M.E.(cvs)-wetenschap

maart 22, 2017

Epigenetische modificaties & glucocorticoïden sensitiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:58 pm
Tags: , , , , , ,

Lees, ter introductie, o.a. nog es ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’…

Epigenetica betreft de chemische wijzigingen die voorkomen op het DNA van onze genen – dikwijls het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide). – die veranderen hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA).

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS(de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757). Nu werden hier 12.608 verschillen op het DNA (“differentieel gemethyleerde sites”) gevonden bij M.E.(cvs)-patiënten in vergelijking met gezonde mensen; een groot biologisch verschil. Deze verschillen op het DNA beïnvloeden ook de werking van immuniteit-cellen. Er werd meer hyper-methylatie gevonden bij de M.E.(cvs)-patiënten (71,6% t.o.v. 28,4% hypo-methylatie) vergeleken met controles. 1.600 differentieel gemethyleerde genen waren gelinkt met lichamelijke stoornissen (RAND-36 score) bij M.E.(cvs). Vele van deze genen zijn betrokken bij cellulaire energie-produktie, metabolisme en immuun-signalisering.

Er werd ook bekeken of deze verschillen een invloed hadden op de immuun-funktie. Daartoe werden cellen uit het bloed onderworpen aan een specifieke test waarbij de immuuncellen worden geaktiveerd (simulatie van een immuun-respons) en deze respons dan wordt gestopt met een synthetische vorm van cortisol. Bij een subgroep M.E.(cvs)-patiënten waren de cellen hyper-sensitief voor cortisol (de hoeveelheid nodig om gezonde immuuncellen te ‘kalmeren’ veroorzaakte bij M.E.(cvs) dat deze cellen werden uitgezet. Er waren differentieel gemethyleerde genen geassocieerd met deze hyper-sensitiviteit voor cortisol.

Eens te meer wordt hier aangegeven dat M.E.(cvs) een biologische oorzaak heeft… De auteurs: “Deze bevindingen komen overéén met ander werk die aangeven dat de energie-produktie verstoord is in de cellen van mensen met M.E.(cvs).”.

 

————————-

BMC Med Genomics. 23 (2017) 10: 11

Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

de Vega WC1,2, Herrera S1,3, Vernon SD4,5, McGowan PO6,7,8,9

1Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

3Department of Biological Sciences, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA

4Solve ME/CFS Initiative, Los Angeles, CA, USA

5Present affiliation: The Bateman Horne Centre of Excellence, Salt Lake City, UT, USA

6Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, M1C 1A4, Canada

7Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

8Department of Psychology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

9Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

Samenvatting

Achtergrond: Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende idiopathische ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verdwijnt door voldoende rust. De diagnose is gebaseerd op een lijst symptomen en uitsluiting van andere vermoeidheid-gerelateerde gezondheid-aandoeningen. Ondanks de heterogene patiënten-populatie komen verschillen qua immuniteit en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, zoals versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden, steeds terug in M.E./CVS-studies. Het is geweten dat epigenetische modificaties, zoals CpG-methylatie [DNA-methylatie komt voornamelijk voor op de cytosines van CpG dinucleotide sites], lange-termijn fenotypische verschillen reguleren en eerder werk door ons groep toonde DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] verschillen bij M.E./CVS; het verband tussen DNA-methyloom modificaties, klinische en funktionele karakteristieken geassocieerd met M.E./CVS werd echter niet onderzocht.

Methodes: We onderzochten het DNA-methyloom in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van een grotere groep vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (‘Illumina Human Methylation 450 BeadChip Array’ [‘chip’ waarmee > 485.000 methylatie-sites per staal kunnen worden geanalyseerd]). Parallel met de analyse van het DNA-methyloom, bekeken we de glucocorticoïden-gevoeligheid ‘in vitro’ door het stimuleren van PBMCs met fyto-haemagglutinine [PHA] en onderdrukten de groei met dexamethason [synthetisch glucocorticoid]. We gingen DNA-methylatie verschillen na d.m.v. bisulfiet-pyrosequentie-bepaling [‘pyrosequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling] en statistische permutatie. Er werd lineaire regressie [statistische analyse] toegepast om epigenomische gebieden geassocieerd met zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit te ontdekken, en netwerk-analyse van gen-ontologische termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] om de resultaten in een biologische context te plaatsen.

Resultaten: We detekteerden 12.608 verschillende gemethyleerde plaatsen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voornamelijk gelokaliseerd in genen m.b.t. het cellulair metabolisme; enkele daarvan waren ook gerelateerd met scores van zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit. Bij de M.E./CVS-patiënten was glucocorticoid-sensitiviteit geassocieerd met differentiële methylatie op 13 loci. [locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt]

Besluiten: Onze resultaten geven aan dat DNA-methylatie modificaties in het cellulair metabolisme bij M.E./CVS – ondanks een heterogene patiënten-populatie – deze processen in immune en HPA-as dysfunktie bij M.E./CVS impliceren. Modificaties op epigenetische loci geassocieerd met verschillen qua glucocorticoid-gevoeligheid kunnen belangrijk zijn als biomerkers. Globaal genomen komen deze bevindingen overéén met werk dat wijst op stoornissen bij de cellulaire energie-produktie in deze patiënten-populatie.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een idiopathische ziekte gekenmerkt door ernstige en invaliderende vermoeidheid, cognitieve stoornissen, niet-verfrissende slaap, autonome verschijnselen en post-exertionele malaise. Andere ziekten of gezondheid-aandoeningen die de persistente aanwezigheid van vermoeidheid kunnen verklaren, zoals majeure depressie, anorexie en boulimie, worden uitgesloten voor het stellen van de diagnose M.E./CVS. De heterogeniteit wat betreft de klinische kenmerken van M.E./CVS is een obstakel bij het bepalen van de biologische oorzaak.

Veel studies die de pathofysiologie van M.E./CVS onderzochten, hebben wijzigingen in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as gerapporteerd. De HPA-as is een belangrijke component van het neuro-endocrien systeem dat homeostatische processen, het circadiaans ritme en stress-responsen reguleert via een hormonen-cascade die leidt tot de afgifte van glucocorticoïden (GCs). GCs interageren met de GC-receptor (GR) om de stress-respons en inflammatie te reguleren. M.E./CVS-patiënten vertonen een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback responsen op GCs, wat een belangrijke rol van de HPA-as bij deze ziekte suggereert.

Naast de veranderde werking van de HPA-as, werden ook wijzigingen qua immuun-fenotype alom gedocumenteerd bij M.E./CVS. Hoewel de specifieke patronen van de verschillen nog niet zijn opgelost, bleek M.E./CVS geassocieerd met abnormale cytokine-profielen, lymfocyten-proporties en verstoorde immuun-funktie (in het bijzonder verminderde cytotoxiciteit). Verhoogde inflammatie in het darm-microbioom bleek ook geassocieerd met M.E./CVS. Dit omvat gedaalde diversiteit van het darm-microbioom, verschuivingen naar pro-inflammatoire bakteriële soorten en een proliferatie van merkers voor pro-inflammatoire processen in het serum [Giloteaux L, Goodrich JK, Walters WA, Levine SM, Ley RE, Hanson MR. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30].

Epigenetische modificaties, inclusief de methylatie van DNA op CpG-dinucleotiden, kan lange-termijn fenotypische veranderingen beïnvloeden in respons op externe stimuli. DNA-methylatie modificaties in genen betrokken bij de HPA-as en het immuunsysteem bleken sterk gelinkt met omgeving-stress. We documenteerden eerder DNA-methyloom abnormaliteiten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van ‘sudden-onset’ M.E./CVS-patiënten (gevalideerd via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling) [de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757]; deze abnormaliteiten waren significant geconcentreerd in genen gelinkt met immuun-regulering. Er bleven belangrijke vragen over het feit of deze epigenetische modificaties een impact hadden op de werking van immuun-cellen en hun relatie met klinische kenmerken van M.E./CVS.

In de huidige studie brachten we loci in kaart die epigenetische gemodificeerd waren in PBMCs en onderzochten hun gevoeligheid voor glucocorticoïden. Onze doelstellingen waren te bepalen hoe epigenetische patronen in verband staan met HPA-as signalisering in immuun-cellen bij M.E./CVS-patiënten, en de identificatie van neuro-immune mechanismen die waren beïnvloed bij M.E./CVS.

Methodes

Criteria voor selektie van deelnemers

[…] De diagnose M.E./CVS werd gesteld op basis van de Fukuda en Canadese criteria. […] Vragenlijsten over symptomen, medicatie en medische geschiedenis, en de RAND-36 voor zelf-rapportering over gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit. [36 items ter beoordeling van 8 gezondheid-concepten: lichamelijk funktioneren, beperkingen veroorzaakt door fysieke gezondheid problemen, beperkingen veroorzaakt door emotionele problemen, sociaal funktioneren, emotioneel welzijn, energie/vermoeidheid, pijn & algemene gezondheid percepties] […] We selekteerden vrouwen voor deze studie. […] 49 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles voldeden aan de volgende criteria: 1) negatief voor HIV, AIDS en/of hepatitis-C, en 2) blanke non-obese vrouwen (BMI < 30) die geen immunomodulerende en/of epigenetisch aktieve medicatie gebruikten. […]

Isolatie en bewaring van PBMCs

[…]

DNA Extractie en zuivering van genomisch DNA

[…]

DNA-methyloom chips

[…]

Normalisatie en statistische analyses va, DNA-methyloom gegevens

[…]

DNA-methylatie validering via by bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

[…]

Dexamethason-suppressie test en verband met DNA-methylatie verschillen

[…]

Associatie tussen klinische gegevens en DNA-methylatie

[…]

Resultaten

RAND-36 scores significant lager bij M.E./CVS-patiënten

Globaal hadden de M.E./CVS-patiënten een lagere gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit dan de gezonde controles (significant lager voor 7 van 8 RAND-36 categorieën (alle p-waarden ≤ 0.05). Er waren geen verschillen qua gemiddelde leeftijd of BMI. […] Verdere analyse toonde een duidelijke scheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles […].

DNA-methyloom verschillen bij M.E./CVS

We vonden – na correctie voor leeftijd, BMI en verschillen qua in cel-proporties – 12.608 significant verschillend gemethyleerde loci in onze groep. 5.544 daarvan waren toegekend aan een gekend proteïne-coderend gen (UCSC Genome Browser). […] In termen van de richting van de methylatie-verschillen bij de M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, waren 71,6% van de differentieel gemethyleerde sites hyper-gemethyleerd en 28,4% hypo-gemethyleerd. […] Hoewel er geen significante verschillen waren qua proportie hypo-/hyper-gemethyleerde sites volgens genetische lokatie, waren er significante verschillen wat betreft deze proporties wanneer de afstand van een CpG-eiland in acht werd genomen. De hoeveelheid hyper-methylatie daalde naar gelang de afstand tot een CpG-eiland vergrootte. […]

Glucocorticoïden-gevoeligheid in PBMCs bij bij M.E./CVS-subgroepen

Globaal genomen was er een significant gemiddelde toename qua glucocorticoïden-sensitiviteit in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (p ≤ 0.05). Een visuele inspectie van de gegevens onthulde een bimodale verdeling van de glucocorticoïden-gevoeligheid binnen de M.E./CVS-groep: een GC-hypersensitieve groep (die een verhoogde respons op glucocorticoid-behandeling vertoonde t.o.v. de gemiddelde controle) en een GC-typische groep (die een respons vertoonde gelijkaardig met de gezonde controles). De verschillen qua GC-sensitiviteit waren niet geassocieerd met het type M.E./CVS-aanvang of de RAND-36 (scores voor de ganse vragenlijst of bepaalde categorieën; p > 0.10).

DNA-methylatie verschillen in dexamethason-test subgroepen via pyrosequentie-bepaling en permutatie-testen

Om het verband te bepalen tussen verschillen qua DNA-methylatie en glucocorticoïden-gevoeligheid, pasten we dezelfde statistische criteria toe die werden gebruikt om methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te identificeren toe op 3 verschillende vergelijkingen: 1) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch; 2) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles; en 3) M.E./CVS GC-typisch vs. controles. We vonden dat er geen methylatie-verschillen voldeden aan deze statistische criteria. Een groot aantal loci vertoonden echter significant nominale p-waarden ≤ 0.05 [De ‘significantie’ is een nominale p-waarde die de researcher selekteert als ‘cut-off’ punt voor het interpreteren of iets statistisch significant ka worden beschouwd of niet.]. Als alternatieve methodes voor statistische analyse van de 3 glucocorticoïden-gevoeligheid vergelijkingen, evalueerden we de verschillen die werden gevonden met de ‘450K array’ via 2 doelgerichte statistische methodes.

Wat betreft de pyrosequentie-bepaling analyse was onze strategie het selekteren van 3 loci die nominaal significante verschillen vertoonden tussen M.E./CVS GC-hypersensitief en M.E./CVS GC-typisch: 2 loci in JRK [gen coderend voor een proteïne lijkend op DNA-bindende proteïnen] & 1 locus in SLC6A4 [codeert voor de serotonine-transporter]. Deze sites werden gekozen om de betrouwbaarheid te onderzoeken van de ‘450K array’ om significante verschillen te detekteren zowel boven als onder de 5% cut-off die we implementeerden bij het zoeken naar significant differentieel gemethyleerde plaatsen bij M.E./CVS, en om DNA-methylatie verschillen te valideren die zowel potentieel gerelateerd zijn met GC-sensitiviteit verschillen, alsook uniek voor M.E./CVS. De JRK-sites weden geselekteerd voor de volgende redenen: ze waren bij de top sites in termen van verschil-grootte > 5% methylatie-verschil op de ‘450K array’ […] en ze lagen ook dicht bijéén in het genoom (5 bp uit elkaar), wat ons toeliet af te leiden hoe de DNA-methylatie status wordt gereflekteerd binnen hetzelfde gen-gebied. […] Na pyrosequentie-bepaling werden de JRK-sites significant verklaard (p ≤ 0.05) of ‘trending’ (p ≤ 0.10) naargelang de resultaten. Het < 5% nominaal significant verschil gevonden op de ‘450K array’ gegevens voor SLC6A4 was hier echter niet significant; wat er op wijst dat methylatie-verschillen < 5% op de ‘450K array’ niet op een betrouwbare manier werden gedetekteerd voor deze vergelijkingen.

Wat betreft de permutatie-analyse [een type statistische significantie-test] onderzochten we de mate van overlapping tussen de sites met een > 5% gemiddeld methylatie-verschil die nominaal significant waren op de ‘450K array’ […] en de sites die significant verschillende werden verklaard bij 10.000 permutaties. We vonden dat een meerderheid van de nominaal significanten ook significant waren volgens de permutatie-test: 76,8% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch, 84,5% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles, en 99,6% bij de vergelijking M.E./CVS GC-typisch vs. controles; wat er op wijst dat de meerderheid van de methylatie-verschillen die nominaal significant waren met > 5% gemiddeld methylatie-verschil waarschijnlijk differentiële methylatie reflekteerden.

Gezien deze resultaten implementeerden we de 5% verschil cut-off voor de verschillende dexamethason-test subgroep-vergelijkingen, en onderzochten sites die significant bleken […]. Om potentiële epigenomische loci geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit te bepalen, onderzochten we de overlap qua nominaal significante loci voor de 3 vergelijkingen. Er waren 5 sites die differentieel gemethyleerd waren bij de 3 vergelijkingen; één die correspondeerde met een coderend gen: NPAS3 [transcriptie-factorNeuronal PAS domain protein 3’], een gen betrokken bij neurogenese. We vonden 13 loci die differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles én M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch. Deze loci […] zijn waarschijnlijk geassocieerd met glucocorticoïden-gevoeligheid. De top 3 sites met de grootste verschillen bij vergelijking van M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch correspondeerden met GSTM1 [Glutathion S-transferase Mu 1] (14,3% verhoogde methylatie), MYO3B [myosine IIIB] (13,7% stijging) en GSTM5 [Glutathion S-transferase Mu 5] (12,0% stijging). Naast deze glucocorticoïden-sensitieve sites vonden we 4.699 loci die waarschijnlijk geassocieerd zijn met M.E./CVS, aangezien ze differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles en de M.E./CVS GC-typisch vs. controles vergelijkingen. GO-analyse van deze sites onthulde een aanrijking van differentiële methylatie bij M.E./CVS geassocieerd met regulerende processen, inclusief neuronale cel ontwikkeling, signaal-transductie, metabole regulering en transcriptie-regulering. Er waren 203 significant differentieel gemethyleerde sites die uniek waren voor M.E./CVS GC-typische individuen maar er waren echter geen GO-termen significant geassocieerd met deze sites.

Verbanden tussen differentieel gemethyleerde gebieden en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

Om het verband te onderzoeken tussen DNA-methylatie en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit […] onderzochten we gen-gebieden om potentiële epigenomische plaatsen te bepalen die een significante relatie vertonen met levenskwaliteit-scores. Na lineaire regressie analysis vonden we meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden met een > 5% methylatie-verschil (M.E./CVS en controles) die een significant verband vertoonden met de globale RAND-36 score. De top 5 differentieel gemethyleerde gebieden correspondeerden met TSS-methylatie [TSS = ‘transcription start site’; plaats waar de transcriptie start] in GRAMD1A [GRAM Domain Containing 1A’], ATP6V0E2 [ATPase H+ Transporting V0 Subunit E2’] & LOC144571 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne], en gen-‘body’ methylatie [in het gen zelf] in LOC401431 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne] & IL6R [IL-6 receptor].

Bespreking

In deze studie detekteerden we 12.608 differentieel gemethyleerde sites in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, sommige daarvan waren significant geassocieerd met scores van zelf-gerapporteerde levenskwaliteit. 71,6% van deze sites vertoonden hyper-methylatie bij M.E./CVS en de hyper-methylatie bleek te delen naar gelang de afstand van een CpG-eiland steeg; dit suggereert dat epigenetische ontregeling bij M.E./CVS significant varieert afhankelijk van de relatieve plaats t.o.v. CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. Binnen de groep M.E./CVS-patiënten zagen we 2 subgroepen op basis van de in vitro [‘in een proefbuis’] sensitiviteit voor blootstelling aan glucocorticoïden. Het verschil qua glucocorticoïden-gevoeligheid was geassocieerd met differentiële methylatie op 13 sites (op basis van vergelijkingen van differentiële methylatie bij M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. M.E./CVS GC-typisch en M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. gezonde controles).

DNA-methylatie modificaties in cellulaire processen/metabolisme-mechanismen bij M.E./CVS

Genen geassocieerd met cellulaire en metabole regulering waren belangrijke mechanismen met differentiële epigenetische profielen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Deze bevindingen zijn consistent met een eerder rapport van onze groep bij M.E./CVS-patiënten waarbij de ziekte plots startte [zie link/ref. in onze inleiding] en met andere rapporten over genomische, transcriptomische en metabolomische verschillen bij M.E./CVS [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U, Rajeevan MS. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-86 /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T, Rajeevan MS, Vernon SD, Horvath S. Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol. (2008) 2: 95 /// Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405 /// Naviaux RK, Naviaux JC, Li K, Bright AT, Alaynick WA, Wang L, Gordon E. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences (2016) 113: E5472-E5480], die een rol aangeven voor DNA-methylatie modificaties bij de metabole stress die wordt vastgesteld bij deze ziekte. Oxidatieve en nitrosatieve stress werden gedocumenteerd in immuuncellen van M.E./CVS-patiënten, en een daling van metabolieten van de elektronen-transport-keten suggereert een rol in de M.E./CVS-pathologie voor processen die de mitochondriale werking beïnvloeden. Er is een gekend verband tussen oxidatieve stress en epigenetische modificaties. DNA-beschadigingen zijn dikwijls het resultaat van oxidatieve stress, en deze beïnvloeden op hun beurt de epigenetische regulering, wat leidt tot afwijkende DNA-methylatie en gen-expressie patronen. Het is mogelijk dat oxidatieve stress, zoals in onze studie aangegeven door de verschillen gevonden in genen betrokken bij cellulaire en metabole regulering (inclusief ARL4C & HOXA11), sommige van de epigenetische veranderingen bij M.E./CVS kunnen aansturen. Er is echter bijkomend werk – zoals het karakteriseren van het effekt van ARL4C [‘ADP-Ribosylation Factor Like Protein 4C’] & HOXA11 [transcriptie-factor ‘Homeobox protein Hox-A11’] op DNA-methylatie patronen – vereist om dit verband te onderzoeken.

Genen geassocieerd met neuronale cel ontwikkeling bleken ook een belangrijke klasse genen met differentiële methylatie bij M.E./CVS-patiënten. Ten minste 2 eerdere studies die gen-expressie patronen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten onderzochten, rapporteerden ook significante verschillen voor genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling en regulerende processen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9]. Het is ook bekend dat genen die geassocieerd zijn met psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen rijke expressie-profielen vertonen in PBMCs [Vernon SD, Nicholson A, Rajeevan M, Dimulescu I, Cameron B, Whistler T, Lloyd A. Correlation of psycho-neuroendocrine-immune (PNI) gene expression with symptoms of acute infectious mononucleosis. Brain Res. (2006) 1068: 1-6]. DNA-methylatie verschillen op neuronale genen in PBMCs kunnen sommige centrale verschillen in psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen bij M.E./CVS weerspiegelen, zoals wordt gesuggereerd door de resultaten van onze glucocorticoïden-sensitiviteit test, die overéénkomen met werk dat perifeer bloed en immuuncellen identificeert als geschikte kandidaten die differentiële DNA-methylatie in het brein weerspiegelen.

Dexamethason-respons subgroepen bij bij M.E./CVS

We stelden een gemiddelde toename qua glucocorticoïden-gevoeligheid vast bij M.E./CVS-patiënten, die niet kon worden verklaard op basis van het type M.E./CVS-aanvang of levenskwaliteit. Daarnaast onthulde een meer gedetailleerd onderzoek van onze resultaten 2 subgroepen bij de M.E./CVS-patiënten. Er werd een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden geobserveerd in meerdere studies van de GC-responsen bij M.E./CVS. De aanwezigheid van een GC-typische en GC-hypersensitieve subgroep binnen onze M.E./CVS-groep komt dus overéén met de geobserveerde heterogeniteit van HPA-gerelateerde verschillen in deze eerdere rapporten.

Glucocorticoïden staan bekend om hun anti-inflammatoire effekten en worden typisch gebruikt om immuun-responsen te onderdrukken. Een ongepaste respons op behandeling met glucocorticoïden is echter geassocieerd met verhoogde vatbaarheid voor metabole en hart-ziekten. Onze resultaten op basis van PHA, een T-cel mitogen [molekule die een cel aanzet tot delen], als immuun-stressor gaven een funktionele stoornis qua T-cel GR-gevoeligheid bij GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten aan. Bijkomend bewijsmateriaal suggereert dat T-cellen kandidaten zijn voor een primaire immuuncel-populatie bij M.E./CVS-pathologie. Bv.: een GWAS [‘genome-wide association study’] vond significante verschillen qua polymorfismen geassocieerd met T-cel receptoren bij M.E./CVS-patiënten [Schlauch KA, Khaiboullina SF, Rawat S, Petereit J, Rizvanov AA, Blatt N, Mijatovic T, Kulick D, Palotas A et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry. (2016) 6: e730]. Daarnaast werden DNA-methylatie verschillen gerapporteerd in CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brenu EW, Staines DR, Marshall-Gradisbik SM. Methylation profile of CD4+ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228], een cel-populatie die een verhoogde dexamethason-sensitiviteit lijkt te vertonen bij M.E./CVS [Visser J, Blauw B, Hinloopen B, Brommer E, de Kloet ER, Kluft C, Nagelkerken L. CD4 T-lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4].

We vonden 13 sites geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit bij in GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten in vergelijking met zowel GC-typische M.E./CVS-patiënten als gezonde controles. Naar ons weten zijn er geen andere EWAS [‘epigenome-wide association study’] of GWAS studies die specifiek de epigenetische of genetische verschillen onderzochten in de context van GC-sensitiviteit. Genomische studies bij M.E./CVS hebben echter polymorfismen in GC-signalisering genen bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd. Interessant: deze genen lijken niet te overlappen met andere aandoeningen die worden gekenmerkt door verstoorde GC-signalisering [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Daarnaast was FKBP5 [gen met een rol bij post-traumatische stress, depressie en angst], een gen dat differentieel gemethyleerd bleek bij het syndroom van Cushing [hormonale aandoening gekenmerkt door een verhoogd gehalte aan cortisol in het bloed], niét bij de genen die in onze studie werden geïdentificeerd. De potentiële link tussen M.E./CVS en epigenetische modificatie van deze genen zou dus echter met voorzichtigheid moeten worden bekeken. Niettemin suggereren de resultaten dat epigenetische verschillen op deze sites nuttige informatie kunnen bieden betreffende geassocieerde GC-sensitiviteit bij sommige M.E./CVS-patiënten.

6 van de 13 sites waren onderdeel van coderende genen, 4 daarvan met rollen in het cellulair metabolisme. ‘Patatin Like Phospholipase Domain Containing 4’ (PNPLA4) is een fosfolipase dat een rol speelt bij het lipiden-metabolisme en sterk tot expressie komt in metabool aktief weefsel. PNPLA4 maakt ook deel uit van de PNPLA-familie, die aktiveert na interaktie met glucocorticoïden. D-aspartaat-oxidase (DDO) is een enzyme dat D-aspartaat en N-methyl-D-aspartaat, overvloedig aanwezig in neuro-endocrien weefsel, deaminiseert. Gen ‘knock-out’ studies over DDO in muizen hebben onthuld dat dit enzyme belangrijk is bij de produktie van melanocortinen [groep of peptide-hormonen] en betrokken is bij de regulering van basale corticosteron-waarden. Fosfodiesterase-1C (PDE1C) is verantwoordelijk voor de hydrolyse van cyclische nucleotiden, wat belangrijk is voor fysiologische regulering, calcium-signalisering mechanismen en circadiaans ritme. Stiudies met cel-culturen hebben getoond dat inhibitie van PDE1C […] resulteert in geïnhibeerde cel-proliferatie en dat PDE1C geaktiveerd wordt na behandeling met dexamethason.

De top 3 sites, op basis van grootte-verschillen tussen on GC-hypersensitieve en GC-typische (M.E./CVS & controle) individuen, correspondeerden met GSTM1, MYO3B & GSTM5 [zie eerder], die alle een > 10% toename van de methylatie vertoonden. GSTM1 & GSTM5 maken deel uit van de mu-klasse van de GST genen-familie, waarvan de primaire rol detoxificatie is van milieu- en exogene toxinen, specifiek polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Genetische polymorfismen in GSTM zijn gekende voorspellers van de potentiële respons op glucocorticoïden bij acute lymfoblastische leukemie, wat er op wijst dat GSTM een significante rol zou kunnen spelen bij glucocorticoïden-signalisering in immuuncellen. MYO3B is een ATPase dat geaktiveerd wordt door actine [onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en betrokken is bij kinase-aktiviteit. MYO3B en z’n meerdere interakties worden echter nog niet goed begrepen vergeleken met andere myosine-genen [van belang bij spier-samentrekking], zo dat het onduidelijk is hoe verschillen in MYO3B verband kunnen houden met glucocorticoïden-signalisering.

De 13 differentie gemethyleerde sites zouden als biomerkers voor of glucocorticoïden-hypersensitiviteit beschouwd kunnen worden maar er is echter nog bijkomend werk vereist om de funktionele impact van hyper-methylatie op deze genen en het verband met glucocorticoïden-signalisering te begrijpen en te bevestigen. Gen ‘knock-out’ en RNA ‘knock-down’ studies kunnen helpen bij het bepalen van de precieze impact die deze genen op glucocorticoïden-signalisering hebben. Het meten van mRNA-transcripten, methylatie-verschillen en proteïne-waarden van deze genen bij baseline, PHA-gestimuleerd en DEX-onderdrukt in vitro en in vivo, kunnen tot een beter begrip van de dynamiek die aan de basis ligt van GC-sensitiviteit verschillen bij M.E./CVS leiden.

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met levenskwaliteit-scores

We vonden meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden die significant geassocieerd waren met de globale RAND-36 score, waarbij variatie in methylatie in deze gebieden significant was geassocieerd met variatie in de globale RAND-36 score. De scores van deze vragenlijst kunnen wijzen in de richting van veranderingen in biologische systemen. Van de top 5 differentieel gemethyleerde gebieden [zie ‘resultaten’] vermelden we de volgende. ATP6V0E2 is een isoform van de H+-ATPase V0 e subunit (belangrijk is voor cellulaire energie [ATPases pompen protonen (H+) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types]), LOC401431 codeert de het antisense RNA voor ATP6V0E2 (suggererend dat de regulering-dynamiek van dit gen beïnvloed zou kunnen zijn bij M.E./CVS), IL6R codeert voor de IL-6 receptor (een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]) en LOC144571 is het antisense RNA [inaktiveert het mRNA] voor alfa-2-macroglobuline (een protease-inhibitor en cytokine-transporter). De lage ‘Physical Health’ scores bij de M.E./CVS-patiënten suggereren dat de lichamelijke stoornissen bij M.E./CVS geassocieerd zijn met een epigenetisch onevenwicht qua cellulaire energie, metabolisme en immuun-signalisering.

Besluiten

We rapporteren hier DNA-methylatie verschillen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, waarvan sommige significant geassocieerd waren met de globale levenskwaliteit alsook met glucocorticoïden-hypersensitiviteit in een subgroep M.E./CVS-patiënten. We bepaalden epigenetische loci geassocieerd met verschillen in glucocorticoïden-sensitiviteit die de onderliggende M.E./CVS-pathologie van sommige patiënten kan weerspiegelen. Er is bijkomend werk vereist om de mogelijke mechanistische verbanden tussen DNA-methylatie in deze genen, gen-expressie en proteïne-profielen, en M.E./CVS-fenotype te bevestigen. Er zijn longitudinale studies (zowel in vivo als in vitro) nodig om de stabiliteit te bepalen van deze epigenetische modificaties, inclusief veranderingen qua symptoom-profielen en in respons op behandeling met glucocorticoïden. Bv.: cytokines zoals IL-10 & IFN-gamma, die differentieel gemethyleerd bleken in onze studie, staan bekend om hun interaktie met GR en vertonen expressie-verschillen in vitro na dexamethason-behandeling [Visser J, Graffelman W, Blauw B, Haspels I, Lentjes E, de Kloet ER, Nagelkerken L. LPS-induced IL-10 production in whole blood cultures from Chronic Fatigue Syndrome patients is increased but supersensitive to inhibition by dexamethasone. J Neuroimmunol. (2001) 119: 343-9]. Hoewel GR-densiteit en binding-affiniteit in PBMCs van M.E./CVS niet lijken te verschillen qua ‘steady-state’ [evenwicht-toestand] condities, staat GR bekend om z’n upregulering tijdens inspanning bij M.E./CVS [Meyer JD, Light AR, Shukla SK, Clevidence D, Yale S, Stegner AJ, Cook DB. Post-exertion malaise in Chronic Fatigue Syndrome: symptoms and gene expression. Fatigue (2013) 1: 190-204]. Toekomstig werk zou DNA-methylatie signaturen moeten onderzoeken tijdens inspanning bij M.E./CVS om de dynamiek van glucocorticoïden-signalisering beter te kunnen begrijpen. Niettemin kunnen de differentieel gemethyleerde sites die in deze studie werden geïdentificeerd op z’n minst belangrijk zijn als biomerkers voor toekomstige klinische testen om te bepalen of epigenetische wijzigingen in deze genen verband houden met ziekte-aanvang of -progressie.

De resultaten van deze studie onderlijnen het potentieel nut van immuuncel-subtypering binnen de M.E./CVS-populatie en geven aan dat epigenetische gegevens kunnen helpen bij het ophelderen van relevante biologische mechanismen die bij M.E./CVS beïnvloed zijn. Klinisch onderzoek naar de regulering van het cellulair metabolisme is nodig om deze mogelijkheid te beoordelen, aangezien we vonden dat genen zoals GSTM1, MYO3B, GSTM5 & ATP6V0E2 significante epigenetische modificaties vertoonden bij M.E./CVS. Een beter begrip van M.E./CVS-subtypes zal patiënten en artsen helpen de geschikte interventies te bepalen om symptomen te behandelen en de gezondheid te verbeteren.

februari 1, 2017

Overzicht van het verband tussen vermoeidheid & genetische polymorfismen

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:28 pm
Tags: , , , , , ,

Bij de database-search door de auteurs van onderstaand overzicht van studies aangaande het verband tussen ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en vermoeidheid ontbreken een deel van de artikels die we op deze pagina’s (enter ‘SNP’ in ons zoek-venster) al meegaven (wellicht omdat ze na 2015 verschenen)… Er zullen naar o.i. nog SNPs opduiken die verband houden met vermoeidheid.

In dit overzicht vond men dat funktionele genetische variaties in mechanismen van neurotransmitter-regulering, HPA-as funktie en immuun-gemedieerde inflammatie een rol spelen bij het ontstaan van ‘CVS’. Het lijkt ons echter belangrijk te onderstrepen dat het onwaarschijnlijk is dat één enkel genetisch defekt verantwoordelijk is, maar dat daarentegen wellicht een interaktie tussen fouten in meerdere mechanismen aanleiding zullen geven of voorbestemmen tot de aandoening.

Naast de problemen die genetisch vastliggen, zullen omgevingsfactoren (epigenetica) ook een rol spelen. Een enkelvoudige/éénduidige factor voor het ontstaan van M.E.(cvs) lijkt ons te simpel. Lees daaromtrent ook: Landmark-Hoyvik H et al. The genetics and epigenetics of fatigue. PM & R: the journal of injury, function and rehabilitation (2010) 2: 456-465.

————————-

Brain, Behavior & Immunity (pre-print januari 2017)

A systematic review of the association between fatigue and genetic polymorphisms

Tengteng Wang (a,b), Jie Yin (b,c), Andrew H. Miller (d), Canhua Xiao (e)

a Department of Epidemiology, University of North Carolina at Chapel Hill Gillings School of Global Public Health, Chapel Hill, NC

b Department of Epidemiology, Emory University Rollins School of Public Health, Atlanta, GA

c Kaiser Permanente Northern California, Division of Research, Oakland, CA

d Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA

e School of Nursing, Emory University, Atlanta, GA

Samenvatting

Vermoeidheid is één van de meest courante en kwellende symptomen, leidend tot aanzienlijk afgenomen kwaliteit van het leven bij een grote groep patiënten met verscheidene aandoeningen. Vatbaarheid voor vermoeidheid kan beïnvloed zijn door genetische factoren zoals ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs), bijzonderlijk in de regulerende gebieden van relevante genen. Om verder het verband van SNPs met vermoeidheid in meerdere patiënten-populaties te onderzoeken, werd een systematische search in Pubmed, CINAHL, PsycINFO & de ‘Sociological Abstracts Database’ uitgevoerd op basis van met vermoeidheid gelinkte termen in combinatie met termen gerelateerd met polymorfismen of genetische variatie. Er voldeden in het totaal 50 artikels aan de inclusie- en exclusie-criteria voor deze analyse. Deze 50 werden verder geklassificeerd in 3 subgroepen: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), kanker-gerelateerde vermoeidheid (CRF) en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid. SNPs in regulerende mechanismen van immuun- en neurotransmitter-systemen bleken belangrijke rollen te spelen in de etiologieën van of CVS, CRF en met ander ziekten gerelateerde vermoeidheid. Er werd bewijsmateriaal onthuld voor associaties tussen verhoogde vermoeidheid en specifieke polymorfismen in de TNF-alfa, IL1b, IL4 en IL6 genen voor alle 3 de subgroepen. We vonden ook dat een reeks polymorfismen in de HLA, IFN-gamma, 5-HT & NR3C1 genen bij CVS & met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid; deze SNPs (met uitzondering van IFN-gamma) bleken echter niet adequaat onderzocht bij CRF. Hiaten in de kennis omtrent vermoeidheid-etiologie en aanbevelingen voor toekomstig onderzoek worden besproken.

1. Inleiding

Vermoeidheid is een courant symptoom dat moeheid, zwakte, gebrek aan energie en het onvermogen zich te concentreren omvat. Bij studies die de symptoom-prevalentie onderzoeken wordt vermoeidheid consistent in de top 3 gerapporteerd door patiënten met verscheidene ziekten. Vermoeidheid-symptomen kunnen een nadelig effekt hebben op sociale relaties, mentale gezondheid en dagelijkse aktiviteiten; en een uitgesproken daling qua globale kwaliteit van het leven veroorzaken bij ziekte en na behandeling. Ten behoeve van het verder begrijpen van de etiologie en pathofysiologie van vermoeidheid, kunnen vermoeidheid-symptomen worden gecategoriseerd in 3 belangrijke subgroepen: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), kanker-gerelateerde vermoeidheid (CRF) en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid.

[criteria]

Studies suggereren dat CVS, CRF en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid complexe aandoeningen zijn met een multi-factoriële etiologie waarbij meerdere mechanismen betrokken zijn. Hoewel CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid kwalitatief en kwantitatief van elkaar kunnen verschillen, kunnen ze ook biologische mechanismen voor aanvang en verslechtering of delen. Eerdere studies hebben getoond dat bij alle 3 het perifeer zenuwstelsel én het zenuwstelsel betrokken is. Daarnaast bestaat er een langdurige interesse naar de rol van het immuunsysteem bij de pathogenese en pathofysiologie van CVS en CRF, in het bijzonder de rol van inflammatoire cytokinen. Genetische componenten, zoals ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in immuun- en neurotransmitter-gerelateerde genen, werden dus onderzocht. SNPs zijn variaties van één basepaar in de DNA-struktuur die worden gevonden bij 1% of meer van de bevolking (het meest courante type genetische variatie). Ze worden gemeten via gentypering-technieken op DNA uit perifeer bloed. SNPs die worden gevonden in regulerende gebieden van genen (funktionele SNPs), inclusief promoters, intronen en onvertaalde gebieden, kunnen in veel gevallen de expressie van de gerelateerde gen-produkten, inclusief proteïnen, beïnvloeden, waardoor de mechanismen betrokken bij de vatbaarheid voor vermoeidheid mogelijks worden beïnvloed.

Polymorfismen specifiek voor de 3 subgroepen van vermoeidheid zijn niet goed bekend en geen enkele studie heeft SNPs geïdentificeerd die gemeenschappelijk zijn voor deze subgroepen. Een systematisch overzicht van de beschikbare literatuur zou kunnen helpen bij het verduidelijken van gedeelde etiologieën via het onderzoeken van potentiële gemeenschappelijke verbanden tussen genetische polymorfismen en de verschillende vermoeidheid-subtypes. Bovendien zou deze informatie kunnen bijdragen tot een beter klinisch management van vermoeidheid-symptomen via het vermijden van een onderschatting qua prevalentie en onder-behandeling door klinici.

2. Methodes

Er werd een literatuur-‘search’ uitgevoerd in Pubmed [‘US National Library of Medicine, National Institutes of Health’], CINAHL [‘Cumulative Index to Nursing and Allied Health Literature’], PsycINFO [‘American Psychological Association’] & de ‘Sociological Abstracts Database’, op basis van de volgende sleutelwoorden: vermoeidheid EN (‘single nucleotide’ polymorfismen OF genetische variatie). Om de specifieke bezorgdheden met betrekking tot kanker-gerelateerde vermoeidheid te adresseren, werden andere sleutelwoorden toegevoegd: (kanker OF gezwellen OF tumor OF oncologie) EN (gen OF ‘single nucleotide’ polymorfismen OF genetische variatie). […] Evaluatie gebeurde door 2 ‘reviewers’ en de artikels werden voor meer uitgebreide ‘review’ geselekteerd a.h.v. de volgende inclusie en exclusie-criteria:

Inclusie-criteria: 1) duidelijke focus op Chronische Vermoeidheid Syndroom, kanker-gerelateerde vermoeidheid en met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid; en 2) gegevens bevatten aangaande eender welk polymorfisme. Studies die individuen categoriseerden las vermoeid of niet (‘case-control’) en studies die vermoeidheid onderzochten als een continue variabele werden opgenomen.

Exclusie-criteria: 1) algemene overzichten, systematische ‘reviews’ en meta-analyse, editorialen, gevallen-studies en studies niet bij mensen uitgevoerd; 2) studies die niet focusten op de 3 types vermoeidheid; of 3) studies zonder gegevens over gen-polymorfismen.

[selektie-procedure]

De ‘Newcastle-Ottawa Scale’ (NOS) werd gebruikt ter beoordeling van de kwaliteit van niet-gerandomiseerde studies. De NOS bekijkt de kwaliteit in 3 domeinen: selektie van de studie-groepen, vergelijkbaarheid van de studie-groepen verzekering van de uitkomsten. […] Maximum totale score = 15 punten. […]

3. Resultaten

Er waren 50 artikels die voldeden aan onze inclusie- en exclusie-criteria, en deze werden gecategoriseerd in 3 subgroepen: CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Voor elke subgroep geven we een overzicht van onze bevindingen, de gerelateerde mechanismen en voorspelde effekten (indien mogelijk).

3.1. Chronische Vermoeidheid Syndroom

3.1.1 Overzicht

Er werden 16 artikels over CVS (gepubliceerd tussen 2003 & 2015) opgenomen in deze systematische ‘review’ (op basis van onze inclusie- en exclusie-criteria). Het aantal gevallen in deze studies varieerde van 35 tot 171. In 2 artikels werd het aantal controles niet gespecificeerd. Al deze studies gebruikten de 1994 Fukuda criteria [niet de striktere Canadese Consensus Criteria dus…] als definitie voor CVS. […] De gemiddelde kwaliteit-score was 7,5 (van 2 tot 13). De meest courante redenen voor lagere scores waren het niet vermelden van de methodes voor genotypering-blindering en onvoldoende beschrijving van verstorende factoren.

3.1.2 Mechanismen

Hoewel de pathofysiologische mechanismen voor CVS niet duidelijk zijn geïdentificeerd, leverden 12 van de 16 studies bewijsmateriaal ter ondersteuning van gen-gerelateerde mechanismen voor CVS. Deze mechanismen omvatten voornamelijk neurotransmitter-ontregeling (5 studies) (Fukuda et al. 2013; Narita et al. 2003; Smith et al. 2008; Smith et al. 2011; Sommerfeldt et al. 2011), hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as regulering (2 studies) (Lee et al. 2009; Rajeevan et al. 2007), inflammatoire/immunomodulerende responsen (4 studies) (Carlo-Stella et al. 2006; Carlo-Stella et al. 2009; Rajeevan et al. 2015; Smith et al. 2005) en andere mechanismen met betrekking tot metabolisme en uithouding (1 studie) (Vladutiu & Natelson 2004) [volledige referenties: zie verder]

3.1.2.1 Neurotransmitter-systeem – Het meest courante neurotransmitter-systeem gerelateerd met CVS was het serotonerg systeem. Een aantal polymorfismen in serotonine-transporters, receptoren en enzymen werden gelinkt met CVS. In een gevallen-controle studie [Narita M et al. Association between serotonin transporter gene polymorphism and Chronic Fatigue Syndrome. Biochemical and Biophysical Research Communications (2003) 311: 264-266] werd een polymorfisme in het ‘5’ upstream’ [vóór de initiatie-plaats van transcriptie] gebied van het serotonine-transporter gen (5-HTTLPR) geïdentificeerd bij CVS-patiënten maar niet bij controles. Daarnaast bleken 3 merkers gelegen in het 5-HT receptor subtype HTR2A geassocieerd met CVS [Smith AK et al. Genetic evaluation of the serotonergic system in Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology (2008) 33: 188-197]. Bijkomend bleken polymorfismen in de mono-amine synthetiserende enzymen, tyrosine-hydroxylase (TH) – dat dopamine [neurotransmitter] synthetiseert – en GTP-cyclohydrolase-I (GCH) – dat betrokken is bij het synthese-mechanisme van alle mono-amines [Mono-aminerge systemen – netwerken van neuronen mono-amine neurotransmitters gebruiken – zijn betrokken bij de regulering van cognitieve processen en bepaalde types geheugen.] – geassocieerd met de pathofysiologie van CVS [Fukuda S. et al. Association of monoamine-synthesizing genes with the depression tendency and personality in Chronic Fatigue Syndrome patients. Life Sciences (2013) 92: 183-186]. Er werd gevonden dat 2 polymorfismen in het adrenerg signalisering-mechanisme – inclusief de β2-adrenerge receptor en catechol-O-methyl transferase (COMT) dat noradrenaline kataboliseert – significant meer aanwezig bij CVS-patiënten […] [Sommerfeldt L et al. Polymorphisms of adrenergic cardiovascular control genes are associated with adolescent Chronic Fatigue Syndrome. Acta Paediatrica Norway (2011) 100: 293-298]. Tenslotte werden 2 genen betrokken bij andere neurotransmissie-systemen gevonden die geassocieerd zijn met CVS [Smith AK et al. Convergent genomic studies identify association of GRIK2 and NPAS2 with Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (2011) 64: 183-194], suggestief voor mogelijke rollen voor genen betrokken bij glutamaterge neurotransmissie en het circadiaans ritme.

3.1.2.2 Hypothalamus-Hypofyse-Bijnier as – NR3C1, een glucocorticoïd receptor [zie o.a. ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB] gen met een invloed op het reguleren van de werking van de HPA-as en glucocorticoïden (cortisol) concentraties in het bloed trok aandacht bij de exploratie van het pathologische mechanisme voor CVS. Er werden ondersteunende resultaten geobserveerd in een gevallen-controle studie [Rajeevan MS et al. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes, Brain and Behavior (2007) 6, 167-176]: 4 merkers van NR3C1 bleken significant geassocieerd met CVS. Verder werd in een studie (gebruikmakend van een geïntegreerde benadering om het verband te zoeken tussen genotype-variatie en ziekte) getoond dat NR3C1 SNPs sterk geassocieerd waren met CVS [Lee E et al. An integrated approach to infer causal associations among gene expression, genotype variation and disease. Genomics (2009) 94: 269-277].

3.1.2.3 Inflammatie & Immuun-respons – Immune ontregeling en inflammatoire reakties kunnen ook bijdragen tot CVS. Een studie die focuste op humaan leucocyten antigen (HLA) klasse-II allelen vond een significante associatie tussen HLA-DQA1*01 en CVS [Smith J et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. Journal of Clinical Pathology (2005) 58: 860-863]. Een andere studie [Carlo-Stella N et al. Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. International journal of Immunopathology and Pharmacology (2009) 22: 745-754] vond dat de combinatie van RAGE-374A [RAGE = receptor die ‘advanced glycation endproducts’ (AGEs; “beschadigde proteïnen of lipiden”) bindt], HLA-DRB1*1104 [HLA = humaan leukocyten antigen; histocompatibiliteit-antigen], RAGE-374A en HLA-DRB1*1301 geassocieerd was met CVS, terwijl bij afzonderlijke expressie deze varianten niet geassocieerd waren met de ziekte. Er werd gevonden dat DRB1*1104 een beschermende factor is bij enkele expressie. Daarnaast vond men dat het cytokine SNP TNF-308 sterk geassocieerd was met CVS [Carlo-Stella N et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma 874 rare alleles. Clinical and Experimental Rheumatology (2006) 24: 179-182]. Dit verband werd verder ondersteund door een andere studie die associaties tussen 32 inflammatie- en immuun-gerelateerde SNPs en CVS aantoonde [Rajeevan MS et al. Pathway focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome. Human Immunology (2015) 76: 553-560].

3.1.2.4 Andere mechanismen – In een gevallen-controle studie die de genetica van het spier-metabolisme en fysieke uithouding onderzocht, werd gevonden dat M647V [plaats van het SNP] op het DCP1 [mRNA-‘decapping’ enzyme; reguleert translatie & mRNA-verval] gen geassocieerd was met CVS bij veteranen van de eerste Golf Oorlog [Vladutiu GD & Natelson BH. Association of medically unexplained fatigue with ACE insertion/deletion polymorphism in Gulf War veterans. Muscle & Nerve (2004) 30, 38-43].

3.1.3 Voorspeld effekt

Terwijl de meeste studies tot doel hadden de associatie te onderzoeken tussen SNPs en CVS, exploreerden meerdere studies de voorspellende effekten van SNPs voor CVS. Eén studie [Goertzel BN et al. Combinations of single nucleotide polymorphisms in neuroendocrine effector and receptor genes predict Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2006) 7: 475-483] vond dat 28 SNPs gebruikt kunnen worden ter voorspelling van CVS met een accuraatheid van 76%. De meerderheid van de relevante SNPs waren gelegen in gebieden van TPH2, COMT of NR3C1. Een andere studie [Cifuentes RA & Barreto E. Supervised selection of single nucleotide polymorphisms in Chronic Fatigue Syndrome. Biomedica : Revista del Instituto Nacional de Salud (2011) 31: 613-621] vond ook een profiel van 13 SNPs ter voorspelling van CVS met een accuraatheid van 72,8%. De meerderheid van de polymorfismen geassocieerd met CVS traden op in 5-HTT en NR3C1. Bovendien vond een eerdere studie [Lin E & Hsu SY. A Bayesian approach to gene-gene and gene-environment interactions in Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2009) 10: 35-42] dat een gen-gen effekt waatbij NR3C1 is betrokken, en een gen-omgeving effekt van NR3C1 en geslacht belangrijke rollen kunnen spelen bij CVS. Om de klinische diagnostische betekenis te onderzoeken observeerden Shimosako N & Kerr JR [Use of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) to distinguish gene expression subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME). Journal of Clinical Pathology (2014) 67: 1078-1083] zagen dat 21 van 504 SNPs significant geassocieerd waren met CVS/ Myalgische Encefalomyelitis. De meeste waren gelegen in het ‘bone morphogenic protein-2-inducible protein kinase’ (BMP2K [coderend voor een kinase-enzyme]) gen, dat een belangrijke rol speelt bij skelet-ontwikkeling en patroon-vorming, en in het IL6ST gen [interleukine-6 signaal-transducer] (alias Glycoproteïne-130), dat codeert voor een trans-membraan proteïne als deel van type-I cytokine-receptor in de IL-6 receptor familie (dat de correcte ligand-binding en proteïnen-opvouwing verzekert).

3.2. Kanker-gerelateerde vermoeidheid

[…]

3.3. Met andere ziekten gerelateerde vermoeidheid

[…]

4. Bespreking

Het doel van deze systematische ‘review’ was om verband-patronen te bekijken tussen genetische polymorfismen en vermoeidheid (CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid), zowel individueel als collectief. We vonden dat funktionele genetische variaties (100% van de onderzochte SNPs in de associatie-studies waren funktioneel) in mechanismen van neurotransmitter-regulering, HPA-as funktie en immuun-gemedieerde inflammatie belangrijke rollen lijken te spelen in de etiologieën van CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Deze ‘review’ biedt empirische ondersteuning voor de associatie tussen funktionele polymorfismen in TNF-α, IL1b, IL4 & IL6 genen en verhoogde vermoeidheid voor alle 3 subgroepen van vermoeidheid. We vonden ook dat CVS een reeks polymorfismen in HLA, IFN-γ, 5-HT & NR3C1 genen deelt met andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid; deze SNPs (uitgezonderd IFN-γ) werden echter niet adequaat onderzocht bij CRF.

De bekeken studies tonen dat selekte neurotransmitter & HPA-as gerelateerde genen belangrijke rollen kunnen spelen bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Specifiek: polymorfismen in 5-HT, NR3C1, POMC, MAOA, MAOB, TPH2, COMT, GRIK2 & NPAS2 bleken allemaal geassocieerd vermoeidheid. 5-HT, een mono-amine neurotransmitter die de stemming, eetlust en slaap reguleert, werkt via interakties met 5-HT receptoren, en vermoeidheid en stemming-aandoeningen zouden gereguleerd kunnen worden via het wijzigen van de expressie van deze receptoren. De glucocorticoïd receptor NR3C1 medieert feedback binnen de HPA-as en beïnvloedt de concentratie van het glucocorticoïd cortisol, dat een impact heeft op het metabolisme, het immuunsysteem en de hersenen, alsook stress-gerelateerd gedrag. Aangezien zowel lage en hoge waarden circulerend cortisol verband houden met CVS, kunnen HPA-as gerelateerde genen CVS beïnvloeden [Cleare AJ. The HPA axis and the genesis of chronic fatigue syndrome. Trends Endocrinol. Metab. (2004) 15: 55-59]. Zoals in onze ‘review’ besproken, was er een waaier aan neurotransmitter en HPA-as gerelateerde genen, (inclusief POMC, MAOA, MAOB & THP2) geassocieerd met CVS en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Omwille van het feit dat deze polymorfismen niet ten volle werden onderzocht bij CRF, is het moeilijk te weten in welke mate specifieke neurotransmitters betrokken zijn. Toekomstige studies zijn vereist om het verband tussen neurotransmitter en HPA-as gerelateerde genen en CRF op te helderen.

De in de ‘review’ bekeken artikels onthullen dat de ontwikkeling van vermoeidheid wordt beïnvloed door immuun-ontregeling, waarbij specifieke funktionele SNPs en genotypes van TNFα, IL1b, IL4 & IL-6 bijdragen tot de verergering of het bestendigen van vermoeidheid. Cytokine gen-polymorfismen kunnen cytokine-produktie significant beïnvloeden. Deze bevindingen zijn consistent met eerdere studies die verbanden tussen cytokine-concentraties in het perifeer bloed en het voorkomen en de ernst van vermoeidheid hebben aangetoond. Een kwantitatieve ‘review’ suggereerde een positieve correlatie tussen vermoeidheid en circulerende concentraties van inflammatoire merkers. Belangrijker: genetische polymorfismen in deze mechanismen zouden een voorbestemdheid van de gastheer voor vermoeidheid kunnen aangeven [zie Carlo-Stella N et al. (2006) hierboven]. Bij de onderzochte cytokine SNPs was het GG-genotype van TNFα-308 het enige polymorfisme dat significant geassocieerd is met alle 3 de subgroepen van vermoeidheid. TNFα is een pro-inflammatoir cytokine betrokken bij de regulering van een brede waaier aan biologische processen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat een variatie in het TNF-α gen geassocieerd kan zijn met verschillen qua symptoom-frequentie en vermoeidheid-ernst. Deze hypothese was gebaseerd op bevindingen van klinische en experimentele studies bij mensen en dieren die suggereren dat tumor en/of ziekte-behandelingen verhoogde in vivo concentraties van TNF-α kunnen triggeren, die verder vermoeidheid via cytokine-regulering van de werking van het CZS beïnvloeden. Preliminair bewijsmateriaal suggereert ook dat de SNPs […] in IL-6 geassocieerd zijn met CRF tijdens en na behandeling. Belangrijk: deze SNPs werden niet bestudeerd bij CVS en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Er zijn ook studies die suggereren dat bepaalde SNPs in IL1b, IL1RN, IL4 geassocieerd zijn met HIV en vermoeidheid-symptomen na beroerte. Daarnaast werd getoond dat HLA-DR genen/gen-produkten een immuun-regulerende rol spelen bij resistentie tegen of vatbaarheid voor andere infektueuze agentia. Relevant in dit opzicht: HLA-DR polymorfismen werden gelinkt met andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid (zoals chronische Q-koorts).

Naast de hierboven besproken neurotransmitter-, HPA-as en immuun-mechanismen, omvatten de genen gelinkt met andere mechanismen geassocieerd met CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid: HFE C282Y, DCP1, ACE, APOE, OATP1C1, AHSG & POLDIP3. Meerdere studies suggereren dat het polymorfisme HFE C282Y geassocieerd zou kunnen zijn met vermoeidheid bij patiënten met Hereditaire Hemochromatose (HH). Hereditaire Hemochromatose is een erfelijke ziekte, die bekend staat als ijzer-overbelasting, gekenmerkt door ontregelde ijzer-absorptie. Het is geweten dat de mutatie van C282Y in het HFE gen zeer frequent voorkomt bij patiënten met HH en één van de meest courante klinische manifestaties bij HH is vermoeidheid. Er dient echter nog meer werk te worden gedaan om de associatie tussen HFE C282Y en vermoeidheid te bevestigen.

4.1 Beperkingen en richtingen voor de toekomst

We zijn beperkt wat betreft het trekken van sterke conclusies uit het hierboven besproken werk omwille van beperkingen bij de individuele studies en algemene hiaten in de kennis omtrent vermoeidheid.

Het eerste voorbehoud dat dient te worden besproken is dat de grootte van de groepen voor alle in deze ‘review’ opgenomen studies relatief klein was. Van de 50 artikels in ‘t totaal, waren er slechts 7 (14%) met een groep groter dan 500. Er zijn bijkomende studies met grotere groepen nodig om meer statistische ‘power’ te verkrijgen, in het bijzonder gezien het feit dat individuele SNPs waarschijnlijk slechts zwak geassocieerd zijn met het risico. Met grotere groepen kunnen ook meer subgroep- (stratificatie) analyses worden uitgevoerd om vermoeidheid en verschillen met gezonden (op basis van leeftijd, ras, geslacht, enz.) verder te onderzoeken.

Het tweede voorbehoud bij het besproken werk is dat bij veel van de studies een accurate definitie ontbreekt, in het bijzonder voor CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Bv.: van de 50 beschreven studies, waren er slechts 20 die vermoeidheid conceptueel definieerden. Het zou kunnen dat ongerijmdheden tussen studies, wat betreft beschreven associaties tussen vermoeidheid en genetische polymorfismen, gelinkt zijn met alternatieve definities van vermoeidheid, alsook verschillende vereiste duur van de symptomen. Bovendien: anders dan voor CVS, ontbreken voor kanker- en andere ziekten gerelateerde vermoeidheid duidelijke definities van vermoeidheid met betrekking tot duur en ernst. Daarnaast kunnen we – omwille van het feit dat de meeste studies betreffende CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid geen controle-groep (d.w.z.. zonder de diagnose van kanker of een andere ziekte) omvatten, niet bepalen of het verband tussen deze polymorfismen en vermoeidheid specifiek was voor de ziekte-diagnose en/of -behandeling. Vermoeidheid kan ook toepasbaar zij op individuen in de algemene bevolking die symptomen ervaren ten gevolge bv. stressvolle omstandigheden. Ten slotte: omwille van verschillen qua studie-ontwerpen (bv. gevallen-controle of niet), zouden de resultaten van deze ‘review’ met voorzichtigheid dienen te worden geïnterpreteerd. Bv.: studies gebruikmakend van gevallen-controle ontwerpen die deelnemers als vermoeid of niet categoriseren, zouden vooringenomen effekten van een SNP-vermoeidheid verband (ziekte-mis-klassificatie vooroordeel) kunnen genereren, vergeleken met studies die vermoeidheid-ernst als een continue variabele als primaire uitkomst gebruiken.

Het derde voorbehoud is dat slechts 28% van de studies een longitudinaal ontwerp gebruikten om de associaties tussen genetische variaties en vermoeidheid te onderzoeken. Er zijn meer longitudinale studies nodig om de rollen van ziekte-progressie en behandeling te beoordelen bij vermoeidheid bij grepen patiënten. Het is mogelijk dat andere genetische verbanden met vermoeidheid zullen opduiken als dezelfde analyses worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen van de ziekte of behandeling van een patient, aangezien klassificatie van ziekte-ernst met verloop van tijd kan veranderen.

Ten vierde: de meeste van deze studies gebruikten een kandidaat-gen benadering (alle genen en SNPs werden geselekteerd op basis van bestaande empirische literatuur en waren dus hypothese-gedreven) en daarom is het mogelijk dat sommige invloedrijke polymorfismen niet werden geïdentificeerd. Het valt op te merken dat er geen genoom-brede studies warden gevonden; dus bestaat er redelijke kans op vooringenomen bevindingen op basis van deze 50 artikels. Bijkomend: er werd geen uniform statistisch model gebruikt bij de geciteerde studies om SNPs-vermoeidheid associaties te beoordelen en dus werd ons oorspronkelijk plan voor een meta-analyse verhinderd. Bovendien was het gebruik van statistische methodes, om multipele vergelijkingen te maken, beperkt.

Ten slotte: ondanks alle hierboven vermelde bezorgdheden had onze ‘review’ 3 bijkomende beperkingen. Ten eerste: het zou kunnen dat we studies hebben gemist die nog aan de gang zijn en nog niet gepubliceerd. Ten tweede: hoewel we zochten in 4 openbare databases, zouden relevante studies gevonden kunnen geweest zijn gebruikmakend van andere databases of verschillende sleutelwoorden. Ten derde: we konden geen statistische analyse uitvoeren, aangezien er geen uniform genetisch statistisch model was gebruikt voor de studies, en er geen informatie die de verdeling van elke genotype of allel aflijnt die ons zou toelaten de SNPs-vermoeidheid associatie te bepalen/berekenen.

4.2 Sterktes

Selektie-vooringenomenheid is een frequente bezorgdheid bij observatie-studies wanneer deelname van de individuen gezamelijk afhangt van blootstelling en ziekte-status. De beoordeling van polymorfisme-prevalentie is echter niet onderhevig aan selektie-vooringenomenheid bij de veronderstelling dat genotype de participatie van individuen niet beïnvloedt […]. Dit is een sterkte van deze studies. Daarnaast verzamelden meer dan de helft van deze studies informatie betreffende belangrijke co-variabelen, waardoor niet-gemeten verstorende factoren werden verminderd.

5. Besluit

We vonden meerdere mogelijks belangrijke verbanden van SNPs gerelateerd met neurotransmitter-systemen, de HPA-as en immuun-gemedieerde inflammatie met vermoeidheid, inclusief CVS, CRF en andere ziekte-gerelateerde vermoeidheid. Ons overzicht suggereert een belangrijke rol voor cytokine SNPs in alle 3 de subgroepen van vermoeidheid. Daarnaast ondersteunt de ‘review’ het voortgezet gebruik van genetische en epigenetische perspectieven bij het beoordelen van de rol die neurotransmitters spelen bij persistente vermoeidheid bij kanker-overlevers. We bedenken dat de nieuwe kennis verkregen uit deze studies patiënten met CVS, kanker-overlevers en mensen met andere ziekten, en hun behandelaars en verzorgenden, kunnen helpen via de identificatie van specifieke genen met risico op vermoeidheid, […].

mei 27, 2016

NK-cellen & SNPs in ion-kanalen en receptor-genen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:19 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel is een integratie van resultaten betreffende TRP (‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’) en AChR (‘SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS’) gevonden in vol-bloed bij M.E.(cvs)-patiënten en het verder onderzoeken van deze bevindingen bij geïsoleerde NK-cellen. De lezer wordt aangeraden vooraf missschien ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ (en ev. andere artikels betreffende NK-cellen alhier ook nog eens na te lezen…

In essentie rapporteert men hier over abnormale genen coderend voor ion-kanalen & receptoren in (geïsoleerde) ‘natural killer’ cellen. Men legt uit, op basis hiervan, waarom NK-cellen (onderdeel van het immuunsysteem) bij M.E.(cvs) niet goed funktioneren. Deze genen worden ook niet enkel gevonden in NK-cellen en met stelt dat de anomalieën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor andere de andere symptomen van de ziekte.

Het research-team van het ‘National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases’ (NCNED) – waartoe deze onderzoekers behoren – blijken op termijn ook een screening-test op de markt te willen brengen op basis van “nieuwe merkers geïdentificeerd op witte bloedcellen”. Het is niet helemaal duidelijk of de hieronder beschreven SNPs daar ook onder vallen maar naar aanleiding van het persbericht daarover sprak Prof. Staines echter over “zeer specifieke delen van genen die coderen voor bepaalde receptoren of proteïnen die belangrijke rollen spelen bij het metabolisme, neuronale en cardiovasculaire funktie, enz.”. Wellicht zal het een combinatie zijn met de door deze onderzoeksgroep eerder gerapporteerde en gepatenteerde miRNAs…

————————-

Application of Clinical Genetics Vol. 9, pp 39-47 (2016)

Natural killer cells and single nucleotide polymorphisms of specific ion channels and receptor genes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Teilah Huth (1,2), Anu Chacko (1,2), Samantha Johnston (1,2), Pete Smith (2), Donald Staines (2)

1School of Medical Science, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases [NCNED], Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Samenvatting

Doelstelling Het doel van dit artikel is om de cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) cellen te bepalen, en te kijken of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en genotypes in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen en acetylcholine-receptoren (AChRs) aanwezig waren in geïsoleerde NK-cellen van patiënten die eerder de diagnose Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kregen.

Individuen en methodes Er werd een totaal van 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar oud) en 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar oud) in deze studie opgenomen. Patiënten kregen de diagnose op basis van de CDC criteria. Er werd flow-cytometrie aangewend om de NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Er werd een totaal van 678 SNPs in geïsoleerde NK-cellen onderzocht (voor 21 zoogdier TRP ion-kanaal genen en 9 zoogdier AChR genen […]). SNP-associatie en genotype werd bepaald […].

Resultaten M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua percentage lysis van doelwit-cellen door NK (17% ± 4,68%) t.o.v. de niet-vermoeide controle-groep (31% ± 6,78%). Van de 678 onderzochte SNPs, werden 11 SNPs voor TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) geïdentificeerd in de M.E./CVS-groep. 5 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3, terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8, TRPC2 & TRPC4 (P < 0.05). 14 SNPs bleken geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen: 6 met CHRNA3, de rest met CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5 & CHRNE (P < 0.05). Er werden 16 genotypes geïdentificeerd met SNPs in TRP ion-kanalen en AChRs voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1) (P < 0.05).

Besluit We identificeerden een aantal SNPs en genotypes voor TRP ion-kanalen en AChRs bij geïsoleerde NK-cellen bij patiënten met M.E./CVS, wat suggereert dat deze SNPs en genotypes betrokken kunnen zijn bij veranderingen qua NK-cel funktie en de ontwikkeling van M.E./CVS-pathologie. Deze anomalieën suggereren een rol voor de ontregeling van Ca2+ in AChR en TRP ion-kanaal signalisering in het pathomechanisme van M.E./CVS.

Inleiding

‘Natural killer’ (NK) cellen zijn granulaire [gekorrelde] lymfocyten die worden gevonden in het perifeer bloed, het beenmerg, de milt en in lymfeknopen. In het perifeer bloed beslaan NK-cellen 15% van de lymfocyten en ze kunnen worden gegroepeerd in 4 subtypes volgens de expressie op het cel-oppervlak en de densiteit van CD56 (neurale cel-adhesie molekule) en CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG). Deze fenotypes omvatten CD56brightCD16-/dim, CD56dimCD16bright, CD56dimCD16 & CD56CD16bright. Ongeveer 90% van de NK-cellen in het perifeer bloed zijn CD56dimCD16bright en de CD56bright beslaan ca. 10%. NK-cel cytotoxische aktiviteit vereist een aantal gereguleerde processen om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] van de doelwit-cel te verzekeren.

Hoewel er weinig is geweten over Ca2+-signalisering in NK-cellen, werd er gezien dat het granule-afhankelijk pad voor apoptose calcium-afhankelijk is, terwijl het ‘death’-receptor mechanisme dat niet is. Bij apoptose bleken het transport van lytische proteïnen, exocytose [proces waarbij een vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan samensmelten en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte] en fusie duidelijk calcium-afhankelijk. Ca2+ is ook vereist voor de her-oriëntatie van microtubules [buisvormige proteïne-strukturen die deel uitmaken van het cel-skelet] en het actine-skelet [het proteïne actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], alsook de aktivatie van cytokinen gen-transcriptie. Bovendien hebben studies aangetoond dat er een verband bestaat tussen calcium-mobilisatie en het stopzetten van de degranulatie in PLCγ2-deficiënte NK-cellen [PLC = fosfolipase; PLC-gamma is een belangrijke regulator van intracellulair Ca2+].

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen komen tot expressie op bijna alle cellen en hebben een significant effekt op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, zoals kanker, skeletale abnormaliteiten, pijn-syndroom, enz. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd bij aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen, en hebben een belangrijke rol bij Ca2+-signalisering.

Acetylcholine (ACh) bindt op 2 membraan-proteïnen, namelijk de muscarine receptor (mAChR) en de nicotine receptor (nAChR), waarvan meerdere isoformen bestaan. ACh heeft niet-neuronale funkties, het non-neuronaal cholinerg system genaamd, in pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, ooglens-cellen en vasculair endothelium [= bedekkende cellen van bloedvaten] van het brein, dat gemedieerd wordt door Ca2+-signalisering. AChRs brengen aktivatie-signalen over in een waaier van menselijke weefsels, inclusief skelet- en gladde spieren, alle pre-ganglionische [van het CZS tot de ganglia (zenuw-knopen)] autonome zenuw-vezels, post-ganglionische [van de ganglia naar een orgaan] autonome parasympathische zenuwen, en op veel plaatsen over gans het centraal zenuwstelsel.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) heeft een ongekende etiologie en er is geen specifieke diagnostische test. De ziekte wordt grotendeels gekenmerkt door significante stoornissen van de lichamelijke aktiviteit en uitputtende vermoeidheid, en kan gepaard gaan met stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie, meer spier- en gewricht-pijn, hoofdpijn, pijnlijke keel en lymfeknopen. Het is verder geassocieerd met ontregeling van het gastro-intestinaal, cardiovasculair en immuunsysteem. Belangrijk: NK-cel dysfunktie, in het bijzonder verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit, is een courante bevinding bij M.E./CVS-patiënten. We hebben eerder ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in TRP ion-kanaal genen (TRPM3, TRPA1, TRPC4) en AChR genen (CHRM3, CHRNA10, CHRNA5 & CHRNA2) in perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten. [Marshall-Gradisnik SM, Smith P, Brenu EW, Nilius B, Ramos SB, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in transient receptor potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights. (2015) 7:1-6 /// Marshall-Gradisnik S, Smith P, Nilius B, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms in acetylcholine receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights (2015) 7: 7-20; zie links onze inleiding] Deze SNP-anomalieën in genen coderend voor TRP ion-kanalen en AChRs kunnen gewijzigde receptor-proteïnen opleveren, die mogelijks de strukturen van TRP ion-kanalen en AChR, en ook hun funkties kunnen veranderen.

Het doel van deze studie was de NK cytotoxische aktiviteit te bepalen, alsook of SNPs en hun genotypes aanwezig waren in TRP ion-kanaal en AChR genen in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten.

Individuen en methodes

[…]

Resultaten

Deelnemers

Er waren 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar) waarvan 71,79% vrouwen. Er waren 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar) waarvan 56,67% vrouwen. […] Er werden geen significante verschillen gevonden qua tellingen van witte bloedcellen tussen M.E./CVS-patiënten en de niet-vermoeide controle-groep. […]

NK-cel zuiverheid

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft NK zuiverheid-graad. De zuiverheid van de NK-cellen na isolatie en aanrijking was > 93%.

NK-cel cytotoxische aktiviteit

Er was een significant verschil voor NK cytotoxische aktiviteit tussen de groepen wat betreft de E:T [effector/target’] ratio van 25:1 [de optimale verhouding voor het bepalen van de cytotoxische aktiviteit]. M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua NK percentage lyse van doelwit-cellen (17% ± 4,68%) vergeleken met de controle-groep (31% ± 6,78%).

SNP-analyse

Van de 678 SNPs geïdentificerd in TRP ion-kanaal and AChR genen van geïsoleerde NK-cellen, waren er 11 SNPs in TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) die significant geassocieerd waren met de M.E./CVS-groep. Daarvan waren er 5 geassocieerd met TRPM3 […] terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8 […] & TRPC4 […].

Er waren 14 SNPs geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen, waarvan er 6 met CHRNA3 […] en de rest met CHRNA2 […], CHRNB4 […], CHRNA5 […] & CHRNE […].

Genotype-analyse

Er werden 16 genotypes met SNPs geïdentificeerd die significant bleken voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1). Van de als significant geïdentificeerde SNPs gingen we verder na of genotypes verschilden tussen de groepen. […] De ‘odds ratio’s [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] voor specifieke genotypes met SNPs in TRP & AChR genen in geïsoleerde NK-cellen varieerde tussen 3.13 & 11.39 voor M.E./CVS vergeleken met de niet-vermoeide controle-groep.

Bespreking

Verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit werd eerder al gerapporteerd bij M.E./CVS en de studie hier ondersteunt deze bevindingen. Het huidig onderzoek ondersteunt nieuwe bevindingen aangaande een aantal SNPs in genen coderend voor AChR en TRP varianten en genotypes van geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Een bijkomende nieuwe bevinding is de identificatie van SNPs in TRPM3 & TRPM8 bij geïsoleerde NK-cellen, suggererend dat er TRPM3 & TRPM8 receptoren gelokaliseerd zijn op NK-cellen.

We rapporteren een significante reductie van de NK-lyse bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de niet-vermoeide controles. De rol van TRP ion-kanalen bij Ca2+-signalisering, en aangeboren en adaptieve immuun-cellen wordt meer en meer gedocumenteerd. De TRPs bleken TRP kation-kanalen [TRPC worden geaktiveerd door fosfolipase-C, membraan enzymen die fosfolipiden splitsen] en TRP-melastatine [TRPM; melastatine is een vermeende tumor-suppressor] subfamilies, voornamelijk TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPM2, TRPM4 & TRPM7 tot expressie te brengen. Deze kanalen zijn niet-selektief en doorlaatbaar voor calcium. Ca2+ speelt een sleutelrol bij fusie van lytische granules in NK-cellen, alsook bij het verzekeren dat lytische granules zich naar de immuun-synaps [de interface tussen een antigeen-presenterende cel of doelwit-cel en een lymfocyt zoals een effector-T-cel of NK-cel] verplaatsen om perforine en granzymes af te geven om doelwit-cellen te doden. Rho GTPase Miro [Mitochondriaal Rho GTPase; een enzyme met een belangrijke rol bij mitochondriaal transport, betrokken bij mitochondriale homeostase en apoptose] biedt een link tussen de mitochondrieën en de microtubules, waar het de Ca2+-afhankelijke stopzetting van de mitochondriale motiliteit medieert. Aangezien Miro mitochondriale polarisatie [ontstaan/opbouw van een spanningsverschil over de mitochondriale membranen] modificeert, zou het ook transport van lytische granules naar de immuun-synaps kunnen veranderen, alsook de lytische funktie, te wijten aan de modulatie door de Ca2+-concentratie in het cytosol via TRP-melastatine en AChR genen. Het is duidelijk: mitochondrieën spelen een belangrijke rol bij de werking van NK-cellen. De ontdekking dat mitochondrieën een waaier aan AChR-subtypes tot expressie brengen, inclusief nicotine-α3, die differentieel tot expressie komen naar gelang het weefsel-type, suggereert dat nAChRs een impact kunnen hebben op de mitochondriale funktie en regulering van oxidante stress. Interessant: we rapporteerden eerder een significante daling van de ‘respiratory burst’ [of ‘oxidative burst’; snelle afgifte van reaktieve zuurstof molekulen; speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem] funktie van neutrofielen bij M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW, Staines DR et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8:1; zie link onze inleiding]

TRPM2 en TRPM3 mobiliseren Ca2+, waarbij de laatste de Ca2+-signalisering bleek te mediëren voor polarisatie van cytolytische granules en degranulatie. [Na de herkenning van doelwit-cellen door NK-cellen worden NK-cel receptoren geaktiveerd, wat helpt bij de vorming van een immuun-synaps, waarbij cytolytische granules die perforine en granzymes bevatten, in dezelfde richting worden geleid.] […] Interessant is ook dat gelijkaardige bevindingen voor NK-cel funkties werden gerapporteerd in de M.E./CVS-research [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One. (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012)10: 88 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81], wat mogelijks suggereert dat de genotype-wijzigingen die hier werden gerapporteerd voor TRPM3 ook een gelijkaardige rol kunnen spelen bij polarisatie en degranulatie van cytolytische granules.

Van de 678 SNPs die werden onderzocht, waren er 11 varianten van TRP ion-kanalen en 14 varianten van AChRs die significant geassocieerd waren met M.E./CVS vergeleken met niet-vermoeide controles. De variante TRP-SNPs waren gelegen in de gen-sequentie van 2 [kanonieke] TRP ion-kanalen (TRPC2 & TRPC4) en 2 melastatine TRP ion-kanalen (TRPM3 & TRPM8). We rapporteren ook variante SNPs in genen coderend voor 2 van de CHRM3receptoren, 2 CHRM1receptoren, 6 CHRNA3receptoren, 3 CHRNA2receptoren en 1 CHRNA5receptor, alsook 1 CHRNB4-receptor en 1 CHRNE-receptor.

Deze research hier rapporteert significante SNP associaties van genotypes van AChRs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Lymfocyten brachten muscarine en nicotine AChRs tot expressie, T- en B-cellen en monocyten brachten alle 5 de subtypes van mAChRs (M1-M5) tot expressie, terwijl nAChRs werden gevonden voor α2-α7, α9, α10, β2 & β10 subunits. Lymfocyten maken deel uit van een cholinerg systeem dat onafhankelijk is van cholinerge zenuwen, wat resulteert in de regulering van de immuun-funktie. AChR-agonisten bleken lymfocyten-cytotoxiciteit te versterken en hun intracellulair cyclisch guanosine-monofosfaat [cGMP; een cyclisch nucleotide met een belangrijke rol in verscheidene biochemische processen in de cel, een zgn. secundaire boodschapper voor intracellulaire signaal-overdracht] en inositol-1,4,5-trifosfaat [IP3; secundaire boodschapper bij signaal-overdracht en lipiden-signalisering] te verhogen, wat suggereert dat het lymfocyten cholinerg systeem betrokken is bij de regulering van de immuun-funktie via AChRs gekoppeld met fosfolipase-C via veranderingen in Ca2+. Er is onderzoek dat het belang heeft benadrukt van varianten bij het beïnvloeden van gen-transcripten door het veroorzaken van alternatieve ‘splicing’ [splicing = tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.], wat resulteert in anomalieën in het boodschapper-RNA en translatie-produkten. We identificeerden ook SNPs en een genotype in CHRNE bij M.E./CVS-patiënten. Het is interessant dat deze SNP gelegen is in het 3’ onvertaald gebied [‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie], waar een bindingplaats is voor regulerende proteïnen alsook voor microRNAs (miRNAs). Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript. Onze eerdere research vond significante verschillen qua NK cytotoxische aktiviteit, alsook qua miRNAs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269]

[Uitleg voor experten =>] Onderzoeken hebben gesuggereerd dat alternatieve ‘splicing’ in de coderende en ook niet-coderende sequenties significante onverwachte resultaten wat betreft het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. Het ‘splicen’ van genetische varianten gelegen in de exonen & intronen en de assemblage van het spliceosoom [complexe cellulaire ‘machine’ met een rol bij gen-expressie] dragen allemaal bij tot het ‘splicing’-mechanisme voor het correct coderen van een proteïne-sequentie. Bovendien zijn ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] en ‘silencers’ [transcriptie-regulerende factoren die zorgen voor verlaging of volledige onderdrukking van de vorming van RNA] gelegen in de exonen of intronen een integraal deel bij de herkenning van de correcte exon-sequentie. Belangrijk is dat intronen in staat zijn aktieve spliceosomen te genereren, wat aanleiding geeft tot alternatieve ‘splicing’. Gen 80036 (TRPM3) is geassocieerd met calcium-binnenkomst en calcium-opslag depletie via verschillende isoformen die geïdentificeerd werden via alternatieve ‘splicing’. Een gebied dat onontbeerlijk is voor kanaal-funktie [‘indispensable for channel function’; ICF] is een gebied van 18 aminozuren waarvan de afwezigheid zorgt dat de kanalen funktioneel niet in staat zijn om calcium-binnenkomst te mediëren, en dat bleek te ontbreken in een TRPM3 variant. Co-expressie van deze TRPM3 ICF varianten met funktionele TRPM3 ion-kanalen toonde daarenboven verstoorde calcium-mobilisatie. Aangezien TRPM3 ICF varianten overvloedige expressie vertonen in vele weefsels en cel-types, en 15% van alle TRPM3 isoformen uitmaken, kan de expressie op NK-cellen een mogelijke verklaring bieden voor gedaalde cytotoxische aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten. Bepaalde ‘splice’-varianten, zoals TRPM3α1, kunnen mogelijks begunstigd zijn, culminerend in een gedaalde NK-cel cytotoxische respons en hitte-detektie, inclusief ontregeling van thermoregulerende responsen, nociceptie en transmissie van pijn, zoals centrale en perifere pijn-perceptie. Bovendien bleek TRPM8 ook geaktiveerd bij koude en schadelijke stimuli, wat suggereert dat de hier gerapporteerde genotype-wijzigingen overéénkomen met de klinische presentatie van thermoregulerende responsen, nociceptie, en transmissie van centrale en perifere pijn bij M.E./CVS-patiënten.

Onze resultaten suggereren dat SNP-varianten en genotypes gerapporteerd in NK-cellen wellicht niet exclusief zijn voor dit type immuun-cel. AChRs en TRP ion-kanaal receptoren komen overvloedig voor op meerdere cel-types en controleren andere funkties in lichamelijke systemen. Ca2+-signalisering in de context van TRP ion-kanalen en AChR-funktie is vitaal voor de werking van het centraal zenuwstelsel, en er is veel variëteit qua nicotine receptoren die tot expressie komen in dierlijke en menselijke immuun-cellen. Op te merken valt dat nAChRs betrokken bleken bij het wakker worden, slaap en vermoeidheid, alsook de funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie, die allemaal klinische symptomen bij M.E./CVS zijn.

Besluit

In deze studie identificeerden we, voor de eerste keer, SNPs in genen coderend voor TRPM3 en TRPM8 ion-kanalen in geïsoleerde NK-cellen. We identificeerden ook talrijke SNPs in nAChRs samen met andere TRP-kanalen in geïsoleerde NK-cellen, wat de belangrijke rol van het niet-neuronale ACh systeem bij NK-cel funktie zou kunnen verklaren. Anomalieën in genotypes van TRP ion-kanalen en AChRs suggereren dat veranderd calcium een belangrijke funktionele consequentie kan zijn, niet enkel voor NK-cellen maar ook afhankelijk van weefsel-type, vatbaarheid of voorbestemdheid voor M.E./CVS.

april 15, 2016

Mitochondriale DNA varianten correleren met symptomen van M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:49 am
Tags: , , ,

Maureen R. Hanson staat aan het hoofd van het Hanson Laboratorium, van de Afdeling Molekulaire Biologie en Genetica van de Cornell Universiteit. Een team onder haar leiding voerde onderstaande studie uit. Dit werk werd hoofdzakelijk ondersteund door het ‘Chronic Fatigue Initiative’.

Mitochondrieën zijn de sub-cellulaire organellen verantwoordelijk voor de aanmaak van ATP, de energie-bron van cellen. Mitochondrieën zijn opgebouwd uit molekulen die worden gecodeerd door het nucleair genoom (DNA dat zich in de nucleus, kern bevindt) alsook door het mitochondriaal genoom (een kleinere hoveelheid DNA aanwezig in elk van dit organel). Defekten in het mitochondriaal DNA kunnen leiden tot genetische aandoeningen. Het mitochondriaal genoom van gezonde mensen vertoont ook wat natuurlijke variatie – componenten van het mitochondriaal DNA verschillen soms tussen individuen – dat noemt men een SNP (‘single nucleotide polymorphism’, één enkel nucleotide verschilt). Dikwijls verschilt meer dan één SNP tussen een populatie van mensen en een andere. Deze verschillende types mitochondriale genomen, gebaseerd op een specifieke set SNPs, noemt men haplogroepen. Zelfs mensen wiens mitochondriaal DNA tot dezelfde haplogroep behoort, kunnen van elkaar omwille van variatie in bijkomende SNPs. Sommige mitochondriale SNPs bleken verband te houden met verscheidene kenmerken (bv. vatbaarheid voor diabetes of inflammatoire ziekten).

Wat het nog ingewikkelder maakt is dat er veel individuele mitochondrieën in dezelfde cel zijn en dus veel copieën van mitochondriaal DNA in elke cel. Soms ontstaan nieuwe mutaties zodat sommige copieën van het DNA in dezelfde cel (en dus bij dezelfde persoon) van elkaar verschillen. Dit wordt ‘heteroplasmie’ genoemd. Wanneer cellen groeien en vermenigvuldigen, kan er per toeval een ongelijkmatige verdeling van normaal tegenover abnormaal DNA in verschillende cellen ontstaan. Als mitochondriaal DNA met een schadelijke mutatie het overheersend type wordt in een bepaald weefsel, zullen ernstige symptomen ontstaan.

In de studie worden de volgende vragen gesteld: Waren er bij door 6 erkende experten geïdentificeerde M.E.(cvs)-patiënten mensen die een verkeerde diagnose kregen en eigenlijk aan een mitochondriale genetische ziekte leden? /// Dragen mensen met M.E.(cvs) meer copieën mitochondriaal DNA met schadelijke mutaties dan gezonde mensen (heteroplasmie)? /// Lijden mensen behorende tot één bepaalde haplogroep meer waarschijnlijk aan M.E.(cvs)? /// Ervaren mensen met bepaalde SNPs meer waarschijnlijk bepaalde symptomen of hebben ze ernstiger symptomen?

Er was bij geen enkele van de patiënten een aanwijzing voor mitochondriale ziekte. Men vond bovendien geen verschil in de mate van heteroplasmie, ook geen verhoogde vatbaarheid voor M.E.(cvs) bij individuen die tot bepaalde haplogroepen behoren of bepaalde SNPs vertoonden binnen een haplogroep. Er werden wel verbanden gevonden tussen bepaalde SNPs en een aantal symptomen en de ernst ervan. Dit betekent niet dat als je één van die SNPs in je mitochondriaal DNA hebt, dat je dan onvermijdelijk een bepaalt symptoom zult ervaren of dat dit bepaalde symptomen ernstiger zouden zijn. Individuen die drager zijn van dat SNP hebben wel een groter risico voor bepaalde types symptomen eens ze ziek worden.

De vraag is nu: hoeveel van de variatie in symptomen is het resultaat van hun verschillend nucleair en/of mitochondriaal materiaal, in plaats van de variatie qua uitlokkende oorzaak? Hanson heeft het op haar website over het raadselachtige van de diversiteit qua symptomen en variatie van de ernst ervan. Die verschillen zouden niet als bewijs mogen worden genomen voor het feit dat meer dan één aanval de ziekte kan initiëren, noch dat patiënten verschillende onderliggende problemen hebben. Het blijft mogelijk dat de diversiteit van de ziekte het resultaat is van genetische diversiteit eerder dan van het bestaan van meerdere fundamentele oorzaken.

Of mitochondrieën verstoord zijn bij M.E.(cvs) is nog niet definitief vastgesteld. Mitochondrieën kunnen direct of indirect aangestast zijn. Een stoornis in het metabolisme of de regulering van genen kan bv. verhinderen dat mitochondrieën behoorlijk werken. Theoretisch kunnen mitochondrieën aangetast zijn via een onbekend auto-immuun mechanisme.

Voor nog wat meer achtergrond: lees o.m. ook ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’, alsook ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’, alwaar Prof. Kerr en collega’s rapporteren dat 2 mtDNA-polymorfismen waarschijnlijk het risico op het ontwikkelen van meerdere “funktionele syndromen” bepaalt…

————————-

Journal of Translational Medicine (2016) 14: 19

Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Billing-Ross P, Germain A, Ye K, Keinan A, Gu Z, Hanson MR

Cornell University, Ithaca, NY, USA

Samenvatting

Achtergrond We stellen als hypothe dat mitochondriale dysfunktie voorkomt bij Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), een ziekte gekenmerkt door vermoeidheid, cognitieve problemen, pijn, malaise en inspanning-intolerantie. We onderzochten of het type haplogroep, ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) of heteroplasmie van mitochondriaal DNA (mtDNA) geassocieerd waren met gezondheid-status en/of symptomen.

Methodes Er werd sequentie-bepaling van (via PCR vermeervuldigd) mtDNA uitgevoerd om de sequentie en mate van heteroplasmie te analyseren van mtDNAs van 193 patiënten en 196 voor leeftijd en geslacht gematchte controles (DNA-stalen verzameld in het kader van het ‘Chronic Fatigue Initiative’). Er werd getest op mogelijke correlaties van mitochondriale sequenties en symptomen/ernst (gerapporteerd via de ‘Short Form-36’ en ‘DePaul Symptom Questionnaire’).

Resultaten Er waren geen individuen met M.E./CVS die gekende ziekte-veroorzakende mtDNA-mutaties vertoonden. De mate van heteroplasmie was laag bij alle individuen. Hoewel er geen associatie tussen mtDNA SNPs en M.E./CVS vs. gezonde status werd geobserveerd, waren de haplogroepen J, U en H alsook 8 SNPs bij M.E./CVS-patiënten significant geassocieerd met individuele symptomen, symptoom-clusters of symptoom-ernst.

Conclusies Analyse van mitochondriale genomen bij M.E./CVS-patiënten geeft aan dat individuen van een bepaalde haplogroep of drager van specifieke SNPs meer waarschijnlijk bepaalde neurologische, inflammatoire en/of gastro-intestinale symptomen vertonen. Er werd geen toegenomen vatbaarheid voor M.E./CVS geobserveerd bij mensen met bepaalde mitochondriale genomen of SNPs.

Achtergrond

[…] Mitochondriale dysfunktie bleek betrokken bij M.E./CVS in meerdere studies. Een onderzoeksteam publiceerde 3 studies over M.E./CVS die rapporteerden over verstoorde mitochondriale aktiviteit in neutrofielen (via een indirecte test voor oxidatieve fosforylatie d.m.v. ATP-meting) [Myhill S et al. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – a clinical audit. Int J Clin Exp Med. (2013) 6: 1-15]. Interpretatie van neutrofiel-studies is moeilijk omwille van het feit dat neutrofielen minder mitochondrieën hebben dan spiercellen of andere types bloedcellen. In tegenstelling tot de neutrofiel-analyses, rapporteerden 2 research-groepen er geen detekteerbare verschillen waren tussen de aktiviteiten van mitochondriale complexen die ze testten in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93; zie ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS]. Er werden geen ultrastrukturele abnormaliteiten geobserveerd in mitochondrieën van spieren van M.E./CVS-patiënten (via elektronen-microscopie) [Plioplys AV, Plioplys S. Electron-microscopic investigation of muscle mitochondria in Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (1995) 32: 175-81]. Een andere groep maakte echter melding van normale mitochondriale aktiviteit maar gedaalde mitochondriale inhoud in skelet-spieren van M.E./CVS-patiënten [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Bovendien noteerden 2 studies een lagere coenzyme-Q inhoud in bloedcellen of plasma van M.E./CVS-patiënten [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antiox. Redox Sig. (2013) 19: 1855-60; zie ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?].

De literatuur betreffende bio-energetische funktie van hart- en/of skelet-spier (geanalyseerd via magnetische resonantie spectroscopie) bij M.E./CVS is ook tegenstrijdig: sommigen rapporteren abnormaliteiten bij M.E./CVS-patiënten, terwijl anderen een normale werking aangeven [Hollingsworth KG, Newton JL et al. Impaired cardiovascular response to standing in Chronic Fatigue Syndrome. Eur J Clin Invest. (2010) 40: 608-15 zie ‘Verstoorde cardiovasculaire respons op staan bij CVS’ /// Lane RJ et al. Heterogeneity in Chronic Fatigue Syndrome: evidence from magnetic resonance spectroscopy of muscle. Neuromuscul Dis. (1998) 8: 204-9 /// Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-22 /// McCully KK, Natelson BH et al. Blood flow and muscle metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Sci. (2003) 104: 641-7 /// McCully KK, Natelson BH et al. Muscle metabolism with blood flow restriction in Chronic Fatigue Syndrome. J Appl Phys. (2004) 96: 871-8]. Het kan zijn dat slechts een deel van de gevallen abnormaliteiten vertonen, die daardoor niet opgepikt worden wanneer de grootte van het staal beperkt is. Ofwel kunnen mitochondriale defekten of problemen qua bloeddoorstroming in de spieren resulteren in abnormale bevindingen in spectroscopische studies.

Er is weinig informatie beschikbaar betreffende de mitochondriale genomen van individuen met M.E./CVS. Bepaalde variaties in menselijke mitochondriale genomen bleken geassocieerd met verschillende fenotypes zoals klimaat-aanpassing, tolerantie voor grote hoogte en obesitas, of verhoogde of verminderde vatbaarheid of ernst van medische problemen zoals (o.a.) diabetes, sepsis, beroerte, Alzheimer’s & Parkinson’s, en hypertensie.

Menselijke populaties hebben overgeërfde polymorfismen die verschillende mitochondriale DNA (mtDNA) haplogroepen vertegenwoordigen. Het effekt van een nucleotide-polymorfisme kan variëren afhankelijk van het mitochondriaal genoom waarin het ontstaat. Het testen van de verbanden met het type haplogroep is daarom waardevol bij het analyseren van de rol van mtDNA-polymorfismen bij metabole ziekten. Bijvoorbeeld: een dergelijke aanpak werd gebruikt bij de ontdekking dat mitochondriale haplogroep-N9 bijdraagt tot resistentie tegen type-II diabetes bij Aziaten. Een studie bij individuen met Europese haplotypes bepaalde of 2 SNPs in een patiënten-groep al dan niet geassocieerd waren met symptomen en rapporteerde een verband van 1 SNP met pijn, chronische vermoeidheid en abnormale gastro-intestinale motiliteit [Boles RG et al. Hurt, tired and queasy: specific variants in the ATPase domain of the TRAP1 mitochondrial chaperone are associated with common, chronic “functional” symptomatology including pain, fatigue and gastro-intestinal dysmotility. Mitochondrion (2015) 23:64-70]. Een andere studie van mitochondriale genomen bij 162 M.E./CVS-patiënten met haplogroep-H rapporteerde een verband tussen ziekte met een SNP [Boles RG et al. Increased prevalence of two mitochondrial DNA polymorphisms in functional disease: are we describing different parts of an energy-depleted elephant? Mitochondrion (2015) 23:1-6; zie ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS].

Er zijn geen onderzoeken aangaande de heteroplasmie (aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom) bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Er kunnen somatische mutaties [somatische of lichaam-cellen; hun erfelijk materiaal wordt niet aan de volgende generatie doorgegeven] in mitochondriale genomen voorkomen en het is geweten dat de effekten bij het ouder-worden zich opstapelen of vermeerderen. Door het verkrijgen van volledige mitochondriale genoom-sequenties uit cellen van M.E./CVS-patiënten en een voor leeftijd gematchte groep, is het mogelijk om te bepalen of patiënten meer somatische mutaties (dan verwacht) hebben in mitochondriaal DNA. Een onderzoek naar heteroplasmie in mitochondriaal DNA van 1.085 [gezonde] individuen vond dat 90 % ten minste één variant genoom droeg en 20 % had sequentie-varianten die bekend staan als pathogeen. De frequentie van pathogene genomen in een individu kan worden onderzocht via sequentie-bepaling van mitochondriaal DNA, om zo te bepalen of een drempel werd bereikt waarbij ziekte duidelijk wordt.

Heteroplasmische pathogene mutaties kunnen ook worden doorgegeven via de kiemlijn [kiem- of geslacht-cellen bevatten de helft van de chromosomen van een somatische cel], wat leidt tot mitochondriale ziekte als het aandeel mutante genomen voldoende groot is geworden om de werking te verstoren. Bijvoorbeeld: de m.3243A>G mutatie kan mitochondriale encefalopathie met lactaat-acidose en beroerte (MELAS) veroorzaken wanneer de frequentie hoger is dan 59 %.

We ondernamen een studie van de mitochondriale genomen in een groep van voor geslacht en leeftijd gematchte M.E./CVS-patiënten en controles van overwegend Europese origine. We voerden ‘next-generation’ sequentie-bepaling uit om de mtDNAs van de individuen te karakteriseren wat betreft haplotype, SNPs en heteroplasmie. We deden associatie-testen om te bekijken of SNPs significant verband hielden met de M.E./CVS-status of met bepaalde symptomen en hun ernst in de patiënten-groep.

Methodes

[…]

Resultaten

Alle individuen kwamen uit een grote studie ondersteund door het ‘Chronic Fatigue Initiative’ (CFI) [Klimas NG et al. Findings from a clinical and laboratory database developed for discovery of pathogenic mechanisms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Fatigue (2015) 3: 75-96]. De individuen kregen een diagnose via artsen gespecialiseerd in M.E./CVS en voldeden aan de Fukuda criteria en/of de Canadese consensus criteria. […]

Causale mitochondriale ziekte varianten

Gemiddeld waren er 23,2 ± 11,3 SNPs bij de patiënten en 25,8 ± 12,4 bij controles t.o.v. de Cambridge referentie-sequentie. Polymorfismen die werden gezien in de consensus-sequenties van alle individuen werden vergeleken met de MITOMAP database (gerapporteerde, met ziekte geassocieerde mutaties) om te bepalen of er individuen waren met ziekte-veroorzakende mtDNA SNPs. Er werd slechts één bekende mitochondriale ziekte-veroorzakende substitutie geobserveerd bij de patiënten en controles. Er werd een T14484C substitutie [omwisseling van een nucleotide] gevonden bij een gezonde controle (wordt gezien bij individuen die ‘Leber’s erfelijke optische neuropathie’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast] ontwikkelen). Er werden geen andere ziekte-veroorzakende mtDNA-varianten gezien.

Zeldzame varianten associate-analyse

Om het effekt te bepalen van de totaal-mtDNA variatie inclusief courante en zeldzame varianten, vergeleken we de cumulatieve pathogeniciteit [ziekteverwekkend vermogen] tussen controles en M.E./CVS-individuen. Voor elke mtDNA-variant in een individu werd een ruwe pathogeniciteit-score verkregen uit de vrij beschikbare CADD-database [‘comined annotation dependent depletion’, CADD; score voor de schadelijkheid van ‘single nucleotide’ varianten of insertie/deletie varianten in het menselijk genoom]. Er werd een gemiddelde CADD-score berekend voor elk individu door de cumulatieve CADD-score van een individu te delen door hun aantal variant-plaatsen. De verdeling van de gemiddelde CADD-scores werd vergeleken tussen patiënten en controles […]. Er was geen significant verschil in de verdeling van gemiddelde CADD-scores tussen patiënten en controles.

Analyse van haplogroep met ziekte-status

De grote meerderheid van de individuen in de studie (90,1 %) droeg mtDNA-haplogroepen die courant voorkomen in nakomelingen van Europese afkomst, zoals werd verwacht gezien de groep > 96 % blank was. De sterkst vertegenwoordigde haplogroepen waren H (39,1 %), U (15,4 %), T (10,6 %), K (9,1 %) & J (5,6 %). De rest van de haplogroepen vertegenwoordigt nakomelingen verspreid over Azië en Amerika (5,5 %) en deze die courant zijn in Afrika (4,3 %).

Vergelijking van de verdeling van de haplogroepen toonde geen significant verschil tussen patiënten en controles. Daarnaast deden we afzonderlijke [statistische] testen bij elke individuele belangrijke haplogroep-categorie. Dit onthulde een nominaal-significante aanrijking van haplogroep-T (HgT) bij controles versus patiënten; wat een mogelijks beschermend effekt van HgT tegen M.E./CVS zou kunnen suggereren. [De nominale significantie is niet hetzelfde als de eigenlijke significantie maar uitleg zou een cursus statistiek vergen…].

We analyseerden ook de haplogroep-verdelingen in vrouwen en mannen afzonderlijk. We zagen een nominaal-significante aanrijking van HgT bij de vrouwelijke controles maar geen verbanden bij mannen.

Analyse van haplogroep en symptomen

Na geen belangrijk verband met ziekte te hebben gezien, testten we voor haplogroep-associatie met 270 verschillende symptoom-scores uit SF-36 [Medical Outcomes Survey Short Form-36’; zelf-rapportering vragenlijst over de algemene gezondheid] en DSQ [DePaul Symptom Questionnaire’; zelf-rapportering vragenlijst over de frequentie en ernst van 54 symptomen specifiek voor CVS] bevragingen. Omdat veel van de symptomen gerelateerd zijn met of afhankelijk van elkaar, pastten we geen multipele-test correctie […] toe. Er waren enkel Europese haplogroepen aanwezig met een frequentie groot genoeg om opgenomen te worden in deze analyse, en HgJ, HgU & HgH vertoonden allemaal significante verbanden […]. Als we individuele associatie-testen uitvoerden […], vonden we 6 significante associaties tussen mitochondriale haplogroepen en klinische fenotypes vastgesteld via de ‘DePaul Questionnaire’. Alle significante associaties waren met symptomen gerelateerd met gewricht-pijn, opgeblazen gevoel of “zich op voelen” na inspanning. Haplogroep-J vertoonde een beschermend effekt tegen alle metingen voor gewricht-pijn en individuen behorend tot haplogroep-U rapporteerden minder ernstig opgeblazen gevoel […]. Anderzijds hadden M.E./CVS-individuen met haplogroep-H de neiging meer vatbaar te zijn voor “zich op voelen” na inspanning dan andere haplogroepen.

Analyse van het verband tussen enkelvoudige merkers en ziekte

De meerderheid van variabele mtDNA-plaatsen (SNPs) in onze data-set waren ‘enkelingen’ – slechts één individu droeg de variante allelen, deze werden niet opgenomen in de associatie-analyse. 70 mtDNA-SNPs voldeden aan onze minimum ‘minor’ [minst voorkomend] allel frequentie-drempel van 5 % [geeft informatie over courante en zeldzame varianten in een populatie] en werden opgenomen in de associatie-testen met demografische en symptomatische variabelen geassocieerd met M.E./CVS.

Er werd ‘single marker association testing’ [vergelijkt frequenties van bepaalde allelen of genotypes] toegepast voor het bepalen van SNP-associaties met de aandoening van individuen (gezonde controles of M.E./CVS-patiënten). Van de 70 SNPs, bleken er 10 nominaal significant maar geen enkele bleken significant na multipele test correctie. Bij de M.E./CVS-patiënten, bekeken we ook SNP-associaties met acute of graduele aanvang van de ziekte en vonden geen significante verbanden. In een poging om rekening te houden met mtDNA genetische achtergrond en de individuele SNP-effekten meer accuraat te meten, werden SNP-associaties gemeten in de subgroep individuen met haplogroep-H (HgH). Idealiter zouden SNP-associaties moeten worden gemeten voor alle haplogroepen maar gezien de [beperkte] grootte van ons staal was HgH echter de enige haplogroep waar associatie-analyse doenbaar was. Van de 151 HgH-individuen waarvan klinische gegevens beschikbaar waren, vertoonden geen van de 18 SNPs die voldeden significante verbanden met M.E./CVS t.o.v. gezonde status.

De prevalentie van M.E./CVS en met vermoeidheid gerelateerde syndromen is hoger bij vrouwen. Daarnaast zijn – omwille van het maternaal overerving-patroon van mtDNA – mitochondriale varianten onderhevig aan geslacht-specifieke selektie, wat kan leiden tot een verschillende fitness bij vrouwen en mannen. Om rekening te houden met mogelijke geslacht-verschillen, werden onafhankelijke SNP-associatie testen op basis van geslacht uitgevoerd maar dit toonde geen verbanden.

Analyse van het verband tussen enkelvoudige merkers en symptomen

Er werd dan ‘single-marker association testing’ toegepast op symptoom-scores zoals voor de haplogroep-associatie analyse. Er bleken 8 mtDNA-SNPs geassocieerd met 16 symptoom-categorieën. De significante SNPs lagen op mtDNA-posities 150, 930, 1719, 3010, 5147, 16093, 16223 & 16519. SNPs 930 & 5147 delen één associatie terwijl 3010, 16093 & 16223 elk geassocieerd waren met 2 verschillende symptomen. 5 symptomen beleken geassocieerd met 16519, 150 was geassocieerd met 4 symptomen en 1719 met 7 symptomen. […].

Allel 150T was geassocieerd met lagere gezondheid-scores met betrekking tot emotionele beperkingen, werk-geschiktheid en -prestaties (SF-36 vragenlijst M.E./CVS-patiënten). Allelen 930G & 5147G waren geassocieerd met grotere moeilijkheden bij het uitvoeren van werk. Het 1719A allel was geassocieerd met hogere symptoom-scores in 7 categorieën (inflammatie & neuro-inflammatie; DSQ vragenlijst M.E./CVS-patiënten). De 2 significante verbanden van 16223T met neuro-inflammatoir lijden en frequentie van gevoeligheid voor helder licht overlapten met dezelfde symptomen die geassocieerd waren met 1719A. Patiënten met 3010A vertooden meer frequent een slaap-aandoening. Lichamelijke aktiviteiten waren meer beperkt bij patiënten met 16093T. De aanwezigheid van 16519C was geassocieerd met ernstiger gastro-intestinale symptomen (opgeblazen gevoel en abdominale pijn). […]

Heteroplasmie-analysis

Een mitochondriale heteroplasmie komt voor wanneer een individu mtDNA-copieën met verschillende allelen draagt. Heteroplasmieën kunnen voorkomen door somatische mutatie of maternale overerving […]. Er wordt gedacht dat mitochondrieën door een kiemlijn ‘flessehals’ gaan die de frequentie reduceert van heteroplasmieën overgedragen van moeder naar kind. Als heteroplasmieën echter een kritieke frequentie binnen een weefsel of individu bereiken, kunnen ze potentieel pathogene effekten hebben. De accumulatie van heteroplasmieën tijdens het ouder-worden kan ook bijdragen tot de variabele aanvang-leeftijd die wordt gezien bij verscheidene energie-ziekten.

Om de rol van heteroplasmie bij M.E./CVS te onderzoeken, voerden we een omvangrijke sequente-bepaling uit om heteroplasmieën aanwezig bij M.E./CVS-patiënten te identificeren en te analyseren. Er werd een gemiddelde van 1,42 heteroplasmieën per individu gezien (t.o.v. slechts 1,28 bij controles). Om rekening te houden met het feit dat het aantal plaatsen dat voldeed aan onze criteria om het een heteroplasmie te noemen varieerde tussen de stalen, berekenden we echter hat aantal heteroplasmieën per bruikbare plaats per individu (HPUI) en gebruikten dat bij de vergelijking. […] Er werd een statistische test gebruikt om de verdeling van HPUI te vergelijken tussen patiënten met acute aanvang van M.E./CVS versus geleidelijke aanvang, en er was geen significant verschil (p = 0.30). Aangezien cytokine-profielen van M.E./CVS-patiënten bleken te verschillen met het verloop van de ziekte [Hornig M, Montoya JG, Klimas NG et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: e1400121; zie ‘Afzonderlijke immuun-signaturen bij vroege & late M.E.(cvs)], werd HPUI ook vergeleken tussen individuen met M.E./CVS van langer dan 3 jaar of minder en meer dan 3 jaar. Er was geen significant verschil.

Een vergelijking van de frequentie van heteroplasmische allelen onthulde dat zeer weinig heteroplasmieën voorkomen bij patiënten of controles. Van de 406 verschillende heteroplasmieën die werden geobserveerd bij patiënten en controles, was de gemiddelde heteroplasmie aanwezig bij slechts 1,23 ± 0,85 individuen en 353 heteroplasmieën werden slechts gevonden bij één enkel individu. De meest courante heteroplasmie was aanwezig bij 7 individuen.

Bespreking

Onze sequentie-bepaling van het compleet mitochondriaal genoom van patiënten onthulde dat er geen individuen in deze groep waren met genetische mitochondriale ziekte te wijten aan gekende mtDNA-mutaties, die de diagnose M.E./CVS verkeerdelijk zouden hebben gekregen. De specialisten die de patiënten selekteerden hebben dus geen patiënten met een gekende mitochondriale ziekte verkeerdelijk toegelaten.

Onze studie onderzocht associaties tussen mtDNA-variatie en demografische variabelen zoals M.E./CVS-status, acute aanvang en ziekte-duur. We vonden een correlatie tussen haplogroep en sommige symptomen gerelateerd met gewricht-pijn, opgeblazen gevoel en uitputting na inspanning. De meeste studies van mitochondriaal DNA en ziekte hebben betrekking tot de verhoogde of verlaagde vatbaarheid met de ziekte afhankelijk van de haplogroep of variant, eerder dan met verschillen qua type symptomen of hun ernst. Er zijn echter enkele ziekten waarbij haplogroep geassocieerd bleek niet om de kans van de ziekte op te lopen maar in plaats daarvan de uitkomst te bepalen als iemand de diagnose heeft gekregen. Bijvoorbeeld: het type haplogroep beïnvloedt de overleving van ernstige sepsis en de progressie van AIDS.

Het meten van mtDNA-SNP associaties met M.E./CVS-status toonde geen significante verbanden, hoewel 10 SNPs nominale significantie bereikten. Bij onderzoek van deze 10 SNPs bleken er 9 merker-polymorfismen voor HgT te zijn en de tiende een merker voor 5 andere erkende sub-haplogroepen binnen T. De bevinding is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat haplogroep-associatie analyse vond dat meer controles dan M.E./CVS-individuen dragen waren van HgT in onze groep. Er is een grotere groep nodig om te bepalen of dit haplotype ietwat beschermt tegen M.E./CVS. Met betrekking tot HgT: een molekulaire analyse van cybride cellen [cytoplasmische hybride, een cel-lijn ontstaan na fusie van een volledige cel met een cytoplast (binnenste van een cel zonder de celwand cel-kern en plasma-membraan); de nucleaire genen van de ene cel worden gemengd met de mitochondriale genen van de andere – zo wordt het mogelijk de bijdrage van de mitochondriale genen en de nucleaire genen te onderscheiden] met identieke nucleaire achtergronden en verschillende mtDNA-populaties gaven aan dat HgT cybriden een hogere overleving vertoonden en toleranter waren voor oxidatieve stress, t.o.v. de meer courante Europese haplogroep-H.

Een studie onderzocht mitochondriale DNA SNPs op positie 3010 & 16519 bij 162 M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. [Boles RG et al. (hierboven)] Men vond een aanrijking van 16519T bij M.E./CVS-gevallen. In onze studie zagen we echter geen significante associatie van 16519T of enig ander polymorfisme met M.E./CVS t.o.v. controle. In de plaats daarvan zagen we, bij individuen met M.E./CVS, een significante associatie van 16519C met gastro-intestinale symptomen. Verder vonden we dat de allelen 16519C & 3010A geassocieerd waren met ernstiger M.E./CVS-symptomen.

De variatie qua symptomen voorkomend bij M.E./CVS zou te wijten kunnen zijn aan genetische variatie bij de individuen, eerder dan verschillen qua onderliggende oorzaak van de ziekte. Meting van verbanden tussen haplogroepen of mtDNA-SNPs en symptoom-scores van M.E./CVS-patiënten (SF-36 & DSQ), toonde 24 significante associaties. Hoewel we deze studie ondernamen omdat enkele van de belangrijke M.E./CVS-symptomen theoretisch zouden kunnen te wijten zijn aan mitochondriale dysfunktie, detekteerden we geen mitochondriale DNA SNP associaties met de belangrijke symptoom-clusters vermoeidheid/post-exertionele malaise, cognitieve problemen, autonome dysfunktie, endocriene abnormaliteiten en pijn. In de plaats daarvan zagen we associaties met neurologische, inflammatoire en gastro-intestinale symptomen en/of hun ernst, alsook correlaties met de mogelijkheid van de patiënten om te werken. Het zal belangrijk zijn om een volledig onafhankelijke groep te gebruiken om te bepalen of de door ons gedetekteerde correlaties kunnen worden herhaald.

Onze studie geeft hints dat minstens enkele van de klaarblijkelijke M.E./CVS-subtypes te wijten kunnen zijn aan verschillen in DNA-sequenties bij de patiënten, zelfs als is er geen bewijs dat bepaalde mitochondriale genomen leiden tot verhoogde vatbaarheid voor de ziekte zelf. Hoewel de groep behoorlijk groot was (389) in vergelijking met de meeste M.E./CVS-studies, zal verdere analyse van de mitochondriale en nucleaire genomen bij een veel grotere patiënten-populatie nodig zijn om te ontdekken hoe genetische variatie ziekte-ernst, progressie en symptoom-clusters beïnvloedt.

Besluiten

We vonden geen significant verband tussen mitochondriaal DNA genoom variatie en vatbaarheid voor of resistentie tegen M.E./CVS. We detekteerden geen enkel significant verschil qua heteroplasmie tussen patiënten en controles. Op basis van een groep van 193 M.E./CVS-patiënten en 196 controles, zagen we 8 mtDNA SNPs die geassocieerd waren met 16 symptoom-categorieën en 3 haplogroen geassocieerd met 6 symptoom-categorieën, wat suggereert dat het mitochondriaal genoom van een individu met M.E./CVS het type en de ernst van bepaalde symptomen kan beïnvloeden.

juli 25, 2015

Genetische evaluatie van met immuniteit & inflammatie gerelateerde genen bij CVS

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 8:12 am
Tags: , , , , , , , ,

We hebben het op deze pagina’s al meermaals over SNPs bij M.E.(cvs) gehad. Een onderzoek-groep van het CDC heeft bekeken of patiënten meer van dergelijke variaties in genen betrokken bij immuniteit/inflammatie hadden dan normaal. Dergelijke polymorfismen zijn dikwijls niet zeldzaam (10-30%) maar het punt is dat ze niet onder de courante vorm voorkomen. Tot nu toe waren slechts enkele immuniteit-genen bekeken maar in deze studie werd een chip gebruikt die 11.000 SNPs in 1000 genen van 38 immune sub-mechanismen kan bepalen. De gen-polymorfismen die werden gevonden bleken niet verspreid te liggen in genen over het immuunsysteem maar waren geclusterd.

Het CDC-team categoriseerde de polymorfismen volgens type. Niet-synonieme: gen-wijzigingen die zorgen voor een veranderde vorm van het proteïne (3 genen waarvan 2 die een rol spelen bij het complement-systeem). Synonieme: waarbij het proteïne niet verandert (4 gen-varianten die ongewoon courant of zeldzaam waren bij M.E.(cvs); 2 daarvan behorend tot complement-pad). Genen in de onvertaalde gebieden (‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie (2 genen van de complement-cascade). SNPs in de intronische gebieden (intron = DNA-sequentie in een gen die niet codeert voor het eiwit): beïnvloeden ook de gen-expressie. Daarnaast keken ze nog naar 6 extra gen-varianten van het complement-pad en ze vonden afwijkingen in hun voorkomen (ongebruikelijk hoog of laag) bij M.E.(cvs).

Het complement-systeem is een onderdeel van de aangeboren immuun-respons dat antilichamen en fagocyterende cellen ‘complementeert’ (aanvult) in de strijd tegen pathogenen. Het bestaat uit een 30-tal proteïnen. Bij een invasie van een pathogen of inflammatie worden deze proteïnen gesplitst door enzymen (proteasen), wat aanleiding geeft tot de afgifte van cytokinen. Polymorfismen in complement-genen bleken eerder al gelinkt met meerdere aandoeningen…

In 2003 hebben Bristol Sorensen en medewerkers al getoond dat M.E.(cvs)-patiënten 6h na inspanning een significante verhoging van het complement splitsing-produkt C4a vertoonden. Een team van het CDC (toen nog met Suzanne Vernon) bevestigde in 2005 dat complement-aktivatie één van de door inspanning geïnduceerde verschillen was tussen M.E.(cvs) en controles (zie ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS’). Samen stelden ze dat complement-aktivatie een merker kan zijn voor met M.E.(cvs) geassocieerde post-exertionele malaise (zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’).

Het CDC zette dus dit werk verder en deze studie hier toonde weer een verband tussen M.E.(cvs) en SNPs in o.a. het complement-aktivatie mechanisme. Het complement-systeem blijkt dus een belangrijke rol te spelen bij de aandoening, wat een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij M.E.(cvs) verder ondersteunt. Hopelijk volgen er nog studies om dit verder uit te klaren en de effekten van inspanning op complement gen-expressie en concentraties in het bloed te onderzoeken. Dit zou een immune oorzaak voor post-exertionele malaise kunnen aantonen.

————————-

Hum Immunol. 2015 Jun [pre-print]

Pathway-focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome

Rajeevan MS, Dimulescu I, Murray J, Falkenberg VR, Unger ER

Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

Samenvatting

Er is bewijsmateriaal dat suggereert dat immuniteit- en inflammatoire wijzigingen belangrijk zijn bij Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS). Deze studie werd uitgevoerd om het verband van funktioneel belangrijke genetische varianten in inflammatie- en immune mechanismen bij CVS te exploreren. Er werd DNA uit perifeer bloed geïsoleerd van 50 CVS- en 121 niet-vermoeide (NF) controle-deelnemers in een populatie-studie. Er werd genotypering uitgevoerd met de Affymetrix Immuniteit en Inflammatie Chip die 11.000 ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) omvat. De accuraatheid van de genotypering voor de specifieke genen werd gevalideerd via pyrosequentiebepaling. Er werd Golden Helix SVS software gebruikt voor de genetische analyse. […] CVS bleek geassocieerd met 32 funktioneel belangrijke SNPs: 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 ‘untranslated regulatory region’ (UTR) varianten en 6 intron-varianten. Enkele van deze SNPs bevonden zich in genen van mechanismen gerelateerd met de complement-cascade (SERPINA5, CFB, CFH, MASP1 & C6), chemokinen (CXCL16, CCR4, CCL27), cytokine-signalisering (IL18, IL17B, IL2RB) en ‘toll-like’ receptor signalisering (TIRAP, IRAK4). Van bijzonder belang is de associatie van CVS met 2 mis-sense varianten in genen va de complement-aktivatie: rs4151667 in CFB en rs1061170 in CFH. Een 5’-UTR polymorfisme (rs11214105) in IL-18 was ook geassocieerd met lichamelijke vermoeidheid, lichaam-pijn en de score voor CVS-definiërende symptomen. Deze studie identificeerde nieuwe verbanden tussen CVS en genetische varianten in mechanismen, waaronder complement-aktivatie, wat bijkomende ondersteuning biedt voor een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

1. Inleiding

[…] Inflammatoire merkers bleken geassocieerd met specifieke symptomen die gemeenschappelijk zijn voor CVS; chronische vermoeidheid, hartslag-variabiliteit, slaap-kwaliteit, cognitieve problemen en post-exertionele malaise. Er werden wijzigingen in cytokine-profielen gesuggereerd als biomerkers voor CVS. Polymorfismen met een impact op gen-funktie, direct of via interaktie met andere risico-factoren, dragen bij tot de genetische vatbaarheid voor CVS. Er werd slechts een klein aantal polymorfismen in enkele genen betrokken bij immune en inflammatoire respons bestudeerd. De Affymetrix Menselijke Immuniteit en Inflammatie Chip werd ontwikkeld om systematische genetische evaluatie van of immuniteit- en inflammatie-mechanismen te een vergemakkelijken. We gebruikten dit platform om de genetica van de immune en inflammatoire respons bij CVS te onderzoeken.

2. Materialen en methodes

2.1. Individuen

[…] De deelnemers […] werden als CVS geklassificeerd als ze voldeden aan de internationale research-definitie (1994). […] Individuen die niet aan de criteria voor CVS voldeden, werden geklassificeerd als niet-vermoeide (NF) controles. De groep omvatte […] 121 NF-controles en 50 CVS-patiënten. […]

2.2. Multiplex Affymetrix genotypering

[…]

2.3. Genotypering d.m.v. pyrosequentiebepaling

[…]

2.4. Data-analyse en bio-informatica

[…]

3. Resultaten

3.1. Demografie van de deelnemers opgenomen in deze analyse

[…] De mediane tijd sinds aanvang van de vermoeidheid voor de CVS-deelnemers was 8,97 jaar (0,39-40,2 jaar) en 82,2% vertoonde een gradueel begin van de ziekte. […]

3.2. Mogelijke funktionele SNPs geassocieerd met CVS

De resultaten identificeerden 427 SNPs geassocieerd met CVS op allel-niveau en 405 op genotype-niveau. De 38 SNPs met een mogelijke funktionele betekenis […] werden samen met 14 van hun nabijgelegen SNPs die niet op de Affymetrix chip zaten, gegenotypeerd via ‘pyrosequencing’ [moderne vorm van sequentie-bepaling]. […] 32 van de 38 SNPs en 10 van de 14 proxy SNPs waren significant geassocieerd met CVS. De 32 funktionele SNPs werden gegroepeerd […]: niet-synonieme varianten (11 SNPs), synonieme variants (4 SNPs), gelegen in de ‘untranslated regulatory regions’ (UTR) van genen (11 SNPs) of intronische (6 SNPs). […]

[uitleg in de bespreking]

3.3. C2/CFB en CFH allelen, en haplotypes geassocieerd met CVS

[uitleg in de bespreking]

3.4. SNPs geassocieerd met kwantitatieve metingen van CVS

[uitleg in de bespreking]

4. Bespreking

Deze studie identificeerde meerdere eerdere niet erkende genetische associaties met CVS die het waard zijn verder te worden bestudeerd voor validering. Wanneer ze worden gevalideerd, zullen deze associaties de hypothese dat immuniteit- en inflammatie-mechanismen betrokken zijn bij CVS ondersteunen. Vele van de SNPs geassocieerd met CVS zijn gelegen in genen die betrokken zijn bij complement-aktivatie, chemokinen en cytokinen, en ‘toll-like’ receptor (TLR) signalisering. De bevindingen aangaande het complement-systeem zijn van bijzonder belang, aangezien er een rol voor complement-aktivatie bij CVS werd gesuggereerd door een melding over een geval en eerdere gen-expressie en proteoom-studies. Uit een rapport over één chronisch vermoeide patient bleek dat de waarden van de complement splitsing-produkten verhoogd waren maar dat de CVS-symptomen verbeterden binnen 2 maand na of normalisering van de splitsing-produkten. Gen-expressie studies duiden op differentiële expressie van het complement-proteïne MASP2, wat bijdraagt tot het C4a splitsing-produkt bij CVS na inspanning [Sorensen B et al. Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J. Allergy Clin. Immunol. (2003) 112: 397-403 /// Sorensen B, Jones JF, Vernon SD, Rajeevan MS. Transcriptional control of complement-activation in an exercise-model of Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Med. (2009) 15: 34-42; zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS]. Complement-proteïnen in het cerebrospinaal vocht van individuen met CVS bleken verhoogd vergeleken met gezonde controles [zie ‘Verschillende proteomen in ruggemergvocht bij CVS & Lyme].

Het complement-systeem speelt belangrijke rollen bij de verdediging van de gastheer tegen infektie, coördineert gebeurtenissen tijdens inflammatie, en vormt een brug tussen aangeboren en adaptieve immuun-responsen. Complement-aktivatie wordt geïnitieerd via 3 sub-mechanismen (klassiek, alternatief en lectine-mechanisme), die allemaal leiden tot de vorming van C3-convertase [enzyme] dat nodig is voor de splitsing van C3. CFH [complement-factor H] en CFB [complement-factor B] spelen een centrale maar tegengestelde rol bij het alternatief mechanisme. CFB aktiveert de complement-cascade via zijn bijdrage tot de vorming van C3-convertase en CFH inhibeert hetzelfde mechanisme via het versnellen van de afbraak van C3-convertase. C2 lijkt op CFB, maar draagt bij tot de vorming van C3-convertase via het klassiek mechanisme.

Interessant is dat van 2 met CVS geassocieerde mis-sense varianten [coderend voor een verkeerd aminozuur] in genen van de complement-aktivatie – rs4151667 in CFB & rs1061170 in CFH – een associatie met ‘age-related macular degeneration’ [AMD; een oog-aandoening] was gevonden. Het SNP rs9332739 in C2 […] – waarvan ook een associatie met AMD werd gerapporteerd – was ook geassocieerd met CVS in onze studie; het risico en de beschermende varianten waren echter omgewisseld (m.a.w. de allelen die beschermen tegen AMD waren geassocieerd met het risico op CVS). Een rapport gaf aan dat beschermende allelen (van CFH & CFB) voor AMD verband houden met lagere waarden qua complement-aktivatie. Aangezien dezelfde allelen geassocieerd zijn met het risico op CVS in deze studie, stellen we als hypothese dat lagere complement-aktivatie geassocieerd kan zijn met te minste een subgroep CVS-individuen.

Bij ons weten is dit de eerste studie die CVS in verband brengt met met polymorfismen in chemokine-liganden/receptoren, molekulen die leukocyten-bewegingen reguleren. Eén van de sterkste associaties was met de synonieme risico-variant rs2228428 die mogelijks ‘splicing’ [Tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.] reguleert in CCR4, een chemokine-receptor waarvan is gemeld dat die tot expressie komt op Th2 en Treg cellen. Er werden ook associaties gevonden met varianten in CXCL16 [chemokine (C-X-C motief) ligand 16], een lid van de CXC-familie der chemokinen. rs1051007 in het 3’UTR van CXCL16, waarvan werd gerapporteerd dat het een impact heeft op zijn gen-expressie, was geassocieerd met het risico op CVS, terwijl een mis-sense polymorfisme (rs2277680) in CXCL16 geassocieerd was met bescherming. Deze resultaten suggereren dat verdere studies van CCR4 en CXCL16 bij CVS gerechtvaardigd zijn.

Studies hebben gerapporteerd over het feit dat enkele polymorfismen in cytokinen geassocieerd zijn met CVS [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24: 179-182; zie ook ‘Circadiaans ritme voor cytokine-secretie]. Deze SNPs werden niet opgenomen in de ‘Affymetrix Human Immune and Inflammation Chip’ die we gebruikten. We identificeerden echter bijkomende cytokine-polymorfismen, nl. rs11214105 in IL-18, een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend] dat door perforine [enzyme dat vrijkomt wanneer cellen worden aangevallen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen en dat porieën boort in het membraan van te vernietigen cellen] gemedieerde T-cel en NK-cel cytotoxiciteit versterkt. IL-18 bleek ook bij te dragen tot de ontwikkeling en de pathogenese van infektueuze en neuro-inflammatoire ziekten met immuniteit- en cognitieve dyfunktie [Alzheimer’s, hepatitis-C virus infektie]. Dieren-studies linkten IL-18 aan ziekten met geslacht-specifieke prevalentie en ingewikkelde, regionale en geslacht-specifieke ouderlijke effekten in de hersenen. We vonden dat dit IL18-polymorfisme geassocieerd is met CVS en kwantitatieve metingen van de CVS-symptomen: lichaam-pijn, fysieke vermoeidheid, symptoom-scores en aantal CVS-symptomen. Onze resultaten suggereren bijkomend onderzoek naar IL-18 als een kandidaat-gen bij CVS-pathofysiologie.

Meerdere met CVS geassocieerde 3’UTR-polymorfismen verdienen verdere analyse aangezien ze een impact kunnen hebben op binding-plaatsen voor microRNAs [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)] die nog niet werden onderzocht bij CVS. Hoewel de impact van deze SNPs op microRNA-binding nog experimenteel dient te worden geverifieerd, suggereren onze resultaten een mechanisme voor microRNA-regulering van genen geassocieerd met CVS. Sommige van de microRNAs die worden beïnvloed door met CVS geassocieerde SNPs zijn gelinkt met in IL17B & en SERPINA5 [‘serpin peptidase inhibitor clade A member 5’]. Een mis-sense variant in SERPINA5 (rs6115) was ook geassocieerd met CVS. Aangezien deze SERPINA5-varianten niet in ‘linkage disequilibrium’ zijn [Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.], kunnen ze een onafhankelijk risico op CVS betekenen. SERPINA5, een inhibitor van geaktiveerd proteïne-C [APC is in staat om, samen met proteïne-S de stolling te stoppen], is gelegen op chromosoom 4 met andere leden van de serpent protease-familie – inclusief corticosteroid-bindend globuline (SERPINA6), waarvan werd gerapporteerd dat het verband houdt met CVS [Torpy DJ et al. Association between Chronic Fatigue Syndrome and the corticosteroid-binding globulin gene ALA SER224 polymorphism. Endocr. Res. (2004) 30:417-29]. De met CVS geassocieerde intron-variant rs11257804 in CAMK1D is van belang. CAMK1D is een proteïne-kinase in het calcium-signalisering mechanisme. Het speelt een belangrijke rol bij de werking van granulocyten en heeft weinig of geen expressie in monocyten en lymfocyten. Dit suggereert dat een verdere verkenning van de granulocyten-funktie en gastheer-verdediging bij CVS gerechtvaardigd is.

De beperkte grootte van de groep, samen met het ontbreken van een correctie voor multipele testen is de belangrijkste beperking van deze verkennende studie. [Complexe uitleg hoe hier werd aan verholpen…]

Onze studie identificeerde 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 3’UTR- en 6 intron-varianten met mogelijke regulerende werking […]. De specificiteit van de associaties met CVS kon in deze studie niet worden bepaald aangezien er enkel werd vergeleken met niet-vermoeide controles. Het identificeren van met CVS geassocieerde abnormaliteiten in een ‘case-control’ studie is een belangrijke eerste stap bij het identificeren van kandidaat-genen en mechanismen die betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CFS.

Tot besluit: deze studie identificeerde meerdere nieuwe genetische verbanden tussen CVS en varianten in de complement-aktivatie, chemokinen, cytokinen en ‘toll-like’ receptor signalisering. Associaties met deze mechanismen leveren bijkomende ondersteuning voor een rol van gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies met grotere patiënten-groepen nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

juli 10, 2015

Gen-expressie factor analyse differentieert FM, CVS & depressie

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:21 am
Tags: , , , , , , , ,

Het echtpaar Light en hun medewerkers van de ‘ University of Utah’ hebben al heel wat onderzoek gericht naar gen-expressie patronen bij M.E.(cvs) (en fibromyalgie). Links naar hier reeds besproken artikels zijn terug te vinden in de tekst. Ze houden daarbij rekening met de geleverde inspanning en vergelijken hun resultaten ook bij groepen met andere aandoeningen (bv. kanker – zie ‘Piloot-studie gen-expressie bij kanker versus M.E.(cvs)’).

In onderstaande studie werd gekeken naar de effekten van de aanwezigheid van co-morbide aandoeningen (FM en depressie): er werd bepaald welke mechanismen deze aandoeningen al dan niet delen. Daartoe werd gekeken of bepaalde genen konden worden gegroepeerd in relevante biologische ‘factoren’ en of deze konden worden gelinkt aan een bepaalde diagnose.

Op basis van de resultaten besloot hun team dat gen-expressie die relevant is voor fibromyalgie, M.E.(cvs) en depressie kan ondergebracht worden in biologische ‘clusters’; en dat M.E.(cvs) en depressie geassocieerd zijn met dezelfde 2 clusters – waarbij M.E.(cvs) een verhoogde expressie vertoont terwijl depressie een verlaagd expressie-patroon voor deze genen heeft.

————————-

Arthritis Care & Research (Pre-print juni 2015)

Gene expression factor analysis to differentiate pathways linked to fibromyalgia, Chronic Fatigue Syndrome and depression in a diverse patient sample

Eli Iacob (1), Alan R. Light (2), Gary W. Donaldson (1), Akiko Okifuji (1), Ronald W. Hughen (2), Andrea T. White (3) & Kathleen C. Light (2)

1 Department of Anesthesiology Pain Research Centre, University of Utah, Salt Lake City, UT

2 Department of Anesthesiology, University of Utah, Salt Lake City, UT

3 Department of Exercise and Sport Science, University of Utah, USA, Salt Lake City, UT

Samenvatting

Doelstelling Bepalen of onafhankelijke kandidaat-genen gegroepeerd kunnen worden tot betekenisvolle biologische factoren en of deze factoren geassocieerd zijn met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FMS) als men controleert voor co-morbide depressie, geslacht en leeftijd.

Methodes We bekeken de mRNA gen-expressie in leukocyten van 261 individuen: gezonde controles (n = 61), patiënten met enkel FMS (n = 15), enkel CVS (n = 33), co-morbide CVS & FMS (n = 79) en medicatie-resistente (n = 42) of medicatie-responsieve (n = 31) depressie. We gebruikten ‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) voor 34 kandidaat-genen om factor-scores te bepalen en regressie-analyse om te onderzoeken of deze factoren geassocieerd waren met specifieke diagnoses.

Resultaten EFA resulteerde in 4 onafhankelijke factoren met een minimale overlap van genen tussen de factoren, die 51% van de variantie kunnen verklaren. We labelden deze factoren op basis van funktie: 1) purinerge en cellulaire modulatoren; 2) neuronale groei en immuun-funktie; 3) nociceptie en stress-mediatoren; 4) energie en mitochondriale funktie. Regressie-analyse onthulde dat grotere expressie van factoren 1 & 3 positief geassocieerd was met CVS en negatief geassocieerd met depressie-graad (QIDS score), maar niet geassocieerd met FMS.

Besluit Expressie van kandidaat-genen kan gegroepeerd worden in betekenisvolle ‘clusters’, en CVS en depressie zijn geassocieerd met dezelfde 2 ‘clusters’ maar in omgekeerde richting – wanneer wordt gecontroleerd voor co-morbide FMS. Gezien het veel voorkomen van co-morbide ziekte en inter-relaties tussen biomerkers, zou EFA kunnen helpen om patiënten-subgroepen in deze populatie vast te leggen op basis van gen-expressie.

Inleiding

1-5 miljoen Amerikanen lijdt aan fibromyalgie-syndroom (FMS) en Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS). Beide aandoeningen zijn multi-symptoom syndromen met klachten zoals spier- en gewricht-pijn, vermoeidheid, slaapstoornissen en and stemming-problemen. Deze 2 syndromen komen dikwijls samen voor; bijna 70% van de individuen met FMS voldoen aan de criteria voor co-morbide CVS. Stemming-problemen komen ook samen voor met FMS en CVS: ca. 50% van de patiënten melden significante depressie.

Het is goed gedocumenteerd dat de aanwezigheid van depressie gepaard gaat met verergering van pijn, funktionele stoornissen, slechte slaap en slechte gezondheid in het algemeen. Hoewel er geen doorslaggevende oorzakelijke verbanden werden beschreven, is het zo dat patiënten met een geschiedenis van depressie later meer kans hebben op het ontwikkelen van chronische pijn en met vermoeidheid gerelateerde aandoeningen en, omgekeerd, degenen met [chronische] pijn hebben meer kans om een depressie te krijgen. Een nauw verband tussen CVS, FMS en depressie suggereert de aanwezigheid van gemeenschappelijke mechanismen die bijdragen tot deze aandoeningen. Ander bewijs suggereert echter dat FMS en CVS vergeleken met gezonde mensen perifere dysfunktie – wat betreft pijn, zenuw- en spier-vezels, immuun-merkers en mRNA gen-expressie patronen – vertonen, die niet volledig verklaard kunnen worden door depressie.

Leukocyten gen-expressie (mRNA) is een betrekkelijk niet-invasieve methode om de funktionele status van meerdere neurale en immune mechanismen gelijktijdig te bepalen in één enkel bloedstaal. Ons eerder werk gaf aan dat na matige inspanning, de ‘baseline’ gen-expressie is verhoogd bij CVS-patiënten en FMS voor één cytokine (IL-10), samen met zuur-detekterende (ASIC3), ‘transient vanilloid’ (TRPV1) en purinerge (P2RX4) ion-kanaal genen [Light AR, Bateman L, Jo D, Hughen RW, Vanhaitsma TA, White AT, et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and Fibromyalgia Syndrome. J Intern Med. (2012) 271: 64-81; zie ‘Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM /// Light AR, White AT, Hughen RW, Light KC. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS]. In dieren-modellen werd aangetoond dat dezelfde ASIC3, TRPV1 en P2RX4 receptoren samenwerken, differentieel geaktiveerd worden door metabolieten aan waarden die corresponderen met deze die worden opgewekt door vermoeiende vs. pijnlijke inspanning [Light AR, Hughen RW, Zhang J, Rainier J, Liu Z, Lee J. Dorsal root ganglion neurons innervating skeletal muscle respond to physiological combinations of protons, ATP and lactate mediated by ASIC, P2X and TRPV1. J Neurophysiol. (2008) 100: 1184-201; zie ‘Spier-metaboreceptoren]. Interessant is dat meerdere van deze genen die veranderd zijn bij CVS na inspanning ge-upreguleerd bleken bij depressieve mensen. Belangrijk: de meeste studies onderzochten de expressie van elk gen individueel in plaats van als gen-groepen, en bestudeerden CVS/FMS- of depressie-groepen afzonderlijk, waarbij de effekten van co-morbiditeit op gen-expressie werden genegeerd.

Onderzoek van gen-expressie geassocieerd met FMS, CVS en depressie kan ons helpen beter te begrijpen welke mechanismen deze aandoeningen gemeenschappelijk hebben. Er zijn veel kandidaat-genen maar het onderzoeken van een groot aantal genen is analytisch uitdagend en maakt de interpretatie van de resultaten lastig. Identificatie van coherente subgroepen genen zou moeten helpen leiden tot een beter begrip van de gen-expressies die een belangrijke kunnen spelen bij deze aandoeningen. In dit artikel stellen we een alternatieve strategie voor, gebruikmakend van ‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) gebaseerd op de premisse dat een set kandidaat-genen gegroepeerd kan worden in een veel eenvoudiger set ‘cluster’-factoren. We kunnen dan conventionele analyse toepassen op een klein aantal ‘super-variabelen’ in plaats van op een veel grotere set individuele genen met hoge variabiliteit. Onze studie probeerde 2 research-vragen te beantwoorden: 1) Kunnen kandidaat-genen onderverdeeld worden in betekenisvolle autonome ‘clusters’ d.m.v. factor-analyse? 2) Vertonen FMS, CVS en depressie-graad unieke of overlappende verbanden met specifieke gen-expressie ‘clusters’ of factoren als met controleert voor co-morbiditeiten?

Methodes

Deelnemers

Dit is een ‘cross-sectionele’ studie [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] die leukocyten mRNA gen-expressie van meerdere overéénkomende ‘case-control’ studies onderzoekt. De deelnemers […] omvatten mannen en niet-zwangere vrouwen tussen 18 & 73 jaar oud: 33 individuen met CVS (‘Centre for Disease Control’ criteria, Fukuda 1994), 15 individuen met FMS (‘American College Rheumatology’ criteria, 1990), 79 met co-morbide CVS en FMS (beide criteria), 31 met medicatie-responsieve depressie (RESP; voorafgaande diagnose door arts, symptomen onder controle met medicatie), 42 met medicatie-resistente depressie (REF; voorafgaande diagnose door arts, in een depressieve toestand en niet reagerend op medicatie) en 61 gezonde controles zonder pijn, vermoeidheid of depressie. […] Exclusie-criteria omvatten aktieve virale of bovenste-luchtwegen infekties, chronische cardiovasculaire of long-aandoeningen, of andere chronische aandoeningen zoals bloedarmoede of kanker.

Bepalingen

[…] Depressie-graad: ‘Quick Inventory of Depression Symptomatology’ (QIDS) zelf-rapportering (gevalideerde vragenlijst met 16 items). Voor de deelnemers in de REF-groep: ‘Hamilton Rating Scale of Depression’ (HRSD)-24 […].

mRNA leukocyten gen-expressie

[…]

Statistische Methodes

[…]

Factor Analyse

‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) laat toe te onderzoeken hoe niet-gemeten latente variabelen (factoren), patronen van correlaties – die worden gevonden in de gemeten verbanden tussen genen – weergeven. [EFA is een statistische methode om de onderliggende struktuur van een relatief grote variabelen bloot te leggen. Het doel is de onderliggende verbanden tussen gemeten variabelen te identificeren.] De Pearson correlatie [meest gebruikte correlatie-coëfficiënt] onthulde dat veel van de 34 genen significante inter-correlaties vertonen. […] De factor-score determinatie-coëfficiënt, de theoretische correlatie tussen score en factor, geeft de betrouwbaarheid en validiteit aan van de scores. Coëfficiënten groter dan 0,9 duiden op een excellente overéénkomst. [hoge ‘loading’ = grote regressie-coëfficiënt van het gen op de factor]

Lineaire Regressie

Eénmaal dat de factoren bepaald waren via de EFA, gebruikten we multi-variate lineaire regressie om te bekijken of de factoren voorspeld konden worden door demografische/diagnostische variabelen (FMS-diagnose, CVS-diagnose, QIDS depressie-graad, leeftijd en geslacht). We voerden lineaire regressie analyse uit voor het volledig staal en het staal zonder de REF-groep. […] p < 0.05 significantie-level. Er dienen strengere criteria te worden gehanteerd wanneer een bevestigende FA wordt uitgevoerd.

Resultaten

Beschrijving van het staal

[…] Personen met CVS of FMS bleken ouder en voornamelijk vrouwen. Leeftijd en geslacht werden dus behouden als and co-variabelen. […]

Resultaten van de Verkennende Factor Analyse

[…] 4 factoren bleek optimaal voor een eenvoudige struktuur; […] minstens 4 genen per factor en een minimaal aantal genen met een hoge coëfficiënt voor meerdere factoren. […] 7 genen hadden hoge (> 0,4) coëfficiënten voor 2 factoren: HSPA2, PPARA [andere naam voor NR1C1, het proteïne is een transcriptie-factor en belangrijke regulator van het lipiden-metabolisme in de lever], SULT1A1, LTA, SIRT1, TRPV1 en TLR4. Er waren 3 genen zonder significante coëfficiënt (i.e. < 0,4), voor geen enkele factor: ADR2A [adrenerge receptor], OXTR [oxytocine-receptor], SPARC [coderen voor osteonectine; een glycoproteïne in beenderen dat calcium bindt].

Biologische Groepen op basis van de Factor Analyse

Factor 1 wordt voornamelijk gekenmerkt door genen betrokken bij purinerge and cellulaire modulator mechanismen inclusief purinerge ion-kanalen P2RX4 en P2RX7 (beiden geassocieerd met neuropathische pijn) alsook cellulaire/immune modulatoren NFKB1 [het proteïne NF-κB is een transcriptie-factor die wordt geaktiveerd door cytokinen, bakteriële/viral produkten, enz.], DBI [diazepam-bindende inhibitor; gen betrokken bij energie-regulering via lipiden-metabolisme, modulering van stemming via de GABA-A receptor en transcriptie van bijnier-steroïden], TNFA & IL10. Factor 2 wordt gekenmerkt door deze genen met hoge ‘loading’: glucocorticoid receptor NR3C1 [zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS], neureguline (NRG)-1 [neuregulinen zijn proteïnen met diverse funkties in de ontwikkeling van het CZS], chemokine-receptor CXCR4 [‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’: “CXCR4 is significant ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten maar dit is wellicht niet specifiek voor CVS.”], ‘amyloid precursor protein’ [APP; ge-upreguleerd in het cerebrospinaal vocht bij CVS-patiënten; zie: ‘CVS-gerelateerd proteoom in cerebrospinaal vocht] & Toll-Like receptor 4 (TLR4) [Toll-like receptoren’ = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren], die allemaal een rol hebben bij neuronale groei en immuun-funktie. Factor 2 deelt deze genen met hoge ‘loading’: SULT1A1 [coderend voor een enzyme betrokken bij de verwerking van hormonen, neurotransmitters, enz.], LTA [gen coderend voor lymfotoxine-α of Tumor Necrose Factor-β], SIRT1 [betrokken bij mitochondriale biogenese] & TLR4 met Factor 3, en HSPA2 [coderend voor ‘Heatshock-related’ 70 kDa proteïne-2] met Factor 4. Factor 3 wordt voornamelijk gekenmerkt door het ASIC3-TRPV1 complex [zie eerdere artikels Light et al.], de NR3C2 mineralocorticoid receptor en cytokinen LTA & IL6, en daarom klassificeerden we deze set bij nociceptie en stress-mediatoren. Factor 4 wordt gekenmerkt door een hoge ‘loading’ voor genen die belangrijk zijn voor mitochondriale funktie (HSPA2, NDUFS5, ATP5E & COX5B), en de purinerge receptoren P2RY1 & P2RY2 die reageren op metabolieten die worden gegenereerd door de mitochondriale machinerie en dus voorlopig geklassificeerd als behorende tot energie en mitochondriale funktie.

Verband tussen factoren en diagnostische kenmerken (lineaire regressie [β-coëfficiënten])

[…] De factor-score coëfficiënten waren allemaal hoger dan 0,95 – wat wijst op een uitstekende betrouwbaarheid en validiteit […].

[…]

Voor het volledig staal vonden dat Factor 1 een significante positief verband met CVS (β-coëfficiënt = 0.34, p = 0.03), leeftijd (β = 0.16, p < 0.01) en geslacht (β = 0.57, p < 0.01). vertoonde Zonder de REF-groep werden gelijkaardige of sterkere associaties gevonden voor CVS, leeftijd en geslacht met een negatief verband met QIDS [depressie-graad] (β = -0.23, p = 0.05). Factor 2 had enkel een negatieve associatie voor leeftijd (β= -0.20, p < 0.01) […]. Factor 3 vertoonde een negatief verband voor leeftijd (β = -0.27, p < 0.01). Zonder de REF-groep was er ook een positieve associatie voor CVS (β = 0.39, p = 0.02), negatieve associatie met QIDS (β = -0.27, p = 0.02) en negatief verband met leeftijd. Factor 4 vertoonde een negatieve associatie voor depressie-graad (β = -0.16, p = 0.01). Deze relatie verdween als de REF-groep werd weggelaten. […].

Anders dan wat verwacht werd, was FMS niet significant geassocieerd met om het even welke factor; noch voor het volledig staal, noch wanneer de REF-groep werd weggelaten.

Bespreking

Het is goed gedocumenteerd dat FMS en CVS dikwijls samen voorkomen, en co-morbide depressie is courant bij beide. Jammer genoeg heeft het wetenschappelijke onderzoek – ondanks de goed gedocumenteerde heterogeniteit onder de patiënten binnen deze ziekten – vertrouwd op eenvoudige groep-vergelijkingen tussen patiënten en gezonde controles waarbij co-morbiditeiten werden genegeerd. Gezien de schaarste aan studies die biologische factoren geassocieerd met co-morbiditeiten en patiënten-heterogeniteit identificeren, is het overwegen van deze factoren kritisch voor de vooruitgang van onze kennis over de pathofysiologie van deze aandoeningen.

De mRNA gen-expressie gerelateerd met FMS, CVS en depressie is complex. Deze aandoeningen zouden kunnen worden bestendigd door de expressie van een zeer grote aantallen genen, die bijna zeker interageren via ingewikkelde patronen die de diverse fenotypische co-morbiditeiten opleveren. De conventionele kandidaat-gen benadering beschouwt dergelijke genen als grotendeels onafhankelijk en in staat om individueel te moduleren. Zelfs met het betrekkelijk klein aantal van 34 kandidaat-genen, is totale onafhankelijkheid echter biologisch onaannemelijk en statistisch onmogelijk. De voornaamste doelstelling van deze verkennende studie was om een alternatieve strategie voor te stellen om te bekijken of kandidaat-genen van bloed-leukocyten gegroepeerd zouden kunnen worden in betekenisvolle biologische ‘clusters’ in een gemengde populatie van FMS, CVS, depressie en gezonde controles. De tweede doelstelling was om te zien of de factoren zouden samenlopen met diagnostische variabelen in deze populatie.

Er werd een gen-panel van 34 genen gebruikt dat elementen vertegenwoordigt van biologische mechanismen die eerder betrokken bleken bij pijn, vermoeidheid en depressie: ion-kanalen, mitochondriale funktie, immuniteit/inflammatie, monoamine receptoren [membraan-receptoren die bij stimulatie een cascade intracellulaire gebeurtenissen initiëren die cellulaire biochemische reakties begeleiden], transcriptie-factoren en cellulaire signalisering modulatoren. Door middel van EFA identificeerden we 4 onafhankelijke factoren die 51% variantie voor hun rekening nemen en we hebben deze geklassificeerd op basis van de belangrijkste van elke groep: Factor 1 (purinerge en immune modulatoren), Factor 2 (neuronale groei en immuun-funktie), Factor 3 (nociceptie en stress-mediatoren) & Factor 4 (energie en mitochondriale funktie). Het is niet verrassend dat genen van één familie, bv. deze coderend voor IL-10, IL-6, TNF-α en LTA, bij verschillende factoren opduiken. Dit houdt éénvoudigweg verband met het feit dat binnen de grotere klasse van immuun-merkers, bepaalde subsets gecorreleerd zijn met genen van andere families. We onderzochten dan of deze factor-scores geassocieerd waren met diagnostische variabelen van FMS & CVS, alsook depressie-graad. Daarom hebben we bij effektief analyses uitgevoerd op de 4 gen-expressie super-variabelen i.p.v. de 34 genen, wat het dus minder onderhevig aan toeval maakt. Op dit moment begrijpen we deze groeperingen dan misschien wel niet volledig en kunnen we enkel speculeren wat betreft hun mogelijke relaties en biologische betekenis. Hieronder bespreken we kort de biologische rationale voor elke factor en hoe deze factor geassocieerd kan zijn met klinische variabelen van onze regressie-resultaten.

Factor 1: purinerge en cellulaire immuun-modulatoren

De eerste factor wordt gekenmerkt door de purinerge ion-kanalen P2RX4 en P2RX7, en meerdere cellulaire/immune modulatoren inclusief TNFA, NFKB1, DBI en IL10. De P2-ligand kanalen worden geopend door ATP […]. Ze komen tot expressie in vele cel-types inclusief immune, microglia en gliale cellen, en spelen rollen in immuniteit- en inflammatie-mechanismen. Overzicht-artikels beschrijven de vele funktionele rollen die deze receptoren zouden kunnen spelen bij stemming-aandoeningen en pijn in dieren en mensen. Onder hun signalisering-doelwitten [genen] bevinden zich de transcriptie-factor NFKB1 en deze coderend voor cytokinen zoals TNF-α en IL-10. Deze bleken allemaal betrokken bij FMS, CVS en depressie. Onze resultaten suggereren een associatie tussen CVS en deze factor wanneer wordt gecontroleerd voor FMS en depressie-graad. Depressie-graad vertoonde een negatieve associatie in de kleinere groep zonder de medicatie-resistente depressie (REF) patiënten. Onze eerdere research aangaande gen-expressie na inspanning toonde geen verschillen voor CVS bij ‘baseline’. De huidige resultaten suggereren dat deze super-variabelen bijzonder belangrijk kunnen zijn voor CVS. Dit kan ook een argument zijn voor het feit dat CVS te differentiëren is van depressie, hoewel ze beide dysfunktionele kunnen vertonen; omdat hogere expressie gelinkt was met de aanwezigheid van CVS maar ook met een lagere depressie-graad. Bovendien: aangezien meerdere studies hebben aangetoond dat inspanning geassocieerd is met abnormale veranderingen in inflammatoire mechanismen, zou toekomstige research factor-scores moeten onderzoeken vóór en na inspanning [Nijs J et al. Altered immune-response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exercise immunology review (2014) 20: 94-116].

Factor 2: neuronale groei en immuun-funktie

Factor 2 heeft positieve ‘loading’ voor genen die betrokken zijn bij neuronale groei en immuun-funktie. Vergeleken met Factor 1 – met immune cellulaire modulatoren zoals IL10 en NFKB1 – hebben de genen in deze groep rollen bij het controleren van deze modulatoren daardoor immuun-cel groei en funktie. In beide modellen met en zonder de REF-groep was er geen associatie tussen Factor 2 en CVS of FMS. Aangezien groeifactoren gewijzigd kunnen zijn na een aanval of uitdaging, zouden ‘baseline’ waarden geen verschillen kunnen vertonen, wat de nood aan meerdere metingen op verschillende tijdstippen beklemtoont.

Factor 3: nociceptie en stress-mediatoren

Factor 3 wordt gekenmerkt door positieve ‘loading’ voor het ion-kanaal receptor complex TRPV1-ASIC3 en de mineralocorticoïde receptor (MR) NR3C2. Zoals eerder beschreven, hebben deze receptoren belangrijke rollen bij de sensatie van pijn, inflammatie en vermoeidheid [Pollak KA et al. Exogenously applied muscle metabolites synergistically evoke sensations of muscle fatigue and pain in human subjects. Experimental physiology. 2014;99(2):368-80; ook het echtpaar Light werkte mee aan deze studie. Hier wordt gesuggereerd dat de combinatie van een ASIC-receptor en een P2X receptor vereist is voor het signaliseren van vermoeidheid en pijn.], en zijn ze geassocieerd met verergering van post-exertionele pijn en vermoeidheid bij CVS-patiënten. Ze kunnen ook een rol spelen bij depressie en angst. Het blokkeren van de MR kan pijn doen dalen in dieren-modellen en betrokken zijn bij pijn bij diabete neuropathie. Factor 3 heeft ook ‘loadings’ voor LTA en IL-6, inflammatoire cytokinen waarvan is geweten dat ze interageren met de TRPV1-, ASIC3- en MR-receptoren. Regressie-analyse suggereert dat de diagnose van CVS positief is geassocieerd met deze factor: er is een positieve trend in het volledig staal en een significant verband wanneer individuen met ernstige behandeling-resistente depressie niet worden uitgesloten. Verder is de QIDS-score negatief geassocieerd met deze factor maar slechts wanneer de REF-groep wordt uitgesloten. Gezien de rol voor deze receptoren bij pijn, vermoeidheid en depressie, suggereren deze resultaten dat CVS-patiënten dysfunktie in dit mechanisme (verhoogde expressie) vertonen en net zoals met de genen van Factor 1, is depressie gelinkt met een tegengestelde dysfunktie dan CVS in hetzelfde mechanisme (verminderde expressie).

Factor 4: energie en mitochondriale funktie

Factor 4 wordt gekenmerkt door genen betrokken bij energie en mitochondriale funktie. Deze verzameling genen was van groot belang gezien hun betrokkenheid bij spier-funktie en vermoeibaarheid bij FMS en CVS [Castro-Marrero J, Cordero MD, Saez-Francas N, Jimenez-Gutierrez C, Aguilar-Montilla FJ, Aliste L et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants & redox signaling. (2013) 19: 1855-60; zie ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?]. Studies hebben ook mitochondriale funktie gen-expressie onderzocht bij stemming-aandoeningen. Ondanks zijn mogelijk belang, bleek uit onze regressie-modellen dat Factor 4 ongerelateerd was met de diagnose van FMS of CVS, en enkel geassocieerd was met depressie als patiënten met ernstige behandeling-resistente depressie werden opgenomen. Eerder dan te besluiten dat deze factor niet ontregeld is bij CVS of FMS, suggereren we in plaats daarvan echter dat toekomstige studies expressie-wijzigingen moeten onderzoeken na een energie-verbruikende uitdaging zoals aanhoudende inspanning.

GLOBAAL ondersteunen de resultaten van de Factor Analyse het gebruik van EFA ter aflijning van een kleinere set super-variabelen gebruikmakend van gen-gen inter-correlaties van een groot aantal individuele genen. De huidige set kandidaat-genen werd gekozen op basis van eerdere literatuur die de betrokkenheid bij de aandoeningen documenteerde. […] De huidige regressie-resultaten suggereren eigenlijk dat ten minste bij ‘baseline’ de gen-expressie gerelateerd was met CVS en depressie-graad bij Factor 1 & 3, zonder verband met FMS voor enige factor. Daarom is het mogelijk dat deze genen meer verband houden met vermoeidheid dan met FMS-pijn, wat wordt ondersteund door sterkere wijzigingen na inspanning bij de CVS- maar niet de FMS-populatie. Toekomstige studies zouden de inclusie van andere interessante genen […] moeten overwegen. Bovendien: hoewel deze studie focuste op FMS-pijn en CVS-vermoeidheid, kunnen deze individuen ook pijn van andere oorsprong hebben. Het is mogelijk en waarschijnlijk dat gen-expressie factoren verschillend zullen zijn bij andere pijn-aandoeningen (artritis, lage-rug pijn, neuropathische pijn en kanker-pijn).

Onze studie omvatte het ganse spectrum: gezonde mensen, mensen met enkel depressie, met enkel FMS/CVS en co-morbide groepen. Dit is tegengesteld aan andere eerdere studies die deze aandoeningen vergeleken met niet-depressieve, niet-gemediceerde gezonde controles. Vergelijkingen tussen patiënten met chronische pijn/stemming-aandoeningen en gezonde controles zijn moeilijk te begrijpen omwille van de meerdere verstorende factoren. Het wegwerken van al die potentiële verstorende factoren is een moeilijke taak; toekomstige bevestigende analyse zou echter andere factoren die evenzeer belangrijk zijn (levensstijl, fitheid, obesitas, slaap-kwaliteit/kwantiteit en -aandoeningen, en medicatie) moeten opnemen; deze dragen allemaal bij tot de ernst van de ziekte en mogelijke wijzigingen qua gen-expressie.

Er zijn meerdere opmerkenswaardige beperkingen bij deze studie. Ten eerste: de data-set is ‘cross-sectioneel’ en vertegenwoordigt slechts één tijdstip. Er is research die suggereert dat individuen met CVS hun biologische verschillen in vergelijking met controles vertonen na een experimentele belasting. Daarom is het niet verrassend dat individuen minder verschillen vertonen (FMS, CVS en depressie t.o.v. controles) bij ‘baseline’. Het is kritisch dat toekomstige studies deze factoren onderzoeken na een experimentele belasting of behandeling (waarvan is geweten dat ze de symptomen verbetert). Ten tweede: deze studie startte met de focus op sterke co-morbiditeit van CVS en FMS met depressie. Deze aandoeningen komen echter ook vaker voor samen met o.a. prikkelbare darm, rusteloze benen syndroom en temporomandibulair gewricht aandoeningen disorders. Deze co-morbiditeiten dragen bij tot ziekte-heterogeniteit en kunnen zorgen voor een verdoezeling van de mogelijke verbanden van gen-expressie met FMS of CVS. Ten derde: we hebben er voor gekozen de factoren te benoemen op basis van kenmerken van de genen met de hoogste ‘loading’. Deze indeling omvat echter de diverse funkties van alle opgenomen genen niet. Toekomstige studies die de kandidaat-genen verder bekijken en een bevestigende factor-analyse, zouden hun voordeel halen uit het gebruik van gen-ontologie [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] instrumenten om overéénkomende genen verdere te onderzoeken.

De doelstelling van deze studie was om ‘clusters’ van genen te identificeren die funktionele autonomie vertoonden (sterke correlaties binnen ‘clusters’ maar zwakke correlaties tussen ‘clusters’). Het is een ganse uitdaging om deze verkennende doelstelling standvastig in een bevestigende setting te vatten. […] We kunnen niet beweren dat de geïdentificeerde ‘clusters’ ondubbelzinnig nauwkeurig zijn, enkel dat ze een aanvaardbare benadering bieden voor de correlaties tussen de 34 genen die in deze studie werden onderzocht.

Besluit

De resultaten van deze ‘Exploratory Factor Analysis’ studie ondersteunen de notie dat gen-expressie relevant voor FMS, CVS en depressie kan worden gegroepeerd in biologische coherente en betekenisvolle categorieën. Omdat de indelingen gebaseerd zijn op gen-gen-correlaties en genen combineren die zich in meerdere overlappende mechanismen bevinden, zouden toekomstige research-studies verder de aard van de verbanden moeten onderzoeken d.m.v. bevestigende factor-analyse van longitudinale gegevens. We onderzochten ook of gen-factoren, in plaats van individuele genen, zouden kunnen samengaan met specifieke symptomen. Preliminaire verkennende resultaten suggereren dat CVS en depressie-graad, maar niet FMS, geassocieerd zijn met de factor-scores wanneer wordt gecontroleerd voor leeftijd, geslacht en co-morbide symptomen, maar dat CVS gelinkt is met verhoogde expressie terwijl depressie gelinkt is met gedaalde expressie van de geclusterde genen. Met het vorderen van het wetenschappelijk onderzoek en beter begrijpen van deze complexe aandoeningen, is het belangrijk om heterogene populaties en hoe co-morbide aandoeningen de fysiologie kunnen moduleren, beter te leren begrijpen. Gezien het feit dat klinische interventies voor CVS en FMS dikwijls multi-modale behandelingen vereisen, zouden research-studies deze populaties ook moeten behandelen als zijnde een combinatie van ziekten en symptomen i.p.v. enkelvoudige klassificaties.

juni 12, 2015

SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:31 am
Tags: , , , , ,

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’.

De acetylcholine-receptor (AChR) is een membraan-proteïne dat als een receptor werkt. De neurotransmitter acetylcholine is de belangrijkste stof die er op bindt en voor fysiologische responsen zorgt. Er zijn 2 types acetylcholine-receptoren (op basis van hun affiniteit en gevoeligheid voor andere molekulen): de nicotinerge acetylcholine-receptor (nAChR) en de muscarine acetylcholine-receptor (mAChR). De eerste (ook bekend als ‘ionotrope’ acetylcholine-receptoren) zijn responsief op nicotine en werken als ion-kanalen (wijzigen de doorlaatbaarheid van de cel). De tweede (ook bekend als ‘metabotrope’ acetylcholine-receptoren – ze werken via een ‘tweede boodschapper’ om signalen naar de cel te geven) zijn responsief op muscarine.

We schreven hier al over een suggestie van cholinergische anti-inflammatoire signalisering (zie Het Cholinergisch Anti-inflammatoir Mechanisme). Dr Vance Spence en zijn collega’s aan de Dundee University maakten ook al gewag van “verhoogde cholinergische aktiviteit in de perifere micro-circulatie aan bij patiënten met CVS” en “cerebrale hypo-perfusie gelinkt met abnormaliteiten in het cholinergisch metabolisme” (zie ‘Bloed-circulatie abnormaal bij mensen met CVS’). De research-groep van Stefania Fulle (Universiteit van Chieti in Italië) vond ook dat het belangrijk was dat “de expressie van een gen coderend voor een component van de nicotine-cholinergische receptor-bindingsplaats verminderd” bleek (zie ‘Transcriptie-profiel van spieren bij CVS’).

Hier wordt nu een mogelijke kadering voor aangereikt…

 

————————-

Immunology and Immunogenetics Insights 2015: 7

Examination of Single Nucleotide Polymorphisms in Acetylcholine Receptors in Chronic Fatigue Syndrome Patients

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Peter Smith (2), Bernd Nilius (3) & Donald R. Staines (2)

1 School of Medical Science, Griffith University, Gold Coast, Australia

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute, Griffith University, Gold Coast, Australia

3 Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Ion Channel Research, KU Leuven, Belgium

SAMENVATTING

DOELSTELLING: Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME) is een aandoening gekenmerkt door uitputtende vermoeidheid vergezeld van pijn en stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie. Acetylcholine (ACh) heeft een groot aantal rollen bij neuronale en neuromusculaire transmissie. Er zijn 2 types Ach-receptoren, muscarine and nicotinerge, bestaande uit 17 verschillende subunits van de nicotinerge Ach-receptor (nAChR) en 5 verschillende subtypes van de muscarine receptor (mAChR) die bij mensen werden geïdentificeerd. Het doel van deze studie was om de rol van ACh receptor (nAChRs and mAChRs) ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNPs) bij CVS/ME-patiënten te bepalen.

METHODES: 115 CVS/ME-patiënten (leeftijd = 48,68 ± 1,06 jaar) en 90 niet-vermoeide controles (leeftijd = 46,48 ± 1,22 jaar) nemen deel aan deze studie, waar de CVS/ME-patiënten werden gedefinieerd volgens de 1994 CDC criteria. Er werd een totaal aantal van 464 SNPs in 9 Ach-receptor genen (M1, M2, M3, M4, M5, alfa- 2, 5, 7 & 10) onderzocht.

RESULTATEN: 17 SNPs waren significant geassocieerd met CVS/ME-patiënten vergeleken met de controles. 9 van deze SNPs waren geassocieerd met mAChRM3 […], terwijl de rest the geassocieerd waren met nAChR alfa-10 […], alfa-5 […] en alfa-2 […].

BESLUIT: De gegevens van deze piloot-studie suggereren een verband tussen Ach-receptoren (voornamelijk M3) en CVS. Ach-receptor SNPs zouden kunnen bijdragen tot het pathomechanisme van CVS/ME.

Inleiding

De fysiologische funkties van acetylcholine (ACh) worden gemedieerd door 2 membraan-proteïnen: de muscarine (mAChR) en nicotinerge (nAChR) receptoren. Beide receptor-types hebben meerdere subtypes en zijn gelokaliseerd in het centraal en perifeer zenuwstelsel, inclusief het autonoom zenuwstelsel. ACh heeft ook een funktie in gladde spieren, zweetklieren, pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, cellen van de oog-lens, hersenen, het vasculair endotheel en het centraal zenuwstelsel (CZS). De afbraak van ACh in choline en acetaat wordt gekatalyseerd door het enzyme acetylcholinesterase (AChE).

Er zijn 5 mAChR subtypes: M1, M2, M3, M4 & M5, waarbij M2 & M4 inhiberende receptoren zijn, en M1, M2 & M3 stimulerende receptoren. Eens ze geaktiveerd zijn, heeft elk subtype kenmerkende funkties. Aktivatie van M1, M3 & M5 receptoren resulteert in verhoogde intracellulair calcium signalisering. In tegenstelling daarmee inhiberen geaktiveerde M2 & M4 receptoren adenylaat-cyclase [ACs; enzymen van belang bij het energie-metabolisme] aktiviteit en mediëren de werking van niet-seleltieve kation-kanalen, ‘transient receptor potential’ [TRP; zie ‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS] kanalen en kalium-kanalen.

nAChRs zijn snelle ionotrope nicotinerge receptor kanalen die de influx van kationen zoals kalium-, calcium- en natrium-ionen in de cel toelaten. Naar gelangd de combinatie van verschillende subunits, kunnen AChRs heteromeren of homomeren vormen [combinatie van verschillende of identieke subunits].

Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME) is een aandoening die wordt gekenmerkt door uitputtende vermoeidheid gepaard met stoornissen qua geheugen, cognitie en concentratie, alsook pijn en ontregeling van de gastro-intestinale, cardiovasculaire en immuun-systemen. [Lees o.a. onze meldingen over het werk van Ekua Brenu, Don Staines & Sonya Marshall-Gradisnik op deze pagina’s]

Belangrijk: er werd opgemerkt dat de perifere cholinerge werking abnormaal is bij CVS/ME-patiënten die worden blootgesteld aan Ach, waarbij het langer duurt voor bloeddoorstroming-pieken naar normale waarden terugkeren. Er werd ook verhoogde gevoeligheid voor ACh in het perifeer vasculair endotheel gemeld. [Khan F, Kennedy G, Spence VA, Newton DJ, Belch JJ. Peripheral cholinergic function in humans with Chronic Fatigue Syndrome, Gulf War syndrome and with illness following organophosphate exposure. Clin Sci (2004) 106: 183-189 /// Spence VA, Khan F, Kennedy G, Abbot NC, Belch JJ. Acetylcholine mediated vasodilatation in the microcirculation of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids (2004) 70: 403-407; zie ook ‘Bloed-circulatie abnormaal bij mensen met CVS] ACh beïvloedt de funktie van immuun-cellen en wordt aangemaakt en gesecreteerd door een brede waaier immuun-cellen, inclusief lymfocyten. Wij hebben, samen met anderen, gerapporteerd over veranderingen in immuun-cel fenotype en funktie, alsook cardiale en neurologische effekten bij de ziekte aangestipt. Daarnaast hebben we gerapporteerd over ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNPs) in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen bij CVS/ME-patiënten. [zie SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS] SNPs komen voor in de coderende sequenties, niet-coderende gebieden of inter-genitische regionen, waarbij deze SNPs – afhankelijk van hun locatie en de invloed van bijkomende ‘splicing’-mechanismen [Splicing: tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.] – kunnen leiden tot ziekte. Gezien deze rapporten, en de rol van TRPs en AChRs bij cellulaire funkties, was het doel van de huidige studie om SNPs in AChRs te onderzoeken bij dezelfde groep CVS/ME-patiënten waarbij we eerder TRP SNP-anomalieën hadden gerapporteerd.

Methodologie

Individuen. […] 1994 CDC criteria voor CVS. 115 CVS/ME-patiënten en 90 niet-vermoeide controles. […]

DNA-extractie. […]

SNP-genotypering studies. […]. Er werden aangepaste testen ontwikkeld voor 464 SNPs over 9 (zoogdier) acetylcholine receptor genen (M1, M2, M3, M4, M5 alfa 2, 5, 7 & 10) […].

Statistische analyse. […] significantie P-waarde 0.05.

Resultaten

Deelnemers. Er werd een totaal van 115 CVS/ME-patiënten (leeftijd = 48,68 ± 1,06 jaar) – 84 (73,04%) vrouwen en 31 (26,96%) mannen – gerecruteerd. De 90 niet-vermoeide controles (leeftijd = 46,48 ± 1,22 jaar) omvatten 59 (65,56%) vrouwen en 31 (34,44%) mannen. Alle deelnemers waren van Europese afkomst. Alle deelnemers waren tussen 25 en 65 jaar, en sommigen werden uitgesloten op basis van symptomen en antwoorden op vragenlijsten (medicatie, co-morbide chronische ziekte, psychose of epilepsie, zwangerschap/borstvoeding, roken). […]

SNP-associatie studies. Van de 464 SNPs onderzocht in deze studie, werden er 393 succesvol geïdentificeerd bij beide deelnemende groepen. Van de 393 bleken er 17 significant geassocieerd met CVS. 9 van deze SNPs waren geassocieerd met mAChRM3 […], terwijl de rest geassocieerd was met nAChR alfa-10 […], alfa-5 ([…] en alfa-2 […].

Bespreking

Deze piloot-studie onthulde een aantal AChR SNP-variaties bij CVS/ME-patiënten. Specifiek: binnen de coderende sequenties van 9 AChR-genen (op 464 onderzochte SNPs), werden 17 allelen gevonden die significant geassocieerd zijn met CVS/ME vergeleken met niet-vermoeide controles. Bovendien waren deze allelen gelegen in de gen-sequentie van één van de muscarine acetylcholine receptoren (mAChRM3) en 3 nicotinerge acetylcholine alfa receptoren (nAChRa2, nAChRa5 & nAChRa10). Interessant was dat we, in onze eerdere studie, een aantal SNPs identificeerden in de TRP-familie, nl. TRPM3. Het belang van SNPs in mAChRM3 en TRPM3 is dat de laatste met mAChRM3 koppelt en geaktiveerd kan worden door ACh.

Er is weinig informatie beschikbaar over de rol van deze AChR SNPs. Gewijzigde ‘splicing’ in de niet-coderende sequenties zou echter een significante, onverwachte uitkomst van het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. ‘Splicen’ van genetische varianten die intron-varianten zijn, speelt een rol bij gewijzigde ‘splicing’-mechanismen, resulterend in diverse proteïne-isoformen [verschillende vormen van één proteïne]. […] Belangrijk is dat een aantal intron-varianten in de SNPs geassocieerd was met de werking van gladde spieren en de ademhaling […], neurocognitieve funktie […], neuropathische pijn […] en maag-funktie […]. Daarnaast rapporteren we hier het SNP rs6669810, verantwoordelijk voor het gen ART1, een ADP-ribosyltransferase dat de ADP-ribosylering [De biologische funktie van ADP-ribosylering is gerelateerd met DNA-herstel, apoptose en ziekte-respons. Een hypothese stelt dat oxidanten en vrije radikalen het DNA beschadigen, oxidatieve stress zou via het ADP-ribosylering mechanisme DNA-herstel kunnen initiëren.] van arginine-residuen in proteïnen katalyseert, bij CVS/ME-patiënten. Mono-ADP-ribosylering is een post-translationele modificatie [verandering in de eiwitten na de vertaling vanuit RNA] van proteïnen aangetast door een waaier aan bakteriële toxinen, inclusief cholera, kinkhoest en hitte-labiele enterotoxinen van Escherichia coli. Interessant is dat researchers melding hebben gemaakt van verhoogde virale ladingen, met ademhaling geassocieerde ziekten, neurocognitieve veranderingen en neuropathische pijn bij CVS/ME-patiënten. [Meeus M, Nijs J. Central sensitization: a biopsychosocial explanation for chronic widespread pain in patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome. Clin Rheumatol (2007) 26: 465-473 /// Ocon AJ, Messer ZR, Medow MS, Stewart JM. Increasing orthostatic stress impairs neurocognitive functioning in Chronic Fatigue Syndrome with postural tachycardia syndrome. Clin Sci (2012) 122: 227-238; zie ‘Neurocognitie & cerebrale bloeddoorstroming bij CVS+POTS’ /// Smith AP, Thomas M, Borysiewicz L, Llewelyn M. Chronic Fatigue Syndrome and susceptibility to upper respiratory tract illness. Br J Health Psychol (2010) 4: 327-335]

Er werden SNPs gevonden in mAChR receptoren die verantwoordelijk zijn voor het initiëren van de samentrekking van gladde spieren, zoals in het gastro-intestinaal en genito-urinair kanaal, alsook voor effekten in immuun-cellen, epitheliale, ovariële en ooglens-cellen, en klieren. Daarnaast werden ook nAChRs gerapporteerd op T- en B-lymfocyten. Menselijke T-lymfocyten brengen de α3, α4, α7, ß2 & ß4 receptor-subunits tot expressie, terwijl bij muis en mens thymus mAChR expressie een rol bleek te spelen bij T-lymfocyten ontwikkeling en proliferatie. Er werden ook α4 of α7 subunits gerapporteerd op B-lymfocyten en die bleken proliferatie te stimuleren en antilichaam-produktie te doen dalen. Dergelijke bevindingen bieden mogelijks inzicht betreffende de hier gevonden SNPs, want eerdere onderzoeken hebben melding gemaakt van gecompromitteerde immuun-funktie bij CVS/ME. Belangrijk: veranderingen qua aantallen en werking van lymfocyten, zoals ‘natural killer’ (NK) lymfocyten en T- & B-lymfocyten, suggereren een verhoogde influx van Ca2+.

De mAChRM3 receptoren bevinden zich in het maag-darm-kanaal en worden ten dele gecontroleerd door het parasympathisch zenuwstelsel via de nervus vagus. Bovendien tonen klinische gegevens dat nAChRs betrokken zijn bij inflammatoire darm-ziekte. CVS/ME-patiënten vertonen dikwijls gastro-intestinale klachten, zoals prikkelbare darm syndroom en constipatie.

Ontregeling van mAChRM3 receptoren kan metabole en cardiale responsen beïnvloeden. In een normale alvleesklier spelen mAChRM3 receptoren een rol bij het reguleren van de insuline- en glucagon-secretie. Er werd gerapporteerd dat muscarine ACh receptoren tot expressie gebracht door pancreatische ß-cellen een significante rol spelen bij het handhaven van gepaste insuline-afgifte en glucose-homeostase. Veranderingen in Ca2+-gemedieerde kanalen kan resulteren in nadelige uitkomsten qua glucose-metabolisme bij CVS/ME-patiënten. Pancreatische ß-cellen zijn afhankelijk van kortstondige veranderingen in Ca2+ om de complexe sequentie gebeurtenissen te initiëren die resulteert in insuline-afgifte na blootstelling aan glucose. Zodoende kan worden geargumenteerd dat afwijkende intracellulaire Ca2+-concentraties omwille van de plooibare AChR-aktiviteit, de gebruikelijke en noodzakelijke opéénvolgende gebeurtenissen die vereist zijn om de insuline-respons op glucose te initiëren, zal verhinderen bij CVS/ME-patiënten.

Cardiale mAChRM3 receptoren hebben een ganse reeks pathologische en fysiologische funkties. mAChM2 is niet de enige muscarine receptor betrokken bij de werking van het hart. De mAChRM3 parasympathische controle van de cardiale funktie is goed gekend. […] Er zijn bevindingen die impliceren dat gebruik van een muscarine receptor agonist [stof die de mAChR aktiveert] een effekt kan hebben op de werking van de sino-atriale (SA) knoop [belangrijkste pacemaker van het hart; een groep cellen in de wand van de rechter-boezem die het hart er periodiek toe aanzet om een contractie uit te voeren], waarbij verstoringen van de gepaste cardio-regulerende mechanismen verergert, in het bijzonder in een omgeving waar intracellulaire Ca2+-concentraties waarschijnlijk gewijzigd zijn door de directe effekten van receptor-aktiviteit. Er zouden klinische gevolgen zoals gewijzigde orthostatische cardiovasculaire responsen voorspeld kunnen worden en dit kan overéénkomen met de symptomen van CVS/ME.

In het vasculair systeem, bevat het endotheel nAChRs, inclusief α3, α5, α7, α10, ß2, ß3 & ß4. Afhankelijk van het type gladde-spier, is een specifiek subtype nAChR aanwezig: α3 en α5 worden gevonden in arterieën, terwijl α7 wijdverspreid is (hoewel niet aanwezig in de bloedcirculatie van de nieren). nAChR α5, α7, ß2 & ß3 werden gevonden in endotheliale cellen van de hersenen en zijn een belangrijke component van de bloed-hersen-barrière. Deze studie identificeerde SNPs in de α5 en α3 nAChR subunits, wat anomalieën van de signaal-transductie in onze patiënten-groep impliceert. Er werd gerapporteerd dat nAChRs betrokken zijn bij waken, slaap en vermoeidheid, alsook die funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie.

Besluit

We rapporteren voor de eerste keer over de aanwezigheid van SNPs in receptoren voor ACh bij patiënten met CVS/ME. Er zijn vele schadelijke gevolgen voor de fysiologische homeostase mogelijk door de afwijkende werking AChR bij deze patiënten. Deze scenario’s vergen verder onderzoek om vast te stellen of de in deze studie geïdentificeerde AChR SNPs resulteren in een gewijzigde funktie en geassocieerd zouden kunnen zijn met de pathomechanismen en symptomatologie van CVS/ME.

mei 29, 2015

SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:31 am
Tags: , , , , ,

We rapporteerden op deze pagina’s al meermaals over de mogelijke impact bij M.E.(cvs) van zgn. SNPs in bepaalde genen. Zie onder meer ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’.

TRP-kanalen zijn ion-kanalen die cellen triggeren om te reageren op veranderingen in hun omgeving; deze kunnen worden veroorzaakt door pathogenen, oxidatieve stress, chemische stoffen, toxinen en gewijzigde zuurtegraad. In ‘Sensory TRP channels: the key transducers of nociception and pain’ (Prog Mol Biol Transl Sci. (2015)131: 73-118) lezen we: “Bij de perifere detektie van nociceptieve en pijnlijke stimuli door sensorische neuronen is een ingewikkeld repertoire van molekulaire detektoren en transducers betrokken op bepaalde zenuw-vezels. De meerderheid van die detektoren/transducers behoort tot de ‘transient receptor potential’ (TRP) familie.”. TRPs zijn bij meerdere ziekten verstoord. Het is dus mogelijk dat bepaalde variaties (SNPs) in de genen coderend voor TRP ion-kanalen geassocieerd zijn met M.E.(cvs).

De Australische researchers die onderstaand artikel publiceerden vonden dat de frequentie van 13 SNPs significant verschilde tussen M.E.(cvs) en controles. 9 daarvan lagen in het TRPM3 gen, 2 in het TRPA1 gen en 2 in het TRPC4 gen. De resultaten zijn nog preliminair maar ze geven aan dat genetische wijzigingen in TRP ion-kanalen (receptoren van belangrijke signalisering-mechanismen betrokken bij de werking van cellen en het immuunsysteem, en het reageren op bedreigingen) een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling of het doen voortduren van M.E.(cvs).

De meldingen van SNPs bij M.E.(cvs) kunnen worden omschreven als ‘hypothese-genererend’. De vondsten kunnen worden voor het nader onderzoeken van specifieke gebieden van het genoom. Het is wel waarschijnlijk dat een complexe chronische ziekte zoals M.E.(cvs) het resultaat is van een groot aantal SNP-varianten die samen zorgen voor stoornissen.

Zie verder o.a. ook ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’, ‘Variaties in Pijn-perceptie zijn Genetisch bepaald’ en ‘Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is’.

————————-

Immunology and Immunogenetics Insights Vol 7, pp 1-6 (2015)

Examination of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Transient Receptor Potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients

Sonya M. Marshall-Gradisnik (1,2,*), Peter Smith (2), Ekua W. Brenu (1,2), Bernd Nilius (3), Sandra B. Ramos (1,2) & Donald R. Staines (2)

1 School of Medical Science

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, Australia

3 Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Ion Channel Research, KU Leuven, Belgium

Samenvatting

Achtergrond. De ‘transient receptor potential’ (TRP) super-familie omvat bij mensen 27 kation-kanalen met doorlaatbaarheid voor monovalente en divalente kationen [één- of twee-waardig positief geladen ionen]. Deze kanalen komen bij mensen op vele cellen en weefsels tot expressie en ze hebben significante sensorische en regulerende rollen bij de meeste fysiologische funkties. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen.

Doelstellingen. Het doel van deze studie was om de rol te bepalen van TRPs bij CVS.

Methodes. De studie omvatte 115 CVS-patiënten […] en 90 niet-vermoeide controles […]. De CVS-patiënten werden gedefinieerd volgens de 1994 CDC criteria voor CVS. Er werden in het totaal 240 ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNPs) bij 21 TRP ion-kanaal genen (TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5 & TRPV6) bepaald. […]

Resultaten. Er waren 13 SNPs significant geassocieerd met CVS vergeleken met de controles. Daarvan waren er 9 SNPs geassocieerd met TRPM3 […], terwijl de rest was geassocieerd met TRPA1 […] en TRPC4 […].

Besluit. De gegevens van deze piloot-studie suggereren een associatie tussen TRP ion-kanalen – voornamelijk TRPM3 – en CVS. Deze en andere TRPs kunnen bijdragen tot de etiologie en het pathomechanisme van CVS.

Inleiding

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen zijn kation-kanalen met een vermeende rol bij vele fysiologische signalisering-mechanismen. Bij zoogdieren omvatten TRPs 6 groepen: TRPA (ankyrine), TRPC (kanoniek), TRPM (melastatine), TRPML (mucolipine), TRPP (polycystine) en TRPV (vanilloïd). In het algemeen zijn de TRPC-kanalen niet-selektieve kation-kanalen; slechts 2 zijn zeer doorlaatbare Ca2+-kanalen en 2 zijn ondoorlaatbaar voor Ca2+. Belangrijk is dat meerdere TRPs doorlaatbaar zijn voor Mg2+ en Zn2+. TRPs komen uitgebreid tot expressie op bijna alle cellen en hebben daarom waarschijnlijk significante effekten op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, inclusief chronische pijn, over-aktieve blaas, diabetes, chronische obstructieve long-ziekte, cardiale hypertrofie [verdikking hartwand], familiale Alzheimer’s, huid-ziekten, skeletale dysplasiën [misvormingen van bot/kraakbeen], motor-neuropathieën, neurosensorische neuropathieën inclusief de ziekte van Charcot-Marie-Tooth [verzamelnaam voor een aantal erfelijke ziekten waarbij de zenuwen zijn aangetast] (type 2C) en kanker. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd na schommelingen of afwijkingen in de cellulaire omgeving. Factoren die deze veranderingen kunnen beïnvloeden zijn stressoren zoals pathogenen, temperatuur, druk, chemische stoffen, oxidatie/reductie, toxine, osmolariteit en pH.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen. Research suggereert significante immuun-stoornissen; het mechanisme van deze aandoening dient echter nog te worden bepaald. CVS-patiënten kunnen reakties vertonen op een aantal omgeving- en biologische factoren. Bovendien is er bewijs dat suggereert dat CVS een allergische component zou kunnen hebben. Atypische TRP-expressie werd gerapporteerd bij CVS; in het bijzonder upregulering van de expressie van TRPV1. [Light AR, Bateman L, Jo D et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia syndrome. J Intern Med. (2012) 271: 64-81; zie Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM] Aangezien TRPs een overvloed aan fysiologische signalisering-mechanismen reguleren, zouden ze een rol kunnen spelen bij CVS. Een aantal channelopathieën [ziekten veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanalen; zie o.a. ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS] bleken geassocieerd met TRP-genen en die hebben gevolgen voor de cellulaire funktie. Daarnaast kunnen TRP-kanalen een doelwit zijn tijdens inflammatoire reakties, aangezien ze makkelijk geaktiveerd worden in aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen. Daarnaast rapporteren CVS-patiënten een significante sensitiviteit voor toxinen en irriterende stoffen uit de omgeving, maar de oorzaken van deze gevoeligheden dienen nog te worden uitgeklaard. Het doel van deze piloot-studie was om te bepalen of polymorfismen in SNPs geassocieerd met TRP ion-kanaal genen een bijdragende factor zijn in de pathogenese van CVS.

Methodologie

Deelnemers. Er werden 115 CVS-patiënten en 90 niet-vermoeide controles gerecruteerd voor deze studie. Van de 115 CVS-patiënten (leeftijd 48,68 ± 1,06 jaar), waren er 84 (73,04%) vrouwen en 31 (26,96%) mannen. De 90 niet-vermoeide controles (leeftijd = 46,48 ± 1,22 jaar) omvatten 59 (65,56%) vrouwen en 31 (34,44%) mannen. De CVS-patiënten warden gedefinieerd volgens de 1994 criteria van het ‘Centre for Disease Prevention and Control’ (CDC) voor CVS. Alle deelnemers waren van Europese afkomst en inwoners van Australië […].

DNA-extractie. […]

SNP-genotypering. […]

Statistische analyse. […]

Resultaten

SNP associatie studies. Van de 240 SNPs die hier werden onderzocht, warden er 233 succesvol geïdentificeerd in beide groepen. 13 bleken significant geassocieerd met CVS. 9 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3 (rs12682832; P ≤ 0.003, rs11142508; P ≤ 0.004, rs1160742; P ≤ 0.08, rs4454352; P ≤ 0.013, rs1328153; P ≤ 0.013, rs3763619; P ≤ 0.014, rs7865858; P ≤ 0.021, rs1504401; P ≤ 0041, rs10115622; P ≤ 0.050), terwijl de overblijvende SNPs geassocieerd waren met TRPA1 (rs2383844; P ≤ 0.040, rs4738202; P ≤ 0.018) en TRPC4 (rs6650469; P ≤ 0.016, rs655207; P ≤ 0.018).

Bespreking

Het doel van deze piloot-studie was om de aanwezigheid te bepalen van mogelijke SNP-variaties bij CVS-patiënten, met een specifieke focus op SNPs in de coderende sequenties van 21 TRP ion-kanaal genen. Van de 240 onderzochte SNPs, bleken 13 allelen significant geassocieerd met CVS-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Aangezien CVS een heterogene aandoening is, is het waarschijnlijk dat verdere stratificatie van patiënten meer allel-associaties zou kunnen aantonen. Deze allelen waren gelegen in de gen-sequentie van één van de kanonieke TRP ion-kanalen (TRPC4), één ankyrine (TRPA1) en één melastatine TRP ion-kanaal (TRPM3).

SNPs die in een coderende sequentie zijn gelegen veranderen de amionozuur-sequentie van het geproduceerde proteïne al dan niet noodzakelijkerwijs. Een SNP dat de polypeptide-sequentie niet wijzigt, draagt de term ‘synoniem’ (soms een ‘stille variant’ genoemd), terwijl naar een SNP dat resulteert in een verschillende polypeptide-sequentie wordt verwezen als ‘niet-synoniem’ (mogelijks resulterend in gewijzigde gen-transcripten en ziekte-fenotypes). In dit onderzoek rapporteren we TRP SNP-anomalieën, suggererend dat ze de mogelijke aanvang of klinische presentatie van CVS kunnen mediëren; dit dient echter te worden bevestigd bij grotere groepen. Niettemin suggereert deze studie de mogelijke rol voor afwijkende TRPs bij CVS. Verdere uitleg, waarbij wordt aangetoond dat TRPs significante fysiologische rollen spelen, wordt hieronder verstrekt. In het bijzonder: CVS-patiënten rapporteren symptomen die geassocieerd zouden kunnen zijn met afwijkende TRP-funktie.

TRPC4 wordt geaktiveerd via receptor-afhankelijke aktivatie van het Gq/11/PLC (fosfolipase-C)/γ mechanisme maar ook via Gαi proteïnen, PI(4,5)P2 proteïnen en ook intracellulair Ca2+. Het is voornamelijk betrokken bij vasomotor-funktie [vaat-verwijding en -samentrekking], aggregatie van bloedplaatjes en werking van gladde spieren. Ca2+ staat ook bekend vereist te zijn voor de regulering van immuun-cellen, aangezien het werkt als een tweede boodschapper [na aktivatie van G-proteïne gebonden receptoren ontstaan er intracellulair zogenaamde ‘second messengers’ die, na een aantal biochemische tussenstappen, zorgen voor het uiteindelijk fysiologisch effekt] voor de meeste cellen, bijzonderlijk T- en B-cellen. Intracellulair Ca2+ verhoogt wanneer lymfocyt-receptoren worden blootgesteld aan antigenen. Bij CVS-patiënten zijn er talrijke meldingen over gecompromitteerde immuun-funktie, maar er is slechts beperkte informatie over de rol van Ca2+ bij deze patiënten. Ontregeling van TRPCs kan echter de intracellulaire calcium-concentratie beïnvloeden en desgevallend de lymfocyten-funktie. Lymfocyten zoals ‘Natural Killer’ (NK) cellen en T-cellen bleken gecompromitteerd bij CVS. In NK-cellen versterkt Ca2+ de cytotoxische aktiviteit, en de uitputting of overmatige toevloed ervan kan ernstige gevolgen hebben op de werking van NK-cellen. Bij CVS werd verminderde cytotoxische aktiviteit consistent gerapporteerd [Brenu EW, Huth TK, Hardcastle SL et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-242 = ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Ashton KJ, van Driel M et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269 = ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88 /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 = ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Staines DR, Baskurt OK et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8: 1 = ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ /// Barker E, Fujimura SF, Fadem MB, Landay AL, Levy JA. Immunologic abnormalities associated with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis. (1994) 18: S136-S141] en dit zou verband kunnen hebben met de ontregeling van Ca2+.

Ontregeling van TRPCs kan neuronale responsen beïnvloeden, in het bijzonder deze die geassocieerd zijn met de stimulatie van muscarine receptoren [werken als belangrijkste eind-receptor gestimuleerd door acetylcholine in het parasympathisch zenuwstelsel]. Na aktivatie van TRPCs door fosfolipase-C, treedt een influx van Ca2+ op, wat een inductie in muscarine receptoren veroorzaakt en onophoudelijk neuronaal ‘vuren’ [‘overbrengen van signalen’] onderhoudt. Secretie van Ca2+ en de beschikbaarheid van TRPCs in het neuronaal milieu zijn daarom van uiterst belang voor de optimale werking van muscarine receptoren en de globale werking van de hersenen. Belangrijk: dit proces is essentieel voor het geheugen, de aandacht, sensorische scherpte, emotie, pijn en motor-controle, en gebeurt in de amygdala, entorhinale cortex [bepaald deel van de hersenschors; o.a. van belang bij het geheugen], hippocampus en pre-frontale cortex. Neuronale gebreken met betrekking tot het geheugen en de aandacht werden geïdentificeerd bij CVS. [o.a. Nakatomi Y, Mizuno K, Ishii A et al. Neuroinflammation in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an 11C-(R)-PK11195 PET Study. J Nucl Med. (2014) 55: 945-950; zie ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie] Het gebrek/fouten aan TRPC4 kunnen ook de darm-funkie beïnvloeden. TRPC4 en TRPC6 vormen een paar met muscarine receptoren in de darm, wat depolarisatie van gladde spieren, toevloed van of Ca2+ en contractie van gladde spieren aktiveert. Intestinale dysfunktie is een component van CVS [Lakhan SE, Kirchgessner A. Gut inflammation in Chronic Fatigue Syndrome. Nutr Metab. (2010) 7: 79]; de mate van beschadiging aan de darm-wand of de exacte rol van ion-kanalen in de darm dient echter te worden bepaald. TRPC4 zou simultaan geregeld kunnen worden door G-proteïne gekoppelde receptoren [GPCRs; signaaloverdracht via een trans-membranair systeem, de G-eiwit receptor].

TRPA1 is een receptor voor meerdere chemische stoffen die werd geïdentificeerd op nociceptieve sensorische neuronen (C-vezels) en heeft een rol bij de regulering van de afgifte van neuropeptiden, pijn-sensatie en inflammatie. Het kan worden geaktiveerd door zowel exogene als endogene inflammatoire agentia, resulterend in inflammatie en pijn. GPCRs aktiveren ook TRPA1 via PLC-signalisering, waardoor het ion-kanaal wordt gesensitiseerd voor verscheidene stimuli. TRPA1 kan worden geaktiveerd en daaropvolgend geïnaktiveerd in aanwezigheid van intracellulaire en extracellulaire calcium-concentraties. Er werd voorgesteld dat het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli beïnvloedt; daarom zou bij CVS-patiënten met SNPs in het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli verhoogd kunnen zijn. In het centraal zenuwstelsel brengen astrocyten TRPA1-kanalen tot expressie en deze kanalen zijn nodig voor calcium-opname en neuronale regulering in de astrocyten. Veranderingen in qua calcium kunnen daarom de werking van astrocyten en communicatie tussen neuronen aantasten. Er werd aangetoond dat aktivatie van TRPA1 acute hoofdpijn kan induceren en dit zou kunnen gebeuren via het calcitonine-gen gerelateerd peptide [CGRP; het proteïne wordt geproduceerd door neuronen, is een krachtige vasodilator, kan tussenkomen bij pijn-transmissie], wat vasodilatie [vaat-verwijding] in de meningeale arterie [naar de hersenvliezen] kan veroorzaken. Belangrijk: hoofdpijn is een prominent symptoom van CVS. TRPA1 speelt ook een sleutelrol bij migraine, en neuropathische gewricht- en spier-pijn, die dikwijls wordt ervaren door patiënten met fibromyalgie. TRPA1 vormt funktionele hetero-tetrameren met TRPV1; daarom zouden variaties in het TRPA1 gen op funktionele gebreken aan TRPV1 kunnen wijzen, die misschien niet gerelateerd zijn aan een nucleotide-polymorfisme. Belangrijk ook is dat Spaanse onderzoekers rapporteerden dat TRPV1 bijdraagt tot de genetische voorbestemdheid voor migraine (grote studie bij 500 Spaanse deelnemers), wat suggereert dat TRPA1 en TRPV1 een rol kunnen spelen bij de symptoom-presentatie van CVS. Interessant is dat analgetica en anti-nociceptieve medicijnen gericht zijn op, respectievelijk, TRPV1 en TRPA1 om de pijn-sensatie te verlichten [tramadol, paracetamol cannabinoïden], en deze medicijnen worden routinematig voorgeschreven aan CVS-patiënten. Misschien zijn deze medicijnen bij CVS wel niet meer doeltreffend omwille van de stoornissen of variaties in deze ion-kanalen.

TRPM-kanalen zijn meestal doorlaatbaar voor magnesium en calcium. Enkel TRPM4 en TRPM5 zijn ondoorlaatbaar voor twee-waardige kationen. TRPM3 is doorlaatbaar voor kationen inclusief Ca2+ en Zn2+. Het doorlaatbaarheid-profiel hangt echter erg af van de tot expressie gebrachte variant. Er werd tot op heden geen erfelijke TRPM3 channelopathie beschreven. TRPM3 bleek betrokken bij inflammatoire pijn syndromen, Reumatoïde Arthritis en afgifte van pro-inflammatoire cytokinen. Aangezien pancreatische [insuline-producerende] β-cellen ook een groot aantal of TRPM3-kanalen dragen, bestaat de kans op verstoringen in de insuline/glucose-regulering bij CVS-patiënten. Metabole verstoring werd sinds lang geïdentificeerd als een kardinaal kenmerk van CVS. Bij mensen werd TRPM3 het meest gekarakteriseerd in het centraal zenuwstelsel en de ogen, waar een mis-sense mutatie [punt-mutatie waarbij een wijziging van één nucleotide resulteert in een ander aminozuur in het proteïne] van het TRPM3 gen ook ten grondslag bleek te liggen aan de ontwikkeling van katarakt en glaucoom. TRPM3 is betrokken bij de detektie van warmte en bij pijn-transmissie. TRPM3-deficiënte muizen vertonen duidelijke gebreken wat betreft hun vermijding-responsen ten aanzien van schadelijke warmte en bij de ontwikkeling van inflammatoire hitte hyper-algesie. Ontregeling van de thermoregulerende responsen werd gerapporteerd bij CVS-patiënten. Veralgemeende pijn is een kenmerk van CVS en treedt op in afwezigheid van weefsel-schade, en dit is suggestief voor mogelijke stoornissen van het centraal zenuwstelsel. [Meeus M, Nijs J. Central sensitization: a biopsychosocial explanation for chronic widespread pain in patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome. Clin Rheumatol. (2007) 26: 465-473; zie ook ‘Centrale sensitisatie & pijn-behandeling] Aangezien TRPM3 een rol speelt bij nociceptie en thermoregulering, zou het van belang kunnen zijn bij het pathomechansime van CVS. Daarnaast wordt TRPM3 geaktiveerd door pregnenolon-sulfaat [pregnenolon = een endogeen steroïd-hormoon, de voorloper van progestogenen, mineralo- en gluco-corticoïden, androgenen, oestrogenen en neuro-aktieve steroïden], wat suggereert dat het neuro-endocriene effekten heeft en het zou ook betrokken kunnen zijn bij de regulering van glutamaterge signalisering [via de neurotranimitter glumataat] in de hersenen.

Deze preliminaire bevindingen impliceren TRP ion-kanalen bij de etiologie en het pathomechanisme van CVS. Ontregeling van TRPs, inclusief de TRPM3-familie, is waarschijnlijk betrokken bij het vatbaar maken van CVS-patiënten voor stoornissen in het calcium-metabolisme en loopt evenwijdig met de symptoom-presentatie. Mogelijks zullen de ontregelde influx van calcium-ionen in de cellen een impact hebben op een aantal vitale componenten van de cel-regulerende machinerie. Deze componenten omvatten calcium-gevoelige adenylaat-cyclasen [ACs; enzymen van belang bij het energie-metabolisme] en dus cAMP-expressie en -funktie [cyclisch AMP; een signalisering-molekule]. Zo zouden bv. geïsoleerde cel-types, waarvan werd aangetoond dat ze calcium-sensitieve cel-regulerende mechanismen vertonen bij CVS-patiënten, voor verdere opheldering van TRP ion-kanalen en de waarschijnlijke gevolgen bij CVS kunnen zorgen. Bovendien dienen bevolking-analyse van TRP-SNPs wat betreft vatbaarheid voor CVS, alsook onderzoek van de voorgestelde subtypes, te worden overwogen. Dit zal waarschijnlijk van aanzienlijk belang blijken voor de publieke gezondheid, alsook voor researchers bij het bepalen van de rol van TRP ion-kanalen bij de CVS-symptomatologie, -ernst en -voorbestemdheid.

mei 15, 2015

Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:39 am
Tags: , , , ,

In onderstaand artikel catalogeren de auteurs M.E.(cvs) als een ‘funktionele ziekte’ (zie hierna voor uitleg over ‘funktionele syndromen’). Mede-auteur Prof. Jonathan Kerr (zie o.a. ook ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’) stelt echter in een ‘rapid reponse’ (British Medical Journal 2015; 350:h2087; mei 2015) nog eens dat M.E.(cvs) kan worden getriggerd door infekties, vaccins, enz. en dat bij de pathogenese langdurige immuun-aktivatie betrokken is. Hij stelt ook klaar en duidelijk dat cognitieve gedragtherapie slechts weinigen helpt en dat graduele oefen therapie niet zou mogen worden gebruikt bij M.E.(cvs).

 

Funktionele somatische syndromen (FSS; een term van de psychologische school) – multipele chemische sensitiviteit, ‘sick building’ syndroom, repetitieve stress letsel, bijwerkingen van siliconen borst-implantaten, Golf Oorlog syndroom, chronische ‘whiplash’, Chronische Vermoeidheid Syndroom, prikkelbare darm syndroom, fibromyalgie, enz. – worden gedefinieerd als “lichamelijke syndromen zonder een verklaring voor organische ziekte, aantoonbare strukturele veranderingen of vastgestelde biochemische abnormaliteiten”. Een aantal klinici aanvaarden dat deze aandoeningen reëel zijn. Psychologen/psychiaters stellen echter (pseudo-wetenschappelijk): “Hoewel discrete pathofysiologische oorzaken uiteindelijk kunnen worden aangetoond; wordt bij sommige patiënten met FSS hun lijden verergerd door een zichzelf in stand houdende, zelf-bevestigende cyclus, waarbij courante symptomen foutief worden toegeschreven aan een ernstige abnormaliteit en waardoor het geloof van de patient dat zij/hij een ernstige ziekte heeft, wordt versterkt. Enz.”…

Een funktioneel symptoom is een medisch symptoom dat wordt beschouwd als ontstaan door een probleem in de werking van het zenuwstelsel en niet veroorzaakt door een struktureel probleem of pathologische gedefinieerde ziekte. Het mag uit onze bijdragen hier duidelijk zijn dat er bij M.E.(cvs)wel degelijk strukturele/organische/somatische problemen zijn. FSS is, zoals cvs, een ‘vuilbak-diagnose’. De term wordt hier wellicht gebruikt als synoniem voor ‘onverklaard’ (men erkent de symptomen maar er lijkt niets abnormaals te worden gevonden). De researchers lijken geïnteresseerd om te blijven zoeken naar een verklaring die niet psychologisch is. De criteria waarop de M.E.(cvs)-patiënten werden geselekteerd zijn de Fukuda criteria, weliswaar niet de Canadese Consensus Criteria maar ook niet de Oxford Criteria (waar ook individuen met stemming-stoornissen de diagnose cvs krijgen). De auteurs concluderen ten slotte ook dat de mitosomatische” ziekte (lees: “probleem met de werking van de mitochondrieën”) wellicht een meer accurate term is dan “psychosomatische” ziekte.

Naast het chromosomaal kern-DNA is er in cellen ook zgn. mitochondriaal DNA aanwezig. Dit mtDNA bevindt zich niet in de cel-kern maar in de mitochondrieën. Elk mitochondrion bevat vele circulaire chromosomen die allemaal dezelfde genen bevatten, maar niet steeds identiek zijn (door mutaties en ‘polymorfismen’). Het dubbelstrengig mtDNA bij de mens bevat 37 genen: 22 coderen voor transfer-RNA (van belang bij translatie van mRNA naar eiwitten), 2 voor ribosomaal-RNA (belangrijk bij proteïne-synthese) en de overige 13 voor proteïnen (enzymen betrokken bij de energie-produktie, de belangrijkste taak van het mitochondrion). Het mitochondriaal DNA erft normaal enkel over via de vrouwelijke lijn. De mitochondrieën van de mannelijke zaadcel bevinden zich in de staart, die bij de bevruchting meestal niet de eicel binnentreedt. Een genetische afwijking in het mtDNA van de moeder wordt zodoende overgedragen op alle nakomelingen.

Mitochondriaal DNA bestaat uit amper 16.500 nucleotiden (drie miljard in het nucleair DNA). Polymorfie is het voorkomen van een veranderde nucleotiden-code voor een bepaald gen die bij een dusdanig groot percentage van de populatie voorkomt dat niet meer van een mutatie kan worden gesproken. Volgens de definitie komen polymorfismen bij meer dan 1% van de populatie voor. In geval van gen-veranderingen die meer zeldzaam zijn (voorkomen minder dan 1%), wordt van mutaties gesproken. Polymorfismen kunnen vaak heel kleine varianten zijn van bijvoorbeeld één nucleotide lang (‘single’ nucleotide polymorfiisme of SNP), maar ze kunnen ook veel groter zijn (bv. deleties of duplicaties). Ze ontstaan door een fout tijdens de DNA-replicatie die niet gerepareerd wordt door DNA-herstel-mechanismen. Polymorfismen blijven in een populatie in stand en kunnen zich zelfs uitbreiden, juist doordat ze geen nadeel opleveren voor de vruchtbaarheid van het organisme; zo kan dit polymorfisme hierdoor worden doorgegeven aan het nageslacht. Het door het polymorfisme veranderde gen produceert proteïnen/enzymen met een lagere binding-capaciteit voor haar co-enzyme. Dit kan leiden tot een groot aantal veel-voorkomende ziektebeelden en stoornissen. Daarnaast bestaan er een aantal ras-specifieke polymorfismen.

 

Dit artikel hoort o.i. thuis in de reeks artikels die bewijs leveren voor een genetische overerving van M.E.(cvs) (zie bv. ‘Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is’, ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’ & ‘Bewijs voor erfelijke voorbestemming tot CVS’) en rechtvaardigt zeker verder onderzoek naar fouten in het mtDNA bij M.E.(cvs)-patiënten.

————————-

Mitochondrion [pre-print april 2015]

Increased prevalence of two mitochondrial DNA polymorphisms in functional disease: Are we describing different parts of an energy-depleted elephant?

Boles RG1, Zaki EA2, Kerr JR3, Das K2, Biswas S2, Gardner A4

1Division of Medical Genetics and the Saban Research Institute, Children’s Hospital Los Angeles, CA, USA; Department of Pediatrics, Keck School of Medicine at the University of Southern California, Los Angeles, CA, USA

2Division of Medical Genetics and the Saban Research Institute, Children’s Hospital Los Angeles, CA, USA

3Division of Clinical Sciences, St. George’s University of London, Cranmer Terrace, London, United Kingdom

4Department of Clinical Neuroscience, Division of Psychiatry, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden

Samenvatting

Ongeveer 20% van bevolking lijdt aan “funktionele syndromen”. Aangezien deze syndromen grotendeels overlappen in termen van co-morbiditeit, pathofysiologie (inclusief afwijkende autonome aktiviteit) en behandeling-responsen, veronderstelt men dat er gemeenschappelijke voorbestemmende genetische factoren zijn. We hebben eerder aangetoond dat 2 mitochondriale DNA (mtDNA) polymorfismen op plaatsen 16519 en 3010 statistisch geassocieerd zijn met de funktionele syndromen migraine, cyclisch braken syndroom en niet-specifieke abdominale pijn. Hier werd bij individuen van de mtDNA haplogroep H (HgH [zie Methodes]) de aanwezigheid van deze 2 mtDNA polymorfismen vastgesteld in bijkomende funktionele syndromen: Chronische Vermoeidheid Syndroom, complex regionale pijn syndroom, ‘sudden infant death syndrome’ [SIDS; wiegedood] en majeure depressie. De prevalentie van de polymorfismen werd vergeleken tussen ziekte- en controle-groepen, en binnen elke ziekte-groep bij individuen met en zonder klinische bevindingen. Bij elk van de 4 aandoeningen, was één of beide polymorfismen significant geassocieerd met de respectievelijke aandoening en/of co-morbide funktionele symptomatologie. We besluiten dat deze 2 mtDNA-polymorfismen waarschijnlijk het risico op het ontwikkelen van meerdere funktionele syndromen bepaalt en een aandeel vormt van de gepostuleerde gemeenschappelijke genetische factor, ten minste bij individuen met HgH. Bij de pathophysiologie zijn waarschijnlijk brede effekten op het autonoom zenuwstelsel betrokken.

1. Inleiding

“Funktionele” symptomen (o.a. pijn, misselijkheid en vermoeidheid), vormen de voornaamste reden waarom individuen professionele hulp zoeken in de “lichamelijke” en “mentale” gezondheidszorg. De oorzaak is in minstens een derde van de gevallen onverklaard. Prominente funktionele symptomen worden dikwijls toegeschreven aan syndromen op basis van symptoom-clusters aangegeven door consensus-criteria. Sommige funktionele syndromen zijn courant – prevalentie > 10% – bv. migraine en prikkelbare darm syndroom (IBS), terwijl andere minder vaak of zelden voorkomen maar kunnen resulteren in ernstige invaliditeit, bv. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), cyclisch braken syndroom en complex regionale pijn syndroom (CRPS).

Het samen voorkomen van funktionele syndromen wordt vaak vastgesteld: er werd bv. gerapporteerd dat 67% van de CVS-patiënten ook migraine hebben en 51% ook IBS. Een studie toonde een ‘odds ratio’ [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] van 2,5 voor het familiaal voorkomen van meerdere funktionele syndromen en dat het risico op verschillende funktionele syndromen zicht uitstrekte naar familieleden. De sterke syndroom-overlap bij individuen en in families suggereert de aanwezigheid van gemeenschappelijke genetische factoren. Het breed spectrum van enkele therapeutische middelen tegen meerdere funktionele syndromen ondersteunt dit concept [TCAs, tricyclishe antidepressiva, zoals bv. amitriptyline, imipramine, desipramine, doxepine en trimipramine]. Zou het kunnen dat de opsplitsing van “funktionele” ziekte in verschillende syndromen, dikwijls gedefinieerd door opdeling onder medische sub-specialteiten, dokters “blind” maakt […]?

Twee mogelijke verenigende principes bij funktionele ziekte zijn het autonoom zenuwstelsel en het energie-metabolisme. Afwijkende autonome funktie (dysautonomie [funktie-stoornis van het autonoom zenuwstelsel]) werd gedocumenteerd bij migraine, IBS, CVS [team van Julia Newton: Postural orthostatic tachycardia syndrome is an under-recognized condition in Chronic Fatigue Syndrome. QJM (2008) 101: 961-965; zie ook ander werk op deze paginas], cyclisch braken, CRPS en SIDS; dus is een effekt op autonome mechanismen een plausibel mechanisme voor de werking van een gemeenschappelijke genetische factor. Er werd een afwijkend energie-metabolisme (mitochondriale dysfunktie) aangetoond bij migraine, CRPS, CVS [werk door Sara Myhill et al.; zie ook ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’ en elders], cyclisch braken en SIDS. Er werd maternale overerving gerapporteerd bij migraine, cyclisch braken, depressie, IBS en SIDS; wat suggereert dat enkele van de gemeenschappelijke genetische factoren bij funktionele ziekten gecodeerd kunnen liggen op het maternaal overgeërfde, in het cytoplasma gelegen mitochondriaal DNA (mtDNA). Genomische sequentie-bepaling van het volledig mtDNA onthulde zeer statistisch-significante verbanden met de courante polymorfismen 16519T en 3010A bij cyclisch braken. Dezelfde 2 mtDNA-polymorfismen bleken sterk statistisch geassocieerd met migraine […]. De effekten van deze polymorfismen zijn sterk, aangezien de gegevens een prevalentie van 11% voorspellen voor individuen met 16519C, 28% voor individuen met 16519T, 95 en 74% voor individuen met 16519T en 3010A. Volwassenen met IBS wiens afstammelingen een waarschijnlijke maternale overerving vertoonden, bleken significant meer waarschijnlijk 16519T te dragen dan controles of IBS zonder maternale overerving. Verder bleken 3010A en/of het courante mtDNA-polymorfisme 7028T statistisch geassocieerd met IBS, niet-specifieke abdominale pijn en de fysiologische/autonome processen van maag-lediging, verzadiging en rectum-gevoeligheid. SIDS bleek geassocieerd met 16519T.

Het doel van deze studie was om te bepalen of mtDNA sequentie-variatie op plaats 16519 en 3010 geassocieerd zijn met de funktionele en met dysautonomie gerelateerde syndromen CVS en CRPS, en dus aan de basis kunnen liggen van de gedeelde genetische component van funktionele/dysautonome syndromen in het algemeen. We testten ook majeure depressie (MDD) waarbij migraine en IBS, aandoeningen gelinkt met dysautonomie, veelal vorkomen. Hoewel gegevens over co-morbiditeit (door de vroege mortaliteit) niet zeker waren, namen we ook SIDS, wat kan worden beschouwd als een dodelijke dysautonomie, op.

2. Methodes

2.1. Deelnemers

2.1.1. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS)

De CVS-patiënten waren volwassenen (18-65 jaar) […]. Allen hadden ze een klinische diagnose van CVS gekregen op basis van de CDC criteria (Fukuda et al. 1994). […] Een totaal van 162 deelnemers voldeed aan de criteria en onderging mtDNA haplo-groepering.

[…]

2.2. Molekulaire onderzoeken

[…] Onze eerdere studies werden uitgevoerd bij deelnemers van de courante West-Euraziatische mtDNA haplogroep H (HgH). [haplogroep = groep individuen die worden geklassificeerd a.h.v. het DNA] De experimentele en controle-deelnemers in de huidige studie waren dus ook HgH. De mtDNA haplogroepen geven belangrijke maternale afstamming-lijnen aan die tienduizenden jaren oud zijn. Haplogroep H is goed geschikt voor studies naar genetische associaties omwille van het relatief gebrek aan intra-groep sequentie-variabiliteit (8 polymorfismen per genoom t.o.v. de HgH consensus-sequentie) en de hoge prevalentie. Ca. 35-50% van de Noord-Europeanen en 30-40% van de Europees-Amerikanen dragen HgH. Haplogroep H werd gedefinieerd als de aanwezigheid van een C op positie 7028. […]

2.3. Data-analyse

[…]

3. Resultaten

Meer dan 90% van de individuen in alle 4 de ziekte-groepen waren van Europese afkomst. Genotypering onthulde dat HgH aanwezig was present bij 59/162 (36%) CVS-, 49/139 (35%) CRPS-, 33/82 (40%) SIDS- en 111/295 (38%) MDD-individuen, en deze deelnemers werden dus verder geëvalueerd in deze studie.

3.1. Verband tussen funktionele/dysautonome aandoeningen met individuele mtDNA-polymorfismen

CVS […] statistisch geassocieerd met 16519T met een ‘odds-ratio’ (OR) van 1,8. […]

3.2. Verband tussen co-morbide funktionele symptomatologie binnen elke groep met mtDNA-polymorfismen

In de CVS-groep was 3010A geassocieerd met een substantieel verhoogde rapportering van 6 van de 10 onderzochte funktionele symptomen [hoofdpijn, duizeligheid, spierpijn, spierzwakte, slaapproblemen, tintelingen]. […]

3.3. mtDNA “mitotypes” en funktionele/dysautonome aandoeningen/co-morbide symptomen

Op basis van onze eerdere gegevens dat 16519T en 3010A synergistische as risico-factoren voor cyclisch braken en migraine kunnen zijn, bekeken we alle statistisch significante gegevens in termen van de 4 mogelijke “mitotypes” [mitochondriale haplotypes]: individuen met de 3010G en 16519C polymorfismen (“GC”), 3010G en 16519T (“GT”), 3010A en 16519C (“AC”) or 3010A en 16519T 274 (“AT”). Bij nucleaire genetica wordt naar deze combinaties gerefereerd als haplotypes maar de “haplo” prefix is niet van toepassing voor mtDNA, wat aanwezig is met een hoog ‘copy-number’ [aantal copieën, bij mtDNA: de vele circulaire chromosomen (zie onze inleiding)]. Aangezien mtDNA geen recombinatie ondergaat, zijn mitotypes het resultaat van mutatie, oud of recent.

[…]

4. Bespreking

Onze eerdere en huidige gegevens tonen statistisch-significante verbanden aan tussen courante mtDNA-polymorfismen op posities 3010, 7028 en 16519, alleen en/of in combinatie, en 7 op 7 funktionele en/of dysautonome syndromen die tot op heden werden getest, o.a. CVS. MDD is geen funktionele of dysautonome aandoening zoals de 7 andere, maar is geassocieerd met enkele dysautonome syndromen/symptomen. Overéénkomstig daarmee gaven onze gegevens geen associatie van de of 3 polymorfismen met MDD zelf aan, maar er was een associatie met dysautonome co-morbiditeit bij individuen met MDD.

Het ontwikkelen van dysautonomie kan worden beïnvloed door bepaalde mtDNA-polymorfismen die, alleen of gecombineerd, bij voorkeur de autonome neuronale fysiologie beïnvloeden. Funktionele en met dysautonomie gerelateerde aandoeningen worden dikwijls gerapporteerd bij mitochondriale aandoeningen [Evidence of cardiovascular autonomic impairment in mitochondrial disorders. J. Neurol. (2007) 254: 1498-1503] en bij deze stoornissen werd selektieve schade aan autonome vezels voorgesteld. Preferentiële effekten kunnen te wijten zijn aan een “verkeer-opstopping” zoals gerapporteerd bij neuronale processen als mitochondrieën vergroten (zwellen) of van vorm veranderen, wat courante fenomenen zijn bij mitochondriale dysfunktie. C-vezels zijn ongemyeliniseerde afferenten die vezels omvatten in het autonoom zenuwstelsel en vezels die sensorische informatie overdragen die van belang zijn bij neuropathische pijn. [Pijn-prikkels worden voornamelijk gegenereerd door sensorische zenuw-uiteinden van ongemyeliniseerde Aδ- (snelle transmissie) en dun-gemyeliniseerde (trage transmissie) C-vezels.] C-vezels zijn zeer fijn met diameters tussen 0,2 tot 1,5 μm, terwijl axonale mitochondrieën “sigaar-vormig” zijn met een diameter van 0,5 μm en 1-3 μm lang. Bioptie-gegevens van patiënten met funktionele syndromen zijn schaars maar mitochondriaal pleomorfisme [variabiliteit qua grootte en vorm], reuze-mitochondrieën en andere vorm-variaties werden gerapporteerd bij migraine, CVS en fibromyalgie [Behan WM, More IA, Behan PO. Mitochondrial abnormalities in the post-viral fatigue syndrome. Acta Neuropathol. (1991) 83: 61-65 /// Sprott H et al. Increased DNA-fragmentation and ultrastructural changes in fibromyalgic muscle fibres. Ann. Rheum. Dis. (2004) 63: 245-251]. Degeneratie van C-vezels was de enige histopathologische zenuw-abnormaliteit die werd aangetoond in een studie bij CRPS. Daarnaast werd C-vezel neuropathie aangetoond bij fibromyalgie [Giannoccaro MP et al. Small nerve fibre involvement in patients referred for fibromyalgia. Muscle Nerve (2014) 49: 757-759; zie ook ‘Small-fibre’ polyneuropathie i.p.v. fibromyalgie] alsook autonome stoornissen, een aandoening die sterk overlapt met migraine, CVS en IBS.

Onze bevindingen zijn waarschijnlijk niet het resultaat van verstorende factoren bij de keuze van onze controles. Onze HgH controle-groep voor de molekulaire onderzoeken studies is groot en komt voornamelijk uit de V.S. en het V.K., met slechts een klein aantal van het Europees continent. De polymorfisme-frequenties van 16519T en 3010A zijn erg gelijkend bij HgH-populaties in Noord-Amerika, het Verenigd Koninkrijk en het Europees continent, en er werden sterk overéénkomende frequenties gevonden bij HgH-controles die we in onze controle-groep opnamen: bloed-donoren uit London (16519T 8/31 = 26%; 3010A 9/31 = 29%). Hoewel de grootte van de groepen relatief klein is voor sommige aandoeningen, zijn veel van de P-waarden extreem significant, wat een argument is tegen type-I fouten in de meeste gevallen. Het is onwaarschijnlijk dat veelvuldig testen de oorzaak is van onze resultaten, aangezien slechts 2 polymorfismen hier werden geëvalueerd. Co-morbiditeit associaties bij de CVS-, MDD- en CRPS-groepen werd getemperd door veelvuldig testen (10-16 condities getest per syndroom). De meerderheid van de vergelijkingen waren echter significant voor CVS. Onze populatie controle-groep bestaat uit “gezonde” individuen uit gepubliceerde databases en er is geen klinische informatie beschikbaar. Het is echter onwaarschijnlijk dat sommige van deze individuen lijden aan relatief courante aandoeningen zoals depressie. Dit zou de nul-hypothese ondersteunen en dus zouden onze ‘odds ratios’ onderschat kunnen zijn, in het bijzonder voor de minder ernstige fenotypes.

De belangrijkste beperking van deze studie is dat gegevens werden verkregen bij de 30-50% van de Europese Noord-Amerikanen/Europeanen met HgH. Daardoor lieten we een groot aantal individuen vallen en verhoogde de toepasbaarheid voor substantieel grotere genotypische homogeniteit en statistische ‘power’. Hoewel enkel haplogroep H werd bestudeerd, worden 16519T en 3010A gevonden bij individuen met een groot aantal haplogroepen en in bij alle rassen. Bij Europese Amerikanen is 16519T is eigenlijk lichtjes meer courant bij individuen die niet tot haplogroep H behoren. Het effekt van deze polymorfismen zou al dan niet afhankelijk kunnen zijn van de achterliggende haplogroep en verdere studies bij een veel grotere groep deelnemers met gevarieerde haplogroepen is vereist.

Het 16519 polymorfisme bleek bio-energetica betrokken bij inspanning te beïnvloeden [Murakami H et al. Polymorphisms in control-region of mtDNA relates to individual differences in endurance capacity or trainability. Jpn. J. Physiol. (2002) 52: 247-256]. Dat polymorfisme ligt in de omgeving van het controle-gebied betrokken bij mtDNA-replicatie, terwijl het 3010 polymorfisme in het 16S ribosomaal RNA gen ligt. Het is onduidelijk hoe deze polymorfismen geassocieerd zijn met funktionele/dysautonome ziekte; hun lokaties suggereren echter dat pathologie het resultaat kan zijn van een gedaald ‘copy-number’ van mitochondriaal gecodeerde subunits van de ademhaling-keten.

Onze bevindingen hebben potentiële klinische implicaties. Bepaalde medicijnen [tricyclisch antidepressiva] worden aangewend om veel van de funktionele syndromen te behandelen en zouden werkzaam kunnen zijn bij deze aandoeningen door lichtjes de mitochondriale oxidatie van fosforylatie te ontkoppelen, zoals werd gerapporteerd voor de tricyclische medicijnen imipramine en chlorimipramine. Men zou kunnen voorspellen dat dit de vorming van vrije radikalen (door een elektron-transport-keten die slechter werkt door een laag ‘copy-number’ mtDNA-gecodeerde subunits) doet verminderen wanneer de energie-vereisten hoog zijn (bv. psychologische en fysiologische stress). Er werd gesuggereerd dat een ander tricyclisch medicijn, nortriptyline, neuroprotectief is omwille van zijn vermogen om zuurstof/glucose-deprivatie, geïnduceerde cel-dood, verlies van mitochondriaal membraan-potentiaal en downstream afgifte van mitochondriale factoren te inhiberen. Op mitochondrieën gerichte therapieën, inclusief 2 co-factoren vereist voor elektron-transport: co-enzyme Q10 en riboflavine, zijn behandel-opties bij meerdere funktionele syndromen. Er werden succesvolle klinische proeven gerapporteerd met co-enzyme Q10 en riboflavine bij migraine en de doeltreffendheid van co-enzyme Q10 werd gesuggereerd in studies bij CVS. Farmacologische supplementering-niveaus kunnen, hypothetisch, gedeeltelijk een laag aantal ademhaling-keten-complexen veroorzaakt door 16519 en 3010 polymorfismen compenseren. Bijkomende klinische proeven zijn aangewezen. Aangezien co-factor therapie geen of milde bijwerkingen heeft, wetenschappelijk onderbouwd is, doeltreffend werd bewezen bij funktionele ziekte en veel wordt gebruikt, kunnen klinici echter overwegen om het aan te wenden bij deze moeilijk te behandelen funktionele syndromen.

We besluiten dat de courante mtDNA-polymorfismen op plaatsen 16519 en 3010 onderdeel uitmaken van de genetische factor die individuen voorbestemt, minstens die van de mtDNA haplogroep H, tot het ontwikkelen van vele “funktionele” syndromen en symptomen. De associatie is sterker voor 16519, waarbij het T allel geassocieerd blijkt met cyclisch braken, vormen van migraine, CVS, CRPS en vormen van SIDS. Een ogenschijnlijk verband met 3010 is voorlopiger en zou afhankelijk kunnen zijn van het 16519 genotype. We hypothiseren dat de verbijsterende overvloed aan symptomen te wijten zou kunnen zijn aan een stoornis van de kleine vezels (autonome en nociceptieve zenuwen).

Hoewel het energie-metabolisme waarschijnlijk één van meerdere factoren in de pathogenese van “funktionele” symptomatologie is, stellen we voor dat “mitosomatische” ziekte wellicht een meer accurate term is dan “psychosomatische” ziekte, een term die dikwijls wordt toegepast voor funktionele syndromen. […].

december 28, 2014

Stress verandert expressie & methylatie van perforine bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Uit ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS’ onthielden we dat er een toegenomen aanwezigheid is van differentieel gemethyleerde genen gerelateerd aan de immuun-respons, het cellulair metabolisme en kinase-aktiviteit. Genen geassocieerd met immuun-cel regulering, de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde mechanismen, vertoonden hypo-methylatie in promoters en andere gen-regulerende elementen bij M.E.(cvs). Epigenetische modificaties, zoals DNA-methylatie, die voornamelijk voorkomen op de cytosines van CpG dinucleotide sites (CpG) doorheen het genoom, zouden gen-expressie kunnen reguleren zonder de onderliggende gen-sequentie te wijzigen en optreden door genetische en milieu-factoren.

De onderzoek-groep van het CDC die onderstaande studie uitvoerde had blijkbaar eerder al bevindingen in die richting gedaan, meer bepaald dat er een link zou kunnen zijn tussen epigenetica (voor wat meer algemene achtergrond, zie ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’) en de dysfunkties qua ‘natural killer’ cellen. De resultaten werden echter pas een jaar na publicatie aan het algemeen publiek bekend gemaakt…

Bij het aanvallen van cellen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen komt ook het enzyme perforine vrij; dat porieën boort in het celmembraan. De porie-achtige strukturen vergemakkelijken de toegang van granzymen in de target-cel en deze aktiveren meerdere apoptose (geprogrammeerde cel-dood) -mechanismen die het effektief doden van de target-cel verzekeren. Perforine en granzymen bleken verminderd in NK- én CD8+T-cellen bij M.E.(cvs).

Lees hier meer over de verminderde funktie van NK-cellen bij M.E.(cvs) en de mogelijke rol van een daling qua perforine-gehalte in de pathogenese van CVS: ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS? & Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS.

In het stuk ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ wordt gemeld dat basale expressie-niveaus van perforine significant verhoogd bleken bij M.E.(cvs) in vergelijking met de controle-populatie. Uit de studie hieronder komt naar voor dat PRF1-expressie significant lager is bij M.E.(cvs)-individuen dan bij niet vermoeide-controles onmiddellijk na een psychosociale belasting. Bij het CDC wordt stress nogal snel gelimiteerd tot psychologische stress. Ook inspanning is een stress en wij vragen ons dan ook af hoe de resultaten zouden zijn mocht men dergelijke metingen doen na een inspanningtest…

————————-

Genet Epigenet. (2013) 5: 1-9

Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome

Virginia R. Falkenberg, Toni Whistler, Janna R. Murray, Elizabeth R. Unger & Mangalathu S. Rajeevan

Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Samenvatting

Perforine (PRF1) is essentieel voor immuniteit-bewaking en er zijn studies die rapporteren over verminderd perforine bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een ziekte die mogelijk geassocieerd is met stress en/of infektie. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST) als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress en evalueerden het effekt op PRF1-expressie en methylatie bij CVS-patiënten (n = 34) vergeleken met NF (n = 47) controles. Tijdens de TSST bleken ‘natural killer’ (NK) cellen significant verhoogd bij CVS- (P ≤ 0.0001) en NF-individuen (P ≤ 0.0001). Anders dan bij eerdere rapporten, was er geen significant verschil qua PRF1-expressie bij baseline of tijdens TSST tussen CVS en NF. PRF1-expressie in vol-bloed verhoogde echter 1,6 maal tijdens de TSST bij CVS (P = 0.0003) en NF (P ≤ 0.0001). Verder was de piek-respons onmiddellijk na de TSST lager bij CVS vergeleken met NF (P = 0.04). Daarnaast was de PRF1-expressie 1,5 uur na de TSST verhoogd bij CVS in vergelijking met NF (vol-bloed: P = 0.06; PBMC: P = 0.02). Methylatie van 7 CpG-sites in het methylatie-gevoelige gebied van de PRF1-promoter varieerde tussen 38% en 79%, zonder significante verschillen tussen CVS en NF. Hoewel de gemiddelde baseline methylatie van alle 7 CpG-sites niet verschilde tussen de CVS- en de NF-groep, was er een significante negatieve correlatie met PRF1-expressie op alle TSST-tijdstippen bij zowel CVS (P ≤ 0.0001) en NF (P ≤ 0.0001). Bij de deelnemers met een hoge gemiddelde methylatie (≥ 65%), was de PRF1-expressie significant lager bij CVS-individuen dan NF-controles onmiddellijk na TSST. Deze bevindingen suggereren dat methylatie mogelijks een belangrijke epigenetische determinant is voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie, en dat de verschillen qua PRF1-expressie en methylatie tussen CVS en NF bij de acute stress-respons verder onderzoek vereisen.

Inleiding

Stress, zowel lichamelijk of psychosociaal, leidt tot aktivatie van de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPA) as en de afgifte van cortisol. Studies bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) identificeerden een verminderde cortisol-respons bij ontwaken die voortkomt uit glucocorticoïden-resistentie, hypersensitiviteit voor de negatieve feedback werking van cortisol of gewijzigde serotonerge aktivatie van de hypothalamus. Naast deze HPA-as bevindingen werden bij CVS veranderingen qua immuun-funktie gedocumenteerd. Deze omvatten een verschuiving van Th1- naar Th2-type T-cel responsen [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason LA, Maher K, Fletcher MA. Evidence for T-helper 2 shift and association with illness parameters in Chronic Fatigue Syndrome. Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33] en gereduceerde cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) en CD8+ cytotoxische T-cellen [Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9:81 – zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Stress kan het immuunsysteem beïnvloeden via zijn interakties met de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel (SZS). Er werd verhoogde SZS-aktiviteit aangetoond bij CVS en dit zou de gereduceerde cytotoxiciteit kunnen beïnvloeden door het onderdrukken van Th1 en versterken van Th2 T-cel responsen, resulterend in gereduceerde cytotoxiciteit aktiviteit bij mensen en muizen. Perforine is een porie-vormend proteïne dat samenwerkt met granzymes en caspases om apoptose in doelwit-cellen te induceren, en verminderde perforine-expressie of -werking resulteert in verminderde cytotoxiciteit van NK en CD8+ T-cellen. Aangezien perforine belangrijk is voor de cytolytische aktiviteit van NK en cytotoxische CD8+ T-cellen, zou stress-regulering van het immuunsysteem gedeeltelijk gemedieerd kunnen worden via perforine. Studies door 3 verschillende groepen identificeerden verminderd perforine bij CVS-individuen. Een daling (maal 8) van perforine (PRF1) boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd geïdentificeerd via ‘differential display’ Polymerase Ketting Reaktie (PCR) [techniek om veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau te vergelijken en identificeren]. Verminderde werking of expressie van PRF1 bij CVS-patiënten werd herhaaldelijk aangetoond; in het algemeen is verminderd intracellulair perforine-proteïne gecorreleerd met PRF1 mRNA downregulering, hoewel één studie vond dat gereduceerde cytotoxiciteit voorkwam bij toegenomen PRF1 mRNA expressie. Studies geven aan dat methylatie een rol speelt bij de regulering van PRF1-expressie. Hypo-methylatie van de PRF1-promoter, bijzonderlijk in het methylatie-gevoelige gebied (MSR), bleek geassocieerd met verhoogde expressie van PRF1. In vitro testen toonden aan dat 70% van de totale PRF1 mRNA expressie zou kunnen gereduceerd zijn door methylatie van de 7 CpG-sites in het MSR. Daarenboven leidde behandeling van T-cellen met een methylatie-inhibitor, 5-azacytidine, tot verhoogde PRF1 mRNA expressie.

Stress-regulering van perforine werd nog niet direct onderzocht. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST), een erkende en gevalideerde methode om de stress-respons te bestuderen via aktivatie van het sympathisch zenuwstelsel en de HPA-as, als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress, en evalueerden het effekt ervan op PRF1-expressie en methylatie bij CVS (n = 34) in vergelijking met NF (n = 47) deelnemers.

Materialen & Methodes

Individuen

[…] Deze studie omvatte 81 individuen (34 CVS en 47 NF) uit een follow-up bevolking-studie naar CVS in Georgia (V.S.) die de TSST ondergingen als onderdeel van een 3-dagen durende studie […]. De CVS-gevallen voldeden aan de 1994 internationale research-definitie voor CVS (evaluatie d.m.v. gestandaardiseerde vragenlijsten, inclusief de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’, de ‘SF-36® Health Survey’ en de ‘CDC Symptom Inventory’. Er waren geen statistische verschillen tussen CVS en NF qua gemiddelde leeftijd (CVS: 45 ± 9 jaar, NF: 46 ± 9 jaar; P = 0.75), geslacht (CVS: 82% vrouwen, NF: 77% vrouwen; P = 0.53), ras (CVS: 76% Kaukasisch; NF: 85% Kaukasisch; P = 0.23) of BMI (CVS: 28 ± 5, NF: 26 ± 5; P = 0.075).

Trier sociale stress test

De TSST werd uitgevoerd om stress-geïnduceerde regulering van neuro-endocriene, autonome en immuun-responsen te bepalen. De TSST werd consistent op hetzelfde tijdstip van de dag gestart om een gelijkaardige diurnale [de dagelijkse cyclus volgende] respons voor alle deelnemers te verzekeren. De test bestaat uit een voorbereidende en anticipatie-fase (start om 1:15 pm) gevolgd door 10 min. spreken voor een publiek en een mentale rekenkundige test van 10 min. voor 3 getrainde staf-medewerkers (het TSST-panel, 1:30 pm tot 1:50 pm). Er werd een katheter voor bloedafname ingebracht om 7:30 am. Er werd bloed afgenomen voor micro-array analyse om 8:00 am en om 1:00 pm (baseline), alsook onmiddellijk vóór het TSST-panel om 1:30 pm, onmiddellijk ná het TSST-panel om 1:50 pm, en op opéénvolgende 15 minuten intervallen tot 3:05 pm. Er werd ook bloed afgenomen voor PBMC-isolatie om 10:00 am (3,5 uur vóór de TSST) en om 3:05 pm (1,5 uur ná de TSST). Er werden ook cel-tellingen gedaan.

DNA/RNA-extractie

Micro-array procedure

Kwantitatieve ‘reverse’ transcriptie PCR (qRT-PCR)

Kwantitative methylatie via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

Bioinformatische analyse van het PRF1 MSR [methylatie-gevoelige gebied]

Statistische analyse

Resultaten

Impact van TSST op bloedcel-tellingen en PRF1-expressie

Er was een significante toename in globaal percentage NK-cellen bij CVS- (P < 0.0001) en NF- (P < 0.0001) individuen tijdens de TSST, zonder significant verschil tussen de groepen. Ook de andere cel-type percentages (neutrofielen, T-cellen en B-cellen) verhoogden in respons op TSST en verschilden niet met betrekking tot ziekte-status (gegevens niet getoond).

Micro-array analyse van vol-bloed toonde een significante toename qua PRF1-expressie tussen de introductie/voorbereiding-fase en onmiddellijk vóór de TSST mondelinge presentatie (1:00 pm-1:30 pm) van ca. 1,6 maal in NF (P < 0.0001) en CVS (P = 0.0003). PRF1-expressie bleef stijgen bij NF-individuen tijdens de TSST mondelinge presentatie (1:30-1:50 pm) terwijl de expressie lichtjes daalde bij de CVS-individuen, resulterend in een significant verschil tussen NF- en CVS-individuen (P = 0.04) om 1:50 pm. Gedurende de 45 min. na de TSST, daalde de PRF1-expressie en keerde terug naar baseline waarden in beide groepen (om 2:35 pm). PRF1-expressie bij NF-individuen bleef afnemen maar nam toe bij CVS-individuen, resulterend in 1,3 maal hogere expressie bij CVS i.v.m. NF op dat moment (P = 0.06).

PRF1-expressie om 10:00 am en 3:05 pm in PBMCs – bepaald via qRT-PCR – was over het algemeen consistent met de resultaten van de vol-bloed micro-array. PRF1-expressie in PBMCs verschilde niet tussen CVS en NF om 10:00 am, maar om 3:05 pm was de PRF1-expressie hoger bij CVS dan NF (1,4 maal; P = 0.02).

Impact van TSST op PRF1-methylatie

Site-specifieke CpG-methylatie in het MSR om 10 am varieerde tussen 38% en 79%, en steeg op alle 7 CpG-sites met 2,1% tot 4% na de TSST (om 3:05 pm) voor de ganse studie-populatie (P < 0.0001 tot P = 0.01). Bij CVS-individuen was de toename qua methylatie na TSST echter significant voor slechts 2 CpG-sites, terwijl bij NF-controles de stijging significant was voor 4 CpG-sites. Er waren geen significante globale verschillen tussen CVS en NF in termen van site-specifiieke methylatie of gemiddelde methylatie voor alle 7 CpG-sites voor of na de TSST.

Impact van PRF1-methylatie op zijn expressie

Om te impact te onderzoeken van PRF1-methylatie op PRF1-expressie, bekeken we correlaties tussen gemiddelde methylatie van de 7 CpG-sites en gen-expressie voor elke deelnemer en tijdstip in vol-bloed en PBMCs. De gemiddelde baseline methylatie (10:00 am) was negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed op alle 8 tijdstippen in CVS en NF, statistisch significant voor alle tijdstippen uitgenomen één bij NF (2:35 pm). De gemiddelde methylatie om 3:05 pm was ook negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed om 3:05 pm bij NF- en CVS-individuen, hoewel de correlatie niet significant was bij CVS. Er werden gelijkaardige negatieve correlaties tussen PRF1-methylatie en PRF1-expressie in PBMCs geobserveerd bij NF- en CVS-individuen.

We gebruikten lineaire regressie om het verband te kwantificeren tussen PRF1 gemiddelde methylatie om 10:00 am en vol-bloed PRF1-expressie op alle tijdstippen. Bij CVS-individuen voorspelde deze analyse een stijging van 3% qua PRF1-expressie […] bij elke 1% toename van de PRF1-methylatie […]. Er werd een gelijkaardig omgekeerd verband gevonden bij NF-individuen, maar 31% en 14% van de variantie qua PRF1-expressie werd verklaard door PRF1-promoter methylatie bij CVS en NF, respectievelijk.

We gebruikten de mediane opsplitsing van het gemiddeld methylatie-niveau van de 7 CpG-sites om 10:00 am om de individuen te categoriseren met hoge (≥ 65%) en lage (< 65%) methylatie. Vol-bloed PRF1-expressie was significant hoger in de lage-methylatie groep op alle TSST tijdstippen (P-waarde van 0.0002 tot 0.05). Wanneer de groepen met hoge- of lage-methylatie werden gestratificeerd op basis van ziekte, werd enkel om 1:50 pm (onmiddellijk na TSST) een significant verschil opgemerkt tussen CVS en NF. De CVS hoge-methylatie groep had een significant lagere PRF1-expressie dan de NF hoge-methylatie groep (P = 0.005).

Bespreking

Deze studie toont aan dat acute psychosociale stress een impact heeft op PRF1 gen-expressie en dat PRF1-methylatie bijdraagt tot individuele verschillen qua PRF1-expressie. De PRF1-expressie steeg ca. 1,6 maal (t.o.v. baseline) in respons op TSST en dit niveau van verandering valt binnen de relatieve perforine-expressie verandering die wordt gezien bij andere paradigma’s. De piek PRF1-expressie in respons op TSST was echter verminderd bij CVS– t.o.v. NF-individuen (P = 0.04). NK-cellen namen af in respons op de TSST bij CVS en NF, en aangezien PRF1-expressie grotendeels beperkt blijft tot NK-cellen, is het waarschijnlijk dat de toegenomen expressie van PRF1 in respons op de TSST gerelateerd kan zijn met NK-cel aantallen. Aangezien we de heterogeniteit qua NK-cellen naar gelang hun ontwikkeling niet beschreven, kunnen we niet onderscheiden of alle NK-cellen of slechts een deel van de rijpe NK-cellen bijdroegen tot de PRF1-expressie na TSST. Verdere analyses gebruikmakend van aangerijkte NK-cellen zijn nodig ter evaluatie van de toename qua PRF1-expressie in termen van transcript-copieën/cel, en het verband met NK-cel heterogeniteit in respons op acute stress.

We vonden ondersteuning voor het feit dat methylatie een regulering-mechanisme van PRF1-expressie is, aangezien er een significante negatieve correlatie bestond tussen de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites in de PRF1-promoter en zijn expressie. We zagen dit verband op alle TSST-tijdstippen, wanneer de methylatie op een continue schaal werd uitgezet of gecategoriseerd op basis van alge of hoge status. Op basis hiervan is het mogelijk dat ontbreken van een significant verschil qua gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites tussen CVS en NF zou kunnen bijdragen tot het ontbreken van een verschil qua PRF1-expressie tussen CVS en NF in deze studie. Onze resultaten suggereren dat methylatie een belangrijke epigenetische determinant voor inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie zou kunnen zijn en zodoende dat de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites verantwoordelijk kan zijn voor de gerapporteerde discrepanties (stijging, daling of geen verandering) qua PRF1-expressie bij verschillende CVS-studies. Deze resultaten impliceren verder het belang van het meten van PRF1-methylatie én -expressie voor het begrijpen van de mechanismen van PRF1-expressie bij immuniteit-bewaking. Hoewel er geen verschil was qua methylatie-niveaus tussen CVS en NF, vertoonden deze groepen enkele verschillen wat betreft het verband tussen methylatie en expressie, onmiddellijk na TSST (1:50 pm) en op het laatste tijdstip na TSST (3:05 pm). Het lijkt er op dat om 1:50 pm (na de TSST), een subgroep CVS-individuen met hoge baseline methylatie (10:00 am) in het MSR bijdroeg tot de afgestompte respons qua PRF1-expressie in vergelijking met NF-individuen. Op het laatste tijdstip na de TSST (3:05 pm) wanneer PRF1-expressie significant steeg bij CVS (zowel vol-bloed als PBMCs), werd zijn negatieve relatie met methylatie op het dichtste tijdstip (3:05 pm) niet-significant. Een verklaring voor de ziekte-specifieke verschillen die werden gezien in deze studie blijkt ingewikkeld. We focusten ons op het verband tussen PRF1-promoter methylatie en mRNA, maar er zouden veel andere mechanismen kunnen betrokken zijn om de expressie van PRF1 te reguleren, inclusief een GRE [glucocorticoïd responsief element; korte DNA-sequentie in de promoter van een gen dat kan binden met de glucocorticoïd receptor] en de op IL-2 reagerende regulering van ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] in de PRF1-promoter. Er zijn ook mechanismen waarbij post-transcriptionele, post-translationele en circadiane regulering van PRF1 betrokken zijn, die kunnen bijdragen tot de differentiële expressie of aktiviteit.

Er zijn meerdere beperkingen bij deze studie. De grootte van de groep is beperkt, hoewel deze vergelijkbaar is met eerdere studies die gebruik maken van de TSST. De deelnemers aan de studie werden gescreend op medicatie en niemand gebruikte immunosuppressors. De impact van medicijnen op HPA-as responsiviteit, als er al één is, is echter onbekend. Hoewel statistisch significant, waren de geobserveerde verschillen (2.6%-6.8%) qua CpG-site specifieke methylatie in het MSR tussen pre- (10:00 am) en post- (3:05 pm) TSST stalen klein, mogelijks verstoord door de mengeling van cel-types aanwezig bij PBMCs. Het methylatie-profiel van het PRF1 MSR in deze studie (81 individuen) was verschillend van een eerdere studie (5 individuen), mogelijks omwille van een substantieel verschil tussen deze studies wat betreft het aantal stalen. Eén van de belangrijke vragen is echter of het klein percentage veranderingen qua methylatie dat werd gezien bij deze studie een belangrijk biologisch mechanisme voor de regulering van PRF1-expressie is. Enkele studies suggereren dat kleine wijzigingen qua DNA-methylatie (2%-10%) zich inderdaad kunnen vertalen naar veranderingen (1,5- tot 32 maal) qua gen-expressie. [geen studies bij M.E.(cvs)-patiënten maar bv. hartfalen] Hoewel deze gerapporteerde schattingen van de impact van DNA-methylatie op expressie aanzienlijk variëren afhankelijk van het gen, weefsel, milieu en statistische analyse, komt onze schatting van een 3% toename qua PRF1-expressie met elke 1% afname qua methylatie overéén met de schatting van de impact of FXN [gen coderend voor het mirochondriaal proteïne frataxine] -methylatie op zijn expressie. Deze resultaten ondersteunen de visie dat subtiele epigenetische wijzigingen de gen-expressie kunnen beïnvloeden in respons op de omgeving.

Besluit

We documenteerden een toename qua PRF1-expressie die evenwijdig loopt met een verhoging van NK-cellen in respons op acute psychosociale stress, waarbij patiënten met CVS een afgestompte respons vertoonden vergeleken met NF-controles. Deze afgestompte expressie bij CVS zou kunnen verband houden met de hoge baseline PRF1-promoter methylatie die een belangrijke epigenetische determinant bleek voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie. Er zijn verdere studies nodig om deze resultaten te bevestigen en verklaringen voor de geobserveerde PRF1-expressie dynamiek te evalueren. Het zal ook interessant zijn de signaal-transductie die resulteert in perifere influx van NK-cellen te onderzoeken, alsook PRF1-expressie en zijn funktionele rol in de context van acute stress, en de molekulaire mechanismen te identificeren die overéénkomen bij stress en infektie.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.