M.E.(cvs)-wetenschap

mei 10, 2019

Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 11:57 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel (gefinancierd door de ‘National Institutes of Health’, de ‘ME Association’ & de ‘Medical Research Council UK’) is gebaseerd op stalen die door patiënten aan de Britse M.E./CVS Biobank werden gedoneerd. De tekst spreekt voor zichzelf. Er komen verdere aanwijzingen naar boven voor een abnormaal energie-metabolisme bij M.E.(cvs).

————————-

Diagnostics Vol 9, #2, p. 41 (2019)

Evidence of clinical pathology abnormalities in People with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome from an analytic cross-sectional study

Luis Nacul (1), Barbara de Barros (1), Caroline C. Kingdon (1), Jacqueline M. Cliff (1), Taane G. Clark (1,2), Kathleen Mudie (1), Hazel M. Dockrell (1), Eliana M. Lacerda (1)

1 Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, WC1E 7HT, UK

2 Faculty of Epidemiology and Population Health, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London,WC1E 7HT, UK

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende ziekte met extreme vermoeidheid, post-exertionele malaise en andere symptomen. Door de afwezigheid van een diagnostische biomerker wordt de diagnose van M.E./CVS klinisch gesteld, hoewel laboratoriumtesten routinematig worden aangewend om alternatieve diagnoses uit te sluiten. In deze analytische ‘cross-sectionele’ studie hadden we tot doel potentiële haematologische en biochemische merkers voor M.E./CVS en ziekte-graad te exploreren. We deden een review van laboratorium-test resultaten van 272 mensen met M.E./CVS en 136 gezonde controles participerend in de Britse M.E./CVS Biobank [UKMEB]. Na correcties voor multipele vergelijkingen lagen de meeste resultaten binnen de normale waarden, maar mensen met ernstige M.E./CVS vertoonden lagere mediane waarden (p < 0.001) van serum creatine-kinase (CK; mediaan = 54 U/l), vergeleken met gezonde controles (HCs; mediaan = 101,5 U/l) en minder-ernstige M.E./CVS (mediaan = 84 U/l). De verschillen qua CK-concentraties hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd, body-mass-index, spiermassa, ziekte-duur en aktiviteit-niveau […]. Dit is het eerste rapport over het feit dat serum CK-concentraties uitgesproken gedaald zijn bij ernstige M.E./CVS en deze resultaten suggereren dat serum-CK verder onderzoek verdient als een biomerker voor ernstige M.E./CVS.

1. Inleiding

[…] Hoewel ontregeling van de zenuw-, immuun- en endocriene stelsels met verstoord cellulair energie-metabolisme en ionen-transport werd gesuggereerd, wordt de pathofysiologie van M.E./CVS nog niet helemaal begrepen, en er zijn geen biologische merkers die alom gebruikt worden voor de diagnose, subgroepering of prognose.

[…] Een belangrijke doelstelling van klinische research bij M.E./CVS is het verbeteren van de diagnose-stelling, en het vinden van klinische en laboratorium-testen die kunnen worden gebruikt als ziekte-merkers. In 2011 lanceerden we de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB) als een hulpmiddel om M.E./CVS-research te versnellen. Een rigoureuze beoordeling, naast uitgebreide klinische fenotypering van de deelnemers, is essentieel om te verzekeren dat M.E./CVS-diagnose accuraat is volgens erkende klinische criteria. De analyse van deze klinische gegevens in relatie met molekulaire merkers ondersteunt verder het beter begrijpen van de ziekte-etiologie en -pathofysiologie. In deze studie vergeleken we resultaten van ‘baseline’ laboratorium-testen van UKMEB-deelnemers met M.E./CVS, inclusief mild/matig en ernstig aangetasten (d.i. aan huis gebonden en bedlegerige) individuen, en gezonde controles […]

2. Materialen en methodes

Deze analytische ‘cross-sectionele’ studie [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] werd uitgevoerd als een subgroep van de UKMEB-deelnemers die toestemming. De recrutering – inclusief opname-criteria, gegevens- en staal-collectie, en behandeling van bio-stalen voor de UKMEB – werden elders in detail beschreven [The UK ME/CFS Biobank for biomedical research on Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) and Multiple Sclerosis. Open J. Bioresour. (2017) 4: 4]. Volwassen deelnemers met M.E./CVS die eerder de diagnose kregen via huisartsen en/of M.E./CVS-specialisten en gezonde controles werden gerecruteerd via de Britse ‘National Health Service’ (NHS). De inclusie-criteria voor de deelnemers met M.E./CVS omvatten het beantwoorden aan de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ criteria (CDC 1994) of Canadese Consensus Criteria, wat werd vastgesteld door de klinici van het research-team. Ervaren research-verpleegsters beoordeelden alle deelnemers en er werd bloed afgenomen voor onmiddellijke ‘baseline’ klinische laboratorium-testen, alsook voor research-doeleinden en bewaring op langere termijn. De bloedafnames vonden plaats in de participerende klinieken of bij de deelnemers thuis (voor de ernstig geïnvalideerden), en de stalen werden binnen 6 uur overgebracht voor verwerking en bewaring. Gegevens-input, transport van de stalen, voorbereiding, verwerking en opslag van de stalen gebeurde volgens ‘standard operating procedures’ (SOPs).

De ‘baseline’ laboratorium-testen werden in de eerste plaats gebruikt om deelnemers met M.E./CVS uit te sluiten waarvan de chronische vermoeidheid door andere aandoeningen zou kunnen worden verklaard. Deze testen omvatten: bloedcel-tellingen, erythrocyten-sedimentatie (ESR), serum vitamine-B12 en folaat; biochemische testen met inbegrip van elektrolyten, creatinine [afbraakprodukt van creatine-fosfaat in spierweefsel; creatine is een tussenprodukt bij de energie-voorziening van spier- en zenuw-cellen], ureum, serum creatine-kinase (CK), lever-funktie testen, C-reaktief proteïne, reumatoïde factor, schildklier-funktie testen; transglutaminase-antilichamen [geassocieerd met coeliakie, artritis, inflammatoire darm ziekte]; en urine-analyse (proteïne, glucose & bloed). CK iso-enzymen, voornamelijk aangemaakt in skeletspieren (CK-MM) en hartspier (CK-MB), en aldolase [enzyme van het glycolyse-pad] werden geanalyseerd in een subgroep met 50 patiënten (25 ernstige & 25 niet-ernstige) en 25 controles. De bloedstalen werden in laboratoria geanalyseerd naargelang de afstand van de plaats van afname; er werden standaard NHS laboratorium-protocollen gebruikt voor alle testen. Het personeel van de NHS [Brits ‘National Health System’] laboratoria was geblindeerd wat betreft de status van de studie-deelnemers.

Deze studie omvatte een staal van 272 bevestigde M.E./CVS-gevallen en 136 gezonde controles. De M.E./CVS-patiënten werden verder geklassificeerd als mild/matig (n = 216) of ernstig ziek (n = 56). Het vaststellen van de ziektegraad gebeurde bij de recrutering op basis van het feit of de patient hoodzakelijk aan huis gebonden of bedlegerig (ernstig) or ambulant (mild/matig) was. We inspecteerden visueel de vorm van de distrubutie van de continue variabelen en, wanneer afwijkingen van normaalwaarden werd vastgesteld, gebruikten we wiskundige bewerkingen om gegevens te bekomen die een normale distributie benaderden voor [statistische] regressie-analyse. […]

We voerden ook regressie-analyses uit met leeftijd bij recrutering, geslacht, body-mass-index, ziekteduur, spiermassa index (percentage van totaal lichaamsgewicht) en recente aktiviteit als co-variaten. De aktiviteit-niveaus werden opgemaakt uit antwoorden op specifieke vragen (op maat gemaakte vragenlijst): er werd de deelnemers gevraagd hun ervaren aktiviteit-niveau van de 7 dagen vóór de bloedafname te categoriseren, gaande van “helemaal niet aktief” tot “zeer aktief”. Voor enkele analyses werden de twee extreme aktiviteit-categorieën samengevoegd en had de gebruikte variabele drie resulterende categorieën. [uitleg over statistische verwerking]

[…]

3. Resultaten

[…] Het aantal vrouwen was hoger bij de patiënten, die gemiddeld minder aktief waren en een lagere spiermassa hadden. De milde gevallen hadden de hoogste ‘body-mass-index’ (BMI) vergeleken met de ernstige gevallen (laagste) en gezonde controles.

Er werden 19 biochemische en 10 haematologische testen uitgevoerd. Zoals verwacht waren er correlaties tussen veel van de test-resultaten […], inclusief tussen: (i) creatinine & ureum, en beide met CK […]; (ii) CK & aspartaat-aminotransferase (AST [ASAT of SGOT; enzyme van belang voor de diagnostiek en follow-up van lever-aandoeningen en van myocard-infarct]) […]; (iii) albumine & vrij-T4, totaal proteïne & globuline […]; (iv) C-reaktief proteïne (CRP) & erythrocyten-sedimentatie-snelheid […]; (v) monocyten met witte bloedcellen, lymfocyten en neutrofielen […]. […] De verdelingen van de analyten werden vergeleken tussen patiënten en controles, en tussen ernstige en niet-ernstige M.E./CVS-gevallen. ESR, bloedplaatjes en CRP waren verhoogd bij de patiënten, terwijl CK en ureum verlaagd waren […]. Vergeleken met de milde gevallen hadden die met ernstige ziekte gestegen albumine, vrij-T4 en serum-folaat, en lager CK, CRP, kalium, creatinine en bilirubine […].

De gedaalde CK-waarden waren hoofdzakelijk te wijten aan lage waarden qua CK-MM iso-enzyme (gemiddeld 44 U/l […]) bij de ernstige gevallen, vergeleken met 73 […] bij de milde/matige en bij gezonde controles (p = 0.03). De waarden van CK-MB en aldolase waren ook laagst bij de ernstige gevallen […]. De verhouding CK-MB/CK-totaal was het hoogst bij de ernstig aangetaste gevallen: 0,26 […], t.o.v. 0,20 […] bij de niet-ernstige en 0,14 […] voor de gezonde controles (p = 0.03); wat een bevestiging is van de belangrijke bijdrage van gereduceerd CK-MM aan de lage concentratie van totaal CK bij de patiënten, en bijzonderlijk de ernstige gevallen. Totaal CK correleerde zeer sterk met CK-MM […] in alle studie-groepen, maar er werden zwakkere correlaties gevonden tussen totaal CK en CK-MB ([…]. Dit wijst verder CK-MM aan als de voornaamste bepalend factor van de gedaalde concentraties totaal CK bij M.E./CVS.

Uit de multivariate logistische regressie bleek dat (ln) CK-waarden omgekeerd geassocieerd waren met het risico voor M.E./CVS […]. Als we focussen op ernstige gevallen (vs. controles) onthulde dezelfde analyse dat verhoogde risicos geassocieerd zijn met lager (ln) bilirubine […] en lager (ln) CK […], alsook met hoger albumine […] en T4 […]. Op dezelfde manier waren lagere waarden voor creatinine […], (ln) bilirubine […] en (ln) CK […] geassocieerd met verhoogd risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS. [ln = natuurlijk logaritme; wiskundige bewerking, hier voor statistische verwerking]

Consistent met het bovenstaande, waren gestegen albumine-waarden geassocieerd met een groter risico op ernstige t.o.v. milde M.E./CVS […].

De verschillen qua CK waren het meest consistent; er waren uitgesproken verschillen tussen patiënten en gezonde controles, waarbij ernstige gevallen veel lagere waarden vertoonden dan milde/matige gevallen of gezonde controles. Bij het her-aanpassen van de verschillende uitkomst-modellen met ofwel ureum, creatinine, bilirubine, albumine, T4 en CK, of met CK alleen, konden we een schatting maken van de waarde van CK als een potentiële merker voor M.E./CVS. Uit de analyse van de ROC-curve [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] voor routine serum-CK bleek een beperkte rol ter onderscheiding van M.E./CVS-gevallen van gezonde controles (AUC = 67%) maar een potentiële rol bij het onderscheiden tussen ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten en deze met milde/matige M.E./CVS (AUC = 75%) en van gezonde controles (AUC = 84%). Een compleet model met CK, bilirubine, albumine, T4, creatinine en CRP verbeterde de voorspellingen, bijzonderlijk wanneer ernstige gevallen werden vergeleken met niet-ernstige en gezonde controles (AUC = 91%; verbetering door enkel CK p << 0.001), en een gereduceerd model met CK, bilirubine, albumine en T4 gaf gelijkaardige resultaten (AUC = 90%).

We vonden dat een ‘cut-off’ waarde van 51 U/l voor serum-CK hoge gevoeligheid voor beide M.E./CVS-groepen vertoonde vergeleken met controles (sensitiviteit = 96%) en voor ernstige M.E./CVS-patiënten vergeleken met milde/matige gevallen (sensitiviteit = 88,7%). Deze hebben echter een lage specificiteit (< 50%).

Gezien het sterk verband tussen aktiviteit-graad en deelnemer-categorie – patient of controle – onderzochten we verder de associatie tussen (ln) CK en deelnemer-categorie in drie verschillende klassen van aktiviteit-niveau: “niet zo erg aktief or eerder niet-aktief”, “noch aktief noch inaktief” en “eerder aktief of zeer aktief”. De resultaten tonen duidelijk trends tot lagere CK-waarden bij patiënten, bijzonderlijk wanneer de ernstig aangetasten worden vergeleken met gezonde controles. De hoogste significantie (p < 0.001) wordt gezien bij degenen die verklaarden dat ze inaktief waren.

4. Bespreking

Routine laboratorium-testen blijken gewoonlijk normaal bij M.E./CVS-patiënten, wanneer ze worden aangewend ter uitsluiting van andere ziekten die chronische vermoeid veroorzaken. Eén van die routine laboratorium-testen voor M.E./CVS is serum-CK, waarbij studies typisch rapporteren dat CK-resultaten binnen normale waarden liggen als ze al worden gerapporteerd. We vonden dat M.E./CVS-patiënten lagere CK-waarden hadden dan gezonde controles, en dat CK significant lager was bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. degenen die mild/matig zijn aangetast. De verbanden hielden stand na aanpassing voor geslacht, leeftijd-groep, BMI, spiermassa of recente fysieke aktiviteit (die allemaal het potentieel hebben om de CK-concentratie in het serum te beïnvloeden), alsook ziekteduur waar dit geschikt was (t.t.z. wanneer gevallen met verschillende ziekte-graad worden vergeleken). Creatinine en bilirubine bleken ook significant lager bij ernstig-aangetaste patiënten t.o.v. gevallen met milde/matige M.E./CVS, terwijl albumine hoger lag bij ernstige gevallen. Er was een trend naar hoge waarden qua CRP en ESR bij M.E./CVS, en bijzonderlijk bij mild/matig zieken. CK-waarden bleken goede voorspellers voor ernstige M.E./CVS vergeleken met de minder ernstig aangetasten of gezonde controles; dit werkt versterkt door het opnemen van de resultaten van andere laboratorium-testen in het model.

4.1.Het fysiologisch en klinisch belang van CK

CK is een sleutel enzyme betrokken bij energie-produktie en homeostase-processen, bijzonderlijk in weefsels met zeer dynamische en fluctuerende energie-vereisten waaraan snel dient te worden voldaan, zoals de hersenen, skeletspieren en het hart. Het is ook aanwezig in veel andere cellen, zoals immuun- en epitheliale cellen, waar het ook een cruciale rol speelt bij in energie-produktie.

Cellulaire energie wordt hoofdzakelijk gegenereerd via de afbraak van het hoog-energetische molekule adenosine-trifosfaat (ATP). Hoewel de complexe mechanismen voor cellulair energie evenwicht niet volledig worden begrepen, is er bewijs voor het feit dat spiercellen afhankelijk zijn van meerdere processen om de energie-beschikbaarheid te verhogen en complete energie-depletie te voorkomen door gebruik te maken van ATP-voorraden. CK speelt een cruciale rol bij deze processen: ten eerste door het aanleggen van efficiënte voorraden hoog-energetische fosfaten in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] voor snelle ATP-heraanvulling, het katalyseert de re-lokatie van γ-fosfaat van ATP naar creatine om fosfocreatine en adenosine-difosfaat (ADP) te genereren, in een omkeerbaar proces; en ten tweede is het betrokken bij de transfer van hoog-energetische fosfaten van de mitochondrieën naar het cytoplasma van de spiercellen, waar het wordt aangewend tijdens spier-contractie. Zodoende kunnen metingen van CK in serum de beschikbaarheid van cellulaire energie aangeven.

CK serum-concentraties worden alom gebruikt om een waaier aan spierziekten te diagnostiseren en monitoren wanneer hoge waarden klinisch relevant zijn. Het is geweten dat CK-waarden stijgen bij spierletsels en inflammatie, en ze kunnen ook hoger zijn bij hypothyroïde myopathie [veralgemeende spierpijn en spierzwakte door tekort aan schildklier-hormonen] en secundair aan behandelingen met statinen [cholesterol-syntheseremmers]; verhoogde waarden van CK in het serum kunnen worden gezien bij getrainde atleten en individuen na extreme inspanning. Er zijn drie types CK, de zgn. iso-enzymen: CK-MM (in spieren en verhoogd bij vele spierziekten), CK-MB (bijzonderlijk in de hartspier) en CK-BB (meestal gevonden in de hersenen maar gewoonlijk niet te detekteren in perifeer bloed). CK-MB werd alom gebruikt bij de diagnose van ischemisch hart [verminderde bloeddoorstroming naar de hartspier], hoewel het nu werd verdrongen door andere ziekte-merkers.

Lage CK-concentraties in het serum werden minder frequent gerapporteerd maar ze kunnen klinisch van betekenis zijn bij sommige reumatologische en bindweefsel-ziekten. De oorzaken en significantie van deze bevindingen is onduidelijk maar er werd gesuggereerd dat serum-CK omgekeerd verband kan houden met inflammatoire processen, en lage CK-waarden bleken geassocieerd met spierzwakte, onafhankelijk van spier-atrofie. Een studie bij patiënten met ernstig nier-falen meldde een significant verband tussen lager serum-CK en een verhoogd sterfte-risico, en suggereerde dat de serologische bevindingen zouden kunnen worden verklaard door de verspilde spiermassa en slechte voeding-status van de patiënten, maar er was geen verdere suggestie om serum-CK aan te wenden voor de diagnose of het management van deze aandoeningen. In studies over Huntington’s, een ernstige degeneratieve neurologische ziekte, werd gesuggereerd dat gedaalde hersen-energie het resultaat kan zijn van de gereduceerde aktiviteit van het CK-systeem, en dat verlies van CK-BB een belangrijke onherkende biomerker van deze ziekte kan zijn.

De lage concentraties serum-CK die wordt gevonden bij mensen met M.E./CVS suggereren een abnormaal energie-metabolisme, wat door afzonderlijke auteurs werd gerapporteerd [Vernon SD et al. Preliminary evidence of mitochondrial dysfunction associated with post-infective fatigue after acute infection with Epstein Barr virus. BMC Infect. Dis. (2006) 6: 15 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Med. Genet. (2017) 18: 29 /// Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017) 12: e0186802 /// Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 12: 371-379] en kan de inspanning-intolerantie verklaren die courant wordt gemeld door de patiënten, en daaropvolgende verminderde aktiviteit. Een alternatieve of bijkomende verklaring is dat het gedaald serum-CK, minstens gedeeltelijk, het resultaat zou zijn van lichamelijke inaktiviteit. Niettemin suggereert het consistent significant verband tussen lager serum-CK en ziektegraad in het multivariaat model – dat controleert voor aktiviteit – dat deze resultaten niet volledig kunnen worden verklaard door verminderde lichamelijke aktiviteit maar dat er andere factoren betrokken zijn. Om een mogelijke verstorende rol van het aktiviteit-niveau verder te verkennen, vergeleken we de mediane serum-waarden van CK in verschillende aktiviteit-categoriën. De waarden waren in alle klassen gedaald bij de ernstige gevallen. Niettemin is er nog een potentieel voor bijkomende verstoring en differentiële mis-klassificatie qua aktiviteit, met overschatting van de aktiviteit bij ernstige M.E./CVS, blijft een mogelijke verklaring (ten minste gedeeltelijk), voor het geobserveerde verschil qua CK-waarden. Met het stijgend aantal rapporten over een abnormaal energie-metabolisme bij mensen met M.E./CVS is verdere verkenning van deze associatie echter gerechtvaardigd.

Naast de intolerantie voor fysieke inspanning rapporteren M.E./CVS-patiënten gewoonlijk ook mentale vermoeidheid en ‘hersen-mist’, alsook subjectieve spierzwakte. Als we het belang van CK bij zowel het spier- als hersen-metabolisme in overweging nemen, kunnen de lage concentraties van dit enzyme, minstens gedeeltelijk, deze symptomen verklaren.

Sommige researchers hebben eerder melding gemaakt van intrigerende bevindingen aangaande serum-CK bij M.E./CVS-patiënten. Bijvoorbeeld: twee studies met 30 en 33 individuen vergeleken de CK serum-concentratie van M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de CDC-1994 criteria) met deze van gezonde controles vóór en na inspanning, om de fysieke capaciteit te evalueren [Riley MS et al. Aerobic work capacity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. BMJ (1990) 301: 953-956 /// Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93]. De gemiddelde CK bij M.E./CVS-patiënten lag lager (hoewel niet significant) dan bij controles, en steeg niet door inspanning bij degenen met M.E./CVS (zoals wordt gezien bij gezonde individuen). De resultaten suggereren dat tekort aan acute lichamelijke inspanning niet de voornaamste factor was die de CK-waarden bij M.E./CVS bepaalt. Een andere studie bij M.E./CVS-patiënten vond hoger serum-CK bij deelnemers met enterovirus-specifiek RNA (detektie via spierbioptie) dan degenen zonder bewijs voor enterovirale infekties. Die studie suggereerde dat een subgroep M.E./CVS-patiënten spierschade zou kunnen vertonen secundair aan enterovirus-infektie maar jammer genoeg specifieerden de auteurs de CK-concentraties in de groep patiënten met lagere waarden niet [Archard C et al. Postviral fatigue syndrome: persistence of enterovirus RNA in muscle and elevated creatine kinase. J. Royal Soc. Med. (1988) 81: 326-329].

Andere studies overwogen mogelijke verstoring van de mitochondriale funktie bij M.E./CVS, wat de geloofwaardigheid van metabole dysfunktie in het energie-systeem bekrachtigt, zoals onze bevindingen aangeven.

4.2. Andere studie-bevindingen

De creatinine-waarden bleken significant lager bij ernstige M.E./CVS. Creatine-fosfaat (CP) wordt omgezet naar creatinine in spieren en creatinine wordt uitgescheiden in de urine, dus is laag CP het resultaat van mindere omzetting van creatine naar CP door CK en dit zou de lage creatinine-waarden kunnen verklaren die worden gevonden bij ernstige M.E./CVS. Lage urine-concentratie van creatinine werd ook gerapporteerd [???] [Lidbury BA et al. Activin B is a novel biomarker for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME) diagnosis: A cross sectional study. J. Transl. Med. (2017) 15, 1-10].

We vonden ook dat ureum gedaald was en bloedplaatjes, CRP & ESR verhoogd bij M.E./CVS, hoewel dit niet significant bleek bij de multivariate analyse. Er werd een omgekeerd verband tussen bloedplaatjes en CK gevonden in één studie aangaande Reumatoïde Artritis, samen met verhogingen van inflammatoire klinische merkers zoals ESR & CRP. Bloedplaatjes hebben ook de neiging te stijgen bij inflammatoire processen. Niettemin brengt het patroon van inflammatoire merkers in onze studie er ons toe te speculeren dat een bepaalde graad van inflammatie gerelateerd kan zijn met symptomen bij mensen met milde/matige M.E./CVS. Voor mensen met een ernstige graad van de ziekte, lijkt het dat de inflammatoire respons geïnhibeerd kan zijn, ofwel omwille van een gebrek aan blijvende stimuli of verstoring van sommige aspecten van de inflammatoire respons, wat kan duiden op chronische ziekte met gevestigde complicaties. Het is echter belangrijk om op te merken dat de wijzigingen qua inflammatoire merkers relatief bescheiden waren, en verdere veronderstellingen dienen op gepaste manier te worden getest en bevestigd in andere groepen. We vonden lagere ureum-waarden bij milde/matige gevallen maar niet bij degenen die ernstig zijn aangetast. Dit zou verband kunnen houden met creatinine-waarden, die ook lager waren bij M.E./CVS t.o.v. controles; voor creatinine waren de laagste waarden echter te vinden bij de patiënten met ernstige M.E./CVS. Abnormaliteiten in de ureum-cyclus werden ook al gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamano E et al. Index Markers of Chronic Fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990 /// Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv. Clin. Chem. (2014) 66: 121-172]

Onze bevindingen aangaande verhoogd albumine en T4 zijn moeilijk te verklaren. Gestegen albumine suggereert dat malnutritie geen belangrijke factor is bij M.E./CVS. De lichtjes verhoogde T4 kan kleine veranderingen gerelateerd met het schildklier-hormoon metabolisme suggereren […] (zoals eerder gesuggereerd door Ruiz-Núñez B et al. Higher prevalence of “low T3 syndrome” in patients with Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Front. Endocrinol. (2018) 9, 1-13). Deze hypothese werd echter niet bevestigd door andere bevindingen, die gelijkaardige T3- en TSH-waarden tussen de groepen toonden; ook zijn bevindingen niet typisch voor ‘euthyroid sick syndrome’ [abnormaal T3 en/of T4 maar de schildklier lijkt niet dysfunktioneel]. Er werd in het verleden een hogere prevalentie van Gilbert’s syndroom [lever-aandoening met verstoorde verwerking van bilirubine (afbraakprodukt van haem)] bij M.E./CVS voorgesteld [Cleary KJ & White PD. Gilbert’s and chronic fatigue syndromes in men. Lancet (1993) 341: 842] maar dit werd in deze studie niet gevonden: er werden gelijkaardige bilirubine-waarden getoond voor patiënten en controles, en gedaalde bilirubine-waarden bij mensen met ernstige M.E./CVS vergeleken met niet-ernstige gevallen.

Er zullen verdere onderzoeken bij grotere groepen en meer gedetailleerde exploraties nodig zijn om te bevestigen of lage CK-aktiviteit een primaire of secundair gebeurtenis is bij M.E./CVS of dat het, inderdaad, één of andere metabole dysfunktie weerspiegelt. Dit zou voordeel kunnen halen uit ge gebruik van “zieke” controle-groepen, zoals bepaalde orthopedische patiënten met langdurige immobiliteit. Ondertussen suggereren we dat CK kan worden aangewend als een potentiële merker voor ernstige M.E./CVS. Het is belangrijk de klinische anamnese en bevindingen van lichamelijk onderzoek in acht te nemen, alsook aktiviteit-metingen (bv. accelerometer [toestel dat de versnelling van het lichaam meet]) op het tijdstip van de bloedafname voor serum-CK. Bovendien moet een ‘hoog-normaal’ resultaat bij mensen die dikwijls sedentair of bedlegerig zijn, bijzonderlijk individuen met ernstige M.E./CVS, omzichtig geïnterpreteerd worden, aangezien het de aanwezigheid van spierletsel kan aangeven.

4.3. Studie-sterktes en zwakheden

De studie onderzocht een groep mensen met goed-gekarakteriseerde M.E./CVS op basis van robuuste standaarden voor gegevens- en staal-collectie zoals beschreven in het ‘UK M.E./CVS Biobank’ protocol. In termen van M.E./CVS-onderzoek was dit een groot staal: er werden 272 M.E./CVS-patiënten getest, inclusief 56 die ernstig waren aangetast. De beoordeling van het aktiviteit-niveau geschiedde echter via zelf-rapportering. Indien dit leidde tot een over-schatting van de aktiviteit-graad bij sommige groepen, dan zou tot differentiële mis-klassificatie kunnen hebben geleid, bv. als de minder aktieve en ernstig-aangetastte M.E./CVS-gevallen hun aktiviteit hebben overschat.

Het opnemen van ernstig-aangetastte M.E./CVS-individuen, die typisch afwezig waren in de meeste eerdere studies, kan belangrijk zijn voor het aantonen van niet eerdere gerapporteerde abnormaliteiten. De hier voorgestelde resultaten komen voort uit routine laboratorium-testen bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Het doel van de bloed-testen was voornamelijk het uitsluiten van andere ziekten die zich zouden kunnen voordoen met gelijkaardige symptomen; het onderzoeken van spier-gerelateerde biochemische abnormaliteiten was niet in respons op een specifieke hypothese die werd opgemerkt wanneer alle resultaten werden getest voor ‘null’-hypotheses ([geen verband tussen 2 gemeten fenomenen] van geen groep-verschillen tussen de studie-groepen op basis van laboratorium-testen). Dit betekent dat we niet in staat zijn abnormaliteiten in spier/energie-metabolisme meer gedetailleerd te onderzoeken. Ons vermogen om bevindingen verder te onderzoeken (bv. door verbeterde metaboloom-studies en via bio-bank stalen van de groep, inclusief op andere tijdstippen), zal echter bevorderlijk zijn voor een verder begrijpen van de hier gerapporteerde veranderingen.

5. Besluiten

Dit is de eerste studie die significant lagere concentraties qua CK bij M.E./CVS-patiënten toont. Sommige indicaties voor lage CK-waarden lijken eerder over het hoofd te zijn gezien wanneer de trend naar lagere waarden werd afgedaan als niet significant en niet verder werd onderzocht. Een enkelvoudige meting van serum-CK heeft wellicht onvoldoende sensitiviteit en specificiteit om als een biomerker voor M.E./CVS-diagnose te worden gebruikt maar, indien aangewend naast andere klinische en laboratorium-merkers, zouden routinematige CK bloed-testen kunnen helpen om de diagnose van M.E./CVS accuraat te stellen, maar ook om patiënten onder te verdelen volgens ziektegraad. Het zou mogelijks ook kunnen worden aangewend als een prognostische merker, en als een uitkomst-meting voor observationele studies en klinische proeven, alsook in de klinische praktijk, in afwachting van verdere longitudinale studies die de correlatie van klinische en op lab-testen gebaseerde fenotypes onderzoeken. Of mensen met ernstige M.E./CVS die een laag CK vertonen een unieke subgroep vormen met afzonderlijke patronen qua biochemische/pathofysiologische abnormaliteiten en symptomen, of dat ze een andere fase of een extreem spectrum van de ziekte vertegenwoordigen, dient nog te worden opgehelderd.

Onze bevindingen bieden betekenisvolle ondersteuning voor het groeiend bewijs aangaande metabole abnormaliteiten bij M.E./CVS, en we suggereren voldoende grote studies om een diepgaander onderzoek van specifieke metabole mechanismen ter opheldering van het feit of CK een primaire of secundaire abnormaliteit is bij alle of een subgroep van M.E./CVS-patiënten. Dergelijke studies kunnen ook helpen om de oorzaken van dergelijke abnormaliteiten op te helderen. Het correleren van serum CK-concentraties met objectief gemeten aktiviteit en andere energie-metabolisme parameters kan leiden tot een beter begrip van de pathofysiologische abnormaliteiten betrokken bij spier-gebruik en -herstel, en hun verband met symptomen zoals post-exertionele malaise en vermoeidheid.

Advertenties

maart 30, 2019

Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 9:09 am
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome’ uit 2017 (zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’), waar werd aangetoond dat er statistisch significante verschillen zijn in het bio-energetisch profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen van M.E.(cvs)-patiënten t.o.v. controles. Wanneer deze cellen fysiologische stress ondervinden, blijken ze minder capabel om hun respiratie (mitochondriale ademhaling) te verhogen om de stijgende stress te compenseren en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften.

In het huiding artikel (studie gefinancierd door van de ‘Medical Research Council’, ‘Action for ME’, ‘ME research UK’ & de ‘ME Association’) probeerden de onderzoekers na te gaan waaraan de mitochondriale dysfunktie zou kunnen gelegen zijn, door te kijken hoe ’t is gesteld met de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten in dezelfde soort cellen (waar de mitochondrieën direct bereikbaar zijn gemaakt) en in ‘voorlopers van spiercellen’.

Ter herinnering: Oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie. Het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen (I t/m V) gelokaliseerd in het mitochondriaal binnenste membraan: Complex I: NADH/ubiquinon oxidoreductase – krijgt elektronen van NADH en geeft deze door aan co-enzyme Q10 (ubiquinon); elektronen worden verder doorgegeven aan Complex II: succinaat-degydregenase, Complex III: ubiquinol/ferrocytochroom-c oxidoreductase en Complex IV: cytochroom-c oxidase – ze reageren met zuurstof en vormen water; en Complex V: proton-transporterend ATPase gebruikt de protonen om ATP te vormen.

Het lijkt er op dat de mitochondriale dysfunktie bij M.E.(cvs) (waar de al eerder over rapporteerden – zie bv. M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte en elders) te wijten is aan verstoorde cellulaire mechanismen ‘upstream’ (stroomopwaarts) van de werking van de mitochondrieën, m.a.w. niet de mitochondrieën zelf maar systemen die ze sturen zouden zijn aangetast…

—————

PeerJ Vol 7, paper e6500 (March 2019)

Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types

Cara Tomas (1), Audrey E. Brown (1), Julia L. Newton (1,2), Joanna L. Elson (3,4)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne Hospitals, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Centre for Human Metabonomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Er werden eerder abnormaliteiten qua mitochondriale funktie bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) aangetoond, wat impliceert dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. Deze studie bouwt verder op eerder werk dat aantoonde dat mitochondriale ademhaling parameters verstoord zijn in cellen van CVS-patiënten en dit via het onderzoeken van de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten. Er werden twee verschillende cel-types gebruikt in deze studies, om de aktiviteit te bepalen van individuele complexen lokaal – in skeletspier (myotubes [zich ontwikkelende skeletspier-vezels]) (n = 6) – en systemisch – perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) – bij controles (n = 6) en CVS (n = 13). De aktiviteiten van complex-I, -II & -IV, en respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie en glutaminolyse [reeks biochemische reakties waarbij het aminozuur glutamine wordt omgezet naar o.a. pyruvaat/lactaat] werden gemeten gebruikmakend van extracellulaire flux analyse. De cellen werden doorlaatbaar gemaakt, en er werden voor de bepalingen combinaties van substraten en inhibitoren toegvoegd om toe te laten de toestand van de mitochondriale respiratie na te gaan en de aktiviteit van specifieke aspecten van de respiratoire aktiviteit te meten. De resultaten toonden geen significante verschillen qua individuele mitochondriale complexen aktiviteit of respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie of glutaminolyse tussen groepen gezonde controles en CVS-patiënten, noch voor skeletspier (p ≥ 0.190) of PBMCs (p ≥ 0.065). Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse [flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex] aanwendt om de aktiviteit van individuele mitochondriale complexen te onderzoeken in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. De afwezigheid van verschillen qua complex-aktiviteit in CVS PBMCs suggereert dat de eerder geobserveerde mitochondriale dysfunktie in totale PBMCs te wijten is aan oorzaken ‘upstream’ van de mitochondriale admhaling-keten.

INLEIDING

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een uitputtende ziekte die 0,2-0,4% van de bevolking in het V.K. aantast. CVS heeft een significante impact op de levenskwaliteit van patiënten met symptomen zoals ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. De mechanismen achter de etiopathogenese van CVS moeten nog opgehelderd worden. Het gebrek aan kennis omtrent de mechanismen achter de ziekte draagt bij tot de moeilijkheden bij het vormen van een consensus aangaande diagnostische criteria en de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen.

Er werden eerder verscheidene aspecten van mitochondriale dysfunktie gepostuleerd als bijdragende factor tot CVS [referenties beschikbaar]. Vermoeidheid bleek courant bij patiënten met primaire mitochondriale ziekte maar er dient echter te worden opgemerkt dat patiënten met CVS geen primaire mitochondriale mutaties dragen [Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18: 29]. Andere onderzoekers toonden dat bepaalde wijzigingen in het mitochondriaal genoom de kans vergroten op specifieke symptomen bij CVS-patiënten (gastro-intestinale, neurologische en inflammatoire) [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. Journal of Translational Medicine (2016) 14: 19]; deze genomische veranderingen maken de patiënten echter niet vatbaarder voor het ontwikkelen van de ziekte. Eerdere studies hebben aangetoond dat de energie-produktie, inclusief mitochondriale aktiviteit, van totale PBMCs van CVS-patiënten significant verstoord is in vergelijking met een groep gezonde controles [Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1: e89376 /// Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Eén studie, gebruikmakend van extracellulaire flux analyse van complete cellen, toonde dat CVS PBMCs significant verstoorde mitochondriale funktie hebben onder zowel basale omstandigheden als bij maximale stimulatie, bij een aantal experimentele condities [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Dit suggereerde dat CVS-patiënten niet in staat waren om mitochondriale energie-produktie in dezelfde mate aan te wenden als gezonde controles en impliceerde dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. De studie die hier wordt gepresenteerd, werd uitgevoerd om verder te onderzoeken of de mitochondriale dysfunktie die werd gezien in CVS PBMCs te wijten was aan a-typische aktiviteit van individuele mitochondriale complexen, door gebruik te maken van dezelfde techniek als de eerdere studie (extracellulaire flux analyse) maar met gepermeabilseerde cellen i.p.v. complete cellen. Het gebruik van doorlaatbaar gemaakte cellen laat toe om mitochondrieën direct toegankelijk te maken voor substraten zonder cellulaire interferentie in termen van substraat-transport of intracellulaire interakties. De permeabilisatie van cellen laat ook toe om de enzymatische aktiviteit van individuele respiratoire keten complexen te meten wat niet makkelijk is complete cellen. Deze studie onderzoekt de aktiviteit van individuele complexen en componenten van de mitochondriale respiratoire keten in myotubes en PBMCs – myotubes werden gebruikt om de mitochondriale aktiviteit lokaal in skeletspier te onderzoeken, terwijl PBMCs werden gebruikt om de aktiviteit van mitochondriale complexen systemisch te bekijken. Dit werd bewerkstelligd door het permeabiliseren van cellen om er zeker van te zijn dat de mitochondrieën intact blijven en het aanwenden van extracellulaire flux analyse om de zuurstof-consumptie van cellen te registreren na opéénvolgende behandeling met mitochondriale aktivitet veranderende molekulen. Respiratoire parameters werden berekend en vergeleken tussen spiercellen en PBMCs van controles en CVS-patiënten.

Voor deze studie werd saponine aangewend om het cel-membraan doorlaatbaar te maken. Saponine is een cel-permeabilsator die werkt door het vormen van complexen met cholesterol, wat leidt tot een vermindering van de integriteit van het cel-membraan, terwijl de mitochondriale membranen intact blijven. Wanneer mitochondrieën uit cellen geïsoleerd worden, wordt de architectuur en de morfologie van de mitochondrieën gewijzigd, maar permeabilisatie van het cel-membraan laat toe om de architectuur en morfologie van de mitochondrieën normaal te houden, een voordeel van het gebruik van geïsoleerde mitochondrieën, aangezien de mitochondriale funktie eerder een sterk verband met struktuur bleek te vertonen. Permeabilisatie van het cel-membraan laat toe het effekt van substraten op mitochondriale aktiviteit uitgebreid na te gaan doordat endogene substraten toegang krijgen tot mitochondrieën. De toediening van verschillende substraten en inhibitoren wijzigt de mitochondriale ademhaling en laat toe de aktiviteit van individuele componenten van mitochondriale respiratie te meten. In 1955 werd al beschreven dat de mitochondriale ademhaling aktiviteit kan worden gemeten in termen van meerdere respiratoire ‘toestanden’. Toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) worden dikwijls gebruikt als merkers voor mitochondriale respiratoire aktiviteit. Toestand-3 respiratie is wanneer mitochondrieën een hoge concentratie ADP extern hebben, en een hoge zuurstof-consumptie en ATP-synthese waardoor een toestand ontstaat waarbij door ADP gestimuleerde ademhaling kan worden gemeten. Toestand-4 respiratie, anderzijds, is wanneer mitochondrieën een zeer lage externe ADP-concentratie hebben, en weinig of geen ATP-synthese omwille van de complete fosforylatie van ADP naar ATP. De respiratoire controle ratio (RCR) is een maatstaf voor het koppelen van ATP-synthese en elektron-flux, en toont de capaciteit van mitochondrieën om ATP te synthetiseren via de oxidatie van respiratoire substraten.

Dit werk had tot doel te bepalen of de enzymatische aktiviteit van verschillende complexen van de mitochondriale respiratoire keten verschillen tussen CVS-patiënten en gezonde controles, en dit lokaal (skeletspier) of systemisch (PBMC)s.

MATERIALEN & METHODES

Deelnemers aan de studie

Primaire myoblasten werden verkregen via spier-bioptie […]. Alle CVS-patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria […].

[…]

Reagentia

[…]

Cel-culturen & voorbereiding

Myotubes

[…]

PBMCs

[…]

Extracellulaire flux analyse

XFe96 analyser (Agilent Technologies) […]. Zuurstof-consumptie (OCR) werd op 12 tijdstippen gemeten. Drie basale metingen vóór de eerste toevoeging met een mix van de substraten van belang, ADP, FCCP [carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS] & saponine. Nog drie volgende metingen en dan de tweede toevoeging, met oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken]. Daarna nog drie metingen van de OCR en dan de laatste toevoeging met ofwel rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] of kalium-azide [inhibeert cytochroom-c oxidase (complex-IV)], en de laatste finale drie OCR-metingen. De concentratie van saponine werd geoptimaliseerd voor myotubes en PBMCs, en de schade aan de mitochondrieën veroorzaakt door saponine werd bepaald gebruikmakend van cytochroom-c. De optimale concentratie van saponine voor myotubes werd bepaald op 25 mg/ml, voor PBMCs 2,5 mg/ml. […]

Voorbereiding van de molekulen

[pyruvaat/malaat => complex-I gemedieerde respiratie /// succinaat => complex-II gemedieerde respiratie /// tetramethylfenylendiamine(TMPD)/ascorbaat => complex-IV aktiviteit /// palmitoyl-l-carnitine => respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie /// glutamine/malaat => respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse /// ADP => toestand-3 respiratoire aktiviteit /// FCCP => maximale respiratoire aktiviteit /// oligomycine => toestand-4 respiratoire aktiviteit / rotenon => metabole inhibitor / kalium-azide => metabole inhibitor]

Berekening van de parameters

[…]

Toestand-3 respiratie = (gemiddelde van de metingen 4-6) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

Toestand-4 respiratie = (gemiddelde van de metingen 7-9) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

RCR = Toestand-3 respiratie/ Toestand-4 respiratie.

Data-analyse

[…]

RESULTATEN

Respiratoire keten complex aktiviteit in myobutes

[…] Complex-II respiratie (succinaat) en complex-IV aktiviteit (TMPD [tetramethylfenylendiamine; staat elektronen af aan cytochroom-c] & ascorbaat) bleken niet significant verschillend tussen de controle- (n = 6) en CVS- (n = 6) groep voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR […] (p ≥ 0.190).

Er werd geprobeerd complex-I gemedieerde respiratie (gebruikmakend van pyruvaat en malaat), respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie (toevoeging van palmitoyl-l-carnitine) en respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse (toevoeging van glutamine en malaat) te meten. De resultaten voor alle drie de experimenten gaven consistent negatieve waarden voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle- (n = 6) myotubes en daarom was het onmogelijk toestand-3, toestand-4 en RCR voor deze experimenten te berekenen.

Respiratoire keten complex aktiviteit in PBMCs

Er werden PBMCs van gezonde controles en CVS-patiënten gebruikt om verschillende aspecten van mitochondriale respiratoire keten aktiviteit te onderzoeken. De resultaten toonden dat er geen verschil voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR was tussen PBMCs van CVS-patiënten (n = 13) en gezonde controles (n = 6; succinaat controles n = 4) voor geen enkele van de substraat/inhibitor-combinaties (p ≥ 0.065).

BESPREKING

De aktiviteit van verschillende aspecten van de mitochondriale respiratoire keten funktie werden onderzocht via het toedienen van verscheidene substraten en inhibitoren. Het effekt van de verschillende substraten op toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) werd gemeten.

Er werden vijf verschillende combinaties van substraten onderzocht omtrent hun effekten op myotubes en PBMCs – glutamine & malaat; palmitoyl-l-carnitine; pyruvaat en malaat; succinaat; TMPD & ascorbaat. Deze werden toegediend om respiratie ondersteund door glutaminolyse, respiratie ondersteund door vetzuur-oxidatie, complex-I aktiviteit, complex-II aktiviteit, en complex-IV aktiviteit (respectievelijk) te onderzoeken. Ondanks het ontbreken van een verschil qua OXPHOS tussen de controle- en CVS-groepen aangetoond in complete myotubes [Rutherford G. Investigating the biochemical basis of muscle cell dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. PhD thesis, Newcastle University, Newcastle upon Tyne (2016)], hadden deze experimenten tot doel te onderzoeken of meer subtiele en specifieke verschillen optraden in individuele complexen. Er werden PBMCs gebruikt om te bekijken of de specifieke lokatie van eerder gerapporteerde abnormaliteiten geïdentificeerd in totale cellen kon worden vastgepind op specifieke complexen of mechanismen [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding].

In myotubes gaven slechts twee van de substraten-combinaties nuttige resultaten. De toevoeging van pyruvaat & malaat, palmitoyl-l-carnitine, en glutamine & malaat leverde negatieve waarden op voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle-myotubes (n = 6). De toevoeging van de molekulen leek een effekt te hebben op de OCR, maar niet het geanticipateerd effekt. Het resulteerde slechts in meer negatieve OCR-metingen bij elke toediening en gaf niet de verwachte toename na de eerste toediening. Deze experimenten werden een aantal keer herhaald met elke keer gelijkaardige vaststellingen. Dit suggereert dat deze techniek voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen misschien wel niet geschikt is voor het gebruik in myotubes. Er waren wel succesvolle metingen van het effekt van succinaat, en TMPD & ascorbaat voor controle- en CVS-myotubes. Er werd geen verschil gezien qua toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR tussen de controle- en CVS-groepen. Dit geeft aan dat er geen abnormaliteiten zijn qua respiratoire aktiviteit gelinkt aan glutaminolyse of complex-IV aktiviteit in CVS-myotubes. Dit stemt overéén met eerdere research waarbij, gebruikmakend van 3 carboxyl-14C gelabelde substraten, werden gevonden dat er geen verschil is tussen CVS en controle skeletspier-cel complex-I, complex-II+III, complex-III of complex-IV aktiviteit [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738]. Echter: gezien de inconsistentie tussen substraten-metingen bij deze studie, waarbij enkele substraten succesvolle metingen gaven en andere niet, en de grote fouten-marges aangegeven voor elk van de substraten (inclusief deze waarvoor we toestand-3 & -4 respiratie succesvol konden afleiden), dient het gebruik van deze techniek in vraag te worden gesteld wat betreft accuraat meten van de aktiviteit van specifieke aspecten van de mitochondriale ademhaling in gepermeabiliseerde myotubes. Andere technieken zoals fosforescentie zuurstof-sensitieve probes en spectrofotometrische enzyme-testen zouden moeten worden aangewend om dezelfde stalen in toekomstige experimenten te analyseren, om te bepalen of ze meer accurate resultaten kunnen geven dan deze die hier met de XFe96 werden bekomen en de consistentie ertussen te bekijken. Er zijn slechts zeer weinig eerder gepubliceerde studies die gebruikmaakten van extracellulaire flux analyse om de mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde myotubes te detekteren. Eén studie gebruikte extracellulaire flux analyse en hoge-resolutie respirometrie [HRR of oxygrafie; gestandardiseerde metingen van de mitochondriale respiratoire funktie] om de verschillen tussen de technieken te bepalen [bij obese mensen]. De studie toonde dat de metingen van de Seahorse XFe24 hogere waarden qua variabiliteit hadden voor elk gegevens-punt, wat de hier gerapporteerde gegevens ondersteunt en aantoont dat extracellulaire flux analyse misschien niet de meest geschikte techniek is voor het detekteren van veranderingen in de aktiviteit van mitochondriale complexen in gepermeabiliseerde myotubes.

In PBMCs waren er succesvolle metingen voor alle vijf de substraten-combinaties. We vergeleken toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en RCR van controle- (n = 6, succinaat-controles n = 4) & CVS- (n = 13) PBMCs. Er werd geen verschil gezien tussen de twee groepen voor geen enkele van de onderzochte substraten. Dit suggereert dat de aktiviteit van complex-I, -II & -IV, en de respiratie ondersteund door vetzuur-oxidation of glutaminolyse niet verschillend is in CVS-PBMCs vergeleken met gezonde controles. Deze resultaten zijn in overéénstemming met een studie door Lawson N et al. [Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. Journal of Nature and Science (2016) 2: e221] waar spectrofotometrische technieken gebruikten om te tonen dat gepermeabiliseerde CVS-PBMCs niet verschillen van gezonde controles in termen van complex-I, complex-II+III of complex-IV aktiviteit. De consistentie van de resultaten tussen de verschillende research-groepen, gebruikmakend van verschillende technieken, versterkt de bewijskracht die suggereert dat er geen abnormaliteiten zijn qua individuele mitochondriale complex aktiviteiten in CFS-PBMCs. Het ontbreken van verschillen PBMCs kan suggereren dat de eerder gevonden abnormaliteiten in complete cellen zijn niet te wijten aan abnormaliteiten qua complexen van de mitochondriale respiratoire keten maar eerder aan andere aspecten van het respiratie-mechanisme zoals transport van glucose in de cellen, AMPK-abnormaliteiten of gewijzigd funktioneren van andere mitochondriale enzymes [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Er dient echter omzichtigheid in acht te worden genomen bij het interpreteren van deze resultaten op zich, gezien de verschillen in OXPHOS die worden gezien in complete PBMCs [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding], aangezien de resultaten van complete cellen een weerspiegeling is van een natuurlijker en fysiologisch relevanter milieu voor de mitochondrieën. Hoewel in deze studie relatief kleine groepen werden gebruikt, verhoogt de samenhang van de bevindingen van deze studie met eerdere studies, die andere technieken voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in myotubes en PBMCs van CVS-patiënten, de deugdelijkheid van de resultaten [Lawson N et al. (2016) & Smits B et al. (2011); zie hierboven].

BESLUITEN

Deze studie onderzocht de aktiviteit van specifieke componenten van de mitochondriale ademhaling door te kijken naar individuele complex aktiviteit en mechanismen in myotubes en PBMCs. Op basis van een cel-permeabilisatie protocol en gebruikmakend van de XFe96 extracellular flux analyser werd aangewend om deze experimenten uit te voeren. Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse gebruikt om individuele mitochondriale complex aktiviteit na te gaan in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. Uiteindelijk werd een normale mitochondriale funktie opgetekend in CVS-myotubes & -PBMCs; er werden echter relatief kleine groepen gebruikt en daarom dienen de resultaten omzichtig te worden geïnterpreteerd. De bevinding van een normale mitochondriale werking van CVS-myotubes ondersteunt de resultaten van ongepubliceerde gegevens van complete cellen [zie Rutherford G 2016; hierboven]. De resultaten waar geen verschil qua mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde PBMCs werden gevonden, waren onverwacht gezien het feit dat de mitochondriale funktie in PBMCs eerder significant lager bleek bij CVS [Tomas et al. 2017; zie onze inleiding]. Het ontbreken van een verschil qua complex-aktiviteit in CFS-PBMCs is echter in overéénstemming met resultaten die door andere groepen werden gerapporteerd – die normale mitochondriale respiratoire keten complex-aktiviteiten toonden [Lawson N et al. (2016); zie hierboven] en postuleerden dat wijzigingen qua mitochondriale ATP-synthese dient te worden toegeschreven aan andere oorzaken zoals de transport-capaciteit van zuurstof [Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8: 93]. Gezien onze resultaten hier, moeten toekomstige bio-energetische studies bij CVS zich concentreren op mechanismen ‘upstream’ van de mitochondriale respiratoire keten.

maart 17, 2019

Veranderingen in het transcriptoom van circulerende immuun-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , , , , , ,

Het onderzoeken van het transcriptoom, de verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’, tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen, gebeurt in onderstaande studie via sequentiebepaling van dat RNA. Dit kan bv. worden gehaald uit totaal-bloed of uit bepaalde cel-populaties (bv. perifeer bloed mononucleaire cellen – PBMCs).

Een Noorse onderzoeksgroep (Nguyen CB et al. – ref. zie hieronder) voerde een studie uit a.h.v. bloed van adolescenten met ‘cvs’. Hun resultaten suggereren de mogelijke betrokkenheid van neuro-immune ontregeling. De publicatie (mede gefinancierd door de ‘Associated New Zealand ME Society’, ANZMES) hieronder (over M.E.(cvs)-patiënten uit Nieuw-Zeeland) beschrijft volgens de auteurs de eerste RNA sequentie-analyse op basis van PBMCs. Ze toonden de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress. Resultaten die gelijklopen met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire (maar niet identieke) studies. Wederom aanduidingen voor consistentie van de bevindingen omtrent M.E.(cvs) en het feit dat dit wel degelijk een echte medische aandoening is.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology Volume 33: 1-8 (2019)

Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eiren Sweetman (1), Margaret Ryan (2), Christina Edgar (1), Angus MacKay (1), Rosamund Vallings (3), Warren Tate (1)

1 Department of Biochemistry, University of Otago, Dunedin, New Zealand

2 Department of Anatomy, University of Otago, Dunedin, New Zealand

3 Howick Health & Medical Centre, Auckland, New Zealand

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een slecht begrepen ziekte die 0,2%-2% van de wereld-bevolking treft. Om inzicht te verkrijgen in de pathofysiologie van M.E./CVS in Nieuw-Zeeland, onderzochten we de transcriptomen bij een kleine maar goed gekarakteriseerde groep patiënten (n = 10), en voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles (n = 10). Er bleken 27 gen-transcripten 1,5 tot 6 maal verhoogd en 6 bleken 3 tot 6 maal verlaagd in de patiënten-groep (P < 0.01). De meest verhoogde gen-transcripten, IL8, NFΚBIA & TNFAIP3 zijn funktioneel verbonden met inflammatie, en significante veranderingen werden gevalideerd voor IL8 & NFΚBIA d.m.v. kwantitatieve polymerase-ketting-reaktie (qPCR). Een funktionele netwerk analyse [FNA] van de gewijzigde gen-transcripten (P < 0.01) detekteerde interakties tussen de produkten gerelateerd met inflammatie, circadiaanse klok funktie, metabole ontregeling, cellulaire stress-responsen en mitochondriale funktie. ‘Ingenuity pathway analysis’ [IPA; software om expressie-profielen te analyseren] (P < 0.05) biedt verdere inzichten in de dysfunktionele fysiologie, en markeerde stress en inflammatie mechanismen. Deze analyse levert nieuwe inzichten in de molekulaire veranderingen bij M.E./CVS en draagt bij tot het begrijpen van de pathofysiologische mechanismen van de ziekte.

Inleiding

[…] Hoewel de pathofysiologie van M.E./CVS nog steeds slecht wordt begrepen, wordt als hypothese gesteld dat diepgaande ontregeling van het centraal zenuwstelsel en immuunsysteem, dysfunktie van het cellulair energie metabolisme en cardiovasculaire abnormaliteit belangrijke rollen kunnen spelen bij de pathofysiologie van de ziekte.

Er werden een aantal M.E./CVS immuun-cel gen-expressie studies gepubliceerd. Gezamenlijk hebben ze verstoringen geïdentificeerd in mechanismen verbonden met immune, neuronale, mitochondriale en metabole funktie, maar er is weinig consensus over de genen die specifiek differentieel tot expressie komen. ‘High-throughput’ RNA-‘sequencing’ technologie (RNA-seq) werd eerder aangewend om het M.E./CVS transcriptoom te onderzoeken. [Nguyen CB et al. Whole blood gene expression in adolescent Chronic Fatigue Syndrome: An exploratory cross-sectional study suggesting altered B cell differentiation and survival. Journal of Translational Medicine (2017) 15: 102] Onze RNA-seq studie die hier wordt beschreven, focust op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) bij een goed gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten. Er werd gerapporteerd dat PBMCs stabiel zijn en accuraat de biologische verschillen tussen gezonde en zieke individuen weerspiegelen, bijzonderlijk wat betreft immunologische of inflammatoire mechanismen. We identificeerden 27 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep vergeleken met gezonde controles en 6 significant verlaagde gene-transcripten (P < 0.01), en vonden een aanrijking wat betreft stress- en inflammatie-mechanismen, alsook mitochondriale en circadiaanse klok funkties. Deze resultaten geven diepgang aan het bewijs voor een pathofysiologische basis van M.E./CVS.

Methodes

PBMC-isolatie

[…] 10 M.E./CVS-patiënten [mediane leeftijd 36,4; 6 vrouwen & 4 mannen], diagnose volgens de Canadese consensus criteria (CCC). […]

Transcriptoom-analyse

[…]

RT-qPCR validatie. Er werd een validatie van de gen-expressie (RTqPCR) test uitgevoerd voor de 3 meest significant gewijzigde gen-transcripten IL8, NFKBIA & TNFAIP3. […] De genormaliseerde relatieve expressie-waarden van elk gen werden berekend […].

FNA. Differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden getest op funktionele verbanden tussen de gecodeerde proteïnen […]. Er werden FDR [false discovery rate’, aantal vals positieve resultaten] -aangepaste P-waarden berekend voor elk verrijkt biologisch proces.

IPA. Er werden 125 ge-upreguleerde en 40 gedownreguleerde gen-transcripten geanalyseerd (P < 0.05). IPA gebruikt analytische instrumenten om de ‘upstream’ biologische oorzaken en waarschijnlijke ‘downstream’ effekten op de cellulaire biologie te verhelderen. […]

Resultaten en bespreking

In deze RNA-seq transcriptoom-analyse werden op deze kleine maar klinisch goed gekarakteriseerde patiënten-groep de concepten van ‘Precision Medicine’ [medisch model voor de gezondheidszorg; waarbij medische beslissingen, behandelingen, praktijken of produkten op maat van de individuele patient worden gemaakt] met gepaste statistische analyse toegepast. Deze benadering is succesvol gebleken bij groepen patiënten met zeldzame ziekten, waar het aantal beschikbare patiënten gering is. Daarnaast heeft de RNA-seq analyse zelf gepaste sequentiebepaling-diepte om de beperkte grootte van het staal te compenseren.

RNA-seq analyse onthulde een veranderd PBMC-transcriptoom

Een statistische test van genormaliseerde RNA-seq gegevens vond 27 significant verhoogde gen-transcripten en 6 significant verlaagde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (P < 0.01 [lijst beschikbaar]).

qPCR-validatie van gewijzigde gen-expressie

De top 3 van de significant gewijzigde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep werd geëvalueerd d.m.v. RT-qPCR op de studie-groep. De resultaten waren consistent met de RNA-seq gegevens voor IL8 en NFKBIA. IL8 (FC [‘fold change’, hoeveel maal een parameter is veranderd] = 4,8; P = 0.01) & NFKBIA (FC = 2,0; P = 0.05) waren allebei significant gestegen in de patiënten-groep vergeleken met controles. TNFAIP3 was ook gestegen in de patiënten-groep (FC = 2,1; P = 0.19) met een trend naar significantie.

Analyse van de transcriptoom-gegevens

Via FNA & IPA onderzochten we de verrijkte funktionele interakties, en de biochemische en fysiologische mechanismen die werden afgeleid uit de analyse van de differentieel tot expressie komende gen-transcripten bij M.E./CVS.

FNA. De funktionele associatie netwerken van proteïnen gecodeerd door differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden bepaald d.m.v. het STRING portaal [een omvangrijke database van gekende en voorspelde proteïne/proteïne-interakties]. We vonden een significant niveau van netwerk-aanrijking (P-waarde 6.1×10-5) in deze lijst, wat er op wijst dat de gecodeerde proteïnen biologisch verbonden zijn. Er werden sterke funktionele associaties geobserveerd tussen IL8, NFKBIA, TNFAIP3, JUN, NAMPT, CREM, PMAIP1, PPP1R15A, RBBP6, UBE2D3, SOCS3, RIPK2 & ZC3H12A. Er bleken meerdere overtuigende funktionele mechanismen verrijkt door de toegenomen gecodeerde proteïnen [lijst beschikbaar]. Gezamenlijk bekrachtigen deze mechanismen significant immune en inflammatoire over-aktivatie en ontregeling die optreedt bij de pathologie van M.E./CVS.

IPA toont inflammatie en oxidatieve stress bij M.E./CVS. Er werd IPA uitgevoerd op de transcriptoom-gegevens met een significantie van P < 0.05, wat de pool beschikbaar voor de analyse op 125 verhoogde en 40 verlaagde gen-transcripten bracht [lijst beschikbaar]. Deze analyse identificeerde een aantal overlappende, funktioneel onderling verbonden kanonieke mechanismen. De meeste mechanismen waren direct gerelateerd met inflammatoire signalisering en de stress-respons, wat de resultaten van de FNA ondersteunt [lijst beschikbaar]. Gen-netwerken verbonden met oxidatieve stress, inflammatie en zenuwweefsel-schade [lijst beschikbaar] waren ook significant. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat mitochondriale dysfunktie en verstoord energie-metabolisme leiden tot vermoeidheid, malaise, en de courant ervaren spierpijn en cognitieve stoornissen bij M.E./CVS.

Anti-inflammatoire responders op TNFα & NF-κB

De top 3 ge-upreguleerde genen in onze studie – IL8 [coderend voor interleukine-8 (IL-8); neutrofiel-aktiverende factor (NAF), een chemokine], NFKBIA [coderend voor NF-κB inhibitor alfa] & TNFAIP3 [coderend voor tumor necrose factor alfa geïnduceerd proteïne 3; inhibeert NF-κB aktivatie en TNF-gemedieerde apoptose] – zijn vroegere responders op TNF-geïnduceerde NF-κB aktivatie. De proteïnen A20 (TNFAIP3) en IκBa (NFKBIA) maken deel uit van de twee voornaamste negatieve feedback-loops van NF-κB-gestuurde transcriptie. Bovendien is TNFα een krachtige inducer van IL-8 sekretie, via een transcriptioneel mechanisme dat wordt gereguleerd door NF-κB. Stijgingen qua IL-8 en TNFα warden geïdentificeerd in meerdere cytokine- en immune studies bij M.E./CVS. Chronische inflammatie wordt ook versterkt door het NF-κB signalisering mechanisme. De stijging van de expressie van deze 3 gen-transcripten in de M.E./CVS-groep impliceert sterk een aanhoudende biologische respons tegen ongewenste overmatige aktiviteit van NF-κB en inflammatie bij M.E./CVS, aangestuurd door TNFα.

Significante biologische mechanismen verrijkt in de M.E./CVS-groep, geïdentificeerd door FNA & IPA

Het circadiaans ritme. Meerdere gestegen gen-transcripten in de M.E./CVS-groep coderen voor kern-proteïnen die de circadiaanse klok reguleren, het centraal mechanisme dat ons 24h circadiaans ritme aanstuurt. Een verstoord circadiaans ritme kan direct gelinkt zijn met vele van de M.E./CVS-symptomen, zoals pijn, vermoeidheid, slaapstoornissen, griep-achtige symptomen, cognitieve stoornissen, post-exertionele malaise, en dysfunktie van metabole en immuun-systemen. Deze resultaten suggereren dat ontregeling van het circadiaans ritme waarschijnlijk is bij M.E./CVS een plausibele kandidaat kan zijn voor het doen aanhouden van de symptomen en de ernst van M.E./CVS.

Mitochondriale dysfunktie. Mitochondrieën zijn essentieel voor cellulaire energie produktie, metabolisme en het reguleren van stress-responsen. De resultaten van FNA & IPA duiden op mitochondriale dysfunktie, gekenmerkt door tekenen van oxidatieve stress en downregulering van metabole mechanismen. Er zijn 3 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (PMAIP1, PMPCB & JUN) die belangrijke rollen spelen bij de mitochondriale funktie en apoptotische mechanismen:

1. Ademhaling. Mitochondriale ademhaling kan worden geïnhibeerd door cytokine-veranderingen en oxidatieve stress. Regulering van cytokine-produktie en oxidatieve stress mechanismen bleken beide verrijkt in de M.E./CVS-groep. M.E./CVS-studies vonden belangrijke indicatoren voor mitochondriale dysfunktie, inclusief gedaalde aanmaak van ATP en verstoring van de oxidatieve fosforylatie. Ter ondersteuning van onze analyse: een studie toonde verlaagde maximale respiratie door mitochondrieën in M.E./CVS PBMCs. Ze vonden metabole verschillen die een onvermogen toonden om te voldoen aan de cellulaire energetische vereisten, bijzonderlijk wanneer mitochondrieën onder stress stonden. [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017)12: e0186802]

2. Downregulering van het metabolisme. FNA toonde verstoorde regulering van meerdere metabole mechanismen in de M.E./CVS-groep, waarvan vele gerelateerd met mitochondrieën. Metabole profilering studies bij M.E./CVS hebben verstoord metabolisme gelinkt met post-exertionele malaise. Belangrijk: een studie onderzocht metabolieten bij M.E./CVS-patiënten en controles, en ontdekte een homogene afname van diagnostische metabolieten bij alle M.E./CVS-patiënten, consistent met hypometabool syndroom. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (2016) 113: E5472-E5480] Aangezien alle geïdentificeerde metabole abnormaliteiten ofwel direct gereguleerd worden door redox of door de beschikbaarheid van NADPH, speculeerde men dat een mitochondriale betrokkenheid waarschijnlijk was. Accumulatie van melkzuur door het verstoord metabolisme kan de pijn in spieren en gewrichten, die wordt gerapporteerd door M.E./CVS-patiënten, verklaren. Bovendien werd gerapporteerd over lactaat-accumalatie in de ventriculaire ruimtes van de hersenen en het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten en dit zou kunnen bijdragen tot de neuro-inflammatoire symptomen van M.E./CVS.

3. Stress-respons. FNA toonde een verhoogde cellulaire stress respons en positieve regulering van apoptotische processen in de M.E./CVS-groep. IPA vestigde de aandacht op de produktie van stikstof-oxide (NO) en reaktieve zuurstof soorten (ROS) in macrofagen. NO- en ROS-produktie, gestimuleerd door TNFα en NF-κß, speelt een centrale rol bij de controle van infekties, en ROS-produktie wordt ook toegeschreven aan geaktiveerd NADPH-oxidase, een component van de mitochondriale elektron-transport-keten. Mitochondrieën komen veel voor in cellen van het centraal zenuwstelsel, waar ze de essentiële energie voor neuronen leveren en daardoor de synaptische plasticiteit beïnvloeden. Oxidatieve stress, veroorzaakt door verhoogd ROS in mitochondrieën, kan aanleiding geven tot cognitieve stoornissen en apoptose [geprogrammeerde cel-dood] – leidend tot mitochondriale DNA-schade en bijdragend tot cognitieve problemen door aantasting van neurotransmissie en Ca2+-homeostase. Van belang is dat veel M.E./CVS-symptomen, zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en myalgie, ook voorkomen bij primair mitochondriale ziekten.

Chronische inflammatie. Aanhoudende inflammatie wordt benadrukt door het M.E./CVS-transcriptoom, waarbij NF-κB en TNFα centraal zijn voor twee primaire kanonieke mechanismen die door IPA als verrijkt voorspeld werden. Zoals eerder vermeld, zijn IL8, NFKBIA & TNFAIP3 componenten van de bepalende aangetaste mechanismen. Het NF-κB aktivatie mechanisme richt zich op een reeks van cytokine- en chemokine-receptoren die vereist zijn voor immune herkenning, antigen-presentering en adhesie-receptoren. Het TNFR2 signalisering mechanisme reguleert de TNFα-aktiviteit via het tegenwerken van de door TNFα geïnduceerde apoptose, bijzonderlijk in sterk geaktiveerde T-cellen. Door LPS gestimuleerd ‘mitogen activated- protein-kinase (MAPK) [‘mitogen activated protein’ (MAP) kinasen reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleren verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose] stuurt de inflammatoire respons in macrofage immuun-cellen. Peroxisoom Proliferator Geaktiveerde Receptoren (PPAR) signalisering [PPAR zijn een groep receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] bleek ook aangetast. PPAR-signalisering molekulen reguleren metabole processen in hartspier-weefsel, inflammatie en oxidatieve stress, en faciliteren interakties tussen circadiaanse, metabole (lipiden-metabolisme) en cardiovasculaire mechanismen. Mitochondriale dysfunktie kan verder beïnvloed worden door verhoogde chronische aktivatie van immuun-inflammatoire stress mechanismen. Inflammatoire mediatoren zoals TNFα bleken in vitro geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en gestegen ROS. Een letsel of infektie kan ook leiden tot gecompromitteerde mitochondriale integriteit, wat inflammatie triggert via NF-κB, MAPKs en interferon regulerende factoren, en pathologie bevordert bij een groeiend aantal ziekten.

Deze resultaten bekrachtigen de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress bij M.E./CVS.

Eerdere M.E./CVS-transcriptoom studies ondersteunen inflammatie en mitochondriale betrokkenheid

Voor zover wij weten is dit de eerste RNA-seq analyse van PBMCs bij M.E./CVS-patiënten. Deze technologie werd echter al gebruikt voor een analyse van totaal-bloed bij adolescente M.E./CVS-deelnemers via gen-aanrijking. [zie Nguyen CB et al. hierboven] Onze analyse was consistent met onze bevindingen, suggestief voor verstoring van of B-cel differentiatie en overleving, versterkte aangeboren antivirale responsen en inflammatie. Co-expressie patronen en afzonderlijke gen-transcripten bleken geassocieerd met neuro-endocriene merkers van gewijzigde HPA-as en autonoom zenuwstelsel aktiviteit, plasma-cortisol, en aantallen monocyten en eosinofielen. We vonden significante molekulaire veranderingen in onze M.E./CVS-groep die consistent zijn met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire maar niet identieke studies. Eerdere micro-array [‘genen-chips’] en ‘differential display’ [vergelijken en identificeren van veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau] studies van de gen-expressie bij M.E./CVS hebben verstoringen qua immuun-mechanismen, mitochondriale funktie, cel-stress en apoptose aangegeven. Een ‘micro-array’ onderzoek van PBMCs bij een kleine groep post-infektueuze M.E./CVS mannen door Gow JW et al. [A gene signature for post-infectious Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genomics (2009) 2: 38] identificeerde differentieel tot expressie komende genen met rollen in immuun-modulatie, oxidatieve stress en apoptose, en – van bijzonder belang – vonden gestegen TNFAIP3, ter ondersteuning van onze resultaten. Ook van belang voor onze studie: Zhang L et al. [Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Clinical Pathology (2010) 63: 156-164] identificeerden een differentiële gen-signatuur van 88 genen via ‘micro-array’ analyse, wat verder werd gesubstantieerd door studies bij andere M.E./CVS-groepen. De gen-signatuur liet sub-groepering van de patiënten-groepen toe, en IPA-analyse van de gen-interakties, ziekte-verbanden en funkties identificeerde immunologische ziekte, met kanker gerelateerde cel-sterfte, immuun-respons en infektie mechanismen, alsook links met indicatoren voor Epstein-Barr en enterovirus infektie.

Onze verkennende benadering stelde ons in staat een rijke dataset van genen die differentieel tot expressie komen te verkrijgen, om de biologische veranderingen bij M.E./CVS te onderkennen. We identificeerden ontregeling van het circadiaans als een nieuwe mogelijke onderliggende oorzaak voor de niet-verfrissende slaap, vermoeidheid en metabole abnormaliteiten die worden gezien bij M.E./CVS. Verder biedt verstoorde mitochondriale funktie en de resulterende oxidatieve stress, gekoppeld met chronische immuun-inflammatoire signalisering, een dwingende verklaring voor de vermoeidheid, cognitieve dysfunktie en post-exertionele malaise die wordt ervaren bij M.E./CVS.

Daarom is deze studie een bijkomende stap naar het beter begrijpen van het ziekte-proces en het identificeren van vermeende biomerkers ter ondersteuning van de klinische diagnose. De geïndentificeerde biologische mechanismen bieden een rationele verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van M.E./CVS.

februari 23, 2019

Hoge energie-kost bij laag-gradige inflammatie

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:18 am
Tags: , , , , , , ,

Prof. Jacoba (Cobi) Heijnen is een belangrijk figuur in het gebied van de psychoneuro-immunologie. Haar research focust op de cellulaire en molekulaire mechanismen van neuronale schade, motorisch gedrag en neuroprotectanten. Ze combineert brein/immuunsysteem-communicatie om de invloed van het neuro-endocrien systeem op de immuunrespons van patiënten met auto-immuunziekten te bestuderen. Samen met Prof. Robert Dantzer richtte ze het ‘Neuroimmunology Laboratory’ aan de universiteit van Texas op; waar onderzoek wordt verricht omtrent pijn, vermoeidheid, neuropathie en cognitieve stoornissen. Dantzer lanceerde het nu het nu aanvaarde idee dat het immuunsysteem de symptomen van ‘sickness-behaviour’ (ziekte-gedrag; vermoeidheid, hoofdpijn, spierpijn, keelpijn, enz.) bepaalt en dat deze fungeren als een manier om het energie-verbruik te reduceren (om, zo wordt gesteld, de verspreiding van pathogenen te voorkomen). Lees ook ‘Identifikatie en behandeling van symptomen geassocieerd met inflammatie’.

In onderstaand ‘review’-artikel focust hun team op twee zaken die op deze pagina’s al veelvuldig aan bod kwamen: de problematische energie-voorziening en de laag-gradige (neuro)inflammatie. Op basis van de literatuur (grotendeels door M.E.(cvs)-researchers) stellen ze voor dat deze inflammatie problemen met de energie-produktie veroorzaakt.

Vroeger had Heijnen het over cognitieve gedrag therapie als hulpmiddel maar daar wordt nu blijkbaar niets meer over geopperd…

————————-

Front Behav Neurosci. (2018) 12: 78

The High Costs of Low-Grade Inflammation: Persistent Fatigue as a Consequence of Reduced Cellular-Energy Availability and Non-adaptive Energy Expenditure

Lacourt TE, Vichaya EG, Chiu GS, Dantzer R, Heijnen CJ

Neuroimmunology Laboratory, Symptom Research Department, The University of Texas MD Anderson Cancer Institute, Houston, TX, United States

Samenvatting

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom bij meerdere ziekten. Persistente vermoeidheid bleek geassocieerd met laag-gradige inflammatie in meerdere modellen voor vermoeidheid (inclusief kanker-gerelateerde vermoeidheid [CRF] en Chronische Vermoeidheid Syndroom). Het is echter onduidelijk hoe laag-gradige inflammatie tot het ervaren van vermoeidheid leidt. We presenteren hier een model voor een onevenwicht qua energie-beschikbaarheid en energie-verbruik als een gevolg van laag-gradige inflammatie. In dit verhalend overzicht, bespreken we hoe laag-gradige inflammatie kan leiden tot verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie. Laag-gradige inflammatie induceert een metabole omschakeling van energie-efficiënte oxidatieve fosforylatie naar snel-werkende, maar minder efficiënte, aërobe glycolytische energie-produktie; doet reaktieve zuurstof soorten verhogen en reduceert insuline-sensitiviteit. Deze effekten resulteren in gedaalde glucose-beschikbaarheid en, daardoor, verminderde cellulaire energie. Daarnaast suggereert nieuw bewijsmateriaal dat chronische laag-gradige inflammatie verbonden is met de bereidheid om inspanning te leveren onder specifieke omstandigheden. Veranderingen in het circadiaans ritme en slaap-stoornissen kunnen de effekten van inflammatie op de beschikbaarheid van cellulaire energie en niet-adaptief energie-verbruik mediëren. In het tweede deel van deze bespreking, presenteren we bewijs voor deze metabole mechanismen in modellen voor aanhoudende vermoeidheid, waarbij we focussen op Chronische Vermoeidheid Syndroom en kanker-gerelateerde vermoeidheid. Het meeste bewijsmateriaal voor gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie met betrekking tot vermoeidheid komt van studies over het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Hoewel het mechanistisch bewijs uit de literatuur omtrent kanker-gerelateerde vermoeidheid nog beperkt is, wijzen de beperkte resultaten ook naar gereduceerde beschikbaarheid van cellulaire energie. Er is ook groeiend bewijs voor het feit dat het energie-verbruik voor aktiviteiten de verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie bij patiënten met persisterende vermoeidheid overstijgt. Dit suggereert dat een onvermogen om energie-verbruik aan te passen aan de beschikbare bronnen één mechanisme kan zijn dat aan de basis ligt van persistente vermoeidheid.

Inleiding

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom van meerdere ziekten. Het is één van de meeste frequent gerapporteerde symptomen bij kanker en kanker-behandeling, en is zeer sterk aanwezig bij meerdere chronische ziekten, zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis. Daarnaast is ‘t het kenmerkend symptoom van het Chronische Vermoeidheid Syndroom, een aandoening waarbij ernstige persistente vermoeidheid wordt ervaren in afwezigheid van een gediagnostiseerde ziekte. Aanhoudende vermoeidheid is anders dan acute vermoeidheid. Acute vermoeidheid is een gezonde, adaptieve respons op fysieke of mentale inspanning, die metabole signalisering induceert om verdere energie-consumptie te vermijden. Acute vermoeidheid verdwijnt typisch na rust of slaap. In tegenstelling daarmee is persisterende vermoeidheid dikwijls disproportioneel met de uitgeoefende aktiviteiten en wordt over het algemeen niet volledig verlicht door rust. Er zijn geen behandelingen voor aanhoudende vermoeidheid die goedgekeurd werden door de Amerikaanse ‘Food and Drug Administration’, ten dele omdat de onderliggende mechanismen nog niet goed worden begrepen.

Er werd gesuggereerd dat aktivatie van inflammatoire mechanismen aan de basis ligt van persistente vermoeidheid bij veel patiënten-populaties [bv. Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158] en dieren-modellen. Inderdaad: het is goed bekend uit experimentele studies dat acute ernstige inflammatie, zoals deze geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS), acuut ziekte-gedrag, inclusief vermoeidheid, veroorzaakt. Deze respons werd geïnterpreteerd als een adaptief proces dat leidt tot het behoud van energie en reductie van het risico op verdere verspreiding van pathogenen (bv. door het zich terugtrekken uit sociale interakties) [Dantzer R et al. The neuroimmune basis of fatigue. Trends Neurosci. (2014) 37: 39-46]. Bovendien is, bij auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis, het vermoeidheid-niveau geassocieerd met een toename van plasma-cytokinen, bijzonderlijk bij opflakkering van symptomen. Verbanden tussen kleine, langdurige verhogingen qua inflammatoire cytokinen en chemokinen in het plasma, en persisterende vermoeidheid werden ook gerapporteerd bij kanker-overlevers; en bij individuen met het Chronische Vermoeidheid Syndroom [zie Montoya JG et al. hierboven]. Bij deze patiënten zijn de waarden van plasma-cytokinen over het algemeen veel lager dan deze die worden gedetekteerd bij patiënten met auto-immune ziekten. De mechanismen waarmee subtiele verhogingen qua inflammatie vermoeidheid induceren zijn nog onduidelijk en zouden verschillend kunnen zijn van wat werd aangetoond voor acute ernstige inflammatie. Het aantal in de literatuur gerapporteerde associaties suggereert echter dat het effekt biologisch significant is.

We stellen voor dat chronische laag-gradige inflammatie persistente vermoeidheid induceert en/of bestendigt door het induceren van een onevenwicht tussen beschikbaarheid van cellulaire energie en cellulair & aktiviteiten energie-verbruik. Inflammatie verhoogt de noodzaak van immuun-cellen om snel cellulaire energie te genereren. Om hieraan te voldoen verschuiven immuun-cellen naar aërobe glycolyse voor energie-produktie, een minder efficiënt maar snel-werkend mechanisme. Tijdens chronische laag-gradige inflammatie wordt verwacht dat het uitgebreid vertrouwen op aërobe glycolyse zal leiden tot gedaalde beschikbaarheid van nutriënten en dus tot minder energie-beschikbaarheid voor de noodlijdende orgaan-systemen. Het energie-evenwicht van het organisme kan verder belast raken door veranderingen qua circadiaanse ritmes en slaap. Daarnaast is er bewijs dat suggereert dat laag-gradige of chronische inflammatie (maar niet acute ernstige inflammatie) gelinkt kan worden aan verhogingen qua energie-verbruik bij aktiviteiten, wat bijdraagt tot het onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid en -verbruik en, daardoor, leidt tot vermoeidheid.

Effekten van laag-gradige inflammatie op energie-produktie en -verbruik

Adenosine-trifosfaat (ATP) is de voornaamste vorm van energie-‘munteenheid’ die door de cellen wordt gebruikt. Het genereren van ATP omvat het katabolisme van macronutriënten (koolhydraten, lipiden en proteïnen), elk startend van een uniek metabool mechanisme, maar dat uiteindelijk leidt tot ATP-produktie door de cellen. Factoren die ATP-produktie negatief kunnen beïnvloeden omvatten gedaalde intracellulaire glucose-beschikbaarheid (door veranderingen in het metabolisme van macronutriënten of verminderde glucose-opname door de cellen), gedaalde funktie van de mitochondrieën wat betreft aërobe energie-produktie en daaropvolgende afhankelijkheid van minder-efficiënte aërobe glycolyse.

Energie-produktie tijdens langdurige inflammatie

Inflammatie vereist een verandering qua metabolisme en deze wijzigingen verschillen voor acute en chronische of langdurige inflammatie. Bij acute inflammatie is snelle ATP-produktie door de immuun-cellen vereist voor de ganse reeks immuun-responsen. Immuun-cellen (lymfocyten en leukocyten) wisselen van oxidatieve fosforylatie naar een groter vertrouwen op aërobe glycolyse voor snelle ATP-produktie. Deze verschuiving is in het voordeel van overhaaste ATP-produktie terwijl de katabole efficiëntie wordt opgeofferd, resulterend in verminderde mitochondriale werking en gestegen aanmaak van lactaat.

Bijkomend is langdurige inflammatie geassocieerd met verhoogde insuline-resistentie en gedaalde glucose-tolerantie, wat leidt tot verminderde glucose-opname door de immuun-cellen en, bijgevolg, minder globale ATP-produktie uit glucose. Tijdens persistente laag-gradige inflammatie worden daarom energie en glucose afgeleid van andere systemen om de immuun-respons te ondersteunen. Ter compensatie doet het lichaam het lipiden- en proteïnen-metabolisme stijgen voor de produktie van ATP. Het lipiden-metabolisme is een traag proces en kan dus niet voldoen aan de snelle energie-vereisten. Daarnaast betekent een verhoogd betrouwen op het proteïnen-metabolisme dat andere funkties, zoals het bevorderen van groei-stimulatie, gecompromitteerd raken. Inflammatie leidt ook tot meer reaktieve zuurstof soorten (ROS) om binnendringende pathogenen te bestrijden. ROS kunnen echter schadelijk zijn voor mitochondrieën en mitochondriaal DNA, en dus draagt langdurige blootstelling aan ROS tijdens chronische inflammatie bij tot mitochondriale dysfunktie.

De effekten van chronische inflammatie zijn bijzonder schadelijk voor neuronen die sterk afhankelijk zijn van oxidatieve fosforylatie voor hun ATP-behoeften. Bij normaal brein-metabolisme vertrouwen neuronen sterk op astrocyten. Astrocyten gebruiken glycolyse om lipiden en glucose om te zetten naar pyruvaat en dan lactaat. Lactaat wordt dan naar neuronen gestuurd, waar het binnenkomt in de TCA-cyclus. Tijdens chronische inflammatie zorgt insuline-resistentie voor een daling van glucose en het proteïnen-metabolisme in het astrocyten, wat resulteert in verminderde beschikbaarheid van lactaat voor neuronen, wat deze er toe dwingt sterker te leunen op het trager proces van het lipiden-metabolisme. Verder is inflammatie in staat om de mitochondriale efficiëntie te verlagen, wat de metabole belasting op neuronen verhoogt. Veranderingen qua neuronaal metabolisme zullen uiteindelijk het neuronaal funktioneren aantasten.

Aktiviteiten energie-verbruik tijdens inflammatie

Er wordt geraamd dat chronische laag-gradige inflammatie het systemisch energie-verbruik met 10% verhoogt. Gezien de gestegen energie-vereisten bij chronische inflammatie en de resulterende gedaalde energie-beschikbaarheid, zou men verwachten dat het aktiviteiten energie-verbruik (d.i. de hoeveelheid energie die wordt gespendeerd aan aktiviteiten) zou verminderen. Meerdere studies in de context van acute, ernstige inflammatie bekrachtigen deze hypothese en tonen de verminderde bereidheid (motivatie) tot inspanning, zowel bij knaagdier-modellen als bij mensen. Resultaten van deze en andere studies suggereren echter ook dat motivatie-gedrag anders beïnvloed kan zijn bij laag-gradige inflammatie.

Studies met dieren-modellen tonen een daling qua inspanning om voedsel te verkrijgen enkel na toediening van hogere dosissen inflammatoire mediatoren. Voor de laagste dosissen was er niet alleen geen verminderde, er bleek ook een trend naar meer aktiviteit. Verder testten onderzoekers dieren 24 h na een acute inflammatoire aanval (LPS-injektie), een punt waar de acute inflammatoire respons en het ziekte-gedrag waren geluwd: er werd een verschuiving vastgesteld wat betreft motivationele prioriteit naar keuzes die een hogere inspanning voor een meer in het oog springende beloning vereisten.

Een vergelijking van de resultaten van de twee beschikbare studies bij mensen wijst ook op afzonderlijke effekten van hoog- vs. laag-gradige inflammatie op keuzes omtrent energie-verbruik. Researchers testten gezonde individuen 2 en 5 h na LPS-injektie en vonden een verminderde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (2, maar niet 5, h na injektie; op 2 h had de inflammatie z’n piek bereikt). In tegenstelling daarmee vonden anderen, bij deelnemers 5 h na LPS, een verhoogde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (maar enkel in omstandigheden die voordelig waren om iets te winnen). Ze merkten verder op dat deelnemers te zwak waren om getest te worden tussen 3 en 4 h na injektie. Op te merken: de 2 studies verschilden wat betreft meerdere belangrijke aspecten, inclusief karakteristieken van het staal (enkel mannen vs. een mix van mannen en vrouwen) en taken (keuze tussen aanvaarden of afwijzen van een taak vs. keuze tussen een taak met grote inspanning/grote beloning of een lage inspanning/kleine beloning). Niettemin, stellen we op basis van deze experimentele gegevens bij muizen en mensen als hypothese dat acute ernstige inflammatie leidt tot veralgemeende adaptieve dalingen van energie-verbruik/inspanning, terwijl milde inflammatie kan leiden tot relatieve stijgingen van energie-verbruik/inspanning op voorwaarde dat de drijfveer groot genoeg is. Deze notie wordt ondersteund door onze bevindingen dat laag-gradige inflammatie geassocieerd was met keuzes voor verhoogde inspanning van een groep kanker-patiënten en -overlevers. Er dient nog te worden nagegaan of deze verschuivingen qua inspanning-gedrag/energie-verbruik overéénkomen met ‘herstel’ of met een omschakeling van de immuun-cellen van een glycolytisch naar een meer oxidatief gestuurd metabool profiel. Daarnaast werden verschuivingen in het gedrag tijdens chronische laag-gradige inflammatie nog niet bestudeerd.

De effekten van inflammatie op inspanning/energie-verbruik bij motivatie-taken lijken te worden gemedieerd door het dopaminerg systeem. Hoewel het mechanisme waardoor inflammatie in staat is de dopamine-neurotransmissie te wijzigen nog onduidelijk is, geeft de literatuur omtrent Parkinson’s aan dat chronische neuro-inflammatie leidt tot oxidatieve stress en mitochondriale schade in dopaminerge neuronen, leidend tot een belangrijke verstoring qua dopaminerge [via dopamine werkende] neurotransmissie. Dopaminerge neuronen zijn bijzonder kwetsbaar voor inflammatie. Hoewel de oorzaak van deze kwetsbaarheid nog niet volledig wordt begrepen, kunnen de verhoogde basale oxidatieve fosforylatie van deze cellen en de auto-oxidatie van overmatig extracellulair dopamine daartoe bijdragen.

Slaap en circadiaanse ritmes als partiële mediatoren van de effekten van chronische laag-gradige inflammatie op energie-beschikbaarheid en -verbruik

Inflammatie kan bijkomend leiden tot meer aanhoudende wijzigingen in het metabolisme via veranderingen van het circadiaans ritme en slaap. Chronische laag-gradige en ernstige inflammatie bleek de slaap-kwaliteit en circadiaanse ritmes te beïnvloeden, en vice versa [Rahman K et al. Sleep-wake behavior in Chronic Fatigue Syndrome. Sleep (2011) 34: 671-678]. Veranderingen qua ritmes van de circadiaanse aktiviteit werden gelinkt met vermoeidheid. Slaap-stoornissen en verminderde slaap-kwaliteit – dikwijls gerapporteerd door individuen met persistente vermoeidheid – kunnen ook leiden tot een gedesorganiseerd/ontregeld circadiaans ritme omwille van dutjes tijdens de dag en strukturele wijzigingen qua slaap-aanvang ‘s nachts.

De meeste metabole processen worden gereguleerd door de circadiaanse klok en veranderingen qua circadiaans ritme of slaap zijn verbonden met metabole veranderingen, zoals verhoogd circulerend glucose en gedaalde insuline-sensitiviteit. Specifiek: expressie van mitochondriale proteïnen betrokken bij veel metabole processen ondergaat post-translationele modificaties die worden gereguleerd door het ‘Clock’-gen [Circadian Locomotor Output Cycles Kaput; beïnvloedt de circadiaanse ritmes]. Daarnaast wordt het mitochondriaal oxidatief metabolisme ook gecontroleerd door de circadiaanse klok via oscillaties in de biosynthese van nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD+) en de beschikbaarheid van mitochondriale enzymen.

Onvoldoende slaap en wijzigingen in circadiaanse ritmes kunnen ook het verbruik van cellulaire energie en aktiviteit veranderen. Pre-klinische studies tonen een verhoogd energie-verbruik na totale slaap-onthouding bij ratten. Zo ook leidde experimenteel geïnduceerde slaap-onthouding bij gezonde menselijke vrijwilligers tot gestegen dagelijks energie-verbruik (bepaald via totale-ruimte calorimetrie; meten van zuurstof-consumptie en koolstof-dioxide produktie). Hoewel dit gepaard ging met een compenserende toename in energie (voedsel-inname, t.t.z. calorische inname hoger dan calorisch verbruik), steeg de fysieke inspanning significant. Als de hierboven beschreven studies steunen op experimenteel geïnduceerde veranderingen qua circadiaans ritme en slaap, is het onduidelijk in welke mate deze bevindingen relevant zijn voor natuurlijk optredende veranderingen. Daarnaast: of meer subtiele, aanhoudende veranderingen qua slaap en circadiaans ritme, zoals deze geobserveerd bij vermoeide individuen, ook energie-verbruik wijzigen, dient nog te worden aangetoond.

Samenvatting van de voorgestelde mechanismen

Chronische laag-gradige inflammatie is gerelateeerd met een persistente metabole switch naar snellere, maar minder efficiënte, glycolytische energie-produktie, en verhoogde aanmaak van ROS. Dit beïnvloedt op z’n beurt de mitochondriale funktie, waardoor het betrouwen op glycolytische mechanismen vergroot. Daarnaast gaat, hoewel chronische inflammatoire processen meer energie vereisen, deze verhoogde nood aan energie niet altijd gepaard met verminderingen qua aktiviteiten energie-verbruik. Dit lijkt in het bijzonder het geval in de context van laag-gradige inflammatie, die motivatie voor inspanning bleek te verhogen. Inflammatie kan ook circadiaanse ritmes en slaap beïnvloeden (en vice versa), wat de effekten op energie-beschikbaarheid en -verbruik verder kan verergeren.

We stellen voor dat dit onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid vs. -verbruik aan de basis ligt van het ervaren van vermoeidheid geïnduceerd door chronische laag-gradige inflammatie. Hierna bespreken we het bewijsmateriaal voor deze metabole mechanismen bij persistente vermoeidheid.

Aanhoudende vermoeidheid ten gevolge gereduceerde energie-beschikbaarheid en verhoogd energie-verbruik?

Er werden voornamelijk verbanden tussen laag-gradige inflammatie en aanhoudende vermoeidheid gerapporteerd bij individuen met CVS of CRF. Bij patiënten met CVS, bleek de vermoeidheid-ernst geassocieerd met gestegen cytokine-concentraties in plasma [zie Montoya JG et al. hierboven] en ruggemergvocht [Hornig M et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Psychiatry (2016) 21: 261-269]. Er werden ook wijzigingen in de fysiologische stress-respons (overwegend hypothalamus-hypofyse-bijnier as output) bij CVS-patiënten gerapporteerd [bv. Silverman M et al. Neuroendocrine and immune contributors to fatigue. PMR (2010) 2: 338-346], suggererend dat laag-gradige inflammatie het resultaat kan zijn van een gereduceerde sensitiviteit voor immuun-regulerende stress-hormonen zoals cortisol. Voor CRF begint de vermoeidheid gewoonlijk tijdens de kanker-behandeling maar houdt bij overleving aan bij een significante subset patiënten. Het is geweten dat de meeste eerste-lijn behandelingen zoals chemotherapie en chirurgie een inflammatoire respons induceren (bv. door weefsel-beschadiging). Stijgingen van inflammatoire merkers bleken inderdaad geassocieerd met verhoogde vermoeidheid-ernst bij patiënten die behandeling ondergingen, hoewel niet alle inflammatoire merkers geassocieerd met vermoeidheid een respons op kanker-behandeling vertonen, wat de aanwezigheid van andere oorzakelijke factoren suggereert. Bij kanker-overlevers werden ook, ondanks het ophouden van de onmiddellijke inflammatoire effekten van de kanker-behandeling, verbanden tussen gestegen waarden van inflammatoire merkers en verhoogde vermoeidheid gezien. CRF bij overlevers bleek daarnaast geassocieerd met psychosociale stress factoren (zoals angst voor het terugkeren van de kanker) wat suggereert dat inflammatoire processen bij overlevers (ten dele) stress-gerelateerd kunnen zijn.

Gedaalde energie-beschikbaarheid bij aanhoudende vermoeidheid

Bewijs voor verminderde energie-beschikbaarheid bij langdurige vermoeidheid komt voornamelijk uit metaboloom-studies [bv. Fluge Ø et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-5480 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] en van studies omtrent mitochondriale dysfunktie [bv. Filler K et al. Association of mitochondrial dysfunction and fatigue: a review of the literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]

Mitochondriale Dysfunktie

Mitochondrieën worden dikwijls voorgesteld als de ‘krachtcentrales van de cel’. De mitochondriale werking kan gecompromitteerd worden door meerdere factoren, inclusief verminderde beschikbaarheid van de nodige metabolieten en mitochondriale schade door, bijvoorbeeld, oxidatieve stress. De notie dat mitochondriale dysfunktie kan leiden tot vermoeidheid wordt aangegeven door de observatie dat vermoeidheid een courant symptoom bij mitochondriale ziekte is en dat vermoeidheid-achtig gedrag in dieren-modellen geassocieerd is met gedaalde expressie van mitochondriale complexen, verminderingen qua metabole aktiviteit en veranderingen qua mitochondriale morfologie in de hersenen.

Het verband tussen mitochondriale dysfunktie en persistente vermoeidheid werd het meest bestudeerd bij patiënten met CVS. Een systematische ‘review’ rapporteerde dat 21 op 25 artikels beperkt waren tot CVS [zie Filler K et al. hierboven]. Lagere serum-waarden van het anti-oxidant CoQ10 was de meest consistente bevinding van het overzicht, met beperkt bewijs voor lagere waarden van andere anti-oxidanten en verhoogde waarden van oxidatieve stress merkers. Er werden lagere carnitine-waarden gezien in sommige studies maar de resultaten hingen af van het type carnitine dat werd bepaald. Later gepubliceerde studies over CVS bevestigen verhoogde oxidatieve stress, mogelijke dalingen qua efficiëntie van de ATP-aanmaak en verminderingen van de mitochondriale energie-produktie bij CVS-patiënten [Ciregia F et al. Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome. Transl. Psychiatry (2016) 6: e904]. Het bepalen van de zuurstof-consumptie in PBMCs [Tomas C et al. (2017). Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE 12: e0186802] is veelbelovend, wijzend op een gereduceerde capaciteit van de mitochondrieën om te voldoen aan de gestegen energie-vereisten tijdens cellulaire stress; een replicatie omwille van het gebruik van ingevroren en verse bloedstalen, en de beperkte grootte van het staal is aangewezen.

Studies aangaande CRF bleven tot hier toe beperkt tot de onmiddellijke effekten van kanker-behandeling en het is onduidelijk in welke mate deze effekten nog aanwezig zijn bij overlevers. Pre-klinische research heeft aangetoond dat zowel kanker als kanker-therapie geassocieerd zijn met mitochondriale dysfunktie. Op basis van pre-klinische modellen is het onbekend of door behandeling geïnduceerde of door kanker geïnduceerde veranderingen qua mitochondriale funktie verband houden met vermoeidheid. Een handvol observationele studies van één research-groep rapporteren echter over een associatie bij prostaat-kanker patiënten die bestraling-therapie ondergaan. Hun resultaten duiden op verminderd mitochondriaal funktioneren tesamen in associatie met vermoeidheid, zoals bewezen door gedaalde expressie van mitochondrieën-gerelateerde genen, verminderde expressie van mitochondriale elektronen-transport complex-II enzymen en gestegen apoliproteïne-A1 (ApoA1) in associatie met hogere vermoeidheid. ApoA1 is belangrijk voor lipiden-opruiming en een stijging qua ApoA1 is indicatief voor een gedaald gebruik van lipiden voor ATP-synthese.

Een handvol studies en klinische proeven bekrachtigen de hierboven beschreven bevindingen. Twee experimentele studies bij CVS-patiënten toonden wijzigingen in metabole processen. Resultaten van de in vitro stimulatie van skeletspier-cellen van patiënten met CVS gaven insuline-resistentie of verminderde sensitiviteit van insuline-receptoren aan [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10: e0122982; zie ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]. Verder vertoonden CVS-patiënten een trager herstel na maximale inspanning-test, leidend tot een snellere afhankelijkheid op het minder efficiënt glycolytisch metabolisme tijdens een daaropvolgende test [Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492].

Anti-oxidanten supplementering kan doeltreffend zijn naar het verminderen van vermoeidheid toe, wat een oorzakelijk verband suggereert tussen verminderde beschikbaarheid van anti-oxidanten en vermoeidheid. Bij patiënten met CVS deed supplementering met CoQ10 en nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) de vermoeidheid dalen, terwijl dat niet geval was voor een placebo-behandeling [Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid. Redox Signal. (2014) 22: 679-685]. Supplementering bleek ook CRF te verbeteren. Cachexische patiënten [cachexie = veralgemeende zwakte-toestand] met gevorderde gynaecologische kanker leken voordeel te halen uit de toediening van meerdere metabolisme-gerelateerde supplementen naast hun standaard cachexie-behandeling met synthetisch progestogeen; wat verminderingen qua vermoeidheid, inflammatie en energie-verbruik aantoont in vergelijking met enkel de standaard behandeling. Bij patiënten met borst-kanker die chemotherapie ondergaan, leidde supplementering met een aminozuren-gel die CoQ10 en L-carnitine bevat tot minder ernstige vermoeidheid. Aangezien deze studie een ‘standard-of-care’ conditie als controle omvatte, kan een placebo-effekt niet worden uitgesloten. In tegenstelling daarmee werd bij een grote studie met of borst-kanker patiënten die chemotherapie ondergingen, gebruikmakend van supplementering met vitamine-E met of zonder CoQ10, geen enkel effekt van CoQ10 op de ontwikkeling van vermoeidheid gevonden. In dieren-modellen werd ook aangetoond dat verscheidene molekulen met anti-oxidante eigenschappen vermoeidheid-achtig gedrag kunnen verminderen [bv. quercetine, coenzyme-Q10, ginsenoside-Rb1 (steroïd-achtige stof voorkomend in ginseng, agonist voor de oestrogeen-receptor)]. Bij deze studies dient te worden opgemerkt dat de vermoeidheid-modellen een significante beperking betekenen. Aangezien de mechanismen die ten gronde liggen aan CVS nog slecht gedefinieerd zijn, is de validiteit van dieren-modellen voor CVS betwistbaar. Bovendien induceren en kwantificeren veel van deze studies vermoeidheid in dezelfde interventie (bv. gedwongen zwemmen), wat inherent problematisch is. Daarom is nog veel werk vereist om onze model-systemen te verbeteren en deze bevindingen te valideren.

Samengevat: het meeste bewijsmateriaal voor een verband tussen vermoeidheid en mitochondriale werking komt van CVS, wijzend op lagere waarden van anti-oxidanten en mogelijke dalingen qua mitochondriale ATP-produktie. Hoerwel er geen lagere anti-oxidanten concentraties werden gevonden bij kanker-patiënten, duiden wijzigingen van de mitochondriale gen-expressie toch op een rol voor het mitochondriaal funktioneren bij vermoeidheid. Resultaten van klinische en pre-klinische studies wijzen op mogelijke voordelige effekten van mitochondrieën-ondersteunende supplementen. De meeste observationele en interventie-studies lijden echter onder ernstige beperkingen wat betreft staal-grootte of studie-ontwerp. Daarnaast werden de exacte oorzaken van gedaalde waarden van anti-oxidanten of ATP-aanmaak nog niet bestudeerd. Hoewel inflammatie waarschijnlijk de oorzaak is, is het zeker niet de enige kandidaat. Dus zijn bijkomende pre-klinisch onderzoek om de mechanismen te identificeren, als ook klinische replicaties bij grotere groepen, gebruikmakend van placebo-gecontroleerde ontwerpen en relevante biomerkers, dringend aangewezen.

Metabolomica

Metabolomica-studies laten een brede beoordeling van veranderingen in het metabolisme toe. Drie dergelijke studies rapporteerden over CVS, elk met verschillende resultaten maar allemaal wijzend naar gereduceerde metabole aktiviteit. Yamano et al. [ref. zie hierboven] leverden bewijs voor verminderde aktiviteit in de TCA- en de ureum-cyclus. Naviaux [ref. zie hierboven] rapporteerde over gedownreguleerde metabolieten van twee klassen lipiden en Fluge [ref. zie hierboven] over gedaalde concentraties aminozuren die fungeren als voorlopers voor acetyl-Coenzyme A, één van de voornaamste inputs van de TCA-cyclus. Hoewel Yamano et al. & Naviaux et al. geen meldingen maakten over verbanden tussen metabolieten en vermoeidheid-graad, rapporteerde Fluge et al. dat er geen assosciaties waren. Ze observeerden eerder verbanden tussen leeftijd en ‘body-mass-index’, suggererend dat hun bevindingen niet specifiek waren voor vermoeidheid bij de CVS-patiënten.

Er werd slechts beperkt werk verricht aangaande metabolomica in dieren-modellen voor vermoeidheid; bij één studie van inspanning-geïnduceerde vermoeidheid werden echter meerdere potentiële “anti-vermoeidheid” metabolomica biomerkers geïdentificeerd. Eén daarvan was geranyl-difosfaat [wordt beschouwd als een sleutel-intermediair bij de biosynthese van steroïden], dat indirect de lipiden-synthese en proteïnen-afbraak kan reguleren. Sebacinezuur [een dicarbonzuur], een resultaat van het vetzuren-metabolisme dat geoxideerd kan worden tot metabole intermediairen voor de TCA-cyclus [acetyl-CoA & succinyl-CoA], was een ander.

Samengevat: de resultaten van de drie metabolomica-studies duiden op veranderingen in het lipiden- & vetzuren metabolisme en gedaalde TCA-aktiviteit in verband met vermoeidheid, wat lijkt op metabole wijzigingen tijdens chronische laag-gradige inflammatie. Aangezien de TCA-cyclus nodig is om de voorlopers voor het proces van oxidatieve fosforylatie te creëeren, zou een verminderde aktiviteiten wijzen op gedaalde ATP-produktie via gereduceerde oxidatieve fosforylatie. Aangezien het lipiden-metabolisme, of lipolyse, de meeste energie per gram substraat genereert, is het de meest efficiënte manier voor energie-opslag. Het katabolisme van lipiden naar bruikbare energie is een traag proces en wordt hoofdzakelijk aangewend bij uitgebreide energie-vereisten, zoals bij chronische inflammatie. Veranderingen in dit metabool mechanisme kunnen dus resulteren in verminderde beschikbaarheid van efficiënte energie-bronnen, wat leidt tot verhoogde afhankelijkheid van een op koolhydraten gebaseerd metabolisme. Daarnaast zou de gedaalde beschikbaarheid van vetzuren interfereren met de aërobe energie-produktie, wat de nood voor anaërobe glycolytische ATP-produktie verhoogt.

Verhoogd energie-verbruik bij aanhoudende vermoeidheid

Meerdere bevindingen wijzen naar een energie-verbruik voor aktiviteiten die de beschikbare energie overstijgt bij patiënten met CVS & CRF. Bv.: één studie rapporteerde dat ca. de helft van een groep CVS-patiënten een energie-verbruik ervaarde dat hun ervaren energie-beschikbaarheid overschreed [Jason L et al. The impact of energy modulation on physical functioning and fatigue severity among patients with ME/CFS. Patient Educ. Couns. (2009) 77: 237-241]. Daarnaast bleek dat een niet-farmacologische interventie gericht op het verminderen van de vermoeidheid bij CVS-patiënten enkel doeltreffend was bij die patiënten waar energie-beschikbaarheid en -verbruik overéénkwamen [Brown M et al. The role of changes in activity as a function of perceived available and expended energy in nonpharmacological treatment outcomes for ME/CFS. J. Clin. Psychol. (2011) 67: 253-260]. Bij CRF hebben we getoond dat kanker-overlevers die melding maken van ernstiger vermoeidheid, een verhoogde tendens vertoonden om inspanning te leveren. Kanker-patiënten onder behandeling vertoonden dit verband niet maar eerder een gedaalde neiging om inspanning te leveren. Andere onderzoekers rapporteerden significante positieve verbanden tussen vermoeidheid-ernst en gemiddeld dagelijks calorie-verbruik bij patiënten met borst-kanker na de vierde cyclus chemotherapie. Dus is er preliminair bewijs dat suggereert dat energie-verbruik niet overéénkomt met (ervaren) energie-beschikbaarheid.

Veranderingen in circadiaanse ritmes en slaap bij bij aanhoudende vermoeidheid

Zoals hierboven vermeld, kunnen door laag-gradige inflammatie geïnduceerde veranderingen van het metabolisme gemedieerd zijn door wijzingen in circadiaanse ritmes & slaap, mogelijks via veranderingen van de melatonine-ritmiciteit. Hieronder bespreken we de bevindingen omtrent slaap, circadiaans ritme en melatonine in relatie tot chronische vermoeidheid.

Bij CVS werden een slechte slaap en wijzigingen qua melatonine-ritmiciteit, maar niet qua circadiaans ritme, gerapporteerd. CVS-patiënten maken meer melding van slaap-storrnissen en vertonen abnormale slaap-progressie (d.w.z. grotere mate van cyclisch alternerend patroon). Daarnaast was de vermoeidheid-graad geassocieerd met door de patiënten gerapporteerde slechte slaap, wat op z’n beurt verband hield met kleine toenames van de waarden van de pro-inflammatorire cytokinen interleukine-1β & tumor necrose factor-α in het plasma. Hoewel er geen bewijs werd gevonden voor een gewijzigd circadiaans ritme bij CVS, is er bewijs voor veranderde melatonine-ritmiciteit. Bv.: er werden significant hogere nachtelijke melatonine-waarden in het speeksel gezien bij adolescenten met CVS die melding maakten van niet-verfrissende slaap vergeleken met gezonde individuen. Verder was de associatie tussen het circadiaans ritme van de lichaamstemperatuur een melatonine-aanvang, die wordt gezien bij gezonde mensen, afwezig bij CVS-patiënten. Hoewel in één studie de behandeling met melatonine of fototherapie (daglicht-therapie) de vermoeidheid niet deden afnemen bij CVS-patiënten, was melatonine succesvol voor het verminderen van vermoeidheid wanneer de deelnemers werden geselekteerd voor een later-dan-gewoonlijke avondlijke melatonine-start. Deze studie omvatte placebo-controle maar de vermoeidheid-reducties waren significant meer uitgesproken bij patiënten met een zeer late start vs. Deze met een relatief vroege start, suggererend dat de effekten waarschijnlijk niet te verklaren zijn door enkel een placebo-effekt.

Bij kanker-patiënten werden associaties tussen CRF en verstoord circadiaans ritme en slaap gerapporteerd vóór, tijdens en na behandeling. In een longitudinale studie bij borst-kanker patiënten, waren verhoogde vermoeidheid tijdens chemotherapie gerelateerd met meer meldingen van slaap-stoornissen alsook meer dutjes en verminderd wakker-zijn tijdens de dag. In een subgroep van deze patiënten, waarvan info over inflammatie beschikbaar was, bleken verhoogde vermoeidheid of ontregelde slaap geassocieerd met meer inflammatie. Interventies gericht op het normaliseren van het circadiaans ritme bleken succesvol wat betreft het verlichten van CRF. Behandeling met helder wit licht was doeltreffend wat betreft het voorkomen en behandelen van circadiaans ritme desynchronisatie bij patiënten met borst-kanker, en verbeterde vermoeidheid bij overlevers van borst-kanker en in een gemengde groep van overlevers van niet-uitgezaaide kanker. Er werd getoond dat licht-behandeling tijdens chemotherapie voor borst-kanker verhoogde vermoeidheid voorkomt, hoewel verrassend genoeg, deze effekten niet gemedieerd bleken door samenlopende effekten op het circadiaans ritme.

Samengevat: verstoorde slaap en gewijzigde circadiaanse of melatonine-ritmiciteit treden frequent op bij individuen met aanhoudende vermoeidheid, hoewel deze kan worden ervaren in afwezigheid van een veranderde slaap en circadiaans ritme. Slechts enkele studies hebben de verbanden tussen laag-gradige inflammatie en slaap of circadiaans ritme in de context van vermoeidheid beoordeeld, en de resultaten zijn inconsistent. Daarnaast warden associaties tussen slaap of circadiaans ritme en metabole uitkomsten niet bestudeerd in vermoeide populaties.

Samenvatting & besluit

We hebben hier een model voorgesteld van persistente vermoeidheid ten gevolge chronische laag-gradige inflammatie die leidt tot een onevenwicht in energie-beschikbaarheid en -verbruik, wat kan worden gemedieerd en onderhouden door veranderingen qua circadiaans ritme en slaap. De hier besproken literatuur duidt inderdaad op associaties tussen aanhoudende vermoeidheid bij CVS en CRF met veranderingen in cellulair metabolisme, verstoorde slaap en, in mindere mate, ontregelingen van het circadiaans ritme. Voor zowel CRF en CFS werden modellen met meerdere oorzaken gesuggereerd; deze omvatten niet enkel laag-gradige inflammatie en verstoorde slaap, maar ook veranderingen qua in stress-fysiologische responsen, genetische kwetsbaarheid en socio-demografische factoren (o.a.). Deze oorzaken zijn niet wederzijds exclusief en wijzen mogelijks op een beperkter aantal uiteindelijke eindpunten. We bespraken hier een dergelijk finaal gemeenschappelijk mechanisme, waarbij meerdere erkende bijdragende factoren aan persistente vermoeidheid zijn opgenomen.

Er zijn meerdere beperkingen omtrent de huidige stand van de kennis. Ten eerste: de meeste studies warden uitgevoerd bij patiënten met CVS, en dit is in het bijzonder het geval voor studies omtrent metabolisme en energie-produktie. Het is dus zeker onduidelijk in welke mate de bevindingen omtrent metabolisme en energie-produktie ook betrekking hebben op patiënten met CRF. Bovendien zijn slechts weinig rapporten beschikbaar die meer dan één van de gesuggereerde parameters voor ons voorgesteld model omvatten. Slechts twee studies verkenden associaties tussen laag-gradige inflammatie en slaap, één bij CVS-patiënten en één bij vermoeide borst-kanker patiënten. Naar ons weten werden er geen studies gepubliceerd die verbanden beschrijven tussen inflammatie en metabolisme bij patiënten met aanhoudende vermoeidheid. Ondanks dit gebrek aangaande meer allesomvattende studies, suggereert het bewijsmateriaal dat nu beschikbaar is, dat gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie een rol bij chronische vermoeidheid kan spelen wanneer deze vermoeidheid geassocieerd is met laag-gradige inflammatie. Daarnaast is er beperkt bewijs voor gestegen energie-verbruik voor aktiviteiten, wat suggereert dat het energie-verbruik niet aangepast is aan de mate van vermoeidheid of aan de energie-beschikbaarheid.

Interventie-studies gericht op het verbeteren van aspecten van het gepresenteerde model, met als uiteindelijk doel het verlichten van vermoeidheid, zijn nog schaars. Niettemin is het reeds duidelijk dat deelnemers aan dergelijke studies zorgvuldig geselekteerd dienen te worden en niet enkel op basis van hun ervaren van vermoeidheid. De studie waarbij zorgvuldige selektie van individuen met CVS met een avondlijke melatonine-start die later gewoonlijk valt en significant voordelige effekten onthulde van melatonine-supplementering, illustreert dit mooi. Dergelijke effekten werden niet gezien wanneer de deelnemers enkel werden geselekteerd op basis van hun vermoeidheid-toestand.

Samengevat: er is meer research nodig om inéén te puzzelen hoe chronische laag-gradige inflammatie kan leiden tot het ervaren van aanhoudende vermoeidheid. Niettemin ligt een mogelijke belangrijke verklaring bij gereduceerde cellulaire energie gekoppeld met verhoogde of maladaptieve veranderingen qua energie-verbruik. Bewijsmateriaal voor dit model kan worden gevonden voor zowel laag-gradige inflammatie als vermoeidheid.

februari 8, 2019

Bewijs voor metabolieten-abnormaliteiten in het brein bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Neurologie — mewetenschap @ 2:28 pm
Tags: , , , , , , ,

Een (te groot) deel van de medische ‘professionals’ weigert de term Myalgische Encefalomyelitis (wat betekent: spierpijn gerelateerd met inflammatie – wat overigens niét hetzelfde is als ‘infektie’ – van het centraal zenuwstelsel) te gebruiken omdat er volgens hen geen inflammatie in de hersenen kan worden aangetoond. We gaven op deze pagina’s al informatie mee die het tegenovergestelde aantoont.

Michael B. VanElzakker van de ‘Harvard Medical School’ besprak (in ‘Frontiers in Neurology’, 2019) de methodes om neuro-inflammatie bij in M.E.(cvs) te bestuderen (‘Neuroinflammation and cytokines in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): A critical review of research methods). Hij opperde dat, omwille van de talrijke bronnen voor mogelijke variabiliteit, het onwaarschijnlijk is dat ooit een consistent en repliceerbaar diagnostisch cytokinen-profiel zal worden ontdekt. De techniek van PET-scanning met TSPO-bindend radioligand – gebruikt in de studie van Nakatomi (zie hieronder) – zou een veelbelovende optie zijn met echter methodologische moeilijkheden. (Nieuwe liganden van de tweede generatie zijn specifieker.) Magnetische Resonantie Spectroscopie MRS zou minder informatief zijn maar makkelijker beschikbaar, minder invasief en goedkoper. VanElzakker et al. suggereren PET-scans samen met MRS aan te wenden. In onderstaande studie wordt deze laatste techniek gecombineerd met de meting van de temperatuur (inflammatie geeft temperatuur-stijgingen) van de hersenen (brein-thermometrie). De draagkracht van de bevindingen wordt vergroot omdat de bevindingen omtrent metabolieten en temperatuur samenvallen.

Samen met radiologie-experten publiceerde Prof. Jarred Younger (‘University of Alabama at Birmingham’) een studie (gefinancierd door het ‘Solve M.E./CFS Initiave’s Ramsay Award Program) waarbij – gebruikmakend van magnetische resonantie spectroscopie (MRS; een niet-invasieve methode voor het evalueren van molekulen en hun hoeveelheden in het brein op basis van 3D beelden, die een afbeelding kunnen schetsen van metabole veranderingen) – de mogelijke inflammatoire processen in de (globale) hersenen van met M.E.(cvs) worden onderzocht. Deze piloot-studie levert belangwekkend bewijsmateriaal voor een lage-graads neuro-inflammatie. De resultaten bekrachtigen eerdere observaties omtrent hersen-abnormaliteiten (zoals bv. gestegen lactaat) en zijn een uitbreiding op bevindingen van MRS-studies die beperkt bleven tot specifieke gebieden.

————————-

Brain Imaging Behav. 2019 [pre-print]

Evidence of widespread metabolite abnormalities in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: assessment with whole-brain magnetic resonance spectroscopy

Mueller C1, Lin JC1, Sheriff S2, Maudsley AA2, Younger JW3

1 Department of Psychology, The University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, 35294, USA

2 Department of Radiology, Miller School of Medicine, University of Miami, Miami, FL, 33136, USA

3 Department of Psychology, The University of Alabama at Birmingham, AL, 35294, USA

Samenvatting

Eerdere neuro-beeldvorming studies hebben merkers voor neuro-inflammatie gedetekteerd bij patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Magnetische Resonantie Spectroscopie (MRS) is geschikt voor het meten van hersen-metabolieten die gelinkt zijn aan inflammatie maar werd enkel toegepast op bepaalde gebieden die van belang zijn bij M.E./CVS. We hebben de MRS-analyse van M.E./CVS uitgebreid door het vastleggen van multi-voxel [voxel = volume-pixel; een waarde van een standaard ‘rooster’ in een drie-dimensionale ruimte, in dit geval dus bij beeldvorming via Magnetische Resonantie] informatie van het ganse brein. Daarnaast testten we of de via MRS bepaalde hersen-temperatuur verhoogd is bij M.E./CVS-patiënten. 15 vrouwen met M.E./CVS en 15 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles vulden vragenlijsten betreffende vermoeidheid- en stemming-symptomen in en ondergingen echo-planaire spectroscopische beeldvorming [EPSI; techniek om de regionale metaboliet-concentraties in kaart te brengen] van de volledige hersenen. Choline (CHO), myo-inositol (MI), lactaat (LAC) en N-acetyl-aspartaat (NAA) warden gekwantificeerd in 47 gebieden, uitgedrukt als verhouding t.o.v. creatine (CR), en vergeleken tussen M.E./CVS-patiënten en controles […]. De hersen-temperatuur werd op gelijkaardige wijze getest. Er werden significante verschillen tussen de groepen gedetekteerd in meerdere gebieden, met als meest opvallende gestegen CHO/CR in de linker anterieure [voorste] cingulate [cortex] (p < 0.001). De metabolieten-verhoudingen in 7 gebieden bleken gecorreleerd met vermoeidheid (p < 0.05). De M.E./CVS-patiënten vertoonden een verhoogde temperatuur in de rechter insula, putamen, frontale cortex, thalamus en het cerebellum (allemaal p < 0.05), wat niet toe te schrijven was aan een verhoogde lichaam-temperatuur of verschillen qua cerebrale perfusie. De hersen-temperatuur stijgingen gingen samen met verhoogd LAC/CR in de rechter insula, rechter thalamus en cerebellum (allemaal p < 0.05). We rapporteren metabolieten- en temperatuur-abnormaliteiten in M.E./CVS-patiënten in wijd-verspreide gebieden. Onze bevindingen kunnen aangeven dat neuro-inflammatie betrokken is bij M.E./CVS.

Inleiding

[…]

De pathofysiologie van M.E./CVS is nog onzeker, aangezien er ontregelingen van meerdere lichaam-systemen werden geïdentificeerd in de literatuur. Eén hypothese is dat M.E./CVS een toestand van chronische, laag-gradige neuro-inflammatie vertegenwoordigt [Komaroff AL. Inflammation correlates with symptoms in Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (2017) 114: 8914-8916]. De term ‘laag-gradige’ neuro-inflammatie wordt hier gebruikt ter onderscheiding van meningitis of encefalitis, of andere medisch opduikende of neurodegeneratieve aandoeningen zoals een traumatisch hersen-letsel, beroerte en Multipele Sclerose. Vele van de kern-symptomen van M.E./CVS worden ook gezien bij de klassieke ‘sickness-response’ [lusteloosheid, apathie, enz.] die het gevolg is van de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen door microglia in de hersenen. Bovendien hebben meerdere studies bewijs geleverd voor centrale inflammatie bij M.E./CVS. Analyses van het cerebrospinaal vocht uit lumbaal-punkties vonden gestegen hoeveelheden pro-inflammatoire cytokinen en gedaalde anti-inflammatoire cytokinen bij M.E./CVS-patiënten. [Hornig M et al. Immune network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome with atypical and classical presentations. Translational Psychiatry (2017) 7: e1080 (zie ook ‘Cytokine netwerk-analyse van het cerebrospinaal vocht bij M.E.(cvs)’) /// Natelson BH et al. Spinal fluid abnormalities in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (2005) 12: 52-55 /// Peterson D et al. Cytokines in the cerebrospinal fluids of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mediators of Inflammation (2015) 929720] Op een meer directe manier toonde positron-emissie tomografie (PET) van de 18 kDa translocator proteïne (TSPO) receptor een verhoogde opname in meerdere corticale, sub-corticale en hersenstam-gebieden bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Nakatomi Y. Neuroinflammation in patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: An (1)(1)C-(R)-PK11195 PET study. Journal of Nuclear Medicine (2014) 55: 945-950]. Omdat TSPO-binding verhoogd is wanneer microglia zich in een pro-inflammatoire toestand bevinden, wordt gestegen PET-binding gebruikt als een merker voor neuro-inflammatie.

Hersen-inflammatie bij M.E./CVS werd ook onderzocht via magnetische resonantie spectroscopie (MRS). MRS kan worden gebruikt om de waarden van meerdere metabolieten gerelateerd met neuro-inflammatie, zoals choline-bevattende molekulen (CHO), myo-inositol (MI), lactaat (LAC) en N-acetylaspartaat (NAA), te meten. Enkele studies die gebruik maakten van ‘single’-voxel MRS hebben metabolieten-abnormaliteiten geïdentificeerd in de hersenen van individuen met M.E./CVS. Er werd melding gemaakt van verhoogd CHO in de occipitale cortex [Puri BK et al. Relative increase in choline in the occipital cortex in Chronic Fatigue Syndrome. Acta Psychiatrica Scandinavica (2002) 106: 224-226], frontale witte-hersenstof en basale ganglia [Chaudhuri A et al. Proton magnetic resonance spectroscopy of basal ganglia in Chronic Fatigue Syndrome. Neuroreport (2003) 14: 225-228 (zie ook ‘Metabole veranderingen in spieren en hersenen bij CVS]. Andere studies hebben gestegen LAC in de cerebrale ventrikels van M.E./CVS-patiënten gedetekteerd [bv. Murrough JW et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome measured by 1H MRS imaging at 3.0 T. II: Comparison with major depressive disorder. NMR in Biomedicine (2010) 23: 643-650 /// Natelson BH et al. Elevations of ventricular lactate levels occur in both Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia. Fatigue (2017) 5: 15-20 /// Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. III. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR in Biomedicine (2012) 25: 1073-1087]. Anderen rapporteerden over gedaalde waarden van de axonale merker NAA in de hippocampus van M.E./CVS-patiënten. [Brooks JC et al. Proton magnetic resonance spectroscopy and morphometry of the hippocampus in Chronic Fatigue Syndrome. The British Journal of Radiology (2000) 73: 1206-1208] Het idee dat MRS geschikt is voor het detekteren van inflammatie-gerelateerde veranderingen in de hersenen wordt ook ondersteund door dieren-studies die wijzigingen van metabolieten-concentraties aantonen na toediening van lipopolysaccharide – een gekende inflammatoire stimulus. MRS metabolieten werden ook aangewend om de progressie van gekende inflammatoire aandoeningen, zoals Multipele Sclerose te monitoren, en bleken te correleren met inflammatie-merkers in het cerebrospinaal vocht en met pathologie in menselijke en dierlijke weefsel-stalen.

Een beperking bij eerdere M.E./CVS-studies die gebruik maakten van MRS is dat ze kleine gebieden van de hersenen analyseerden. Daarom stelden we voor, bij deze studie, de MRS-analyse van M.E./CVS uit te breiden door het vastleggen van multi-voxel informatie van het ganse brein. 3D echo-planaire spectroscopische beeldvorming (EPSI) laat beeldvorming toe van de volledige hersenen via het simultaan opnemen van metabolieten-spectra en hun ruimtelijke lokatie in de hersenen. Deze benadering vereist geen a priori hypothesen betreffende de plaats van de pathologie en laat toe het gemiddelde van meerdere voxels te maken om meer betrouwbare informatie qua concentratie-metingen te verkrijgen.

Naast het bekomen van MRS-informatie van de totale hersenen, probeerden we eerdere studies uit te breiden door het meten van de hersen-temperatuur. [De MR-frequentie van water-protonen hangt af van de temperatuur. Men kan de absolute hersen-temperatuur kwantificeren door het monitoren van het verschil tussen de resonantie-frequentie van water en deze van een temperatuur-onafhankelijk metaboliet.] De temperatuur voor een lokatie wordt berekend uit de temperatuur-variante water resonantie-piek t.o.v. de creatine (CR) piek, die resoneert bij 3.0 ppm, ongeacht de temperatuur. De regionale brein-temperatuur werd gebruikt als een benadering voor het meten van neuro-inflammatie, met in het achterhoofd dat microglia-aktivatie [reeds meerdere malen besproken op onze pagina’s] de metabole vereisten kan verhogen, wat mogelijks kan leiden tot overtollige warmte. Er werd een stijging van de hersen-temperatuur gevonden bij meerdere neuro-inflammatoire aandoeningen maar dit werd nog niet getest bij M.E./CVS.

In deze studie gebruikten we EPSI om metabolieten-waarden van de totale hersenen en temperatuur te bekomen van individuen met M.E./CVS en voor leeftijd gematchte controles. Naar ons weten is dit de eerste MRS-studie van de totale hersenen uitgevoerd bij individuen met M.E./CVS. We hypothiseerden dat de M.E./CVS-groep verhoogd CHO, MI, LAC, gestegen hersen-temperatuur en lager NAA zou vertonen dan de controle-groep. Ondersteuning voor deze hypothesen zou consistent zijn met de aanwezigheid van hersen-inflammatie bij M.E./CVS.

Materialen & methodes

Deelnemers

[…] 17 vrouwen met M.E./CVS en 17 voor leeftijd gematchte gezonde vrouwen. […] Inclusie-criteria: (i) tussen 18 en 55 jaar oud; (ii) voldoen aan de Fukuda criteria voor M.E./CVS, zonder de [vage en fel gecontesteerde] Reeves et al. modificaties maar met bijkomende criteria voorgesteld door Jason et al. [gereviseerde Canadese M.E./CVS definitie 2010]; en (iii) gemiddelde zelf-gerapporteerde dagelijkse vermoeidheid-score ≥ 6 op een schaal van 11. […] Exclusie-criteria: (i) MRI veiligheid contra-indicaties; (ii) diagnose van neurologische, belangrijke psychiatrische, auto-immune, reumatologische of inflammatoire aandoeningen; (iii) gebruik van psychostimulanten of opioïden; (iv) roken; of (v) regelmatig gebruik van niet-steroïdale anti-inflammatoire medicijnen (NSAIDs). […]

Studie-protocol

[…] Invullen vragenlijsten (zie hieronder) en meting van lichaamstemperatuur. Na de MRI (ca. 45 min) werd de meting van de lichaamstemperatuur herhaald.

Symptomen-vragenlijsten

‘Fatigue Severity Scale’ (FSS): 9 vragen, schaal van 7 punten (1-7; ‘helemaal niet akkoord’ tot ‘helemaal akkoord’), ontworpen om het verband te beoordelen tussen vermoeidheid-intensiteit en funktionele invaliditeit. ‘Hospital Anxiety and Depression Scale’ (HADS): onderverdeeld in subschalen voor angst (HADS-A) en depressie (HADS-D), telkens 7 items op een schaal van 4 punten (0-3).

Verzameling van beelden

[…]

Verwerking van beelden

[…]

Data-analyse

[…] De metabolieten werden uitgedrukt t.o.v. CR om meer directe vergelijkingen over verschillende studies toe te laten. CR wordt dikwijls gebruikt als interne referentie aangezien de waarden als relatief constant worden aangenomen. Enkele rapporten hebben echter gesuggereerd dat CR niet homogeen verdeeld is in de hersenen en dat de veronderstelling dat de waarden constant blijven misschien wel incorrect is. Daarom testten we de CR-waarden in elk gebied voor de groepen.

Er werden brein-temperatuur kaarten gegenereerd gebruikmakend van het frequentie-verschil tussen de water- en CR-pieken […]. [zie hierboven]

[…]

Statistiek

[…] significantie-drempel van p < 0.05 […]

 

Resultaten

Deelnemers

De gegevens van 4 deelnemers (2 M.E./CVS en 2 controles) werden uitgesloten omwille van zichtbare beweging tijdens de opname, zodat voor elke groep gegevens van 15 deelnemers overbleven. De meest courante co-morbide medische aandoeningen in de M.E./CVS-groep waren gastro-intestinale aandoeningen (n = 3), hypothyroïdisme (gecontroleerd; n = 3), fibromyalgie (n = 2) & astma (n = 2). […]

De groepen verschilden niet significant qua leeftijd. Zoals verwacht rapporteerden de deelnemers in de M.E./CVS-groep een hogere vermoeidheid, alsook meer angst en depressie (HADS). De angst (gemiddelde: 9,67) en depressieve stemming (gemiddelde = 8,00) in de M.E./CVS-groep worden als mild beschouwd. Scores van 11 of hoger duiden op middelmatige ernst en scores van 15 of hoger op hoge ernst. De deelnemers in de M.E./CVS-groep hadden een hogere lichaamstemperatuur (gemiddelde temperatuur aan het trommelvlies vóór en na de scan) [36,97 vs. 36,72].

Voornaamste resultaten

Om de validiteit van CR als de noemer in metabolieten-verhoudingen na te gaan, werden de waarden van dit metaboliet getest tussen de groepen. […] Van de 47 gebieden (AAL [‘anatomical automatic labeling’] atlas [digitale atlas van het menselijk brein]) en de laterale ventrikels, zagen we dat de CR-waarden significant (p < 0.05) verschillend waren tussen de groepen in de linkele parietale cortex en het linker putamen. In de parietale cortex was CR lager in de M.E./CVS-groep dan in de controle-groep (p = 0.028). In het putamen was CR hoger in de M.E./CVS-groep dan bij de controles (p = 0.011). Er waren geen CR-verschillen tussen de groepen in andere gebieden.

[…] Er werden metabole verschillen gezien in meerdere hersen-gebieden. Metabolieten gerelateerd met neuro-inflammatie (CHO, MI & LAC) bleken hoger bij de M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles in meerdere hersen-gebieden. […] Deelnemers met M.E./CVS vertoonden ook een significant lagere NAA/CR in de rechter fusiforme [spoelvormige] en linguale [tongvormige] gyri [gyri (meervoud van gyrus) zijn windingen van de cortex of hersenschors]. Het enige resultaat dat correcties voor multipele vergelijkingen doorstond, was gestegen CHO/CR in de linker anterieure cingulate cortex [de cingulate hersenschors is cruciaal voor cognitie, pijn en emotie] bij deelnemers met M.E./CVS.

De LAC/CR-verhouding in de laterale ventrikels verschilde tussen de groepen (p = 0.057). Statische testen aangaande regionale CBF [cerebrale bloeddoorstroming] gaven aan dat er geen verschillen waren tussen M.E./CVS-patiënten en controles in geen enkel ROI [‘Region Of Interest’; bepaald hersengebied] die metabole verschillen vertoonden. […]

Van de gebieden met metabole verschillen waren er ook meerdere met significante correlaties tussen metabolieten-verhoudingen en zelf-gerapporteerde vermoeidheid op de FSS […], waarbij hogere verhoudingen geassocieerd bleken met hogere vermoeidheid. Geen enkele van de metabolieten-verhoudingen geassocieerd met inflammatie vertoonde negatieve verbanden met vermoeidheid.

CHO/CR in de linker anterieure cingulate vertoonde matig positieve correlaties met angst (p = 0.028), terwijl LAC/CR in het linker Rolandisch operculum [bepaald hersengebied], rechter thalamus en laterale ventrikels matig negatieve correlaties vertoonde met angst (p = 0.017, p = 0.019 & p = 0.046 respectievelijk). CHO/CR in de rechter occipitale cortex was matig positief gecorreleerd met depressie (p = 0.019). Alle andere correlaties waren niet significant (p > 0.05).

De deelnemers met M.E./CVS vertoonden ook een significant hogere gemiddelde hersen-temperatuur dan de controles (p < 0.05) in 5 hersen-gebieden: de rechter frontale cortex, rechter insula, rechter putamen, rechter thalamus en cerebellum. Deze bevindingen doorstonden de correcties voor multipele vergelijkingen niet. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat de hersen-temperatuur verschillen gestuurd werden door de geobserveerde verschillen in lichaamstemperatuur, voerden we significantie-testen uit tussen de temperaturen in de 5 hersen-gebieden en de kern-temperatuur bij de M.E./CVS-groep. De hersen-temperatuur bleek niet significant gecorreleerd met de lichaamstemperatuur voor geen enkele van deze gebieden (rechter frontale cortex: p = 0.224, rechter insula: p = 0.341, rechter putamen: p = 0.715, thalamus: p = 0.759, cerebellum: p = 0.232); wat suggereert dat de verhoogde hersen-temperatuur bij M.E./CVS geen gevolg is van gestegen lichaamstemperatuur.

Bespreking

Voornaamste resultaten

De voornaamste doelstelling van deze studie was het beoordelen van vermoedelijke merkers van neuro-inflammatie in het brein bij M.E./CVS. Vrouwen met M.E./CVS en voor leeftijd gematchte gezonde vrouwen ondergingen MRS van de totale hersenen. We vonden stijgingen van CHO, LAC, MI en temperatuur in meerdere hersen-gebieden bij de M.E./CVS-groep, alsook lagere waarden van de neuronale merker NAA. We toonden dat deze verschillen niet toe te schrijven zijn aan verhoogde lichaamstemperatuur of aan abnormale regionale bloed-toevoer. De metabolieten- en temperatuur-abnormaliteiten kwamen voor in grote delen van het brein en zijn consistent met globale neuro-inflammatie.

Er werd een verhoogd CHO gevonden in de M.E./CVS-groep in de bilaterale anterieure cingulate (ACC), linker middenste cingulate, rechter calcarine sulcus [sulci zijn plooien/gleuven zichtbaar aan het oppervlak van de cortex of hersenschors; de calcarine sulcus is waar de primaire visuele cortex geconcentreerd is], en rechter occipitale en temporale kwabben. Deze resultaten ondersteunen eerder rapporten over verhoogd CHO in M.E./CVS, specifiek in de occipitale cortex [zie Puri BK et al. hierboven]. Omdat slechts vrij CHO en water-oplosbare afbraak-produkten van membraan-componenten (fosfocholine, glycerofosfocholine) detekteerbaar zijn via MRS, werd een overmaat aan CHO geïnterpreteerd als indicatief voor een abnormaal fosfolipiden-metabolisme en een versnelde omzet van cel-membranen, wat consistent is met de processen van gliale proliferatie en demyelinisatie. Hoewel word verwacht dat inflammatie bij M.E./CVS laag-gradig is en wellicht geen demyelinisatie veroorzaakt, hebben eerder diffusie-studies gewezen op subtiele witte-hersenstof abnormaliteiten bij M.E./CVS [Zeineh MM et al. Right arcuate fasciculus abnormality in Chronic Fatigue Syndrome. Radiology (2015) 274: 517-526]. De huidige bevindingen suggereren dat gliale proliferatie aan de basis ligt van deze veranderingen. Verhoogd CHO/CR is consistent met de aanwezigheid van neuro-inflammatie bij patiënten met M.E./CVS.

Het meest significante verschil in de studie was CHO in de linker ACC. We duiden dit gebied in het bijzonder aan omdat dit het enige gebied is dat correcties voor multipele vergelijkingen doorstaat en omdat het werd opgemerkt als een cruciaal gebied dat cytokine-geïnduceerde vermoeidheid en stemming-verslechtering medieert. Door cytokinen geïnduceerde vermoeidheid en depressieve symptomen werden eerder toegeschreven aan inflammatie in de ACC, zoals aangegeven door gestegen glutamaat via MRS. De huidige studie levert bewijs voor de link tussen ACC-inflammatie en vermoeidheid door aan te tonen dat M.E./CVS-patiënten verhoogd CHO in dit gebied vertonen. Hoewel in ons staal de FSS-scores niet significant correleerden met CHO/CR in de linker ACC, zou dit te wijten kunnen zijn aan de kleine groep of mindere sensitiviteit van de meting. We vonden een matige positieve correlatie met angst, wat toont dat ACC-abnormaliteiten kunnen resulteren in een scala aan gedrag-effekten. De correlatie met depressie was niet significant, hoewel dit waarschijnlijk te wijten is aan de lage depressieve symptomen in ons staal.

MI werd in deze studie getest omdat het preferentieel tot expressie komt in gliale cellen, en stijgingen suggereren veranderingen in de densiteit of aktivatie-toestand van microglia en astrocyten die consistent zijn met inflammatoire processen. We vonden dat MI bij M.E./CVS normaal was in bijna alle hersen-gebieden, met uitzondering van een stijging in de rechter globus pallidus [sub-corticale struktuur; belangrijk onderdeel van de basale kernen]. Het is onduidelijk hoe microglia-abnormaliteiten in de globus pallidus geassocieerd kunnen zijn met M.E./CVS, hoewel meerdere studies verbanden vonden tussen vermoeidheid en abnormale verwerking in dit gebied [bv. Ferrero K et al. CNS findings in Chronic Fatigue Syndrome and a neuropathological case report. Journal of Investigative Medicine (2017) 65: 974-983].

Omdat NAA wordt gebruikt als een merker voor neuronale gezondheid in MRS-studies, onderzochten we NAA in de volledige hersenen. NAA bleek over het algemeen normaal, hoewel verhoogd NAA werd gevonden in de rechter linguale en fusiforme gyri [zie hierboven] bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. van controles. Finkelmeyer A et al. [Grey and white matter differences in Chronic Fatigue Syndrome – a voxel-based morphometry study. Neuroimage Clinical (2018) 17: 24-30] rapporteerden volume-stijgingen qua grijze-hersenstof volume in dezelfde gebieden. Vocht-opstapeling zou verantwoordelijk kunnen zijn voor zowel de metabolieten- als strukturele abnormaliteiten, en is consistent met de aanwezigheid van of gelokaliseerde inflammatoire processen. Omdat abnormaliteiten in dit hersen-gebied echter niet dikwijls geassocieerd werden met M.E./CVS, nopen we tot voorzichtigheid omtrent over-interpretatie van deze resultaten.

We vonden verhoogd LAC bij M.E./CVS-patiënten in de bilaterale insula, bilaterale parietale cortex, linker hippocampus, linker middenste cingulate gyrus, linker precuneus, rechter thalamus, rechter Rolandisch operculum, linker temporale cortex, rechter calcarine sulcus, rechter fusiforme gyrus, rechter linguale gyrus en cerebellum. LAC is een nevenprodukt van het anaëroob cel-metabolisme (glycolyse) dat niet aan hoge concentraties wordt gevonden in het gezonde brein, maar wordt geproduceerd door verscheidene immuun-cellen onder inflammatoire omstandigheden. Omdat anaërobe glycolyse resulteert in een veel minder efficiënte synthese van adenosine-trifosfaat (ATP) dan bij een gezond metabolisme, kunnen de resulterende energie-tekorten op cellulair niveau de diepgaande vermoeidheid bepalen die wordt ervaren door M.E./CVS-patiënten [Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants & Redox Signaling (2013) 19: 1855-1860 /// Lawson N et al. Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. Journal of Nature and Science (2016) 2: e221 /// Myhill S et al. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – a clinical audit. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2013) 6: 1-15].

Onze bevindingen ondersteunen meerdere eerdere rapporten van verhoogd LAC in de hersenen van M.E./CVS-patiënten [zie hierboven]. Die studies maakten melding van LAC-abnormaliteiten in de cerebrale ventrikels en we tonen hier dat LAC-stijgingen zich kunnen uitbreiden naar het parenchym [funktioneel orgaan-weefsel]. Hoewel we dit geen replicatie is van de eerder gerapporteerde ventrikulaire LAC-verhogingen, zagen we dat ventrikulair LAC meer dan dubbel zo hoog was in de M.E./CVS-groep in vergelijking met de controle-groep (p = 0.057); dus het gebrek aan statistische resultaten kan deels te wijten zijn aan een onvoldoende ‘power’. Ook: de korte T.E. [echo-tijd = tijd tussen puls en weerkaatsing (electromagnetische resonantie signaal)] die werd gebruikt, kan resulteren in contaminatie van de LAC-piek door lipiden. Bij toekomstige studies gebruikmakend van totaal-brein MRS kan een afzonderlijke scan met een T.E. die geoptimaliseerd is voor LAC vereist zijn.

We onderzochten ook de temperatuur van het ganse brein bij M.E./CVS- en controle-deelnemers. Consistent met onze metabolieten-gegevens en met eerdere meldingen van verhoogde temperatuur bij andere neuro-inflammatoire aandoeningen, vonden we dat individuen met M.E./CVS hogere gemiddelde temperaturen hadden in de rechter frontale cortex, rechter insula, rechter putamen, rechter thalamus en het cerebellum dan de controle-groep. Verhogingen van de hersen-temperatuur waren niet toe te schrijven aan een gestegen lichaamstemperatuur en er waren geen gebieden waar controles hogere hersen-temperaturen dan M.E./CVS-individuen hadden. Temperatuur-stijgingen bij M.E./CVS gingen van 0,28 tot 0,50 °C boven de respectievelijke regionale temperatuur bij controle-deelnemers. De brein-temperaturen in de M.E./CVS-groep waren, gemiddeld, niet verhoogd tot een waarde die als hyperthermisch wordt beschouwd. Het is niet zeker dat de geobserveerde temperatuur-verschillen geassocieerd zijn met neuro-inflammatie. We merken echter op dat 3 van de 5 hersen-gebieden met gestegen temperatuur bij individuen met M.E./CVS ook verhoogd lactaat vertoonden: de rechter insula, rechter thalamus en cerebellum. De samenloop van verhoogd lactaat en gestegen temperatuur in dezelfde gebieden suggereert een verhoogd metabolisme dat gerelateerd kan zijn met neuro-inflammatie.

Beperkingen

Er dienen drie belangrijke aandachtspunten te worden genoteerd betreffende de interpreteerbaarheid van onze bevindingen. Ten eerste: we hebben alle metabolieten-resultaten uitgedrukt als verhoudingen t.o.v. CR i.p.v. als absolute concentraties. Hoewel deze methode directere vergelijkingen tussen laboratoria en scanners toelaat, is dit afhankelijk van de stabiliteit van CR, wat niet kan worden verondersteld. Wanneer dit direct werd getest, vonden we dat CR-waarden verschilden tussen de M.E./CVS-groep en controles in de linker parietale cortex en putamen. Onze bevinding omtrent verhoogd LAC/CR in de linker parietale cortex dient dus omzichtig te worden geïnterpreteerd. Er werden geen significante groep-verschillen qua CR gedetekteerd voor eender welk gebied. Tenslotte had deze kwestie kunnen worden vermeden als absolute metabolieten-concentraties gekwantificeerd werden, hoewel technische moeilijkheden beperken hoe snel dit in de praktijk kan worden gebracht.

Ten tweede: het is moeilijk om vals-positieven en vals-negatieven te voorkomen in gevallen waar de groep betrekkelijk klein is vergeleken met het aantal uitgevoerde testen. We hebben onze resultaten voorgesteld gebruikmakend van niet-gecorrigeerde zowel als FDR-gecorrigeerde [‘false discovery rate’, aantal vals positieve resultaten] p-waarden. De meerderheid van de gebieden bereikte de significantie-drempel niet bij correcties voor multipele vergelijkingen en we roepen op tot omzichtigheid aangaande mogelijke over-interpretatie tot dat de resultaten kunnen worden bevestigd bij een onafhankelijk staal, bij voorkeur met een grotere omvang.

Ten derde: omdat angst en neerslachtige stemming verhoogd bleken in de M.E./CVS-groep t.o.v. controles, is het mogelijk dat de metabolieten- of temperatuur-verschillen tussen de groepen met deze variabelen gerelateerd waren. In feite vonden we matige correlaties tussen angst en depressie, en de metabolieten-verhoudingen in sommige hersen-gebieden. We merken echter op dat gemiddelde scores in de M.E./CVS-groep onder de drempel voor klinische significantie voor depressie of angst lagen, wat betekent dat de invloed van deze variabelen op onze resultaten, als die er al waren, wellicht minimaal waren. Onze analyses onthulden ook dat de correlaties tussen LAC/CR en angst negatief waren, wat het tegengestelde is van wat werd verwacht.

Ten laatste: we merken op dat hoewel metabolieten- en temperatuur-abnormaliteiten bij M.E./CVS-patiënten consistent zijn met de aanwezigheid van neuro-inflammatie, er andere mechanismen – zoals mitochondriale dysfunktie of afwijkende neuronale communicatie – zij kunnen bijdragen tot deze veranderingen. Omdat kan worden aangetoond dat bij veel aandoeningen abnormaliteiten qua MI, CHO, LAC of CHO tot uitdrukking komen, zijn het geen specifieke merkers voor neuro-inflammatie en kunnen wellicht geen unieke diagnostische test voor M.E./CVS zijn. Ons vertrouwen dat metabolieten-abnormaliteiten verband houden met neuro-inflammatie zou sterker worden als er meerdere merkers (bv. MI & CHO) verhoogd zijn in overlappende gebieden.

Besluiten

Deze studie is de eerste die totaal-brein MRS merkers voor neuro-inflammatie onderzocht bij M.E./CVS. We rapporteren metabolieten- en temperatuur-abnormaliteiten bij M.E./CVS-patiënten in wijd-verspreide hersen-gebieden, suggestief voor het feit dat M.E./CVS wordt gestuurd door diffuse pathofysiologische processen die het ganse brein aantasten, i.p.v. eerder regionaal beperkt te zijn, wat consistent is met de heterogeniteit van de klinische symptomen. Onze bevindingen bieden ondersteuning aan de hypothese dat M.E./CVS het resultaat is van chronische, laag-gradige neuro-inflammatie. Hoewel de resultaten preliminair zijn, merken we op dat ze grotendeels overéénkomen met eerdere publicaties die MRS hebben aangewend bij M.E./CVS. Deze resultaten dienen te worden gerepliceerd in toekomstige studies bij grotere aantallen om verder het profiel van pathofysiologische abnormaliteiten in de hersenen van M.E./CVS-patiënten vast te stellen. Uiteindelijk zou de ontwikkeling van gevoelige MRI-merkers voor M.E./CVS een aanvulling kunnen zijn op klinische testen om behandelingen te helpen begeleiden.

————————-

Het is geweten dat neuro-inflammatie een waaier aan symptomen (vermoeidheid, pijn-gevoeligheid, cognitieve problemen, slaap-stoornissen) veroorzaakt. De hypothese van Prof. Younger is dat geaktiveerde immuun-cellen van elders in het lichaam (de darm?) het brein infiltreren. Aangezien de hersenen en het lichaam afzonderlijke immuunsystemen hebben – gescheiden door de zgn. bloed-hersen-barrière (BBB) – gebruiken ze verschillende cellen: microglia in het brein, en T-, B- & NK-cellen in de rest van het lichaam. Bij neuro-inflammatie kan de BBB beschadigd raken waardoor perifere immun-cellen de hersenen kunnen bereiken. Infiltrerende T-cellen zouden dan microglia van het brein kunnen aktiveren naar een inflammatoire toestand. Om dit te onderzoeken wil Younger’s team nu perifere immuun-cellen volgen en bekijken of ze door de BBB gaan en het brein infiltreren. Daartoe werd een nieuwe techniek ontwikkeld (labeling van immuun-cellen met het radio-isotoop zirconium-89 en injektie in patiënten, om ze via een PET-scan te volgen). Daartoe werd financiering voorzien door ‘ME Research UK’.

januari 12, 2019

Metabolomica-biomerkers voor M.E.(cvs) impliceren een redox-onevenwicht

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 9:40 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel kwam mede tot stand door financiering van de ‘National Institutes of Health’ en het ‘Solve ME/CFS Initiative’. Het onderzoek werd mede uitgevoerd door gerenommeerde M.E.(cvs)-onderzoekers. Maureen Hanson heeft overigens een zoon met de ziekte…

De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. De research hier bekeek deze problematiek gebruikmakend van een andere methodologie en de resultaten werden vergeleken met die van een paar andere groepen (in de tekst wordt dan ook veelvuldig verwezen naar Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 & Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480) en naar eerder werk van de eigen groep (Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9).

Het lijkt ons een zeer belangrijk artikel gebaseerd op degelijke wetenschap en waar een brede waaier aan metabolieten (mogelijke biomerkers) wordt bekeken. Ook al is het aantal onderzochte individuen niet ontzettend groot, toch werden enkele interessante bevindingen vastgesteld. Sommige van de biomerkers blijken weerom betrokken bij energie-produktie. Er werden ook vergelijkingen gemaakt met enkele andere ziekten en er blijkt weinig overlapping; d.w.z. M.E.(cvs) is anders dan die aandoeningen, de bevindingen lijken specifiek. Ook de gelijkenissen met resultaten van andere onderzoeksgroepen geeft het werk extra draagkracht; ook al betreft geen ‘echte replicatie’.

De researchers besluiten dat ze meer bewijsmateriaal aandragen voor een dysfunktioneel metabolisme bij M.E.(cvs), en meer bepaald een redox-onevenwicht. Bij redox (een samentrekking van reductie/oxidatie) -reakties verandert de oxidatie-toestand (lees: lading) van atomen. Er worden bij dit proces elektronen overgedragen/uitgewisseld. Eénvoudig gezegd: een atoom ondergaat ‘oxidatie’ (verliest elektronen), een ander ondergaat een ‘reductie’ (neemt elektronen op). In de tekst verwijst men naar de reeds veelvuldig vermelde oxidatieve stress bij ME.(cvs)…

————————-

Metabolites Vol 8, #4, p 90 (december 2018)

Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology

Arnaud Germain (1), David Ruppert (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

2 Department of Statistical Science and School of Operations Research and Information Engineering, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ziekte met een enigmatische oorsprong en zonder vastgestelde geneeswijze. De constellatie van symptomen ruïneert de levens van miljoenen mensen overal ter wereld. Er werd de laatste jaren een plethora aan hypothesen tevergeefs onderzocht: de biologische basis van deze invaliderende aandoening blijft een mysterie. In deze studie onderzochten we of er een verstoring is in de homeostase van metabole netwerken in het plasma van een groep met 32 vrouwelijke patiënten vergeleken met 19 gezonde vrouwelijke controles. Een uitgebreide analyse van de dataset met 832 metabolieten gegenereerd d.m.v. Metabolon®, (die 8 biologische klassen beslaat), leverde belangrijke inzichten op wat betreft metabole ontregelingen die voorkomen bij M.E./CVS. We rapporteren over 14 metabolieten die in verschillende hoeveelheden voorkomen, wat ons toelaat een theorie te ontwikkelen omtrent een omvangrijk redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten, dat consistent is met bevindingen van eerder werk op het gebied van M.E./CVS. Bovendien biedt de analyse informatie betreffende gelijkenissen tussen metabolieten-ontregelingen bij M.E./CVS en deze die voorkomen bij andere ziekten, terwijl de biomerker-analyse ervan toekomstige plasma-biomerkers voor M.E./CVS opleverden. Dit werk voegt belangrijke elementen toe aan de ontwikkeling van M.E./CVS-diagnostiek, een cruciale stap die nodig is voor het ontdekken van een behandeling.

1. Inleiding

[…] Hoewel gegevens die M.E./CVS-deficiënties beschrijven zich blijven opstapelen, is er nog steeds geen verklaring voor de vele symptomen van de ziekte.

We onderzochten de hypothese dat de homeostase van metabole netwerken bij M.E./CVS-patiënten is ontregeld in vergelijking met gezonde controles. Vele studies, o.a. door ons lab, hebben reeds gebruik gemaakt van de snel-evoluerende massa-spectrometrie voor de identificatie van metabolieten en hebben de samenstelling van metabolieten in het bloed bij meerdere afzonderlijke populaties bekeken. Er begint zich een consensus af te tekenen, waarbij gewijzigde mechanismen worden gemeld in verscheidene studies. Namelijk: meerdere studies hebben vastgesteld dat het metabolisme van lipiden, oxidatieve stress and energie relevant is bij M.E./CVS. Jammer genoeg werd niet één enkele of redelijk kleine set metabolieten bepaald als zijnde de basis metabole signatuur van deze aandoening. Niettemin werden statistisch significante verschillen qua plasma- of serum-metabolieten in meerdere groepen aangetoond, gebruikmakend van verscheidene metabolomica-instrumenten, door een reeks deskundige teams. Er werden ook verschillen tussen metabolieten-profielen van vrouwen en mannen met M.E./CVS gezien [Naviaux RK et al.].

In dit rapport werken we verder op 14 metabolieten die verschillend qua hoeveelheid bleken tussen onze vrouwelijke patiënten en gezonde controles, en connecteren deze bevinding met een groter beeld qua dysfunktie van metabole mechanismen. De in de kijker lopende mechanismen sturen ons begrip over de ziekte naar een effekt op redox-reakties, die een focus in verscheidene studies bleken [bv. Richards RS et al. Blood parameters indicative of oxidative stress are associated with symptom expression in Chronic Fatigue Syndrome. Redox. Rep. (2000) 5: 35-41 /// Jammes Y et al. Chronic Fatigue Syndrome: acute infection and history of physical activity affect resting levels and response to exercise of plasma oxidant/antioxidant status and heat-shock proteins. J. Intern. Med. (2012) 272: 74-84 (zie ook ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’) /// Fenouillet E et al. Association of biomarkers with health-related quality of life and history of stressors in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients. J. Transl. Med. (2016) 14: 251]. We tonen aan dat we onze eigen studies kunnen kruis-valideren met gegevens van gepubliceerde rapporten van andere onderzoekers. Het is onze bedoeling dieper onderzoek naar metabolomica bij M.E./CVS te inspireren, met het ontwikkelen van diagnostische testen als doel.

2. Resultaten

2.1. Onderzoeksgroepen

De stalen in deze studie zijn een subset van de populatie die werd geselekteerd voor onze darm-microbioom analyse en een uitbreiding van de piloot-groep die werd gebruikt in onze eerste metabolieten-analyse [Germain A et al.]. Het betreft in het totaal 19 controles en 32 patiënten, allen vrouwen, gematcht voor leeftijd [mediaan controles & patiënten: 50 jaar] en ‘body-mass-index’ (BMI) [mediaan: controles 26,1 – patiënten 24,4]. Alle patiënten voldeden aan de 1994 Fukuda definitie voor M.E./CVS […].

De demografische gegevens waren gelijkaardig met deze van de datasets van Naviaux et al. en Germain et al. wat betreft leeftijd en BMI. De populatie van Armstrong et al. was 15 jaar jonger (geen info over BMI).

2.2. Metabolieten-gegevens en statistische verwerking

Het Metabolon® platform liet de identificatie en meting toe van in het totaal 832 metabolieten […]. De metabolieten-klassen waren: aminozuren (177), koolhydraten (26), co-factoren & vitaminen (28), energie (10), lipiden (353), nucleotiden (29), peptiden (33) en xenobiotica (176). Deze acht super-mechanismen, zoals door Metabolon® gedefinieerd, kunnen verder worden onderverdeeld in 83 sub-mechanismen. […] Hoewel de namen van de meeste super-mechanismen duidelijk zijn, is het relevant om op te merken dat de categorie xenobiotica wordt gevormd door metabolieten behorend tot de volgende sub-mechanismen: benzoaat-metabolisme (11%), chemische stoffen (14%), medicijnen (40%), voeding-componenten/plantaardig (24%), tabak-metabolisme (2%) en xanthine-metabolisme (9%).

[…]

[…] Metabolon® super-mechanismen worden door Metabolon® gedefinieerd volgens uitgebreide ‘review’ van de literatuur maar uiteindelijk ‘in house’, aangezien er vanzelfsprekend meerdere mechanismen zijn waar een molekule kan worden gecategoriseerd. Super-mechanismen zijn het resultaat van een groepering van sub-mechanismen volgens hun belangrijkste kenmerk […]. Sub-mechanismen zijn het resultaat van de klassificatie van metabolieten in de voornaamste metabole mechanismen waartoe ze behoren, zoals overééngekomen bij metabolomica-normen. […]

Statistische verwerking vond 60 metabolieten (7% van de metabolieten-netwerken) met significante verschillen (p < 0.05). […] 50% van deze 60 behoren tot de lipiden-categorie en 15% tot de aminozuren-categorie.

Er werd een correctie uitgevoerd op de p-waarden om te controleren voor ‘false discovery rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]). […] Toegepast op elke biologische klasse metabolieten volgens Metabolon®’s nomenclatuur, kwamen we uit op 9 significant verschillende metabolieten (controles vs. patiënten) [zie hieronder].

2.3. Metabolieten die meest aangetast zijn bij M.E./CVS behoren tot 4 klassen

De 9 metabolieten die hieronder worden besproken, behoren tot de volgende 4 super-mechanismen: co-factoren & vitaminen, energie, nucleotiden en peptiden. […].

Vier van deze metabolieten worden geklassificeerd bij co-factoren & vitaminen. Haem, het pigment dat bloed z’n rode kleur geeft, is één van de meest statistisch verschillende metabolieten, dat veel meer voorkomt bij patiënten t.o.v. controles. Haem bestaat uit een ijzer-ion in het centrum van een grote organische ring en wordt vooral in haemoglobine gevonden, maar ook in enkele andere haemoproteïnen, met wisselende funkties die allemaal verband houden met redox-chemie. Vrij haem is zeer cytotoxisch en schadelijk voor weefsels door z’n pro-oxidatieve en pro-inflammatoire eigenschappen, aangezien het in staat is de vorming van vrije radikalen te katalyseren.

De andere drie metabolieten zijn onderdeel van het vitamine-E mechanisme en waren significant lager bij de patiënten. Vitamine-E [tocoferol] is een vet-oplosbaar anti-oxidant dat de verspreiding van reaktieve zuurstof-soorten door lipiden-membranen te belemmeren. Gamma-CEHC [carboxyethyl-hydrochroman] is de geoxideerde vorm van gamma-tocoferol uit de voeding en is anti-inflammatoir, de andere twee zijn glucuronide-conjugaten van alfa-CEHC en gamma-CEHC, allebei significant circulerend in het bloed.

Een andere metaboliet van belang is alfa-ketoglutaraat, één van de tien energie-metabolieten waar we gegevens over hebben in deze studie. Onze gegevens geven aan dat het hoger is bij de patiënten. Alfa-ketoglutaraat is een essentiële biologische molekule die wordt gevonden in veel biologische mechanismen, verbonden met het aminozuren-metabolisme en onderdeel van de TCA-cyclus, die zich afspeelt in de mitochondrieën, waar chemische energie wordt geproduceerd door de oxidatie van pyruvaat.

De volgende drie metabolieten behoren tot de klasse nucleotiden en komen alle drie minder voor bij patiënten vergeleken met controles. Er is niet veel geweten over 2’-O-methylcytidine, buiten het feit dat het onderdeel is van het pyrimidine-metabolisme. Aan de ander kant zijn adenosine-3’,5’-cyclisch monofosfaat (cAMP) en inosine-5’-monofosfaat (IMP) een deel van het purine-metabolisme, en beide geassocieerd met ATP/AMP, respectievelijk, en zijn zodoende gelinkt met het energie-metabolisme. Hoewel over de funktie van IMP in het bloed nog wordt gediscussieerd, staat cAMP bekend als een a centrale intracellulaire regulator die hormonale mechanismen beïnvloedt.

Ten slotte werd gamma-glutamyl-threonine, een dipeptide [2 aminozuren] uit de klasse peptiden, waarvan significant hogere bloed-waarden werden gedetekteerd bij de patiënten. Afgezien van het feit dat deze molekule een intermediair afbraak-produkt van proteïnen is, is weinig bekend aangaande z’n fysiologisch effekt in het bloed. Het wordt echter geciteerd in een patent als een potentiële biomerker voor lever-toxiciteit.

2.4. De MetaboAnalyst statistische analyse biedt bijkomend waardevol inzicht in de dataset

Dit instrument […] brengt enige biologische significantie in de statistische analyse. Een totaal van 7 metabolieten sprong er boven uit […], twee overlappen met de statistisch significante metabolieten hierboven beschreven: haem en IMP.

Alle andere hiermee geïdentificeerde metabolieten kwamen meer voor bij patiënten dan controles. Deze omvatten tauroursodeoxycholaat (TUDCA; zowel een cytoprotectief agens als een chemisch chaperone [molekule die helpt bij het vouwen of ontvouwen en het op- of afbouwen van macromolekulaire strukturen (proteïnen/DNA)]), 3-hydroxybutyrylcarnitine-1 & 3-hydroxybutyraat (BHBA; allebei betrokken bij ketose [verhoogde concentratie ketonen, veroorzaakt door afbraak van vetzuren], een metabool proces geassocieerd met energie en glucose), piperine (een alkaloïd dat wordt gevonden in kruiden en specerijen) en histamine (een molekule waarvan de betrokkenheid bij veel aspecten in het menselijke lichaam is gekend, inclusief lokale immuun-responsen, een werking als centrale neurotransmitter en een vasodilator).

2.5. De MetaboAnalyst aanrijking-analyse biedt ovetuigende met ziekte geassocieerde plasma metaboliten-sets

Het aanrijking-analyse instrument laat vergelijking toe tussen een te onderzoeken metabolieten-dataset […] en gekende, met ziekte geassocieerde metabolieten-sets. […] Hoewel dit instrument metabolieten identificeert die op de zelfde manier variëren als bij andere ziekten [o.a. obesitas, hart-falen, diabetes-ketoacidose, anoxie, …], is het niet de intentie dit te gebruiken om te impliceren dat alle metabolieten-veranderingen bij M.E./CVS identiek zijn met deze die voorkomen bij bepaalde andere ziekten.

[…] Eén van de intrigerende patronen is dat bij 4 van de 10 beschreven ziekten (40%), een dehydrogenase-, oxidase- of transferase-deficiëntie betrokken is. Die zijn allen mogelijks gelinkt met enig onevenwicht in de redox-toestand aangezien het zeer onwaarschijnlijk is dat ze het resultaat zijn van gen-mutaties in de verscheidene aangetaste mechanismen.

Omdat de statistische betrouwbaarheid van deze module na correctie slecht is […], voerden we dezelfde analyse uit op gepubliceerde datasets, inclusief ons eerder werk, waar een dergelijk instrument nog niet werd gebruikt. Dergelijke navorsingen gaven gelijkaardige resultaten maar met een grotere statistische ‘power’ voor sommige. We namen enkel de ziekten op waar minstens de helft van de metabolieten-veranderingen geassocieerd waren met het patient-fenotype, aangezien het instrument ook resultaten oplevert betreffende wijzigingen die enkel pertinent zijn voor de verschillen qua controle metaboliet-waarden. We hebben opzettelijk gekozen de afzonderlijke metabolieten die door deze module worden gebruikt niet te bespreken (aangezien het niet onze intentie is M.E./CVS te linken met deze ziekten) maar in plaats daarvan mogelijke trends wat ziekte-associatie te bekijken. We bespreken de mogelijke links tussen M.E./CVS-symptomen en gekende fysiologische dysfunkties hieronder.

Van de 10 metabolieten-sets van de Metabolon® dataset, waren er 6 aanwezig bij Armstrong et al. of Germain et al. Dit toont een sterke gemeenschappelijkheid, een kenmerk dat we verder zullen verkennen in 2.7.

Ons eerder werk geeft overvloedige voorbeelden van dehydrogenase-, carboxylase-, hydrolase- & transferase-aktiviteit deficiënties, enkele spier-gerelateerde aandoeningen door varianten van carnitine-deficiënties, en enkele suiker-gerelateerde onevenwichten. De Armstrong et al. dataset levert ook talrijke dehydrogenase- & carboxylase-defekten op. Globaal overheersen dehydrogenase-, transferase- & oxidase-deficiënties, en een dergelijk patroon leidt tot onze suggestie dat een algemeen onevenwicht een dergelijk type reakties belemmert.

Een opvallende aandoening die werd gevonden in de dataset-analyse is anoxie (samen met asfyxie [zuurstof-tekort/verstikking]), een extreme vorm van hypoxie, wanneer het lichaam (of een gebied) over extreem weinig zuurstof beschikt. Bij een gezonde persoon die lijdt onder hypoxie, treedt vermoeidheid, verwarring, hoofdpijn en dof gevoel in de ledematen op, allemaal symptomen die optreden bij M.E./CVS-patiënten. De zuurstof-status van weefsels kan mogelijks aangetast worden door de ontwrichting van de hoeveelheid haem die we beschreven. Gedaalde cerebrale bloeddoorstroming, die kan resulteren in inadequate brein-oxygenatie, is een hypothese gelinkt met de cognitieve stoornissen bij M.E./CVS-patiënten [Biswal B et al. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J. Neurol. Sci. (2011) 301: 9-11 /// Staud R et al. Task related cerebral blood flow changes of patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin labeling study. Fatigue (2018) 6: 63-79].

Veel ziekten gerelateerd met ketose keren ook terug in de analyse en zijn het gevolg van een overmatige toename van ketonen in het bloed, een proces dat hierboven werd vernoemd bij het bespreken van 3-hydroxybutyraat (BHBA) en 3-hydroxybutyrylcarnitine-1. Bv.: diabetes-ketoacidose resulteert uit een onvermogen om koolhydraten te gebruiken voor energie-voorziening, leidend tot metabolisme van vetten en zodoende enige verstoring van het gebruik van koolhydraten bij M.E./CVS.

Ten slotte: persistente hyperinsulinemische [te veel insuline in het bloed] hypoglycemie bij kinderen (PHHI) was een andere ziekte die werd gevonden in twee datasets en die mogelijks kan worden gelinkt met hersen-aktiviteit. Andere ziekten die het vermelden waard zijn met betrekking tot hersen-funktie betreffen correlaties met metabolieten die worden gevonden bij schizofrenie, toevallen en epilepsie, alsook meerdere syndromen waarbij de gezondheid van de ogen betrokken is. In het bijzonder: een courant symptoom bij M.E./CVS-patiënten is de extreme gevoeligheid voor licht.

2.6. De MetaboAnalyst biomerker-analyse levert toekomstige (plasma)biomerkers op voor M.E./CVS

Het ‘machine-learning’ attribuut dat wordt gebruikt om het diagnostisch vermogen te illustreren is de ‘receiver operating characteristic’ curve (ROC-curve), die echt-positieven en vals-positiven integreert. De resulterende grafiek laat de berekening toe van een ‘area under the curve’ (AUC): hogere waarden wijzen op een hogere waarschijnlijkheid van accurate klassificatie van een staal.

De hoogste voorspellende waarden werden bereikt met pyroglutamine [metaboliet in de glutathion-cyclus] en haem: AUCs van 0.75.

Globaal waren er 24 metabolieten met een AUC boven 0.70 [AUC (maat voor diagnostische accuraatheid = 1 betekent perfekt; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] (inclusief haem, tauroursodeoxycholaat, gamma-CEHC, gamma-CEHC-glucuronide, IMP, alfa-ketoglutaraat, terwijl veel van de andere molekulen lipiden zijn).

2.7. Analyse geeft aan dat bijna 100% van de kruis-geïdentificeerde metabolieten een gelijkaardig statistisch gedrag vertoont tussen studies

De toepassing van metabolomica op M.E./CVS-stalen staat nog in z’n kinderschoenen: er zijn nog maar enkele studies gepubliceerd. Om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen research-teams, met afzonderlijke populaties en metabolieten-identificatie technologieën, te beoordelen, besloten we paarsgewijze vergelijkingen uit te voeren. Er dient te worden opgemerkt dat als de ziekte geen effekt vertoont in elk van de twee studies, dat onze test dan niet-significant zal zijn.

De eerste vergelijking was deze tussen onze Metabolon® dataset en Germain et al., die een kleinere maar gedeeltelijk overlappende populatie op een verschillende massa-spectrometrie platform gebruikte. De vergelijking betrof 149 metabolieten met dezelfde HMDB [‘Human Metabolome Database’] -identiteit. De hypothese die werd getest was dat het gemiddeld verschil […] tussen controles en patiënten dezelfde is voor beide studies. Geen van de gevonden metabolieten-patronen bleek te verschillen tussen de twee studies.

We gingen dan over tot het vergelijken van de volledige Metabolon® dataset met alle gegevens van Germain et al. In dit geval bleken 145 van de 149 metabolieten zich anders te gedragen […] op 4 uitzonderingen na: dihydrothymine [intermediair in het metabolisme van het nucleotide thymine], taurine [zwavel-bevattend organisch zuur met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie; bleek al van belang voor de differentiatie tussen FM en controles], spermidine [inhibeert stikstofoxide-synthase] en acetylcarnosine [anti-oxidant], die allen significant verschillend bleken tussen controles en patiënten bij Germain et al.

De volgende vergelijking betrof de volledige Metabolon® dataset en de vrouwen-dataset van Naviaux et al. Van de 154 metabolieten met dezelfde HMDB-identiteiten bleken er slechts twee, adenosine en flavine-adenine-dinucleotide (FAD), statistisch verschillend tussen de twee studies. Dit verschil kan te wijten zijn aan de afname-methode van het plasma (EDTA voor onze stalen, lithium-heparine bij Naviaux et al.).

Een andere vergelijking was een dataset van Armstrong et al. en de volledige Metabolon® dataset. Alhoewel slechts 26 metabolieten gemeenschappelijke HMDB-IDs hadden, gedroegen er zich 14 statistisch op dezelfde manier.

De uiteindelijke combinaties omvatten Germain et al. & Armstrong et al., Germain et al. & Naviaux et al., en Armstrong et al. & Naviaux et al.; en de resultaten waren zeer gelijkaardig: respectievelijk 87%, 98% en 91% van de metabolieten die zich statistisch niet verschillend gedroegen.

Belangrijk is het terugkerend verschijnen van hypoxanthine [afgeleide van purinen, bouwstenen van nucleïnezuren], een metaboliet dat significant verschillende bleek tussen de studies, samen met enkele andere metabolieten, altijd bij vergelijkingen met de Armstrong et al. dataset. Het is belangrijk om op te merken dat de Armstrong dataset werd verkregen via analyse van serum i.p.v. plasma (wat werd gebruikt bij alle andere studies). Alhoewel plasma en serum onderdelen van totaal bloed zijn, werden significante verschillen qua metabolieten-profielen aangetoond.

2.8. Hiërarchische clustering levert geen definitieve subgroep-identificatie op

Eén van de hypotheses betreffende M.E./CVS is dat verschillende fundamentele ontwrichtingen optreden in verschillende groepen patiënten die dezelfde invaliderende symptomen blijken te vertonen. De aanwezigheid van patiënten-subsets kan verklaren waarom statistische significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten als groep en een groep gezonde individuen soms niet worden gezien. Het bestaan van subgroepen patiënten-types werd ook gesuggereerd ter verklaring van het feit waarom tegenstrijdigheid tussen studies wordt vastgesteld voor sommige metingen en waarom de responsen op behandeling verschillen tussen patiënten-populaties.

Er werd een ‘clustering’-analyse op de Metabolon® dataset uitgevoerd in een poging om potentiële onderscheidende metabole signaturen binnen de patiënten-populaties te identificeren. Er werd geen significant resultaat gevonden: noch bij gebruik van de volledige set metabolieten, noch bij de individuele super-mechanismen. Hetzelfde besluit werd bereikt wanneer de analyse geïmplementeerd werd op de controle-groep (gegevens niet getoond).

Er werd een identieke ‘clustering’-analyse uitgevoerd op elk van de andere drie beschikbare datasets, voor dewelke geen super-mechanisme klassificatie beschikbaar was. Bij gebruik van enkel de patiënten van Germain et al., lagen de p-waarden tussen 0.940 en 0.954 (mediaan 0.946). Voor de Naviaux et al. dataset lagen de p-waarden tussen 0.990 en 0.998 (mediaan 0.992). Voor Armstrong et al. lagen de p-waarden tussen 0.008 en 0.032 (mediaan 0.020), wat maakte dat dit de enige dataset was waar subgroepering evident was. Om deze bevinding verder te onderzoeken, werd hiërarchische ‘clustering’ toegepast op de Armstrong at al. dataset […]. We zagen slechts twee individuen die zich ietwat onderscheiden van de rest; […] er was slechts zwak bewijs voor subgroepering. […]

3. Bespreking

De grootte van de populatie van deze studie is vergelijkbaar met gepubliceerd werk zoals door Naviaux et al. & Armstrong et al., en is een uitbreiding van de groep die we gebruikten voor onze eerdere poging. Bovendien is het substantieel aantal gekwantificeerde metabolieten (832) opmerkelijk groter dan de 420 molekulen van Naviaux et al., de 361 van Germain et al. of de 29 van Armstrong et al. Ongetwijfeld werd de statistische ‘power’ van onze analyse verzwakt door de combinatie van een populatie van 51 individuen en een reeks van 832 metabolieten, wat het beperkt aantal metabolieten verklaart die we als significant verschillend kunnen bestempelen […]. Niettemin werpen onze bevindingen, door de uitgebreide analyse van onze dataset, een licht op een intrigerend aspect van het dysfunktioneel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten, met betrekking tot de redox-toestand.

Van de vier verstoorde biologische klassen in onze groep, bevatten de categorieën ‘nucleotiden’ en ‘peptiden’ metabolieten die potentieel brede repercussies hebben op biologische funkties. Bv.: cAMP en IMP zijn molekulen waarvan is geweten dat ze betrokken zijn bij veel aspecten van het funktioneren van het menselijk lichaam, zoals purine-metabolisme, opslag van chemische energie in spieren en intracellulaire signaal-overdracht. Het is daarom ontzettend moeilijk een uniek mechanisme gelinkt met M.E./CVS-toestand of -symptomen op basis van dergelijke molekulen of, anderzijds, molekulen waarvan weinig of niets is geweten (zoals 2’-O-methylcytidine of gamma-glutamylthreonine) aan te wijzen. Deze laatste molekule wordt echter in een patent genoemd als potentieel belangrijke molekule (onder andere biomerkers) ter bepaling van lever-toxiciteit. De resultaten van ons eerder werk focusten op biomerkers voor lever-letsel.

Een ander zeer belangrijk metaboliet is alfa-ketoglutaraat omdat het deel uitmaakt van het ‘energie’ super-mechanisme en de TCA cyclus. Inderdaad: de Krebs-cyclus is een mechanisme dat consistent aan de oppervlakte komt bij M.E./CVS-metabolomica analyse. Omdat vermoeidheid een belangrijk uitputtend symptoom van deze ziekte is, werd lang gespeculeerd dat het energie-metabolisme van de patiënten dysfunktioneel is. Verscheidene studies wijzen op een directe manier naar een abnormaal energie-metabolisme te wijten aan falende TCA- en ureum-cycli of indirect via een vermoedelijke stoornis van pyruvaat-dehydrogenase [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Een piloot-studie met een gepatenteerd voedingsupplement waarvan wordt gesteld dat het de aktiviteit van dit enzyme – en bijgevolg de Krebs-cyclus – aanwakkert, beschrijft substantiële verbeteringen van de gezondheid en conditie van behandelde patiënten [Comhaire F. A novel nutriceutical treatment of Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”. Intern. Med. (2017) 7: 5 (zie ook ‘Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?’)]. Niettemin is alfa-ketoglutaraat betrokken bij talrijke metabole mechanismen (zoals het carnitine-metabolisme, lysine-metabolisme en dat van de vertakte aminozuren, om er enkele te noemen), zodat een focus op één enkel mechanisme als basis voor de invaliderende symptomen van M.E./CVS tot nu toe niet gerechtvaardigd is.

De categorie ‘co-factoren en vitaminen’ omvat metabolieten met ongelijksoortige eigenschappen, zoals geïllustreerd door haem & gamma-CEHC. In onze groep werden hogere waarden van haem, onderdeel van het haemoglobine- en porfyrine-metabolisme, en lagere waarden van gamma-CEHC, onderdeel van het tocoferol-metabolisme, gemeten bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Haem is een vitale component van vele metalloproteïnen (met haemoglobine als best bekende) en wordt gesynthetiseerd in de lever en het beenmerg. Aangezien de staal-voorbereiding bij Metabolon® op methanol is gebaseerd, wordt precipitatie van proteïnen verwacht maar aan proteïnen gebonden haem kan dan nog worden afgegeven […]. Omdat we plasma (cel-vrij) gebruikten, wordt er een grotere bijdrage van ‘vrij haem’ aan de meting van de hoeveelheid haem geanticipeerd, tenzij er substantiële haemolyse [kapotgaan van rode bloedcellen waardoor haemoglobine in het bloed terecht komt] optrad. Een hoge concentratie vrij haem in het plasma is een biomerker voor de ernst van sikkelcel-ziekte [rode bloedcellen hebben een abnormale vorm door abnormaal haemoglobine], waarbij gestegen waarden qua inflammatoire biomerkers zoals lactaat-dehydrogenase, bilirubine, een hoog aantal reticulocyten [voorlopers van rode bloedcellen] en lipiden worden gedetekteerd. We bepaalden drie vormen van bilirubine en biliverdine [afbraakprodukten van haemoglobine] in onze stalen die ook meer aanwezig bleken bij patiënten vs. controles; wat wijst op een algemene verstoring van het haem-afbraak mechanisme, waarvan de laatste stap in de lever gebeurt. Alle vijf molekulen hebben sterk nadelige effekten die verbonden zijn met het genereren van vrije radikalen en er wordt beweerd dat hun afbraak onderdeel is van een cel-beschermende feedback in respons op oxidatieve stress. In tegenstelling daarmee zijn gamma-CEHC, samen met gamma-CEHC-glucuronide en alfa-CEHC-glucuronide (metabolieten van het vitamine-E mechanisme), dat anti-inflammatoire kenmerken heeft (zoals een werking als lipofiel anti-oxidant). Ons eerder werk [piloot-studie; zie ref. in onze inleiding] suggereerde ook een ontwrichting van het vitamine-E metabolisme ten gevolge de detektie van [z’n metaboliet] 13’-carboxy-alfa-tocoferol, wat jammer genoeg niet aanwezig is in deze dataset.

Veel M.E./CVS-patiënten rapporteren zelf dat gespecialiseerde diëten en supplementen hun symptomen verlichten. Dergelijk gedrag is wijdverspreid in patiënten-gemeenschappen van veel ziekten, inclusief M.E./CVS, fibromyalgie en kanker (om er maar enkele te noemen) [bv. Craig C. Mitoprotective dietary approaches for Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome: Caloric restriction, fasting and ketogenic diets. Med. Hypotheses. (2015) 85: 690-693 /// Lopez-Rodriguez MM et al. Patterns of food avoidance and eating behavior in women with fibromyalgia. Endocrinol. Diab. Nutr. (2017) 64: 480-490]. Gezien de exclusie van voorgeschreven farmaceutica, kunnen dergelijke voeding-benaderingen worden gedefinieerd als voeding-restricties of geassocieerd met specifieke supplementen waarvan wordt gedacht dat ze voordelige effekten tegen inflammatie, cardiovasculaire problemen of veroudering opleveren. Er werd door andere patiënten gerapporteerd dat het diëten om een mogelijke tarwe-gevoeligheid bij sommigen te verbeteren of ketogene dieten en vasten, nuttig zijn. Veel patiënten beschouwen enkele supplementen (inclusief NADH, coenzyme-Q10 of polyfenolen) nuttig, hoewel systematisch beoordeling van studie-uitkomsten geen aanleiding geeft tot duidelijke aanbevelingen. Een gemeenschappelijk iets in al het geciteerde werk aangaande voeding bij M.E./CVS kan echter worden gevonden in het redox-metabolisme. Het is duidelijk dat ons huidig werk en andere rapporteren suggereren dat nutritionele veranderingen van nut kunnen zijn voor patiënten, hoewel verder onderzoek nodig is vooraleer aanbevelingen kunnen worden gemaakt.

Een ambitieus doel wat betreft de toepassing van ongerichte metabolomica op M.E./CVS-stalen is het peilen naar een patroon dat ons beperkt begrip van deze ziekte kan uitbreiden. De aanrijking-analyse ‘unit’ van MetaboAnalyst onthulde een mogelijk onevenwicht in de redox-toestand van de patiënten, aangezien hun metabole profielen overéénkwamen met meerdere aandoeningen die niet gerelateerd zijn met elkaar, maar waar bij alle redox enzymatische reakties betrokken zijn. Onze hypothese is dat een verstoring van de redox-toestand de status van donoren en acceptoren van chemische reakties aslook hun co-enzymen (zoals NAD+/NADH, FAD+/FADH voor dehydrogenasen) beïnvloedt. Oxidasen zouden vanzelfsprekend ook aangetast zijn als katalysatoren van redox-reakties. Veel transferase katalytische aktiviteiten kunnen worden beïnvloed door de redox-toestand van hun omgeving en veel ziekten worden veroorzaakt door transferase-deficiënties. Bv.: succinyl-CoA:3-ketoacid-CoA transferase deficiëntie leidt tot een toename van ketonen en diabetes-ketoacidose […]. Carnitine-palmitoyl-transferase deficiëntie II (CPT II) is een ander voorbeeld waarbij het vetzuren-metabolisme ontwricht is door het gebrek aan transport van lange-keten vetzuren naar de mitochondrieën, waar ze worden gebruikt als brandstof-bron.

Anoxie is één van de met ziekte geassocieerde metabolieten-sets, een aandoening die ook opdook gebruikmakend van de Armstrong et al. dataset (gegevens niet getoond), en samen met asfyxie in de Germain et al. dataset (gegevens niet getoond). Het M.E./CVS metabolieten-profiel vertoont ook gelijkenissen met dat van kinderen die hypoxisch-ischemische encefalopathe (HIE) ontwikkelen door zuurstof-deprivatie. Anoxie en asfyxie zijn beide verbonden met het gebrek aan zuurstof, wat duidelijk ernstige repercussies kan hebben op spier- en lichamelijke aktiviteit. Het onvermogen om adequaat zuurstof te leveren aan spieren is evident in studies van de respons op inspanning bij in M.E./CVS-patiënten [bv. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J. Transl. Med. (2010) 8: 93 /// Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492]. Bovendien is de oxygenatie van de pre-frontale cortex in het brein verminderd bij inspanning in M.E./CVS-patiënten [Neary JP et al. Prefrontal cortex oxygenation during incremental exercise in Chronic Fatigue Syndrome. Clin. Physiol. Funct. (2008) 28: 364-372]. Veel personen met M.E./CVS vertonen een gedaald bloed-volume, wat de oxygenatie van veel weefsels aantast [Streeten DHP et al. The roles of orthostatic hypotension, orthostatic tachycardia and subnormal erythrocyte volume in the pathogenesis of the Chronic Fatigue Syndrome. Am. J. Med. Sci. (2000) 320: 1-8 /// Streeten DHP & Bell DS. Circulating blood volume in Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2011) 4: 3-11]. Verstoringen van de circulatie en zuurvoorziening naar de weefsels kan aan de basis liggen van veel symptomen van M.E./CVS. Hypoxie resulteert in het genereren van reaktieve zuurstof-soorten in de mitochondrieën, met als gevolg de aktivatie van beschermende systemen.

Er werd een verband van oxidatieve stress met M.E./CVS gerapporteerd in een aantal M.E./CVS-studies. Van belang: bij het meten van gekende merkers voor oxidatieve stress, vonden Richards et al. [zie ref. hierboven] dat methaemoglobine [ontstaat als het tweewaardig ijzer (Fe2+) in haemoglobine door oxidatie wordt omgezet in driewaardig ijzer (Fe3+)] één van de voornaamste componenten was die hun M.E./CVS-patiënten van controles differentieerden. Deze vorm van haemoglobine draagt de geoxideerde vorm of het ijzer-ion […] die nodig is opdat haemoglobine zuurstof kan binden. Zelfs al maken methaemoglobine-metingen geen deel uit van onze dataset, is het intrigerend om de oxidatie-toestand te verbinden met een verstoord redox-milieu, terwijl het effekt van het onvermogen zuurstof te binden zich kan vertalen naar anoxie en asfyxie.

M.E./CVS-biomerkers, als een middel voor ondubbelzinnige diagnose en monitoring van de doeltreffendheid van behandelingen, zijn één van de dringend noodzakelijke ontwikkelingen op dit gebied. Er werden ROC-analyse gegevens gegenereerd met doel in gedachten. De hoogste voorspellende waarde bleek 0.75 AUC [zie resultaten]. Toekomstig werk waarbij een grotere en onafhankelijke groep wordt geanalyseerd en vergeleken met andere vermoeiende ziekten zal waarschijnlijk de voorspellende waarde verhogen en onthullen of plasma metabolomica kunnen dienen als betrouwbaar instrument voor objectieve identificatie en monitoring van M.E./CVS-patiënten.

4. Materialen & methodes

4.1. Staalname & metabolomica-platform

[…] Metabolon® ‘Global Metabolomics’: ‘ultra-high-performance’ vloeistof-chromatografie/ tandem massa-spectrometrie (UHPLC/MS/MS) laat accurate relatieve kwantificatie van honderden metabolieten uit verscheidene categorieën molekulen.

4.2. Gegevens-analysis via MetaboAnalyst

[] Een uitgebreid instrument voor metabolomica-analyse en -interpretatie (www.metaboanalyst.ca).

4.3. Interne gegevens-analysis

[]

5. Besluiten

In deze studie rapporteren we over een metabolomica-profiel van een relatief kleine groep. Ondanks statistische uitdagingen, leveren we toch meer bewijsmateriaal voor een redox-onevenwicht bij M.E./CVS-patiënten. De rationale achter onze theorie wordt ondersteund door parallellen met onze eerdere studie en beschikbare datasets van andere teams. De patiënten-groepen die in onze studies en die van anderen werden gebruikt, verschillen qua geografische ligging, dieet, behandel-regimes, maar toch zijn er opmerkelijke gelijkenissen bij de bevindingen. Zodoende kunnen metabolomica een fundamenteel kenmerk onthullen van de ontwrichting die optreedt in slachtoffers van M.E./CVS.

oktober 6, 2018

Gewijzigde samenstelling & funktie van het oraal microbioom bij CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 6:05 am
Tags: , , ,

Er werden al wijzigingen in de microbiële gemeenschappen van M.E.(cvs)-patiënten gedetekteerd. Nu vond men deze (weliswaar andere) ook in de mondholte. Wederom waren er aanwijzingen voor een verstoord metabolisme.

Of dit een oorzaak of gevolg is blijft nog open… Het blijft momenteel nog te voorbarig om verregaande conclusies te trekken – dat geven de auteurs zelf aan – maar het vinden van indicaties over metabole verstoringen blijkt consistent.

————————-

Plos One Vol 13, #9, p e0203503 (september 2018)

Chronic Fatigue Syndrome patients have alterations in their oral microbiome composition and function

Taiwu Wang (1,2), Lei Yu (1), Cong Xu (1), Keli Pan (1), Minglu Mo (1), Mingxiang Duan (1), Yao Zhang (1), Hongyan Xiong (1)

1 Department of Epidemiology, College of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, People’s Republic of China

2 Research Institute for Medicine of Nanjing Command, Nanjing, P.R. China, Nanjing, China

Samenvatting

Gastheer/microben interakties bleken geïmpliceerd bij de pathogenese van Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), maar of het oraal microbioom gewijzigd is bij CVS-patiënten is ongeweten. We verkenden veranderingen van het oraal microbioom bij Chinese Han CVS-patiënten gebruikmakend van 16S rRNA gen sequentie-bepaling en wijzigingen qua funktioneel potentieel van het oraal microbioom d.m.v. PICRUSt. We vonden dat de Shannon & Simpson diversiteit-indexen niet verschillend waren bij CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, maar de globale samenstelling van het oraal microbioom was anders (p < 0.01). CVS-patiënten hadden een hogere relatieve hoeveelheid Fusobacteria vergeleken met gezonde controles. Verder waren de geslachten Leptotrichia, Prevotella & Fusobacterium aangerijkt, en Haemophilus, Veillonella & Porphyromonas verminderd bij CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Funktionele analyse van afgeleide metagenomen toonde dat de bij CVS gewijzigde bakteriële geslachten voornamelijk waren geassocieerd met het aminozuren- en energie-metabolisme. Onze bevindingen tonen aan dat het oraal microbioom bij CVS-patiënten verschillend is van dat bij gezonde controles, en deze verschillen leiden tot verschuivingen qua funktionele mechanismen met implicaties voor CVS-pathogenese. Deze bevindingen verhogen onze kennis over de relatie tussen de orale microbiota en CVS, wat ons begrip omtrent CVS-pathogenese zal vooruit helpen en kan bijdragen aan toekomstige verbeteringen naar behandeling en diagnose toe.

Inleiding

Bakterieën koloniseren de mondholte snel na de geboorte en deze worden stabiel in meerdere niches binnen dit ecosysteem. Deze orale bakteriële gemeenschappen, of microbioom, bevatten 1.000 verschillende soorten en zijn zeer complex. Het oraal microbioom is de tweede meest complexe bakteriële gemeenschap in het lichaam, na dat van de dikke darm. Het oraal microbioom is geassocieerd met orale ziekten, alsook tand-bederf, endodontische infekties [van het tand-wortelkanaal], gingivitis [ontsteking van het tandvlees] en periodontitis [paradontitis; ontsteking van het weefsel rond de tanden], en ook met niet-orale ziekten [pancreas]. In een […] ‘case’-controle studie bleken Porphyromonas gingivalis & Aggregatibacter actionmycetemcomitans, leden van het oraal microbioom, geassocieerd met een verhoogd risico op pancreas-kanker, terwijl het fylum [de stam] Fusobacteria en z’n geslacht Leptotrichia geassocieerd bleken met een verlaagd risico op pancreas-kanker. Verder zijn veranderingen qua samenstelling van bakterieën aanwezig in het oraal microbioom geassocieerd met intestinale dysbiose in muis-modellen voor colitis [inflammatie van de darmwand]. Bijkomend bewijsmateriaal heeft aangetoond dat het oraal microbioom niet enkel een belangrijke rol speelt bij ziekte-toestanden maar bij de gezondheid van mensen, inclusief bij de immuun-respons, het metabolisme en vertering van nutriënten.

[…] De oorzaak van CVS blijft onbekend.

Hoewel de etiologie van CVS nog ongekend is, suggereert bewijsmateriaal dat een complexe wisselwerking tussen genetische, milieu- en microbiële factoren betrokken is bij de oorzaak. CVS is een systeem-ziekte die kan optreden met inflammatoire symptomen; bv. inflammatie van de orale mucosa [slijmvlies; in dit geval van de mondholte] wordt courant beschreven bij patiënten met CVS. Hoewel wijzigingen van de darm-microbiota geassocieerd bleken met CVS [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Mandarano AH et al. Eukaryotes in the gut microbiota in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. PeerJ. (2018) 6: e4282], werden veranderingen qua orale microbiota bij CVS-patiënten niet bestudeerd. Het oraal microbioom verdient te worden verkend omdat deze microbiële gemeenschap kan bijdragen tot CVS-symptomen en omdat bakterieën van het oraal microbioom een bron kunnen zijn van niet-invasieve biomerkers voor CVS. Om te begrijpen of er wijzigingen optreden in het oraal microbioom van CVS-patiënten voerden we daarom een uitgebreide beoordeling uit van de samenstelling van het oraal microbioom en de hoeveelheden van individuele taxa [meervoud van taxon – taxonomische groepen; organismen die samen een éénheid vormen] d.m.v. sequentie-bepaling van bakterieel 16S rRNA bij CVS-patiënten en gematchte controles. Daarnaast voorspelde een analyse uitgevoerd d.m.v. PICRUSt [‘phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states’; een computer-techniek om de funktionele samenstelling van een metagenoom te voorspellen, gebruikmakend van merker-genen uit een database met referentie-genomen] de funktionaliteit van het bakterieel metagenoom op basis van de 16S rRNA genen. Deze studie zal wijzigingen in de samenstelling van het oraal microbioom en de funktie bij CVS-patiënten in de Chinese Han populatie [grootste etnische groep van China] blootleggen.

Materialen & methodes

Recrutering

[…] Fukuda criteria voor CVS […]. Patiënten met epilepsie, inflammatoire darm-ziekte, type-1 diabetes, chronische obstructieve long-ziekte, psoriasis, Reumatoïde Artritis en Lupus Erythematosus werden uitgesloten. Controles werden gematcht voor leeftijd, geslacht en body-mass-index […]. De gezonde controles werden ook uitgesloten op basis van de volgende criteria: individuen met symptomen gelijkaardig als bij een CVS-diagnose en met een virale infektie, aktieve bakteriële, schimmel- of orale ziekte zoals gingivitis en/of periodontitis. De controles hadden geen antibiotica, probiotica, prebiotica of synbiotica genomen 2 maanden voor speeksel-stalen werden verzameld.

[…]

DNA-extractie, amplificatie van bakterieel 16S rRNA & sequentie-bepaling

[…]

Bio-informatica & statistische analyse

[…]

We wenden een ‘machine-learning’ benadering aan om CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles. Voor deze analyses gebruikten we taxon-hoeveelheden gebaseerd op ‘operational taxonomic units’ [OTUs; refereert naar clusters van organismen gegroepeerd op basis van DNA-sequentie gelijkenis van een specifiek merker-gen] op verschillende niveaus. Er werd logistische regressie [een statistische methode] aangewend om de CVS-patiënten te klassificeren en ‘area under the curve’ (AUC [maatstaf voor de diagnostische accuraatheid]) om de prestaties te evalueren […]. We gebruikten PICRUSt om de bakteriële metagenoom-inhoud van op 16S rRNA gen gebaseerde microbiële samenstellingen te voorspellen en funkties te voorspellen […]. Funkties worden afegeleid op basis van de ‘Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes’ (KEGG) [een database die genomische, chemische systemische funktionele informatie bevat]. Er werd ‘statistical analysis of metagenomic profiles’ (STAMP [grafische software voor de analyse van taxonomische en funktionele profielen] gebruikt om verschillen qua in KEGG-funkties te bepalen.

Resultaten

Deelnemers aan de studie

De 91 deelnemers (46 CVS-patiënten en 45 gezonde controles) verschilden niet qua leeftijd (37,43 ± 7,53 vs. 36,98 ± 7,23, p = 0.31), geslacht (man/vrouw) (32/14 vs. 30/15, p = 0.94) of BMI (24,53 ± 3,23 vs 23,86 ± 3,58, p = 0.35). […]

Overzicht van 16S rRNA sequentie-bepaling: sequenties, kwaliteit-analyse & geïdentificeerde taxa

Sequentie-bepaling van het 16s rRNA gen uit de mondholte van onze 91 individuen leverde 2.753.405 ruwe sequenties op (18.615 tot 44.950 ‘reads’ [een ‘read’ is het resultaat van een sequentie-bepaling (volgorde van de base-paren of nucletioden)] van 420-460 baseparen met een gemiddelde lengte van 445 bp). […] Na kwaliteit-controle bleven 15.340 ‘reads’ van hoge kwaliteit per staal over voor verdere analyse. De omvang in de 2 groepen voor alle stalen was ca. 99,6%, wat suggereert dat de meeste kenmerken werden in beslag genomen en dat de diepte van de sequentie-bepaling voor het onderzoeken van met CVS geassocieerde orale microbiota voldoende is.

Wijzigingen in de globale samenstelling

Na de kwaliteit-controles werd de bakteriële diversiteit bepaald op basis van de Shannon & Simpson indexen [kwantitatieve metingen die weerspiegelen hoeveel verschillende types er in een gemeenschap aanwezig zijn en hoe gelijkmatig ze verdeeld zijn], die de gemiddelde rijkdom qua bakteriële diversiteit aangeven. We vonden gelijkenissen tussen CVS-patiënten en gezonde controles wat betreft hun orale microbiota maar de gezonde controles vertoonden een lichtjes hogere diversiteit (niet statistisch significant). Om te weten of de globale microbioom-samenstelling anders was bij de CVS-patiënten t.o.v. de gezonde controles, voerden we een [statistische] bewerking uit […]. Op basis van deze meting vonden we een significant verschil qua samenstelling tussen CVS-patiënten en gezonde controles (p < 0.01).

CVS-patiënten verschillen qua relatieve hoeveelheden van sommige bakteriële stammen in de mond t.o.v. gezonde controles

Analyses van OTUs uit de mondholte van CVS-patiënten en gezonde controles onthulde dat hun bakterieën zich groepeerden binnen 5 bakteriële stammen: Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria & Proteobacteria. Van alle stammen met een relatieve hoeveelheid groter dan 1% waren echter slechts Fusobacteria significant gewijzigd bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde controles. Vergelijkingen van bakteriële geslachten tussen CVS-patiënten en gezonde controles legden complexere resultaten bloot dan deze die werden gezien op fylum-niveau. Op het niveau van de geslachten waren de 5 meest overvloedige bij CVS-patiënten: Neisseria (19,77%), Veillonella (9,81%), Fusobacterium (9,39%), Streptococcus (9,28%) & Prevotella-7 (9,06%), te samen goed voor 57,31% van de orale bakteriële gemeenschap bij CVS-patiënten. De 5 meest overvloedige geslachten bij de gezonde controles waren Neisseria (18,75%), Veillonella (13,97%), Haemophilus (9,04%), Streptococcus (8,52%) & Prevotella-7 (8,35%), samen goed voor 58,63% van de orale bakteriëen bij gezonde controles. Van deze was de hoeveelheid Veillonella significant verschillende tussen de 2 groepen: 9,81 ± 8,26% (CVS) & 13,97 ± 8,91% (controles) (p = 0.02). Daarnaast waren veel van de geslachten met een relatieve hoeveelheid groter dan 1% significant verschillend tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Bv.: Fusobacterium, Prevotella, Leptotrichia & Campylobacter hadden verhoogde hoeveelheden bij CVS t.o.v. controles, terwijl Haemophilus, Porphyromonas & Moraxella verhoogde hoeveelheden hadden bij CVS vergeleken met controles.

We onderzochten deze significante verschillen verder gebruikmakend van LEfSe [‘linear discriminant analysis (LDA) effect-size’; bepaalt de kenmerken (organismen, groepen organismen afstammend van een gemeenschappelijke evolutionaire voorouder, OTUs, genen of funkties) van een metagenoom dat het meest waarschijnlijk de verschillen verklaart, door het koppelen van standaard-testen voor statistische significantie met bijkomende testen voor biologische consistentie en effekt-relevantie] analyse. LEfSe gebruikt een statistische test om kenmerken te detekteren in een gemeenschap die significant verschillende hoeveelheden vertonen en het gebruikt dan LDA [lineaire discriminant analyse; methode bij ‘machine-learning’, gebruikt wanneer groepen a priori gekend zijn – het resultaat is een LDA-score] om de effekt-grootte van elk of differentieel kenmerk te schatten. De output van deze analyse is een cladogram [‘afstammingsboom’; weergave van de evolutionaire relaties tussen organismen] dat de verschillen tussen de mondholte-microbiota van CVS-patiënten en gezonde individuen visueel voorstelt, en een staaf-grafiek die de bakterieën met een LDA-score > 3.0 vertegenwoordigt [aangerijkte taxa bij CVS: positieve LDA-score; aangerijkte taxa bij gezonden: negatieve LDA-score]. De LEfSe resultaten identificeerden de volgende groepen als verschillen qua orale microbiota tussen CVS-patiënten en gezonde controles: Fusobacteria op fylum-niveau; Epsilonproteobacteria, Fusobacteria, Gammaproteobacteria & Negativicutes op klasse-niveau; Campylobacterales, Fusobacteriales, Pasteurellales & Selenomonadales op orde-niveau; Bacteroidaceae, Campylobacteraceae, Family-XI, Fusobacteriaceae, Pasteurellaceae, Porphyromonadaceae, Pseudomonadaceae & Veillonellaceae op familie-niveau; Alkalibacillus, Bacteroides, Campylobacter, Fusobacterium, Gemella, Haemophilus, Moraxella, Porphyromonas, Prevotella, Prevotella-2, Pseudomonas & Veillonella geslacht-niveau.

‘Machine-learning’ & voorspelling van het bakterieel metagenoom

We wilden de diagnostische mogelijkheden van de bakteriële taxa die significant verschilden tussen CVS-patiënten en gezonde controles verder onderzoeken. Voor deze analyses kozen we Fusobacteria, Gammaproteobacteria, Veillonellaceae & Fusobacterium omdat ze verschillende taxon-niveuas vertegenwoordigden met hoge LDA-scores en aanzienlijke verschillen tussen de groepen. Om het diagnostisch vermogen van elk taxon te bepalen, gebruikten we de AUC. Alle taxa hadden AUC-values van ca. 0.7 (0.73, 0.72, 0.65 & 0.68), wat zou kunnen aangeven dat één enkel taxon niet volstaat om de diagnose van CVS te stellen. Het kan zijn dat het opnemen van meer taxa in de analyse het diagnostisch vermogen van het microbioom zal verhogen.

Om de in het microbioom voorgestelde funkties te voorspellen uit hun metagenoom, wenden we het PICRUSt algoritme aan. Van de 236 geteste mechanismen (uit KEGG [zie hierboven]), waren 40 mechanismen verschillend qua hoeveelheid tussen CVS-patiënten en gezonde controles. Deze 40 mechanismen vertegenwoordigen verschillende niveaus. Specifiek: geen mechanismen van niveau-1 [chemische reakties], 6 mechanismen van niveau-2 [molekulaire interakties, post-translationele proteïne-modificaties] en 55 mechanismen van niveau-3 [biologische reakties, inclusief regulering van gen-expressie] bleken significant verschillend. De niveau-2 mechanismen die CVS-patiënten onderscheidden, waren ‘Biosynthese van Andere Secundaire Metabolieten’, ‘Energie Metabolisme’, ‘Milieu Adaptatie’, ‘Enzyme Families’, ‘Metabole Ziekten’ en ‘Metabolisme van Andere Aminozuren’. Sommige geslachten waren geassocieerd met mechanismen op verschillende niveaus; bv. Prevotella, dat aangerijkt was bij CVS-patiënten, was significant geassocieerd met vele niveau-2 mechanismen. Prevotella was positief geassocieerd met [gen-categorieën] koolhydraten-metabolisme, cel-motiliteit en immuunsysteem ziekte, en negatief geassocieerd met biosynthese van ander secundair metabolisme, enzyme-families en nucleotide-metabolisme.

KEGG funktionele mechanismen gerelateerd met metabolisme bleken gewijzigd in de microbiota van CVS-patiënten. Vermoeidheid in het bijzonder is een symptoom van CVS en er wordt gedacht dat het metabolisme een sleutelrol speelt in de CVS-pathogenese. Daarom analyseerden we verder het verband tussen bakteriële geslachten die via LEfSe een LDA > 3.0 hadden en KEGG mechanismen gerelateerd met het metabolisme. De meeste geslachten correleerden met KEGG mechanismen die verband houden met het metabolisme; de funkties bij geslachten die aangerijkt of verminderd zijn bij CVS-patiënten waren echter inconsistent en complex, wat een afspiegeling is van de complexiteit van CVS-pathogenese.

Bespreking

Omwille van de implicatie van de microbiota bij menselijke gezondheid en ziekte-toestanden, zijn ze niet enkel een doelwit voor therapeutische interventies voor een waaier aan ziekten, maar er zijn therapeutische effekten vastgesteld [allergieën, inflammatoire darm ziekte]. Eerdere studies focusten op darm-microbiota, welke de meest dominante microbiële gemeenschap is bij mensen. De mondholte, die ook wemelt van een grote microbiële gemeenschap die een belangrijke rol speelt bij de menselijke gezondheid, krijgt echter meer en meer aandacht van de research-gemeenschap.

Terwijl wijzigingen van darm-microbiota geassocieerd bleken met CVS, werden veranderingen van de orale microbiota bij CVS-patiënten nog niet bestudeerd. Eerdere studies rapporteerden dat het microbioom van de mondholte bij de mens meer wordt beïnvloed door de omgeving dan door genetica en de voornaamste stammen die voorkomen in het oraal microbioom zijn Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes & Proteobacteria, variërend van individu tot individu, wat correspondeert met onze resultaten. Hier vonden we, overéénkomstig met studies over de intestinale microbiota van CVS-patiënten, wijzigingen in de microbiota van de montholte bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Specifiek: we vonden significante aanrijking van de Fusobacteria bij CVS-patiënten. Verder waren veel geslachten ofwel verminderd of aangerijkt bij CVS-patiënten in vergelijking met gezonde controles. Ondanks deze observaties bleken Shannon & Simpson diversiteit-indexen geen verschillen aan te geven. We onderzochten ook associaties tussen deze veranderde geslachten en KEGG mechanismen, en vonden dat er enkele trends waren wat betreft funktioneel potentieel tussen de microbiota van CVS-patiënten en gezonde controles. Analyse van afgeleide metagenomen gaf aan dat de microbiota van CVS-patiënten verschillende funkties in de categorieën ‘Biosynthese van Andere Secundaire Metabolieten’, ‘Energie Metabolisme’, ‘Milieu Adaptatie’, ‘Enzyme Families’, ‘Metabole Ziekten’ & ‘Metabolisme van Andere Aminozuren’ kan hebben.

Er werden eerder verschillen geobserveerd qua menselijke intestinale microbiota van CVS-patiënten [zie hierboven en Nagy-Szakal D et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44]. De samenstelling van faecale microbiota in het bijzonder is enorm verschillend van deze van de orale microbiota, dus zijn de wijzigingen die we zagen betreffende orale microbiota substantieel verschillend van wat eerder werd gerapporteerd omtrent wijzigingen in de intestinale microbiota van CVS-patiënten. In vergelijking met gepubliceerde studies over veranderingen in de intestinale microbiota van CVS-patiënten, zijn de wijzigingen die we opmerkten in de mondholte minder significant. Bv.: de intestinale microbiota van CVS-patiënten heeft een significant gedaalde diversiteit-index t.o.v. de gezonde controles, wat we niet zagen in de orale microbiota. Daarnaast waren de specifieke taxa die veranderd waren in de intestinale microbiota verschillend van deze die veranderd waren in de orale microbiota. Bv.: in een LEfSe analyse van CVS-patiënten waren de intestinale microbiota van CVS-patiënten aangerijkt voor Oscillospira, Lactococcus & Anaerotruncus van het Firmicutes fylum, en Coprobacillus & Eggerthella van het Actinobacteria fylum. Verder waren 18 geslachten met leden die voornamelijk behoren tot de Firmicutes verminderd, vergeleken met gezonde controles. In een andere studie vertoonden de intestinale microbiota van Noorse CVS-patiënten verhoogde hoeveelheden Lactonifactor & Alistipes, en verlaagde hoeveelheden Holdemania & Syntrophococcus, terwijl de intestinale microbiota van Belgische CVS-patiënten gestegen Lactonifactor en gedaalde Asaccharobacter vertooden. CVS-patiënten onderinden dus wijzigingen in de microbiota zowel de mondholte als de darm, maar de veranderingen die optreden in de mondholte en de darm van CVS-patiënten zijn anders. We vonden echter enkele geslachten waarvan de hoeveelheden gewijzigd waren de mondholte als het darm-kanaal. Bv.: Haemophilus was verminderd in onze studie en Giloteaux’s studie van de intestinale microbiota van CVS-patiënten. Haemophilus, samen met Veillonella & Prevotella, bleken ook veranderd bij mond-letsels en in het oraal microbioom van HIV-positieve individuen. Hoewel de pathogenese van CVS onbekend blijft, kunnen gewijzigde microbiota, van de darm en de mondholte, een belangrijke rol spelen bij de etiologie. Omdat we veel geslachten vonden die veranderd waren bij CVS-patiënten, is verder onderzoek vereist omtrent de verbanden van deze veranderingen en of ze allemaal evenveel betekenis hebben bij de CVS-etiologie.

CVS is een agnogene [van ongekende oorsprong] ziekte, waarvan de symptomen veel systemen en systemische inflammatoire factoren omvatten. Zodoende zijn wijzigingen van het oraal microbioom bij CVS wellicht slecht één klinische indicator voor CVS-pathogenese. Het kan zijn dat wijzigingen van het oraal microbioom de ernst van de symptomen verhogen en zodoende leiden tot of veranderingen versnellen van inflammatorire factoren. Maar ook het omgekeerde kan waar zijn: door CVS geïnduceerde orale symptomen kunnen het gevolg zijn van wijzigingen in het oraal microbioom. Ongeacht het oorzakelijk verband tussen veranderingen in het oraal microbioom en orale CVS-symptomen, zijn deze 2 kenmerken samen met gewijzigde inflammatoire factoren echter geassocieerd met infekties. Zodoende kunnen infekties ook bijdragen tot CVS-symptomen, hoewel verdere research vereist is om deze hypothese te testen.

Daarnaast vonden we dat het 16s rRNA bakterieel profiel van gezonde controles in onze studie lichtjes verschillend was van andere publicaties. Deze discrepanties kunnen o.a. ook te wijten zijn aan verschillen qua etniciteit en methodes. Microbioom-profielen van het speeksel worden niet significant beïnvloed door de afname-methode of DNA-extractie protocollen, dus matchten we de stalen van onze controles en CVS-individuen om verschillen in hun oraal microbioom te identificeren.

We gebruikten een gecontroleerde ‘machine-learning’ benadering om CVS-patiënten te identificeren op basis van hun oraal microbioom, een methode die bij meerdere microbioom-studies werd gebruikt om patiënten van gezonde controles te onderscheiden [bv. inflammatoire darm ziekte]. Via deze benadering klassificeerden we patiënten met een middelmatige accuraatheid (AUC ROC waarde ca. 0.7). Om de AUC ROC waarde te verhogen, dienen toekomstige studies inflammatoire factoren en intestinale microbiomen met orale microbiomen te combineren. De grootte van het staal is een bijkomende verstorende factor die de accuraatheid van deze analyse kan beïnvloeden, te samen met etniciteit en enkele methodische verschillen; een grote groep CVS-patiënten en gezonde controles is dus nog nodig. Met deze verbeteringen, kan dit type benadering verder dienen als een aanvulling op andere niet-invasieve methodes om patiënten met een waaier aan, inclusief CVS, te onderscheiden.

We gebruikten PICRUSt om genoom-funkties aanwezig in het oraal microbioom te voorspellen en vonden een verschil. Een correlatie-analyse van voorspelde funkties en geslachten met een LDA groter dan 3.0, identificeerde dat deze geslachten verschillende funkties zouden hebben. Prevotella bv., aangerijkt bij CVS-patiënten, vertoonde de meest significante correlaties met KEGG mechanismen. Gezien hoe significant Prevotella gewijzigd is bij CVS-patiënten, kunnen ze een rol spelen in de pathogenese van CVS of een indicator zijn voor wijzingen in de orale microbiota bij CVS. Verder bleken van de geanalyseerde gen-mechanismen, deze die gerelateerd zijn met het immuunsysteem en infektueuze ziekten significant geassocieerd met vele geslachten die veranderde hoeveelheden vertoonden bij CVS-patiënten, bijzonderlijk Prevotella, Haemophilus & Veillonella (p ≤ 0.001). Dit zou kunnen suggereren dat deze 3 geslachten bijzonder belangrijk zijn voor CVS-pathogenese.

Omdat vermoeidheid het voornaamste symptoom is van CVS, waren we vooral geïnteresseerd in correlaties waarbij mechanismen betrokken zijn die verband houden met het metabolisme. Gedetailleerde analyse van deze mechanismen onthulde significante verschillen in het koolhydraten-metabolisme, energie-metabolisme, xenobiotica-biodegradatie [afbraak van lichaamsvreemde stoffen] en -metabolisme, en glycaan [polysaccharide] -biosynthese en -metabolisme. We merken echter op dat sommige veranderingen beperkt waren; wat te wijten kan zijn aan de complexiteit van CVS, hoe de diagnose is gebaseerd op symptomen en hoe voor elk geval de symptomen een verschillende oorzaak kunnen hebben. Ondanks deze complexiteit, zijn er wijzigingen qua voorspelde funktie in het oraal microbioom van CVS-patiënten en deze corresponderen met CVS-symptomen – bijzonderlijk ernstige vermoeidheid.

Onze studie had enkele beperkingen, vooral verband houdend met de complexe symptomen van CVS. We identificeerden enkel variatie in het oraal microbioom tussen CVS-patiënten en gezonde controles maar we namen geen verstorende factoren zoals ziekte-ernst, ziekte-duur en gekregen medische behandeling in acht. We lieten geen patiënten toe die verbeterd waren na een behandeling, of letten niet op pre- of post-behandeling, wat de conclusies die we uit deze studie kunnen trekken beperkt. Het oorzakelijk verband en mechanisme van de gerapporteerde met de ziekte geassocieerde microben vereist daarnaast verder onderzoek. Er zijn geen andere studies die wijzigingen van het oraal microbioome bij CVS-patiënten bekeek, er zijn dus verdere studies nodig om onze resultaten te bevestigen. Hoewel we het metagenoom voorspelden op basis van onze 16s rRNA gen sequentie-bepaling, zou deze analyse verbeterd kunnen worden met gegevens van het volledige metagenoom ter bepaling van de eigenlijke gen-inhoud van bakterieën die gewijzigd zijn bij de ziekte. Andere ziekten met gelijkaardige symptomen zouden bij toekomstige analyse ook kunnen worden opgenomen om ons begrijpen van het verband tussen veranderingen van het oraal microbioom en CVS-symptomen te verbeteren.

Samengevat: we onderzochten hier wijzigingen in het menselijk oraal microbioom bij CVS en bevestigden dat de samenstelling ervan kleine maar significante verschillen vertoont in vergelijking met gezonde controles. De geslachten waarvan de hoeveelheden zijn veranderd zijn gecorreleerd met KEGG mechanismen, in het bijzonder deze die verband houden met het metabolisme. Deze studie biedt nieuwe inzichten betreffende de CVS-pathogenese en we denken dat het begrijpen van het verband tussen ontwrichting van het oraal microbioom en CVS-symptomen kan leiden tot betere behandeling en in diagnose.

september 22, 2018

Biomerker voor M.E.(cvs) d.m.v. ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:43 am
Tags: , , , , , ,

‘Single’ cel Raman spectroscopie (SCRS – Raman is een Indiaans fysicus) is een niet-invasieve technologie waarbij geen labeling nodig is en die analyse van individuele levende cellen toelaat ‘in vivo’. Spectroscopie is een wetenschappelijke techniek om stoffen te onderzoeken aan de hand van hun spectrum, een beschrijving van de in een signaal voorkomende golflengtes en hun sterkte. Dit wordt dikwijls gebruikt in de scheikunde. Een ‘single’ cel Raman spectrum omvat gewoonlijk 1.000 Raman-banden die informatie geven over de cel (bv. over nucleïnezuren, proteïnen, koolhydraten en lipiden) en een weerspiegeling zijn van cellulaire genotypes, fenotypes en fysiologische toestanden. Een Raman-spectrum fungeert als een molekulaire/strukturele ‘fingerprint’ van een individuele cel, waardoor het mogelijk wordt verscheidene cellen te identificeren/differentiëren zonder voorafgaande kennis over de cellen. Een belangrijk nadeel van SCRS is het feit dat spontane Raman-signalen van nature zwak zijn…

Monochromatisch licht (één golflengte), gewoonlijk van een laser interageert met de molekulaire vibraties, herschikkingen van atomen/molekulen of excitaties, waardoor de energie van de laser-fotonen (fotonen zijn elementaire deeltjes waaruit licht en alle andere elektromagnetische straling bestaat) wordt verschoven. Deze verschuiving geeft informatie over de vibraties in het systeem. De zgn. Raman ‘scattering’ (verstrooing/verspreiding) of het Raman effekt is de niet-elastische (de kinetische energie van een partikel blijft niet behouden) ‘scattering’ van een foton door molekulen waarbij het wordt geëxciteerd tot een hoger energie-niveau. Wanneer fotonen door een atoom of molekule worden verstrooid, is dat meestal ‘elastisch’: de verspreide fotonen hebben dezelfde energie (frequentie & golflengte) als de verstorende fotonen. Een klein deel (ca. 1 op 10 miljoen) wordt niet-elastisch verstrooid door een excitatie (frequentie en energie is anders en gewoonlijk lager dan die van de veroorzakende fotonen).

Het gebruik van deze techniek in onderstaande piloot-studie gaf (weerom) aanwijzingen voor metabole stoornissen bij M.E.(cvs).

————————-

Analyst (Pre-print augustus 2018)

A new approach to find biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CVS/ME) by single-cell Raman micro-spectroscopy

Jiabao Xu (1), Michelle Potter (2), Cara Tomas (3), Jo Elson (3), Karl J. Morten (2), Joanna Poulton (2), Ning Wang (4), Hanqing Jin (4), Zhaoxu Hou (4) & Wei E. Huang (1)

1. Department of Engineering Science, University of Oxford, Begbroke Science Park, Woodstock Road, Oxford, OX5 1PF, United Kingdom

2. Nuffield Department of Women’s and Reproductive Health, University of Oxford, the Women Centre, John Radcliffe Hospital, Headley Way, Headington, Oxford, OX3 9DU, United Kingdom

3. Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, United Kingdom

4. Mathematical Institute, University of Oxford, Andrew Wiles Building, Radcliffe Observatory Quarter, Woodstock Road, Oxford, OX2 6GG, United Kingdom

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) genaamd, is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door lichamelijke en mentale uitputting. Er werd onderzoek verricht naar mitochondriale en energetische dysfunktie bij CVS-patiënten omwille van een kenmerkend verband met vermoeidheid; er werd echter nog geen consistent besluit getrokken. ‘Single’ cel Raman spectra (SCRS) zijn label-vrije biochemische profielen, die fenotypische ‘fingerprints’ van individuele cellen aangeven. In deze studie pasten we een nieuwe benadering op basis van ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om ρ0 cellen die mitochondriaal DNA (mtDNA) missen en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te onderzoeken van CVS-patiënten en gezonde controles. De resultaten van de experimenten tonen dat Raman-banden geassocieerd met fenylalanine in ρ0 cellen en PBMCs van CVS-patiënten significant hoger waren dan in het ‘wild type’ model en bij gezonde controles. Opmerkenswaardig is dat er ook een toename van de intensiteiten van Raman fenylalanine banden werd gezien bij CVS-patiënten. Aangezien gelijkaardige veranderingen werden gezien in het ρ0 cel model met een gekende deficiëntie in de mitochondriale respiratoire keten alsook bij CVS-patiënten, suggereren onze resultaten dat de stijging qua cellulair fenylalanine verband kan houden met mitochondriale/energetische dysfunktie in beide systemen. Interessant is dat fenylalanine kan worden gebruikt als een potentiële biomerker voor de diagnose van CVS d.m.v. SCRM. Een ‘machine-learning’ klassificatie-model bereikte een accuraatheid van 98% wat betreft het correct toewijzen van Raman-spectra aan de CVS- of de controle-groep. SCRM gecombineerd met een ‘machine-learning’ algoritme heeft daarom het vermogen om een diagnostisch instrument voor CVS te worden.

Inleiding

[…] Het blijft een uitdaging voor artsen en researchers, en een onvolledig gekarakteriseerde ziekte, ten dele omwille van de controversiële definitie, pathogenese en diagnose. Daarom is het vinden van potentiële biomerkers van groot belang voor het begrijpen van de ziekte en het ontwikkelen van een doelgerichte behandeling.

Mitochondrieën bleken van groot belang voor CVS-onderzoek omwille van nieuw bewijsmateriaal voor mitochondriale dysfunktie als een vermoedelijk biologisch mechanisme voor vermoeidheid. De onderliggende hypothese is dat vermoeidheid en andere vergezellende symptomen ten dele te wijten zijn aan een verstoord energie-metabolisme op cellulair niveau, dat grotendeels wordt bepaald door mitochondrieën als energie-fabriek en z’n ATP-produktie. Het ATP-profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd aangewend als een diagnostisch instrument voor CVS maar de resultaten waren echter controversieel. Meerdere studies hebben gedaald ATP-niveau getoond in patiënten-groepen [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxid Redox Signal. (2013) 19: 1855-60], terwijl andere geen verschillen konden detekteren of verrassend genoeg een verhoogde energie-produktie vonden bij CVS-patiënten [bv. Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93].

Hier, in een poging om mitochondriale dysfunktie en CVS-pathogenese te linken, probeerden we ‘single’ cel Raman-spectra (SCRS) te analyseren en universele biomerkers in cellen te identificeren. Een SCRS kan worden beschouwd als een intrinsieke chemische ‘fingerprint’ van een cel met zeer doorslaggevende Raman-banden voor belangrijke cellulaire bouwstenen zoals proteïnen, aminozuren, lipiden en fosfolipiden, en koolhydraten. Daarom zijn SCRS biochemische profielen van individuele cellen die fysiologische toestanden en metabole veranderingen weerspiegelen. Door de rijke en semi-kwantitatieve metabole informatie van afzonderlijke cellen, kan SCRS worden gebruikt om het cellulair metabolisme te beschrijven en ziekte-gerelateerde biomerkers te tonen.

In deze studie gebruikten we ten eerste ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) om fenotypische profielen van menselijke ρ0 cel-lijnen volledig ontdaan van mitochondriaal DNA (mtDNA) te bekomen om het effekt te bestuderen van ernstige mitochondriale dysfunktie. Ten tweede vergeleken we SCRS van PBMCs van 5 CVS-patiënten en 5 gezonde controles als piloot-studie om potentiële biomerkers voor CVS-diagnose te vinden. De vergelijking van de 2 resultaten biedt inzichten omtrent het verband van mitochondriale dysfunktie met de pathofysiologie van CVS en toont een coherente en consistente benadering voor de diagnose van de ziekte.

Experiment

Cel-cultuur, generatie van WT cybriden en PicoGreen-kleuring

De gebruikte 143B ρ0 cel-lijn zonder mtDNA […] wordt veelvuldig gebruikt bij studies die het pathogeen effekt van mtDNA-mutaties onderzoeken. […] De wild-type (WT) lijn werd gegenereerd door 143B ρ0 cellen te fuseren met normaal mtDNA […]. Het ‘herbevolken’ van de ρ0 lijn is een beter controle-systeem dan de originele 143B wild-type cellen […].

De aanwezigheid van mtDNA werd bevestigd d.m.v. kleuring met PicoGreen. […] Het mtDNA ‘copy-number’ van de ρ0 cellen en de WT cellen werd ook bepaald via ‘real-time’ PCR (vergelijking van celkern en mitochondriaal DNA). […]

ATP-metingen van WT en ρ0 cellen

[…]

Ethiek

[…]

Isolatie van PBMCs uit bloed-stalen

[…] Er werden morfologisch 2 types cellen met verschillende groottes (5-7 µm & 15-20 µm) in de PBMC-fractie gezien. Enkel de cellen met grotere afmetingen werden geselekteerd voor de Raman-experimenten na vergelijking van de resultaten (gegevens niet getoond), om de heterogeniteit door de verschillende cell-types te minimaliseren. Er dienen verdere experimenten te worden gedaan om de identiteit van de cellen te bevestigen (nu geloven we dat het monocyten zijn, op basis van de cel-populatie en grootte).

Metingen van ‘single’-cel Raman-spectra (SCRS)

[…] De gefixeerde cellen werden op een specifiek behandeld microscopisch plaatje gelegd (dat geen achtergrond Raman-signaal geeft). SCRS m.b.v. een Raman-microscpop en een 532 nm […] laser. […] Spectraal bereik: 330 tot 1900 cm-1 […] 5 s per spectrum, 10 spectra per cel & 20-30 ‘single’ cellen per conditie.

Voor-verwerking en analyse van Raman-gegevens

[…] Kwantificering van intracellulaire bio-molekulen via integratie van de corresponderende Raman-banden in SCRS. Banden geassocieerd met fenylalanine tussen 993-1013 cm-1 & 1022-1036 cm-1 werden gebruikt om de intracellulaire concentratie te kwantificeren. […]

‘Machine-learning’ klassificatie-model

Er werd een ‘machine-learning’ [wetenschappelijke discipline over het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen op basis van empirische gegevens (bv. van sensoren of uit databases; ook wel ‘data-mining’] klassificatie-model geconstrueerd op basis van SCRS van 5 CVS-patiënten en 5 controles (80 & 126 SCRS respectievelijk). Er werd een niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM [een ‘binaire klassificeerder’; wijst, aan de hand van een aantal kenmerken, objecten toe aan één van twee klassen – daarvoor moet ze eerst een numeriek model van deze objecten maken als punten in een wiskundige struktuur; in de training (inoefening) -fase brengt de SVM op basis van een verzameling van voorbeelden, waarvan is aangegeven tot welke klasse ze behoren, een scheiding aan die de twee klassen zo goed mogelijk van elkaar scheidt (die scheiding is een hyper-vlak); nadien kan de SVM dan voor een nieuw te klasseren object beslissen tot welke klasse het behoort door te kijken langs welke kant van het hyper-vlak het corresponderende punt in de ruimte ligt]) algoritme gebruikt om het model op te bouwen […]. Er werden niet-lineaire hyper-vlakken gebruikt om de gegevens te scheiden. ‘Leave-one-out’ kruis-validatie [kruis-validatie = techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] (LOOCV [zie hieronder]) werd aangewend om het model te evalueren en de sensitiviteit werd voor elke conditie en globaal berekend.

Extracellulaire flux analyse

De OXPHOS van PBMCs werd bepaald d.m.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser [zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’] […] Daarbij wordt de zuurstof-consumptie (OCR) opgenomen na opéénvolgende toediening van 1 μM oligomycine, 3 μM carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)-fenylhydrazone (FCCP), en een combinatie van 0,5 μM rotenon en 0,5 μM antimycine-A. […]

Resultaten en bespreking

Cellen zonder mtDNA hebben specifieke ‘single’-cel Raman spectra (SCRS)

PicoGreen kan specifiek worden aangewend om mitochondriaal DNA (mtDNA) te kleuren in levende cellen. Na incubatie met de kleurstof vertoonden ρ0 cellen waarin opnieuw wild-type mtDNA werd geïntroduceerd (WT cellen) helder gekleurde cel-kernen omgeven door talrijke heldere cytoplasmatische spikkels, terwijl ρ0 cellen slechts helder gekleurde cel-kernen zonder de omringende spikkels vertoonden, wat de depletie van mtDNA in ρ0 cellen bevestigt.

Aangezien mitochondrieën de primaire energie-fabriek van de meest eukaryote cellen zijn en de cel bevoorraden met metabole energie onder de vorm van ATP, hebben we de ATP-produktie van WT cellen en ρ0 cellen gemeten bij 50.000 of 75.000 cellen. Verrassend was dat bij beide cel-aantallen, ρ0 cellen gelijkaardige hoeveelheden ATP aanmaakten in vergelijking met WT cellen, als de toegevoegde glucose-concentraties hoog waren (11 mM & 25 mM). Aan de andere kant was de ATP-concentratie in ρ0 cellen significant lager dan in WT cellen bij lage glucose-concentraties (0 mM tot 5 mM). Onze resultaten suggereren dat, als er voldoende glucose is, ρ0 cellen zich kunnen aanpassen om ATP-produktie te stimuleren via niet-mitochondriale glycolyse ter compensatie voor de slechte mitochondriale respiratoire keten. Wanneer de glucose laag en ATP-produktie uit glycolyse beperkt is, is de WT cel-lijn in staat om switchen naar een mitochondriale manier van ATP-produktie gebruikmakend van de respiratoire keten via elektronen-transport gekoppelde fosforylatie (ETCP). De ρ0 cellen zijn echter niet in staat de ETCP te gebruiken omwille van de defekte mitochondrieën.

We pasten ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om de WT cellen en de ρ0 cellen bij hoog glucose te onderzoeken en de verschillen qua bio-energetisch mechanisme (ondanks een gelijkaardige ATP-aanmaak in de 2 cel-lijnen) te verklaren. […] Er werd een relatief lage standaard-deviatie gezien omwille van de beperkte heterogeniteit bij het in vitro bestuderen van de cel-lijnen. Vergeleken met WT cellen, vertonen ρ0 cellen een verschillend spectraal patroon in het ‘fingerprint’-gebied van hun SCRS (600-1.800 cm-1), wat typisch kan worden gebruikt als een fenotypische ‘fingerprint’ van cellen die de belangrijkste biochemische informatie bevatten.

Er werd dan ongecontroleerde ‘principal component analysis’ (PCA [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.]) aangewend om de vele dimensies van SCRS (omwille van de aanwezigheid van meer dan 1.500 Raman-banden) te reduceren. Een PCA-grafiek […] illustreert 2 duidelijk afscheidbare clusters die de WT cellen en ρ0 cellen weergeven. Er werd een diagram opgesteld voor de karakterisatie van de belangrijke Raman-banden. Het meest prominente kenmerk werd gezien bij 1003 cm-1, wat kan worden toegeschreven aan de aromatische ring [benzeen-ring; zes koolstof-atomen die in een vlakke ring liggen] van fenylalanine. Andere banden gerelateerd met fenylalanine bleken ook een grote bijdrage te leveren, inclusief 1.609 […], 1.030 […] en 618 […] cm-1. Alle banden gerelateerd met fenylalanine waren hoger in de ρ0 cellen vergeleken met de WT cellen, wat een belangrijke rol van het aminozuur fenylalanine in het metabolisme van cellen met mitochondriale dysfunktie aangeeft.

Andere verschillen omvatten banden rondom 1.658 […] en 1.440 […] cm-1, die beide hoger zijn in WT cellen t.o.v. ρ0 cellen. Dit suggereert dat, ondanks een hogere accumulatie van cellulair fenylalanine, ρ0 cellen een globale gedaalde intracellulaire concentratie van proteïnen lipiden te wijten aan een verstoord metabolisme hebben. Aangezien fenylalanine alleen wellicht onvoldoende is om het pathomechanisme te karakteriseren, dienen meer biomerkers te worden geïdentificeerd om mitochondriale dysfunktie simultaan en meer betrouwbaar te identificeren.

PBMCs van CVS-patiënten kunnen worden onderscheiden via één enkele Raman-merker

[…] Aangezien fenylalanine een potentiële biomerker in ρ0 cellen bleek, werd gehypothiseerd dat het een geschikte kandidaat kan zijn om bij CVS-patiënten – waarvan wordt gedacht dat ze een gelijkaardige bio-energetische dysfunktie hebben – te onderzoeken. Van de 5 patiënten vertoonden er 4 Raman-spectra met verhoogde fenylalanine-band op 1.003 cm-1 (CVS 1-4), terwijl de andere (CVS 5) een gelijkaardige intensiteit vertoonde i.v.g. met de controles. Door het gemiddelde te maken van 80 SCRS van de patiënten en 126 spectra van de controles, is het zichtbaarder dat de fenylalanine-band een uitgesproken stijging in de cellen van patiënten vertoont.

PCA van SCRS van 10 stalen toonde een aanzienlijke afscheiding tussen de CVS- en de controle-groep. Terwijl CVS 1-4 kleinere ellipsoïden vertoonden met weinig overlapping met de controles, had CVS 5 een hogere ‘single’ cel verspreiding en overlapte grotendeels met de ellipsoïden van de controles; wat correleert met de observatie aangaande fenylalanine. Om te verifiëren dat de afscheiding tussen de groepen in de PCA-clustering toe te schrijven was aan fenylalanine, zetten we het Raman golfgetal [hoeveel golven (golflengtes) per lengte-eenheid] uit tegenover de componenten die de grootste afscheiding tussen de groepen toonden. Raman-banden rond 1.003 en 1.030 cm-1 werden geïdentificeerd voor het beschrijven van de maximum varianties […]. De intracellulaire concentratie van fenylalanine werd semi-gekwantificeerd door het integreren van de Raman-banden op 1.003 en 1.030 cm-1, respectievelijk. Beide signatuur-banden voor fenylalanine bleken significant hoger bij de patiënten t.o.v. controles (p < 0.0001).

Eerdere research ondersteunt de mogelijkheid dat het pathomechanisme van CVS gelinkt is met veranderingen qua aminozuren. Er werden reducties van de concentraties van bepaalde aminozuren, inclusief fenylalanine, in het serum en urine van CVS-patiënten gerapporteerd [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta. (2012) 413: 1525-31 /// Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Fluge Ø, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight. (2016) 1: e89376]. Deze bevindingen ondersteunen een mogelijk metabool defekt verbonden met het aminozuren-metabolisme bij CVS-patiënten, d.m.v. de analyse van de metabolomica van biologsiche vloeistoffen van de patiënten. Ons werk is, naar ons weten, het eerste dat melding maakt van de veranderingen in ‘single’ perifere bloedcellen van CVS-patiënten. Onze resultaten suggereren dat cellen van patiënten meer aminozuren (bv. fenylalanine) kunnen accumuleren, wat resulteert in een vermindering in de lichaamsvochten die wordt gezien in andere studies. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een inductie van secundaire redding-mechanismen om intracellulair meer aminozuren te accumuleren en een normale ATP-produktie te behouden in de metabool dysfunktionele patiënten-cellen [zie Fluge Ø, Mella O et al. hierboven]. Verder toont onze bevinding de impact van fenylalanine in zowel ρ0 cellen zonder mtDNA en bloedcellen van CVS-patiënten, die mitochondriale defekten ook kan linken met CVS. Niettemin: hoe de gestegen fenylalanine-waarden in PBMCs in verband staan met andere weefsels bij de patiënten is nog onduidelijk. Raman-benaderingen die fenotypische spectra kunnen leveren van weefsels zou zeer nuttig kunnen zijn bij toekomstige onderzoeken.

Er werd een extracellulaire flux analyse uitgevoerd bij 4 CVS-patiënten die het meest ongelijk waren van de controles wat betreft SCRS-resultaten (CVS 1-4), om te onderzoeken of er een correlatie bestaat tussen abnormaliteiten qua oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) en de SCRS-analyse wanneer PBMCs geïncubeerd worden in laag- en hoog-glucose. Twee van de patiënten hadden een zeer lage OXPHOS in beide condities (CVS 2 & 4) en de andere 2 hadden veel hogere OXPHOS-profielen (CVS 1 & 3). Hoewel bij de OXPHOS-analyse er mitochondriale deficiëntie uitgesproken werd gedetekteerd in 2 van de 4 patiënten, was SCRS van PBMCs in staat bij alle 4 de abnormaliteiten op te pikken. Niettemin is het staal patiënten en controles klein als we de mogelijks grote heterogeniteit bij CVS-individuen in acht nemen. Onze resultaten dienen als een piloot-studie om het potentieel te verkennen van SCRM als instrument om biomerkers voor CVS te identificeren. Er wordt een studie op grotere schaal voorbereid om de resultaten van dit werk te consolideren.

‘Machine-learning’ modellen kunnen CVS-patiënten met succes en met hoge accuraatheid klassificeren

Bij Raman-benaderingen is, naast het afleiden van kenmerken om informatieve biomerkers te vinden, de klassificatie gebaseerd op spectra dikwijls wenselijk voor diagnostische doeleinden. ‘Machine-learning’ benaderingen zijn gewoonlijk geschikt om de gecompliceerde Raman gegevens-set op te delen in componenten. Niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM) [uitgelegd bij ‘Experiment’] is een gesuperviseerd [input en output duidelijk gedefinieerd] leer-algoritme […] om verschillende klassen te scheiden die d.m.v. lineaire klassificatie niet te scheiden zijn. Er werd een klassificatie-model ingeoefend via niet-lineaire SVM om het onderscheid te maken tussen de CVS-groep en controle-groep op basis van hun SCRS (80 SCRS voor de CVS-groep, 126 SCRS voor de controle-groep). Er werd ‘leave-one-out’ kruis-validatie gebruikt om het model te evalueren door éénder welke van 205 spectra te gebruiken om het model te trainen en dan te testen of het model het ene weggelaten spectrum correct kan klassificeren. Dit model was in staat de CVS-groep met succes te klassificeren met een sensitiviteit van 96,3% (77 van de 80) en de controle-groep met een sensitiviteit van 99,2% (125 van de 126). De lagere sensitiviteit die wordt gezien voor de patiënten-groep kan worden verklaard door de aanwezigheid van hogere heterogeniteit bij de CVS-patiënten. Er werd een totale accuraatheid van 98,1% bereikt op basis van 206 Raman-spectra. Opmerkenswaardig: bij een groter wordend staal en aantal Raman-spectra om de referentie-database op te bouwen, kunnen klassificatie-modellen met betere deugdelijkheid worden bereikt. Aangezien één Raman-spectrum binnen luttele seconden kan worden verkregen, kan één patient-staal bestaande uit meerdere spectra en meerdere cellen worden gekarakteriseerd en geklassificeerd binnen enkele minuten, wat een enorm potentieel en haalbaarheid in de klinische praktijk impliceert.

Besluiten

Deze studie werd uitgevoerd om de haalbaarheid van of ‘single’ cel Raman-analyse te evalueren bij de detektie van biomerkers gerelateerd met mitochondriale dysfunktie en CVS. Zodoende identificeerden we een verhoogde intracellulaire concentratie van het aromatisch aminozuur fenylalanine [essentieel aminozuur dat nodig is voor diverse biochemische processen; onder andere voor de aanmaak van de neurotransmitters dopamine, adrenaline en noradrenaline] en toonden dat het kan worden gebruikt als een potentiële biomerker in ρ0 cellen zonder mitochondriaal DNA, alsook in perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS-patiënten. Bovendien gaf een ‘machine-learning’ model een accuraatheid van 98,1% correct te klassificeren van patiënten en controles op basis van hun Raman-spectra. De combinatie van Raman-biomerkers en klassificatie-modellen zou kunnen leiden tot verbeteringen omtrent het begrijpen van CVS-pathogenese en het potentieel hebben te worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor CVS.

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

juli 29, 2018

Uitgebreide metaboloom-studie bij M.E.(cvs)

Aankondigingen als “Nieuwe CVS-test is 84 percent accuraat’ klinken natuurlijk hoopgevend maar de realiteit is toch ietsje ingewikkelder… Als men het artikel hier onder leest, zal men te weten komen dat het niet over één (snel) test(je) gaat maar een complexe analyse die op lange termijn inzichten zou kunnen verschaffen over de pathologie, subgroepen en een mogelijke therapeutische aanpak daarvan. ‘Inzichten over metabolieten brengen ons dichter naar een test voor CVS’ klinkt al wat genuanceerder…

Onderstaande studie, door een research-team o.l.v. onderzoekers van het ‘Centre for Infection and Immunity’ (CII) van de Columbia Universiteit (New York City), levert dus geen kant-en-klare diagnostische test op. D.m.v. hoog-technologische technieken (die bijlange niet in elk routine-lab beschikbaar zijn) werden 562 metabolieten (zeg maar produkten die ontstaan bij menselijke en of microbiële processen die suikers/vetten/eiwitten verwerken) gevonden die bij M.E.(cvs)-patiënten al dan niet anders waren. Een aantal daarvan bleken te wijzen op mogelijk slecht funktioneren van de mitochondrieën (de energie-fabriekjes van cellen) – wat overéénkomt met wat andere research-teams vonden. Ook hun eerdere vondst van een onderscheidend metabolieten-patroon tussen M.E.(cvs) en prikkelbare darm syndroom werd bevestigd. Combinatie van de gegevens (metaboloom) met de eerder gevonden biomerkers (microbioom) leverde een voorspellend model op en statistische analyse gaf aan dat de accuraatheid daarvan om de diagnose M.E.(cvs) te kunnen stellen 84% is.

Dr. W. Ian Lipkin, directeur van het CII en het ‘National Institutes of Health Centre for Solutions for ME/CFS’ liet optekenen: “We beginnen te begrijpen hoe de ziekte in z’n werk gaat. We zouden dieren-modellen kunnen gaan ontwikkelen die ons in staat kunnen stellen om hypotheses en potentiële therapieën (bv. probiotica de darm-flora regelen of medicijnen die bepaalde neurotransmitter-systemen aktiveren) te testen.”.

————————-

Scientific Reports Vol 8, #1, article 10056 (juli 2018)

Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics

Dorottya Nagy-Szakal (1), Dinesh K. Barupal (2), Bohyun Lee (1), Xiaoyu Che (1), Brent L. Williams (1), Ellie J.R. Kahn (1), Joy E. Ukaigwe (1), Lucinda Bateman (3), Nancy G. Klimas (4,5), Anthony L. Komaroff (6), Susan Levine (7), Jose G. Montoya (8), Daniel L. Peterson (9), Bruce Levin (10), Mady Hornig (1), Oliver Fiehn (11), W. Ian Lipkin (12)

1 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

3 Bateman Horne Center, Salt Lake City, UT, USA

4 Institute for Neuro Immune Medicine, College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, USA

5 Miami VA Medical Centre, Miami, FL, USA

6 Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA

7 Levine Clinic, New York, NY, USA

8 Stanford University, Palo Alto, CA, USA

9 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

10 Department of Biostatistics, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

11 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

12 Centre for Infection and Immunity, Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA

Samenvatting

De pathogenese van M.E./CVS, een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, slaap-stoornissen, orthostatische intolerantie, koorts, prikkelbare darm syndroom (IBS) en lymfadenopathie [afwijkingen/vergroting van de lymfeklieren], wordt niet goed begrepen. We rapporteren over biomerkers en topologische analyse van het plasma metaboloom, faecaal bakterieel metagenoom en klinische gegeven van 50 M.E./CVS-patiënten & 50 gezonde controles. We bevestigen meldingen van gewijzigde plasma-waarden van choline, carnitine en complexe lipiden, en tonen aan dat patiënten met M.E./CVS & IBS verhoogde plasma-waarden van ceramide hebben. Integratie van faecal metagenoom en plasma metaboloom gegevens resulteerde in een sterker voorspellend model voor M.E./CVS (kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom (kruis-validatie AUC = 0.745) of metaboloom (kruis-validatie AUC = 0.820) -analyse apart. Onze bevindingen kunnen inzicht bieden in de pathogenese van M.E./CVS en z’n subtypes, en suggereren mechanismen voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën.

Inleiding

[…]

Metaboloom-studies over M.E./CVS hebben onregelmatigheden onthuld aangaande het energie-, aminozuren-, nucleotiden- en stiktstof-metabolisme [Armstrong CW et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172], alsook inconsistente verstoringen in neurotransmitter-gerelateerde mechanismen en het lipiden-metabolisme. In een massa-spectrometrische studie met 45 M.E./CVS-individuen en 39 gezonde controles, rapporteerden Naviaux et al. abnormaliteiten qua niveaus van fosfo- en sfingolipiden, cholesterol, ‘vertakte’ aminozuren, vitaminen, proline/glutamaat en mitochondriale metabolieten. [Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480] In een studie met 67 M.E./CVS-patiënten en 66 gezonde controles bepaalden Yamano en z’n collega’s 144 metabolieten en rapporteerden abnormaliteiten qua waarden van metabolieten gerelateerd met glycolyse, de TCA-cyclus en de ureum-cyclus, maar niet van het glutamine-metabolisme. [Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep (2016) 6: 34990] Fluge et al. brachten bewijsmateriaal aan voor afwijkingen die consistent zijn met verstoorde funktie van pyruvaat-dehydrogenase die gelinkt is met verstoringen van de (TCA-cyclus gebaseerde) energie-produktie. [Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1] Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie heeft ook metaboloom-abnormaliteiten onthuld die consistent zijn met veranderde gluconeogenese, mogelijke inhibitie van de glycolyse en een verstoorde respons op oxidatieve stress. [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639] Een andere NM-studie vond dat bij M.E./CVS (t.o.v. controles) de waarden van glutamine en ornithine in het serum lager waren, en correleerden met metabolieten verbonden met de ureum-cyclus. [Armstrong CW et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531] Een piloot-studie (met de focus op plasma van vrouwen met M.E./CVS) onthulde wijzigingen qua energie-gerelateerde metabole molekulen en mechanismen. [Germain A et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst (2017) 13: 371-379] We hebben melding gemaakt van analyses van het faecaal microbioom en stelden een model voor waarbij intestinale dysbiose kan bijdragen tot bakteriële metabole stoornissen die verschillen tussen M.E./CVS-subgroepen met of zonder IBS. [Nagy-Szakal D. et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5, 44]

Hier rapporteren we over gerichte en ongerichte analyses van 562 molekulen die primaire metabolieten, biogene aminen, lipiden-complexen en oxylipinen [molekulen ontstaan door oxidatie van vetzuren] vertegenwoordigen, in het plasma van M.E./CVS-patiënten en controles. We beschreven ook de verbondenheid van de resulterende metaboloom-gegevens met faecaal metagenoom en klinische gegevens. Zoals bij onze eerder gerapporteerde metagenoom-analyses, vonden we dat metaboloom-profielen niet enkel verschilden tussen M.E./CVS-patiënten en controles maar ook tussen M.E./CVS-patiënten die al dan niet IBS hebben.

Methodes

Studie-ontwerp

[…]

Studie-populatie en plasma-collectie

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Controles gematcht voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en seizoen van afname. […]

[…]

Klinische beoordeling & medische anamnese

[…]

Zelf-gerapporteerd diagnose van IBS […] 24/50 M.E//CVS-patiënten (48%), 1/50 controle-individuen (2%). […]

Metabolomica

Er werden 3 ongerichte metaboloom-testen en 1 gerichte test uitgevoerd voor 562 metabolieten van 20 biochemische mechanismen [massa-spectrometrie]. […].

Statistische analyses

[…]

MetaMapp

[Methode om verbanden tussen biochemische en chemische verbanden te integreren om alle gedetekteerde metabolieten d.m.v. in netwerk-diagrammen in kaart te brengen. Deze diagrammen visualiseren op een efficiënte manier de op massa-spectrometrie gebaseerde metaboloom-gegevens. Een knooppunt vertegenwoordigt een metaboliet. Ge-upreguleerde en ge-downreguleerde knooppunten krijgen een verschillende kleur. De grootte van een knooppunt weerspiegelt de grootte-orde van het effekt.] […] Struktureel geïdentificeerde metabolieten werden gegroepeerd in 21 chemische groepen [carnitine-choline * tryliceriden (TG) * ceramide * fosfatidylethanolminen (PE) * aminozuren * oxylipinen * exposoom * vetzuren * sfingomyelinen (SM) * energie * complexe lipiden (LPC) * carnitine * suiker * suiker-alkohol * cholesterol * neutrale lipiden * één-koolstof/nicotinaat * neurotransmitter * nucleotide * vitamine]. De metabolieten werden manueel geklassificeerd omdat dit voor veel molekulen, inclusief complexe lipiden, niet altijd even goed gebeurt in bestaande databases. […]

Analyses van topologische gegevens

Metagenoom- en metaboloom-gegevens, inclusief plasma-waarden van de metabolieten, bakteriële samenstelling en afgeleide metabole mechanismen, plasma immuun-profielen en symptoom-ernst-scores, werden gebruikt voor TDA [‘topological data analysis’, topologische gegevens analyse]. De aangewende methodiek geeft de complexe biologische sets gegevens weer als gestruktureerde 3-dimensionele netwerken [knooppunten verbonden met lijnen]. […] De lijnen verbinden netwerk-knooppunten die gemeenschappelijke gegevenspunten bevatten. […] De grootte van een knooppunt in het topologisch netwerk was proportioneel met het aantal variabelen met een gelijkaardig profiel. We construeerden een netwerk bestaande uit 100 stalen en 1.900 variabelen (562 plasma-metabolieten, 574 faecale bakteriële relatieve aantallen […], 586 voorspelde bakteriële metabole mechanismen, 61 immuun-molekulen, 81 variabelen met betrekking tot M.E./CVS-vermoeidheid en andere symptoom-scores/vragenlijst-items, en informatie over co-morbiditeiten en 36 demografische variabelen). […]

Resultaten

Karakteristieken van de studie-populatie

[…] 41 vrouwelijke en 9 mannelijke M.E./CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 51,1 ± 1,6 jaar); 41 vrouwelijke en 9 mannelijke controle-individuen (gemiddelde leeftijd 51,3 ± 1,6 jaar). […] Prikkelbare darm syndroom (IBS) diagnose bij 24 van de 50 M.E./CVS-patiënten (48%). Eén van de 50 controle-individuen meldde een diagnose van IBS (2%).

Metaboloom-gegevens

Gerichte en ongerichte massa-spectrometrie leverde gegevens op voor 562 metabolieten: 111 primaire metabolieten (PM), inclusief deze gerelateerd met het tryptofaan-metabolisme, suikers, hydroxyzuren, keton-lichamen en andere molekulen van het energie-metabolisme; 103 biogene aminen (BA) inclusief vertakte en onvertakte acylcarnitinen, trimethylamine N-oxidase (TMAO [osmolyt (molekule bijdragend tot de (regulering van) osmotische druk in cellen en weefsels); ook gerapporteerd significant verhoogd te zijn bij fibromyalgie]), choline [organische stof die belangrijk is voor de struktuur van cel-membranen en andere membraan-strukturen, en voor neurotransmissie] en aminozuren; 302 complexe lipiden (CL) inclusief mono- en di-acylglyceriden [molekulen van glycerol gelinkt met 1 of 2 vetzuren], vetzuren, ceramide [(sfingo)lipide-molekule in het celmembraan waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood; Naviaux rapporteerde bij M.E.(cvs) gedaalde waarden] sfingomyelinen [sfingolipiden die voornamelijk voorkomen in de myeline-schede rond axonen] en fosfolipiden [cel-membranen bestaan uit een dubbele laag fosfolipiden]; en 46 bio-aktieve oxylipinen (OL), steroïden en galzuren. […]

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel

Exposoom- en vitamine-metabolieten (exogene milieu-stoffen) [Het exposoom is het geheel van menselijke (d.i. niet-genetische) blootstellingen aan het milieu vanaf de conceptie.]) werden uitgesloten [lijst beschikbaar op aanvraag] bij onze biomerker-analyse omdat vitamine-supplementen, medicijnen en dieet een impact kunnen hebben op de concentraties metabolieten onafhankelijk van de ziekte-toestand. [514 overblijvende metabolieten] We selekteerden de top 10 potentiële M.E./CVS-biomerkers. […] 5-methoxytryptamine (5-MT) werd uitgesloten aangezien het in 50% van de gevallen wordt verstoord door het gebruik van antidepressiva. […]

Bij de top plasma-biomerkers die M.E./CVS-patiënten differentiëren van controles waren gedaalde waarden van betaïne [osmolyt], complexe lipiden (lysofosdatidylcholine [LPC], fosfatidylcholinen [PC]) en sfingomyelinen (SM), en gestegen waarden van triglyceriden (TG), α-N-fenylacetyl-glutamine [metaboliet van de ureum-cyclus], ε-caprolactam [cyclisch amide] en urobiline [afbraakprodukt van oude erythrocyten; kleurstof in de urine]. [complete lijst beschikbaar op aanvraag] Analyse leerde dat M.E./CVS-individuen verminderde waarden qua PC en ontregeling van het of choline-carnitine mechanisme vertoonden.

MetaMapp-analyse van alle metabolieten, inclusief vitaminen en neurotransmitters, bracht de biochemische en chemische relaties in kaart in een metabool netwerk-diagram. De diagrammen beschrijven verhoogde TG en vetzuren, en verlaagde carnitinen, ceramiden, SM en fosfatidylcholinen bij M.E./CVS i.v.m. controles. De analyse toonde ook verminderd 5-MT, tyrosine en indol-3-lactaat [tryptofaan-metaboliet], en verhoogd vitamine-B5 (pantotheenzuur) bij de M.E./CVS-individuen. [In detail: MetaMapp identificeerde verstoringen in het tryptofaan-metabolisme, de carnitine-‘shuttle’ (enzymen-mechanisme verantwoordelijk voor de transfer van lange-keten vetzuren door het binnenste mitochondriaal membraan om te worden afgebroken) / energie-homeostase en de complexe lipiden. Metabolieten die het tryptofaan- en carnitine-mechanisme vertegenwoordigen waren gedaald bij M.E./CVS (t.o.v. controles). In tegenstelling daarmee waren threonzuur (metaboliet van ascorbinezuur of vitamine-C), aminozuren (tyrosine, methionine & lysine), fenylacetyl-glutamine, pantotheenzuur, hexa-ethyleen-glycol (metaboliet) & ε-caprolactam gestegen bij M.E./CVS. Lipiden-analyses toonden dat terwijl metabolieten die de SM, Cer/CE (ceramide) & PC/LPC mechanismen vertegenwoordigen verminderd waren bij M.E./CVS, de TG-mechanismen waren verhoogd.]

IBS co-morbiditeit is geassocieerd met veranderde metabole profielen bij M.E./CVS-patiënten

In eerder werk (met dezelfde individuen) bleek IBS co-morbiditeit de sterkste factor die bepalend was voor de topologische netwerken gebaseerd op faecaal metagenoom gegevens (bakteriële relatieve hoeveelheden en voorspelde bakteriële metabole mechanismen). Analyse van plasma-metabolieten onthulde dat metaboloom-profielen van M.E./CVS-patiënten met IBS zich onderscheiden van controles door waarden van TG, ceramiden, fosfatidylethanolminen (PE) [membraan-fosfolipiden] en metabolieten van het carnitine-choline mechanisme.

M.E./CVS-patiënten zonder IBS co-morbiditeit vertoonden verstoringen qua PCs en het carnitine-choline mechanisme, gelijkaardig met die gevonden bij de globale M.E./CVS-groep. Statistische analyses van de plasma-metabolieten identificeerden verhoogde waarden qua ceramiden, TG, PE, 5-methylthio-adenosine [een nucleoside; zie hieronder], mannitol [een een polyol of suiker-alkohol] en betaïne, alsook gedaalde waarden LPCs en γ-butyrobetaïne [voorloper van carnitine] bij M.E./CVS-patiënten met IBS t.o.v. controles. Bij M.E./CVS-patiënten zonder IBS vonden we verminderde waarden qua tyrosine en PC, en verhoogde waarden qua TG en Tyr-Met-Lys [de 3 aminozuren tyrosine, methionine & lysine] t.o.v. controles. In vergelijking met controles hadden alle M.E./CVS-groepen (globaal, met IBS en zonder IBS) gedaalde waarden van carnitine-choline metabolieten. M.E./CVS-patiënten met IBS hebben een onderscheidend metaboloom-profiel.

M.E./CVS is geassocieerd met een gewijzigd metaboloom-profiel bij vrouwen

De metabole profielen bij vrouwen met M.E./CVS waren gelijkaardig met deze die worden gezien bij alle M.E./CVS-gevallen. De waarden van complexe lipiden (LPC & PC) waren gedaald en de TG-waarden waren verhoogd bij M.E./CVS vs. controles. Bij de top 10 plasma biomerkers die de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten differentieerden van de vrouwelijke controles waren verlaagd indol-3-lactaat en γ-butyrobetaïne. Deze bleken ook gereduceerd bij de globale M.E./CVS-groep maar behoorden niet tot de top 10.

Geselekteerde metabolieten als potentieel diagnostisch instrumetn bij M.E./CVS

M.E./CVS vs. controles

We testten de sensitiviteit en de specificiteit van de top 10 M.E./CVS-biomerkers […]. Deze metabolieten onderscheiden de M.E./CVS-individuen van de controles met een accuraatheid (‘receiver operating characteristic’ (ROC) [ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit] & ‘area under the curve’ (AUC) [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] van 0.960 (kruis-validatie [een techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] AUC = 0.820). Er bleken in onze eerder studie 8 bakteriële soorten M.E./CVS te voorspellen […] (Coprococcus (C.) catus, Pseudoflavonifractor (P.) capillosus, Dorea (D.) formicigenerans, Faecalibacterium (F.) prausnitzii, Clostridium (C.) asparigiforme, Sutterella (S.) wadsworthensis, Alistipes (A.) putredinisand Anaerotruncus (A.) colihominis; kruis-validatie AUC = 0.745). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (ROC AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.836) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart. […]

IBS-subgroepen vs. controles

[…] De top 10 metabolieten onderscheiden M.E./CVS met IBS van de controles met een accuraatheid van AUC = 0.877 (kruis-validatie AUC = 0.754). In onze eerdere studie werden 9 bakteriële soorten geselekteerd om M.E./CVS+IBS te voorspellen […] (F. cf., F. prausnitzii, Bacteroides (B.) vulgatus, A. putredinis, C. catus, Anaerostipes (A.) caccae, D. formicigenerans, A. colihominis & C. asparagiforme; kruis-validatie AUC = 0.791. Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.824) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Bij M.E./CVS zonder IBS zorgden de top 10 metabolieten ook voor een onderscheid met een hoge accuraatheid (AUC = 0.975, kruis-validatie AUC = 0.839). In onze eerdere studie werden 7 bakteriële soorten geselekteerd om ME/CFS-IBS te voorspellen (B. caccae, P. capillosus, Parabacteroides (P.) distasonis, B. fragilis, Prevotella (P.) buccalis, B. xylanisolvens & D. formicigenerans; kruis-validatie AUC = 0.754). Een model dat metagenoom- en metaboloom-gegevens integreert, geeft een betere voorspellende waarde (MET+BACT: AUC = 1.000, kruis-validatie AUC = 0.880) dan metagenoom- of metaboloom-gegevens apart.

Plasma metaboloom-profielen, faecale bakteriële profielen en symptoom-scores bij M.E./CVS

[lijst met unieke en gedeelde metabolieten in de M.E./CVS-subgroepen beschikbaar op aanvraag]

De relatieve aantallen van bakteriële soorten in faeces van de individuen varieerden met hun plasma metaboloom-profielen. Verminderd betaïne bleek geassocieerd met minder A. colihominis. Gedaald PC 30:0 correleerde met minder A. putredinis, een bakterie die sulfonolipiden – ongewone sfingolipiden die struktureel gerelateerd zijn met ceramiden – produceert. Van sfingolipiden is geweten dat ze bakterieën helpen overleven en stress-resistentie bevorderen.

Bij M.E./CVS met IBS was 5-methylthio-adenosine (een metaboliet afgeleid van S-adenosylmethionine als neven-produkt van de polyamine-biosynthese, dat toxisch kan zijn voor zoogdier-cellen) geassocieerd met funktionele stoornissen. Ceramide was geassocieerd met verhoogde lichamelijke vermoeidheid. Gedaald γ-butyrobetaïne correleerde met meer Faecalibacterium, een bakterie die een belangrijke rol speelt bij de aanmaak in de dikke-darm van butyraat [boterzuur], een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten.

In M.E./CVS zonder IBS correleerde gedaald tyrosine met minder P. distasonis. Verhoogd TG 54:6 A was gecorreleerd met D. formicigenerans, en TG 54:8 was gecorreleerd met minder B. caccae & D. formicigenerans. Parabacteroides & Bacteroides soorten hebben het vermogen complexe polysacchariden om te zetten in energie-bronnen. D. Formicigenerans is een koolhydraten-fermenterende bakterie die mierenzuur en lactaat produceert.

TDA-analyse voor netwerk-identificatie

‘Topological data analysis’ (TDA) [zie methodes] van plasma metaboloom- en faecaal metagenoom-gegevens, en klinische symptoom-ernst identificeerde netwerken die M.E./CVS van controles onderscheiden. Profielen van bakteriële relatieve aantallen waren sterkere bepalende factoren voor netwerk-onderscheid dan plasma-metabolieten.

Bespreking

We rapporteerden eerder dat M.E./CVS-patiënten met IBS, M.E./CVS-patiënten zonder IBS en normale controle-individuen groep-specifieke verschillen vertonen qua faecale microflora. We hebben de karakterisatie van dezelfde individuen uitgebreid d.m.v. gerichte en ongerichte metaboloom-analyses van het plasma en geïntegreerde analyse van plasma metaboloom-, faecal metagenoom- en klinische gegevens.

De groep van Naviaux rapporteerde eerder gedaalde plasma-waarden van sfingomyelinen, ceramiden en fosfolipiden (met uitzondering van 18:1 & PC 22:6, die gestegen waren). Tomic et al. rapporteerden verhoogde plasma-waarden TG. [Lipid and protein oxidation in female patients with Chronic Fatigue Syndrome. Arch Med Sci (2012) 8: 886-891] Germain et al. rapporteerden over metabolome biomerkers voor het verstoorde aminozuren-, energie-, suiker- en vetzuren-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [zie hierboven] Geen van deze research-groepen onderzocht de impact van IBS op metaboloom-profien bij M.E./CVS. Onze analyse bevestigde de gedaalde waarden van fosfolipiden en SM, en de gestegen waarden van TG, maar verschilde met betrekking tot specifieke molekulen. We vonden bij de gevallen geen verschillen qua PC 18:1 & PC 22:6. We vonden ook geen consistente afname qua ceramide-waarden. Terwijl M.E./CVS zonder IBS verminderde waarden van de ceramiden d43:1 & d42:1 vertoonden, bleken bij M.E./CVS met IBS verhoogde waarden van 6 ceramiden: d36:1, d40:0, d42:0, d 34:1, d38:1 & d40:1.

Ceramide is een was-achtig lipide dat betrokken is bij de suppressie van elektronen-transport, insuline- & leptine-resistentie, en apoptose. Eerdere studies meldden dat ceramiden betrokken zouden kunnen zijn bij de pathologie van IBS en metabole aandoeningen. Verhoogde waarden van lipopolysacchariden (LPS) geassocieerd met een gewijzigd darm-microbioom [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30] kunnen de aktivatie van sfingomyelinase (SMAse [enzyme]) en de hydrolyse [splitsing] van SM triggeren om ceramide te produceren. Ceramiden zijn toxisch voor veel cel-subtypes via de aanmaak van reaktieve zuurstof-soorten en zou een rol kunnen spelen bij darm-barrière-dysfunktie en verhoogde darm-permeabiliteit. Er werden gestegen waarden van ceramide gerapporteerd in mucosa [(darm)slijmvlies] -stalen van IBS-patiënten alsook in plasma- en weefsel-stalen bij diabetes, cardiomyopathie, insuline-resistentie, atherosclerose [‘aderverkalking’] en steatohepatitis [‘vette lever’; veroorzaakt levercirrose]. Het blokkeren van SMAse om ceramide-waarden te doen dalen kan therapeutisch zijn door inflammatie te reduceren. Patiënten met M.E./CVS en IBS hadden ook hogere plasma mannitol-concentraties. We speculeren dat mannitol de permeabiliteit kan verhogen van de darm-mucosa en de bloed-hersen-barrière resulterend in het doorlaten van molekulen zoals cytokinen en neurotransmitters, wat bijdraagt tot de ziekte.

Net als Armstrong en z’n collega’s, vinden we wijzigingen qua metabolieten geassocieerd met het mitochondriaal energie-metabolisme. Een eerdere studie meldde significante dalingen van TCA-cyclus metabolieten gerelateerd met het energie-metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. [Yamano E et al.] De gerapporteerde dysfunktie had een impact op het carnitine-metabolisme en ATP/energie-metabolisme in de spieren van M.E./CVS-patiënten. [Armstrong CW et al. (2015)] Carnitine is een belangrijk supplement dat acyl-CoA transfereert naar de mitochondriale matrix en deelneemt aan vetzuur β-oxidatie (TCA-cyclus, ATP-produktie en energie-metabolisme). Studies omtrent carnitine-waarden in het serum en plasma bij M.E./CVS bleken niet overtuigend: sommige teams meldden reducties terwijl andere normale waarden vonden. In een open-label studie met 30 patiënten, bleken acetyl-carnitine supplementen de vermoeidheid en cognitieve funktie verbeteren bij 59% van de M.E./CVS-patiënten. [Vermeulen RC & Scholte HR. Exploratory open label, randomized study of acetyl- and propionylcarnitine in Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom Med (2004) 66: 276-282; zie ook ‘Lange-keten acylcarnitine deficiëntie bij CVS] In onze studie waren molekulen van het choline-carnitine mechanisme gedaald bij M.E./CVS-patiënten ongeacht hun IBS-status.

Onze resultaten zijn consistent met vroegere rapporten die suggereren dat metabolieten gelinkt met het lipiden- en energie-metabolisme aangetast zijn bij M.E./CVS. Ze breiden vroeger werk uit door aan te tonen dat M.E./CVS-individuen met IBS co-morbiditeit een duidelijk verschillend metaboloom-profiel hebben t.o.v. M.E./CVS-individuen zonder IBS en controles.

Veel M.E./CVS-patiënten in onze groep namen vitamine-B supplementen (26/50, 52%) die het potentieel hebben de waarden van pantotheenzuur te doen stijgen. Het gebruik van vitamine-B supplementen was geassocieerd met hogere waarden van pantotheenzuur en lagere vermoeidheid-scores (gegevens niet getoond). Het aantal stalen was echter onvoldoende groot om een significant verband te testen. Plasma-waarden van 5-MT, een molekule gerelateerd met het tryptofaan-, serotonine- en melatonine-metabolisme, waren gedaald bij M.E./CVS; deze bevinding werd echter verstoord door het gebruik van selektieve serotonine heropname inhibitoren (SSRIs) of andere antidepressiva (serotonine-norepinefrine heropname inhibitoren en tricyclische antidepressiva) bij 25 van de 50 (50%) M.E./CVS-individuen vs. 6 of 50 (12%) gezonde controles. Voorafgaande metaboloom-studies hebben gereduceerde waarden van 5-MT in het plasma aangetoond bij chronische, maar niet acute, SSRI-toediening. In menselijke cellen is 5-MT een belangrijk metaboliet dat betrokken is bij de omzetting van serotonine (5-hydroxytryptamine) en melatonine (N-acetyl-5-methoxytryptamine). Er werden eerder al gedaalde waarden van serotonine-transporters, die een rol spelen bij het reguleren van serotonine-waarden in de synapsen, gerapporteerd bij M.E./CVS. [Yamamoto S. et al. Reduction of serotonin-transporters of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neuroreport (2004) 15: 2571-2574]

Correlatie-studies suggereerden mogelijke verbanden tussen 5-MT neurotransmitter metabolieten en de ernst van M.E./CVS, inclusief verstoorde cognitieve funktie, slaap-stoornissen en globaal verhoogde vermoeidheid-scores bij M.E./CVS. Bijkomende studies met grotere aantallen individuen zullen nodig zijn om te bekijken of plasma-waarden van pantotheenzuur of 5-MT gecorreleerd kunnen worden met symptomen en om te bepalen of er een subgroep M.E./CVS-patiënten is waarvan kan worden voorspeld dat ze voordeel haalt uit medicijnen die de geassocieerde mechanismen moduleren.

In onze studie waren 41 van de 50 M.E./CVS-individuen (82%) vrouwen, net zoals 41 op 50 (82%) controle-individuen. Gezien het feit dat de overgrote meerderheid patiënten en controles vrouwen waren, is het niet verrassend dat de bevindingen bij vrouwen met M.E./CVS gelijkaardig waren met de bevindingen in de globale M.E./CVS-groep. Beide hadden lage waarden complexe lipiden (LPC & PC) en hogere waarden TG dan controles. De studie-groep omvatte slechts 9 M.E./CVS mannen en 9 mannelijke controles; dus is er onvoldoende ‘power’ om ev. verschillen tussen vrouwen en mannen te bekijken. Dit verschil qua prevalentie per geslacht is kenmerkend voor M.E./CVS (typisch 4:1 vrouwen:mannen).

Ons voorspellend model onderscheidt M.E./CVS-patiënten van controles met hoge accuraatheid; maar dit dient echter te worden geverifieerd via een onafhankelijke studie.

M.E./CVS is een heterogene aandoening. Identificatie van M.E./CVS-subgroepen die worden gekarakteriseerd d.m.v. specifieke metaboloom-profielen die primaire metabolieten, biogene aminen, complexe lipidomica [studie van mechanismen en netwerken van cellulaire lipiden in biologische systemen] en oxylipinen integreren, zouden de aflijning van subtypes moeten mogelijk maken en leiden tot specifieke diagnostische en therapeutische strategieën.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.