EPS te verhogen.

AMPK is een heterotrimeer [samengesteld uit 3 verschillende onderdelen] complex van α, β & γ subunits. Er bestaan meerdere isoformen voor elke subunit en sommige isoformen komen tot expressie in een celtype- of weefsel-specifieke manier. AMPK kan allosterisch [verandering (dikwijls door wijziging van de 3-dimensionele vorm) van de aktiviteit van een proteïne/enzyme door de binding van een effector-molekule op een specifieke plaats] worden geaktiveerd, vooral door AMP, of via aktivatie van kinasen [groep enzymen die een fosfaat-groep aanbrengen op een proteïne of andere molekule (fosforylatie)] inclusief lever kinase-B1 (LKB1) en het Ca2+/calmoduline-afhankelijk kinase kinase (CaMKK). AMPK kan ook worden gereguleerd door farmacologische middelen zoals metformine, dat AMPK indirect aktiveert via de inhibitie van de ATP-synthese. Er werd een aantal kleine aktiverende molekulen ontwikkeld die direct op AMPK binden, resulterend in allosterische aktivatie van AMPK.

Het doel van deze studie was om te onderzoeken of AMPK gemodifieerd kan worden door farmacologische behandeling van culturen van menselijke skeletspier-cellen afkomstig van patiënten met M.E./CVS. We gebruikten een indirecte aktivator van AMPK (metformine [medicijn ter behandeling van diabetes type-2]) en een directe aktivator (‘compound 991’ [kleine organische molekule die bindt op AMPK; ontwikkeld door Merck – patent WO2010036613) om AMPK-aktivatie, glucose-opname en ATP-content van spiercellen na te gaan.

Studie-ontwerp en methodes

Studie-individuen

Er werden spier-biopten verkregen van 10 patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom en 7 gezonde controle-individuen. De groepen warden gematcht voor leeftijd, en omvatten vrouwen en mannen. […] Alle patiënten voldeden aan de Fukuda criteria […]. Niemand vertoonde een neurologisch gebrek op basis van de klinische beoordeling. […]

Reagentia

[…]

Celculturen

[…] Alle experimenten warden uitgevoerd op gedifferentieerde myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] […].

Western-blotting

[…]

ATP-bepaling

[…]

Glucose-opname

[…]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op AMPK-aktivatie

Skeletspier-cellen van 7 gezonde controles en 8 CVS-individuen werden opgekweekt gedurende 7 dagen om te differentiëren. De cellen werden behandeld met 2 mM metformine gedurende 16 h of 1 μM ‘compound 991’ gedurende 2 uur vóór proteïne-extractie en ‘western blotting’. Metformine-behandeling verhoogde significant de AMPK-aktivatie […] bij controle- (p < 0.01) en CVS- (p < 0.05) myotubes (t.o.v. onbehandeld). De behandeling met ‘compound 991’ had een gelijkaardig effect: significante toename van de AMPK-aktivatie t.o.v. onbehandelde myotubes bij controles en CVS (p < 0.05). De fosforylatie van acetyl-CoA carboxylase [enzyme; AMPK is de voornaamste kinase-regulator van ACC] verhoogde op een dosis-afhankelijke manier in respons op ‘compound 991’.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op glucose-opname

Er kan worden verwacht dat de aktivatie van AMPK leidt tot een toename qua glucose-opname. Metformine-behandeling verhoogde significant de glucose-opname bij controle- en CVS-cellen, en het effekt was vergelijkbaar met dat van insuline. Bij de controles verhoogde metformine de glucose-opname van 632,8 ± 50,4 pmol/mg/min tot 1.014 ± 79,2 pmol/mg/min (p < 0.0005), terwijl bij CVS de glucose-opname steeg van 576,4 ± 26,5 pmol/mg/min tot 715 ± 21,2 pmol/mg/min (p < 0.0005). Behandeling met ‘compound 991’ verhoogde ook de glucose-opname bij concentraties van 0,1 μM & 1 μM bij zowel controle- als CVS-cellen. Bij de controles steeg de glucose-opname van 802,2 ± 59,4 pmol/mg/min tot 963,9 ± 37,9 pmol/mg/min en 1.084,3 ± 44,9 pmol/mg/min (p < 0.05) voor 0.1 μM & 1 μM 991, respectievelijk. ‘Compound 991’ verhoogde de glucose-opname van 633,8 ± 56,8 pmol/mg/min tot 933,7 ± 93,3 pmol/mg/min (p < 0.01) en 913,9 ± 105,7 pmol/mg/min (p < 0.01) voor 0,1 μM & 1 μM, respectievelijk. Voor zowel controle- als CVS-cellen was het effekt van de behandeling met ‘compound 991’ vergelijkbaar met dat van insuline.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op cellulaire ATP-inhoud

Behandeling met metformine of ‘compound 991’ verlaagde de cellulaire ATP-inhoud niet. De ATP-inhoud is echter significant gedaald in spiercel-culturen van CVS-patiënten in vergelijking met controles (p < 0.05), ongeacht de behandeling.

Bespreking

Deze studie toont aan dat AMPK en daaropvolgende ‘downstream’ effekten kunnen worden geaktiveerd door zowel een indirecte (metformine) als directe (‘compound 991’) aktivator van AMPK in skeletspier-cellen van patiënten met M.E./CVS. Dit in tegenstelling met onze eerdere studie van dezelfde spiercel-culturen die toonde dat EPS-gemedieerde contractie niet in staat was AMPK en glucose-opname te aktiveren in skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten. Deze bevindingen duiden op een signalisering-defekt in de nabijheid van AMPK en er zijn verdere studies aan de gang om de expressie en werking van de belangrijkste proximale signalisering-molekulen te verkennen in M.E./CVS-culturen. Dit is het eerste rapport dat aantoont dat ‘compound 991’ actief is bij menselijke skeletspiercel-culturen. Er werd eerder aangetoond dat ‘compound 991’ de AMPK-aktiviteit en glucose-opname verhoogt in geïsoleerde skeletspieren van ratten. Deze effekten worden te niet gedaan in AMPKα1-/α2 myotubes van ‘knockout’ muizen, wat suggereert dat ‘compound 991’ specifiek werkt via AMPK. Verder bewijsmateriaal voor de specificiteit van ‘compound 991’ van AMPK wordt aangegeven door een screening van ‘compound 991’ tegen een panel proteïne-kinasen in cel-vrije testen. Dit toonde dat ‘compound 991’ AMPK-aktiviteit versterkt terwijl het geen effekt heeft op ‘upstream’ kinasen inclusief LKB1 & CaMKK.

Bewijsmateriaal geeft aan dat AMPK-aktivatie de glucose-opname verhoogt via aktivatie van AS160 [proteïne dat fosforylatie-afhankelijke glucose-opname in spiercellen medieert] en glucose-transporter translocatie naar het cel-membraan. Als onderdeel van ons lopend werk, onderzochten we hoe het zit met de AMPK-gemedieerde glucose-opname (met bijzondere focus op glucose-oxidatie en glycolyse) in de M.E./CVS-culturen. De regulering van AMPK is complex. Naast allosterische aktivatie door de binding van AMP, kan AMPK geaktiveerd worden door upstream kinasen zoals LKB1 & CaMKK. Een verstoorde inspanning-gestimuleerde glucose-opname in spier-specifieke LKB1 ‘knockout’ [gen coderend voor lever kinase-B1 ontbreekt] muizen suggereert dat LKB1 het voornaamste kinase zou kunnen zijn dat betrokken is bij regulering van AMPK bij contractie van skeletspieren. Het verband tussen AMPK en inspanning-tolerantie werd ook aangetoond bij AMPK-‘knockout’ muizen. Een skeletspier-specifiek AMPK-‘knockout’ model toonde een verminderde inspanning-capaciteit (‘voluntary wheel running’ [aktiviteit-meting bij proefdieren, waarbij ze vrij in een rad lopen] en ‘treadmill running to exhaustion’ [inspanning op een loopband tot uitputting]). Verstoorde spier-funktie werd aangegeven door een gedaalde maximale kracht en resistentie tegen vermoeidheid ex vivo [experiment met levend weefsel, buiten het lichaam]. Het is ook duidelijk dat spier-funktie sterk afhankelijk is van de metabole funktie, bijzonderlijk glucose-opname, zoals getoond in GLUT4-‘knockout’ [gen coderend voor glucose-transporter type-4 ontbreekt] muizen. Deze modellen tonen dat wanneer de glucose-opname verstoord is, de gevoeligheid voor vermoeidheid na inspanning versterkt is. Onderzoekers toonden ook dat de maximale kracht-ontwikkeling en het samentrekking-vermogen gedaald waren in deze muizen-modellen. Zoals werd gezien voor onze M.E./CVS skeletspiercel-culturen, in respons op contractie geïnduceerd door EPS, zijn zowel AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord is. We zouden voorspellen dat het ontbreken van een effekt op glucose-opname door EPS de samentrekking van spieren zou kunnen verstoren, leidend tot inspanning-intolerantie. De huidige studie suggereert dat dit onvermogen om AMPK te aktiveren in respons op contractie zou kunnen worden omzeild d.m.v. een farmacologische interventie, en bijdraagt aan het bewijs voor een klinische test aangaande een AMPK-aktivator in M.E./CVS.

Een andere belangrijke bevinding van deze studie is de significante daling qua cellulaire ATP-inhoud in skeletspieren bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Deze afname trad op ongeacht de behandeling en werd op 2 afzonderlijke momenten gemeten. Een gereduceede ATP-inhoud werd eerder al gezien bij M.E./CVS-patiënten na inspanning [Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-1722] en verstoorde ATP-synthese werd ook al vastgesteld bij patiënten in vivo [Vermeulen RC, Kurk RM, Visser FC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93]. De ATP-inhoud beïnvloedt cel-overleving: een met leeftijd gerelateerde afname van de ATP-hoeveelheid in gecultiveerde fibroblasten is gelinkt met een verhoogde gevoeligheid voor cel-dood door necrose. Een andere studie rapporteerde echter verhoogde ATP-waarden in perifeer bloed mononucleaire cellen van patiënten met M.E./CVS [Lawson N et al. Elevated Energy Production in Chronic Fatigue Syndrome Patients. J Nat Sci (2016) 2]. Deze auteurs suggereerden dat vermoeidheid gelinkt zou kunnen zijn met niet-mitochondriale processen die ATP produceren, zoals glycolyse.

Potentiële oorzaken van een reductie qua cellulaire ATP-inhoud omvatten stoornissen van de mitochondriale funktie, een afname van het mitochondriaal membraan potentiaal, of verhoogde produktie van reaktieve zuurstof/stikstof soorten (ROS/RNS). Bewijsmateriaal voor een daling van de mitochondriale funktie in skeletspieren bij M.E./CVS is tegenstrijdig. Sommige studies vonden een verminderde mitochondriale inhoud, maar geen mitochondriale dysfunktie in skeletspier-biopten van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738], terwijl anderen metabole abnormaliteiten (consistent met verstoorde mitochondriale werking) identificeerden bij M.E./CVS [Naviaux RK, Naviaux JC et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: E5472-5480]. ROS kunnen een belangrijke rol spelen bij het vermogen van skeletspieren om zich aan te passen bij inspanning maar evenzeer kunnen toegenomen ROS de mitochondriale funktie verstoren, de samentrekkingskracht van spieren reduceren en bijdragen tot spier-dysfunktie. Er is enig bewijsmateriaal dat suggereert dat oxidatieve stress mechanismen geaktiveerd zijn in vivo bij M.E./CVS [Kennedy G, Spence VA, McLaren M et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39: 584-589] maar, naar ons weten, werd dit niet onderzocht in vitro. Toekomstig werk zal zich moeten focussen op het onderzoeken van de mechanismen die er voor zorgen dat contractie AMPK niet kan aktiveren en op de mitochondriale funktie in skeletspieren.

De belangrijk bevindingen van deze studie zijn dat, ten eerste, farmacologische aktivatie van AMPK de glucose-opname in skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten kan verbeteren en, ten tweede, cellulaire ATP-inhoud significant verminderd is in M.E./CVS spiercel-culturen. De vaststelling dat AMPK op een directe manier werd geaktiveerd door metformine en ‘compound 991’ maar niet via EPS in M.E./CVS culturen duidt op een signalisering-defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defekt af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij patiënten met M.E./CVS verbetert.

Advertenties

april 21, 2018

NIR-spectroscopie screening ter detektie van pathogene mitochondriale DNA-varianten bij ‘onverklaarde vermoeidheid’

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , , , ,

Op onze pagina’s hadden we het al over M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte. We gaven er daaromtrent de mening van M.E.(cvs)-specialisten weer. Een Italiaans onderzoeksteam schreef dienaangaande ook: “Een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong zou de daling in funktionele mogelijkheden van de spier kunnen verklaren, zowel als een vermindering in kracht maar, vooral, een vermindering in weerstand.” (‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’). Oproepen tot verder onderzoek bleven niet uit; zie ‘Rol van mitochondriale dysfunkties bij pijn (CVS & FM)’ & ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’. Er werd ook gewag gemaakt van “extreem zware of uitputtende inspanning die mitochondriale stoornissen bevordert, die de werking ervan permanent kunnen beschadigen” (zie ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’)…

Onderstaande publicatie over onderzoek uitgevoerd door researchers en artsen verbonden aan de Universiteit Gent zou een respons op de vraag naar meer onderzoek kunnen vertegenwoordigen maar jammer genoeg toont het de ongemakkelijke spreidstand aan tussen verschillende ‘stromingen’ betreffende onverklaarde vermoeidheid. Sommigen (bv. Prof. Van Coster) gaan hier voor de hypothese dat M.E.(cvs) elementen van een mitochondriale myopathie heeft, terwijl de adepten van de biopsychosociale school (bv. psychiater dr Mariman) alle langdurige vermoeiden op één hoop gooit, brede definities hanteren en een mengelmoes van patiënten (waarvan misschien slechts enkelen die M.E.(cvs) hebben) in één studie opnemen. Dat deze zoektocht slechts bij 1/3 aanwijzingen voor een eventuele mitochondriale myopathie oplevert, lijkt ons dan ook maar evident. Men zal argumenteren dat dit een piloot-studie betreft met maar een klein aantal patiënten maar ons lijkt dit een quasi amateuristische aanpak die van bij aanvang gedoemd is te mislukken en/of dergelijke halfslachtige resultaten op te leveren. Verder blijft de noodzakelijkheid van (invasieve) biopten een bijkomend obstakel. Ook hierbij is het amateurisme niet ver weg, te meer daar we vernemen dat spierbiopt-materiaal van sommige deelnemers gewoon is ‘verdwenen’…

De waarde van de nieuwe methodiek kan o.i. enkel worden nagegaan bij patiënten die beoordelen aan de geschikte criteria voor M.E.(cvs).

————————-

Appl Spectrosc. (2018) [pre-print]

Near-Infrared Spectroscopy Screening to Allow Detection of Pathogenic Mitochondrial DNA Variants in Individuals with Unexplained Abnormal Fatigue: A Preliminary Study

Celie BM1, Mariman A2,3, Boone J1,4, Delesie L2, Tobback E2,3, Seneca S5, De Paepe B6, Vogelaers D2,3, Van Coster RN6, Bourgois JG1,4

1 Department of Movement and Sports Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium

2 Department of General Internal Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

3 Centre for Neurophysiologic Monitoring, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

4 Centre of Sports Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

5 Centre for Medical Genetics, University Hospital Brussels, Neurogenetics Research Group, Reproduction Genetics and Regenerative Medicine Research Group, Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium.

6 Department of Pediatrics, Division of Pediatric Neurology and Metabolism, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

Samenvatting

Onverklaarde abnormale vermoeidheid wordt gekenmerkt door chronische vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand en onvoldoende wordt verklaard door enige erkende medische aandoening. In deze piloot-studie, werden 12 individuen met abnormale vermoeidheid die onverklaard bleef na een grondige screening, onderzocht m.b.v. een ‘near-infrared’ [elektromagnetische straling net buiten het zichtbaar licht; golflengte > 780 nm] (NIR) spectroscopie handgreep-test. Daarvan bleken er 4 een abnormaal zuurstof-extractie patroon te vertonen dat lijkt op dat van individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [MM]. Bij 3 van deze 4 individuen werden diverse mitochondriale abnormaliteiten gedocumenteerd via spectrofotometrische, immunocytologische, fluorescente en morfologische analyses uitgevoerd op skeletspier[biopten] en gecultiveerde huid-fibroblasten. Bij 3 van de 4 mensen met verminderde musculaire zuurstof-extractie werd een verschillende homoplasmatische pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie (m.961T > C, m.1555A > G, m.14484T > C) getoond. [homoplasmie = enkel identieke mtDNA-kopieën aanwezig; alle cellen hetzelfde mitochondriaal genoom] Bij de vierde werd de aanwezigheid van meerdere grote mitochondriaal-DNA deleties [ontbrekende fragmenten] in spierweefsel vermoed. In tegenstelling daarmee hadden geen enkele van de 8 abnormaal vermoeide individuen met normale NIR-spectroscopie resultaten een pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie of grote deleties (P < 0.001). Deze piloot-studie geeft aan dat NIR-spectroscopie kan dienen als een niet-invasief screening-instrument om een subgroep (patiënten) met mitochondriale dysfunktie af te bakenen bij de grote groep individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid.

Inleiding

Onverklaarde abnormale vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand vormt een significant probleem dat leidt tot ernstige dalingen qua beroeps- en sociale aktiviteiten. De diagnostische benadering van onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist een zorgvuldige uitsluiting van andere verklarende aandoeningen, zoals psychiatrische, farmacologische, endocriene, neoplastische, hematologische, infektueuze, metabole (inclusief mitochondriale), cardiopulmonaire, bindweefsel ziekten en slaap-stoornissen. Meerdere van deze aandoeningen kunnen makkelijk worden uitgesloten door gebruik te maken van de gepaste klinische onderzoeken. Sommige vormen onverklaarde abnormale vermoeidheid worden als idiopathisch [zonder bekende oorzaak] beschouwd, t.t.z. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie, en de diagnose hangt af van de exclusie van andere ziekten en het voldoen aan diagnostische criteria (bv. de Fukuda criteria).

De uitsluiting van een mitochondriaal defekt als de onderliggende oorzaak voor vermoeidheid ligt niet altijd voor de hand. Bij jongere individuen zijn de klinische en biochemische abnormaliteiten overduidelijk. Uiteindelijk wordt de diagnose weerhouden na de geschikte biochemische, radiologische en genetische testen. In sommige gevallen, bijzonderlijk bij volwassenen, kunnen de klinische symptomen van mitochondriale defekten subtieler zijn. Sommige individuen met mitochondriale defekten vertonen zelfs geen tekenen van een myopathie of andere orgaan-betrokkenheid vooraleer ze ouder zijn geworden of symptomatisch worden na het innemen van medicatie die toxisch is voor de mitochondriale werking (natrium-valproaat [anti-epilepticum], aminoglycosiden [antibiotica], linezolid [antibioticum]). Hoewel inspanning-intolerantie, spierpijn en spierzwakte sleutel-symptomen zijn voor de erkende entiteit mitochondriale myopathie, kan onverklaarde abnormale vermoeidheid het enige of overwegende symptoom zijn bij een persoon met een mitochondriaal defekt. Bovendien kan het klinisch beeld CVS nabootsen. In een studie […] rapporteerden 62% van patiënten met gedocumenteerde mitochondriale ziekte overmatige symptomatische vermoeidheid (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 40), terwijl 32% ernstige, funktioneel beperkende vermoeidheid-symptomen meldden (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 80), vergelijkbaar met de vermoeidheid die wordt ervaren door patiënten met Myalgische Encefalopathie/CVS. Volgens de auteurs is subjectieve vermoeidheid een prominent symptoom bij individuen met mitochondriale ziekte maar de prevalentie, impact en etiologie ervan wordt nog niet goed begrepen.

In een eerdere studie toonden we dat ondubbelzinnig onderscheid gemaakt kan worden tussen gezonde controles en individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [Celie B, Boone J, Smet J et al. Forearm Deoxyhemoglobin and Deoxymyoglobin (Deoxy[Hb+Mb]) Measured by Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Using a Handgrip Test in Mitochondrial Myopathy. Appl. Spectrosc. (2015) 69: 342-347] d.m.v. NIR-spectroscopie in voorarm-spieren tijdens een ‘incremental cyclic contractions protocol’ [cyclus van spier-samentrekkingen met oplopende intensiteit] (ICCP) [Celie B, Boone J, Van Coster R, Bourgois J. Reliability of Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for Measuring Forearm Oxygenation During Incremental Handgrip Exercise’’. Eur. J. Appl. Physiol. (2012) 112: 2369-2374]. Het doel van de huidige studie was om NIR-spectroscopie te gebruiken als een niet-invasief screening-instrument voor mitochondriale dysfunktie bij individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid zonder co-morbiditeit en geselekteerd na multidisciplinaire beoordeling [Vraag is: hoe onbevooroordeeld dit gebeurde wetende dat de artsen van het Gentse ‘CVS referentiecentrum’ de biopsychosociale school’ aanhangen…]. De deelnemers waarbij abnormale NIR-spectroscopie resultaten werden gevonden werden verder onderzocht d.m.v. spier- en huid-biopten [niet allemaal, zie ook onze inleiding] alsook bloed-onderzoeken om morfologische, biochemische of genetische abnormaliteiten in hun mitochondrieën en mitochondriaal DNA (mtDNA) te documenteren. Er werd ook bloed afgenomen van individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid en normale NIR-spectroscopie resultaten.

Methodes

Deelnemers

Er werden 2 groepen individuen vergeleken. Een eerste bestond uit 12 patiënten met de diagnose ‘ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid, zonder co-morbiditeit’ [niet noodzakelijk ME.(cvs)]. De tweede bestond uit 12 voor leeftijd en geslacht gematchte ongetrainde gezonde controles. De patiënten met ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ werden gerecruteerd via de Afdeling Algemene Interne Geneeskunde van het Universitair Ziekenhuis van Gent, België. […] De leeftijd, lengte en gewicht van de patiënten (11 vrouwen, 1 man) waren 45 ± 8 jaar, 165 ± 6 cm & 71 ± 17 kg (gemiddelde ± standaard-deviatie). De controles (11 vrouwen, 1 man) waren gematcht voor leeftijd en geslacht. Hun leeftijd, lengte en gewicht waren 46 ± 8 jaar, 168 ± 7 cm & 70 ± 15 kg.

Diagnostisch beslissingmaking-proces voor Onverklaarde Abnormale Vermoeidheid

Voor de beoordeling van tot dusver onverklaarde en langdurige abnormale vermoeidheid, volgden we een holistische benadering gebaseerd op het biopsychosociaal model van Wessely et al. [!!!] Het geïntegreerd diagnostisch pad omvatte een internistische beoordeling, psycho-diagnostische screening, revalidatie-beoordeling en polysomnografie gecombineerd met een multipele slaap-latentie-test [EEG-registraties met een tussentijd van ongeveer 2 uur om het slaap-patroon overdag te onderzoeken]. De internistische beoordeling bestond uit een uitgebreide anamnese, met oog voor eerdere medische diagnoses of onderzoeken, en een lichamelijk onderzoek met bijkomende onderzoeken indien daar indicatie voor was. Een revalidatie-arts evalueerde de aanwezigheid van musculoskeletale co-morbiditeit waarvoor fysiotherapie voor bestaat. De psycho-diagnostische werd uitgevoerd door een klinisch psycholoog en omvatte anamnese, gevalideerde vragenlijsten en psychologische testen. Er had een psychiatrisch consult plaats wanneer de voorgeschiedenis suggestief was voor eerdere of huidige psychiatrische problemen, en wanneer er hints voor de aanwezigheid van een psychiatrische aandoening opdoken uit de psycho-diagnostische evaluatie of de multidisciplinaire bespreking. De uitkomst van deze multidisciplinaire bespreking was een diagnostische klassificatie in: (1) ‘ondubbelzinnige onverklaarde abnormale vermoeidheid’, (2) onverklaarde abnormale vermoeidheid met co-morbiditeit of (3) een aandoening die onverklaarde abnormale vermoeidheid uitsluit. Bij ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid waren naast elkaar bestaande slaap- of psychiatrische aandoeningen uitgesloten. Zodoende werd het diagnostisch proces niet beperkt tot enkel tekenen en symptomen. Zonder de discussie te willen aangaan omtrent de controversiële syndroom-definities, hebben we geopteerd voor het gebruik van de benaming ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ om deze patiënten te beschrijven. [M.a.w. dit artikel handelt niet over M.E.(cvs) per se.]

‘Incremental Cyclic Contraction Protocol’ (ICCP)

Het ICCP bestond uit ritmische handgreep-samentrekkingen met oplopende intensiteit […]. Deze test werd uitgevoerd in ruglig m.b.v. een handgreep-dynamometer. Na bepaling van de maximale vrijwillige contractie kracht (MVC) […] werd de NIR-spectroscopie sonde op de M. flexor carpi ulnaris [spier die het polsgewricht laat buigen] & de M. flexor digitorum superficialis [onderarm-spier die zorgt voor buiging van alle vingers behalve de duim] geplaatst om de microvasculaire zuurstof-extractie te bepalen. Dit protocol startte met het afsluiten van de voorarm-arterie door het opblazen van een manchet tot 260 mmHg (onbepaalde duur, tot een evenwicht-toestand in deoxy[Hb+Mb] [deoxy-haemoglobine/ -myoglobine = haemoglobine/myoglobine dat niet gecombineerd is met zuurstof; het verschil qua weefsel absorptievermogen tussen de 2 geeft de balans tussen de aan- en afvoer van zuurstof in kleine bloedvaten] werd bereikt). De taak bestond uit periodes van 2 min waar oplopende samentrekkingen werden uitgevoerd (1 sec contractie, 1 sec relaxatie), met verschillende intensitieiten van de vrijwillige contractie kracht (% MVC). De samentrekking-periodes werden onderbroken door 60 sec rust. De arbeid-intensiteit begon aan 20% MVC en verhoogde per stap met 10% MVC. Het ICCP werd uitgevoerd tot er uitputting optrad. […] Het onderscheid tussen normale en abnormale NIR-spectroscopie responsen was overwegend gebaseerd op de resultaten van eerdere research; waarbij gezonde controles in staat bleken tot een funktionele toename van hun microvasculaire O2-extractie tot 72,8 % van hun maximale ‘gedwongen’ O2-extractie (tijdens arteriële occlusie [afsluiting]), terwijl MM-patiënten een gemiddelde maximale O2-extraction van 26 % bereikten. MM-patiënten vertoonden een homogene respons op deze handgreep-inspanning met een zeer klein deoxy[Hb+Mb] bereik van 17,2-34,4% van de gedwongen maximale O2-extractie. Eerder hebben we een goede test-hertest betrouwbaarheid van deze NIR-spectroscopische metingen bij gezonde controles getoond […]. Er werd enkel een hertest bij de patiënten uitgevoerd om de resultaten van de eerste test te bevestigen.

Metingen en analyse van de gegevens

NIR-spectroscopie. De skelet-spier weefsel-oxygenatie werd non-invasief gemeten d.m.v. een systeem gebaseerd op absorptie van infrarood (IR) licht, waarbij IR licht van verschillende golflengten wordt uitgezonden. De veranderingen in deoxyhaemoglobine en deoxymyoglobine (deoxy[Hb+Mb]) tijdens het ICCP (t.t.z. het gemiddelde van de hoogste 10 sec) werden uitgedrukt in verhouding met de arteriële occlusie, om mogelijke invloeden van de dikte van het vetweefsel in de voorarm en eventuele deconditionering-effekten te verminderen.

Analyses van skeletspier[biopt]en en huid-fibroblasten

Biopten. 4 individuen met abnormale deoxy[Hb+Mb] waarden (in %) tijdens het ICCP werden uitgenodigd om weefsel-biopten ondergaan om mitochondriale abnormaliteiten te documenteren. 3 daarvan (S1, S2 & S3) gaven toestemming voor skeletspier- (quadriceps) en huid-biopten. […] De spier-biopten werden verwerkt voor licht- en elektronen-microscopie & spectrofotometrische analyse, terwijl de huid-biopten dienden voor primaire fibroblast culturen. […]

Microscopische evaluatie van skeletspier[biopten]

[…]

Funktionele evaluatie van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)

Er werd een standaard spectrofotometrische analyse gebruikt voor de meting van de aktiviteiten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) complexen (I, II, II+III, III & IV) en citraat-synthase in skeletspieren. Dezelfde enzymen werden getest in gecultiveerde huid-fibroblasten (uitgezonderd complex-I). Z-score [gestandaardiseerde waarde] = aktiviteit van het patient-staal min de gemiddelde aktiviteit van de controle-stalen gedeeld door de standaard-deviatie van de controle-stalen. De patient-aktiviteit wordt als deficiënt beschouwd als de Z-score < -3.0 is.

Immuno- en fluorescente kleuring van gecultiveerde huid-fibroblasten

[…]

Sequentie-bepaling van het volledig mitochondriaal genoom

[…]

Statistische Analyse

[…]

Resultaten & bespreking

Er werden significante verschillen gevonden qua deoxy[Hb+Mb] in de groep met onverklaarde abnormale vermoeidheid in vergelijking met een groep gezonde controles (P = 0.019). […] De gemiddelde deoxy[Hb+Mb] waarden tijdens de ICCP waren significant beïnvloed door een subgroep van 4 individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid. Bij deze individuen konden geen significante toenames qua deoxy[Hb+Mb] worden gevonden (test & hertest). Analyse van deze individuele resultaten toonde dat 3 individuen (S1, S2 & S4) een identiek, abnormaal deoxy[Hb+Mb] profiel hadden (test & hertest), wat gelijkaardig was met eerdere observaties bij patiënten met mitochondriale myopathie (MM). Volgens de resultaten van deze laatste studie, konden mitochondriale defekten bij gezonde controles worden uitgesloten, op basis van hun deoxy[Hb+Mb] profiel in de huidige studie. Bij 1 patient (S3) werd dit gewijzigd profiel slechts gevonden bij de hertest (normale deoxy[Hb+Mb] respons tijdens de eerste test), wat aangeeft dat de deoxy[Hb+Mb] respons van dit individu tijdens ICCP niet dezelfde was bij test en hertest.

Voor het testen van het mitochondriaal membraan potentiaal (ΔΨ [ΔΨmt; het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]) werden JC-1 [fluorescente kleurstof die aktieve (rood) en inaktieve (groen) mitochondrieën kleurt; mitochondriale depolarisatie wordt aangegeven door een afname van de rood/groene fluorescentie-intensiteit] en MitoTracker [fluorescente kleurstof die afhankelijk van het membraan-potentiaal de mitochondrieën labelt] testen aangewend, welke geen wijzigingen qua ΔΨ opbouw oppikten. Hoewel de JC-1 fluorescente kleuring homogeen was bij controles en in fibroblasten van S2, vertoonden cellen van S1 & S3 een mozaïek-patroon [doordat de aanwezigheid van mtDNA-afwijkingen varieert van cel tot cel] aangezien een subset cellen voornamelijk inaktieve (groene) mitochondrieën bevatte. Dit mozaïek-patroon doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (e.g. punt-mutatie, deletie of depletie van het mtDNA). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. In tegenstelling daarmee was de immunokleuring voor het oxidatieve fosforylatie complex-II (een complex dat enkel nucleair gecodeerde strukturele subunits bevat) normaal voor alle cel-lijnen (gegevens niet getoond), wat verder duidt op een onderliggend mtDNA-gerelateerd defekt.

De 4 abnormaal vermoeide individuen waarbij gedaalde zuurstof-extractie werd gedocumenteerd, droegen een pathogene mtDNA-variant. Het eerste individu (S1) bleek homoplasmatisch voor de m.961 T>C variant in gecultiveerde huid-fibroblasten en skeletspier. [homoplasmie voor een mutatie wil zeggen: alleen afwijkend mtDNA] Uit de literatuur is bekend dat de m.961 T>C variant gelinkt is met ‘non-syndromic hearing impairment’ [gedeeltelijk of totaal gehoor-verlies dat niet gepaard gaat met andere tekenen en symptomen]. De patient klaagde daadwerkelijk over gehoor-verlies sinds de vroege kindertijd en haar audiogram toonde significant gehoor-verlies in de hoge frequenties. Zoals verwacht op basis van het maternaal overerving-patroon of mtDNA, was haar moeder ook homoplasmatisch voor deze m.961 T>C variant. Er is weinig geweten over de prevalentie van deze mtDNA-wijziging. Poolse onderzoekers vonden dat slechts 2 op 500 gezonde individuen (0,4%) deze variant droegen in Polen. Onze tweede deelnemer (S2) had de m.1555A>G variant in homoplasmie, zoals haar moeder. Deze m.1555 A>G variant is geassocieerd met aminoglycoside-geïnduceerde doofheid welke maternaal wordt overgedragen […] Naar ons weten zijn er geen meldingen over de incidentie [mate van voorkomen] van de m.1555 A>G variant in de algemene bevolking. Er zijn slechts studies beschikbaar die prevalenties variërend tussen 0-0,70% tonen. De vierde deelnemer (S4) in onze studie bleek homoplasmatisch voor de m.14484 T>C variant in het MT-ND6 gen, wat één van de mtDNA-varianten is die geassocieerd zijn met Leber hereditaire optische neuropathie (LHON [plots verlies van gezichtsvermogen door afsterven van cellen in de oogzenuw]). Zoals verwacht waren alle onderzochte matrilineaire [in vrouwelijke lijn] verwanten (moeder en 6 nakomelingen) homoplasmatisch voor deze LHON-mutatie. LHON wordt veroorzaakt door een mitochondriaal overgeërfde degeneratie van de retinale ganglion cel-laag [type neuronen van het netvlies] en optische zenuw, leidend tot sub-acuut of acuut pijnloos, bilateraal visueel falen bij jong-volwassenen, voornamelijk mannen. De m.14484 T>C die de p.(Met64Val) substitutie [door de mutatie bepaalde omwisseling van het betreffend aminozuur in het proteïne] in de MT-ND6 subunit van complex-I veroorzaakt, is 1 van de 3 belangrijke mtDNA primaire mutaties van LHON. Ca. 50% van de mannen en 10% van de vrouwen met deze mutaties ontwikkelen optische neuropathie. Prevalentie-studies aangaande Leber hereditaire optische neuropathie werden meestal in West-Europa uitgevoerd: de prevalenties lagen tussen 1,36-3,22 per 100.000 voor de 3 meest frequente LHON-mutaties tesamen. Er werd een rigoureuze klinische en genetische studie betreffende LHON uitgevoerd in het noord-oosten van Engeland: in een populatie van 2,2 miljoen werden alle patiënten met onverklaard visueel falen en hun familieleden gescreend. Stamboom-analyse onthulde een minimum prevalentie voor m.14484 T>C van 0,3 per 100.000. Bij deelnemer 3 (S3) werden geen pathogene punt-mutaties gedetekteerd maar er werden meerdere deleties gevonden in het mitochondriaal genoom. De incidentie van multipele mtDNA-deleties in de algemene bevolking is onbekend. Als we voor de m.961 T>C mutatie een incidentie van 4/1.000 aannemen, voor de m.1555 A>G mutatie een incidentie van 7/1.000 en voor de m.14484 T>C mutatie een incidentie van 0,003/1000, is de kans dat een individu één van deze mitochondriale punt-mutaties draagt 0,011 [(4.000+7.000+3)/1.000.000]. In tegenstelling daarmee werd gevonden dat 3 van de 12 (0,25) individuen in onze studie één van deze pathogene punt-mutaties droegen. […] Geen enkele van de 8 patiënten met onverklaarde abnormale vermoeidheid waarbij normale NIR-spectroscopie resultaten werden verkregen, bleken een pathogene variant in hun mtDNA te dragen [sequentie-bepaling].

In de literatuur zijn er geen meldingen van NIR-spectroscopie abnormaliteiten gedetekteerd bij individuen die een uiteindelijke diagnose van CVS kregen. In een studie waarbij 16 patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/CVS werden vergeleken met 16 gezonde controles (handgreep-test/NIR-spectroscopie) [Miller RR, Reid WD, Mattman A, Yamabayashi C et al. Submaximal Exercise Testing with Near-Infrared Spectroscopy in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Patients Compared to Healthy Controls: A Case-Control Study. J. Transl. Med. (2015) 13: 159], werd geen significant verschil tussen de 2 groepen gevonden. In een andere studie werden bloedstalen van 193 CVS-patiënten (Canadese criteria) genetisch geanalyseerd voor mogelijke mtDNA-variaties d.m.v. sequentie-bepaling van het ganse mitochondriaal genoom. [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. J. Transl. Med. (2016) 14: 19] In deze laatste studie werd de sequentie van gans het mtDNA bepaald en geen enkele van de bekende pathogene mitochondriaal DNA mutaties werden gedetekteerd bij de individuen met CVS. Men zou een mogelijke heterogeniteit in verschillende groepen gelabeld als CVS in gedachten moeten houden, gezien de variabiliteit qua gebruikte definities, en verschillen qua diepgang van zowel somatische als psychiatrische diagnostische screening en het verstrekken van gegevens over de familiale geschiedenis.

Aangezien de 4 individuen werden gescreend via een gedaalde zuurstof-extractie tijdens inspanning van de voorarm-spieren, had een in vitro zuurstof-consumptie test moeten worden uitgevoerd in voorarm-skeletspier stalen om de gedaalde zuurstof-consumptie te bevestigen. Omwille van ethische redenen was het echter niet mogelijk om een skeletspier-biopt te nemen in voorarm-spieren gezien de hoge concentratie zenuwen en capillairen. In plaats daarvan werd een batterij diagnostische testen aangewend om aan te tonen dat de mtDNA-abnormaliteiten inderdaad een negatieve funktionele impact op de mitochondrieën hadden. Er werd een afname of complex-I aktiviteit en van complex-II+III aktiviteit in skeletspieren, en een daling van complex-IV aktiviteit in gecultiveerde huid-fibroblasten gedetekteerd in S2 m.b.v. spectrofotometrische analyse. In skeletspieren van S3 werd een vermindering van OXPHOS complex-IV aktiviteit gedetekteerd (uitgedrukt t.o.v. OXPHOS complex-II aktiviteit). De JC-1 groene en rode fluorescente kleuring van […] cellen van S1 & S3 toonde een mozaïek-patroon dat doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (punt-mutatie, deletie, depletie). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. […] Bij elk van de 3 patiënten [die toestemmming gaven voor een biopt] werden één of meer mitochondriale abnormaliteiten gedetekteerd. Bij S4 waren bijkomende testen niet mogelijk aangezien de patient een huid/spier-biopt had afgewezen. S4 was echter homozygoot voor de m.14484 T>C mutatie die onbetwijfeld als een pathogene mutatie wordt beschouwd.

Besluit

Via niet-invasieve screening met NIR-spectroscopie en een ICCP, identificeerden we een subgroep [sterk uitgedrukt voor maar 4 op 12 patiënten…] individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid die drager zijn van een pathogene mtDNA variant. NIR-spectroscopie zou een krachtige techniek kunnen zijn om deze individuen te detekteren. Het spreekt vanzelf dat verdere studies met grotere groepen met onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist zijn om onze bevindingen te bevestigen en hun klinische significantie te evalueren.

————————-

We herinneren er ook nog eens aan dat het meten van de ‘baseline’ spier-pH (via magnetische resonantie spectroscopie) metabole onevenwichten bij rust kan aantonen (bv. bij ernstige mitochondriale myopathieën). In ‘Abnormale zuur-verwerking in spieren bij CVS’ kan men lezen dat deze niet significant verschilde tussen controle- en CVS/M.E.-groepen…

Men weet ook dat bij bepaalde myopathieën het ryanodine receptor gen is aangetast (mutaties). Daarom willen we, n.a.v. het bovenstaande nog es oproepen tot meer research hieromtrent (zie ‘Ryanodine receptor & inspanning’)…

maart 23, 2018

Verband van CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 7:34 am
Tags: , , , , , , ,

Telomeren zijn de repetitieve sequenties die de uiteinden van chromosomen beschermen en de genomische integriteit helpen bewaren. Menselijke chromosomen worden begrensd en gestabiliseerd door telomeren. Ze bestaan uit meerdere duizenden copieën van een hexameer (6 nucleotiden) sequentie (TTAGGG)n ondersteund door een complex van DNA-bindende proteïnen en enzymes. Telomeren zorgen er voor dat de chromosoom-uiteiden worden herkend als beschadigd DNA waarbij herstel van de dubbele streng nodig is. Telomeren worden wel eens vergeleken met de plastic tip aan het uiteinde van een schoenveter: ze voorkomen degradatie en ‘uitrafeling’ van chromosomen. Telomeren variëren in lengte tussen chromosoom en individuen. Ze verkorten met elk cel-deling omdat de zeer repetitieve DNA-sequenties niet efficient worden gecopieerd (het zgn. ‘end replication problem’), wat leidt tot een progressief verlies van de gemiddelde telomeer-lengte (15 tot > 60 baseparen per jaar). De mate van telomeer-slijtage is het hoogst gedurende de eerste levensjaren maar stijgt ook na de leeftijd van 50 jaar.

De telomeer-lengte werd eerder al gelinkt met fibromyalgie-pijn (‘Pain is associated with short leukocyte telomere length in women with fibromyalgia’. J Pain (2012) 13: 959-69).

De groep die onderstaande studie uitvoerde, publiceerde in 2016 al een samenvatting van de resultaten die ze hadden voorgesteld op de Experimental Biology Meeting dat jaar (‘Telomere length analysis in Chronic Fatigue Syndrome’ in The FASEB Journal 30). Nu dus een uitgebreid artikel.

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 44 (februari 2018)

Association of Chronic Fatigue Syndrome with premature telomere attrition

Mangalathu S. Rajeevan (1), Janna Murray (1,2), Lisa Oakley (1,3), Jin-Mann S. Lin (1), Elizabeth R. Unger (1)

1 Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

2 Influenza Division, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

3 College of Public Health and Human Services, Oregon State University, Corvallis, USA

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook bekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een ernstig invaliderende aandoening met onbekende etiologie. De symptomen en risico-factoren van M.E./CVS delen kenmerken met de versnelde veroudering die geïmpliceerd is bij meerdere ziekten. Gebruikmakend van telomeer-lengte als merker, werd deze studie uitgevoerd om de hypothese te testen dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering.

Methodes Gegevens van de deelnemers (n = 639) kwamen van de follow-up van de Georgia CVS-studie. De deelnemers werden geklassificeerd – gebruikmakend van de 1994 ‘CFS Research Case Definition’ met op vragenlijsten gebaseerde subschaal drempels voor vermoeidheid, funktioneren en symptomen – in 4 ziekte-groepen: CVS als aan alle criteria werd voldaan (n = 64), CVS-X als CVS met uitsluitende aandoeningen (n = 77), ISF (onvoldoende symptomen/vermoeidheid) als slechts aan enkele criteria werd voldaan ongeacht uitsluitende aandoeningen (n = 302) en NF (niet-vermoeid) als niet aan de criteria werd voldaan en er geen uitsluitende aandoeningen waren (n = 196). De relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio) [de verhouding van telomeer PCR-signaal (T) op het PCR-signaal van een ‘single copy’ gen (S); deze is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel en wordt uitgedrukt t.o.v. de T/S-ratio van een referentie-DNA] werd gemeten gebruikmakend van DNA uit vol bloed en ‘real-time’ PCR. Er werden algemene lineaire modellen gebruikt om het verband te bepalen tussen ziekte-groepen of T/S-verhouding en demografische gegevens, biologische metingen en co-variabelen (significantie p < 0.05).

Resultaten De gemiddelde T/S-ratio verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratios bij CVS (0.90 ± 0.03) en ISF (0.94 ± 0.02) waren elk significant lager dan voor NF (1.06 ± 0.04). Verschillen qua T/S-verhouding bij de ziekte-groepen bleven significant na aanpassing voor co-variabelen (leeftijd, geslacht, ‘body-mass-index’, lende/heup-verhouding, post-exertionele malaise en opleidingsniveau). De telomeer-lengte was 635, 254 & 424 baseparen korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, t.o.v. van NF. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering bij CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF, respectievelijk. Verder toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht aan dat de associatie van of M.E./CVS met korte telomeren grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar.

Besluiten Deze studie vond een significant verband tussen M.E./CVS en vroegtijdige telomeer-slijtage die grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten geven aan dat M.E./CVS kan worden opgenomen in de lijst van aandoeningen die geassocieerd zijn met versnelde veroudering. Er is verder werk vereist om de funktionele betekenis van die versnelde veroudering bij M.E./CVS te evalueren.

Achtergrond

[…]. De symptomen en risico-factoren voor M.E./CVS hebben kenmerken die gemeenschappelijk zijn met deze voor versnelde veroudering/vroegtijdige immunosenescentie [de geleidelijke verslechtering van het immuunsysteem veroorzaakt door natuurlijk ouder-worden]. Versnelde veroudering bleek betrokken bij meerdere ziekten en slechte gezondheid-resultaten, en telomeer-lengte is een alom gebruikte merker van versnelde veroudering.

Telomeren zijn meerdere duizenden ‘repeats’ van TTAGGG nucleotide-sequenties die de uiteinden van lineaire chromosomen begrenzen. Telomeren verkorten tijdens elke serie cel-replicatie […] en zodoende weerspiegelt telomeer-lengte de replicatie-geschiedenis van cellen en bepaalt ze de levensduur van cellen. Omwille van de graduele erosie van telomeren bij elke cel-deling, is leeftijd de sterkste voorspeller van de telomeer-lengte van een individu. Meerdere rapporten geven echter geslacht-verschillen aan: voor leeftijd aangepaste telomeer-lengte van leukocyten bleek langer bij volwassen vrouwen dan mannen. Daarnaast is er ook een impact op telomeer-lengte door andere genetische, epigenetische, fysiologische en omgeving-factoren. Deze factoren dragen bij tot de variabiliteit van zowel de absolute telomeer-lengte en de mate van telomeer-verkorting bij individuen. Chronische inflammatie en oxidatieve stress kunnen telomeer-slijtage verhogen, wat mogelijks de associatie van versnelde telomeer-verkorting bij ziekte verklaart [metabole & inflammatoire ziekten, psychiatrische aandoeningen, kanker]. We hypothiseren dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering en dat kortere telomeren kunnen dienen als een merker voor dit verband. We testten onze hypothese betreffende telomeer-lengte gebruikmakend van DNA uit vol bloed met de klemtoon op een aantal demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen [Allostatische belasting is een term uit de psychosomatiek: opéénstapeling van ontregelde fysiologische regelsystemen waardoor de soepelheid van de adaptatie afneemt; een vorm van slijtage; ook: een slechte stress-reaktie, in plaats van je evenwicht te bewaren gaan de stresshormonen je psychisch en lichamelijk ondermijnen. Meten van de ‘allostatic load’ = verzamelen van informatie over fysiologische aktiviteit van meerdere belangrijke regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel, zowel als het cardiovasculair systeem, het immuunsysteem en metabole processen] die waarschijnlijk een invloed hebben op de associatie tussen M.E./CVS-status en telomeer-lengte. Onze resultaten tonen significante telomeer-verkorting aan bij individuen met M.E./CVS en andere vermoeidheid-groepen in de globale studie-groep, waarbij analyses significante vroegtijdige telomeer-erosie bij vermoeide vrouwelijke deelnemers jonger dan 45 jaar onthulden. Deze bevindingen ondersteunen de opname van het model van vroegtijdige en versnelde immunosenescentie in toekomstige studies naar de M.E./CVS-pathofysiologie.

Methodes

Gegevens-bronnen & studie-groep

De gegevens kwamen uit de ‘follow-up’ fase van een 2-ledige populatie-gebaseerde longitudinale studie van CVS en vermoeiende ziekte in Georgia (V.S.) […].

De huidige analyse focuste op gegevens van de klinische evaluatie van deze fase; deze omvatte een gedetailleerde medische anamnese, lichamelijk onderzoek, laboratorium-testen en psychiatrische evaluatie […]. De deelnemers vulden een aantal vragenlijsten in, waaronder de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ (MFI-20), de ‘Short Form Health Survey’ (SF-36 v2) en de ‘CDC Symptom Inventory’ (SI). […] De hartslag (bpm), systolische & diastolische bloeddruk (mmHg), lengte, gewicht, en buik- & heup-omtrekken werden gemeten […]. De afgeleide parameters ‘body-mass-index’ (BMI) en lende/heup-ratio (WHR) werden berekend [BMI = gewicht/lengte2 (kg/m2)]; [WHR = buik/heup (cm/cm)]. De analyse omvatte biologische metingen zoals HDL-cholesterol (mg/dl), triglyceriden (mg/dl), nuchtere glucose (mg/dl), insuline (µIU/ml), C-reactief proteïne (CRP, mg/dl) en albumine (g/dl).

Diagnose CVS: voldoen aan de 1994 internationale research-definitie. Individuen met onverklaarde chronische ziekte met onvoldoende symptomen/vermoeidheid om te voldoen aan alle CVS-criteria werden geklassificeerd in de ‘insufficient symptoms/fatigue’ (ISF) groep. Individuen die aan geen enkele van de CVS-criteria voldeden, werden gegroepeerd als niet-vermoeide (NF) controles. Daarnaast werden de deelnemers in elke groep onderverdeeld in met of zonder uitsluitende medische/psychiatrische aandoeningen. Van de 751 deelnemers die klinisch werden geëvalueerd, voldeden er 71 aan alle CVS-criteria zonder uitsluitende aandoeningen (CVS-groep), 78 voldeden aan alle CVS-criteria maar met uitsluitende aandoeningen (CVS-X groep), 340 voldeden aan de criteria voor ISF ongeacht uitsluitende aandoeningen, 212 voldeden aan de criteria voor NF controles zonder uitsluitende aandoeningen, 47 voldeden aan de criteria voor NF met uitsluitingen en 3 deelnemers werden geklassificeerd als “onbeslist” omwille van onvolledige informatie. […] Uiteindelijk bleven er 639 deelnemers in de 4 ziekte-groepen: 64 CVS, 77 CVS-X, 302 ISF (met en zonder uitsluitende aandoeningen) en 196 NF zonder uitsluitende aandoeningen.

Bepaling van relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio)

De relatieve telomeer-lengte werd gemeten op basis van een alom gebruikt ‘real-time’ PCR protocol […]. De bepaling maakt gebruik van telomeer-specifieke ‘primers’ en hun vermogen om een signaal te genereren dat proportioneel is met de totale opgetelde lengte van alle telomeren in de cel. Dit telomeer-signaal wordt uitgedrukt t.o.v. het signaal dat ontstaat door de amplificatie van het ‘single copy’ gen [gen dat slechts met één enkele kopie in het hele genoom voorkomt] 36B4 [éénvoudig uitgedrukt: een referentie-gen] […]. De verhouding van het telomeer (T) -signaal op het ‘single copy’ gen (S) -signaal (de T/S-verhouding) is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel. Deze verhouding wordt uitgedrukt t.o.v. een referentie-DNA (K562 DNA) waaraan een T/S-ratio van 1,0 wordt toegekend.

[…] De T/S-verhouding kan op 2 manieren worden berekend […]; we gebruikten hier T/S-ratios bekomen via de standaard-curve methode […]. Voorafgaandelijk evalueerden we de reproduceerbaarheid en valideerden we de resultaten [t.o.v. een andere methode]. De T/S-ratios bleken zeer sterk reproduceerbaar […]. Er werd op meerdere niveaus een kwaliteit-controle van de bepaling uitgevoerd, inclusief. […]

Statistische analyses

[…] Er werden ook leeftijd- en geslacht-analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe deze demografische variabelen het verband tussen CVS-status en T/S-ratio beïnvloeden. […] We maakten een schatting van het aantal jaren bijkomende veroudering op basis van een literatuur-waarde voor telomeer-slijtage van 31-63 bp/jaar […].

Resultaten

[…] Het studie-staal (n = 639) bestond voornamelijk uit vrouwen (75%), blanken (76%), levend in een landelijk gebied (50%), met een jaarlijks inkomen van meer dan 40.000 $ (71%), met een gemiddelde leeftijd van 48 jaar […] en een gemiddelde BMI van 28 ± 0,21 kg/m2. Het staal werd opgedeeld in 4 ziekte-groepen: CVS-X (12%), CVS (10%), ISF (47%) & NF (31%). De groepen verschilden niet qua gemiddelde leeftijd en ziekte-duur maar verschilden significant qua metingen van abdominale obesitas (BMI & WHR), geslacht, ras, opleiding, inkomen en PEM [post-exertionele malaise].

We bekeken ook associaties met de ziekte-groepen: biologische metingen zoals telomeer-lengte, metabole variabelen en ‘allostatic load’. De globale T/S-ratio varieerde van 0,269 tot 4,138 (gemiddelde: 0,98; mediaan: 0,917). De gemiddelde telomeer-lengte verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratio bij CVS (0,90 ± 0,03) & ISF (0,94 ± 0,02) lagen elk significant lager dan de NF groep (1,06 ± 0,04). De triglyceriden-concentratie, een maatstaf voor metabool syndroom [chronisch stofwisselingsprobleem met abdominale (centrale) obesitas + hypertensie + verhoogd nuchter bloed-glucose + hoge triglyceriden in het bloed + lage hoge-densiteit lipoproteïnen (HDL)], was significant verschillend voor de ziekte-groepen, maar andere metingen opgenomen bij zowel metabool syndroom en ‘allostatic load’ (HDL, systolische & diastolische bloeddruk en nuchtere glucose) verschilden niet significant. Bij de metingen die specifiek zijn voor ‘allostatic load’, vertoonden hartslag, insuline & CRP significante verschillen, waarbij de gemiddelde CRP-waarde bij CVS-X & CVS 93% hoger lag dan in de NF groep.

Wat betreft bepalingen van de bivariate associaties tussen T/S-ratio en demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen, zagen we een significant omgekeerd verband van telomeer-lengte met de leeftijd (p = 0.0009.), metingen m.b.t. abdominale obesitas [BMI (p = 0.0145), WHR (p = 0.0149)] & PEM (p = 0.0153). De telomeer-lengte was ook significant geassocieerd met opleidingsniveau (p = 0.0288). De telomeer-lengte was niet statistisch significant gerelateerd met enige andere demografische of biologische meting, hoewel associaties met CRP (p = 0.0789) en nuchtere glucose (p = 0.0625) bijna statistisch significant waren.

We controleerden de associatie van gemiddelde telomeer-lengte met ziekte-groepen voor eerder gedefinieerde co-variabelen: leeftijd, BMI, WHR, PEM en opleidingsniveau. Geslacht werd ook opgenomen omwille van het significant verband met CVS. De gemiddelde telomeer-lengte verschillen tussen alle vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X, ISF) en de niet-vermoeide groep bleven significant (p < 0.01) vóór en na controle op co-variabelen. Op basis van de aangepaste groep-gemiddelden was de telomeer-lengte 635, 254 & 424 bp korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, vergelen met de NF groep. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering […].

De significante negatieve lineaire correlatie tussen telomeer-lengte en leeftijd in de globale studie-groep werd bepaald door de statistisch significante relatie onder de NF. Bij de NF in hun twintiger of dertiger jaren was de telomeer-lengte het langst. Bij NF gaf de trend een verkorting van 42 bp/jaar aan, terwijl het bij de andere groepen niet significant was (CVS 17 bp/jaar, CVS-X 22 bp/jaar & ISF 8,5 bp/jaar). De significante associatie van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot deelnemers van < 45 jaar (n = 216). Bij hen waren de telomeren 932 bp (CVS), 767 bp (CVS-X) & 966 bp (ISF) korter t.o.v. NF; ruw-weg 14,8-30,1, 12,2-24,7 & 15,3-31,8 jaar bijkomende veroudering of […].

Hoewel er geen associatie was tussen telomeer-lengte en geslacht in de globale studie-groep, werd het verwachte man/vrouw-verschil gezien in de NF groep: de telomeren waren 713 bp langer bij vrouwen (n = 133; T/S-ratio 1,116) dan mannen (n = 63; T/S-ratio 0,9476). Analyses op basis van geslacht toonden dat het significant verband van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot vrouwen (n = 477). Onder de vrouwelijke deelnemers waren de telomeren in de CVS-groep (n = 58) 957 bp korter (p < 0.001) t.o.v. de NF groep (n = 133). T.o.v. de NF was het verschil 690 bp bij CVS-X (n = 64; p = 0.003) & 711 bp bij ISF (n = 222; p < 0.001), respectievelijk. Ter ondersteuning van dit geslacht-specifiek effekt, bleek uit een analyse van alle mannelijke deelnemers (n = 99) geen significant verschil qua telomeer-lengte voor CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF (n = 63).

Hoewel in alle analyses de gemiddelde telomeer-lengte voor alle ziekte-groepen consistent lager was dan voor de NF groep, werd het grootste verschil gezien in de groep vrouwen jonger dan 45 (n = 175). De mate van telomeer-verkorting bij vrouwen jonger dan 45 was 1.130 bp voor CVS, 1.007 bp bij CVS-X & 1.154 bp bij ISF (t.o.v. NF); […] Bij de vrouwen van minder dan 45 jaar oud, hadden 95% van deze met CVS (21/22) telomeren die korter waren dan de gemiddelde telomeer-lengte (T/S-ratio = 1,2324) of die van de NF (p = 0.0092).

Bespreking

Naar ons weten is dit de eerste studie die telomeer-ersoie aantoont bij patiënten met M.E./CVS, die significant bleef vóór en na controle op leeftijd, geslacht, obesitas (BMI, WHR), PEM en opleidingsniveau. Bovendien toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht dat deze associatie van korte telomeren bij M.E./CVS grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen jonger 45 jaar. Overéénkomstig met studies in de algemene bevolking vertoonde onze studie-groep een omgekeerd verband van telomeer-lengte met leeftijd maar, interessant, de associatie was slechts statistisch significant bij NF deelnemers. Het leeftijd-gerelateerd verschil qua telomeer-lengte was meer uitgesproken voor het 40ste levensjaar, en analyse gaf aan dat het significant verband van telomeer-lengte met vermoeidheid-groepen was beperkt tot deelnemers jonger dan 45. Gelijkaardig met de bevindingen van deze studie, vonden andere researchers dat vroegtijdige telomeer-slijtage meer significant was bij met Lupus Erythematosus en Reumatoïde Artritis van jonger dan 40-45.

Globaal gezien, en in overéénkomst met studies van de algemene bevolking, waren telomeren significant langer bij vrouwen in vergelijking met mannen in de NF groep. Dit geslacht-gerelateerd verschil in telomeer-lengte werd echter niet gezien bij de vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X & ISF). Wanneer de analyse van telomeer-lengte per ziekte werd gestratificeerd per geslacht, was de telomeer-verkorting met betrekking tot NF individuen enkel significant bij vrouwen. De telomeer-lengte bleef echter zonder significant verschil bij mannelijke deelnemers in de analyse die alle mannen met CVS, CVS-X en ISF combineerde in één groep t.o.v. NF; dit impliceert dat het onwaarschijnlijk is dat het geslacht-specifiek effekt te wijten is aan een verschil van de grootte van de stalen. Er werd voorgesteld dat in de algemene bevolking het hormoon oestrogeen een rol speelt bij het behouden van lange telomeren en langere levensduur bij vrouwen t.o.v. mannen (door het stimuleren van telomerase [enzyme dat de chromosoom-uiteinden herstelt] in specifieke doelwit-cellen of via het verminderen van de belasting van oxidatieve stress te wijten aan een effekt van oestrogeen op reaktieve zuurstof-soorten (ROS). Er werd gerapporteerd over lage oestrogeen-waarden geassocieerd met korte telomeren bij vrouwen. CVS heeft een hogere prevalentie bij vrouwen en gynecologische factoren zoals vroege menopauze en hysterectomie bleken geassocieerd met CVS [Boneva RS, Lin JM, Unger ER. Early menopause and other gynecologic risk indicators for Chronic Fatigue Syndrome in women. Menopause. (2015) 22: 826-34]. Deze bevindingen, tesamen met onze observatie van korte telomeren bij vrouwelijke individuen jonger dan 45 met CVS, CVS-X & ISF, suggereren de nood aan verdere studies aangaande de dynamiek van telomeer-lengte in relatie met leeftijd, geslachtshormonen, gynecologische voorgeschiedenis en de aanvang van CVS.

Er werd voor een brede waaier aan chronische ziekten gerapporteerd dat gestegen waarden qua inflammatoire merkers  – zoals CRP en cytokines zoals interferon-γ (IFN-γ), tumor necrose factor α (TNF- α), interleukine-1 & -6 (IL-1, IL-6) – geassocieerd zijn met ziekte-progressie, slechte levenskwaliteit en slechte therapeutische uitkomsten. Deze rapporten omvatten diabetes, chronische obstructieve pulmonaire ziekte, nier-falen, psychiatrische/neurologische aandoeningen, cardiovasculaire ziekte en andere chronische/auto-immune/infektueuze ziekten, inclusief M.E./CVS. Er werd ook vesnelde verkorting van telomeren gemeld bij van veel van deze chronische/auto-immune ziekten. In de meeste gevallen werden inflammatie en telomeer-verkorting afzonderlijk bestudeerd en een oorzakelijk verband tussen deze 2 processen die optreden in dezelfde cellen moet nog worden opgehelderd; hoewel werd voorgesteld dat zowel telomeer-verkorting als inflammatie kunnen betrokken bij een bidirectioneel oorzaak-gevolg relatie. Telomeer-slijtage kan werken als een sterke inducerende factor voor pro-inflammatoire cytokinen in verschillende cel-types tijdens het verouderen (een fenomeen genaamd senescentie-geassocieerde secretorische fenotypes, SASP [karakteristieke eigenschap van of senescente cellen; omvat inflammatoire cytokinen, groei-factoren & proteasen]) of chronische inflammatie kan telomeer/telomerase-dysfunktie veroorzaken op een directe manier via de aanmaak van ROS die resulteert in beschadigd telomeer-DNA. Beide mogelijkheden zouden de eerder gerapporteerde omgekeerde relatie van telomeer-lengte met oxidatieve stress en IL-6 (een component van SASP) kunnen verklaren bij individuen met depressie. Het is interessant op te merken dat senescentie-merkers zoals IL-6 en p16INK4a geassocieerd bleken met een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker-vermoeidheid syndroom na cytotoxische chemotherapie. Eliminatie van senescente cellen in een dier-model voor chemotherapie-geïnduceerde vermoeidheid herstelde de normale fysieke aktiviteit bijna volledig. Het feit dat de incidentie van ernstige vermoeidheid bij borst-kanker patiënten correleerde met de hoogste p16INK4a waarden suggereert dat een verhoogde totale belasting door senescente cellen vermoeidheid kan veroorzaken [vooral onderzocht bij kanker]. We vonden significante associatie van M.E./CVS met hogere CRP-waarden, en een marginaal verband van hogere CRP-waarden met kortere telomeren in onze studie. Een gelijkaardige omgekeerde maar sterkere associatie van CRP en telomeer-lengte werd gerapporteerd in verband met het risico op cardiovasculaire ziekte en obesitas. Het is aannemelijk dat pro-inflammatoire cytokinen de produktie van CRP zouden stimuleren, wat dan weer zou bijdragen tot telomeer-verkorting door oxidatieve stress. In combinatie met deze eerdere studies, suggereren onze observaties dat chronische inflammatie en/of oxidatieve stress kan bijdragen tot versnelde telomeer-verkorting of vice versa bij minstens een subgroep van individuen met M.E./CVS. Bovendien kunnen leeftijd-gerelateerde fundamentele en translationele studies beloftevolle paden aanwijzen om het risico te bepalen en therapeutische benaderingen te beoordelen die gebruikmaken van een nieuwe klasse senolytische medicijnen [eenvoudig gezegd: die ouderdom-ziekten vertragen, voorkomen, verlichten of omkeren] die zich richten op senescente cellen, om de symptomen van M.E./CVS te verlichten [dasatinib (middel tegen leukemie), quercetine, fisetine (natuurlijk flavonoïde), piperlongumine (stof uit een peper-plant met mogelijke anti-kanker eigenschappen), navitoclax (ABT263; anti-kanker geneesmiddel) en selektieve BCL-XL inhibitoren].

De mitochondriale funktie neemt ook af met de leeftijd, voornamelijk onder de vorm van verstoorde ATP-produktie en verhoogde aanmaak van ROS, welke beiden geassocieerd zijn met chronische ziekten. Hoewel details van de potentiële wisselwerking tussen telomeer-verkorting en mitochondriale dysfunktie onbekend zijn, bleken veel chronische ziekten zoals metabole, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten, diabetes, stemming- en andere psychologische aandoeningen met aangetoonde telomeer-verkorting ook geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en oxidatieve stress die DNA-schade kunnen veroorzaken. Metaboloom-bevindingen [Levine SM, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol BioSyst. (2017) 13: 371-9 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-80] suggereren dat M.E./CVS een hypometabool syndroom is dat verband kan houden met mitochondriale dysfunktie. Deze studies vonden ook dat de metabolomica van M.E./CVS geslacht-specifiek zijn [Fluge O, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Bijkomende studies die het verband onderzoeken tussen een geslacht-specifieke hypometabole toestand en telomeer-slijtage zouden kunnen helpen bij het begrijpen van de pathofysiologie van M.E./CVS.

Er zijn meerdere sterktes verbonden aan deze exploratieve studie aangaande de associatie van telomeer-lengte met CVS. Deze omvatten een relatief grote globale studie-groep (n = 639) bestaande uit deelnemers gegroepeerd in 4 ziekte-toestanden (CVS, CVS-X, ISF & NF), controle van ziekte-status en telomeer-lengte met een aantal demografische en biologische metingen, en validatie van de qPCR-methode wat betreft reproduceerbaarheid en overéénkomst met [een andere] methode. De studie heeft ook zwaktes, inclusief het ‘cross-sectioneel’ ontwerp en onvermogen de ziekte-duur & gebruikte medicatie te evalueren of controleren. De qPCR-methode levert slechts globale gemiddelde telemeer-lengte op en herkent de individuele korte telomeren niet of biedt geen info over de mate van pathologisch kritieke korte telomeren. In deze zin is de diagnostische bruikbaarheid van de bepaling van de telomeer-lengte d.m.v. qPCR beperkt maar het is vergelijkbaar met andere methodes wat betreft accuraatheid voor associatie-studies van telomeer-lengte met ziekten. Een verdere beperking van onze bepaling is dat we DNA uit vol-bloed (dat lymfocyten, monocyten en granulocyten bevat) gebruikten. Zodoende vertegenwoordigt de hier vastgestelde telomeer-lengte enkel de gemiddelde telomeer-lengte van de verschillende bloedcel-types i.p.v. bloedcel-type specifieke of de telomeer-lengte verdeling van verschillende chromosomen in een bepaald cel-type.

Besluit

Deze studie toont een significant verband van M.E./CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage, grotendeels bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten dienen onafhankelijk te worden gerepliceerd bij een grote groep en met methodes die een verbeterde diagnostische waarde qua kunnen bijdragen aan de meting van telomeer-lengte. Deze observatie van kortere telomeren tesamen met meldingen van laag- of hoog-gradige inflammatie gemedieerd door pro-inflammatoire cytokinen en metabool verval/mitochondriale dysfunktie biedt op meerdere vlakken ondersteuning om M.E./CVS op te nemen in de lijst van aandoeningen geassocieerd met versnelde veroudering die getriggerd zou kunnen worden door genetische, epigenetische, infektueuze, stress of andere omgeving-factoren. Er is verder werk nodig om de funktionele betekenis te evalueren, en de specifieke bijdrage van genetische, epigenetische en omgeving-factoren aan versnelde ouder-worden bij M.E./CVS.

januari 25, 2018

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 12:26 pm
Tags: , , , , , , ,

In het artikel ‘Metabolic profiling indicates impaired pyruvate-dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome’ (zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’) rapporteerden de Noorse Ritixumab-onderzoekers Øystein Fluge & Olav Mella over een funktionele verstoring van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) op basis van biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. Hun resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van andere metabolisme-researchers.

Een Noorse arts/professor van de afdeling Medische Biochemie van het Universitair Ziekenhuis van Oslo, goed op de hoogte in zake de biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, publiceerde een commentaar/kritiek daarop in een landelijk tijdschrift (enkel in het Noors).

Fluge & Mella hebben het eerder over een PDH-inhibitie (suppressie/onderdrukking). Dit kan misschien een gevolg zijn van een andere dysfunktie in het energie-metabolisme. Nu wordt er geargumenteerd dat er geen deficiëntie is. Spreekt men hier over twee verschillende dingen? Het is bij wetenschappelijk onderzoek ook van belang kritiek in acht te nemen en daarom geven wij dit mee. Bij verder onderzoek kan zeker rekening worden gehouden met de aanbevelingen.

De auteur gaf als belangen-conflict aan dat hij een vergoeding heeft ontvangen voor een lezing op een professioneel forum van psychiaters, ondersteund door het farmaceutisch bedrijf Lundbeck.

————————-

Tidsskr Nor Laegeforen. (2017) 137: 23-24

Tenuous link between Chronic Fatigue Syndrome and pyruvate dehydrogenase deficiency

Yngve Thomas Bliksrud

In een studie van het energie-metabolisme bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom concludeerden onderzoekers verminderde pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit bij patiënten, maar de metingen passen niet bij de veranderingen die we zien bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie.

In een studie gepubliceerd in december 2016 werd een gewijzigd patroon van aminozuren in plasma gevonden bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Bovendien werd veranderde gen-expressie gedetekteerd in witte bloedcellen en veranderde de energie-produktie in spiercellen [zie link in onze inleiding]. De auteurs interpreteren de resultaten als expressie van funktionele remming van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase, en ze suggereren een ontregeling van dit enzyme-complex als mogelijke belangrijke factor in de pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Het onderzoek kreeg uitgebreide aandacht in de [Noorse] media en de link met pyruvaat-dehydrogenase werd openbaar gemaakt zonder voorbehoud. In ons laboratorium ontvingen we stalen voor de metabole screening van patiënten met mogelijk vermoeidheid-syndroom. Op basis van mijn ervaring met biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, wil ik wijzen op gebreken in de studie die moeten aansporen tot een aanzienlijk grotere mate van voorzichtigheid omtrent de conclusies.

Kritiek op methode en interpretatie

In het onderzoek werden aminozuur-concentraties in plasma van 200 patiënten en 102 gezonde controle-personen onderzocht. De onderzoekers vonden significante verschillen tussen de twee groepen maar de betekenis is onduidelijk omdat ze zich niet hebben gebaseerd op de gevestigde diagnose van pyruvate-dehydrogenase deficiëntie en omdat de stalen niet op een gestandaardiseerde manier zijn genomen.

AMINOZUREN-PATROON VOLDOET NIET AAN WAT WIJ ZIEN BIJ PATIËNTEN MET PRIMAIRE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie verhoogt de concentratie van pyruvaat in bijvoorbeeld spier- en zenuwcellen. Pyruvaat wordt omgezet in lactaat en het aminozuur alanine. Alanine is het enige aminozuur dat naar verwachting buiten het referentie-gebied valt in plasma en cerbrospinaal vocht bij primaire pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie (één tot twee keer de bovengrens van referentie). Het onderzoek meldde echter een neiging tot lagere alanine-spiegels bij de patiënten. Het is verrassend dat deze opvallende discrepantie niet in het artikel wordt genoemd.

VERKEERDE NORMALISATIE VOOR TESTEN KAN HET VERSCHIL TUSSEN DE GROEPEN VERKLAREN

Een vasten-test wordt sterk aanbevolen bij het bepalen van de plasma-concentratie van aminozuren, omdat de niveaus aanzienlijk variëren met het dieet en ook gedurende de dag tot 10-15%. In de studie worden niet-nuchtere aminozuur-patronen met kleine afwijkingen vergeleken. Het is heel vreemd dat de auteurs geen grotere bedenkingen hebben bij dieet als een verstorende factor wanneer ze zelf hebben aangetoond dat het dieet alleen de groep aminozuren beïnvloedt die argumenteren voor verstoord pyruvaat-dehydrogenase. De studie toonde significante verschillen tussen nuchtere en niet-nuchtere patiënten. De nuchtere patiënten werden daarom uitgesloten van verdere statistische analyse. De auteurs moeten ook duidelijker maken dat een mogelijke verborgen vertekening tussen de patiënten-groep en de controle-groep met betrekking tot voeding en staalname een alternatieve verklaring kan zijn voor de gevonden verschillen. Systematische verschillen in voeding tussen de groepen zijn niet ondenkbaar. […]

WAT MET DE PYRUVAAT/LACTAAT-RATIO EN EEN DIRECTE METING VAN DE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE AKTIVITEIT?

De pyruvaat/lactaat-verhouding in het plasma kan patiënten met pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie van andere patiënten met hyperlactacidemie [verhoogd lactaat in het bloed] onderscheiden. Deze ratio heeft daarom een centrale plaats in de biochemische diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. In het onderzoek werd de pyruvaat/lactaat-verhouding niet bepaald. Dat is jammer: de verhouding had een belangrijke aanwijzing kunnen geven voor, mogelijk tegen, pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Een directe bepaling van de enzyme-aktiviteit in de cellen is ook de sleutel bij de routine-matige diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Het is vreemd dat dit in de studie niet is gedaan in spiercellen die groeien in de aanwezigheid van serum van de patiënt.

SPECIFIEKE LINK MET CHRONISCHE VERMOEIDHEID SYDROOM VEREIST MEERDERE CONTROLE-GROEPEN

In de studie heeft de patiënten-groep een ander expressie-patroon dan de controle-groep met betrekking tot genen geassocieerd met het pyruvaat-dehydrogenase complex. Dit is een interessant resultaat maar de studie biedt geen basis voor het interpreteren van het verschil als specifiek voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Volgens de consensus-criteria hebben patiënten een “aanzienlijk verminderd aktiviteiten-niveau” gehad gedurende minimaal zes maanden. Het is bekend dat de expressie van genen geassocieerd met het volledige metabolisme (inclusief pyruvaat-dehydrogenase complex) verandert bij immobilisatie. Spieren groeien en verdwijnen naar gelang het aktiviteit-niveau, daarom zijn er in deze studie verschillende expressie-patronen te verwachten. Vooraleer het expressie-patroon specifiek kan worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom, moet het niet alleen worden vergeleken met gezonde mensen maar met andere patiënten-groepen die een overeenkomstig verminderd aktiviteiten-niveau ervaren, zoals een beroerte, fracturen, nier-falen of ernstige depressie. In het onderzoek werd ook aangetoond dat in spiercellen in vitro het energie-metabolisme kan veranderen in de aanwezigheid van serum van patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het is interessant dat dit experimenteel kan worden aangetoond maar evenmin kan deze waarneming specifiek worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Nogmaals: meer controle-groepen van patiënten met verminderde aktiviteiten-niveaus zijn om andere redenen nodig. De studie laat bijvoorbeeld een verminderde produktie van hoge-energie fosfaten (ATP) in vitro zien. In een muizen-model waarin spiercellen worden gekweekt in aanwezigheid van serum van individuen met spier-atrofie en chronisch nierfalen, neemt de ATP-produktie ook af.

CHRONISCHE VERMOEIDHEID IS NIET TYPISCH VOOR PRIMAIRE GENETISCHE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

De auteurs suggereren dat pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie een sleutel is in de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Chronische vermoeidheid is geen typisch symptoom bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, noch ernstig noch mild. Het vereist een opmerking maar wordt met geen woord vermeld.

Pragmatische beoordelingen gevraagd

Onderzoek naar metabole mechanismen voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom is interessant, en het grote werk van Fluge en collega’s kan hypotheses genereren die verder onderzoek waard zijn. De auteurs komen echter al heel vroeg vast te zitten bij de opvallende pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie als onderdeel van de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Momenteel is het verband tussen bewezen aminozuur-veranderingen en pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie te zwak, en de verandering in gen-expressie en energie-metabolisme is te onspecifiek voor een dergelijke harde conclusie.

————————-

De endocrinoloog Emeritus Professor Frank Comhaire (Universitair Ziekenhuis, Gent) staat bekend als specialist op het vlak van de behandeling van mannelijke infertiliteit en ondernemer (het op de markt brengen van testen en complementaire behandelingen). De voorbije jaren ontwikkelde hij ook een interesse voor M.E.(cvs)…

In een artikel getiteld ‘Chronic Fatigue Syndrome (CFS) or “systemic immune disorder” (SID)? (Internal Medicine 2016, 6: 225) rapporteerde hij dat er bewijs voor het feit dat “CVS te wijten” is “aan een systemische immuun-stoornis waarbij oxidatieve, immunologische en epigenetische mechanismen de aktiviteit van pyruvaat-dehydrogenase kinase (PDHK) kunnen verhogen en de pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit inhiberen”. Op basis daarvan liet hij een ‘nutriceutical’ (voeding-supplement) testen dat bepaalde organische zuren van algen, vitamine-B1, alfa-liponzuur, acetyl-L-carnitine en oxidoreductase-ubiquinon Q10 bevat. Bij publicatie van een kleine piloot-studie (n = 10; patiënten gediagnosticeerd in Belgische CVS-referentie-centra (!???!)) (‘A Novel Nutriceutical Treatment of Myalgic Encephalitis/Chronic FatigueSyndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”; Internal Medicine 2017, 7:5) bleken er evenveel responders als niet-responders te zijn. Deze laatsten bleken uiteindelijk (na verdere diepgaande screening) aan een andere aandoening dan M.E.(cvs) te leiden. Op het moment van het verschijnen van het artikel was een patent hangende…

Er werd verder meegegeven dat een mogelijke diagnostische methode voor de detektie van deficiënte enzymatische aktiviteit van PDH is: het meten van de concentraties van pyruvaat en acetyl-coenzyme-A in monocyten. “Dit vergt geavanceerde laboratoriumtechnologie”…

Merk op: het tijdschrift Internal Medicine (met slechts een beperkte impact en niet opgenomen in PubMed of Web Of Science) is niet het gerenommeerde Journal of Internal Medicine of het befaamde Annals of Internal Medicine…

november 10, 2017

Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:36 am
Tags: , , , ,

Julia Newton en haar collega’s van de ‘Newcastle University’ rapporteren hier dat PBMCs (type witte bloedcellen in het circulerend bloed) van M.E.(cvs)-patiënten niet in staat zijn om voldoende energie te produceren. Bij bevestiging (bij grotere groepen en andere types cellen) zou dit een indicatie kunnen zijn voor een elematair probleem bij de aandoening.

Ze bestudeerden het oxidatieve fosforylatie systeem (‘elektronentransportketen’, mitochondriaal mechanisme voor de produktie van energie (ATP) en de glycolyse (omzetting van glucose waarbij ook energie vrijkomt) onder basale omstandigheden en onder ‘stress’ (belasting), en concludeerden dat de cellen bij fysiologische stress (lees: hogere nood aan glucose) minder in staat zijn om de cellulaire (mitochondriale) ademhaling op te drijven en zo tegemoet te kunen komen aan de energie-behoeften. Een zoveelste aanwijzing dat er iets mis is met de cellulaire energie-produktie bij M.E.(cvs) – zie referenties/links in de tekst.

Bij de mitochondriale stress test wordt d.m.v. de toevoeging van bepaalde chemische stoffen aan het cultuur-milieu van de cellen enkele parameters gemeten waaruit de ATP-produktie, de reserve-capaciteit, het ‘proton-lek’ (mitochondriale ontkoppeling; diffusie van protonen zodat die niet meer kunnen bijdragen tot de synthese van ATP, de energie gaat verloren als warmte), de niet-mitochondriale respiratie, de maximale respiratie (= reserve-capaciteit + ATP-produktie), de basale respiratie (= ATP-produktie + proton-lek) en de koppeling-efficiëntie (graad waarop nuttige energie wordt gemaakt uit de cellulaire brandstof; mate waarop de mitochondriale systemen op elkaar zijn afgestemd) worden berekend.

Voor de glycolyse stress test worden de cellen ‘behandeld’ (ten einde hen glucose te ontzeggen en zo te ‘dwingen’ andere paden aan te wenden om energie te produceren) om de glycolyse, de glycolytische reserve, de glycolytische capaciteit (som van de eerste 2) en de niet-glycolytische verzuring te berekenen.

Het feit dat PMBCs van M.E.(cvs)-patiënten hun energie-output niet kunnen verhogen om aan de behoeften te voldoen voor routine taken lijkt er op te wijzen dat ze metabool uitgeput zijn. Het is een belangrijke bevinding maar de vraag blijft of dit enkel in deze witte bloedcellen is of ook in andere weefsels voorkomt. Het research-team liet optekenen dat ze ook spiercellen op dezelfde manier wil testen…

————————-

PLoS ONE (2017) 12: e0186802

Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Cara Tomas (1), Audrey Brown (1), Victoria Strassheim (2,3), Joanna L. Elson (4,5), Julia Newton (1,3), Philip Manning (1)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

5 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een zeer uitputtende ziekte met een ongekende etiologie. Abnormaliteiten qua bio-energetische funktie werden genoemd als een mogelijke oorzaak voor CVS. Er werden preliminaire studies uitgevoerd om cellulaire bio-energetische abnormaliteiten bij CVS-patiënten te onderzoeken. Er werd een reeks testen uitgevoerd op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten en gezonde controles.

Deze experimenten onderzochten cellulaire patronen met betrekking tot de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS) en glycolyse. De resultaten toonden consistent lagere metingen van de OX-FOS-parameters in PBMCs van CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Er werden 7 sleutel-parameters van de OX-FOS berekend: basale respiratie, ATP-produktie, protonen-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiration en koppeling-efficiëntie. Hoewel veel van de parameters verschilden tussen de CVS- en controle-groep, werd maximale respiratie aangeduid als sleutel-parameter met betrekking tot de mitochondriale funktie die verschilde tussen CVS- en controle-PBMCs omwille van de consistentie van de stoornis bij CVS-patiënten die werd gevonden doorheen de studie (p ≤ 0.003). De lagere maximale respiratie in CVS-PBMCs suggereert dat wanneer de cellen fysiologische stress ondervinden, ze minder in staat zijn om hun respiratie te verhogen om te compenseren voor stijgende stress en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften. De ontdekte metabole verschillen benadrukken het overmogen van CVS-patient PBMCs om de cellulaire energetische eisen te bevredigen onder basale omstandigheden zowel als wanneer de mitochondrieën onder druk komen te staan tijdens periodes met hoge metabole behoeften.

Inleiding

[…]

Er werd voorgesteld dat abnormaliteiten in de bio-energetische werking de oorzaak kan zijn van de ernstige vermoeidheid die wordt ervaren door CVS-patiënten. Factoren zoals mitochondriale dysfunktie, adenosine-monofosfaat geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK [een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt]) verstoring, oxidatieve stress en skeletspier-cel acidose [‘verzuring’] werden allemaal in verband gebracht met het CVS-fenotype [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10 /// Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Chronic Fatigue Syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2009) 2: 1-16 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radical Biology and Medicine (2005) 39: 584-9]. Een abnormaal energie-metabolisme werd geïdentificeerd als een belangrijk interesse-gebied in de CVS-research, met een aantal studies die plasma- en serum-metabolomica onderzochten en wijzigingen qua metabolieten toonden, en de hypothese dat CVS een hypometabool syndroom is [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39 /// Yamano ES et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA- and urea-cycles. Scientific Reports (2016) 6 /// Naviaux RN et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. PNAS (2016) 113 /// Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9 /// Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1].

Verworven mitochondriale dysfunktie (bv. post-virale infektie) is ook een research-gebied van belang [o.a. Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J. Mitochondrial dysfunction and the pathophysiology of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2012) 5: 208-20 /// Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Mitochondrieën fungeren als het energie-overdracht centrum van de cel en zijn verantwoordelijk voor de produktie van cellulair ATP via respiratie [‘ademhaling’; metabole reakties en processen in de mitochondrieën die de energie uit voedingsstoffen omzetten naar ATP]. Mitochondriale respiratie kan door meerdere factoren worden geïnhibeerd: van cytokine-veranderingen tot oxidatieve stress. Studies omtrent CVS hebben sleutel-indicatoren voor mitochondriale dysfunktie zoals verlaagde aanmaak van ATP [Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – A clinical audit. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2013) 6: 1-15 /// Castro-Marrero J, Cordero MD et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants and Redox Signaling (2013) 19: 1855-60] en een verstoring van de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS [zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie; het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen in de mitochondrieën]) mechanismen getoond. Bijkomend komen cruciale symptomen die geassocieerd zijn met CVS (zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en spierpijn) ook voor bij patiënten met primaire mitochondriale ziekten waarvan is geweten dat ze worden veroorzaakt door mitochondriale dysfunktie die het resultaat is van mutaties van het kern- of mitochondriaal DNA (mtDNA) [Newton JL et al. Perceived fatigue is highly prevalent and debilitating in patients with mitochondrial disease. Neuromuscular Disorders. (2015) 25: 563-6]. Er werd gesuggereerd dat mitochondriale dysfunktie voorkwam bij een subgroep van de CVS-populatie. Door een gebrek aan definitief bewijs voor gans de CVS-populatie hebben anderen echter gesuggereerd dat een dergelijk verband niet significant is [o.a. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8]. Twee research-groepen hebben onafhankelijk van elkaar getoond dat klinisch gevalideerde pathogene mtDNA-mutaties waarschijnlijk zeer zeldzaam zijn in CVS-groepen [Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Translational Medicine (2016) 14 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18]. Eén studie vond geen enkele klinisch gevalideerde mtDNA-mutatie die voldoende significant heteroplasmie [aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom] vertoont, terwijl de andere er slechts één vond: een LHON (‘Leber hereditary optic neuropathy’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast]) mutatie. Daarnaast verschillen de sub-klinische waarden van gekende mtDNA-mutaties niet van deze in de algemene bevolking.

De studie hier richtte zich specifiek op het onderzoeken van sleutel-parameters van de mitochondriale funktie, inclusief de twee belangrijkste energie-producerende mechanismen in de cel – glycolyse en OX-FOS. Veranderingen in deze parameters kunnen wijzen op een mitochondriale basis voor CVS, en mechanismen in de etiopathogenese van de ziekte ophelderen en mogelijke doelwitten voor toekomstige studie identificeren.

De doelstelling van deze studie was het detekteren en vaststellen van veranderingen qua mitochondriale funktie en cellulaire energie-profielen (in PBMCs) van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom en gezonde controles. PBMCs kunnen relatief makkelijk worden verkregen via bloed-afname en werden gebruikt om systemisch de mitochondriale funktie na te gaan in controles en CVS-patiënten omwille van hun systemische blootstelling.

Abnormale PBMC bio-energetica werden al onderzocht bij andere chronische ziekten zoals obesitas, type-2 diabetes mellitus (T2DM) en Reumatoïde Arthitis. Er werd een hogere basale respiratie en maximale respiratie getoond bij T2DM-patiënten. Zoals CVS-patiënten ervaren patiënten met T2DM dikwijls vermoeidheid. Eerdere research heeft getoond dat maximale respiratie en reserve-capaciteit in PBMCs correleert met lichamelijk funktioneren en kracht [bij obesitas]. De symptomen beschreven in die studie (zoals spierpijn, zwakte en inspanning-intolerantie zijn ook courante symptomen bij CVS-patiënten. Gezien de gelijkenissen qua symptoom-profielen van deze 2 ziekten, hadden we in deze studie tot doel te onderzoeken of er ook PBMC-abnormaliteiten qua bio-energetische funktie bestaan bij CVS.

Methodes

[…] patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria voor CVS […]

Bereiding van PBMCs

[…]

Extracellulaire flux-analyse

[Flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex]

Werking van OX-FOS en glycolyse werden bepaald gebruikmakend van een ‘extracellular flux analyser’ […] De mitochondriale respiratie wordt gemeten via de afname van de zuurstof-concentratie in het test-medium. […] Veranderingen qua zuurstof- en proton-concentratie worden gedetekteerd. De glycolyse in de cellen wordt gemeten via de daling van de protonen-concentratie in het test-medium (ook gekend als ‘extracellular acidification [verzuring] -rate’, ECAR). Zuurstof-verbruik (OCR) werd gebruikt als een indicator voor OX-FOS, terwijl ECAR werd gebruikt als een indicator voor glycolytische omzetitng van glucose naar lactaat.

De OCR en ECAR werden gemeten na de opéénvolgende toevoeging van test-reagentia. Voor de mitochondriale stress test: oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP [ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS]), en rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] en antimycine-A [inhibeert de cellulaire respiratie]. Daaruit werden de basale respiratie, ATP-produktie, proton-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie berekend. Voor de glycolyse stress-test: glucose, oligomycine en 2-deoxyglucose [stopt de glycolyse]. Dit liet toe glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring te berekenen. […]

Trypaan-blauw

Na toevoeging van [de kleurstof] trypaan-blauw worden dode cellen blauw om dat ze doorlaatbaar zijn voor de kleurstof en levende cellen blijven ongekleurd. Het percentage levende cellen (t.o.v. het totaal aantal cellen) geeft de cel-viabiliteit.

Statistiek

[…]

Resultaten

[…]

Effekt van het invriezen op PBMC-OCR

De afname van bloedstalen van de patiënten gebeurde sporadisch en was onvoorspelbaar, daarom werd het nodig geacht dat de stalen werden ingevroren om ze op hetzelfde moment te kunnen testen en de variatie te niet te doen. Om die reden werden mitochondriale stress testen uitgevoerd op vers geïsoleerde en ingevroren (-80˚C) PBMCs om het effekt na te gaan van het invriezen (omwille van eerdere tegenstrijdige resultaten). […]

Er werden significante verschillen gezien tussen CVS-patiënten en controles voor zowel verse als ingevroren PBMCs voor dezelfde 4 parameters: basale respiratie (p ≤ 0.043), proton-lek (p ≤ 0.013), maximale respiratie (p ≤ 0.003) en reserve-capaciteit (p ≤ 0.012).

Wanneer we verse en ingevroren PBMC-stalen van CVS-patiënten vergeleken, verschilden de basale respiratie (p = 0.006), ATP-produktie (p = 0.003), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) significant. Ook bij de gezonde controles werden significante verschillen gezien voor basale respiratie (p = 0.008), ATP-produktie (p = 0.047), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) tussen verse en ingevroren stalen. Er wordt gedacht dat de consistent significante afname qua basale respiratie en maximale respiratie voor de ingevroren stalen t.o.v. de verse PMBCs freshly isolated PBMCs te wijten is aan de stress ten gevolgde het invries-proces.

Effekt van glucose-concentratie op PBMCs

OCR mitochondriale stress testen werden uitgevoerd in medium met laag (1 mM) en hoog (10 mM) glucose, met de bedoeling te kijken of veranderingen qua cellulaire ATP-produktie konden worden gedetekteerd bij deze 2 concentraties. De hypothese was dat inculatie van PBMCs in laag-glucose de cellen van energie-transductie via glycolyse zou sturen in de reichting van het OX-FOS-mechanisme, en zo een toename qua mitochondriale respiratie zou veroorzaken. Deze hypothese voorspelt een hogere zuurstof-consumptie bij laag-glucose t.o.v. van hoog-glucose. Laag-glucose werd aangewend om een natuurlijke stressor (hypoglycemie) na te bootsen die PBMCs in vivo kunnen ondervinden (en die anders is dan de stress van het invriezen, wat niet voorkomt in vivo).

Bij laag-glucose vertoonde de CVS-populatie significant lagere resultaten dan de controles voor 6 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), maximale respiratie (p < 0.001), reserve-capaciteit (p < 0.001), niet-mitochondriale respiratie (p < 0.001) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Wanneer cellen werden geïncubeerd in hoog-glucose, verschilden CVS- en controle-PBMCs voor 5 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p = 0.013), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001).

De parameters die significante verschillen vertoonden wanneer de resultaten werden vergeleken tussen laag- en hoog-waren ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p < 0.001), maximale respiratie (p = 0.025), niet-mitochondriale respiratie (p = 0.004) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Deze verschillen werden echter enkel in de controle-groep gevonden. De glucose-concentratie had geen enkel effekt op de parameters in de CVS-groep.

[Leeftijd bleek geen verstorende factor voor mitochondriale funktie. Ook geslacht kon worden geëmlimineerd als verstorende factor.]. De duur van het invriezen correleerde niet met de cell-viabiliteit (p = 0.100) of maximale respiratie (p = 0.722) en is dus geen verstorende factor. Zelfs een korte periode invriezen veroorzaakt veranderingen qua OX-FOS-funktie, wat bewijst dat het proces van invriezen/ontdooien deze veranderingen veroorzaakt en niet de duur van het invriezen.

[…]

Glycolytische aktiviteit

De resultaten van een glycolyse stress test met PBMCs vertoonden geen verschillen qua glycolyse tussen de patiënten en controles. Geen enkele van de 5 berekende parameters verschilde significant tussen CVS- en controle-stalen (p ≥ 0.075).

De cel-viabiliteit van verse en ingevroren stalen verschilde niet significant en er was geen significant verschil wat betreft de viabiliteit van de CVS- en controle-stalen, vers noch ingevroren (p ≥ 0.346).

Bespreking

Ondanks de grote aantallen mensen met CVS in de bevolking, blijven de oorzaken er van onverklaard. Dit is de eerste studie die gevallen-controle gebruikt om de mitochondriale funktie te onderzoeken in PBMCs bij CVS. Er werden PBMCs gebruikt in deze preliminaire studie aangezien het toelaat potentiële abnormaliteiten te bekijken op systemsch niveau.

Significant gewijzigde mitochondriale stress test parameters in de CVS-groep t.o.v. de gezonde controle groep suggereren dat CVS-patiënten systemische abnormaliteiten qua energie-overdracht kunnen vertonen, bijzonderlijk wanneer geïsoleerde PBMCs onder mitochondriale stress komen te staan. De lagere reserve-capaciteit die wordt gezien bij CVS-patiënten wijst er op dat hun cellen al hun capaciteit aanwenden onder normale omstandigheden (zonder stress) dan gezonde controles. De verlaagde maximale respiratie suggereert dat de PBMCs van CVS-patiënten niet in staat zijn tot dezelfde mate van respiratie als gezonde controles. De resultaten tonen dat CVS-patiënten hun respiratoire capaciteit slechts met 47% (± 37%) kunnen verhogen (van baseline tot maximaal gestimuleerd door FCCP), wat significant (p < 0.001) lager is dan de 98% (± 32%) toename qua respiratoire capaciteit bereikt door controle-PBMCs. De consistent lagere maximale respiratie in de CVS-groep toont het onvermogen van CVS-patiënten tot dezelfde mate van respiratie als de controle-groep onder cellulaire stress. De lagere reserve-capaciteit suggereert dat wanneer CVS-PBMCs onder stress komen te staan, ze minder in staat zijn hun respiratie te verhogen om te compenseren voor de toegenomen stress waardoor patiënten minder in staat zijn om te voldoen aan de cellulaire energie-vereisten. Er wordt gedacht dat gelijkaardige abnormaliteiten qua reserve-capaciteit bijdragen aan een waaier van andere ziekte-pathologieën zoals hart-ziekte, neurodegeneratieve ziekten bij het ouder-worden en gladde-spiercel sterfte.

Het invries-proces had een significante impact op de cellulaire bio-energetica van PBMCs bij zowel de controle- als de CVS-groep. Vier van de onderzochte parameters vertoonden significante verschillen tussen de verse en ingevroren stalen in beide groepen: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. De resultaten tonen dat het invries-proces dezelfde invloed op beide groepen had, met dezelfde dalingen van elk van de vermelde parameters. Het invriezen van PBMCs kan talrijke cellulaire wijzigingen veroorzaken die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de gedaalde OCR die in deze experimenten werd opgetekend. Mogelijke veranderingen veroorzaakt door invriezen omvatten oxidatieve schade, een verlies qua membraan-integriteit door de vorming van ijs-kristallen en wijzingingen in de ion-homeostase.

Hoewel bleek dat invriezen een impact had op bepaalde parameters, werd gezien dat dezelfde parameters significant verschillend waren tussen de controle- en de CVS-groep bij verse en ingevroren stalen. Dit toont aan dat zelfs al zijn de absolute waarden van sommige parameters beïnvloed door het invries-proces, het patroon in beide groepen kan worden gezien en dat daarom verse of ingevroren stalen kunnen worden gebruikt om verschillen te detekteren tussen controles en CVS-patiënten. Voor toekomstige studies waarbij men wil kijken naar de absolute OCR-waarden zouden verse stalen moeten worden gebruikt, voor andere experimenten volstaan echter ingevroren stalen om adequaat de verschillen tussen groepen te tonen cohorts. Er werden ingevroren stalen gebruikt voor de hoge- en lage-glucose experimenten omwille van de sporadische staalnames gedurende een relatief lange periode maar deze bevinding valideert het gebruik van ingevroren stalen voor deze experimenten en suggereert dat het invriezen van stalen het vermogen om groepen te vergelijken niet verandert. Er dient te worden opgemerkt dat tijdens eerdere analyse met ≤ 12 stalen, het moeilijk was om verschillen tussen de 2 groepen te detekteren met ingevroren stalen, daarom is voor een kleiner aantal stalen het gebruik van verse stalen gewenst.

De hypothese was dat PBMC-incubatie in laag-glucose de energie-transductie van cellen van glycolyse zou leiden naar het OX-FOS-mechanisme, wat een toename van de mitochondriale respiratie veroorzaakt. Deze hypothese voorspelt een hogere basale respiratie en maximale respiratie in laag-glucose. Een hogere maximale respiratie in laag-glucose werd enkel gezien in de controle-groep maar niet in de CVS-groep, terwijl de basale respiratie niet significant steeg in om het even welke groep bij lage-glucose omstandigheden. Daarenboven steeg in de controle-groep de ATP-produktie, de niet-mitochondriale respiratie en de koppeling-efficiëntie, en daalde het proton-lek, bij laag-glucose. De CVS-groep vertoonde geen verschillen tussen laag- en hoog-glucose condities voor om het even welke parameter. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de controle-cellen zich beter kunnen aanpassen aan hun omgeving en beschikken over het vermogen om hun ATP-produktie te verhogen via mitochondriale respiratie indien nodig – iets waar de CVS-cellen wellicht niet toe in staat zijn.

Vier van de parameters bleken verschillend tussen de controle- en CVS-groepen bij zowel laag- als hoog-glucose: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. Dit toont aan dat de verschillen voor deze parameters tussen de 2 groepen die hier werden gezien, kunnen worden gereproduceerd in verschillende glucose-condities en bevestigt het onvermogen van de CVS-PBMCs om hun respiratoire capaciteit te verhogen tot het niveau van de controle-PBMCs zowel bij ‘baseline’ als wanneer ze tot het maximum worden gestimuleerd (door FCCP), zelfs bij laag-glucose wanneer de cellen worden naar ATP-produktie via mitochondriale respirate worden gepusht en weg van de glycolyse als energie-bron. Niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie verschilden enkel tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, terwijl het proton-lek enkel verschilde bij hoog-glucose.

De koppeling-efficiëntie toonde dat ATP-produktie enkel efficiënter werd in de controle-groep wanneer er stress ontstond door laag-glucose, en niet in de CVS-groep. Er werden verschillen qua koppeling-efficiëntie gezien tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, wat suggereert dat de CVS-cellen reeds aan de maximum efficiënctie zitten wat betreft de aanmaak van ATP wanneer controle-cellen nog in staat zijn die efficiëntie te verhogen en ATP produceren wanneer dit vereist is (bv. bij laag-glucose).

[…] De statistische significante resultaten wijzen op robuste statistische gegevens, ondanks de relatief beperkte grootte van de groepen.

Deze experimenten helpen bij het identificeren van de richting die toekomstige research omtrent cellulaire bio-energetica bij CVS zou moeten nemen voor het detekteren van verschillen betreffende sommige, maar niet alle, parameters van de mitochondriale funktie. Verschillen qua mitochondriale parameters tonen het onvermogen van CVS-PBMCs om het OX-FOS-mechanisme aan te wenden om energie te produceren in dezelfde mate als controle-PBMCs dat doen, zowel onder basale omstandigheden als wanneer ze worden gedwonen tot maximale respiratie. De consistent significante verschillen tussen de 2 groepen bij basale respiratie en maximale respiratie tonen hun belang aan als potentiële merkers voor CVS, een bevinding die kan worden gebruikt om richting te geven aan toekomstig onderzoek omtrent de mitochondriale dysfunktie bij CVS.

In tegenstelling tot eerdere literatuur [zie bv. Armstrong et al. hierboven] die suggereerde dat abnormaliteiten qua PBMC ATP-concentraties kunnen worden veroorzaakt door glycolyse, tonen resultaten van de glycolyse stress test dat glycolyse bij CVS-patiënten niet significant verschilt van de gezonde groep. Dit kan te wijten zijn aan de relatief kleine groepen die in deze studie werden gebruikt. De combinatie van de detektie van significante verschillen in OX-FOS naast het ontbreken van detekteerbare verschillen in glycolyse heeft mogelijks een voorheen ongekend fenotype van CVS-PBMCs blootgelegd, hoewel grotere stalen nodig zullen zijn om dit te bevestigen. Hoewel de belangrijkste beperking van deze studie de grootte van het staal was, resulterend in een minder krachtige analyse (bijzonderlijk voor de vers geïsoleerde controle-groep), dient te worden opgemerkt dat de hier gepresenteerde gegevens enkel preliminaire bevindingen zijn. Grotere stalen en longitudinale afnames zijn nodig om de hier verkregen reulstaten te valideren en te zorgen voor de statistische ‘power’ die vereist is om verschillen in andere parameters te detekteren. Een andere beperking van deze studie is het gebrek aan karakteristieken van de CVS-groep. Demografische, antropometrische en symptoom-gegevens zouden nuttig zijn om te kijken naar links met de mitochondriale abnormaliteiten die in deze studie werden geobserveerd. Het zou interessant zijn om te analyseren of CVS-symptomen – in het bijzonder vermoeidheid-graad – correleerden met de gemeten mitochondriale parameters. Er zouden bijkomende experimenten en technieken kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de mitochondriale inhoud en morfologie, mitochondriale funktie in doorlaatbaar-gemaakte cellen en geïsoleerde mitochondrieën, en metingen van het mitochondriaal membraan potentiaal om deze resultaten verder te valideren. Stratificatie van PBMCs op basis van fluorescentie-gektiveerde cel-sortering (FACS) is een techniek die kan worden aangewend om de cel-types PBMCs verder onder te verdelen om te identificeren welke specifieke cel-populaties verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde OX-FOS-verschillen. Het is momenteel nog niet geweten of factoren zoals recente aktiviteit en dieet voor de bloed-afname een effekt heeft op PBMC bio-energetica en dit is iets dat dient te worden onderzocht. Het gebruik van sedentaire controles en aktiviteit-monitors zou nuttig zijn om het effket op PBMC bio-energetica te tonen. Deze studie maakte gebruik van PBMCs als een voorspeller voor de systemische mitochondriale funktie maar er zounden andere cel-types kunnen worden gebruikt om te onderzoeken of de hier geoberveerde verschillen kunnen worden gezien in andere weefel-types bij CVS-patiënten.

De resultaten van deze studie weerspiegelen de resultaten gevonden bij T2DM-patiënten (een link tussen een andere ziekte met vermoeidheid als kern-symptoom en OX-FOS-parameters: basale respiratie en maximale respiratie. Dit geeft aan dat de PBMC bio-energetische abnormaliteiten een consistente link met vermoeidheid vertonen, maar of de abnormaliteiten optreden ten gevolge de vermoeidheid of de oorzaak van de ziekte zijn blijft onbekend.

Deze preliminaire research heeft duidelijk statistisch significante verschillen in het bio-energetisch profiel van PBMCs van CVS-patiënten getoond in vergelijking met cellen van gezonde controles. Belangrijk: deze resultaten leggen niet vast of de verschillen qua PBMC energie-mechanismen een oorzaak of gevolg van CVS zijn; deze gegevens impliceren echter duidelijk dat deze cellen een rol kunnen spelen in het ziekte-mechanisme. Verder kan het gerbuik van PBMCs een nieuw en waardevol model zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen ter behandeling van CVS.

januari 7, 2017

Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:37 am
Tags: , , , , , , , , ,

Samen met medewerkers van 5 Noorse ziekenhuizen brachten Oystein Fluge & Olav Mella – die de immunosuppressiva rituximab (en cyclofosfamide) test(t)en als mogelijke (momenteel nog preliminair/experimenteel; want niet bevestigd) behandeling bij M.E.(cvs) – het metabolisme van een behoorlijk grote groep patiënten (en gezonde controles) gedetailleerd in kaart. We geven het uitgebreid artikel hier zo compleet mogelijk weer om (mede-)patiënten zo goed mogelijk te informeren en het belang ervan te onderstrepen naar behandelaars/onderzoekers toe…

De researchers detekteerden specifieke biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. De waarden van bepaalde aminozuren waren gedaald. Het patroon gaf belangrijke informatie over de mechanismen die de symptomen veroorzaken en vooral over het energie-metabolisme bij de patiënten.

De reductie van de specifieke aminozuren werd voornamelijk gevonden bij vrouwen met M.E.(cvs). De verschillen bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten waren minder significant (vergeleken met gezonde mannen). De onderzoekers vonden echter dat de waarden van een bepaald aminozuur dat de afbraak van proteïnen in spierweefsel weerspiegelt gestegen waren bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten. Aangezien mannen meer spiermassa hebben dan vrouwen, zouden proteïnen van spierweefsel kunnen worden gebruikt als extra energie-reserve.

Onder normale omstandigheden gebruiken mensen koolhydraten, vetten (lipiden) en proteïnen (opgebouwd uit aminozuren) als energie-bronnen, in de katabole (afbraak-) processen in de mitochondrieën. Wanneer intense lichamelijke inspanning wordt gevergd, ontstaat een tekort aan zuurstof in de spier-mitochondrieën (anaërobe inspanning), zodat glucose wordt omgezet naar melkzuur (lactaat). Het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) speelt een belangrijke rol bij de regulering van de processen die zorgen voor de omzetting van koolhydraten naar energie. Onderstaande studie suggereert dat PDH geïnhibeerd (onderdrukt) is bij M.E.(cvs)-patiënten.

Als de aktiviteit van PDH verstoord is, kunnen de cellen reageren door het verbruik van alternatieve ‘brandstoffen’ te verhogen, wat de veranderingen in het aminozuren-profiel in het bloed bij M.E.(cvs) kan verklaren. Ondanks de pogingen tot compensatie van het lichaam, zou deze situatie het vermogen van de cellen om de metabole processen aan te passen (om een geschikt antwoord te bieden voor de steeds veranderende vereisten qua energie-produktie) kunnen compromitteren. Lichamelijke aktiviteit kan dan leiden tot een plots energie-gebrek in de spieren, samen met een accumulatie van melkzuur. Bij ernstig zieke M.E.(cvs)-patiënten kan dit worden gezien na een minimale belasting.

Na meting van de gen-expressie (mRNA) in witte bloedcellen (PBMCs) van een aantal factoren die PDH reguleren, vonden de onderzoekers dat meerdere belangrijke factoren die de werking van PDH remmen, verhoogd waren bij de M.E.(cvs)-patiënten. Deze veranderingen waren aanwezig bij de vrouwelijk en mannelijke patiënten. Dit geeft aan dat de PDH-inhibitie zelf optreedt bij de beide geslachten maar dat de effekten op het metabolisme geslacht-specifiiek kunnen zijn.

Het is zeer waarschijnlijk dat M.E.(cvs) ook regulatie-problemen in andere delen van het metabolisme (bv. het verwerken van vetten) omvat en dat wordt verder onderzocht. Er wordt ook onderzoek verricht om te begrijpen hoe een vermoedelijk defekte immuun-respons (Auto-immuniteit?) een inhibitie van het cellulair metabolisme zou kunnen veroorzaken (Welke auto-antilichamen hinderen welke signalisering-mechanismen?).

De resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van Robert Naviaux in de V.S., McGregor & Armstrong et. al. in Australië, Ruud Vermeulen in Nederland, Emi Yamano et al. in Japan en anderen… (zie links in de tekst) Lees ook ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Computer-model voor inspanning-intolerantie bij M.E.(cvs)’ & ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ alhier.

————————-

Journal of Clinical Investigation Vol. 1, #2 (december 2016)

Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome

Oystein Fluge (1), Olav Mella (1,2), Ove Bruland (1,3), Kristin Risa (1), Sissel E. Dyrstad (4), Kine Alme (1), Ingrid G. Rekeland (1), Dipak Sapkota (1), Gro V. Rosland (4), Alexander Fossa (5), Irini Ktoridou-Valen (1), Sigrid Lunde (1), Kari Sorland (1), Katarina Lien (6), Ingrid Herder (6), Hanne Thurmer (7), Merete E. Gotaas (8), Katarzyna A. Baranowska (8), Louis M.L.J. Bohnen (9), Christoph Schafer (9), Adrian McCann (10), Kristian Sommerfelt (11), Lars Helgeland (12), Per M. Ueland (2,10), Olav Dahl (1,2), Karl J. Tronstad (4)

1 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

2 Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

3 Department of Medical Genetics and Molecular Medicine, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

4 Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, Norway

5 Department of Oncology, Norwegian Radium Hospital, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

6 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 Telemark Hospital, Department of Medicine, Notodden, Norway

8 Department of Pain and Complex Disorders, St. Olav’s Hospital, Trondheim, Norway

9 Division of Rehabilitation Services, University Hospital of Northern Norway, Tromso, Norway

10 Bevital AS, Bergen, Norway

11 Department of Pediatrics Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

12 Department of Pathology, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

[Oystein Fluge & Olav Mella hebben mogelijks een belangen-conflict omwille van hun patenten m.b.t. de B-cel depletie bii M.E./CVS.]

Samenvatting

Myalgische Encefalopathie/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een uitputtende ziekte zonder gekende etiologie, met als kenmerkende symptomen post-exertionele malaise en een slecht herstel. Metabole dysfunktie is een plausibele bijdragende factor. We hypothiseerden dat wijzingen qua aminozuren in het serum specifieke defekten in het energie-metabolisme kunnen blootleggen bij M.E./CVS. Een analyse van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde individuen toonde een specifieke daling van de aminozuren die het oxidatief metabolisme via de TCA-cyclus voeden, voornamelijk bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. De concentratie in het serum van 3-methylhistidine, een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme, was significant gedaald bij mannelijke patiënten. Het aminozuren-patroon suggereerde een funktionele verstoring van pyruvaat-dehydrogenase (PDH), wat werd ondersteund door verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende PDH-kinasen 1, 2 & 4; sirtuine-4 en PPARδ in perifeer bloed mononucleaire cellen [PBMCs] bij beide geslachten. Myoblasten opgekweekt in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertoonden metabole aanpassingen, inclusief verhoogde mitochondriale ademhaling en overmatige lactaat-sekretie. De aminozuren-veranderingen konden niet worden verklaard door symptoom-ernst, ziekte-duur, leeftijd, BMI of niveau van fysieke aktivteit. Deze bevindingen zijn in overéénstemming met de manier waar op de ziekte zich klinisch presenteert: met inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie en excessieve lactaat-produktie bij inspanning.

Inleiding

[…] Research suggereert dat M.E./CVS gepaard gaat met wijzigingen in fundamentele processen van het energie-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531 /// Filler K et al. Association of Mitochondrial Dysfunction and Fatigue: A Review of the Literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]. Dergelijke metabole veranderingen kunnen ontstaan door ontregelde fysiologische respons-mechanismen (immuun-aktivatie, inflammatie en receptor-gemedieerde signalisering) [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: 1]. Er zijn echter geen consistente gegevens die een gemeenschappelijk metabool defekt aangeven die de symptomen van deze patiënten zouden kunnen verklaren. […]

[…] Observaties suggereren dat de systemische inspanning-intolerantie bij M.E./CVS, minstens gedeeltelijk, een omschakeling naar anaërobe glycolyse, waarbij lactaat wordt gegenereerd bij een significant lagere belasting dan bij gezonde mensen, zou kunnen inhouden. Er werden verhoogde lactaat-waarden gevonden in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Murrough JW et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome measured by 1H MRS imaging at 3.0 T. NMR Biomed. (2010) 23: 643-650 /// Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed. (2012) 25: 1073-1087; zie ook ‘Lactaat in Ventriculair Cerebrospinaal Vocht is verhoogd bij CVS]. Het vinden van defekten in glucose-gebruik en lactaat-produktie is echter niet evident op basis van routine bloed-analyses, wellicht omdat de afname gebeurt in rust zonder voorafgaande lichamelijke inspanning.

Er werden wijzigingen qua serum- (of plasma-) concentraties van bepaalde aminozuren gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten. Een studie over aminozuren in het serum […] toonde significant lagere waarden glutamine & ornithine, wijzend op een mogelijke stoornis in het aminozuren- en stikstof-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al.; zie hierboven]. Dezelfde onderzoekers vonden significant gedaalde serum-waarden voor glutamaat & fenylalanine [vrouwelijke M.E./CVS-patiënten] en ze stelden voor dat verminderde glucose-oxidatie leidt tot toegenomen gebruik van aminozuren als substraat in de TCA-cyclus [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics. (2015) 11: 1626-1639]. In een andere studie werden significante dalingen voor meerdere aminozuren en metabolieten gezien in de urine van M.E./CVS-patiënten [Niblett SH et al. Hematologic and urinary excretion anomalies in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Exp Biol Med (2007) 232: 1041-1049]. Deze gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een metabool defekt maar de specifieke oorzaak werd nog niet geïdentificeerd.

De anaërobe drempel en herstel-tijd na inspanning hangen af van de hoeveelheid geproduceerd lactaat en de opruiming ervan. Lactaat wordt gemaakt uit pyruvaat, hoofdzakelijk door glucose-katabolisme via glycolyse, of de afbraak van bepaalde aminozuren. Onder normale aërobe omstandigheden wordt pyruvaat getransporteerd naar de mitochondrieën waar het wordt omgezet naar acetyl-CoA d.m.v. het pyruvaat-dehydrogenase (PDH) complex. Daarnaast wordt acetyl-CoA geproduceerd zonder tussenkomst van PDH, via degradatie van vetzuren en ketogene aminozuren [die kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA]. Het gevormd acetyl-CoA wordt verder geoxideerd in de TCA-cyclus en dient als brandstof voor de mitochondriale ademhaling en aanmaak van adenosine-trifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylatie. Onder anaërobe omstandigheden, wanneer tekort aan zuurstof mitochondriale ademhaling verhindert, stapelt het pyruvaat zich op in het cytosol, wat leidt tot verhoogde aanmaak en cellulaire excretie van lactaat. Mitochondriale dysfunktie leidt tot overmatige lactaat-produktie én een gebrekkige toevoer van ATP, en werd gesuggereerd een rol te spelen bij M.E./CVS [werk door Myhill]. PDH werkt als een toegangsweg in het oxidatief metabolisme door het coördineren van de afbraak van energie-substraten afgeleid van koolhydraten, vetten en aminozuren. Een daling qua PDH enzymatische aktiviteit kan leiden to accumulatie van pyruvaat en daardoor over-produktie van lactaat, zelfs in aanwezigheid van toereikende zuurstof. De PDH-aktiviteit wordt verder gecontroleerd door PDH-kinasen (PDKs) die de PDH enzyme-aktiviteit remmen via fosforylatie [verbinding met een fosfaat-groep; dergelijke enzymatische reaktie speelt dikwijls een rol bij signaal-overdracht], en PDH-fosfatasen die defosforylatie katalyseren. Sirtuine-4 (SIRT4) werd geïdentificeerd als een mitochondriaal lipoamidase [enzyme] dat de PDH-aktiviteit inhibeert [sirtuinen zijn NAD+-afhankelijke enzymen betrokken bij gen-regulering en het metabolisme]. PDK1-PDK4 worden gereguleerd op transcriptie-niveau via signalisering-aanwijzingen waarbij factoren zoals AMP-afhankelijk proteïne kinase (AMPK [zie link in de ‘Bespreking’]), PPARs [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren; groep van receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] en HIF1 [hypoxie-induceerbare factoren zijn transcriptie-factoren die reageren op dalingen van de beschikbare zuurstof in het cellulair milieu] betrokken zijn. Er werd een mogelijke rol van een verstoorde werking van PDH en abnormale AMPK-aktivatie bij M.E./CVS voorgesteld [Rutherford G, Manning P, Newton JL. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) 2497348].

Samengevat: eerdere bevindingen ondersteunen dat ontregeling van PDH en veranderingen qua aminozuren in het serum betrokken kunnen zijn bij het pathomechanisme voor M.E./CVS. Onze hypothese was dat M.E./CVS geassocieerd is met een defekt oxidatief metabolisme waarbij PDH betrokken is, leidend tot verhoogd gebruik van ketogene aminozuren om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien. Om deze hypothese te controleren, bestudeerden we de concentraties van aminozuren in serum-stalen van 200 M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de ‘Canadian consensus criteria’ en 102 gezonde controles. Om mogelijke ziekte-mechanismen na te gaan, hebben we de mRNA-expressie van relevante genen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles gemeten. We stelden gecultiveerde spiercellen bloot aan serum van M.E./CVS-patiënten om te bepalen of bestanddelen in het bloed het cellulair energie-metabolisme kunnen beïnvloeden.

Methodes

ME/CVS-patiënten en gezonde controles. Alle deelnemende patiënten voldeden aan de Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. […] 162 vrouwen [gemiddeld 37,8 jaar oud] en 38 mannen [gemiddeld 36,3 jaar oud]. BMI (kg/m2) gemiddeld 24,9 voor de vrouwelijke & 25,0 voor de mannelijke patiënten. Controles (bloed-donoren en medisch personeel): 67 vrouwen [gemiddeld 34,5 jaar oud] en 35 mannen [gemiddeld 36,2 jaar oud] […].

Van de 200 M.E./CVS-patiënten waren er 47 die overnacht vastten voor de bloed-afname en 153 die dat niet deden. Alle 102 gezonde controles vastten niet. We vergeleken de serum-concentraties van alle aminozuren, van overnacht-vastende en niet-vastende patiënten, per geslacht. […]

Metabolieten-analyse. De 20 standaard aminozuren werden geanalyseerd d.m.v. gas-chromatografie & massa-spectrometrie […] Arg, hArg, ADMA, SDMA, 1-Mhis & 3-MHis d.m.v. vloeistof- chromatografie & massa-spectrometrie […]. […]

Kwantitatieve RT-PCR. Alle M.E./CVS-patiënten en gezonde controles in de gen-expressie studie waren niet-vastend. […] Beoordeling van PDK1, PDK2, PDK3, PDK4, PPARA, PPARD, PPARG, PDHA, MPC1, MPC2, ACOX1, HIF1A & SIRT4 mRNAs van 75 M.E./CVS-patiënten en 43 gezonde controles. […]

Cel-cultuur. […] Om te onderzoeken of blootstelling aan serum van M.E./CVS-patiënten het energie-metabolism in gecultiveerde myoblasten [voorlopers van spier-cellen] beïnvloedde […]. De experimenten werden geblindeerd uitgevoerd wat betreft de groepen (M.E./CVS of gezonde controle).

Cellulair metabolisme. OCR [zuurstof-verbruik] & ECAR [extracellulaire verzuring] [zie ‘Resultaten’] werden gemeten om, respectievelijk, de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie (glycolyse) te beoordelen. […] OCR & ECAR werden gedurende het experiment (waarbij sequentieel specifieke metabole modulatoren werden toegediend) simultaan opgenomen. […] De volgende cellulaire energetische omstandigheden werden gedefinieerd. Conditie-I “Rustend (alleen aminozuren)” (cellen heb enkel energie nodig voor basale fysiologische vereisten.): enkel aminozuren (niet Gln) als energie-substraten toegediend in het test-medium. Conditie-II “Rustend (aminozuren & glucose)”: cellen krijgen glucose (maar nog steeds in rust aangezien de vraag naar ATP onveranderd is). Conditie-III “Anaërobe belasting”: ATP-synthase geïnhibeerd d.m.v. oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme geen ATP meer kan aanmaken] (cellen vertrouwen op glycolytische ATP-produktie; gelijkaardig aan het anaëroob energie-metabolisme, waarbij de mitochondriale ATP-produktie geïnhibeerd is door zuurstof-depletie). Hier wordt de maximale glycolytische capaciteit gemeten. Deze OCR wordt ‘leak activity’ [‘lek-aktiviteit’] genoemd aangezien het niet is gelinkt aan ATP-produktie via oxidatieve fosforylatie. Een lage ‘leak’-ademhaling betekent dat de integriteit van het mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem intact is. Conditie-IV “Aërobe belasting”: toevoeging van CCCP [carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone; chemische inhibitor van de oxidatieve fosforylatie, vernietigt het mitochondriaal membraan-potentiaal] liet het inhiberend effekt van oligomycine op het mitochondriaal zuurstof-verbruik los […]. Dit weerspiegelt een situatie van ernstige energie-depletie (mitochondriale ademhaling en glycolyse maximaal). […] Tenslotte werden rotenon [blokkeert NADH-dehydrogenase (complex-I) en zodoende de respiratoire keten] & antimycine-A [blokkeert complex-III en zodoende de respiratoire ademahaling] toegediend om (respectievelijk) respiratoir complex-I & -III te inhiberen, en zo de niet-mitochondriale zuurstof-consumptie te bepalen […].

Statistiek. […]

De studie is exploratief en hypothese-genererend […]. […]

Studie-goedkeuring. […]

Resultaten

Serum-concentraties van de 20 standaard aminozuren […]. De initiële analyses toonden een duidelijk patroon bij vergelijking van aminozuren met verschillende startpunten voor oxidatie via de mitochondriale pyruvaat/TCA-cyclus as. Daarom werden de aminozuren onderverdeeld in 3 categorieën […]:

Categorie-I aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat en daarom afhankelijk van PDH zijn voor verdere oxidiatie: alanine (Ala), cysteïne (Cys), glycine (Gly), serine (Ser) & threonine (Thr).

Categorie-II aminozuren treden het oxidatie-mechanisme binnen als acetyl-CoA, dat direct en onafhankelijk van PDH de TCA-cyclus voedt […]: isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenylalanine (Phe), tryptofaan (Trp) & tyrosine (Tyr).

Categorie-III bestaat uit anaplerotische aminozuren [anaplerotische reakties zijn er waar tussenprodukten van een metabool mechanisme worden gevormd; simpel uitgedrukt: “ze vullen de voorraden aan”] die worden omgezet naar TCA-cyclus intermediairen (en zo de metabole capaciteit van de cyclus aanvullen en ondersteunen): enkel aminozuren die niet tot categorieën-I of -II behoren; methionine (Met) & valine (Val) […]; histidine (His), glutamine (Gln), glutamaat/glutaminezuur (Glu), (Gln + Glu = Glx) & proline (Pro) […] en asparagine (Asn) & aspartaat/asparaginezuur (Asp), (Asn + Asp = Asx) […]. […]

Deze klassificatie is een vereenvoudigd model. Verscheidene aminozuren kunnen meerdere afbraak-mechanismen hebben afhankelijk van de fysiologische context. De aminozuren in categorie-I & -III zijn uitsluitend glucogeen [kunnen worden omgezet tot glucose], terwijl die in categorie-II ketogeen [kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA] zijn of beide. […]

Aminozuren die voorzien in pyruvaat als substraat voor PDH (categorie-I). Er waren geen significante verschillen qua gemiddelde serum-waarden voor categorie-I aminozuren (Cys, Gly, Ser, Thr) tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles, uitgezonderd voor Ala (kleine maar statistisch significante daling bij de patiënten; P = 0.027). Er waren geen verschillen voor Gly & Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. vrouwelijke controles maar geringe dalingen voor Ser & Thr (telkens P = 0.010). Bij de mannen waren er geen verschillen voor deze aminozuren (M.E./CVS-patiënten versus controles). De som van de serum-concentraties van deze 4 categorie-I aminozuren (zonder Ala) verschilde niet tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles (ook niet per geslacht).

Aminozuren die zorgen voor acetyl-CoA toevoer in de TCA-cyclus (categorie-II). Alle 6 aminozuren in categorie-II waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde (P-waarden < 0.001 voor Ile, Leu, Phe & Tyr; 0.001 & 0.009 voor Lys & Trp). De dalingen waren zeer significant bij vrouwen met M.E./CVS (t.o.v. gezonde vrouwen) […]. Vergelijking van mannelijke M.E./CVS-patiënten met mannelijke controles toonde geen significante verschillen […] (trend tot vermindering voor Tyr; P = 0.086). De som van de serum-concentraties van de 6 categorie-II aminozuren was significant lager voor M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (ook bij vrouwen maar niet bij mannen). […]

Anaplerotische aminozuren (categorie-III). De gemiddelde serum-waarden voor anaplerotische (categorie-III) aminozuren waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles […]. […]  De dalingen qua anaplerotische aminozuren werden vastgesteld bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten maar niet bij mannen, t.o.v. controles. De som van de serum-concentraties van de anaplerotische aminozuren was gedaald voor de ganse groep M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. […]

Vergelijking tussen niet-vastende en vastende M.E./CVS-patiënten. […] De serum-concentraties waren lager bij overnacht-vastende patiënten voor categorie-II aminozuren Ile, Phe, Trp & Tyr, naast Ala. Er waren trends voor lagere gemiddelde serum-waarden voor Pro, Met & Arg in serum van overnacht-vastende patiënten maar geen verschillen voor de andere aminozuren of metabolieten.

Andere gemodificeerde aminozuren. Op basis van een studie die endotheliale dysfunktie [endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten] bij M.E./CVS-patiënten aantoonde [Newton DJ et al; zie ‘Bespreking’], beslisten we serum-concentraties te meten van aminozuren en afgeleiden waarvan is geweten dat ze de endotheliale funktie beïnvloeden. Arginine, asymmetrisch dimethylarginine (ADMA) en homo-arginine (hArg) vertoonden gelijkaardige serum-waarden tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen én mannen). Voor symmetrisch dimethylarginine (SDMA) was er een significant gedaald gemiddelde serum-waarde bij vrouwen met M.E./CVS maar niet bij mannen, vergeleken met controles. Voor 1-methylhistidine (1-MHis), een merker voor inname van (voornamelijk dierlijke) proteïnen, was er geen verschil tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen noch mannen). De concentraties van 3-methylhistidine (3-MHis), een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme (bv. spier-atrofie), waren significant hoger bij met M.E./CVS t.o.v. gezonde mannen (P = 0.003), terwijl er geen verschil qua 3-MHis was voor vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde vrouwen.

Aminozuren en hun verband met andere karakteristieken van M.E./CVS-patiënten. Bij de niet-vastende vrouwen met M.E./CVS werden zeer significante correlaties gevonden voor alle combinaties met de categorie-II aminozuren (Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr) (P < 0.001). Bij de mannelijke M.E./CVS-patiënten werden gelijkaardige correlatie-patronen gezien. In tegenstelling daarmee vonden we minder en zwakkere correlaties met categorie-I & categorie-II aminozuren. Er waren voor Thr echter meerdere uitgesproken correlaties met categorie-II aminozuren; mogelijks een weerspiegeling van het feit dat er alternatieve oxidatie-paden (zonder omzetting naar pyruvaat) zijn voor Thr. Verder waren er zeer significante correlaties voor alle combinaties met de categorie-II en -III aminozuren maar minder significante correlaties met de categorie-I en -III aminozuren.

Geslacht bleek een belangrijke factor bij de interpretatie van de resultaten: er waren significante dalingen voor gemiddelde serum-waarden van categorie-II en -III aminozuren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Om de mogelijkheid te evalueren dat de geobserveerde veranderingen qua aminozuur-patronen veroorzaakt zouden kunnen zijn door andere verstorende factoren, voerden we statistische analyses uit om aminozuur-waarden in het serum te vergelijken met klinische variabelen (leeftijd, BMI, lichamelijke aktiviteit, M.E./CVS-ernst en ziekte-duur). Hogere leeftijd correleerde significant met verhoogde waarden voor Cys, Gly, Ile, Leu, Lys & Tyr bij vrouwen met M.E./CVS maar bij M.E./CVS-mannen enkel met Cys. Er waren geen significante correlaties tussen serum-waarden van aminozuren en fysieke aktiviteit (aantal elektronisch geregistreerde stappen per 24 uur) bij de M.E./CVS-groep, uitgezonderd een significante negatieve correlatie met Cys bij vrouwen. Bij de M.E./CVS-vrouwen waren er significante positieve correlaties tussen BMI en Cys, Ile, Leu, Phe & Tyr, en significante negatieve correlaties tussen BMI en Ser & Thr. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat verschillen qua BMI verantwoordelijk zouden zijn voor de vastgestelde verschillen in aminozuur-waarden in het serum bij vrouwen met M.E./CVS, werden de patiënten onderverdeeld in 4 BMI-groepen (ondergewicht tot obees). Bij vergelijking bleken er significante verbanden tussen hogere BMI en hogere serum-waarden van de categorie-II aminozuren Leu, Phe, Tyr & Ile. Bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten waren in alle BMI-groepen (ook de obese) de gemiddelde serum-waarden van deze aminozuren echter lager dan bij gezonde vrouwen. Bij de mannen met M.E./CVS werden geen significante verbanden gezien tussen BMI-groepen en aminozuren van categorie-I of -II, uitgezonderd een significante positieve associatie tussen Cys en BMI. […]

Verder werden de patiënten ook onderverdeeld in groepen volgens ziekte-ernst, ziekte-duur, lichamelijke aktiviteit en leven-kwaliteit. De serum-waarden van categorie-I of categorie-II aminozuren waren niet geassocieerd met M.E./CVS-ernst. Er werd een significant positief verband gevonden tussen ziekte-duur en serum-waarden van aminozuren enkel voor Phe bij vrouwelijke patiënten. Er waren geen significante associaties tussen gemiddelde aminozuur-waarden (categorie-I & -II) en fysieke aktiviteit, uitgezonderd een negatief verband met Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren significante associaties tussen hogere ADMA-waarden en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.036) en tussen hoger 1-MHis en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.024) bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (een trend bij mannelijke patiënten; P = 0.086). […] Er was een significant verband tussen een hogere “SF36mean5” score [leven-kwaliteit] en een hogere gemiddelde serum-waarde van het categorie-I aminozuur Ser (P = 0.023); er waren trends voor Gly (P = 0.056) en Thr (P = 0.065) maar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten.

PDH-gerelateerde gen-expressie (mRNA) in PBMCs. Om te onderzoeken of de effekten op de aminozuren-profiel in het serum bij M.E./CVS-patiënten kan worden verklaard door veranderingen qua PDH-funktie, vergeleken we mRNA-waarden van PDH-gerelateerde genen in PBMCs van niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles. We vonden significant verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende kinasen PDK1 (P = 0.002), PDK2 (P = 0.022) & PDK4 (P = 0.006) bij M.E./CVS-patiënten, terwijl PDK3 onveranderd bleef. Ook het mitochondriaal lipoamidase en PDH-inhibitor SIRT4 was significant ge-upreguleerd (P = 0.013). Bij de PPAR transcriptie-factoren was PPARδ (PPARD) ge-upreguleerd (P = 0.001). Er waren geen verschillen voor PPARα (PPARA), het PPAR transcriptioneel doelwit en peroxisomaal vetzuur β-oxidatie enzyme acyl-coenzyme-A oxidase 1 (ACOX1) of de transcriptie-factor HIF1α (HIF1A). Pyruvaat-dehydrogenase-E1α (PDHA) mRNA was lichtjes ge-upreguleerd (P = 0.037). De expressie van PPARγ (PPARG) mRNA lag onder de detektie-limiet van de analyse. Analyses van de mitochondriale pyruvaat-dragers (MPCs [mediëren de opname van pyruvaat in de mitochondrieën]) onthulden een nipt-significante upregulering van MPC1 (P = 0.046) maar MPC2 verschilde niet.

Hoewel er geslacht-specifieke verschillen werden vastgesteld qua gemiddelde serum-waarden van aminozuren bij M.E./CVS-patiënten, waren de gestegen mRNA-waarden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten versus gezonde controles gelijkaardig bij mannen en vrouwen wat betreft PDK1, PDK4, PPARA, PPARD & SIRT4.

Wat betreft PDK1 gen-expressie waren er significante verbanden met ziekte-ernst (gestegen PDK1 mRNA in matige/ernstige versus milde/mild-matige groepen), met ziekte-duur (gestegen PDK1 mRNA bij langere duur) en met lichamelijke aktiviteit […] (gestegen PDK1 mRNA bij lagere aktiviteit). De associaties werden niet gevonden voor PDK4 mRNA, PPARA, PPARD of SIRT4.

De mRNA-expressie van PDK1 correleerde sterk met PPARD (P < 0.0001), met SIRT4 (P = 0.003) en zwak, maar significant, met PPARA (P = 0.028). Er was geen significante correlatie tussen PDK1 & PDK4 (P = 0.12). Verder waren er zeer significante correlaties tussen SIRT4 & PPARD (P < 0.0001), en SIRT4 & PPARA (P < 0.0001) maar geen significante correlatie tussen SIRT4 & PDK4 (P = 0.15). Deze gegevens werden onderbouwd met een zeer significante correlatie tussen PPARA & PPARD mRNA (P < 0.0001). Voor expressie van PDK1, PDK4, PPARA of waren er geen significante correlaties met leeftijd of BMI. Bij de 75 niet-vastende M.E./CVS-patiënten waren er geen significante correlaties tussen serum-waarden van categorie-I of -II aminozuren en mRNA-expressie van PDKs, SIRT4, PPARA of PPARD.

Effekten van M.E./CVS-patiënten serum op de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie in gecultiveerde skeletspier-cellen. Bij de verklaring van de kenmerkende M.E./CVS-symptomen (post-exertionele malaise en slecht herstel) zou men relevante metabole defekten in skeletspier-cellen kunnen verwachten. We konden het energie-metabolisme in het spier-weefsel van onze patiënten niet op een directe manier meten. Om de invloed van mogelijke substanties in het bloed op M.E./CVS te bestuderen, onderzochten we het energie-metabolisme in gecultiveerde menselijke skeletspier-cellen blootgesteld aan serum van 12 M.E./CVS-patiënten (waaronder 3 patienten met zeer ernstige ziekte en 6 met ernstige M.E./CVS) en 12 gezonde controles. Deze studie was ontworpen voor het beoordelen van de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie via het meten van (respectievelijk) het zuurstof-verbruik (‘oxygen-consumption rate’, OCR) en extracellulaire verzuring (‘extracellular acidification rate’, ECAR), in aanwezigheid van aminozuren en glucose als substraten. […]

Basale (in rust) aminozuren-gedreven mitochondriale ademhaling (conditie-I) was matig verhoogd in spiercellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum voor 6 dagen en dit effect was ook aanwezig wanneer glucose werd toegevoegd (conditie-II). Daaropvolgende toediening van de ATP-synthase inhibitor oligomycine (conditie-III) toonde aan dat bijna alle respiratoire aktiviteit gelinkt was met ATP-produktie; wat bevestigt dat de integriteit van het oxidatieve fosforylatie systeem intact was. Er was echter een minieme toename qua overgebleven OCR (‘lek-aktiviteit’). Daarna werd via toediening van de ‘ontkoppeler’ carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone [CCCP; ontkoppelt het elektron-transport-systeem van de ATP-produktie] een significant toegenomen respiratoire capaciteit (conditie-IV) onthuld. De gegevens gaven ook aan dat de ATP-gelinkte ademhaling (verschil conditie-II/-III) en de reserve respiratoire capaciteit (verschil conditie-IV/-II) verhoogd waren na blootstelling aan M.E./CVS-serum.

De basale glycolyse (conditie-II) was gelijkaardig tussen cellen blootgesteld aan M.E./CVS- en controle-serum. […] De maximum glycolyse in aanwezigheid van oligomycine neigde lichtjes verhoogd te zijn in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum (conditie-III) en deze trend was ook aanwezig na toediening van CCCP. Verdere analyse onthulde dat de lactaat-productie veroorzaakt door oligomycine (verschil conditie-III/-II) en door CCCP (verschil conditie-IV/-II) significant verhoogd waren in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum versus controle. Daarom: de cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum vertonen een metabole wijziging waarbij versterkte lactaat-produktie is betrokken bij energetische belasting.

Samengevat: serum van patiënten met ernstige M.E./CVS bleek het mitochondriaal oxidatief metabolisme en de ademhaling in spiercellen te doen stijgen, bijzonderlijk bij energetische belasting. Bijkomende experimenten met kortere blootstelling toonden dat het effekt van M.E./CVS-serum op de mitochondriale ademhaling geleidelijk aan verhoogde afhankelijk van de duur van de blootstelling.

Bespreking

Deze studie vond dat het serum aminozuren-profiel veranderd was in een grote en goed-gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten, op een manier die verstoorde mitochondriale pyruvaat-oxidatie suggereert. Deze bevinding wijst, in combinatie met verhoogde mRNA-expressie van PDK1, PDK2 & PDK4 en SIRT4, in PBMCs van patiënten, op abnormaliteiten qua PDH-regulering als een potentiële belangrijke factor bij de pathogenese van M.E./CVS. Blootstelling van gecultiveerde spiercellen aan serum van M.E./CVS-patiënten wees op de aanwezigheid van bloed-bestanddelen die het energie-metabolisme beïnvloeden.

Analyse van het serum van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde controles onthulde dat de concentraties van aminozuren die deelnemen aan het mitochondriaal oxidatief metabolisme op het niveau van acetyl-CoA (categorie-II) significant gedaald waren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee waren er geen grote wijzigingen qua aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat (categorie-I). [lees: “de pyruvaat-produktie zelf is in orde”] M.E./CVS lijkt zodoende een specifieke daling te veroorzaken van energetische substraten die worden geoxideerd downstream van PDH [“na de aanmaak van pyruvaat”]. Dit suggereert dat het pyruvaat-katabolisme wordt belemmerd bij M.E./CVS-patiënten [m.a.w. wellicht ligt het probleem bij het PDH enzyme-complex dat pyruvaat omzet naar acetyl-CoA], leidend tot verhoogd gebruik van acetyl-CoA producerende aminozuren als alternatieve substraten die het aëroob metabolisme via de TCA-cyclus van brandstof voorzien. De anaplerotische aminozuren, die dienen om de capaciteit van de TCA-cyclus op peil te houden (categorie-III), waren gedaald bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen komen overéén met eerdere rapporten [door Armstrong et al.] over dalingen qua Gln, Glu & Phe […]. Interessant: een studie bij M.E./CVS-patiënten vond veranderingen qua aminozuren-concentraties in urine die consistent zijn met het specifiek aminozuren-patroon dat we vonden in serum, en een gedaalde urinaire excretie van de TCA-cyclus intermediairen barnsteenzuur [succinaat] en citroenzuur [citraat] werd ook gerapporteerd [zie Niblett SH et al. hierboven]. Een metaboloom-studie rapporteerde gedaalde concentraties TCA-cyclus intermediairen, samen met een gedaalde pyruvaat/isocitraat verhouding, in plasma bij M.E./CVS [Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990]. Dit ondersteunt verder de hypothese dat het bevoorraden van de TCA-cyclus met pyruvaat belemmerd is bij M.E./CVS-patiënten, wat in lijn is met de gesuggereerde PDH-inhibitie.

We vonden significante mRNA-upregulering van of PDK1, PDK2 en PDK4 in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. De expressie van PDK1 mRNA was geassocieerd met klinische kenmerken zoals langere ziekte-duur, ernstiger M.E./CVS en verminderde lichamelijke aktiviteit. De werking van de PDKs is het inhiberen van PDH via fosforylatie onder omstandigheden waar pyruvaat-oxidatie moet worden onderdrukt (bv. uithongering). Een afwijkende toename qua PDK-expressie kan daarom een verstoorde PDH-funktie bij M.E./CVS veroorzaken, mogelijks via aktiviteit van transcriptie-factoren. PPARD mRNA was significant ge-upreguleerd in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, terwijl PPARA niet verschilde van gezonde controles. Er was echter een positieve correlatie tussen de expressie van PDK1 en allebei deze PPARs. Zelfs als expressie van het PPAR target-gen ACOX1 [codeert voor het enzyme peroxisomaal acyl-coenzyme-A oxidase-1 van het vetzuren beta-oxidatie pad] gelijkaardig was bij M.E./CVS-patiënten en controles, kan niet worden uitgesloten dat de PPARs bijdragen tot de regulering van PDKs op een bepaald stadium van de ontwikkeling van de ziekte. Het mitochondriaal enzyme SIRT4 bleek PDH-aktiviteit te inhiberen via hydrolyse van een component van het PDH-complex. We vonden dat SIRT4 mRNA-expressie ge-upreguleerd was in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en significant correleerde met mRNA-expressie van PDK1, PPARA & PPARD. Dit suggereert dat PDH-aktiviteit geïnhibeerd is door gecoördineerde regulerende mechanismen bij deze patiënten. Er was een kleine maar significante toename in PBMC mRNA-expressie van MPC1 maar niet van MPC2. Deze MPCs [zie hierboven] bleken belangrijke rollen te spelen in het mitochondriaal oxidatief metabolisme. De geringe upregulering van MPC1 en van PDH-E1α (PDHA [Het PDH-complex bestaat uit meerdere copieën van 3 enzymatische componenten: pyruvaat-dehydrogenase (E1), dihydrolipoamide-acetyltransferase (E2) & lipoamide-dehydrogenase (E3); E1 enzyme bestaat uit 2 alfa- & 2 beta- subunits.]) mRNAs zou compenserende mechanismen kunnen weerspiegelen die de pyruvaat-accumulatie (te wijten aan gedaalde PDH-aktiviteit) tegenwerken.

De oxidatie-paden van pyruvaat en aminozuren zijn nauw verbonden met de vetzuur-oxidatie machinerie, samenkomend op het niveau van acetyl-CoA in het mitochondriaal compartment. Er zou kunnen worden verwacht dat bij een adaptieve respons op een toestand van lage energie (veroorzaakt door een beperkte acetyl-CoA bevoorrading) meerdere signalisering-factoren betrokken zijn om de energie-homeostase te redden. Dergelijke signalisering-factoren omvatten AMPK, PPARs & HIF1, die context-afhankelijke regulering van vele metabole mechanismen mediëren. Het uibreiden van onze kennis omtrent de relatieve bijdragen van specifieke katabole paden tot de pathogenese van M.E./CVS zal belangrijk zijn om de ontwikkeling van biomerkers en behandelingen te vergemakkelijken.

Er zou kunnen worden verwacht dat de PDH-inhibitie bij M.E./CVS die hier wordt gesuggereerd, met compenserend gebruik van aminozuren als substraten voor TCA-oxidatie, ook de mitochondriale vetzuur β-oxidatie beïnvloedt in een poging om de energie-homeostase te redden. Een studie beoordeelde 612 metaboliteten bij 45 M.E./CVS-patiënten en 39 gezonde controles, en rapporteerde meerdere abnormaliteiten in verscheidene mechanismen betrokken bij het lipiden-metabolisme en het mitochondriaal energie-metabolisme [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480]. De meest prominente veranderingen bij M.E./CVS-patiënten waren uitgebreide dalingen qua sfingolipiden, glycosfingolipiden en fosfolipiden. Deze bevindingen waren consistent met een lagere ATP- en GTP-turnover, en met dalingen qua metabole intermediairen van vertakte aminozuren. Er waren echter ook indicaties voor een gereduceerde mitochondriale vetzuur-oxidatie, mar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Voegen we daarbij de PDH-inhibitie, dan zou verminderde mitochondriale vetzuur-oxidatie mogelijkerwijs de toevoer van acetyl-CoA verder compromitteren en zodoende de afhankelijkheid van categorie-II aminozuren als alternatieve brandstof voor de TCA-cyclus verhogen, zoals aangetoond in onze studie.

Geslacht-specifieke verschillen betreffende veranderingen in serum aminozuren-patronen waren duidelijk bij onze M.E./CVS-patiënten. Terwijl all 6 de aminozuren die kunnen worden omgezet naar acetyl-CoA significant waren gedaald bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (t.o.v. gezonde vrouwen), vertoonden mannelijke M.E./CVS-patiënten geringe en niet-significante dalingen van Tyr & Phe. Omwille van het relatief laag aantal mannelijke M.E./CVS-patiënten en mannelijke gezonde controles in de studie, was de statistische ‘power’ om een verschil te detekteren lager. De effekt-groottes waren echter groter bij vrouwen. Daarnaast werden bij de 124 niet-vastende vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 67 gezonde vrouwen afzonderlijke analyses uitgevoerd (2 niet-overlappende willekeurige groepen van 33 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 33 gezonde vrouwen) die dezelfde patronen aantoonden, met een significante daling van de som van de serum-concentraties van zowel categorie-II als categorie-III aminozuren bij vrouwen met M.E./CVS. Dit is een argument voor een differentieel en geslacht-specifiek gebruik van aminozuren. Een eerdere studie rapporteerde een significant verhoogde urinaire excretie van 3-Mhis (een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme) in een groep van 100 M.E./CVS-patiënten (waaronder 73 vrouwen) [zie Niblett SH et al.; hierboven]. Wanneer we echter serum 3-MHis per geslacht analyseerden, vonden we enkel bij mannelijke M.E./CVS-patiënten een verhoging. Dit suggereert dat mannen, meer dan vrouwen, endogeen proteïnen-katabolisme [eiwit-afbraak/spier-atrofie] aanwenden om te voorzien in substraten voor de TCA-cyclus. Geslacht-specifieke verschillen qua metabolisme [compensatie-mechanismen anders bij vrouwen dan bij mannen] werden aangetoond en kunnen bij M.E./CVS-patiënten in werking zijn, waarbij vetzuren, aminozuren, oxidatieve fosforylatie en het steroïden-metabolisme betrokken zijn. In tegenstelling met de geslacht-specifieke effekten betreffende aminozuren, was de verhoogde expressie van PDKs & PPARD (mRNA in PBMCs) gelijkaardig bij vrouwen en mannen met M.E./CVS. Tesamen geeft dit aan dat het ziekte-veroorzakende mechanisme verschillende compenserende effekten triggert bij vrouwen en mannen. Een gemeenschappelijk effector-systeem voor het bestendigen van symptomen zou dus de PDK-PDH-lactaat as kunnen omvatten, met gedeeltelijk geslacht-specifieke compenserende (secundaire) effekten gerelateerd met aanpassingen in het energie-metabolisme.

Onze studies met gecultiveerde menselijke spiercellen geven aan dat blootstelling aan M.E./CVS-serum leidde tot verhoogde mitochondriale ademhaling, aaangedreven door aminozuren, alleen of in combinatie met glucose. Dit effekt was bijzonder duidelijk onder omstandigheden van energie-uitputting, wanneer de mitochondriale ademhaling aan een maximum werkt (conditie-IV). Hoewel de lactaat-produktie laag neigde te zijn in rust, was deze buitensporig geïnduceerd bij energetische belasting. Deze observaties zijn compatibel met een metabole belemmering op het niveau van PDH, met een verhoogde omzetting van pyruvaat naar lactaat tot gevolg, en versterkte vraag naar alternatieve substraten downstream van PDH. Het is denkbaar dat de effekten van een dergelijke PDH-ontregeling significant escaleren onder omstandigheden met een verhoogde metabole flux, in overéénstemming met de cel-studies die hier worden gerapporteerd. Er werden ondersteunende bevindingen aangetoond na uitschakeling van PDH in gecultiveerde spiercellen. Op basis van deze observaties lijkt er een substantie(s) aanwezig in serum van M.E./CVS-patiënten die een cellulaire respons induceert ter ondersteuning van de mitochondriale energie-produktie. In overéénstemming daarmee zou optimalisering van de mitochondriale ademhaling kunnen worden beschouwd als een beschermende respons om energie-depletie veroorzaakt door PDH-dysfunktie te vermijden. Het energetisch rendement van zo’n metabole adaptatie zal echter afhangen van de toevoer van energetische substraten als brandstof voor de mitochondriale ademhaling – die gelimiteerd blijkt bij M.E./CVS-patiënten. De huidige bevindingen suggereren dat de mitochondriale brandstof-voorziening gecompromiteerd is door verminderde flux via PDH, wat leidt tot over-consumptie van alternatieve substraten zoals aminozuren gelinkt met de TCA-cyclus. Er zijn bijkomende studies vereist om de substantie(s) in M.E./CVS-serum – die de effekten op gecultiveerde spiercellen mediëren, die direct op het metabool apparaat kunnen werken of indirect via signalisering-factoren – te identificeren.

Onze gegevens – die suggereren dat M.E./CVS geassocieerd is met verminderde efficiëntie van het energie-metabolisme gecombineerd met over-produktie van lactaat – kunnen verklaren waarom veel M.E./CVS-patiënten de anaërobe drempel bereiken bij een lage belasting [Vermeulen RC. Decreased oxygen extraction during cardiopulmonary exercise test in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2014) 12: 20 /// Snell CR, Stevens SR, Davenport TE, Van Ness JM. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys Ther. (2013) 93: 1484-1492 (lees ook ‘Dubbele fietstest’) /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J Transl Med. (2014) 12: 104]. Dit wordt ondersteund door een individueel patient-verslag [Vink M. The aerobic energy production and the lactate excretion are both impeded in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Neurol Neurobiol. (2015) 1: 4] en onze eigen observaties bij patiënten met ernstige M.E./CVS die lactaat-waarden van boven 8 mM [normaalwaarden bij volwassenen: 0,5-1,7 mM] hadden, enkel en alleen door 10 min rechtop staan. Aangezien M.E./CVS-patiënten normaal gezien geen verhoogde lactaat-waarden in rust vertonen, kan er worden gespeculeerd dat het metabolisme zich aanpast aan de vermoedelijke verstoorde PDH-werking door het verhogen van de oxidatie van acetyl-CoA opleverende aminozuren en misschien ook vetzuren. [zie piloot-studie van Hanson et al. in epiloog] Zodoende kan het PDH-afhankelijk metabolisme toereikend funktioneren om over-produktie van lactaat te vermijden bij rustende patiënten maar niet in staat zijn adequaat te reageren op verhoogde glycolyse wanneer het systeem wordt belast bij inspanning. Er wordt geschat dat de TCA-cyclus 70- tot 100-voud stijgt bij zware inspanning om voldoende ATP te genereren. Dit zou een situatie creëeren met ontoereikende toevoer van acetyl-CoA om de oxidatieve ATP-produktie van brandstof te voorzien alsook accumulatie van pyruvaat en vervolgens lactaat, ondanks aërobe omstandigheden met voldoende zuurstof. Een slechte werking van PDH kan daarom consistent zijn met de verlaging van de aërobe drempel, het slecht herstel en de post-exertionele malaise die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten. Een dergelijk mechanisme zou in overéénstemming zijn met het geobserveerde verschil in inspanning-intolerantie versus ziekte-ernst bij M.E./CVS-patiënten, door het in verband brengen van de symptomen met de grootte-orde van de metabole belemmering.

De bevinding dat PDKs ge-upreguleerd zijn in PBMCs van M.E./CVS-patiënten is suggestief voor metabole ontregeling op systeem-niveau. Deze cellen hebben een funktionele PPAR-PDK interaktie en kunnen daarom een afspiegeling zijn van geassocieerde effekten die optreden in andere weefsels (die verantwoordelijk zijn voor het klinisch beeld en de symptomen van M.E./CVS). Belangrijk: zelfs al waren de verminderingen qua aminozuren zeer significant bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten, de effekt-groottes bleken gematigd. De serum-waarden van de acetyl-CoA producerende en anaplerotische aminozuren lagen binnen het normaal bereik, ook in de meeste vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren zodoende geen tekenen voor een aminozuren-deficiëntie, en er is geen voor de hand liggende noodzaak voor voeding-supplementen. De bij M.E./CVS-patiënten geobserveerde verminderingen qua aminozuren kan louter een weespiegeling zijn van een gewijzigd metabolisme bij pogingen om te adapteren aan een metabole belemmering. Het patroon van aminozuren-wijzigingen kan niet worden verklaard door andere variabelen zoals leeftijd, mate van inaktiviteit (beoordeeld via het aantal stappen per dag), ziekte-ernst of -duur. Zelfs al waren er significante correlaties met BMI: alle categorieën M.E./CVS-vrouwen (inclusief obese vrouwen) hadden lagere gemiddelde waarden qua ketogene aminozuren dan gezonde vrouwen, d.w.z. de BMI-verschillen konden de vastgestelde verminderde serum-waarden van categorie-II aminozuren niet verklaren. We vergeleken de serum-waarden van aminozuren van overnacht-vastende en niet-vastende M.E./CVS-patiënten en vonden hetzelfde patroon van veranderingen qua aminozuren-profielen. Er waren echter significante dalingen van meerdere categorie-II aminozuren bij de overnacht-vastende patiënten. Dus: zelfs al was het effekt van het vasten beperkt, toch sloten we de overnacht-vastende patiënten uit bij de analyses om te vermijden dat deze variabele werd verstoord.

Deze studie identificeert metabole veranderingen die meerdere van de klinische symptomen bij M.E./CVS-patiënten kunnen verklaren; het onderliggend mechanisme(n) voor de oorzaak van deze effekten blijft echter onduidelijk. Onze eerdere bevindingen bij proeven van B-lymfocyten depletie-therapie (monoclonaal anti-CD20 antilichaam rituximab) [momenteel nog geen bevestigingen] suggereren dat M.E./CVS in een subgroep patiënten een variant van een auto-immune ziekte zou kunnen zijn. Verdere research zou de hier gerapporteerde metabole effekten bij M.E./CVS moeten aanpakken in de context van een potentieel immunologisch mechanisme. Auto-antilichamen kunnen mogelijks interfereren met cel-oppervlakte receptoren alsook met andere factoren die betrokken zijn bij cel-signalisering. Een studie toonde dat serum-waarden van auto-antilichamen tegen meerdere autonome receptoren hoger waren bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles [Loebel M et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-39]. Er werden gelijkaardige auto-antilichamen gedetekteerd bij posturaal orthostatische tachycardie syndroom [POTS] en bij complex regionaal pijn syndroom [CRPS], aandoeningen met enkele gelijkenissen met M.E./CVS […]. Auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden kunnen interfereren met belangrijke metabole signalisering-mechanismen waarbij factoren zoals HIF1 & PPARs, alsook AMPK – dat abnormaal geaktiveerd bleek skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982] – betrokken zijn. Deze factoren zijn geassocieerd met PDK & SIRT4 bij de regulering van het oxidatief metabolisme. Bij dergelijke signalisering-mechanismen zijn factoren betrokken die eerder met M.E./CVS werden gelinkt, zoals reaktieve zuurstof soorten geassocieerd met signalisering- en mitochondriale dysfunktie, en stikstof-oxide gerelateerd met endotheliale dysfunktie, wat werd aangetoond bij M.E./CVS [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-336]. AMPK aktiveert het enzyme endotheliaal stikstof-oxide-synthase (eNOS) en foutieve AMPK-signalisering kan een mechanisme zijn bij endotheliale dysfunktie. In de huidige studie was de gemiddelde serum-waarde van de endogene eNOS-inhibitor en L-Arg analoog ADMA gelijkaardig bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. ADMA is gewoonlijk verhoogd bij cardiovasculaire endotheliale dysfunktie, wat er op wijst dat de mechanismen voor endotheliale dysfunktie bij M.E./CVS […] verschillen van die bij cardiovasculaire ziekten.

Er werd PDH-deficiëntie aangetoond bij ernstige metabole aandoeningen veroorzaakt door mutaties, waarbij progressieve neurologische degeneratie/acidose/energie-tekort betrokken bleek en associaties met epilepsie te wijten aan gewijzigde neuronale prikkelbaarheid. Bij de auto-immune zieke primaire biliare cirrose [PBC; ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)], die gepaard gaat met ernstige vermoeidheid, richten anti-mitochondriale auto-antilichamen zich tegen componenten van het PDH-complex, wat leidt tot inflammatie en weefsel-vernietiging. Bij M.E./CVS is er geen overtuigend bewijsmateriaal voor histologische inflammatie of weefsel-vernietiging, Maar toch zijn er gegevens die aktivatie van pro-inflammatoire én anti-inflammatoire mechanismen tonen (cytokine-analyses), bijzonderlijk tijdens de eerste jaren van de ziekte [Hornig M et al.; zie ‘Inleiding’]. […] Verder werk zal focussen op hoe abnormale immuun-responsen bij M.E./CVS cellulaire signalisering aantast en PDH-inhibitie veroorzaakt.

Tot besluit: deze studie suggereert dat M.E./CVS geassocieerd is met PDH-verstoring, leidend tot verhoogd verbruik van aminozuren die alternatieve paden voor de aanmaak van ATP van brandstof voorzien. Er werd gevonden dat serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale ademhaling in gecultiveerde spiercellen verhoogt, mogelijks ter compensatie of adaptatie van een inhibitie van metabole energie-mechanismen. De fysiologische gevolgen van dergelijke defekten omvatten waarschijnlijk energie- (ATP) deficiëntie en overmatige lactaat-produktie, wat strookt met de invaliderende inspanning-intolerantie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten.

————————-

Ongeveer terzelfder tijd als bovenstaand artikel verscheen er ook één van Maureen R. Hanson et al. (‘Cornell University’, New York) in het tijdschrift Molecular BioSystems, getiteld ‘Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism’. Het betreft een piloot-studie (17 M.E./CVS-patiënten & 15 gematchte controles) waar de ‘metabole signatuur’ in het plasma wordt vergeleken en mogelijke metabole verstoring worden geëxploreerd. Er werden 74 “differentieel accumulerende metabolieten” gevonden op een toaal van 361 onderzochte (35 significant gewijzigd na statistische correctie). Daarbij meerdere “essentiële energie-gerelateerde molekulen” die theoretisch gelinkt kunnen worden aan het algemeen gebrek aan energie dat wordt gezien bij M.E./CVS. Er werden “enkele mechanismen aangewezen met een hoge impact: het taurine-metabolisme (taurine is een zwavel-bevattend organisch zuur, een belangrijk bestanddeel van gal, met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie, modulatie van calcium-signalisering, enz.), het glycerofosfolipiden-metabolisme (of fosfoglyceriden; belangrijkste component van biologische membranen), die in combinatie met het primaire (gesynthetiseerd in de lever) galzuren (ontstaan uit cholesterol) -metabolisme, alsook het glyoxylaat & dicarboxylaat -metabolisme (de glyoxylaat-cyclus is een serie reakties betrokken bij de biosynthese van carbohydraten/suikers uit vetzuren of voorlopers met 2 koolstoffen die het systeem binnenkomen als acetyl-coenzyme A) en enkele andere, allemaal betrokken zijn bij het vetzuren-metabolisme”. Purinen (includsief ADP & ATP), pyrimidines en meerdere metabole aminozuren-mechanismen bleken significant verstoord…

december 3, 2016

Differentiële expressie van mitochondriale proteïnen bij CVS

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 8:25 am
Tags: , , , , , , ,

Een artikel dat voor zichzelf spreekt… Er worden hier 2 proteïnen (betrokken bij de cellulaire energie-produktie) aangeduid die (in combinatie) een diagnostische merker zouden kunnen zijn voor M.E.(cvs).

Over aconitase (aconitaat-hydratase; omzetting van citraat naar isocitraat in de TCA-cyclus) werd ook al gesproken in onze stukken ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’ & ‘Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS’…

Er werd tevens afwijkende expressie van ACON en ATPB in het speeksel gevonden. Dit zou een afname bij een eventuele test veel makkelijker maken.

Lees ook ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’ & ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’.

————————-

Transl Psychiatry. (2016) 6: e904

Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome

Ciregia F1, Kollipara L2, Giusti L1, Zahedi RP2, Giacomelli C3, Mazzoni MR1, Giannaccini G1, Scarpellini P4, Urbani A5,6, Sickmann A2,7,8, Lucacchini A1, Bazzichi L3

1Department of Pharmacy, University of Pisa, Pisa, Italy

2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften-ISAS, Dortmund, Germany

3Division of Rheumatology, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

4Division of Psychiatry, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

5Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica, Rome, Italy

6Proteomics and Metabonomics Unit, IRCCS-Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

7Department of Chemistry, College of Physical Sciences, University of Aberdeen, Aberdeen, UK

8Medizinische Fakultät, Medizinische Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende en complexe aandoening die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verbetert door rust. Dysfunktie van de mitochondrieën is een research-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS. In eerder werk onderzochten we het proteoom-profiel in speeksel van een monozygote tweeling met en zonder CVS. Hierna analyseerden we mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. We gebruikten een gesofisticeerde techniek (nano-LC-MS) om de mitochondrieën uit bloedplaatjes te bestuderen. Daarna selekteerden we 3 proteïnen die waren gevalideerd d.m.v. ‘western blot’ analyse bij een grote groep individuen (n = 45 CVS; n = 45 gezond), in het speeksel. De gekozen proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). De resultaten voor ATPB & ACON bevestigden hun upregulering bij CVS. De MDHM-verandering werd echter niet bevestigd. Daarna beslisten we, gezien de grote variabiliteit qua klinische kenmerken van CVS-patiënten, de expressie van onze proteïnen te analyseren na opsplitsing van de patiënten volgens klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger bij de groep patiënten die klinische kenmerken vertoonden die gelijkaardig waren met de zieke tweeling-helft. We besluiten dat deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de criteria zou kunnen zijn die in rekening kunnen worden gebracht bij het helpen stellen van de diagnose. Bovendien zou de identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kunnen helpen bij het werpen van een licht op de complexe aandoening CVS. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van aangepaste behandelingen.

Inleiding

[…] De moeilijkheden bij het definiëren van CVS, door het gebrek aan diagnostische merkers, maakt epidemiologische studies ingewikkeld. […] Tot nu toe blijft de etiologie van CVS onduidelijk; waarschijnlijk is het een heterogene aandoening die kan worden verklaard via een multi-factorieel model waar genetische, infektueuze, neuro-endocriene en psychologische factoren samenkomen. […]

Een ander onderzoek-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS is een gebrekkige mitochondriale funktie. Studies betreffende het metabolisme bij CVS suggereren onregelmatigheden qua energie-metabolisme en oxidatieve stress. [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172; zie ook referenties onze inleiding] Er wordt in het bijzonder steeds meer erkend dat mitochondriale dysfunkties aan de basis van CVS kunnen liggen [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J]; bovendien is vermoeidheid een prominent symptoom bij patiënten met mitochondriale ziekte. Dit is een aantrekkelijke hypothese, aangezien een metabole wijziging op mitochondriaal niveau een energie-deficiëntie met zich mee kan brengen en de uitzonderlijke vermoeidheid verklaren.

Er werd dikwijls gesuggereerd dat een genetische voorbestemdheid aan de basis van CVS kan liggen; daarom voorziet het bestuderen van tweelingen de best gematchte controles. Zodoende onderzochten we in eerder werk het proteoom-profiel in van een monozygote tweeling, waarvan één met en één zonder CVS. [Ciregia F et al. A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the Chronic Fatigue Syndrome: a focus on potential salivary biomarkers. J Transl Med (2013) 11: 243] Onze resultaten beklemtoonden de betrokkenheid van de inflammatoire respons bij de pathogenese van CVS. Na de bemoedigende resultaten verkregen via deze preliminaire studie, wilden we meer kennis verwerven betreffende mechanismen bij CVS via het analyseren van mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. De verwachting was dat onze bevindingen bewijs zouden kunnen leveren voor een mitochondriale rol bij de pathogenese van CVS.

Met dit doel isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes. Dit zijn circulerende bloedcellen die essentieel zijn voor de hemostase [preventie van bloedverlies] en coagulatie [bloedstolling] maar ook voor de aangeboren en adaptieve immuniteit. Bloedplaatjes hebben funktioneel aktieve mitochondrieën, waarvan de betrokkenheid bij de cel-fysiologie en bij pathologische aandoeningen werden aangetoond. De beoordelingen van de mitochondriale funktie in bloedplaatjes bieden meerdere voordelen voor diagnostische doeleinden: hun overvloed in het perifeer bloed, het betrekkelijk gemak om ze te verkrijgen, hun beperkte complexiteit, het aanzienlijk aantal mitochondrieën in de bloedplaatjes en de mogelijkheid voor herhaalde metingen bij elke patient.

Bloedplaatjes werden reeds aangewend bij onderzoeken naar de mitochondriale betrokkenheid bij enkele aandoeningen, bv. sepsis, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze studies bleven echter beperkt tot analyse van het mitochondriaal DNA en elektron-transfer aktiviteiten, terwijl er geen onderzoek werd verricht naar de totale proteïnen-inhoud van de mitochondrieën. Daarom analyseerden we de mitochondrieën uit bloedplaatjes via ‘nano-liquid chromatography electrospray-ionization mass-spectrometry’ (nano-LC-MS [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]) bij hetzelfde tweeling-paar als in de eerdere studie. Daarna werden de meest beloftevolle biomerkers gevalideerd via ‘western blot’ [WB] analyse [Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.] bij een grote groep patiënten, gebruikmakend van speeksel, dat op een niet-invasieve, eenvoudige, veilige en stress-vrije manier kan worden gecollecteerd en die makkelijk toepasbaar is bij grote groepen individuen.

Gezien de heterogeniteit van de ziekte was het doel biomerkers te suggereren om gevallen van CVS te stratificeren, eerder dan het selekteren van enkele biomerkers voor de identificatie van CVS. Dit kan helpen de behandeling op maat van de patient te snijden.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

Deze studie werd opgedeeld in 3 verschillende stappen. De eerste ‘ontdekking’-fase was gericht op het karakteriseren van het mitochondriaal proteoom-profiel van een CVS-patient in vergelijking met z’n gezonde monozygote tweeling-helft. Dit doel werd bereikt d.m.v. een proteoom-benadering (nano-LC-MS). De tweede ‘verkennende’ fase was gericht op het onderzoeken van de veranderende proteïnen (Ingenuity Pathway Analysis – IPA [software om expressie-profielen te analyseren]). Dit platform laat toe de mogelijke interakties te visualiseren tussen de geïdentificeerde biomerker-signaturen in mitochondrieën, wat ons helpt enkele kandidaten te selekteren voor de ‘validatie’-fase. De geselekteerde proteïnen werden eerst gezocht in het speeksel van de tweeling-broers en, eens de verschillen bevestigd werden, werd de validatie verbreed naar een groter aantal patiënten en controles. Tenslotte hebben we onze analyse versterkt door te kijken naar klinische gegevens, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers correleren met de klinische parameters van de patiënten. Dit leidt ons tot de identificatie van mitochondriale proteïnen die bruikbaar zijn bij het subtyperen van CVS-patiënten.

Patiënten

[…] 45 CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 38,6 ± 11,9 jaar); 45 gezonde controles (36,4 ± 10,9) 25 vrouwen, 20 mannen […]. De patiënten werden geklassificeerd op basis van de criteria volgens Fukuda et al. […] De individuen vulden de ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) in […]. Vermoeidheid werd ook beoordeeld d.m.v. de ‘Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue Scale’ (FACIT). […] Om de individuen beter te klassificeren, werden de volgende parameters geëvalueerd: anti-nucleaire antilichamen, ‘extraheerbare nucleaire antigenen’ [ENA] antilichamen [voor auto-immuunziekten], reumatoïde factor & anti-cardiolipine antilichamen (immunologische parameters); cortisol en adrenocorticotroop hormoon, serotonine, groei-hormoon, IGF-1 & vitamine-D3 (hormoon-profiel); tumor necrose factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, interleukine (IL)-6, IL-10, IL-2, IL-8 & IL-1b (cytokine-profiel).

Speeksel-stalen

[…]

Bloedplaatjes & aanrijking mitochondrieën

[…]

Kwantificatie op basis van LC-MS

[…]

LC-MS stalen

[…]

LC-MS analyse

[…]

Analyse van signalisering-mechanismen

[…] Alle proteïnen met differentiële expressie gelijk aan of meer dan 2 maal (CVS t.o.v. controle) werden opgenomen voor de bio-informatische analyse, om de molekulaire funkties te identificeren die het sterkt geassocieerd waren met de proteïnen-lijst.

WB voor validatie

Om de expressie-veranderingen in speeksel te valideren, gebruikten we ‘western blot’ analyse. De geselekteerde proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). […]

[…]

Statistische analyse

[…]

Klinische correlaties

[…]

Resultaten

Proteoom-analyse

Om het profiel op te maken van de mitochondriale proteïnen bij CVS, isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes van hetzelfde tweeling-koppel met en zonder CVS dat eerder werd onderzocht. Om de kwaliteit te evalueren van de geïsoleerde mitochondrieën gebruikten we enzymatische testen en WB-analyse: de mitochondriale aanrijking was bevredigend. We verkregen een mitochondriale fractie van 450 μg proteïnen startend van ca. 5×109 bloedplaatjes. Met als doel de grens van reproduceerbaarheid van het mitochondriaal preparaat te overwinnen, werden de experimenten in 3-voud uitgevoerd. De mitochondrieën die werden verkregen uit elk van de 3 experimenten werden samengevoegd en geanalyseerd in drievoud.

De proteïnen-samenstelling van de mitochondrieën werd geanalyseerd via nano-LC-MS en er werd een differentiële analyse tussen de CVS-patient en z’n gezonde broer uitgevoerd. Globaal identificeerden we 1.007 proteïnen […]. Van die 1.007 gedetekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant gemodificeerd bij CVS. Van deze 194 proteïnen waren er 41 met een variatie bij CVS t.o.v. controle groter dan 2,0: 34 waren ge-upreguleerd bij CVS en 7 waren ge-downreguleerd. […] Deze 41 proteïnen werden opgenomen in de IPA. Van elk geïdentificeerd proteïne werd het overéénkomstig gen in de IPA kennis-databank gezocht.

We gebruikten IPA om de gekende funkties van elk proteïne terug te vinden. Aangezien één proteïne meerder funkties kan hebben, selekteerden we de funkties met de hoogste statistische significantie. De eerste 3 hoogst-gerangschikte biologische funkties waren: metabolisme van isocitraat, metabolisme van NADH & metabolisme van nucleïnezuur-componenten of afgeleiden. […] Voor de validatie selekteerden we een proteïne uit elke categorie op basis van de hoeveelheid variatie en de P-waarde [indicatie voor de statistische significantie] van proteïnen uit de proteoom-analyse.

Expressie van biomerkers in speeksel

We selekteerden 3 mitochondriale proteïnen voor de validatie via WS – ACON, ATPB & MDHM. We beoordeelden eerst of hun variatie bij CVS t.o.v. controle bevestigd werd via de WS van de tweelingbroers. De upregulering bij CVS werd via WB bekrachtigd voor al de proteïnen. ACON, ATPB & MDHM vertoonden een toename van 3,1, 1,5 & 4,7. […]

Vervolgens gingen we over tot de analyse van deze proteïnen in een ruime groep CVS-patiënten (n = 45) en gezonde individuen (n = 45). We begonnen met een globale analyse van de expressie van deze proteïnen in het speeksel om dan verder te gaan met het onderzoek van verschillende CVS-subtypes. De veranderingen voor ACON & ATPB waren consistent met de resultaten van de nano-LC-MS, maar niet voor MDHM.

Dan klassificeerden we patiënten volgens hun klinische kenmerken (vragenlijsten): FACIT, FIQ, VAS-pijn, VAS-vermoeidheid & VAS-slaap. De CVS-patiënten werden in 2 groepen gesplitst met als referentie de tweeling-helft met CVS: een groep met de klinische kenmerken waarvan de waarden overéénkwamen met (of groter dan) die van de zieke tweeling-helft (groep A) en de tweede met de patiënten met lagere waarden (groep B). De intensiteiten waren hoger voor elk van de 3 merkers in groep A t.o.v. groep B.

ROC-curves

Er werden ROC-curves [grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] berekend ter beoordeling van het klinisch potentieel van onze geselekteerde en gevalideerde proteïnen om CVS te onderscheiden van gezonde individuen (in speeksel). De AUCs [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden] werden voor elk proteïne individueel berekend, om aan te tonen of elke merker apart dit onderscheid kan maken. ATPB & ACON bleken betere differentiërende biomerkers dan MDHM. ATPB: sensitiviteit 54% en specificiteit 78%; ACON: sensitiviteit 61% en specificiteit = 78%. Daarenboven onderzochten we via logistische regressie analyse of het onderscheidend vermogen van elke merker mogelijks verhoogd was door combinatie van meerdere merkers. Met deze doelstelling testten we alle verschillende combinaties om de beste combinatie van biomerkers te selekteren die bruikbaar is om mensen met CVS te onderscheiden van gezonde individuen. Zodoende vonden we dat het onderscheidend vermogen lichtjes steeg als ATPB werd gecombineerd met ACON. De sensitiviteit steeg tot 85% maar de specificiteit was 72%. Tenslotte berekenden we ook ROC-curves om te testen of de biomerkers patiënten en controles kunnen differentiëren volgens de klinische parameters – enkel FACIT gaf goeie resultaten. Wanneer we patiënten opsplitsen volgens FACIT, gaven ATPB en ACON ROC-curves (groep A versus controles) met een AUC van 0.780 en 0.722, respectievelijk, terwijl de gecombineerde ROC-curve een AUC had van 0.844 (sensitiviteit = 93%, specificiteit = 70%).

Klinische correlaties

Tenslotte bekeken we statistische correlaties voor de volgende klinische parameters: leeftijd, leeftijd bij aanvang, ziekte-duur en de hematochemische parameters (bv. TNF-α, IL-6, enz.). ACON correleerde negatief met IL-2 […]. ATPB correleerde positief met TNF-α & IFN-γ. […] MDHM correleerde ook met TNF-α […].

Bespreking

De ontdekking en validatie van meer objectieve merkers kunnen een belangrijke ondersteuning betekenen voor het stellen van de diagnose en behandeling van CVS. Aangezien bewijsmateriaal suggereert dat mitochondriale dysfunkties aan de grondslag liggen van CVS, analyseerden we mitochondriale proteïnen verkregen uit bloedplaatjes. Deze kwamen van een monozygoot tweeling-koppel met en zonder CVS. Nano-LC-MS markeerde de wijzigingen qua expressie van 41 proteïnen met een P < 0.05 en een vermenigvuldiging met meer dan 2. Voor de validatie selekteerden we hieruit 3 proteïnen van elk van de 3 meest significante ‘biologische funkties’ die met onze proteïnen geassocieerd bleken na IPA-analyse.

Deze 3 proteïnen waren: ACON (‘metabolisme van isocitraat’), MDHM (‘metabolisme van NADH’) en ATPB (‘metabolisme nucleïnezuur-componenten of afgeleiden’). De validatie van onze kandidaat proteïne-biomerkers werd beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die de detektie van proteïnen in speeksel-stalen toelaten.

Ondanks het feit dat deze studie slechts 2 individuen analyseerde, kunnen de verschillen qua proteïne-expressie gelinkt worden aan de ziekte, aangezien de tweeling slechts verschilde wat betreft de aanwezigheid van CVS. Op deze manier liet onze studie toe te focussen op enkele biomerkers die kunnen worden onderzocht bij een groter aantal patiënten om hun bruikbaarheid bij de diagnose van CVS te bevestigen. We beslisten speeksel van CVS-patiënten te onderzoeken (een niet-invasieve procedure). Hoewel speeksel een minder complex vocht is, werd bewezen dat het een beloftevol diagnostisch instrument is, dat de fysiologische werking van het lichaam weerspiegelt. Eerst was het aangewezen om te controleren of de significante toename van deze proteïnen bij CVS (t.o.v. de controle) kon worden geverifieerd in het speeksel van de tweeling-broers. We bevestigden de resultaten.

De analyse van de mechanismen markeerde het ‘metabolisme van NADH’ als één van de meest belangrijke biologische funkties betrokken bij CVS. De verhouding NAD+/NADH speelt een alomtegenwoordige rol bij het reguleren van de intracellulaire redox-status en vertegenwoordigt daardoor een funktie van de metabole toestand. Enkele studies suggereren dat NADH-concentraties significant lager liggen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid Redox Signal (2015) 22: 679-685 /// Castro-Marrero J et al. Effect of coenzyme-Q10 plus nicotinamide adenine dinucleotide supplementation on maximum heart rate after exercise testing in Chronic Fatigue Syndrome – a randomized, controlled, double-blind trial. Clin Nutr (2015) 35: 826-834] Het is waarschijnlijk dat de hoge waarden MDHM en isocitraat-dehydrogenase die worden gezien bij CVS een adaptieve verandering kunnen zijn voor deficiënties qua NADH dat, op z’n beurt, een cruciale rol speelt bij ATP-produktie in de mitochondrieën.

ATPB is de subunit-beta van ATP-synthase, het belangrijkste enzyme voor de aanmaak van ATP. Naast de toename van ATPB bij CVS, detekteerden we (d.m.v. nano-LC-MS) ook significante verhogingen van de subunit-alfa en -gamma (P = 0.005 & 0.001, respectievelijk). Moeheid en energie zijn nauw verbonden; daarom is een aantrekkelijke hypothese dat er een metabole dysfunktie is met als resultaat dat er niet genoeg energie wordt geproduceerd. In dit perspectief kan de toename worden verklaard als een poging om de ATP-produktie te verhogen. Er zijn inderdaad studies die suggereren dat daling qua mitochondriale ATP-synthese bij CVS-patiënten niet wordt veroorzaakt door een defekt in de enzyme-complexen die de oxidatieve fosforylatie katalyseren maar in een andere factor. [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93] Opdat ADP kan worden gerecycleerd en ATP naar het cytosol van de matrix kan gaan, is de uitwisseling van cytoplasmatisch ADP met mitochondriaal ATP via het binnenste membraan nodig. Deze funktie wordt voorzien door een translocator-proteïne. Consistent met ander werk is de expressie van mitochondriaal ADP/ATP-translocase [transporter-proteïnen die zorgen voor de uitwisseling van ADP in het cytosol en mitochondriaal ATP via het binnenste membraan] gewijzigd in onze studie: translocase-2 & -3 daalde [x 0,65 & x 0,80 t.o.v. controle] bij CVS (P = 0.009 & 0.002, respectievelijk).

Samen met ATPB lijkt ACON de meest beloftevolle biomerker. Dit is de mitochondriale vorm van aconitase, een enzyme dat de omzetting van citraat naar isocitraat katalyseert via cis-aconitaat in de TCA-cyclus. [inhibitie van dit enzyme vermindert de cellulaire energie-voorraad] ACON wordt courant gebruikt als een biomerker voor oxidatieve stress en werd gesuggereerd dienst te doen als een sensor voor de redox-status. Inderdaad: de reaktie tussen ACON en superoxide genereert vrije hydroxyl-radikalen. Het is waarschijnlijk dat de reaktie tussen superoxide en ACON de mitochondriale oxidatieve schade geassocieerd met de pathofysiologie van CVS kan versterken. De buitensporige produktie van ROS en stikstof-soorten wordt trouwens gewoonlijk in verband gebracht met CVS en we vonden een significante upregulering [x 2,2 t.o.v. controle] van superoxide-dismutase [SOD; enzyme dat zuurstof-radikalen ‘opruimt’] (P = 0.001).

Na de validatie in het speeksel van de tweeling, hebben we de validatie uitgebreid naar een grote groep CVS-patiënten. De resultaten voor ATPB & ACON bevestigen de upregulering bij CVS en hun klinisch potentieel om patiënten van controles te onderscheiden werd geëvalueerd. De ROC-curves gaven een goede specificiteit maar lage sensitiviteit aan. Als de biomerkers geombineerd werden, verkregen we een betere diagnose en de sensitiviteit verhoogde tot 85%, met een kleine daling qua specificiteit.

Anderzijds werd de gevonden MDHM-wijziging niet bevestigd in de grotere groep patiënten maar we konden een stijging zien wanneer we enkel de patiënten beschouwden met gelijkaardige of hogere klinische parameters dan de tweeling-helft met CVS. Deze bevinding bracht ons ertoe te bekijken of andere vermoedelijke biomerkers ook duidelijke CVS-subgroepen zouden kunnen afbakenen, gezien de grote variabiliteit van de klinische kenmerken van onze patiënten. Daarom hebben we onze analyse opgedreven door de klinische gegevens van dichterbij te bekijken, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers gelinkt zijn met de klinische kenmerken van de patiënten. We analyseerden de expressie van onze proteïnen na de patiënten te hebben opgesplitst volgens de klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger in de groep patiënten met klinische kenmerken die gelijkaardig waren met die van de zieke tweeling-helft. Het leek er op dat de toename qua expressie van deze proteïnen overéénkwam met een slechte patiënten-uitkomst.

Daarnaast gaf de combinatie van ATPB met ACON een sensitiviteit van 93% en specificiteit van 70% wanneer we de FACIT-waarden gebruikten van de patiënten die groter dan deze van de tweeling-helft met CVS.

Het valt op te merken dat CVS-patiënten met co-morbide bipolaire stoornis (en niet met andere psychiatrische co-morbiditeiten) een significante upregulering van de ATPB-expressie vertoonden (P = 0.03). In onze groep CVS-patiënten waren er slechts 8 met een co-morbide bipolaire aandoening; maar dit aspect verdient verder onderzoek gezien het feit dat een belemmerde mitochondriale funktie bij bipolaire patiënten werd besproken.

Tenslotte onderzochten we de correlatie van onze proteïnen met hematochemische parameters. Cytokine-abnormaliteiten zijn courant bij CVS maar de bevindingen zijn gemengd en er wordt geen individuele merker gebruikt als een objectieve biomerker voor de diagnose of het management van CVS. Het is opmerkenswaardig dat de toename van bij CVS positief correleerde met de stijging van IFN-γ & TNF-α. Immunologische ontregeling werd altijd voorgesteld als een significante component van CVS en CVS-patiënten hebben gewoonlijk hoge waarden pro-inflammatoire cytokinen, zoals IFN-γ & TNF-α. [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Klimas NG et al. Biomarkers for chronic fatigue. Brain Behav Immun (2012) 26: 1202-1210] Daarnaast was er een positieve correlatie van MDHM met TNF-α. Deze correlaties brengen ons iets bij, aangezien al deze variabelen als merkers kunnen worden beschouwd. Het is interessant aan te geven dat de ACON-waarden negatief correleerden met IL-2, in lijn met het feit dat de tweeling-helft met CVS lagere waarden van IL-2 had t.o.v. zijn gezonde tweeling-broer.

Besluit: deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de te overwegen criteria kunnen zijn bij het helpen stellen van de diagnose. Daarenboven: zelfs als deze proteïnen niet noodzakelijk bruikbaar blijken voor een universele CVS-diagnose (gezien de enorme heterogeniteit van de ziekte), bieden ze een sterk potentieel om subsets te karakteriseren. De identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kan helpen de complexe entiteit die CVS is, op te helderen. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van op maat gemaakte behandelingen. Op die manier zou dit werk kunnen bijdragen aan de gestage ontwikkeling van een duidelijker kader voor een ingewikkelde en genuanceerde ziekte zoals CVS.

november 19, 2016

Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie

Filed under: Celbiologie,Inspanning — mewetenschap @ 8:02 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand literatuur-overzicht, geschreven door een professor/arts met een post-graduaat inspanning-geneeskunde -hij is o.a. directeur van het ‘Human Performance Laboratory’ van de univeristeit van Belgrado; zijn research focust op de fysiologische responsen op maximale en sub-maximale inspanning – handelt niet zo zeer over M.E.(cvs) maar geeft o.i. wel aanwijzingen over wat er mogelijks gebeurt in de mitochondrieën wanneer mensen met deze aandoening zich inspannen (oefenen/trainen) in een mate die hun grenzen overschrijdt. Het bevestigt naar onze mening dat oefen-therapie die niet om maat is van de patient wel degelijk nog meer schade kan aanrichten en dus niet is aangewezen. Een duidelijke boodschap naar de dames en heren kine-/fysiotherapeuten! De auteur geeft ook enkele behandel-strategieën mee om schade aan de mitochondrieën te voorkomen/herstellen…

Lees – onder andere – ook: ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’, ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)’, ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’, …

————————-

Clinical Science (2016) 130: 1407-16

Exercise-induced mitochondrial dysfunction: A myth or reality?

Sergej M. Ostojic

Faculty of Sport and Physical Education, University of Novi Sad, Serbia School of Medicine, University of Belgrade, Serbia

Samenvatting

De voordelige effekten van lichamelijke aktiviteit op mitochondriale gezondheid – waarbij regelmatige inspanning de kwaliteit en de kwantiteit van de mitochondrieën verbetert in de normale gezonde populatie – zijn goed onderbouwd in de wetenschappelijke literatuur, alsook bij cardiometabole en neurodegeneratieve aandoeningen, en ouder-worden. Meerder studies stelden echter vragen bij dit paradigma, suggererend dat extreem zware of uitputtende inspanning mitochondriale stoornissen bevordert die permanente schade kunnen toebrengen aan de werking ervan bij gezondheid en ziekte. Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie (‘exercise-induced mitochondrial dysfunction’, EIMD) zou een bepalende factor kunnen zijn voor negatieve gevolgen van uitputtende inspanning, als pathofysiologisch substraat van hart-abnormaliteiten, Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) of spier-degeneratie. Hier geven we een overzicht van de mogelijke factoren die negatieve effekten van uitputtende inspanning op de mitochondriale funktie en struktuur mediëren, en opperen we alternatieve oplossingen voor het management van EIMD.

Inleiding

Mitochondrieën worden al lang erkend als een sleutel-element van cellulaire levensvatbaarheid; het organel bleek betrokken bij een overvloed aan fundamentele levensprocessen. Het zijn de voornaamste cellulaire energie-bronnen (oxidatieve fosforylatie), belangrijke regulatoren van de redox-produktie en -signalisering, modulatoren van de calcium-homeostase, haem-biosynthese en gebruik van aminozuren, en belangrijke spelers bij de controle van stress-responsen en apoptotische cel-dood. Het behouden van de mitochondriale werking lijkt de belangrijkste determinant te zijn voor een lange levensduur, terwijl een dysfunktie myopathieën, neurodegeneratieve en cardiometabole aandoeningen, kanker en veroudering vergezelt of triggert. Het organel wordt zo een belangrijk doelwit voor verschillende farmacologische en niet-farmacologische interventies om mitochondriale dysfunktie aan te pakken, waarbij inspanning dikwijls gesuggereerd wordt als de te kiezen therapie. Veel studies hebben gerapporteerd over voordelige effekten van lichamelijke inspanning op mitochondriale inhoud en funktie, waarbij regelmatige inspanning tekenen en symptomen van mitochondriale dusfunktie bij veroudering, diabetes en hersen-aandoening verlicht. Meerdere studies stelden echter vraagtekens bij dit paradigma, suggererend dat extreem zware of langdurige inspanning eigenlijk mitochondriale stoornissen zou induceren die de werking permanent zouden aantasten. Een groep van de ‘University of Cape Town Medical School’ rapporteerden over een geval van een klaarblijkelijk gezonde top-atleet die een onomkeerbare mitochondriale dysfunktie ontwikkelde na jaren van uitputtende training. [St Clair Gibson et al. Exercise-induced mitochondrial dysfunction in an elite athlete. Clin. J. Sport Med. (1998) 8: 52-55] Daarnaast suggereerden meerdere studies bij knaagdieren dat uitputtende inspanning een inhibitie van mitochondriale fosforylatie-aktiviteit zou kunnen induceren en moeilijk te herstellen mtDNA-deleties en cel-dood. Het lijkt er op dat inspanning de mitochondriale struktuur en werking sterk aantast, maar toch blijft de richting en de graad van verandering open voor discussie. In dit artikel zal ik mogelijke factoren die de negatieve effekten van inspanning op mitochondriale funktie mediëren bespreken en alternatieve oplossingen voor het managen van inspanning-geïnduceerde mitochondriale schade naar voor brengen.

Voordelige effekten van inspanning op mitochondriale funktie

Eén van de klassieke responsen op inspanning is een verhoogd aantal en betere funktie van mitochondrieën, waarbij een verbeterde kwaliteit en kwantiteit nauw verband houdt met meerdere positieve gezondheid-effekten die worden gerapporteerd na training. Na de voorbijgaande daling qua mitochondriale prestaties die worden gezien onmiddellijk na een inspanning, verhoogt de mitochondriale biogenese – met gunstige veranderingen qua mitochondriaal volume en aantal [na 7 à 10 dagen 2u/dag fiets-training bij gezonde mensen!]. De organellen vermeerderen in grootte en densiteit, het verbruik van mitochondriale brandstof verschuift naar een toegenomen verbruik van lipiden en de capaciteit qua mitochondriale enzymen breidt uit [7 weken uithouding-training door gezonde mensen!]. Bijgevolg verhogen de oxidatieve capaciteit en de inspanning-prestaties. Het lijkt dat regelmatige inspanning een positieve invloed heeft op de expressie van PGC-1α [‘peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α’; lid van een familie van transcriptie co-aktivatoren die een centrale rol speelt bij de regulering van het cellulair energie-metabolisme], een belangrijke regulator van de mitochondriale biogenese en funktie. Uithouding-training lijkt hiervoor bijzonder doeltreffend: zelfs een enkele aërobe inspanning van 60 min induceert wijzigingen qua gen-expressie die de mitochondrieën in inspannende en niet- inspannende spieren van gezonde mannen positief beïnvloedt. Gunstige mitochondriale aanpassingen na regelmatige inspanningen werden ook gerapporteerd bij patiënten met verschillende aandoeningen [diabetes en Alzheimer’s & Parkinson’s] of ouder-wordenden [4-6 sessies/week van 30-40 min, gedurende 12 weken]. Na regelmatige aërobe inspanning verbetert zelfs de funktie van ernstig beschadigde mitochondrieën [mitochondriale myopathie]. Er is echter veel minder geweten over het dosis-respons verband tussen gunstige mitochondriale veranderingen en de intensiteit/volume inspanning. Meerdere studies brachten zeer intensieve inspanning naar voor als een doeltreffend model voor het verbeteren van de mitochondriale biogenese en funktie. Aan de andere kant rapporteerde een studie dat PGC-1α mRNA-expressie negatief gecorreleerd was met inspanning-intensiteit [Mille-Hamard L et al. Transcriptional modulation of mitochondria biogenesis pathway at and above critical speed in mice. Mol. Cell. (2015) Biochem. 405: 223-232], wat suggereert dat de transcriptie-aktiviteit van de mitochondriale biogenese signalisering-cascade gevoelig is voor inspanning-intensiteit. Optimalisatie van de inspanning-belasting kan van cruciaal belang zijn voor specifieke mitochondriale aanpassingen, maar of verschillende intensiteiten biologisch verschillende mechanismen betrokken bij ‘acclimatisatie aan inspanning’ opleveren, blijft momenteel nog onbekend.

Mitochondriale dysfunktie geïnduceerd door inspanning

De term ‘dysfunktionele mitochondrieën’ wordt veel gebruikt in de cel-biologie, bio-energetische research en klinische geneeskunde. De precieze definitie is echter nogal moeilijk, en hangt af van het feit of dysfunktie bepaald dient te worden via geïsoleerde organellen, intacte cellen of in vivo, en welke biomerkers (klinische of experimentele) beschikbaar zijn voor de beoordeling van mitochondriale prestaties. Gewoonlijk wordt mitochondriale dysfunktie gedefinieerd als een verstoord vermogen van de mitochondrieën om ATP – de belangrijkste energie-drager in de cel – aan te maken, op de juiste manier in respons op energie-behoeften, hoewel abnormaliteit bij andere processen die worden bestuurd door mitochondrieën ook mitochondriale dysfunktie kunnen worden genoemd. Diagnostische strategieën voor mitochondriale aandoeningen/dysfunktie vereisen een multi-disciplinaire evaluatie, en steunen op een combinatie van klinische observaties, laboratorium-testen, beeldvorming van de hersenen en skeletspier-biopten, waarbij momenteel niet één enkele ‘golden standard’ test beschikbaar is om de diagnose van mitochondriale dysfunktie te stellen. Mitochondriale dysfunktie treedt vroeg op en werkt oorzakelijk bij veel ziekten en aandoeningen, waarbij meerdere factoren werden geïdentificeerd die de aandoening induceren, en het energie-metabolisme of vorming van vrije radikalen in het lichaam storen [statinen, sertraline, antibiotica]. Het begrijpen van de etiologie zou kunnen helpen bij de identificatie van kwetsbaarheid-eigenschappen en het vermijden van uitlokkende stoffen, inclusief verschillende medicijnen en toxische agentia of andere tegen mitochondrieën gerichte beschadigende interventies. Er is speculatie dat excessieve uithouding-training schadelijk kan zijn voor verscheidene biologische systemen en subcellulaire strukturen [O’Keefe JH et al. Potential adverse cardiovascular effects from excessive endurance exercise. Mayo Clin. Proc. (2012) 87: 587-595], waarbij mitochondriale dysfunktie een rol zou kunnen spelen [Feng Z et al. Mitochondrial dynamic remodeling in strenuous exercise-induced muscle and mitochondrial dysfunction: regulatory effects of hydroxytyrosol. Free Radical Biol. Med. (2011) 50: 1437-1446].

Ernstige modificaties van de mitochondriale struktuur in het myocard [hartspier(weefsel)] van honden onderworpen aan uitputtende inspanning werden al in 1966 gerapporteerd: frequent geobserveerde reuzen-mitochondrieën […] en ontwrichting van de cristae [instulpingen van het binnenste membraan in een mitochondrium]. De jaren daarna evalueerden andere onderzoekers de fijne struktuur van hart- en skeletspier na uitputtende inspanning in een reeks studies uitgevoerd bij ratten en mensen. De auteurs rapporteerden mitochondriale zwelling bij de ratten die ca. 450 h waren onderworpen aan uitputtend zwemmen, waarbij de veranderingen grotendeels normaliseerden door een herstel-periode van 15-18 h. Enkele mitochondrieën waren echter erg gezwollen en hadden verstoorde en gedegenereerde cristae (het meest prominent in myocardiale mitochondrieën), waarbij de metabole capaciteit van de dysfunktionele organellen op een nadelige manier leek te zijn veranderd na langdurige ernstige inspanning. Deze observaties suggereren dat uitputtende inspanning de mitochondriale funktie en/of struktuur sterk kan aantasten, ten minste in een bepaald gebied of weefsel. Anderen [Gohil K et al. Effects of training and exhaustive exercise on the mitochondrial oxidative capacity of brown adipose tissue. Biosci. Rep. (1984) 4: 987-993] bevestigden bovenstaande bevindingen: ze rapporteerden een inspanning-geïnduceerde afname van de mitochondriale aktiviteit in bruin vet-weefsel [vet-cellen met een grote hoeveelheid mitochondrieën] van ratten onderworpen aan een slopende loop-test, waarbij mitochondriale oxidatieve mechanismen meer gestresseerd waren bij ongetrainde ratten t.o.v. getrainde. De laatste 20 jaar rapporteerden meerdere studies gelijkaardige schadelijke effekten van extreem zware inspanning op mitochondriale prestaties, met permanente of langdurige inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie (EIMD) die werd gevonden in de hersenen, skeletspieren, hart, lever en bloedcellen van knaagdieren en mensen [Bijvoorbeeld: Rasmussen UF et al. The effect of high-intensity exhaustive exercise studied in isolated mitochondria from human skeletal muscle. Pflugers Arch. (2001) 443: 180-187 /// Hsu TG et al. Leukocyte mitochondria alterations after aerobic exercise in trained human subjects. Med. Sci. Sports Exerc. (2002) 34: 438-442 /// Tuan TC et al. Deleterious effects of short-term, high-intensity exercise on immune function: evidence from leucocyte mitochondrial alterations and apoptosis. Br. J. Sports Med. (2008) 42: 11-15 /// Layec G et al. Impact of age on exercise-induced ATP supply during supramaximal plantar flexion in humans. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. (2015) 309: R378-R388 /// Layec G et al. Effects of exercise-induced intracellular acidosis on the phosphocreatine recovery kinetics: a 31P MRS study in three muscle groups in humans. NMR Biomed. (2013) 26: 1403-1411].

Uitputtende inspanning lijkt verschillende merkers voor mitochondriale gezondheid negatief te beïnvloeden, inclusief een verstoring van de aktiviteit en/of expressie van mitochondriale enzymen (cyclo-oxygenase, citraat-synthase, malondialdehyde), met mitochondrieën gerelateerde groei-factoren (PGC-1α, MAP (‘mitogen-activated protein’) -kinase [reageert op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleert verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose], BDNF), meer mtDNA-deleties [ontbrekende stukken in het mitochondriaal DNA], expressie van mitochondriale apoptotische factoren (DRPs [‘dynamin-related proteins’; betrokken bij mitochondriale splitsing], transcriptie-factor A [aktivator van mtDNA-transcriptie, verpakt mtDNA in DNA/proteïne-aggregaten (mitochondriale nucleoïden)]), een daling van het mitochondriaal membraan-potentiaal (ΔΨmt [het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste membraan]) en verhoogde aanmaak van mitochondriale reaktieve oxidatieve soorten (ROS). Anderzijds is het moeilijk om meerdere biomerkers voor de mitochondriale funktie in studies bij mensen te interpreteren: een daling qua leucocyten mitochondriaal trifunktioneel proteïne (mtMTP [enzyme op het binnenste mitochondriaal membraan dat 3 van de 4 stappen van de vetzuur-afbraak katalyseert]) of een toename van het NAD(P)H-oxidase [katalyseert de produktie van super-oxide] systeem van spier-mitochondrieën duidt niet noodzakelijk op mitochondriale schade na uitputtende inspanning. Tenslotte induceert een krachtige inspanning ernstige ultrastrukturele veranderingen in het organel, inclusief een onevenwichtige mitochondriale distributie […], en een hoge prevalentie van grote en gezwollen mitochondrieën met dense matrixen en ruwe of abnormale cristae. EIMD komt voor bij zowel mannen als vrouwen die verschillende vormen van inspanning tot uitputting krijgen te verwerken (bv. lopen, fietsen, zwemmen), bij zowel acute als chronische inspanning-modellen. Er zijn momenteel geen duidelijke richtlijnen betreffende diagnostische criteria voor EIMD. Het lijkt er op dat de ernst (en geïmpliceerde onomkeerbaarheid) van dit fenomeen een belangrijk aspect is dat zou moeten worden aangewend om het onderscheid te maken tussen voorbijgaande afname qua mitochondriale prestaties en ernstiger EIMD. Dit kan verband houden met cruciale veranderingen in het mtDNA of nucleair DNA (nDNA) (bv. grote deleties geïnduceerd door uitputtende inspanning) die de gen-expressie op het niveau van de transcriptie en/of translatie permanent wijzigen. Een extreme produktie van mitochondriale ROS en stikstof-soorten tijdens uitputtende inspanning lijkt inspanning-gerelateerde DNA-schade te induceren [Neubauer O et al. Exercise-induced DNA damage: is there a relationship with inflammatory responses? Exerc. Immunol. Rev. (2008) 14: 51-72], wat mtDNA bijzonder vatbaar maakt voor oxidatieve stress en een pathofysiologisch doelwit voor EIMD. mtDNA lijkt een veel hogere mutatie-graad te hebben in vergelijking met nDNA, aangezien het makkelijk wordt blootgesteld aan ROS-schade terwijl de beschermende histonen [histoon-proteïnen = kleine eiwitten met een hoog aantal positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA binden; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt] en andere DNA-herstel-mechanismen ontbreken. Daarom zou het monitoren van mtDNA-deleties in specifieke gebieden […] en wijzigingen in genetische profielen na inspanning (d.m.v. ‘hoge-resolutie digitale profilering’) kunnen worden gebruikt als nieuw instrument om de ernst en de progressie van EIMD te evalueren. Hoewel ROS-gemedieerde mtDNA-wijzigingen EIMD kunnen induceren, zouden ook andere mechanismen verantwoordelijk kunnen zijn. […]

Verhoogde produktie van ROS en reaktieve stikstof-soorten (RNS) tijdens lichamelijke inspanning treedt op ten gevolge zuurstof-afhankelijke bio-energetica in de mitochondrieën, waarbij de elektronen-transport-keten en mitochondriale xanthine-oxidase [ROS-genererend enzyme] aktiviteit de voornaamste bronnen zijn. Een andere inspanning-gerelateerde bron van ROS is de inflammatoire respons op weefsel-letsels (zoals die worden geïnduceerd door achteréénvolgende spier-contracties) met aktivatie van neutrofielen en macrofagen-infiltratie. Hyperthermie, dehydratatie en osmotische stress werden ook geïdentificeerd als onconventionele bronnen van ROS gegenereerd tijdens inspanning, waarbij de effekten van inspanning op ROS-produktie intensiteit-afhankelijk lijkt te zijn. Hoewel matige inspanning de mitochondrieën-gerelateerde ROS-aanmaak in evenwicht blijkt te houden en gunstige ROS-geassocieerde aanpassingen induceert, stimuleert uitputtende of langdurige inspanning een over-produktie van ROS. Vandaar: te veel ROS kan subcellulaire bio-molekulen, zoals lipiden, proteïnen & DNA beschadigen [Powers SK & Jackson MJ. Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production. Physiol. Rev. (2008) 88: 1243-1276], en de mitochondriale funktie erg in gevaar brengen, leidend tot EIMD.

Hoewel EIMD bij alle leeftijden voorkomt, lijkt het er op dat een gevorderde leeftijd een voorbestemmende factor kan zijn voor EIMD. Ouder-worden per se induceert diepgaande veranderingen qua mitochondriale vorm en funktie, inclusief DNA-deleties, verhoogde oxidatieve stress en verstoorde mitochondriale bio-energetica. Bij blootstelling aan krachtige inspanning, lijkt het dat oudere individuen makkelijker mitochondriale dysfunktie en versneld verval ontwikkelen. Onderzoekers evalueerden de effekten van zware inspanning in skeletspieren van muizen van 2 maand (jonge groep) en 24 maand (oude groep), onderworpen aan 5 dagen inspanning (rennen in een gemotoriseerde loopband tot uitputting). Deze uitputtende inspanning resulteerde bij oudere muizen in een daling van zowel fusie- en splitsing- (respectievelijk mitofusine-2 & DNM1L) proteïnen [mitochondrieën ondergaan verlenging, fusie en splitsing; wat de recyclage van membranen toelaat en het herwinnen van onbeschadigd mtDNA om de mitochondriale funktie te behouden] die zouden kunnen bijdragen tot wijziging van mitochondriale morfologie, en verminderde PGC-1α nucleaire translocatie [verplaatsing naar de cel-kern]. Verder was er een 69% toename qua interleukine-1β (een belangrijke mediator van de inflammatoire respons) in de oude groep, terwijl uitputtende inspanning deze biomerker niet beïnvloedde in jonge muizen. De auteurs concludeerden dat uitputtende inspanning in verouderende spieren mitochondriale schade verergert en dat het een ongeschikte manier van inspannen is voor het behandelen van veroudering en ouderdom-gerelateerde mitochondriale ziekten.

Een andere factor die de vatbaarheid voor EIMD zou kunnen bepalen, is de voorafgaande training-status. EIMD treft zowel getrainde als ongetrainde individuen maar toch lijkt dit fenomeen frequenter bij over-getrainde mensen, wat een dosis-respons voor EIMD suggereert. Herhaalde blootstelling aan extreem zware of langdurige inspanning-aktiviteit kan bij vatbare individuen mitochondriale schade induceren die met verloop van tijd accumuleert, en uiteindelijk chronisch wordt en niet meer te herstellen, met lange-termijn implicaties voor inspanning-prestaties en gezondheid [St Clair Gibson A et al. Chronic exercise activity and the fatigued athlete myopathic syndrome (FAMS). Int. SportMed. J. (2000) 1: 1-7]. Er werd tot hier toe echter geen duidelijke blootstelling-respons verband tussen uitputtende inspanning-belasting (bv. frequentie, intensiteit, duur en type inspanning) en EIMD beschreven. Inspanning-intensiteit zou echter een cruciale rol kunnen spelen bij de etiolgie van EIMD, aangezien de expressie van het stress-proteïne ‘heat-shock’ proteïne (Hsp70) – dat de mitochondriale funktie mee reguleert – afhankelijk is van inspanning-intensiteit [Milne KJ & Noble EG. Exercise-induced elevation of Hsp70 is intensity dependent. J. Appl. Physiol. (2002) 93, 561-568]. Tenslotte blijkt EIMD weefsel-specifieke responsen te vertonen, waarbij myocardiale mitochondrieën het meest te lijden hebben van uitputtende inspanning, in vergelijking met die van de de hersenen, lever of skeletspieren. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het hoger zuurstof-verbruik per milligram proteïnen in hart-mitochondrieën en de daaruitvolgende hyper-produktie van organel-beschadigende ROS.

Mogelijke gevolgen van EIMD voor de gezondheid

Hoewel regelmatige fysieke aktiviteit gezondheid-risico’s voor vele ziekten vermindert, hebben studies gedocumenteerd dat uitputtende inspanning – zelfs bij gezonde individuen – een waaier aan gevaren voor de gezondheid oplevert; een feit dat bezorgdheid opwekte omtrent de schadelijke gevolgen van dergelijke inspanning. Naast andere mogelijke factoren, zou EIMD een belangrijke factor kunnen zijn voor de negatieve resultaten van uitputtende inspanning, omwille van het feit dat het een pathofysiologisch substraat is voor hart-abnormaliteiten, chronische vermoeidheid en over-training syndroom of spier-degeneratie. Er werd [bij ratten] aangetoond dat belastende inspanning biochemische veranderingen in myocardiale mitochondrieën (bv. verminderde mitochondriale accumulatie van Ca2+) kan opleveren die de hart-funktie nadelig kan beïnvloeden na opéénvolgende uitputtende inspanningen. Anderen vonden opgezwollen mitochondrieën in cardiomyocyten van uitgeputte ratten, met mogelijke hart-ritme-verstorende veranderingen […]. Chinese researchers evalueerden door inspanning geïnduceerde hart-letsels bij ratten na herhaalde uitputtende inspanning. Er werd ook geschreven over significante mitochondriale veranderingen, vergezeld door ischemische wijzigingen, cellulaire schade aan het cytoskeleton en ‘gap-junctions’ [eiwit-kanalen die het cytoplasma van naburige cellen met elkaar verbinden, waardoor ionen en ‘boodschapper-molekulen’ kunnen stromen], en weefsel-fibrose in het cardiaal geleiding-systeem, waarbij de mitochondriale stoornissen hart-ritme-stoornissen induceren. Er werd ook gerapporteerd over dysfunktionele mitochondrieën-gerelateerde cardiale stress bij ratten die werden gedwongen 3 h te zwemmen, inclusief een ontregeling van het matrix metalloproteinase-systeem [matrix-metalloproteïnasen of MMPs zijn enzymen die in staat zijn de extracellulaire matrix (bindweefsel) af te breken], verhoogde nitro-oxidatieve stress en sporadische fragmentatie van de myocard-struktuur. Klinisch relevante stoornissen van de haemodynamiek (bv. verhoogd eind-systolisch volume, verminderde ejectie-fractie, gestoorde samentrekbaarheid en mechano-energetica van het linker-ventrikel na inspanning) gingen samen met histologische veranderingen. Er zijn ons geen studies bij mensen bekend die EIMD linken met cardiale dysfunktie maar sommige hart-ritme-stoornissen bij atleten zouden een mitochondriale oorsprong kunnen hebben en op mitochondrieën gerichte anti-oxidanten kunnen een nieuwe anti-arythmische behandeling zijn [Yang KC et al. Mitochondria and arrhythmias. Free Radical Biol. Med. (2014) 71: 351-361].

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een complexe medische aandoening met aanhoudende post-exertionele malaise, wijdverspreide musculoskeletale pijn, en mentale en fysieke uitputting die niet substantieel verbetert door rust, is een aandoening met onbekende etiologie, die wereldwijd tot 5% van de algemene bevolking treft. Meerdere studies suggereren dat mitochondriale dysfunktie betrokken is bij de pathofysiologie van CVS [Myhill S, Booth NE & McLaren-Howard J]. Daarnaast kan langdurige zware inspanning CVS induceren bij atleten of uitputting aanzwengelen bij CVS-patiënten [Staud R et al. Evidence for sensitized fatigue pathways in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain (2015) 156: 750-759], wat suggereert dat EIMD een co-factor zou kunnen zijn die CVS triggert. Over-training is een andere aandoening die gerelateerd kan zijn met EIMD. Over-training wordt gewoonlijk beschreven als een langdurige excessieve belasting met ontoereikend herstel die gepaard gaat met verminderde prestaties. De diagnose blijft moeilijk te stellen en omwille van de ongekende oorzaak zo ook het management. Een bepalend artikel door St Clair Gibson et al. [zie hierboven] beschreef meerdere gevallen van mitochondriale pathologie in schijnbaar gezonde maar over-trainde top-atleten, met schadelijke veranderingen qua skeletspier-struktuur en -funktie geassocieerd met vele jaren excessieve training en competitie. De auteurs suggereerden dat de spier-regeneratie na uitputtende inspanning wel eens niet eindig zou kunnen zijn en dat die, wanneer die wordt overschreden, over-training en verslechtering van de atletische prestaties initieert. Anderen [Wang X et al. Mitochondrial dysfunction-associated OPA1 cleavage contributes to muscle degeneration: preventative effect of hydroxytyrosol acetate. Cell Death Dis. (2014) 5, e1521] suggereerden daarom ook dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de ontwikkeling van spier-aandoeningen, inclusief wegkwijnen van spieren, spier-atrofie en -degeneratie. Vorming van ROS en oxidatieve stress in de skeletspieren zijn cruciaal voor mitochondriale dysfunktie die wordt gekenmerkt door downregulering van OPA1 (een belangrijk proteïne bij de regulering van fusie en her-modelering van het mitochondriaal binnenste membraan) en verlies van myosine zware-keten proteïne [‘myosin heavy chains’, MyHC; van belang bij spier-samentrekking], dat uiteindelijk leidt tot significante morfologie-wijzigingen in myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] en spiercel-degeneratie. De rol van mitochondrieën bij spier-beschadigende inspanning werd bevestigd via een andere proef [zie Feng Z et al. hierboven] – waarbij door krachtige inspanning geïnduceerde spier-dysfunktie gepaard ging met verhoogde mitochondriale splitsing, gestegen merkers voor spier-atrofie […] en cel-autofagie triggerede. Interessant is dat in deze studie meer mitochondriale splisting in beschadigde myocyten na zware inspanning (geëvalueerd via een toename van DRP1 [‘dynamin-related protein 1’, enzyme dat zorgt voor de splisting in 2 dochter-mitochondrieën]) gelijkaardig was met de DRP1-respons in skeletspieren na een dieet met een hoog vet-gehalte [muizen], wat misschien suggestief is voor een gelijkaardig mechanisme van mitochondriale dysfunktie in een inspanning-geïnduceerd model en obesitas. Ondanks het beperkt begrip aangaande mechanismen verantwoordelijk voor met mitochondrieën gerelateerde spier-aandoeningen, zou EIMD echter verder moeten worden onderzocht als een mogelijk pathogene factor voor myocyten-schade in vivo. Hoewel EIMD meer voorkomt in skeletspieren, rapporteerden andere onderzoekers dat uitputtende inspanning ook mitochondriale dysfunktie in de hersenen bevordert [bij muizen], waarschijnlijk omwille van inspanning-geïnduceerde inhibitie van de BDNF-produktie in de frontale cortex. Dit kan de cognitieve stoornissen verklaren die worden gezien bij CVS en over-training syndroom. Er zijn echter meer studies nodig om een link tussen EIMD en gevolgen voor de gezondheid van uitputtende inspanning bij atleten en de klinische populaties op lange-termijn vast te stellen.

Management-strategieën voor EIMD

Naast inspanning-interventies, die waarschijnlijk het sleutel-element vertegenwoordigen bij de preventie van en het omgaan met dysfunktionele mitochondrieën, kunnen wellicht meerdere op mitochondrieën gerichte agentia worden overwogen om EIMD te overwinnen of minstens te verminderen. Het ondersteunen van mitochondriale bio-energetica en het helpen herstellen van mtDNA na uitputtende inspanning, en het behouden van een hoog anti-oxidant vermogen om toxische ROS in het organel op te ruimen, zijn mogelijke behandel-opties voor mitochondriale dysfunktie geïnduceerd door extreem zware of langdurige inspanning. Anti-oxidanten en verwante ‘nutraceuticals’ worden alom besproken in de klinische en voeding-literatuur. Er zijn echter slechts een beperkt aantal studies die de doeltreffendheid van op mitochondrieën gerichte interventies bij EIMD evalueerden d.m.v. organel-specifieke biomerkers. De beschermende effekten van salidroside, een molekule uit de plant Rhodiola rosea op mitochondriale dysfunktie en cardiomyocyten-beschadiging (geïnduceerd door een uitputtend zwem-inspanning) bij ratten werd gëevalueerd. Toediening van salidroside (100-300 mg/kg per dag gedurende 2 weken) verminderde myocard-letsels en ultrastrukturele mitochondriale misvormingen, bewaarde de mitochondriale respiratoire funktie, en ging onaangepaste gen-expressie van PGC-1α en nucleaire respiratoire factoren (NRF-1 & NRF-2) [regelen cel-groei en nucleaire genen die vereist zijn voor de cellurlaire ademhaling] tegen, vergeleken met de controle-groep die een placebo kreeg. In een andere studie rapporteerden over de beschermende effekten van hydroxytyrosol, een natuurlijk polyfenol uit olijven, bij spier- en mitochondriale dysfunktie (geïnduceerd door krachtige inspanning) in ratten. Behandeling met hydroxytyrosol (25 mg/kg per dag gedurende 8 weken) inhibeerde de toename van autofagie en mitochondriale splitsing, en de afname van PGC-1α expressie geïnduceerd door excessieve inspanning. Daarnaast versterkte hydroxytyrosol mitochondriale fusie en aktiviteiten van mitochondriaal complex-I & -II. Een studie onderzocht de effekten van Galdieria sulphuraria microalgen op EIMD opgewekt door acute krachtige inspanning (6 h zwemmen) bij ratten. Behandeling met G. sulphuraria (10 g/kg per dag gedurende 10 dagen) verminderde de door inspanning toegenomen protiëne-carbonyl inhoud, een indicator voor oxidatieve schade, in mitochondrieën van het hart en de spieren van ratten na zware inspanning. Daarnaast werden gunstige effekten gerapporteerd van oraal quercetine (100 mg/kg per dag gedurende 4 weken) op myocardiale mitochondriale oxidatieve stress en dysfunktie bij muizen onderworpen aan zware inspanning; waarschijnlijk door z’n anti-oxidatief effekt en aconitase [enzyme dat citraat naar isocitraat omzet; inhibitie ervan vermindert de cellulaire energie-voorraad] -aktivatie, wat een beloftevolle strategie voor EIMD door dit natuurlijk flavonoïd benadrukt. Een Chinees team meldde gunstige effekten van een mitochondriale cocktail van nutriënten (α-liponzuur, acetyl-L-carnitine, biotine, nicotinamide, riboflavine, pyridoxine, creatine, coenzyme-Q10, resveratrol & taurine) op de mitochondriale gezondheid bij ratten na uitputtende inspanning. Supplementering met nutriënten verhoogde de proteïnen-expressie van mitochondriaal complex-I, -II & -III, mtDNA-aantal en transcriptie-factoren betrokken bij mitochondriale biogenese en funktie in skeletspieren. Dezelfde groep rapporteerde gelijkaardige resultaten met een combinatie van nutriënten gericht op mitochondrieën (α-liponzuur, creatine, B-vitaminen, polyfenolen) die verbetering van complex-V en aktiviteit van een FAD-bindend flavoproteïne enzyme brachten, en versterking van de aktiviteiten van complex-I & -IV in lever-mitochondrieën van ratten die gedurende 4-weken werden onderworpen aan krachtige inspanning. Deze 2 studies suggereren dat supplementering met een multi-component nutriënten-preparaat EIMD kan verminderen, hoewel de bijdrage van elk nutrient onbekend blijft. Aan de andere kant rapporteerden bleek een L-arginine-rijk dieet (2%) geen significante impact te hebben op courante mtDNA-deleties in spier- en lever-mitochondrieën van ratten na uitputtende inspanning. Er zijn geen studies beschikbaar betreffende andere op mitochondrieën gerichte nutraceuticals bij EIMD, inclusief kleine anti-oxidante molekulen (bv. mitoquinon [MitoQ of MitoQ10], mito-tocopherol [MitoVitE; “beschermt mitochondrieën tegen oxidatieve stress via inhibitie van lipiden-peroxidatie”], mito-apocynin [Mito-Apo; “beschermt tegen oxidatieve schade en glia-gemedieerde inflammatie”]) en molekulaire waterstof, die werden ontworpen om zich op te stapelen in de mitochondrieën in vivo [Ostojic SM. Targeting molecular hydrogen to mitochondria: barriers and gateways. Pharmacol. Res. (2015) 94, 51-53]. Daarom zijn verdere studies vereist om alle op mitochondrieën gerichte interventies voor EIMD – inclusief nieuwe behandelingen (bv. ketogeen dieet, sirtuinen [klasse van HDACs – histoon-deacetylasen, enzymen die acetyl-groepen (O=C-CH3) verwijderen; van belang bij de vertaling van RNA], protopanaxadiol [molekule uit ginseng]) [Rai PK et al. Potential compounds for the treatment of mitochondrial disease. Br. Med. Bull. (2015) 116: 5-18] – te evalueren.

Een ander controversieel aspect van het eventueel gebruik van anti-oxidanten bij EIMD dient ook te worden besproken. Er is steeds meer bewijsmateriaal dat eerder schadelijke effekten van supplementering met anti-oxidanten bij training suggereert, waarbij een hoge dosis anti-oxidanten nadelig zou kunnen interfereren met belangrijke door ROS gemedieerde fysiologische processen (zoals proteïne-signalisering, mitochondriale biogenese of vasodilatie. Er werden negatieve uitkomsten van supplementering met anti-oxidanten gevonden bij fietsers, trialeten, marathon-loper, kayakers en ongetrainde individuen die verschillende anti-oxidanten – zowel water- als vet-oplosbare – kregen toegediend. Aangezien het potentieel voor langdurende schade van supplementering met anti-oxidanten bestaat, dient het gebruik van hoge dosissen anti-oxidanten bij EIMD misschien te worden beperkt tot dat er ‘evidence-based’ richtlijnen zijn.

Besluit

Mitochondrieën kunnen zichzelf doeltreffend beschermen tegen de accumulatie van externe en interne stress via verscheidene mechanismen. Wanneer de bescherming-mechanismen echter uitgeput raken door of gewijzigd omwille van repetitieve herhaalde inspanning en onvoldoende herstel na inspanning, kan EIMD ontstaan. Hoewel er geen studie bestaat die de mitochondriale gezondheid (en herstel na inspanning) op lange termijn volgde na één enkele sessie uitputtende inspanning, is het zeer onwaarschijnlijk dat één enkelvoudige inspanning tot onherstelbare mitochondriale stoornissen leidt – ten minste bij ongetrainde individuen. Frequente uitputtende inspanningen laten mitochondrieën echter misschien wel niet toe zich volledig te herstellen van inspanning-stress, en ernstige DNA-deleties en ultrastrukturele schade (voornaamste merkers voor EIMD) te repareren. Hypothetisch gezien kan uitputtende inspanning een regelmatige mitochondriale levenscyclus – bestaande uit ca. 5 fusie/splitsing-cycli per uur per mitochondrion – in gevaar brengen, leidend tot langdurige slechte mitochondriale prestaties en gevolgen voor de gezondheid. Dit literatuur-overzicht identificeerde mogelijke verbanden tussen uitputtende inspanning en mitochondriale dysfunktie bij mensen; de bevindingen waren echter beperkt tot ‘cross-sectionele’ studies [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] (geen longitudinale effekt-studies), waarbij de definitie van uitputtende inspanning soms onduidelijk is. Er zijn in vivo inspanning-studies nodig bij klinische en atletische populaties die de drempel – die moet worden overschreden om het organel onomkeerbaar te beschadigen – beschrijven.

Klinische Perspectieven

Extreem zware of uitputtende inspanning bevordert mitochondriale stoornissen die de werking ervan permanent kunnen beschadigen. Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie kan een belangrijke factor zijn voor hart-abnormaliteiten, chronische vermoeidheid en over-training syndroom, of spier-degeneratie bij atleten. Het ondersteunen van mitochondriale bio-energetica en het helpen om mitochondriaal DNA te herstellen na uitputtende inspanning, en het behouden van een optimaal anti-oxidant vermogen om toxische reaktieve zuurstof-soorten in het organel op te ruimen, omvat mogelijke behandel-opties voor inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie.

september 9, 2016

Metabole kenmerken van M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 12:53 pm
Tags: , , , , ,

In ‘De ‘cell danger response’’ plaatsten we al het werk van Prof. Naviaux in de schijnwerper. We maakter er al gewag van een veelbelovend artikel (door sommigen aangekondigd als “truly spectacular … that will change the face of CFS-treatment”) dat van hem was aangekondigd. Hier is het dan. Het betreft een metaboloom-studie (‘metabolomics’); zeg maar het meten in ons bloed van de molekulen die ontstaan in de verscheidene stappen en als bijprodukten van ons metabolisme (het afbreken van voedingstoffen om energie en bouwstenen van de cellen aan te maken). De gebruikte technolgieën bieden een moment-opname van de cellulaire fysiologie. Het werk werd ondersteund en gefinancierd door verschillende fondsen en stichtingen (o.a. de ‘UCSD Mitochondrial Disease Research Fund) en mede mogelijk gemaakt door giften van privé-personen.

De researchers suggereren dat veel van de gevonden abnormaliteiten onderdeel kunnen zijn van de reaktie van het lichaam dat probeert de verspreiding en de effekten van een infektie (niet één bepaalde – zoals we hier al meermaals meegaven) te beperken via alternatieve mechanismen en zo andere molekulen creëert dan die het nodig heeft. Een toestand die blijft voortduren bij M.E.(cvs)-patiënten.

De gevonden ontwrichte processen beïnvloeden de cellulaire bouwstenen sfingolipiden en glycosfingolipiden (in het lichaam gebruikt om cel-membranen in hersen- en zenuw-weefsel te vormen), cholesterol (nodig voor de aanmaak van cel-membranen en steroïd-hormonen zoals cortisol of aldosteron), galzuren (belangrijk voor normale vet-vertering; onvoldoende galzuren in de darm kunnen leiden tot ‘leaky gut’), de mitochondrieën (gevolg: lage energie-reserve en een onvermogen om de energie-reserves na inspanning aan te vullen), het vermogen van het lichaam om vitaminen te vormen (vitamine-A en de B-vitaminen riboflavine (B2), niacine (B3), pyridoxine (B6), foliumzuur (B9) & cobalamine (B12); essentieel voor energie-produktie, cel-ontwikkeling en normale werking van het zenuwstelsel) & HICA (een anti-schimmel/ anti-bakteriële molekule die normaal door het lichaam wordt geproduceerd). De auteurs spreken over een opmerkelijke uniformiteit niettegenstaande het voorkomen van meerdere triggers en de heterogeniteit bij de aandoening.

De ‘cell danger response’ (CDR) is een evolutionair bewaarde metabole respons die cellen beschermt en de gastheer van schade vrijwaart. Maar zo zijn er nog in de biologische wereld. Zo is er ‘dauer’ (Duits voor ‘uithouding’), een toestand die voorkomt bij de rondworm Caenorhabditis elegans (een model dat uitgebreid bestudeerd wordt door biologen) wanneer deze barre omstandigheden probeert te overleven. Door het vermogen van deze wormen om een dergelijke situatie te verdragen kunnen ze 4 tot 8 maal langer leven dan gewoonlijk. Volgens Naviaux et al. is dit vergelijkbaar met wat bij M.E.(cvs) aan de hand is: milieu/omgeving-stressoren triggeren een vertraging van het metabolisme en dit geeft aanleiding tot een objectief identificeerbare chemische signatuur. Slechts 25% van de verstoorde metabolieten die bij elke persoon werden gevonden waren nodig voor de diagnose en ruw-weg 75% waren uniek voor elk individu, wat volgens hen nuttig is voor een gepersonaliseerde behandeling. Naviaux: “Onze bevindingen tonen dat de cellulaire metabole respons dezelfde is bij de patiënten.”.

Het valt ook op te merken dat de geobserveerde metabole respons tegengesteld is aan het patroon die bv. bij een acute infektie wordt gezien. Hoewel een infektie dikwijls wordt gemeld als initiërende gebeurtenis, draagt deze blijkbaar niet bij tot het voortduren van de ziekte. Prof Ronald W. Davis (directeur van de wetenschappelijke adviesraad van de ‘Open Medicine Foundation’) oppert dat in afwezigheid van bewijs voor een aktieve infektie, het aannemelijk is dat langdurige antimicrobiële behandelingen (antivirale middelen en antibiotica) – die dikwijls worden gebruikt bij M.E.(cvs)-patiënten – eigenlijk nog meer schade kunnen toebrengen.

Kritici halen aan dat het tot nu toe niet vast te stellen is of de gemelde veranderingen oorzaak of gevolg zijn van M.E.(cvs). Ron Davis (die Professor Biochemie & Genetica aan de Stanford Universiteit is) benadrukt echter het enorme belang van de studie. Verder onderzoek en validering via onafhankelijke studies zijn natuurlijk cruciaal. Daarom financiert de ‘Open Medicine Foundation’ een studie bij een grotere groep patiënten uit geografisch diverse plaatsen.

————————-

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) [Augustus 2016 pre-print]

Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome

Robert K. Naviaux (a,b,c,d), Jane C. Naviaux (a,e), Kefeng Li (a,b), A. Taylor Bright (a,b), William A. Alaynicka (b) Lin Wang (a,b), Asha Baxter (f), Neil Nathan (f), Wayne Anderson (f) & Eric Gordon (f)

aThe Mitochondrial and Metabolic Disease Centre, University of California, San Diego School of Medicine, San Diego, California

bDepartment of Medicine, cDepartment of Pediatrics, dDepartment of Pathology, eDepartment of Neurosciences, University of California, San Diego School of Medicine, San Diego, California

fGordon Medical Associates, Santa Rosa, California

Betekenis

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom is een multi-systeem ziekte die langdurige pijn en invaliditeit veroorzaakt. Het is moeilijk om een diagnose te stellen omwille van de veranderende symptomen en het gebrek aan een diagnostische laboratorium-test. We rapporteren dat doelgerichte, breed-spectrum metaboloom-studie van plasma niet enkel een kenmerkende chemische signatuur onthulde maar ook een onverwachte onderliggende biologie. Metaboloom-studie toonde dat Chronische Vermoeidheid Syndroom een zeer gecoördineerde hypometabole respons is op omgeving-stress die terug te voeren is naar de mitochondrieën en gelijkaardig is met de klassieke ontwikkeling-toestand ‘dauer’. Deze ontdekking opent een nieuw pad voor de rationele ontwikkeling van nieuwe therapeutica en identificeert metaboloom-studie als een krachtig instrument voor het identificeren van chemische verschillen die bijdragen tot gezondheid en ziekte.

Samenvatting

Meer dan 2 miljoen mensen in de V.S. hebben Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). We voerden een doelgerichte, breed-spectrum metaboloom-studie uit om inzichten te verwerven in de biologie van CVS. We bestudeerden een totaal van 84 individuen. 45 individuen (23 vrouwen en 22 mannen) voldeden aan de diagnostische criteria voor M.E./CVS: ‘Institute of Medicine’, Canadese & Fukuda. 39 individuen (21 vrouwen, 18 mannen) werden voor leeftijd en geslacht gematcht met normale controles. De vrouwen met M.E./CVS waren 52 (± 2,5) jaar oud (20-67); de mannen met M.E./CVS waren 53 (± 2,8) jaar oud (21-67). De Karnofsky prestatie-scores waren 54 (± 3,3) voor de vrouwen en 62 (± 3,2) voor de mannen. We bekeken 612 metabolieten van 63 biochemische mechanismen in het plasma d.m.v. hydrofiele-interaktie vloeistof-chromatografie, ‘electrospray’ ionisatie en tandem massa-spectrometrie [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]. Patiënten met M.E./CVS vertoonden abnormaliteiten in 20 metabole mechanismen. 80% van de diagnostische metabolieten waren gedaald, consistent met een hypometabool syndroom. De abnormale mechanismen omvatten: sfingolipiden, fosfolipiden, purine, cholesterol, microbioom, pyrroline-5-carboxylaat, riboflavine, vertakte-keten aminozuren, peroxisomaal en mitochondriaal metabolisme. […] Analyse toonde diagnostische accuraatheden van 96% […] bij de vrouwen (gebruikmakend van 13 metabolieten) en 94% […] bij de mannen (gebruikmakend van 8 metabolieten). Onze gegevens tonen dat, ondanks de heterogeniteit van de factoren die tot M.E./CVS leiden, de cellulaire metabole respons bij de patiënten homogeen, statistisch robust en chemische gelijkaardig was met de evolutionair bewaarde respons op omgeving-stress die bekend staat als ‘dauer’.

Inleiding

[…]

De diagnose van complexe ziekten zoals M.E./CVS zijn dikwijls moeilijk en vallen duur uit. Hoewel individuele testen betaalbaar kunnen zijn en mogelijks gedekt door de sociale zekerheid, maken veel patiënten een omzwerving door die resulteert in substantiële persoonlijke kosten en jaren van zoeken, zonder werk en met significant verminderde levenskwaliteit. De maatschappelijke kost door M.E./CVS is heel zwaar. Professionele gezondheidszorg-werkers zijn ook gefrustreerd door het ontbreken van objectieve technologie die de diagnose kan ondersteunen. Pogingen om een klein aantal biomerkers – molekulen in het bloed, cerebrospinaal vocht of een handvol genen – te gebruiken, leverden geen diagnostisch bruikbare testen voor M.E./CVS op.

Metaboloom-studies hebben meerdere voordelen t.o.v. genoom-studies voor de diagnose van complexe chronische ziekten […]. Ten eerste: minder dan 2.000 metabolieten vormen de meerderheid van de molekulen in het bloed die worden gebruikt voor cel-cel communicatie en metabolisme, vergeleken met de 6 miljard baseparen in het menselijk genoom. Ten tweede: metabolieten weerspiegelen de huidige funktionele toestand van het individu. De collectieve cellulaire chemie vertegenwoordigt de funktionele interaktie van genen en het milieu. Dit is het metabolisme. In tegenstelling: het genoom vertegenwoordigt een mengeling van voorouderlijke genotypes die geselekteerd werden voor hun geschiktheid in ancestrale omgevingen. De metabole toestand van een individu op het tijdstip van ziekte komt voort uit de huidige situatie, leeftijd en gezamelijke geschiedenis, timing en aantal blootstellingen aan lichamelijke en emotionele stress, trauma, dieet, inspanning, infekties en het microbioom – het metabool geheugen [Naviaux RK. Oxidative shielding or oxidative stress? J Pharmacol Exp Ther (2012) 342: 608-618 /// Naviaux RK. Metabolic features of the cell danger response. Mitochondrion (2014) 16: 7-17 (zie onze inleiding)]. Analyse van metabolieten kunnen een meer technische en bio-informatisch beheersbare, fysiologisch relevante, chemisch uitgebreide en kosten-efficiënte diagnose-methode voor complexe chronische ziekten bieden. Omdat metaboloom-studies directe informtaie over kleine molekulen bieden, kunnen de resultaten onmiddellijk aktie-gerichte behandeling-informatie bieden; gebruikmakend van beschikbare kleine voeding-molekulen, co-factoren en lifestyle-interventies. Onze resultaten tonen dat M.E./CVS een objectief identificeerbare chemische signatuur heeft bij zowel mannen als vrouwen en dat doelgerichte metaboloom-studies kunnen worden gebruikt om biologische inzichten bloot te leggen die bruikbaar kunnen zijn voor de diagnose en gepersonaliseerde behandeling.

Materialen & Methodes

[…]

Resultaten

Demografiek

De 84 individuen in deze studie kwamen uit plaatsen met 51 post-codes van de V.S. en Canada. 80 personen kwamen uit Californië. Alle M.E./CVS-patiënten voldeden aan de 2015 diagnostische criteria gepubliceerd door het IOM, de Canadese werk-groep en Fukuda et al. […] Hoewel het IOM een nieuwe naam heeft gesuggereerd (“systemic exertion intolerance disease”, SEID), blijven we de term “M.E./CVS” gebruiken. De gemiddelde leeftijd van de vrouwen met M.E./CVS was 52 (± 2,5) en van de mannen met M.E./CVS 53 (± 2,8). De gemiddelde leeftijd bij aanvang was 33 (± 2,3) voor de vrouwen en 30 (± 2,6) voor de mannen. De gemiddelde ziekte-duur was 17 (± 2,3) jaar voor de vrouwen en 21 (± 3,0) voor de mannen. De Karnofsky-score was 54 (± 3,3) voor de vrouwen, 62 (± 3,2) voor de mannen.

Een homogene metabole respons op heterogene triggers

Hoewel deze studie niet was ontworpen om de rol van triggerende gebeurtenissen te onderzoeken, verzamelden we enkele basis-gegevens. Mogelijke triggerende gebeurtenissen konden in 5 groepen worden ondergebracht: biologische (virale, bakteriële, schimmel- en parasitaire infekties), chemische blootstellingen, lichamelijk trauma, psychologisch trauma en ongekend. […] Meerdere patiënten hadden multipele triggers die samenliepen in hetzelfde jaar. Hoewel biologische triggers het meest courant waren, was er geen enkel infektueus agens of andere stressor statistisch meer prevalent. Uitgebreid testen voor biologische blootstellingen in de controle-groep viel buiten de scope van deze studie.

Ondanks de heterogeniteit van de triggers, was de cellulaire respons van deze omgeving-stressoren bij de M.E./CVS-patiënten homogeen en statistisch robust. Deze gegevens ondersteunen de notie dat het de overkoepelende cellulaire respons is en niet de specifieke trigger die aan de basis ligt van de metabole kenmerken van M.E./CVS.

Metaboloom-studies onthullen een chemische signatuur van M.E./CVS

Er werd multi-variate analyse aangewend om het patroon van de chemische abnormaliteiten bij M.E./CVS te identificeren in vergelijking met de gezonde controles. We vonden dat zowel mannelijke als vrouwelijke patiënten een chemische signatuur hadden die verschillend was van de gezonde controles. […] Er waren 9 verstoorde biochemische mechanismen die gemeenschappelijk waren voor zowel mannen en vrouwen met CVS. 11 mechanismen vertoonden metabolieten-stoornissen die een zekere graad van geslacht-specificiteit vertoonden. De biochemische mechanismen en metabolieten die gewijzigd waren bij M.E./CVS werden gerangschikt en opgelijst […]: de dominante bevinding van de analyse was dat sfingolipiden-abnormaliteiten bijna 50% van al de metabole stoornissen geassocieerd met M.E./CVS (mannen en vrouwen) vormden. Fosfolipiden-abnormaliteiten vormden 26% van de metabole stoornissen bij de vrouwen, 16% bij de mannen.

Metabolieten correleerden met de klinische ernst van M.E./CVS

We onderzochten dan hoe elk van de metabolieten-abnormaliteiten in de top-25 gerelateerd was met de klinische funktionele toestand […]. Elk van deze metabolieten bleek ‘false discovery-rates’ (FDRs [maat voor het aantal foute hypothesen]) van minder dan 10% te vertonen. […] 21 uit de top-25 (84%) onderscheidende metabolieten waren laag. Deze bevindingen waren consistent met de notie dat CVS een gecoördineerde hypometabole toestand is.

Sfingolipiden en glycosfingolipiden waren gedaald

De grootste stoornissen in de chemische signatuur van M.E./CVS kwamen door wijdverspreide daling qua plasma sfingo- en glycosfingolipiden. Er waren 30 molekulaire soorten van sfingolipiden gedaald bij de mannen en 21 bij de vrouwen. Sfingolipiden- en glycosfingolipiden-abnormaliteiten verklaarden 55% van de metabole impact bij de mannen en 44% bij de vrouwen. […] Van de verminderde sfingolipiden waren bij de mannen meer dan 50% (16/30) ceramiden en 47% (14/30) sfingomyeline-soorten. Bij de vrouwen waren 86% (18/21) ceramiden en 14% (3/21) sfingomyelinen. Over het algemeen bleven bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten meer sfingomyeline-soorten binnen de normale waarden dan bij de mannen. Het laag-sfingolipiden profiel bij M.E./CVS lijkt een adaptieve respons te zijn die tegengesteld aan de verhoogde sfingolipiden die worden gezien bij het metabool syndroom [abdominale (centrale) obesitas + hypertensie + verhoogd nuchter bloed-glucose + hoge triglyceriden in het bloed + lage hoge-densiteit lipoproteïnen (HDL)] en de acute ‘cell-danger-response’ (CDR), en uiteindelijk zou dit een fundamentele respons kunnen vertegenwoordigen om de verspreiding van aanhoudende virale en intracellulaire bakteriële infekies tegen te gaan.

Fosfolipiden waren gedaald

Meerdere plasma fosfatidylcholine (PC) fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden] waren verminderd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. In tegenstelling daarmee vonden we dat een zeer specifieke molekulaire soort fosfolipide, PC(18:1/22:6) – die essentieel omega-3 vetzuur docosahexaanzuur (DHA, C22:6) en oleïnezuur (C18:1) omvat – was gestegen. Dit patroon is tegengesteld aan wat wordt gezien in respons op acute infektie, en bij de CDR en het metabool syndroom.

Purinen waren verminderd

Urinezuur in het plasma was verminderd bij mannen met M.E./CVS. Het is het eindprodukt van het purine-metabolisme en een belangrijke anti-oxidante molekule. Plasma adenosine was gedaald bij de vrouwen. Dit wordt geproduceerd uit ATP en ADP dat wordt afgegeven door cel-oppervlakte ectonucleotidasen [bepaalde enzymen die tussenkomen bij het metabolisme van nucleotiden], en door S-adenosylhomocysteïne-hydrolase (SAHH [enzyme]), tijdens acute infektie, inflammatie of stress. De daling qua plasma-purinen bij M.E./CVS is consistent met verminderde synthese en/of turn-over (flux) van ATP & GTP, en de verlaagde reserve-capaciteit die wordt veroorzaakt (ten dele) door een veralgemeende daling van de capaciteit om hoge-energie fosfaat voorraden aan te vullen na inspanning.

Aromatische aminozuur metabolieten van het microbioom waren gedaald

4-hydroxyfenyl-melkzuur (HPLA) in het plasma was gedaald bij de mannen met M.E./CVS. Plasma fenyl-melkzuur (PLA) was gedaald bij de vrouwen. HPLA is een microbioom-metaboliet van tyrosine. PLA is een microbioom-metaboliet van fenylalanine. Dit patroon is ook tegengesteld aan wat wordt gevonden tijdens acute inflammatie en infektie.

Flavine-adenine-dinucleotide (FAD) was verminderd

Plasma FAD was verminderd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Het wordt gesynthetiseerd uit riboflavine (vitamine-B2) en ATP. De gastro-intestinale absorptie, distributie en transporter-gemedieerde opname van FAD worden zorgvuldig gereguleerd. FAD wordt gemobiliseerd uit weefsels, stijgt in het plasma en secretie door de nieren verhoogt bij stress of infektie. FAD is een belangrijke co-factor voor oxidatie van vetzuren en sterol-synthese, en is vereist voor aktivatie en oxidatie van vitamine-B6 (pyridoxine); het liponzuur-metabolisme (E3-subunit) nodig voor pyruvaat, alfa-ketoglutaraat en oxidatie van vertakte-keten aminozuren; vitamine-A aktivatie; 5-methyltetrahydro-foliumzuur synthese; niacine- & NAD-synthese; en glutathion-reductie. Funktionele deficiëntie van riboflavine kan ontstaan door by voeding- en milieu-factoren. […]

Cholesterol en galzuren synthese via het lathosterol-mechanisme was gedaald

Plasma-lathosterol was gedaald bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Totaal plasma cholesterol, desmosterol [voorloper van cholesterol], cortisol en aldosteron waren normaal bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Er worden 2 mechanismen gebruikt om cholesterol te synthetiseren in zoogdier-cellen: het Kandutsch-Russell (K-R) mechanisme (via lathosterol) en het Bloch mechanisme (via desmosterol). Het K-R mechanisme krijgt de voorkeur voor cholesterol-synthese in de hersenen, het hart, skelet-spieren en huid: onder basale omstandigheden 80% van de cholesterol-synthese in deze weefsels. Het Bloch mechanisme krijgt normaal de voorkeur bij bepaalde metabole stress respons weefsels zoals de geslachtsorganen, milt, bijnieren, nieren en vet-weefsel. Onder basale omstandigheden bij gezondheid gebruikt de lever de beide mechanismen bijna evenveel. Onze gegevens zijn consistent met een gedaalde flux door het desmosterol-mechanisme om normale cellulaire waarden voor cholesterol aan te houden. Het desmosterol-mechanisme correspondeert met de stress-induceerbare arm van de cholesterol- en sterolen-synthese.

Chenodeoxycholzuur (CDCA) was gedaald in het plasma van de vrouwen. Het is een primair galzuur dat wordt gemaakt uit cholesterol. Een gedaalde cholesterol-flux kan resulteren in minder substraat voor galzuur-synthese (vereist voor normale vet-vertering en microbioom-signalisering). De afwezigheid van voldoende galzuur kan leiden tot een verlies van de intestinale mucosale integriteit en ‘leaky gut’ […].

Pyrroline-5-carboxylaat en arginine waren verhoogd

Pyrroline-5-carboxylzuur (P5C) was verhoogd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. De aanmaak van P5C is een goed bestudeerde respons op stress in planten en zoogdieren. P5C kan worden aangemaakt via de stress-geïnduceerde oxidatie van [aminozuren] proline en hydroxyproline […]. P5C wordt omgezet tot glutamaat-semi-aldehyde (GSA) en dan tot ornithine onder stress. […] Hydroxyproline was verhoogd bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Het wordt omgezet tot proline, en dan tot P5C & GSA, wat dan wordt aangewend als de voorloper voor de synthese van arginine uit ornithine in het epitheel van de dunne-darm (bij gedaalde calorie- of proteïne-inname. Een ander metabool lot van hydroxyproline is glyoxylaat, wat in mitochondrieën wordt omgezet tot glycine en gemetaboliseerd in peroxisomen tot oxalaat en peroxide voor de cel-verdediging, en aangeboren en antivirale immuniteit.

De arginine-waarden in het plasma waren ook verhoogd bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Arginine is een bron van ureum […] maar belangrijker: het is een aktivator van de Nacetylglutamaat (NAG) synthese. NAG is de onontbeerlijke aktivator van carbamoyl-fosfaat-synthetase-I (CPS-I). Dit enzyme is vereist voor de introductie van ammoniak in de ureum-cyclus via de synthese van citrulline uit ornithine en carbamoylfosfaat door ornithine-transcarbamoylase (OTC). De waarden van citrulline, ornithine, proline, glutamine & glutamaat waren allemaal normaal. Bij stress wordt proline uit de collageen-afbraak afgeleid naar de arginine-synthese om stikstof te besparen en verspilling te beperken tijdens periodes van gedaalde calorie- en/of proteïne-inname. […] Een ander metabool lot van arginine is de NO-inhibitor genaamd asymmetrisch dimethylarginine (ADMA). M.E./CVS-patiënten vertoonden geen toenname qua plasma-ADMA. Verhoogd arginine is verbonden met een verminderd risico op infektie na operatieve stress en wordt gebruikt om de antimicrobiële molekule agmatine te synthetiseren bij aktieve infektie.

Vertakte-keten aminozuur metabole intermediairen waren gedaald

2-Hydroxyisocapronzuur (HICA [metaboliet van het aminozuur leucine]) […] was gedaald bij mannen én vrouwen met M.E./CVS. Dit is consistent met verminderde darm-absorptie, verhoogde excretie door de nieren, verhoogde mitochondriale oxidatie of een combinatie van deze 3. HICA heeft antibakteriële en anti-schimmel aktiviteit.

Diagnostische versus gepersonaliseerde metabole stoornissen

We klassificeerden alle metaboliet-abnormaliteiten van elke patient bij één van de of abnormaliteiten die M.E./CVS-patiënten als een groep definieerden of als abnormaliteiten die verschilden van controles maar niet bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose. De M.E./CVS-patiënten hadden gemiddeld 10 (± 1,0) metaboliet-abnormaliteiten die bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose en 30 (± 2,0) metabolieten die abnormaal waren maar niet bijdraagden aan de M.E./CVS-diagnose. Dit betekent dat 75% van de chemische abnormaliteiten die werden geïdentificeerd via metaboloom-analyse gepersonaliseerd waren en 25% leverden diagnostische informatie. Onze klinische ervaring suggereert dat symptoom-verbeteringen op een meer betrouwbare manier kunnen worden bekomen via het aanpakken van de gepersonaliseerde abnormaliteiten i.p.v. uitgaande van een chemische abormaliteit zonder werkelijke meting.

Beoordeling van metaboloom-studie als een diagnostische test voor M.E./CVS

Na het identificeren van meer dan 60 metabolieten die verschilden tussen M.E./CVS en controles bij mannen én vrouwen, wilden we kleinere sets analyten vinden die zouden kunnen worden aangewend voor de diagnose. Stalen van 5-15 van de top-60 metabolieten werden manueel geselekteerd om in grote lijnen meerdere van de discriminerende biochemische mechanismen te onderzoeken. De prestaties van elke klassificerende set metabolieten werd dan getest […]. We vonden dat de exacte specificatie van de metabolieten per klassificerende set flexibel was. […] We vonden dat eens een set van 5-15 analyten werd gevonden, de toevoeging of verwijdering van één of enkele analyten weinig effekt had op de globale kwaliteit van de klassificerende set. Bij de mannen vonden we dat een set van 8 analyten goed werkte; bij de vrouwen was dat een set van 13 analyten. We vonden dat zelfs klassificatie-methodes met een enkel analyt het verrassend goed deed bij deze 84 individuen. Enkelvoudige biomerkers zijn echter biologisch onwaarschijnlijk als diagnostische test voor een complexe ziekte zoals M.E./CVS en die zullen het waarschijnlijk slecht doen bij grotere populaties. Door het gebruik van klassificerende sets bestaande uit 5 tot 15 metabolieten, is de natuurlijke biologische variatie gemakkelijker te klassificeren en is de diagnostische accuraatheid robuster. […]

Metabole gelijkenissen tussen CVS en ‘dauer’

Veel van de mechanismen en metabolieten die abnormaal waren bij M.E./CVS zijn ook gekend als kenmerken van ‘dauer’, een degelijk bestudeerde, langdurende toestand van overleving en volharding die wordt getriggerd door omgeving-stress. Interessant is dat we vonden dat de richting van de M.E./CVS-abnormaliteiten tegengesteld was aan het metabool syndroom en tegengesteld aan de metabole respons op infektie, inflammatie of omgeving-stress die de CDR werd genoemd. Het cholesterol-, fosfolipiden-, sfingolipiden- en purine-metabolisme zijn bv. allemaal gedaald bij M.E./CVS en ‘dauer’ maar zijn gestegen bij het metabool syndroom en de CDR. Deze feiten suggereren dat M.E./CVS een evolutionair bewaarde, genetische gereguleerde, hypometabole toestand is gelijkaardig met ‘dauer’, die overleving en volharding toelaat onder omstandigheden van omgeving-stress maar ten koste van een ernstig beknotte funktie en levenskwaliteit.

Bespreking

Het doelvan deze studie was het testen van de bruikbaarheid van doelgerichte metaboloom-studie bij de diagnose van M.E./CVS. We vonden dat patiënten die voldeden aan de criteria voor M.E./CVS aanbevolen door het IOM, de Canadese werk-groep en Fukuda et al. objectieve chemische abnormaliteiten vertoonden die hen duidelijk onderscheidde van controles. Daarnaast onthulde analyse dat alle 9 mechanismen die bij vrouwen en mannen met M.E./CVS verstoord bleken, gerelateerd waren met de CDR. In tegenstelling met een acute CDR, waarbij plasma-sfingolipiden en -fosfolipiden verhoogd zijn, waren deze mechansimen echter gedaald; wat een adaptatie na blootstelling of mitocellulaire hormese [Mitochondrieën helpen cellen adapteren aan metabole stress uit het verleden via wijzigingen van de cellulaire reaktiviteit. Wanneer zowel mitochondriale als cellulaire mechanismen zich aanpassen, spreekt men van mitocellulaire hormese.] suggereert in respons op pathologisch persistente of terugkerende ‘cell-danger’-signalisering.

Hypometabolisme, ‘dauer’ en M.E./CVS

Onze resultaten tonen dat de metabole kenmerken van M.E./CVS consistent zijn met een hypometabole toestand. Sfingolipiden, glycosfingolipiden, fosfolipiden, purinen, aromatische en vertakte-keten aminozuur metabolieten van het microbioom, FAD en lathosterol waren verminderd. De dalingen van deze metabolieten correleerden met de ziekte-ernst (gemeten via de Karnofsky-scores). Er is veel research gebeurd aangaande het hypometabool fenotype in andere biologische systemen (‘dauer’, diapause [tijdelijke opschorting van de ontwikkeling van het embryo], hibernatie [‘winterslaap’; toestand van inaktiviteit en metbole onderdrukking], estivatie [zgn. ‘zomerslaap’; langdurige sluimer-toestand tijdens een hete of droge periode], torpor [toestand van verminderde fysiologische aktiviteit, gekenmerkt door een sterk verlaagde lichaam-temperatuur, hartslag, ademhaling en stofwisseling], de ‘unfolded’ proteïnen respons [mitochondriale UPRmt; de UPR wordt geaktiveerd in respons op accumulatie van ongevouwen of verkeer opgevouwen proteïnen; de cel evalueert de werking van de mitochondrieën en reguleert de proteïnen-synthese tijdens stress], autofagie [mitochondriale autofagie (elimineert beschadigde mitochondrieën) = mitofagie; strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten], enz.). ‘Dauer’ – betekent ‘persistentie/volharding’ of ‘langdurig’ in het Duits – is één voorbeeld van een goed bestudeerd systeem. Het ontwikkeling-stadium van ‘dauer’ is een hypometabole toestand waar men in staat is efficient te leven door het wijzigen van een aantal basis mitochondriale funkties, brandstof-voorkeuren, gedrag en fysieke kenmerken. Dauer bestaat uit evolutionair bewaarde en synergistische programmas voor metabole en strukturele veranderingen die worden getriggerd bij blootstelling aan nadelige omgeving-omstandigheden. Het in werking treden van ‘dauer’ verleent overleving-voordelen bij zware omstandigheden. Als de ‘dauer’-respons wordt geblokkeerd door bepaalde mutaties (‘dauer’-gebrekkigen), leven dieren kort als ze blootgesteld worden aan omgeving-stress. Deze mutaties tonen dat het latent vermogen om in een hypometabole toestand te komen tijdens een bedreiging uit het milieu, adaptief is, zelfs als dit gaat ten koste van een verminderde optimale funktionele capaciteit. Gelijkaardig met ‘dauer’, lijkt M.E./CVS een hypometabole overleveing-toestand te vertegenwoordigen die wordt getriggerd door omgeving-stress. De metabole kenmerken van M.E./CVS & ‘dauer’ stemmen overéén met dezelfde mechanismen die de acute CDR en het metabool syndroom karakteriseren maar worden geregeld in de tegengestelde richting. Bv.: cholesterol, fosfolipiden en urinezuur zijn dikwijls gestegen bij de acute CDR en het metabool syndroom, maar deze metabolieten waren gedaald bij M.E./CVS-patiënten. Een voorspelling op basis van deze bevindingen is dat M.E./CVS-patiënten meer resistent zullen zijn tegen de constellatie van of hypertensie, dyslipidemie [abnormale hoveelheid van één of meer van de bloed-vetten (= lipiden, cholesterol, triglyceriden)], obesitas en insuline-resistantie die de mortaliteit geassocieerd met het metabool syndroom, maar ten koste van een significante langdurende invaliditeit, pijn en lijden.

Het belang van mitochondrieën, redox en NADPH-metabolisme bij M.E./CVS

Al de metabole abnormaliteiten die we identificeerden bij M.E./CVS werden ofwel direct geregeld via redox of de beschikbaarheid van NADPH. Ca. 60% van het NADPH wordt geproduceerd door het pentose-fosfaat mechansime [genereert naast NADPH ook pentosen (essentiële componenten van nucleotiden en nucleïnezuren)]. De ander 40% wordt aangemaakt via de gecombineerde werking van 5 NADP+ afhankelijke enzymen […]. Elk van deze enzymen heeft minstens één mitochondriale isoform en staat bekend geupreguleerd te zijn onder omstandigheden van omgeving- of ontwikkeling-stress. Er werd aangetoond dat mitochondriaal MTHFD2L [methyleen-tetrahydrofolaat-dehydrogenase 2-achtig proteïne] verantwoordelijk is voor de aanmaak van 20-40% van het cellulair NADPH via de oxidatie van methyleen-tetrahydrofoliumzuur naar 10-formyl-tetrahydrofolaat. Deze gegevens tonen dat folaten belangrijk zijn, niet enkele in methylatie-reakties maar ook bij het reguleren van de intracellulaire redox en NADPH. Er werd een aantal ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in het MTHFD2L gen dat correleert met de CDR en aanmaak van interleukine-1β (IL1β) getriggerd door pokken-vaccinatie. Mitochondriale voorraden van NADPH staan continu in communicatie met NADH-waarden via het enzyme NNT. NADPH werkt daarom als een globale barometer voor de status van de cellulaire brandstof d.m.v. het bekijken van de mitochondriale elektronen (NADH) consumptie en de beschikbaarheid van cytoplasmische reducerende equivalenten zoals NADPH. Als het mitochondriaal elektronen-transport om welke reden dan ook daalt, worden minder zuurstof-molekulen omgezet in water (H2O) door cytochroom-c-oxidase. Als de levering van zuurstof aan de cel onveranderd is, stijgt de concentratie opgelost zuurstof in de cel (zoals water in een kom) in respons op onmiddellijke dalingen van de mitochondriale zuurstof-consumptie. Dit aktiveert een groep enzymen die worden gereguleerd op basis van de beschikbarheid van opgelost zuurstof en als zuurstof-sensors kunnen werken. Sommige daarvan omvatten NADPH-oxidasen zoals Nox4 [NADPH-oxidase type 4] die waterstof-peroxide (H2O2) aanmaakt uit de overmaat zuurstof (O2) [oxidatieve beschermende respons; zie Naviaux’ artikel over de CDR]. Als de voorraden van gereduceerd (NADPH) en totaal (NADPH plus NADP+) laag staan, neigen de synthese van sterolen, vetzuren, proteïnen en nucleotiden naar basale overleving-waarden. Als de NADPH-waarden hoger zijn, verschuift het metabolisme van ‘persistentie’ naar normale cel-funktie en groei, anabole mechanismen worden gestimuleerd, er wordt biomassa gecreëerd en, koolstoffen en elektronen worden als biopolymeren opgeslagen voor cel-groei en herstel, onder de vorm van lipiden, proteïnen, glycogeen, glycanen en nucleïnezuren.

Het is belangrijk te benadrukken dat NADPH niet het probleem noch de oplossing zelf is. Het is een boodschapper en co-factor. NADPH kan niet funktioneren zonder de beschikbaarheid van honderden koolstof-skeletten van het intermediair metabolisme nodig om de boodschap uit te voeren – het signaal dat brandstof-voorraden vol of beperkt zijn, en dat het metabolisme navenant dient te worden aangepast. Specifiek: NADPH kan niet op een eenvoudige manier als voeding-supplement worden toegevoegd om de verschuiving van het metabolisme te geven welke nodig is om van de ‘dauer’ toestand bij M.E./CVS naar een normale gezonde toestand te gaan. Stap-voor-stap verbeteringen qua NADPH-produktie zouden theoretisch kunnen worden ondersteund door interventies gericht op folaat, B12, glycine- & serine-voorraden, en B6-metabolisme, maar de veiligheid en de doeltreffendheid van deze manipulaties dienen echter nog te worden uitgetest in een rigoreus ontworpen klinische proef. Doeltreffende behandelingen voor M.E./CVS zullen uiteindelijk waarschijnlijk worden bekomen via de zorgvuldige aandacht voor voeding, metabolisme, triggers, stressoren en lichamelijke aktiviteit – een geïntegreerd systeem – gecombineerd met een systeem-biologisch begrijpen van de van de CDR en ‘dauer’.

Besluiten

M.E./CVS heeft een chemische signatuur die kan worden geïdentificeerd d.m.v. doelgerichte plasma metaboloom-studies. Analyse toonde een diagnostische accuraatheid die de 90% overschreed. Het patroon en de richting van de veranderingen toonden dat M.E./CVS een geconserveerde, hypometabole respons op omgeving-stress is die gelijkaardig is met ‘dauer’. Slechts ca. 25% van de verstoorde metabolieten die bij elke persoon werden gevonden, waren nodig voor de diagnose van M.E./CVS. Ongeveer 75% van de metaboliet-abnormaliteiten waren uniek voor het individu en bruikbaar bij het begeleiden van gepersonaliseerde behandeling. Het bestuderen bij grotere groepen uit diverse geografische gebieden, en vergelijking met verwante medische aandoeningen (zoals depressie en post-traumatische stress aandoening), zullen nodig zij om de universaliteit en specificiteit van deze bevindingen te valideren. De ontdekking van een objectieve chemische signatuur bij M.E./CVS helpt om de diagnostische onzekerheden weg te nemen, zal klinici ondersteunen om geïndividualiseerde responsen op behandeling te monitoren en zal multi-centrum klinische proeven vergemakkelijken.

————————-

Zoals reeds medegedeeld in de inleiding, financiert de ‘Open Medicine Foundation’ een studie bij een grotere groep patiënten Prof. Ron Davies onderzoekt daarbij zelf de rol van genetica bij de individuele responsen.

Volgens M.E.(cvs)-aktivist Cort Johnson, zou Dr Maureen Hanson (Afdeling Molekulaire Biologie & Genetica, Cornell Universiteit) – die een familielid met M.E.(cvs) zou hebben en in de wetenschappelijke raad van de ‘Simmaron Research Foundation’ zetelt – in een ‘Solve ME/CFS’ webinar onthuld hebben dat ze Naviaux’ kern-bevindingen gerepliceerd heeft; weliswaar in een kleinere studie, enkel bij vrouwen, en met een verschillende een massa-spectrometer en andere behandeling van de stalen. Hanson’s bevindingen zouden opvallende gelijkenissen vertonen met die van Naviaux: 84% van de metabolieten gereduceerd, enkele mechanismen doken ook op (fosfolipiden, purinen, proline, vetzuren), andere – o.a. de sfingolipiden-reducties – dan weer niet. Dat zou te wijten kunnen zijn aan de verschillende methodiek (standardisatie is dus uiterst belangrijk) maar ook aan het feit dat de patiënten uit een andere geografische regio komen… Ze is ook van plan verder te zoeken en richtte daartoe een nieuw M.E.(cvs) research-centrum op (het ‘Centre for Enervating NeuroImmune Disease’ (CEND)’.

mei 27, 2016

NK-cellen & SNPs in ion-kanalen en receptor-genen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:19 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel is een integratie van resultaten betreffende TRP (‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’) en AChR (‘SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS’) gevonden in vol-bloed bij M.E.(cvs)-patiënten en het verder onderzoeken van deze bevindingen bij geïsoleerde NK-cellen. De lezer wordt aangeraden vooraf missschien ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ (en ev. andere artikels betreffende NK-cellen alhier ook nog eens na te lezen…

In essentie rapporteert men hier over abnormale genen coderend voor ion-kanalen & receptoren in (geïsoleerde) ‘natural killer’ cellen. Men legt uit, op basis hiervan, waarom NK-cellen (onderdeel van het immuunsysteem) bij M.E.(cvs) niet goed funktioneren. Deze genen worden ook niet enkel gevonden in NK-cellen en met stelt dat de anomalieën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor andere de andere symptomen van de ziekte.

Het research-team van het ‘National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases’ (NCNED) – waartoe deze onderzoekers behoren – blijken op termijn ook een screening-test op de markt te willen brengen op basis van “nieuwe merkers geïdentificeerd op witte bloedcellen”. Het is niet helemaal duidelijk of de hieronder beschreven SNPs daar ook onder vallen maar naar aanleiding van het persbericht daarover sprak Prof. Staines echter over “zeer specifieke delen van genen die coderen voor bepaalde receptoren of proteïnen die belangrijke rollen spelen bij het metabolisme, neuronale en cardiovasculaire funktie, enz.”. Wellicht zal het een combinatie zijn met de door deze onderzoeksgroep eerder gerapporteerde en gepatenteerde miRNAs…

————————-

Application of Clinical Genetics Vol. 9, pp 39-47 (2016)

Natural killer cells and single nucleotide polymorphisms of specific ion channels and receptor genes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Teilah Huth (1,2), Anu Chacko (1,2), Samantha Johnston (1,2), Pete Smith (2), Donald Staines (2)

1School of Medical Science, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases [NCNED], Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Samenvatting

Doelstelling Het doel van dit artikel is om de cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) cellen te bepalen, en te kijken of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en genotypes in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen en acetylcholine-receptoren (AChRs) aanwezig waren in geïsoleerde NK-cellen van patiënten die eerder de diagnose Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kregen.

Individuen en methodes Er werd een totaal van 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar oud) en 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar oud) in deze studie opgenomen. Patiënten kregen de diagnose op basis van de CDC criteria. Er werd flow-cytometrie aangewend om de NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Er werd een totaal van 678 SNPs in geïsoleerde NK-cellen onderzocht (voor 21 zoogdier TRP ion-kanaal genen en 9 zoogdier AChR genen […]). SNP-associatie en genotype werd bepaald […].

Resultaten M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua percentage lysis van doelwit-cellen door NK (17% ± 4,68%) t.o.v. de niet-vermoeide controle-groep (31% ± 6,78%). Van de 678 onderzochte SNPs, werden 11 SNPs voor TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) geïdentificeerd in de M.E./CVS-groep. 5 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3, terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8, TRPC2 & TRPC4 (P < 0.05). 14 SNPs bleken geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen: 6 met CHRNA3, de rest met CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5 & CHRNE (P < 0.05). Er werden 16 genotypes geïdentificeerd met SNPs in TRP ion-kanalen en AChRs voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1) (P < 0.05).

Besluit We identificeerden een aantal SNPs en genotypes voor TRP ion-kanalen en AChRs bij geïsoleerde NK-cellen bij patiënten met M.E./CVS, wat suggereert dat deze SNPs en genotypes betrokken kunnen zijn bij veranderingen qua NK-cel funktie en de ontwikkeling van M.E./CVS-pathologie. Deze anomalieën suggereren een rol voor de ontregeling van Ca2+ in AChR en TRP ion-kanaal signalisering in het pathomechanisme van M.E./CVS.

Inleiding

‘Natural killer’ (NK) cellen zijn granulaire [gekorrelde] lymfocyten die worden gevonden in het perifeer bloed, het beenmerg, de milt en in lymfeknopen. In het perifeer bloed beslaan NK-cellen 15% van de lymfocyten en ze kunnen worden gegroepeerd in 4 subtypes volgens de expressie op het cel-oppervlak en de densiteit van CD56 (neurale cel-adhesie molekule) en CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG). Deze fenotypes omvatten CD56brightCD16-/dim, CD56dimCD16bright, CD56dimCD16 & CD56CD16bright. Ongeveer 90% van de NK-cellen in het perifeer bloed zijn CD56dimCD16bright en de CD56bright beslaan ca. 10%. NK-cel cytotoxische aktiviteit vereist een aantal gereguleerde processen om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] van de doelwit-cel te verzekeren.

Hoewel er weinig is geweten over Ca2+-signalisering in NK-cellen, werd er gezien dat het granule-afhankelijk pad voor apoptose calcium-afhankelijk is, terwijl het ‘death’-receptor mechanisme dat niet is. Bij apoptose bleken het transport van lytische proteïnen, exocytose [proces waarbij een vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan samensmelten en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte] en fusie duidelijk calcium-afhankelijk. Ca2+ is ook vereist voor de her-oriëntatie van microtubules [buisvormige proteïne-strukturen die deel uitmaken van het cel-skelet] en het actine-skelet [het proteïne actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], alsook de aktivatie van cytokinen gen-transcriptie. Bovendien hebben studies aangetoond dat er een verband bestaat tussen calcium-mobilisatie en het stopzetten van de degranulatie in PLCγ2-deficiënte NK-cellen [PLC = fosfolipase; PLC-gamma is een belangrijke regulator van intracellulair Ca2+].

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen komen tot expressie op bijna alle cellen en hebben een significant effekt op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, zoals kanker, skeletale abnormaliteiten, pijn-syndroom, enz. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd bij aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen, en hebben een belangrijke rol bij Ca2+-signalisering.

Acetylcholine (ACh) bindt op 2 membraan-proteïnen, namelijk de muscarine receptor (mAChR) en de nicotine receptor (nAChR), waarvan meerdere isoformen bestaan. ACh heeft niet-neuronale funkties, het non-neuronaal cholinerg system genaamd, in pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, ooglens-cellen en vasculair endothelium [= bedekkende cellen van bloedvaten] van het brein, dat gemedieerd wordt door Ca2+-signalisering. AChRs brengen aktivatie-signalen over in een waaier van menselijke weefsels, inclusief skelet- en gladde spieren, alle pre-ganglionische [van het CZS tot de ganglia (zenuw-knopen)] autonome zenuw-vezels, post-ganglionische [van de ganglia naar een orgaan] autonome parasympathische zenuwen, en op veel plaatsen over gans het centraal zenuwstelsel.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) heeft een ongekende etiologie en er is geen specifieke diagnostische test. De ziekte wordt grotendeels gekenmerkt door significante stoornissen van de lichamelijke aktiviteit en uitputtende vermoeidheid, en kan gepaard gaan met stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie, meer spier- en gewricht-pijn, hoofdpijn, pijnlijke keel en lymfeknopen. Het is verder geassocieerd met ontregeling van het gastro-intestinaal, cardiovasculair en immuunsysteem. Belangrijk: NK-cel dysfunktie, in het bijzonder verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit, is een courante bevinding bij M.E./CVS-patiënten. We hebben eerder ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in TRP ion-kanaal genen (TRPM3, TRPA1, TRPC4) en AChR genen (CHRM3, CHRNA10, CHRNA5 & CHRNA2) in perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten. [Marshall-Gradisnik SM, Smith P, Brenu EW, Nilius B, Ramos SB, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in transient receptor potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights. (2015) 7:1-6 /// Marshall-Gradisnik S, Smith P, Nilius B, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms in acetylcholine receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights (2015) 7: 7-20; zie links onze inleiding] Deze SNP-anomalieën in genen coderend voor TRP ion-kanalen en AChRs kunnen gewijzigde receptor-proteïnen opleveren, die mogelijks de strukturen van TRP ion-kanalen en AChR, en ook hun funkties kunnen veranderen.

Het doel van deze studie was de NK cytotoxische aktiviteit te bepalen, alsook of SNPs en hun genotypes aanwezig waren in TRP ion-kanaal en AChR genen in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten.

Individuen en methodes

[…]

Resultaten

Deelnemers

Er waren 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar) waarvan 71,79% vrouwen. Er waren 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar) waarvan 56,67% vrouwen. […] Er werden geen significante verschillen gevonden qua tellingen van witte bloedcellen tussen M.E./CVS-patiënten en de niet-vermoeide controle-groep. […]

NK-cel zuiverheid

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft NK zuiverheid-graad. De zuiverheid van de NK-cellen na isolatie en aanrijking was > 93%.

NK-cel cytotoxische aktiviteit

Er was een significant verschil voor NK cytotoxische aktiviteit tussen de groepen wat betreft de E:T [effector/target’] ratio van 25:1 [de optimale verhouding voor het bepalen van de cytotoxische aktiviteit]. M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua NK percentage lyse van doelwit-cellen (17% ± 4,68%) vergeleken met de controle-groep (31% ± 6,78%).

SNP-analyse

Van de 678 SNPs geïdentificerd in TRP ion-kanaal and AChR genen van geïsoleerde NK-cellen, waren er 11 SNPs in TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) die significant geassocieerd waren met de M.E./CVS-groep. Daarvan waren er 5 geassocieerd met TRPM3 […] terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8 […] & TRPC4 […].

Er waren 14 SNPs geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen, waarvan er 6 met CHRNA3 […] en de rest met CHRNA2 […], CHRNB4 […], CHRNA5 […] & CHRNE […].

Genotype-analyse

Er werden 16 genotypes met SNPs geïdentificeerd die significant bleken voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1). Van de als significant geïdentificeerde SNPs gingen we verder na of genotypes verschilden tussen de groepen. […] De ‘odds ratio’s [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] voor specifieke genotypes met SNPs in TRP & AChR genen in geïsoleerde NK-cellen varieerde tussen 3.13 & 11.39 voor M.E./CVS vergeleken met de niet-vermoeide controle-groep.

Bespreking

Verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit werd eerder al gerapporteerd bij M.E./CVS en de studie hier ondersteunt deze bevindingen. Het huidig onderzoek ondersteunt nieuwe bevindingen aangaande een aantal SNPs in genen coderend voor AChR en TRP varianten en genotypes van geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Een bijkomende nieuwe bevinding is de identificatie van SNPs in TRPM3 & TRPM8 bij geïsoleerde NK-cellen, suggererend dat er TRPM3 & TRPM8 receptoren gelokaliseerd zijn op NK-cellen.

We rapporteren een significante reductie van de NK-lyse bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de niet-vermoeide controles. De rol van TRP ion-kanalen bij Ca2+-signalisering, en aangeboren en adaptieve immuun-cellen wordt meer en meer gedocumenteerd. De TRPs bleken TRP kation-kanalen [TRPC worden geaktiveerd door fosfolipase-C, membraan enzymen die fosfolipiden splitsen] en TRP-melastatine [TRPM; melastatine is een vermeende tumor-suppressor] subfamilies, voornamelijk TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPM2, TRPM4 & TRPM7 tot expressie te brengen. Deze kanalen zijn niet-selektief en doorlaatbaar voor calcium. Ca2+ speelt een sleutelrol bij fusie van lytische granules in NK-cellen, alsook bij het verzekeren dat lytische granules zich naar de immuun-synaps [de interface tussen een antigeen-presenterende cel of doelwit-cel en een lymfocyt zoals een effector-T-cel of NK-cel] verplaatsen om perforine en granzymes af te geven om doelwit-cellen te doden. Rho GTPase Miro [Mitochondriaal Rho GTPase; een enzyme met een belangrijke rol bij mitochondriaal transport, betrokken bij mitochondriale homeostase en apoptose] biedt een link tussen de mitochondrieën en de microtubules, waar het de Ca2+-afhankelijke stopzetting van de mitochondriale motiliteit medieert. Aangezien Miro mitochondriale polarisatie [ontstaan/opbouw van een spanningsverschil over de mitochondriale membranen] modificeert, zou het ook transport van lytische granules naar de immuun-synaps kunnen veranderen, alsook de lytische funktie, te wijten aan de modulatie door de Ca2+-concentratie in het cytosol via TRP-melastatine en AChR genen. Het is duidelijk: mitochondrieën spelen een belangrijke rol bij de werking van NK-cellen. De ontdekking dat mitochondrieën een waaier aan AChR-subtypes tot expressie brengen, inclusief nicotine-α3, die differentieel tot expressie komen naar gelang het weefsel-type, suggereert dat nAChRs een impact kunnen hebben op de mitochondriale funktie en regulering van oxidante stress. Interessant: we rapporteerden eerder een significante daling van de ‘respiratory burst’ [of ‘oxidative burst’; snelle afgifte van reaktieve zuurstof molekulen; speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem] funktie van neutrofielen bij M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW, Staines DR et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8:1; zie link onze inleiding]

TRPM2 en TRPM3 mobiliseren Ca2+, waarbij de laatste de Ca2+-signalisering bleek te mediëren voor polarisatie van cytolytische granules en degranulatie. [Na de herkenning van doelwit-cellen door NK-cellen worden NK-cel receptoren geaktiveerd, wat helpt bij de vorming van een immuun-synaps, waarbij cytolytische granules die perforine en granzymes bevatten, in dezelfde richting worden geleid.] […] Interessant is ook dat gelijkaardige bevindingen voor NK-cel funkties werden gerapporteerd in de M.E./CVS-research [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One. (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012)10: 88 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81], wat mogelijks suggereert dat de genotype-wijzigingen die hier werden gerapporteerd voor TRPM3 ook een gelijkaardige rol kunnen spelen bij polarisatie en degranulatie van cytolytische granules.

Van de 678 SNPs die werden onderzocht, waren er 11 varianten van TRP ion-kanalen en 14 varianten van AChRs die significant geassocieerd waren met M.E./CVS vergeleken met niet-vermoeide controles. De variante TRP-SNPs waren gelegen in de gen-sequentie van 2 [kanonieke] TRP ion-kanalen (TRPC2 & TRPC4) en 2 melastatine TRP ion-kanalen (TRPM3 & TRPM8). We rapporteren ook variante SNPs in genen coderend voor 2 van de CHRM3receptoren, 2 CHRM1receptoren, 6 CHRNA3receptoren, 3 CHRNA2receptoren en 1 CHRNA5receptor, alsook 1 CHRNB4-receptor en 1 CHRNE-receptor.

Deze research hier rapporteert significante SNP associaties van genotypes van AChRs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Lymfocyten brachten muscarine en nicotine AChRs tot expressie, T- en B-cellen en monocyten brachten alle 5 de subtypes van mAChRs (M1-M5) tot expressie, terwijl nAChRs werden gevonden voor α2-α7, α9, α10, β2 & β10 subunits. Lymfocyten maken deel uit van een cholinerg systeem dat onafhankelijk is van cholinerge zenuwen, wat resulteert in de regulering van de immuun-funktie. AChR-agonisten bleken lymfocyten-cytotoxiciteit te versterken en hun intracellulair cyclisch guanosine-monofosfaat [cGMP; een cyclisch nucleotide met een belangrijke rol in verscheidene biochemische processen in de cel, een zgn. secundaire boodschapper voor intracellulaire signaal-overdracht] en inositol-1,4,5-trifosfaat [IP3; secundaire boodschapper bij signaal-overdracht en lipiden-signalisering] te verhogen, wat suggereert dat het lymfocyten cholinerg systeem betrokken is bij de regulering van de immuun-funktie via AChRs gekoppeld met fosfolipase-C via veranderingen in Ca2+. Er is onderzoek dat het belang heeft benadrukt van varianten bij het beïnvloeden van gen-transcripten door het veroorzaken van alternatieve ‘splicing’ [splicing = tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.], wat resulteert in anomalieën in het boodschapper-RNA en translatie-produkten. We identificeerden ook SNPs en een genotype in CHRNE bij M.E./CVS-patiënten. Het is interessant dat deze SNP gelegen is in het 3’ onvertaald gebied [‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie], waar een bindingplaats is voor regulerende proteïnen alsook voor microRNAs (miRNAs). Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript. Onze eerdere research vond significante verschillen qua NK cytotoxische aktiviteit, alsook qua miRNAs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269]

[Uitleg voor experten =>] Onderzoeken hebben gesuggereerd dat alternatieve ‘splicing’ in de coderende en ook niet-coderende sequenties significante onverwachte resultaten wat betreft het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. Het ‘splicen’ van genetische varianten gelegen in de exonen & intronen en de assemblage van het spliceosoom [complexe cellulaire ‘machine’ met een rol bij gen-expressie] dragen allemaal bij tot het ‘splicing’-mechanisme voor het correct coderen van een proteïne-sequentie. Bovendien zijn ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] en ‘silencers’ [transcriptie-regulerende factoren die zorgen voor verlaging of volledige onderdrukking van de vorming van RNA] gelegen in de exonen of intronen een integraal deel bij de herkenning van de correcte exon-sequentie. Belangrijk is dat intronen in staat zijn aktieve spliceosomen te genereren, wat aanleiding geeft tot alternatieve ‘splicing’. Gen 80036 (TRPM3) is geassocieerd met calcium-binnenkomst en calcium-opslag depletie via verschillende isoformen die geïdentificeerd werden via alternatieve ‘splicing’. Een gebied dat onontbeerlijk is voor kanaal-funktie [‘indispensable for channel function’; ICF] is een gebied van 18 aminozuren waarvan de afwezigheid zorgt dat de kanalen funktioneel niet in staat zijn om calcium-binnenkomst te mediëren, en dat bleek te ontbreken in een TRPM3 variant. Co-expressie van deze TRPM3 ICF varianten met funktionele TRPM3 ion-kanalen toonde daarenboven verstoorde calcium-mobilisatie. Aangezien TRPM3 ICF varianten overvloedige expressie vertonen in vele weefsels en cel-types, en 15% van alle TRPM3 isoformen uitmaken, kan de expressie op NK-cellen een mogelijke verklaring bieden voor gedaalde cytotoxische aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten. Bepaalde ‘splice’-varianten, zoals TRPM3α1, kunnen mogelijks begunstigd zijn, culminerend in een gedaalde NK-cel cytotoxische respons en hitte-detektie, inclusief ontregeling van thermoregulerende responsen, nociceptie en transmissie van pijn, zoals centrale en perifere pijn-perceptie. Bovendien bleek TRPM8 ook geaktiveerd bij koude en schadelijke stimuli, wat suggereert dat de hier gerapporteerde genotype-wijzigingen overéénkomen met de klinische presentatie van thermoregulerende responsen, nociceptie, en transmissie van centrale en perifere pijn bij M.E./CVS-patiënten.

Onze resultaten suggereren dat SNP-varianten en genotypes gerapporteerd in NK-cellen wellicht niet exclusief zijn voor dit type immuun-cel. AChRs en TRP ion-kanaal receptoren komen overvloedig voor op meerdere cel-types en controleren andere funkties in lichamelijke systemen. Ca2+-signalisering in de context van TRP ion-kanalen en AChR-funktie is vitaal voor de werking van het centraal zenuwstelsel, en er is veel variëteit qua nicotine receptoren die tot expressie komen in dierlijke en menselijke immuun-cellen. Op te merken valt dat nAChRs betrokken bleken bij het wakker worden, slaap en vermoeidheid, alsook de funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie, die allemaal klinische symptomen bij M.E./CVS zijn.

Besluit

In deze studie identificeerden we, voor de eerste keer, SNPs in genen coderend voor TRPM3 en TRPM8 ion-kanalen in geïsoleerde NK-cellen. We identificeerden ook talrijke SNPs in nAChRs samen met andere TRP-kanalen in geïsoleerde NK-cellen, wat de belangrijke rol van het niet-neuronale ACh systeem bij NK-cel funktie zou kunnen verklaren. Anomalieën in genotypes van TRP ion-kanalen en AChRs suggereren dat veranderd calcium een belangrijke funktionele consequentie kan zijn, niet enkel voor NK-cellen maar ook afhankelijk van weefsel-type, vatbaarheid of voorbestemdheid voor M.E./CVS.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.