M.E.(cvs)-wetenschap

november 30, 2009

Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 7:04 am
Tags: , , , , , ,

Voor een overzicht van ideëen en werk van de researh-groep van door Klimas, zie o.a. ‘CVS: inflammatie, immuun-funktie en neuro-endocriene interakties’. Zoek naar andere bijdragen aangaande cytokinen op deze paginas…

Op basis van het onderstaande claimen dat bepaalde cytokinen merkers voor M.E.(cvs) zijn is voorbarig. Zoals de auteurs zelf aangeven zijn de bevindingen niet noodzakelijk specifiek en is bevestiging door andere labs nodig.

Toch geeft deze studie wel degelijk aanwijzingen dat er iets mis is met het immuun-respons. Dus: ook beweren dat het immuunsysteem níet betrokken is, is een flagrante ontkenning van het bewijsmateriaal. Het veranderd cytokine-patroon wijst op immuun-aktivatie en inflammatie (wat niet hetzelfde betekent als ‘infektie’).

————————-

Journal of Translational Medicine 2009, 7:96

Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome

Mary Ann Fletcher* 1,2, Xiao Rong Zeng1,2, Zachary Barnes1, Silvina Levis1,2 and Nancy G Klimas* 1,2

1Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 1600 NW 10th Ave, Miami, FL USA

2Miami Veterans Health Care Centre, 1201 NW 16th St, Miami, FL USA

Achtergrond

[…] Veel van de symptomen [van CVS] zijn inflammatoir van aard (spier-pijn, gewricht-pijn, pijnlijke keel, gevoelige lymfe-klieren) en hebben een theorie over infektie-geïinduceerde ziekte aangemoedigd. Bij 60 à 80% van de gepubliceerde stalen kent CVS een acute aanvang, met systemische symptomen gelijkaardig aan influenza-infektie die niet verzwakken. Deze observaties hebben geleid tot rapporten over geassocieerde microbiële infekties of reaktivatie van latente virale infekties. Er is echter geen consensus wat betreft etiologie.

Er is een aanzienlijke hoeveelheid literatuur die immuun-dysfunktie bij CVS beschrijft. Verhoging van pro-inflammatoire cytokinen en bewijs voor TH2 (T-helper cel-type 2) cytokine-aktivatie werden gemeld. Andere studies rapporteerden dat er geen verschillen waren tussen CVS en controles. De methodes varieerden echter sterk en weinig studies maten meer dan vier of vijf cytokinen. Gebrek aan sensitiviteit van de standaard ELISA [‘enzyme-linked immunosorbent assay’, een immunologische techniek om antilichamen of antigenen te meten] beperkte het gebruik van plasma voor de detektie van verschillen tussen gevallen en controles.

Ondanks bewijzen voor immunologische en molekulaire mediatoren, werd er geen individuele merker of combinatie of merkers gevonden die voldoende geassocieerd bleek met CVS om als een biomerker voor de diagnose of het management van CVS te gebruiken. Het doel van deze studie was te bepalen of, gebruikmakend van nieuwe technologie, plasma-cytokinen voldoende sensitiviteit en specificiteit hadden om CVS-gevallen te onderscheiden van gezonde controles gematcht voor leeftijd. Gebruikmakend van een multiplex bepaling werden 16 cytokinen (TH1, TH2, TH17, pro-inflammatoir, anti-inflammatoir) vergeleken tussen gevallen en controles. Omwille van de sterke geslachtelijke bias bij CVS (80% vrouwen), werden enkel vrouwen opgenomen in de studie.

Methodes

Patiënten

Vrouwelijke CVS-patiënten (n = 40; gemiddelde leeftijd 50) […] diagnose gebruikmakend van de ‘International Case Definition’. Vrouwelijke gezonde controles (n = 59; gemiddelde leeftijd 53) […]. Alle CVS-individuen hadden een SF-36 fysieke score (PCS) onder het 50e percentiel […]. Exclusie-criteria […] psychiatrische exclusies volgens de ‘International CFS Working Group’. Alle CVS-individuen werden bij recrutering beoordeeld voor psychiatrische diagnose mer de ‘Composite International Diagnostic Instrument’. […] De individuen hadden geen geschiedenis van hart-ziekte, COPD, kwaadaardigheid of andere systemische aandoeningen […].

Ethische kwesties

[…]

Bloed-afname

[…] Plasma werd afgescheiden binnen 2 uur na afname en bewaard bij -80°C.

Cytokine-bepaling

We maten 16 cytokinen in plasma met Quansys reagentia en instrument […] Het Q-Plex™ Human Cytokine – Screen (16-plex) is een kwantitatieve op ELISA gebaseerde test […]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

We clusterden de resultaten van de cytokine-testen in 5 groepen volgens de cytokine-literatuur. […]

Pro-inflammatoire cytokinen

Er werd een significante verhoging van de relatieve hoeveelheden van 4 uit 5 pro-inflammatoire cytokinen in perifeer bloed-plasma van patiënten met CVS gevonden, vergeleken met de controles. Enkel tumor necrose factor (TNF)α bleef onveranderd. Bij de gevallen was lymfotoxine (LT)α gestegen met 257% en IL-6 met 100% tegenover de controles.

TH2-cytokinen

IL-4 én IL-5 waren verhoogd bij CVS (mediaan voor IL-4 240% en voor IL-5 95% hoger).

Anti-inflammatoire cytokinen

IL-13 was significant lager (15%) bij CVS-patiënten terwijl IL-10 niet verschilde.

TH1-cytokinen

Mediane plasma-waarden voor IL-2 en IFNγ bij CVS waren gelijkaardig met die bij controles. IL-12 was echter significant gestegen (120%) en IL-15 gedaald (15%).

IL-8 (CXCL8)

Dit chemokine was 42% lager bij de CVS-patiënten.

TH17-cytokinen

IL-17 en IL-23 waren niet significant verschillend bij CVS-gevallen vergeleken met controles.

ROC-curve analyses

[ROC  = ‘receiver operating characteristic’; ROC-curve; grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument]

‘Area under the curve’ (AUC) voor IL-5 (0. 84), LTα (0.77), IL-4 (0.77), IL-12 (0.76) wees op een goed biomerker-potentieel. […] AUC voor IL-6 (0.73), IL-15 (0.73), IL-8 (0.69), IL-13 (0.68) IL-1α (0.62), IL-1β (0.62) toonde redelijk potentieel als biomerkers.

Bespreking

Meerdere studies melden cytokine-abnormaliteiten bij CVS; de bevindingen zijn echter gemengd. Verschillen tussen rapporten kunnen grotendeels te wijten zijn aan verschillen qua methodologie. Hoeveelheden cytokinen in plasma of serum liggen dikwijls lager dan het detektie-niveau bij traditionele ELISA-testen. Naast test-sensitiviteit worden resultaten gebruikmakend van de directe benadering beïnvloed door de tijd tussen bloed-afname en afscheiding van het serum of plasma, de bewaar-temperatuur en het herhaald ontdooien/invriezen. In vitro stimulatie van totaal bloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) is een andere benadering om cytokinen te bestuderen. ELISA wordt dan gebruikt om cytokine-inhoud van supernatants [vloeistof die boven de cellen staat na centrifugatie] van cultuur-media te meten. Het is vanzelfsprekend dat resultaten afhangen van de cultuur-condities en de gebruikte stimulantia. Andere technieken omvatten ofwel ongestimuleerde of gestimuleerde PBMCs. Resultaten verkregen met deze methodologieën zijn niet direct vergelijkbaar.

De beschikbaarheid van sensitieve multiplex technologie liet de bepaling toe van 16 cytokinen tegelijkertijd op plasma-stalen van vrouwelijke CVS-patiënten en gezonde controles gematcht voor leeftijd en geslacht. Bij de CVS-gevallen vonden we een ongebruikelijk patroon qua cytokinen die de CD4 T-cel definiëren. IL-12 afgeleid van dendritische cellen [soort witte bloedcellen; antigeen-presenterende cellen die antigenen presenteren aan CD4 T-cellen en CD8 T-cellen, waarna deze prolifereren in volwassen, antigeen-specifieke T-cellen; ze spelen dus een rol bij de immuun-respons], het belangrijkste TH1-inducerend cytokine leidend tot de aanmaak van IFNγ, IL-2 en TNFα, was gestegen. IFNγ, IL-2 en TNFwaren echter onveranderd in plasma bij CVS-gevallen in vergelijking met controles. Een ander cytokine afgeleid van dendritische cellen, IL-15, was gedaald. IL-2 en IL-15 zijn belangrijke participanten in CD8 T-cel en NK-cel aktivatie en funktie. Het feit dat ze de beta en gamma receptor-subunits gemeen hebben, resulteert in meerdere gemeenschappelijk funkties: bv. cytotoxiciteit. Aan de andere kant spelen ze, door hun verschillende alfa receptor-subunits, tegenovergestelde rollen bij immuun-processen zoals aktivatie-geïnduceerde cel-dood (IL-2) en immunologisch geheugen (IL-15). IL-23 (onveranderd bij gevallen t.o.v. controles) stimuleert de differentiatie en funktie van de TH17-subset van CD4 T-cellen, een relatief nieuw beschreven immuun-verdediging. DeTH17 CD4-cel produceert IL-17, beschermt oppervlakten (bv. huid, darmwand-bekleding) tegen bakterieën en speelt een kritieke rol bij chronische intestinale inflammatie. De ongewijzigde IL-17 en IL-23 waarden bij CVS opgetekend in deze studie zou een argument zijn tégen bakteriële gastro-intestinale infekties en tégen een belangrijke rol bij persisterende ziekte.

Samen met de TH1-abnormaliteite vonden we upregulering van TH2-geassocieerde cytokinen, IL-4 en IL-5 bij de CVS-individuen. Allergie is courant bij CVS-gevallen. Straus et al. rapporteerden >50% atopie [de aanleg om immunoglobuline (Ig)-E (antistoffen) aan te maken specifiek gericht tegen stoffen uit de omgeving] bij 24 CVS-patiënten. De verhoging van deze twee cytokinen impliceert een type 2 verschuiving – en verminderde stimulus voor cytotoxische lymfocyten funktie.

De waarschijnlijkheid van chronische inflammatie bij CVS wordt ondersteund door de verhoging van vier cytokinen van de pro-inflammatoire cascade, LTα, IL-1α, IL-1β en IL-6, in de CVS-stalen vergeleken met controles. De uitzondering was TNFα, hoewel de mediane waarde voor de gevallen 14% hoger was dan de controles en ca. 1/4 van CVS-patiënten in andere studies studies hadden verhoogd TNFα. Interleukine-13, geassocieerd met inhiberende effekten op de produktie van inflammatoire cytokinen, was lager bij gevallen vergeleken met controles. Het anti-inflammatoire cytokine, IL10, was niet verschillend. De inflammatoire mediator IL-8 (een chemokine [chemotactisch cytokine dat leukocyten kan aan trekken] gekend als CXCL8) is geweten verantwoordelijk te zijn voor de migratie en aktivatie van neutrofielen en NK-cellen, was gedaald in plasma van CVS-patiënten.

De observaties van abnormale cytokine-patronen bij CVS-patiënten ondersteunen de meldingen van retrovirus-infekties en reaktivatie van latente herpes-virus infekties. […]

Latente herpes-virus infekties zijn waarschijnlijk van belang bij CVS. Immunologische effekten van persistente herpes-infekties vergen geen virus DNA-synthese. Glazer et al. rapporteerden dat door EBV gecodeerd deoxyuridine trifosfaat nucleotidohydrolase (dUTPase) [enzyme dat het verkeerdelijk inbouwen van uracil in het DNA voorkomt en zodoende kritiek is voor de betrouwbaarheid van DNA-replicatie en -herstel] de produktie van pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-1β en IL-6, upreguleerde. dUTPase toegediend aan muizen, veroorzaakte ook ziekte-gedrag; waarvan is geweten dat geïnduceerd wordt door enkele van de cytokinen die geupreguleerd bleken bij onze studie. Een ander artikel [Waldman et al.] toonde dat EBV dUTPase de aanmaak van pro-inflammatoire cytokinen kan versterken in monocyten/macrofagen in contact met endotheliale cellen van bloedvaten. Daarenboven demonstreerden Ariza et al. dat het gezuiverd EBV dUTPase NF-kappaB op een dosis-afhankelijke manier aktiveerde via Toll Like Receptor 2 (TLR2). Behandeling van menselijke, van monocyten afgeleide macrofagen met een anti-EBV dUTPase of met een anti-TLR2 blokkeerde de produktie van IL-6. Iwakiri et al. meldden dat door EBV gecodeerd (klein) RNA [EBER; bepaalde proteïnen die tijdens de latente cyclus, wanneer geen virus-partikels worden geproduceerd, van het virus worden aangemaakt], dat wordt afgegeven door met EBV geïnfekteerde cellen, verantwoordelijk was voor immuun-aktivatie door EBV, inclusief de release van pro-inflammatoire cytokinen. Een studie (M Vera, MA Fletcher, C Cuba, L Garcia, N Klimas, gepresenteerd voor de ‘International Association for Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalitis’, Reno, 2009) rapporteerde dat het anti-virale en immuno-modulerende medicijn inosine-pranobex [Isoprinosine®, Imunovir®; een afgeleide van inosine, bootst de werking na van immuun-stimulerende hormonen aangemaakt in de thymus] tot significante verbetering leidde van de klinische scores van 61 patiënten behandeld gedurende 6 maanden. Immuun-aktivatie was verminderd, NK-cel aktiviteit verbeterd en titers van anti-Epstein Barr Virus Viraal Capside Antigen IgG waren significant gedaald. Antilichaam-titers tegen Humaan Herpes Virus 6 bleven onveranderd. Een grotere gerandomiseerde proef lijkt zinvol.

Volgens de ROC-analyse was plasma IL-5 best bij het onderscheiden van CVS-gevallen van controles […]. We rapporteerden eerder verhoging van IL-5 in de supernatants van door mitogen gestimuleerde, gecultiveerde lymfocyten van gevallen met Golf Oorlog Ziekte (GWI) vergeleken met controles. De symptomen van GWI zijn gelijkaardig met die van CVS. Drie andere cytokinen met AUC-waarden consistent met een goed potentieel als biomerkers waren LTα, IL-4 en IL-12. Minder beloftevol als systemische merkers voor CVS, maar met een AUC significant verschillend tussen gevallen en controles, waren IL-6, IL-15, IL-13, IL-1α en IL-1β.

De cytokine-veranderingen geobserveerd tussen CFS-patiënten en gezonde, gematchte controles zijn wellicht indicatief voor immuun-aktivatie en nd inflammatie. Fibromyalgie, GWI, reumatologische aandoeningen en Multipele Sclerose zouden gelijkaardige cytokine-patronen kunnen vertonen. Toekomstig onderzoek zal nodig zijn om te bepalen of de cytokine-patronen geassocieerd met CVS-gevallen gelijkaardig zijn met of verschillend van ander complexe, chronische en slecht-begrepen ziekten.

Duidelijke beperkingen van deze studie zijn dat de stalen een enkelvoudig tijdpunt en één geslacht vertegenwoordigen. Het hoofd-protocol, waarvan de CVS-stalen waren verzameld, is een grotere longitudinale studie. Individuen worden 18 maanden gevolgd en stalen worden verzameld op tijdstippen van relatieve symptoom-remissie of -verslechtering. Het vervolledigen van de studie zal de correlatie toelaten van met CVS gerelateerde symptomen en andere immuun-merkers met de cytokine-patronen. CVS is een aandoening die onevenredig meer vrouwen aantast. De grotere studie zal voldoende kracht hebben om het bestuderen van cytokine-patronen bij mannen met CVS toe te laten. Zoals Broderick et al. aanstipten: merkers van de immuun-status hebben de neiging om zeer variabel en context-specifiek te zijn, wat leidt tot inconsistente biomerker-lijsten [Fuite J, Vernon SD, Broderick G: Neuro-endocrine and immune network re-modeling in Chronic Fatigue Syndrome: an exploratory analysis. Genomics 2008, 92:393-9]. Deze indicatoren zijn onderdeel van een complex en geïntegreerd systeem en hun onderlinge afhankelijkheid moet worden aangepakt. Daarom zijn we bezig met het combineren van de proteomische en genomische gegevens over cytokinen met andere immunologische en neuro-endocriene merkers, zowel proteomisch en genomisch, om de netwerk-struktuur van neuro-endocriene-immune interaktie bij CVS in kaart te brengen. We zullen focussen op identificerende associaties tussen knooppunten die differentieel tot expressie komen bij de ziekte-groep en controles.

De bevinding van cytokine-onevenwichten in perifeer bloed heeft implicaties voor fysiologische en psychologische funktie. De gedaalde natural killer (NK) cel cytotoxiciteit en lymfoproliferatieve aktiviteiten, en verhoogde allergische en auto-immune manifestaties bij CVS zouden compatibel zijn met de hypothese dat het immuunsysteem van aangetaste individuen neigt naar een T-helper (TH) 2 type, of een cytokine-patroon dat georiënteerd is naar humorale immuniteit. De verhogingen qua LTα, IL-1α, IL1β en IL-6 wijzen op inflammatie, waarschijnlijk vergezeld van auto-antilichaam produktie, ongepaste vermoeidheid, spier- en gewricht-pijn, zowel als van stemming en slaap-patronen.

Besluit

Deze studie is één van de eerste in de CVS-literatuur die plasma-profielen rapporteert van een redelijk groot panel cytokinen gelijktijdig bepaald met een multiplex techniek. Cytokine-abnormaliteiten lijken courant te zijn bij CVS. Meerdere bleken beloftevol als potentiële biomerkers. De veranderingen in vergelijking met de normale situatie duiden op immuun-aktivatie en inflammatie – en wijzen naar to mogelijke therapeutische strategieën. De resultaten impliceren een gedesorganiseerd regulerend patroon van TH1-funktie, kritiek voor anti-virale verdediging. De gegevens van de studie ondersteunen een TH2-verschuiving, upregulering van pro-inflammatoire cytokinen en downregulering van belangrijke mediatoren van cytotoxische cel funktie.

november 23, 2009

Transcriptie-profiel van spieren bij CVS

Filed under: Celbiologie,Genetica — mewetenschap @ 2:21 pm
Tags: , , , , , , , ,

Dit is het vervolg op de eerdere studie betreffende de morfologie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten (‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS’). In feite gaat het over dezelfde groep patiënten en experimenten die gelijktijdig werden ondernomen.

Samengevat: er werd bij CVS-patiënten veranderde gen-expressie in de spieren gevonden en deze wijzigingen bleken terug te brengen naar de volgende processen en mechanismen: energie-produktie, oxidatieve stress, spierweefsel-morfolgie (vezel-type), spier-groei/-afbraak en geleiding van zenuwprikkels naar de spieren.

Wederom dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology (2009) 22: 795-807

Transcription profile analysis of vastus lateralis muscle from patients with Chronic Fatigue Syndrome

Pietrangelo T, Mancinelli R, Toniolo L, Montanari G, Vecchiet J, Fanó G, Fulle S

Department of Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Aging (CeSI), University G. d’Annunzio Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Vele lichaam-systemen zijn aangetast en de etiologie werd nog niet geïdentificeerd. Naast immunologische en psychologische aspekten, zijn skeletale spieren symptomen prominent bij CVS-patiënten. In een poging vast te stellen welke mechanismen mogelijks betrokken zijn bij de aanvang en ontwikkeling van spier-symptomen, gebruikten we algemene transcriptoom [verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’ , tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen] -analyse om genen te identificeren die differentieel tot expressie komen in de vastus lateralis spier [spier aan de voorzijde van het dijbeen, deel van de quadriceps] van vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten. We vonden dat de expressie van genen die een sleutel-rol spelen bij mitochondriale funktie en oxidatief evenwicht, inclusief superoxide-dismutase 2, was gewijzigd, net zoals genen betrokken bij energie-produktie, musculaire groei/ontwikkeling en bepaling van het vezel-fenotype. Belangrijk was dat de expressie van een gen coderend voor een component van de nicotine-cholinergische receptor-bindingsplaats verminderd was, wat een gestoorde neuromusculaire transmissie suggereert. We argumenteren dat deze belangrijke biologische processen betrokken kunnen zijn bij en/of verantwoordelijk voor de spier-symptomen van CVS.

[…]

Het is niet verrassend dat skelet-spieren het meest onderzochte orgaan zijn bij studies die zich richten op de lage tolerantie voor inspanning. Oxidatieve stress, door anderen en ons eigen laboratorium voorgesteld als een mogelijke bijdrage tot de pathofysiologie en klinische symptomen van CVS, is het brandpunt voor research geworden. [zie artikels van het lab van S. Fulle] Een studie vond dat reaktieve zuurstof soorten [ROS] niet enkel verantwoordelijk zijn voor molekulaire schade maar ook fungeren als belangrijke signalisering-molekulen die de samentrekbaarheid moduleren in niet-vermoeide én vermoeide skelet-spieren. Meerdere biochemische en metabole manifestaties in spiervezels bij CVS werden onderzocht maar de besluiten waren controversieel. Er werd getoond dat CVS-patiënten verminderde serum-concentraties aan acetylcarnitine hadden (Kuratsune et al. 1994) [zie ook: ‘Acetylcarnitine – verminderde opname in de hersenen], wat mogelijks duidt op een verminderde mitochondriale energie-produktie in de spier. Matige inspanning veroorzaakt sustantiële musculaire verzuring en de aktiviteiten van adenylaat- en creatine-kinase kinase [enzymen die een rol spelen bij de energie-voorziening van spieren] in de spier zijn gebrekkig bij CVS-patiënten. Bovendien werden spier-pijn in afwezigheid van perifere weefsel-schade en gedaalde zuurstof-verzadiging na inspanning gerapporteerd. In het licht van het beschikbare maar controversiële bewijsmateriaal betreffende de betrokkenheid van spiervezels bij CVS en de karakterisatie van enkelvoudige spiervezels, met inbegrip van de bepaling van contractie-eigenschappen in vivo [zie: ‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS], beslisten we een benadering te gebruiken die niet nog niet werd toegepast om skelet-spieren van CVS-patiënten te bestuderen: de identificatie van veranderingen qua gen-expressie m.b.v. micro-arrays. Ons doel was te bepalen of consistente gen-expressie wijzigingen konden worden geïdentificeerd bij CVS-patiënten. […]

Materialen en Methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria. […] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar en 5,4±0,7 jaar ziek) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar en 7,8±1,9 jaar ziek). […] controles hadden geen huidige of vroegere geschiedenis van diffuse musculoskeletale pijn/vermoeidheid die langer dan 10 dagen duurde. […]

Om de klinische diagnose van CVS te bevestigen en, in het bijzonder, patiënten met fibromyalgie uit te sluiten, gebruikten we ook een directe test. In een eerdere studie toonden we aan dat oxidatieve schade bij CVS de fluïditeit [omschrijvig van de viscositeit van de lipiden-lagen van een cel-membraan] en de vetzuur-samenstelling veranderde van membranen van skelet-spieren, resulterend in een specifiek en eigenaardig patroon dat volledig verschillend was van dat van fibromyalgie-patiënten. Deze laatsten, die over het algemeen hogere gelijkaardige symptomen hebben als CVS-ers, vertonen hogere membraan-fluïditeit dan CVS-patiënten en controles. [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] Om deze reden werd voorgesteld dat deze specifieke schade aan de membranen van skelet-spieren in staat is de excitatie-contractie [de elektrische aktivatie van de spiercel zet de samentrekking in werking] mechanismen te wijzigen [zie ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS] en het zou dus nuttig kunnen zijn een onderscheid te maken tussen de twee aandoeningen. Tijdens het voorbereiden van de stalen in deze studie werden bij willekeurige biopten testen uitgevoerd om de membraan-fluïditeit te verifiëren als een inclusie-criterium; en de resultaten bevestigden de klinische diagnose.

[…]

Micro-array

De totale spier biopten hier gebruikt als RNA-bron zullen waarschijnlijk gecontamineerd zijn met andere cel-types (gladde spier, endotheliale cellen, ‘end-plates’ [uiteinden van een motor-neuron], fibroblasten) die kunnen bijdragen tot verschillen qua gen-expressie. Daarom werd een algemene micro-array i.p.v. een spier-specifieke gebruikt.

De humane oligonucleotide-set die hier werd gebruikt bestaat uit 21.329 oligonucleotiden […].

Analyse van gen-expressie profiel werd uitgevoerd bij vier patiënten (twee vrouwen, allebei 48 jaar, 4 en 65 jaar ziek; twee mannen, 27 en 36 jaar, respectievelijk 7 en 12 jaar ziek) aangezien slechts deze in aanmerking kwamen voor de analyse. […]

RNA-isolatie, amplificatie en labeling

[…]

Micro-array co-hybridisatie

[…]

Array-scan en statistische analyse van expressie-data

Resultaten

Samenvatting van het transcriptie-profiel

[…]

Transcriptie-analyse werd gebruikt om de expressie-waarden van duizenden genen gelijktijdig te monitoren, met de specifieke bedoeling transcripten en/of mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij CVS spier-symptomen. Ons experimenteel ontwerp vergeleek het RNA van elke CVS-patient met een ‘pool’ van controle-RNA verkregen van alle controle-individuen van het zelfde geslacht. Dit controle-RNA werd aangewend om de effekten van inter-indiviu heterogeniteit onder de controles te minimaliseren en een meer homogene ‘baseline’ te creëeren, om zo een grotere betrouwbaarheid te verkrijgen dat up- of downregulering van transcripten geïdentificeerd bij individuele CVS-patiënten gelinkt zijn met spier-symptomen van het syndroom.

Genen die differentieel tot expressie komen bij vrouwelijke én mannelijke CVS-patiënten

De ‘Significantie Analyse van Micro-Array’ (SAM) identificeerde 218 genen die differentieel tot expressie kwamen (96 ge-upreguleerde en 122 ge-downreguleerde) bij de twee vrouwelijke patiënten, en 453 genen (19 ge-upreguleerde en 434 ge-downreguleerde) bij de twee mannelijke patiënten.

[…]

Terwijl de expressie van 218 genen was gewijzigd bij de vrouwelijke patiënten en de expressie van 453 genen bij de mannelijke patiënten, was de expressie van slechts 47 genen significant veranderd in de bioptie-stalen van alle patiënten: twee genen waren die ge-upreguleerd en 38 waren ge-downreguleerd in biopten van van én mannelijke én vrouwelijke patiënten; zeven genen waren ge-upreguleerd bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten. Deze genen met differentiële expressie werden gebruikt als basis van onze poging om wijzigingen in sigalisering-mechanismen in spieren te identificeren bij dit syndroom.

Specifieke metabole veranderingen

De genen met differentiële expressie wijzen naar de mogelijke betrokkenheid van meerdere sigalisering-mechanismen en cellulaire processen in skelet-spieren bij de ontwikkeling van CVS. Ze omvatten (a) controle van de oxidatieve toestand, (b) DNA-herstel, (c) energie-balans, (d, e) trofische/inflammatoire processen, (f, g) groei-/apoptose-mechanismen, (h) neuromusculaire transmissie en (i) vezel-fenotype.

[We beperken ons hier tot een opsomming van de genen zonder al te veel wetenschappelijke uitleg; anders zouden we een ganse cursus biochemie en molekulaire biologie moeten meegeven. Geïnteresseerden kunnen altijd contact nemen voor meer informatie. Meer duiding ook in de bespreking…]

a) Oxidatieve stress. Ten minste drie mitochondriale genen die coderen voor proteïnen die direct of indirect gecorreleerd zijn met een onevenwicht in de oxidatieve status in de spier, waren ge-downreguleerd bij zowel vrouwelijke als mannelijke patiënten: (i) superoxide-dismutase 2 (SOD2), dat betrokken is bij het metabolisme van superoxide-anionen en een ‘opruimer’ van ROS gegenereerd in de mitochondrieën; (ii) ferrodoxine 1 (FDX1), dat een ijzer-zwavel proteïne is, in staat om elektronen te transfereren van NADH naar cytochroom-p450 en ook betrokken bij ROS-generatie; en (iii) NADPH-dehydrogenase-quinone 1 (NQO1), dat codeert voor een enzyme in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] dat in staat is te beschermen tegen toxische agentia.

Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (IHPK3), belangrijk in de context van verhoogde oxidatieve schade. […]

b) DNA-herstel en gen-expressie. Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren bij CVS-patiënten was het gen coderend voor […] (POLB), een enzyme dat DNA dubbele helixen herstelt […]. Belangrijk was ook dat we vonden dat het gen […] (CITED2), een proteïne dat het start-complex vormt voor […] acetylering, ge-downreguleerd was. Verminderde acetylering […] aktiviteit van POLB verhoogt. Van het gen […] (SFPQ), dat ook ge-downreguleerd was, werd aangetoond dat het interageert met RNA-polymerase II om de transcriptie te reguleren. Naast een mogelijke rol bij oxidatieve stress, zou downregulering van IHPK3 kunnen resulteren in […], wat het DNA-herstel vermogen wijzigt of mRNA-export verstoort. Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (SRRM2), een component voor een proteïne van de cel-kern matrix dat funktioneert als een co-acktivator voor pre-mRNA ‘splicing’ [verandering van genetische informatie na transcriptie van DNA naar mRNA: tijdens het RNA-processing worden ‘introns’ (overbodige, niet-coderende stukken) uit het pre-mRNA geknipt en de exons van het pre-mRNA aan elkaar geplakt].

Downregulering van het gen coderend voor […] (NM23A/NME1) zou een poging tot compensatie-respons kunnen zijn, bedoeld om DNA-schade te verlichten.

Het is moeilijker de funktionele betekenis te interpreteren van genen die bleken ge-upreguleerd te zijn bij vrouwen maar ge-downreguleerd bij mannen. Deze genen omvatten […] (DYRK2), dat p53 [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] reguleert om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] te induceren in respons op DNA-schade; […] (TBL1XR1), die betrokken is gebleken bij histoon-binding [eiwitten die aan DNA binden; zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB]; en […] (PDE4B), dat waarschijnlijk geen rol speelt in CVS-spieren.

c) Energie-balans. Eén kenmerk van het CVS-spier gen-profiel was de onderdrukte transcriptie van meerdere genen betrokken bij het energie-meatbolisme van skeletale spiervezels. We vonden dat twee […enzymen, […] (PFKFB3) en […] (PFKFB1) ge-downreguleerd waren; wat suggereert dat glycolyse [afbraak van glucose, waarbij energie vrijkomt, tot pyrodruivenzuur, dat verder kan verbrand worden of anäeroob omgezet tot lactaat] en/of gluconeogenese [vorming van glucose uit niet-koolhydraat bronnen zoals bv. aminozuren, maar vooral uit pyrodruivenzuur] verstoord waren. […] Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (PDK4), dat pyruvaat-dehydrogenase fosforyleert, een enzyme dat belangrijk is voor de oxidatieve [omzetting] van pyruvaat dat uiteindelijk wordt gebruikt voor oxidatieve fosforylatie [ox-fos; mitochondriaal proces waarbij energie-rijke elektronen hun energie afgeven in een serie redox-reakties; zie ook: ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte]. Bovendien was […] (GOT1) ge-downreguleerd, wat suggestief is voor een toename van de gluconeogenese zonder verbruik van aminozuren., consistent met een poging van de CVS-spieren om glucose te besparen. Genen betrokken bij de fosforylatie van nucleoside-difosfaten waren ook ge-downreguleerd: inclusief […] (AMPD3), een belangrijk enzyme in purine-afbraak [purine is één van de stikstof-basen waaruit nucleïnezuren zijn opgebouwd] in spieren. Het […] (ABCA5) bleek ook ge-downreguleerd, wat suggereert dat de efflux [verwijdering van opgestapeld cholesterol uit de vaatwanden] van cholesterol uit de vezel geïnhibeerd is.

Slechts één met een mogelijk belang voor het energie-evenwicht bleek ge-upreguleerd bij vrouwen én mannen: […] (VLDLR). Dit gen codeert voor de receptor die verantwoordelijk is voor de opname van VLDL [‘very low density’ lipoproteïnen; deeltjes die vetten en cholesterol uit de lever via het bloed naar weefsels transporteren] in de spiervezel en betrokken is bij het primair mechanisme voor vetzuur-transport in skelet-spieren.

d) Atrofische processen. Een ge-downreguleerd tanscript betrokken bij de atrofische processen was […] (FOXO3A). Proteïnen van deze familie zijn transcriptie-factoren die de expressie reguleren van meerdere genen [FOXO transcriptie-factoren controleren fundamentele cellulaire processen zoals metabolisme, cel-differentiatie, cel-cyclus, DNA-herstel en andere reakties op cellulaire stress] die ge-downreguleerd bleken bij onze screening (inclusief PDK4, SOD2 en GADD45, die van belang zijn bij cellulaire responsen zoals glucose-metabolisme, regulering van de cel-cyclus en apoptose). Het is het vermelden waard dat een ander gen dat betrokken is bij het FOXO-mechanisme, […] (H1FX), coderend voor een nucleosoom-proteïne dat DNA linkt met het nucleosoom [complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt], ge-downreguleerd was.

Belangrijk in de context van atrofische processen: het ubiquitine-afhankelijk katabolisme [merken van proteïnen, door koppeling met ubiquitine, waardoor ze kunnen worden afgebroken] was waarschijnlijk ook onderdrukt; wat blijkt uit de downregulering van ubiquinatie-factor E4A (UBE4A), coderend voor de bijkomende conjugatie-factor E4. Deze factor, die sterk tot expressie komt in skelet-spieren, vervangt het E3-enzyme en is in staat ubiquitine te transfereren naar zijn doel. De onderdrukking van ubiquitine-afhankelijke processen in CVS-spieren wordt verder bevestigd door de downregulering bij vrouwelijke patiënten van […] (PSMD3), coderend voor een non-ATPase subunit [betrokken bij de afbraak van ge-ubiquitineerde proteïnen] van het proteasoom [proteasoom = cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreken via proteasen]. Bij mannelijke patiënten werd de downregulering van […] (PSMB2), coderend voor een beta subunit van het 20S proteasoom [onderdeel van het proteasoom dat ge-ubiquitineerde molekulen afbreekt], vastgesteld.

e) Inflammatoir proces. De volgende genen waren ge-downregeuleerd bij alle patiënten, wat een vermindering van de inflammatoire respons in CVS-spieren suggereert: (i) […] (SLPI), een gen coderend voor een serine-protease [proteasen die peptide-verbindingen, waarin één van de aminozuren serine is, doorknippen] met meerdere funkties bij aangeboren gastheer-verdediging, inflammatie en infektie; (ii) GRO2 oncogen [gen dat ervoor zorgt dat een cel zich als een kanker-cel gaat gedragen], […], een krachtig chemotactisch agens voor polymorfonucleaire leukocyten [stof die meerkernige witte bloedecellen aantrekt]; (iii) […] (GBP2), coderend voor een proteïne dat de proliferatie en de angiogene respons [angiogenese = vorming van nieuwe bloedvaten] van endotheliale cellen [bedekkende cellen van bloed-/lymfe-vaten en lichaamsholten] op inflammatie tegenwerkt, en ook weerstand biedt tegen de proliferatie van vesikulair stomatitis virus en encefalomyocarditis vrius; (iv) […] (TSC22D3/GILZ), een gen coderend voor de mediator van glucocorticoïd-geïnduceerde immunosuppressie, dat interfereert met AP-1 [zie Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB] […] om de binding van aktief AP-1 met zijn doelwit-DNA te inhiberen.

f, g) Groei/apoptose en cytoskeletale regulering. Meerdere ge-downreguleerde genen gemeenschappelijk bij mannelijke en vrouwelijke CVS-patiënten zijn betrokken bij cellulaire groei en apoptose-mechanismen, suggestief voor een relatieve uitdoving van deze inter-connecterende mechanismen. We vonden dat […] (FOS) en […] (MYC) ge-downreguleerd waren. FOS en MYC zijn transcriptie-factoren betrokken bij de proliferatie en cel-cyclus regulering […] maar ze induceren ook apoptose in gevoelige cellen. FOS downregulering is consistent met de downregulering van het met FOS interagerend proteïne TCS22/GILZ, waarmee het een gemeenschappelijke signaal-transductie mechanisme deelt. Ook ge-downreguleerd waren […] (AATF), een transcriptie-factor die EF2-transcriptie [EF = elongatie-factor; proteïne dat het verlengen van peptide-ketens bij proteïne-synthese vergemakkelijkt] stimuleert en cel-cyclus progressie bevordert, en […] (CEBPD), die werd gelinkt aan cel-groei en apoptose in spiercellen.

Vele genen betrokken bij controle van focale adhesie [cel-matrix adhesies of FAs; specifieke types grote macro-molekulaire samenstellingen waarmee mechanische kracht en regulerende signalen worden doorgegeven] en cytoskeletale en/of regulering van de extracellulaire matrix bleken ook ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Onder andere: (i) […] (PRELP), coderend voor een eiwit dat type-I collageen linkt met heparaan-sulfaat basale membranen [heparaan-sulfaat speelt een rol bij angiogenese, coagulatie en tumor-metastase]; (ii) collageen type-V alfa 3 (COL5A3); (iii) […] (LIMK1), coderend voor en proteïne dat eiwitten betrokken bij de organisatie van het actine-cytoskeleton linkt; en (iv) […] (SAT1), coderend voor een eiwit betrokken bij de regulering van apoptose, cellulaire proliferatie en cel-cyclus progressie.

Ook meldenswaardig is de downregulering van twee bijkomende proteïnen: (i) […] (PTK2/FAF), coderend voor een cytoplasmatisch proteïne gelokaliseerd op focale adhesies tussen groeiende cellen, dat belangrijk is voor transductie van externe signalen; en (ii) prion-proteïne (PRNP), ook bekend van bv. Creutzfel-Jakob ziekte […], coderend voor een glycoproteïne gehecht aan het cel-membraan […]; kenmerken die consistent zouden kunnen zijn met rollen qua cel-adhesie en trans-mebraan signalisering. Een ander gewijzigd gen in CVS-spieren, een anti-angiogene factor met een rol in de focale adhesie, is thrombospondine (FLJ14440, THBS1, THBS2), dat ge-upreguleerd blijkt bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten.

h) Neuromusculaire transmissie. Het gen CHRNA1, coderend voor een component van de acetylcholine binding-plaats van de nicotine-receptor […] bleek ge-downreguleerd. De afwezigheid van dit gen-produkt zou een verstoord vermogen om te antwoorden op motor-neuron ‘vuren’, belangrijk voor trage-vezel-type specificatie, kunnen impliceren.

h) Spiervezel-fenotype. De transcriptie-factor […] (MYF6/MRF4/herculine) bleek ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Bij muizen accumuleert MRF4 in trage vezels en er is bewijs dat dit gen de verschuiving naar het trage vezel-type reguleert. Dit suggereert dat her-modelering van spieren gericht is naar het snelle fenotype bij CVS-patiënten, een interpretatie die overeenstemt met de resultaten van vezel-typering op eiwit-niveau [zie Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS].

Downregulering van de volgende genen geïdentificeerd in de huidige transcriptoom-analyse ondersteunt ook deze visie: (i) calmoduline 1 (CALM1/fosforylase-kinase delta), coderend voor een belangrijk calmoduline-afhankelijk kinase dat betrokken is bij het decoderen van intracellulaire calcium-oscillaties tijdens myogenese en de differentiatie van het trage-vezel fenotype [calmoduline, CaM, ‘CALcium MODULated proteIN’, een calcium-bindend proteïne dat verschillende doelwit-proteïnen kan binden en reguleren, en zo verscheidene cellulaire funkties beïnvloeden]; en (ii) […] (Egralfa3), coderend voor een transcriptie-factor die sterk tot expressie komt bij ontwikkelende spier-spoelen [sensorische receptoren in de ‘buik’ van een spier die veranderingen detekteert in de lengte van deze spier]. Aangezien spier-spoelen meer aanwezig zijn in de delen van de spier waar type-I vezels geconcentreerd zijn, zou downregulering van dit gen consistent kunnen zijn met een spier-modelering in de richting van het snelle-vezel type. Andere observaties consistent met de visie dat gen-expressie veranderingen bij CVS een verschuiving van het vezel-type van traag naar snel weerspiegelen omvatten: (i) upregulering (beperkt tot vrouwelijke patiënten) van myosine lichte-keten kinase 2 (MYLK2), coderend voor een calmoduline-afhankelijk kinase dat sterk tot expressie komt bij regenererende en volwassen snelle vezels; en (ii) verandering (downregulering bij mannen, upregulering bij vrouwen) […] (CASQ2), coderend voor een proteïne dat kenmerkend is voor trage spiervezels, en belangrijk voor de opslag van calcium in het sarcoplasmatisch reticulum en regulering van de ryanodine-receptor [zie ‘Molekulair mechanisme voor verminderde inspanningscapaciteit].

Bespreking

In deze studie vergeleken we de gen-expressie profielen van de vastus lateralis skelet-spier bij CVS-patiënten en gezonde controles. In deze context was het doel van onze analyse te bepalen of er consistente gen-expressie wijzigingen zijn bij CVS-patiënten die mogelijks de betrokkenheid kunnen tonen van skelet-spieren bij de manifestaties van deze ziekte en aanwijzingen zouden kunnen geven over welke cellulaire processen betrokken zijn. Eerdere studies door onze groep hebben specifieke oxidatieve veranderingen in DNA en lipiden in spier-stalen van CVS-patiënten aangetoond. Het is het vermelden waard dat Mn-SOD [superoxide-dismutase] deficiëntie geassocieerd is met ernstige lipiden-peroxidatie en andere ge-downreguleerde genen, zoals FDX1, NQO1 en IHPK3, kunnen mogelijks bijdragen tot de verstoring van anti-oxidante mechanismen. Daarenboven argumenteerden we dat oxidatieve schade zou kunnen voortkomen uit mitochondriale dysfunktie, gezien de gedocumenteerde strukturele veranderingen van mitochondriale cristae van de spier-mitochondrieën bij CVS, zoals eerder geobserveerd. [zie ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS] Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren in spieren van mannelijke én vrouwelijke CVS-patiënten is het gespecialiseerd DNA-polymerase POLB (zeer belangrijk omwille van zijn ‘base excision’ [cellulair mechanisme dat beschadigd DNA herstelt door het verwijderen van kleine base-paar gebreken] herstel-aktiviteit), dat mogelijks betrokken is bij de respons op verhoogde oxidatieve schade. POLB-aktiviteit kan post-transcriptioneel verhoogd zijn door een vermindering van POLB-acetylering, die een verwacht gevolg zou zijn van CITED2 downregulering. We zouden ook kunnen speculeren dat het cyclisch voorkomen en de variabiliteit van spier-symptomen bij dit syndroom een weerspiegeling zou kunnen zijn van het weefsel-specifiek vermogen van POLB om ROS-geïnduceerde schade te herstellen. In een eerdere studie werd verhoogde anti-oxidante aktiviteit in CVS-spieren aangetoond, te wijten aan verhoogde aktiviteit van peroxidase, transferase en katalase. Deze uitkomst lijkt een poging van de CVS-spieren te vertegenwoordigen om zichzelf te beschermen tegen oxidatieve stress, gebruikmakend van anti-oxidante enzymen die tegen ROS werken in het cytoplasma, en POLB dat in de cel-kern DNA-mutaties helpt herstelllen. Deze positieve feedback is in overeenstemming met de hypothese van verhoogd peroxinitriet (Lane er al. 1998) die reeds werd voorgesteld. In feite zou stikstof-oxide kunnen reageren met ROS en het krachtige oxidant peroxinitriet genereren dat op zijn beurt het niveau van Mn-SOD zou kunnen doen dalen.

De downregulering van fosfofructokinase-transcripten bij al onze geteste patiënten suggereert de hypothese dat CVS, in bepaald opzichten, vergelijkbaar zou kunnen zijn met type-VII glycogenose of Tarui-ziekte, een zeldzame erfelijke ziekte veroorzaakt door fosfofructokinase-deficiëntie in spieren. Een tekort aan dit enzyme resulteert in glycogeen [polymeer van glucose, als energie-reserve opgesalgen in de lever en spieren] opstapeling in weefsels, wat symptomen veroorzaakt die inspanning-intolerantie of voortijdige vermoeidheid, zwakte en stijfheid bij inspanning, en pijnlijke spier-krampen omvatten. In veel gevallen heeft dit defekt systemische consequenties maar in andere gevallen beperken compenserende mechanismen de effekten tot bepaalde weefsels. In enkele patiënten met Tarui-ziekte werd de AMP-deaminase aktiviteit van erythrocyten verhoogd door calmoduline-afhankelijke intracellulaire calcium-verhoging. Bij CVS-spieren vonden we dat AMP-deaminase én calmoduline-fosforylase-kinase ge-downreguleerd waren. Dit is direct bewijs dat CVS en Tarui-ziekte verschillend zijn, gezien beide pathologieën klinisch significante spier-zwakte veroorzaken maar enkel bij CVS zijn de patiënten niet in staat hun verzwakte toestand te verhelpen met rust. De geobserveerde downregulering bij mannelijke én vrouwelijk patiënten van het gen coderend voor AMP-deaminase verdient bijkomende commentaar. AMP-deaminase is een enzyme dat van uiterst belang is bij het behouden van de beschikbaarheid van ATP bij inspanning. Eerdere studies hebben bewijs geleverd van gebrekkige adenylaat-aktiviteit in spieren van CVS-patiënten na matige inspanning [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259]. Deze verandering zou kunnen gelinkt zijn met de hoge vermoeibaarheid van CVS-patiënten tijdens uitputtende arbeid. De verstoorde afbraak van purine-nucleotiden in de spier werd geobserveerd bij andere ziekten zoals glycolytisch defekt ziekte en ook bij mitochondriale ziekten waarbij de lipiden- en koolhydraten-oxidatie zijn aangetast.

Het intense gebruik van anaërobe glycolyse voor de nood aan ATP tijdens matige inspanning en het verhoogd aantal glycolytische vezels impiceert lactaat-accumulatie. We kunnen suggereren dat in CVS-spieren er een samenloop is van metabool falen die een verstoring van aërobe energie-produktie, onderdrukking van de purine-afbraak en verhoogd lipiden-verbruik omvat.

Alle spier-stalen van CVS-patiënten vertoonden downregulering van FOXO3A, coderend voor […] één van de vooraanstaande regulators van ubiquitine-ligasen. Als we de mogelijke rol van fosforylatie bij FOXO-inaktivatie ter zijde laten, wat we niet bestudeerden, vonden we dat meerdere aan ubiquitine-proteïne-ligase verwante genen, die molekulaire doelwitten zijn voor FOXO-aktiviteit, waren ge-downreguleerd. Te samen genomen, wijzen deze gegevens naar een onderdrukking van atrofie-signalen in CVS-spieren.

Immuun-dysfunktie werd bij sommige CVS-patiënten gedocumenteerd […]. In onze analyse vonden we geen aanwijzing voor veranderde immuniteit noch enige indicatie voor inflammatoire respons. In tegenstelling daarmee vonden we dat enkele inflammatoire respons genen ge-downreguleerd waren.

Eén van de meest opvallende wijzigingen bij de huidige transcriptoom-analyse bij CVS-patiënten, is de uitgesproken downregulering van CHRNA1, coderend voor […] een component van de acetylcholine-bindingsplaats. De vermoeidheid ervaren door CVS-patiënten zou een centrale óf perifere oorzaak kunnen hebben. Het eerste hangt af van de ‘vuur-frequentie’ en het tweede van neuromusculaire transmissie en/of excitatie/contractie-koppeling. Eerdere rapporten suggereren dat de symptomen van vermoeidheid bij CVS kunnen worden afgeleid van een falen qua ‘vuur-frequentie’ van motor-neuronen en niet van een perifeer defekt in de spier-contractie. Onze resultaten leveren sterk bewijs voor deze opinie, suggererend dat daling van de transcripten leidend tot insufficiëntie wat betreft deze belangrijke cholinergische receptor component zou kunnen bijdragen tot verstoorde neuromusculaire transmissie.

[Dit zou ietwat contradictorisch kunnen lijken… Vroegere studies wijzen NIET op een perifeer defekt en de resultaten hier ondersteunen dit. TOCH wijst de bevinding van gestoorde neuromusculaire transmissie WEL op perifere betrokkenheid… Dr Pietrangelo verklaart (persoonlijke communicatie): “We hebben geen bewijs voor de etiopathogenese van CVS, dus weten we niet of de oorzaak centraal of perifeer is, maar toonden dat skelet-spieren bij CVS-patiënten (vezels en geaktiveerde genen) veranderd zijn. Dit wijst er op dat ook de periferie betrokken is door bv. gestoorde neurotransmissie, mitochondriale defekten, oxidatie enz. Meldenswaardig is dat bewijs is gevonden dat de toestand van de spieren het lot van motor-neuronen beïnvloedt (Musaro A et al., Cell Metabolism (2008) 8, 425-436, ‘Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity’) dus denken we dat de interaktie spier-zenuw, en vice versa, heel belangrijk is.”. Voor een overzicht van hun ideëen aangaande CVS en spieren, zie: Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis’.]

Een aantal hier gemelde wijzigingen qua gen-expressie wijzen consistent naar een verschuiving van trage- naar snelle-vezel fenotype zolas reeds aangetoond. Down-regulering van MRF4 en calmoduline-kinase suggereren dat regulerende mechanismen die het trage-vezel fenotype ondersteunen onderdrukt zijn. De downregulering van een gen zoals CASQ2, typisch voor het trage-vezel fenotype, en upregulering van MYLK2, hoewel beperkt tot een subgroep patiënten, is volledig consistent met deze interpretatie.

Ondanks de aanwezigheid van individuele en geslacht-specifieke variaties, zijn er significante en consistente wijzigingen in de transcriptie-profielen van spieren bij vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten; in het bijzonder zijn energie-produktie, management van oxidatieve schade, neuromusculaire transmissie en bepaling van het vezel-fenotype de belangrijkste biologische processen die betrokken zijn. Het is het melden waard dat vele processen gesuggereerd bij transcriptie-profiel analyse onafhankelijk ondersteuning vinden in eerdere rapporten, zoals in het geval van veranderde oxidatieve status en vezel-fenotype wijziging. Deze studie ondersteunt sterk de visie dat spiervezels direct betrokken zijn bij de funktionele en strukturele veranderingen die aan de basis liggen van de pathogene mechanismen van de ziekte en we kunnen besluiten dat spieren op molekulair en cellulair niveau betrokken zijn bij CVS-patiënten.

De twee studies (over veranderingen in vezel-fenotype en dit hier) plus het feit dat dit waarschijnlijk niet het resultaat is van deconditionering is opwindend. We vroegen hoe deze veranderingen ev. zouden kunnen worden omgekeerd Oefen-programmas lijken geen mogelijkheid, gezien vele patiënten een flinke terugval kennen na inspanning. Is er een andere (farmacotherapeutische) optie? Dr Pietrangelo: “ De enige suggestie die we hebben is uithouding-oefeningen. Dit zou het vezel-fenotype kunen doen verschuiven naar het trage type. Dit is echter slechts een opinie, we weten niet of dit effektief zou kunnen werken, en of het mogelijk is dit te doen bij deze patiënten en welk soort protocol zou moeten worden voorgesteld.”.

november 14, 2009

Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 3:53 pm
Tags: , , , , ,

De research-groep van Stefania Fulle hebben weer enkele toonaangevende artikels gepubliceerd. Een studie betreffende de morfologie en gen-expressie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten leverde twee complementaire publicaties op.

Dit eerste deel toonde bij CVS-ers, in vergelijking met gezonde mensen, relatief meer zgn. ‘snelle’ vezels en minder ‘trage’ vezels. De ‘trage’ vezels zijn efficiënter in het gebruik van ATP, zijn beter gevasculariseerd en bevatten meer mitochondriën; kortom ze zijn resistenter tegen vermoeidheid en beter geschikt voor langdurige aërobe arbeid. Bij ‘snelle’ vezels duurt het aanvullen van ATP langer; er zijn minder mitochondrieën, minder myoglobine en minder bloedvaten. De ‘snelle’ vezels raken makkelijk vermoeid en produceren/accumuleren meer melkzuur, wat resulteert in pijn/krampen en kan mogelijks ook TRPV1- en ASIC3-kanalen aktiveren.

Er zijn dus morfologische veranderingen waar te nemen. En volgens de auteurs zouden die NIET te wijten zijn aan het minder gebruiken van de spieren (deconditionering).

Voor meer achtergrond zie ook: ‘Vertraagd herstel na Inspanning bij CVS’ en ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’.

Het tweede deel van de studie volgt…

Met dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 22(2):427-436. (2009)

Functional characterization of muscle fibres from patients with Chronic Fatigue Syndrome: case-control study

Pietrangelo T, Toniolo L, Paoli A, Fulle S, Puglielli C, Fanò G, Reggiani C

Dept. Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Ageing (CeSI), University – G. d’Annunzio- Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Niettegenstaande de aanwezigheid van immunologische en psychologische aspekten, zijn symptomen gerelateerd met skelet-spieren, zoals pijnlijke spieren, vermoeibaarheid en gestegen lactaat-accumulatie, prominent bij CVS-patiënten. In deze geval-controle studie werd het fenotype van dezelfde bioptie-stalen geanalyseerd door het bepalen van i) vezel-type proportie – d.m.v. myosine-isoformen als vezel-type molekulaire merker en gel-elektroforese [scheidingstechniek voor eiwitten of nucleïnezuren] als een instrument om myosine-isoformen te scheiden en te kwantificeren, en ii) contractie-eigenschappen van manueel gedissecteerde, chemisch permeabel gemaakte en calcium-geaktiveerde enkelvoudige spiervezels. De resultaten toonden dat de vezel-type proportie significant gewijzigd was bij CVS-stalen: een verschuiving van het trage- naar het snelle-samentrekking fenotype. Dwars-doorsnede, kracht, maximum verkorting-snelheid [Spiervezels genereren spanning door de wisselwerking van de proteïnen actine en myosine; daardoor kunnen ze verlengen, verkorten of hetzelfde blijven. Hoewel de term ‘contractie’ verkorting impliceert als we over het spier-stelsel spreken, betekent het spiervezels die spanning genereren m.b.v. of motor-neuronen. Naargelang de verkorting-snelheid stijgt, daalt de kracht die kan worden geleverd.] en calcium-gevoeligheid waren niet significant veranderd in enkelvoudige spiervezels van CVS-stalen. De samentrekking-eigenschappen van spiervezels bleven dus bewaard maar hun verhouding was gewijzigd, met een toename van het meer voor vermoeidheid vatbare, energie-verbruikende snelle vezel-type. Alles te samen ondersteunen deze resultaten de visie dat spier-weefsel direct betrokken is bij de pathogenese van CVS en dat het zou kunnen bijdragen tot de vroege aanvang van vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren bij CVS-patiënten.

[…]

Bij CVS-patiënten zijn de meest in het oog springende symptomen de invaliderende vermoeidheid, spier-pijn en spier-zwakte, wijzend op neuromusculaire dysfunktie. Eerdere studies toonden dat sommige CVS-patiënten bij toenemende inspanning een gedaalde anaërobe drempel vertoonden. Deficiëntie in serum-acetylcarnitine bij CVS-patiënten kan leiden tot een daling in oxidatief metabolisme en hoger plasma-lactaat. Dergelijke metabole defekten kunnen bijdragen tot de verminderde fysieke uithouding van CVS-patiënten. Bij dynamische inspanning raken CVS-patiënten sneller uitgeput dan controle-individuen niettegenstaande ze over normale spier-kracht beschikken en normale of lichtjes verminderde spier-uithouding hebben. […]

Skelet-spieren van zoogdieren zijn heterogeen, opgebouwd uit vezels met een verschillende molekulaire architektuur en specifieke funktionele eigenschappen, zoals samentrekking-snelheid, maxiumum verkorting-snelheid en weerstand tegen vermoeidheid. De fysiologische eigenschappen van spieren, o.m. weerstand tegen vermoeidheid, worden bepaald door de proporties van fenotypisch afzonderlijke vezel-types. Van de proteïnen die differentieel tot expressie komen bij afzonderlijke vezel-types, worden myosine zware ketens [‘myosin heavy chains’, MyHC] dikwijls als molekulaire merkers gebruikt, omdat ze i) het meest overvloedige proteïne uitmaken (ca. 50% van de totale proteïne-inhoud); ii) meerdere funktionele eigenschappen – zoals maxiumum verkorting-snelheid en ATPase-aktiviteit – bepalen; en iii) verantwoordelijk zijn voor de differentiële histochemische ATPase kleuring […], en procedure die reeds vele jaren wordt gebruikt om vezel-types te klassificeren. In volwassen menselijke skelet-spieren komen drie MyHC-types tot expressie: twee snelle isoformen (2A en 2X) en één trage isoform (type 1 of β-cardiale isoform). Zo komen drie vezel-types voor in humane skelet-spieren: trage vezels waar type 1 MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een oxidatief metabolisme, snelle 2X-vezels waar type 2X MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een glycolyse-metabolisme en snelle 2A-vezels waar type 2A MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door intermediaire metabole eigenschappen. Welk gen tot expressie komt in een bepaalde spier-vezel hangt af van intrinsieke programmas verbonden met de myoblast-lijn [voorlopers van spiercellen] waaruit de vezel ontwikkelt, en van extrinsieke invloeden zoals neurale, hormonale en mechanische factoren (inclusief spier-aktiviteit).

Een eerdere studie betreffende de samentrekking-eigenschappen van spieren bij CVS-patiënten toonde geen consistente correlaties tussen symptomen en veranderingen qua vezel-type proportie, vezel-grootte, degeneratieve of regeneratieve kenmerken. Die studie vond dat de samentrekking-eigenschappen van quadriceps […] niet significant waren veranderd vergeleken met controles (Edwards et al. 1993). Een later rapport over een grotere CVS-groep, waar bioptie-stalen de quadriceps werden geëvalueerd […] besloot dat CVS-patiënten met een abnormale lactaat-respons bij inspanning een significant lager aantal mitochondria-rijke type 1 spiervezels hadden (Lane et al. 1998). In de huidige studie analyseerden we kracht, doorsnede-oppervlakte, maxiumum verkorting-snelheid en calcium-gevoeligheid van enkelvoudige CVS-vezels om meer te weten te komen over de samentrekking-eigenschappen van CVS-spiervezels en hun verhouding.

Materialen en methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria.

[…] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar).

Criteria voor opanme [in de studie] waren voor alle individuen: (a) leeftijd 25-55 jaar; (b) geen huidige pathologie buiten CVS […]; (c) niet zwanger; (d) type I voedsel-inname (richtlijnen ‘American Heart Assosciation’) [beperkt totaal vet: niet meer dan 30% en verzadig vet niet meer dan 10% van de totale calorie-inname, cholesterol minder dan 300 mg/dag]; (e) geen medicatie ten minste één maand voor het onderzoek; en (f) geïnformeerde, geschreven toestemming voor deelname.

Controles […] belangrijk criterium was de afwezigheid van enige diffuse musculoskeletale/vermoeidheid van langer dan 10 dagen in het heden of het verleden. […]

Experimenteel plan

[…] twee verschillende groepen experimenten: (i) transcriptie-profiel analyse van totaal spier-fragment, (ii) meting van spanning-ontwikkeling en vezel-type karakterisatie. […]

Elektroforese en Western blot analyse

[Elektroforese is een manier om eiwitten te scheiden volgens elektrische lading/grootte op een drager (polymeer/gel) in een elektrisch veld.]

[…] Scheiding van MyHC-isoformen […] volgens migratie [van snelle naar trage migratie in, van onder naar boven op een gel; de β traag-samentrekkende isoform verplaatst zich dus het snelst in een elektrisch veld]: MyHC-1, MyHC-2A en MyHC-2X. […]

Mechanische experimenten op enkelvoudige vezels

[Meten van isometrische spanning bij verschillende calcium-concentraties.]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

De proportie van vezel-types in bioptie-stalen werd bepaald via het analyseren van MyHC-isoformen. […] Elektroforetische analyse werd uitgevoerd bij totaal spier-weefsel en enkelvoudige geïsoleerde spiervezels. […]

De resultaten tonen dat er aanzienlijke variabiliteit was qua isoformen tussen individuele patiënten. […] De snelle MyHC-2A vezels bij CVS-patiënten en controles was ongeveer gelijk. De proportie trage MyHC-1 vezels was echter significant lager en die van de snelle MyHC-2X vezels significant hoger bij CVS-patiënten vergeleken met controles.

Interessant is dat de proportie vezel-types niet varieerde naar gelang geslacht. Bij mannen lagen de gemiddelden op 33,9% MyHC-1, 37,2% MyHC-2A en 28,9% MyHC-2X; bij vrouwen waren de gemiddelden 32,1% MyHC-1, 40,4% MyHC-2A en 27,5% MyHC-2X. De verschuiving qua myosine-isoform expressie is een duidelijke aanwijzing voor veranderde vezel-type proportie […]. We vonden ook geen significante verschillen qua doorsnede-oppervlakte.

In de mechanische experimenten evalueerden we de samentrekking-capaciteiten van elke vezel. We maten de maximum verkorting-snelheid (V0) tijdens maximale aktivatie van onbelaste vezels. Omdat de samentrekking-parameters, en in het bijzonder V0, sterk afhankelijk zijn van het vezel-type, werden de vezels gegroepeerd op basis van hun MyHC-isoform inhoud. Het vezel-type waar MyHC-1 en MyHC-2A tot expressie komen zijn homogeen [qua V0] voor patiënten en controles; terwijl de hybride MyHC-1-2A en de MyHC-2X vezels van CVS-spieren ietwat verschillen. Ook de hybride MyHC-2A-2X lijken te verschillen maar dit bleek statistisch niet significant.

De maximale isometrische spanning (P0) werd bij de vrij-gedissekteerde vezels gemeten bij maximale calcium-concentratie. […] De CVS-en controle-vezels bleken vrij homogeen. Er waren geen statistisch-significante verschillen, wat suggereert dat de samentrekking-eigenschappen van de spier-vezels niet was veranderd bij CVS-patiënten.

[…] De relatieve spanning ontwikkeld bij sub-maximale aktivatie van de CVS-vezels was niet significant verschillend van controle-vezels, wat er op wijst dat de samentrekking-respons van de myofibrillen [bundel samentrekbare filamenten (myosine en actine), samen betrokken bij de beweging van (spier-)cellen] op calcium-stimulatie gelijkaardig was.

Discussie

Niettegenstaande aanzienlijke research over dit onderwerp blijft de associatie tussen strukturele veranderingen in skelet-spieren en zwakte of verminderde resistentie tegen vermoeidheid, gezien bij CVS-patiënten, controversieel. Onze studie toonde een verschuiving qua vezel-type proportie bij CVS-patiënten, m.n. de aanwezigheid van meer snelle 2X-vezels en minder trage vezels. Er waren geen verschillen qua doorsnede-oppervlakte en wat betreft de belangrijke parameters die spier-samentrekking kenmerken […].

De bevinding dat de MyHC-isoform proportie gewijzigd bleek, is volgens ons een duidelijke aanwijziging voor een veranderde vezel-type verhouding. MyHC-isoformen worden beschouwd als molekulaire merkers voor vezel-types. In eerdere studies hebben we de potentiële correlatie tussen MyHC-isoform en vezel-type verhouding onderzocht, en bereikten we de conclusie dat, in afwezigheid van belangrijke veranderingen qua doorsnede-oppervlakte van de vezels, de elektroforetische analyse van de MyHC-proportie een indicator was voor de verhouding van de vezel-types. De MyHC-isoformen verhouding bij de controles hier was vergelijkbaar met wat we vonden in eerdere studies; trage MyHC vertegenwoordigde ca. 45% van het totaal, een waarde die vergelijkbaar is met wat anderen vonden. Het aantal CVS-patiënten dat we hier bestudeerden was beperkt maar dat was ten dele te wijten aan de zeer precieze inclusie-criteria. De verschuiving qua vezel-type proportie werd verder bevestigd door de observatie dat gelijkaardige resultaten werden bekomen als de patiënten werden verdeeld op basis van geslacht.

De vermindering van trage MyHC-isoformen bij CVS-patiënten ging gepaard met een vermeerdering van snelle 2X MyHC, met vrijwel geen wijziging qua snelle 2A MyHC. Bovendien was de proportie MyHC-2X in stalen van CVS-patiënten duidelijk hoger dan die van controles in deze studie en, belangrijk, in andere onafhankelijke studies. De verschuiving qua vezel-type proportie van traag naar 2X, zoals gesuggereerd door de verschuiving qua myosine-isoformen, correspondeert niet enkel met een verandering in de hoeveelheid trage en snelle vezels, maar ook in die van oxidatieve en glycolytische vezels (bij menselijke spieren zijn trage vezels hoofdzakelijk oxidatief en 2X vezels hoofdzakelijk glycolytisch). Analyse van het expressie-profiel legde ook een aantal veranderingen bloot [zie later] die consistent zijn met een verschuiving van trage naar snelle vezels. […] Een vermindering van de expressie van overeenkomstige proteïnen suggereert een onderdrukking van de signalisering die een ‘trage vezel’ fenotype ondersteunt. […] Onze analyse van het expressie-profiel  toont ook de upregulering van het gen […] dat sterk tot expressie komt in regenererende en volwassen snelle vezels.

Eerdere studies bij CVS-patiënten hebben aanwijzingen opgeleverd voor een mogelijke wijziging qua vezel-type proportie. Lane et al. rapporteerden dat lactaat in hoger mate accumuleert in de spieren van CVS-patiënten dan die van controles. Volgens een breed geaccepteerde visie wordt lactaat tijdens inspanning geproduceerd door glycolytische vezels en opgenomen door oxidatieve vezels, en ook door cardiomyocyten [hartspier-cellen] en hepatocyten [lever-cellen]. Lane et al. toonden ook dat de regeneratie van ATP via mitochondriale oxidatieve processen bij een groep CVS-patiënten verstoord was. Onze expressie-profiel analyse toonde een aantal veranderingen qua gen-expressie […] die wijzen op een verstoord energie-metabolimse. Hoewel er geen post-transcriptionele [op vlak van proteïnen] informatie beschikbaar is, kunnen we hypothiseren dat de ATP-bronnen in CVS-spieren anaërobe glycolyse zouden kunnen zijn die de lactaat-concentratie doet stijgen. De verhoging van het percentage glycolytische vezels hier toonde bovendien dat het evenwicht werd verstoord: van lactaat-verwijdering naar lactaat-accumulatie.

Het is bekend dat spier-onbruik een overgang van trage naar snelle vezels en van oxidatief naar glycolytisch metabolisme kan opleveren. De observatie dat de vezel-type proportie is veranderd bij CVS-patiënten stelt dus een belangrijke vraag betreffende de oorzaak van CVS: is de verschuiving qua vezel-type de oorzaak of het gevolg van verminderd spier-gebruik? Onsze expressie-profiel analyse biedt enkele interessante en verhelderende aanwijzingen. Een ge-downreguleerd gen bevat de bindingsplaats voor acetylcholine [neurotransmitter]. Verminderde waarden van dit transcript suggereren de mogelijkheid van een defekte nicotine-receptor [acetylcholine bindt op een nicotine-receptor, een ionkanaal-receptor die werkt via een wijziging van de celmembraan-permeabiliteit] en verminderde efficiëntie van neuronale transmissie van de neuromusculaire junctie [synaps van een axon-uiteinde van een motor-neuron (neuron in het centraal zenuwstelsel waarbij de axonen buiten het CZS reiken en spieren controleren) met de ‘motor end plate’ (uiteinde van een motor-neuron dat neurale impulsen doorgeeft aan een spier)]. Deze deficiëntie zou het vermogen van de ‘end-plate’ om het repetitieve lage-frequentie vuren van motor-neuronen – dat specifiek is voor trage vezels – kunnen verstoren en, ten gevolge daarvan, kunnen resulteren in een daling van het aantal trage vezels. Daarenboven zouden enkel intra-cellulaire signalisering-mechanismen, die vermoedelijk een rol spelen in het doorgeven van de effekten van neurale stimulatie, ook kunnen ge-downreguleerd zijn. […]

De afwezigheid van een verandering qua vezel-grootte bij CVS verdient ook enige commentaar. Hoewel het niet in overeenstemming is met de hypothese dat ongebruik kan bijdragen tot de verschuiving van snel naar vast, zoals hierboven beschreven, komt het wel overeen met eerdere histologische [histolgie = weefselkunde] studies over spieren bij CVS-patiënten die niet in staat bleken significant bewijs te vinden voor spier-atrofie. Onze mening is dat de verhoogde aanwezigheid van snelle vezels niet afhangt van spier-onbruik maar een onbekende molekulaire oorzaak zou kunnen hebben die dieper onderzocht moet worden. Het gemelde gebrek aan spier-vezel atrofie wordt ondersteund door de expressie-profiel studies […] Te samen genomen suggereert de downregulering van de genen [zie later] dat de katabolische [katabolisme = afbrekende chemische processen in het lichaam, waarbij energie vrijkomt] en atrofische [atrofie = verschrompelen van een orgaan door het afsterven van de cellen waaruit het orgaan bestaat] processen die de spier-massa kunnen reduceren minder aktief zijn.

De karakterisatie van de samentrekking-eigenschappen van spiervezels van CVS-patiënten op het niveau van de enkelvoudige vezel biedt een nieuwe bijdrage tot ons begrip van de fysiopathologie van deze ziekte. We vonden dat isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid niet verschilden tussen spieren van CVS en controles. De mechanische kracht, die proportioneel is met het produkt van isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid bij nul-belasting, zou ook ongewijzigd zijn. Hetzelfde was geldig voor de samentrekking-respons van het myofibrillair apparaat op calcium-stimulatie […]. Het is bekend dat ATPase-aktiviteit van myosine-motors [Myosine molekulaire motors bewegen langs actine-filamenten om bv. spier-samentrekking op te wekken. De koppen van myosine bevatten actine en ATP-bindingsplaatsen, dit zijn de motor-proteïnen die kracht geven aan spierspanning.], die ca. 75% van de totale energie-consumptie van de spieren bedraagt tijdens samentrekking, proportioneel is met de maximum verkorting-snelheid en dat deze groter zal zijn voor snel 2X-myosine dan voor traag myosine. De verschuiving qua vezel-type die hier werd geoberveerd, impliceert dus een hogere ATP-consumptie tijdens samentrekking. Dit creëert een nood voor snellere ATP-regeneratie, die kan worden bewerkstelligd via glycolyse en lactaat-produktie, met een daling van de extra-cellulaire pH [zuurtegraad] tot gevolg. Dit kan bijdragen tot een verslechtering van de spier-conditie tijdens aktiviteit via zuur-voelende ion-kanalen die werden gevonden op primaire afferente vezels [zie ook: ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS]

De bepaling van de contractie-prestatie werd uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de membranen (sarcolemma en sarcoplasmatisch reticulum) [sarcolemma = celmembraan van een dwarsgestreepte spiervezel; sarcoplasma = vloeistof die de myofibrillen van dwarsgestreepte spiervezels omgeeft] doorlaatbaar waren en de samentrekking werd geïnduceerd door immersie van de spiervezels in oplossingen met specifieke concentraties vrij calcium. Op deze manier waren mechanismen voor calcium-afgifte en -opname onbeschikbaar en dus kon geen conclusie worden getrokken aangaande dit aspekt van de contractie-regulering. Eerder werk door onze groep heeft echter getoond dat oxidanten zich opstapelen in CVS-spieren [zie: ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS’ /// Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] met daaraan verbonden stoornissen van proteïnen van het sarcoplasmatisch reticulum betrokken bij calcium-afgifte/-opname [Fulle S, Belia S, Vecchiet J et al. Modification of the functional capacity of sarcoplasmic reticulum membranes in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome. Neuromuscul Disord. (2003) 13: 479-84]; en dat mitochondriale aktiviteit aan de basis ligt van een toename van de produktie van reaktieve zuurstof soorten [ROS] leidend tot spier-vermoeidheid, een proces dat gelijkaardig is met het normale ouder worden. De resultaten die hier worden gerapporteerd kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat dergelijke post-transcriptionele veranderingen kunnen bijdragen tot funktionele wijzigingen, maar ze suggereren wel dat schade aan myfibrillaire proteïnen niet betrokken is.

[…]

Besluit: deze studie brengt sterk bewijs aan dat het idee ondersteunt dat struktuur en funktie van skelet-spieren zijn gewijzigd bij CVS-patiënten. Samen met de resultaten van de transcriptie-profiel analyse is de toename aan snelle, meer voor vermoeidheid vatbare 2X-vezels consistent met hogere ATP-consumptie en -regeneratie door glycolyse en lactaat-produktie. Ongeacht het mechanisme kan de verschuiving van traag-naar-snel, zoals gesuggereerd door de gegevens, bijdragen tot de verminderde weerstand tegen vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren van CVS-patiënten.

november 7, 2009

NF-κB en Inspanning

Filed under: Celbiologie,Inspanning — mewetenschap @ 6:56 pm
Tags: , , , ,

In een artikel over NF-kappaB [NF-κB] bij proteïne-afbraak en immobilisatie, ouder worden en inspanning [Ann N Y Acad Sci. 2005 Dec;1057:431-447] besloten Marina Bar-Shai en haar collegas:

>>Inspanning en spier-aktiviteit zijn essentieel voor ons welbehagen. Met de leeftijd nemen de mogelijkheden om te trainen of zich in te spannen af. Bij ouderen zal de spier-massa verminderen en de spier-schade toenemen. Fysieke inspanning kan schadelijk zijn voor iemand op leeftijd. Aangezien spier-schade veroorzaakt door inspanning bij ouderen gedeeltelijk kan geassocieerd zijn met inflammatoire processen, is het logisch aan te nemen dat NF-κB – ten minste gedeeltelijk – verantwoordelijk is voor de schadelijke effekten van fysieke inspanning op hogere leeftijd. In het geval van de upregulering van NF-κB bij inspanning, is het ook mogelijk inhibitoren van het NF-κB mechanisme te gebruiken om de schade veroorzaakt door NF-κB afhankelijke inflammatoire processen te verminderen.<<

Aangezien de door patiënten gemelde verergering van M.E.(cvs)-symptomen en aangetoonde schade [zie o.a. ‘Specifieke correlaties tussen oxidatiev stress in de spieren en CVS’] zou het NF-κB ook wel eens heel belangrijk kunnen zijn. Te meer omdat NF-κB o.a. latente virussen zou kunnen aktiveren/stimuleren [commentaren van Prof. Pall & Dr Cheney]. Omdat inspanning de M.E.(cvs) verergert [zie: ‘Dubbele fietstest’], proberen we in de wetenschappelijke literatuur hieromtrent aanwijzingen te vinden. Om te beginnen hier wat Bar-Shai et al. nog meer zeggen over het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie (naast wat bijkomende duiding).

>>Aktivatie van NF-kappaB werd vastgesteld in spieren na acute en intense inspanning, wat impliceert dat inflammatoire processen kunnen plaatsvinden bij inspanning. Dit kan spier-schade en proteïne-afbraak veroorzaken. Het gebruik van inhibitoren van het NF-kappaB mechanisme zou nuttig kunnen zijn bij het verminderen van met NF-kappaB geassocieerde spier-schade.<<

Voor wat meer achtergrond betreffende de mechanismen die NF-κB stuurt, verwijzen we naar: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB

Ann N Y Acad Sci. 2005 Dec;1057:431-47

The role of NF-kappaB in protein breakdown in immobilization, aging and exercise: from basic processes to promotion of health

Bar-Shai M, Carmeli E, Reznick AZ

Department of Anatomy and Cell Biology, Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Institute of Technology, P.O. Box 9649, Haifa 31096, Israel

Inleiding

Het verouderen van skelet-spieren

Het wegkwijnen van skelet-spieren, courant bij oudere mensen en dieren, wordt dikwijls ‘ouderdom-sarcopenie’ genoemd. Sarcopenie is een term voor het globaal verlies aan spier-massa, -kracht en -kwaliteit (strukturele samenstelling, bezenuwing, samentrekbaarheid, capillarire densiteit, vermoeibaarheid en glucose-metabolisme). Op oudere leeftijd, is er een uitgesproken afname van 20-30% qua spier-massa in vergelijking met die bij jongeren. Sarcopenie resulteert in spier-zwakte, wat leidt tot een verhoogd verkomen van valpartijen, hogere morbiditeit en verlies van funktionele autonomiteit. Er zijn meerdere voorstellen betreffende het onderliggend biochemisch mechanisme voor leeftijd-gerelateerde sarcopenie. Deze omvatten vermindering in mediërende factoren betrokken bij aktivatie van myoblasten [voorlopers van myocyten (spiercellen); bevinden zich aan de rand van spiervezels en kunnen door deling voor herstel zorgen], verminderde proteïnen-synthese in de spieren, een rol voor reaktieve zuurstof soorten [ROS], metabole gevolgen van de wijziging in enzyme-aktiviteiten, stikstof-onevenwicht, verstoord glucose-metabolisme en onevenwicht tussen afbraak en verwijdering van ‘oude’ beschadigde spier-proteïnen. De rol van mitochondrieën in spier-degeneratie en sarcopenie werden ook al voorgesteld. De factoren die leiden tot de veroudering van skelet-spieren zijn complex en talrijk. Ze omvatten biochemische en metabole veranderingen in spier-weefsel, wijzigingen in de grootte en samenstelling van spiervezels, en verlies van spier-massa. Het is echter niet duidelijk of dit fenomeen het resultaat is van de afname in spier-gebruik bij oudere leeftijd of, omgekeerd, een direct resultaat is van het veroudering-proces. De eerder vermelde wijzigingen zijn zelfs meer uitgesproken bij oudere mensen en dieren die gedurende langere perioden niet bewegen. Bij deze individuen ondergaan de skelet-spieren, in het bijzonder die van de onderste ledematen, progressieve atrofie en verlies van massa en funktie. Dit proces wordt ‘disuse muscle atrophy’ [spier-atrofie door ongebruik] genoemd en het kan schadelijke resultaten, zoals zwakte, instabiliteit en frequent vallen, opleveren die dikwijls het leven van ouder mensen belasten.

Proteolytische systemen in spieren

[…]

De betrokkenheid van TNF-α en NF-κB bij proteïne-afbraak in spieren

De connectie tussen inflammatoire processen, NF-κB aktivatie en proteïne-afbraak werd eerder al beschreven. In 1997, toonden Sen et al. [Sen CK, Khanna S, Reznick AZ et al. 1997. Glutathione-regulation of tumor necrosis factor-alpha induced NF-kappa B activation in skeletal muscle derived L6 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 645-649] dat […] TNF-α NF-κB kan aktiveren en dat deze aktivatie redox-gereguleerd is. In daaropvolgende studies, toonden Li et al. [Li YP, Schwartz RJ, Waddell ID et al. 1998. Skeletal muscle myocytes undergo protein-loss and reactive oxygen mediated NF-kappaB activation in response to tumor necrosis factor alpha. FASEB J. 12: 871-880] aan dat […], TNF-α proteïne-verlies induceerde, die gemedieerd werd door oxidatieve stress en NF-κB aktivatie. In andere studies werd getoond dat de blootstelling aan waterstof-peroxide of TNF-α leidde tot NF-κB afhankelijke proteïne-ubiquitinatie [Merken van eiwitten met ubiquitine-molekulen zodat ze afgebroken worden. Ubiquitine is in staat om te binden aan andere ubiquitine-molekulen waardoor er een poly-ubiquitine keten ontstaat.] en de expressie en aktiviteit van ubiquitine-ligasen van E3 familie [Ubiquitine wordt aan een eiwit gekoppeld via drie enzymatische stappen. Eerst wordt ubiquitine via E1 (aktivatie-enzyme) geaktiveerd, vervolgens wordt het doorgegeven aan E2 (conjugerend enzyme) en ten slotte wordt ubiquitine gekoppeld aan een target-eiwit via E3 (proteïne-ligase).].

[…]

NF-κB signalisering-mechanismen en spier-afbraak

Alle leden van de NF-κB familie members komen tot expressie in skelet-spieren. Het NF-κB transcriptie-factor complex is betrokken gebleken bij spier-atrofie toegeschreven aan het niet gebruiken én cachexie [algemene zwakte-toestand], maar de specifieke betrokken familie-leden bij de twee types van atrofie zijn duidelijk. Dit is belangrijk, omdat het er op wijst dat er verschillen zijn in de molekulaire signalisering voor deze twee types atrofie en, daardom, dat er mogelijks meer specifieke molekulen zijn die als doelwit kunnen dienen bij de ontwikkeling van therapieën.

Bij cachexie zijn de belangrijke upstream doelswitten circulerende cytokinen, vooral TNF-α, die de fosforylatie van het NF-κB inhibitor-proteïne I-κB α induceert, door het aktiveren van het specifiek kinase IKK. Na fosforylatie krijgt I-κB α meerder ubiquitine-molekulen en afgebroken door het proteasoom [cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreken via proteasen], zodat NF-κB nucleaire translokatie [verplaatsing naar de cel-kern] en transcriptionele aktiviteit [‘overschrijven’ van DNA naar RNA] mogelijk wordt. De meest overvloedige vorm van NF-κB, het p65/p50 heterodimeer, wordt geaktiveerd via het bovenstaande mechanisme, wat wordt beschouwd als de klassieke of kanonieke aktivering-wijze. [Janssen-Heininger YM, Poynter ME & Baeuerle PA. 2000. Recent advances towards understanding redox-mechanisms in the activation of nuclear factor kappaB. Free Radic. Biol. Med. 28: 1317-1327]

Bij het niet gebruiken van spieren, werd een alternatief mechansime voor NF-κB aktivering opgehelderd. Er werd aangetoond dat het niet gebruiken van de spieren leidt tot verhoogde transcriptie-aktiviteit van NF-κB. […] Het prototypisch NF-κB familie-lid p65 vertoonde geen gestegen nucleaire waarden, p50 en Bcl-3 (een nucleair I-κB familie-lid) was uitgesproken verhoogd. […]

[…]

Bespreking

[…]

Het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie

Er zijn tegenstrijdige rapporten geweest over het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie in spier-cellen en andere weefsels. Als inderdaad bepaalde manieren van training spier-schade zouden veroorzaken, zou men verwachten dat NF-κB mogelijks participeert in de processen van spier-beschadiging zoals blijkt uit proteïne-afbraak door schadelijke inspanning-regimes. Veronderstellend dat bij de meeste inspanningen proteïne-synthese in de spieren wordt gestimuleerd, is het plausibel downregulering van NF-κB aktivatie te verwachten onder deze omstandigheden.

Een aantal rapporten wijst er op dat intense fysieke inspanning leidt tot de toename van de aktivatie van het NF-κB signalisering-mechanisme. Ji et al. [Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Steinhafel N & Vina J. 2004. Acute exercise activates nuclear factor (NF)-kappaB signalling-pathway in rat skeletal muscle. FASEB J. 18: 1499-1506] hebben gevonden dat bij ratten die zich inspanden tot uitputting, er hoge waarden van NF-κB aktivatie in de spieren waren, vergeleken met ratten die geen inspanning leverden. De inhoud van IKK en I-κB α in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof met daarin de cel-organellen] van de spier-cellen was daarom ook gedaald. Behandeling met anti-oxidanten, zoals pyrrolidine-dithiocarbamaat (PDTC), deed de aktivatie van de NF-κB signalisering-cascade bijna volledig teniet. Zo rapporteerde Ho et al. ook dat NF-κB aktiviteit steeg met 50% in de kuit-spieren van ratten 1-3 uur na 60 minuten op een loopband. [Ho RC, Hirshman MF, Li Y et al. 2005. Regulation of I{kappa} B kinase and NF-{kappa}B in contracting adult rat skeletal muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 289(4): C794-801] Inhibitie van p38 en ERK MAP-kinasen [zie ook: ‘Glia, glutamaat-transport en chronische pijn’] resulteerde in 76% inhibitie van de IKK-fosforylatie. Dit suggereerde dat deze kinasen de aktivatie van IKK en NF-κB tijdens inspanning kunnen beïnvloeden.

Sen heeft een mechanisme gesuggereerd voor de mogelijke manier voor NF-κB aktivatie bij inspanning. [Sen CK. 1999. Glutathione-homeostasis in response to exercise-training and nutritional supplements. Mol. Cell. Biochem. 196: 31-42] In zijn artikel beschijft hij hoe intense acute inspanning de oxidatie van glutathion in spier-cellen kan veroorzaken, wat resulteert in verhoogde oxidatieve stress en NF-κB aktivatie. Regelmatige inspanning kan echter glutathion-waarden verhogen in spier-weefsel, wat resulteert in een downregulering van de NF-κB aktiviteit. Inderdaad: andere studies bij mensen hebben gesuggereerd dat acute vermoeiende inspanning de NF-κB aktiviteit in spieren lijkt te doen dalen. [Durhan WJ, Li YP, Gerken E et al. 2004. Fatiguing exercise reduces DNA-binding activity of NF-kappaB in skeletal muscle nuclei. J. Appl. Physiol. 97: 1740-1745]

Ander werk op het effekt van ouderdom en inspanning toonde dat er, met de leeftijd, een stijging qua NF-κB inhoud was in rat-levers. Dit werd significant verminderd door regelmatige inspanning. [Radak Z, Chung HY, Naito H et al. 2004. Age-associated increase in oxidative stress and nuclear factor kappaB activation are attenuated in rat-liver by regular exercise. FASEB J. 18: 749-750] Daarom kan regelmatige inspanning mogelijks de inflammatoire respons die wordt gezien op oudere leeftijd doen dalen.

[…]

Dit alles komt ook aan bod in een overzicht door dezelfde groep (‘Exercise and immobilization in aging animals: the involvement of oxidative stress and NF-kappaB activation’; Free Radic Biol Med. 2008 Jan 15;44(2):202-14):

>> Intense fysieke inspanning door jonge mensen gaat gepaard met verhoogde parameters voor oxidatieve stress in spieren en andere organen. Veeleisende inspanning door dieren leidde tot verhoogde proteïne-oxidatie (gemeten via proteïne-carbonyl accumulatie) in de spieren, die kon worden verminderd door toediening van vitamine-E. Nucleaire factor kappaB (NF-kappaB) is een redox-gevoelige transcriptie-factor die responsief is voor ROS en reaktieve stikstof soorten (RNS) redox-cascades.<<

Er wordt hier ook melding gemaakt van het feit dat oxidatieve stress afkomstig van mitochondrieën de aktiviteit van NF-κB reguleert. [Wordt vervolgd]

*************************

Het bestuderen van het verband tussen NF-κB en inspanning gaat natuurlijk verder. Hoewel niet specifiek gericht op M.E.(cvs)-patiënten, vindt er men in de wetenschappelijke literatuur wel aanwijzingen die van belang zouden kunnen zijn… Eventeel tegenstrijdige uitkomsten kunnen te wijten zijn aan het inspanning-protocol, het onderzocht cellulair materiaal of de methodologie. In elk geval zouden onderzoeken specifiek bij M.E.(cvs) voor ons interessant zijn… Een bloemlezing:

Free Radic Res. 2005 Apr;39(4):431-9

Changes in oxidative stress markers and NF-kappaB activation induced by sprint-exercise

Cuevas MJ, Almar M, García-Glez JC, García-López D, De Paz JA, Alvear-Ordenes I, González-Gallego J

Department of Physiology, University of León, University Campus, León 24071, Spain

Deze studie was gericht op het onderzoek van veranderingen in bloed-merkers voor oxidatieve schade geïnduceerd door korte-termijn supra-maximale anaërobe inspanning en op het bepalen of oxidatieve stress geassocieerd was met aktivatie van de redox-gevoelige transcriptie-factor nuclear factor-kappaB (NF-kappaB). [Het betreft hier wel inspanningen die M.E.(cvs)-patiënten zelden zullen leveren: sprinten door professionele renners.] De waarden van 8-OH-2-deoxyguanosine [8-OH-2DG; maat voor oxidatieve schade aan DNA] in leukocyten waren significant verhoogd 24 h na inspanning. Een significante daling van de concentratie gereduceerd glutathion (GSH) in het bloed werd geobserveerd direct, 15, 60 en 120 min na inspanning, gevolgd door een terugkeer naar basale waarden na 24 h. Deze daling ging parallel met een significante stijging van de verhouding geoxideerd/gereduceerd glutathion (GSSG/GSH), met een aktivatie van NF-kappaB en met een significante daling in het proteïne-gehalte van zijn inhibitor IkappaB. […] We besluiten dat de hier geleverde inspanningen oxidatieve stress induceren, zoals wordt bewezen door schade aan macro-molekulen en verandeingen in de glutathion-status. Onze gegeven wijzen er op dat anaërobe inspanning van hoge intensiteit aanleiding geeft tot een aktivatie van de transcriptie- factor NF-kappaB tesamen met een afbraak van IkappaB.

Mech Ageing Dev. 2008 Jun;129(6):313-21. Epub 2008 Feb 23

Eccentric training impairs NF-kappaB activation and over-expression of inflammation-related genes induced by acute eccentric exercise in the elderly

Jiménez-Jiménez R, Cuevas MJ, Almar M, Lima E, García-López D, De Paz JA, González-Gallego J

Institute of Biomedicine, University of León, León, Spain

Deze studie richtte zich op het onderzoeken van wijzigingen qua in NF-kappaB aktivatie en in de expressie van de  met inflammatie gerelateerde genen iNOS (induceerbaar stikstof-oxide-synthase), COX-2 (cyclo-oxygenase-2) en IL-6 (interleukine-6) geïnduceerd in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) bij ouderen mensen bij acute excentrische inspanning [type spiersamentrekking waarin de weerstand groter is dan de kracht die door de spier wordt geleverd] en bij sub-maximale excentrische training. Elf individuen, met een leeftijd tussen 66-75 jaar, leverden 2 periodes van excentrische inspanning gescheiden door 8 weken training. Na de eerste inspanning stegen NF-kappaB aktivatie en proteïne-gehalte van de p50/p65 subunits, stegen fosfo-IkappaBalfa en fosfo-IKKalfa, terwijl het IkappaBalfa proteïne-gehalte significant was gereduceerd. Dit ging vergezeld van een significante stijgingin iNOS, COX-2 en IL-6 mRNA proteïne-gehalte en proteïne-hoeveelheid. Veranderingen waren significant afgenomen na de tweede inspanning. Belsuit: acute excentrische inspanning doet NF-kappaB aktivatie en de expressie van meerdere inflammatie-gerelateerde genen stijgen in PBMCs van oudere individuen. Regelmatige excentrische training zou een effektieve methode kunnen zijn ter preventie van ongewenste inflammatoire responsen geïnduceerd door excentrische inspanning. [Met nadruk op ‘zou’, zeker bij M.E.(cvs)-patiënten waarvan de symptomen aanwakkeren bij inspanning…]

Cell Biochem Funct. 2007 Jan-Feb;25(1):63-73

Acute exercise stimulates macrophage function: possible role of NF-kappaB pathways

Silveira EM, Rodrigues MF, Krause MS, Vianna DR, Almeida BS, Rossato JS, Oliveira LP Jr, Curi R, de Bittencourt PI Jr

Department of Physiology, Institute of Basic Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil

Matige fysieke inspanning uitgevoerd op een regelmatige basis heft een aantal voordelen voor gans het organisme, in het bijzonder wat betreft de werking van het immuunsysteem, zoals het verhogen van de weerstand tegen infekties en kanker. Hoewel glutamine-aanmaak door aktieve spier-cellen zowel als neuro-endocriene veranderingen gemedieerd door de chronische aanpassing aan inspanning een rol kunnen spelen, blijft het gehele mechanisme, waardoor inspanning het immuunsysteem bewust maakt van uitdagingen, grotendeels onbekend uncovered. Dit is in het bijzonder waar voor de effekten van een acute inspanning-sessie op de werking van het immuunsysteem. In dit werk werden circulerende monocyten/macrofagen van sedentaire ratten, onderworpen aan een acute (1 h) zwem-sessie, getest op het vermogen om zymosan-deeltjes te fagocyteren [zymosan induceert experimentele steriele inflammatie], op forbol-myristaat-acetaat [PMA; een krachtig promotor van de cel-deling, door aktivatie van het signaal-transductie enzyme proteïne-kinase-C] geïnduceerde produktie van waterstof-peroxide, stikstof-oxide (NO) release (bepaald via nitraat- en nitriet-produktie) en de expressie van NO-synthases (NOS-1, NOS-2 en NOS-3). De resultaten toonden dat een inspanning een 2,4-voudige stijging in macrofaag fagocyterende capaciteit induceerde (p = 0.0041), een 9,6-voudige verhoging in PMA-geïnduceerde waterstof-peroxide afgifte in het incubatie-medium (p = 0.0022) en een 95,5% verhoging van de basale nitriet-produktie (p = 0.0220), die geassocieerd was met een duidelijke expressie van NOS-2 (de induceerbare NOS isoform; p = 0.0319), maae niet van andere NOS gen-produkten. Hoewel NOS-2 expressie afhnakelijk is van nucleaire factor kappaB (NF-kappaB), werd geen systemische oxidatieve stress gevonden (op basis van de gegevens betreffende plasma-TBARS en de glutathion-disulfide (GSSG) – glutathion (GSH) ratio in erythrocyten die constant bleven na acute inspanning). Er leek ook geen stress-situatie te zijn voor monocyten/macrofagen, aangezien de expressie van de het 70-kDa heat-shock proteïne [Hsp70; zie ook: ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ waar wél wijzigingen werden opgemerkt, en ‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS’] onveranderd bleef. We besluiten dat NF-kappaB afhankelijke inductie van NOS-2 en macrofaag-aktivatie verband moet houden met (een) plaatselijke factor(en) geproduceerd in de omgeving van de monocytns/macrofagen.

Appl Physiol Nutr Metab. 2009 Aug;34(4):745-53

Effects of eccentric treadmill exercise on inflammatory gene expression in human skeletal muscle

Buford TW, Cooke MB, Shelmadine BD, Hudson GM, Redd L, Willoughby DS

Exercise and Biochemical Nutrition Laboratory, Baylor University, Waco, TX 76798, USA

Deze studie onderzocht de expressie van meerdere genen gerelateerd met het inflammatoir proces in skelet-spieren voor en na een periode van bergafwaarts lopen. Negenentwintig mannen tussen 18 en 35 jaar voerden een 45 min bergafwaarts (-17.5%) loopban-protocol aan 60% van de maximale zuurstof-consumptie uit. Stalen veneus bloed spier-biopten van de vastus lateralis werden verkregen vóór, en 3h en 24-h na inspanning , samen met schattingen van de ervaren spier-pijn. Serum creatine-kinase [CK; enzyme dat een rol speelt bij de energie-voorziening van de spier; komt vrj in het bloed bij spier-beschadiging/-afbraak] werd bepaald, alsook gen-expressie van interleukine (IL)-6, IL-8, IL-12 (p35), tumor necrose factor-alfa (TNF-alfa), IL-1beta, cyclo-oxygenase 2 (COX2) en nucleaire factor kappa B (NF-kB) (p105/p50) in skelet-spieren. […] Er werd significante (p < 0.05) upregulering van IL-6, IL-8 en COX2 mRNA-expressie geobserveerd vergeleken met basale waarden, terwijl geen significante veranderingen voor IL-12, IL-1beta, TNF-alfa of NF-kB werden gezien. Er werden significante stijgingen van IL-6 mRNA geobserveerd na 3 h (p < 0.001) en na 24 h (p = 0.043), terwijl significante verhogingen van IL-8 (p = 0.001) en COX2 (p = 0.046) mRNA werden gevonden 3h na inspanning. Daarenboven was de spier-gevoeligheid significant gecorreleerd met IL-8 na 24 h (p = 0.048), terwijl CK significant was gerelateerd met NF-kB bij aanvang (p = 0.012). Deze gegevens wijzen er op dat stijgingen in de mRNA-expressie van IL-6, IL-8 en COX2 voorkomen in de vastus lateralis ten gevolge een beschadigende excentrische inspanning bij jonge, recreationeel getrainde mannen. Verder lijkt het dat IL-8 transcriptie een zekere rol kan spleen bij het inhiberen van spier-gevoeligheid na inspanning, mogelijks via regulering van angiogenese [vorming van nieuwe bloedvaten].

Ann N Y Acad Sci. 2009 Aug;1171:464-71

Effects of exercise on cyclooxygenase-2 expression and nuclear factor-kappaB DNA binding in human peripheral blood mononuclear cells

Kim SY, Jun TW, Lee YS, Na HK, Surh YJ, Song W

Health and Exercise Science Laboratory, Institute of Sports Science, Seoul National University, Seoul, Korea

Er is veelvuldig dwingend bewijs dat de heilzame effekten van inspanning op de preventie en/of verbetering van bepaalde chronische ziekten ondersteunt. Uitputtende of intense inspanning veroorzaakt echter generatie van zuurstof vrije radikalen en oxidatieve stress, die kan leiden tot letsels en chronische vermoeidheid, alsook inflammatie. Abnormale upregulering van cyclo-oxygenase-2 (COX-2), een beperkend/bepalend enzyme bij prostaglandine-biosynthese, bleek betrokken bij vele met inflammatie geassocieerde chronische aandoeningen. Nucleaire factor-kappaB (NF-kappaB) is eenbelangrijke transcriptie-factor betrokken bij de regulering van COX-2 gen-expressie. Om te bepalen of inflammatie-inductie afhankelijk is van de inspanning-intensiteit, werden COX-2 expressie en NF-kappaB aktivatie als hoofd-doelwitten gekozen. Dertien vrijwilligers die deelnamen aan het inspanning-programma werden onderworpen aan vier inspanning-intensiteiten [40, 60, 80 en 100% hartslag-reserve [HRR; verschil tussen maximale hartslag en rustpols] op een loopband en rust-condities. Geïsoleerde menselijke perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werden verzameld tijdens de rust en onmiddellijk na inspanning, en onderworpen aan de ‘elektroforetische mobiliteit verschuiving’ test  [Een ‘electrophoretic mobility shift assay’ (EMSA, ook ‘gel shift assay’, ‘gel mobility shift assay’), is een courante techniek uit de molekulaire biologie gebruikt om interakties (affiniteit) tussen proteïne en DNA of tussen proteïne en RNA te bestuderen. Deze procedure kan bepalen of een eiwit of mengsel van eiwitten in staat is te binden op een bepaalde DNA- of RNA-sequentie. Bij een dergelijke test verandert de elektroforetische mobiliteit in een polacrylamide-gel van een radioaktief gemerkt eiwit als er een ander eiwit aan bindt. De verschuiving is dan waarneembaar ten opzichte van stalen waar geen binding optreedt.]en Western blot analyse. Naargelang de inspanning-intensiteit steeg, waren COX-2 expressie én NF-kappaB DNA-binding aktiviteit verhoogd. De expressie van IkappaB kinase alfa (IKKalfa) en IkappaBalfa waren niet significant gewijzigd. Uitputtende/energieke inspanning (100% HRR) kon echter de fosforylatie van IKKalfa én IkappaBalfa induceren. Besluit: een enkelvoudige inspanning induceerde COX-2 expressie en DNA-binding aktiviteit van NF-kappaB in menselijke PBMCs, en zowel COX-2 expressie en DNA-binding aktiviteit van NF-kappaB waren afhankelijk van de inspanning-intensiteit.

Blog op WordPress.com.