M.E.(cvs)-wetenschap

september 22, 2018

Biomerker voor M.E.(cvs) d.m.v. ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:43 am
Tags: , , , , , ,

‘Single’ cel Raman spectroscopie (SCRS – Raman is een Indiaans fysicus) is een niet-invasieve technologie waarbij geen labeling nodig is en die analyse van individuele levende cellen toelaat ‘in vivo’. Spectroscopie is een wetenschappelijke techniek om stoffen te onderzoeken aan de hand van hun spectrum, een beschrijving van de in een signaal voorkomende golflengtes en hun sterkte. Dit wordt dikwijls gebruikt in de scheikunde. Een ‘single’ cel Raman spectrum omvat gewoonlijk 1.000 Raman-banden die informatie geven over de cel (bv. over nucleïnezuren, proteïnen, koolhydraten en lipiden) en een weerspiegeling zijn van cellulaire genotypes, fenotypes en fysiologische toestanden. Een Raman-spectrum fungeert als een molekulaire/strukturele ‘fingerprint’ van een individuele cel, waardoor het mogelijk wordt verscheidene cellen te identificeren/differentiëren zonder voorafgaande kennis over de cellen. Een belangrijk nadeel van SCRS is het feit dat spontane Raman-signalen van nature zwak zijn…

Monochromatisch licht (één golflengte), gewoonlijk van een laser interageert met de molekulaire vibraties, herschikkingen van atomen/molekulen of excitaties, waardoor de energie van de laser-fotonen (fotonen zijn elementaire deeltjes waaruit licht en alle andere elektromagnetische straling bestaat) wordt verschoven. Deze verschuiving geeft informatie over de vibraties in het systeem. De zgn. Raman ‘scattering’ (verstrooing/verspreiding) of het Raman effekt is de niet-elastische (de kinetische energie van een partikel blijft niet behouden) ‘scattering’ van een foton door molekulen waarbij het wordt geëxciteerd tot een hoger energie-niveau. Wanneer fotonen door een atoom of molekule worden verstrooid, is dat meestal ‘elastisch’: de verspreide fotonen hebben dezelfde energie (frequentie & golflengte) als de verstorende fotonen. Een klein deel (ca. 1 op 10 miljoen) wordt niet-elastisch verstrooid door een excitatie (frequentie en energie is anders en gewoonlijk lager dan die van de veroorzakende fotonen).

Het gebruik van deze techniek in onderstaande piloot-studie gaf (weerom) aanwijzingen voor metabole stoornissen bij M.E.(cvs).

————————-

Analyst (Pre-print augustus 2018)

A new approach to find biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CVS/ME) by single-cell Raman micro-spectroscopy

Jiabao Xu (1), Michelle Potter (2), Cara Tomas (3), Jo Elson (3), Karl J. Morten (2), Joanna Poulton (2), Ning Wang (4), Hanqing Jin (4), Zhaoxu Hou (4) & Wei E. Huang (1)

1. Department of Engineering Science, University of Oxford, Begbroke Science Park, Woodstock Road, Oxford, OX5 1PF, United Kingdom

2. Nuffield Department of Women’s and Reproductive Health, University of Oxford, the Women Centre, John Radcliffe Hospital, Headley Way, Headington, Oxford, OX3 9DU, United Kingdom

3. Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, United Kingdom

4. Mathematical Institute, University of Oxford, Andrew Wiles Building, Radcliffe Observatory Quarter, Woodstock Road, Oxford, OX2 6GG, United Kingdom

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) genaamd, is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door lichamelijke en mentale uitputting. Er werd onderzoek verricht naar mitochondriale en energetische dysfunktie bij CVS-patiënten omwille van een kenmerkend verband met vermoeidheid; er werd echter nog geen consistent besluit getrokken. ‘Single’ cel Raman spectra (SCRS) zijn label-vrije biochemische profielen, die fenotypische ‘fingerprints’ van individuele cellen aangeven. In deze studie pasten we een nieuwe benadering op basis van ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om ρ0 cellen die mitochondriaal DNA (mtDNA) missen en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te onderzoeken van CVS-patiënten en gezonde controles. De resultaten van de experimenten tonen dat Raman-banden geassocieerd met fenylalanine in ρ0 cellen en PBMCs van CVS-patiënten significant hoger waren dan in het ‘wild type’ model en bij gezonde controles. Opmerkenswaardig is dat er ook een toename van de intensiteiten van Raman fenylalanine banden werd gezien bij CVS-patiënten. Aangezien gelijkaardige veranderingen werden gezien in het ρ0 cel model met een gekende deficiëntie in de mitochondriale respiratoire keten alsook bij CVS-patiënten, suggereren onze resultaten dat de stijging qua cellulair fenylalanine verband kan houden met mitochondriale/energetische dysfunktie in beide systemen. Interessant is dat fenylalanine kan worden gebruikt als een potentiële biomerker voor de diagnose van CVS d.m.v. SCRM. Een ‘machine-learning’ klassificatie-model bereikte een accuraatheid van 98% wat betreft het correct toewijzen van Raman-spectra aan de CVS- of de controle-groep. SCRM gecombineerd met een ‘machine-learning’ algoritme heeft daarom het vermogen om een diagnostisch instrument voor CVS te worden.

Inleiding

[…] Het blijft een uitdaging voor artsen en researchers, en een onvolledig gekarakteriseerde ziekte, ten dele omwille van de controversiële definitie, pathogenese en diagnose. Daarom is het vinden van potentiële biomerkers van groot belang voor het begrijpen van de ziekte en het ontwikkelen van een doelgerichte behandeling.

Mitochondrieën bleken van groot belang voor CVS-onderzoek omwille van nieuw bewijsmateriaal voor mitochondriale dysfunktie als een vermoedelijk biologisch mechanisme voor vermoeidheid. De onderliggende hypothese is dat vermoeidheid en andere vergezellende symptomen ten dele te wijten zijn aan een verstoord energie-metabolisme op cellulair niveau, dat grotendeels wordt bepaald door mitochondrieën als energie-fabriek en z’n ATP-produktie. Het ATP-profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd aangewend als een diagnostisch instrument voor CVS maar de resultaten waren echter controversieel. Meerdere studies hebben gedaald ATP-niveau getoond in patiënten-groepen [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxid Redox Signal. (2013) 19: 1855-60], terwijl andere geen verschillen konden detekteren of verrassend genoeg een verhoogde energie-produktie vonden bij CVS-patiënten [bv. Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93].

Hier, in een poging om mitochondriale dysfunktie en CVS-pathogenese te linken, probeerden we ‘single’ cel Raman-spectra (SCRS) te analyseren en universele biomerkers in cellen te identificeren. Een SCRS kan worden beschouwd als een intrinsieke chemische ‘fingerprint’ van een cel met zeer doorslaggevende Raman-banden voor belangrijke cellulaire bouwstenen zoals proteïnen, aminozuren, lipiden en fosfolipiden, en koolhydraten. Daarom zijn SCRS biochemische profielen van individuele cellen die fysiologische toestanden en metabole veranderingen weerspiegelen. Door de rijke en semi-kwantitatieve metabole informatie van afzonderlijke cellen, kan SCRS worden gebruikt om het cellulair metabolisme te beschrijven en ziekte-gerelateerde biomerkers te tonen.

In deze studie gebruikten we ten eerste ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) om fenotypische profielen van menselijke ρ0 cel-lijnen volledig ontdaan van mitochondriaal DNA (mtDNA) te bekomen om het effekt te bestuderen van ernstige mitochondriale dysfunktie. Ten tweede vergeleken we SCRS van PBMCs van 5 CVS-patiënten en 5 gezonde controles als piloot-studie om potentiële biomerkers voor CVS-diagnose te vinden. De vergelijking van de 2 resultaten biedt inzichten omtrent het verband van mitochondriale dysfunktie met de pathofysiologie van CVS en toont een coherente en consistente benadering voor de diagnose van de ziekte.

Experiment

Cel-cultuur, generatie van WT cybriden en PicoGreen-kleuring

De gebruikte 143B ρ0 cel-lijn zonder mtDNA […] wordt veelvuldig gebruikt bij studies die het pathogeen effekt van mtDNA-mutaties onderzoeken. […] De wild-type (WT) lijn werd gegenereerd door 143B ρ0 cellen te fuseren met normaal mtDNA […]. Het ‘herbevolken’ van de ρ0 lijn is een beter controle-systeem dan de originele 143B wild-type cellen […].

De aanwezigheid van mtDNA werd bevestigd d.m.v. kleuring met PicoGreen. […] Het mtDNA ‘copy-number’ van de ρ0 cellen en de WT cellen werd ook bepaald via ‘real-time’ PCR (vergelijking van celkern en mitochondriaal DNA). […]

ATP-metingen van WT en ρ0 cellen

[…]

Ethiek

[…]

Isolatie van PBMCs uit bloed-stalen

[…] Er werden morfologisch 2 types cellen met verschillende groottes (5-7 µm & 15-20 µm) in de PBMC-fractie gezien. Enkel de cellen met grotere afmetingen werden geselekteerd voor de Raman-experimenten na vergelijking van de resultaten (gegevens niet getoond), om de heterogeniteit door de verschillende cell-types te minimaliseren. Er dienen verdere experimenten te worden gedaan om de identiteit van de cellen te bevestigen (nu geloven we dat het monocyten zijn, op basis van de cel-populatie en grootte).

Metingen van ‘single’-cel Raman-spectra (SCRS)

[…] De gefixeerde cellen werden op een specifiek behandeld microscopisch plaatje gelegd (dat geen achtergrond Raman-signaal geeft). SCRS m.b.v. een Raman-microscpop en een 532 nm […] laser. […] Spectraal bereik: 330 tot 1900 cm-1 […] 5 s per spectrum, 10 spectra per cel & 20-30 ‘single’ cellen per conditie.

Voor-verwerking en analyse van Raman-gegevens

[…] Kwantificering van intracellulaire bio-molekulen via integratie van de corresponderende Raman-banden in SCRS. Banden geassocieerd met fenylalanine tussen 993-1013 cm-1 & 1022-1036 cm-1 werden gebruikt om de intracellulaire concentratie te kwantificeren. […]

‘Machine-learning’ klassificatie-model

Er werd een ‘machine-learning’ [wetenschappelijke discipline over het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen op basis van empirische gegevens (bv. van sensoren of uit databases; ook wel ‘data-mining’] klassificatie-model geconstrueerd op basis van SCRS van 5 CVS-patiënten en 5 controles (80 & 126 SCRS respectievelijk). Er werd een niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM [een ‘binaire klassificeerder’; wijst, aan de hand van een aantal kenmerken, objecten toe aan één van twee klassen – daarvoor moet ze eerst een numeriek model van deze objecten maken als punten in een wiskundige struktuur; in de training (inoefening) -fase brengt de SVM op basis van een verzameling van voorbeelden, waarvan is aangegeven tot welke klasse ze behoren, een scheiding aan die de twee klassen zo goed mogelijk van elkaar scheidt (die scheiding is een hyper-vlak); nadien kan de SVM dan voor een nieuw te klasseren object beslissen tot welke klasse het behoort door te kijken langs welke kant van het hyper-vlak het corresponderende punt in de ruimte ligt]) algoritme gebruikt om het model op te bouwen […]. Er werden niet-lineaire hyper-vlakken gebruikt om de gegevens te scheiden. ‘Leave-one-out’ kruis-validatie [kruis-validatie = techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] (LOOCV [zie hieronder]) werd aangewend om het model te evalueren en de sensitiviteit werd voor elke conditie en globaal berekend.

Extracellulaire flux analyse

De OXPHOS van PBMCs werd bepaald d.m.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser [zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’] […] Daarbij wordt de zuurstof-consumptie (OCR) opgenomen na opéénvolgende toediening van 1 μM oligomycine, 3 μM carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)-fenylhydrazone (FCCP), en een combinatie van 0,5 μM rotenon en 0,5 μM antimycine-A. […]

Resultaten en bespreking

Cellen zonder mtDNA hebben specifieke ‘single’-cel Raman spectra (SCRS)

PicoGreen kan specifiek worden aangewend om mitochondriaal DNA (mtDNA) te kleuren in levende cellen. Na incubatie met de kleurstof vertoonden ρ0 cellen waarin opnieuw wild-type mtDNA werd geïntroduceerd (WT cellen) helder gekleurde cel-kernen omgeven door talrijke heldere cytoplasmatische spikkels, terwijl ρ0 cellen slechts helder gekleurde cel-kernen zonder de omringende spikkels vertoonden, wat de depletie van mtDNA in ρ0 cellen bevestigt.

Aangezien mitochondrieën de primaire energie-fabriek van de meest eukaryote cellen zijn en de cel bevoorraden met metabole energie onder de vorm van ATP, hebben we de ATP-produktie van WT cellen en ρ0 cellen gemeten bij 50.000 of 75.000 cellen. Verrassend was dat bij beide cel-aantallen, ρ0 cellen gelijkaardige hoeveelheden ATP aanmaakten in vergelijking met WT cellen, als de toegevoegde glucose-concentraties hoog waren (11 mM & 25 mM). Aan de andere kant was de ATP-concentratie in ρ0 cellen significant lager dan in WT cellen bij lage glucose-concentraties (0 mM tot 5 mM). Onze resultaten suggereren dat, als er voldoende glucose is, ρ0 cellen zich kunnen aanpassen om ATP-produktie te stimuleren via niet-mitochondriale glycolyse ter compensatie voor de slechte mitochondriale respiratoire keten. Wanneer de glucose laag en ATP-produktie uit glycolyse beperkt is, is de WT cel-lijn in staat om switchen naar een mitochondriale manier van ATP-produktie gebruikmakend van de respiratoire keten via elektronen-transport gekoppelde fosforylatie (ETCP). De ρ0 cellen zijn echter niet in staat de ETCP te gebruiken omwille van de defekte mitochondrieën.

We pasten ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om de WT cellen en de ρ0 cellen bij hoog glucose te onderzoeken en de verschillen qua bio-energetisch mechanisme (ondanks een gelijkaardige ATP-aanmaak in de 2 cel-lijnen) te verklaren. […] Er werd een relatief lage standaard-deviatie gezien omwille van de beperkte heterogeniteit bij het in vitro bestuderen van de cel-lijnen. Vergeleken met WT cellen, vertonen ρ0 cellen een verschillend spectraal patroon in het ‘fingerprint’-gebied van hun SCRS (600-1.800 cm-1), wat typisch kan worden gebruikt als een fenotypische ‘fingerprint’ van cellen die de belangrijkste biochemische informatie bevatten.

Er werd dan ongecontroleerde ‘principal component analysis’ (PCA [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.]) aangewend om de vele dimensies van SCRS (omwille van de aanwezigheid van meer dan 1.500 Raman-banden) te reduceren. Een PCA-grafiek […] illustreert 2 duidelijk afscheidbare clusters die de WT cellen en ρ0 cellen weergeven. Er werd een diagram opgesteld voor de karakterisatie van de belangrijke Raman-banden. Het meest prominente kenmerk werd gezien bij 1003 cm-1, wat kan worden toegeschreven aan de aromatische ring [benzeen-ring; zes koolstof-atomen die in een vlakke ring liggen] van fenylalanine. Andere banden gerelateerd met fenylalanine bleken ook een grote bijdrage te leveren, inclusief 1.609 […], 1.030 […] en 618 […] cm-1. Alle banden gerelateerd met fenylalanine waren hoger in de ρ0 cellen vergeleken met de WT cellen, wat een belangrijke rol van het aminozuur fenylalanine in het metabolisme van cellen met mitochondriale dysfunktie aangeeft.

Andere verschillen omvatten banden rondom 1.658 […] en 1.440 […] cm-1, die beide hoger zijn in WT cellen t.o.v. ρ0 cellen. Dit suggereert dat, ondanks een hogere accumulatie van cellulair fenylalanine, ρ0 cellen een globale gedaalde intracellulaire concentratie van proteïnen lipiden te wijten aan een verstoord metabolisme hebben. Aangezien fenylalanine alleen wellicht onvoldoende is om het pathomechanisme te karakteriseren, dienen meer biomerkers te worden geïdentificeerd om mitochondriale dysfunktie simultaan en meer betrouwbaar te identificeren.

PBMCs van CVS-patiënten kunnen worden onderscheiden via één enkele Raman-merker

[…] Aangezien fenylalanine een potentiële biomerker in ρ0 cellen bleek, werd gehypothiseerd dat het een geschikte kandidaat kan zijn om bij CVS-patiënten – waarvan wordt gedacht dat ze een gelijkaardige bio-energetische dysfunktie hebben – te onderzoeken. Van de 5 patiënten vertoonden er 4 Raman-spectra met verhoogde fenylalanine-band op 1.003 cm-1 (CVS 1-4), terwijl de andere (CVS 5) een gelijkaardige intensiteit vertoonde i.v.g. met de controles. Door het gemiddelde te maken van 80 SCRS van de patiënten en 126 spectra van de controles, is het zichtbaarder dat de fenylalanine-band een uitgesproken stijging in de cellen van patiënten vertoont.

PCA van SCRS van 10 stalen toonde een aanzienlijke afscheiding tussen de CVS- en de controle-groep. Terwijl CVS 1-4 kleinere ellipsoïden vertoonden met weinig overlapping met de controles, had CVS 5 een hogere ‘single’ cel verspreiding en overlapte grotendeels met de ellipsoïden van de controles; wat correleert met de observatie aangaande fenylalanine. Om te verifiëren dat de afscheiding tussen de groepen in de PCA-clustering toe te schrijven was aan fenylalanine, zetten we het Raman golfgetal [hoeveel golven (golflengtes) per lengte-eenheid] uit tegenover de componenten die de grootste afscheiding tussen de groepen toonden. Raman-banden rond 1.003 en 1.030 cm-1 werden geïdentificeerd voor het beschrijven van de maximum varianties […]. De intracellulaire concentratie van fenylalanine werd semi-gekwantificeerd door het integreren van de Raman-banden op 1.003 en 1.030 cm-1, respectievelijk. Beide signatuur-banden voor fenylalanine bleken significant hoger bij de patiënten t.o.v. controles (p < 0.0001).

Eerdere research ondersteunt de mogelijkheid dat het pathomechanisme van CVS gelinkt is met veranderingen qua aminozuren. Er werden reducties van de concentraties van bepaalde aminozuren, inclusief fenylalanine, in het serum en urine van CVS-patiënten gerapporteerd [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta. (2012) 413: 1525-31 /// Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Fluge Ø, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight. (2016) 1: e89376]. Deze bevindingen ondersteunen een mogelijk metabool defekt verbonden met het aminozuren-metabolisme bij CVS-patiënten, d.m.v. de analyse van de metabolomica van biologsiche vloeistoffen van de patiënten. Ons werk is, naar ons weten, het eerste dat melding maakt van de veranderingen in ‘single’ perifere bloedcellen van CVS-patiënten. Onze resultaten suggereren dat cellen van patiënten meer aminozuren (bv. fenylalanine) kunnen accumuleren, wat resulteert in een vermindering in de lichaamsvochten die wordt gezien in andere studies. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een inductie van secundaire redding-mechanismen om intracellulair meer aminozuren te accumuleren en een normale ATP-produktie te behouden in de metabool dysfunktionele patiënten-cellen [zie Fluge Ø, Mella O et al. hierboven]. Verder toont onze bevinding de impact van fenylalanine in zowel ρ0 cellen zonder mtDNA en bloedcellen van CVS-patiënten, die mitochondriale defekten ook kan linken met CVS. Niettemin: hoe de gestegen fenylalanine-waarden in PBMCs in verband staan met andere weefsels bij de patiënten is nog onduidelijk. Raman-benaderingen die fenotypische spectra kunnen leveren van weefsels zou zeer nuttig kunnen zijn bij toekomstige onderzoeken.

Er werd een extracellulaire flux analyse uitgevoerd bij 4 CVS-patiënten die het meest ongelijk waren van de controles wat betreft SCRS-resultaten (CVS 1-4), om te onderzoeken of er een correlatie bestaat tussen abnormaliteiten qua oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) en de SCRS-analyse wanneer PBMCs geïncubeerd worden in laag- en hoog-glucose. Twee van de patiënten hadden een zeer lage OXPHOS in beide condities (CVS 2 & 4) en de andere 2 hadden veel hogere OXPHOS-profielen (CVS 1 & 3). Hoewel bij de OXPHOS-analyse er mitochondriale deficiëntie uitgesproken werd gedetekteerd in 2 van de 4 patiënten, was SCRS van PBMCs in staat bij alle 4 de abnormaliteiten op te pikken. Niettemin is het staal patiënten en controles klein als we de mogelijks grote heterogeniteit bij CVS-individuen in acht nemen. Onze resultaten dienen als een piloot-studie om het potentieel te verkennen van SCRM als instrument om biomerkers voor CVS te identificeren. Er wordt een studie op grotere schaal voorbereid om de resultaten van dit werk te consolideren.

‘Machine-learning’ modellen kunnen CVS-patiënten met succes en met hoge accuraatheid klassificeren

Bij Raman-benaderingen is, naast het afleiden van kenmerken om informatieve biomerkers te vinden, de klassificatie gebaseerd op spectra dikwijls wenselijk voor diagnostische doeleinden. ‘Machine-learning’ benaderingen zijn gewoonlijk geschikt om de gecompliceerde Raman gegevens-set op te delen in componenten. Niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM) [uitgelegd bij ‘Experiment’] is een gesuperviseerd [input en output duidelijk gedefinieerd] leer-algoritme […] om verschillende klassen te scheiden die d.m.v. lineaire klassificatie niet te scheiden zijn. Er werd een klassificatie-model ingeoefend via niet-lineaire SVM om het onderscheid te maken tussen de CVS-groep en controle-groep op basis van hun SCRS (80 SCRS voor de CVS-groep, 126 SCRS voor de controle-groep). Er werd ‘leave-one-out’ kruis-validatie gebruikt om het model te evalueren door éénder welke van 205 spectra te gebruiken om het model te trainen en dan te testen of het model het ene weggelaten spectrum correct kan klassificeren. Dit model was in staat de CVS-groep met succes te klassificeren met een sensitiviteit van 96,3% (77 van de 80) en de controle-groep met een sensitiviteit van 99,2% (125 van de 126). De lagere sensitiviteit die wordt gezien voor de patiënten-groep kan worden verklaard door de aanwezigheid van hogere heterogeniteit bij de CVS-patiënten. Er werd een totale accuraatheid van 98,1% bereikt op basis van 206 Raman-spectra. Opmerkenswaardig: bij een groter wordend staal en aantal Raman-spectra om de referentie-database op te bouwen, kunnen klassificatie-modellen met betere deugdelijkheid worden bereikt. Aangezien één Raman-spectrum binnen luttele seconden kan worden verkregen, kan één patient-staal bestaande uit meerdere spectra en meerdere cellen worden gekarakteriseerd en geklassificeerd binnen enkele minuten, wat een enorm potentieel en haalbaarheid in de klinische praktijk impliceert.

Besluiten

Deze studie werd uitgevoerd om de haalbaarheid van of ‘single’ cel Raman-analyse te evalueren bij de detektie van biomerkers gerelateerd met mitochondriale dysfunktie en CVS. Zodoende identificeerden we een verhoogde intracellulaire concentratie van het aromatisch aminozuur fenylalanine [essentieel aminozuur dat nodig is voor diverse biochemische processen; onder andere voor de aanmaak van de neurotransmitters dopamine, adrenaline en noradrenaline] en toonden dat het kan worden gebruikt als een potentiële biomerker in ρ0 cellen zonder mitochondriaal DNA, alsook in perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS-patiënten. Bovendien gaf een ‘machine-learning’ model een accuraatheid van 98,1% correct te klassificeren van patiënten en controles op basis van hun Raman-spectra. De combinatie van Raman-biomerkers en klassificatie-modellen zou kunnen leiden tot verbeteringen omtrent het begrijpen van CVS-pathogenese en het potentieel hebben te worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor CVS.

Advertenties

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

augustus 26, 2018

Mogelijke rol van mest-cellen bij inflammatie in de hypothalamus bij M.E.(cvs)

We hadden in het op deze pagina’s al over de suggestie dat mest-cellen – mastocyten; een type immuun-cellen die een rol spelen bij allergie en overgevoeligheid, ook betrokken bij wond-heling en verdediging tegen pathogenen – mogelijks betrokken zijn bij de pathogenese van M.E.(cvs) en hoe het gebruik van natuurlijke flavonoïden, organische verbindingen uit planten, bepaalde symptomen zouden kunnen verlichten (zie Hersen-mist, inflammatie – behandeld met luteoline?’).

Anderen opperden dat mest-cel aktivatie betrokken kan zijn bij ander symptomen die voorkomen bij M.E.(cvs) (zie Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS?)’).

Theoharis C. Theoharides van het Laboratorium of Molekulaire Immunofarmacologie, Departement Immunologie van de ‘Tufts University School of Medicine’ in Boston is zowat dé specialist op het gebied van mest-cellen.

Prof. Theoharides heeft een aantal patenten aangevraagd en heeft het daarbij over “samenstellingen met anti-inflammatoire effekten die het resultaat zijn van de aktivatie en daaropvolgende degranulatie van mest-cellen met sekretie van inflammatoire molekulen”. Die omvatten “één of meerdere flavonen of flavonoïd-glycosiden, een sterk gesulfateerd proteoglycan, een ongerafineerde olijfpitten-extract […], een hexosamine-sulfaat zoals D-glucosamine-sulfaat, S-adenosylmethionine, een histamine-1 receptor antagonist, een histamine-3 receptor agonist, een antagonist van de werking van CRH, een lange-keten onverzadigd vetzuur, een fosfolipide, Krill-olie [omega-3 vetzuren], een polyamine, glutiramer-acetaat en interferon”. Onderzoeken daaromtrent lopen… Zoals eerder meegegeven creëerde Theoharides (bij het bedrijf Algonot Inc.) flavinoïd-rijke supplementen (zoals bv. Neuroprotek dat luteoline, quercetine en rutine bevat). Er zijn een aantal aanwijzingen voor een mogelijke werking maar nog geen échte wetenschappelijk bewijzen…

Dit overzicht geeft de context voor en de hypothese over het mogelijk ontstaan van hersen-inflammatie door toedoen van mest-cellen. De stukken over ‘Metabole onregelmatigheden’, ‘Het verband tussen M.E./CVS en metabole ziekte’ en ‘Mitochondriale dysfunktie’ laten we nu achterwege omdat dit hier al meermaals aan bod is gekomen. Als de geïnteresseerde lezer alsnog de tekst wil lezen, kan men deze aanvragen…

————————-

Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (augustus 2018)

Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome – Metabolic Disease or Disturbed Homeostasis due to Focal Inflammation in the Hypothalamus?

Erifili Hatziagelaki, MD, PhD, Maria Adamaki, PhD, Irene Tsilioni, PhD, George Dimitriadis, MD, Theoharis C. Theoharides, MS, MPhil, PhD, MD

Second Department of Internal Medicine, Attikon General Hospital, Athens Medical School, Athens, Greece (EH, MA, GD)

Laboratory of Molecular Immunopharmacology and Drug Discovery, Department of Immunology, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA (IT, TCT)

Sackler School of Graduate Biomedical Sciences, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA (TCT)

Departments of Internal Medicine and Psychiatry, Tufts University School of Medicine and Tufts Medical Centre, Boston, MA, USA (TCT)

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe ziekte die wordt gekenmerkt door invaliderende vermoeidheid, die voor minstens 6 maanden aanhoudt, samen met malaise, hoofdpijn, slaap-stoornissen en cognitieve problemen, met een ernstige impact op de levenskwaliteit. Een significant percentage M.E./CVS-patiënten krijgt geen diagnose, voornamelijk door de complexiteit van de ziekte en het gebrek aan betrouwbare objectieve biomerkers. M.E./CVS-patiënten vertonen een verminderd metabolisme en de ernst van de symptomen lijkt direct gecorreleerd met de graad van de metabole reductie die wellicht per individu verschilt. De precieze pathogenese is echter nog onbekend, wat de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen bemoeilijkt. Het M.E./CVS-fenotype bleek geassocieerd met abnormaliteiten qua energie-metabolisme, klaarblijkelijk te wijten aan mitochondriale dysfunktie, in afwezigheid van mitochondriale ziekten, resulterend in een gedaald oxidatief metabolisme: mitochondrieën kunnen verder bijdragen tot de M.E./CVS-symptomatologie door de extracellulaire sekretie van mitochondriaal DNA, dat kan fungeren als een ‘aangeboren’ pathogen en een auto-inflammatoire toestand kan creëren in de hypothalamus. We stellen voor dat stimulatie van hypothalamische mest-cellen door neuro-immune pathogene en stress-triggers uit de omgeving microglia aktiveert, leidend tot focale inflammatie in het brein en tot verstoorde homeostase. Dit proces zou het doelwit kunnen worden voor de ontwikkeling van nieuwe doeltreffende behandelingen.

Inleiding

[…]

Er bleek een aantal mechanismen en molekulen betrokken bij de pathogenese van M.E./CVS. Auto-immune en metabole mechanismen lijken belangrijke rollen te spelen in de pathophysiologie van M.E./CVS. Neuro-immune en neuro-endocriene processen zouden ook betrokken maar die zijn nog grotendeels onbekend. Er werden klinische en sub-klinische virale infekties verdacht maar nooit bevestigd, als een mogelijke risico-factor voor de ontwikkeling van M.E./CVS. De betrokkenheid van neuro-inflammatie van de hersenen werd gesuggereerd zonder enig specifiek pathogeen mechanisme. Hier geven we een overzicht van de kennis omtrent de verbanden tussen M.E./CVS en metabole ziekte, en stellen voor dat focale inflammatie in de hypothalamus – te wijten aan de lolale aktivatie van mest-cellen en microglia – de homeostase kan wijzigen en een doelwit kan vormen voor nieuwe therapeutische benaderingen.

Metabole onregelmatigheden

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Het verband tussen M.E./CVS en metabole ziekte

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Mitochondriale dysfunktie

[tekst beschikbaar op aanvraag]

Focale inflammatie in de tussenhersenen en dysfunktionele HPA-as

Er werd gesuggereerd dat neuro-inflammatie [Nakatomi Y et al. Neuroinflammation in Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: An 11C-(R)-PK11195 PET Study. J Nucl Med (2014) 55: 945-950] en immuun-dysfunktie [Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116 /// Trivedi MS et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLos One (2018) 13: e201066] betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS maar de serum-waarden van pro-inflammatoire cytokinen werden niet bevestigd. Er is aanzienlijk bewijs dat aangeeft dat M.E./CVS wordt gekenmerkt door dysfunktie van de HPA-as en het is bekend dat de symptomen verergeren bij stress. Stress kan ook obesitas en cardiovasculaire voorvallen verergeren of precipiteren, door lokale inflammatie.

Corticotropine-afgevend hormoon (CRH) wordt gesekreteerd door de hypothalamus onder stress en stimuleert de HPA-as via aktivatie van 2 types of G-proteïne gekoppelde receptoren: CRHR-1 and CRHR-2 [signaaloverdracht via een trans-membranair systeem]. CRH dat wordt gesekreteerd bij acute stress bleek geïmpliceerd in de pathofysiologie van neuro-inflammatoire aandoeningen en myocard-infarct (MI).

We stellen voor dat stimulatie van hypothalamische mest-cellen door factoren in het milieu, neurale, immuun-pathogene (Lyme, mycotoxinen) of stress-triggers (CRH, somatostatine) microglia aktiveren, leidend tot focale inflammatie en verstoorde homeostase. [Samengevat: de voorgestelde mest-cell/microglia interakties in de hypothalamus dragen als volgt bij tot de pathogenese van M.E./CVS. Hypothalamische mest-cellen worden gestimuleerd door met stress geassocieerde triggers (zoals CRH, substantie-P & z’n homoloog hemokine-1) samen met mtDNA en IL-33. Gestimuleerde mest-cellen sekreteren dan molekulen zoals CXCL8, neurotensine, TNF, tryptase en mtDNA, die dan microglia aanzetten tot de afgifte van inflammatoire molekulen zoals IL-1β, IL-6 en CXCL8 die de homeostase verder ontregelen, mitochondriale dysfunktie veroorzaken en leiden tot de symptomen van M.E./CVS. Luteoline zou deze processen op meerdere niveaus kunnen inhiberen.] Mest-cellen en/of microglia triggers kunnen voortkomen uit de neus-holte of de hersenen bereiken door een verstoorde BBB [bloed-brein-barrière] of via de lymfevaten. Gestimuleerde mest-cellen zouden molekulen kunnen sekreteren die de homeostase op een directe manier kunnen wijzigen (via afgifte van CRH, urocortine [proteïne van de corticotropine-afgevende factor (CRF) familie; betrokken bij de stress-respons]) of microglia aktiveren (via sekretie van histamine, tryptase [enzyme] en mtDNA [mitochondriaal DNA]). Microglia geven dan meer inflammatoire molekulen (IL-1ß, IL-6 & CCL2 [cytokine/chemokine; chemokine (C-C motief) ligand 2 ook monocyten-aantrekkend proteïne 1 (MCP1) genoemd]) af, die de homeostase verder ontregelen, mitochondriale dysfunktie veroorzaken en bijdragen tot centrale én perifere vermoeidheid. Er werd gerapporteerd dat geaktiveerde microglia bijdragen tot de pathofysiologie van slaap-stoornissen. De betrokkenheid van meer dan één trigger kan leiden tot een significant verhoogde respons, en de trigger-drempel van mest-cellen én microglia verlagen, wat aanleiding geeft tot chronische symptomen.

Mest-cellen zijn unieke weefsel immuun-cellen betrokken bij allergische reakties maar die ook werken als sensoren voor omgeving- en psychologische stress. Zelfs indien we stimulatie van mest-cellen in de hypothalamus inroepen, betekent dit niet noodzakelijk dat mest-cellen noodzakelijkerwijs gestimuleerd zouden moeten zijn buiten het CZS. Niettemin zijn er rapporten geweest over een verband tussen M.E./CVS en acute rhinitis [ontsteking van het neusslijmvlies], inclusief significant hogere TNF & CXCL8 [chemokine; ook interleukine-8 (IL-8) of neutrofiel-aktiverende factor (NAF) genoemd] -waarden in lavage-vocht uit de neus. Daarnaast waren chronische rhinosinusitis symptomen significant erger bij patiënten met M.E./CVS [Chester AC. Symptoms of rhinosinusitis in patients with unexplained chronic fatigue or bodily pain: a pilot study. Arch Intern Med (2003) 163: 1832-1836], blijkbaar door niet-allergische rhinitis [Baraniuk JN & Ho LU The nonallergic rhinitis of Chronic Fatigue Syndrome. Clin Allergy Immunol 19 (2007): 427-447]. Het is goed bekend dat zowel allergische als aanhoudende rhinitis de aktivatie van mest-cellen omvatten. Er werd gerapporteerd dat de incidentie van M.E./CVS hoger lag bij patiënten met een voorgeschiedenis van atopie [de aanleg om immunglobuline (Ig)-E (antistoffen) aan te maken specifiek gericht tegen stoffen uit de omgeving] [Yang TY et al. Increased Risk of Chronic Fatigue Syndrome Following Atopy: A Population-Based Study. Medicine (Baltimore) (2015) 94: e1211]. Er werden overigens meer circulerende bloed mest-cel voorlopers gevonden bij M.E./CVS-patiënten [Nguyen T et al. Novel characterisation of mast cell phenotypes from peripheral blood mononuclear cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients. Asian Pac J Allergy Immunol (2017) 35: 75-81].

Mest-cellen zijn perivasculair [rond de bloedvaten] gelokaliseerd in de hypothalamus, de thalamus en het derde [hersen]ventrikel [omvat de ‘plexus chorioides’ waar hersenvocht aangemaakt wordt] van het diencefalon [tussenhersenen]. CRH kan mest-cellen stimuleren in de hypothalamus aangezien het CRHR-1 gen tot expressie komt op menselijke gecultiveerde mest-cellen: aktivatie daarvan induceert de aanmaak van vasculaire endotheliale groei-factor (VEGF) door de hersenen. Bovendien wordt CRH gesynthetiseerd door mest-cellen, wat impliceert dat het autocriene effekten [waarbij de uitgescheiden stoffen op de eigen cel inwerken] kan hebben. Interessant: zelfs somatostatine stimuleert mest-cellen. Mest-cellen worden ook gevonden in de pijnappelklier, hypofyse en schildklier, wat hun bijdrage tot de symptomen van M.E./CVS (zoals slaap-stoornissen, dysfunktionele HPA-as en vermoeidheid te wijten aan een dysfunktionele schildklier) verder uitbreidt. Mest-cellen zijn goed gekend voor hun rol bij allergie, wat de permeabileit van de bloed-brein-barrière (BBB) kan verhogen, leidend tot inflammatie-reakties; maar mest-cellen worden nu als belangrijk beschouwd bij aangeboren en verworven immuniteit, antigen-presentatie en inflammatie [Theoharides TC et al. Mast cells and inflammation. Biochim Biophys Acta (2010) 1822: 21-33].

Mest-cellen kunnen gestimuleerd worden door neuronen, hormonen, omgeving-, neuro-immune, pathogene en stress-triggers. [Stimuleren degranulatie: o.a. acetylcholine, adenosine, complement-fragmenten, IgE, IgG1, IgG4, histamine, serotonine, tryptase /// Stimuleren selektieve release van mediatoren zonder degranulatie: o.a. ATP, Borrelia burgdorferi, CRH, zware metalen, IL-33, mycotoxinen, LPS, virussen]. Reaktieve zuurstof soorten (ROS) kunnen mest-cellen ook stimuleren. Mest-cellen sekreteren ook leptine dat kan bijdragen tot cachexie [veralgemeende zwakte-toestand] en vermoeidheid. Mest-cellen sekreteren wel 100 verschillende mediatoren, dikwijls op een selektieve manier zonder degranulatie [Theoharides TC et al. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev (2007) 217: 65-78] en gebruikmakend van verschillende sekretorische mechanismen. Mest-cellen kunnen ook ‘danger’-signalen [molekulen die attenderen op beschadiging/infektie] sekreteren [Theoharides TC. Danger Signals and Inflammation. Clin Ther (2016) 38: 996-999], inclusief veel chemokinen en cytokinen, en bijzonderlijk mitochondriaal DNA (mtDNA) (Zhang B et al. Stimulated human mast cells secrete mitochondrial components that have autocrine and paracrine inflammatory actions. PloS One (2012) 7:e49767] dat als een ‘aangeboren pathogen’ kan werken en leidt tot een plaatselijke auto-inflammatoire respons in de hersenen [Collins LV et al. Endogenously oxidized mitochondrial DNA induces in vivo and in vitro inflammatory responses. J Leukoc Biol (2004) 75: 995-1000 /// Theoharides TC et al. The “missing link” in autoimmunity and autism: Extracellular mitochondrial components secreted from activated live mast cells. Autoimmun Rev (2013) 12: 1136-1142]. Extracellulair mtDNA kan ofwel direct gesekreteerd worden in het diencefalon of het brein bereiken via lymfevaten. We rapporteerden dat mtDNA verhoogd is in het serum van kinderen met autisme spectrum aandoening (ASD). Van mest-cellen afkomstige mediatoren kunnen microglia dan stimuleren [Zhang X et al. Induction of Microglial Activation by Mediators Released from Mast Cells. Cell Physiol Biochem (2016) 38:1520-1531] om bijkomende pro-inflammatoire en homeostase-verstorende molekulen [de cytokinen IL-1β, IL-6 & TNF, en de chemokinen CCL2, CXCL8 & CCL5] te sekreteren, wat bijdraagt tot vermoeidheid en neuropsychiatrische symptomen [studie bij autisme spectrum stoornissen]. Het is interessant dat peptide-Y [stress-mediator] gestegen bleek te zijn in het plasma van patiënten met M.E./CVS en significant correleerde met stress [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in chronic fatigue syndrome. Behav Brain Funct (2010) 6: 76], aangezien van dit peptide is geweten dat het mest-cellen stimuleert.

Een belangrijk onderdeel is dat de combinatie van triggers waarschijnlijk een belangrijker pathogenetische rol speelt dan individuele triggers. Bv.: we rapporteerden dat de combinatie van CRH en NT een synergistische werking vertonen bij het stimuleren van de VEGF-afgifte zonder tryptase van menselijke mest-cellen, alsook het induceren van de expressie van hun receptoren op menselijke mest-cellen. We toonden ook dat de combinatie van SP en IL-33 synergistisch werken bij het stimuleren van TNF-sekretie zonder tryptase door menselijke gecultiveerde mest-cellen [Taracanova A et al. SP and IL-33 together markedly enhance TNF synthesis and secretion from human mast cells mediated by the interaction of their receptors. Proc Natl Acad Sci USA (2017) 114: E4002-E4009].

CRH wordt dikwijls afgegeven tesamen met een ander peptide, neurotensine (NT) [neurotransmitter], dat vaso-aktief is en ook geïmpliceerd bleek bij inflammatie en neurologische ziekten. NT is verhoogd in de huid na acute stress en verhoogt de vasculaire doorlaatbaarheid, een effekt dat synergistisch is met CRH.

Mest-cellen worden ook gestimuleerd door het peptide Substantie-P (SP [neuropeptide dat funktioneert als een neurotransmitter en als een neuromodulator; zie ‘Mest-cellen & Substantie-P]) […] en er werd aangetoond dat het deelneemt in inflammatoire processen. IL-33 is een lid van de IL-1 familie van cytokinen en dook op als een vroeg waarschuwing-signaal (‘alarmine’ [alarminen zijn endogene molekulen die weefsel- en cel-schade signaliseren]) bij auto-immune of inflammatoire processen. IL-33 wordt afgegeven door fibroblasten en endotheliale cellen maar ook door mest-cellen. IL-33 verhoogt het effekt van IgE op de sekretie van histamine door mest-cellen en basofielen; maar er zijn geen rapporten over het effekt van IL-33 op zichzelf of in combinatie met SP op de sekretie van IL-1ß door menselijke mest-cellen. Substantie-P stimuleerde de afgifte van VEGF, een werking die wordt verhoogd door IL-33.

We toonden dat de stimulatie van menselijke mest-cellen door SP tesamen met IL-33 de sekretie en gen-expressie van het pro-inflammatoir cytokine TNF uitgesproken doet stijgen [zie Taracanova A et al. hierboven]. Interessant is dat chronische rhinosinusitis, wat (zoals eerder besproken) vrij courant voorkomt bij M.E./CVS, geassocieerd bleek met hoge waarden van nasaal IL-33, wat de hypothalamus kan bereiken via de cribriforme plexus [‘zeefvormig netwerk’; het hersenvlies rond de reukzenuw gaat door het zeefbeen (cribriforme plaat) en gaat over in lymfevaten die het hersenvocht door de lymfeknopen pompen].

Is er een behandeling die werkt?

Er zijn momenteel geen door de FDA goedgekeurde medicijnen drugs voor M.E./CVS, en de beschikbare psychologische, fysieke en farmacologische interventies lijken niet doeltreffend. Mitochondrieën lijken een aantrekkelijk doelwit voor medicijnen bij de behandeling van M.E./CVS, maar andere artikels rapporteerden geen klaarblijkelijke wijziging van de ATP-produktie [Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. III. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed (2012) 25: 1073-1087]. Chemokinen en cytokinen werden voorgesteld als doelwitten voor neuro-inflammatoire aandoeningen maar die werden niet uitgeprobeerd bij M.E./CVS.

De peroxisoom proliferator geaktiveerde receptor (PPAR [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren zijn een groep receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren]) agonist bezafibraat [bedoeld als vet-verlagend middel] verbeterde de mitochondriale funktie door stimulatie van mitochondriale biogenese en het verhogen van de efficiëntie van de oxidatieve fosforylatie in een aantal studies [Systemische Lupus Erythematosus, Huntington’s]. Er werd ook gesuggereerd dat – aangezien vermoeidheid geassocieerd is met hypotensie bij M.E./CVS-patiënten – het verhogen van de bloeddruk een doeltreffende therapeutische benadering kan betekenen voor dit symptoom. Alhoewel eerdere studies aangaande het gebruik van het mineralcorticoïd fludrocortison geen verbetering kon aantonen, heeft het aanwenden van de agonist midodrine [alfa-adrenerge agonist voor de behandeling van orthostatische hypotensie] om de bloeddruk te doen stijgen, enige verbetering van de vermoeidheid opgeleverd [Naschitz J et al. Midodrine treatment for Chronic Fatigue Syndrome. Postgrad Med J (2004) 80: 230-232]. Interessant is dat werd getoond dat angiotensine-II inhibitoren het mitochondriaal membraan potentiaal verhogen, mitochondriale funktie verbeteren en mitochondriale biogenese stimuleren. Inderdaad: er werd getoond dat blokkage van angiotensine-II de aanvang van T2DM [diabetes type-2] bij muizen voorkomt door het verhogen van de vet-oxidatie, triglyceriden in spieren vermindert en de glucose-tolerantie verbetert. De angiotensine-receptor blokker telmisartan [bloeddruk-verlagend middel] verbetert de mitochondriale dysfunktie door het versterken van mitochondriale biogenese en het beschermen tegen beschadiging van vasculaire en endotheliale cellen. Op dezelfde manier werd getoond dat de angiotensine-receptor blokker losartan [wordt gebruikt bij de behandeling van verhoogde bloeddruk] de werking van de mitochondriale respiratoire keten en co-enzyme-Q10 (CoQ10) inhoud verbetert bij hypertensieve dieren. Gezien de bloeddruk-verlagende effekten van deze middelen is het echter onwaarschijnlijk dat ze nuttig zouden zijn bij M.E./CVS, uitgezonderd bij een selekte groep patiënten misschien.

Meerdere natuurlijke stoffen kunnen een voordelig effekt hebben op de mitochondriale funktie. Magnesium-ionen spelen cruciale rollen bij het energie-metabolisme en het behouden van normale spier-funktie, als positief aktieve regulator van de glycolyse en van alle enzymatische reakties waarbij de transfer van fosfaat-groepen van ATP betrokken is. Meerdere studies hebben aangetoond dat magnesium-ion supplementen de spierkracht significant verhogen en optimale lichamelijke aktiviteit-prestaties bij mensen bewaren. Bij dieren lijkt deze verbetering van inspanning-prestaties te geschieden via het verhogen van de beschikbaarheid van glucose in de hersenen en spieren, en via het verminderen/vertragen van lactaat-accumulatie. Magnesium-sulfaat kan ook de mitochondriale respiratoire funktie verbeteren en de aanmaak van stikstof-oxide in het brein voorkomen.

Coenzyme-Q10 deficiëntie werd gerapporteerd bij patiënten met M.E./CVS. De toediening van CoQ10 aan M.E./CVS-patiënten gaf echter geen voordeel [Campagnolo N et al. Dietary and nutrition interventions for the therapeutic treatment of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic review. J Hum Nutr Diet (2017) 30: 247-259]. [Een Spaans onderzoeksteam rapporteerde “een significante verbetering qua vermoeidheid”; zie ‘Oraal Co-enzyme Q10 plus NADH voor M.E.(cvs)]

In de natuur voorkomende flavonoïden hebben krachtige anti-oxidante, anti-inflammatoire en neuroprotectieve werkingen en worden over het algemeen als veilig beschouwd. Het flavonoïd genisteïne verlicht spier-vermoeidheid bij mensen door het downreguleren van oxidatieve stress en het versterken van de aktiviteit van anti-oxidante enzymen. De flavonoïden epigallocatechine, naringine [polyfenol anti-oxidant] en curcumine kunnen M.E./CVS-symptomen verbeteren in experimentele modellen [ratten & muizen]. Andere rapporten documenteerden gelijkaardige chronische vermoeidheid verlichtende effekten voor de Astragalus [belangrijk kruid in de traditionele chinese geneeskunde] flavonoïden [ononine, formononetine & demethylhomopterocarpine] [Kuo YH et al. Astragalus membranaceus flavonoids (AMF) ameliorate Chronic Fatigue Syndrome induced by food intake restriction plus forced swimming. J Ethnopharmacol (2009) 122: 28-34] en olijven-extract [Gupta A et al. Possible role of oxidative stress and immunological activation in mouse model of Chronic Fatigue Syndrome and its attenuation by olive extract. J Neuroimmunol (2010) 226: 3-7]. Van de isoflavonen genisteïne en daidzeïne werd een omkering getoond van de effekten van poly-inosine:poly-cytidine zuur (poly I:C) [synthetisch dubbel-strengig RNA] op locomotor-aktiviteit bij muizen en expressie van brein-inflammatie mediator in een muizen-model voor vermoeidheid [Vasiadi M et al. Isoflavones inhibit poly(I:C)-induced serum, brain, and skin inflammatory mediators – relevance to chronic fatigue syndrome. J Neuroinflammation (2014) 11: 168]. Quercetine [flavonoïd; zie ook ‘Quercetine – Effekt op mitochondriale biogenese & inspanning-tolerantie] lijkt de inspanning-tolerantie te verhogen door het verlichten van oxidatieve stress in muizen-hersenen, en ter zelfder tijd een anti-oxidante en anti-inflammatoire werking te verlenen [Davis JM et al. Quercetin increases brain and muscle mitochondrial biogenesis and exercise tolerance. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol (2009) 296: R1071-R1077].

Luteoline onderdrukt de adipocyten [vet-cellen] -aktivatie van macrofagen en inflammatie, terwijl het de insuline-sensitiviteit van het endothelium verhoogt [Deqiu Z et al. Luteolin inhibits inflammatory response and improves insulin sensitivity in the endothelium. Biochimie (2011) 93: 506-512]. Luteoline inhibeert ook mest-cellen [Weng Z et al. The novel flavone tetramethoxyluteolin is a potent inhibitor of human mast cells. J Allergy Clin Immunol (2015) 135: 1044-1052] en microglia. In deze context is het interessant dat luteoline verbetering gaf van symptomen van ASD, post-Lyme syndroom en hersen-mist; in open-label testen. We toonden dat tetramethoxyluteoline krachtiger is dan luteoline wat betreft het vermogen om menselijke gecultiveerde microglia en mest-cellen te inhiberen [Patel AB & Theoharides TC. Methoxyluteolin Inhibits Neuropeptide-stimulated Proinflammatory Mediator Release via mTOR Activation from Human Mast Cells. J Pharmacol Exp Ther (2017) 361: 462-471]. Intranasale toediening van selekte flavonoïden kunnen inflammatie in de hypothalamus reduceren en de centrale pathogenese van M.E./CVS corrigeren. Er zijn nieuwe behandelingen nodig om de centrale pathogene processen aan te pakken. Bv.: er werd getoond dat intranasale toediening van curcumine ingekapseld in microvesikels inflammatie van het brein in een muizen-model inhibeert [Sun D et al. A novel nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Mol Ther (2010) 18: 1606-1614].

Besluiten

Over het geheel genomen bleek het M.E./CVS-fenotype verband te houden met klaarblijkelijke abnormaliteiten in het metabool profiel, mogelijks te wijten aan lokale inflammatie in de hypothalamus. Molekulen die de inflammatie in het brein zouden kunnen inhiberen, zoals tetramethoxy-luteoline of het anti-inflammatoir cytokine IL-37 [Mastrangelo F et al. Low-grade chronic inflammation mediated by mast cells in fibromyalgia: role of IL-37. J Biol Regul Homeost Agents (2018) 32: 195-198.] kunnen potentiële behandel-opties zijn.

juli 29, 2018

Uitgebreide metaboloom-studie bij M.E.(cvs)

Aankondigingen als “Nieuwe CVS-test is 84 percent accuraat’ klinken natuurlijk hoopgevend maar de realiteit is toch ietsje ingewikkelder… Als men het artikel hier onder leest, zal men te weten komen dat het niet over één (snel) test(je) gaat maar een complexe analyse die op lange termijn inzichten zou kunnen verschaffen over de pathologie, subgroepen en een mogelijke therapeutische aanpak daarvan. ‘Inzichten over metabolieten brengen ons dichter naar een test voor CVS’ klinkt al wat genuanceerder…

Onderstaande studie, door een research-team o.l.v. onderzoekers van het ‘Centre for Infection and Immunity’ (CII) van de Columbia Universiteit (New York City), levert dus geen kant-en-klare diagnostische test op. D.m.v. hoog-technologische technieken (die bijlange niet in elk routine-lab beschikbaar zijn) werden 562 metabolieten (zeg maar produkten die ontstaan bij menselijke en of microbiële processen die suikers/vetten/eiwitten verwerken) gevonden die bij M.E.(cvs)-patiënten al dan niet anders waren. Een aantal daarvan bleken te wijzen op mogelijk slecht funktioneren van de mitochondrieën (de energie-fabriekjes van cellen) – wat overéénkomt met wat andere research-teams vonden. Ook hun eerdere vondst van een onderscheidend metabolieten-patroon tussen M.E.(cvs) en prikkelbare darm syndroom werd bevestigd. Combinatie van de gegevens (metaboloom) met de eerder gevonden biomerkers (microbioom) leverde een voorspellend model op en statistische analyse gaf aan dat de accuraatheid daarvan om de diagnose M.E.(cvs) te kunnen stellen 84% is.

Dr. W. Ian Lipkin, directeur van het CII en het ‘National Institutes of Health Centre for Solutions for ME/CFS’ liet optekenen: “We beginnen te begrijpen hoe de ziekte in z’n werk gaat. We zouden dieren-modellen kunnen gaan ontwikkelen die ons in staat kunnen stellen om hypotheses en potentiële therapieën (bv. probiotica de darm-flora regelen of medicijnen die bepaalde neurotransmitter-systemen aktiveren) te testen.”.

————————-

Scientific Reports Vol 8, #1, article 10056 (juli 2018)

Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics

Dorottya Nagy-Szakal (1), Dinesh K. Barupal (2), Bohyun Lee (1), Xiaoyu Che (1), Brent L. Williams (1), Ellie J.R. Kahn (1), Joy E. Ukaigwe (1), Lucinda Bateman (3), Nancy G. Klimas (4,5), Anthony L. Komaroff (6), Susan Levine (7), Jose G. Montoya (8), Daniel L. Peterson (9), Bruce Levin (10), Mady Hornig (1), Oliver Fiehn (11), W. Ian Lipkin (12)

1 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

3 Bateman Horne Center, Salt Lake City, UT, USA

4 Institute for Neuro Immune Medicine, College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, USA

5 Miami VA Medical Centre, Miami, FL, USA

6 Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA

7 Levine Clinic, New York, NY, USA

8 Stanford University, Palo Alto, CA, USA

9 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

10 Department of Biostatistics, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

11 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

12 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

Samenvatting

De pathogenese van M.E./CVS, een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, slaap-stoornissen, orthostatische intolerantie, koorts, prikkelbare darm syndroom (IBS) en lymfadenopathie [afwijkingen/vergroting van de lymfeklieren], wordt niet goed begrepen. We rapporteren over biomerkers en topologische analyse van het plasma metaboloom, faecaal bakterieel metagenoom en klinische gegeven van 50 M.E./CVS-patiënten & 50 gezonde controles. We bevestigen meldingen van gewijzigde plasma-waarden van choline, carnitine en complexe lipiden, en tonen aan dat patiënten met M.E./CVS & IBS verhoogde plasma-waarden van ceramide hebben. Integratie van faecal metagenoom en plasma metaboloom gegevens resulteerde in een sterker voorspellend model voor M.E./CVS (kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom (kruis-validatie AUC = 0.745) of metaboloom (kruis-validatie AUC = 0.820) -analyse apart. Onze bevindingen kunnen inzicht bieden in de pathogenese van M.E./CVS en z’n subtypes, en suggereren mechanismen voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën.

Inleiding

[…]

Metaboloom-studies over M.E./CVS hebben onregelmatigheden onthuld aangaande het energie-, aminozuren-, nucleotiden- en stiktstof-metabolisme [Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172], alsook inconsistente verstoringen in neurotransmitter-gerelateerde mechanismen en het lipiden-metabolisme. In een massa-spectrometrische studie met 45 M.E./CVS-individuen en 39 gezonde controles, rapporteerden Naviaux et al. abnormaliteiten qua niveaus van fosfo- en sfingolipiden, cholesterol, ‘vertakte’ aminozuren, vitaminen, proline/glutamaat en mitochondriale metabolieten. [Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480] In een studie met 67 M.E./CVS-patiënten en 66 gezonde controles bepaalden Yamano en z’n collega’s 144 metabolieten en rapporteerden abnormaliteiten qua waarden van metabolieten gerelateerd met glycolyse, de TCA-cyclus en de ureum-cyclus, maar niet van het glutamine-metabolisme. [Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep (2016) 6: 34990] Fluge et al. brachten bewijsmateriaal aan voor afwijkingen die consistent zijn met verstoorde funktie van pyruvaat-dehydrogenase die gelinkt is met verstoringen van de (TCA-cyclus gebaseerde) energie-produktie. [Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1] Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie heeft ook metaboloom-abnormaliteiten onthuld die consistent zijn met veranderde gluconeogenese, mogelijke inhibitie van de glycolyse en een verstoorde respons op oxidatieve stress. [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] Een andere NM-studie vond dat bij M.E./CVS (t.o.v. controles) de waarden van glutamine en ornithine in het serum lager waren, en correleerden met metabolieten verbonden met de ureum-cyclus. [Armstrong CW et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531] Een piloot-studie (met de focus op plasma van vrouwen met M.E./CVS) onthulde wijzigingen qua energie-gerelateerde metabole molekulen en mechanismen. [Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst (2017) 13: 371-379] We hebben melding gemaakt van analyses van het faecaal microbioom en stelden een model voor waarbij intestinale dysbiose kan bijdragen tot bakteriële metabole stoornissen die verschillen tussen M.E./CVS-subgroepen met of zonder IBS. [Nagy-Szakal D. et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5, 44]

Hier rapporteren we over gerichte en ongerichte analyses van 562 molekulen die primaire metabolieten, biogene aminen, lipiden-complexen en oxylipinen [molekulen ontstaan door oxidatie van vetzuren] vertegenwoordigen, in het plasma van M.E./CVS-patiënten en controles. We beschreven ook de verbondenheid van de resulterende metaboloom-gegevens met faecaal metagenoom en klinische gegevens. Zoals bij onze eerder gerapporteerde metagenoom-analyses, vonden we dat metaboloom-profielen niet enkel verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en controles maar ook tussen M.E./CVS-patiënten die al dan niet IBS hebben.

Methodes

Studie-ontwerp

[…]

Studie-populatie en plasma-collectie

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Controles gematcht voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en seizoen van afname. […]

[…]

Klinische beoordeling & medische anamnese

[…]

Zelf-gerapporteerd diagnose van IBS […] 24/50 M.E//CVS-patiënten (48%), 1/50 controle-individuen (2%). […]

Metabolomica

Er werden 3 ongerichte metaboloom-testen en 1 gerichte test uitgevoerd voor 562 metabolieten van 20 biochemische mechanismen [massa-spectrometrie]. […].

Statistische analyses

[…]

MetaMapp

[Methode om verbanden tussen biochemische en chemische verbanden te integreren om alle gedetekteerde metabolieten d.m.v. in netwerk-diagrammen in kaart te brengen. Deze diagrammen visualiseren op een efficiënte manier de op massa-spectrometrie gebaseerde metaboloom-gegevens. Een knooppunt vertegenwoordigt een metaboliet. Ge-upreguleerde en ge-downreguleerde knooppunten krijgen een verschillende kleur. De grootte van een knooppunt weerspiegelt de grootte-orde van het effekt.] […] Struktureel geïdentificeerde metabolieten werden gegroepeerd in 21 chemische groepen [carnitine-choline * tryliceriden (TG) * ceramide * fosfatidylethanolminen (PE) * aminozuren * oxylipinen * exposoom * vetzuren * sfingomyelinen (SM) * energie * complexe lipiden (LPC) * carnitine * suiker * suiker-alkohol * cholesterol * neutrale lipiden * één-koolstof/nicotinaat * neurotransmitter * nucleotide * vitamine]. De metabolieten werden manueel geklassificeerd omdat dit voor veel molekulen, inclusief complexe lipiden, niet altijd even goed gebeurt in bestaande databases. […]

Analyses van topologische gegevens

Metagenoom- en metaboloom-gegevens, inclusief plasma-waarden van de metabolieten, bakteriële samenstelling en afgeleide metabole mechanismen, plasma immuun-profielen en symptoom-ernst-scores, werden gebruikt voor TDA [‘topological data analysis’, topologische gegevens analyse]. De aangewende methodiek geeft de complexe biologische sets gegevens weer als gestruktureerde 3-dimensionele netwerken [knooppunten verbonden met lijnen]. […] De lijnen verbinden netwerk-knooppunten die gemeenschappelijke gegevenspunten bevatten. […] De grootte van een knooppunt in het topologisch netwerk was proportioneel met het aantal variabelen met een gelijkaardig profiel. We construeerden een netwerk bestaande uit 100 stalen en 1.900 variabelen (562 plasma-metabolieten, 574 faecale bakteriële relatieve aantallen […], 586 voorspelde bakteriële metabole mechanismen, 61 immuun-molekulen, 81 variabelen met betrekking tot M.E./CVS-vermoeidheid en andere symptoom-scores/vragenlijst-items, en informatie over co-morbiditeiten en 36 demografische variabelen). […]

Resultaten

Karakteristieken van de studie-populatie

[…] 41 vrouwelijke en 9 mannelijke M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 51,1 ± 1,6 jaar); 41 vrouwelijke en 9 mannelijke controle-individuen (gemiddelde leeftijd 51,3 ± 1,6 jaar). […] Prikkelbare darm syndroom (IBS) diagnose bij 24 van de 50 M.E./CVS-patiënten (48%). Eén van de 50 controle-individuen meldde een diagnose van IBS (2%).

Metaboloom-gegevens

Gerichte en ongerichte massa-spectrometrie leverde gegevens op voor 562 metabolieten: 111 primaire metabolieten (PM), inclusief deze gerelateerd met het tryptofaan-metabolisme, suikers, hydroxyzuren, keton-lichamen en andere molekulen van het energie-metabolisme; 103 biogene aminen (BA) inclusief vertakte en onvertakte acylcarnitinen, trimethylamine N-oxidase (TMAO [osmolyt (molekule bijdragend tot de (regulering van) osmotische druk in cellen en weefsels); ook gerapporteerd significant verhoogd te zijn bij fibromyalgie]), choline [organische stof die belangrijk is voor de struktuur van cel-membranen en andere membraan-strukturen, en voor neurotransmissie] en aminozuren; 302 complexe lipiden (CL) inclusief mono- en di-acylglyceriden [molekulen van glycerol gelinkt met 1 of 2 vetzuren], vetzuren, ceramide [(sfingo)lipide-molekule in het celmembraan waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood; Naviaux rapporteerde bij M.E.(cvs) gedaalde waarden] sfingomyelinen [sfingolipiden die voornamelijk voorkomen in de myeline-schede rond axonen] en fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden]; en 46 bio-aktieve oxylipinen (OL), steroïden en galzuren. […]

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel

Exposoom- en vitamine-metabolieten (exogene milieu-stoffen) [Het exposoom is het geheel van menselijke (d.i. niet-genetische) blootstellingen aan het milieu vanaf de conceptie.]) werden uitgesloten [lijst beschikbaar op aanvraag] bij onze biomerker-analyse omdat vitamine-supplementen, medicijnen en dieet een impact kunnen hebben op de concentraties metabolieten onafhankelijk van de ziekte-toestand. [514 overblijvende metabolieten] We selekteerden de top 10 potentiële M.E./CVS-biomerkers. […] 5-methoxytryptamine (5-MT) werd uitgesloten aangezien het in 50% van de gevallen wordt verstoord door het gebruik van antidepressiva. […]

Bij de top plasma-biomerkers die M.E./CVS-patiënten differentiëren van controles waren gedaalde waarden van betaïne [osmolyt], complexe lipiden (lysofosdatidylcholine [LPC], fosfatidylcholinen [PC]) en sfingomyelinen (SM), en gestegen waarden van triglyceriden (TG), α-N-fenylacetyl-glutamine [metaboliet van de ureum-cyclus], ε-caprolactam [cyclisch amide] en urobiline [afbraakprodukt van oude erythrocyten; kleurstof in de urine]. [complete lijst beschikbaar op aanvraag] Analyse leerde dat M.E./CVS-individuen verminderde waarden qua PC en ontregeling van het of choline-carnitine mechanisme vertoonden.

MetaMapp-analyse van alle metabolieten, inclusief vitaminen en neurotransmitters, bracht de biochemische en chemische relaties in kaart in een metabool netwerk-diagram. De diagrammen beschrijven verhoogde TG en vetzuren, en verlaagde carnitinen, ceramiden, SM en fosfatidylcholinen bij M.E./CVS i.v.m. controles. De analyse toonde ook verminderd 5-MT, tyrosine en indol-3-lactaat [tryptofaan-metaboliet], en verhoogd vitamine-B5 (pantotheenzuur) bij de M.E./CVS-individuen. [In detail: MetaMapp identificeerde verstoringen in het tryptofaan-metabolisme, de carnitine-‘shuttle’ (enzymen-mechanisme verantwoordelijk voor de transfer van lange-keten vetzuren door het binnenste mitochondriaal membraan om te worden afgebroken) / energie-homeostase en de complexe lipiden. Metabolieten die het tryptofaan- en carnitine-mechanisme vertegenwoordigen waren gedaald bij M.E./CVS (t.o.v. controles). In tegenstelling daarmee waren threonzuur (metaboliet van ascorbinezuur of vitamine-C), aminozuren (tyrosine, methionine & lysine), fenylacetyl-glutamine, pantotheenzuur, hexa-ethyleen-glycol (metaboliet) & ε-caprolactam gestegen bij M.E./CVS. Lipiden-analyses toonden dat terwijl metabolieten die de SM, Cer/CE (ceramide) & PC/LPC mechanismen vertegenwoordigen verminderd waren bij M.E./CVS, de TG-mechanismen waren verhoogd.]

IBS co-morbiditeit is geassocieerd met veranderde metabole profielen bij M.E./CVS-patiënten

In eerder werk (met dezelfde individuen) bleek IBS co-morbiditeit de sterkste factor die bepalend was voor de topologische netwerken gebaseerd op faecaal metagenoom gegevens (bakteriële relatieve hoeveelheden en voorspelde bakteriële metabole mechanismen). Analyse van plasma-metabolieten onthulde dat metaboloom-profielen van M.E./CVS-patiënten met IBS zich onderscheiden van controles door waarden van TG, ceramiden, fosfatidylethanolminen (PE) [membraan-fosfolipiden] en metabolieten van het carnitine-choline mechanisme.

M.E./CVS-patiënten zonder IBS co-morbiditeit vertoonden verstoringen qua PCs en het carnitine-choline mechanisme, gelijkaardig met die gevonden bij de globale M.E./CVS-groep. Statistische analyses van de plasma-metabolieten identificeerden verhoogde waarden qua ceramiden, TG, PE, 5-methylthio-adenosine [een nucleoside; zie hieronder], mannitol [een een polyol of suiker-alkohol] en betaïne, alsook gedaalde waarden LPCs en γ-butyrobetaïne [voorloper van carnitine] bij M.E./CVS-patiënten met IBS t.o.v. controles. Bij M.E./CVS-patiënten zonder IBS vonden we verminderde waarden qua tyrosine en PC, en verhoogde waarden qua TG en Tyr-Met-Lys [de 3 aminozuren tyrosine, methionine & lysine] t.o.v. controles. In vergelijking met controles hadden alle M.E./CVS-groepen (globaal, met IBS en zonder IBS) gedaalde waarden van carnitine-choline metabolieten. M.E./CVS-patiënten met IBS hebben een onderscheidend metaboloom-profiel.

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel bij vrouwen

De metabole profielen bij vrouwen met M.E./CVS waren gelijkaardig met deze die worden gezien bij alle M.E./CVS-gevallen. De waarden van complexe lipiden (LPC & PC) waren gedaald en de TG-waarden waren verhoogd bij M.E./CVS vs. controles. Bij de top 10 plasma biomerkers die de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten differentieerden van de vrouwelijke controles waren verlaagd indol-3-lactaat en γ-butyrobetaïne. Deze bleken ook gereduceerd bij de globale M.E./CVS-groep maar behoorden niet tot de top 10.

Geselekteerde metabolieten als potentieel diagnostisch instrumetn bij M.E./CVS

M.E./CVS vs. controles

We testten de sensitiviteit en de specificiteit van de top 10 M.E./CVS-biomerkers […]. Deze metabolieten onderscheiden de M.E./CVS-individuen van de controles met een accuraatheid (‘receiver operating characteristic’ (ROC) [ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit] & ‘area under the curve’ (AUC) [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] van 0.960 (kruis-validatie [een techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] AUC = 0.820). Er bleken in onze eerder studie 8 bakteriële soorten M.E./CVS te voorspellen […] (Coprococcus (C.) catus, Pseudoflavonifractor (P.) capillosus, Dorea (D.) formicigenerans, Faecalibacterium (F.) prausnitzii, Clostridium (C.) asparigiforme, Sutterella (S.) wadsworthensis, Alistipes (A.) putredinisand Anaerotruncus (A.) colihominis; kruis-validatie AUC = 0.745). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (ROC AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart. […]

IBS-subgroepen vs. controles

[…] De top 10 metabolieten onderscheiden M.E./CVS met IBS van de controles met een accuraatheid van AUC = 0.877 (kruis-validatie AUC = 0.754). In onze eerdere studie werden 9 bakteriële soorten geselekteerd om M.E./CVS+IBS te voorspellen […] (F. cf., F. prausnitzii, Bacteroides (B.) vulgatus, A. putredinis, C. catus, Anaerostipes (A.) caccae, D. formicigenerans, A. colihominis & C. asparagiforme; kruis-validatie AUC = 0.791. Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.824) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Bij M.E./CVS zonder IBS zorgden de top 10 metabolieten ook voor een onderscheid met een hoge accuraatheid (AUC = 0.975, kruis-validatie AUC = 0.839). In onze eerdere studie werden 7 bakteriële soorten geselekteerd om ME/CFS-IBS te voorspellen (B. caccae, P. capillosus, Parabacteroides (P.) distasonis, B. fragilis, Prevotella (P.) buccalis, B. xylanisolvens & D. formicigenerans; kruis-validatie AUC = 0.754). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (MET+BACT: AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.880) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Plasma metaboloom-profielen, faecale bakteriële profielen en symptoom-scores bij M.E./CVS

[lijst met unieke en gedeelde metabolieten in de M.E./CVS-subgroepen beschikbaar op aanvraag]

De relatieve aantallen van bakteriële soorten in faeces van de individuen varieerden met hun plasma metaboloom-profielen. Verminderd betaïne bleek geassocieerd met minder A. colihominis. Gedaald PC 30:0 correleerde met minder A. putredinis, een bakterie die sulfonolipiden – ongewone sfingolipiden die struktureel gerelateerd zijn met ceramiden – produceert. Van sfingolipiden is geweten dat ze bakterieën helpen overleven en stress-resistentie bevorderen.

Bij M.E./CVS met IBS was 5-methylthio-adenosine (een metaboliet afgeleid van S-adenosylmethionine als neven-produkt van de polyamine-biosynthese, dat toxisch kan zijn voor zoogdier-cellen) geassocieerd met funktionele stoornissen. Ceramide was geassocieerd met verhoogde lichamelijke vermoeidheid. Gedaald γ-butyrobetaïne correleerde met meer Faecalibacterium, een bakterie die een belangrijke rol speelt bij de aanmaak in de dikke-darm van butyraat [boterzuur], een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten.

In M.E./CVS zonder IBS correleerde gedaald tyrosine met minder P. distasonis. Verhoogd TG 54:6 A was gecorreleerd met D. formicigenerans, en TG 54:8 was gecorreleerd met minder B. caccae & D. formicigenerans. Parabacteroides & Bacteroides soorten hebben het vermogen complexe polysacchariden om te zetten in energie-bronnen. D. Formicigenerans is een koolhydraten-fermenterende bakterie die mierenzuur en lactaat produceert.

TDA-analyse voor netwerk-identificatie

‘Topological data analysis’ (TDA) [zie methodes] van plasma metaboloom- en faecaal metagenoom-gegevens, en klinische symptoom-ernst identificeerde netwerken die M.E./CVS van controles onderscheiden. Profielen van bakteriële relatieve aantallen waren sterkere bepalende factoren voor netwerk-onderscheid dan plasma-metabolieten.

Bespreking

We rapporteerden eerder dat M.E./CVS-patiënten met IBS, M.E./CVS-patiënten zonder IBS en normale controle-individuen groep-specifieke verschillen vertonen qua faecale microflora. We hebben de karakterisatie van dezelfde individuen uitgebreid d.m.v. gerichte en ongerichte metaboloom-analyses van het plasma en geïntegreerde analyse van plasma metaboloom-, faecal metagenoom- en klinische gegevens.

De groep van Naviaux rapporteerde eerder gedaalde plasma-waarden van sfingomyelinen, ceramiden en fosfolipiden (met uitzondering van 18:1 & PC 22:6, die gestegen waren). Tomic et al. rapporteerden verhoogde plasma-waarden TG. [Lipid and protein oxidation in female patients with Chronic Fatigue Syndrome. Arch Med Sci (2012) 8: 886-891] Germain et al. rapporteerden over metabolome biomerkers voor het verstoorde aminozuren-, energie-, suiker- en vetzuren-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [zie hierboven] Geen van deze research-groepen onderzocht de impact van IBS op metaboloom-profien bij M.E./CVS. Onze analyse bevestigde de gedaalde waarden van fosfolipiden en SM, en de gestegen waarden van TG, maar verschilde met betrekking tot specifieke molekulen. We vonden bij de gevallen geen verschillen qua PC 18:1 & PC 22:6. We vonden ook geen consistente afname qua ceramide-waarden. Terwijl M.E./CVS zonder IBS verminderde waarden van de ceramiden d43:1 & d42:1 vertoonden, bleken bij M.E./CVS met IBS verhoogde waarden van 6 ceramiden: d36:1, d40:0, d42:0, d 34:1, d38:1 & d40:1.

Ceramide is een was-achtig lipide dat betrokken is bij de suppressie van elektronen-transport, insuline- & leptine-resistentie, en apoptose. Eerdere studies meldden dat ceramiden betrokken zouden kunnen zijn bij de pathologie van IBS en metabole aandoeningen. Verhoogde waarden van lipopolysacchariden (LPS) geassocieerd met een gewijzigd darm-microbioom [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30] kunnen de aktivatie van sfingomyelinase (SMAse [enzyme]) en de hydrolyse [splitsing] van SM triggeren om ceramide te produceren. Ceramiden zijn toxisch voor veel cel-subtypes via de aanmaak van reaktieve zuurstof-soorten en zou een rol kunnen spelen bij darm-barrière-dysfunktie en verhoogde darm-permeabiliteit. Er werden gestegen waarden van ceramide gerapporteerd in mucosa [(darm)slijmvlies] -stalen van IBS-patiënten alsook in plasma- en weefsel-stalen bij diabetes, cardiomyopathie, insuline-resistentie, atherosclerose [‘aderverkalking’] en steatohepatitis [‘vette lever’; veroorzaakt levercirrose]. Het blokkeren van SMAse om ceramide-waarden te doen dalen kan therapeutisch zijn door inflammatie te reduceren. Patiënten met M.E./CVS en IBS hadden ook hogere plasma mannitol-concentraties. We speculeren dat mannitol de permeabiliteit kan verhogen van de darm-mucosa en de bloed-hersen-barrière resulterend in het doorlaten van molekulen zoals cytokinen en neurotransmitters, wat bijdraagt tot de ziekte.

Net als Armstrong en z’n collega’s, vinden we wijzigingen qua metabolieten geassocieerd met het mitochondriaal energie-metabolisme. Een eerdere studie meldde significante dalingen van TCA-cyclus metabolieten gerelateerd met het energie-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [Yamano E et al.] De gerapporteerde dysfunktie had een impact op het carnitine-metabolisme en ATP/energie-metabolisme in de spieren van M.E./CVS-patiënten. [Armstrong CW et al. (2015)] Carnitine is een belangrijk supplement dat acyl-CoA transfereert naar de mitochondriale matrix en deelneemt aan vetzuur β-oxidatie (TCA-cyclus, ATP-produktie en energie-metabolisme). Studies omtrent carnitine-waarden in het serum en plasma bij M.E./CVS bleken niet overtuigend: sommige teams meldden reducties terwijl andere normale waarden vonden. In een open-label studie met 30 patiënten, bleken acetyl-carnitine supplementen de vermoeidheid en cognitieve funktie verbeteren bij 59% van de M.E./CVS-patiënten. [Vermeulen RC & Scholte HR. Exploratory open label, randomized study of acetyl- and propionylcarnitine in Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom Med (2004) 66: 276-282; zie ook ‘Lange-keten acylcarnitine deficiëntie bij CVS] In onze studie waren molekulen van het choline-carnitine mechanisme gedaald bij M.E./CVS-patiënten ongeacht hun IBS-status.

Onze resultaten zijn consistent met vroegere rapporten die suggereren dat metabolieten gelinkt met het lipiden- en energie-metabolisme aangetast zijn bij M.E./CVS. Ze breiden vroeger werk uit door aan te tonen dat M.E./CVS-individuen met IBS co-morbiditeit een duidelijk verschillend metaboloom-profiel hebben t.o.v. M.E./CVS-individuen zonder IBS en controles.

Veel M.E./CVS-patiënten in onze groep namen vitamine-B supplementen (26/50, 52%) die het potentieel hebben de waarden van pantotheenzuur te doen stijgen. Het gebruik van vitamine-B supplementen was geassocieerd met hogere waarden van pantotheenzuur en lagere vermoeidheid-scores (gegevens niet getoond). Het aantal stalen was echter onvoldoende groot om een significant verband te testen. Plasma-waarden van 5-MT, een molekule gerelateerd met het tryptofaan-, serotonine- en melatonine-metabolisme, waren gedaald bij M.E./CVS; deze bevinding werd echter verstoord door het gebruik van selektieve serotonine heropname inhibitoren (SSRIs) of andere antidepressiva (serotonine-norepinefrine heropname inhibitoren en tricyclische antidepressiva) bij 25 van de 50 (50%) M.E./CVS-individuen vs. 6 of 50 (12%) gezonde controles. Voorafgaande metaboloom-studies hebben gereduceerde waarden van 5-MT in het plasma aangetoond bij chronische, maar niet acute, SSRI-toediening. In menselijke cellen is 5-MT een belangrijk metaboliet dat betrokken is bij de omzetting van serotonine (5-hydroxytryptamine) en melatonine (N-acetyl-5-methoxytryptamine). Er werden eerder al gedaalde waarden van serotonine-transporters, die een rol spelen bij het reguleren van serotonine-waarden in de synapsen, gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamamoto S. et al. Reduction of serotonin-transporters of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neuroreport (2004) 15: 2571-2574]

Correlatie-studies suggereerden mogelijke verbanden tussen 5-MT neurotransmitter metabolieten en de ernst van M.E./CVS, inclusief verstoorde cognitieve funktie, slaap-stoornissen en globaal verhoogde vermoeidheid-scores bij M.E./CVS. Bijkomende studies met grotere aantallen individuen zullen nodig zijn om te bekijken of plasma-waarden van pantotheenzuur of 5-MT gecorreleerd kunnen worden met symptomen en om te bepalen of er een subgroep M.E./CVS-patiënten is waarvan kan worden voorspeld dat ze voordeel haalt uit medicijnen die de geassocieerde mechanismen moduleren.

In onze studie waren 41 van de 50 M.E./CVS-individuen (82%) vrouwen, net zoals 41 op 50 (82%) controle-individuen. Gezien het feit dat de overgrote meerderheid patiënten en controles vrouwen waren, is het niet verrassend dat de bevindingen bij vrouwen met M.E./CVS gelijkaardig waren met de bevindingen in de globale M.E./CVS-groep. Beide hadden lage waarden complexe lipiden (LPC & PC) en hogere waarden TG dan controles. De studie-groep omvatte slechts 9 M.E./CVS mannen en 9 mannelijke controles; dus is er onvoldoende ‘power’ om ev. verschillen tussen vrouwen en mannen te bekijken. Dit verschil qua prevalentie per geslacht is kenmerkend voor M.E./CVS (typisch 4:1 vrouwen:mannen).

Ons voorspellend model onderscheidt M.E./CVS-patiënten van controles met hoge accuraatheid; maar dit dient echter te worden geverifieerd via een onafhankelijke studie.

M.E./CVS is een heterogene aandoening. Identificatie van M.E./CVS-subgroepen die worden gekarakteriseerd d.m.v. specifieke metaboloom-profielen die primaire metabolieten, biogene aminen, complexe lipidomica [studie van mechanismen en netwerken van cellulaire lipiden in biologische systemen] en oxylipinen integreren, zouden de aflijning van subtypes moeten mogelijk maken en leiden tot specifieke diagnostische en therapeutische strategieën.

mei 5, 2018

Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen

Filed under: Behandeling,Celbiologie — mewetenschap @ 7:52 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel betreffende AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) – niet te verwarren met ‘mitogen-activated protein kinase’ (MAPK) – is een vervolg op ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’. AMPK is een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt; een nutriënten- en energie-sensor die zorgt voor energie-homeostase. Het is ook betrokken bij de ‘cell danger response’, beschreven door Robert Naviaux: “AMPK optimaliseert de energie-efficiëntie en stimuleert de recyclage van cellulaire materialen bij autofagie (opruimen van beschadigde mitochondrieën). De mechanismen die geaktiveerd worden door AMPK ondersteunen regeneratie en zijn anti-inflammatoir omdat ze beschadigde proteïnen, lipiden, glycanen, RNA en DNA afbreken. AMPK faciliteert de her-synthese van deze macromolekulen via nieuw gesynthetiseerde monomeren en ververste bouwstenen.”.

Ook op te merken (zie ons stuk ‘Potentiële speeksel-biomerkers bij M.E.(cvs)’):“Er werd een een downregulering van ZAG (zink alfa-2-glycoproteïne; een belangrijke regulator van het energie-metabolisme in skelet-spieren) gevonden bij CVS. Dit adipokine (cytokine afgegeven door vet-weefsel) speelt een rol bij aktivatie AMPK, een belangrijke regulator van energie-metabolisme in cellen van menselijke skelet-spieren.”…

In een kort overzicht getiteld ‘Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis’ (Biochemical Society Transactions; 2018) Laat Prof. Julia Newton optekenen: “Studies die veranderingen qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS tonen, dienen omzichtig te worden geïnterpreteerd aangezien de mitochondriale veranderingen te wijten kunnen zijn aan de ontregeling van verdergelegen signalisering-mechanismen, zoals het AMPK-mechanisme, eerder dan een defekt in de mitochondrieën zelf.”

AMPK-aktivatie door metformine bleek al de respons op oxidatieve stress en het mitochondriaal metabolisme te verbeteren in fibromyalgie-fibroblasten (‘Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients’; Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease (2015) 1852: 1257-1267)…

————————-

Bioscience Reports (Pre-print April 2018)

Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with M.E./CVS

Audrey E Brown, Beth Dibnah, Emily Fisher, Julia L Newton, Mark Walker

Institute of cellular medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Achtergrond Vermoeide skeletspieren en post-exertionele malaise zijn sleutel-symptomen van Myalgische Encefalomyelitis (M.E./CVS). We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord zijn in celculturen van menselijke skeletspieren afkomstig van patiënten M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie, een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro. Het doel van deze studie was vaststellen of AMPK farmacologisch kan worden geaktiveerd bij M.E./CVS.

Methodes

Primaire skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden behandeld met metformine of ‘compound 991’. De AMPK-aktivatie werd beoordeeld via western-blot en de glucose-opname werd gemeten.

Resultaten Zowel metformine als ‘compound 991’ behandeling verhoogde de AMPK-aktivatie en glucose-opname in culturen van spiercellen significant bij controles en M.E./CVS. De cellulaire ATP-inhoud bleef onveranderd door de behandeling hoewel deze significant verminderd was bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Besluiten Farmacologische aktivatie van AMPK kan de glucose-opname in spiercel-culturen van patiënten met M.E./CVS verbeteren. Dit suggereert dat het feit dat elektrische puls stimulatie AMPK in dergelijke spiercel-culturen niet kon aktiveren, te wijten is aan een defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defect af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij M.E./CVS-patiënten verbetert.

Inleiding

[…]

AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) is een belangrijke mediator van de skeletspier-respons op inspanning. In respons op een energie-tekort, zoals tijdens spier-contractie, wordt AMPK geaktiveerd, resulterend in het uitschakelen van ATP-verbruikende processen en het opstarten van ATP-genererende processen. In skeletspieren omvat dit een verhoging van de opname van glucose in de spiercellen. We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie verstoord is in celculturen van skeletspieren afkomstig van patiënten met M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie (EPS), een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Deze abnormale AMPK-aktivatie resulteerde ook in een onvermogen op glucose-opname in de cellen in respons op EPS te verhogen.

AMPK is een heterotrimeer [samengesteld uit 3 verschillende onderdelen] complex van α, β & γ subunits. Er bestaan meerdere isoformen voor elke subunit en sommige isoformen komen tot expressie in een celtype- of weefsel-specifieke manier. AMPK kan allosterisch [verandering (dikwijls door wijziging van de 3-dimensionele vorm) van de aktiviteit van een proteïne/enzyme door de binding van een effector-molekule op een specifieke plaats] worden geaktiveerd, vooral door AMP, of via aktivatie van kinasen [groep enzymen die een fosfaat-groep aanbrengen op een proteïne of andere molekule (fosforylatie)] inclusief lever kinase-B1 (LKB1) en het Ca2+/calmoduline-afhankelijk kinase kinase (CaMKK). AMPK kan ook worden gereguleerd door farmacologische middelen zoals metformine, dat AMPK indirect aktiveert via de inhibitie van de ATP-synthese. Er werd een aantal kleine aktiverende molekulen ontwikkeld die direct op AMPK binden, resulterend in allosterische aktivatie van AMPK.

Het doel van deze studie was om te onderzoeken of AMPK gemodifieerd kan worden door farmacologische behandeling van culturen van menselijke skeletspier-cellen afkomstig van patiënten met M.E./CVS. We gebruikten een indirecte aktivator van AMPK (metformine [medicijn ter behandeling van diabetes type-2]) en een directe aktivator (‘compound 991’ [kleine organische molekule die bindt op AMPK; ontwikkeld door Merck – patent WO2010036613) om AMPK-aktivatie, glucose-opname en ATP-content van spiercellen na te gaan.

Studie-ontwerp en methodes

Studie-individuen

Er werden spier-biopten verkregen van 10 patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom en 7 gezonde controle-individuen. De groepen warden gematcht voor leeftijd, en omvatten vrouwen en mannen. […] Alle patiënten voldeden aan de Fukuda criteria […]. Niemand vertoonde een neurologisch gebrek op basis van de klinische beoordeling. […]

Reagentia

[…]

Celculturen

[…] Alle experimenten warden uitgevoerd op gedifferentieerde myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] […].

Western-blotting

[…]

ATP-bepaling

[…]

Glucose-opname

[…]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op AMPK-aktivatie

Skeletspier-cellen van 7 gezonde controles en 8 CVS-individuen werden opgekweekt gedurende 7 dagen om te differentiëren. De cellen werden behandeld met 2 mM metformine gedurende 16 h of 1 μM ‘compound 991’ gedurende 2 uur vóór proteïne-extractie en ‘western blotting’. Metformine-behandeling verhoogde significant de AMPK-aktivatie […] bij controle- (p < 0.01) en CVS- (p < 0.05) myotubes (t.o.v. onbehandeld). De behandeling met ‘compound 991’ had een gelijkaardig effect: significante toename van de AMPK-aktivatie t.o.v. onbehandelde myotubes bij controles en CVS (p < 0.05). De fosforylatie van acetyl-CoA carboxylase [enzyme; AMPK is de voornaamste kinase-regulator van ACC] verhoogde op een dosis-afhankelijke manier in respons op ‘compound 991’.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op glucose-opname

Er kan worden verwacht dat de aktivatie van AMPK leidt tot een toename qua glucose-opname. Metformine-behandeling verhoogde significant de glucose-opname bij controle- en CVS-cellen, en het effekt was vergelijkbaar met dat van insuline. Bij de controles verhoogde metformine de glucose-opname van 632,8 ± 50,4 pmol/mg/min tot 1.014 ± 79,2 pmol/mg/min (p < 0.0005), terwijl bij CVS de glucose-opname steeg van 576,4 ± 26,5 pmol/mg/min tot 715 ± 21,2 pmol/mg/min (p < 0.0005). Behandeling met ‘compound 991’ verhoogde ook de glucose-opname bij concentraties van 0,1 μM & 1 μM bij zowel controle- als CVS-cellen. Bij de controles steeg de glucose-opname van 802,2 ± 59,4 pmol/mg/min tot 963,9 ± 37,9 pmol/mg/min en 1.084,3 ± 44,9 pmol/mg/min (p < 0.05) voor 0.1 μM & 1 μM 991, respectievelijk. ‘Compound 991’ verhoogde de glucose-opname van 633,8 ± 56,8 pmol/mg/min tot 933,7 ± 93,3 pmol/mg/min (p < 0.01) en 913,9 ± 105,7 pmol/mg/min (p < 0.01) voor 0,1 μM & 1 μM, respectievelijk. Voor zowel controle- als CVS-cellen was het effekt van de behandeling met ‘compound 991’ vergelijkbaar met dat van insuline.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op cellulaire ATP-inhoud

Behandeling met metformine of ‘compound 991’ verlaagde de cellulaire ATP-inhoud niet. De ATP-inhoud is echter significant gedaald in spiercel-culturen van CVS-patiënten in vergelijking met controles (p < 0.05), ongeacht de behandeling.

Bespreking

Deze studie toont aan dat AMPK en daaropvolgende ‘downstream’ effekten kunnen worden geaktiveerd door zowel een indirecte (metformine) als directe (‘compound 991’) aktivator van AMPK in skeletspier-cellen van patiënten met M.E./CVS. Dit in tegenstelling met onze eerdere studie van dezelfde spiercel-culturen die toonde dat EPS-gemedieerde contractie niet in staat was AMPK en glucose-opname te aktiveren in skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten. Deze bevindingen duiden op een signalisering-defekt in de nabijheid van AMPK en er zijn verdere studies aan de gang om de expressie en werking van de belangrijkste proximale signalisering-molekulen te verkennen in M.E./CVS-culturen. Dit is het eerste rapport dat aantoont dat ‘compound 991’ actief is bij menselijke skeletspiercel-culturen. Er werd eerder aangetoond dat ‘compound 991’ de AMPK-aktiviteit en glucose-opname verhoogt in geïsoleerde skeletspieren van ratten. Deze effekten worden te niet gedaan in AMPKα1-/α2 myotubes van ‘knockout’ muizen, wat suggereert dat ‘compound 991’ specifiek werkt via AMPK. Verder bewijsmateriaal voor de specificiteit van ‘compound 991’ van AMPK wordt aangegeven door een screening van ‘compound 991’ tegen een panel proteïne-kinasen in cel-vrije testen. Dit toonde dat ‘compound 991’ AMPK-aktiviteit versterkt terwijl het geen effekt heeft op ‘upstream’ kinasen inclusief LKB1 & CaMKK.

Bewijsmateriaal geeft aan dat AMPK-aktivatie de glucose-opname verhoogt via aktivatie van AS160 [proteïne dat fosforylatie-afhankelijke glucose-opname in spiercellen medieert] en glucose-transporter translocatie naar het cel-membraan. Als onderdeel van ons lopend werk, onderzochten we hoe het zit met de AMPK-gemedieerde glucose-opname (met bijzondere focus op glucose-oxidatie en glycolyse) in de M.E./CVS-culturen. De regulering van AMPK is complex. Naast allosterische aktivatie door de binding van AMP, kan AMPK geaktiveerd worden door upstream kinasen zoals LKB1 & CaMKK. Een verstoorde inspanning-gestimuleerde glucose-opname in spier-specifieke LKB1 ‘knockout’ [gen coderend voor lever kinase-B1 ontbreekt] muizen suggereert dat LKB1 het voornaamste kinase zou kunnen zijn dat betrokken is bij regulering van AMPK bij contractie van skeletspieren. Het verband tussen AMPK en inspanning-tolerantie werd ook aangetoond bij AMPK-‘knockout’ muizen. Een skeletspier-specifiek AMPK-‘knockout’ model toonde een verminderde inspanning-capaciteit (‘voluntary wheel running’ [aktiviteit-meting bij proefdieren, waarbij ze vrij in een rad lopen] en ‘treadmill running to exhaustion’ [inspanning op een loopband tot uitputting]). Verstoorde spier-funktie werd aangegeven door een gedaalde maximale kracht en resistentie tegen vermoeidheid ex vivo [experiment met levend weefsel, buiten het lichaam]. Het is ook duidelijk dat spier-funktie sterk afhankelijk is van de metabole funktie, bijzonderlijk glucose-opname, zoals getoond in GLUT4-‘knockout’ [gen coderend voor glucose-transporter type-4 ontbreekt] muizen. Deze modellen tonen dat wanneer de glucose-opname verstoord is, de gevoeligheid voor vermoeidheid na inspanning versterkt is. Onderzoekers toonden ook dat de maximale kracht-ontwikkeling en het samentrekking-vermogen gedaald waren in deze muizen-modellen. Zoals werd gezien voor onze M.E./CVS skeletspiercel-culturen, in respons op contractie geïnduceerd door EPS, zijn zowel AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord is. We zouden voorspellen dat het ontbreken van een effekt op glucose-opname door EPS de samentrekking van spieren zou kunnen verstoren, leidend tot inspanning-intolerantie. De huidige studie suggereert dat dit onvermogen om AMPK te aktiveren in respons op contractie zou kunnen worden omzeild d.m.v. een farmacologische interventie, en bijdraagt aan het bewijs voor een klinische test aangaande een AMPK-aktivator in M.E./CVS.

Een andere belangrijke bevinding van deze studie is de significante daling qua cellulaire ATP-inhoud in skeletspieren bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Deze afname trad op ongeacht de behandeling en werd op 2 afzonderlijke momenten gemeten. Een gereduceede ATP-inhoud werd eerder al gezien bij M.E./CVS-patiënten na inspanning [Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-1722] en verstoorde ATP-synthese werd ook al vastgesteld bij patiënten in vivo [Vermeulen RC, Kurk RM, Visser FC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93]. De ATP-inhoud beïnvloedt cel-overleving: een met leeftijd gerelateerde afname van de ATP-hoeveelheid in gecultiveerde fibroblasten is gelinkt met een verhoogde gevoeligheid voor cel-dood door necrose. Een andere studie rapporteerde echter verhoogde ATP-waarden in perifeer bloed mononucleaire cellen van patiënten met M.E./CVS [Lawson N et al. Elevated Energy Production in Chronic Fatigue Syndrome Patients. J Nat Sci (2016) 2]. Deze auteurs suggereerden dat vermoeidheid gelinkt zou kunnen zijn met niet-mitochondriale processen die ATP produceren, zoals glycolyse.

Potentiële oorzaken van een reductie qua cellulaire ATP-inhoud omvatten stoornissen van de mitochondriale funktie, een afname van het mitochondriaal membraan potentiaal, of verhoogde produktie van reaktieve zuurstof/stikstof soorten (ROS/RNS). Bewijsmateriaal voor een daling van de mitochondriale funktie in skeletspieren bij M.E./CVS is tegenstrijdig. Sommige studies vonden een verminderde mitochondriale inhoud, maar geen mitochondriale dysfunktie in skeletspier-biopten van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738], terwijl anderen metabole abnormaliteiten (consistent met verstoorde mitochondriale werking) identificeerden bij M.E./CVS [Naviaux RK, Naviaux JC et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: E5472-5480]. ROS kunnen een belangrijke rol spelen bij het vermogen van skeletspieren om zich aan te passen bij inspanning maar evenzeer kunnen toegenomen ROS de mitochondriale funktie verstoren, de samentrekkingskracht van spieren reduceren en bijdragen tot spier-dysfunktie. Er is enig bewijsmateriaal dat suggereert dat oxidatieve stress mechanismen geaktiveerd zijn in vivo bij M.E./CVS [Kennedy G, Spence VA, McLaren M et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39: 584-589] maar, naar ons weten, werd dit niet onderzocht in vitro. Toekomstig werk zal zich moeten focussen op het onderzoeken van de mechanismen die er voor zorgen dat contractie AMPK niet kan aktiveren en op de mitochondriale funktie in skeletspieren.

De belangrijk bevindingen van deze studie zijn dat, ten eerste, farmacologische aktivatie van AMPK de glucose-opname in skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten kan verbeteren en, ten tweede, cellulaire ATP-inhoud significant verminderd is in M.E./CVS spiercel-culturen. De vaststelling dat AMPK op een directe manier werd geaktiveerd door metformine en ‘compound 991’ maar niet via EPS in M.E./CVS culturen duidt op een signalisering-defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defekt af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij patiënten met M.E./CVS verbetert.

april 21, 2018

NIR-spectroscopie screening ter detektie van pathogene mitochondriale DNA-varianten bij ‘onverklaarde vermoeidheid’

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , , , ,

Op onze pagina’s hadden we het al over M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte. We gaven er daaromtrent de mening van M.E.(cvs)-specialisten weer. Een Italiaans onderzoeksteam schreef dienaangaande ook: “Een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong zou de daling in funktionele mogelijkheden van de spier kunnen verklaren, zowel als een vermindering in kracht maar, vooral, een vermindering in weerstand.” (‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’). Oproepen tot verder onderzoek bleven niet uit; zie ‘Rol van mitochondriale dysfunkties bij pijn (CVS & FM)’ & ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?’. Er werd ook gewag gemaakt van “extreem zware of uitputtende inspanning die mitochondriale stoornissen bevordert, die de werking ervan permanent kunnen beschadigen” (zie ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’)…

Onderstaande publicatie over onderzoek uitgevoerd door researchers en artsen verbonden aan de Universiteit Gent zou een respons op de vraag naar meer onderzoek kunnen vertegenwoordigen maar jammer genoeg toont het de ongemakkelijke spreidstand aan tussen verschillende ‘stromingen’ betreffende onverklaarde vermoeidheid. Sommigen (bv. Prof. Van Coster) gaan hier voor de hypothese dat M.E.(cvs) elementen van een mitochondriale myopathie heeft, terwijl de adepten van de biopsychosociale school (bv. psychiater dr Mariman) alle langdurige vermoeiden op één hoop gooit, brede definities hanteren en een mengelmoes van patiënten (waarvan misschien slechts enkelen die M.E.(cvs) hebben) in één studie opnemen. Dat deze zoektocht slechts bij 1/3 aanwijzingen voor een eventuele mitochondriale myopathie oplevert, lijkt ons dan ook maar evident. Men zal argumenteren dat dit een piloot-studie betreft met maar een klein aantal patiënten maar ons lijkt dit een quasi amateuristische aanpak die van bij aanvang gedoemd is te mislukken en/of dergelijke halfslachtige resultaten op te leveren. Verder blijft de noodzakelijkheid van (invasieve) biopten een bijkomend obstakel. Ook hierbij is het amateurisme niet ver weg, te meer daar we vernemen dat spierbiopt-materiaal van sommige deelnemers gewoon is ‘verdwenen’…

De waarde van de nieuwe methodiek kan o.i. enkel worden nagegaan bij patiënten die beoordelen aan de geschikte criteria voor M.E.(cvs).

————————-

Appl Spectrosc. (2018) [pre-print]

Near-Infrared Spectroscopy Screening to Allow Detection of Pathogenic Mitochondrial DNA Variants in Individuals with Unexplained Abnormal Fatigue: A Preliminary Study

Celie BM1, Mariman A2,3, Boone J1,4, Delesie L2, Tobback E2,3, Seneca S5, De Paepe B6, Vogelaers D2,3, Van Coster RN6, Bourgois JG1,4

1 Department of Movement and Sports Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium

2 Department of General Internal Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

3 Centre for Neurophysiologic Monitoring, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

4 Centre of Sports Medicine, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

5 Centre for Medical Genetics, University Hospital Brussels, Neurogenetics Research Group, Reproduction Genetics and Regenerative Medicine Research Group, Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium.

6 Department of Pediatrics, Division of Pediatric Neurology and Metabolism, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium

Samenvatting

Onverklaarde abnormale vermoeidheid wordt gekenmerkt door chronische vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand en onvoldoende wordt verklaard door enige erkende medische aandoening. In deze piloot-studie, werden 12 individuen met abnormale vermoeidheid die onverklaard bleef na een grondige screening, onderzocht m.b.v. een ‘near-infrared’ [elektromagnetische straling net buiten het zichtbaar licht; golflengte > 780 nm] (NIR) spectroscopie handgreep-test. Daarvan bleken er 4 een abnormaal zuurstof-extractie patroon te vertonen dat lijkt op dat van individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [MM]. Bij 3 van deze 4 individuen werden diverse mitochondriale abnormaliteiten gedocumenteerd via spectrofotometrische, immunocytologische, fluorescente en morfologische analyses uitgevoerd op skeletspier[biopten] en gecultiveerde huid-fibroblasten. Bij 3 van de 4 mensen met verminderde musculaire zuurstof-extractie werd een verschillende homoplasmatische pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie (m.961T > C, m.1555A > G, m.14484T > C) getoond. [homoplasmie = enkel identieke mtDNA-kopieën aanwezig; alle cellen hetzelfde mitochondriaal genoom] Bij de vierde werd de aanwezigheid van meerdere grote mitochondriaal-DNA deleties [ontbrekende fragmenten] in spierweefsel vermoed. In tegenstelling daarmee hadden geen enkele van de 8 abnormaal vermoeide individuen met normale NIR-spectroscopie resultaten een pathogene mitochondriaal-DNA punt-mutatie of grote deleties (P < 0.001). Deze piloot-studie geeft aan dat NIR-spectroscopie kan dienen als een niet-invasief screening-instrument om een subgroep (patiënten) met mitochondriale dysfunktie af te bakenen bij de grote groep individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid.

Inleiding

Onverklaarde abnormale vermoeidheid die aanhoudt gedurende minstens 6 maand vormt een significant probleem dat leidt tot ernstige dalingen qua beroeps- en sociale aktiviteiten. De diagnostische benadering van onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist een zorgvuldige uitsluiting van andere verklarende aandoeningen, zoals psychiatrische, farmacologische, endocriene, neoplastische, hematologische, infektueuze, metabole (inclusief mitochondriale), cardiopulmonaire, bindweefsel ziekten en slaap-stoornissen. Meerdere van deze aandoeningen kunnen makkelijk worden uitgesloten door gebruik te maken van de gepaste klinische onderzoeken. Sommige vormen onverklaarde abnormale vermoeidheid worden als idiopathisch [zonder bekende oorzaak] beschouwd, t.t.z. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie, en de diagnose hangt af van de exclusie van andere ziekten en het voldoen aan diagnostische criteria (bv. de Fukuda criteria).

De uitsluiting van een mitochondriaal defekt als de onderliggende oorzaak voor vermoeidheid ligt niet altijd voor de hand. Bij jongere individuen zijn de klinische en biochemische abnormaliteiten overduidelijk. Uiteindelijk wordt de diagnose weerhouden na de geschikte biochemische, radiologische en genetische testen. In sommige gevallen, bijzonderlijk bij volwassenen, kunnen de klinische symptomen van mitochondriale defekten subtieler zijn. Sommige individuen met mitochondriale defekten vertonen zelfs geen tekenen van een myopathie of andere orgaan-betrokkenheid vooraleer ze ouder zijn geworden of symptomatisch worden na het innemen van medicatie die toxisch is voor de mitochondriale werking (natrium-valproaat [anti-epilepticum], aminoglycosiden [antibiotica], linezolid [antibioticum]). Hoewel inspanning-intolerantie, spierpijn en spierzwakte sleutel-symptomen zijn voor de erkende entiteit mitochondriale myopathie, kan onverklaarde abnormale vermoeidheid het enige of overwegende symptoom zijn bij een persoon met een mitochondriaal defekt. Bovendien kan het klinisch beeld CVS nabootsen. In een studie […] rapporteerden 62% van patiënten met gedocumenteerde mitochondriale ziekte overmatige symptomatische vermoeidheid (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 40), terwijl 32% ernstige, funktioneel beperkende vermoeidheid-symptomen meldden (‘Fatigue Impact Scale’ ≥ 80), vergelijkbaar met de vermoeidheid die wordt ervaren door patiënten met Myalgische Encefalopathie/CVS. Volgens de auteurs is subjectieve vermoeidheid een prominent symptoom bij individuen met mitochondriale ziekte maar de prevalentie, impact en etiologie ervan wordt nog niet goed begrepen.

In een eerdere studie toonden we dat ondubbelzinnig onderscheid gemaakt kan worden tussen gezonde controles en individuen met gedocumenteerde mitochondriale myopathie [Celie B, Boone J, Smet J et al. Forearm Deoxyhemoglobin and Deoxymyoglobin (Deoxy[Hb+Mb]) Measured by Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Using a Handgrip Test in Mitochondrial Myopathy. Appl. Spectrosc. (2015) 69: 342-347] d.m.v. NIR-spectroscopie in voorarm-spieren tijdens een ‘incremental cyclic contractions protocol’ [cyclus van spier-samentrekkingen met oplopende intensiteit] (ICCP) [Celie B, Boone J, Van Coster R, Bourgois J. Reliability of Near Infrared Spectroscopy (NIRS) for Measuring Forearm Oxygenation During Incremental Handgrip Exercise’’. Eur. J. Appl. Physiol. (2012) 112: 2369-2374]. Het doel van de huidige studie was om NIR-spectroscopie te gebruiken als een niet-invasief screening-instrument voor mitochondriale dysfunktie bij individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid zonder co-morbiditeit en geselekteerd na multidisciplinaire beoordeling [Vraag is: hoe onbevooroordeeld dit gebeurde wetende dat de artsen van het Gentse ‘CVS referentiecentrum’ de biopsychosociale school’ aanhangen…]. De deelnemers waarbij abnormale NIR-spectroscopie resultaten werden gevonden werden verder onderzocht d.m.v. spier- en huid-biopten [niet allemaal, zie ook onze inleiding] alsook bloed-onderzoeken om morfologische, biochemische of genetische abnormaliteiten in hun mitochondrieën en mitochondriaal DNA (mtDNA) te documenteren. Er werd ook bloed afgenomen van individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid en normale NIR-spectroscopie resultaten.

Methodes

Deelnemers

Er werden 2 groepen individuen vergeleken. Een eerste bestond uit 12 patiënten met de diagnose ‘ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid, zonder co-morbiditeit’ [niet noodzakelijk ME.(cvs)]. De tweede bestond uit 12 voor leeftijd en geslacht gematchte ongetrainde gezonde controles. De patiënten met ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ werden gerecruteerd via de Afdeling Algemene Interne Geneeskunde van het Universitair Ziekenhuis van Gent, België. […] De leeftijd, lengte en gewicht van de patiënten (11 vrouwen, 1 man) waren 45 ± 8 jaar, 165 ± 6 cm & 71 ± 17 kg (gemiddelde ± standaard-deviatie). De controles (11 vrouwen, 1 man) waren gematcht voor leeftijd en geslacht. Hun leeftijd, lengte en gewicht waren 46 ± 8 jaar, 168 ± 7 cm & 70 ± 15 kg.

Diagnostisch beslissingmaking-proces voor Onverklaarde Abnormale Vermoeidheid

Voor de beoordeling van tot dusver onverklaarde en langdurige abnormale vermoeidheid, volgden we een holistische benadering gebaseerd op het biopsychosociaal model van Wessely et al. [!!!] Het geïntegreerd diagnostisch pad omvatte een internistische beoordeling, psycho-diagnostische screening, revalidatie-beoordeling en polysomnografie gecombineerd met een multipele slaap-latentie-test [EEG-registraties met een tussentijd van ongeveer 2 uur om het slaap-patroon overdag te onderzoeken]. De internistische beoordeling bestond uit een uitgebreide anamnese, met oog voor eerdere medische diagnoses of onderzoeken, en een lichamelijk onderzoek met bijkomende onderzoeken indien daar indicatie voor was. Een revalidatie-arts evalueerde de aanwezigheid van musculoskeletale co-morbiditeit waarvoor fysiotherapie voor bestaat. De psycho-diagnostische werd uitgevoerd door een klinisch psycholoog en omvatte anamnese, gevalideerde vragenlijsten en psychologische testen. Er had een psychiatrisch consult plaats wanneer de voorgeschiedenis suggestief was voor eerdere of huidige psychiatrische problemen, en wanneer er hints voor de aanwezigheid van een psychiatrische aandoening opdoken uit de psycho-diagnostische evaluatie of de multidisciplinaire bespreking. De uitkomst van deze multidisciplinaire bespreking was een diagnostische klassificatie in: (1) ‘ondubbelzinnige onverklaarde abnormale vermoeidheid’, (2) onverklaarde abnormale vermoeidheid met co-morbiditeit of (3) een aandoening die onverklaarde abnormale vermoeidheid uitsluit. Bij ondubbelzinnige en onverklaarde abnormale vermoeidheid waren naast elkaar bestaande slaap- of psychiatrische aandoeningen uitgesloten. Zodoende werd het diagnostisch proces niet beperkt tot enkel tekenen en symptomen. Zonder de discussie te willen aangaan omtrent de controversiële syndroom-definities, hebben we geopteerd voor het gebruik van de benaming ‘onverklaarde abnormale vermoeidheid’ om deze patiënten te beschrijven. [M.a.w. dit artikel handelt niet over M.E.(cvs) per se.]

‘Incremental Cyclic Contraction Protocol’ (ICCP)

Het ICCP bestond uit ritmische handgreep-samentrekkingen met oplopende intensiteit […]. Deze test werd uitgevoerd in ruglig m.b.v. een handgreep-dynamometer. Na bepaling van de maximale vrijwillige contractie kracht (MVC) […] werd de NIR-spectroscopie sonde op de M. flexor carpi ulnaris [spier die het polsgewricht laat buigen] & de M. flexor digitorum superficialis [onderarm-spier die zorgt voor buiging van alle vingers behalve de duim] geplaatst om de microvasculaire zuurstof-extractie te bepalen. Dit protocol startte met het afsluiten van de voorarm-arterie door het opblazen van een manchet tot 260 mmHg (onbepaalde duur, tot een evenwicht-toestand in deoxy[Hb+Mb] [deoxy-haemoglobine/ -myoglobine = haemoglobine/myoglobine dat niet gecombineerd is met zuurstof; het verschil qua weefsel absorptievermogen tussen de 2 geeft de balans tussen de aan- en afvoer van zuurstof in kleine bloedvaten] werd bereikt). De taak bestond uit periodes van 2 min waar oplopende samentrekkingen werden uitgevoerd (1 sec contractie, 1 sec relaxatie), met verschillende intensitieiten van de vrijwillige contractie kracht (% MVC). De samentrekking-periodes werden onderbroken door 60 sec rust. De arbeid-intensiteit begon aan 20% MVC en verhoogde per stap met 10% MVC. Het ICCP werd uitgevoerd tot er uitputting optrad. […] Het onderscheid tussen normale en abnormale NIR-spectroscopie responsen was overwegend gebaseerd op de resultaten van eerdere research; waarbij gezonde controles in staat bleken tot een funktionele toename van hun microvasculaire O2-extractie tot 72,8 % van hun maximale ‘gedwongen’ O2-extractie (tijdens arteriële occlusie [afsluiting]), terwijl MM-patiënten een gemiddelde maximale O2-extraction van 26 % bereikten. MM-patiënten vertoonden een homogene respons op deze handgreep-inspanning met een zeer klein deoxy[Hb+Mb] bereik van 17,2-34,4% van de gedwongen maximale O2-extractie. Eerder hebben we een goede test-hertest betrouwbaarheid van deze NIR-spectroscopische metingen bij gezonde controles getoond […]. Er werd enkel een hertest bij de patiënten uitgevoerd om de resultaten van de eerste test te bevestigen.

Metingen en analyse van de gegevens

NIR-spectroscopie. De skelet-spier weefsel-oxygenatie werd non-invasief gemeten d.m.v. een systeem gebaseerd op absorptie van infrarood (IR) licht, waarbij IR licht van verschillende golflengten wordt uitgezonden. De veranderingen in deoxyhaemoglobine en deoxymyoglobine (deoxy[Hb+Mb]) tijdens het ICCP (t.t.z. het gemiddelde van de hoogste 10 sec) werden uitgedrukt in verhouding met de arteriële occlusie, om mogelijke invloeden van de dikte van het vetweefsel in de voorarm en eventuele deconditionering-effekten te verminderen.

Analyses van skeletspier[biopt]en en huid-fibroblasten

Biopten. 4 individuen met abnormale deoxy[Hb+Mb] waarden (in %) tijdens het ICCP werden uitgenodigd om weefsel-biopten ondergaan om mitochondriale abnormaliteiten te documenteren. 3 daarvan (S1, S2 & S3) gaven toestemming voor skeletspier- (quadriceps) en huid-biopten. […] De spier-biopten werden verwerkt voor licht- en elektronen-microscopie & spectrofotometrische analyse, terwijl de huid-biopten dienden voor primaire fibroblast culturen. […]

Microscopische evaluatie van skeletspier[biopten]

[…]

Funktionele evaluatie van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)

Er werd een standaard spectrofotometrische analyse gebruikt voor de meting van de aktiviteiten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) complexen (I, II, II+III, III & IV) en citraat-synthase in skeletspieren. Dezelfde enzymen werden getest in gecultiveerde huid-fibroblasten (uitgezonderd complex-I). Z-score [gestandaardiseerde waarde] = aktiviteit van het patient-staal min de gemiddelde aktiviteit van de controle-stalen gedeeld door de standaard-deviatie van de controle-stalen. De patient-aktiviteit wordt als deficiënt beschouwd als de Z-score < -3.0 is.

Immuno- en fluorescente kleuring van gecultiveerde huid-fibroblasten

[…]

Sequentie-bepaling van het volledig mitochondriaal genoom

[…]

Statistische Analyse

[…]

Resultaten & bespreking

Er werden significante verschillen gevonden qua deoxy[Hb+Mb] in de groep met onverklaarde abnormale vermoeidheid in vergelijking met een groep gezonde controles (P = 0.019). […] De gemiddelde deoxy[Hb+Mb] waarden tijdens de ICCP waren significant beïnvloed door een subgroep van 4 individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid. Bij deze individuen konden geen significante toenames qua deoxy[Hb+Mb] worden gevonden (test & hertest). Analyse van deze individuele resultaten toonde dat 3 individuen (S1, S2 & S4) een identiek, abnormaal deoxy[Hb+Mb] profiel hadden (test & hertest), wat gelijkaardig was met eerdere observaties bij patiënten met mitochondriale myopathie (MM). Volgens de resultaten van deze laatste studie, konden mitochondriale defekten bij gezonde controles worden uitgesloten, op basis van hun deoxy[Hb+Mb] profiel in de huidige studie. Bij 1 patient (S3) werd dit gewijzigd profiel slechts gevonden bij de hertest (normale deoxy[Hb+Mb] respons tijdens de eerste test), wat aangeeft dat de deoxy[Hb+Mb] respons van dit individu tijdens ICCP niet dezelfde was bij test en hertest.

Voor het testen van het mitochondriaal membraan potentiaal (ΔΨ [ΔΨmt; het spanning-verschil tussen het buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]) werden JC-1 [fluorescente kleurstof die aktieve (rood) en inaktieve (groen) mitochondrieën kleurt; mitochondriale depolarisatie wordt aangegeven door een afname van de rood/groene fluorescentie-intensiteit] en MitoTracker [fluorescente kleurstof die afhankelijk van het membraan-potentiaal de mitochondrieën labelt] testen aangewend, welke geen wijzigingen qua ΔΨ opbouw oppikten. Hoewel de JC-1 fluorescente kleuring homogeen was bij controles en in fibroblasten van S2, vertoonden cellen van S1 & S3 een mozaïek-patroon [doordat de aanwezigheid van mtDNA-afwijkingen varieert van cel tot cel] aangezien een subset cellen voornamelijk inaktieve (groene) mitochondrieën bevatte. Dit mozaïek-patroon doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (e.g. punt-mutatie, deletie of depletie van het mtDNA). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. In tegenstelling daarmee was de immunokleuring voor het oxidatieve fosforylatie complex-II (een complex dat enkel nucleair gecodeerde strukturele subunits bevat) normaal voor alle cel-lijnen (gegevens niet getoond), wat verder duidt op een onderliggend mtDNA-gerelateerd defekt.

De 4 abnormaal vermoeide individuen waarbij gedaalde zuurstof-extractie werd gedocumenteerd, droegen een pathogene mtDNA-variant. Het eerste individu (S1) bleek homoplasmatisch voor de m.961 T>C variant in gecultiveerde huid-fibroblasten en skeletspier. [homoplasmie voor een mutatie wil zeggen: alleen afwijkend mtDNA] Uit de literatuur is bekend dat de m.961 T>C variant gelinkt is met ‘non-syndromic hearing impairment’ [gedeeltelijk of totaal gehoor-verlies dat niet gepaard gaat met andere tekenen en symptomen]. De patient klaagde daadwerkelijk over gehoor-verlies sinds de vroege kindertijd en haar audiogram toonde significant gehoor-verlies in de hoge frequenties. Zoals verwacht op basis van het maternaal overerving-patroon of mtDNA, was haar moeder ook homoplasmatisch voor deze m.961 T>C variant. Er is weinig geweten over de prevalentie van deze mtDNA-wijziging. Poolse onderzoekers vonden dat slechts 2 op 500 gezonde individuen (0,4%) deze variant droegen in Polen. Onze tweede deelnemer (S2) had de m.1555A>G variant in homoplasmie, zoals haar moeder. Deze m.1555 A>G variant is geassocieerd met aminoglycoside-geïnduceerde doofheid welke maternaal wordt overgedragen […] Naar ons weten zijn er geen meldingen over de incidentie [mate van voorkomen] van de m.1555 A>G variant in de algemene bevolking. Er zijn slechts studies beschikbaar die prevalenties variërend tussen 0-0,70% tonen. De vierde deelnemer (S4) in onze studie bleek homoplasmatisch voor de m.14484 T>C variant in het MT-ND6 gen, wat één van de mtDNA-varianten is die geassocieerd zijn met Leber hereditaire optische neuropathie (LHON [plots verlies van gezichtsvermogen door afsterven van cellen in de oogzenuw]). Zoals verwacht waren alle onderzochte matrilineaire [in vrouwelijke lijn] verwanten (moeder en 6 nakomelingen) homoplasmatisch voor deze LHON-mutatie. LHON wordt veroorzaakt door een mitochondriaal overgeërfde degeneratie van de retinale ganglion cel-laag [type neuronen van het netvlies] en optische zenuw, leidend tot sub-acuut of acuut pijnloos, bilateraal visueel falen bij jong-volwassenen, voornamelijk mannen. De m.14484 T>C die de p.(Met64Val) substitutie [door de mutatie bepaalde omwisseling van het betreffend aminozuur in het proteïne] in de MT-ND6 subunit van complex-I veroorzaakt, is 1 van de 3 belangrijke mtDNA primaire mutaties van LHON. Ca. 50% van de mannen en 10% van de vrouwen met deze mutaties ontwikkelen optische neuropathie. Prevalentie-studies aangaande Leber hereditaire optische neuropathie werden meestal in West-Europa uitgevoerd: de prevalenties lagen tussen 1,36-3,22 per 100.000 voor de 3 meest frequente LHON-mutaties tesamen. Er werd een rigoureuze klinische en genetische studie betreffende LHON uitgevoerd in het noord-oosten van Engeland: in een populatie van 2,2 miljoen werden alle patiënten met onverklaard visueel falen en hun familieleden gescreend. Stamboom-analyse onthulde een minimum prevalentie voor m.14484 T>C van 0,3 per 100.000. Bij deelnemer 3 (S3) werden geen pathogene punt-mutaties gedetekteerd maar er werden meerdere deleties gevonden in het mitochondriaal genoom. De incidentie van multipele mtDNA-deleties in de algemene bevolking is onbekend. Als we voor de m.961 T>C mutatie een incidentie van 4/1.000 aannemen, voor de m.1555 A>G mutatie een incidentie van 7/1.000 en voor de m.14484 T>C mutatie een incidentie van 0,003/1000, is de kans dat een individu één van deze mitochondriale punt-mutaties draagt 0,011 [(4.000+7.000+3)/1.000.000]. In tegenstelling daarmee werd gevonden dat 3 van de 12 (0,25) individuen in onze studie één van deze pathogene punt-mutaties droegen. […] Geen enkele van de 8 patiënten met onverklaarde abnormale vermoeidheid waarbij normale NIR-spectroscopie resultaten werden verkregen, bleken een pathogene variant in hun mtDNA te dragen [sequentie-bepaling].

In de literatuur zijn er geen meldingen van NIR-spectroscopie abnormaliteiten gedetekteerd bij individuen die een uiteindelijke diagnose van CVS kregen. In een studie waarbij 16 patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/CVS werden vergeleken met 16 gezonde controles (handgreep-test/NIR-spectroscopie) [Miller RR, Reid WD, Mattman A, Yamabayashi C et al. Submaximal Exercise Testing with Near-Infrared Spectroscopy in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Patients Compared to Healthy Controls: A Case-Control Study. J. Transl. Med. (2015) 13: 159], werd geen significant verschil tussen de 2 groepen gevonden. In een andere studie werden bloedstalen van 193 CVS-patiënten (Canadese criteria) genetisch geanalyseerd voor mogelijke mtDNA-variaties d.m.v. sequentie-bepaling van het ganse mitochondriaal genoom. [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. J. Transl. Med. (2016) 14: 19] In deze laatste studie werd de sequentie van gans het mtDNA bepaald en geen enkele van de bekende pathogene mitochondriaal DNA mutaties werden gedetekteerd bij de individuen met CVS. Men zou een mogelijke heterogeniteit in verschillende groepen gelabeld als CVS in gedachten moeten houden, gezien de variabiliteit qua gebruikte definities, en verschillen qua diepgang van zowel somatische als psychiatrische diagnostische screening en het verstrekken van gegevens over de familiale geschiedenis.

Aangezien de 4 individuen werden gescreend via een gedaalde zuurstof-extractie tijdens inspanning van de voorarm-spieren, had een in vitro zuurstof-consumptie test moeten worden uitgevoerd in voorarm-skeletspier stalen om de gedaalde zuurstof-consumptie te bevestigen. Omwille van ethische redenen was het echter niet mogelijk om een skeletspier-biopt te nemen in voorarm-spieren gezien de hoge concentratie zenuwen en capillairen. In plaats daarvan werd een batterij diagnostische testen aangewend om aan te tonen dat de mtDNA-abnormaliteiten inderdaad een negatieve funktionele impact op de mitochondrieën hadden. Er werd een afname of complex-I aktiviteit en van complex-II+III aktiviteit in skeletspieren, en een daling van complex-IV aktiviteit in gecultiveerde huid-fibroblasten gedetekteerd in S2 m.b.v. spectrofotometrische analyse. In skeletspieren van S3 werd een vermindering van OXPHOS complex-IV aktiviteit gedetekteerd (uitgedrukt t.o.v. OXPHOS complex-II aktiviteit). De JC-1 groene en rode fluorescente kleuring van […] cellen van S1 & S3 toonde een mozaïek-patroon dat doet denken aan het patroon dat wordt gezien bij individuen met mtDNA-abnormaliteiten (punt-mutatie, deletie, depletie). Immunocytochemische kleuring voor de oxidatieve fosforylatie complex-IV subunit-I toonde verminderde kleuring in gecultiveerde huid-fibroblasten van S2 & S3. […] Bij elk van de 3 patiënten [die toestemmming gaven voor een biopt] werden één of meer mitochondriale abnormaliteiten gedetekteerd. Bij S4 waren bijkomende testen niet mogelijk aangezien de patient een huid/spier-biopt had afgewezen. S4 was echter homozygoot voor de m.14484 T>C mutatie die onbetwijfeld als een pathogene mutatie wordt beschouwd.

Besluit

Via niet-invasieve screening met NIR-spectroscopie en een ICCP, identificeerden we een subgroep [sterk uitgedrukt voor maar 4 op 12 patiënten…] individuen met onverklaarde abnormale vermoeidheid die drager zijn van een pathogene mtDNA variant. NIR-spectroscopie zou een krachtige techniek kunnen zijn om deze individuen te detekteren. Het spreekt vanzelf dat verdere studies met grotere groepen met onverklaarde abnormale vermoeidheid vereist zijn om onze bevindingen te bevestigen en hun klinische significantie te evalueren.

————————-

We herinneren er ook nog eens aan dat het meten van de ‘baseline’ spier-pH (via magnetische resonantie spectroscopie) metabole onevenwichten bij rust kan aantonen (bv. bij ernstige mitochondriale myopathieën). In ‘Abnormale zuur-verwerking in spieren bij CVS’ kan men lezen dat deze niet significant verschilde tussen controle- en CVS/M.E.-groepen…

Men weet ook dat bij bepaalde myopathieën het ryanodine receptor gen is aangetast (mutaties). Daarom willen we, n.a.v. het bovenstaande nog es oproepen tot meer research hieromtrent (zie ‘Ryanodine receptor & inspanning’)…

maart 23, 2018

Verband van CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 7:34 am
Tags: , , , , , , ,

Telomeren zijn de repetitieve sequenties die de uiteinden van chromosomen beschermen en de genomische integriteit helpen bewaren. Menselijke chromosomen worden begrensd en gestabiliseerd door telomeren. Ze bestaan uit meerdere duizenden copieën van een hexameer (6 nucleotiden) sequentie (TTAGGG)n ondersteund door een complex van DNA-bindende proteïnen en enzymes. Telomeren zorgen er voor dat de chromosoom-uiteiden worden herkend als beschadigd DNA waarbij herstel van de dubbele streng nodig is. Telomeren worden wel eens vergeleken met de plastic tip aan het uiteinde van een schoenveter: ze voorkomen degradatie en ‘uitrafeling’ van chromosomen. Telomeren variëren in lengte tussen chromosoom en individuen. Ze verkorten met elk cel-deling omdat de zeer repetitieve DNA-sequenties niet efficient worden gecopieerd (het zgn. ‘end replication problem’), wat leidt tot een progressief verlies van de gemiddelde telomeer-lengte (15 tot > 60 baseparen per jaar). De mate van telomeer-slijtage is het hoogst gedurende de eerste levensjaren maar stijgt ook na de leeftijd van 50 jaar.

De telomeer-lengte werd eerder al gelinkt met fibromyalgie-pijn (‘Pain is associated with short leukocyte telomere length in women with fibromyalgia’. J Pain (2012) 13: 959-69).

De groep die onderstaande studie uitvoerde, publiceerde in 2016 al een samenvatting van de resultaten die ze hadden voorgesteld op de Experimental Biology Meeting dat jaar (‘Telomere length analysis in Chronic Fatigue Syndrome’ in The FASEB Journal 30). Nu dus een uitgebreid artikel.

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 44 (februari 2018)

Association of Chronic Fatigue Syndrome with premature telomere attrition

Mangalathu S. Rajeevan (1), Janna Murray (1,2), Lisa Oakley (1,3), Jin-Mann S. Lin (1), Elizabeth R. Unger (1)

1 Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

2 Influenza Division, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

3 College of Public Health and Human Services, Oregon State University, Corvallis, USA

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook bekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een ernstig invaliderende aandoening met onbekende etiologie. De symptomen en risico-factoren van M.E./CVS delen kenmerken met de versnelde veroudering die geïmpliceerd is bij meerdere ziekten. Gebruikmakend van telomeer-lengte als merker, werd deze studie uitgevoerd om de hypothese te testen dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering.

Methodes Gegevens van de deelnemers (n = 639) kwamen van de follow-up van de Georgia CVS-studie. De deelnemers werden geklassificeerd – gebruikmakend van de 1994 ‘CFS Research Case Definition’ met op vragenlijsten gebaseerde subschaal drempels voor vermoeidheid, funktioneren en symptomen – in 4 ziekte-groepen: CVS als aan alle criteria werd voldaan (n = 64), CVS-X als CVS met uitsluitende aandoeningen (n = 77), ISF (onvoldoende symptomen/vermoeidheid) als slechts aan enkele criteria werd voldaan ongeacht uitsluitende aandoeningen (n = 302) en NF (niet-vermoeid) als niet aan de criteria werd voldaan en er geen uitsluitende aandoeningen waren (n = 196). De relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio) [de verhouding van telomeer PCR-signaal (T) op het PCR-signaal van een ‘single copy’ gen (S); deze is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel en wordt uitgedrukt t.o.v. de T/S-ratio van een referentie-DNA] werd gemeten gebruikmakend van DNA uit vol bloed en ‘real-time’ PCR. Er werden algemene lineaire modellen gebruikt om het verband te bepalen tussen ziekte-groepen of T/S-verhouding en demografische gegevens, biologische metingen en co-variabelen (significantie p < 0.05).

Resultaten De gemiddelde T/S-ratio verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratios bij CVS (0.90 ± 0.03) en ISF (0.94 ± 0.02) waren elk significant lager dan voor NF (1.06 ± 0.04). Verschillen qua T/S-verhouding bij de ziekte-groepen bleven significant na aanpassing voor co-variabelen (leeftijd, geslacht, ‘body-mass-index’, lende/heup-verhouding, post-exertionele malaise en opleidingsniveau). De telomeer-lengte was 635, 254 & 424 baseparen korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, t.o.v. van NF. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering bij CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF, respectievelijk. Verder toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht aan dat de associatie van of M.E./CVS met korte telomeren grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar.

Besluiten Deze studie vond een significant verband tussen M.E./CVS en vroegtijdige telomeer-slijtage die grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten geven aan dat M.E./CVS kan worden opgenomen in de lijst van aandoeningen die geassocieerd zijn met versnelde veroudering. Er is verder werk vereist om de funktionele betekenis van die versnelde veroudering bij M.E./CVS te evalueren.

Achtergrond

[…]. De symptomen en risico-factoren voor M.E./CVS hebben kenmerken die gemeenschappelijk zijn met deze voor versnelde veroudering/vroegtijdige immunosenescentie [de geleidelijke verslechtering van het immuunsysteem veroorzaakt door natuurlijk ouder-worden]. Versnelde veroudering bleek betrokken bij meerdere ziekten en slechte gezondheid-resultaten, en telomeer-lengte is een alom gebruikte merker van versnelde veroudering.

Telomeren zijn meerdere duizenden ‘repeats’ van TTAGGG nucleotide-sequenties die de uiteinden van lineaire chromosomen begrenzen. Telomeren verkorten tijdens elke serie cel-replicatie […] en zodoende weerspiegelt telomeer-lengte de replicatie-geschiedenis van cellen en bepaalt ze de levensduur van cellen. Omwille van de graduele erosie van telomeren bij elke cel-deling, is leeftijd de sterkste voorspeller van de telomeer-lengte van een individu. Meerdere rapporten geven echter geslacht-verschillen aan: voor leeftijd aangepaste telomeer-lengte van leukocyten bleek langer bij volwassen vrouwen dan mannen. Daarnaast is er ook een impact op telomeer-lengte door andere genetische, epigenetische, fysiologische en omgeving-factoren. Deze factoren dragen bij tot de variabiliteit van zowel de absolute telomeer-lengte en de mate van telomeer-verkorting bij individuen. Chronische inflammatie en oxidatieve stress kunnen telomeer-slijtage verhogen, wat mogelijks de associatie van versnelde telomeer-verkorting bij ziekte verklaart [metabole & inflammatoire ziekten, psychiatrische aandoeningen, kanker]. We hypothiseren dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering en dat kortere telomeren kunnen dienen als een merker voor dit verband. We testten onze hypothese betreffende telomeer-lengte gebruikmakend van DNA uit vol bloed met de klemtoon op een aantal demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen [Allostatische belasting is een term uit de psychosomatiek: opéénstapeling van ontregelde fysiologische regelsystemen waardoor de soepelheid van de adaptatie afneemt; een vorm van slijtage; ook: een slechte stress-reaktie, in plaats van je evenwicht te bewaren gaan de stresshormonen je psychisch en lichamelijk ondermijnen. Meten van de ‘allostatic load’ = verzamelen van informatie over fysiologische aktiviteit van meerdere belangrijke regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel, zowel als het cardiovasculair systeem, het immuunsysteem en metabole processen] die waarschijnlijk een invloed hebben op de associatie tussen M.E./CVS-status en telomeer-lengte. Onze resultaten tonen significante telomeer-verkorting aan bij individuen met M.E./CVS en andere vermoeidheid-groepen in de globale studie-groep, waarbij analyses significante vroegtijdige telomeer-erosie bij vermoeide vrouwelijke deelnemers jonger dan 45 jaar onthulden. Deze bevindingen ondersteunen de opname van het model van vroegtijdige en versnelde immunosenescentie in toekomstige studies naar de M.E./CVS-pathofysiologie.

Methodes

Gegevens-bronnen & studie-groep

De gegevens kwamen uit de ‘follow-up’ fase van een 2-ledige populatie-gebaseerde longitudinale studie van CVS en vermoeiende ziekte in Georgia (V.S.) […].

De huidige analyse focuste op gegevens van de klinische evaluatie van deze fase; deze omvatte een gedetailleerde medische anamnese, lichamelijk onderzoek, laboratorium-testen en psychiatrische evaluatie […]. De deelnemers vulden een aantal vragenlijsten in, waaronder de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ (MFI-20), de ‘Short Form Health Survey’ (SF-36 v2) en de ‘CDC Symptom Inventory’ (SI). […] De hartslag (bpm), systolische & diastolische bloeddruk (mmHg), lengte, gewicht, en buik- & heup-omtrekken werden gemeten […]. De afgeleide parameters ‘body-mass-index’ (BMI) en lende/heup-ratio (WHR) werden berekend [BMI = gewicht/lengte2 (kg/m2)]; [WHR = buik/heup (cm/cm)]. De analyse omvatte biologische metingen zoals HDL-cholesterol (mg/dl), triglyceriden (mg/dl), nuchtere glucose (mg/dl), insuline (µIU/ml), C-reactief proteïne (CRP, mg/dl) en albumine (g/dl).

Diagnose CVS: voldoen aan de 1994 internationale research-definitie. Individuen met onverklaarde chronische ziekte met onvoldoende symptomen/vermoeidheid om te voldoen aan alle CVS-criteria werden geklassificeerd in de ‘insufficient symptoms/fatigue’ (ISF) groep. Individuen die aan geen enkele van de CVS-criteria voldeden, werden gegroepeerd als niet-vermoeide (NF) controles. Daarnaast werden de deelnemers in elke groep onderverdeeld in met of zonder uitsluitende medische/psychiatrische aandoeningen. Van de 751 deelnemers die klinisch werden geëvalueerd, voldeden er 71 aan alle CVS-criteria zonder uitsluitende aandoeningen (CVS-groep), 78 voldeden aan alle CVS-criteria maar met uitsluitende aandoeningen (CVS-X groep), 340 voldeden aan de criteria voor ISF ongeacht uitsluitende aandoeningen, 212 voldeden aan de criteria voor NF controles zonder uitsluitende aandoeningen, 47 voldeden aan de criteria voor NF met uitsluitingen en 3 deelnemers werden geklassificeerd als “onbeslist” omwille van onvolledige informatie. […] Uiteindelijk bleven er 639 deelnemers in de 4 ziekte-groepen: 64 CVS, 77 CVS-X, 302 ISF (met en zonder uitsluitende aandoeningen) en 196 NF zonder uitsluitende aandoeningen.

Bepaling van relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio)

De relatieve telomeer-lengte werd gemeten op basis van een alom gebruikt ‘real-time’ PCR protocol […]. De bepaling maakt gebruik van telomeer-specifieke ‘primers’ en hun vermogen om een signaal te genereren dat proportioneel is met de totale opgetelde lengte van alle telomeren in de cel. Dit telomeer-signaal wordt uitgedrukt t.o.v. het signaal dat ontstaat door de amplificatie van het ‘single copy’ gen [gen dat slechts met één enkele kopie in het hele genoom voorkomt] 36B4 [éénvoudig uitgedrukt: een referentie-gen] […]. De verhouding van het telomeer (T) -signaal op het ‘single copy’ gen (S) -signaal (de T/S-verhouding) is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel. Deze verhouding wordt uitgedrukt t.o.v. een referentie-DNA (K562 DNA) waaraan een T/S-ratio van 1,0 wordt toegekend.

[…] De T/S-verhouding kan op 2 manieren worden berekend […]; we gebruikten hier T/S-ratios bekomen via de standaard-curve methode […]. Voorafgaandelijk evalueerden we de reproduceerbaarheid en valideerden we de resultaten [t.o.v. een andere methode]. De T/S-ratios bleken zeer sterk reproduceerbaar […]. Er werd op meerdere niveaus een kwaliteit-controle van de bepaling uitgevoerd, inclusief. […]

Statistische analyses

[…] Er werden ook leeftijd- en geslacht-analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe deze demografische variabelen het verband tussen CVS-status en T/S-ratio beïnvloeden. […] We maakten een schatting van het aantal jaren bijkomende veroudering op basis van een literatuur-waarde voor telomeer-slijtage van 31-63 bp/jaar […].

Resultaten

[…] Het studie-staal (n = 639) bestond voornamelijk uit vrouwen (75%), blanken (76%), levend in een landelijk gebied (50%), met een jaarlijks inkomen van meer dan 40.000 $ (71%), met een gemiddelde leeftijd van 48 jaar […] en een gemiddelde BMI van 28 ± 0,21 kg/m2. Het staal werd opgedeeld in 4 ziekte-groepen: CVS-X (12%), CVS (10%), ISF (47%) & NF (31%). De groepen verschilden niet qua gemiddelde leeftijd en ziekte-duur maar verschilden significant qua metingen van abdominale obesitas (BMI & WHR), geslacht, ras, opleiding, inkomen en PEM [post-exertionele malaise].

We bekeken ook associaties met de ziekte-groepen: biologische metingen zoals telomeer-lengte, metabole variabelen en ‘allostatic load’. De globale T/S-ratio varieerde van 0,269 tot 4,138 (gemiddelde: 0,98; mediaan: 0,917). De gemiddelde telomeer-lengte verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratio bij CVS (0,90 ± 0,03) & ISF (0,94 ± 0,02) lagen elk significant lager dan de NF groep (1,06 ± 0,04). De triglyceriden-concentratie, een maatstaf voor metabool syndroom [chronisch stofwisselingsprobleem met abdominale (centrale) obesitas + hypertensie + verhoogd nuchter bloed-glucose + hoge triglyceriden in het bloed + lage hoge-densiteit lipoproteïnen (HDL)], was significant verschillend voor de ziekte-groepen, maar andere metingen opgenomen bij zowel metabool syndroom en ‘allostatic load’ (HDL, systolische & diastolische bloeddruk en nuchtere glucose) verschilden niet significant. Bij de metingen die specifiek zijn voor ‘allostatic load’, vertoonden hartslag, insuline & CRP significante verschillen, waarbij de gemiddelde CRP-waarde bij CVS-X & CVS 93% hoger lag dan in de NF groep.

Wat betreft bepalingen van de bivariate associaties tussen T/S-ratio en demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen, zagen we een significant omgekeerd verband van telomeer-lengte met de leeftijd (p = 0.0009.), metingen m.b.t. abdominale obesitas [BMI (p = 0.0145), WHR (p = 0.0149)] & PEM (p = 0.0153). De telomeer-lengte was ook significant geassocieerd met opleidingsniveau (p = 0.0288). De telomeer-lengte was niet statistisch significant gerelateerd met enige andere demografische of biologische meting, hoewel associaties met CRP (p = 0.0789) en nuchtere glucose (p = 0.0625) bijna statistisch significant waren.

We controleerden de associatie van gemiddelde telomeer-lengte met ziekte-groepen voor eerder gedefinieerde co-variabelen: leeftijd, BMI, WHR, PEM en opleidingsniveau. Geslacht werd ook opgenomen omwille van het significant verband met CVS. De gemiddelde telomeer-lengte verschillen tussen alle vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X, ISF) en de niet-vermoeide groep bleven significant (p < 0.01) vóór en na controle op co-variabelen. Op basis van de aangepaste groep-gemiddelden was de telomeer-lengte 635, 254 & 424 bp korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, vergelen met de NF groep. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering […].

De significante negatieve lineaire correlatie tussen telomeer-lengte en leeftijd in de globale studie-groep werd bepaald door de statistisch significante relatie onder de NF. Bij de NF in hun twintiger of dertiger jaren was de telomeer-lengte het langst. Bij NF gaf de trend een verkorting van 42 bp/jaar aan, terwijl het bij de andere groepen niet significant was (CVS 17 bp/jaar, CVS-X 22 bp/jaar & ISF 8,5 bp/jaar). De significante associatie van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot deelnemers van < 45 jaar (n = 216). Bij hen waren de telomeren 932 bp (CVS), 767 bp (CVS-X) & 966 bp (ISF) korter t.o.v. NF; ruw-weg 14,8-30,1, 12,2-24,7 & 15,3-31,8 jaar bijkomende veroudering of […].

Hoewel er geen associatie was tussen telomeer-lengte en geslacht in de globale studie-groep, werd het verwachte man/vrouw-verschil gezien in de NF groep: de telomeren waren 713 bp langer bij vrouwen (n = 133; T/S-ratio 1,116) dan mannen (n = 63; T/S-ratio 0,9476). Analyses op basis van geslacht toonden dat het significant verband van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot vrouwen (n = 477). Onder de vrouwelijke deelnemers waren de telomeren in de CVS-groep (n = 58) 957 bp korter (p < 0.001) t.o.v. de NF groep (n = 133). T.o.v. de NF was het verschil 690 bp bij CVS-X (n = 64; p = 0.003) & 711 bp bij ISF (n = 222; p < 0.001), respectievelijk. Ter ondersteuning van dit geslacht-specifiek effekt, bleek uit een analyse van alle mannelijke deelnemers (n = 99) geen significant verschil qua telomeer-lengte voor CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF (n = 63).

Hoewel in alle analyses de gemiddelde telomeer-lengte voor alle ziekte-groepen consistent lager was dan voor de NF groep, werd het grootste verschil gezien in de groep vrouwen jonger dan 45 (n = 175). De mate van telomeer-verkorting bij vrouwen jonger dan 45 was 1.130 bp voor CVS, 1.007 bp bij CVS-X & 1.154 bp bij ISF (t.o.v. NF); […] Bij de vrouwen van minder dan 45 jaar oud, hadden 95% van deze met CVS (21/22) telomeren die korter waren dan de gemiddelde telomeer-lengte (T/S-ratio = 1,2324) of die van de NF (p = 0.0092).

Bespreking

Naar ons weten is dit de eerste studie die telomeer-ersoie aantoont bij patiënten met M.E./CVS, die significant bleef vóór en na controle op leeftijd, geslacht, obesitas (BMI, WHR), PEM en opleidingsniveau. Bovendien toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht dat deze associatie van korte telomeren bij M.E./CVS grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen jonger 45 jaar. Overéénkomstig met studies in de algemene bevolking vertoonde onze studie-groep een omgekeerd verband van telomeer-lengte met leeftijd maar, interessant, de associatie was slechts statistisch significant bij NF deelnemers. Het leeftijd-gerelateerd verschil qua telomeer-lengte was meer uitgesproken voor het 40ste levensjaar, en analyse gaf aan dat het significant verband van telomeer-lengte met vermoeidheid-groepen was beperkt tot deelnemers jonger dan 45. Gelijkaardig met de bevindingen van deze studie, vonden andere researchers dat vroegtijdige telomeer-slijtage meer significant was bij met Lupus Erythematosus en Reumatoïde Artritis van jonger dan 40-45.

Globaal gezien, en in overéénkomst met studies van de algemene bevolking, waren telomeren significant langer bij vrouwen in vergelijking met mannen in de NF groep. Dit geslacht-gerelateerd verschil in telomeer-lengte werd echter niet gezien bij de vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X & ISF). Wanneer de analyse van telomeer-lengte per ziekte werd gestratificeerd per geslacht, was de telomeer-verkorting met betrekking tot NF individuen enkel significant bij vrouwen. De telomeer-lengte bleef echter zonder significant verschil bij mannelijke deelnemers in de analyse die alle mannen met CVS, CVS-X en ISF combineerde in één groep t.o.v. NF; dit impliceert dat het onwaarschijnlijk is dat het geslacht-specifiek effekt te wijten is aan een verschil van de grootte van de stalen. Er werd voorgesteld dat in de algemene bevolking het hormoon oestrogeen een rol speelt bij het behouden van lange telomeren en langere levensduur bij vrouwen t.o.v. mannen (door het stimuleren van telomerase [enzyme dat de chromosoom-uiteinden herstelt] in specifieke doelwit-cellen of via het verminderen van de belasting van oxidatieve stress te wijten aan een effekt van oestrogeen op reaktieve zuurstof-soorten (ROS). Er werd gerapporteerd over lage oestrogeen-waarden geassocieerd met korte telomeren bij vrouwen. CVS heeft een hogere prevalentie bij vrouwen en gynecologische factoren zoals vroege menopauze en hysterectomie bleken geassocieerd met CVS [Boneva RS, Lin JM, Unger ER. Early menopause and other gynecologic risk indicators for Chronic Fatigue Syndrome in women. Menopause. (2015) 22: 826-34]. Deze bevindingen, tesamen met onze observatie van korte telomeren bij vrouwelijke individuen jonger dan 45 met CVS, CVS-X & ISF, suggereren de nood aan verdere studies aangaande de dynamiek van telomeer-lengte in relatie met leeftijd, geslachtshormonen, gynecologische voorgeschiedenis en de aanvang van CVS.

Er werd voor een brede waaier aan chronische ziekten gerapporteerd dat gestegen waarden qua inflammatoire merkers  – zoals CRP en cytokines zoals interferon-γ (IFN-γ), tumor necrose factor α (TNF- α), interleukine-1 & -6 (IL-1, IL-6) – geassocieerd zijn met ziekte-progressie, slechte levenskwaliteit en slechte therapeutische uitkomsten. Deze rapporten omvatten diabetes, chronische obstructieve pulmonaire ziekte, nier-falen, psychiatrische/neurologische aandoeningen, cardiovasculaire ziekte en andere chronische/auto-immune/infektueuze ziekten, inclusief M.E./CVS. Er werd ook vesnelde verkorting van telomeren gemeld bij van veel van deze chronische/auto-immune ziekten. In de meeste gevallen werden inflammatie en telomeer-verkorting afzonderlijk bestudeerd en een oorzakelijk verband tussen deze 2 processen die optreden in dezelfde cellen moet nog worden opgehelderd; hoewel werd voorgesteld dat zowel telomeer-verkorting als inflammatie kunnen betrokken bij een bidirectioneel oorzaak-gevolg relatie. Telomeer-slijtage kan werken als een sterke inducerende factor voor pro-inflammatoire cytokinen in verschillende cel-types tijdens het verouderen (een fenomeen genaamd senescentie-geassocieerde secretorische fenotypes, SASP [karakteristieke eigenschap van of senescente cellen; omvat inflammatoire cytokinen, groei-factoren & proteasen]) of chronische inflammatie kan telomeer/telomerase-dysfunktie veroorzaken op een directe manier via de aanmaak van ROS die resulteert in beschadigd telomeer-DNA. Beide mogelijkheden zouden de eerder gerapporteerde omgekeerde relatie van telomeer-lengte met oxidatieve stress en IL-6 (een component van SASP) kunnen verklaren bij individuen met depressie. Het is interessant op te merken dat senescentie-merkers zoals IL-6 en p16INK4a geassocieerd bleken met een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker-vermoeidheid syndroom na cytotoxische chemotherapie. Eliminatie van senescente cellen in een dier-model voor chemotherapie-geïnduceerde vermoeidheid herstelde de normale fysieke aktiviteit bijna volledig. Het feit dat de incidentie van ernstige vermoeidheid bij borst-kanker patiënten correleerde met de hoogste p16INK4a waarden suggereert dat een verhoogde totale belasting door senescente cellen vermoeidheid kan veroorzaken [vooral onderzocht bij kanker]. We vonden significante associatie van M.E./CVS met hogere CRP-waarden, en een marginaal verband van hogere CRP-waarden met kortere telomeren in onze studie. Een gelijkaardige omgekeerde maar sterkere associatie van CRP en telomeer-lengte werd gerapporteerd in verband met het risico op cardiovasculaire ziekte en obesitas. Het is aannemelijk dat pro-inflammatoire cytokinen de produktie van CRP zouden stimuleren, wat dan weer zou bijdragen tot telomeer-verkorting door oxidatieve stress. In combinatie met deze eerdere studies, suggereren onze observaties dat chronische inflammatie en/of oxidatieve stress kan bijdragen tot versnelde telomeer-verkorting of vice versa bij minstens een subgroep van individuen met M.E./CVS. Bovendien kunnen leeftijd-gerelateerde fundamentele en translationele studies beloftevolle paden aanwijzen om het risico te bepalen en therapeutische benaderingen te beoordelen die gebruikmaken van een nieuwe klasse senolytische medicijnen [eenvoudig gezegd: die ouderdom-ziekten vertragen, voorkomen, verlichten of omkeren] die zich richten op senescente cellen, om de symptomen van M.E./CVS te verlichten [dasatinib (middel tegen leukemie), quercetine, fisetine (natuurlijk flavonoïde), piperlongumine (stof uit een peper-plant met mogelijke anti-kanker eigenschappen), navitoclax (ABT263; anti-kanker geneesmiddel) en selektieve BCL-XL inhibitoren].

De mitochondriale funktie neemt ook af met de leeftijd, voornamelijk onder de vorm van verstoorde ATP-produktie en verhoogde aanmaak van ROS, welke beiden geassocieerd zijn met chronische ziekten. Hoewel details van de potentiële wisselwerking tussen telomeer-verkorting en mitochondriale dysfunktie onbekend zijn, bleken veel chronische ziekten zoals metabole, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten, diabetes, stemming- en andere psychologische aandoeningen met aangetoonde telomeer-verkorting ook geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en oxidatieve stress die DNA-schade kunnen veroorzaken. Metaboloom-bevindingen [Levine SM, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol BioSyst. (2017) 13: 371-9 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-80] suggereren dat M.E./CVS een hypometabool syndroom is dat verband kan houden met mitochondriale dysfunktie. Deze studies vonden ook dat de metabolomica van M.E./CVS geslacht-specifiek zijn [Fluge O, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Bijkomende studies die het verband onderzoeken tussen een geslacht-specifieke hypometabole toestand en telomeer-slijtage zouden kunnen helpen bij het begrijpen van de pathofysiologie van M.E./CVS.

Er zijn meerdere sterktes verbonden aan deze exploratieve studie aangaande de associatie van telomeer-lengte met CVS. Deze omvatten een relatief grote globale studie-groep (n = 639) bestaande uit deelnemers gegroepeerd in 4 ziekte-toestanden (CVS, CVS-X, ISF & NF), controle van ziekte-status en telomeer-lengte met een aantal demografische en biologische metingen, en validatie van de qPCR-methode wat betreft reproduceerbaarheid en overéénkomst met [een andere] methode. De studie heeft ook zwaktes, inclusief het ‘cross-sectioneel’ ontwerp en onvermogen de ziekte-duur & gebruikte medicatie te evalueren of controleren. De qPCR-methode levert slechts globale gemiddelde telemeer-lengte op en herkent de individuele korte telomeren niet of biedt geen info over de mate van pathologisch kritieke korte telomeren. In deze zin is de diagnostische bruikbaarheid van de bepaling van de telomeer-lengte d.m.v. qPCR beperkt maar het is vergelijkbaar met andere methodes wat betreft accuraatheid voor associatie-studies van telomeer-lengte met ziekten. Een verdere beperking van onze bepaling is dat we DNA uit vol-bloed (dat lymfocyten, monocyten en granulocyten bevat) gebruikten. Zodoende vertegenwoordigt de hier vastgestelde telomeer-lengte enkel de gemiddelde telomeer-lengte van de verschillende bloedcel-types i.p.v. bloedcel-type specifieke of de telomeer-lengte verdeling van verschillende chromosomen in een bepaald cel-type.

Besluit

Deze studie toont een significant verband van M.E./CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage, grotendeels bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten dienen onafhankelijk te worden gerepliceerd bij een grote groep en met methodes die een verbeterde diagnostische waarde qua kunnen bijdragen aan de meting van telomeer-lengte. Deze observatie van kortere telomeren tesamen met meldingen van laag- of hoog-gradige inflammatie gemedieerd door pro-inflammatoire cytokinen en metabool verval/mitochondriale dysfunktie biedt op meerdere vlakken ondersteuning om M.E./CVS op te nemen in de lijst van aandoeningen geassocieerd met versnelde veroudering die getriggerd zou kunnen worden door genetische, epigenetische, infektueuze, stress of andere omgeving-factoren. Er is verder werk nodig om de funktionele betekenis te evalueren, en de specifieke bijdrage van genetische, epigenetische en omgeving-factoren aan versnelde ouder-worden bij M.E./CVS.

januari 25, 2018

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 12:26 pm
Tags: , , , , , , ,

In het artikel ‘Metabolic profiling indicates impaired pyruvate-dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome’ (zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’) rapporteerden de Noorse Ritixumab-onderzoekers Øystein Fluge & Olav Mella over een funktionele verstoring van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) op basis van biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. Hun resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van andere metabolisme-researchers.

Een Noorse arts/professor van de afdeling Medische Biochemie van het Universitair Ziekenhuis van Oslo, goed op de hoogte in zake de biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, publiceerde een commentaar/kritiek daarop in een landelijk tijdschrift (enkel in het Noors).

Fluge & Mella hebben het eerder over een PDH-inhibitie (suppressie/onderdrukking). Dit kan misschien een gevolg zijn van een andere dysfunktie in het energie-metabolisme. Nu wordt er geargumenteerd dat er geen deficiëntie is. Spreekt men hier over twee verschillende dingen? Het is bij wetenschappelijk onderzoek ook van belang kritiek in acht te nemen en daarom geven wij dit mee. Bij verder onderzoek kan zeker rekening worden gehouden met de aanbevelingen.

De auteur gaf als belangen-conflict aan dat hij een vergoeding heeft ontvangen voor een lezing op een professioneel forum van psychiaters, ondersteund door het farmaceutisch bedrijf Lundbeck.

————————-

Tidsskr Nor Laegeforen. (2017) 137: 23-24

Tenuous link between Chronic Fatigue Syndrome and pyruvate dehydrogenase deficiency

Yngve Thomas Bliksrud

In een studie van het energie-metabolisme bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom concludeerden onderzoekers verminderde pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit bij patiënten, maar de metingen passen niet bij de veranderingen die we zien bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie.

In een studie gepubliceerd in december 2016 werd een gewijzigd patroon van aminozuren in plasma gevonden bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Bovendien werd veranderde gen-expressie gedetekteerd in witte bloedcellen en veranderde de energie-produktie in spiercellen [zie link in onze inleiding]. De auteurs interpreteren de resultaten als expressie van funktionele remming van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase, en ze suggereren een ontregeling van dit enzyme-complex als mogelijke belangrijke factor in de pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Het onderzoek kreeg uitgebreide aandacht in de [Noorse] media en de link met pyruvaat-dehydrogenase werd openbaar gemaakt zonder voorbehoud. In ons laboratorium ontvingen we stalen voor de metabole screening van patiënten met mogelijk vermoeidheid-syndroom. Op basis van mijn ervaring met biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, wil ik wijzen op gebreken in de studie die moeten aansporen tot een aanzienlijk grotere mate van voorzichtigheid omtrent de conclusies.

Kritiek op methode en interpretatie

In het onderzoek werden aminozuur-concentraties in plasma van 200 patiënten en 102 gezonde controle-personen onderzocht. De onderzoekers vonden significante verschillen tussen de twee groepen maar de betekenis is onduidelijk omdat ze zich niet hebben gebaseerd op de gevestigde diagnose van pyruvate-dehydrogenase deficiëntie en omdat de stalen niet op een gestandaardiseerde manier zijn genomen.

AMINOZUREN-PATROON VOLDOET NIET AAN WAT WIJ ZIEN BIJ PATIËNTEN MET PRIMAIRE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie verhoogt de concentratie van pyruvaat in bijvoorbeeld spier- en zenuwcellen. Pyruvaat wordt omgezet in lactaat en het aminozuur alanine. Alanine is het enige aminozuur dat naar verwachting buiten het referentie-gebied valt in plasma en cerbrospinaal vocht bij primaire pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie (één tot twee keer de bovengrens van referentie). Het onderzoek meldde echter een neiging tot lagere alanine-spiegels bij de patiënten. Het is verrassend dat deze opvallende discrepantie niet in het artikel wordt genoemd.

VERKEERDE NORMALISATIE VOOR TESTEN KAN HET VERSCHIL TUSSEN DE GROEPEN VERKLAREN

Een vasten-test wordt sterk aanbevolen bij het bepalen van de plasma-concentratie van aminozuren, omdat de niveaus aanzienlijk variëren met het dieet en ook gedurende de dag tot 10-15%. In de studie worden niet-nuchtere aminozuur-patronen met kleine afwijkingen vergeleken. Het is heel vreemd dat de auteurs geen grotere bedenkingen hebben bij dieet als een verstorende factor wanneer ze zelf hebben aangetoond dat het dieet alleen de groep aminozuren beïnvloedt die argumenteren voor verstoord pyruvaat-dehydrogenase. De studie toonde significante verschillen tussen nuchtere en niet-nuchtere patiënten. De nuchtere patiënten werden daarom uitgesloten van verdere statistische analyse. De auteurs moeten ook duidelijker maken dat een mogelijke verborgen vertekening tussen de patiënten-groep en de controle-groep met betrekking tot voeding en staalname een alternatieve verklaring kan zijn voor de gevonden verschillen. Systematische verschillen in voeding tussen de groepen zijn niet ondenkbaar. […]

WAT MET DE PYRUVAAT/LACTAAT-RATIO EN EEN DIRECTE METING VAN DE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE AKTIVITEIT?

De pyruvaat/lactaat-verhouding in het plasma kan patiënten met pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie van andere patiënten met hyperlactacidemie [verhoogd lactaat in het bloed] onderscheiden. Deze ratio heeft daarom een centrale plaats in de biochemische diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. In het onderzoek werd de pyruvaat/lactaat-verhouding niet bepaald. Dat is jammer: de verhouding had een belangrijke aanwijzing kunnen geven voor, mogelijk tegen, pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Een directe bepaling van de enzyme-aktiviteit in de cellen is ook de sleutel bij de routine-matige diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Het is vreemd dat dit in de studie niet is gedaan in spiercellen die groeien in de aanwezigheid van serum van de patiënt.

SPECIFIEKE LINK MET CHRONISCHE VERMOEIDHEID SYDROOM VEREIST MEERDERE CONTROLE-GROEPEN

In de studie heeft de patiënten-groep een ander expressie-patroon dan de controle-groep met betrekking tot genen geassocieerd met het pyruvaat-dehydrogenase complex. Dit is een interessant resultaat maar de studie biedt geen basis voor het interpreteren van het verschil als specifiek voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Volgens de consensus-criteria hebben patiënten een “aanzienlijk verminderd aktiviteiten-niveau” gehad gedurende minimaal zes maanden. Het is bekend dat de expressie van genen geassocieerd met het volledige metabolisme (inclusief pyruvaat-dehydrogenase complex) verandert bij immobilisatie. Spieren groeien en verdwijnen naar gelang het aktiviteit-niveau, daarom zijn er in deze studie verschillende expressie-patronen te verwachten. Vooraleer het expressie-patroon specifiek kan worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom, moet het niet alleen worden vergeleken met gezonde mensen maar met andere patiënten-groepen die een overeenkomstig verminderd aktiviteiten-niveau ervaren, zoals een beroerte, fracturen, nier-falen of ernstige depressie. In het onderzoek werd ook aangetoond dat in spiercellen in vitro het energie-metabolisme kan veranderen in de aanwezigheid van serum van patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het is interessant dat dit experimenteel kan worden aangetoond maar evenmin kan deze waarneming specifiek worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Nogmaals: meer controle-groepen van patiënten met verminderde aktiviteiten-niveaus zijn om andere redenen nodig. De studie laat bijvoorbeeld een verminderde produktie van hoge-energie fosfaten (ATP) in vitro zien. In een muizen-model waarin spiercellen worden gekweekt in aanwezigheid van serum van individuen met spier-atrofie en chronisch nierfalen, neemt de ATP-produktie ook af.

CHRONISCHE VERMOEIDHEID IS NIET TYPISCH VOOR PRIMAIRE GENETISCHE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

De auteurs suggereren dat pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie een sleutel is in de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Chronische vermoeidheid is geen typisch symptoom bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, noch ernstig noch mild. Het vereist een opmerking maar wordt met geen woord vermeld.

Pragmatische beoordelingen gevraagd

Onderzoek naar metabole mechanismen voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom is interessant, en het grote werk van Fluge en collega’s kan hypotheses genereren die verder onderzoek waard zijn. De auteurs komen echter al heel vroeg vast te zitten bij de opvallende pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie als onderdeel van de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Momenteel is het verband tussen bewezen aminozuur-veranderingen en pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie te zwak, en de verandering in gen-expressie en energie-metabolisme is te onspecifiek voor een dergelijke harde conclusie.

————————-

De endocrinoloog Emeritus Professor Frank Comhaire (Universitair Ziekenhuis, Gent) staat bekend als specialist op het vlak van de behandeling van mannelijke infertiliteit en ondernemer (het op de markt brengen van testen en complementaire behandelingen). De voorbije jaren ontwikkelde hij ook een interesse voor M.E.(cvs)…

In een artikel getiteld ‘Chronic Fatigue Syndrome (CFS) or “systemic immune disorder” (SID)? (Internal Medicine 2016, 6: 225) rapporteerde hij dat er bewijs voor het feit dat “CVS te wijten” is “aan een systemische immuun-stoornis waarbij oxidatieve, immunologische en epigenetische mechanismen de aktiviteit van pyruvaat-dehydrogenase kinase (PDHK) kunnen verhogen en de pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit inhiberen”. Op basis daarvan liet hij een ‘nutriceutical’ (voeding-supplement) testen dat bepaalde organische zuren van algen, vitamine-B1, alfa-liponzuur, acetyl-L-carnitine en oxidoreductase-ubiquinon Q10 bevat. Bij publicatie van een kleine piloot-studie (n = 10; patiënten gediagnosticeerd in Belgische CVS-referentie-centra (!???!)) (‘A Novel Nutriceutical Treatment of Myalgic Encephalitis/Chronic FatigueSyndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”; Internal Medicine 2017, 7:5) bleken er evenveel responders als niet-responders te zijn. Deze laatsten bleken uiteindelijk (na verdere diepgaande screening) aan een andere aandoening dan M.E.(cvs) te leiden. Op het moment van het verschijnen van het artikel was een patent hangende…

Er werd verder meegegeven dat een mogelijke diagnostische methode voor de detektie van deficiënte enzymatische aktiviteit van PDH is: het meten van de concentraties van pyruvaat en acetyl-coenzyme-A in monocyten. “Dit vergt geavanceerde laboratoriumtechnologie”…

Merk op: het tijdschrift Internal Medicine (met slechts een beperkte impact en niet opgenomen in PubMed of Web Of Science) is niet het gerenommeerde Journal of Internal Medicine of het befaamde Annals of Internal Medicine…

november 10, 2017

Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:36 am
Tags: , , , ,

Julia Newton en haar collega’s van de ‘Newcastle University’ rapporteren hier dat PBMCs (type witte bloedcellen in het circulerend bloed) van M.E.(cvs)-patiënten niet in staat zijn om voldoende energie te produceren. Bij bevestiging (bij grotere groepen en andere types cellen) zou dit een indicatie kunnen zijn voor een elematair probleem bij de aandoening.

Ze bestudeerden het oxidatieve fosforylatie systeem (‘elektronentransportketen’, mitochondriaal mechanisme voor de produktie van energie (ATP) en de glycolyse (omzetting van glucose waarbij ook energie vrijkomt) onder basale omstandigheden en onder ‘stress’ (belasting), en concludeerden dat de cellen bij fysiologische stress (lees: hogere nood aan glucose) minder in staat zijn om de cellulaire (mitochondriale) ademhaling op te drijven en zo tegemoet te kunen komen aan de energie-behoeften. Een zoveelste aanwijzing dat er iets mis is met de cellulaire energie-produktie bij M.E.(cvs) – zie referenties/links in de tekst.

Bij de mitochondriale stress test wordt d.m.v. de toevoeging van bepaalde chemische stoffen aan het cultuur-milieu van de cellen enkele parameters gemeten waaruit de ATP-produktie, de reserve-capaciteit, het ‘proton-lek’ (mitochondriale ontkoppeling; diffusie van protonen zodat die niet meer kunnen bijdragen tot de synthese van ATP, de energie gaat verloren als warmte), de niet-mitochondriale respiratie, de maximale respiratie (= reserve-capaciteit + ATP-produktie), de basale respiratie (= ATP-produktie + proton-lek) en de koppeling-efficiëntie (graad waarop nuttige energie wordt gemaakt uit de cellulaire brandstof; mate waarop de mitochondriale systemen op elkaar zijn afgestemd) worden berekend.

Voor de glycolyse stress test worden de cellen ‘behandeld’ (ten einde hen glucose te ontzeggen en zo te ‘dwingen’ andere paden aan te wenden om energie te produceren) om de glycolyse, de glycolytische reserve, de glycolytische capaciteit (som van de eerste 2) en de niet-glycolytische verzuring te berekenen.

Het feit dat PMBCs van M.E.(cvs)-patiënten hun energie-output niet kunnen verhogen om aan de behoeften te voldoen voor routine taken lijkt er op te wijzen dat ze metabool uitgeput zijn. Het is een belangrijke bevinding maar de vraag blijft of dit enkel in deze witte bloedcellen is of ook in andere weefsels voorkomt. Het research-team liet optekenen dat ze ook spiercellen op dezelfde manier wil testen…

————————-

PLoS ONE (2017) 12: e0186802

Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Cara Tomas (1), Audrey Brown (1), Victoria Strassheim (2,3), Joanna L. Elson (4,5), Julia Newton (1,3), Philip Manning (1)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

5 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een zeer uitputtende ziekte met een ongekende etiologie. Abnormaliteiten qua bio-energetische funktie werden genoemd als een mogelijke oorzaak voor CVS. Er werden preliminaire studies uitgevoerd om cellulaire bio-energetische abnormaliteiten bij CVS-patiënten te onderzoeken. Er werd een reeks testen uitgevoerd op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten en gezonde controles.

Deze experimenten onderzochten cellulaire patronen met betrekking tot de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS) en glycolyse. De resultaten toonden consistent lagere metingen van de OX-FOS-parameters in PBMCs van CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Er werden 7 sleutel-parameters van de OX-FOS berekend: basale respiratie, ATP-produktie, protonen-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiration en koppeling-efficiëntie. Hoewel veel van de parameters verschilden tussen de CVS- en controle-groep, werd maximale respiratie aangeduid als sleutel-parameter met betrekking tot de mitochondriale funktie die verschilde tussen CVS- en controle-PBMCs omwille van de consistentie van de stoornis bij CVS-patiënten die werd gevonden doorheen de studie (p ≤ 0.003). De lagere maximale respiratie in CVS-PBMCs suggereert dat wanneer de cellen fysiologische stress ondervinden, ze minder in staat zijn om hun respiratie te verhogen om te compenseren voor stijgende stress en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften. De ontdekte metabole verschillen benadrukken het overmogen van CVS-patient PBMCs om de cellulaire energetische eisen te bevredigen onder basale omstandigheden zowel als wanneer de mitochondrieën onder druk komen te staan tijdens periodes met hoge metabole behoeften.

Inleiding

[…]

Er werd voorgesteld dat abnormaliteiten in de bio-energetische werking de oorzaak kan zijn van de ernstige vermoeidheid die wordt ervaren door CVS-patiënten. Factoren zoals mitochondriale dysfunktie, adenosine-monofosfaat geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK [een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt]) verstoring, oxidatieve stress en skeletspier-cel acidose [‘verzuring’] werden allemaal in verband gebracht met het CVS-fenotype [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10 /// Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Chronic Fatigue Syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2009) 2: 1-16 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radical Biology and Medicine (2005) 39: 584-9]. Een abnormaal energie-metabolisme werd geïdentificeerd als een belangrijk interesse-gebied in de CVS-research, met een aantal studies die plasma- en serum-metabolomica onderzochten en wijzigingen qua metabolieten toonden, en de hypothese dat CVS een hypometabool syndroom is [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39 /// Yamano ES et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA- and urea-cycles. Scientific Reports (2016) 6 /// Naviaux RN et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. PNAS (2016) 113 /// Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9 /// Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1].

Verworven mitochondriale dysfunktie (bv. post-virale infektie) is ook een research-gebied van belang [o.a. Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J. Mitochondrial dysfunction and the pathophysiology of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2012) 5: 208-20 /// Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Mitochondrieën fungeren als het energie-overdracht centrum van de cel en zijn verantwoordelijk voor de produktie van cellulair ATP via respiratie [‘ademhaling’; metabole reakties en processen in de mitochondrieën die de energie uit voedingsstoffen omzetten naar ATP]. Mitochondriale respiratie kan door meerdere factoren worden geïnhibeerd: van cytokine-veranderingen tot oxidatieve stress. Studies omtrent CVS hebben sleutel-indicatoren voor mitochondriale dysfunktie zoals verlaagde aanmaak van ATP [Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – A clinical audit. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2013) 6: 1-15 /// Castro-Marrero J, Cordero MD et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants and Redox Signaling (2013) 19: 1855-60] en een verstoring van de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS [zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie; het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen in de mitochondrieën]) mechanismen getoond. Bijkomend komen cruciale symptomen die geassocieerd zijn met CVS (zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en spierpijn) ook voor bij patiënten met primaire mitochondriale ziekten waarvan is geweten dat ze worden veroorzaakt door mitochondriale dysfunktie die het resultaat is van mutaties van het kern- of mitochondriaal DNA (mtDNA) [Newton JL et al. Perceived fatigue is highly prevalent and debilitating in patients with mitochondrial disease. Neuromuscular Disorders. (2015) 25: 563-6]. Er werd gesuggereerd dat mitochondriale dysfunktie voorkwam bij een subgroep van de CVS-populatie. Door een gebrek aan definitief bewijs voor gans de CVS-populatie hebben anderen echter gesuggereerd dat een dergelijk verband niet significant is [o.a. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8]. Twee research-groepen hebben onafhankelijk van elkaar getoond dat klinisch gevalideerde pathogene mtDNA-mutaties waarschijnlijk zeer zeldzaam zijn in CVS-groepen [Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Translational Medicine (2016) 14 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18]. Eén studie vond geen enkele klinisch gevalideerde mtDNA-mutatie die voldoende significant heteroplasmie [aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom] vertoont, terwijl de andere er slechts één vond: een LHON (‘Leber hereditary optic neuropathy’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast]) mutatie. Daarnaast verschillen de sub-klinische waarden van gekende mtDNA-mutaties niet van deze in de algemene bevolking.

De studie hier richtte zich specifiek op het onderzoeken van sleutel-parameters van de mitochondriale funktie, inclusief de twee belangrijkste energie-producerende mechanismen in de cel – glycolyse en OX-FOS. Veranderingen in deze parameters kunnen wijzen op een mitochondriale basis voor CVS, en mechanismen in de etiopathogenese van de ziekte ophelderen en mogelijke doelwitten voor toekomstige studie identificeren.

De doelstelling van deze studie was het detekteren en vaststellen van veranderingen qua mitochondriale funktie en cellulaire energie-profielen (in PBMCs) van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom en gezonde controles. PBMCs kunnen relatief makkelijk worden verkregen via bloed-afname en werden gebruikt om systemisch de mitochondriale funktie na te gaan in controles en CVS-patiënten omwille van hun systemische blootstelling.

Abnormale PBMC bio-energetica werden al onderzocht bij andere chronische ziekten zoals obesitas, type-2 diabetes mellitus (T2DM) en Reumatoïde Arthitis. Er werd een hogere basale respiratie en maximale respiratie getoond bij T2DM-patiënten. Zoals CVS-patiënten ervaren patiënten met T2DM dikwijls vermoeidheid. Eerdere research heeft getoond dat maximale respiratie en reserve-capaciteit in PBMCs correleert met lichamelijk funktioneren en kracht [bij obesitas]. De symptomen beschreven in die studie (zoals spierpijn, zwakte en inspanning-intolerantie zijn ook courante symptomen bij CVS-patiënten. Gezien de gelijkenissen qua symptoom-profielen van deze 2 ziekten, hadden we in deze studie tot doel te onderzoeken of er ook PBMC-abnormaliteiten qua bio-energetische funktie bestaan bij CVS.

Methodes

[…] patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria voor CVS […]

Bereiding van PBMCs

[…]

Extracellulaire flux-analyse

[Flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex]

Werking van OX-FOS en glycolyse werden bepaald gebruikmakend van een ‘extracellular flux analyser’ […] De mitochondriale respiratie wordt gemeten via de afname van de zuurstof-concentratie in het test-medium. […] Veranderingen qua zuurstof- en proton-concentratie worden gedetekteerd. De glycolyse in de cellen wordt gemeten via de daling van de protonen-concentratie in het test-medium (ook gekend als ‘extracellular acidification [verzuring] -rate’, ECAR). Zuurstof-verbruik (OCR) werd gebruikt als een indicator voor OX-FOS, terwijl ECAR werd gebruikt als een indicator voor glycolytische omzetitng van glucose naar lactaat.

De OCR en ECAR werden gemeten na de opéénvolgende toevoeging van test-reagentia. Voor de mitochondriale stress test: oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP [ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS]), en rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] en antimycine-A [inhibeert de cellulaire respiratie]. Daaruit werden de basale respiratie, ATP-produktie, proton-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie berekend. Voor de glycolyse stress-test: glucose, oligomycine en 2-deoxyglucose [stopt de glycolyse]. Dit liet toe glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring te berekenen. […]

Trypaan-blauw

Na toevoeging van [de kleurstof] trypaan-blauw worden dode cellen blauw om dat ze doorlaatbaar zijn voor de kleurstof en levende cellen blijven ongekleurd. Het percentage levende cellen (t.o.v. het totaal aantal cellen) geeft de cel-viabiliteit.

Statistiek

[…]

Resultaten

[…]

Effekt van het invriezen op PBMC-OCR

De afname van bloedstalen van de patiënten gebeurde sporadisch en was onvoorspelbaar, daarom werd het nodig geacht dat de stalen werden ingevroren om ze op hetzelfde moment te kunnen testen en de variatie te niet te doen. Om die reden werden mitochondriale stress testen uitgevoerd op vers geïsoleerde en ingevroren (-80˚C) PBMCs om het effekt na te gaan van het invriezen (omwille van eerdere tegenstrijdige resultaten). […]

Er werden significante verschillen gezien tussen CVS-patiënten en controles voor zowel verse als ingevroren PBMCs voor dezelfde 4 parameters: basale respiratie (p ≤ 0.043), proton-lek (p ≤ 0.013), maximale respiratie (p ≤ 0.003) en reserve-capaciteit (p ≤ 0.012).

Wanneer we verse en ingevroren PBMC-stalen van CVS-patiënten vergeleken, verschilden de basale respiratie (p = 0.006), ATP-produktie (p = 0.003), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) significant. Ook bij de gezonde controles werden significante verschillen gezien voor basale respiratie (p = 0.008), ATP-produktie (p = 0.047), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) tussen verse en ingevroren stalen. Er wordt gedacht dat de consistent significante afname qua basale respiratie en maximale respiratie voor de ingevroren stalen t.o.v. de verse PMBCs freshly isolated PBMCs te wijten is aan de stress ten gevolgde het invries-proces.

Effekt van glucose-concentratie op PBMCs

OCR mitochondriale stress testen werden uitgevoerd in medium met laag (1 mM) en hoog (10 mM) glucose, met de bedoeling te kijken of veranderingen qua cellulaire ATP-produktie konden worden gedetekteerd bij deze 2 concentraties. De hypothese was dat inculatie van PBMCs in laag-glucose de cellen van energie-transductie via glycolyse zou sturen in de reichting van het OX-FOS-mechanisme, en zo een toename qua mitochondriale respiratie zou veroorzaken. Deze hypothese voorspelt een hogere zuurstof-consumptie bij laag-glucose t.o.v. van hoog-glucose. Laag-glucose werd aangewend om een natuurlijke stressor (hypoglycemie) na te bootsen die PBMCs in vivo kunnen ondervinden (en die anders is dan de stress van het invriezen, wat niet voorkomt in vivo).

Bij laag-glucose vertoonde de CVS-populatie significant lagere resultaten dan de controles voor 6 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), maximale respiratie (p < 0.001), reserve-capaciteit (p < 0.001), niet-mitochondriale respiratie (p < 0.001) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Wanneer cellen werden geïncubeerd in hoog-glucose, verschilden CVS- en controle-PBMCs voor 5 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p = 0.013), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001).

De parameters die significante verschillen vertoonden wanneer de resultaten werden vergeleken tussen laag- en hoog-waren ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p < 0.001), maximale respiratie (p = 0.025), niet-mitochondriale respiratie (p = 0.004) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Deze verschillen werden echter enkel in de controle-groep gevonden. De glucose-concentratie had geen enkel effekt op de parameters in de CVS-groep.

[Leeftijd bleek geen verstorende factor voor mitochondriale funktie. Ook geslacht kon worden geëmlimineerd als verstorende factor.]. De duur van het invriezen correleerde niet met de cell-viabiliteit (p = 0.100) of maximale respiratie (p = 0.722) en is dus geen verstorende factor. Zelfs een korte periode invriezen veroorzaakt veranderingen qua OX-FOS-funktie, wat bewijst dat het proces van invriezen/ontdooien deze veranderingen veroorzaakt en niet de duur van het invriezen.

[…]

Glycolytische aktiviteit

De resultaten van een glycolyse stress test met PBMCs vertoonden geen verschillen qua glycolyse tussen de patiënten en controles. Geen enkele van de 5 berekende parameters verschilde significant tussen CVS- en controle-stalen (p ≥ 0.075).

De cel-viabiliteit van verse en ingevroren stalen verschilde niet significant en er was geen significant verschil wat betreft de viabiliteit van de CVS- en controle-stalen, vers noch ingevroren (p ≥ 0.346).

Bespreking

Ondanks de grote aantallen mensen met CVS in de bevolking, blijven de oorzaken er van onverklaard. Dit is de eerste studie die gevallen-controle gebruikt om de mitochondriale funktie te onderzoeken in PBMCs bij CVS. Er werden PBMCs gebruikt in deze preliminaire studie aangezien het toelaat potentiële abnormaliteiten te bekijken op systemsch niveau.

Significant gewijzigde mitochondriale stress test parameters in de CVS-groep t.o.v. de gezonde controle groep suggereren dat CVS-patiënten systemische abnormaliteiten qua energie-overdracht kunnen vertonen, bijzonderlijk wanneer geïsoleerde PBMCs onder mitochondriale stress komen te staan. De lagere reserve-capaciteit die wordt gezien bij CVS-patiënten wijst er op dat hun cellen al hun capaciteit aanwenden onder normale omstandigheden (zonder stress) dan gezonde controles. De verlaagde maximale respiratie suggereert dat de PBMCs van CVS-patiënten niet in staat zijn tot dezelfde mate van respiratie als gezonde controles. De resultaten tonen dat CVS-patiënten hun respiratoire capaciteit slechts met 47% (± 37%) kunnen verhogen (van baseline tot maximaal gestimuleerd door FCCP), wat significant (p < 0.001) lager is dan de 98% (± 32%) toename qua respiratoire capaciteit bereikt door controle-PBMCs. De consistent lagere maximale respiratie in de CVS-groep toont het onvermogen van CVS-patiënten tot dezelfde mate van respiratie als de controle-groep onder cellulaire stress. De lagere reserve-capaciteit suggereert dat wanneer CVS-PBMCs onder stress komen te staan, ze minder in staat zijn hun respiratie te verhogen om te compenseren voor de toegenomen stress waardoor patiënten minder in staat zijn om te voldoen aan de cellulaire energie-vereisten. Er wordt gedacht dat gelijkaardige abnormaliteiten qua reserve-capaciteit bijdragen aan een waaier van andere ziekte-pathologieën zoals hart-ziekte, neurodegeneratieve ziekten bij het ouder-worden en gladde-spiercel sterfte.

Het invries-proces had een significante impact op de cellulaire bio-energetica van PBMCs bij zowel de controle- als de CVS-groep. Vier van de onderzochte parameters vertoonden significante verschillen tussen de verse en ingevroren stalen in beide groepen: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. De resultaten tonen dat het invries-proces dezelfde invloed op beide groepen had, met dezelfde dalingen van elk van de vermelde parameters. Het invriezen van PBMCs kan talrijke cellulaire wijzigingen veroorzaken die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de gedaalde OCR die in deze experimenten werd opgetekend. Mogelijke veranderingen veroorzaakt door invriezen omvatten oxidatieve schade, een verlies qua membraan-integriteit door de vorming van ijs-kristallen en wijzingingen in de ion-homeostase.

Hoewel bleek dat invriezen een impact had op bepaalde parameters, werd gezien dat dezelfde parameters significant verschillend waren tussen de controle- en de CVS-groep bij verse en ingevroren stalen. Dit toont aan dat zelfs al zijn de absolute waarden van sommige parameters beïnvloed door het invries-proces, het patroon in beide groepen kan worden gezien en dat daarom verse of ingevroren stalen kunnen worden gebruikt om verschillen te detekteren tussen controles en CVS-patiënten. Voor toekomstige studies waarbij men wil kijken naar de absolute OCR-waarden zouden verse stalen moeten worden gebruikt, voor andere experimenten volstaan echter ingevroren stalen om adequaat de verschillen tussen groepen te tonen cohorts. Er werden ingevroren stalen gebruikt voor de hoge- en lage-glucose experimenten omwille van de sporadische staalnames gedurende een relatief lange periode maar deze bevinding valideert het gebruik van ingevroren stalen voor deze experimenten en suggereert dat het invriezen van stalen het vermogen om groepen te vergelijken niet verandert. Er dient te worden opgemerkt dat tijdens eerdere analyse met ≤ 12 stalen, het moeilijk was om verschillen tussen de 2 groepen te detekteren met ingevroren stalen, daarom is voor een kleiner aantal stalen het gebruik van verse stalen gewenst.

De hypothese was dat PBMC-incubatie in laag-glucose de energie-transductie van cellen van glycolyse zou leiden naar het OX-FOS-mechanisme, wat een toename van de mitochondriale respiratie veroorzaakt. Deze hypothese voorspelt een hogere basale respiratie en maximale respiratie in laag-glucose. Een hogere maximale respiratie in laag-glucose werd enkel gezien in de controle-groep maar niet in de CVS-groep, terwijl de basale respiratie niet significant steeg in om het even welke groep bij lage-glucose omstandigheden. Daarenboven steeg in de controle-groep de ATP-produktie, de niet-mitochondriale respiratie en de koppeling-efficiëntie, en daalde het proton-lek, bij laag-glucose. De CVS-groep vertoonde geen verschillen tussen laag- en hoog-glucose condities voor om het even welke parameter. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de controle-cellen zich beter kunnen aanpassen aan hun omgeving en beschikken over het vermogen om hun ATP-produktie te verhogen via mitochondriale respiratie indien nodig – iets waar de CVS-cellen wellicht niet toe in staat zijn.

Vier van de parameters bleken verschillend tussen de controle- en CVS-groepen bij zowel laag- als hoog-glucose: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. Dit toont aan dat de verschillen voor deze parameters tussen de 2 groepen die hier werden gezien, kunnen worden gereproduceerd in verschillende glucose-condities en bevestigt het onvermogen van de CVS-PBMCs om hun respiratoire capaciteit te verhogen tot het niveau van de controle-PBMCs zowel bij ‘baseline’ als wanneer ze tot het maximum worden gestimuleerd (door FCCP), zelfs bij laag-glucose wanneer de cellen worden naar ATP-produktie via mitochondriale respirate worden gepusht en weg van de glycolyse als energie-bron. Niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie verschilden enkel tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, terwijl het proton-lek enkel verschilde bij hoog-glucose.

De koppeling-efficiëntie toonde dat ATP-produktie enkel efficiënter werd in de controle-groep wanneer er stress ontstond door laag-glucose, en niet in de CVS-groep. Er werden verschillen qua koppeling-efficiëntie gezien tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, wat suggereert dat de CVS-cellen reeds aan de maximum efficiënctie zitten wat betreft de aanmaak van ATP wanneer controle-cellen nog in staat zijn die efficiëntie te verhogen en ATP produceren wanneer dit vereist is (bv. bij laag-glucose).

[…] De statistische significante resultaten wijzen op robuste statistische gegevens, ondanks de relatief beperkte grootte van de groepen.

Deze experimenten helpen bij het identificeren van de richting die toekomstige research omtrent cellulaire bio-energetica bij CVS zou moeten nemen voor het detekteren van verschillen betreffende sommige, maar niet alle, parameters van de mitochondriale funktie. Verschillen qua mitochondriale parameters tonen het onvermogen van CVS-PBMCs om het OX-FOS-mechanisme aan te wenden om energie te produceren in dezelfde mate als controle-PBMCs dat doen, zowel onder basale omstandigheden als wanneer ze worden gedwonen tot maximale respiratie. De consistent significante verschillen tussen de 2 groepen bij basale respiratie en maximale respiratie tonen hun belang aan als potentiële merkers voor CVS, een bevinding die kan worden gebruikt om richting te geven aan toekomstig onderzoek omtrent de mitochondriale dysfunktie bij CVS.

In tegenstelling tot eerdere literatuur [zie bv. Armstrong et al. hierboven] die suggereerde dat abnormaliteiten qua PBMC ATP-concentraties kunnen worden veroorzaakt door glycolyse, tonen resultaten van de glycolyse stress test dat glycolyse bij CVS-patiënten niet significant verschilt van de gezonde groep. Dit kan te wijten zijn aan de relatief kleine groepen die in deze studie werden gebruikt. De combinatie van de detektie van significante verschillen in OX-FOS naast het ontbreken van detekteerbare verschillen in glycolyse heeft mogelijks een voorheen ongekend fenotype van CVS-PBMCs blootgelegd, hoewel grotere stalen nodig zullen zijn om dit te bevestigen. Hoewel de belangrijkste beperking van deze studie de grootte van het staal was, resulterend in een minder krachtige analyse (bijzonderlijk voor de vers geïsoleerde controle-groep), dient te worden opgemerkt dat de hier gepresenteerde gegevens enkel preliminaire bevindingen zijn. Grotere stalen en longitudinale afnames zijn nodig om de hier verkregen reulstaten te valideren en te zorgen voor de statistische ‘power’ die vereist is om verschillen in andere parameters te detekteren. Een andere beperking van deze studie is het gebrek aan karakteristieken van de CVS-groep. Demografische, antropometrische en symptoom-gegevens zouden nuttig zijn om te kijken naar links met de mitochondriale abnormaliteiten die in deze studie werden geobserveerd. Het zou interessant zijn om te analyseren of CVS-symptomen – in het bijzonder vermoeidheid-graad – correleerden met de gemeten mitochondriale parameters. Er zouden bijkomende experimenten en technieken kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de mitochondriale inhoud en morfologie, mitochondriale funktie in doorlaatbaar-gemaakte cellen en geïsoleerde mitochondrieën, en metingen van het mitochondriaal membraan potentiaal om deze resultaten verder te valideren. Stratificatie van PBMCs op basis van fluorescentie-gektiveerde cel-sortering (FACS) is een techniek die kan worden aangewend om de cel-types PBMCs verder onder te verdelen om te identificeren welke specifieke cel-populaties verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde OX-FOS-verschillen. Het is momenteel nog niet geweten of factoren zoals recente aktiviteit en dieet voor de bloed-afname een effekt heeft op PBMC bio-energetica en dit is iets dat dient te worden onderzocht. Het gebruik van sedentaire controles en aktiviteit-monitors zou nuttig zijn om het effket op PBMC bio-energetica te tonen. Deze studie maakte gebruik van PBMCs als een voorspeller voor de systemische mitochondriale funktie maar er zounden andere cel-types kunnen worden gebruikt om te onderzoeken of de hier geoberveerde verschillen kunnen worden gezien in andere weefel-types bij CVS-patiënten.

De resultaten van deze studie weerspiegelen de resultaten gevonden bij T2DM-patiënten (een link tussen een andere ziekte met vermoeidheid als kern-symptoom en OX-FOS-parameters: basale respiratie en maximale respiratie. Dit geeft aan dat de PBMC bio-energetische abnormaliteiten een consistente link met vermoeidheid vertonen, maar of de abnormaliteiten optreden ten gevolge de vermoeidheid of de oorzaak van de ziekte zijn blijft onbekend.

Deze preliminaire research heeft duidelijk statistisch significante verschillen in het bio-energetisch profiel van PBMCs van CVS-patiënten getoond in vergelijking met cellen van gezonde controles. Belangrijk: deze resultaten leggen niet vast of de verschillen qua PBMC energie-mechanismen een oorzaak of gevolg van CVS zijn; deze gegevens impliceren echter duidelijk dat deze cellen een rol kunnen spelen in het ziekte-mechanisme. Verder kan het gerbuik van PBMCs een nieuw en waardevol model zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen ter behandeling van CVS.

januari 7, 2017

Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:37 am
Tags: , , , , , , , , ,

Samen met medewerkers van 5 Noorse ziekenhuizen brachten Oystein Fluge & Olav Mella – die de immunosuppressiva rituximab (en cyclofosfamide) test(t)en als mogelijke (momenteel nog preliminair/experimenteel; want niet bevestigd) behandeling bij M.E.(cvs) – het metabolisme van een behoorlijk grote groep patiënten (en gezonde controles) gedetailleerd in kaart. We geven het uitgebreid artikel hier zo compleet mogelijk weer om (mede-)patiënten zo goed mogelijk te informeren en het belang ervan te onderstrepen naar behandelaars/onderzoekers toe…

De researchers detekteerden specifieke biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. De waarden van bepaalde aminozuren waren gedaald. Het patroon gaf belangrijke informatie over de mechanismen die de symptomen veroorzaken en vooral over het energie-metabolisme bij de patiënten.

De reductie van de specifieke aminozuren werd voornamelijk gevonden bij vrouwen met M.E.(cvs). De verschillen bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten waren minder significant (vergeleken met gezonde mannen). De onderzoekers vonden echter dat de waarden van een bepaald aminozuur dat de afbraak van proteïnen in spierweefsel weerspiegelt gestegen waren bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten. Aangezien mannen meer spiermassa hebben dan vrouwen, zouden proteïnen van spierweefsel kunnen worden gebruikt als extra energie-reserve.

Onder normale omstandigheden gebruiken mensen koolhydraten, vetten (lipiden) en proteïnen (opgebouwd uit aminozuren) als energie-bronnen, in de katabole (afbraak-) processen in de mitochondrieën. Wanneer intense lichamelijke inspanning wordt gevergd, ontstaat een tekort aan zuurstof in de spier-mitochondrieën (anaërobe inspanning), zodat glucose wordt omgezet naar melkzuur (lactaat). Het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) speelt een belangrijke rol bij de regulering van de processen die zorgen voor de omzetting van koolhydraten naar energie. Onderstaande studie suggereert dat PDH geïnhibeerd (onderdrukt) is bij M.E.(cvs)-patiënten.

Als de aktiviteit van PDH verstoord is, kunnen de cellen reageren door het verbruik van alternatieve ‘brandstoffen’ te verhogen, wat de veranderingen in het aminozuren-profiel in het bloed bij M.E.(cvs) kan verklaren. Ondanks de pogingen tot compensatie van het lichaam, zou deze situatie het vermogen van de cellen om de metabole processen aan te passen (om een geschikt antwoord te bieden voor de steeds veranderende vereisten qua energie-produktie) kunnen compromitteren. Lichamelijke aktiviteit kan dan leiden tot een plots energie-gebrek in de spieren, samen met een accumulatie van melkzuur. Bij ernstig zieke M.E.(cvs)-patiënten kan dit worden gezien na een minimale belasting.

Na meting van de gen-expressie (mRNA) in witte bloedcellen (PBMCs) van een aantal factoren die PDH reguleren, vonden de onderzoekers dat meerdere belangrijke factoren die de werking van PDH remmen, verhoogd waren bij de M.E.(cvs)-patiënten. Deze veranderingen waren aanwezig bij de vrouwelijk en mannelijke patiënten. Dit geeft aan dat de PDH-inhibitie zelf optreedt bij de beide geslachten maar dat de effekten op het metabolisme geslacht-specifiiek kunnen zijn.

Het is zeer waarschijnlijk dat M.E.(cvs) ook regulatie-problemen in andere delen van het metabolisme (bv. het verwerken van vetten) omvat en dat wordt verder onderzocht. Er wordt ook onderzoek verricht om te begrijpen hoe een vermoedelijk defekte immuun-respons (Auto-immuniteit?) een inhibitie van het cellulair metabolisme zou kunnen veroorzaken (Welke auto-antilichamen hinderen welke signalisering-mechanismen?).

De resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van Robert Naviaux in de V.S., McGregor & Armstrong et. al. in Australië, Ruud Vermeulen in Nederland, Emi Yamano et al. in Japan en anderen… (zie links in de tekst) Lees ook ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Computer-model voor inspanning-intolerantie bij M.E.(cvs)’ & ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ alhier.

————————-

Journal of Clinical Investigation Vol. 1, #2 (december 2016)

Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome

Oystein Fluge (1), Olav Mella (1,2), Ove Bruland (1,3), Kristin Risa (1), Sissel E. Dyrstad (4), Kine Alme (1), Ingrid G. Rekeland (1), Dipak Sapkota (1), Gro V. Rosland (4), Alexander Fossa (5), Irini Ktoridou-Valen (1), Sigrid Lunde (1), Kari Sorland (1), Katarina Lien (6), Ingrid Herder (6), Hanne Thurmer (7), Merete E. Gotaas (8), Katarzyna A. Baranowska (8), Louis M.L.J. Bohnen (9), Christoph Schafer (9), Adrian McCann (10), Kristian Sommerfelt (11), Lars Helgeland (12), Per M. Ueland (2,10), Olav Dahl (1,2), Karl J. Tronstad (4)

1 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

2 Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

3 Department of Medical Genetics and Molecular Medicine, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

4 Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, Norway

5 Department of Oncology, Norwegian Radium Hospital, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

6 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 Telemark Hospital, Department of Medicine, Notodden, Norway

8 Department of Pain and Complex Disorders, St. Olav’s Hospital, Trondheim, Norway

9 Division of Rehabilitation Services, University Hospital of Northern Norway, Tromso, Norway

10 Bevital AS, Bergen, Norway

11 Department of Pediatrics Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

12 Department of Pathology, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

[Oystein Fluge & Olav Mella hebben mogelijks een belangen-conflict omwille van hun patenten m.b.t. de B-cel depletie bii M.E./CVS.]

Samenvatting

Myalgische Encefalopathie/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een uitputtende ziekte zonder gekende etiologie, met als kenmerkende symptomen post-exertionele malaise en een slecht herstel. Metabole dysfunktie is een plausibele bijdragende factor. We hypothiseerden dat wijzingen qua aminozuren in het serum specifieke defekten in het energie-metabolisme kunnen blootleggen bij M.E./CVS. Een analyse van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde individuen toonde een specifieke daling van de aminozuren die het oxidatief metabolisme via de TCA-cyclus voeden, voornamelijk bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. De concentratie in het serum van 3-methylhistidine, een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme, was significant gedaald bij mannelijke patiënten. Het aminozuren-patroon suggereerde een funktionele verstoring van pyruvaat-dehydrogenase (PDH), wat werd ondersteund door verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende PDH-kinasen 1, 2 & 4; sirtuine-4 en PPARδ in perifeer bloed mononucleaire cellen [PBMCs] bij beide geslachten. Myoblasten opgekweekt in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertoonden metabole aanpassingen, inclusief verhoogde mitochondriale ademhaling en overmatige lactaat-sekretie. De aminozuren-veranderingen konden niet worden verklaard door symptoom-ernst, ziekte-duur, leeftijd, BMI of niveau van fysieke aktivteit. Deze bevindingen zijn in overéénstemming met de manier waar op de ziekte zich klinisch presenteert: met inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie en excessieve lactaat-produktie bij inspanning.

Inleiding

[…] Research suggereert dat M.E./CVS gepaard gaat met wijzigingen in fundamentele processen van het energie-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531 /// Filler K et al. Association of Mitochondrial Dysfunction and Fatigue: A Review of the Literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]. Dergelijke metabole veranderingen kunnen ontstaan door ontregelde fysiologische respons-mechanismen (immuun-aktivatie, inflammatie en receptor-gemedieerde signalisering) [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: 1]. Er zijn echter geen consistente gegevens die een gemeenschappelijk metabool defekt aangeven die de symptomen van deze patiënten zouden kunnen verklaren. […]

[…] Observaties suggereren dat de systemische inspanning-intolerantie bij M.E./CVS, minstens gedeeltelijk, een omschakeling naar anaërobe glycolyse, waarbij lactaat wordt gegenereerd bij een significant lagere belasting dan bij gezonde mensen, zou kunnen inhouden. Er werden verhoogde lactaat-waarden gevonden in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Murrough JW et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome measured by 1H MRS imaging at 3.0 T. NMR Biomed. (2010) 23: 643-650 /// Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed. (2012) 25: 1073-1087; zie ook ‘Lactaat in Ventriculair Cerebrospinaal Vocht is verhoogd bij CVS]. Het vinden van defekten in glucose-gebruik en lactaat-produktie is echter niet evident op basis van routine bloed-analyses, wellicht omdat de afname gebeurt in rust zonder voorafgaande lichamelijke inspanning.

Er werden wijzigingen qua serum- (of plasma-) concentraties van bepaalde aminozuren gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten. Een studie over aminozuren in het serum […] toonde significant lagere waarden glutamine & ornithine, wijzend op een mogelijke stoornis in het aminozuren- en stikstof-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al.; zie hierboven]. Dezelfde onderzoekers vonden significant gedaalde serum-waarden voor glutamaat & fenylalanine [vrouwelijke M.E./CVS-patiënten] en ze stelden voor dat verminderde glucose-oxidatie leidt tot toegenomen gebruik van aminozuren als substraat in de TCA-cyclus [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics. (2015) 11: 1626-1639]. In een andere studie werden significante dalingen voor meerdere aminozuren en metabolieten gezien in de urine van M.E./CVS-patiënten [Niblett SH et al. Hematologic and urinary excretion anomalies in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Exp Biol Med (2007) 232: 1041-1049]. Deze gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een metabool defekt maar de specifieke oorzaak werd nog niet geïdentificeerd.

De anaërobe drempel en herstel-tijd na inspanning hangen af van de hoeveelheid geproduceerd lactaat en de opruiming ervan. Lactaat wordt gemaakt uit pyruvaat, hoofdzakelijk door glucose-katabolisme via glycolyse, of de afbraak van bepaalde aminozuren. Onder normale aërobe omstandigheden wordt pyruvaat getransporteerd naar de mitochondrieën waar het wordt omgezet naar acetyl-CoA d.m.v. het pyruvaat-dehydrogenase (PDH) complex. Daarnaast wordt acetyl-CoA geproduceerd zonder tussenkomst van PDH, via degradatie van vetzuren en ketogene aminozuren [die kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA]. Het gevormd acetyl-CoA wordt verder geoxideerd in de TCA-cyclus en dient als brandstof voor de mitochondriale ademhaling en aanmaak van adenosine-trifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylatie. Onder anaërobe omstandigheden, wanneer tekort aan zuurstof mitochondriale ademhaling verhindert, stapelt het pyruvaat zich op in het cytosol, wat leidt tot verhoogde aanmaak en cellulaire excretie van lactaat. Mitochondriale dysfunktie leidt tot overmatige lactaat-produktie én een gebrekkige toevoer van ATP, en werd gesuggereerd een rol te spelen bij M.E./CVS [werk door Myhill]. PDH werkt als een toegangsweg in het oxidatief metabolisme door het coördineren van de afbraak van energie-substraten afgeleid van koolhydraten, vetten en aminozuren. Een daling qua PDH enzymatische aktiviteit kan leiden to accumulatie van pyruvaat en daardoor over-produktie van lactaat, zelfs in aanwezigheid van toereikende zuurstof. De PDH-aktiviteit wordt verder gecontroleerd door PDH-kinasen (PDKs) die de PDH enzyme-aktiviteit remmen via fosforylatie [verbinding met een fosfaat-groep; dergelijke enzymatische reaktie speelt dikwijls een rol bij signaal-overdracht], en PDH-fosfatasen die defosforylatie katalyseren. Sirtuine-4 (SIRT4) werd geïdentificeerd als een mitochondriaal lipoamidase [enzyme] dat de PDH-aktiviteit inhibeert [sirtuinen zijn NAD+-afhankelijke enzymen betrokken bij gen-regulering en het metabolisme]. PDK1-PDK4 worden gereguleerd op transcriptie-niveau via signalisering-aanwijzingen waarbij factoren zoals AMP-afhankelijk proteïne kinase (AMPK [zie link in de ‘Bespreking’]), PPARs [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren; groep van receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] en HIF1 [hypoxie-induceerbare factoren zijn transcriptie-factoren die reageren op dalingen van de beschikbare zuurstof in het cellulair milieu] betrokken zijn. Er werd een mogelijke rol van een verstoorde werking van PDH en abnormale AMPK-aktivatie bij M.E./CVS voorgesteld [Rutherford G, Manning P, Newton JL. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) 2497348].

Samengevat: eerdere bevindingen ondersteunen dat ontregeling van PDH en veranderingen qua aminozuren in het serum betrokken kunnen zijn bij het pathomechanisme voor M.E./CVS. Onze hypothese was dat M.E./CVS geassocieerd is met een defekt oxidatief metabolisme waarbij PDH betrokken is, leidend tot verhoogd gebruik van ketogene aminozuren om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien. Om deze hypothese te controleren, bestudeerden we de concentraties van aminozuren in serum-stalen van 200 M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de ‘Canadian consensus criteria’ en 102 gezonde controles. Om mogelijke ziekte-mechanismen na te gaan, hebben we de mRNA-expressie van relevante genen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles gemeten. We stelden gecultiveerde spiercellen bloot aan serum van M.E./CVS-patiënten om te bepalen of bestanddelen in het bloed het cellulair energie-metabolisme kunnen beïnvloeden.

Methodes

ME/CVS-patiënten en gezonde controles. Alle deelnemende patiënten voldeden aan de Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. […] 162 vrouwen [gemiddeld 37,8 jaar oud] en 38 mannen [gemiddeld 36,3 jaar oud]. BMI (kg/m2) gemiddeld 24,9 voor de vrouwelijke & 25,0 voor de mannelijke patiënten. Controles (bloed-donoren en medisch personeel): 67 vrouwen [gemiddeld 34,5 jaar oud] en 35 mannen [gemiddeld 36,2 jaar oud] […].

Van de 200 M.E./CVS-patiënten waren er 47 die overnacht vastten voor de bloed-afname en 153 die dat niet deden. Alle 102 gezonde controles vastten niet. We vergeleken de serum-concentraties van alle aminozuren, van overnacht-vastende en niet-vastende patiënten, per geslacht. […]

Metabolieten-analyse. De 20 standaard aminozuren werden geanalyseerd d.m.v. gas-chromatografie & massa-spectrometrie […] Arg, hArg, ADMA, SDMA, 1-Mhis & 3-MHis d.m.v. vloeistof- chromatografie & massa-spectrometrie […]. […]

Kwantitatieve RT-PCR. Alle M.E./CVS-patiënten en gezonde controles in de gen-expressie studie waren niet-vastend. […] Beoordeling van PDK1, PDK2, PDK3, PDK4, PPARA, PPARD, PPARG, PDHA, MPC1, MPC2, ACOX1, HIF1A & SIRT4 mRNAs van 75 M.E./CVS-patiënten en 43 gezonde controles. […]

Cel-cultuur. […] Om te onderzoeken of blootstelling aan serum van M.E./CVS-patiënten het energie-metabolism in gecultiveerde myoblasten [voorlopers van spier-cellen] beïnvloedde […]. De experimenten werden geblindeerd uitgevoerd wat betreft de groepen (M.E./CVS of gezonde controle).

Cellulair metabolisme. OCR [zuurstof-verbruik] & ECAR [extracellulaire verzuring] [zie ‘Resultaten’] werden gemeten om, respectievelijk, de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie (glycolyse) te beoordelen. […] OCR & ECAR werden gedurende het experiment (waarbij sequentieel specifieke metabole modulatoren werden toegediend) simultaan opgenomen. […] De volgende cellulaire energetische omstandigheden werden gedefinieerd. Conditie-I “Rustend (alleen aminozuren)” (cellen heb enkel energie nodig voor basale fysiologische vereisten.): enkel aminozuren (niet Gln) als energie-substraten toegediend in het test-medium. Conditie-II “Rustend (aminozuren & glucose)”: cellen krijgen glucose (maar nog steeds in rust aangezien de vraag naar ATP onveranderd is). Conditie-III “Anaërobe belasting”: ATP-synthase geïnhibeerd d.m.v. oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme geen ATP meer kan aanmaken] (cellen vertrouwen op glycolytische ATP-produktie; gelijkaardig aan het anaëroob energie-metabolisme, waarbij de mitochondriale ATP-produktie geïnhibeerd is door zuurstof-depletie). Hier wordt de maximale glycolytische capaciteit gemeten. Deze OCR wordt ‘leak activity’ [‘lek-aktiviteit’] genoemd aangezien het niet is gelinkt aan ATP-produktie via oxidatieve fosforylatie. Een lage ‘leak’-ademhaling betekent dat de integriteit van het mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem intact is. Conditie-IV “Aërobe belasting”: toevoeging van CCCP [carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone; chemische inhibitor van de oxidatieve fosforylatie, vernietigt het mitochondriaal membraan-potentiaal] liet het inhiberend effekt van oligomycine op het mitochondriaal zuurstof-verbruik los […]. Dit weerspiegelt een situatie van ernstige energie-depletie (mitochondriale ademhaling en glycolyse maximaal). […] Tenslotte werden rotenon [blokkeert NADH-dehydrogenase (complex-I) en zodoende de respiratoire keten] & antimycine-A [blokkeert complex-III en zodoende de respiratoire ademahaling] toegediend om (respectievelijk) respiratoir complex-I & -III te inhiberen, en zo de niet-mitochondriale zuurstof-consumptie te bepalen […].

Statistiek. […]

De studie is exploratief en hypothese-genererend […]. […]

Studie-goedkeuring. […]

Resultaten

Serum-concentraties van de 20 standaard aminozuren […]. De initiële analyses toonden een duidelijk patroon bij vergelijking van aminozuren met verschillende startpunten voor oxidatie via de mitochondriale pyruvaat/TCA-cyclus as. Daarom werden de aminozuren onderverdeeld in 3 categorieën […]:

Categorie-I aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat en daarom afhankelijk van PDH zijn voor verdere oxidiatie: alanine (Ala), cysteïne (Cys), glycine (Gly), serine (Ser) & threonine (Thr).

Categorie-II aminozuren treden het oxidatie-mechanisme binnen als acetyl-CoA, dat direct en onafhankelijk van PDH de TCA-cyclus voedt […]: isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenylalanine (Phe), tryptofaan (Trp) & tyrosine (Tyr).

Categorie-III bestaat uit anaplerotische aminozuren [anaplerotische reakties zijn er waar tussenprodukten van een metabool mechanisme worden gevormd; simpel uitgedrukt: “ze vullen de voorraden aan”] die worden omgezet naar TCA-cyclus intermediairen (en zo de metabole capaciteit van de cyclus aanvullen en ondersteunen): enkel aminozuren die niet tot categorieën-I of -II behoren; methionine (Met) & valine (Val) […]; histidine (His), glutamine (Gln), glutamaat/glutaminezuur (Glu), (Gln + Glu = Glx) & proline (Pro) […] en asparagine (Asn) & aspartaat/asparaginezuur (Asp), (Asn + Asp = Asx) […]. […]

Deze klassificatie is een vereenvoudigd model. Verscheidene aminozuren kunnen meerdere afbraak-mechanismen hebben afhankelijk van de fysiologische context. De aminozuren in categorie-I & -III zijn uitsluitend glucogeen [kunnen worden omgezet tot glucose], terwijl die in categorie-II ketogeen [kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA] zijn of beide. […]

Aminozuren die voorzien in pyruvaat als substraat voor PDH (categorie-I). Er waren geen significante verschillen qua gemiddelde serum-waarden voor categorie-I aminozuren (Cys, Gly, Ser, Thr) tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles, uitgezonderd voor Ala (kleine maar statistisch significante daling bij de patiënten; P = 0.027). Er waren geen verschillen voor Gly & Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. vrouwelijke controles maar geringe dalingen voor Ser & Thr (telkens P = 0.010). Bij de mannen waren er geen verschillen voor deze aminozuren (M.E./CVS-patiënten versus controles). De som van de serum-concentraties van deze 4 categorie-I aminozuren (zonder Ala) verschilde niet tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles (ook niet per geslacht).

Aminozuren die zorgen voor acetyl-CoA toevoer in de TCA-cyclus (categorie-II). Alle 6 aminozuren in categorie-II waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde (P-waarden < 0.001 voor Ile, Leu, Phe & Tyr; 0.001 & 0.009 voor Lys & Trp). De dalingen waren zeer significant bij vrouwen met M.E./CVS (t.o.v. gezonde vrouwen) […]. Vergelijking van mannelijke M.E./CVS-patiënten met mannelijke controles toonde geen significante verschillen […] (trend tot vermindering voor Tyr; P = 0.086). De som van de serum-concentraties van de 6 categorie-II aminozuren was significant lager voor M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (ook bij vrouwen maar niet bij mannen). […]

Anaplerotische aminozuren (categorie-III). De gemiddelde serum-waarden voor anaplerotische (categorie-III) aminozuren waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles […]. […]  De dalingen qua anaplerotische aminozuren werden vastgesteld bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten maar niet bij mannen, t.o.v. controles. De som van de serum-concentraties van de anaplerotische aminozuren was gedaald voor de ganse groep M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. […]

Vergelijking tussen niet-vastende en vastende M.E./CVS-patiënten. […] De serum-concentraties waren lager bij overnacht-vastende patiënten voor categorie-II aminozuren Ile, Phe, Trp & Tyr, naast Ala. Er waren trends voor lagere gemiddelde serum-waarden voor Pro, Met & Arg in serum van overnacht-vastende patiënten maar geen verschillen voor de andere aminozuren of metabolieten.

Andere gemodificeerde aminozuren. Op basis van een studie die endotheliale dysfunktie [endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten] bij M.E./CVS-patiënten aantoonde [Newton DJ et al; zie ‘Bespreking’], beslisten we serum-concentraties te meten van aminozuren en afgeleiden waarvan is geweten dat ze de endotheliale funktie beïnvloeden. Arginine, asymmetrisch dimethylarginine (ADMA) en homo-arginine (hArg) vertoonden gelijkaardige serum-waarden tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen én mannen). Voor symmetrisch dimethylarginine (SDMA) was er een significant gedaald gemiddelde serum-waarde bij vrouwen met M.E./CVS maar niet bij mannen, vergeleken met controles. Voor 1-methylhistidine (1-MHis), een merker voor inname van (voornamelijk dierlijke) proteïnen, was er geen verschil tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen noch mannen). De concentraties van 3-methylhistidine (3-MHis), een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme (bv. spier-atrofie), waren significant hoger bij met M.E./CVS t.o.v. gezonde mannen (P = 0.003), terwijl er geen verschil qua 3-MHis was voor vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde vrouwen.

Aminozuren en hun verband met andere karakteristieken van M.E./CVS-patiënten. Bij de niet-vastende vrouwen met M.E./CVS werden zeer significante correlaties gevonden voor alle combinaties met de categorie-II aminozuren (Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr) (P < 0.001). Bij de mannelijke M.E./CVS-patiënten werden gelijkaardige correlatie-patronen gezien. In tegenstelling daarmee vonden we minder en zwakkere correlaties met categorie-I & categorie-II aminozuren. Er waren voor Thr echter meerdere uitgesproken correlaties met categorie-II aminozuren; mogelijks een weerspiegeling van het feit dat er alternatieve oxidatie-paden (zonder omzetting naar pyruvaat) zijn voor Thr. Verder waren er zeer significante correlaties voor alle combinaties met de categorie-II en -III aminozuren maar minder significante correlaties met de categorie-I en -III aminozuren.

Geslacht bleek een belangrijke factor bij de interpretatie van de resultaten: er waren significante dalingen voor gemiddelde serum-waarden van categorie-II en -III aminozuren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Om de mogelijkheid te evalueren dat de geobserveerde veranderingen qua aminozuur-patronen veroorzaakt zouden kunnen zijn door andere verstorende factoren, voerden we statistische analyses uit om aminozuur-waarden in het serum te vergelijken met klinische variabelen (leeftijd, BMI, lichamelijke aktiviteit, M.E./CVS-ernst en ziekte-duur). Hogere leeftijd correleerde significant met verhoogde waarden voor Cys, Gly, Ile, Leu, Lys & Tyr bij vrouwen met M.E./CVS maar bij M.E./CVS-mannen enkel met Cys. Er waren geen significante correlaties tussen serum-waarden van aminozuren en fysieke aktiviteit (aantal elektronisch geregistreerde stappen per 24 uur) bij de M.E./CVS-groep, uitgezonderd een significante negatieve correlatie met Cys bij vrouwen. Bij de M.E./CVS-vrouwen waren er significante positieve correlaties tussen BMI en Cys, Ile, Leu, Phe & Tyr, en significante negatieve correlaties tussen BMI en Ser & Thr. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat verschillen qua BMI verantwoordelijk zouden zijn voor de vastgestelde verschillen in aminozuur-waarden in het serum bij vrouwen met M.E./CVS, werden de patiënten onderverdeeld in 4 BMI-groepen (ondergewicht tot obees). Bij vergelijking bleken er significante verbanden tussen hogere BMI en hogere serum-waarden van de categorie-II aminozuren Leu, Phe, Tyr & Ile. Bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten waren in alle BMI-groepen (ook de obese) de gemiddelde serum-waarden van deze aminozuren echter lager dan bij gezonde vrouwen. Bij de mannen met M.E./CVS werden geen significante verbanden gezien tussen BMI-groepen en aminozuren van categorie-I of -II, uitgezonderd een significante positieve associatie tussen Cys en BMI. […]

Verder werden de patiënten ook onderverdeeld in groepen volgens ziekte-ernst, ziekte-duur, lichamelijke aktiviteit en leven-kwaliteit. De serum-waarden van categorie-I of categorie-II aminozuren waren niet geassocieerd met M.E./CVS-ernst. Er werd een significant positief verband gevonden tussen ziekte-duur en serum-waarden van aminozuren enkel voor Phe bij vrouwelijke patiënten. Er waren geen significante associaties tussen gemiddelde aminozuur-waarden (categorie-I & -II) en fysieke aktiviteit, uitgezonderd een negatief verband met Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren significante associaties tussen hogere ADMA-waarden en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.036) en tussen hoger 1-MHis en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.024) bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (een trend bij mannelijke patiënten; P = 0.086). […] Er was een significant verband tussen een hogere “SF36mean5” score [leven-kwaliteit] en een hogere gemiddelde serum-waarde van het categorie-I aminozuur Ser (P = 0.023); er waren trends voor Gly (P = 0.056) en Thr (P = 0.065) maar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten.

PDH-gerelateerde gen-expressie (mRNA) in PBMCs. Om te onderzoeken of de effekten op de aminozuren-profiel in het serum bij M.E./CVS-patiënten kan worden verklaard door veranderingen qua PDH-funktie, vergeleken we mRNA-waarden van PDH-gerelateerde genen in PBMCs van niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles. We vonden significant verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende kinasen PDK1 (P = 0.002), PDK2 (P = 0.022) & PDK4 (P = 0.006) bij M.E./CVS-patiënten, terwijl PDK3 onveranderd bleef. Ook het mitochondriaal lipoamidase en PDH-inhibitor SIRT4 was significant ge-upreguleerd (P = 0.013). Bij de PPAR transcriptie-factoren was PPARδ (PPARD) ge-upreguleerd (P = 0.001). Er waren geen verschillen voor PPARα (PPARA), het PPAR transcriptioneel doelwit en peroxisomaal vetzuur β-oxidatie enzyme acyl-coenzyme-A oxidase 1 (ACOX1) of de transcriptie-factor HIF1α (HIF1A). Pyruvaat-dehydrogenase-E1α (PDHA) mRNA was lichtjes ge-upreguleerd (P = 0.037). De expressie van PPARγ (PPARG) mRNA lag onder de detektie-limiet van de analyse. Analyses van de mitochondriale pyruvaat-dragers (MPCs [mediëren de opname van pyruvaat in de mitochondrieën]) onthulden een nipt-significante upregulering van MPC1 (P = 0.046) maar MPC2 verschilde niet.

Hoewel er geslacht-specifieke verschillen werden vastgesteld qua gemiddelde serum-waarden van aminozuren bij M.E./CVS-patiënten, waren de gestegen mRNA-waarden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten versus gezonde controles gelijkaardig bij mannen en vrouwen wat betreft PDK1, PDK4, PPARA, PPARD & SIRT4.

Wat betreft PDK1 gen-expressie waren er significante verbanden met ziekte-ernst (gestegen PDK1 mRNA in matige/ernstige versus milde/mild-matige groepen), met ziekte-duur (gestegen PDK1 mRNA bij langere duur) en met lichamelijke aktiviteit […] (gestegen PDK1 mRNA bij lagere aktiviteit). De associaties werden niet gevonden voor PDK4 mRNA, PPARA, PPARD of SIRT4.

De mRNA-expressie van PDK1 correleerde sterk met PPARD (P < 0.0001), met SIRT4 (P = 0.003) en zwak, maar significant, met PPARA (P = 0.028). Er was geen significante correlatie tussen PDK1 & PDK4 (P = 0.12). Verder waren er zeer significante correlaties tussen SIRT4 & PPARD (P < 0.0001), en SIRT4 & PPARA (P < 0.0001) maar geen significante correlatie tussen SIRT4 & PDK4 (P = 0.15). Deze gegevens werden onderbouwd met een zeer significante correlatie tussen PPARA & PPARD mRNA (P < 0.0001). Voor expressie van PDK1, PDK4, PPARA of waren er geen significante correlaties met leeftijd of BMI. Bij de 75 niet-vastende M.E./CVS-patiënten waren er geen significante correlaties tussen serum-waarden van categorie-I of -II aminozuren en mRNA-expressie van PDKs, SIRT4, PPARA of PPARD.

Effekten van M.E./CVS-patiënten serum op de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie in gecultiveerde skeletspier-cellen. Bij de verklaring van de kenmerkende M.E./CVS-symptomen (post-exertionele malaise en slecht herstel) zou men relevante metabole defekten in skeletspier-cellen kunnen verwachten. We konden het energie-metabolisme in het spier-weefsel van onze patiënten niet op een directe manier meten. Om de invloed van mogelijke substanties in het bloed op M.E./CVS te bestuderen, onderzochten we het energie-metabolisme in gecultiveerde menselijke skeletspier-cellen blootgesteld aan serum van 12 M.E./CVS-patiënten (waaronder 3 patienten met zeer ernstige ziekte en 6 met ernstige M.E./CVS) en 12 gezonde controles. Deze studie was ontworpen voor het beoordelen van de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie via het meten van (respectievelijk) het zuurstof-verbruik (‘oxygen-consumption rate’, OCR) en extracellulaire verzuring (‘extracellular acidification rate’, ECAR), in aanwezigheid van aminozuren en glucose als substraten. […]

Basale (in rust) aminozuren-gedreven mitochondriale ademhaling (conditie-I) was matig verhoogd in spiercellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum voor 6 dagen en dit effect was ook aanwezig wanneer glucose werd toegevoegd (conditie-II). Daaropvolgende toediening van de ATP-synthase inhibitor oligomycine (conditie-III) toonde aan dat bijna alle respiratoire aktiviteit gelinkt was met ATP-produktie; wat bevestigt dat de integriteit van het oxidatieve fosforylatie systeem intact was. Er was echter een minieme toename qua overgebleven OCR (‘lek-aktiviteit’). Daarna werd via toediening van de ‘ontkoppeler’ carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone [CCCP; ontkoppelt het elektron-transport-systeem van de ATP-produktie] een significant toegenomen respiratoire capaciteit (conditie-IV) onthuld. De gegevens gaven ook aan dat de ATP-gelinkte ademhaling (verschil conditie-II/-III) en de reserve respiratoire capaciteit (verschil conditie-IV/-II) verhoogd waren na blootstelling aan M.E./CVS-serum.

De basale glycolyse (conditie-II) was gelijkaardig tussen cellen blootgesteld aan M.E./CVS- en controle-serum. […] De maximum glycolyse in aanwezigheid van oligomycine neigde lichtjes verhoogd te zijn in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum (conditie-III) en deze trend was ook aanwezig na toediening van CCCP. Verdere analyse onthulde dat de lactaat-productie veroorzaakt door oligomycine (verschil conditie-III/-II) en door CCCP (verschil conditie-IV/-II) significant verhoogd waren in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum versus controle. Daarom: de cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum vertonen een metabole wijziging waarbij versterkte lactaat-produktie is betrokken bij energetische belasting.

Samengevat: serum van patiënten met ernstige M.E./CVS bleek het mitochondriaal oxidatief metabolisme en de ademhaling in spiercellen te doen stijgen, bijzonderlijk bij energetische belasting. Bijkomende experimenten met kortere blootstelling toonden dat het effekt van M.E./CVS-serum op de mitochondriale ademhaling geleidelijk aan verhoogde afhankelijk van de duur van de blootstelling.

Bespreking

Deze studie vond dat het serum aminozuren-profiel veranderd was in een grote en goed-gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten, op een manier die verstoorde mitochondriale pyruvaat-oxidatie suggereert. Deze bevinding wijst, in combinatie met verhoogde mRNA-expressie van PDK1, PDK2 & PDK4 en SIRT4, in PBMCs van patiënten, op abnormaliteiten qua PDH-regulering als een potentiële belangrijke factor bij de pathogenese van M.E./CVS. Blootstelling van gecultiveerde spiercellen aan serum van M.E./CVS-patiënten wees op de aanwezigheid van bloed-bestanddelen die het energie-metabolisme beïnvloeden.

Analyse van het serum van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde controles onthulde dat de concentraties van aminozuren die deelnemen aan het mitochondriaal oxidatief metabolisme op het niveau van acetyl-CoA (categorie-II) significant gedaald waren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee waren er geen grote wijzigingen qua aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat (categorie-I). [lees: “de pyruvaat-produktie zelf is in orde”] M.E./CVS lijkt zodoende een specifieke daling te veroorzaken van energetische substraten die worden geoxideerd downstream van PDH [“na de aanmaak van pyruvaat”]. Dit suggereert dat het pyruvaat-katabolisme wordt belemmerd bij M.E./CVS-patiënten [m.a.w. wellicht ligt het probleem bij het PDH enzyme-complex dat pyruvaat omzet naar acetyl-CoA], leidend tot verhoogd gebruik van acetyl-CoA producerende aminozuren als alternatieve substraten die het aëroob metabolisme via de TCA-cyclus van brandstof voorzien. De anaplerotische aminozuren, die dienen om de capaciteit van de TCA-cyclus op peil te houden (categorie-III), waren gedaald bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen komen overéén met eerdere rapporten [door Armstrong et al.] over dalingen qua Gln, Glu & Phe […]. Interessant: een studie bij M.E./CVS-patiënten vond veranderingen qua aminozuren-concentraties in urine die consistent zijn met het specifiek aminozuren-patroon dat we vonden in serum, en een gedaalde urinaire excretie van de TCA-cyclus intermediairen barnsteenzuur [succinaat] en citroenzuur [citraat] werd ook gerapporteerd [zie Niblett SH et al. hierboven]. Een metaboloom-studie rapporteerde gedaalde concentraties TCA-cyclus intermediairen, samen met een gedaalde pyruvaat/isocitraat verhouding, in plasma bij M.E./CVS [Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990]. Dit ondersteunt verder de hypothese dat het bevoorraden van de TCA-cyclus met pyruvaat belemmerd is bij M.E./CVS-patiënten, wat in lijn is met de gesuggereerde PDH-inhibitie.

We vonden significante mRNA-upregulering van of PDK1, PDK2 en PDK4 in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. De expressie van PDK1 mRNA was geassocieerd met klinische kenmerken zoals langere ziekte-duur, ernstiger M.E./CVS en verminderde lichamelijke aktiviteit. De werking van de PDKs is het inhiberen van PDH via fosforylatie onder omstandigheden waar pyruvaat-oxidatie moet worden onderdrukt (bv. uithongering). Een afwijkende toename qua PDK-expressie kan daarom een verstoorde PDH-funktie bij M.E./CVS veroorzaken, mogelijks via aktiviteit van transcriptie-factoren. PPARD mRNA was significant ge-upreguleerd in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, terwijl PPARA niet verschilde van gezonde controles. Er was echter een positieve correlatie tussen de expressie van PDK1 en allebei deze PPARs. Zelfs als expressie van het PPAR target-gen ACOX1 [codeert voor het enzyme peroxisomaal acyl-coenzyme-A oxidase-1 van het vetzuren beta-oxidatie pad] gelijkaardig was bij M.E./CVS-patiënten en controles, kan niet worden uitgesloten dat de PPARs bijdragen tot de regulering van PDKs op een bepaald stadium van de ontwikkeling van de ziekte. Het mitochondriaal enzyme SIRT4 bleek PDH-aktiviteit te inhiberen via hydrolyse van een component van het PDH-complex. We vonden dat SIRT4 mRNA-expressie ge-upreguleerd was in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en significant correleerde met mRNA-expressie van PDK1, PPARA & PPARD. Dit suggereert dat PDH-aktiviteit geïnhibeerd is door gecoördineerde regulerende mechanismen bij deze patiënten. Er was een kleine maar significante toename in PBMC mRNA-expressie van MPC1 maar niet van MPC2. Deze MPCs [zie hierboven] bleken belangrijke rollen te spelen in het mitochondriaal oxidatief metabolisme. De geringe upregulering van MPC1 en van PDH-E1α (PDHA [Het PDH-complex bestaat uit meerdere copieën van 3 enzymatische componenten: pyruvaat-dehydrogenase (E1), dihydrolipoamide-acetyltransferase (E2) & lipoamide-dehydrogenase (E3); E1 enzyme bestaat uit 2 alfa- & 2 beta- subunits.]) mRNAs zou compenserende mechanismen kunnen weerspiegelen die de pyruvaat-accumulatie (te wijten aan gedaalde PDH-aktiviteit) tegenwerken.

De oxidatie-paden van pyruvaat en aminozuren zijn nauw verbonden met de vetzuur-oxidatie machinerie, samenkomend op het niveau van acetyl-CoA in het mitochondriaal compartment. Er zou kunnen worden verwacht dat bij een adaptieve respons op een toestand van lage energie (veroorzaakt door een beperkte acetyl-CoA bevoorrading) meerdere signalisering-factoren betrokken zijn om de energie-homeostase te redden. Dergelijke signalisering-factoren omvatten AMPK, PPARs & HIF1, die context-afhankelijke regulering van vele metabole mechanismen mediëren. Het uibreiden van onze kennis omtrent de relatieve bijdragen van specifieke katabole paden tot de pathogenese van M.E./CVS zal belangrijk zijn om de ontwikkeling van biomerkers en behandelingen te vergemakkelijken.

Er zou kunnen worden verwacht dat de PDH-inhibitie bij M.E./CVS die hier wordt gesuggereerd, met compenserend gebruik van aminozuren als substraten voor TCA-oxidatie, ook de mitochondriale vetzuur β-oxidatie beïnvloedt in een poging om de energie-homeostase te redden. Een studie beoordeelde 612 metaboliteten bij 45 M.E./CVS-patiënten en 39 gezonde controles, en rapporteerde meerdere abnormaliteiten in verscheidene mechanismen betrokken bij het lipiden-metabolisme en het mitochondriaal energie-metabolisme [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480]. De meest prominente veranderingen bij M.E./CVS-patiënten waren uitgebreide dalingen qua sfingolipiden, glycosfingolipiden en fosfolipiden. Deze bevindingen waren consistent met een lagere ATP- en GTP-turnover, en met dalingen qua metabole intermediairen van vertakte aminozuren. Er waren echter ook indicaties voor een gereduceerde mitochondriale vetzuur-oxidatie, mar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Voegen we daarbij de PDH-inhibitie, dan zou verminderde mitochondriale vetzuur-oxidatie mogelijkerwijs de toevoer van acetyl-CoA verder compromitteren en zodoende de afhankelijkheid van categorie-II aminozuren als alternatieve brandstof voor de TCA-cyclus verhogen, zoals aangetoond in onze studie.

Geslacht-specifieke verschillen betreffende veranderingen in serum aminozuren-patronen waren duidelijk bij onze M.E./CVS-patiënten. Terwijl all 6 de aminozuren die kunnen worden omgezet naar acetyl-CoA significant waren gedaald bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (t.o.v. gezonde vrouwen), vertoonden mannelijke M.E./CVS-patiënten geringe en niet-significante dalingen van Tyr & Phe. Omwille van het relatief laag aantal mannelijke M.E./CVS-patiënten en mannelijke gezonde controles in de studie, was de statistische ‘power’ om een verschil te detekteren lager. De effekt-groottes waren echter groter bij vrouwen. Daarnaast werden bij de 124 niet-vastende vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 67 gezonde vrouwen afzonderlijke analyses uitgevoerd (2 niet-overlappende willekeurige groepen van 33 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 33 gezonde vrouwen) die dezelfde patronen aantoonden, met een significante daling van de som van de serum-concentraties van zowel categorie-II als categorie-III aminozuren bij vrouwen met M.E./CVS. Dit is een argument voor een differentieel en geslacht-specifiek gebruik van aminozuren. Een eerdere studie rapporteerde een significant verhoogde urinaire excretie van 3-Mhis (een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme) in een groep van 100 M.E./CVS-patiënten (waaronder 73 vrouwen) [zie Niblett SH et al.; hierboven]. Wanneer we echter serum 3-MHis per geslacht analyseerden, vonden we enkel bij mannelijke M.E./CVS-patiënten een verhoging. Dit suggereert dat mannen, meer dan vrouwen, endogeen proteïnen-katabolisme [eiwit-afbraak/spier-atrofie] aanwenden om te voorzien in substraten voor de TCA-cyclus. Geslacht-specifieke verschillen qua metabolisme [compensatie-mechanismen anders bij vrouwen dan bij mannen] werden aangetoond en kunnen bij M.E./CVS-patiënten in werking zijn, waarbij vetzuren, aminozuren, oxidatieve fosforylatie en het steroïden-metabolisme betrokken zijn. In tegenstelling met de geslacht-specifieke effekten betreffende aminozuren, was de verhoogde expressie van PDKs & PPARD (mRNA in PBMCs) gelijkaardig bij vrouwen en mannen met M.E./CVS. Tesamen geeft dit aan dat het ziekte-veroorzakende mechanisme verschillende compenserende effekten triggert bij vrouwen en mannen. Een gemeenschappelijk effector-systeem voor het bestendigen van symptomen zou dus de PDK-PDH-lactaat as kunnen omvatten, met gedeeltelijk geslacht-specifieke compenserende (secundaire) effekten gerelateerd met aanpassingen in het energie-metabolisme.

Onze studies met gecultiveerde menselijke spiercellen geven aan dat blootstelling aan M.E./CVS-serum leidde tot verhoogde mitochondriale ademhaling, aaangedreven door aminozuren, alleen of in combinatie met glucose. Dit effekt was bijzonder duidelijk onder omstandigheden van energie-uitputting, wanneer de mitochondriale ademhaling aan een maximum werkt (conditie-IV). Hoewel de lactaat-produktie laag neigde te zijn in rust, was deze buitensporig geïnduceerd bij energetische belasting. Deze observaties zijn compatibel met een metabole belemmering op het niveau van PDH, met een verhoogde omzetting van pyruvaat naar lactaat tot gevolg, en versterkte vraag naar alternatieve substraten downstream van PDH. Het is denkbaar dat de effekten van een dergelijke PDH-ontregeling significant escaleren onder omstandigheden met een verhoogde metabole flux, in overéénstemming met de cel-studies die hier worden gerapporteerd. Er werden ondersteunende bevindingen aangetoond na uitschakeling van PDH in gecultiveerde spiercellen. Op basis van deze observaties lijkt er een substantie(s) aanwezig in serum van M.E./CVS-patiënten die een cellulaire respons induceert ter ondersteuning van de mitochondriale energie-produktie. In overéénstemming daarmee zou optimalisering van de mitochondriale ademhaling kunnen worden beschouwd als een beschermende respons om energie-depletie veroorzaakt door PDH-dysfunktie te vermijden. Het energetisch rendement van zo’n metabole adaptatie zal echter afhangen van de toevoer van energetische substraten als brandstof voor de mitochondriale ademhaling – die gelimiteerd blijkt bij M.E./CVS-patiënten. De huidige bevindingen suggereren dat de mitochondriale brandstof-voorziening gecompromiteerd is door verminderde flux via PDH, wat leidt tot over-consumptie van alternatieve substraten zoals aminozuren gelinkt met de TCA-cyclus. Er zijn bijkomende studies vereist om de substantie(s) in M.E./CVS-serum – die de effekten op gecultiveerde spiercellen mediëren, die direct op het metabool apparaat kunnen werken of indirect via signalisering-factoren – te identificeren.

Onze gegevens – die suggereren dat M.E./CVS geassocieerd is met verminderde efficiëntie van het energie-metabolisme gecombineerd met over-produktie van lactaat – kunnen verklaren waarom veel M.E./CVS-patiënten de anaërobe drempel bereiken bij een lage belasting [Vermeulen RC. Decreased oxygen extraction during cardiopulmonary exercise test in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2014) 12: 20 /// Snell CR, Stevens SR, Davenport TE, Van Ness JM. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys Ther. (2013) 93: 1484-1492 (lees ook ‘Dubbele fietstest’) /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J Transl Med. (2014) 12: 104]. Dit wordt ondersteund door een individueel patient-verslag [Vink M. The aerobic energy production and the lactate excretion are both impeded in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Neurol Neurobiol. (2015) 1: 4] en onze eigen observaties bij patiënten met ernstige M.E./CVS die lactaat-waarden van boven 8 mM [normaalwaarden bij volwassenen: 0,5-1,7 mM] hadden, enkel en alleen door 10 min rechtop staan. Aangezien M.E./CVS-patiënten normaal gezien geen verhoogde lactaat-waarden in rust vertonen, kan er worden gespeculeerd dat het metabolisme zich aanpast aan de vermoedelijke verstoorde PDH-werking door het verhogen van de oxidatie van acetyl-CoA opleverende aminozuren en misschien ook vetzuren. [zie piloot-studie van Hanson et al. in epiloog] Zodoende kan het PDH-afhankelijk metabolisme toereikend funktioneren om over-produktie van lactaat te vermijden bij rustende patiënten maar niet in staat zijn adequaat te reageren op verhoogde glycolyse wanneer het systeem wordt belast bij inspanning. Er wordt geschat dat de TCA-cyclus 70- tot 100-voud stijgt bij zware inspanning om voldoende ATP te genereren. Dit zou een situatie creëeren met ontoereikende toevoer van acetyl-CoA om de oxidatieve ATP-produktie van brandstof te voorzien alsook accumulatie van pyruvaat en vervolgens lactaat, ondanks aërobe omstandigheden met voldoende zuurstof. Een slechte werking van PDH kan daarom consistent zijn met de verlaging van de aërobe drempel, het slecht herstel en de post-exertionele malaise die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten. Een dergelijk mechanisme zou in overéénstemming zijn met het geobserveerde verschil in inspanning-intolerantie versus ziekte-ernst bij M.E./CVS-patiënten, door het in verband brengen van de symptomen met de grootte-orde van de metabole belemmering.

De bevinding dat PDKs ge-upreguleerd zijn in PBMCs van M.E./CVS-patiënten is suggestief voor metabole ontregeling op systeem-niveau. Deze cellen hebben een funktionele PPAR-PDK interaktie en kunnen daarom een afspiegeling zijn van geassocieerde effekten die optreden in andere weefsels (die verantwoordelijk zijn voor het klinisch beeld en de symptomen van M.E./CVS). Belangrijk: zelfs al waren de verminderingen qua aminozuren zeer significant bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten, de effekt-groottes bleken gematigd. De serum-waarden van de acetyl-CoA producerende en anaplerotische aminozuren lagen binnen het normaal bereik, ook in de meeste vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren zodoende geen tekenen voor een aminozuren-deficiëntie, en er is geen voor de hand liggende noodzaak voor voeding-supplementen. De bij M.E./CVS-patiënten geobserveerde verminderingen qua aminozuren kan louter een weespiegeling zijn van een gewijzigd metabolisme bij pogingen om te adapteren aan een metabole belemmering. Het patroon van aminozuren-wijzigingen kan niet worden verklaard door andere variabelen zoals leeftijd, mate van inaktiviteit (beoordeeld via het aantal stappen per dag), ziekte-ernst of -duur. Zelfs al waren er significante correlaties met BMI: alle categorieën M.E./CVS-vrouwen (inclusief obese vrouwen) hadden lagere gemiddelde waarden qua ketogene aminozuren dan gezonde vrouwen, d.w.z. de BMI-verschillen konden de vastgestelde verminderde serum-waarden van categorie-II aminozuren niet verklaren. We vergeleken de serum-waarden van aminozuren van overnacht-vastende en niet-vastende M.E./CVS-patiënten en vonden hetzelfde patroon van veranderingen qua aminozuren-profielen. Er waren echter significante dalingen van meerdere categorie-II aminozuren bij de overnacht-vastende patiënten. Dus: zelfs al was het effekt van het vasten beperkt, toch sloten we de overnacht-vastende patiënten uit bij de analyses om te vermijden dat deze variabele werd verstoord.

Deze studie identificeert metabole veranderingen die meerdere van de klinische symptomen bij M.E./CVS-patiënten kunnen verklaren; het onderliggend mechanisme(n) voor de oorzaak van deze effekten blijft echter onduidelijk. Onze eerdere bevindingen bij proeven van B-lymfocyten depletie-therapie (monoclonaal anti-CD20 antilichaam rituximab) [momenteel nog geen bevestigingen] suggereren dat M.E./CVS in een subgroep patiënten een variant van een auto-immune ziekte zou kunnen zijn. Verdere research zou de hier gerapporteerde metabole effekten bij M.E./CVS moeten aanpakken in de context van een potentieel immunologisch mechanisme. Auto-antilichamen kunnen mogelijks interfereren met cel-oppervlakte receptoren alsook met andere factoren die betrokken zijn bij cel-signalisering. Een studie toonde dat serum-waarden van auto-antilichamen tegen meerdere autonome receptoren hoger waren bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles [Loebel M et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-39]. Er werden gelijkaardige auto-antilichamen gedetekteerd bij posturaal orthostatische tachycardie syndroom [POTS] en bij complex regionaal pijn syndroom [CRPS], aandoeningen met enkele gelijkenissen met M.E./CVS […]. Auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden kunnen interfereren met belangrijke metabole signalisering-mechanismen waarbij factoren zoals HIF1 & PPARs, alsook AMPK – dat abnormaal geaktiveerd bleek skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982] – betrokken zijn. Deze factoren zijn geassocieerd met PDK & SIRT4 bij de regulering van het oxidatief metabolisme. Bij dergelijke signalisering-mechanismen zijn factoren betrokken die eerder met M.E./CVS werden gelinkt, zoals reaktieve zuurstof soorten geassocieerd met signalisering- en mitochondriale dysfunktie, en stikstof-oxide gerelateerd met endotheliale dysfunktie, wat werd aangetoond bij M.E./CVS [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-336]. AMPK aktiveert het enzyme endotheliaal stikstof-oxide-synthase (eNOS) en foutieve AMPK-signalisering kan een mechanisme zijn bij endotheliale dysfunktie. In de huidige studie was de gemiddelde serum-waarde van de endogene eNOS-inhibitor en L-Arg analoog ADMA gelijkaardig bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. ADMA is gewoonlijk verhoogd bij cardiovasculaire endotheliale dysfunktie, wat er op wijst dat de mechanismen voor endotheliale dysfunktie bij M.E./CVS […] verschillen van die bij cardiovasculaire ziekten.

Er werd PDH-deficiëntie aangetoond bij ernstige metabole aandoeningen veroorzaakt door mutaties, waarbij progressieve neurologische degeneratie/acidose/energie-tekort betrokken bleek en associaties met epilepsie te wijten aan gewijzigde neuronale prikkelbaarheid. Bij de auto-immune zieke primaire biliare cirrose [PBC; ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)], die gepaard gaat met ernstige vermoeidheid, richten anti-mitochondriale auto-antilichamen zich tegen componenten van het PDH-complex, wat leidt tot inflammatie en weefsel-vernietiging. Bij M.E./CVS is er geen overtuigend bewijsmateriaal voor histologische inflammatie of weefsel-vernietiging, Maar toch zijn er gegevens die aktivatie van pro-inflammatoire én anti-inflammatoire mechanismen tonen (cytokine-analyses), bijzonderlijk tijdens de eerste jaren van de ziekte [Hornig M et al.; zie ‘Inleiding’]. […] Verder werk zal focussen op hoe abnormale immuun-responsen bij M.E./CVS cellulaire signalisering aantast en PDH-inhibitie veroorzaakt.

Tot besluit: deze studie suggereert dat M.E./CVS geassocieerd is met PDH-verstoring, leidend tot verhoogd verbruik van aminozuren die alternatieve paden voor de aanmaak van ATP van brandstof voorzien. Er werd gevonden dat serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale ademhaling in gecultiveerde spiercellen verhoogt, mogelijks ter compensatie of adaptatie van een inhibitie van metabole energie-mechanismen. De fysiologische gevolgen van dergelijke defekten omvatten waarschijnlijk energie- (ATP) deficiëntie en overmatige lactaat-produktie, wat strookt met de invaliderende inspanning-intolerantie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten.

————————-

Ongeveer terzelfder tijd als bovenstaand artikel verscheen er ook één van Maureen R. Hanson et al. (‘Cornell University’, New York) in het tijdschrift Molecular BioSystems, getiteld ‘Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism’. Het betreft een piloot-studie (17 M.E./CVS-patiënten & 15 gematchte controles) waar de ‘metabole signatuur’ in het plasma wordt vergeleken en mogelijke metabole verstoring worden geëxploreerd. Er werden 74 “differentieel accumulerende metabolieten” gevonden op een toaal van 361 onderzochte (35 significant gewijzigd na statistische correctie). Daarbij meerdere “essentiële energie-gerelateerde molekulen” die theoretisch gelinkt kunnen worden aan het algemeen gebrek aan energie dat wordt gezien bij M.E./CVS. Er werden “enkele mechanismen aangewezen met een hoge impact: het taurine-metabolisme (taurine is een zwavel-bevattend organisch zuur, een belangrijk bestanddeel van gal, met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie, modulatie van calcium-signalisering, enz.), het glycerofosfolipiden-metabolisme (of fosfoglyceriden; belangrijkste component van biologische membranen), die in combinatie met het primaire (gesynthetiseerd in de lever) galzuren (ontstaan uit cholesterol) -metabolisme, alsook het glyoxylaat & dicarboxylaat -metabolisme (de glyoxylaat-cyclus is een serie reakties betrokken bij de biosynthese van carbohydraten/suikers uit vetzuren of voorlopers met 2 koolstoffen die het systeem binnenkomen als acetyl-coenzyme A) en enkele andere, allemaal betrokken zijn bij het vetzuren-metabolisme”. Purinen (includsief ADP & ATP), pyrimidines en meerdere metabole aminozuren-mechanismen bleken significant verstoord…

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.