M.E.(cvs)-wetenschap

oktober 29, 2011

Een Epidemie van Valse Beweringen

Filed under: Wetenschap - algemeen — mewetenschap @ 5:48 pm
Tags: , , ,

John Ioannidis – arts, professor geneeskunde / gezondheid-research & -beleid en afdeling-hoofd van de het ‘Stanford Prevention Research Centre’ aan de ‘Stanford University School of Medicine’ – bespreekt belangrijke problemen bij biomedische research en manieren om de planning, uitvoeringen en rapportering sterker te maken.

Scientific American Magazine Juni 2011

Een Epidemie van Valse Beweringen

Competitie en belangen-conflicten vervormen te veel medische bevindingen

John P. A. Ioannidis

Vals positieven en overdreven resultaten bij ‘peer-reviewed’ wetenschappelijke studies hebben in de afgelopen jaren epidemische proporties aangenomen. Het probleem is alomtegenwoordig in de economische, sociale en zelfs in de natuur-wetenschappen, maar het is vooral kolossaal in de biomedische wetenschappen. Veel studies die claimen dat sommige medicijnen of behandelingen nuttig zijn, bleken niet waar te zijn. We hoeven maar te kijken naar de tegenstrijdige bevindingen over beta-caroteen, vitamine-E, hormoon-behandelingen, Vioxx en Avandia. Zelfs wanneer effekten autenthiek zijn, is de ware omvang ervan vaak kleiner dan aanvankelijk werd beweerd. Het probleem begint met de stijgende verwachtingen van de wetenschap bij het publiek. Doordat ze menselijk zijn, hebben wetenschappers de neiging om aan te tonen dat ze meer weten dan eigenlijk het geval is. Het aantal onderzoekers – en het aantal experimenten, observaties en analyses die ze produceren – is ook exponentieel toegenomen in vele gebieden, maar afdoende beveiligingen tegen vooroordelen ontbreken. Onderzoek is gefragmenteerd, de concurrentie is fel en de nadruk wordt vaak gelegd op afzonderlijke studies in plaats van het grote geheel. Veel onderzoek wordt uitgevoerd om andere redenen dan het streven naar waarheid. Belangen-conflicten zijn er in overvloed en ze beïnvloeden de resultaten. In de gezondheid-zorg wordt onderzoek vaak uitgevoerd in opdracht van bedrijven die een groot financieel belang bij de resultaten hebben. Zelfs voor academici staat of valt het succes vaak met het publiceren van positieve bevindingen. De oligopolie van ‘high-impact’ tijdschriften heeft ook een verstorend effekt op de financiering, academische carrière en de markt-aandelen. De industrie maakt de onderzoek-agenda op maat van hun behoeften, wat ook de academische prioriteiten, tijdschrift-omzet en zelfs de publieke financiering vorm geeft.

De crisis zou het vertrouwen in de wetenschappelijke methode niet mogen schaden. De mogelijkheid om iets als vals aan te duiden blijft een kenmerk van de wetenschap. Maar wetenschappers moeten de manier waarop ze hun onderzoek uitvoeren en hoe ze bewijs verspreiden verbeteren. Ten eerste moeten we routinematig robuuste en uitgebreide externe validatie eisen – onder de vorm van bijkomende studies – voor elk rapport dat beweert iets nieuws te hebben gevonden. Veel onderzoek-gebieden besteden weinig aandacht aan de noodzaak van replicatie of zijn er te spaarzaam mee en doen het op goed geluk. Ten tweede: wetenschappelijke rapporten moeten rekening houden met het aantal analyses die zijn uitgevoerd, wat neiging tot vals positieven zou bagatelliseren. Natuurlijk zou dat betekenen dat sommige geldige claims over het hoofd worden gezien. Hierbij zouden grote internationale samenwerking-verbanden onontbeerlijk zijn. Epidemiologie van het menselijk genoom heeft een goed ‘track-record’ omdat enkele grote consortia rigoureus genetische risico-factoren valideren. De beste manier om ervoor te zorgen dat de test-resultaten worden geverifieerd, zou zijn dat wetenschappers hun gedetailleerde experimentele protocollen registreren vooraleer hun onderzoek te starten en de volledige resultaten en gegevens openbaar maken wanneer het onderzoek klaar is. Op dit moment worden resultaten vaak selektief gerapporteerd waarbij de nadruk wordt gelegd op de meest opwindende, en buitenstaanders hebben vaak geen toegang tot wat ze nodig hebben om studies te repliceren. Tijdschriften en financiering-agentschappen moeten volledige openbaarheid van alle gegevens en analytische methoden voor elk gepubliceerd artikel sterk aanmoedigen. Het zou ook helpen als wetenschappers op voorhand de beperkingen van hun gegevens of de inherente gebreken van hun studie-ontwerpen zouden meegeven. Zo ook moeten wetenschappers en sponsors grondig alle potentiële belangenconflicten omschrijven. Sommige onderzoek-gebieden hebben één of meerdere van deze mechanismen overgenomen. Grote internationale consortia worden steeds gemeengoed in de epidemiologie; tijdschriften zoals ‘Annals of Internal Medicine’ en het ‘Journal of the American Medical Association’ instrueren auteurs om studie-beperkingen te adresseren en veel tijdschriften stellen vragen over belangen-conflicten. Het op grote schaal toepassen van de maatregelen zal echter niet gemakkelijk zijn.

Vele wetenschappers die zich bezighouden met onderzoek van hoge inzet zullen weigeren grote onthullingen te doen. Nog belangrijker: veel essentieel onderzoek werd al overgelaten aan de farmaceutische en biomedische industrie, die soms ontwerpen en studies rapporteren op een manier die het meest gunstig is voor hun produkten. Dit is een knelpunt. Hogere investeringen in ‘evidence-based’ klinisch en populatie-onderzoek, bijvoorbeeld, zou niet moeten worden ontworpen door de industrie maar door wetenschappers zonder belangen-conflicten.

Uiteindelijk zouden bevindingen die wegen op behandeling-beslissingen en het beleid moeten verschijnen met een uitleg over onzekerheden die ze omgeven. […]

Advertenties

oktober 22, 2011

Verhoogd HDAC samen met verlaagd Cortisol bij ouderen met CVS

Bij een studie van 2 gen-gen associatie-netwerken bij CVS (Integratie van klinische, genetische en proteïne-gegevens bij CVS) bleek HDAC7A in beide voor te komen. Gen-expressie van HDAC7A (een gen dat codeert voor een histoon-deacetylase (enzyme); histoon-acetylatie/-deacetylatie verandert de struktuur van chromosomen en beïnvloedt de toegang van transcriptie-factoren tot DNA) bleek tevens gecorreleerd met onverklaarde vermoeidheid in een andere studie (Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene-expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405).

In onderstaand artikel worden verbanden gelegd tussen HDAC’s en andere bevindingen bij M.E.(cvs): voornamelijk verlaagd cortisol, de verstoorde HPA-as en de mogelijk rol van de Glucocorticoid Receptor (gecodeerd door het NR3C1-gen; zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS’). Dit laatste hangt dan weer samen met de immuniteit/inflammatie via NF-κB (zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’ en ‘NF-κB en Inspanning’). Verregaande conclusies zijn nog niet aan de orde daar deze studie slechts een kleine groep ouderen met CVS omvat

Histoon-deacetylases (HDAC) zijn een klasse enzymes die acetyl-groepen (O=C-CH3) van een geacetyleerd lysine (bepaald aminozuur) op een histoon (histoon-proteïnen = kleine eiwitten met een hoog aantal positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA binden; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt) verwijderen. Zo wordt (via acetylering -via histoon-acetyltransferase (HAT)- en deacetylering) de vertaling van DNA (dat rond de histonen is gewikkeld) naar RNA geregeld. HAT’s en HDAC’s gaan een fysieke interaktie aan met een sequentie-specifieke transcriptie-factor (TF). Ze werken gewoonlijk in een multi-molekulair complex (enzymatisch complex), waarbij de andere subunits nodig om nucleosomen rond de binding-plaats te modifiëren. Er zijn 4 klassen HDACs, telkens met verschillende leden (HDAC’s 1-11 en sirtuinen, SIRT 1-7).

*************************

Brain Behav Immun. 2011 Apr 28. [pre print]

Increased HDAC in association with decreased plasma cortisol in older adults with Chronic Fatigue Syndrome

Jason L, Sorenson M, Sebally K, Alkazemi D, Lerch A, Porter N, Kubow S

Department of Nursing, DePaul University, Chicago, IL, United States

Samenvatting

Hypocortisolisme is een frequente bevinding bij individuen met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) [zie opmerking in rood hieronder], waarbij andere research-bevindingen ook een potentiële ontregeling van de glucocorticoid-signalisering [zie links in onze inleiding] impliceren. Glucocorticoid-signalisering staat onder invloed van diverse mechanismen, waarvan meerdere van interesse zijn bij de studie van CVS. Oxidatieve stress en verminderde anti-oxidante capaciteit staan er om bekend de hypothalamus-hyopfyse-bijnier (HPA) as te verstoren en de aanwezigheid van histoon-deacetylases (HDAC) zouden ook een impact kunnen hebben op de glucocorticoid-signaliserinng. De intentie van deze piloot-studie was de relatie tussen oxidatieve stress elementen, selekte HDAC’s (2/3) en glucocorticoid receptor signalisering te onderzoeken bij een groep ouderen met CVS. De bevindingen suggereren verhoogde aktiviteit van histoon-deacetylases, lager totaal anti-oxidant vermogen in de context van verlaagde plasma-cortisol en verhoogd plasma dehydroepiandrosteron die samen voorkomen met verminderde expressie van het gen coderend voor de Glucocorticoid Receptor. Deze bevindingen ondersteunen de aanwezigheid van HPA-as ontregeling bij oudere individuen met CVS.

1. Inleiding

In volwassen populaties, is de ontregeling van de hypothalamus-hyopfyse-bijnier (HPA) as geassocieerd met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), suggestief voor een gewijzigde fysiologische respons op stress. Verscheidene studies hebben glucocorticoïde regulering bij CVS aangewezen, met een waaier aan bevindingen: volwassenen met CVS vertonen lagere cortisol-waarden [D.i. echter geen alomtegenwoordige bevinding… Uit ‘Neuro-immunologisch model voor CVS: “Een aandacht-punt van het onderzoek betreffende de CVS-pathofysiologie is de exploratie van afwijkingen van de HPA-as. Nogmaals: dit is niet absoluut, maar er bestaat bewijs voor een milde HPA-as suppressie met onderdrukte produktie van adrenocorticotroop hormoon (ACTH) in respons op psychosociale stress en een verhoogde invloed van negatieve feedback van cortisol op de HPA-as. Gezien de immunosuppressieve effekten van glucocorticoid-hormonen, is het gemakkelijk te bedenken hoe hypo-funktie van de HPA-as zou kunnen bijdragen tot de inflammatoire pathologie van CVS het ontbreken van een negatieve regulator van het immuunsysteem. De oorzakelijkheid van deze relatie blijft echter ook onopgelost: bestemt een hypo-aktieve HPA-as voor tot CVS, of moedigt de immuun-dysfunktie van CVS de abnormale funktie van de HPA-as aan?”], een mogelijk gebrek aan responsiviteit van de HPA-as, een patroon van glucocorticoïde resistentie en ontwrichting of ontregeling van het verwachte diurnale cortisol-patroon [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason L, Maher K, Fletcher MA, Reynolds N,Brown M. The associations between basal salivary cortisol and illness-symptomatology in Chronic Fatigue Syndrome. J. Appl. Biobehav. Res. (2008) 13: 157-180; zie ‘Cortisol bij CVS – verband met pijn en vermoeidheid]. Eerder vonden we verminderde genetische expressie van de glucocorticoid receptor (NR3C1) gelijktijdig met lage waarden qua plasma-cortisol bij CVS [Jason LA, Sorenson M, Porter N, Brown M, Lerch A, Van der Eb C, Mikovits J. Possible genetic dysregulation in paediatric CFS. Psychology (2010) 1: 247-251; zie ‘Mogelijke Genetische Ontregeling bij Pediatrische CVS (NR3C1 & NF-kB)]. De aanwezigheid van een verminderde boodschap-overdracht bij minder hormoon leidde tot een concept van epigenetische ontregeling van GR-signalisering. Op basis van de literatuur besloten we dat HDAC’s de meest waarschijnlijke schuldigen waren. Deze piloot-studie werd ontworpen om dit te testen.

Histoon-deacetylases (HDAC) zijn een groep enzymes met uitgesproken effekten op gen-regulering. Deze enzymes inhiberen gen-regulering via de verwijdering van acetyl-groepen, wat uiteindelijk gen-transcriptie vermindert. Dit werking-mechanisme is het primair middel waarmee glucocorticoïden hun effekten uitoefenen. HDAC’s lijken te worden gerecruteerd door glucocorticoïden en onderdrukken op hun beurt de codering van inflammatoire genen, wat bijdraagt tot de globale anti-inflammatoire werking van glucocorticoid. Een stijging qua HDAC-aktiviteit, in aanwezigheid van gedaalde glucocorticoid-concentraties zou een ontregeling van mechanisme-signalisering kunnen weerspiegelen die zou kunnen bijdragen tot een chronische pro-inflammatoire toestand. Terwijl HDAC-aktiviteit inflammatie zou kunnen onderdrukken via effekten op het NF-κB mechanisme, zouden elementen van oxidatieve stress nog steeds in staat kunnen zijn inflammatie te initiëren via effekten op het aktivator proteïne-1 [AP-1; een transcriptie-factor] mechanisme. Differentiële mechanisme-aktivatie zou de uitéénlopende immunologische bevindingen kunnen verklaren die worden geobserveerd bij mensen met CVS. Oxidatieve stress, een toestand van chronische inflammatie, zou expressie van HDAC kunnen verminderen, wat een mechanisme oplevert waarmee inflammatoire processen de expressie van HDAC kunnen beïnvloeden, en daarmee de expressie van andere genen en cel-proliferatie. Het is ook mogelijk dat de aktiviteiten van HDAC’s verminderd zijn bij bepaalde ziekte-toestanden. Het is dan ook belangrijk de relatie te onderzoeken tussen oxidatieve stress en HDAC bij mensen met CVS.

Een nauw verband tussen glucocorticoïde sensitiviteit en oxidatieve stress werd uitvoerig beschreven [Adcock IM, Cosio B, Tsaprouni L, Barnes PJ, Ito K. Redox-regulation of histone-deacetylases and glucocorticoid-mediated inhibition of the inflammatory response. Antioxid. Redox Signal. (2005) 7: 144-152]; dit zou van toepassing kunnen zijn op CVS. Oxidatieve stress is gelinkt met glucocorticoïde resistentie via de aantasting van meerdere aspecten van GR-aktivatie en -werking, inclusief verminderd GR nucleair transport [bij binding van het hormoon verplaatst de GR zich naar de cel-kern om gen-expressie te reguleren] [Okamoto K, Tanaka H, Ogawa H, Makino Y, Eguchi H, Hayashi S, Yoshikawa N, Poellinger L, Umesono K, Makino I. Redox-dependent regulation of nuclear import of the glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. (1999) 274, 10363-10371: “nucleaire translocatie van de GR is verstoord bij oxidatieve toestanden”], gereduceerde GR-transcriptie via daling qua histoon-deacetylase (HDAC) aktiviteit en verminderde expressie van glucocorticoid regulerende genen. De primaire bedoeling van deze piloot-studie was het bepalen van de basale karakteristieken van gen-expressie gezien zijn invloed op een bestanddeel van de HPA-as in een geriatrische populatie met CVS. Specifieke hypotheses waren dat individuen met CVS het volgende zouden vertonen: (1) verminderde expressie van NR3C1 die gedaalde waarden qua plasma-cortisol vergezellen; (2) verminderde expressie en aktiviteit van klasse I HDAC’s. Plasma-DHEA en totaal anti-oxidant vermogen werden geëvalueerd om andere variabelen te beoordelen die mogelijks de cortisol-secretie in deze populatie beïnvloeden.

2. Methodes

2.1. Staal

Er werden data verkregen bij 9 individuen van 65 jaar of ouder met een diagnose van CVS volgens de Fukuda criteria. Er waren 6 vrouwen en 3 mannen. De gemiddelde leeftijd was 69 (65-79). Serum-cortisol diende als een indicator voor de funktie van de HPA-as. De stalen kwamen van het ‘Whittemore Peterson Institute for Neuro-immune Disease’.

2.2. Cortisol en DHEA

Cortisol-concentraties [commerciële ELISA-test]. Aangezien cortisol zelf wordt beïnvloed door een ander hormoon, dehydroepiandrosteron (DHEA), dat betrokken bleek bij het pathogenetisch proces van vermoeidheid, vonden we het belangrijk dit hormoon ook te onderzoeken [commerciële EIA-test].

2.3. Oxidatieve stress en anti-oxidant metingen

Het is belangrijk het homeostatisch vermogen van een organisme om de effekten van oxidatieve stress te bepalen. Dit is dikwijls gedaald bij ziekte en kan worden gemeten via een reeks testen die het ijzer-reducerend vermogen van plasma (‘ferric reducing ability of plasma’, FRAP) meet.

De redox-status van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd bepaald aangezien deze cellen tijdens inflammatoire processen zijn bloodgesteld aan ROS [reaktieve zuurstof soorten], wat een doeltreffende GSH [gereduceerd glutathion] -capaciteit vereist om ROS te neutraliseren die anders de immuun-funktie kan ontwrichten. De cytosol-fractie [intra-cellulaire vloeistof met daarin de cel-organellen] van geïsoleerde PBMCs werd gezuiverd […]. HDAC-aktiviteit werd dan gemeten via een colorimetrische test […].

Een daling qua HDAC-produktie kan op z’n beurt bijdragen tot een chronische pro-inflammatoire toestand, die kan resulteren in vermoeidheid. PBMC nucleaire cel-extracten werden geïncubeerd met HDAC test-substraat (een kort peptide met een geacetyleerd lysine-residu, dat kan worden gedeacetyleerd met HDAC-enzymes). Na incubatie werd ontwikkel-vloeistof toegevoegd dat met het the gedeacetyleerd lysine-residu reageert en colorimetrisch kan worden gemeten […] als HDAC-aktiviteit.

[…] De FRAP-test meet colorimetrisch totaal anti-oxidant vermogen […] en beschrijft de status van plasma anti-oxidanten (afgezien van proteïne-sulfhydrylen [reducerende -SH groepen]). De plasma-componenten die bijdragen tot de totale anti-oxidante capaciteit wordt geschat op 15% ascorbaat, 5% alfa-tocoferol [vitamine-E], 60% urinezuur, 5% bilirubine en 15% andere anti-oxidanten. […]

2.4. Gen-expressie

De cellen werden verstuurd naar Panomic’s Inc. voor onderzoek van mRNA-transcripten. Deze test-dienst wist niets af van de klinische populatie waarvan de cellen werden verkregen […]. Het ‘Quantigene Plex’ systeem gebruikt cel-lysaten en vertakt DNA […]. Resultaten werd uitgedrukt t.o.v. het gemiddeld signaal van glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase [GAPDH; een ‘huishoudelijk’ gen; makkelijk te amplificeren en als controle gebruikt bij PCR en gen-expressie]. […]

In plaats van polymorfismen in de GR te onderzoeken, keken we naar de aanwezigheid van RNA-transcripten die de receptor-expressie aantasten. Een transcript betrokken bij receptor-acetylering was NR3C1 (nucleaire receptor sub-familie 3, groep C, lid 1 Glucocorticoid Receptor). Door deze factor te onderzoeken, keken we naar de variantie qua expressie van een factor die betrokken is bij de regulering en expressie van een element van de HPA-as bij individuen met CVS. Onze rationale voor de selektie van dit gen was de volgende: polymorfismen van het NR3C1 gen bleken geassocieerd met CVS bij volwassenen [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I; Unger ER, Vernon SD, Heim C. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-176] en dit gen is één van de voornaamste transcriptionele regulatoren van de GR. Bijkomende onderzochte transcripten omvatten HDAC2, HDAC3, SIRT1 en NGF.

Sirtuine-1 (SIRT1) [NAD-afhankelijk deacetylase] is een belangrijke regulator van het p53 mechansime [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] en lijkt apoptose bij stress te doen verminderen. SIRT1 lijkt ook circadiaanse gen-expressie te beïnvloeden [Belden WJ, Dunlap JC. SIRT1 is a circadian deacetylase for core clock components. Cell (2008) 134: 212-214]. Het p53 mechanisme wordt ook beïnvloed door histoon-deacetylases die geassocieerd zijn met corticosteroïde ontregeling. Eerder vonden we een daling in mRNA-transcripten voor NR3C1, samen voorkomend met lagere cortisol-waarden in een populatie van volwassenen met chronische vermoeidheid (niet gepubliceerde data). Verminderde boodschap-overdracht van de glucocorticoid receptor in aanwezigheid van gedaald hormoon suggereerde ontregeling van signalisering. De meest waarschijnlijke gen-kandidaten, op basis van eerdere gegevens, waren HDAC2 en HDAC3. Deze werden gekozen omwille van hun invloed op het NF-κB mechanisme en verwevenheid met glucocorticoid [Ito K, Yamamura S, Essilfie-Quaye S, Cosio B, Ito M, Barnes PJ, Adcock IM. Histone-deacetylase 2 mediated deacetylation of the glucocorticoid receptor enables NF-kappaB suppression. J. Exp. Med. (2006) 203: 7-13]. We kozen er ook voor de aanwezigheid te onderzoeken van ‘nerve growth-factor’ [NGF; een klein eiwit, belangrijk voor de groei en overleving van bepaalde neuronen, werkt ook als een signalisering-molekule; ‘nerve growth-factors’ refereert naar een familie factoren, de zgn. neurotrofinen (waartoe o.a. ook de ‘Brain-Derived Neurotrophic Factor’ (BDNF) behoort)] die geassocieerd bleek met pijn-aandoeningen en betrokken bij CVS [Seidel MF, Herguijuela M, Forkert R, Otten U. Nerve growth factor in rheumatic diseases. Semin. Arthritis Rheum. (2010) 40: 109-126; zie ook ‘Glia, glutamaat-transport en chronische pijn].

2.5. Statistische procedures

[…]

3. Resultaten

Allereerst bepaalden we cortisol- en DHEA-waarden. Er werd een laag gemiddeld plasma-cortisol gevonden (64,36 ng/ml), wat aanzienlijk minder is dan bij gezonde controles. De gemiddelde DHEA-waarde was 21,68 ng/ml, wat aanzienlijk hoger is dan wat werd opgetekend voor een populatie van gezonde ouderen van 65-79 jaar (2,7 ng/ml).

Daarna bepaalden we de gen-regulering van de GR [Glucocorticoid Receptor] NRC31 bij de 9 oudere individuen met CVS en vergeleken deze met genormaliseerde ratios voor HDAC2, HDAC3 en SIRT1. Kwantificering van expressie gebeurde via de Quantigene micro-chip. De resultaten werden dan genormaliseerd t.o.v. GAPDH en de expressie-ratios werden bepaald. [De gemiddelde expressie-verhoudingen bij oudere volwassenen met CVS waren: 0,11 voor NR3C1 (0,65), 0,166 voor HDAC2 (0,037), 0,088 voor HDAC3 (0,044) en 0,58 voor SIRT1 (0,081); de waarden tussen haakjes zijn die voor “universeel RNA”)]

NGF correleerde positief met HDAC2 (p < .05), wat in overéénstemming is met de waarneming dat NGF een belangrijke rolspeelt bij neutrofinen-afhankelijke nitrosylering [toevoegen van een nitrosyl-groep (R-N=O) aan een proteïne] van HDAC-2 op cysteine [aminozuur met een zwavel-atoom] -residuen […], wat nodig bleek om de dissociatie van HDAC-2 van chromatine [= complex van DNA en eiwitten in de celkern] te induceren en daardoor de acetylering van histonen te vergemakkelijken. DHEA correleerde daarnaast negatief met SIRT1 (p < 0.1) en de verhouding DHEA/Cortisol correleerde negatief met HDAC2 (p < .01). Daarenboven vonden we verhoogde HDAC-aktiviteit (182 pmol/min/mg proteïne), wat aanzienlijk hoger ligt dan bij normatieve controles. HDAC correleerde ook negatief met leeftijd, wat verminderde aktiviteit naar gelang de leeftijd suggereert (p < .01). Cortisol correleerde positief met HDAC3 (p < .05) wat een mogelijke relatie tussen de twee parameters ondersteunt.

Voor dezelfde 9 individuen verkregen we FRAP-resultaten uitgedrukt als ascorbinezuur [vitamine-C] -equivalenten. De gemiddelde FRAP-waarde was 227,3 µm/l, wat uitgesproken lager is dan de typisch geobserveerde waarden van 400-800 µm/l bij gezonde of hypertensieve individuen van middelbare of oudere leeftijd. FRAP correleerde positief met DHEA (p < .01) en negatief met SIRT1 (p < .01).

4. Bespreking

Onze bevindingen suggereren dat in de context van verlaagd plasma-cortisol en verhoogd plasma-DHEA, vastgesteld in een geriatrisch staal patiënten met CVS, er verhoogde HDAC-expressie en aktiviteit is, samen met verminderd totaal anti-oxidant vermogen samenlopend met downregulering van het gen NR3C1. Hoewel deze bevinding validatie vereist bij een grotere en meer diverse groep individuen met CVS, kan het de klaarblijkelijke ontregeling van diurnale cortisol-secretie [men basseert zich dus best niet op één enkelvoudige meting] die wordt gevonden bij mensen met CVS helpen verklaren.

De akties van glucocorticoïden zijn complex. In het kort: bij vermeend gezonde volwassenen, zou men verwachten dat cortisol-binding op de GR een verhoging qua klasse-I HDAC aktiviteit zou initiëren. Een stijging van deze HDAC’s, in het bijzonder HDAC2, verhoogt DNA-winding en voorkomt inflammatoire gen-transcriptie. Deze verhoogde HDAC-aktiviteit lijkt het voornaamste mechanisme te bieden waardoor glucocorticoïden dan pro-inflammatoire gen-expressie onderdrukken. In deze studie, hebben een klaarblijkelijke ontregeling van dat mechanisme gevonden. We vonden verhoogde HDAC2/3 (klasse I) aktiviteit in aanwezigheid van gereduceerde waarden van hormoon en verminderde receptor-transcriptie. Dit impliceert dat andere mechanismen zouden kunnen dienen om verhoogde HDAC-aktiviteit te behouden. Hoewel cortisol significant correleerde met het HDAC3-niveau, vonden we een globale reductie qua plasma-cortisol vergeleken met dat gevonden in studies bij controles. Een bijkomende overweging is dat oxidatieve stress de neiging heeft HDAC-aktiviteit te reduceren, een werking die tegengesteld is aan deze gezien in onze bevindingen.

Een toename qua HDAC-2 expressie en -aktiviteit zou een algemene ontwrichting van belangrijke immunoregulerende mechanismen kunnen weerspiegelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat HDAC mRNA’s verhoogd zijn in geaktiveerde immuun-cellen, wat er op wijst dat ze dienen als merkers van immuunsysteem-aktivatie en ook zouden fungeren als potentiële doelwitten voor behandeling. Verhoogde HDAC-2 aktiviteit is geassocieerd met neuronale sterfte bij een brede waaier aan neurologische aandoeningen die vormen van cellulaire oxidatieve stress omvatten en leidt tot een verminderde histoon/transcriptie-factor acetylatie en verhoogde transcriptionele repressie [Dit laatste is een essentieel mechanisme bij de precieze controle van gen-expressie. Transcriptionele repressor-proteïnen binden op hun ‘target’-genen – direct via een DNA-bindend domein of indirect door interaktie met andere DNA-gebonden proteïnen.]. Omgekeerd: HDAC-2 inhibitie werkt beschermend tegen door oxidatieve stress geïnduceerde neuronale sterfte door het verschuiven van het evenwicht tussen histoon-acetyltransferases (HAT) en HDAC ten voordele van HAT-aktiviteit; zodoende wordt de transcriptionele repressie verlicht, wat leidt tot verhoogde expressie van anti-apoptotische genen, zoals p21 en Hsp70 [een ‘heat-shock’ proteïne, beschermen cellen tegen de schadelijke effekten van oxidatieve stress zie ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ & ‘‘Heat shock’ proteïnen en inspanning bij CVS] die gelinkt zijn met neuroprotektie. HDAC-inhibitie versterkt ook de interaktie van de transcriptie-factor Nrf2 op het anti-oxidant respons-element [ARE] ter upregulering van belangrijke anti-oxidante enzymes zoals glutathion-S-transferases, NAD(P)H, quinone-oxidoreductase-1 en haem-oxygenase-1 [expressie van deze genen beschermt cellen tegen oxidatieve schade en kan mutagenese & kanker voorkomen] die anti-oxidante en anti-inflammatoire effekten faciliteren. In samenhang met bovenstaande bevindingen, lijkt het dat CVS zou kunnen geassocieerd zijn met een onevenwichtige endogene anti-oxidante respons op oxidatieve stress, wat wordt weerspiegeld door de lagere FRAP-waarden bij de CVS-individuen.

Lagere cortisol-waarden worden dikwijls gevonden bij studies van mensen met CVS [bv. Nater UM, Youngblood LS, Jones JF, Unger ER, Miller AH, Reeves WC, Heim C. Alterations in diurnal salivary cortisol rhythm in a population-based sample of cases with Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom. Med. (2008) 70: 298-305]. Eerder vonden wij een ontwrichting van het verwachte circadiaans secretie-patroon bij individuen met CVS. De huidige data demonstreren een patroon van downregulering van de NR3C1 gen-expressie in dit staal van mensen met CVS die verhoogde expressie van of HDAC2, HDAC3 en SIRT1 vertonen. De expressie van NR3C1 (het gen coderend voor de GR) was duidelijk gedownreguleerd. Interessant is dat studies hebben gevonden dat HDAC3 kan deacetyleren en dus transcriptie van NF-κB reduceren, waarvan is geweten dat het kan interfereren met GR-expressie en funktie [Nissen RM, Yamamoto KR. The glucocorticoid receptor inhibits NF-kappaB by interfering with serine-2 phosphorylation of the RNA polymerase II carboxyterminal domain. Genes. Dev. (2000) 15: 2314-2329]. Te samen met de bevinding van gedaald plasma-cortisol, biedt de gereduceerde expressie van het gen coderend voor de GR ondersteuning voor verdere research maar de werking van de HPA-as bij mensen met CVS.

Deze piloot-studie bleef beperkt tot een kleine groep en het gelimiteerd aantal onderzochte variabelen die de werking van de HPA-as beïnvloeden. Ook werd een beperkte set HDAC’s onderzocht en we keken niet naar de aktiviteit van histoon-acetyltransferase. We waren ook niet in staat een normatief controle-staal mee te nemen. De bevindingen ondersteunen evenwel ons concept voor een rol van epigenetische ontregeling van de Glucocorticoid Receptor bij het pathogenisch proces van CVS [zie ook ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid]. Het verder onderzoeken van de rol van HDAC’s bij CVS kan de variërende immunologische bevindingen die opdoken bij het bestuderen van CVS helpen verklaren. De bevindingen van deze studie dienen te worden gerepliceerd bij een groter staal en bij andere leeftijden van mensen met CVS.

oktober 9, 2011

Integratie van klinische, genetische en proteïne-gegevens bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:26 pm
Tags: , , ,

Tot op heden is er geen persistente link van één bepaald pathogeen met M.E.(cvs) gevonden. Het blijft, tot nader order, onze mening dat wellicht verscheidene micro-organismen de aandoening kunnen triggeren maar dat sub-cellulaire factoren bepalen of iemand de ziekte ontwikkeld of niet. De genetische opmaak van het individu zal daar een rol bij spelen. Gen-expressie onderzoek lijkt ons dan ook van belang. Er zijn daaromtrent wel aanwijzingen maar echter nog geen duidelijke, consistente resultaten…

Stellen dat onderzoek naar het transcriptoom (verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’, tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen) bij M.E.(cvs) daarom niet te rechtvaardigen zou zijn (zoals sommigen beweren), lijkt ons een stap te ver. De niet reproduceerbare resultaten zijn wellicht te wijten aan de (erkende) heterogeniteit binnen de ziekte. Onderzoekers dienen geschikte criteria te hanteren, de patiënten te verdelen in homogene subgroepen en rekening te houden met symptoom-domeinen (onderverdelen in herkenbare en stabiele kenmerken met een waarschijnlijke biologische associatie). Het is ook van belang de gen-expressie (‘gen-signatuur’) op te volgen met het verloop van de ziekte. (Zie de artikels onder ‘Genetica’ op de overzicht-pagina.)

De auteurs van onderstaand artikel keken ook nóg verder: naar hoe verschillende genen geassocieerd zijn, hoe hun ‘netwerken’ veranderen. Op basis van resultaten van eerder werk door anderen bouwden ze op 2 manieren dergelijke netwerken om aanwijzingen te krijgen welke genen van belang zouden kunnen zijn bij M.E.(cvs). De genen die gemeenschappelijk zijn in de 2 netwerken zouden wel es verantwoordelijk kunnen zijn voor bepaalde aspecten van M.E.(cvs) of de symptomen ervan en verdienen verder onderzocht te worden…

————————-

Bioinformation. (2011) 6: 120-4

Meta analysis of Chronic Fatigue Syndrome through integration of clinical, gene-expression, SNP and proteomic data

Vasyl Pihur1, Somnath Datta2 & Susmita Datta2

1The Johns Hopkins University, McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Baltimore, MD 21205

2University of Louisville, Department of Bioinformatics and Biostatistics, Louisville, KY 40292, USA

Samenvatting

We beginnen met het construeren van gen-gen associatie-netwerken op basis van ongeveer 300 genen waarvan de expressie-waarden variëren tussen de groepen CVS-patiënten (plus controle). Verbonden componenten (modules) van deze netwerken worden verder gecontroleerd op hun voorspellend vermogen voor symptoom-ernst, genotypen van twee ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNP) waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met symptoom-ernst en intensiteit van de tien meest discriminerende proteïne-kenmerken. We maken gebruik van twee verschillende netwerk-construktie methoden en kiezen de gemeenschappelijke genen geïdentificeerd via beide, voor bijkomende validatie. Onze analyse identificeerde elf genen die een belangrijke rol zouden kunnen spelen bij bepaalde aspecten van CVS of gerelateerde symptomen. In het bijzonder: het gen WASF3 (alias WAVE3) regelt mogelijk hersen-cytokinen die betrokken zijn bij het mechanisme van vermoeidheid via het p38 MAPK regulerend mechanisme.

Achtergrond

Chronisch Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een relatief zeldzame, slecht begrepen, complexe aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige en chronische fysieke en mentale vermoeidheid die niet toe te schrijven is aan andere oorzaken (ziekten), die soms gepaard gaat met andere symptomen, zoals een zwakke immuun-respons, problemen met de spijsvertering en depressie. Er is de voorbije jaren door de ‘CVS Groep’ bij het CDC veel moeite gedaan om klinische, gen-expressie, genotypische en proteomica [proteoom = verzameling proteïnen in een biologisch staal] data te verzamelen, in een poging een genetische basis voor CVS te vinden. Ook al werden deze gegevens door tal van onderzoekers (en onderzoek-teams) geanalyseerd – resulterend in een speciale uitgave van het tijdschrift Pharmacogenomics [Vernon SD, Reeves WC. The challenge of integrating disparate high-content data: epidemiological, clinical and laboratory data collected during an in-hospital study of Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2006) (3):345-54; zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC] – en maakten ze ook deel van de ‘Critical Assessment of Micro-array Data Analysis (CAMDA)’ conferentie in 2006, toch was het succes dubbelzinnig en beperkt. Omdat genen niet alleen handelen, bijzonderlijk bij een complexe aandoening zoals CVS, bestuderen we – bij onze poging deze gegevens via een systeem-biologische aanpak te analyseren – groepen van genen (de zogenaamde modules) verkregen via gen-gen associatie-netwerken. […] We identificeren elf “interessante” genen die een belangrijke rol kunnen spelen bij bepaalde aspecten van CVS of verwante symptomen. In het bijzonder: het gen WASF3 (alias WAVE3) dat mogelijk de hersenen-cytokinen regelt die betrokken zijn bij het mechanisme van vermoeidheid via het p38 MAPK regulerend mechanisme. Een voorlopige versie van dit werk werd gepresenteerd op de CAMDA conferentie van 2007 [Pihur V et al. Understanding Chronic Fatigue Syndrome (CFS) from CAMDA data: A systems biology approach. CAMDA 2007 Conference Paper].

Methodologie

De ‘CDC Chronic Fatigue Syndrome Research Group’ leverde data-sets op bestaande uit klinische, micro-array [‘gen-chips’], proteomica en SNP-gegevens. […] 227 individuen vulden zelf-rapportering vragenlijsten in en gaven bloed voor labo-analyse. Bij velen werden ook micro-array (163) en proteomica (63) gegevens verzameld met de bedoeling een biologische (genetische) basis voor CVS te ontdekken. Hier integreren we klinische, micro-array, SNP en proteomica data.

Micro-array data

De CAMDA 2006 micro-array data omvatten 177 arrays […] onze analyse werd aangevat met 163 arrays. […]

Klinische gegevens

UItgebreide informatie over 227 individuen die kan worden gelinkt met micro-array en SNP gegevens […].

SNP-data

42 SNP’s voor 10 verschillende genen werden getypeerd. Voor deze analyse selekteerden we 2 SNP’s, hCV245410 (op het TPH2 gen) en hCV7911132 (op het SLC6A4 gen), die eerder geassocieerd bleken met CVS-ernst [Presson A et al. Integration of genetic and genomic approaches for the analysis of Chronic Fatigue Syndrome implicates forkhead box n1. CAMDA 2006 Conference Paper].

Proteomica-data

Er waren proteïnen-spectra beschikbaar van 63 individuen. […]

Statistische analyse

De eerste stap was het identificeren van een set genen met differentiële expressie tussen verschillende groepen individuen. Ziekte-status werd afgeleid uit het klinisch deel van de CVS-gegevens. Alle individuen opgenomen bij de micro-array studie werden geklassificeerd in 5 verschillende groepen: CVS (n = 45), Niet-vermoeiden (n = 34 controles zonder CVS), ISF (n = 45 vermoeide personen die niet als CVS kunnen worden geklassificeerd omdat ze te weinig symptomen hebben), ISF-MDDm (n =20 ISF-individuen met melancholische depressie) en CFS-MDDm (n = 19 CVS-individuen met melancholische depressie). […] 286 genen bleken differentiële expressie te hebben (p-waarden < 0.01). […]

Netwerk construktie en identificatie van geassocieerde genen-sets

Om de relaties tussen de geselekteerde 286 genen beter te begrijpen qua interakties/associaties, gebruikten we twee netwerk-inferentie technieken op basis van berekeningen. De eerste methode is gebaseerd op de ‘Partial Least Squares’ regressie (PLS) [partiële kleinste kwadraten’], terwijl de tweede methode gebaseerd is gebaseerd op de ‘Partial Correlations’ (PC) [‘partiële correlaties’]. […]

Voorspelling van symptoom-ernst

Na het identificeren van clusters geassocieerde/ interagerende genen, onderzochten we het vermogen van elke module om de CVS-ernst te voorspellen. […]

SNP associatie

We bestudeerden dan hoe doeltreffend elke gen-cluster (module) de genotypes van de 2 SNP’s, hCV245410 en hCV7911132, die geassocieerd bleken met symptoom-ernst, kan voorspellen. […]

Integratie van proteomica-data

[…]

Bespreking

Twee gen-associate modules [Gen-Gen Associatie Netwerk geconstrueerd via de PLS-methode’ en het ‘Gen-Gen Associatie Netwerk geconstrueerd via de PC-methode’] zijn van belang op basis van hun voorspellend vermogen van de symptoom-ernst, ten minste één van de SNP-genotypes en de intensiteit van de geïdentificeerde proteoom-analyse kenmerken. De eerste cluster is afkomstig van het ‘PLS’-netwerk en de andere van het ‘PC’-netwerk. Elf genen bleken gemeenschappelijk voor deze twee genen-modules [WASF3 (cellulaire organisatie en biogenese, metabolisme), NUP98 (cellulaire organisatie en biogenese, transport, DNA-replicatie), PRUNE (energie-produktie en conversie), KIRREL (signaal-transductie, cellulaire adhesie), TNK2 (cellulaire organisatie en biogenese, signaal-transductie, proteïne aminozuur fosforylatie), EIF3S8 (proteïne-biosynthese), HOXA1 (transcriptie) PMS2L5 (DNA-herstel), HDAC7A (DNA-metabolisme, transcriptie), GPR41 (signaal-transductie) & MAP3K2 (proteïne aminozuur fosforylatie)] De GO [‘Gene Ontology’; weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] noteringen werden gewonnen uit de ‘BioGrid online repository’ [vrij toegankelijke database met fysieke en genetische interakties] en de ‘pathway’-analyse werd uitgevoerd met behulp van de ‘DAVID web-tools’ [‘Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery’] ter aanvulling van de bestaande literatuur. Het is aannemelijk dat deze genen verantwoordelijk zijn voor bepaalde aspecten van CVS of de symptomen ervan. Van het eerste gen op de lijst WASF3 (alias WAVE3) [WAVE3 is een lid van de WASP/WAVE proteïnen-familie, die een kritieke rol speelt bij de regulering van actine-polymerisatie, organisatie van het cytoskeleton en cel-motiliteit (-beweeglijkheid). Bij proefdieren waar het WAVE3 proteïne werd uitgeschakeld, verminderen fosfo-p38 MAPK waarden (downregulering van p38 aktiviteit). De effekten wijzen op de regulering door WAVE3 van het actine-cytoskeleton, cel-motiliteit en invasie via het p38 MAPK mechanisme.] wordt gedacht dat het deelneemt in het p38 MAPK [p38 ‘mitogen activated protein’ (MAP) kinase reageert op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleert verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose. p38 MAP-kinase inhibitoren zouden waarschijnlijk de produktie van pro-inflammatoire cytokinen en signaal-transductie kunnen blokkeren.] regulerend pad [Sossey-Alaoui K, Ranalli TA, Li X, Bakan AV, Cowell JK. WAVE3 promotes cell-motility and invasion through the regulation of MMP-1, MMP-3 and MMP-9 expression. Exp Cell Res. (2005) 308: 135-45]. Aan de andere kant werd in dier-model studies aangetoond dat de regulatie van brein-cytokinen via p38 MAPK betrokken is bij de centrale mechanismen van vermoeidheid en daardoor een rol kan spelen in de pathogenese van de CVS. De lijst bevat ook auto-immuun respons gen NUP98 [‘Nuclear pore complex protein Nup98-Nup96’, transport-processen tussen cel-kern en cytoplasma verlopen via het ‘nuclear pore complex’ (NPC) dat bestaat uit ca. 50 unieke proteïnen, nucleoporinen genaamd] en genen betrokken bij tumor-aktiviteiten (PRUNE, TNK2, HOXA1). Gen-expressie van HDAC7A [codeert voor het enzyme histoon-deacetylase; histoon-acetylatie/-deacetylatie verandert de struktuur van chromosomen en beïnvloedt de toegang van transcriptie-factoren tot DNA] bleek gecorreleerd met onverklaarde vermoeidheid in een studie [Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene-expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405]. Een rol van het gen GPR41 [ook ‘free fatty acid’ receptor 3 (FFA3) genaamd, een G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR), lid van een grote proteïnen-familie trans-membraan receptoren die molekulen buiten de cel ‘voelen’ en in de cel signaal-transductie mechanismen aktiveren] bij auto-immuun aandoeningen, inclusief CVS, werd reeds geopperd [Staines D. Are vasoactive neuropeptide auto-immune fatigue-related disorders mediated via G protein coupled receptors? Med. Hypotheses (2005) 65: 29-31; zie ook ‘Fosfodiesterase-inhibitoren tegen vermoeidheid?].

Besluit

Het is mogelijk en misschien wenselijk om informatie te integreren uit verschillende experimentele platformen ten einde complexe aandoeningen te begrijpen. De bevindingen van deze studie zijn gebaseerd op ‘data-mining’ benaderingen gebruikmakend van klinische, gen-expressie, SNP en proteomica gegevens. De voorspellende modellen die hier werden verkregen kunnen bepaalde aspecten van CVS verklaren en een pad effenen voor verdere experimentele validatie.

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.