M.E.(cvs)-wetenschap

mei 30, 2020

Auto-immuniteit-gerelateerde risico-varianten geassocieerd met M.E.(cvs) met infektueuze aanvang

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 6:42 am
Tags: , , , , , , ,

Onderstaand werk werd o.a. financieel ondersteund door het ‘Solve ME Ramsay Grant Program’ (solvecfs.org). We weten al dat Dr. Carmen Scheibenbogen heel wat research doet omtrent het definiëren van de rol van auto-immuneit bij M.E.(cvs). In een overzicht gepubliceerd in ‘Autoimmunity Reviews’ (2018) – getiteld ‘Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an auto-immune disease’, bespreekt ze (samen met andere researchers van het ‘European Network on ME/CFS’ (EUROMENE), auto-immune aspecten van M.E.(cvs). Ze verwijzen daarbij naar de bevindingen omtrent auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen (inclusief neurotransmitter-receptoren) en studies die bewijs leverden voor ernstige metabole stoornissen die waarschijnlijk worden gemedieerd door auto-antilichamen. Lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie’.

In deze studie hier vergeleek Dr. Scheibenbogen’s team ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) die risico kunnen vormen voor auto-immune aandoeningen tussen groepen met M.E.(cvs) en controles. SNPs zijn varianten in genen die bij alle individuen voorkomen. Deze hier beïnvloeden immuniteit-genen die aanleiding kunnen geven tot een meer aktieve immuun-respons en waarvan de dragers een groter risico op auto-immuun ziekten vertonen.

Het feit dat mensen een bepaald SNP (risico-variant) dragen betekent niet noodzakelijk dat ze een auto-immuun ziekte zullen ontwikkelen. Associatie-studies zoals deze hier kunnen bepalen of een SNP verband houdt met een ziekte en informatie leveren over het mechanisme dat de ziekte veroorzaakt.

Het onderzoeksteam vond dat SNPs geassocieerd met een hoger risico voor auto-immuniteit in de genen PTPN22 & CTLA4 frequenter voorkwamen bij M.E.(cvs)-patiënten waarvan de ziekte was begonnen met een infektie. Deze genen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de aktivatie van B- & T-cellen. Scheibenbogen stelt: “Onze bevinding levert bewijsmateriaal dat M.E./CVS een auto-immuun ziekte is bij de subgroep van patiënten waarvan de ziekte werd getriggerd door een infektie.”.

Ze wil dan ook verder gaan met de klinische studies aangaande behandeling met IgG of immuno-adsorptie om auto-antilichamen aan te pakken. In een piloot-studie (Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove β2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS ONE (2018) 13: e0193672) werden echter slechts 10 patiënten (met post-infekueuze M.E./CVS behandeld) dus conclusies zijn voorbarig…

————————-

Frontiers in Immunology Vol 11, p 578 (april 2020)

Autoimmunity-related risk variants in PTPN22 and CTLA4 are associated with ME/CFS with infectious onset

Sophie Steiner (1), Sonya C. Becker (1), Jelka Hartwig (1), Franziska Sotzny (1), Sebastian Lorenz (1), Sandra Bauer (1), Madlen Lobel (2), Anna B. Stittrich (3,4), Patricia Grabowski (1), Carmen Scheibenbogen (1,3)

1 Institute of Medical Immunology, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universitat (FU) Berlin, Humboldt-Universitat zu Berlin and Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Germany

2 Carl-Thiem-Klinikum Cottbus gGmbH, Research Centre, Cottbus, Germany

3 BIH Center for Regenerative Therapies, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

4 Labor Berlin-Charité Vivantes GmbH, Berlin, Germany

Samenvatting

Er werden ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNP) in verscheidene genen beschreven die geassocieerd bleken met vatbaarheid voor auto-immuun ziekte. In deze studie werd het genotype van patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) en controles bepaald voor vijf immuun-gen SNPs: tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22, rs2476601), cytotoxisch T-lymfocyten geassocieerd proteïne-4 (CTLA4, rs3087243), tumor necrose factor (TNF, rs1800629 & rs1799724) en interferon regulerende factor 5 (IRF5, rs3807306), die behoren tot de belangrijkste risico-varianten voor auto-immuun ziekten. Analyse van 305 M.E./CVS-patiënten en 201 gezonde controles toonde significante associaties van de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-allelen bij M.E./CVS. De associaties werden enkel gevonden bij M.E./CVS-patiënten die een infektie als acute aanvang van de ziekte rapporteerden (PTPN22 rs2476601: OR 1.63, CI 1.04-2.55, p = 0.016; CTLA4 rs3087243: OR 1.53, CI 1.17-2.03, p = 0.001), maar niét bij M.E./CVS-patiënten zónder infektie-getriggerde aanvang (PTPN22 rs2476601: OR 1.09, CI 0.56-2.14, p = 0.398; CTLA4 rs3087243: OR 0.89, CI 0.61-1.30, p = 0.268). Deze bevinding levert bewijs dat auto-immuniteit een rol kan spelen bij M.E./CVS met een infektie-getriggerde aanvang. Beide genen spelen een sleutelrol bij de regulering van B- en T-cel aktivatie.

INLEIDING

[…] Het onderliggend pathomechanisme van M.E./CVS wordt nog niet goed begrepen maar er is overtuigend bewijsmateriaal voor het feit dat, ten minste in een subgroep patiënten, auto-immuniteit bijdraagt tot de ziekte-etiologie [Blomberg J et al. Infection elicited autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: an explanatory model. Front Immunol. (2018) 9: 229 /// Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9]. Er werden door verschillende teams auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen, inclusief neurotransmitter-receptoren, gerapporteerd. […]

Verhoogde immuun-aktivatie en verstoring van de immunologische tolerantie worden beschouwd als belangrijke risco-factoren voor auto-immuniteit. Auto-immuun ziekten worden als multifactorieel gezien, met betrokkenheid van genetische en milieu-factoren. De ziekte-aanvang wordt dikwijls getriggerd door infekties, en de link tussen infekties en auto-immuun ziekten is welbekend. Genoom-wijde associatie studies hebben onthuld dat ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in verscheidene genen geassocieerd zijn met het risico op het ontwikkelen van auto-immuun ziekten. Voor de meeste van deze SNPs werd gevonden dat ze leiden tot winst- of verlies-van-funktie in enzymen of transcriptie-factoren die een rol spelen bij B- & T-cel aktivatie of cytokine-produktie en -signalisering, wat cruciale mechanismen zijn voor de ontwikkeling van auto-immune ziekten. Bij de meest frequente varianten geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten horen: het tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22) SNP rs2476601, het cytotoxische T-lymfocyten-geassocieerde proteïne-4 (CTLA4) SNP rs3087243, het interferon regulerende factor-5 (IRF5) SNP rs3807306 en het SNP rs1800629 in het tumor necrose factor (TNF) gen.

Het PTPN22 SNP rs2476601 is één van de belangrijkste vatbaarheid loci voor auto-immuniteit en is geassocieerd met myasthenia gravis (MG) [ernstige spierzwakte], type-1 diabetes (T1D), Systemische Lupus Erythematosus (SLE), Reumatoïde Artritis (RA) en andere auto-immuun aandoeningen. Dit SNP bleek een belangrijke rol te spelen in T- & B-cel receptor signalisering. Het SNP rs3087243 in CTLA4 is geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten, inclusief SLE, RA, T1D & Graves’ ziekte. Het CTLA4 SNP heeft een beschermend effekt, en het majeur allel-G is geassocieerd met auto-immuniteit. Het G-allel leidt tot een verstoorde negatieve regulering van T-cell aktivatie. Bij Multipele Sclerose (MS) patiënten bleken homozygote dragers van het G-allel significant minder CTLA4 proteïne tot expressie te brengen in CD4+ T-cellen. Een SNP in IRF5, rs3807306, is een ander courant auto-immuun vatbaarheid locus geassocieerd met RA, SLE, MS & Crohn’s (C.D.), en is verbonden met hogere serum interferon-α (IFNα) aktiviteit […] bij SLE. Het SNP rs1800629 in TNF is gelinkt met verscheidene auto-immuun ziekten, inclusief C.D., coeliakie, RA & SLE. Een ander SNP in het TNF gen, rs1799724 is geassocieerd met C.D. en auto-immune hepatitis (AIH). Er werden hogere serum-waarden qua TNFα aangetoond in dragers van het TNF rs1799724 risico-genotype, terwijl voor het SNP rs1800629 de gegevens omtrent een verband met gestegen TNFα serum-waarden niet overtuigend zijn.

Er is een systematisch overzicht dat de studies over genetische varianten die geassocieerd zijn met M.E./CVS samenvat [Wang T et al. A systematic review of the association between fatigue and genetic polymorphisms. Brain Behav Immun. (2017) 62: 230-44]. Er werden meerdere SNPs in cytokinen en humaan leukocyten antigen (HLA) associaties gevonden bij M.E./CVS. Twee SNPs in TNF, rs1800629 (TNF-308) & rs1799724 (TNF-857), werden vergeleken tussen een M.E./CVS- en controle-groep [Carlo-Stella N et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. (2006) 24: 179-82]. Er werd een hogere frequentie van het TNF-857 T-allel gevonden bij M.E./CVS. Analyse van genetische varianten in PTPN22, CTLA4 & IRF5 werden nog niet beschreven bij M.E./CVS.

Hier vergeleken we de prevalentie van de 5 hierboven beschreven SNPs bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. De aanvang van M.E./CVS wordt getriggerd door een infektie bij ca. twee derden van de patiënten. De link tussen infekties als trigger van auto-immuun ziekten is goed ingeburgerd. Daarom bestudeerden we ook een mogelijk verband van deze SNPs met een infektie-getriggerde ziekte-aanvang (ITO).

MATERIALEN & METHODES

Patiënten en controles

M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose in de immunodeficiëntie-kliniek van het ‘Institute for Medical Immunology’ aan de Charité Univeristeit (Berlijn). De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria (CCC) en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Auto-immuun ziekten waren een exclusie-criterium, met uitzondering van Hashimoto’s thyroïditis, wat wordt geklassificeerd als co-morbiditeit bij M.E./CVS. […] 232 op 305 patiënten verklaarden dat hun ziekte een acute aanvang met een infektie (ITO) had gekend. We verzamelden retrospectief de gegevens van de types infektie […]: ‘respiratoire of gastro-intestinale infektie’, ‘primaire EBV’ [Epstein-Barr Virus; veroorzaker van mononucleose] of ‘virale/bakteriële infektie’. […]

DNA-extractie en PCR ter onderscheiding van allelen

[…] Genomisch DNA verkregen uit totaal-bloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) […]

Beoordeling van oplosbare immuniteit-merkers en lymfocyten

Lymfocyten-fenotypering d.m.v. flow-cytometrie: CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen. Serum-proteïnen analyse: C-reaktief proteïne (CRP), complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2 receptor (IL-2R), IgG en TNFα in LPS-gestimuleerde totaal-bloed cellen […].

Statistische analyse

[…] p ≤ 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.

RESULTATEN

Analyse van de verdeling van allelen en genotypes

305 M.E./CVS-patiënten [gemiddelde leeftijd 44; ca. 2/1 vrouwen/mannen] en 201 gezonde controles werd geanalyseerd wat betreft mogelijke ziekte-associatie van de PTPN22, CTLA4, TNF & IRF5 SNPs […].

We vonden een significant toegenomen frequentie van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A, wat leidt tot vatbaarheid voor auto-immuniteit, bij M.E./CVS-patiënten (allel-frequentie (AF) 12%, odds ratio (OR) 1.50, p = 0.033) t.o.v. gezonde controles (AF 8%, n = 201). Bij subgroepering van de patiënten volgens het type ziekte-aanvang, zagen het significant verband van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A enkel bij patiënten mét ITO (AF 13%, OR 1.63, n = 232, p = 0.016) maar niet bij deze zonder ITO (AF 9%), vergeleken met gezonde controles (AF 8%).

Ook de frequentie van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G is significant hoger bij M.E./CVS-patiënten (AF 63%, OR 1.34), verleken met gezonde controles (AF 56%). Weerom zagen we een significant verband van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G enkel bij patiënten mét ITO (AF = 66%, OR = 1.53, p = 0.001) maar niet bij deze zonder ITO (AF 53%), vergeleken met gezonde controles (AF 56%).

Omgekeerd: de AF van het IRF5 rs3807306 risico-allel T was significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 41%, OR 0.68, p = 0.023), vergeleken met gezonde controles (AF 51%). Er werd geen verschil gezien qua risico AF van het TNF rs1800629 SNP tussen patiënten en controles, maar de AF van het TNF rs1799724 risico-allel T was weer significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 8%, OR 0.55, p = 0.043), vergeleken met gezonde controles (AF 13%). Er werden geen associaties met IRF5 of TNF gevonden bij patiënten met ITO.

We analyseerden ook de genotype-verdeling voor CTLA4 rs3087243 & PTPN22 rs2476601. We vonden een significant verschil tussen de M.E./CVS-patiënten mét ITO, vergeleken met gezonde controles (CTLA4 rs3087243: p = 0.0061; PTPN22 rs2476601: p = 0.026). M.E./CVS-patiënten zonder ITO hadden een gelijkaardige genotype-verdeling als gezonde controles.

Associatie van infektie-getriggerde aanvang en PTPN22 & CTLA4 varianten met immuniteit-merkers

We vergeleken aantallen CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen, CPP, complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2R, IgG en TNFα bij M.E./CVS-patiënten mét en zonder ITO. Patiënten mét ITO hadden minder CD19+ B-cellen (p = 0.05) en er was een trend voor lagere lower C3-waarden. Bij patiënten met beide, waren risico-allel in PTPN22 rs2476601 of het homozygoot risico-allel voor CTLA4 rs3087243, C4-waarden (p = 0.06 & 0.004, respectievelijk) maar niet C3-waarden gedaald, terwijl er geen verschil was qua aantallen B-cellen.

CRP-concentraties waren significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en zonder de risico-allelen van PTPN22 rs2476601-A & CTLA4 rs3087243-G.

CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en concentraties oplosbare IL-2R, TNFα en IgG verschilden niet tussen patiënten-subgroepen en risico-varianten.

BESPREKING

In deze studie evalueerden we 5 belangrijke SNPs die geassocieerd zijn met verscheidene auto-immuun ziekten bij M.E./CVS-patiënten. De geselekteerde patiënten zijn representatief voor M.E./CVS-groepen waar andere groepen over rapporteerden (twee derden vrouwen, met een ITO en een gemiddelde ziekte-ernst met een Bell-score van 30 [score van 100 = gezonde individuen; < 30 = ernstig]). Overéénkomstige een Amerikaanse studie, werd de M.E./CVS-aanvang bij onze patiënten het meest frequent getriggerd door een acute respiratoire infektie of vermoedelijke virale infektie. Ook een primaire EBV-infektie tijdens de adolescentie is een goed gekende trigger van M.E./CVS en werd gerapporteerd door 19% van onze patiënten. Een primaire EBV-infektie bij volwassen staat bekend als risico-factor voor verscheidene auto-immuun ziekten.

We vonden een sterke associatie van de auto-immuniteit risico-allelen in CTLA4 rs3087243-G & PTPN22 rs2476601-A bij ITO M.E./CVS. Het dragen van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A verhoogde de kans op het ontwikkelen van infektie-getriggerde M.E./CVS met 1,6 maal. Bij dragers van het risico-allel G van CTLA4 rs3087243 was de kans op het ontwikkelen van ITO M.E./CVS 1,5 maal hoger. Dienoveréénkomstig was de genotype-verdeling voor beide SNPs significant verschillend bij M.E./CVS-patiënten mét ITO vergeleken met gezonde controles.

Zowel de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 SNPs bleken geassocieerd met talrijke auto-immuun ziekten, inclusief T1D, SLE en RA. PTPN22 codeert voor een lymfoïd tyrosine-fosfatase dat als een sterke negatieve regulator van T-cel aktivatie werkt. Een studie levert bewijs voor het feit dat het auto-immuun risico-allel A van PTPN22 rs2476601 leidt tot winst- of verlies-van-funktie. Dit kan leiden tot lagere T-cel receptor signalisering en het onvermogen om autoreaktieve T-cellen te verwijderen of verminderde aktiviteit van Tregs. Bovendien zou het PTPN22 rs2476601 risico-allel kunnen bijdragen tot het genereren van autoreaktieve B-cellen via stoornissen in de klonale deletie [verwijdering van B- of T-cellen die receptoren tegen lichaamseigen (‘self’) tot expressie brengen, vooraleer ze zich ontwikkelen tot volledig immunocompetente lymfocyten] en receptor-opmaak, wat leidt tot verstoorde centrale [immuun-] tolerantie. Dit wordt ondersteund door de bevinding dat de sterkste verbanden met dit SNP worden gevonden bij auto-immuun ziekten waarbij autoreaktieve T-cellen en auto-antilichamen een grote rol spelen in de pathogenese van de ziekte. In tegenstelling daarmee hebben auto-immuun ziekten waarbij Th17-cellen een belangrijke rol spelen, en die van mucosa [slijmvliezen], de neiging geen associatie met PTPN22 te vertonen.

CTLA4 komt tot expressie op CD4+ & CD8+ T-cellen na aktivatie en heeft een cruciale rol als negatieve T-cel regulator om geaktiveerde T-cellen uit te zetten. Het risico-allel G van rs3087243 leidt tot gedaalde waarden van oplosbaar CTLA4 mRNA, wat resulteert in versterkte T-cel aktiviteit.

Vergelijkbaar met onze bevindingen bleken zowel de PTPN22 rs2476601 als de CTLA4 rs3087243 risico-varianten vatbaarheid-loci te zijn voor auto-immuun ziekten, inclusief anti-neutrofiel cytoplasmatisch antilichaam (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV) en polyglandulaire [met betrokkenheid van meerdere hormoon-producerende klieren] auto-immuniteit zijn. Naar ons weten werd de frequentie van deze SNPs nog niet bestudeerd bij andere M.E./CVS-patiënten.

We correleerden onze SNP-gegevens verder met immuun-merkers. Bij patiënten met zowel het risico-allel in PTPN22 rs2476601 of de homozygote risico-allelen voor CTLA4 rs3087243 waren de C4- maar niet C3-waarden gedaald. Een associatie van deze risico-varianten met C4-waarden werd in de literatuur niet beschreven. Lage C4-waarden komen echter frequent voor bij SLE, een ziekte die geassocieerd is met zowel het risico-allel in PTPN22 als CTLA4.

Bij vergelijking van patiënten-subgroepen hadden enkel deze met ITO minder CD19+ B-cellen. B-cel lymfocytopenie [gering aantal lymfocyten in het bloed] is een frequente bevinding bij SLE & RA, en levert verder bewijs voor een auto-immuun mechanisme bij M.E./CVS-patiënten met ITO. In tegenstelling daarmee waren CRP-waarden significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en deze zonder risico-allelen. Dit zou kunnen suggereren dat, binnen de subgroep M.E./CVS-patiënten zonder ITO, er een aanleg is voor een meer pro-inflammatoire respons gelijkaardig met patiënten met kanker-gerelateerde vermoeidheid.

Voor het IRF5 rs3807306 risico-allel T zagen we een significant lagere AF bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO t.o.v. controles. Deze bevinding is onverwacht en dient te worden bevestigd. We konden geen verschil detekteren wat betreft de frequentie van de TNF rs1800629 AF tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles maar we vonden weer een significant lagere AF voor de TNF rs1799724 bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO vergeleken met controles. Deze bevinding is tegengesteld aan die van een eerdere studie waarbij 80 M.E./CVS-patiënten werden geanalyseerd, waar een hogere frequentie voor het TNF-857 rs1799724 risico-allel werd gevonden [zie Carlo-Stella N et al. hierboven]. We hebben geen voor de hand liggende verklaring voor dit verschil. De patiënten-groep in de studie uit 2006 kreeg de diagnose op basis van de Fukuda criteria, die minder strikt zijn dan de CCC criteria die in onze studie worden gebruikt. Interessant: deze SNPs zijn geassocieerd met verhoogde serum-waarden van TNFα & IFNα, en ook met auto-immuun ziekten van mucosa. Het is verleidelijk om te speculeren dat patiënten die hogere waarden TNFα & IFNα kunnen produceren, een meer doeltreffende mucosale immuniteit hebben en daarom minder vatbaar zijn om M.E./CVS te ontwikkelen. Dit komt overéén met onze eerdere observatie dat een deficiëntie van de complement-factor mannose-bindend lectine (MBL [speelt een rol bij de aangeboren immuniteit]), wat resulteert in vatbaarheid voor infekties, geassocieerd is met M.E./CVS [Guenther S et al. Frequent IgG subclass and mannose binding lectin deficiency in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Hum Immunol. (2015) 76: 729-35].

Er zijn andere varianten van immuun- of immuun-gerelateerde genen beschreven bij M.E./CVS [zie Wang T et al. hierboven]. Meerdere SNPs in HLA klasse-II bleken geassocieerd met M.E./CVS [Smith J et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol. (2005) 58: 860-3 /// Carlo-Stella N et al. Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2009) 22: 745-54 /// lees ook ‘Humaan Leukocyten Antigen allelen gelinkt met M.E.(cvs)]. Dit verband is een ander bewijs voor een auto-immuun pathomechanisme, aangezien de link tussen bepaalde HLA-allelen en auto-immuniteit vastgesteld is. Bovendien zijn er studies die een associatie tonen met meerdere SNPs in het glucocorticoïd receptor gen Nucleaire Receptor Subfamilie-3 Groep-C Lid-1 (NR3C1). Deze receptor speelt een rol in de regulering van de inflammatoire respons voor aantasting van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as (HPA) aktiviteit via cortisol-afgifte [Rajeevan MS et al. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Voor M.E./CVS werd een ontregelde HPA-as gerapporteerd. Op een zelfde manier zouden SNP-varianten van het catechol-O-methyltransferase (COMT) gen en de ß2adrenerge receptor (beschreven bij M.E./CVS) de immuun-respons kunnen moduleren [adolescenten]. Verdere studies vonden associaties met SNPs die niet gerelateerd zijn met het immuunsysteem, zoals varianten geassocieerd met het spier-metabolisme [Golf Oorlog veteranen] en het serotonerg systeem [Smith AK et al. Genetic evaluation of the serotonergic system in Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology. (2008) 33: 188-97].

Tot besluit: onze studie toont dat de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-varianten frequenter voorkomen bij patiënten met ITO M.E./CVS. Deze bevinding biedt verder bewijs dat er een genetische voorbestemdheid voor M.E./CVS is. De associaties met PTPN22 & CTLA4 SNPs wijzen op een rol van autoreaktieve T- & B- cellen in het pathomechanisme van M.E./CVS. In tegenstelling daarmee suggereren het ontbreken van een associatie van CTLA4 & PTPN22 SNPs, en de lagere frequenties van IRF5 & TNF risico-varianten bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO, dat het pathomechanisme verschillend is. Deze associaties dienen te worden bevestigd bij andere M.E./CVS patiënten-groepen. Onze bevindingen zetten ons aan research naar auto-immune mechanismen te intensifiëren en klinische studies met medicijnen gericht tegen autoreaktieve B-cellen uit te voeren.

maart 17, 2019

Veranderingen in het transcriptoom van circulerende immuun-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , , , , , ,

Het onderzoeken van het transcriptoom, de verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’, tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen, gebeurt in onderstaande studie via sequentiebepaling van dat RNA. Dit kan bv. worden gehaald uit totaal-bloed of uit bepaalde cel-populaties (bv. perifeer bloed mononucleaire cellen – PBMCs).

Een Noorse onderzoeksgroep (Nguyen CB et al. – ref. zie hieronder) voerde een studie uit a.h.v. bloed van adolescenten met ‘cvs’. Hun resultaten suggereren de mogelijke betrokkenheid van neuro-immune ontregeling. De publicatie (mede gefinancierd door de ‘Associated New Zealand ME Society’, ANZMES) hieronder (over M.E.(cvs)-patiënten uit Nieuw-Zeeland) beschrijft volgens de auteurs de eerste RNA sequentie-analyse op basis van PBMCs. Ze toonden de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress. Resultaten die gelijklopen met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire (maar niet identieke) studies. Wederom aanduidingen voor consistentie van de bevindingen omtrent M.E.(cvs) en het feit dat dit wel degelijk een echte medische aandoening is.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology Volume 33: 1-8 (2019)

Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eiren Sweetman (1), Margaret Ryan (2), Christina Edgar (1), Angus MacKay (1), Rosamund Vallings (3), Warren Tate (1)

1 Department of Biochemistry, University of Otago, Dunedin, New Zealand

2 Department of Anatomy, University of Otago, Dunedin, New Zealand

3 Howick Health & Medical Centre, Auckland, New Zealand

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een slecht begrepen ziekte die 0,2%-2% van de wereld-bevolking treft. Om inzicht te verkrijgen in de pathofysiologie van M.E./CVS in Nieuw-Zeeland, onderzochten we de transcriptomen bij een kleine maar goed gekarakteriseerde groep patiënten (n = 10), en voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles (n = 10). Er bleken 27 gen-transcripten 1,5 tot 6 maal verhoogd en 6 bleken 3 tot 6 maal verlaagd in de patiënten-groep (P < 0.01). De meest verhoogde gen-transcripten, IL8, NFΚBIA & TNFAIP3 zijn funktioneel verbonden met inflammatie, en significante veranderingen werden gevalideerd voor IL8 & NFΚBIA d.m.v. kwantitatieve polymerase-ketting-reaktie (qPCR). Een funktionele netwerk analyse [FNA] van de gewijzigde gen-transcripten (P < 0.01) detekteerde interakties tussen de produkten gerelateerd met inflammatie, circadiaanse klok funktie, metabole ontregeling, cellulaire stress-responsen en mitochondriale funktie. ‘Ingenuity pathway analysis’ [IPA; software om expressie-profielen te analyseren] (P < 0.05) biedt verdere inzichten in de dysfunktionele fysiologie, en markeerde stress en inflammatie mechanismen. Deze analyse levert nieuwe inzichten in de molekulaire veranderingen bij M.E./CVS en draagt bij tot het begrijpen van de pathofysiologische mechanismen van de ziekte.

Inleiding

[…] Hoewel de pathofysiologie van M.E./CVS nog steeds slecht wordt begrepen, wordt als hypothese gesteld dat diepgaande ontregeling van het centraal zenuwstelsel en immuunsysteem, dysfunktie van het cellulair energie metabolisme en cardiovasculaire abnormaliteit belangrijke rollen kunnen spelen bij de pathofysiologie van de ziekte.

Er werden een aantal M.E./CVS immuun-cel gen-expressie studies gepubliceerd. Gezamenlijk hebben ze verstoringen geïdentificeerd in mechanismen verbonden met immune, neuronale, mitochondriale en metabole funktie, maar er is weinig consensus over de genen die specifiek differentieel tot expressie komen. ‘High-throughput’ RNA-‘sequencing’ technologie (RNA-seq) werd eerder aangewend om het M.E./CVS transcriptoom te onderzoeken. [Nguyen CB et al. Whole blood gene expression in adolescent Chronic Fatigue Syndrome: An exploratory cross-sectional study suggesting altered B cell differentiation and survival. Journal of Translational Medicine (2017) 15: 102] Onze RNA-seq studie die hier wordt beschreven, focust op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) bij een goed gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten. Er werd gerapporteerd dat PBMCs stabiel zijn en accuraat de biologische verschillen tussen gezonde en zieke individuen weerspiegelen, bijzonderlijk wat betreft immunologische of inflammatoire mechanismen. We identificeerden 27 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep vergeleken met gezonde controles en 6 significant verlaagde gene-transcripten (P < 0.01), en vonden een aanrijking wat betreft stress- en inflammatie-mechanismen, alsook mitochondriale en circadiaanse klok funkties. Deze resultaten geven diepgang aan het bewijs voor een pathofysiologische basis van M.E./CVS.

Methodes

PBMC-isolatie

[…] 10 M.E./CVS-patiënten [mediane leeftijd 36,4; 6 vrouwen & 4 mannen], diagnose volgens de Canadese consensus criteria (CCC). […]

Transcriptoom-analyse

[…]

RT-qPCR validatie. Er werd een validatie van de gen-expressie (RTqPCR) test uitgevoerd voor de 3 meest significant gewijzigde gen-transcripten IL8, NFKBIA & TNFAIP3. […] De genormaliseerde relatieve expressie-waarden van elk gen werden berekend […].

FNA. Differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden getest op funktionele verbanden tussen de gecodeerde proteïnen […]. Er werden FDR [false discovery rate’, aantal vals positieve resultaten] -aangepaste P-waarden berekend voor elk verrijkt biologisch proces.

IPA. Er werden 125 ge-upreguleerde en 40 gedownreguleerde gen-transcripten geanalyseerd (P < 0.05). IPA gebruikt analytische instrumenten om de ‘upstream’ biologische oorzaken en waarschijnlijke ‘downstream’ effekten op de cellulaire biologie te verhelderen. […]

Resultaten en bespreking

In deze RNA-seq transcriptoom-analyse werden op deze kleine maar klinisch goed gekarakteriseerde patiënten-groep de concepten van ‘Precision Medicine’ [medisch model voor de gezondheidszorg; waarbij medische beslissingen, behandelingen, praktijken of produkten op maat van de individuele patient worden gemaakt] met gepaste statistische analyse toegepast. Deze benadering is succesvol gebleken bij groepen patiënten met zeldzame ziekten, waar het aantal beschikbare patiënten gering is. Daarnaast heeft de RNA-seq analyse zelf gepaste sequentiebepaling-diepte om de beperkte grootte van het staal te compenseren.

RNA-seq analyse onthulde een veranderd PBMC-transcriptoom

Een statistische test van genormaliseerde RNA-seq gegevens vond 27 significant verhoogde gen-transcripten en 6 significant verlaagde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (P < 0.01 [lijst beschikbaar]).

qPCR-validatie van gewijzigde gen-expressie

De top 3 van de significant gewijzigde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep werd geëvalueerd d.m.v. RT-qPCR op de studie-groep. De resultaten waren consistent met de RNA-seq gegevens voor IL8 en NFKBIA. IL8 (FC [‘fold change’, hoeveel maal een parameter is veranderd] = 4,8; P = 0.01) & NFKBIA (FC = 2,0; P = 0.05) waren allebei significant gestegen in de patiënten-groep vergeleken met controles. TNFAIP3 was ook gestegen in de patiënten-groep (FC = 2,1; P = 0.19) met een trend naar significantie.

Analyse van de transcriptoom-gegevens

Via FNA & IPA onderzochten we de verrijkte funktionele interakties, en de biochemische en fysiologische mechanismen die werden afgeleid uit de analyse van de differentieel tot expressie komende gen-transcripten bij M.E./CVS.

FNA. De funktionele associatie netwerken van proteïnen gecodeerd door differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden bepaald d.m.v. het STRING portaal [een omvangrijke database van gekende en voorspelde proteïne/proteïne-interakties]. We vonden een significant niveau van netwerk-aanrijking (P-waarde 6.1×10-5) in deze lijst, wat er op wijst dat de gecodeerde proteïnen biologisch verbonden zijn. Er werden sterke funktionele associaties geobserveerd tussen IL8, NFKBIA, TNFAIP3, JUN, NAMPT, CREM, PMAIP1, PPP1R15A, RBBP6, UBE2D3, SOCS3, RIPK2 & ZC3H12A. Er bleken meerdere overtuigende funktionele mechanismen verrijkt door de toegenomen gecodeerde proteïnen [lijst beschikbaar]. Gezamenlijk bekrachtigen deze mechanismen significant immune en inflammatoire over-aktivatie en ontregeling die optreedt bij de pathologie van M.E./CVS.

IPA toont inflammatie en oxidatieve stress bij M.E./CVS. Er werd IPA uitgevoerd op de transcriptoom-gegevens met een significantie van P < 0.05, wat de pool beschikbaar voor de analyse op 125 verhoogde en 40 verlaagde gen-transcripten bracht [lijst beschikbaar]. Deze analyse identificeerde een aantal overlappende, funktioneel onderling verbonden kanonieke mechanismen. De meeste mechanismen waren direct gerelateerd met inflammatoire signalisering en de stress-respons, wat de resultaten van de FNA ondersteunt [lijst beschikbaar]. Gen-netwerken verbonden met oxidatieve stress, inflammatie en zenuwweefsel-schade [lijst beschikbaar] waren ook significant. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat mitochondriale dysfunktie en verstoord energie-metabolisme leiden tot vermoeidheid, malaise, en de courant ervaren spierpijn en cognitieve stoornissen bij M.E./CVS.

Anti-inflammatoire responders op TNFα & NF-κB

De top 3 ge-upreguleerde genen in onze studie – IL8 [coderend voor interleukine-8 (IL-8); neutrofiel-aktiverende factor (NAF), een chemokine], NFKBIA [coderend voor NF-κB inhibitor alfa] & TNFAIP3 [coderend voor tumor necrose factor alfa geïnduceerd proteïne 3; inhibeert NF-κB aktivatie en TNF-gemedieerde apoptose] – zijn vroegere responders op TNF-geïnduceerde NF-κB aktivatie. De proteïnen A20 (TNFAIP3) en IκBa (NFKBIA) maken deel uit van de twee voornaamste negatieve feedback-loops van NF-κB-gestuurde transcriptie. Bovendien is TNFα een krachtige inducer van IL-8 sekretie, via een transcriptioneel mechanisme dat wordt gereguleerd door NF-κB. Stijgingen qua IL-8 en TNFα warden geïdentificeerd in meerdere cytokine- en immune studies bij M.E./CVS. Chronische inflammatie wordt ook versterkt door het NF-κB signalisering mechanisme. De stijging van de expressie van deze 3 gen-transcripten in de M.E./CVS-groep impliceert sterk een aanhoudende biologische respons tegen ongewenste overmatige aktiviteit van NF-κB en inflammatie bij M.E./CVS, aangestuurd door TNFα.

Significante biologische mechanismen verrijkt in de M.E./CVS-groep, geïdentificeerd door FNA & IPA

Het circadiaans ritme. Meerdere gestegen gen-transcripten in de M.E./CVS-groep coderen voor kern-proteïnen die de circadiaanse klok reguleren, het centraal mechanisme dat ons 24h circadiaans ritme aanstuurt. Een verstoord circadiaans ritme kan direct gelinkt zijn met vele van de M.E./CVS-symptomen, zoals pijn, vermoeidheid, slaapstoornissen, griep-achtige symptomen, cognitieve stoornissen, post-exertionele malaise, en dysfunktie van metabole en immuun-systemen. Deze resultaten suggereren dat ontregeling van het circadiaans ritme waarschijnlijk is bij M.E./CVS een plausibele kandidaat kan zijn voor het doen aanhouden van de symptomen en de ernst van M.E./CVS.

Mitochondriale dysfunktie. Mitochondrieën zijn essentieel voor cellulaire energie produktie, metabolisme en het reguleren van stress-responsen. De resultaten van FNA & IPA duiden op mitochondriale dysfunktie, gekenmerkt door tekenen van oxidatieve stress en downregulering van metabole mechanismen. Er zijn 3 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (PMAIP1, PMPCB & JUN) die belangrijke rollen spelen bij de mitochondriale funktie en apoptotische mechanismen:

1. Ademhaling. Mitochondriale ademhaling kan worden geïnhibeerd door cytokine-veranderingen en oxidatieve stress. Regulering van cytokine-produktie en oxidatieve stress mechanismen bleken beide verrijkt in de M.E./CVS-groep. M.E./CVS-studies vonden belangrijke indicatoren voor mitochondriale dysfunktie, inclusief gedaalde aanmaak van ATP en verstoring van de oxidatieve fosforylatie. Ter ondersteuning van onze analyse: een studie toonde verlaagde maximale respiratie door mitochondrieën in M.E./CVS PBMCs. Ze vonden metabole verschillen die een onvermogen toonden om te voldoen aan de cellulaire energetische vereisten, bijzonderlijk wanneer mitochondrieën onder stress stonden. [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017)12: e0186802]

2. Downregulering van het metabolisme. FNA toonde verstoorde regulering van meerdere metabole mechanismen in de M.E./CVS-groep, waarvan vele gerelateerd met mitochondrieën. Metabole profilering studies bij M.E./CVS hebben verstoord metabolisme gelinkt met post-exertionele malaise. Belangrijk: een studie onderzocht metabolieten bij M.E./CVS-patiënten en controles, en ontdekte een homogene afname van diagnostische metabolieten bij alle M.E./CVS-patiënten, consistent met hypometabool syndroom. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (2016) 113: E5472-E5480] Aangezien alle geïdentificeerde metabole abnormaliteiten ofwel direct gereguleerd worden door redox of door de beschikbaarheid van NADPH, speculeerde men dat een mitochondriale betrokkenheid waarschijnlijk was. Accumulatie van melkzuur door het verstoord metabolisme kan de pijn in spieren en gewrichten, die wordt gerapporteerd door M.E./CVS-patiënten, verklaren. Bovendien werd gerapporteerd over lactaat-accumalatie in de ventriculaire ruimtes van de hersenen en het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten en dit zou kunnen bijdragen tot de neuro-inflammatoire symptomen van M.E./CVS.

3. Stress-respons. FNA toonde een verhoogde cellulaire stress respons en positieve regulering van apoptotische processen in de M.E./CVS-groep. IPA vestigde de aandacht op de produktie van stikstof-oxide (NO) en reaktieve zuurstof soorten (ROS) in macrofagen. NO- en ROS-produktie, gestimuleerd door TNFα en NF-κß, speelt een centrale rol bij de controle van infekties, en ROS-produktie wordt ook toegeschreven aan geaktiveerd NADPH-oxidase, een component van de mitochondriale elektron-transport-keten. Mitochondrieën komen veel voor in cellen van het centraal zenuwstelsel, waar ze de essentiële energie voor neuronen leveren en daardoor de synaptische plasticiteit beïnvloeden. Oxidatieve stress, veroorzaakt door verhoogd ROS in mitochondrieën, kan aanleiding geven tot cognitieve stoornissen en apoptose [geprogrammeerde cel-dood] – leidend tot mitochondriale DNA-schade en bijdragend tot cognitieve problemen door aantasting van neurotransmissie en Ca2+-homeostase. Van belang is dat veel M.E./CVS-symptomen, zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en myalgie, ook voorkomen bij primair mitochondriale ziekten.

Chronische inflammatie. Aanhoudende inflammatie wordt benadrukt door het M.E./CVS-transcriptoom, waarbij NF-κB en TNFα centraal zijn voor twee primaire kanonieke mechanismen die door IPA als verrijkt voorspeld werden. Zoals eerder vermeld, zijn IL8, NFKBIA & TNFAIP3 componenten van de bepalende aangetaste mechanismen. Het NF-κB aktivatie mechanisme richt zich op een reeks van cytokine- en chemokine-receptoren die vereist zijn voor immune herkenning, antigen-presentering en adhesie-receptoren. Het TNFR2 signalisering mechanisme reguleert de TNFα-aktiviteit via het tegenwerken van de door TNFα geïnduceerde apoptose, bijzonderlijk in sterk geaktiveerde T-cellen. Door LPS gestimuleerd ‘mitogen activated- protein-kinase (MAPK) [‘mitogen activated protein’ (MAP) kinasen reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleren verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose] stuurt de inflammatoire respons in macrofage immuun-cellen. Peroxisoom Proliferator Geaktiveerde Receptoren (PPAR) signalisering [PPAR zijn een groep receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] bleek ook aangetast. PPAR-signalisering molekulen reguleren metabole processen in hartspier-weefsel, inflammatie en oxidatieve stress, en faciliteren interakties tussen circadiaanse, metabole (lipiden-metabolisme) en cardiovasculaire mechanismen. Mitochondriale dysfunktie kan verder beïnvloed worden door verhoogde chronische aktivatie van immuun-inflammatoire stress mechanismen. Inflammatoire mediatoren zoals TNFα bleken in vitro geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en gestegen ROS. Een letsel of infektie kan ook leiden tot gecompromitteerde mitochondriale integriteit, wat inflammatie triggert via NF-κB, MAPKs en interferon regulerende factoren, en pathologie bevordert bij een groeiend aantal ziekten.

Deze resultaten bekrachtigen de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress bij M.E./CVS.

Eerdere M.E./CVS-transcriptoom studies ondersteunen inflammatie en mitochondriale betrokkenheid

Voor zover wij weten is dit de eerste RNA-seq analyse van PBMCs bij M.E./CVS-patiënten. Deze technologie werd echter al gebruikt voor een analyse van totaal-bloed bij adolescente M.E./CVS-deelnemers via gen-aanrijking. [zie Nguyen CB et al. hierboven] Onze analyse was consistent met onze bevindingen, suggestief voor verstoring van of B-cel differentiatie en overleving, versterkte aangeboren antivirale responsen en inflammatie. Co-expressie patronen en afzonderlijke gen-transcripten bleken geassocieerd met neuro-endocriene merkers van gewijzigde HPA-as en autonoom zenuwstelsel aktiviteit, plasma-cortisol, en aantallen monocyten en eosinofielen. We vonden significante molekulaire veranderingen in onze M.E./CVS-groep die consistent zijn met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire maar niet identieke studies. Eerdere micro-array [‘genen-chips’] en ‘differential display’ [vergelijken en identificeren van veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau] studies van de gen-expressie bij M.E./CVS hebben verstoringen qua immuun-mechanismen, mitochondriale funktie, cel-stress en apoptose aangegeven. Een ‘micro-array’ onderzoek van PBMCs bij een kleine groep post-infektueuze M.E./CVS mannen door Gow JW et al. [A gene signature for post-infectious Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genomics (2009) 2: 38] identificeerde differentieel tot expressie komende genen met rollen in immuun-modulatie, oxidatieve stress en apoptose, en – van bijzonder belang – vonden gestegen TNFAIP3, ter ondersteuning van onze resultaten. Ook van belang voor onze studie: Zhang L et al. [Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Clinical Pathology (2010) 63: 156-164] identificeerden een differentiële gen-signatuur van 88 genen via ‘micro-array’ analyse, wat verder werd gesubstantieerd door studies bij andere M.E./CVS-groepen. De gen-signatuur liet sub-groepering van de patiënten-groepen toe, en IPA-analyse van de gen-interakties, ziekte-verbanden en funkties identificeerde immunologische ziekte, met kanker gerelateerde cel-sterfte, immuun-respons en infektie mechanismen, alsook links met indicatoren voor Epstein-Barr en enterovirus infektie.

Onze verkennende benadering stelde ons in staat een rijke dataset van genen die differentieel tot expressie komen te verkrijgen, om de biologische veranderingen bij M.E./CVS te onderkennen. We identificeerden ontregeling van het circadiaans als een nieuwe mogelijke onderliggende oorzaak voor de niet-verfrissende slaap, vermoeidheid en metabole abnormaliteiten die worden gezien bij M.E./CVS. Verder biedt verstoorde mitochondriale funktie en de resulterende oxidatieve stress, gekoppeld met chronische immuun-inflammatoire signalisering, een dwingende verklaring voor de vermoeidheid, cognitieve dysfunktie en post-exertionele malaise die wordt ervaren bij M.E./CVS.

Daarom is deze studie een bijkomende stap naar het beter begrijpen van het ziekte-proces en het identificeren van vermeende biomerkers ter ondersteuning van de klinische diagnose. De geïndentificeerde biologische mechanismen bieden een rationele verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van M.E./CVS.

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

augustus 12, 2018

Identificatie van M.E.(cvs) DNA-methylatie patronen

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:47 am
Tags: , , , , ,

Methylatie van genen – het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide van DNA) – verandert hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA). DNA-methylatie komt dus voornamelijk voor op de cytosinen van CpG dinucleotide ‘sites’.

CpG-eilanden zijn gebieden/ DNA-fragmenten waar veel CpG-‘sites’ voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 baseparen (bp) met een GC (cytosine-guanosine dinucleotiden) -percentage > 50%. Meestal liggen die ‘upstream’ (vóór) van genen. Ze komen voor in ongeveer de helft van gen-promoters, zijn resistent voor methylatie en veelal geassocieerd met genen die frequent ‘aan’ staan.

Een promoter is een nucleotide-sequentie vóór een gen dat dient als startplaats, aanknopingspunt voor DNA-transcriptie; waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie – vrij vertaald ‘overschrijving’ naar RNA – te starten.

————————-

PLoS One Vol 13, #7, p e0201066 (juli 2018)

Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns

Malav S. Trivedi (1), Elisa Oltra (2), Leonor Sarria (3), Natasha Rose (1), Vladimir Beljanski (4), Mary Ann Fletcher (3,5), Nancy G. Klimas (3,5), Lubov Nathanson (3)

1 College of Pharmacy, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

2 School of Medicine and Dentistry, Catholic University of Valencia, Valencia, Spain

3 Institute for Neuro Immune Medicine, Dr. Kiran C. Patel College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

4 Cell Therapy Institute, Dr. Kiran C. Patel College of Allopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

5 Miami VAMC, Miami, Florida, United States of America

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe aandoening waarbij meerdere orgaan-systemen betrokken zijn en die wordt gekenmerkt door aanhoudende uitputtende vermoeidheid, immuun-dysfunktie, neurologische problemen en andere symptomen, gedurende minstens 6 maanden. Verstoring van DNA-methylatie patronen werd reeds gelinkt met verscheidene immuun- en neurologische ziekten; de status van M.E./CVS blijft echter onzeker. Onze studie probeerde wijzigingen van de DNA-methylatie patronen te identificeren die verband houden met M.E./CVS.

Methodes We haalden genomisch DNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen van 13 M.E./CVS studie-deelnemers en 12 gezonde controles, en bekeken de globale DNA-methylatie d.m.v. een op ELISA lijkende methode en de plaats-specifieke methylatie-status d.m.v. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays [‘genen-chips’]. Een validatie d.m.v. pyro-sequentie-bepaling omvatte 33 M.E./CVS-patiënten en 31 controles van 2 geografisch uitéénliggende lokaties.

Resultaten De globale DNA-methylatie waarden van M.E./CVS-individuen waren gelijkaardig met die van controles. De micro-array benadering liet echter toe de detektie toe van 17.296 differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen op 6.368 genen (regulerende elementen en binnen coderende gebieden van genen). Analyse van de DNA-methylatie in promoter-gebieden onthulde 307 differentieel gemethyleerde promoters. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ gaf aan dat genen die geassocieerd zijn met differentieel gemethyleerde promoters voorkwamen in ten minste 15 verschillende mechanismen, meestal gerelateerd met cel-signalisering en met een sterke immune component.

Besluiten Dit is de eerste studie die genoom-brede epigenetische veranderingen heeft onderzocht die geassocieerd zijn met M.E./CVS, gebruikmakend van de geavanceerde ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die ca. 850.000 CpG-sites beslaan en dit in 2 geografisch verwijderde of M.E./CVS-groepen en gematchte controles. Onze resultaten komen overéén met eerdere studies die een ontregeling van het immuunsysteem aangaven bij M.E./CVS. Ze suggereren ook een mogelijke rol van epigenetische ontregeling bij de pathobiologie van M.E./CVS. We stellen screening van grotere M.E./CVS-groepen voor om de externe validiteit van deze epigenetische wijzigingen te bepalen, om ze ev. te implementeren als potentiële diagnostische merkers in een klinische setting.

Inleiding

[…]

Een beter begrip van de molekulaire mechanismen van M.E./CVS en de dysfunktie binnen regulerende systemen zal zich vertalen in geschikte diagnostische methodes en management-strategieën, en meer gerichte behandel-benaderingen bieden.

Verstoring van epigenetische mechanismen is gelinkt met verscheidene immuun-, neurologische en endocriene ziekten. Bovendien werd gevonden dat DNA-methylatie patronen gewijzigd waren bij meerdere ziekten waarvan dikwijls wordt gemeld dat ze co-morbide met M.E./CVS zijn, zoals fibromyalgie (FM) en prikkelbare darm syndroom (IBS) [Ciampi de Andrade D et al. Epigenetics insights into chronic pain: DNA hypomethylation in fibromyalgia-a controlled pilot-study. Pain (2017) 158: 1473-80 /// Mahurkar S et al. Genome-wide DNA methylation profiling of peripheral blood mononuclear cells in irritable bowel syndrome. Neurogastroenterol Motil. (2016) 28: 410-22]. Met betrekking tot M.E./CVS, hebben we weet van slechts enkele studies, waar verschillen in DNA-methylatie patronen werden onderzocht tussen individuen met M.E./CVS en controles [de Vega WC et al. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS one (2014) 9: e104757 /// de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Medical Genomics (2017) 10: 11 /// Brenu EW et al. Methylation Profile of CD4+ T Cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228]. Deze studies maakten gebruik van ‘Illumina Human Methylation450 BeadChip’ micro-arrays, die de analyse van meer dan 450.000 methylatie-sites per staal (‘single-nucleotide’ resolutie) toelaten. Twee andere bijkomende studies beperkten de analyse tot specifieke gen-promoter-gebieden d.m.v. een plaats-specifieke benadering voor het meten van DNA-methylatie bij M.E./CVS [Vangeel E et al. Chronic Fatigue Syndrome and DNA Hypomethylation of the Glucocorticoid Receptor Gene Promoter 1F Region: Associations With HPA Axis Hypofunction and Childhood Trauma. Psychosomatic medicine (2015) 77: 853-62 /// Falkenberg VR et al. Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome. Genet Epigent. (2013) 5: 1-9]. De ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays laten toe DNA-methylatie veranderingen te analyseren op meer dan 850.000 CpG-‘sites’. Deze grotere omvang zou het blootleggen van bijkomende wijzigingen qua transcriptie-regulering bij M.E./CVS-patiënten moeten faciliteren. Door validatie van DNA-methylatie patronen geassocieerd met M.E./CVS bij 64 deelnemers van 2 geografisch uitéénliggende plaatsen d.m.v. pyro-sequentie-bepaling [‘pyro-sequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling], konden we bovendien consensus CpG hypo-gemethyleerde plaatsen identificeren die kunnen worden gebruikt bij toekomstige screenings aangaande verbanden van deze epigenetische wijzigingen bij M.E./CVS. Het was dan ook de intentie van deze om de eerdere analyse van genomische DNA-methylatie veranderingen bij M.E./CVS te valideren en uit te bouwen, en dergelijke bevindingen uit te breiden door gebruik te maken van meer CpG-sites. Toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-patiënten zijn gerechtvaardigd om betrouwbare epigenetische merkers voor M.E./CVS te vinden.

Materialen & methodes

Staal-afname &-verwerking

Recrutering. 2 lokaties: Miami/Fort Lauderdale (Florida) en Valencia, Spanje […]. Alle individuen hadden een vergelijkbare leeftijd en BMI. […] enkel vrouwelijke deelnemers […]. We gebruikten de Fukuda en Canadese definities. […]

All M.E./CVS-individuen zaten voor de ‘Medical Outcomes Study 36-item short-form survey’ (SF-36) samengevatte lichamelijke score onder het 50e percentiel […]. Alle individuen waren tussen 30 & 60 jaar oud.

Exclusie-criteria: […]

[…]

Isolatie van PBMCs & DNA-extracties. […]

Genomische DNA-methylatie profilering

Globale epigenetische metingen: ‘MethylFlash Methylated DNA 5-mC Quantification Kit’ (EpiGentek) & ‘MethylFlash Methylated DNA 5-hmC Quantification Kit’ (EpiGentek). […]

Beoordeling DNA-methylatie over het ganse genoom […] Bisulfiet-conversie van genomisch DNA [ongemethyleerd cytosine wordt omgezet naar uracil in DNA, gemethyleerd cytosine niet; via direct sequentie-bepaling kan dan de plaats van ongemethyleerde cytosinen en 5-methylcytosinen worden bepaald] d.m.v. de ‘EZ DNA Methylation Kit’ (Zymo Research) […] hybridisatie van het DNA op ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays.

Analyse van de genomische DNA-methylatie gegevens

[…]

De analyse van differentiële methylatie werd uitgevoerd gebruikmakend van 2 strategieën: op basis van genomisch gebied en op basis van de plaats. Terwijl de op genoom-gebied gebaseerde benadering kijkt naar het gemiddeld methylatie-niveau van het genoom-gebied (CpG-eilanden, promoters, genen en ‘tiling-regions’ [overlappende gebieden]) en dan de methylatie-toestand van de gebieden voor de stalen vergelijkt, worden bij de op plaats (‘site’) gebaseerde benadering de CpG-loci één per één geanalyseerd. Om gebieden of loci [meervoud van locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt] te detekteren die differentieel gemethyleerd zijn bij M.E./CVS t.o.v. controles, gebruikten we [gespecialiseerde] software voor de analyse van DNA-methylatie gegevens. CpG-plaatsen werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende selektie-criteria: het verschil qua absolute beta-waarde [onderscheidend vermogen] tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05, en de ‘false discovery-rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]) ≤ 0.05 […] voor micro-array analyse en p ≤ 0.05 […] voor pyro-sequentie-bepaling. Promoter-gebieden (1.500 bp ‘upstream’ van de transcriptie-start-plaats (TSS) en 500 bp ‘downstream’ van de TSS) werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende criteria: FDR ≤ 0.1 […] en het verschil qua absolute beta-waarde tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05. […]

[…]

Validatie van differentieel gemethyleerde promoters via pyro-sequentie-bepaling

De gegevens verkregen uit de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays werden gevalideerd via pyro-sequentie-bepaling […]. Methylatie van het DNA wordt gekwantificeerd d.m.v. bisulfiet-behandeling van het DNA en simultane PCR. […]. De resultaten worden gerapporteerd als percentage gemethyleerde cytosinen t.o.v. totaal (gemethyleerde & on-gemethyleerde) cytosinen. […]

‘Ingenuity pathway analysis’

De ‘Ingenuity Pathway Analysis’ software (IPA [software om expressie-profielen te analyseren om overheersende mechanismen en het betrokken interaktie-netwerk te bepalen]) werd aangewend om genen met differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) en de rangschikking van de geassocieerde kanonieke mechanismen aan te geven Analyse van de kanonieke mechanismen identificeert de mechanismen uit de IPA mechanismen-bibliotheek die meest significant zijn voor de set genen met DMPs. De significantie van het verband tussen de genen-set en een kanoniek mechanisme wordt gemeten via het bepalen van de verhouding tussen het aantal genen in de lijst die wordt in kaart gebracht, gedeeld door het totaal aantal van alle bekende genen van dat mechanisme. […]

Resultaten

Studie-ontwerp en demografie

[…] Genomisch DNA van 13 M.E./CVS-patiënten en 12 controles (‘experimentele groep’) werd gehybridiseerd [hybridisatie = samenvoegen van twee complementaire DNA-strengen] op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. deze kunnen testen voor meer dan 850.000 CpG-‘sites’ en beslaan verschillende gebieden van meerdere genen, inclusief promoter-, 5’UTR- [‘untranslated region’, onvertaald gebied; sequentie vóór het translatie start-codon], eerste exon [exon = deel van een gen dat codeert voor een deel van het uiteindelijk RNA/proteïne; het eerste exon omvat ook het 5’UTR], ‘gene-body’ [geheel van coderend stukken van een gen] & 3’UTR- [sequentie volgend op het translatie start-codon], alsook afgelegen gebieden. […]. Na analyse van de gegevens werden de verkregen resultaten gevalideerd d.m.v. pyro-sequentie-bepaling van de stalen van de experimentele groep, alsook (bijkomend) 8 M.E./CVS-patiënten & 8 controles uit de Miami/Fort Lauderdale regio en 12 M.E./CVS-patiënten & 11 controles uit Valencia.

Het is het vermelden waard dat eerdere studies (met ‘Illumina Human Methylation450’ micro-arrays) een gelijkaardig aantal patiënten en controles gebruikten: Brenu et al. [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie van T-cellen bij 25 M.E./CVS- patiënten & 18 controles; De Vega et al. (2014) [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie-status in PMBCs bij 12 M.E./CVS-patiënten & 12 controles. […] Bovendien ligt het belangrijkste sterkte-punt van de huidige bevindingen in de validatie van specifieke CpG-‘sites’ bij een uitgebreide groep M.E./CVS-patiënten en controles van verschillende geografische lokaties. […].

[…] Energie-status, sociaal funktioneren, emotionele rol en mentale gezondheid waren significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Daarnaast werden statistisch significante verschillen qua lichamelijk gezondheid geconstateerd (SF-36 scores). […]

Globale methylatie bij M.E./CVS

We vonden geen statistisch significante verschillen qua globale DNA-methylatie levels […] in PBMCs […]. Deze analyse toont echter algemene cytosine-modificaties maar blijft beperkt tot de detektie van specifieke schommelingen op afzonderlijke lokaties in het genoom.

Aangezien voorgaande studies plaats-specifieke methylatie-verschillen bij M.E./CVS hadden getoond, gingen we over tot de evaluatie van deze mogelijkheid bij onze experimentele groep maar we gebruikte echter een opgewaardeerde versie van de micro-arrays voor humane genoom-methylatie. Deze nieuwe technologie heeft bijna een 2 maal groter bereik en laat validatie en uitbreiding van eerdere bevindingen toe bij onafhankelijke, geografisch verwijderde groepen M.E./CVS-individuen.

Differentieel gemethyleerde CpG-sites bij M.E./CVS

De gegevens toonden hypo-methylatie van differentieel gemethyleerde ‘sites’ (DMS) (98%) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Er bleven 649.836 ‘probes’ [sondes; sequenties die kunnen hybridiseren] over voor verdere analyse na filtering en voor-verwerking van de ruwe genomische DNA-methylatie gegevens […]. Analyse van deze ‘probes’ leidde tot de vondst van 17.296 DMS gelegen in 6.368 genen, wijzend op epigenetische verschillen tussen de M.E./CVS-patiënten en controles […]. Bovendien toonde ‘Principal Component Analysis’ (PCA) [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.] van de volledige methylomen duidelijke differentiatie tussen M.E./CVS en controles. Daarnaast toonde ongecontroleerde hiërarchisch groeperen van de 500 meest variabele ‘CpG-sites’ duidelijke afscheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles, wat bevestigt dat DNA-methylatie patronen in PBMCs van M.E./CVS-individuen verschillen van deze van controles.

Van de 17.296 DMS, werd in het totaal 14.261 DMS (82%) gevonden binnen of in de nabijheid van genen (t.t.z. gen-lokaties), wijzend op het feit dat ze een rol kunnen spelen bij de regulering van gen-expressie. Ca. 98% van de DMS binnen de gen-gebieden vertoonden hypo-methylatie en 2% hyper-methylatie. Deze DMS waren meestal gelijk verdeeld tussen gen-lichamen (43,68%) en gen-regulerende elementen (TSS1500, TSS200 [1.500 – 200 nucleotiden ‘upstream’ van transcriptie-start-‘sites’], 5’UTR & 3’UTR) (43,84%). Er werd hypo-methylatie van M.E./CVS DNA gezien op 21,87% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden; 17,21% in 5’UTRs; 3,08% in eerste exonen en 4,25% in 3’UTRs. Anderzijds kwam hyper-methylatie voor op 0,16% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden, 0,34% in 5’ en 3’UTRs, en 0,79% in gen-lichamen. Wat betreft de lokalisatie t.o.v. CpG-eilanden: van de 17.296 DMS waren er 46,8% gelokaliseerd in CpG-eilanden, terwijl 53,2% (8.089 DMS) in de nabijheid van CpG-eilanden lagen. De plaatsbepaling van 8.089 DMS t.o.v. hun lokatie CpG-eilanden toont dat 99,3% van deze 8.089 DMS hypo-methylatie vertoonden en slechts 0,7% hyper-methylatie. Van deze 8.089 DMS waren er 25,25% gelokaliseerd binnen CpG-eilanden, 61,9% 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-eilanden (‘N, S shores’ [‘oevers’, gebieden kort (0-2 kb) bij CpG-eilanden]), en 12,8% in gebieden 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-‘shores’ (‘N, S shelves’ [‘klippen’, gebieden verder (2-4 kb) van CpG-eilanden]). Binnen deze gebieden vertoonden 74,1% van de ‘shores’ & ‘shelves’ hypo-methylatie, terwijl slechts 0,63% van de CpG-eiland-‘shores’ & -‘shelves’ hyper-methylatie vertoonden; wat consistent is met de globale bevinding dat hypo-methylatie geassocieerd is met M.E./CVS. Minder strenge criteria (FDR ≤ 0.1 & gemiddelde beta-verschillen > 0.05) lieten toe 27.129 DMS te identificeren.

Differentieel gemethyleerde promoters bij M.E./CVS

Aangezien methylatie van promoter-gebieden op een directe manier het niveau van gen-expressie beïnvloedt, gingen we verder met het analyseren van differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) in onze experimentele groep. Zoals beschreven werden promoters gedefinieerd als gebieden gelegen binnen de 1.500 bp ‘upstream’ van TSS en 500 bp ‘downstream’ van TSS. De criteria voor DMPs waren FDR ≤ 0.1 en de gemiddelde beta-verschillen > 0.05. Op basis van deze criteria vonden we 307 DMPs in PBMCs van M.E./CVS-individuen. 306 van deze DMPs vertoonden hypo-methylatie bij de M.E./CVS-groep […]. We bekeken de verdeling van deze promoters volgens gen-biotype. Bijna de helft van de geïdentificeerde DMPs behoren tot de proteïne-coderende genen (47,6%) en meer dan de helft (52,1%) behoren tot de regulerende RNA-genen. Deze laatste bestaan uit korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire [van de cel-kern] RNAs, kleine nucleolaire RNAs [nucleolus, kern-lichaampje]) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief anti-sense RNAs [sequenties die het mRNA inaktiveren] en inter-gen RNAs) (30,6%) en pseudo-genen [genen met een gelijksoortige DNA-struktuur als normaal funktionerende genen maar die niet tot expressie kunnen komen] (11,4%). Deze verdeling van DMPs ondersteunt onze hypothese dat de differentiële methylatie die we vaststellen kan leiden tot ontregeling van gen-expressie bij M.E./CVS. We identificeerden ook 144 DMPs met striktere criteria (FDR ≤ 0.05 en de gemiddelde beta verschillen > 0.05 […]; en dit vertegenwoordigt gelijkaardige gen-funktie patronen als de DMPs geïdentificeerd met FDR ≤ 0.1.

Analyse van funktionele mechanismen van DMPs

Om de mogelijke funkties en interakties tussen de 307 genen die worden gecontroleerd door DMPs beter te begrijpen binnen de context van cel-biologische mechanismen, voerden we een Gen Ontologie [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] analyse uit d.m.v. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ (IPA). Deze analyse onthulde veranderingen in talrijke immuun-regulerende/ stress-respons mechanismen zoals het p38MAPK mechanisme (betrokken bij de respons op een waaier omgeving-stressoren en op inflammatoire cytokinen), de IL-10, IL-17A, Il-1 & IL-8 signalisering-mechanismen (allen met belangrijke immuun-regulerende rollen), het AMPK-mechanisme (belangrijkste regulator van de cellulaire energie-homeostase die wordt geaktiveerd in respons op stressoren die de cellulaire ATP-voorraden uitputten [zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS & ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]) en metabole mechanismen zoals PPARα/RXRα [nucleaire receptoren] -aktivatie, en uracil- & thymine [DNA-basen] -afbraak mechanismen. Verder onthulde funktionele analyse van talrijke individuele genen hypo-methylatie in promoters van de IGHJ1, IGHJ1P, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ6, IGHJ3P, IGHV3-7, IGHD7-27, IGLL1 & LRMP genen die gerelateerd zijn met de B-cel immuun-respons, differentiatie, proliferatie en overleving. Op dezelfde manier vertoonden M.E./CVS-patiënten verminderde DNA-methylatie in promoters van genen verantwoordelijk voor T-cel generatie en aktiviteit, zoals ZCCHC11, CAPN5, IL21R, P2RX5, TREML2, AKNA & CD248. Samen met een robuuste impact op immuun-respons mechanismen, vertoonden PMBCs van M.E./CVS-patiënten verminderde methylatie van promoters van genen geassocieerd met cel-groei die gericht waren op de MAP-kinase, NF-kB & TGF signalisering-mechansimen. Daarnaast werd een onderscheidend patroon van hypo-methylatie van gen-promoters betrokken bij miRNA-expressie (miR-4435, miR-181, miR-148a, miR-193b, miR-1284, miR-10A, miR-1203, miR-3934, miR-4487 & miR-4710) [zie o.a. ook ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.] en bij bio-metaal regulering – inclusief metaal-transporter SLC39A13 (ZIP-transporter) en meerdere ‘zinc-finger’ [‘zinc-finger’ proteïnen zijn een super-familie van proteïnen die op DNA kunnen binden] genen (ZCCHC8, ZCCHC11, ZBTB18, BAZ2B, ZNF225 and ZNF732) – geïdentificeerd.

Validatie van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-array resultaten d.m.v. pyro-sequentie-bepaling

Om de resultaten van onze analyse-resultaten van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays te valideren, selekteerden we 2 DMPs met een hoge densiteit aan CpG-‘sites’ en mogelijke rol in de neuro-immune signalisering bij M.E./CVS. De eerste, het ‘Zinc Finger and BTB Domain Containing 18’ (ZBTB18), is een ‘zinc-finger’ transcriptie-onderdrukker met een cruciale rol in hersen-ontwikkeling en neuronale differentiatie. De tweede, TABPB, codeert voor een trans-membraan glycoproteïne dat de interaktie medieert tussen nieuw geassembleerd majeur histocompatibiliteit complex (MHC) klasse-I molekulen en de transporter geassocieerd met antigen-verwerking, die vereist is bij het transport van antigen-peptiden door het endoplasmatisch reticulum. ZBTB18 zit in het bovenste deel van de lijst met DMPs […] (positie 8 op 307); terwijl TABPB in het onderste deel zit (positie 246 op 307); zodat we bij de validatie-stap DMPs opnamen met waarden aan beiden uiteinden van het spectrum. Voor elk van de 2 geselekteerde genen, bepaalden we het DNA-methylatie niveau van 6 CpG-‘sites’ in het promoter-gebied. Voor ZBTB18 correspondeerden 3 van de CpG-‘sites’ met oligonucleotiden op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays en 3 bijkomende CpG-‘sites’ – niet opgenomen op de micro-array maar gelegen in het gen promoter-gebied tussen cg15896892 & cg19698993 – werden ook getest. In het geval van TABPB correleerden alle geteste CpG-‘sites’ met probes van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. Pyro-sequentie-bepaling analyse valideerde de richting van methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-individuen en controles sterk (p < 0.01) […] voor alle geteste CpG-‘sites’. Belangrijk: we zagen dat de methylatie-niveaus gedetekteerd via pyro-sequentie-bepaling bij M.E./CVS-patiënten gelijkaardig waren met deze vastgesteld d.m.v. ‘MethylationEPIC’ micro-arrays voor alle DMS, en dat de verschillen qua methylatie-niveaus bepaald via pyro-sequentie-bepaling zelfs meer uitgesproken waren dan dezelfde verschillen bepaald d.m.v. micro-arrays.

Bespreking

DNA-methylatie speelt een belangrijke rol bij de wisselwerking tussen externe (omgeving) en interne (gen-expressie) factoren en kan zodoende de late of door een stimulus getriggerde aanvang van complexe multi-systeem ziekten zoals M.E./CVS verklaren. Slechts enkele studies hebben echter gerapporteerd over wijzigingen qua DNA-methylatie geassocieerd met M.E./CVS. Hier gebruikten we een nieuwere en verbeterde technologie – ontwikkeld door Illumina Inc.; die nog niet beschikbaar was ten tijde dat de voorafgaande studies werden uitgevoerd – met de bedoeling de eerdere bevindingen uit te breiden. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays beslaan bijna 2 maal zoveel CpG-‘sites’ als de oudere ‘Illumina HumanMethylation450’ micro-arrays, inclusief 333.265 bijkomende CpGs gelegen regulerende gebieden […].

We identificeerden hier differentieel gemethyleerde CpG-‘sites’ en promoters in PBMCs van M.E./CVS-individuen vergeleken met controles in groepen van twee uitéénliggende geografische lokaties. De associatie van hypo-methylatie van DMPs met immuun-regulerende mechanismen komt overéén met eerdere studies. Deze eerdere studies vonden bij immuun-cel regulering de grootste gecoördineerde aanrijking qua differentieel gemethyleerde mechanismen en rapporteerde genomisch DNA hypo-methylatie van genen in immuun-mechanismen in PBMCs geïsoleerd bij M.E./CVS-patiënten [zie de Vega WC et al. hierboven] en ook in CD4+ T-cellen bij M.E./CVS [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: we vonden significante verschillen qua DNA-methylatie tussen M.E./CVS en controles op 17.296 CpG-‘sites’ in 6.368 genen globaal (FDR ≤ 0.05), in promoters alsook andere gen-regulerende elementen en binnen coderende gen-gebieden. Er werd DNA hypo-methylatie gevonden in 98% van deze plaatsen bij M.E./CVS, terwijl slechts 2% hyper-methylatie vertoonden, t.o.v. controles.

Differentiële methylatie van promoters [in de gebruikte software beschreven als gebieden 1500 bp ‘upstream’ en 500 bp ‘downstream’ van TSS] kan een invloed hebben op de expressie van de corresponderende aangetaste genen. Interessant genoeg houden minder dan de helft van de DMPs (47,6%) verband met proteïne-coderende genen; terwijl meer dan 50% aangetaste niet-proteïne-coderende DMPs overéénkomen met promoters van regulerende gen-elementen, inclusief korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire RNAs, kleine nucleolaire RNAs) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief ‘anti-sense’ RNAs en ‘inter-gen’ RNAs) (30,6%) en pseudo-genen (11,4%). Kleine nucleaire RNAs en kleine nucleolaire RNAs participeren in RNA-‘splicing’ [tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt], terwijl lange niet-coderende RNAs en pseudo-genen belangrijke rollen spelen bij de regulering van transcriptie en mRNA-stabiliteit […]. Het is belangrijk op te merken dat het grootste beta-verschil (hypo-methylatie 14%) in de DMP-lijst werd gezien voor de promoter van het gen dat verband houd met de werking van ‘natural killer’ (NK) cellen.

Op het niveau van enkelvoudige genen, tonen onze resultaten hypo-methylatie van promoters van genen gerelateerd met die van referentie-studies, zoals sommige ‘solute carriers’ [membraan-transport-proteïnen], RNA-bindende proteïnen, ‘homeobox’ [binden op DNA en beïnvloeden zo de expressie van genen] en ‘PHD-finger’ [betrokken bij gen-regulering] -proteïnen [zie Brenu EW et al. hierboven]. Bij deze vonden we het MED13L gen [codeert voor een sub-unit van een groot transcriptioneel co-aktivator complex waarvan wordt gedacht dat het vereist is voor de expressie van bijna alle genen] dat geassocieerd is met verlaagde spier-spanning en neurocognitieve stoornissen, symptomen die verbonden zijn met M.E./CVS. We vonden ook DMPs gelinkt met de expressie van ribosomale proteïnen (RPL23A & RPL7) alsook met de 5S-ribosomale RNA pseudo-genen (RNA5SP245, RNA5SP77 & RNA5SP97) suggestief voor mogelijke verstoring van proteïne-synthese. Met betrekking tot de methylatie-status van de met glucocorticoïde respons geassocieerde genen, vonden we significante hypo-methylatie van de SGK3 (serum glucocorticoid gereguleerd kinase [o.a. rol bij regulering van verscheidene transporter-systemen]) gen-promoter [zie de Vega WC et al. hierboven].

Transcriptie-profilering studies bij M.E./CVS-patiënten gaven verstoringen aan van T- & B-cel aktivatie en ontregeling van gen-expressie die gerelateerd is met immuun-responsen in brede zin, en dergelijke veranderingen passen bij andere studies die een gewijzigde aanmaak van interleukine en interferon cytokinen aantoonden als kenmerken voor M.E./CVS immuun-dysfunktie [Broderick G et al. A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain, behavior and immunity. (2010) 24: 1209-17]. In de huidige studie, rapporteren we hypo-methylatie van DMPs van genen waarvan bekend is dat ze de adaptieve immuun-respons zoals immunoglobulinen en pseudo-genen (bv. IGDCC3, IGHD7-27, IGHJ1, IGHJ3 en andere) reguleren, wat overéénkomt met de gemelde verbetering van M.E./CVS-patiënten na B-cel depletie-therapie. We zagen ook hypo-methylatie van promoters van MMP14, MAP4K4, MAPK12 & CREB5 die mogelijks het TNF-signalisering mechanisme aktiveren, wat past bij de gerapporteerde over-expressie van pro-inflammatoire cytokinen bij M.E./CVS. Daarnaast toonden we ook hypo-methylatie van miRNA-148a promoter die mogelijks kan bijdragen tot over-expressie. Het is bekend dat de miRNA-148-152 familie de aangeboren immuun-respons en antigen-presentatie […] kan verstoren. Bovendien kan miRNA-148a bijdragen tot DNA hypo-methylatie CD4+ T-cellen bij lupus [systemische lupus erythematosus; een auto-immune aandoening] door het onderdrukken van de expressie van DNA-methyltransferase-1 [DNA-methyltransferasen zijn enzymen die een methyl-groep toevoegen aan de 5’ positie]. Het is meldenswaardig dat bij de DMPs die in deze studie geassocieerd zijn met miRNA-expressie, ook werd gemeld dat miRNA-10a, miRNA-181 & miRNA-4710 aangetast waren op DNA-methylatie niveau in minstens één eerdere M.E./CVS-studie [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: miRNA-10a bleek geassocieerd met M.E./CVS in NK-cellen [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9] en miR-181 gerelateerd met de TLR-gemedieerde inflammatoire respons, dat geassocieerd is met M.E./CVS [Gambuzza ME et al. The Role of Toll-Like Receptors in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: A New Promising Therapeutic Approach? CNS Neurol Disord Drug Targets (2015) 1: 903-14].

Hypo-methylatie van de IL21R gen-promoter kan wijzen op verhoogde expressie van de IL21-receptor. De ligand-binding van deze receptor leidt tot de aktivatie van meerdere ‘downstream’ signalisering-molekulen, inclusief JAK1, JAK3, STAT1 & STAT3. ‘Studies suggereren een rol voor dit gen bij het reguleren van de immunoglobulinen-produktie. IL21 reguleert aangeboren én adaptieve immuun-responsen, en oefent ook belangrijk effekten uit op inflammatoire responsen die de ontwikkeling van auto-immune ziekten en inflammatoire aandoeningen bevorderen. Belangrijk: IL21-signalisering is cruciaal voor de inductie van spontane experimentele auto-immune encefalomyelitis. De in onze studie gerapporteerde DMPs zijn niet enkel consistent en valideren de eerdere studies betreffende gen-regulerende elementen in genen binnen de immuun-cel regulering cluster maar ze bieden ook een beter begrip door het gebruik van geavanceerde technologie alsook de validatie via groepen van verwijderde geografische lokaties.

Het is meldenswaardig dat het nog te vroeg is om te besluiten uit eerdere studies of onze huidige studie, of de significante epigenetische modificaties die geassocieerd bleken met M.E./CVS op een compenserend homeostatisch mechanisme wijzen of het resultaat zijn van een adaptieve immuun-respons op inductoren uit de omgeving. Deze resultaten geven echter aan dat DNA-methylatie een potentieel gen-regulerend mechanisme vormt dat in staat is langdurige veranderingen bij M.E./CVS-patiënten te mediëren, zoals eerder opgemerkt door andere auteurs. Samengevat: de associatie van differentiële DNA-methylatie met M.E./CVS suggereert zeker een potentiële rol voor epigenetische wijzigingen in de pathofysiologie van M.E./CVS.

Besluiten

Naar ons weten is dit de eerste studie die epigenetische veranderingen in relatie tot M.E./CVS over gans het genoom heeft onderzocht gebruikmakend van ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die meer dan 850.000 CpG-‘sites’ beslaan en die de resultaten heeft gevalideerd in 2 geografisch van elkaar gelokaliseerde groepen M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen bouwen verder op eerdere preliminaire rapporten die een verband tonen tussen gewijzigde methylatie-profielen van genen met immuun-funkties en DNA-methylatie bevestigen als een epigenetisch regulerend mechanisme geassocieerd met M.E./CVS. Er zijn toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-indviduen nodig om deze bevindingen te bevestigen en de effekten van dergelijke methylatie-patronen op gen-expressie te evalueren.

maart 23, 2018

Verband van CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 7:34 am
Tags: , , , , , , ,

Telomeren zijn de repetitieve sequenties die de uiteinden van chromosomen beschermen en de genomische integriteit helpen bewaren. Menselijke chromosomen worden begrensd en gestabiliseerd door telomeren. Ze bestaan uit meerdere duizenden copieën van een hexameer (6 nucleotiden) sequentie (TTAGGG)n ondersteund door een complex van DNA-bindende proteïnen en enzymes. Telomeren zorgen er voor dat de chromosoom-uiteiden worden herkend als beschadigd DNA waarbij herstel van de dubbele streng nodig is. Telomeren worden wel eens vergeleken met de plastic tip aan het uiteinde van een schoenveter: ze voorkomen degradatie en ‘uitrafeling’ van chromosomen. Telomeren variëren in lengte tussen chromosoom en individuen. Ze verkorten met elk cel-deling omdat de zeer repetitieve DNA-sequenties niet efficient worden gecopieerd (het zgn. ‘end replication problem’), wat leidt tot een progressief verlies van de gemiddelde telomeer-lengte (15 tot > 60 baseparen per jaar). De mate van telomeer-slijtage is het hoogst gedurende de eerste levensjaren maar stijgt ook na de leeftijd van 50 jaar.

De telomeer-lengte werd eerder al gelinkt met fibromyalgie-pijn (‘Pain is associated with short leukocyte telomere length in women with fibromyalgia’. J Pain (2012) 13: 959-69).

De groep die onderstaande studie uitvoerde, publiceerde in 2016 al een samenvatting van de resultaten die ze hadden voorgesteld op de Experimental Biology Meeting dat jaar (‘Telomere length analysis in Chronic Fatigue Syndrome’ in The FASEB Journal 30). Nu dus een uitgebreid artikel.

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 44 (februari 2018)

Association of Chronic Fatigue Syndrome with premature telomere attrition

Mangalathu S. Rajeevan (1), Janna Murray (1,2), Lisa Oakley (1,3), Jin-Mann S. Lin (1), Elizabeth R. Unger (1)

1 Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

2 Influenza Division, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

3 College of Public Health and Human Services, Oregon State University, Corvallis, USA

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook bekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een ernstig invaliderende aandoening met onbekende etiologie. De symptomen en risico-factoren van M.E./CVS delen kenmerken met de versnelde veroudering die geïmpliceerd is bij meerdere ziekten. Gebruikmakend van telomeer-lengte als merker, werd deze studie uitgevoerd om de hypothese te testen dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering.

Methodes Gegevens van de deelnemers (n = 639) kwamen van de follow-up van de Georgia CVS-studie. De deelnemers werden geklassificeerd – gebruikmakend van de 1994 ‘CFS Research Case Definition’ met op vragenlijsten gebaseerde subschaal drempels voor vermoeidheid, funktioneren en symptomen – in 4 ziekte-groepen: CVS als aan alle criteria werd voldaan (n = 64), CVS-X als CVS met uitsluitende aandoeningen (n = 77), ISF (onvoldoende symptomen/vermoeidheid) als slechts aan enkele criteria werd voldaan ongeacht uitsluitende aandoeningen (n = 302) en NF (niet-vermoeid) als niet aan de criteria werd voldaan en er geen uitsluitende aandoeningen waren (n = 196). De relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio) [de verhouding van telomeer PCR-signaal (T) op het PCR-signaal van een ‘single copy’ gen (S); deze is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel en wordt uitgedrukt t.o.v. de T/S-ratio van een referentie-DNA] werd gemeten gebruikmakend van DNA uit vol bloed en ‘real-time’ PCR. Er werden algemene lineaire modellen gebruikt om het verband te bepalen tussen ziekte-groepen of T/S-verhouding en demografische gegevens, biologische metingen en co-variabelen (significantie p < 0.05).

Resultaten De gemiddelde T/S-ratio verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratios bij CVS (0.90 ± 0.03) en ISF (0.94 ± 0.02) waren elk significant lager dan voor NF (1.06 ± 0.04). Verschillen qua T/S-verhouding bij de ziekte-groepen bleven significant na aanpassing voor co-variabelen (leeftijd, geslacht, ‘body-mass-index’, lende/heup-verhouding, post-exertionele malaise en opleidingsniveau). De telomeer-lengte was 635, 254 & 424 baseparen korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, t.o.v. van NF. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering bij CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF, respectievelijk. Verder toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht aan dat de associatie van of M.E./CVS met korte telomeren grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar.

Besluiten Deze studie vond een significant verband tussen M.E./CVS en vroegtijdige telomeer-slijtage die grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten geven aan dat M.E./CVS kan worden opgenomen in de lijst van aandoeningen die geassocieerd zijn met versnelde veroudering. Er is verder werk vereist om de funktionele betekenis van die versnelde veroudering bij M.E./CVS te evalueren.

Achtergrond

[…]. De symptomen en risico-factoren voor M.E./CVS hebben kenmerken die gemeenschappelijk zijn met deze voor versnelde veroudering/vroegtijdige immunosenescentie [de geleidelijke verslechtering van het immuunsysteem veroorzaakt door natuurlijk ouder-worden]. Versnelde veroudering bleek betrokken bij meerdere ziekten en slechte gezondheid-resultaten, en telomeer-lengte is een alom gebruikte merker van versnelde veroudering.

Telomeren zijn meerdere duizenden ‘repeats’ van TTAGGG nucleotide-sequenties die de uiteinden van lineaire chromosomen begrenzen. Telomeren verkorten tijdens elke serie cel-replicatie […] en zodoende weerspiegelt telomeer-lengte de replicatie-geschiedenis van cellen en bepaalt ze de levensduur van cellen. Omwille van de graduele erosie van telomeren bij elke cel-deling, is leeftijd de sterkste voorspeller van de telomeer-lengte van een individu. Meerdere rapporten geven echter geslacht-verschillen aan: voor leeftijd aangepaste telomeer-lengte van leukocyten bleek langer bij volwassen vrouwen dan mannen. Daarnaast is er ook een impact op telomeer-lengte door andere genetische, epigenetische, fysiologische en omgeving-factoren. Deze factoren dragen bij tot de variabiliteit van zowel de absolute telomeer-lengte en de mate van telomeer-verkorting bij individuen. Chronische inflammatie en oxidatieve stress kunnen telomeer-slijtage verhogen, wat mogelijks de associatie van versnelde telomeer-verkorting bij ziekte verklaart [metabole & inflammatoire ziekten, psychiatrische aandoeningen, kanker]. We hypothiseren dat M.E./CVS geassocieerd is met versnelde veroudering en dat kortere telomeren kunnen dienen als een merker voor dit verband. We testten onze hypothese betreffende telomeer-lengte gebruikmakend van DNA uit vol bloed met de klemtoon op een aantal demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen [Allostatische belasting is een term uit de psychosomatiek: opéénstapeling van ontregelde fysiologische regelsystemen waardoor de soepelheid van de adaptatie afneemt; een vorm van slijtage; ook: een slechte stress-reaktie, in plaats van je evenwicht te bewaren gaan de stresshormonen je psychisch en lichamelijk ondermijnen. Meten van de ‘allostatic load’ = verzamelen van informatie over fysiologische aktiviteit van meerdere belangrijke regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel, zowel als het cardiovasculair systeem, het immuunsysteem en metabole processen] die waarschijnlijk een invloed hebben op de associatie tussen M.E./CVS-status en telomeer-lengte. Onze resultaten tonen significante telomeer-verkorting aan bij individuen met M.E./CVS en andere vermoeidheid-groepen in de globale studie-groep, waarbij analyses significante vroegtijdige telomeer-erosie bij vermoeide vrouwelijke deelnemers jonger dan 45 jaar onthulden. Deze bevindingen ondersteunen de opname van het model van vroegtijdige en versnelde immunosenescentie in toekomstige studies naar de M.E./CVS-pathofysiologie.

Methodes

Gegevens-bronnen & studie-groep

De gegevens kwamen uit de ‘follow-up’ fase van een 2-ledige populatie-gebaseerde longitudinale studie van CVS en vermoeiende ziekte in Georgia (V.S.) […].

De huidige analyse focuste op gegevens van de klinische evaluatie van deze fase; deze omvatte een gedetailleerde medische anamnese, lichamelijk onderzoek, laboratorium-testen en psychiatrische evaluatie […]. De deelnemers vulden een aantal vragenlijsten in, waaronder de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ (MFI-20), de ‘Short Form Health Survey’ (SF-36 v2) en de ‘CDC Symptom Inventory’ (SI). […] De hartslag (bpm), systolische & diastolische bloeddruk (mmHg), lengte, gewicht, en buik- & heup-omtrekken werden gemeten […]. De afgeleide parameters ‘body-mass-index’ (BMI) en lende/heup-ratio (WHR) werden berekend [BMI = gewicht/lengte2 (kg/m2)]; [WHR = buik/heup (cm/cm)]. De analyse omvatte biologische metingen zoals HDL-cholesterol (mg/dl), triglyceriden (mg/dl), nuchtere glucose (mg/dl), insuline (µIU/ml), C-reactief proteïne (CRP, mg/dl) en albumine (g/dl).

Diagnose CVS: voldoen aan de 1994 internationale research-definitie. Individuen met onverklaarde chronische ziekte met onvoldoende symptomen/vermoeidheid om te voldoen aan alle CVS-criteria werden geklassificeerd in de ‘insufficient symptoms/fatigue’ (ISF) groep. Individuen die aan geen enkele van de CVS-criteria voldeden, werden gegroepeerd als niet-vermoeide (NF) controles. Daarnaast werden de deelnemers in elke groep onderverdeeld in met of zonder uitsluitende medische/psychiatrische aandoeningen. Van de 751 deelnemers die klinisch werden geëvalueerd, voldeden er 71 aan alle CVS-criteria zonder uitsluitende aandoeningen (CVS-groep), 78 voldeden aan alle CVS-criteria maar met uitsluitende aandoeningen (CVS-X groep), 340 voldeden aan de criteria voor ISF ongeacht uitsluitende aandoeningen, 212 voldeden aan de criteria voor NF controles zonder uitsluitende aandoeningen, 47 voldeden aan de criteria voor NF met uitsluitingen en 3 deelnemers werden geklassificeerd als “onbeslist” omwille van onvolledige informatie. […] Uiteindelijk bleven er 639 deelnemers in de 4 ziekte-groepen: 64 CVS, 77 CVS-X, 302 ISF (met en zonder uitsluitende aandoeningen) en 196 NF zonder uitsluitende aandoeningen.

Bepaling van relatieve telomeer-lengte (T/S-ratio)

De relatieve telomeer-lengte werd gemeten op basis van een alom gebruikt ‘real-time’ PCR protocol […]. De bepaling maakt gebruik van telomeer-specifieke ‘primers’ en hun vermogen om een signaal te genereren dat proportioneel is met de totale opgetelde lengte van alle telomeren in de cel. Dit telomeer-signaal wordt uitgedrukt t.o.v. het signaal dat ontstaat door de amplificatie van het ‘single copy’ gen [gen dat slechts met één enkele kopie in het hele genoom voorkomt] 36B4 [éénvoudig uitgedrukt: een referentie-gen] […]. De verhouding van het telomeer (T) -signaal op het ‘single copy’ gen (S) -signaal (de T/S-verhouding) is proportioneel met de gemiddelde telomeer-lengte per cel. Deze verhouding wordt uitgedrukt t.o.v. een referentie-DNA (K562 DNA) waaraan een T/S-ratio van 1,0 wordt toegekend.

[…] De T/S-verhouding kan op 2 manieren worden berekend […]; we gebruikten hier T/S-ratios bekomen via de standaard-curve methode […]. Voorafgaandelijk evalueerden we de reproduceerbaarheid en valideerden we de resultaten [t.o.v. een andere methode]. De T/S-ratios bleken zeer sterk reproduceerbaar […]. Er werd op meerdere niveaus een kwaliteit-controle van de bepaling uitgevoerd, inclusief. […]

Statistische analyses

[…] Er werden ook leeftijd- en geslacht-analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe deze demografische variabelen het verband tussen CVS-status en T/S-ratio beïnvloeden. […] We maakten een schatting van het aantal jaren bijkomende veroudering op basis van een literatuur-waarde voor telomeer-slijtage van 31-63 bp/jaar […].

Resultaten

[…] Het studie-staal (n = 639) bestond voornamelijk uit vrouwen (75%), blanken (76%), levend in een landelijk gebied (50%), met een jaarlijks inkomen van meer dan 40.000 $ (71%), met een gemiddelde leeftijd van 48 jaar […] en een gemiddelde BMI van 28 ± 0,21 kg/m2. Het staal werd opgedeeld in 4 ziekte-groepen: CVS-X (12%), CVS (10%), ISF (47%) & NF (31%). De groepen verschilden niet qua gemiddelde leeftijd en ziekte-duur maar verschilden significant qua metingen van abdominale obesitas (BMI & WHR), geslacht, ras, opleiding, inkomen en PEM [post-exertionele malaise].

We bekeken ook associaties met de ziekte-groepen: biologische metingen zoals telomeer-lengte, metabole variabelen en ‘allostatic load’. De globale T/S-ratio varieerde van 0,269 tot 4,138 (gemiddelde: 0,98; mediaan: 0,917). De gemiddelde telomeer-lengte verschilde significant per ziekte-groep (p = 0.0017); de T/S-ratio bij CVS (0,90 ± 0,03) & ISF (0,94 ± 0,02) lagen elk significant lager dan de NF groep (1,06 ± 0,04). De triglyceriden-concentratie, een maatstaf voor metabool syndroom [chronisch stofwisselingsprobleem met abdominale (centrale) obesitas + hypertensie + verhoogd nuchter bloed-glucose + hoge triglyceriden in het bloed + lage hoge-densiteit lipoproteïnen (HDL)], was significant verschillend voor de ziekte-groepen, maar andere metingen opgenomen bij zowel metabool syndroom en ‘allostatic load’ (HDL, systolische & diastolische bloeddruk en nuchtere glucose) verschilden niet significant. Bij de metingen die specifiek zijn voor ‘allostatic load’, vertoonden hartslag, insuline & CRP significante verschillen, waarbij de gemiddelde CRP-waarde bij CVS-X & CVS 93% hoger lag dan in de NF groep.

Wat betreft bepalingen van de bivariate associaties tussen T/S-ratio en demografische, metabole en ‘allostatic load’ variabelen, zagen we een significant omgekeerd verband van telomeer-lengte met de leeftijd (p = 0.0009.), metingen m.b.t. abdominale obesitas [BMI (p = 0.0145), WHR (p = 0.0149)] & PEM (p = 0.0153). De telomeer-lengte was ook significant geassocieerd met opleidingsniveau (p = 0.0288). De telomeer-lengte was niet statistisch significant gerelateerd met enige andere demografische of biologische meting, hoewel associaties met CRP (p = 0.0789) en nuchtere glucose (p = 0.0625) bijna statistisch significant waren.

We controleerden de associatie van gemiddelde telomeer-lengte met ziekte-groepen voor eerder gedefinieerde co-variabelen: leeftijd, BMI, WHR, PEM en opleidingsniveau. Geslacht werd ook opgenomen omwille van het significant verband met CVS. De gemiddelde telomeer-lengte verschillen tussen alle vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X, ISF) en de niet-vermoeide groep bleven significant (p < 0.01) vóór en na controle op co-variabelen. Op basis van de aangepaste groep-gemiddelden was de telomeer-lengte 635, 254 & 424 bp korter bij CVS, CVS-X & ISF, respectievelijk, vergelen met de NF groep. Deze kortere telomeer-lengte vertaalt zich in ruw-weg 10,1-20,5, 4,0-8,2 & 6,6-13,7 jaar bijkomende veroudering […].

De significante negatieve lineaire correlatie tussen telomeer-lengte en leeftijd in de globale studie-groep werd bepaald door de statistisch significante relatie onder de NF. Bij de NF in hun twintiger of dertiger jaren was de telomeer-lengte het langst. Bij NF gaf de trend een verkorting van 42 bp/jaar aan, terwijl het bij de andere groepen niet significant was (CVS 17 bp/jaar, CVS-X 22 bp/jaar & ISF 8,5 bp/jaar). De significante associatie van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot deelnemers van < 45 jaar (n = 216). Bij hen waren de telomeren 932 bp (CVS), 767 bp (CVS-X) & 966 bp (ISF) korter t.o.v. NF; ruw-weg 14,8-30,1, 12,2-24,7 & 15,3-31,8 jaar bijkomende veroudering of […].

Hoewel er geen associatie was tussen telomeer-lengte en geslacht in de globale studie-groep, werd het verwachte man/vrouw-verschil gezien in de NF groep: de telomeren waren 713 bp langer bij vrouwen (n = 133; T/S-ratio 1,116) dan mannen (n = 63; T/S-ratio 0,9476). Analyses op basis van geslacht toonden dat het significant verband van telomeer-lengte met ziekte-groepen was beperkt tot vrouwen (n = 477). Onder de vrouwelijke deelnemers waren de telomeren in de CVS-groep (n = 58) 957 bp korter (p < 0.001) t.o.v. de NF groep (n = 133). T.o.v. de NF was het verschil 690 bp bij CVS-X (n = 64; p = 0.003) & 711 bp bij ISF (n = 222; p < 0.001), respectievelijk. Ter ondersteuning van dit geslacht-specifiek effekt, bleek uit een analyse van alle mannelijke deelnemers (n = 99) geen significant verschil qua telomeer-lengte voor CVS, CVS-X & ISF t.o.v. NF (n = 63).

Hoewel in alle analyses de gemiddelde telomeer-lengte voor alle ziekte-groepen consistent lager was dan voor de NF groep, werd het grootste verschil gezien in de groep vrouwen jonger dan 45 (n = 175). De mate van telomeer-verkorting bij vrouwen jonger dan 45 was 1.130 bp voor CVS, 1.007 bp bij CVS-X & 1.154 bp bij ISF (t.o.v. NF); […] Bij de vrouwen van minder dan 45 jaar oud, hadden 95% van deze met CVS (21/22) telomeren die korter waren dan de gemiddelde telomeer-lengte (T/S-ratio = 1,2324) of die van de NF (p = 0.0092).

Bespreking

Naar ons weten is dit de eerste studie die telomeer-ersoie aantoont bij patiënten met M.E./CVS, die significant bleef vóór en na controle op leeftijd, geslacht, obesitas (BMI, WHR), PEM en opleidingsniveau. Bovendien toonden analyses op basis van leeftijd en geslacht dat deze associatie van korte telomeren bij M.E./CVS grotendeels wordt bepaald door vrouwelijke individuen jonger 45 jaar. Overéénkomstig met studies in de algemene bevolking vertoonde onze studie-groep een omgekeerd verband van telomeer-lengte met leeftijd maar, interessant, de associatie was slechts statistisch significant bij NF deelnemers. Het leeftijd-gerelateerd verschil qua telomeer-lengte was meer uitgesproken voor het 40ste levensjaar, en analyse gaf aan dat het significant verband van telomeer-lengte met vermoeidheid-groepen was beperkt tot deelnemers jonger dan 45. Gelijkaardig met de bevindingen van deze studie, vonden andere researchers dat vroegtijdige telomeer-slijtage meer significant was bij met Lupus Erythematosus en Reumatoïde Artritis van jonger dan 40-45.

Globaal gezien, en in overéénkomst met studies van de algemene bevolking, waren telomeren significant langer bij vrouwen in vergelijking met mannen in de NF groep. Dit geslacht-gerelateerd verschil in telomeer-lengte werd echter niet gezien bij de vermoeidheid-groepen (CVS, CVS-X & ISF). Wanneer de analyse van telomeer-lengte per ziekte werd gestratificeerd per geslacht, was de telomeer-verkorting met betrekking tot NF individuen enkel significant bij vrouwen. De telomeer-lengte bleef echter zonder significant verschil bij mannelijke deelnemers in de analyse die alle mannen met CVS, CVS-X en ISF combineerde in één groep t.o.v. NF; dit impliceert dat het onwaarschijnlijk is dat het geslacht-specifiek effekt te wijten is aan een verschil van de grootte van de stalen. Er werd voorgesteld dat in de algemene bevolking het hormoon oestrogeen een rol speelt bij het behouden van lange telomeren en langere levensduur bij vrouwen t.o.v. mannen (door het stimuleren van telomerase [enzyme dat de chromosoom-uiteinden herstelt] in specifieke doelwit-cellen of via het verminderen van de belasting van oxidatieve stress te wijten aan een effekt van oestrogeen op reaktieve zuurstof-soorten (ROS). Er werd gerapporteerd over lage oestrogeen-waarden geassocieerd met korte telomeren bij vrouwen. CVS heeft een hogere prevalentie bij vrouwen en gynecologische factoren zoals vroege menopauze en hysterectomie bleken geassocieerd met CVS [Boneva RS, Lin JM, Unger ER. Early menopause and other gynecologic risk indicators for Chronic Fatigue Syndrome in women. Menopause. (2015) 22: 826-34]. Deze bevindingen, tesamen met onze observatie van korte telomeren bij vrouwelijke individuen jonger dan 45 met CVS, CVS-X & ISF, suggereren de nood aan verdere studies aangaande de dynamiek van telomeer-lengte in relatie met leeftijd, geslachtshormonen, gynecologische voorgeschiedenis en de aanvang van CVS.

Er werd voor een brede waaier aan chronische ziekten gerapporteerd dat gestegen waarden qua inflammatoire merkers  – zoals CRP en cytokines zoals interferon-γ (IFN-γ), tumor necrose factor α (TNF- α), interleukine-1 & -6 (IL-1, IL-6) – geassocieerd zijn met ziekte-progressie, slechte levenskwaliteit en slechte therapeutische uitkomsten. Deze rapporten omvatten diabetes, chronische obstructieve pulmonaire ziekte, nier-falen, psychiatrische/neurologische aandoeningen, cardiovasculaire ziekte en andere chronische/auto-immune/infektueuze ziekten, inclusief M.E./CVS. Er werd ook vesnelde verkorting van telomeren gemeld bij van veel van deze chronische/auto-immune ziekten. In de meeste gevallen werden inflammatie en telomeer-verkorting afzonderlijk bestudeerd en een oorzakelijk verband tussen deze 2 processen die optreden in dezelfde cellen moet nog worden opgehelderd; hoewel werd voorgesteld dat zowel telomeer-verkorting als inflammatie kunnen betrokken bij een bidirectioneel oorzaak-gevolg relatie. Telomeer-slijtage kan werken als een sterke inducerende factor voor pro-inflammatoire cytokinen in verschillende cel-types tijdens het verouderen (een fenomeen genaamd senescentie-geassocieerde secretorische fenotypes, SASP [karakteristieke eigenschap van of senescente cellen; omvat inflammatoire cytokinen, groei-factoren & proteasen]) of chronische inflammatie kan telomeer/telomerase-dysfunktie veroorzaken op een directe manier via de aanmaak van ROS die resulteert in beschadigd telomeer-DNA. Beide mogelijkheden zouden de eerder gerapporteerde omgekeerde relatie van telomeer-lengte met oxidatieve stress en IL-6 (een component van SASP) kunnen verklaren bij individuen met depressie. Het is interessant op te merken dat senescentie-merkers zoals IL-6 en p16INK4a geassocieerd bleken met een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker-vermoeidheid syndroom na cytotoxische chemotherapie. Eliminatie van senescente cellen in een dier-model voor chemotherapie-geïnduceerde vermoeidheid herstelde de normale fysieke aktiviteit bijna volledig. Het feit dat de incidentie van ernstige vermoeidheid bij borst-kanker patiënten correleerde met de hoogste p16INK4a waarden suggereert dat een verhoogde totale belasting door senescente cellen vermoeidheid kan veroorzaken [vooral onderzocht bij kanker]. We vonden significante associatie van M.E./CVS met hogere CRP-waarden, en een marginaal verband van hogere CRP-waarden met kortere telomeren in onze studie. Een gelijkaardige omgekeerde maar sterkere associatie van CRP en telomeer-lengte werd gerapporteerd in verband met het risico op cardiovasculaire ziekte en obesitas. Het is aannemelijk dat pro-inflammatoire cytokinen de produktie van CRP zouden stimuleren, wat dan weer zou bijdragen tot telomeer-verkorting door oxidatieve stress. In combinatie met deze eerdere studies, suggereren onze observaties dat chronische inflammatie en/of oxidatieve stress kan bijdragen tot versnelde telomeer-verkorting of vice versa bij minstens een subgroep van individuen met M.E./CVS. Bovendien kunnen leeftijd-gerelateerde fundamentele en translationele studies beloftevolle paden aanwijzen om het risico te bepalen en therapeutische benaderingen te beoordelen die gebruikmaken van een nieuwe klasse senolytische medicijnen [eenvoudig gezegd: die ouderdom-ziekten vertragen, voorkomen, verlichten of omkeren] die zich richten op senescente cellen, om de symptomen van M.E./CVS te verlichten [dasatinib (middel tegen leukemie), quercetine, fisetine (natuurlijk flavonoïde), piperlongumine (stof uit een peper-plant met mogelijke anti-kanker eigenschappen), navitoclax (ABT263; anti-kanker geneesmiddel) en selektieve BCL-XL inhibitoren].

De mitochondriale funktie neemt ook af met de leeftijd, voornamelijk onder de vorm van verstoorde ATP-produktie en verhoogde aanmaak van ROS, welke beiden geassocieerd zijn met chronische ziekten. Hoewel details van de potentiële wisselwerking tussen telomeer-verkorting en mitochondriale dysfunktie onbekend zijn, bleken veel chronische ziekten zoals metabole, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten, diabetes, stemming- en andere psychologische aandoeningen met aangetoonde telomeer-verkorting ook geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en oxidatieve stress die DNA-schade kunnen veroorzaken. Metaboloom-bevindingen [Levine SM, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol BioSyst. (2017) 13: 371-9 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-80] suggereren dat M.E./CVS een hypometabool syndroom is dat verband kan houden met mitochondriale dysfunktie. Deze studies vonden ook dat de metabolomica van M.E./CVS geslacht-specifiek zijn [Fluge O, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Bijkomende studies die het verband onderzoeken tussen een geslacht-specifieke hypometabole toestand en telomeer-slijtage zouden kunnen helpen bij het begrijpen van de pathofysiologie van M.E./CVS.

Er zijn meerdere sterktes verbonden aan deze exploratieve studie aangaande de associatie van telomeer-lengte met CVS. Deze omvatten een relatief grote globale studie-groep (n = 639) bestaande uit deelnemers gegroepeerd in 4 ziekte-toestanden (CVS, CVS-X, ISF & NF), controle van ziekte-status en telomeer-lengte met een aantal demografische en biologische metingen, en validatie van de qPCR-methode wat betreft reproduceerbaarheid en overéénkomst met [een andere] methode. De studie heeft ook zwaktes, inclusief het ‘cross-sectioneel’ ontwerp en onvermogen de ziekte-duur & gebruikte medicatie te evalueren of controleren. De qPCR-methode levert slechts globale gemiddelde telemeer-lengte op en herkent de individuele korte telomeren niet of biedt geen info over de mate van pathologisch kritieke korte telomeren. In deze zin is de diagnostische bruikbaarheid van de bepaling van de telomeer-lengte d.m.v. qPCR beperkt maar het is vergelijkbaar met andere methodes wat betreft accuraatheid voor associatie-studies van telomeer-lengte met ziekten. Een verdere beperking van onze bepaling is dat we DNA uit vol-bloed (dat lymfocyten, monocyten en granulocyten bevat) gebruikten. Zodoende vertegenwoordigt de hier vastgestelde telomeer-lengte enkel de gemiddelde telomeer-lengte van de verschillende bloedcel-types i.p.v. bloedcel-type specifieke of de telomeer-lengte verdeling van verschillende chromosomen in een bepaald cel-type.

Besluit

Deze studie toont een significant verband van M.E./CVS met vroegtijdige telomeer-slijtage, grotendeels bepaald door vrouwelijke individuen van minder dan 45 jaar oud. Onze resultaten dienen onafhankelijk te worden gerepliceerd bij een grote groep en met methodes die een verbeterde diagnostische waarde qua kunnen bijdragen aan de meting van telomeer-lengte. Deze observatie van kortere telomeren tesamen met meldingen van laag- of hoog-gradige inflammatie gemedieerd door pro-inflammatoire cytokinen en metabool verval/mitochondriale dysfunktie biedt op meerdere vlakken ondersteuning om M.E./CVS op te nemen in de lijst van aandoeningen geassocieerd met versnelde veroudering die getriggerd zou kunnen worden door genetische, epigenetische, infektueuze, stress of andere omgeving-factoren. Er is verder werk nodig om de funktionele betekenis te evalueren, en de specifieke bijdrage van genetische, epigenetische en omgeving-factoren aan versnelde ouder-worden bij M.E./CVS.

maart 22, 2017

Epigenetische modificaties & glucocorticoïden sensitiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:58 pm
Tags: , , , , , ,

Lees, ter introductie, o.a. nog es ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’…

Epigenetica betreft de chemische wijzigingen die voorkomen op het DNA van onze genen – dikwijls het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide) – die veranderen hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA).

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS(de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757). Nu werden hier 12.608 verschillen op het DNA (“differentieel gemethyleerde sites”) gevonden bij M.E.(cvs)-patiënten in vergelijking met gezonde mensen; een groot biologisch verschil. Deze verschillen op het DNA beïnvloeden ook de werking van immuniteit-cellen. Er werd meer hyper-methylatie gevonden bij de M.E.(cvs)-patiënten (71,6% t.o.v. 28,4% hypo-methylatie) vergeleken met controles. 1.600 differentieel gemethyleerde genen waren gelinkt met lichamelijke stoornissen (RAND-36 score) bij M.E.(cvs). Vele van deze genen zijn betrokken bij cellulaire energie-produktie, metabolisme en immuun-signalisering.

Er werd ook bekeken of deze verschillen een invloed hadden op de immuun-funktie. Daartoe werden cellen uit het bloed onderworpen aan een specifieke test waarbij de immuuncellen worden geaktiveerd (simulatie van een immuun-respons) en deze respons dan wordt gestopt met een synthetische vorm van cortisol. Bij een subgroep M.E.(cvs)-patiënten waren de cellen hyper-sensitief voor cortisol (de hoeveelheid nodig om gezonde immuuncellen te ‘kalmeren’ veroorzaakte bij M.E.(cvs) dat deze cellen werden uitgezet. Er waren differentieel gemethyleerde genen geassocieerd met deze hyper-sensitiviteit voor cortisol.

Eens te meer wordt hier aangegeven dat M.E.(cvs) een biologische oorzaak heeft… De auteurs: “Deze bevindingen komen overéén met ander werk die aangeven dat de energie-produktie verstoord is in de cellen van mensen met M.E.(cvs).”.

 

————————-

BMC Med Genomics. 23 (2017) 10: 11

Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

de Vega WC1,2, Herrera S1,3, Vernon SD4,5, McGowan PO6,7,8,9

1Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

3Department of Biological Sciences, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA

4Solve ME/CFS Initiative, Los Angeles, CA, USA

5Present affiliation: The Bateman Horne Centre of Excellence, Salt Lake City, UT, USA

6Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, M1C 1A4, Canada

7Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

8Department of Psychology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

9Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

Samenvatting

Achtergrond: Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende idiopathische ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verdwijnt door voldoende rust. De diagnose is gebaseerd op een lijst symptomen en uitsluiting van andere vermoeidheid-gerelateerde gezondheid-aandoeningen. Ondanks de heterogene patiënten-populatie komen verschillen qua immuniteit en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, zoals versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden, steeds terug in M.E./CVS-studies. Het is geweten dat epigenetische modificaties, zoals CpG-methylatie [DNA-methylatie komt voornamelijk voor op de cytosines van CpG dinucleotide sites], lange-termijn fenotypische verschillen reguleren en eerder werk door ons groep toonde DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] verschillen bij M.E./CVS; het verband tussen DNA-methyloom modificaties, klinische en funktionele karakteristieken geassocieerd met M.E./CVS werd echter niet onderzocht.

Methodes: We onderzochten het DNA-methyloom in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van een grotere groep vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (‘Illumina Human Methylation 450 BeadChip Array’ [‘chip’ waarmee > 485.000 methylatie-sites per staal kunnen worden geanalyseerd]). Parallel met de analyse van het DNA-methyloom, bekeken we de glucocorticoïden-gevoeligheid ‘in vitro’ door het stimuleren van PBMCs met fyto-haemagglutinine [PHA] en onderdrukten de groei met dexamethason [synthetisch glucocorticoid]. We gingen DNA-methylatie verschillen na d.m.v. bisulfiet-pyrosequentie-bepaling [‘pyrosequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling] en statistische permutatie. Er werd lineaire regressie [statistische analyse] toegepast om epigenomische gebieden geassocieerd met zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit te ontdekken, en netwerk-analyse van gen-ontologische termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] om de resultaten in een biologische context te plaatsen.

Resultaten: We detekteerden 12.608 verschillende gemethyleerde plaatsen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voornamelijk gelokaliseerd in genen m.b.t. het cellulair metabolisme; enkele daarvan waren ook gerelateerd met scores van zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit. Bij de M.E./CVS-patiënten was glucocorticoid-sensitiviteit geassocieerd met differentiële methylatie op 13 loci. [locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt]

Besluiten: Onze resultaten geven aan dat DNA-methylatie modificaties in het cellulair metabolisme bij M.E./CVS – ondanks een heterogene patiënten-populatie – deze processen in immune en HPA-as dysfunktie bij M.E./CVS impliceren. Modificaties op epigenetische loci geassocieerd met verschillen qua glucocorticoid-gevoeligheid kunnen belangrijk zijn als biomerkers. Globaal genomen komen deze bevindingen overéén met werk dat wijst op stoornissen bij de cellulaire energie-produktie in deze patiënten-populatie.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een idiopathische ziekte gekenmerkt door ernstige en invaliderende vermoeidheid, cognitieve stoornissen, niet-verfrissende slaap, autonome verschijnselen en post-exertionele malaise. Andere ziekten of gezondheid-aandoeningen die de persistente aanwezigheid van vermoeidheid kunnen verklaren, zoals majeure depressie, anorexie en boulimie, worden uitgesloten voor het stellen van de diagnose M.E./CVS. De heterogeniteit wat betreft de klinische kenmerken van M.E./CVS is een obstakel bij het bepalen van de biologische oorzaak.

Veel studies die de pathofysiologie van M.E./CVS onderzochten, hebben wijzigingen in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as gerapporteerd. De HPA-as is een belangrijke component van het neuro-endocrien systeem dat homeostatische processen, het circadiaans ritme en stress-responsen reguleert via een hormonen-cascade die leidt tot de afgifte van glucocorticoïden (GCs). GCs interageren met de GC-receptor (GR) om de stress-respons en inflammatie te reguleren. M.E./CVS-patiënten vertonen een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback responsen op GCs, wat een belangrijke rol van de HPA-as bij deze ziekte suggereert.

Naast de veranderde werking van de HPA-as, werden ook wijzigingen qua immuun-fenotype alom gedocumenteerd bij M.E./CVS. Hoewel de specifieke patronen van de verschillen nog niet zijn opgelost, bleek M.E./CVS geassocieerd met abnormale cytokine-profielen, lymfocyten-proporties en verstoorde immuun-funktie (in het bijzonder verminderde cytotoxiciteit). Verhoogde inflammatie in het darm-microbioom bleek ook geassocieerd met M.E./CVS. Dit omvat gedaalde diversiteit van het darm-microbioom, verschuivingen naar pro-inflammatoire bakteriële soorten en een proliferatie van merkers voor pro-inflammatoire processen in het serum [Giloteaux L, Goodrich JK, Walters WA, Levine SM, Ley RE, Hanson MR. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30].

Epigenetische modificaties, inclusief de methylatie van DNA op CpG-dinucleotiden, kan lange-termijn fenotypische veranderingen beïnvloeden in respons op externe stimuli. DNA-methylatie modificaties in genen betrokken bij de HPA-as en het immuunsysteem bleken sterk gelinkt met omgeving-stress. We documenteerden eerder DNA-methyloom abnormaliteiten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van ‘sudden-onset’ M.E./CVS-patiënten (gevalideerd via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling) [de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757]; deze abnormaliteiten waren significant geconcentreerd in genen gelinkt met immuun-regulering. Er bleven belangrijke vragen over het feit of deze epigenetische modificaties een impact hadden op de werking van immuun-cellen en hun relatie met klinische kenmerken van M.E./CVS.

In de huidige studie brachten we loci in kaart die epigenetische gemodificeerd waren in PBMCs en onderzochten hun gevoeligheid voor glucocorticoïden. Onze doelstellingen waren te bepalen hoe epigenetische patronen in verband staan met HPA-as signalisering in immuun-cellen bij M.E./CVS-patiënten, en de identificatie van neuro-immune mechanismen die waren beïnvloed bij M.E./CVS.

Methodes

Criteria voor selektie van deelnemers

[…] De diagnose M.E./CVS werd gesteld op basis van de Fukuda en Canadese criteria. […] Vragenlijsten over symptomen, medicatie en medische geschiedenis, en de RAND-36 voor zelf-rapportering over gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit. [36 items ter beoordeling van 8 gezondheid-concepten: lichamelijk funktioneren, beperkingen veroorzaakt door fysieke gezondheid problemen, beperkingen veroorzaakt door emotionele problemen, sociaal funktioneren, emotioneel welzijn, energie/vermoeidheid, pijn & algemene gezondheid percepties] […] We selekteerden vrouwen voor deze studie. […] 49 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles voldeden aan de volgende criteria: 1) negatief voor HIV, AIDS en/of hepatitis-C, en 2) blanke non-obese vrouwen (BMI < 30) die geen immunomodulerende en/of epigenetisch aktieve medicatie gebruikten. […]

Isolatie en bewaring van PBMCs

[…]

DNA Extractie en zuivering van genomisch DNA

[…]

DNA-methyloom chips

[…]

Normalisatie en statistische analyses va, DNA-methyloom gegevens

[…]

DNA-methylatie validering via by bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

[…]

Dexamethason-suppressie test en verband met DNA-methylatie verschillen

[…]

Associatie tussen klinische gegevens en DNA-methylatie

[…]

Resultaten

RAND-36 scores significant lager bij M.E./CVS-patiënten

Globaal hadden de M.E./CVS-patiënten een lagere gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit dan de gezonde controles (significant lager voor 7 van 8 RAND-36 categorieën (alle p-waarden ≤ 0.05). Er waren geen verschillen qua gemiddelde leeftijd of BMI. […] Verdere analyse toonde een duidelijke scheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles […].

DNA-methyloom verschillen bij M.E./CVS

We vonden – na correctie voor leeftijd, BMI en verschillen qua in cel-proporties – 12.608 significant verschillend gemethyleerde loci in onze groep. 5.544 daarvan waren toegekend aan een gekend proteïne-coderend gen (UCSC Genome Browser). […] In termen van de richting van de methylatie-verschillen bij de M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, waren 71,6% van de differentieel gemethyleerde sites hyper-gemethyleerd en 28,4% hypo-gemethyleerd. […] Hoewel er geen significante verschillen waren qua proportie hypo-/hyper-gemethyleerde sites volgens genetische lokatie, waren er significante verschillen wat betreft deze proporties wanneer de afstand van een CpG-eiland in acht werd genomen. De hoeveelheid hyper-methylatie daalde naar gelang de afstand tot een CpG-eiland vergrootte. […]

Glucocorticoïden-gevoeligheid in PBMCs bij bij M.E./CVS-subgroepen

Globaal genomen was er een significant gemiddelde toename qua glucocorticoïden-sensitiviteit in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (p ≤ 0.05). Een visuele inspectie van de gegevens onthulde een bimodale verdeling van de glucocorticoïden-gevoeligheid binnen de M.E./CVS-groep: een GC-hypersensitieve groep (die een verhoogde respons op glucocorticoid-behandeling vertoonde t.o.v. de gemiddelde controle) en een GC-typische groep (die een respons vertoonde gelijkaardig met de gezonde controles). De verschillen qua GC-sensitiviteit waren niet geassocieerd met het type M.E./CVS-aanvang of de RAND-36 (scores voor de ganse vragenlijst of bepaalde categorieën; p > 0.10).

DNA-methylatie verschillen in dexamethason-test subgroepen via pyrosequentie-bepaling en permutatie-testen

Om het verband te bepalen tussen verschillen qua DNA-methylatie en glucocorticoïden-gevoeligheid, pasten we dezelfde statistische criteria toe die werden gebruikt om methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te identificeren toe op 3 verschillende vergelijkingen: 1) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch; 2) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles; en 3) M.E./CVS GC-typisch vs. controles. We vonden dat er geen methylatie-verschillen voldeden aan deze statistische criteria. Een groot aantal loci vertoonden echter significant nominale p-waarden ≤ 0.05 [De ‘significantie’ is een nominale p-waarde die de researcher selekteert als ‘cut-off’ punt voor het interpreteren of iets statistisch significant ka worden beschouwd of niet.]. Als alternatieve methodes voor statistische analyse van de 3 glucocorticoïden-gevoeligheid vergelijkingen, evalueerden we de verschillen die werden gevonden met de ‘450K array’ via 2 doelgerichte statistische methodes.

Wat betreft de pyrosequentie-bepaling analyse was onze strategie het selekteren van 3 loci die nominaal significante verschillen vertoonden tussen M.E./CVS GC-hypersensitief en M.E./CVS GC-typisch: 2 loci in JRK [gen coderend voor een proteïne lijkend op DNA-bindende proteïnen] & 1 locus in SLC6A4 [codeert voor de serotonine-transporter]. Deze sites werden gekozen om de betrouwbaarheid te onderzoeken van de ‘450K array’ om significante verschillen te detekteren zowel boven als onder de 5% cut-off die we implementeerden bij het zoeken naar significant differentieel gemethyleerde plaatsen bij M.E./CVS, en om DNA-methylatie verschillen te valideren die zowel potentieel gerelateerd zijn met GC-sensitiviteit verschillen, alsook uniek voor M.E./CVS. De JRK-sites weden geselekteerd voor de volgende redenen: ze waren bij de top sites in termen van verschil-grootte > 5% methylatie-verschil op de ‘450K array’ […] en ze lagen ook dicht bijéén in het genoom (5 bp uit elkaar), wat ons toeliet af te leiden hoe de DNA-methylatie status wordt gereflekteerd binnen hetzelfde gen-gebied. […] Na pyrosequentie-bepaling werden de JRK-sites significant verklaard (p ≤ 0.05) of ‘trending’ (p ≤ 0.10) naargelang de resultaten. Het < 5% nominaal significant verschil gevonden op de ‘450K array’ gegevens voor SLC6A4 was hier echter niet significant; wat er op wijst dat methylatie-verschillen < 5% op de ‘450K array’ niet op een betrouwbare manier werden gedetekteerd voor deze vergelijkingen.

Wat betreft de permutatie-analyse [een type statistische significantie-test] onderzochten we de mate van overlapping tussen de sites met een > 5% gemiddeld methylatie-verschil die nominaal significant waren op de ‘450K array’ […] en de sites die significant verschillende werden verklaard bij 10.000 permutaties. We vonden dat een meerderheid van de nominaal significanten ook significant waren volgens de permutatie-test: 76,8% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch, 84,5% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles, en 99,6% bij de vergelijking M.E./CVS GC-typisch vs. controles; wat er op wijst dat de meerderheid van de methylatie-verschillen die nominaal significant waren met > 5% gemiddeld methylatie-verschil waarschijnlijk differentiële methylatie reflekteerden.

Gezien deze resultaten implementeerden we de 5% verschil cut-off voor de verschillende dexamethason-test subgroep-vergelijkingen, en onderzochten sites die significant bleken […]. Om potentiële epigenomische loci geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit te bepalen, onderzochten we de overlap qua nominaal significante loci voor de 3 vergelijkingen. Er waren 5 sites die differentieel gemethyleerd waren bij de 3 vergelijkingen; één die correspondeerde met een coderend gen: NPAS3 [transcriptie-factorNeuronal PAS domain protein 3’], een gen betrokken bij neurogenese. We vonden 13 loci die differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles én M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch. Deze loci […] zijn waarschijnlijk geassocieerd met glucocorticoïden-gevoeligheid. De top 3 sites met de grootste verschillen bij vergelijking van M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch correspondeerden met GSTM1 [Glutathion S-transferase Mu 1] (14,3% verhoogde methylatie), MYO3B [myosine IIIB] (13,7% stijging) en GSTM5 [Glutathion S-transferase Mu 5] (12,0% stijging). Naast deze glucocorticoïden-sensitieve sites vonden we 4.699 loci die waarschijnlijk geassocieerd zijn met M.E./CVS, aangezien ze differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles en de M.E./CVS GC-typisch vs. controles vergelijkingen. GO-analyse van deze sites onthulde een aanrijking van differentiële methylatie bij M.E./CVS geassocieerd met regulerende processen, inclusief neuronale cel ontwikkeling, signaal-transductie, metabole regulering en transcriptie-regulering. Er waren 203 significant differentieel gemethyleerde sites die uniek waren voor M.E./CVS GC-typische individuen maar er waren echter geen GO-termen significant geassocieerd met deze sites.

Verbanden tussen differentieel gemethyleerde gebieden en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

Om het verband te onderzoeken tussen DNA-methylatie en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit […] onderzochten we gen-gebieden om potentiële epigenomische plaatsen te bepalen die een significante relatie vertonen met levenskwaliteit-scores. Na lineaire regressie analysis vonden we meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden met een > 5% methylatie-verschil (M.E./CVS en controles) die een significant verband vertoonden met de globale RAND-36 score. De top 5 differentieel gemethyleerde gebieden correspondeerden met TSS-methylatie [TSS = ‘transcription start site’; plaats waar de transcriptie start] in GRAMD1A [GRAM Domain Containing 1A’], ATP6V0E2 [ATPase H+ Transporting V0 Subunit E2’] & LOC144571 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne], en gen-‘body’ methylatie [in het gen zelf] in LOC401431 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne] & IL6R [IL-6 receptor].

Bespreking

In deze studie detekteerden we 12.608 differentieel gemethyleerde sites in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, sommige daarvan waren significant geassocieerd met scores van zelf-gerapporteerde levenskwaliteit. 71,6% van deze sites vertoonden hyper-methylatie bij M.E./CVS en de hyper-methylatie bleek te delen naar gelang de afstand van een CpG-eiland steeg; dit suggereert dat epigenetische ontregeling bij M.E./CVS significant varieert afhankelijk van de relatieve plaats t.o.v. CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. Binnen de groep M.E./CVS-patiënten zagen we 2 subgroepen op basis van de in vitro [‘in een proefbuis’] sensitiviteit voor blootstelling aan glucocorticoïden. Het verschil qua glucocorticoïden-gevoeligheid was geassocieerd met differentiële methylatie op 13 sites (op basis van vergelijkingen van differentiële methylatie bij M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. M.E./CVS GC-typisch en M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. gezonde controles).

DNA-methylatie modificaties in cellulaire processen/metabolisme-mechanismen bij M.E./CVS

Genen geassocieerd met cellulaire en metabole regulering waren belangrijke mechanismen met differentiële epigenetische profielen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Deze bevindingen zijn consistent met een eerder rapport van onze groep bij M.E./CVS-patiënten waarbij de ziekte plots startte [zie link/ref. in onze inleiding] en met andere rapporten over genomische, transcriptomische en metabolomische verschillen bij M.E./CVS [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U, Rajeevan MS. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-86 /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T, Rajeevan MS, Vernon SD, Horvath S. Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol. (2008) 2: 95 /// Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405 /// Naviaux RK, Naviaux JC, Li K, Bright AT, Alaynick WA, Wang L, Gordon E. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences (2016) 113: E5472-E5480], die een rol aangeven voor DNA-methylatie modificaties bij de metabole stress die wordt vastgesteld bij deze ziekte. Oxidatieve en nitrosatieve stress werden gedocumenteerd in immuuncellen van M.E./CVS-patiënten, en een daling van metabolieten van de elektronen-transport-keten suggereert een rol in de M.E./CVS-pathologie voor processen die de mitochondriale werking beïnvloeden. Er is een gekend verband tussen oxidatieve stress en epigenetische modificaties. DNA-beschadigingen zijn dikwijls het resultaat van oxidatieve stress, en deze beïnvloeden op hun beurt de epigenetische regulering, wat leidt tot afwijkende DNA-methylatie en gen-expressie patronen. Het is mogelijk dat oxidatieve stress, zoals in onze studie aangegeven door de verschillen gevonden in genen betrokken bij cellulaire en metabole regulering (inclusief ARL4C & HOXA11), sommige van de epigenetische veranderingen bij M.E./CVS kunnen aansturen. Er is echter bijkomend werk – zoals het karakteriseren van het effekt van ARL4C [‘ADP-Ribosylation Factor Like Protein 4C’] & HOXA11 [transcriptie-factor ‘Homeobox protein Hox-A11’] op DNA-methylatie patronen – vereist om dit verband te onderzoeken.

Genen geassocieerd met neuronale cel ontwikkeling bleken ook een belangrijke klasse genen met differentiële methylatie bij M.E./CVS-patiënten. Ten minste 2 eerdere studies die gen-expressie patronen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten onderzochten, rapporteerden ook significante verschillen voor genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling en regulerende processen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9]. Het is ook bekend dat genen die geassocieerd zijn met psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen rijke expressie-profielen vertonen in PBMCs [Vernon SD, Nicholson A, Rajeevan M, Dimulescu I, Cameron B, Whistler T, Lloyd A. Correlation of psycho-neuroendocrine-immune (PNI) gene expression with symptoms of acute infectious mononucleosis. Brain Res. (2006) 1068: 1-6]. DNA-methylatie verschillen op neuronale genen in PBMCs kunnen sommige centrale verschillen in psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen bij M.E./CVS weerspiegelen, zoals wordt gesuggereerd door de resultaten van onze glucocorticoïden-sensitiviteit test, die overéénkomen met werk dat perifeer bloed en immuuncellen identificeert als geschikte kandidaten die differentiële DNA-methylatie in het brein weerspiegelen.

Dexamethason-respons subgroepen bij bij M.E./CVS

We stelden een gemiddelde toename qua glucocorticoïden-gevoeligheid vast bij M.E./CVS-patiënten, die niet kon worden verklaard op basis van het type M.E./CVS-aanvang of levenskwaliteit. Daarnaast onthulde een meer gedetailleerd onderzoek van onze resultaten 2 subgroepen bij de M.E./CVS-patiënten. Er werd een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden geobserveerd in meerdere studies van de GC-responsen bij M.E./CVS. De aanwezigheid van een GC-typische en GC-hypersensitieve subgroep binnen onze M.E./CVS-groep komt dus overéén met de geobserveerde heterogeniteit van HPA-gerelateerde verschillen in deze eerdere rapporten.

Glucocorticoïden staan bekend om hun anti-inflammatoire effekten en worden typisch gebruikt om immuun-responsen te onderdrukken. Een ongepaste respons op behandeling met glucocorticoïden is echter geassocieerd met verhoogde vatbaarheid voor metabole en hart-ziekten. Onze resultaten op basis van PHA, een T-cel mitogen [molekule die een cel aanzet tot delen], als immuun-stressor gaven een funktionele stoornis qua T-cel GR-gevoeligheid bij GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten aan. Bijkomend bewijsmateriaal suggereert dat T-cellen kandidaten zijn voor een primaire immuuncel-populatie bij M.E./CVS-pathologie. Bv.: een GWAS [‘genome-wide association study’] vond significante verschillen qua polymorfismen geassocieerd met T-cel receptoren bij M.E./CVS-patiënten [Schlauch KA, Khaiboullina SF, Rawat S, Petereit J, Rizvanov AA, Blatt N, Mijatovic T, Kulick D, Palotas A et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry. (2016) 6: e730]. Daarnaast werden DNA-methylatie verschillen gerapporteerd in CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brenu EW, Staines DR, Marshall-Gradisbik SM. Methylation profile of CD4+ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228], een cel-populatie die een verhoogde dexamethason-sensitiviteit lijkt te vertonen bij M.E./CVS [Visser J, Blauw B, Hinloopen B, Brommer E, de Kloet ER, Kluft C, Nagelkerken L. CD4 T-lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4].

We vonden 13 sites geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit bij in GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten in vergelijking met zowel GC-typische M.E./CVS-patiënten als gezonde controles. Naar ons weten zijn er geen andere EWAS [‘epigenome-wide association study’] of GWAS studies die specifiek de epigenetische of genetische verschillen onderzochten in de context van GC-sensitiviteit. Genomische studies bij M.E./CVS hebben echter polymorfismen in GC-signalisering genen bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd. Interessant: deze genen lijken niet te overlappen met andere aandoeningen die worden gekenmerkt door verstoorde GC-signalisering [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Daarnaast was FKBP5 [gen met een rol bij post-traumatische stress, depressie en angst], een gen dat differentieel gemethyleerd bleek bij het syndroom van Cushing [hormonale aandoening gekenmerkt door een verhoogd gehalte aan cortisol in het bloed], niét bij de genen die in onze studie werden geïdentificeerd. De potentiële link tussen M.E./CVS en epigenetische modificatie van deze genen zou dus echter met voorzichtigheid moeten worden bekeken. Niettemin suggereren de resultaten dat epigenetische verschillen op deze sites nuttige informatie kunnen bieden betreffende geassocieerde GC-sensitiviteit bij sommige M.E./CVS-patiënten.

6 van de 13 sites waren onderdeel van coderende genen, 4 daarvan met rollen in het cellulair metabolisme. ‘Patatin Like Phospholipase Domain Containing 4’ (PNPLA4) is een fosfolipase dat een rol speelt bij het lipiden-metabolisme en sterk tot expressie komt in metabool aktief weefsel. PNPLA4 maakt ook deel uit van de PNPLA-familie, die aktiveert na interaktie met glucocorticoïden. D-aspartaat-oxidase (DDO) is een enzyme dat D-aspartaat en N-methyl-D-aspartaat, overvloedig aanwezig in neuro-endocrien weefsel, deaminiseert. Gen ‘knock-out’ studies over DDO in muizen hebben onthuld dat dit enzyme belangrijk is bij de produktie van melanocortinen [groep of peptide-hormonen] en betrokken is bij de regulering van basale corticosteron-waarden. Fosfodiesterase-1C (PDE1C) is verantwoordelijk voor de hydrolyse van cyclische nucleotiden, wat belangrijk is voor fysiologische regulering, calcium-signalisering mechanismen en circadiaans ritme. Stiudies met cel-culturen hebben getoond dat inhibitie van PDE1C […] resulteert in geïnhibeerde cel-proliferatie en dat PDE1C geaktiveerd wordt na behandeling met dexamethason.

De top 3 sites, op basis van grootte-verschillen tussen on GC-hypersensitieve en GC-typische (M.E./CVS & controle) individuen, correspondeerden met GSTM1, MYO3B & GSTM5 [zie eerder], die alle een > 10% toename van de methylatie vertoonden. GSTM1 & GSTM5 maken deel uit van de mu-klasse van de GST genen-familie, waarvan de primaire rol detoxificatie is van milieu- en exogene toxinen, specifiek polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Genetische polymorfismen in GSTM zijn gekende voorspellers van de potentiële respons op glucocorticoïden bij acute lymfoblastische leukemie, wat er op wijst dat GSTM een significante rol zou kunnen spelen bij glucocorticoïden-signalisering in immuuncellen. MYO3B is een ATPase dat geaktiveerd wordt door actine [onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en betrokken is bij kinase-aktiviteit. MYO3B en z’n meerdere interakties worden echter nog niet goed begrepen vergeleken met andere myosine-genen [van belang bij spier-samentrekking], zo dat het onduidelijk is hoe verschillen in MYO3B verband kunnen houden met glucocorticoïden-signalisering.

De 13 differentie gemethyleerde sites zouden als biomerkers voor of glucocorticoïden-hypersensitiviteit beschouwd kunnen worden maar er is echter nog bijkomend werk vereist om de funktionele impact van hyper-methylatie op deze genen en het verband met glucocorticoïden-signalisering te begrijpen en te bevestigen. Gen ‘knock-out’ en RNA ‘knock-down’ studies kunnen helpen bij het bepalen van de precieze impact die deze genen op glucocorticoïden-signalisering hebben. Het meten van mRNA-transcripten, methylatie-verschillen en proteïne-waarden van deze genen bij baseline, PHA-gestimuleerd en DEX-onderdrukt in vitro en in vivo, kunnen tot een beter begrip van de dynamiek die aan de basis ligt van GC-sensitiviteit verschillen bij M.E./CVS leiden.

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met levenskwaliteit-scores

We vonden meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden die significant geassocieerd waren met de globale RAND-36 score, waarbij variatie in methylatie in deze gebieden significant was geassocieerd met variatie in de globale RAND-36 score. De scores van deze vragenlijst kunnen wijzen in de richting van veranderingen in biologische systemen. Van de top 5 differentieel gemethyleerde gebieden [zie ‘resultaten’] vermelden we de volgende. ATP6V0E2 is een isoform van de H+-ATPase V0 e subunit (belangrijk is voor cellulaire energie [ATPases pompen protonen (H+) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types]), LOC401431 codeert de het anti-sense RNA voor ATP6V0E2 (suggererend dat de regulering-dynamiek van dit gen beïnvloed zou kunnen zijn bij M.E./CVS), IL6R codeert voor de IL-6 receptor (een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]) en LOC144571 is het anti-sense RNA [inaktiveert het mRNA] voor alfa-2-macroglobuline (een protease-inhibitor en cytokine-transporter). De lage ‘Physical Health’ scores bij de M.E./CVS-patiënten suggereren dat de lichamelijke stoornissen bij M.E./CVS geassocieerd zijn met een epigenetisch onevenwicht qua cellulaire energie, metabolisme en immuun-signalisering.

Besluiten

We rapporteren hier DNA-methylatie verschillen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, waarvan sommige significant geassocieerd waren met de globale levenskwaliteit alsook met glucocorticoïden-hypersensitiviteit in een subgroep M.E./CVS-patiënten. We bepaalden epigenetische loci geassocieerd met verschillen in glucocorticoïden-sensitiviteit die de onderliggende M.E./CVS-pathologie van sommige patiënten kan weerspiegelen. Er is bijkomend werk vereist om de mogelijke mechanistische verbanden tussen DNA-methylatie in deze genen, gen-expressie en proteïne-profielen, en M.E./CVS-fenotype te bevestigen. Er zijn longitudinale studies (zowel in vivo als in vitro) nodig om de stabiliteit te bepalen van deze epigenetische modificaties, inclusief veranderingen qua symptoom-profielen en in respons op behandeling met glucocorticoïden. Bv.: cytokines zoals IL-10 & IFN-gamma, die differentieel gemethyleerd bleken in onze studie, staan bekend om hun interaktie met GR en vertonen expressie-verschillen in vitro na dexamethason-behandeling [Visser J, Graffelman W, Blauw B, Haspels I, Lentjes E, de Kloet ER, Nagelkerken L. LPS-induced IL-10 production in whole blood cultures from Chronic Fatigue Syndrome patients is increased but supersensitive to inhibition by dexamethasone. J Neuroimmunol. (2001) 119: 343-9]. Hoewel GR-densiteit en binding-affiniteit in PBMCs van M.E./CVS niet lijken te verschillen qua ‘steady-state’ [evenwicht-toestand] condities, staat GR bekend om z’n upregulering tijdens inspanning bij M.E./CVS [Meyer JD, Light AR, Shukla SK, Clevidence D, Yale S, Stegner AJ, Cook DB. Post-exertion malaise in Chronic Fatigue Syndrome: symptoms and gene expression. Fatigue (2013) 1: 190-204]. Toekomstig werk zou DNA-methylatie signaturen moeten onderzoeken tijdens inspanning bij M.E./CVS om de dynamiek van glucocorticoïden-signalisering beter te kunnen begrijpen. Niettemin kunnen de differentieel gemethyleerde sites die in deze studie werden geïdentificeerd op z’n minst belangrijk zijn als biomerkers voor toekomstige klinische testen om te bepalen of epigenetische wijzigingen in deze genen verband houden met ziekte-aanvang of -progressie.

De resultaten van deze studie onderlijnen het potentieel nut van immuuncel-subtypering binnen de M.E./CVS-populatie en geven aan dat epigenetische gegevens kunnen helpen bij het ophelderen van relevante biologische mechanismen die bij M.E./CVS beïnvloed zijn. Klinisch onderzoek naar de regulering van het cellulair metabolisme is nodig om deze mogelijkheid te beoordelen, aangezien we vonden dat genen zoals GSTM1, MYO3B, GSTM5 & ATP6V0E2 significante epigenetische modificaties vertoonden bij M.E./CVS. Een beter begrip van M.E./CVS-subtypes zal patiënten en artsen helpen de geschikte interventies te bepalen om symptomen te behandelen en de gezondheid te verbeteren.

februari 1, 2017

Overzicht van het verband tussen vermoeidheid & genetische polymorfismen

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:28 pm
Tags: , , , , , ,

Bij de database-search door de auteurs van onderstaand overzicht van studies aangaande het verband tussen ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en vermoeidheid ontbreken een deel van de artikels die we op deze pagina’s (enter ‘SNP’ in ons zoek-venster) al meegaven (wellicht omdat ze na 2015 verschenen)… Er zullen naar o.i. nog SNPs opduiken die verband houden met vermoeidheid.

In dit overzicht vond men dat funktionele genetische variaties in mechanismen van neurotransmitter-regulering, HPA-as funktie en immuun-gemedieerde inflammatie een rol spelen bij het ontstaan van ‘CVS’. Het lijkt ons echter belangrijk te onderstrepen dat het onwaarschijnlijk is dat één enkel genetisch defekt verantwoordelijk is, maar dat daarentegen wellicht een interaktie tussen fouten in meerdere mechanismen aanleiding zullen geven of voorbestemmen tot de aandoening.

Naast de problemen die genetisch vastliggen, zullen omgevingsfactoren (epigenetica) ook een rol spelen. Een enkelvoudige/éénduidige factor voor het ontstaan van M.E.(cvs) lijkt ons te simpel. Lees daaromtrent ook: Landmark-Hoyvik H et al. The genetics and epigenetics of fatigue. PM & R: the journal of injury, function and rehabilitation (2010) 2: 456-465.

————————-

Brain, Behavior & Immunity (pre-print januari 2017)

A systematic review of the association between fatigue and genetic polymorphisms

Tengteng Wang (a,b), Jie Yin (b,c), Andrew H. Miller (d), Canhua Xiao (e)

a Department of Epidemiology, University of North Carolina at Chapel Hill Gillings School of Global Public Health, Chapel Hill, NC

b Department of Epidemiology, Emory University Rollins School of Public Health, Atlanta, GA

c Kaiser Permanente Northern California, Division of Research, Oakland, CA

d Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA

e School of Nursing, Emory University, Atlanta, GA

Samenvatting

Vermoeidheid is één van de meest courante en kwellende symptomen, leidend tot aanzienlijk afgenomen kwaliteit van het leven bij een grote groep patiënten met verscheidene aandoeningen. Vatbaarheid voor vermoeidheid kan beïnvloed zijn door genetische factoren zoals ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs), bijzonderlijk in de regulerende gebieden van relevante genen. Om verder het verband van SNPs met vermoeidheid in meerdere patiënten-populaties te onderzoeken, werd een systematische search in Pubmed, CINAHL, PsycINFO & de ‘Sociological Abstracts Database’ uitgevoerd op basis van met vermoeidheid gelinkte termen in combinatie met termen gerelateerd met polymorfismen of genetische variatie. Er voldeden in het totaal 50 artikels aan de inclusie- en exclusie-criteria voor deze analyse. Deze 50 werden verder geklassificeerd in 3 subgroepen: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), kanker-gerelateerde vermoeidheid (CRF) en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid. SNPs in regulerende mechanismen van immuun- en neurotransmitter-systemen bleken belangrijke rollen te spelen in de etiologieën van of CVS, CRF en met ander ziekten gerelateerde vermoeidheid. Er werd bewijsmateriaal onthuld voor associaties tussen verhoogde vermoeidheid en specifieke polymorfismen in de TNF-alfa, IL1b, IL4 en IL6 genen voor alle 3 de subgroepen. We vonden ook dat een reeks polymorfismen in de HLA, IFN-gamma, 5-HT & NR3C1 genen bij CVS & met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid; deze SNPs (met uitzondering van IFN-gamma) bleken echter niet adequaat onderzocht bij CRF. Hiaten in de kennis omtrent vermoeidheid-etiologie en aanbevelingen voor toekomstig onderzoek worden besproken.

1. Inleiding

Vermoeidheid is een courant symptoom dat moeheid, zwakte, gebrek aan energie en het onvermogen zich te concentreren omvat. Bij studies die de symptoom-prevalentie onderzoeken wordt vermoeidheid consistent in de top 3 gerapporteerd door patiënten met verscheidene ziekten. Vermoeidheid-symptomen kunnen een nadelig effekt hebben op sociale relaties, mentale gezondheid en dagelijkse aktiviteiten; en een uitgesproken daling qua globale kwaliteit van het leven veroorzaken bij ziekte en na behandeling. Ten behoeve van het verder begrijpen van de etiologie en pathofysiologie van vermoeidheid, kunnen vermoeidheid-symptomen worden gecategoriseerd in 3 belangrijke subgroepen: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), kanker-gerelateerde vermoeidheid (CRF) en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid.

[criteria]

Studies suggereren dat CVS, CRF en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid complexe aandoeningen zijn met een multi-factoriële etiologie waarbij meerdere mechanismen betrokken zijn. Hoewel CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid kwalitatief en kwantitatief van elkaar kunnen verschillen, kunnen ze ook biologische mechanismen voor aanvang en verslechtering of delen. Eerdere studies hebben getoond dat bij alle 3 het perifeer zenuwstelsel én het zenuwstelsel betrokken is. Daarnaast bestaat er een langdurige interesse naar de rol van het immuunsysteem bij de pathogenese en pathofysiologie van CVS en CRF, in het bijzonder de rol van inflammatoire cytokinen. Genetische componenten, zoals ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in immuun- en neurotransmitter-gerelateerde genen, werden dus onderzocht. SNPs zijn variaties van één basepaar in de DNA-struktuur die worden gevonden bij 1% of meer van de bevolking (het meest courante type genetische variatie). Ze worden gemeten via gentypering-technieken op DNA uit perifeer bloed. SNPs die worden gevonden in regulerende gebieden van genen (funktionele SNPs), inclusief promoters, intronen en onvertaalde gebieden, kunnen in veel gevallen de expressie van de gerelateerde gen-produkten, inclusief proteïnen, beïnvloeden, waardoor de mechanismen betrokken bij de vatbaarheid voor vermoeidheid mogelijks worden beïnvloed.

Polymorfismen specifiek voor de 3 subgroepen van vermoeidheid zijn niet goed bekend en geen enkele studie heeft SNPs geïdentificeerd die gemeenschappelijk zijn voor deze subgroepen. Een systematisch overzicht van de beschikbare literatuur zou kunnen helpen bij het verduidelijken van gedeelde etiologieën via het onderzoeken van potentiële gemeenschappelijke verbanden tussen genetische polymorfismen en de verschillende vermoeidheid-subtypes. Bovendien zou deze informatie kunnen bijdragen tot een beter klinisch management van vermoeidheid-symptomen via het vermijden van een onderschatting qua prevalentie en onder-behandeling door klinici.

2. Methodes

Er werd een literatuur-‘search’ uitgevoerd in Pubmed [‘US National Library of Medicine, National Institutes of Health’], CINAHL [‘Cumulative Index to Nursing and Allied Health Literature’], PsycINFO [‘American Psychological Association’] & de ‘Sociological Abstracts Database’, op basis van de volgende sleutelwoorden: vermoeidheid EN (‘single nucleotide’ polymorfismen OF genetische variatie). Om de specifieke bezorgdheden met betrekking tot kanker-gerelateerde vermoeidheid te adresseren, werden andere sleutelwoorden toegevoegd: (kanker OF gezwellen OF tumor OF oncologie) EN (gen OF ‘single nucleotide’ polymorfismen OF genetische variatie). […] Evaluatie gebeurde door 2 ‘reviewers’ en de artikels werden voor meer uitgebreide ‘review’ geselekteerd a.h.v. de volgende inclusie en exclusie-criteria:

Inclusie-criteria: 1) duidelijke focus op Chronische Vermoeidheid Syndroom, kanker-gerelateerde vermoeidheid en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid; en 2) gegevens bevatten aangaande eender welk polymorfisme. Studies die individuen categoriseerden las vermoeid of niet (‘case-control’) en studies die vermoeidheid onderzochten als een continue variabele werden opgenomen.

Exclusie-criteria: 1) algemene overzichten, systematische ‘reviews’ en meta-analyse, editorialen, gevallen-studies en studies niet bij mensen uitgevoerd; 2) studies die niet focusten op de 3 types vermoeidheid; of 3) studies zonder gegevens over gen-polymorfismen.

[selektie-procedure]

De ‘Newcastle-Ottawa Scale’ (NOS) werd gebruikt ter beoordeling van de kwaliteit van niet-gerandomiseerde studies. De NOS bekijkt de kwaliteit in 3 domeinen: selektie van de studie-groepen, vergelijkbaarheid van de studie-groepen verzekering van de uitkomsten. […] Maximum totale score = 15 punten. […]

3. Resultaten

Er waren 50 artikels die voldeden aan onze inclusie- en exclusie-criteria, en deze werden gecategoriseerd in 3 subgroepen: CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Voor elke subgroep geven we een overzicht van onze bevindingen, de gerelateerde mechanismen en voorspelde effekten (indien mogelijk).

3.1. Chronische Vermoeidheid Syndroom

3.1.1 Overzicht

Er werden 16 artikels over CVS (gepubliceerd tussen 2003 & 2015) opgenomen in deze systematische ‘review’ (op basis van onze inclusie- en exclusie-criteria). Het aantal gevallen in deze studies varieerde van 35 tot 171. In 2 artikels werd het aantal controles niet gespecificeerd. Al deze studies gebruikten de 1994 Fukuda criteria [niet de striktere Canadese Consensus Criteria dus…] als definitie voor CVS. […] De gemiddelde kwaliteit-score was 7,5 (van 2 tot 13). De meest courante redenen voor lagere scores waren het niet vermelden van de methodes voor genotypering-blindering en onvoldoende beschrijving van verstorende factoren.

3.1.2 Mechanismen

Hoewel de pathofysiologische mechanismen voor CVS niet duidelijk zijn geïdentificeerd, leverden 12 van de 16 studies bewijsmateriaal ter ondersteuning van gen-gerelateerde mechanismen voor CVS. Deze mechanismen omvatten voornamelijk neurotransmitter-ontregeling (5 studies) (Fukuda et al. 2013; Narita et al. 2003; Smith et al. 2008; Smith et al. 2011; Sommerfeldt et al. 2011), hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as regulering (2 studies) (Lee et al. 2009; Rajeevan et al. 2007), inflammatoire/immunomodulerende responsen (4 studies) (Carlo-Stella et al. 2006; Carlo-Stella et al. 2009; Rajeevan et al. 2015; Smith et al. 2005) en andere mechanismen met betrekking tot metabolisme en uithouding (1 studie) (Vladutiu & Natelson 2004) [volledige referenties: zie verder]

3.1.2.1 Neurotransmitter-systeem – Het meest courante neurotransmitter-systeem gerelateerd met CVS was het serotonerg systeem. Een aantal polymorfismen in serotonine-transporters, receptoren en enzymen werden gelinkt met CVS. In een gevallen-controle studie [Narita M et al. Association between serotonin transporter gene polymorphism and Chronic Fatigue Syndrome. Biochemical and Biophysical Research Communications (2003) 311: 264-266] werd een polymorfisme in het ‘5’ upstream’ [vóór de initiatie-plaats van transcriptie] gebied van het serotonine-transporter gen (5-HTTLPR) geïdentificeerd bij CVS-patiënten maar niet bij controles. Daarnaast bleken 3 merkers gelegen in het 5-HT receptor subtype HTR2A geassocieerd met CVS [Smith AK et al. Genetic evaluation of the serotonergic system in Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology (2008) 33: 188-197]. Bijkomend bleken polymorfismen in de mono-amine synthetiserende enzymen, tyrosine-hydroxylase (TH) – dat dopamine [neurotransmitter] synthetiseert – en GTP-cyclohydrolase-I (GCH) – dat betrokken is bij het synthese-mechanisme van alle mono-amines [Mono-aminerge systemen – netwerken van neuronen mono-amine neurotransmitters gebruiken – zijn betrokken bij de regulering van cognitieve processen en bepaalde types geheugen.] – geassocieerd met de pathofysiologie van CVS [Fukuda S. et al. Association of monoamine-synthesizing genes with the depression tendency and personality in Chronic Fatigue Syndrome patients. Life Sciences (2013) 92: 183-186]. Er werd gevonden dat 2 polymorfismen in het adrenerg signalisering-mechanisme – inclusief de β2-adrenerge receptor en catechol-O-methyl transferase (COMT) dat noradrenaline kataboliseert – significant meer aanwezig bij CVS-patiënten […] [Sommerfeldt L et al. Polymorphisms of adrenergic cardiovascular control genes are associated with adolescent Chronic Fatigue Syndrome. Acta Paediatrica Norway (2011) 100: 293-298]. Tenslotte werden 2 genen betrokken bij andere neurotransmissie-systemen gevonden die geassocieerd zijn met CVS [Smith AK et al. Convergent genomic studies identify association of GRIK2 and NPAS2 with Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (2011) 64: 183-194], suggestief voor mogelijke rollen voor genen betrokken bij glutamaterge neurotransmissie en het circadiaans ritme.

3.1.2.2 Hypothalamus-Hypofyse-Bijnier as – NR3C1, een glucocorticoïd receptor [zie o.a. ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB] gen met een invloed op het reguleren van de werking van de HPA-as en glucocorticoïden (cortisol) concentraties in het bloed trok aandacht bij de exploratie van het pathologische mechanisme voor CVS. Er werden ondersteunende resultaten geobserveerd in een gevallen-controle studie [Rajeevan MS et al. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes, Brain and Behavior (2007) 6, 167-176]: 4 merkers van NR3C1 bleken significant geassocieerd met CVS. Verder werd in een studie (gebruikmakend van een geïntegreerde benadering om het verband te zoeken tussen genotype-variatie en ziekte) getoond dat NR3C1 SNPs sterk geassocieerd waren met CVS [Lee E et al. An integrated approach to infer causal associations among gene expression, genotype variation and disease. Genomics (2009) 94: 269-277].

3.1.2.3 Inflammatie & Immuun-respons – Immune ontregeling en inflammatoire reakties kunnen ook bijdragen tot CVS. Een studie die focuste op humaan leucocyten antigen (HLA) klasse-II allelen vond een significante associatie tussen HLA-DQA1*01 en CVS [Smith J et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. Journal of Clinical Pathology (2005) 58: 860-863]. Een andere studie [Carlo-Stella N et al. Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. International journal of Immunopathology and Pharmacology (2009) 22: 745-754] vond dat de combinatie van RAGE-374A [RAGE = receptor die ‘advanced glycation endproducts’ (AGEs; “beschadigde proteïnen of lipiden”) bindt], HLA-DRB1*1104 [HLA = humaan leukocyten antigen; histocompatibiliteit-antigen], RAGE-374A en HLA-DRB1*1301 geassocieerd was met CVS, terwijl bij afzonderlijke expressie deze varianten niet geassocieerd waren met de ziekte. Er werd gevonden dat DRB1*1104 een beschermende factor is bij enkele expressie. Daarnaast vond men dat het cytokine SNP TNF-308 sterk geassocieerd was met CVS [Carlo-Stella N et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma 874 rare alleles. Clinical and Experimental Rheumatology (2006) 24: 179-182]. Dit verband werd verder ondersteund door een andere studie die associaties tussen 32 inflammatie- en immuun-gerelateerde SNPs en CVS aantoonde [Rajeevan MS et al. Pathway focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome. Human Immunology (2015) 76: 553-560].

3.1.2.4 Andere mechanismen – In een gevallen-controle studie die de genetica van het spier-metabolisme en fysieke uithouding onderzocht, werd gevonden dat M647V [plaats van het SNP] op het DCP1 [mRNA-‘decapping’ enzyme; reguleert translatie & mRNA-verval] gen geassocieerd was met CVS bij veteranen van de eerste Golf Oorlog [Vladutiu GD & Natelson BH. Association of medically unexplained fatigue with ACE insertion/deletion polymorphism in Gulf War veterans. Muscle & Nerve (2004) 30, 38-43].

3.1.3 Voorspeld effekt

Terwijl de meeste studies tot doel hadden de associatie te onderzoeken tussen SNPs en CVS, exploreerden meerdere studies de voorspellende effekten van SNPs voor CVS. Eén studie [Goertzel BN et al. Combinations of single nucleotide polymorphisms in neuroendocrine effector and receptor genes predict Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2006) 7: 475-483] vond dat 28 SNPs gebruikt kunnen worden ter voorspelling van CVS met een accuraatheid van 76%. De meerderheid van de relevante SNPs waren gelegen in gebieden van TPH2, COMT of NR3C1. Een andere studie [Cifuentes RA & Barreto E. Supervised selection of single nucleotide polymorphisms in Chronic Fatigue Syndrome. Biomedica : Revista del Instituto Nacional de Salud (2011) 31: 613-621] vond ook een profiel van 13 SNPs ter voorspelling van CVS met een accuraatheid van 72,8%. De meerderheid van de polymorfismen geassocieerd met CVS traden op in 5-HTT en NR3C1. Bovendien vond een eerdere studie [Lin E & Hsu SY. A Bayesian approach to gene-gene and gene-environment interactions in Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2009) 10: 35-42] dat een gen-gen effekt waatbij NR3C1 is betrokken, en een gen-omgeving effekt van NR3C1 en geslacht belangrijke rollen kunnen spelen bij CVS. Om de klinische diagnostische betekenis te onderzoeken observeerden Shimosako N & Kerr JR [Use of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) to distinguish gene expression subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME). Journal of Clinical Pathology (2014) 67: 1078-1083] zagen dat 21 van 504 SNPs significant geassocieerd waren met CVS/ Myalgische Encefalomyelitis. De meeste waren gelegen in het ‘bone morphogenic protein-2-inducible protein kinase’ (BMP2K [coderend voor een kinase-enzyme]) gen, dat een belangrijke rol speelt bij skelet-ontwikkeling en patroon-vorming, en in het IL6ST gen [interleukine-6 signaal-transducer] (alias Glycoproteïne-130), dat codeert voor een trans-membraan proteïne als deel van type-I cytokine-receptor in de IL-6 receptor familie (dat de correcte ligand-binding en proteïnen-opvouwing verzekert).

3.2. Kanker-gerelateerde vermoeidheid

[…]

3.3. Met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid

[…]

4. Bespreking

Het doel van deze systematische ‘review’ was om verband-patronen te bekijken tussen genetische polymorfismen en vermoeidheid (CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid), zowel individueel als collectief. We vonden dat funktionele genetische variaties (100% van de onderzochte SNPs in de associatie-studies waren funktioneel) in mechanismen van neurotransmitter-regulering, HPA-as funktie en immuun-gemedieerde inflammatie belangrijke rollen lijken te spelen in de etiologieën van CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Deze ‘review’ biedt empirische ondersteuning voor de associatie tussen funktionele polymorfismen in TNF-α, IL1b, IL4 & IL6 genen en verhoogde vermoeidheid voor alle 3 subgroepen van vermoeidheid. We vonden ook dat CVS een reeks polymorfismen in HLA, IFN-γ, 5-HT & NR3C1 genen deelt met andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid; deze SNPs (uitgezonderd IFN-γ) werden echter niet adequaat onderzocht bij CRF.

De bekeken studies tonen dat selekte neurotransmitter & HPA-as gerelateerde genen belangrijke rollen kunnen spelen bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Specifiek: polymorfismen in 5-HT, NR3C1, POMC, MAOA, MAOB, TPH2, COMT, GRIK2 & NPAS2 bleken allemaal geassocieerd vermoeidheid. 5-HT, een mono-amine neurotransmitter die de stemming, eetlust en slaap reguleert, werkt via interakties met 5-HT receptoren, en vermoeidheid en stemming-aandoeningen zouden gereguleerd kunnen worden via het wijzigen van de expressie van deze receptoren. De glucocorticoïd receptor NR3C1 medieert feedback binnen de HPA-as en beïnvloedt de concentratie van het glucocorticoïd cortisol, dat een impact heeft op het metabolisme, het immuunsysteem en de hersenen, alsook stress-gerelateerd gedrag. Aangezien zowel lage en hoge waarden circulerend cortisol verband houden met CVS, kunnen HPA-as gerelateerde genen CVS beïnvloeden [Cleare AJ. The HPA axis and the genesis of chronic fatigue syndrome. Trends Endocrinol. Metab. (2004) 15: 55-59]. Zoals in onze ‘review’ besproken, was er een waaier aan neurotransmitter en HPA-as gerelateerde genen, (inclusief POMC, MAOA, MAOB & THP2) geassocieerd met CVS en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Omwille van het feit dat deze polymorfismen niet ten volle werden onderzocht bij CRF, is het moeilijk te weten in welke mate specifieke neurotransmitters betrokken zijn. Toekomstige studies zijn vereist om het verband tussen neurotransmitter en HPA-as gerelateerde genen en CRF op te helderen.

De in de ‘review’ bekeken artikels onthullen dat de ontwikkeling van vermoeidheid wordt beïnvloed door immuun-ontregeling, waarbij specifieke funktionele SNPs en genotypes van TNFα, IL1b, IL4 & IL-6 bijdragen tot de verergering of het bestendigen van vermoeidheid. Cytokine gen-polymorfismen kunnen cytokine-produktie significant beïnvloeden. Deze bevindingen zijn consistent met eerdere studies die verbanden tussen cytokine-concentraties in het perifeer bloed en het voorkomen en de ernst van vermoeidheid hebben aangetoond. Een kwantitatieve ‘review’ suggereerde een positieve correlatie tussen vermoeidheid en circulerende concentraties van inflammatoire merkers. Belangrijker: genetische polymorfismen in deze mechanismen zouden een voorbestemdheid van de gastheer voor vermoeidheid kunnen aangeven [zie Carlo-Stella N et al. (2006) hierboven]. Bij de onderzochte cytokine SNPs was het GG-genotype van TNFα-308 het enige polymorfisme dat significant geassocieerd is met alle 3 de subgroepen van vermoeidheid. TNFα is een pro-inflammatoir cytokine betrokken bij de regulering van een brede waaier aan biologische processen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat een variatie in het TNF-α gen geassocieerd kan zijn met verschillen qua symptoom-frequentie en vermoeidheid-ernst. Deze hypothese was gebaseerd op bevindingen van klinische en experimentele studies bij mensen en dieren die suggereren dat tumor en/of ziekte-behandelingen verhoogde in vivo concentraties van TNF-α kunnen triggeren, die verder vermoeidheid via cytokine-regulering van de werking van het CZS beïnvloeden. Preliminair bewijsmateriaal suggereert ook dat de SNPs […] in IL-6 geassocieerd zijn met CRF tijdens en na behandeling. Belangrijk: deze SNPs werden niet bestudeerd bij CVS en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Er zijn ook studies die suggereren dat bepaalde SNPs in IL1b, IL1RN, IL4 geassocieerd zijn met HIV en vermoeidheid-symptomen na beroerte. Daarnaast werd getoond dat HLA-DR genen/gen-produkten een immuun-regulerende rol spelen bij resistentie tegen of vatbaarheid voor andere infektueuze agentia. Relevant in dit opzicht: HLA-DR polymorfismen werden gelinkt met andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid (zoals chronische Q-koorts).

Naast de hierboven besproken neurotransmitter-, HPA-as en immuun-mechanismen, omvatten de genen gelinkt met andere mechanismen geassocieerd met CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid: HFE C282Y, DCP1, ACE, APOE, OATP1C1, AHSG & POLDIP3. Meerdere studies suggereren dat het polymorfisme HFE C282Y geassocieerd zou kunnen zijn met vermoeidheid bij patiënten met Hereditaire Hemochromatose (HH). Hereditaire Hemochromatose is een erfelijke ziekte, die bekend staat als ijzer-overbelasting, gekenmerkt door ontregelde ijzer-absorptie. Het is geweten dat de mutatie van C282Y in het HFE gen zeer frequent voorkomt bij patiënten met HH en één van de meest courante klinische manifestaties bij HH is vermoeidheid. Er dient echter nog meer werk te worden gedaan om de associatie tussen HFE C282Y en vermoeidheid te bevestigen.

4.1 Beperkingen en richtingen voor de toekomst

We zijn beperkt wat betreft het trekken van sterke conclusies uit het hierboven besproken werk omwille van beperkingen bij de individuele studies en algemene hiaten in de kennis omtrent vermoeidheid.

Het eerste voorbehoud dat dient te worden besproken is dat de grootte van de groepen voor alle in deze ‘review’ opgenomen studies relatief klein was. Van de 50 artikels in ‘t totaal, waren er slechts 7 (14%) met een groep groter dan 500. Er zijn bijkomende studies met grotere groepen nodig om meer statistische ‘power’ te verkrijgen, in het bijzonder gezien het feit dat individuele SNPs waarschijnlijk slechts zwak geassocieerd zijn met het risico. Met grotere groepen kunnen ook meer subgroep- (stratificatie) analyses worden uitgevoerd om vermoeidheid en verschillen met gezonden (op basis van leeftijd, ras, geslacht, enz.) verder te onderzoeken.

Het tweede voorbehoud bij het besproken werk is dat bij veel van de studies een accurate definitie ontbreekt, in het bijzonder voor CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Bv.: van de 50 beschreven studies, waren er slechts 20 die vermoeidheid conceptueel definieerden. Het zou kunnen dat ongerijmdheden tussen studies, wat betreft beschreven associaties tussen vermoeidheid en genetische polymorfismen, gelinkt zijn met alternatieve definities van vermoeidheid, alsook verschillende vereiste duur van de symptomen. Bovendien: anders dan voor CVS, ontbreken voor kanker- en andere ziekten gerelateerde vermoeidheid duidelijke definities van vermoeidheid met betrekking tot duur en ernst. Daarnaast kunnen we – omwille van het feit dat de meeste studies betreffende CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid geen controle-groep (d.w.z.. zonder de diagnose van kanker of een andere ziekte) omvatten, niet bepalen of het verband tussen deze polymorfismen en vermoeidheid specifiek was voor de ziekte-diagnose en/of -behandeling. Vermoeidheid kan ook toepasbaar zij op individuen in de algemene bevolking die symptomen ervaren ten gevolge bv. stressvolle omstandigheden. Ten slotte: omwille van verschillen qua studie-ontwerpen (bv. gevallen-controle of niet), zouden de resultaten van deze ‘review’ met voorzichtigheid dienen te worden geïnterpreteerd. Bv.: studies gebruikmakend van gevallen-controle ontwerpen die deelnemers als vermoeid of niet categoriseren, zouden vooringenomen effekten van een SNP-vermoeidheid verband (ziekte-mis-klassificatie vooroordeel) kunnen genereren, vergeleken met studies die vermoeidheid-ernst als een continue variabele als primaire uitkomst gebruiken.

Het derde voorbehoud is dat slechts 28% van de studies een longitudinaal ontwerp gebruikten om de associaties tussen genetische variaties en vermoeidheid te onderzoeken. Er zijn meer longitudinale studies nodig om de rollen van ziekte-progressie en behandeling te beoordelen bij vermoeidheid bij grepen patiënten. Het is mogelijk dat andere genetische verbanden met vermoeidheid zullen opduiken als dezelfde analyses worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen van de ziekte of behandeling van een patient, aangezien klassificatie van ziekte-ernst met verloop van tijd kan veranderen.

Ten vierde: de meeste van deze studies gebruikten een kandidaat-gen benadering (alle genen en SNPs werden geselekteerd op basis van bestaande empirische literatuur en waren dus hypothese-gedreven) en daarom is het mogelijk dat sommige invloedrijke polymorfismen niet werden geïdentificeerd. Het valt op te merken dat er geen genoom-brede studies warden gevonden; dus bestaat er redelijke kans op vooringenomen bevindingen op basis van deze 50 artikels. Bijkomend: er werd geen uniform statistisch model gebruikt bij de geciteerde studies om SNPs-vermoeidheid associaties te beoordelen en dus werd ons oorspronkelijk plan voor een meta-analyse verhinderd. Bovendien was het gebruik van statistische methodes, om multipele vergelijkingen te maken, beperkt.

Ten slotte: ondanks alle hierboven vermelde bezorgdheden had onze ‘review’ 3 bijkomende beperkingen. Ten eerste: het zou kunnen dat we studies hebben gemist die nog aan de gang zijn en nog niet gepubliceerd. Ten tweede: hoewel we zochten in 4 openbare databases, zouden relevante studies gevonden kunnen geweest zijn gebruikmakend van andere databases of verschillende sleutelwoorden. Ten derde: we konden geen statistische analyse uitvoeren, aangezien er geen uniform genetisch statistisch model was gebruikt voor de studies, en er geen informatie die de verdeling van elke genotype of allel aflijnt die ons zou toelaten de SNPs-vermoeidheid associatie te bepalen/berekenen.

4.2 Sterktes

Selektie-vooringenomenheid is een frequente bezorgdheid bij observatie-studies wanneer deelname van de individuen gezamelijk afhangt van blootstelling en ziekte-status. De beoordeling van polymorfisme-prevalentie is echter niet onderhevig aan selektie-vooringenomenheid bij de veronderstelling dat genotype de participatie van individuen niet beïnvloedt […]. Dit is een sterkte van deze studies. Daarnaast verzamelden meer dan de helft van deze studies informatie betreffende belangrijke co-variabelen, waardoor niet-gemeten verstorende factoren werden verminderd.

5. Besluit

We vonden meerdere mogelijks belangrijke verbanden van SNPs gerelateerd met neurotransmitter-systemen, de HPA-as en immuun-gemedieerde inflammatie met vermoeidheid, inclusief CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Ons overzicht suggereert een belangrijke rol voor cytokine SNPs in alle 3 de subgroepen van vermoeidheid. Daarnaast ondersteunt de ‘review’ het voortgezet gebruik van genetische en epigenetische perspectieven bij het beoordelen van de rol die neurotransmitters spelen bij persistente vermoeidheid bij kanker-overlevers. We bedenken dat de nieuwe kennis verkregen uit deze studies patiënten met CVS, kanker-overlevers en mensen met andere ziekten, en hun behandelaars en verzorgenden, kunnen helpen via de identificatie van specifieke genen met risico op vermoeidheid, […].

mei 27, 2016

NK-cellen & SNPs in ion-kanalen en receptor-genen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:19 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel is een integratie van resultaten betreffende TRP (‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’) en AChR (‘SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS’) gevonden in vol-bloed bij M.E.(cvs)-patiënten en het verder onderzoeken van deze bevindingen bij geïsoleerde NK-cellen. De lezer wordt aangeraden vooraf missschien ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ (en ev. andere artikels betreffende NK-cellen alhier ook nog eens na te lezen…

In essentie rapporteert men hier over abnormale genen coderend voor ion-kanalen & receptoren in (geïsoleerde) ‘natural killer’ cellen. Men legt uit, op basis hiervan, waarom NK-cellen (onderdeel van het immuunsysteem) bij M.E.(cvs) niet goed funktioneren. Deze genen worden ook niet enkel gevonden in NK-cellen en met stelt dat de anomalieën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor andere de andere symptomen van de ziekte.

Het research-team van het ‘National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases’ (NCNED) – waartoe deze onderzoekers behoren – blijken op termijn ook een screening-test op de markt te willen brengen op basis van “nieuwe merkers geïdentificeerd op witte bloedcellen”. Het is niet helemaal duidelijk of de hieronder beschreven SNPs daar ook onder vallen maar naar aanleiding van het persbericht daarover sprak Prof. Staines echter over “zeer specifieke delen van genen die coderen voor bepaalde receptoren of proteïnen die belangrijke rollen spelen bij het metabolisme, neuronale en cardiovasculaire funktie, enz.”. Wellicht zal het een combinatie zijn met de door deze onderzoeksgroep eerder gerapporteerde en gepatenteerde miRNAs…

————————-

Application of Clinical Genetics Vol. 9, pp 39-47 (2016)

Natural killer cells and single nucleotide polymorphisms of specific ion channels and receptor genes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Teilah Huth (1,2), Anu Chacko (1,2), Samantha Johnston (1,2), Pete Smith (2), Donald Staines (2)

1School of Medical Science, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases [NCNED], Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Samenvatting

Doelstelling Het doel van dit artikel is om de cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) cellen te bepalen, en te kijken of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en genotypes in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen en acetylcholine-receptoren (AChRs) aanwezig waren in geïsoleerde NK-cellen van patiënten die eerder de diagnose Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kregen.

Individuen en methodes Er werd een totaal van 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar oud) en 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar oud) in deze studie opgenomen. Patiënten kregen de diagnose op basis van de CDC criteria. Er werd flow-cytometrie aangewend om de NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Er werd een totaal van 678 SNPs in geïsoleerde NK-cellen onderzocht (voor 21 zoogdier TRP ion-kanaal genen en 9 zoogdier AChR genen […]). SNP-associatie en genotype werd bepaald […].

Resultaten M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua percentage lysis van doelwit-cellen door NK (17% ± 4,68%) t.o.v. de niet-vermoeide controle-groep (31% ± 6,78%). Van de 678 onderzochte SNPs, werden 11 SNPs voor TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) geïdentificeerd in de M.E./CVS-groep. 5 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3, terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8, TRPC2 & TRPC4 (P < 0.05). 14 SNPs bleken geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen: 6 met CHRNA3, de rest met CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5 & CHRNE (P < 0.05). Er werden 16 genotypes geïdentificeerd met SNPs in TRP ion-kanalen en AChRs voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1) (P < 0.05).

Besluit We identificeerden een aantal SNPs en genotypes voor TRP ion-kanalen en AChRs bij geïsoleerde NK-cellen bij patiënten met M.E./CVS, wat suggereert dat deze SNPs en genotypes betrokken kunnen zijn bij veranderingen qua NK-cel funktie en de ontwikkeling van M.E./CVS-pathologie. Deze anomalieën suggereren een rol voor de ontregeling van Ca2+ in AChR en TRP ion-kanaal signalisering in het pathomechanisme van M.E./CVS.

Inleiding

‘Natural killer’ (NK) cellen zijn granulaire [gekorrelde] lymfocyten die worden gevonden in het perifeer bloed, het beenmerg, de milt en in lymfeknopen. In het perifeer bloed beslaan NK-cellen 15% van de lymfocyten en ze kunnen worden gegroepeerd in 4 subtypes volgens de expressie op het cel-oppervlak en de densiteit van CD56 (neurale cel-adhesie molekule) en CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG). Deze fenotypes omvatten CD56brightCD16-/dim, CD56dimCD16bright, CD56dimCD16 & CD56CD16bright. Ongeveer 90% van de NK-cellen in het perifeer bloed zijn CD56dimCD16bright en de CD56bright beslaan ca. 10%. NK-cel cytotoxische aktiviteit vereist een aantal gereguleerde processen om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] van de doelwit-cel te verzekeren.

Hoewel er weinig is geweten over Ca2+-signalisering in NK-cellen, werd er gezien dat het granule-afhankelijk pad voor apoptose calcium-afhankelijk is, terwijl het ‘death’-receptor mechanisme dat niet is. Bij apoptose bleken het transport van lytische proteïnen, exocytose [proces waarbij een vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan samensmelten en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte] en fusie duidelijk calcium-afhankelijk. Ca2+ is ook vereist voor de her-oriëntatie van microtubules [buisvormige proteïne-strukturen die deel uitmaken van het cel-skelet] en het actine-skelet [het proteïne actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], alsook de aktivatie van cytokinen gen-transcriptie. Bovendien hebben studies aangetoond dat er een verband bestaat tussen calcium-mobilisatie en het stopzetten van de degranulatie in PLCγ2-deficiënte NK-cellen [PLC = fosfolipase; PLC-gamma is een belangrijke regulator van intracellulair Ca2+].

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen komen tot expressie op bijna alle cellen en hebben een significant effekt op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, zoals kanker, skeletale abnormaliteiten, pijn-syndroom, enz. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd bij aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen, en hebben een belangrijke rol bij Ca2+-signalisering.

Acetylcholine (ACh) bindt op 2 membraan-proteïnen, namelijk de muscarine receptor (mAChR) en de nicotine receptor (nAChR), waarvan meerdere isoformen bestaan. ACh heeft niet-neuronale funkties, het non-neuronaal cholinerg system genaamd, in pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, ooglens-cellen en vasculair endothelium [= bedekkende cellen van bloedvaten] van het brein, dat gemedieerd wordt door Ca2+-signalisering. AChRs brengen aktivatie-signalen over in een waaier van menselijke weefsels, inclusief skelet- en gladde spieren, alle pre-ganglionische [van het CZS tot de ganglia (zenuw-knopen)] autonome zenuw-vezels, post-ganglionische [van de ganglia naar een orgaan] autonome parasympathische zenuwen, en op veel plaatsen over gans het centraal zenuwstelsel.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) heeft een ongekende etiologie en er is geen specifieke diagnostische test. De ziekte wordt grotendeels gekenmerkt door significante stoornissen van de lichamelijke aktiviteit en uitputtende vermoeidheid, en kan gepaard gaan met stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie, meer spier- en gewricht-pijn, hoofdpijn, pijnlijke keel en lymfeknopen. Het is verder geassocieerd met ontregeling van het gastro-intestinaal, cardiovasculair en immuunsysteem. Belangrijk: NK-cel dysfunktie, in het bijzonder verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit, is een courante bevinding bij M.E./CVS-patiënten. We hebben eerder ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in TRP ion-kanaal genen (TRPM3, TRPA1, TRPC4) en AChR genen (CHRM3, CHRNA10, CHRNA5 & CHRNA2) in perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten. [Marshall-Gradisnik SM, Smith P, Brenu EW, Nilius B, Ramos SB, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in transient receptor potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights. (2015) 7:1-6 /// Marshall-Gradisnik S, Smith P, Nilius B, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms in acetylcholine receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights (2015) 7: 7-20; zie links onze inleiding] Deze SNP-anomalieën in genen coderend voor TRP ion-kanalen en AChRs kunnen gewijzigde receptor-proteïnen opleveren, die mogelijks de strukturen van TRP ion-kanalen en AChR, en ook hun funkties kunnen veranderen.

Het doel van deze studie was de NK cytotoxische aktiviteit te bepalen, alsook of SNPs en hun genotypes aanwezig waren in TRP ion-kanaal en AChR genen in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten.

Individuen en methodes

[…]

Resultaten

Deelnemers

Er waren 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar) waarvan 71,79% vrouwen. Er waren 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar) waarvan 56,67% vrouwen. […] Er werden geen significante verschillen gevonden qua tellingen van witte bloedcellen tussen M.E./CVS-patiënten en de niet-vermoeide controle-groep. […]

NK-cel zuiverheid

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft NK zuiverheid-graad. De zuiverheid van de NK-cellen na isolatie en aanrijking was > 93%.

NK-cel cytotoxische aktiviteit

Er was een significant verschil voor NK cytotoxische aktiviteit tussen de groepen wat betreft de E:T [effector/target’] ratio van 25:1 [de optimale verhouding voor het bepalen van de cytotoxische aktiviteit]. M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua NK percentage lyse van doelwit-cellen (17% ± 4,68%) vergeleken met de controle-groep (31% ± 6,78%).

SNP-analyse

Van de 678 SNPs geïdentificerd in TRP ion-kanaal and AChR genen van geïsoleerde NK-cellen, waren er 11 SNPs in TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) die significant geassocieerd waren met de M.E./CVS-groep. Daarvan waren er 5 geassocieerd met TRPM3 […] terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8 […] & TRPC4 […].

Er waren 14 SNPs geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen, waarvan er 6 met CHRNA3 […] en de rest met CHRNA2 […], CHRNB4 […], CHRNA5 […] & CHRNE […].

Genotype-analyse

Er werden 16 genotypes met SNPs geïdentificeerd die significant bleken voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1). Van de als significant geïdentificeerde SNPs gingen we verder na of genotypes verschilden tussen de groepen. […] De ‘odds ratio’s [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] voor specifieke genotypes met SNPs in TRP & AChR genen in geïsoleerde NK-cellen varieerde tussen 3.13 & 11.39 voor M.E./CVS vergeleken met de niet-vermoeide controle-groep.

Bespreking

Verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit werd eerder al gerapporteerd bij M.E./CVS en de studie hier ondersteunt deze bevindingen. Het huidig onderzoek ondersteunt nieuwe bevindingen aangaande een aantal SNPs in genen coderend voor AChR en TRP varianten en genotypes van geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Een bijkomende nieuwe bevinding is de identificatie van SNPs in TRPM3 & TRPM8 bij geïsoleerde NK-cellen, suggererend dat er TRPM3 & TRPM8 receptoren gelokaliseerd zijn op NK-cellen.

We rapporteren een significante reductie van de NK-lyse bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de niet-vermoeide controles. De rol van TRP ion-kanalen bij Ca2+-signalisering, en aangeboren en adaptieve immuun-cellen wordt meer en meer gedocumenteerd. De TRPs bleken TRP kation-kanalen [TRPC worden geaktiveerd door fosfolipase-C, membraan enzymen die fosfolipiden splitsen] en TRP-melastatine [TRPM; melastatine is een vermeende tumor-suppressor] subfamilies, voornamelijk TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPM2, TRPM4 & TRPM7 tot expressie te brengen. Deze kanalen zijn niet-selektief en doorlaatbaar voor calcium. Ca2+ speelt een sleutelrol bij fusie van lytische granules in NK-cellen, alsook bij het verzekeren dat lytische granules zich naar de immuun-synaps [de interface tussen een antigeen-presenterende cel of doelwit-cel en een lymfocyt zoals een effector-T-cel of NK-cel] verplaatsen om perforine en granzymes af te geven om doelwit-cellen te doden. Rho GTPase Miro [Mitochondriaal Rho GTPase; een enzyme met een belangrijke rol bij mitochondriaal transport, betrokken bij mitochondriale homeostase en apoptose] biedt een link tussen de mitochondrieën en de microtubules, waar het de Ca2+-afhankelijke stopzetting van de mitochondriale motiliteit medieert. Aangezien Miro mitochondriale polarisatie [ontstaan/opbouw van een spanningsverschil over de mitochondriale membranen] modificeert, zou het ook transport van lytische granules naar de immuun-synaps kunnen veranderen, alsook de lytische funktie, te wijten aan de modulatie door de Ca2+-concentratie in het cytosol via TRP-melastatine en AChR genen. Het is duidelijk: mitochondrieën spelen een belangrijke rol bij de werking van NK-cellen. De ontdekking dat mitochondrieën een waaier aan AChR-subtypes tot expressie brengen, inclusief nicotine-α3, die differentieel tot expressie komen naar gelang het weefsel-type, suggereert dat nAChRs een impact kunnen hebben op de mitochondriale funktie en regulering van oxidante stress. Interessant: we rapporteerden eerder een significante daling van de ‘respiratory burst’ [of ‘oxidative burst’; snelle afgifte van reaktieve zuurstof molekulen; speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem] funktie van neutrofielen bij M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW, Staines DR et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8:1; zie link onze inleiding]

TRPM2 en TRPM3 mobiliseren Ca2+, waarbij de laatste de Ca2+-signalisering bleek te mediëren voor polarisatie van cytolytische granules en degranulatie. [Na de herkenning van doelwit-cellen door NK-cellen worden NK-cel receptoren geaktiveerd, wat helpt bij de vorming van een immuun-synaps, waarbij cytolytische granules die perforine en granzymes bevatten, in dezelfde richting worden geleid.] […] Interessant is ook dat gelijkaardige bevindingen voor NK-cel funkties werden gerapporteerd in de M.E./CVS-research [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One. (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012)10: 88 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81], wat mogelijks suggereert dat de genotype-wijzigingen die hier werden gerapporteerd voor TRPM3 ook een gelijkaardige rol kunnen spelen bij polarisatie en degranulatie van cytolytische granules.

Van de 678 SNPs die werden onderzocht, waren er 11 varianten van TRP ion-kanalen en 14 varianten van AChRs die significant geassocieerd waren met M.E./CVS vergeleken met niet-vermoeide controles. De variante TRP-SNPs waren gelegen in de gen-sequentie van 2 [kanonieke] TRP ion-kanalen (TRPC2 & TRPC4) en 2 melastatine TRP ion-kanalen (TRPM3 & TRPM8). We rapporteren ook variante SNPs in genen coderend voor 2 van de CHRM3receptoren, 2 CHRM1receptoren, 6 CHRNA3receptoren, 3 CHRNA2receptoren en 1 CHRNA5receptor, alsook 1 CHRNB4-receptor en 1 CHRNE-receptor.

Deze research hier rapporteert significante SNP associaties van genotypes van AChRs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Lymfocyten brachten muscarine en nicotine AChRs tot expressie, T- en B-cellen en monocyten brachten alle 5 de subtypes van mAChRs (M1-M5) tot expressie, terwijl nAChRs werden gevonden voor α2-α7, α9, α10, β2 & β10 subunits. Lymfocyten maken deel uit van een cholinerg systeem dat onafhankelijk is van cholinerge zenuwen, wat resulteert in de regulering van de immuun-funktie. AChR-agonisten bleken lymfocyten-cytotoxiciteit te versterken en hun intracellulair cyclisch guanosine-monofosfaat [cGMP; een cyclisch nucleotide met een belangrijke rol in verscheidene biochemische processen in de cel, een zgn. secundaire boodschapper voor intracellulaire signaal-overdracht] en inositol-1,4,5-trifosfaat [IP3; secundaire boodschapper bij signaal-overdracht en lipiden-signalisering] te verhogen, wat suggereert dat het lymfocyten cholinerg systeem betrokken is bij de regulering van de immuun-funktie via AChRs gekoppeld met fosfolipase-C via veranderingen in Ca2+. Er is onderzoek dat het belang heeft benadrukt van varianten bij het beïnvloeden van gen-transcripten door het veroorzaken van alternatieve ‘splicing’ [splicing = tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.], wat resulteert in anomalieën in het boodschapper-RNA en translatie-produkten. We identificeerden ook SNPs en een genotype in CHRNE bij M.E./CVS-patiënten. Het is interessant dat deze SNP gelegen is in het 3’ onvertaald gebied [‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie], waar een bindingplaats is voor regulerende proteïnen alsook voor microRNAs (miRNAs). Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript. Onze eerdere research vond significante verschillen qua NK cytotoxische aktiviteit, alsook qua miRNAs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269]

[Uitleg voor experten =>] Onderzoeken hebben gesuggereerd dat alternatieve ‘splicing’ in de coderende en ook niet-coderende sequenties significante onverwachte resultaten wat betreft het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. Het ‘splicen’ van genetische varianten gelegen in de exonen & intronen en de assemblage van het spliceosoom [complexe cellulaire ‘machine’ met een rol bij gen-expressie] dragen allemaal bij tot het ‘splicing’-mechanisme voor het correct coderen van een proteïne-sequentie. Bovendien zijn ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] en ‘silencers’ [transcriptie-regulerende factoren die zorgen voor verlaging of volledige onderdrukking van de vorming van RNA] gelegen in de exonen of intronen een integraal deel bij de herkenning van de correcte exon-sequentie. Belangrijk is dat intronen in staat zijn aktieve spliceosomen te genereren, wat aanleiding geeft tot alternatieve ‘splicing’. Gen 80036 (TRPM3) is geassocieerd met calcium-binnenkomst en calcium-opslag depletie via verschillende isoformen die geïdentificeerd werden via alternatieve ‘splicing’. Een gebied dat onontbeerlijk is voor kanaal-funktie [‘indispensable for channel function’; ICF] is een gebied van 18 aminozuren waarvan de afwezigheid zorgt dat de kanalen funktioneel niet in staat zijn om calcium-binnenkomst te mediëren, en dat bleek te ontbreken in een TRPM3 variant. Co-expressie van deze TRPM3 ICF varianten met funktionele TRPM3 ion-kanalen toonde daarenboven verstoorde calcium-mobilisatie. Aangezien TRPM3 ICF varianten overvloedige expressie vertonen in vele weefsels en cel-types, en 15% van alle TRPM3 isoformen uitmaken, kan de expressie op NK-cellen een mogelijke verklaring bieden voor gedaalde cytotoxische aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten. Bepaalde ‘splice’-varianten, zoals TRPM3α1, kunnen mogelijks begunstigd zijn, culminerend in een gedaalde NK-cel cytotoxische respons en hitte-detektie, inclusief ontregeling van thermoregulerende responsen, nociceptie en transmissie van pijn, zoals centrale en perifere pijn-perceptie. Bovendien bleek TRPM8 ook geaktiveerd bij koude en schadelijke stimuli, wat suggereert dat de hier gerapporteerde genotype-wijzigingen overéénkomen met de klinische presentatie van thermoregulerende responsen, nociceptie, en transmissie van centrale en perifere pijn bij M.E./CVS-patiënten.

Onze resultaten suggereren dat SNP-varianten en genotypes gerapporteerd in NK-cellen wellicht niet exclusief zijn voor dit type immuun-cel. AChRs en TRP ion-kanaal receptoren komen overvloedig voor op meerdere cel-types en controleren andere funkties in lichamelijke systemen. Ca2+-signalisering in de context van TRP ion-kanalen en AChR-funktie is vitaal voor de werking van het centraal zenuwstelsel, en er is veel variëteit qua nicotine receptoren die tot expressie komen in dierlijke en menselijke immuun-cellen. Op te merken valt dat nAChRs betrokken bleken bij het wakker worden, slaap en vermoeidheid, alsook de funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie, die allemaal klinische symptomen bij M.E./CVS zijn.

Besluit

In deze studie identificeerden we, voor de eerste keer, SNPs in genen coderend voor TRPM3 en TRPM8 ion-kanalen in geïsoleerde NK-cellen. We identificeerden ook talrijke SNPs in nAChRs samen met andere TRP-kanalen in geïsoleerde NK-cellen, wat de belangrijke rol van het niet-neuronale ACh systeem bij NK-cel funktie zou kunnen verklaren. Anomalieën in genotypes van TRP ion-kanalen en AChRs suggereren dat veranderd calcium een belangrijke funktionele consequentie kan zijn, niet enkel voor NK-cellen maar ook afhankelijk van weefsel-type, vatbaarheid of voorbestemdheid voor M.E./CVS.

april 15, 2016

Mitochondriale DNA varianten correleren met symptomen van M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:49 am
Tags: , , ,

Maureen R. Hanson staat aan het hoofd van het Hanson Laboratorium, van de Afdeling Molekulaire Biologie en Genetica van de Cornell Universiteit. Een team onder haar leiding voerde onderstaande studie uit. Dit werk werd hoofdzakelijk ondersteund door het ‘Chronic Fatigue Initiative’.

Mitochondrieën zijn de sub-cellulaire organellen verantwoordelijk voor de aanmaak van ATP, de energie-bron van cellen. Mitochondrieën zijn opgebouwd uit molekulen die worden gecodeerd door het nucleair genoom (DNA dat zich in de nucleus, kern bevindt) alsook door het mitochondriaal genoom (een kleinere hoveelheid DNA aanwezig in elk van dit organel). Defekten in het mitochondriaal DNA kunnen leiden tot genetische aandoeningen. Het mitochondriaal genoom van gezonde mensen vertoont ook wat natuurlijke variatie – componenten van het mitochondriaal DNA verschillen soms tussen individuen – dat noemt men een SNP (‘single nucleotide polymorphism’, één enkel nucleotide verschilt). Dikwijls verschilt meer dan één SNP tussen een populatie van mensen en een andere. Deze verschillende types mitochondriale genomen, gebaseerd op een specifieke set SNPs, noemt men haplogroepen. Zelfs mensen wiens mitochondriaal DNA tot dezelfde haplogroep behoort, kunnen van elkaar omwille van variatie in bijkomende SNPs. Sommige mitochondriale SNPs bleken verband te houden met verscheidene kenmerken (bv. vatbaarheid voor diabetes of inflammatoire ziekten).

Wat het nog ingewikkelder maakt is dat er veel individuele mitochondrieën in dezelfde cel zijn en dus veel copieën van mitochondriaal DNA in elke cel. Soms ontstaan nieuwe mutaties zodat sommige copieën van het DNA in dezelfde cel (en dus bij dezelfde persoon) van elkaar verschillen. Dit wordt ‘heteroplasmie’ genoemd. Wanneer cellen groeien en vermenigvuldigen, kan er per toeval een ongelijkmatige verdeling van normaal tegenover abnormaal DNA in verschillende cellen ontstaan. Als mitochondriaal DNA met een schadelijke mutatie het overheersend type wordt in een bepaald weefsel, zullen ernstige symptomen ontstaan.

In de studie worden de volgende vragen gesteld: Waren er bij door 6 erkende experten geïdentificeerde M.E.(cvs)-patiënten mensen die een verkeerde diagnose kregen en eigenlijk aan een mitochondriale genetische ziekte leden? /// Dragen mensen met M.E.(cvs) meer copieën mitochondriaal DNA met schadelijke mutaties dan gezonde mensen (heteroplasmie)? /// Lijden mensen behorende tot één bepaalde haplogroep meer waarschijnlijk aan M.E.(cvs)? /// Ervaren mensen met bepaalde SNPs meer waarschijnlijk bepaalde symptomen of hebben ze ernstiger symptomen?

Er was bij geen enkele van de patiënten een aanwijzing voor mitochondriale ziekte. Men vond bovendien geen verschil in de mate van heteroplasmie, ook geen verhoogde vatbaarheid voor M.E.(cvs) bij individuen die tot bepaalde haplogroepen behoren of bepaalde SNPs vertoonden binnen een haplogroep. Er werden wel verbanden gevonden tussen bepaalde SNPs en een aantal symptomen en de ernst ervan. Dit betekent niet dat als je één van die SNPs in je mitochondriaal DNA hebt, dat je dan onvermijdelijk een bepaalt symptoom zult ervaren of dat dit bepaalde symptomen ernstiger zouden zijn. Individuen die drager zijn van dat SNP hebben wel een groter risico voor bepaalde types symptomen eens ze ziek worden.

De vraag is nu: hoeveel van de variatie in symptomen is het resultaat van hun verschillend nucleair en/of mitochondriaal materiaal, in plaats van de variatie qua uitlokkende oorzaak? Hanson heeft het op haar website over het raadselachtige van de diversiteit qua symptomen en variatie van de ernst ervan. Die verschillen zouden niet als bewijs mogen worden genomen voor het feit dat meer dan één aanval de ziekte kan initiëren, noch dat patiënten verschillende onderliggende problemen hebben. Het blijft mogelijk dat de diversiteit van de ziekte het resultaat is van genetische diversiteit eerder dan van het bestaan van meerdere fundamentele oorzaken.

Of mitochondrieën verstoord zijn bij M.E.(cvs) is nog niet definitief vastgesteld. Mitochondrieën kunnen direct of indirect aangestast zijn. Een stoornis in het metabolisme of de regulering van genen kan bv. verhinderen dat mitochondrieën behoorlijk werken. Theoretisch kunnen mitochondrieën aangetast zijn via een onbekend auto-immuun mechanisme.

Voor nog wat meer achtergrond: lees o.m. ook ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’, alsook ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’, alwaar Prof. Kerr en collega’s rapporteren dat 2 mtDNA-polymorfismen waarschijnlijk het risico op het ontwikkelen van meerdere “funktionele syndromen” bepaalt…

————————-

Journal of Translational Medicine (2016) 14: 19

Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Billing-Ross P, Germain A, Ye K, Keinan A, Gu Z, Hanson MR

Cornell University, Ithaca, NY, USA

Samenvatting

Achtergrond We stellen als hypothe dat mitochondriale dysfunktie voorkomt bij Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve problemen, pijn, malaise en inspanning-intolerantie. We onderzochten of het type haplogroep, ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) of heteroplasmie van mitochondriaal DNA (mtDNA) geassocieerd waren met gezondheid-status en/of symptomen.

Methodes Er werd sequentie-bepaling van (via PCR vermeervuldigd) mtDNA uitgevoerd om de sequentie en mate van heteroplasmie te analyseren van mtDNAs van 193 patiënten en 196 voor leeftijd en geslacht gematchte controles (DNA-stalen verzameld in het kader van het ‘Chronic Fatigue Initiative’). Er werd getest op mogelijke correlaties van mitochondriale sequenties en symptomen/ernst (gerapporteerd via de ‘Short Form-36’ en ‘DePaul Symptom Questionnaire’).

Resultaten Er waren geen individuen met M.E./CVS die gekende ziekte-veroorzakende mtDNA-mutaties vertoonden. De mate van heteroplasmie was laag bij alle individuen. Hoewel er geen associatie tussen mtDNA SNPs en M.E./CVS vs. gezonde status werd geobserveerd, waren de haplogroepen J, U en H alsook 8 SNPs bij M.E./CVS-patiënten significant geassocieerd met individuele symptomen, symptoom-clusters of symptoom-ernst.

Conclusies Analyse van mitochondriale genomen bij M.E./CVS-patiënten geeft aan dat individuen van een bepaalde haplogroep of drager van specifieke SNPs meer waarschijnlijk bepaalde neurologische, inflammatoire en/of gastro-intestinale symptomen vertonen. Er werd geen toegenomen vatbaarheid voor M.E./CVS geobserveerd bij mensen met bepaalde mitochondriale genomen of SNPs.

Achtergrond

[…] Mitochondriale dysfunktie bleek betrokken bij M.E./CVS in meerdere studies. Een onderzoeksteam publiceerde 3 studies over M.E./CVS die rapporteerden over verstoorde mitochondriale aktiviteit in neutrofielen (via een indirecte test voor oxidatieve fosforylatie d.m.v. ATP-meting) [Myhill S et al. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – a clinical audit. Int J Clin Exp Med. (2013) 6: 1-15]. Interpretatie van neutrofiel-studies is moeilijk omwille van het feit dat neutrofielen minder mitochondrieën hebben dan spiercellen of andere types bloedcellen. In tegenstelling tot de neutrofiel-analyses, rapporteerden 2 research-groepen er geen detekteerbare verschillen waren tussen de aktiviteiten van mitochondriale complexen die ze testten in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93; zie ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS]. Er werden geen ultrastrukturele abnormaliteiten geobserveerd in mitochondrieën van spieren van M.E./CVS-patiënten (via elektronen-microscopie) [Plioplys AV, Plioplys S. Electron-microscopic investigation of muscle mitochondria in Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (1995) 32: 175-81]. Een andere groep maakte echter melding van normale mitochondriale aktiviteit maar gedaalde mitochondriale inhoud in skelet-spieren van M.E./CVS-patiënten [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Bovendien noteerden 2 studies een lagere coenzyme-Q inhoud in bloedcellen of plasma van M.E./CVS-patiënten [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antiox. Redox Sig. (2013) 19: 1855-60; zie ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?].

De literatuur betreffende bio-energetische funktie van hart- en/of skelet-spier (geanalyseerd via magnetische resonantie spectroscopie) bij M.E./CVS is ook tegenstrijdig: sommigen rapporteren abnormaliteiten bij M.E./CVS-patiënten, terwijl anderen een normale werking aangeven [Hollingsworth KG, Newton JL et al. Impaired cardiovascular response to standing in Chronic Fatigue Syndrome. Eur J Clin Invest. (2010) 40: 608-15 zie ‘Verstoorde cardiovasculaire respons op staan bij CVS’ /// Lane RJ et al. Heterogeneity in Chronic Fatigue Syndrome: evidence from magnetic resonance spectroscopy of muscle. Neuromuscul Dis. (1998) 8: 204-9 /// Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-22 /// McCully KK, Natelson BH et al. Blood flow and muscle metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Sci. (2003) 104: 641-7 /// McCully KK, Natelson BH et al. Muscle metabolism with blood flow restriction in Chronic Fatigue Syndrome. J Appl Phys. (2004) 96: 871-8]. Het kan zijn dat slechts een deel van de gevallen abnormaliteiten vertonen, die daardoor niet opgepikt worden wanneer de grootte van het staal beperkt is. Ofwel kunnen mitochondriale defekten of problemen qua bloeddoorstroming in de spieren resulteren in abnormale bevindingen in spectroscopische studies.

Er is weinig informatie beschikbaar betreffende de mitochondriale genomen van individuen met M.E./CVS. Bepaalde variaties in menselijke mitochondriale genomen bleken geassocieerd met verschillende fenotypes zoals klimaat-aanpassing, tolerantie voor grote hoogte en obesitas, of verhoogde of verminderde vatbaarheid of ernst van medische problemen zoals (o.a.) diabetes, sepsis, beroerte, Alzheimer’s & Parkinson’s, en hypertensie.

Menselijke populaties hebben overgeërfde polymorfismen die verschillende mitochondriale DNA (mtDNA) haplogroepen vertegenwoordigen. Het effekt van een nucleotide-polymorfisme kan variëren afhankelijk van het mitochondriaal genoom waarin het ontstaat. Het testen van de verbanden met het type haplogroep is daarom waardevol bij het analyseren van de rol van mtDNA-polymorfismen bij metabole ziekten. Bijvoorbeeld: een dergelijke aanpak werd gebruikt bij de ontdekking dat mitochondriale haplogroep-N9 bijdraagt tot resistentie tegen type-II diabetes bij Aziaten. Een studie bij individuen met Europese haplotypes bepaalde of 2 SNPs in een patiënten-groep al dan niet geassocieerd waren met symptomen en rapporteerde een verband van 1 SNP met pijn, chronische vermoeidheid en abnormale gastro-intestinale motiliteit [Boles RG et al. Hurt, tired and queasy: specific variants in the ATPase domain of the TRAP1 mitochondrial chaperone are associated with common, chronic “functional” symptomatology including pain, fatigue and gastro-intestinal dysmotility. Mitochondrion (2015) 23:64-70]. Een andere studie van mitochondriale genomen bij 162 M.E./CVS-patiënten met haplogroep-H rapporteerde een verband tussen ziekte met een SNP [Boles RG et al. Increased prevalence of two mitochondrial DNA polymorphisms in functional disease: are we describing different parts of an energy-depleted elephant? Mitochondrion (2015) 23:1-6; zie ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS].

Er zijn geen onderzoeken aangaande de heteroplasmie (aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom) bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Er kunnen somatische mutaties [somatische of lichaam-cellen; hun erfelijk materiaal wordt niet aan de volgende generatie doorgegeven] in mitochondriale genomen voorkomen en het is geweten dat de effekten bij het ouder-worden zich opstapelen of vermeerderen. Door het verkrijgen van volledige mitochondriale genoom-sequenties uit cellen van M.E./CVS-patiënten en een voor leeftijd gematchte groep, is het mogelijk om te bepalen of patiënten meer somatische mutaties (dan verwacht) hebben in mitochondriaal DNA. Een onderzoek naar heteroplasmie in mitochondriaal DNA van 1.085 [gezonde] individuen vond dat 90 % ten minste één variant genoom droeg en 20 % had sequentie-varianten die bekend staan als pathogeen. De frequentie van pathogene genomen in een individu kan worden onderzocht via sequentie-bepaling van mitochondriaal DNA, om zo te bepalen of een drempel werd bereikt waarbij ziekte duidelijk wordt.

Heteroplasmische pathogene mutaties kunnen ook worden doorgegeven via de kiemlijn [kiem- of geslacht-cellen bevatten de helft van de chromosomen van een somatische cel], wat leidt tot mitochondriale ziekte als het aandeel mutante genomen voldoende groot is geworden om de werking te verstoren. Bijvoorbeeld: de m.3243A>G mutatie kan mitochondriale encefalopathie met lactaat-acidose en beroerte (MELAS) veroorzaken wanneer de frequentie hoger is dan 59 %.

We ondernamen een studie van de mitochondriale genomen in een groep van voor geslacht en leeftijd gematchte M.E./CVS-patiënten en controles van overwegend Europese origine. We voerden ‘next-generation’ sequentie-bepaling uit om de mtDNAs van de individuen te karakteriseren wat betreft haplotype, SNPs en heteroplasmie. We deden associatie-testen om te bekijken of SNPs significant verband hielden met de M.E./CVS-status of met bepaalde symptomen en hun ernst in de patiënten-groep.

Methodes

[…]

Resultaten

Alle individuen kwamen uit een grote studie ondersteund door het ‘Chronic Fatigue Initiative’ (CFI) [Klimas NG et al. Findings from a clinical and laboratory database developed for discovery of pathogenic mechanisms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2015) 3: 75-96]. De individuen kregen een diagnose via artsen gespecialiseerd in M.E./CVS en voldeden aan de Fukuda criteria en/of de Canadese consensus criteria. […]

Causale mitochondriale ziekte varianten

Gemiddeld waren er 23,2 ± 11,3 SNPs bij de patiënten en 25,8 ± 12,4 bij controles t.o.v. de Cambridge referentie-sequentie. Polymorfismen die werden gezien in de consensus-sequenties van alle individuen werden vergeleken met de MITOMAP database (gerapporteerde, met ziekte geassocieerde mutaties) om te bepalen of er individuen waren met ziekte-veroorzakende mtDNA SNPs. Er werd slechts één bekende mitochondriale ziekte-veroorzakende substitutie geobserveerd bij de patiënten en controles. Er werd een T14484C substitutie [omwisseling van een nucleotide] gevonden bij een gezonde controle (wordt gezien bij individuen die ‘Leber’s erfelijke optische neuropathie’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast] ontwikkelen). Er werden geen andere ziekte-veroorzakende mtDNA-varianten gezien.

Zeldzame varianten associate-analyse

Om het effekt te bepalen van de totaal-mtDNA variatie inclusief courante en zeldzame varianten, vergeleken we de cumulatieve pathogeniciteit [ziekteverwekkend vermogen] tussen controles en M.E./CVS-individuen. Voor elke mtDNA-variant in een individu werd een ruwe pathogeniciteit-score verkregen uit de vrij beschikbare CADD-database [‘comined annotation dependent depletion’, CADD; score voor de schadelijkheid van ‘single nucleotide’ varianten of insertie/deletie varianten in het menselijk genoom]. Er werd een gemiddelde CADD-score berekend voor elk individu door de cumulatieve CADD-score van een individu te delen door hun aantal variant-plaatsen. De verdeling van de gemiddelde CADD-scores werd vergeleken tussen patiënten en controles […]. Er was geen significant verschil in de verdeling van gemiddelde CADD-scores tussen patiënten en controles.

Analyse van haplogroep met ziekte-status

De grote meerderheid van de individuen in de studie (90,1 %) droeg mtDNA-haplogroepen die courant voorkomen in nakomelingen van Europese afkomst, zoals werd verwacht gezien de groep > 96 % blank was. De sterkst vertegenwoordigde haplogroepen waren H (39,1 %), U (15,4 %), T (10,6 %), K (9,1 %) & J (5,6 %). De rest van de haplogroepen vertegenwoordigt nakomelingen verspreid over Azië en Amerika (5,5 %) en deze die courant zijn in Afrika (4,3 %).

Vergelijking van de verdeling van de haplogroepen toonde geen significant verschil tussen patiënten en controles. Daarnaast deden we afzonderlijke [statistische] testen bij elke individuele belangrijke haplogroep-categorie. Dit onthulde een nominaal-significante aanrijking van haplogroep-T (HgT) bij controles versus patiënten; wat een mogelijks beschermend effekt van HgT tegen M.E./CVS zou kunnen suggereren. [De nominale significantie is niet hetzelfde als de eigenlijke significantie maar uitleg zou een cursus statistiek vergen…].

We analyseerden ook de haplogroep-verdelingen in vrouwen en mannen afzonderlijk. We zagen een nominaal-significante aanrijking van HgT bij de vrouwelijke controles maar geen verbanden bij mannen.

Analyse van haplogroep en symptomen

Na geen belangrijk verband met ziekte te hebben gezien, testten we voor haplogroep-associatie met 270 verschillende symptoom-scores uit SF-36 [Medical Outcomes Survey Short Form-36’; zelf-rapportering vragenlijst over de algemene gezondheid] en DSQ [DePaul Symptom Questionnaire’; zelf-rapportering vragenlijst over de frequentie en ernst van 54 symptomen specifiek voor CVS] bevragingen. Omdat veel van de symptomen gerelateerd zijn met of afhankelijk van elkaar, pastten we geen multipele-test correctie […] toe. Er waren enkel Europese haplogroepen aanwezig met een frequentie groot genoeg om opgenomen te worden in deze analyse, en HgJ, HgU & HgH vertoonden allemaal significante verbanden […]. Als we individuele associatie-testen uitvoerden […], vonden we 6 significante associaties tussen mitochondriale haplogroepen en klinische fenotypes vastgesteld via de ‘DePaul Questionnaire’. Alle significante associaties waren met symptomen gerelateerd met gewricht-pijn, opgeblazen gevoel of “zich op voelen” na inspanning. Haplogroep-J vertoonde een beschermend effekt tegen alle metingen voor gewricht-pijn en individuen behorend tot haplogroep-U rapporteerden minder ernstig opgeblazen gevoel […]. Anderzijds hadden M.E./CVS-individuen met haplogroep-H de neiging meer vatbaar te zijn voor “zich op voelen” na inspanning dan andere haplogroepen.

Analyse van het verband tussen enkelvoudige merkers en ziekte

De meerderheid van variabele mtDNA-plaatsen (SNPs) in onze data-set waren ‘enkelingen’ – slechts één individu droeg de variante allelen, deze werden niet opgenomen in de associatie-analyse. 70 mtDNA-SNPs voldeden aan onze minimum ‘minor’ [minst voorkomend] allel frequentie-drempel van 5 % [geeft informatie over courante en zeldzame varianten in een populatie] en werden opgenomen in de associatie-testen met demografische en symptomatische variabelen geassocieerd met M.E./CVS.

Er werd ‘single marker association testing’ [vergelijkt frequenties van bepaalde allelen of genotypes] toegepast voor het bepalen van SNP-associaties met de aandoening van individuen (gezonde controles of M.E./CVS-patiënten). Van de 70 SNPs, bleken er 10 nominaal significant maar geen enkele bleken significant na multipele test correctie. Bij de M.E./CVS-patiënten, bekeken we ook SNP-associaties met acute of graduele aanvang van de ziekte en vonden geen significante verbanden. In een poging om rekening te houden met mtDNA genetische achtergrond en de individuele SNP-effekten meer accuraat te meten, werden SNP-associaties gemeten in de subgroep individuen met haplogroep-H (HgH). Idealiter zouden SNP-associaties moeten worden gemeten voor alle haplogroepen maar gezien de [beperkte] grootte van ons staal was HgH echter de enige haplogroep waar associatie-analyse doenbaar was. Van de 151 HgH-individuen waarvan klinische gegevens beschikbaar waren, vertoonden geen van de 18 SNPs die voldeden significante verbanden met M.E./CVS t.o.v. gezonde status.

De prevalentie van M.E./CVS en met vermoeidheid gerelateerde syndromen is hoger bij vrouwen. Daarnaast zijn – omwille van het maternaal overerving-patroon van mtDNA – mitochondriale varianten onderhevig aan geslacht-specifieke selektie, wat kan leiden tot een verschillende fitness bij vrouwen en mannen. Om rekening te houden met mogelijke geslacht-verschillen, werden onafhankelijke SNP-associatie testen op basis van geslacht uitgevoerd maar dit toonde geen verbanden.

Analyse van het verband tussen enkelvoudige merkers en symptomen

Er werd dan ‘single-marker association testing’ toegepast op symptoom-scores zoals voor de haplogroep-associatie analyse. Er bleken 8 mtDNA-SNPs geassocieerd met 16 symptoom-categorieën. De significante SNPs lagen op mtDNA-posities 150, 930, 1719, 3010, 5147, 16093, 16223 & 16519. SNPs 930 & 5147 delen één associatie terwijl 3010, 16093 & 16223 elk geassocieerd waren met 2 verschillende symptomen. 5 symptomen beleken geassocieerd met 16519, 150 was geassocieerd met 4 symptomen en 1719 met 7 symptomen. […].

Allel 150T was geassocieerd met lagere gezondheid-scores met betrekking tot emotionele beperkingen, werk-geschiktheid en -prestaties (SF-36 vragenlijst M.E./CVS-patiënten). Allelen 930G & 5147G waren geassocieerd met grotere moeilijkheden bij het uitvoeren van werk. Het 1719A allel was geassocieerd met hogere symptoom-scores in 7 categorieën (inflammatie & neuro-inflammatie; DSQ vragenlijst M.E./CVS-patiënten). De 2 significante verbanden van 16223T met neuro-inflammatoir lijden en frequentie van gevoeligheid voor helder licht overlapten met dezelfde symptomen die geassocieerd waren met 1719A. Patiënten met 3010A vertooden meer frequent een slaap-aandoening. Lichamelijke aktiviteiten waren meer beperkt bij patiënten met 16093T. De aanwezigheid van 16519C was geassocieerd met ernstiger gastro-intestinale symptomen (opgeblazen gevoel en abdominale pijn). […]

Heteroplasmie-analysis

Een mitochondriale heteroplasmie komt voor wanneer een individu mtDNA-copieën met verschillende allelen draagt. Heteroplasmieën kunnen voorkomen door somatische mutatie of maternale overerving […]. Er wordt gedacht dat mitochondrieën door een kiemlijn ‘flessehals’ gaan die de frequentie reduceert van heteroplasmieën overgedragen van moeder naar kind. Als heteroplasmieën echter een kritieke frequentie binnen een weefsel of individu bereiken, kunnen ze potentieel pathogene effekten hebben. De accumulatie van heteroplasmieën tijdens het ouder-worden kan ook bijdragen tot de variabele aanvang-leeftijd die wordt gezien bij verscheidene energie-ziekten.

Om de rol van heteroplasmie bij M.E./CVS te onderzoeken, voerden we een omvangrijke sequente-bepaling uit om heteroplasmieën aanwezig bij M.E./CVS-patiënten te identificeren en te analyseren. Er werd een gemiddelde van 1,42 heteroplasmieën per individu gezien (t.o.v. slechts 1,28 bij controles). Om rekening te houden met het feit dat het aantal plaatsen dat voldeed aan onze criteria om het een heteroplasmie te noemen varieerde tussen de stalen, berekenden we echter hat aantal heteroplasmieën per bruikbare plaats per individu (HPUI) en gebruikten dat bij de vergelijking. […] Er werd een statistische test gebruikt om de verdeling van HPUI te vergelijken tussen patiënten met acute aanvang van M.E./CVS versus geleidelijke aanvang, en er was geen significant verschil (p = 0.30). Aangezien cytokine-profielen van M.E./CVS-patiënten bleken te verschillen met het verloop van de ziekte [Hornig M, Montoya JG, Klimas NG et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: e1400121; zie ‘Afzonderlijke immuun-signaturen bij vroege & late M.E.(cvs)], werd HPUI ook vergeleken tussen individuen met M.E./CVS van langer dan 3 jaar of minder en meer dan 3 jaar. Er was geen significant verschil.

Een vergelijking van de frequentie van heteroplasmische allelen onthulde dat zeer weinig heteroplasmieën voorkomen bij patiënten of controles. Van de 406 verschillende heteroplasmieën die werden geobserveerd bij patiënten en controles, was de gemiddelde heteroplasmie aanwezig bij slechts 1,23 ± 0,85 individuen en 353 heteroplasmieën werden slechts gevonden bij één enkel individu. De meest courante heteroplasmie was aanwezig bij 7 individuen.

Bespreking

Onze sequentie-bepaling van het compleet mitochondriaal genoom van patiënten onthulde dat er geen individuen in deze groep waren met genetische mitochondriale ziekte te wijten aan gekende mtDNA-mutaties, die de diagnose M.E./CVS verkeerdelijk zouden hebben gekregen. De specialisten die de patiënten selekteerden hebben dus geen patiënten met een gekende mitochondriale ziekte verkeerdelijk toegelaten.

Onze studie onderzocht associaties tussen mtDNA-variatie en demografische variabelen zoals M.E./CVS-status, acute aanvang en ziekte-duur. We vonden een correlatie tussen haplogroep en sommige symptomen gerelateerd met gewricht-pijn, opgeblazen gevoel en uitputting na inspanning. De meeste studies van mitochondriaal DNA en ziekte hebben betrekking tot de verhoogde of verlaagde vatbaarheid met de ziekte afhankelijk van de haplogroep of variant, eerder dan met verschillen qua type symptomen of hun ernst. Er zijn echter enkele ziekten waarbij haplogroep geassocieerd bleek niet om de kans van de ziekte op te lopen maar in plaats daarvan de uitkomst te bepalen als iemand de diagnose heeft gekregen. Bijvoorbeeld: het type haplogroep beïnvloedt de overleving van ernstige sepsis en de progressie van AIDS.

Het meten van mtDNA-SNP associaties met M.E./CVS-status toonde geen significante verbanden, hoewel 10 SNPs nominale significantie bereikten. Bij onderzoek van deze 10 SNPs bleken er 9 merker-polymorfismen voor HgT te zijn en de tiende een merker voor 5 andere erkende sub-haplogroepen binnen T. De bevinding is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat haplogroep-associatie analyse vond dat meer controles dan M.E./CVS-individuen dragen waren van HgT in onze groep. Er is een grotere groep nodig om te bepalen of dit haplotype ietwat beschermt tegen M.E./CVS. Met betrekking tot HgT: een molekulaire analyse van cybride cellen [cytoplasmische hybride, een cel-lijn ontstaan na fusie van een volledige cel met een cytoplast (binnenste van een cel zonder de celwand cel-kern en plasma-membraan); de nucleaire genen van de ene cel worden gemengd met de mitochondriale genen van de andere – zo wordt het mogelijk de bijdrage van de mitochondriale genen en de nucleaire genen te onderscheiden] met identieke nucleaire achtergronden en verschillende mtDNA-populaties gaven aan dat HgT cybriden een hogere overleving vertoonden en toleranter waren voor oxidatieve stress, t.o.v. de meer courante Europese haplogroep-H.

Een studie onderzocht mitochondriale DNA SNPs op positie 3010 & 16519 bij 162 M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. [Boles RG et al. (hierboven)] Men vond een aanrijking van 16519T bij M.E./CVS-gevallen. In onze studie zagen we echter geen significante associatie van 16519T of enig ander polymorfisme met M.E./CVS t.o.v. controle. In de plaats daarvan zagen we, bij individuen met M.E./CVS, een significante associatie van 16519C met gastro-intestinale symptomen. Verder vonden we dat de allelen 16519C & 3010A geassocieerd waren met ernstiger M.E./CVS-symptomen.

De variatie qua symptomen voorkomend bij M.E./CVS zou te wijten kunnen zijn aan genetische variatie bij de individuen, eerder dan verschillen qua onderliggende oorzaak van de ziekte. Meting van verbanden tussen haplogroepen of mtDNA-SNPs en symptoom-scores van M.E./CVS-patiënten (SF-36 & DSQ), toonde 24 significante associaties. Hoewel we deze studie ondernamen omdat enkele van de belangrijke M.E./CVS-symptomen theoretisch zouden kunnen te wijten zijn aan mitochondriale dysfunktie, detekteerden we geen mitochondriale DNA SNP associaties met de belangrijke symptoom-clusters vermoeidheid/post-exertionele malaise, cognitieve problemen, autonome dysfunktie, endocriene abnormaliteiten en pijn. In de plaats daarvan zagen we associaties met neurologische, inflammatoire en gastro-intestinale symptomen en/of hun ernst, alsook correlaties met de mogelijkheid van de patiënten om te werken. Het zal belangrijk zijn om een volledig onafhankelijke groep te gebruiken om te bepalen of de door ons gedetekteerde correlaties kunnen worden herhaald.

Onze studie geeft hints dat minstens enkele van de klaarblijkelijke M.E./CVS-subtypes te wijten kunnen zijn aan verschillen in DNA-sequenties bij de patiënten, zelfs als is er geen bewijs dat bepaalde mitochondriale genomen leiden tot verhoogde vatbaarheid voor de ziekte zelf. Hoewel de groep behoorlijk groot was (389) in vergelijking met de meeste M.E./CVS-studies, zal verdere analyse van de mitochondriale en nucleaire genomen bij een veel grotere patiënten-populatie nodig zijn om te ontdekken hoe genetische variatie ziekte-ernst, progressie en symptoom-clusters beïnvloedt.

Besluiten

We vonden geen significant verband tussen mitochondriaal DNA genoom variatie en vatbaarheid voor of resistentie tegen M.E./CVS. We detekteerden geen enkel significant verschil qua heteroplasmie tussen patiënten en controles. Op basis van een groep van 193 M.E./CVS-patiënten en 196 controles, zagen we 8 mtDNA SNPs die geassocieerd waren met 16 symptoom-categorieën en 3 haplogroen geassocieerd met 6 symptoom-categorieën, wat suggereert dat het mitochondriaal genoom van een individu met M.E./CVS het type en de ernst van bepaalde symptomen kan beïnvloeden.

juli 25, 2015

Genetische evaluatie van met immuniteit & inflammatie gerelateerde genen bij CVS

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 8:12 am
Tags: , , , , , , , ,

We hebben het op deze pagina’s al meermaals over SNPs bij M.E.(cvs) gehad. Een onderzoek-groep van het CDC heeft bekeken of patiënten meer van dergelijke variaties in genen betrokken bij immuniteit/inflammatie hadden dan normaal. Dergelijke polymorfismen zijn dikwijls niet zeldzaam (10-30%) maar het punt is dat ze niet onder de courante vorm voorkomen. Tot nu toe waren slechts enkele immuniteit-genen bekeken maar in deze studie werd een chip gebruikt die 11.000 SNPs in 1000 genen van 38 immune sub-mechanismen kan bepalen. De gen-polymorfismen die werden gevonden bleken niet verspreid te liggen in genen over het immuunsysteem maar waren geclusterd.

Het CDC-team categoriseerde de polymorfismen volgens type. Niet-synonieme: gen-wijzigingen die zorgen voor een veranderde vorm van het proteïne (3 genen waarvan 2 die een rol spelen bij het complement-systeem). Synonieme: waarbij het proteïne niet verandert (4 gen-varianten die ongewoon courant of zeldzaam waren bij M.E.(cvs); 2 daarvan behorend tot complement-pad). Genen in de onvertaalde gebieden (‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie (2 genen van de complement-cascade). SNPs in de intronische gebieden (intron = DNA-sequentie in een gen die niet codeert voor het eiwit): beïnvloeden ook de gen-expressie. Daarnaast keken ze nog naar 6 extra gen-varianten van het complement-pad en ze vonden afwijkingen in hun voorkomen (ongebruikelijk hoog of laag) bij M.E.(cvs).

Het complement-systeem is een onderdeel van de aangeboren immuun-respons dat antilichamen en fagocyterende cellen ‘complementeert’ (aanvult) in de strijd tegen pathogenen. Het bestaat uit een 30-tal proteïnen. Bij een invasie van een pathogen of inflammatie worden deze proteïnen gesplitst door enzymen (proteasen), wat aanleiding geeft tot de afgifte van cytokinen. Polymorfismen in complement-genen bleken eerder al gelinkt met meerdere aandoeningen…

In 2003 hebben Bristol Sorensen en medewerkers al getoond dat M.E.(cvs)-patiënten 6h na inspanning een significante verhoging van het complement splitsing-produkt C4a vertoonden. Een team van het CDC (toen nog met Suzanne Vernon) bevestigde in 2005 dat complement-aktivatie één van de door inspanning geïnduceerde verschillen was tussen M.E.(cvs) en controles (zie ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS’). Samen stelden ze dat complement-aktivatie een merker kan zijn voor met M.E.(cvs) geassocieerde post-exertionele malaise (zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’).

Het CDC zette dus dit werk verder en deze studie hier toonde weer een verband tussen M.E.(cvs) en SNPs in o.a. het complement-aktivatie mechanisme. Het complement-systeem blijkt dus een belangrijke rol te spelen bij de aandoening, wat een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij M.E.(cvs) verder ondersteunt. Hopelijk volgen er nog studies om dit verder uit te klaren en de effekten van inspanning op complement gen-expressie en concentraties in het bloed te onderzoeken. Dit zou een immune oorzaak voor post-exertionele malaise kunnen aantonen.

————————-

Hum Immunol. 2015 Jun [pre-print]

Pathway-focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome

Rajeevan MS, Dimulescu I, Murray J, Falkenberg VR, Unger ER

Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

Samenvatting

Er is bewijsmateriaal dat suggereert dat immuniteit- en inflammatoire wijzigingen belangrijk zijn bij Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS). Deze studie werd uitgevoerd om het verband van funktioneel belangrijke genetische varianten in inflammatie- en immune mechanismen bij CVS te exploreren. Er werd DNA uit perifeer bloed geïsoleerd van 50 CVS- en 121 niet-vermoeide (NF) controle-deelnemers in een populatie-studie. Er werd genotypering uitgevoerd met de Affymetrix Immuniteit en Inflammatie Chip die 11.000 ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) omvat. De accuraatheid van de genotypering voor de specifieke genen werd gevalideerd via pyrosequentiebepaling. Er werd Golden Helix SVS software gebruikt voor de genetische analyse. […] CVS bleek geassocieerd met 32 funktioneel belangrijke SNPs: 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 ‘untranslated regulatory region’ (UTR) varianten en 6 intron-varianten. Enkele van deze SNPs bevonden zich in genen van mechanismen gerelateerd met de complement-cascade (SERPINA5, CFB, CFH, MASP1 & C6), chemokinen (CXCL16, CCR4, CCL27), cytokine-signalisering (IL18, IL17B, IL2RB) en ‘toll-like’ receptor signalisering (TIRAP, IRAK4). Van bijzonder belang is de associatie van CVS met 2 mis-sense varianten in genen va de complement-aktivatie: rs4151667 in CFB en rs1061170 in CFH. Een 5’-UTR polymorfisme (rs11214105) in IL-18 was ook geassocieerd met lichamelijke vermoeidheid, lichaam-pijn en de score voor CVS-definiërende symptomen. Deze studie identificeerde nieuwe verbanden tussen CVS en genetische varianten in mechanismen, waaronder complement-aktivatie, wat bijkomende ondersteuning biedt voor een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

1. Inleiding

[…] Inflammatoire merkers bleken geassocieerd met specifieke symptomen die gemeenschappelijk zijn voor CVS; chronische vermoeidheid, hartslag-variabiliteit, slaap-kwaliteit, cognitieve problemen en post-exertionele malaise. Er werden wijzigingen in cytokine-profielen gesuggereerd als biomerkers voor CVS. Polymorfismen met een impact op gen-funktie, direct of via interaktie met andere risico-factoren, dragen bij tot de genetische vatbaarheid voor CVS. Er werd slechts een klein aantal polymorfismen in enkele genen betrokken bij immune en inflammatoire respons bestudeerd. De Affymetrix Menselijke Immuniteit en Inflammatie Chip werd ontwikkeld om systematische genetische evaluatie van of immuniteit- en inflammatie-mechanismen te een vergemakkelijken. We gebruikten dit platform om de genetica van de immune en inflammatoire respons bij CVS te onderzoeken.

2. Materialen en methodes

2.1. Individuen

[…] De deelnemers […] werden als CVS geklassificeerd als ze voldeden aan de internationale research-definitie (1994). […] Individuen die niet aan de criteria voor CVS voldeden, werden geklassificeerd als niet-vermoeide (NF) controles. De groep omvatte […] 121 NF-controles en 50 CVS-patiënten. […]

2.2. Multiplex Affymetrix genotypering

[…]

2.3. Genotypering d.m.v. pyrosequentiebepaling

[…]

2.4. Data-analyse en bio-informatica

[…]

3. Resultaten

3.1. Demografie van de deelnemers opgenomen in deze analyse

[…] De mediane tijd sinds aanvang van de vermoeidheid voor de CVS-deelnemers was 8,97 jaar (0,39-40,2 jaar) en 82,2% vertoonde een gradueel begin van de ziekte. […]

3.2. Mogelijke funktionele SNPs geassocieerd met CVS

De resultaten identificeerden 427 SNPs geassocieerd met CVS op allel-niveau en 405 op genotype-niveau. De 38 SNPs met een mogelijke funktionele betekenis […] werden samen met 14 van hun nabijgelegen SNPs die niet op de Affymetrix chip zaten, gegenotypeerd via ‘pyrosequencing’ [moderne vorm van sequentie-bepaling]. […] 32 van de 38 SNPs en 10 van de 14 proxy SNPs waren significant geassocieerd met CVS. De 32 funktionele SNPs werden gegroepeerd […]: niet-synonieme varianten (11 SNPs), synonieme variants (4 SNPs), gelegen in de ‘untranslated regulatory regions’ (UTR) van genen (11 SNPs) of intronische (6 SNPs). […]

[uitleg in de bespreking]

3.3. C2/CFB en CFH allelen, en haplotypes geassocieerd met CVS

[uitleg in de bespreking]

3.4. SNPs geassocieerd met kwantitatieve metingen van CVS

[uitleg in de bespreking]

4. Bespreking

Deze studie identificeerde meerdere eerdere niet erkende genetische associaties met CVS die het waard zijn verder te worden bestudeerd voor validering. Wanneer ze worden gevalideerd, zullen deze associaties de hypothese dat immuniteit- en inflammatie-mechanismen betrokken zijn bij CVS ondersteunen. Vele van de SNPs geassocieerd met CVS zijn gelegen in genen die betrokken zijn bij complement-aktivatie, chemokinen en cytokinen, en ‘toll-like’ receptor (TLR) signalisering. De bevindingen aangaande het complement-systeem zijn van bijzonder belang, aangezien er een rol voor complement-aktivatie bij CVS werd gesuggereerd door een melding over een geval en eerdere gen-expressie en proteoom-studies. Uit een rapport over één chronisch vermoeide patient bleek dat de waarden van de complement splitsing-produkten verhoogd waren maar dat de CVS-symptomen verbeterden binnen 2 maand na of normalisering van de splitsing-produkten. Gen-expressie studies duiden op differentiële expressie van het complement-proteïne MASP2, wat bijdraagt tot het C4a splitsing-produkt bij CVS na inspanning [Sorensen B et al. Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J. Allergy Clin. Immunol. (2003) 112: 397-403 /// Sorensen B, Jones JF, Vernon SD, Rajeevan MS. Transcriptional control of complement-activation in an exercise-model of Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Med. (2009) 15: 34-42; zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS]. Complement-proteïnen in het cerebrospinaal vocht van individuen met CVS bleken verhoogd vergeleken met gezonde controles [zie ‘Verschillende proteomen in ruggemergvocht bij CVS & Lyme].

Het complement-systeem speelt belangrijke rollen bij de verdediging van de gastheer tegen infektie, coördineert gebeurtenissen tijdens inflammatie, en vormt een brug tussen aangeboren en adaptieve immuun-responsen. Complement-aktivatie wordt geïnitieerd via 3 sub-mechanismen (klassiek, alternatief en lectine-mechanisme), die allemaal leiden tot de vorming van C3-convertase [enzyme] dat nodig is voor de splitsing van C3. CFH [complement-factor H] en CFB [complement-factor B] spelen een centrale maar tegengestelde rol bij het alternatief mechanisme. CFB aktiveert de complement-cascade via zijn bijdrage tot de vorming van C3-convertase en CFH inhibeert hetzelfde mechanisme via het versnellen van de afbraak van C3-convertase. C2 lijkt op CFB, maar draagt bij tot de vorming van C3-convertase via het klassiek mechanisme.

Interessant is dat van 2 met CVS geassocieerde mis-sense varianten [coderend voor een verkeerd aminozuur] in genen van de complement-aktivatie – rs4151667 in CFB & rs1061170 in CFH – een associatie met ‘age-related macular degeneration’ [AMD; een oog-aandoening] was gevonden. Het SNP rs9332739 in C2 […] – waarvan ook een associatie met AMD werd gerapporteerd – was ook geassocieerd met CVS in onze studie; het risico en de beschermende varianten waren echter omgewisseld (m.a.w. de allelen die beschermen tegen AMD waren geassocieerd met het risico op CVS). Een rapport gaf aan dat beschermende allelen (van CFH & CFB) voor AMD verband houden met lagere waarden qua complement-aktivatie. Aangezien dezelfde allelen geassocieerd zijn met het risico op CVS in deze studie, stellen we als hypothese dat lagere complement-aktivatie geassocieerd kan zijn met te minste een subgroep CVS-individuen.

Bij ons weten is dit de eerste studie die CVS in verband brengt met met polymorfismen in chemokine-liganden/receptoren, molekulen die leukocyten-bewegingen reguleren. Eén van de sterkste associaties was met de synonieme risico-variant rs2228428 die mogelijks ‘splicing’ [Tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.] reguleert in CCR4, een chemokine-receptor waarvan is gemeld dat die tot expressie komt op Th2 en Treg cellen. Er werden ook associaties gevonden met varianten in CXCL16 [chemokine (C-X-C motief) ligand 16], een lid van de CXC-familie der chemokinen. rs1051007 in het 3’UTR van CXCL16, waarvan werd gerapporteerd dat het een impact heeft op zijn gen-expressie, was geassocieerd met het risico op CVS, terwijl een mis-sense polymorfisme (rs2277680) in CXCL16 geassocieerd was met bescherming. Deze resultaten suggereren dat verdere studies van CCR4 en CXCL16 bij CVS gerechtvaardigd zijn.

Studies hebben gerapporteerd over het feit dat enkele polymorfismen in cytokinen geassocieerd zijn met CVS [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24: 179-182; zie ook ‘Circadiaans ritme voor cytokine-secretie]. Deze SNPs werden niet opgenomen in de ‘Affymetrix Human Immune and Inflammation Chip’ die we gebruikten. We identificeerden echter bijkomende cytokine-polymorfismen, nl. rs11214105 in IL-18, een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend] dat door perforine [enzyme dat vrijkomt wanneer cellen worden aangevallen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen en dat porieën boort in het membraan van te vernietigen cellen] gemedieerde T-cel en NK-cel cytotoxiciteit versterkt. IL-18 bleek ook bij te dragen tot de ontwikkeling en de pathogenese van infektueuze en neuro-inflammatoire ziekten met immuniteit- en cognitieve dyfunktie [Alzheimer’s, hepatitis-C virus infektie]. Dieren-studies linkten IL-18 aan ziekten met geslacht-specifieke prevalentie en ingewikkelde, regionale en geslacht-specifieke ouderlijke effekten in de hersenen. We vonden dat dit IL18-polymorfisme geassocieerd is met CVS en kwantitatieve metingen van de CVS-symptomen: lichaam-pijn, fysieke vermoeidheid, symptoom-scores en aantal CVS-symptomen. Onze resultaten suggereren bijkomend onderzoek naar IL-18 als een kandidaat-gen bij CVS-pathofysiologie.

Meerdere met CVS geassocieerde 3’UTR-polymorfismen verdienen verdere analyse aangezien ze een impact kunnen hebben op binding-plaatsen voor microRNAs [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)] die nog niet werden onderzocht bij CVS. Hoewel de impact van deze SNPs op microRNA-binding nog experimenteel dient te worden geverifieerd, suggereren onze resultaten een mechanisme voor microRNA-regulering van genen geassocieerd met CVS. Sommige van de microRNAs die worden beïnvloed door met CVS geassocieerde SNPs zijn gelinkt met in IL17B & en SERPINA5 [‘serpin peptidase inhibitor clade A member 5’]. Een mis-sense variant in SERPINA5 (rs6115) was ook geassocieerd met CVS. Aangezien deze SERPINA5-varianten niet in ‘linkage disequilibrium’ zijn [Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.], kunnen ze een onafhankelijk risico op CVS betekenen. SERPINA5, een inhibitor van geaktiveerd proteïne-C [APC is in staat om, samen met proteïne-S de stolling te stoppen], is gelegen op chromosoom 4 met andere leden van de serpent protease-familie – inclusief corticosteroid-bindend globuline (SERPINA6), waarvan werd gerapporteerd dat het verband houdt met CVS [Torpy DJ et al. Association between Chronic Fatigue Syndrome and the corticosteroid-binding globulin gene ALA SER224 polymorphism. Endocr. Res. (2004) 30:417-29]. De met CVS geassocieerde intron-variant rs11257804 in CAMK1D is van belang. CAMK1D is een proteïne-kinase in het calcium-signalisering mechanisme. Het speelt een belangrijke rol bij de werking van granulocyten en heeft weinig of geen expressie in monocyten en lymfocyten. Dit suggereert dat een verdere verkenning van de granulocyten-funktie en gastheer-verdediging bij CVS gerechtvaardigd is.

De beperkte grootte van de groep, samen met het ontbreken van een correctie voor multipele testen is de belangrijkste beperking van deze verkennende studie. [Complexe uitleg hoe hier werd aan verholpen…]

Onze studie identificeerde 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 3’UTR- en 6 intron-varianten met mogelijke regulerende werking […]. De specificiteit van de associaties met CVS kon in deze studie niet worden bepaald aangezien er enkel werd vergeleken met niet-vermoeide controles. Het identificeren van met CVS geassocieerde abnormaliteiten in een ‘case-control’ studie is een belangrijke eerste stap bij het identificeren van kandidaat-genen en mechanismen die betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CFS.

Tot besluit: deze studie identificeerde meerdere nieuwe genetische verbanden tussen CVS en varianten in de complement-aktivatie, chemokinen, cytokinen en ‘toll-like’ receptor signalisering. Associaties met deze mechanismen leveren bijkomende ondersteuning voor een rol van gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies met grotere patiënten-groepen nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.