M.E.(cvs)-wetenschap

oktober 17, 2014

Variaties qua cytokinen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 8:14 am
Tags: , ,

In Volume 70, Nummer 1 van het wetenschappelijk tijdschrift Cytokine (November 2014) – het ‘ICIS Abstract Issue’ over de ‘ICIS Conference’ Melbourne, Australia (26-29 October 2014) staan 3 rapporten over de rol van cytokinen bij Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.). De ICIS, ‘International Cytokine and Interferon Society’, is een vzw van meer dan 600 wetenschappers die research doen met betrekking tot cytokine, interferon en chemokine cel-biologie, molekulaire biologie, biochemie en het klinisch gebruik van deze molekulen.

We hebben hier al meermaals aangegeven dat voorzichtig dient te worden omgesprongen met veralgemenende conclusies over cytokinen bij deze aandoening. De bepaling-techniek, het soort staal, het tijdstip van afname (zie ‘Cytokinen bij CVS ’s nachts’), de duur van de ziekte, de subgroep, diagnostische criteria, de relatie met inspanning, enz. kunnen de waarden heel erg beïnvloeden.

De hier beschreven onderzoeken zijn van de hand van het team rond Sonya Marshall-Gradisnik & Ekua Brenu van de Griffith University – die al heel erg productief bleken met publicaties aangaande het immuunsysteem bij M.E.(cvs) (zie bv. ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’, ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ of ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’) – breiden de mogelijke klassificaties nog verder uit. Dit betekent o.i. dat één (of zelfs meerdere) cytokine(n) ons niet in staat zullen stellen de diagnose M.E.(cvs) zomaar te stellen; M.E.(cvs)-patiënten en hun behandelaars kunnen dus maar beter voorzichtig zijn met de interpretatie van resultaten van cytokine-bepalingen. Zoals Prof. Klimas reeds stelde: “Ondanks bewijzen voor immunologische en molekulaire mediatoren, werd er geen individuele merker of combinatie of merkers gevonden die voldoende geassocieerd bleek met CVS om als een biomerker voor de diagnose of het management van CVS te gebruiken.” (zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS’).

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 31 November 2014

The role of cytokines in the cerebrospinal fluids of patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Sonya Marshall-Gradisnik (1), Gunnar Gottschalk (2), Sandra Ramos (1), Ekua Brenu (1), Don Staines (1), Dan Peterson (2)

1 Griffith University, Parklands, QLD, Australia

2 Simmaron Research, Incline Village, NV, USA

Doelstellingen Eerdere research leverde bewijs voor een ontregeling van de cytokine-concentraties in het perifeer bloed van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.). Weinig studies hebben cytokinen in het cerebrospinaal vocht onderzocht. Het doel van deze research is het bekijken van de rol van cytokinen bij de symptoom-presentering bij of CVS/M.E-patiënten.

Methodes Er werd cerebrospinaal vocht (CSV) van 18 CVS/M.E-patiënten en 5 gezonde controles verzameld. De CSV-stalen werd onderzocht wat betreft expressie van 27 cytokinen (IL-1beta, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17, ‘basic’ FGF [‘fibroblast growth factor’], eotaxine [een chemokine], G-CSF [granulocyt kolonie-stimulerende factor], GM-CSF [granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor], IFN-gamma, IP-10, MCP-1 [monocyten chemo-attractant proteïne; een inflammatoire mediator gesecreteerd door geaktiveerde microglia], [Macrofaag Inflammatoir Proteïne] MIP-1alfa, MIP-1beta, [platelet-derived growth factor’] PDGF-BB, RANTES [selektief chemotactisch cytokine voor T-lymfocyten en monocyten], TNF-alfa en VEGF [vasculaire endotheliale groeifactor]) d.m.v. de bioplex test voor 27 menselijk cytokinen.

Resultaten Van de onderzochte cytokinen waren er slechts vier significant gereduceerd bij de CVS/M.E.-patiënten in vergelijking met de controles.

Besluiten De resultaten tonen een daling qua pro-inflammatoire cytokinen in het CSV van CVS/M.E-patiënten en dit zou kunnen bijdragen tot de klinische ziekte-progressie.

[gerelateerd:

Lloyd A, Hickie I, Brockman A, Dwyer J, Wakefield D. Cytokine levels in serum and cerebrospinal fluid in patients with Chronic Fatigue Syndrome and control subjects. J Infect Dis. (1991) 164: 1023-4. (artikel niet on-line beschikbaar)

Natelson BH, Weaver SA, Tseng CL, Ottenweller JE. Spinal fluid abnormalities in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Diagn Lab Immunol. (2005) 12: 52-5. “11 cytokinen detekteerbaar in het CSV – GM-CSF lager bij patiënten t.o.v. controles – IL-8 hoger bij patiënten met plotse aanvang t.o.v. graduele aanvang – IL-10 hoger bij patiënten met abnormale CSV t.o.v. normale CSV of controles.”]

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 45 November 2014

Serum cytokines in patients with moderate and severe Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Sharni L. Hardcastle, Ekua Brenu, Naomi Wong, Samantha Johnston, Thao Nguyen, Teilah Huth, Ally Hawthorn, Rachel Passmore, Sandra Ramos, Ali Salajegheh, Don Staines, Sonya Marshall-Gradisnik

National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Doelstellingen Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een invaliderende ziekte met een ongekende etiologie en de diagnose is gebaseerd op symptoom-specifieke criteria. Immunologische ontregeling en cytokine-abnormaliteiten komen consistent voor bij CVS/M.E. Aangezien studies het belang hebben beklemtoond van het bepalen van ziekte-ernst subgroepen, was het doel van deze studie de relatie tussen ernst-subgroepen bij CVS/M.E. verder te onderzoeken, via het bepalen van Th1/Th2/Th17 en inflammatoire cytokinen bij patiënten met ernstige (bedlegerig) en matige (mobiel) CVS/M.E.

Methodes We gebruikten de 1994 CDC Criteria voor CVS/M.E. om de deelnemers te definiëren en ernst-schalen zoals de ‘Fatigue Severity Scale’ (FSS), ‘Dr. Bell’s Disability Scale’, de ‘FibroFatigue Scale’ en de ‘Karnofsky Performance Scale’ (KPS) werden aangewend ter bevestiging van subgroepen met matige (mobiel) of ernstige (bedlegerig) CVS/M.E. De deelnemers omvatten gezonde controles (n = 22; 40,14 ± 2,38 jaar), mobiele (n = 22; 42,09 ± 2,72 jaar) en bedlegerige (n = 19; 40,21 ± 1,57 jaar) CVS/M.E-patiënten. De serum-stalen werden beoordeeld d.m.v. de Bio-Plex Test voor cytokine-analyse. De cytokinen die werden gemeten, waren IL-1beta, IL-1ra, IL-2, IL-7, IL-10, IL-17, TNF-alfa en IFN-gamma.

Resultaten De resultaten toonden dat IL-1beta significant was gereduceerd bij ernstige CVS/M.E. vergeleken met matige CVS/M.E. (p = 0.002). IL-7 was significant verhoogd in de groep met ernstige CVS/M.E. vergeleken met controles en matige CVS/M.E. (p = 0.000, 0.000 respectievelijk). IFN-gamma was ook verhoogd bij ernstige CVS/M.E. vergeleken met matige CVS/M.E. (p = 0.025).

Besluit Dit is de eerste studie die variaties qua cytokinen aantoont bij matige en ernstige CVS/M.E.-patiënten waarbij alle significante verschillen liggen tussen de CVS/M.E.-ernst groepen. Deze studie ondersteunt de notie dat het noodzakelijk lijkt de CVS/M.E.-patiënten in subgroepen te klassificeren volgens ernst-graad, en dit zowel in research- als klinische settings.

[gerelateerd:

Stringer EA, Baker KS, Carroll IR, Montoya JG, Chu L, Maecker HT, Younger JW. Daily cytokine fluctuations, driven by leptin, are associated with fatigue severity in Chronic Fatigue Syndrome: evidence of inflammatory pathology. J Transl Med. (2013) 11: 93. (zie: ‘Leptine – verband met cytokinen & vermoeidheid bij CVS’)

White AT, Light AR, Hughen RW, Bateman L, Martins TB, Hill HR, Light KC. Severity of symptom flare after moderate exercise is linked to cytokine activity in Chronic Fatigue Syndrome. Psychophysiology (2010) 47: 615-24. (zie: Symptoom-opflakkering verbonden met cytokine-aktiviteit bij CVS’)]

————————-

Cytokine Vol 70, #1 Page 76 November 2014

Cytokine profiles of Chronic Fatigue Syndrome and Multiple Sclerosis patients

Naomi Wong, Ekua Brenu, Sharni Hardcastle, Samantha Johnston, Thao Nguyen, Teilah Huth, Ally Hawthorn, Rachel Passmore, Sandra Ramos, Ali Salajegheh, Simon Broadley, Don Staines, Sonya Marshall-Gradisnik

National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, School of Medical Sciences, Griffith University, Gold Coast, Qld, Australia

Doelstellingen Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en Multipele Sclerose (MS) zijn aandoeningen met ernstige neuro-immune symptomen, inclusief cognitieve stoornissen, immuun-dysfunktie en abnormale cytokine-expressie. Het doel van deze studie was de T helper (Th) 1, Th2 en Th17 cytokine-profielen van CVS- en MS-patiënten te bepalen.

Methodes Deze studie heeft de cytokine-profielen van CVS-patiënten (n = 16; leeftijd 49,88 ± 9,542), MS-patiënten (n = 16; leeftijd 52,75 ± 12,809) en gezonde controles (n = 16; leeftijd 50,06 ± 11,846) gemeten. De diagnostische selektie-methode die werd gebruikt om CVS-patiënten te identificeren was de ‘International Consensus Criteria’. Cytokinen werden bepaald in het serum d.m.v. de Bio-Plex Pro(TM) kit voor Th1 (IFN-gamma, TNF-alfa), Th2 (IL-4, IL-6, IL-10, IL-13) en Th17 (IL-17) -cel cytokinen.

Resultaten Bij vergelijking van de 3 groepen, werd gevonden dat TNF-alfa (p = 0.011, p = 0.012), IL-4 (p = 0.000, p = 0.000), IL-6 (p = 0.039, p = 0.031), IL-13 (p = 0.000, p = 0.000) en IL-17 (p = 0.004, p = 0.038) allemaal significant hoger lagen bij de MS-patiënten vergeleken met de CVS-patiënten en de controles, respectievelijk. Bij de MS-patiënten en CVS-patiënten lagen de serum-waarden van IL-13 en IFN-gamma echter significant hoger (p =< 0.001) vergeleken met de controles. IFN-gamma was significant verschillend tussen MS en CVS (p = 0.001), waarbij MS hogere IFN-gamma serum-waarden vertoonde.

Besluit Cytokine-patronen ondersteunen Th1 én Th2 cytokine-profielen bij CVS en MS. Gelijkenissen qua cytokine-profielen bij MS en CVS, in combinatie met de reeds erkende overéénkomsten qua immuun-cel funktie en symptomen, suggereren een neuro-immune pathologie voor CVS die parallel loopt met die van MS. Bijkomende studies naar de cytokine-profielen van CVS én MS dienen te worden ondernomen, met grotere studie-groepen, om het begrip omtrent de pathologieën van beide aandoeningen verder uit te breiden.

Advertenties

oktober 10, 2014

MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 5:55 am
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel komt van dezelfde onderzoeksgroep die eerder rapporteerde over veranderingen qua miRNAs in cytotoxische cellen die de funktionele capaciteit van deze cellen kunnen verminderen en de effektieve cytotoxische aktiviteit, samen met andere immuun-funkties bij CVS/ME-patiënten verstoren. Zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)’.

‘High-Throughput Sequencing’ is een techniek voor de bepaling van de sequentie (de volgorde van de nucleotiden) van DNA of RNA waarbij er veel materiaal in één keer (geautomatiseerd) kan worden verwerkt. Het wordt ook ‘next-generation sequencing’ genoemd en levert duizenden of miljoenen sequenties terzelfder tijd op. RT-qPCR, ‘reverse transcriptase’-kwantitatieve polymerase ketting-reaktie, is een techniek waarbij met vertrekt van RNA dat via ‘omgekeerde transcriptie’ wordt omgezet in cDNA (complementair DNA) om zo de gen-expressie te bepalen.

————————-

PLoS One. 2014 Sep 19;9(9): e102783

High-Throughput Sequencing of Plasma MicroRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis

Brenu EW (1), Ashton KJ (2), Batovska J (2), Staines DR (3), Marshall-Gradisnik SM (1)

1 School of Medical Science, Griffith Health Centre, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia

2 Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University, Robina, Queensland, Australia

3 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; Queensland Health, Gold Coast Public Health Unit, Robina, Gold Coast, Queensland, Australia

Samenvatting

ACHTERGROND: MicroRNAs (miRNAs) reguleren vele biologische processen en hun ontregeling bleek geassocieerd met een waaier aan ziekten inclusief Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME). De ontdekking van stabiele en reproduceerbare miRNAs in plasma heeft de mogelijkheid verhoogd dat circulerende miRNAs zouden kunnen dienen als diagnostische merkers. De doelstelling van deze studie was het bepalen van de rol van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

RESULTATEN: Gebruikmakend van Illumina ‘high-throughput sequencing’ [HTS] identificeerden we 19 miRNAs met differentiële expressie in het plasma van CVS/M.E.-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Na RT-qPCR analyse, waren we in staat de significante upregulering van 3 miRNAs (hsa-miR-127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p [has = Homo sapiens]) bij de CVS/M.E.-patiënten te bevestigen.

BESLUIT: Onze studie is de eerste om circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te identificeren en ook om 3 differentieel tot expressie komende circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te bevestigen, en zo een basis te bieden voor verdere studie om bruikbare CVS/M.E.-biomerkers te vinden.

Inleiding

[…]. Er is bewijsmateriaal dat een belangrijke ontwrichting van immunologische processen bij CVS/M.E. suggereert en deze zou gekenmerkt kunnen zijn door verminderde cytotoxische aktiviteit en verhoogde regulerende T-cellen [zie onze inleiding]. Daarnaast kunnen patiënten met CVS/M.E. differentiële expressie van mRNA en microRNA (miRNA) genen – die verscheidene fysiologische processen reguleren waarvan is geweten dat ze ontregeld zijn bij CVS/M.E., inclusief cytotoxiciteit, cytokine-secretie en apoptose – vertonen. Ondanks intensieve research wordt de pathofysiologie van CVS/M.E. nog niet volledig begrepen en blijven duidelijke diagnostische biomerkers ongrijpbaar.

MicroRNAs zijn een klasse van kleine (typisch 18-25 nucleotiden groot) enkel-strengige, niet-coderende RNAs die gen-expressie reguleren op post-transcriptioneel niveau [optredend na de overschrijving van DNA naar RNA]. Hun regulerende rollen bleken betrokken bij de meeste biologische processen, ook immunologische, neurologische en fysiologische. Differentiële expressie van miRNAs bleek geassocieerd met meer dan 300 ziekten, waaronder kanker, cardiomyopathieën [hartspier-ziekten], neurologische aandoeningen en onverklaarde aandoeningen zoals CVS/M.E. Er circuleren stabiele en reproduceerbare extracellulaire miRNAs in het bloed en andere bio-vloeistoffen, waar ze werden geïdentificeerd. Er werd voorgesteld dat deze miRNAs het potentieel hebben om te worden aangewend als niet-invasieve nieuwe biomerkers voor ziekte-diagnose en -prognose.

In deze studie gebruikten we ‘high-throughput sequencing’ om het profiel te tekenen van de expressie van circulerende miRNAs. Dit werd gevolgd door bevestigende ‘reverse transcription-quantitative’ PCR (RT-qPCR) om de differentiële miRNA-expressie bij CVS/M.E. te bepalen.

Materialen en Methodes

Deelnemers

CVS/M.E.-patiënten (n = 20, 44,5 ± 6,0 jaar) […]. Inclusie-criteria […] CDC 1994 definitie. Niet-vermoeide controles (n = 20, 47,3 ± 6,7 jaar) […].

Staal-verwerking en RNA-extractie

[…] 10 ml vol bloed […].

MicroRNA-profilering d.m.v. sequentie-bepaling

De 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles met de hoogste hoeveelheid klein RNA werden gebruikt voor HTS. […] cDNA constructie via ‘reverse transcription-PCR’ (RT-PCR) uit klein RNA, zuivering, isolatie van miRNAs en sequentie-analyse […]

Sequentie data-analyse

[…]

Kwantificering van miRNAs d.m.v. RT-qPCR

De expressie van 8 miRNAs werd gevalideerd […]. Daarnaast werd van 4 miRNAs (miR-10, miR-15b, miR-16 & miR-24) bekeken om te zien of ze geschikt zijn als een stabiel referentie-gen. […].

Statistische analyse

[…] Statistische significantie P < 0.05.

Resultaten

Karakteristieken van de individuen

[…] Er waren geen significante verschillen qua leeftijd en tellingen op vol bloed tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen. […] Er werd een significant verschil qua percentages lymfocyten en granulocyten, aantal lymfocyten en distributie-breedte van rode bloedcellen gezien tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen [telkens de 6 hierboven vermelde stalen].

HTS van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

Om kandidaat plasma-miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E. te selekteren, voerden we een initiële screening uit naar klein RNA over het ganse genoom bij 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles d.m.v. HTS. [verwerking van de gegevens leidde tot een ‘bibliotheek’] Initiële analyse van de RNA-lengtes in de ‘bibliotheek’ toonde pieken aan bij 22 en 32 nucleotiden. Deze RNA-groepen bleken miRNA en lang niet-coderend RNA (lncRNA) sequenties te bevatten. […] 17% was matuur miRNA, 80,5% was ander RNA (inclusief lncRNA en snoRNA [‘small nucleolar RNA’; klasse van kort enkelstrengig RNA dat tussenkomt bij modificaties van andere RNAs]). 75,1% van het ander RNA bestond uit lncRNA dat gekend staat als ‘Ro-associated’ RNA Y4 (RNY4) [Y RNAs zijn kleine niet coderende RNAs; oorspronkelijk geïdentificeerd als de RNA-component van ribonucleoproteïnen] […]. Bij het bekijken van de unieke RNA-stukken, bestond 44,3% uit miRNA, de andere RNA-soorten uit slechts 7%.

Differentiële expressie van plasma-miRNA bij CVS/M.E.

[…] Een totaal van 19 microRNAs was significant ontregeld bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles. Van die 19 miRNAs waren er 16 waarvan de hoeveelheid als laag werd beschouwd […], hun detektie bleek onbetrouwbaar […]. De overblijvende 3 miRNAs (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) waren allemaal ge-upreguleerd bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles.

RT-qPCR bevestiging van de plasma-miRNA sequentie-gegevens

De keuze van een stabiel referentie-gen is kritiek voor accurate gen-expressie analyse via RT-qPCR. Van de 4 vermeende referentie-genen die werden getest, bleek hsa-miR-16-5p de meest stabiele expressie te vertonen. Om de RNA-Seq resultaten (n = 6/groep) te valideren, voerden we RT-qPCR uit bij uitgebreidere groepen (n = 20/groep). Drie miRNAs met differentiële expressie (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) en vier miRNAs met niet-differentiële expressie (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103-3p, hsa-miR-146a-5p & hsa-miR-223-3p) werden geselekteerd en hun expressie gekwantificeerd gebruikmakend van RT-qPCR. De vier miRNAs met niet-differentiële expressie werden geselekteerd omdat ze eerder ontregeld bleken in cytotoxische lymfocyten van CVS/M.E.-patiënten, hoewel HTS geen differentiële expressie in plasma identificeerde. Alle RT-qPCR resultaten voor de overblijvende drie miRNAs waren consistent met de RNA-Seq gegevens.

Bespreking

Screenen op CVS/M.E. is tot nu toe gebaseerd op wel-omschreven definities. Profilering van circulerende miRNAs zou kunnen dienen om de molekulaire diagnose van CVS/M.E. te versterken. Gebruikmakend van Illumina HTS, identificeerde de huidige studie 19 miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E.-patiënten. Daarvan werden er slechts 3 bevestigd als zeer overvloedig bij de CVS/M.E.-patiënten in vergelijking met controles. Deze resultaten suggereren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CVS/M.E.

Hoewel er momenteel geen definitieve bron werd geïdentificeerd voor de aanwezigheid van miRNAs in bio-bloeistoffen, zouden bloedcellen – in het bijzonder reticulocyten [voorlopers van erythrocyten], myeloïde cellen [differentiëren naar erythrocyten, leukocyten en bloedplaatjes], lymfoïde cellen [differentiëren naar B-, T-, NK- en dendritische cellen], bloedplaatjes – cellen uit de lever, longen en nieren of gelyseerde cellen miRNAs kunnen afgeven in de circulatie. Ook zouden miRNAs in het plasma kunnen worden uitgescheiden na weefsel-schade – circulerend miR-1 & miR-133a zijn bv. significant verhoogd na acuut hart-infarct. De miRNAs in de huidige studie komen tot expressie in verscheidene weefsels. MiR-127-3p wordt gevonden in de testikels en het zenuwstelsel, miR-143-3p komt tot expressie in het colon, terwijl miR-142-5p tot expressie komt in cellen van het immuunsysteem. Er werd echter gerapporteerd dat miR-142-5p & miR-143-3p behoren tot de miRNAs die frequent worden gevonden in plasma en serum. Over-expressie van miR-142-5p werd gezien bij de meeste kanker-gerelateerde en immunologische aandoeningen. Dit miRNA komt overvloedig voor in de meeste haematopoïetische [haematopoïese = vorming van bloedcellen] cel-lijnen en zou betrokken kunnen zijn bij het counteren van inflammatoire processen. Bij Systemische Lupus Erythematosus (SLE) voorkomt verhoogde expressie van miR-142-5p in CD4+ T-cellen auto-immuniteit, terwijl een downregulering zou kunnen leiden tot autoreaktieve T-cellen en hyperaktieve B-cellen.

MiR-142-5p is belangrijk voor T-cel ontwikkeling […]. Inhibitie van miR-142-5p zou de expressie van CD84, IL-10, SAP [met SLAM – ‘signaling lymphocyte activation molecule’ – geassocieerd proteïne, een signaal-overdragend eiwit dat tot expressie komt op immuun-cellen] en IgG-produktie kunnen verhogen. CD84 is een belangrijke T-cel regulerende merker aangezien het cytokine-produktie, funktie, adhesie en interaktie met B-cellen reguleert. De waarden van IL-10 bleken dubbelzinnig bij CVS/M.E.-patiënten. De oorzaak van een stijging qua miR-142-5p is onbekend; het is echter waarschijnlijk dat dit verband zou kunnen houden met verhoogde Treg-suppressie en bijkomende auto-immune responsen.

MiR-143-3p […] is een tumor-suppressor gen en is sterk gedownreguleerd bij dikkedarm-kanker. Het inhibeert het oncogen KRAS [mutatie in het KRAS gen is essentieel voor de ontwikkeling van veel kankers]. Over-expressie van miR-143-3p doet in de meeste kanker-cellen de groei van tumoren en kanker-cellen stagneren aangezien het BCL2 [B-cell lymfoma 2] mRNA kan reduceren, waardoor het de proliferatie van tumor- of kanker-cellen voorkomt en apoptose bevordert. miR-143-3p werd geïdentificeerd als een neutrofiel-specifiek miRNA. Belangrijk: de expressie ervan wordt ge-upreguleerd in gevallen van verhoogde erythropoïese [vorming van rode bloedcellen] zoals bij polycytemie [abnormale toename van het aantal rode bloedcellen in het bloed]. Bij CVS/M.E. komt verhoogde neutrofiel-apoptose voor bij sommige patiënten [Zie: Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS] en dit komt mogelijks voort uit gestegen waarden van miR-143-3p.

MiR-127-3p interfereert met ERK-signalisering [‘extracellular signal-regulated kinases’], een tumor-suppressor, en upregulering bleek apoptose te verhogen. Belangrijk: het richt zich op BCL6 [B-cell lymfoma 6], een transcriptie-factor die p53 expressie verhoogt [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor]. BCL6 inhibeert de produktie van IL-10; daarom: het dempen van BCL6 tengevolge miR-127 upregulering zou kunnen resulteren in significante toenames van IL-10. In CVS/M.E. waren de rapporteringen over IL-10 waarden dubbelzinnig en een over-expressie van miR-127-3p zou in zekere matige sommige van deze patronen kunnen verklaren. BCL6 is een belangrijke transcriptie-factor die nodig is voor ontwikkeling van kiem-centra B-cellen [kiem-centra of ‘germinal centres’ zijn plaatsen in de lymfeknopen en het perifeer lymfe-weefsel waar rijpe B-lymfocyten snel prolifereren] en folliculaire [in de lymfe-klieren] helper T-cellen. Onregelmatigheden in de expressie van BCL6 zouden kunnen leiden tot afwijkende inflammatoire responsen en de ontwikkeling van verscheidene lymfomas.

[De volgende 3 alinea’s bespreken de technische uitdagingen qua methodiek.]

De aanwezigheid van een een hoog perecntage RNA Y4 in bij de kleine RNAs reduceerde de capaciteit van de miRNA sequentie-bepaling. Y RNAs zijn componenten van Ro ribonucleoproteïnen (RNPs) en werden eerst geïdentificeerd in het serum van patiënten met de auto-immune aandoening lupus erythematosus. Y RNAs zijn gelijkaardig qua grootte en struktuur als miRNAs aangezien ze beide vergelijkbare strukturen hebben. Deze overéénkomsten zouden de aanwezigheid van Y RNA na constructie van de kleine-RNA ‘bibliotheek’ kunnen verklaren. Efficiënte depletie van Y RNA zou ‘HTS’ miRNA gegevens van hogere kwaliteit opleveren, leidend tot diepere sequentie-bepaling. Methodes voor het verminderen van Y RNA op een zelfde manier als rRNA-depletie zou aangewend kunnen worden om de ratio van bruikbare miRNA-gegevens te verbeteren. De meeste studies over extracellulair miRNA zeggen niets over de overvloedigheid van Y RNAs in de circulatie […].

Plasma-miRNAs lijken beloftevol als mogelijke niet-invasieve biomerkers maar momenteel zijn de precieze en accurate meting nog een uitdaging. Een aantal factoren, inclusief cellulaire contaminatie, haemolyse en lage kwantitieit, kan leiden tot een vertekend beeld dat de oorspronkelijke biologische toestand van het staal niet weerspiegelt. De huidige research omtrent circulerend miRNA wijst aan dat haemolyse de beschikbaarheid van circulerende miRNAs kan beïnvloeden. Haemolyse kan worden geëvalueerd in gearchiveerde gegevens via het onderzoeken van de delta Cq [methode voor het bepalen van de genormaliseerde concentratie in een staal bij qPCR] van miR-451 en miR-23a. In gezonde individuen kunnen 194 miRNAs worden gedetekteerd in zowel gehaemolyseerde als niet-gehaemolyseerde bloedstalen; 40,2% vertoont upregulering bij haemolyse, 13% downregulering en 28,9% blijkt onveranderd door haemolyse. In de huidige studie zijn onze 3 kandidaat-miRNAs (miR-127-3p, miR-143-3p & miR-142-5p) bij de miRNA-genen die niet veranderen door haemolyse (bij gezonde individuen).

Het voordeel van circulerende miRNAs als biomerkers voor ziekten houdt verband met een aantal kenmerken zoals mindere complexiteit vergeleken met proteïnen, stabiliteit, geconserveerde sequenties bij verscheidene soorten en beperkte expressie in specifieke weefsels en biologische processen. Er werd gesuggereerd dat 206 miRNAs tot expressie komen in bloedcellen, serum en plasma; dus is het bij de meeste plasma- en serum-studies heel erg noodzakelijk strikte staal-verwerking-procedures in acht te nemen om er zeker van te zijn dat de stalen cel-vrij zijn. Contaminatie van bio-vloeistoffen met cellulaire inhoud kan worden beperkt door gebruik te maken van bijkomende centrifugatie-stappen tijdens de initiële plasma-afscheiding om mogelijke contaminatie met cellulair afval en haemolyse te verminderen. Daarnaast kan het belangrijk zijn bloedcel-aantallen en lyse te bepalen tijdens de staalname aangezien variatie qua plasma-waarden van miRNAs in sommige gevallen werd toegeschreven aan de effekten van circulerende bloedcellen. De begin-concentratie van miRNA varieert naar gelang het individu door de leeftijd, het geslacht en andere factoren, en dit kan een significante impact hebben op de uitkomsten van verschillende expressie-studies. Tot op heden zijn er geen vastgelegde referentie-waarden voor miRNAs bij normale individuen en dit kan noodzakelijk zijn wil men ze als diagnostische merker gaan gebruiken; vandaar dat de inclusie van geschikte calibrator-controles tijdens de RT-qPCR analyse noodzakelijk is. Niettemin: ondanks deze uitdagingen zijn miRNA-signaturen van normale individuen reproduceerbaar, met gelijklopende expressie-patronen en een beperkte mate variabiliteit.

Besluiten

De huidige studie suggereert dat plasma een bevredigende parameter zou kunnen zijn voor het bepalen van miRNAs als biomerkers bij CVS/M.E. De gegevens illustreren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p mogelijke plasma-biomerkers voor CVS/M.E.-diagnose zouden kunnen zijn. Verdere studies zijn echter vereist om deze bevindingen te valideren bij een grotere groep om de diagnostische kracht van deze bevindingen vast te stellen. De tekortkomingen bij het gebruik van bio-vloeistofen is de minieme hoeveelheid RNA, dus is een grote hoeveelheid staal dikwijls vereist om hoge opbrengsten en kwaliteit van het RNA te verkrijgen. Momenteel staat het gebruik van HTS als een middel om mogelijke veranderingen in miRNAs bij ziekten te detekteren in zijn kinderschoenen. Verdere studies zijn vereist om de methode ter verbetering van de detektie en het verkrijgen van betrouwbare gegevens die over verschillende studies kunnen worden gerepliceerd, te evalueren en verfijnen.

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.