M.E.(cvs)-wetenschap

augustus 29, 2009

Inspanning-responsieve genen bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:39 pm
Tags: , , , , ,

In zijn commentaar op gen-expressie onderzoek (zie ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’) liet Prof. Pall noteren dat de zoektocht naar specifieke biomerker-testen volgens hem zou moeten focussen op specifieke responsen op inspanning, responsen waar M.E.(cvs)-patiënten verschillen van normale controles. Het meest specifieke symptoom van M.E.(cvs) is de zogenaamde post-exertionele malaise, waarbij inspanning het hele spectrum van symptomen die kenmerkend zijn voor M.E.(cvs)-patiënten upreguleert. Onderstaande studie heeft zich eerder al gericht op inspanning-responsieve genen…

Het ‘Gen Ontologie’ projekt (zie methodiek) [Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM et al.: Gene-ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000, 25: 25-29] is een belangrijk bio-informatica initiatief met het doel de voorstelling van genen en gen-produkten bij verschillende species en databases te standardiseren. Het projekt voorziet een gecontroleerd vocabularium met termen die gen-produkt karakteristieken en gegevens van leden van het ‘GO Consortium’ beschrijven, alsook instrumenten om toegang te krijgen tot deze data en ze te verwerken. (www.geneontology.org).

Ion-kanalen zijn kleine kanaaltjes in de celwanden, proteïnen die het kleine voltage-verschil op het plasma-membraan controleren en die er voor zorgen dat ionen (zo zijn er natrium-, kalium-, calcium- en chloor-kanalen) van buiten naar binnen en van binnen naar buiten worden gepompt. Kanalopathieën zijn ziekten (genetisch bepaald of verworven) veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanaal subunits of de proteïnen die ze reguleren. Bij spieren geven ze aanleiding tot een overprikkelbaarheid van de spiervezel of een verminderde prikkelbaarheid, leidend tot spierzwakte. De prikkelbaarheid van de celwand wordt gereguleerd door zogenaamde voltage-afhankelijke ion-kanalen: de aktiviteit van deze kanalen is afhankelijk van de stroomspanning. ‘Voltage-gated’ ion-kanalen zijn een klasse trans-membraan ion-kanalen die worden geaktiveerd door veranderingen in het elektrisch potentiaal verschil bij dit kanaal en geven aanleiding tot elektrische signalen; ze zijn bijzonder belangrijk in zenuw- en spiercellen maar komen in veel cellen voor.

ATPase katalyseert de reaktie: ATP + H2O = ADP + fosfaat. Het betreft een groep enzymen die werken als pomp en daarbij het energierijke ATP omzetten in ADP of andersom. Er zijn verschillende types ATPasen: P-type ATPasen verbruiken ATP (Na+K+-ATPasen wisselen natrium-ionen uit voor kalium-ionen waardoor een lage Na+-concentratie en een hoge K+-concentratie binnen de cel ontstaat en een transmembraan-potentiaal wordt gecreëerd; H+K+-ATPasen zorgen voor de lage zuurgraad in de maag; Ca2+-ATPasen zorgen voor een lage intracellulaire calcium-concentratie in spiercellen.), F-type ATPasen zorgen voor de aanmaak van ATP uit ADP en anorganisch fosfaat (mitochondrieën) en V-type ATPasen gebruiken ATP om protonen (H+) te pompen naar een compartiment met een hoge zuurgraad. Bij M.E.(cvs) werd een significante inhibitie van de RBC-membraan Na+K+-ATPase aktiviteit gevonden [zie: ‘Dysfunktie van het Isoprenoid Systeem bij M.E.(cvs)’].

De resultaten van deze studie tonen een groep van gen-ontologie categorieën die goed overéénkomen met funktionele groepen waarvan werd gevonden dat ze CVS van niet-vermoeide indviduen onderscheiden. Inspanning-responsieve genen verschilden tussen CVS-gevallen en controles. Dat was bij genen geklassificeerd in chromatine- en nucleosoom-opbouw, cytoplasmische vesikels, membraan-transport en G-proteïne gekoppelde receptor ontologieën. Verschillen qua ion-transport aktiviteit/ ion-kanaal aktiviteit waren evident bij aanvang en waren verhoogd na inspanning zoals bewezen door een groter aantal differentiële genen voor deze molekulaire funkties.

BMC Physiol. 2005 Mar 24;5(1):5

Exercise-responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control-subjects

Toni Whistler, James F. Jones, Elizabeth R. Unger and Suzanne D. Vernon

Viral Exanthems and Herpesvirus Branch, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

Achtergrond

In een gezonde toestand heeft fysieke inspanning een kwantificeerbaar effekt op neuro-endocriene, autonome en immuunsystemen die metabole en immuun-responsen beïnvloeden. In de initiële fase van acute ziekte is er echter een vermijden van fysieke stressoren opdat energie wordt voorbehouden voor het genezen en een terugkeer naar homeostase. Terwijl fysiologische stoornissen bij acute ziekte van voorbijgaande aard zijn, vertonen chronische ziekten – zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) – langer stoornissen die een invaliderend effekt hebben, fysiologisch en psychologisch. Aktiviteiten die fysiologische stressoren zijn, zoals fysieke inspanning, verergeren bijgevolg de symptomen die CVS definiëren.

[…]

Misschien wel het grootste methodologisch probleem bij het bestuderen van CVS is dat veel individuen die werden geïdentificeerd bij populatie-studies al ten minste 5 jaar ziek zijn. Gedurende die tijd ‘komt en gaat’ de ziekte, waardoor het moeilijk wordt biomerkers te identificeren of de pathogenese te definiëren. Fysieke, mentale en emotionele stress verergeren CVS en resulteren in de definiërende post-exertionele vermoeidheid met meetbare fysiologische verschillen. Daarom is inspanning van mensen met CVS een effektieve methode om CVS-individuen te controleren en zodoende de waarschijnlijkheid van uniform identificerende biomerkers en/of fysiologische abnormaliteiten te verhogen.

We gebruikten gen-expressie profilering van perifeer bloed om verschillen tussen CVS-individuen en sedentaire gezonde controles voor en na een inspanning te evalueren. Globaal vonden we dat de gen-expressie profielen vrij gelijkaardig waren en, belangrijk, dat de meeste verschillen aanwezig waren vóór de inspanning. Die verschillen lagen bij G-proteïne gekoppelde receptor [GPCR: een grote proteïnen-familie trans-membraan receptoren die molekulen buiten de cel ‘voelen’ en in de cel signaal-transductie mechansimen aktiveren; uiteindelijk worden daardoor cellulaire responsen in gang gezet], en ion-transport en ion-kanaal aktiviteit ontologieën. De laatste bleek verhoogd na inspanning, zoals aangegeven door de differentiële expressie van een groter aantal genen betrokken bij molekulaire funkties. Verschillen bleken ook evident bij inspanning-respons; inclusief chromatine- en nucleosoom-assemblage, [chromatine (complex van DNA en eiwitten in de celkern) -assemblage is een belangrijk proces dat nauw verbonden is met DNA-replicatie, het laat de cel toe de chromosomen correct te dupliceren; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt, een onderdeel van een chromatine-ketting] cytoplasmische vesikels [kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], membraan-transport en G-proteïne gekoppelde receptor ontologieën. Deze verschillen kunnen de symptomen van CVS helpen verklaren.

Methoden

Studie-individuen

[…] Vrouwen die ambulant een CVS vermoeidheid-kliniek bezochten, namen vrijwillig aan de studie deel. Allen voldeden aan de huidige definitie voor CVS [Fukuda ‘94] […]. Gezonde controles […] gematcht voor leeftijd, geslacht en aktiviteit-graad (sedentair tot matig aktief). […] Inspanningstest 5 tot 10 dagen na de eerste dag van hun menstruatie-cyclus. Alle individuen werden gevraagd geen inhalatie- of systemische corticosteroïden, anti-histaminen of anti-inflammatoire medicatie te gebruiken gedurende 7 dagen voor de inspanningstest. […] sub-maximale (70% van de voorspelde maximum arbeid), evenwichtige inspanning gedurende 20 minuten op een fiets-ergometer. […] Bloed-stalen werden afgenomen direct voor en 24 uur na inspanning. De selektie van de individuen voor de gen-expressie piloot-studie focuste op degenen zonder allergieën: 5 vrouwen met CVS en 5 vrouwelijke controles.

RNA-isolatie

[…]

Preparatie en hybridisatie van gelabeld cDNA

[…] Atlas Human 3.8I oligonucleotide glazen micro-chips (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) […].

Data-analyse

Voor-verwerking gegevens: […] Genen waarvan de expressie ten minste 1,5 maal verschilde van de mediaan bij ten minste 20% van de arrays [DNA-chips] werden behouden (3.699 genen), zodat genen die minimale variatie vertoonden over de set van arrays werden uitgesloten. Als een expressie-waarde ontbrak of was weggefilterd in meer dan 50% van de arrays, werd deze niet opgenomen; dit gaf een totaal van 3.682 genen voor analyse.

Analyse

We gebruikten meerdere analytische benaderingen om te zoeken naar differentiële expressie onder vier vooraf gedefinieerde klassen: controle-individuen vóór inspanning, controle-individuen na inspanning, CVS-individuen vóór inspanning en CVS-individuen na inspanning. Vergelijkingen omvatten gepaarde analyses van controles vóór versus na inspanning en CVS-gevallen vóór versus na inspanning. Daarenboven onderzochten we controles versus CVS-individuen vóór inspanning (baseline) en controles versus CVS-individuen na inspanning.

Analytische benadering 1: De meer gangbare benadering gebruikt voor micro-chip gen-expressie analyse is vaststellen of gen-expressie profielen verschillen tussen individuen in vooraf-bepaalde klassen en de genen identificeren die verantwoordelijk zijn voor de verschillen. De ‘Class Comparison’ analyse-methode [hier aangewend] gebruikt deze benadering met toepassing van een willekeurige variantie t-test [bepaalde statistische benadering om gegevens te verwerken]. Dit is een verbetering […] aangezien het toelaat informatie over intra-klasse variatie onder genen te delen zonder aan te nemen dat alle genen dezelfde variantie [Maat voor de spreiding van de verschillende metingen in een onderzoek; d.i. de mate waarin de waarden onderling verschillen. Hoe groter de variantie, hoe meer de afzonderlijke waarden onderling verschillen en dus ook hoe meer de waarden van het gemiddelde afwijken.] hebben. Het is een aan te raden wijziging als de aantallen stalen per klasse klein zijn. Genen werden statistisch significant beschouwd als de p-waarde minder dan 0.005 was. Daarna werd een multivariate permutatie-test [statische test] uitgevoerd om te bepalen of de expressie-profielen verschilden tussen de klassen […].

Het EASE software-pakket werd dan gebruikt om de biologische significantie te evalueren van de ontologie van genen met differentiële expressie geïdentificeerd via klasse-vergelijking. EASE voert een statistische analyse uit van gen-categorieën in een genen-lijst met betrekking tot alle genen op de chip en berekent een variant van de standaard ‘Fisher exact probability’ [test voor statistische significantie], genaamd de EASE-score. De meest significante categorieën, zoals aangegeven met de EASE score, worden beschouwd als ‘themas’ van de genen-lijst. Deze themas corresponderen met de systematische en getandardiseerde nomenclatuur ontwikkeld door het ‘GO (Gene Ontology) Consortium’ [Gene-ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000, 25: 25-29]. De drie organiserende principes van ‘GO’ zijn molekulaire funktie, biologisch proces en cellulaire component, en momenteel zijn reeds 22.665 menselijke gen-produkten opgenomen. De associatie van genen met gerelateerde ‘GO’-termen draagt bij tot de interpretatie van expressie-patrnonen. Een ‘GO’-categorie omvat genen die worden beschreven door die term [benaming] en deze opgenomen in eender welke subset (of ‘afstammelingen’) van die ‘GO’-term. Een gen kan gecategoriseerd zijn in meer dan één ontologie-categorie.

Om de afzonderlijke gen-clusters te tonen, voerden we een twee-weg hiërarchische cluster-analyse [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier genen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uit bij de genen die werden geïdentificeerd via deze analytische benadering […].

Analytische bendaring 2: We gebruikten de Gen-Ontologie vergelijkingsmodule van BRB Array tools [software-pakket voor de visualisering en statistische analyse van DNA micro-array gen-expression data] als een tweede analytische benadering. Bij deze methode krijgen de genen ‘GO’-termen toegewezen voorafgaand aan de analyse. Voor elke ‘GO’-term werd het totaal aantal genen op de chip behorende tot die categorie bepaald. […] de p-waarden [significantie] werden berekend […]. Dit levert een lijst op met ‘GO’-categorieën die meer genen met differentiële expressie hebben onder de klassen dan per toeval kan worden verwacht. We beschouwden een GO-categorie differentieel gereguleerd als die significantie kleiner was dan 0.005. Alle ‘GO’-categorieën met tussen 5 en 100 genen vertegenwoordigd op de array werden bekeken.

Resultaten

Inspanning-respons genen werden geëvalueerd d.m.v. een willekeurige variantie t-test in een gepaarde, klasse-vergelijking van controle-individuen vóór en na inspanning; en 21 genen met een differentiële expressie werden geïdentificeerd. [Zie tabel (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/table/T2) – Lijst van genen met differentiële expressie bij controle-individuen na inspanning: De p-waarde is een maat voor de significantie.] De waarschijnlijkheid dat deze 21 genen per toeval, zonder echte verschillen tussen de groepen, zouden zijn geïdentificeerd was 0,056 […]. Van de 21 genen konden 16 worden gecategoriseerd in de ‘Gene Ontology’ (GO) bij biologische processen en 15 bij molekulaire funktie. De meest significante categorieën of ‘themas’ van deze inspanning-responsieve genen, zoals bepaald door een EASE-score van < 0,10, behoorden bij het biologisch proces van transport (vesikel-gemedieerd én proteïne-transport). 5 van de 21 genen waren bij dit proces betrokken.

Aangezien deze 21 genen de perifeer bloed gen-expressie respons op inspanning van gezonde individuen weerspiegelen, redeneerden we dat de expressie van deze genen zou gewijzigd zijn bij CVS-individuen. Om een visuele presentatie van deze verschillen te bekomen, werd de genen-lijst [tabel van hierboven] gebruikt voor een […] cluster-analyse {{Figuur 1 – Hiërarchische clustering van inspanning-responsieve genen bij controle-individuen: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F1) De 21 genen met differentiële expressie (Tabel 2) werden geclusterd […]. In de matrix stelt elke rij de resultaten voor van één gen en elke kolom een individu. Transcript-waarden worden afgebeeld als boven (rood) of onder (groen) het gemiddelde. De dendogrammen [boom-strukturen die mogelijke verwantschappen aangeven] illustreren […] hiërarchische clustering van individuen (boven) en genen (links). […]}}. De respons van 10 van de 21 genen was vrij gelijkaardig qua grootte-orde en richting voor CVS- en controle-individuen. Voor de andere 11 genen was de grootte-orde van de verandering na inspanning aanzienlijk kleiner bij CVS-individuen dan bij controle-indivduen. Met betrekking tot de ‘GO’-categorieën van deze 21 genen, waren 10 genen geassocieerd met binding en 8 met metabolisme, allen daarvan waren gelijk verdeeld over de twee respons-types (# in Figuur 1). 5 genen geklassificeerd bij vesikel-gemedieerd en proteïne-transport ontologieën verschilden echter tussen CVS- en controle-individuen (geel in Figuur 1).

Er werden geen genen met differentiële expressie geïdentificeerd d.m.v. klasse-vergelijking analyse (significantie-niveau p > 0.005) voor CVS-indviduen vóór en na inspanning, voor CVS-indviduen vóór inspanning vergeleken met controles vóór inspanning, of voor CVS-indviduen na inspanning vergeleken met controles na inspanning.

Omdat genen met differentiële expressie werden geïdentificeerd d.m.v. klasse-vergelijking voorafgaand aan de inspanning, redeneerden we dat een vergelijking van gen-expressie bij CVS- en controle-indviduen, gebruikmakend van genen gecategoriseerd volgens ontologie, meer efficiënt de verstoorde fysiologishe mechanismen zou blootleggen. Figuren 2 en 3 tonen de resultaten van deze analyses. ‘GO’-termen met gedefinieerde ouder-kind relaties werden gegroepeerd […]. {{Figuur 2 – Significante gen-ontologie categorieën die inspanning-gerelateerde veranderingen bij controles (a) en CVS-individuen (b) definiëren: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F2) De drie organiserende principes van GO (voorgesteld in de grijze kaders) zijn molekulaire funktie, biologisch proces en cellulaire component. Gerelateerde ontologieën en/of subgroepen van de ontologieën worden aangegeven door kaders met dezelfde kleur. Ontologieën weergegeven op deze figuren waren significant met een p-waarde < 0.005. […]}} Slechts twee inspanning-responsieve ‘GO’-categorieën [fosfolipiden-binding en chromatine-architektuur waren gelijkaardig bij controles en CVS-individuen. Voor de chromatine-architektuur categorie benadrukte de CVS-vergelijking echter 7 overlappende ontologieën (met 59 unieke genen), vergeleken met 1 ontologie van 33 genen bij de controle-vergelijking. De 33 genen overlappen met de 59 die werden geïdentificeerd bij de CVS-vergelijking. De fosfolipiden-binding ontologieën waren identiek qua gen-samenstelling. Veranderingen gerelateerd aan inspanning die enkel bij controle-individuen als significant werden geïdentificeerd, waren verbonden met genen betrokken bij vesikel- (geel), dehydrogenase-, ATPase- en transporter-aktiviteiten. Inspanning-gerelateerde veranderingen die enkel bij CVS-individuen werden gezien, waren verbonden met G-proteïne gekoppelde receptor signalisering.

Gen-ontologie vergelijking werd ook gebruikt om verschillen tussen controle- en CVS-individuen te evalueren (d.i. baseline en na inspanning. {{Figuur 3 – Gen Ontologie categorieën geïdentificeerd als significant verschillend tussen controles en CVS-gevallen vóór (a) en na (b) inspanning: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F3)}} Baseline-verschillen tussen CVS-individuen en controles die bleven na inspanning waren ‘GO’-termen gerelateerd aan ion-transport. Na inspanning lijken deze verschillen versterkt te zijn, zoals blijkt uit het verhoogd aantal genen aanwezig in deze GO-categorieën en ook uit het feit dat meer GO-termen behoren bij de ATPase trans-membraan beweging van ionen. G-proteïne-gekoppelde receptor binding, onderdeel van de brede funktionele categorie van signaal-overdracht, verschilde tussen CVS-individuen en controles vóór inspanning. Dit baseline verschil tussen controles en CVS-individuen was niet significant na inspanning. Interessant was dat complement-aktivatie één van de door inspanning geïnduceerde verschillen was tussen CVS-individuen en controles die enkel aanwezig was na inspanning. Genen in de meeste van de als verschillend geïdentificeerde ontologieën tussen CVS- en controle-individuen hadden lagere expressie-waarden bij CVS-individuen.

Bespreking

Gen-expressie profilering biedt een unieke kans om CVS te karakteriseren op biologisch niveau. Veranderingen qua gen-expressie liggen aan de basis van veel biologische processen en zouden inzicht kunnen bieden in ziekte-specifieke gen-expressie en de respons van genen op omgeving-stimuli. In een ‘bewijs-van-concept’ studie, vonden we dat CVS-patiënten verschillende gen-expressie patronen in mononucleaire cellen uit bloed hadden in vergelijking met niet-vermoeide controles [Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC: Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers 2002, 18: 193-199] en dat CVS een heterogene ziekte is, zoals werd bewezen via verschillende gen-expressie profielen voor patiënten die een graduele aanvang van hun ziekte melden vergeleken met degenen die een plotse aanvang melden [Whistler T, Unger ER, Nisenbaum R, Vernon SD: Integration of gene-expression, clinical and epidemiologic data to characterize Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med 2003, 1: 10]. Daarenboven identificeerde ‘differential display’ PCR [techniek om gen-expressie bij een experimentele en controle-groep (op zicht) te vergelijken; echter minder gevoelig en nauwkeurig dan kwantitatieve PCR] bij een klein aantal CVS- en controle-individuen kandidaat biomerkers in perifeer bloed [Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S, Almond J: Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients. Clin Exp Allergy 2003, 33: 1450-1456 — Steinau M, Unger ER, Jones J.F., Rajeevan MS: Differential display PCR of peripheral blood for biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Molecular Medicine 2004, 82: 750-755].

CVS wordt gedefinieerd door een post-exertionele vermoeidheid die niet vermindert binnen 24 uur na fysieke stress. In tegenstelling daarmee, induceert inspanning bij gezonde, ongetrainde mensen veranderingen qua cellulaire homeostase in 1 tot 4 uur en een terugkeer naar basale waarden binnen 24 uur, gemeten in spieren. Analyse van perifeer bloed gen-expressie bij de gezonde controle-individuen bevestigde deze observatie aangezien de meerderheid van de gen-expressie waarden dezelfde waren vóór en 24 uur na inspanning. Dit impliceerde dat de expressie terugkeerde naar basale waarden óf onveranderd was ten gevolgde de inspanning. Inderdaad: veel van de 21 door inspanning geïnduceerde genen met differentiële expressie bij controle-individuen werd gekenmerkt door ‘GO’s die een diverse set molekulaire funkties, nodig voor cel-funktie en -leefbaarheid, weerspiegelen. (Deze ontologieën overlapten met deze geïdentificeerd bij de ‘GO’-vergelijking analyse in Figuur 2a.). Figuur 1 illustreert duidelijk het patroon van gen-expressie bij de 21 genen voor de meeste van de controle-indivduen. In tegenstelling daarmee waren 11 van de genen ongewijzigd bij CVS-individuen vóór en na inspanning; waarbij er 5 werden geklassificeerd in een transport-gerelateerde ontologie. Omdat dit verschil qua gen-expressie zo dramatisch is, impliceert het een fundamentele verstoring van de biochemische aktiviteit van lymfocyten en monocyten uit perifeer bloed bij CVS-individuen vergeleken met controle-individuen; die de klassieke immunologische merkers (CD45) [algemeen leukocyten-antigen] – waarvan werd aangetoond dat ze niet waren aangetast bij CVS-patiënten – niet beïnvloedt. Lage expressie van deze genen kunnen veeleer subtiele effekten hebben op immuun-funktie. De betrokkenheid van immuun-dysfunktie bij de pathogenese van CVS is niet altijd even consistent gebleken.

Klassen-vergelijking, gebruikt om deze 21 genen met differentiële expressie te identificeren, wees op de mogelijke verstoring van biologische mechansimen (Figuur 1). Om deze mogelijkheid te onderzoeken, gebruikten we de ‘GO’-vergelijking die is gebaseerd op de kennis dat gen-expressie waarden onafhankelijke variabelen zijn bij biologische processen, cellulaire componenten en molekulaire funkties. Op deze manier versterken multipele genen in dezelfde categorie elkaar en verhogen ze de sterkte voor het identificeren van de significantie van de categorie. De ‘GO’-categorieën die als significant verschillend (p < 0.005) werden beschouwd bij het vergelijken van CVS-individuen met controles na inspanning, waren deze behorende tot ion-transporter aktiviteit (een totaal van 87 genen in deze categorie) en ATPase-aktiviteit gekoppeld met trans-membraan beweging (42 genen). Als de CVS- en controle-klassen worden vergeleken vóór inspanning, worden ion-transport aktiviteit en ‘voltage-gated’ ion-kanaal aktiviteit geïdentificeerd (38 en 44 genen in de respectievelijke ‘GO’-categorieën).

Het is duidelijk dat ion-transport en ion-kanaal aktiviteit de gevallen onderscheiden van controles en dat inspanning deze verschillen lijkt te intensifiëren. Van meerdere andere aandoeningen is geweten dat de fluctuerende vermoeidheid die optreedt wordt veroorzaakt door abnormale ion-kanalen. Deze aandoeningen omvatten genetisch bepaalde ‘channelopathieën’ [ziekten veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanaal] en verworven aandoeningen zoals neuromyotonie, myasthenische syndromen, Multipele Sclerose en polyneuropathieën [Chaudhuri A, Behan PO: Fatigue in neurological disorders. Lancet 2004, 20: 978-988 — Chaudhuri A, Watson WS, Pearn J, Behan PO: The symptoms of Chronic Fatigue Syndrome are related to abnormal ion-channel function. Med Hypotheses 2000, 54: 59-63].

Er zijn andere trans-membraan funkties geassocieerd met verschillen tussen controles en CVS-patiënten, o.a. signaal-overdracht aktiviteit via receptor-binding/aktiviteit (Figuur 3a). Signaal-transductie van trans-membraan receptoren gebeurt via een aantal mechanismen, waaronder strukturele veranderingen, ion-kanalen en wijzigingen van trans-membraan potentialen. De G-proteïne gekoppelde receptoren spelen een belangrijke rol bij de membraan-trafiek machinerie. De meest opvallende inspanning-geïnduceerde veranderingen bij CVS-gevallen behoren tot gen-regulering op het punt van chromatine-struktuur; of deze veranderingen de verschillen weerspiegelen die worden gezien bij de mRNA-transcripten verbonden met verschillen qua membraan-traffiek tussen gevallen en controles, is nog niet bepaald.

Eén interessante samenhang bij deze studie was de bevinding dat het complement-mechanisme significante verschillen vertoonde tussen CVS- en controle-individuen na inspanning. Dit werd eerder gerapporteerd bij de analyse van gelijkaardige inspanning-leverende indivduen. Sorensen et al. [Sorensen B, Streib JE, Strand M, Make B, Giclas PC, Fleshner M et al.: Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J Allergy Clin Immunol 2003, 112: 397-403; zie: ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’] maten concentraties complement-afbraakprodukten in de sera van deze individuen en vonden verschillen tussen CVS- en controle-individuen bij C4a na inspanning. Complement-aktivatie werd geïdentificeerd als een ontologie die significant verschillend was tussen CVS- en controle-individuen na inspanning. De correlatie bij deze data is interessant aangezien hun studie proteïne-waarden (d.w.z.. gen-produkt) mat en onze studie mat de transcript-waarden.

[…] Het gebrek aan statistische significantie bij de 3 andere klasse-vergelijking analysen die werden uitgevoerd (CVS-gevallen vergeleken vóór en na inspanning, vergelijking van gevallen met basale controles en de vergelijking van gevallen met controles 24 uur na inspanning) weerspiegelt de lage experimentele gevoeligheid, waarschijnlijk te wijten aan het klein aantal individuen, eerder dan een afwezigheid van biologisch effekt. […]

Verder onderzoek zal grotere aantallen individuen omvatten voor de expressie-arrays. De nadruk bij dergelijke studies zal liggen op het ontwikkelen van een op gen-expressie gebaseerde multivariate funktie, of voorspeller, die het behoren tot een klasse van een nieuw staal correct voorspelt gebaseerd op de expressie-niveaus van belangrijke genen. Instrumenten voor het ontdekken van klassen zullen ook worden toegepast op expressie-profielen van CVS-individuen, in een poging afzonderlijke sub-groepen van deze ziekte verder te beschrijven op basis van gen-expressie; zoals we hebben gedaan voor graduele en plotse aanvang van de ziekte. De methoden gebruikt bij deze studie zullen echter ook worden toegepast op deze data-sets aangezien deze analytische instrumenten zeer nuttig zullen blijken bij het definiëren van de pathofysiologie of CVS. We hopen dat deze bredere, meer omvattende benadering van CVS-research veel deuren zal openen naar het begrijpen van dit syndroom en misschien van vermoeidheid en ziekte in het algemeen.

augustus 17, 2009

Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:36 am
Tags: , , , , ,

Ten einde een beetje duidelijkheid te krijgen over de stand van zaken aangaande gen-expressie bij M.E.(cvs), volgt hier een uitgebreid rapport van Prof. Dr Dr John W Gow (Senior Lecturer in Clinical Neuroscience; University Dept. of Neurology, Southern General Hospital, Glasgow, Scotland) en medewerkers. Er wordt regelmatig verwezen naar en vergeleken met anders studies; en biedt daarom een goed overzicht.

Samen met Prof. Chaudhuri en de ‘University of Glasgow’ heeft Gow in 2006 een patent aangevraagd onder de titel ‘Materials and Methods for Diagnosis and Treatment of Chronic Fatigue Syndrome’: “… Een aantal genen werden geïdentificeerd die tot een abnormale expressie kwamen bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met normal gezonde individuen. Deze genen omvatten deze encoderen voor defensine-α1, haemoglobine-γ, CXCR4, tubuline-beta-1, serine/threonine-kinase-17B, HLA DRss4 en prostaglandine-D2 synthase. De geïdentificeerde genen bieden objectieve ziekte-merkers die mogelijks gebruikt kunnen worden bij diagnostische testen om de diagnose van M.E.(cvs) te ondersteunen of bij het monitoren van de effektiviteit van een therapie. Ze bieden ook een rationele basis voor het klassificeren van M.E.(cvs)-patiënten volgens het onderliggend biochemisch letsel en voor geschikte doelgerichte therapieën.”.

In de leken-pers doken al verklaringen op gaande van “CVS is geen ziekte die veroorzaakt wordt door een erfelijk gen-defekt maar is een verworven aandoening.” tot “Een medicijnen-cocktail zou kunnen worden aangewend om de genen ‘uit te schakelen’, zodat patiënten een ‘redelijk normaal’ leven zouden kunnen leiden.”. In onderstaand artikel is men ietwat meer genuanceerd en minder voortvarend… Zoals eerder al aangegeven: ‘Nature’ en ‘Nurture’ bepalen een aandoening…

————————-

BMC Medical Genomics (2009) 2: 38 [Published: June 2009]

A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome

John W Gow1, Suzanne Hagan1, Pawel Herzyk2, Celia Cannon3, Peter O Behan1, Abhijit Chaudhuri4

1 Dept. of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, Glasgow, G4 0BA, UK;

2 The Sir Henry Wellcome Functional Genomics Facility, Faculty of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, G12 8QQ, UK;

3 Glasgow Veterinary School, University of Glasgow, UK;

4 Essex Centre for Neurological Sciences, Oldchurch Hospital, Romford, RM7 0BE, UK

Achtergrond

Aanhoudende vermoeidheid na infektie wordt erkend en maakt deel uit van een klinisch gedefinieerd syndroom (Chronische Vermoeidheid Syndroom). CVS is een zeer heterogene ziekte die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van nieuwe, persistente of terugkerende vermoeidheid, zo ernstig dat ze interfereert met de normale aktiviteit. Patiënten melden ook verstoord korte-termijn geheugen en concentratie, spier-pijn en post-exertionele malaise. Het klinisch voorkomen van CVS in de bevolking varieert van 0,23-2% en bijna 75% van de patiënten zijn vrouwen. De oorzaak en pathogenese van CVS zijn niet gekend en, tot op heden, is er geen standaard laboratorium-test die op een betrouwbare manier CVS-patiënten onderscheidt van gezonde individuen. Ten gevolgde daarvan wordt de persistentie van anderzijds medisch-onverklaarde chronische vermoeidheid dikwijls toegeschreven aan psychologische factoren. De voorbije jaren werden talrijke micro-chip studies ondernomen om patiënten met chronische vermoeidheid te onderscheiden van gezonde controles. Dit onderwerp werd ook behandeld in een speciale uitgave (2006) van het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’ [zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC’]. Daarin gebruikten meerdere artikels […], bioinformatica, algorithmen en rekenkundige analyses van micro-chip gegevens om een betere discriminatie te bekomen tussen individuen met onverklaarde chronische vermoeidheid en CVS, en gezonde controles.

Hoewel chronische vermoeidheid na bepaalde infekties bekend is (bv. Epstein-Barr virus), wordt CVS gewoonlijk niet beschouwd als te wijten aan een blijvende infektie. […]. [zie bv. ‘Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS’] Er zijn echter weinig studies die specifiiek de veranderingen qua gen-expressie bij post-infektueuze individuen hebben onderzocht.

Onze hypothese stelde dat patiënten met aanhoudende vermoeidheid die zich ontwikkelen na infekties biologisch verschillend zijn van individuen en dat dit zou worden weerspiegeld in een verschillende gen-signatuur. Recente vooruitgang in genoom sequentie-bepaling en geautomatiseerde chip-fabricage hebben DNA-chip (‘micro-array’) technologie makkelijk beschikbaar gemaakt. Deze technologie laat simultane differentiële expressie profilering toe voor een groot aantal genen in weefsel-stalen van CVS-patiënten en controles. Een eerdere studie, gebruikmakend van micro-array technologie met 1.764 genen en RNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC), toonde het nut van witte bloed-cellen voor gen-expressie profilering bij een ziekte zonder gekend pathologisch letsel, zoals CVS. Een meer recente micro-array studie met 9.522 genen concludeerde dat patiënten met CVS reproduceerbare veranderingen qua gen-regulatie vertonen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST, Kerr JR: Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol 2005, 58:826-832]. Daarenboven toonde een studie over inspanning-responsieve genen met een 3.800 oligonucleotide micro-chip significante verschillen in membraan ion-transport genen bij vrouwen met CVS, vergeleken met controle-individuen [Whistler T, Jones JF, Unger ER, Vernon SD: Exercise responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control subjects. BMC Physiology 2005, 5:5].

In onze studie, was het doel een complete ‘gen-signatuur’ te verkrijgen voor niet-psychiatrische patiënten met post-infektueuze, aanhoudende chronische vermoeidheid. We sloten vrouwelijke individuen uit om storende factoren voortkomend door de maandelijkse reproduktieve cyclus te voorkomen. Door gebruik te maken van een ‘Affymetrix GeneChip Human Genome U133’ dubbele chip set met bijna 45.000 probe-sets [een probe bij molekulaire genetica is een stukje erfelijk materiaal dat gemerkt werd om de aanwezigheid van een (deel van een gen) te detekteren of identifceren] – die 39.000 transcripten afgeleid van meer dan 33.000 gen-sequenties bevatten – werd het meeste van het gekende menselijk genoom in dit werk omvat.

Resultaten

Identificatie van genen met differentiële expressie.

Een aantal genen hadden een significante over- of onder-expressie bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde controles, bij micro-array analyse van het ganse genoom. De ‘Rank Products’ (RP) analyse [statistische berekening voor de detektie van differentieel tot expressie komende genen bij herhaalde micro-array experimenten] toonde dat 413 Affymetrix probe-sets significant waren ge-upreguleerd en 189 significant ge-downreguleerd (602 in totaal) bij de CVS-stalen. Van de significant ge-upreguleerd probe-sets, vertoonden 141 een verandering qua expressie van ten minste het 2-voud en 20 ten minste het 3-voud. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde probe-sets zijn respectievelijk 57 en 2.

IPA-resultaten.

[‘Ingenuity Pathway Analysis’, IPA, is software om via RP gegenereerde expressie-profielen te analyseren.]

Na analyse van de 602 probe-sets met differentiële expressie bleken 366 niet-overbodige ‘focus’ genen opgenomen in de IPA-database. Daarvan waren 286 genen significant ge-upreguleerd en 80 significant ge-downreguleerd bij de CVS-patiënten. Van de significant ge-upreguleerde genen waren er 105 waarvan de expressie ten minste verdubbelde en 16 ten minste ver-3-voudigde. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde genen zijn respectievelijk 25 en 3. De tien hoogst ge-upreguleerde genen en de drie hoogst ge-downreguleerde genen zijn te vinden op: http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T1.

Om de biologische context van genen met differentiële expressie bij CVS-patiënten te onderzoeken, werd de IPA-software gebruikt. […] De netwerk-analyse toonde het bestaan van 21 netwerken met een significante score tussen 9 en 47, die tesamen 349 van de 366 genen bevatten. De top drie netwerken, met 5 van de top 10 ge-upreguleerde genen, omvatten lactotransferrine (7,2 x ge-upreguleerd), CXCR4 (3,6 x ge-upreguleerd), de integrinen α2B en β3 (respectievelijk 4,1 x en 3,8 x ge-upreguleerd) en defensine-α1 (6 x ge-upreguleerd).

Veranderde bio-systemen bij CVS.

De gen-signatuur van CVS benadrukte veranderingen qua gen-expressie in drie belangrijke gebieden: oxidatieve stress, apoptose en viraal-achtige immuun- dysfunktie. (http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T2)

Oxidatieve stress

Er is een grote hoeveelheid bewijsmateriaal bij CVS dat er op wijst dat oxidatieve stress bijdraagt tot ziekte-progressie en symptomen. Ons gen-array bevestigt bewijs van oxidatieve stress door een grote verandering in de genen coderend voor prostaglandine-endoperoxide synthase 1 en 2 (ook gekend als COX-1 en -2). Deze enzymen zijn verantwoordelijk voor de regulering van de synthese van de pro-inflammatoire mediatoren: prostaglandinen. De induceerbare vorm van COX-2 katalyseert de omzetting van arachidonzuur naar prostaglandinen, de afgifte van prostanoïden [prostaglandinen (mediatoren van inflammatoire en anafylactische reakties), prostacyclinen (aktief bij de resolutie-fase van inflammatie) en tromboxanen (mediatoren van vasoconstrictie)], die perifere nociceptor [een sensorische receptor die reageert op pijn] -uiteinden sensitiseren en gelokaliseerde hyper-gevoeligheid voor pijn veroorzaken. Er werd ook aangetoond dat COX-2 tot over-expressie komt op plaatsen met inflammatie en bij verscheidene tumoren, met verhoogde expressie van het belangrijkste arachidonaat-metaboliet, prostaglandine-E2 (PGE2). Van COX-2 afgeleid PGE2 is ook gekend de expressie te verhogen van ‘decay-accelerating factor’ (DAF of CD55). DAF is én van de belangrijke beschermende complement-receptor genen en een immuun-regulator, wat van belang is aangezien DAF ge-upreguleerd was op onze chip. Dit is zeer betekenisvol wat betreft immuun-suppressie/ontwrichting en cel-verspreiding (verder besproken bij immuun-modulering). Gecultiveerde, door TNFα gestimuleerde lymfocyten van CVS-patiënten bleken te resulteren in over-expressie van NF-kappaB (NFκB) [zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]. COX-2 is verantwoordelijk voor meerdere inflammatoire akties, Terwijl NFκB het belangrijkste mechanisme is dat inflammatoire en oxidatieve stress mediatoren, zoals pro-inflammatoire cytokinen en COX-2 regelt, en de aanmaak van induceerbaar NOS (iNOS). De over-expressie van genen voor oxidatieve stress bij CVS is ook consistent met de upregulering van de haemoglobine-genen, in het bijzonder gamma-haemoglobine, dat gewoonlijk alleen tot expressie komt in de foetus. Bijkomende ge-upreguleerde genen betrokken bij oxidatieve stress bleken leukotriene B4, cytochroom-P450, superoxide-dismutase en de mono-oxygenasen. Indirect bewijs voor een O2--aanval komt van de upregulering van gamma- en alfa-haemoglobine, in het bijzonder gamma-haemoglobine. De unieke eigenschap van verhoogde zuurstof-binding van dit proteïne zou kunnen worden geïnduceerd ten gevolge een oxidatieve aanval.

Apoptose

Er is aktieve apoptose in de cellen van patiënten met CVS en consistent daarmee is de bevinding dat veel met apoptose geassocieerde genen, o.a. caspase-1, ge-upreguleerd zijn. Meerdere factoren kunnen apoptose triggeren: cellulaire beschadiging, virus-infektie en homeostase. Het signaal voor apoptose kan van binnenin de cel komen, van het omringend weefsel of van een cel behorend tot het immuun-systeem. Bij de top 100 ge-upregueerde genen is er een overwicht van met apoptose geassocieerde genen. Apoptotische cellen en hun kernen krimpen en fragmenteren dikwijls. Ze kunnen dan efficiënt via fagocytose worden verwijderd door macrofagen of naburige cellen. Uit het gen-array blijkt ook bewijs voor macrofaag-aktivatie, via de upregulering van Toll-like receptor (TLR)4 en TLR8 [Toll-Like receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren; er zijn ca. 10 types geïdentificeerd], en monocyt-naar-macrofaag differentiatie genen. Omtrent welke cellen apoptose ondergaan, zijn er theorieën te over. Kennedy en co hebben eerder verhoogde in neutrofiel-apoptose bij CVS gerapporteerd [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’]. Het kan zijn dat het deze groep cellen is die het doelwit is voor apoptose en onze array-gegevens omvatten zeker veel genen die gerelateerd zijn met neutrofielen, alsook eosinofielen.

Immuun-modulatie

Ontwijking van het immuunsysteem is een goed gedocumenteerd mechanisme waarbij virussen, bakterieën, parasieten en kanker-cellen vernietiging door de gastheer voorkomen. Immuun-modulaties kunnen uitéénlopend en complex zijn. Ze omvatten doelgerichte verstoring van T-cel funktie, onderdrukking van T-cel cytotoxische dood-receptoren [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’], inductie van apoptose-proteïnen, inhibitie van aangeboren immuunsystemen zoals dendritische cel en ‘natural killer’ (NK) receptoren. Uit deze studie blijkt dat meerdere genen die verbonden zijn met het immuunsysteem ge-upreguleerd zijn bij patiënten met CVS, wat wijst op mogelijke funktionele wijzigingen. Onder die genen die geïdentificeerd werden, zijn 2 genen die behoren tot het ‘Major Histocompatibility Complex’ [MHC; genen die coderen voor eiwitten op de membranen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]: HLA-DRB4 en HLA-DQB1; deze genen coderen voor β-ketens [bepaalde eiwitten, isoformen, die samen met andere het volledige proteïne vormen] van MHC klasse II molekulen. MHC klasse II molekulen worden gevonden op antigen-presenterende cellen, namelijk B-cellen, dendritische cellen en macrofagen [klasse I molekulen komen voor op élke cel van het lichaam met een kern]. Antigenen geassocieerd met MHC klasse II worden aangeboden aan CD4+ cellen, een sub-groep van T-cellen. Vroegere studies hebben storingen geïdentificeerd in de expressie van MHC klasse II genen bij patiënten met CVS. Steinau en collegas wezen op een downregulering van MHC klasse II molekulen; dit werk identificeerde echter geen individuele MHC klasse II genen [Steinau M, Unger ER, Vernon SD, Jones JF, Rajeevan MS: Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in chronic fatigue syndrome. J Mol Med 2004, 82:750-755]. Vervolgens duidden Smith et al. [Smith J, Fritz EL, Kerr JR, Cleare AJ, Wessely S, Mattey DL: Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol 2005, 58:860-863] verhoogde expressie van HLA-DQB1 aan en benadrukten een aantal andere MHC-genen die waren veranderd bij CVS. De hier voorgestelde data ondersteunen daarom enkele van deze bevindingen maar ze identificeren ook veranderingen qua expressie van HLA-DRB4 bij patiënten met CVS, wat eerder niet werd aangetoond.

Naast het MHC zitten bij de top van de ge-upreguleerde genen meerdere genen die coderen voor immuun-proteïnen die behoren tot het aangeboren immuunsysteem. Van patiënten met CVS worden verondersteld dat ze subtiele immuun-dysfunktie hebben. Veranderde NK-cel funktie bij CVS-patiënten werd eerder gerapporteerd door Morrison et al. en werd geverifieerd via de significante downregulering van NK KIR receptoren op onze gen-chip. Deze gegevens helpen te bevestigen dat immuun-modulerende gen-expressie significant verschillend is bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde individuen. Immuun-dysfunktie lijkt aanwezig te zijn bij patiënten met CVS in afwezigheid van eender welk pathogen. De klassieke Th1 naar Th2 omschakeling laat intracellulaire pathogenen toe opsporing te ontwijken. Zoals hierboven gemeld is DAF een regulator van het complement-systeem en een immuun-regulator. DAF lijkt NK-cellen te inhiberen en is gekend als één van de meest krachtige aktivatoren van tumor-genese/virale verspreiding. DAF is ook gekend als een receptor voor bepaalde virussen (inclusief enterovirussen) en andere micro-organismen. […] Het is geweten dat gen-expressie profielen van totale gemengde PBMC-populaties gen-expressie in sub-groepen van cellen kunnen maskeren. Deze studie toont echter zeer hoge expressie van een aantal MHC klasse II genen die normaal wordt gezien in de minder belangrijke delen van de PBMCs, wat wijst op significante veranderingen binnen deze cel-groepen.

Ge-upreguleerede immuun-gerelateerde genen bij patiënten omvatten lactotransferrine, defensine-α1 en integrinen. Lactotransferrine is een ijzer-bindend proteïne dat verantwoordelijk is voor immunologische reakties, terwijl defensinen een familie van bakterie-dodende en cytotoxische peptiden zijn, afgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Defensinen zijn ook betrokken bij de anti-microbiële verdediging van epithelia (van het ademhaling- en urinogenitaal systeem). Van patiënten met CVS is geweten dat ze meer vatbaar zijn voor infekties […]. Integrinen zijn extra-cellulaire matrix proteïnen betrokken bij in cel-adhesie en aktiveren ook signalisering-mechanismen voor cel-groei en -regulering in het cytosol. Arginase is een belangrijk enzyme waarvan wordt gedacht dat het aktief is bij immuun-modulering en is ook betrokken bij NK-cel funktie. Andere opmerkenswaardige ge-upreguleerde genen zijn haemoglobinen, in het bijzonder foetaal haemoglobine, en dit zou een respons op verhoogde oxidatieve stress kunnen suggereren. Een andere familie ge-upreguleerde genen staat in verband met cellulaire apoptose en serine-threonine kinase is een lid van de hersen kinase familie betrokken bij neurale apoptose en vorming van corpora amylacea [kleine korrels in neuroglia, bestaande uit gedegenereerde cellen]. Van de ge-downreguleerde genen, zijn ribosomaal proteïne [proteïnen die, samen met rRNA, de ribosomale subunits vormen die betrokken zijn bij de vertaling van RNA naar eiwitten] gen en ‘zinc-finger’ proteïne [grote super-familie van proteïne-domeinen die op DNA kunnen binden] genen betrokken bij de cel-cyclus en cellulaire groei.

Validatie van gen-array gegevens via RT-PCR en ‘western blotting’.

[RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) is een variant van PCR waarbij RNA i.p.v. DNA het uitgangspunt is voor amplificatie. Hiervoor wordt het RNA (enkel-strengig) eerst omgezet in cDNA (‘complementary DNA’) door gebruik te maken van het enzym reverse-transcriptase. Het cDNA kan vervolgens met PCR worden geamplificeerd om het dan te visualiseren en ev. te kwantificeren. Het is de meest gevoelige techniek om mRNA te detekteren.

‘Western blotting’: Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.]

Twee leden van de defensine gen-familie bleken zich onder de genen met de hoogste expressie te bevinden: defensine-α1 en -α4. Defensinen zijn een groep cytotoxische peptiden die te vinden zijn in de bakterie-dodende granulen van neutrofielen en macrofagen, en worden vrijgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Deze proteïnen spelen dus waarschijnlijk een rol bij fagocyten-gemedieerde gastheer-verdediging. Ten gevolde de hoge defensine-waarden die werden gemeten via de micro-chip, werd defensine-α1 gekozen voor verder analyse. We probeerden de gegevens te bevestigen op RNA- en proteïne-niveau, aan de hand van een andere groep of bloed-stalen van 10 CVS-patiënten en 10 normale, gezonde controles. We gebruikten oligonucleotiden [korte DNA-sequenties] (bij RT-PCR) en specifieke antilichamen (bij ‘western blotting’) om defensine-α1 veranderingen te detekteren op RNA- en proteïne-niveau. We tonen upregulering van defensine-α1 op het RNA-niveau bij patiënten met CVS, vergeleken met normale gezonde controles. Bovendien toont de immuno-blot upregulering van defensine-α1 bij alle CVS-patiënten (uitgezonderd één), vergeleken met controles die weinig of geen defensine-proteïne vertoonden. […]

Bespreking

Er werd een uitgebreide gen-signatuur van niet-psychiatrische patiënten met CVS gegenereerd d.m.v. een micro-chip test van het ganse genoom. De micro-array data die hier werden gepresenteerd, illustreren verschillen in gen-expressie verspreid over het ganse genoom tussen post-infektueuze, niet-psychiatrische mannelijke patiënten met CVS en gezonde controles. Analyse van de gen-signatuur van CVS suggereert dat drie significante mechanismen zijn veranderd in patiënten: oxidatieve stress, apoptose en virus-achtige immuun-modulering. Eerder voerden Gu et al. een micro-array met 588 genen uit waarbij patiënten met spondyloarthropathie [chronische inflammatoire ziekte van de gewrichten], reumatoïde arthritis en psoriatische arthritis [specifieke vorm van ontstekingsreuma gepaard met bepaalde vorm van huiduitslag] werden vergeleken met normale, gezonde individuen. Van belang was hun bevinding dat expressie van CXCR4 onverwacht hoog was bij alle individuen met arthritis. Dit gen codeert een CXC chemokine receptor [chemokinen = chemotactische cytokinen; geproduceerd door mest-cellen en afgegeven om leukocyten aan te trekken; sommige chemokine-receptoren kunnen aan diverse pathogenen binden] die specifiek is voor één ligand (‘stromal cell-derived factor-1’) [SDF-1; klein cytokine behorend tot de chemokine-familie] en CXCR4 is gekend samen te werken met CD4 proteïne [eiwit op het oppervlak van helper T-lymfocyten dat hen toelaat te interageren met cellen die MHC klasse II gen-produkten tot expressie brengen] om toegang van HIV in cellen te ondersteunen. DNA micro-chip studies door Watanabe en co toonde significante upregulering van het CXCR6 motief [chemokine receptor 6] in patiënten met colitis ulcerosa [chronische ontsteking van de de dikke darm met zweer-vorming]; terwijl ander werk er op wees dat de CXCL12/CXCR4 interaktie betrokken is bij meerdere inflammatoire aandoeningen, inclusief inflammatoire darm ziekte. Daarom wijst de bevinding van onze studie (dat CXCR4 significant was ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten) er op dat dit gen wellicht niet specifiek is voor CVS. We noteren echter dat in de CVS-studies door Kerr et al. [Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D, Sinclair LI, Mattey DL, Richards SC, Montgomery J, Baldwin DA, Kellam P, Harrison TJ, Griffin GE, Main J, Enlander D, Nutt DJ, Holgate ST: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis 2008, 197:1171-1184 — Kerr JR, Burke B, Petty R, Gough J, Fear D, Mattey DL, Axford JS, Dalgleish AG, Nutt DJ: Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol 2008, 61:730-739], CXCR4 ook was ge-upreguleerd.

Het algemeen beeld dat naar voor komt uit deze resultaten wijst naar een significante, hoewel fenotypisch subtiele, verstoring van de microbiële afweer, virale immuun-bewaking en cel-groei bij patiënten met post-infektueuze chronische vermoeidheid. Een mogelijke kritiek op dit werk is dat vrouwelijke patiënten werden uitgesloten. Zoals reeds uitgelegd was de reden hiervoor het vermijden van verstorende endocriene invloeden op de gen-signatuur. Eerdere research heeft weinig geslacht-gebonden verschillen wat betreft symptoom-ernst gevonden. Er was geen geslacht-effekt in een ‘prospective cohort’ studie [volgt gedurende een tijd een groep van gelijkaardige individuen die verschillen met betrekking tot bepaalde te onderzoeken (risico-)factoren, om te bepalen hoe die factoren met verloop van tijd een bepaalde uitkomst (bv. ziekte) opleveren] van patiënten met post-infektueuze vermoeidheid uit de eerstelijn-zorg. Over het algemeen onderscheiden demografische, klinische en psychosociale factoren mannelijke niet van vrouwelijke patiënten met CVS en we geloven dat de resultaten van onze research toepasbaar zijn op CVS-patiënten van de beide geslachten.

Besluiten

Recente studies hebben geprobeerd de molekulaire basis voor CVS te bepalen [zie eerder Kerr et al. — Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker genes for differential diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med 2008, 14:599-607 — Gräns H, Nilsson P, Evengård B: Gene expression profiling in the Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Internal Medicine 2005, 258:388-390]. Onderstaande tabel illustreert overlappende genen geobserveerd bij CVS-patiënten in onze analyse en in eerdere micro-array studies (en één filter-array studie), door andere researchers. Hoewel er enige overlap is, is er over het algemeen een gebrek aan correlatie tussen verschillende publikaties over gen-arrays tot nu toe. Of dit verschillende patiënten-populaties en selektie-criteria weerspiegelt, blijft onduidelijk. Het moet echter in gedachten worden gehouden dat veel mRNAs zeer korte half-waarde tijden [tijd waarin de helft van het mRNA wordt afgebroken] hebben (d.i. minder dan 2 min) en daarom is wat wordt geobserveerd met een micro-array een moment-opname en weerspiegelt het niet noodzakelijk het chronische biologische proces inherent aan deze aandoening. Het is, daarom, noodzakelijk de micro-array gegevens te valideren d.m.v. meer gevestigde technologieën zoals RT-PCR, ‘western blotting’ en ELISA, en grotere populaties met zorgvuldige geselekteerde patiënten te gebruiken om de resultaten te bevestigen.

De data die hier worden voorgesteld illustreren duidelijk belangrijke verschillen qua gen-expressie tussen patiënten met post-infektueuze CVS en gezonde controles. Niettegenstaande deze verschillen in gen-signaturen een rationele verklaring voor de symptomen kunnen bieden, en bevestigen dat CVS een echte en biologische ziekte is, impliceren gen micro-array resultaten niet dat CVS hoofdzakelijk een genetische aandoening is. Daarenboven bewijzen de research-data niet of differentieel tot expressie komende genen de voorbestemmende oorzaak of verder gevolg van CVS zijn. We geloven echter dat de hier voorgestelde gegevens een belangrijke eerste stap voorwaarts zijn naar het doel, nl. het identificeren van vermeende biomerkers om de klinische diagnose van CVS te ondersteunen. Bovendien bieden de geïdentificeerde (via genen met over-expressie) biologische mechanismen, een rationeel begrip en mogelijke verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van CVS – wat een potentieel invaliderende ziekte, op zoek naar een effektieve genezing, blijft.

CVS-genen met over-expressie bij verschillende micro-chip studies

-063-B tabel - Gene Signature for Post-Infectious CFS

augustus 9, 2009

Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 3:51 pm
Tags: , , , , ,

Aansluitend op ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’ hier een aanmoediging om verder te zoeken naar merker-genen voor M.E.(cvs)! Het betreft een overzichtsartikel en geïnteresseerden kunnen eventueel ontbrekende referenties opvragen…

Eén van de auteurs, Esther Crawley – “de enige (?) pediater in het V.K. die specialiseert in M.E.(cvs) – ontving begin 2009 de ‘Clinician Scientist Award’. Ze kreeg ook £ 730.000 research-fondsen van het ‘National Institute of Health Research’ voor research bij pediatrische M.E.(cvs). Dr Crawley is medisch adviseur voor de ‘Association of Young people with ME’ (AYME).” Ze krijgt echter in de M.E.(cvs)-wereld ook flink wat kritiek om dat ze cognitieve gedragstherapie en graduele oefenprogrammas zou promoten. Ze zou de meldingen van patiënten over nadelige effekten hiervan verwerpen…

Voor dit artikel werden Dr Crawley en haar research-team gedeeltelijk gesponsord door ‘The Linbury Trust’ en de ‘Bath Unit for Research in Paediatrics’.

George Davey Smith is Professor Klinische Epidemiologie en Hoofd van de Afdeling Epidemiologie van de ‘University of Bristol’. Dit voornaamste research-interesse ligt bij de sociale ongelijkheden bij gezondheid en hoe deze worden gegenereerd door blootstellingen met een invloed op de ganse levensloop. Hij heeft ook gewerkt rond de geschiedenis van epidemiologie, meta-analyse epidemiologische methodologie en schreef o.a. een artikel over ‘Mendeliaans Randomisering’ (zie hieronder)…

Het werd reeds eerder aangegeven op deze paginas: zoals bij zovele aandoeningen speelt wellicht een interaktie van ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren); genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen die patiënten kunnen over-erven en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren (bv. infektie). Dit wordt hier bevestigd…

Archives of Disease in Childhood 2007 Dec;92(12):1058-61

Is Chronic Fatigue Syndrome (CFS/ME) heritable in children, and if so why does it matter?

Esther Crawley1 en George Davey Smith2

1 Centre for Child and Adolescent health; Hampton House, Cotham Hill, Bristol, BS6 6JS, UK

2 MRC centre for Causal Analyses in Translational Epidemiology (CaiTE), Department of Social Medicine, University of Bristol, UK

Chronische Vermoeidheid Syndroom of M.E. is verrassend courant bij kinderen – een prevalentie tussen 0,19 and 2%, gebaseerd op telefoon-bevragingen in het V.K. en de V.S. Een prevalentie (tot 30 jaar oud) van zelf-gerapporteerde, niet door een arts bevestigde M.E.(cvs) van 0,8% werd gemeld op basis van het ‘1970 British Birth Cohort’. Prevalentie (leeftijd 8 tot 17 jaar) voor invaliderende vermoeidheid gedurende 3 maanden en 6 maanden bleek 2,34% en 1,29% uit een longitudinale tweelingen-studie. Dit betekent dat bijna alle kinderartsen die dit lezen wel eens kinderen met M.E.(cvs) hebben gezien en behandeld. Enkele pediaters zullen een familiale geschiedenis van met M.E.(cvs) hebben opgemerkt en zich hebben afgevraagd of dit te wijten was aan genetische overdraagbaarheid of een omgevingsfactor. Over de oorzaken van M.E.(cvs) wordt reeds lang gedebateerd maar dit is niet noodzakelijk nuttig gebleken voor de klinische behandeling van kinderen met M.E.(cvs). Dit artikel onderzoekt het bewijs voor de genetische overdraagbaarheid van M.E.(cvs). […]

Familiale aggregatie

De familiale aggregatie van M.E.(cvs) werd voor het eerst beschreven in Lyndonville (staat New York) [Bell KM, Cookfair D, Bell DS, Reese P, Cooper L. Risk-factors associated with Chronic Fatigue Syndrome in a cluster of paediatric cases. Rev Infect Dis. 1991; 13 Suppl 1:S32-S38]. In deze studie werd een vragenlijst betreffende de symptomen van M.E.(cvs) en mogelijke risico-factoren (allergieën, astma, risico-factoren voor infektie en familiale geschiedenis) uitgedeeld aan alle 914 studenten van de ‘Lyndonville Central School’. Het hebben van een familie-lid met M.E.(cvs) bleek een sterke voorspellende factor voor M.E.(cvs), met een risico-verhouding van 35,9. Het blijkt niet duidelijk uit deze studie of de auteurs enkel vroegen naar eerste-graad verwanten of ‘om het even welke’ verwanten. In dit stadium besloten de auteurs dat dit kon te wijten zijn aan de overdracht van een infektueus agens, de aanwezigheid van genetische factoren of één of andere nog te definiëren omgevingsfactor. Later, in een andere kleine studie hadden 50% van de kinderen met M.E.(cvs) een familiale geschiedenis van M.E.(cvs) [Bell DS, Bell KM, Cheney PR. Primary juvenile fibromyalgia-syndrome and Chronic Fatigue Syndrome in adolescents. Clin Infect Dis. 1994; 18 Suppl 1:S21-S23]; maar ook hier was niet duidelijk over welke verwanten het ging.

Tweelingen-studies

Onderzoekers hebben een tweelingen-methodologie gebruikt om te bepalen hoeveel van de beschreven familiale aggregatie te wijten is aan genetische factoren en hoeveel aan de omgeving. Tweelingen-studies bij volwassenen hebben voor M.E.(cvs) consequent hogere overeenstemming getoond bij monozygote tweelingen vergeleken met dizygote tweelingen, waarbij de monozygote correlatie gewoonlijk tenminste het dubbel was van die van de dizygote correlatie […]. Aangezien omgevingsfactoren (bv. infekties of ouderlijke opvoeding) tijdens de kindertijd gelijkaardig moeten zijn geweest bij monozygote en dizygote tweelingen-paren, kan het verschil tussen de monozygote tweelingen – die 100% hetzelfde DNA hebben – en de dizygote tweelingen – die gemiddeld 50% gemeen hebben – gebruikt worden om te berekenen wat de bijdrage is van genetische overdraagbaarheid. Het verschil in overeenstemming stijgt bij het hanteren van een striktere definitie bij volwassenen. Dit levert bewijs voor een kern M.E.(cvs)-groep waarbij genetische factoren een belangrijke rol spelen.

[…]

Tweelingen-studies die vermoeidheid bij kinderen onderzoeken komen overeen met deze bij volwassenen. In het V.K. werden verzorgers van 670 tweelingen-paren bevraagd over invaliderende vermoeidheid van meer dan een week en meer dan een maand. In beide gevallen was de overeenkomst groter bij monozygote tweelingen vergeleken met dizygote tweelingen (0,81 vs 0,59 voor één week, 0,75 vs 0,47 voor één maand). Dit suggereert dat de genetische bijdrage tot het ervaren van invaliderende vermoeidheid hoog is. Deze studie werd uitgebreid: de duur van de vermoeidheid werd gedefinieerd als enkele dagen, meer dan een week, meer dan 1, 3 of 6 maanden; en de relatie tussen vermoeidheid en depressie werd nagegaan bij 1.468 tweelingen-paren. Voor kort-durende vermoeidheid was de genetische overdraagbaarheid hoog en er kon geen gedeelde bijdrage van omgevingsfactoren worden gedetekteerd. Voor langdurige vermoeidheid doken er substantiële omgevingsinvloeden op en een matige genetische bijdrage.

Is de erfelijkheid van vermoeidheid te wijten aan depressie?

Dit stelt de vraag of de vermoeidheid die wordt gemeten eigenlijk een deel is van een stemmingsaandoening zoals depressie (ook gekend als erfelijk). In de pediatrische studie hierboven beschreven, werd voor allebei de korte en verlengde vermoeidheid aangetoond dat de meerderheid van de genetische en milieu-variantie specifiek is voor invaliderende vermoeidheid en verschillend van factoren die bijdragen tot depressie. Dit is consistent met een studie bij volwassenen waar depressie, angst en psychologisch leed werden gemeten bij 1.004 volwassen tweelingen-paren. ‘Structural equation modelling’ [SEM is een statistische techniek voor het testen en inschatten van oorzakelijke verbanden via combinatie van of statistische gegevens en kwalitatieve causale veronderstellingen; het is geschikt voor het testen, niet het ontwikkelen, van een theorie.] suggereerde dat de familiale aggregatie van vermoeidheid grotendeels te wijten was aan genetische factoren, welke niet voorkwamen bij andere metingen van psychologisch leed. Met andere woorden: chronische vermoeidheid is erfelijk en deze erfelijkheid is etiologisch verschillend van psychologisch lijden. Deze studies zijn belangrijk aangezien ze suggereren dat vermoeidheid NIET ‘slechts een variant van depressie’ is.

M.E.(cvs) lijkt daarom, ten minste gedeeltelijk, te gehoorzamen aan Turkheimer’s ‘wetten van gedragsgenetica’ [Wet 1: Alles is erfelijk * Wet 2: Het milieu-effekt te zijn opgegroeid in hetzelfde gezin is substantieel kleiner dan het genetisch effekt en benadert dikwijls nul. * Wet 3: De meeste gedragsmatige variabiliteit blijft in de fouten-marge nadat genetische effekten en de effekten van te zijn opgegroeid in hetzelfde gezin werden in rekening gebracht.]. Veel aandoeningen die aan deze wetten gehoorzamen worden echter ook door de omgeving bepaald wanneer men veranderingen qua risico over de tijd en tussen populaties in overweging neemt. Obesitas, bv., vertoont een hoge erfelijkheid – typisch rond 70% – maar ter zelfder tijd hebben we een dramatische stijging in prevalentie gezien, wat er duidelijk op wijst dat omgevingsfactoren betrokken zijn. Schattingen van genetisch en omgevingsbijdragen aan ziekte-risico uit tweelingen-studies kan natuurlijk niet de bijdrage weerspiegelen van bijna universele milieu-blootsellingen of van deze die veranderen over alle lagen van de maatschappij, zoals het evenwicht tussen energie-besteding en energie-opname. Bovendien is de veronderstelling dat schijnbaar gemeenschappelijke blootstellingen – zoals scheiding van de ouders – hetzelfde effekt heeft op twee individuen niet noodzakelijk gerechtvaardigd, aangezien eerdere ervaringen en individuele karakteristieken bij blootstelling kunnen leiden tot verschillende effekten bij verschillende mensen.

Associatie-studies

Zoals bij veel aandoeningen met bewijs voor substantiële erfelijke overdraagbaarheid – en enkele zonder – omvatte veel recent werk zoekwerk naar associaties met kandidaat-genen in gevallen-controle studies bij de bevolking. De kandidaat-genen werden zo gekozen dat ze de gepostuleerde mechanismen via dewelke M.E.(cvs) ontstaat, weerspiegelen; bv. varianten in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as. Als varianten verbonden met verschillende HPA aktiviteit-profielen geassocieerd zouden zijn met risico voor M.E.(cvs), zou dit goed bewijs leveren voor het feit dat potentieel modificeerbare milieu-invloeden op HPA-funktie oorzakelijk gerelateerd zijn met het risico om M.E.(cvs) te ontwikkelen. De redenering hier is complex maar belangrijk. Als we de HPA-as als voorbeeld blijven gebruiken, kunnen we zien dat potentiële omgevingsinvloeden op de HPA-funktie van een kind (bv. onenigheid tussen de ouders) of zelfs directe metingen van de HPA-funktie, verband zullen hebben met een brede waaier aan andere mogelijke oorzaken van M.E.(cvs). Daarom zullen de associaties verstoord worden door deze factoren en is het niet mogelijk de etiologische processen te isoleren die zouden kunnen gemodificeerd worden om M.E.(cvs) te voorkomen of behandelen […]. Bovendien zou het bij M.E.(cvs) betrokken ziekte-proces de HPA-funktie kunnen wijzigen, eerder dan dat verstoorde HPA-funktie leidt tot M.E.(cvs), een situatie die ‘causale omkering’ wordt genoemd. Genotypes zijn echter niet geassocieerd met verstorende factoren; ook veranderen ziekte-processen genetische varianten van geslachtscellen niet. Een genotype verbonden met HPA-funktie kan dus als merker worden genomen voor dergelijke eigenschappen die niet worden verstoord door noch vatbaar zijn voor omkering van oorzakelijk verband, en zodoende beter bewijs voor of causaliteit leveren. Naar deze benadering om genetische data te gebruiken wordt gerefereerd als ‘Mendeliaanse Randomisering’ [De willekeurige overdracht van genen van ouders naar nageslacht die plaatsvindt tijdens vorming van geslachtscellen en bevruchting. * Het aanwenden van verbanden tussen genotype en ziekte om dingen te weten te komen over door het milieu modificeerbare oorzaken van ziekte en zo het causaal effekt te testen, gebruikmakend van gemeten variatie in genen met een gekende funktie.] en dit wordt ook toegepast in andere klinische settings. Deze benadering van genetische epidemiologie gebruikt genetische gegevens om de potentieel modificeerbare oorzaken van ziekte te begrijpen, eerder dan om een basis aan te reiken voor voorspellende genetische testen.

Studies naar genetische associatie bij M.E.(cvs) zijn tot op heden enkel uitgevoerd bij volwassenen. De bevindingen waren gemengd; ze worden hier samengevat.

HPA-as: Varianten van het Corticosteroid Bindend Globuline (CBG) gen werden beschreven in een geïsoleerde verwantschap en de aanwezigheid was geassocieerd met idiopathische chronische vermoeidheid en M.E.(cvs) (CDC definitie) [Torpy DJ, Bachmann AW, Grice JE, Fitzgerald SP, Phillips PJ, Whitworth JA et al. Familial corticosteroid-binding globulin deficiency due to a novel null-mutation: association with fatigue and relative hypotension. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86(8):3692-3700]. Bij onderzoek in een gevallen-controle studie was er echter geen sterk verschil in CBG-prevalentie in een groep van 248 patiënten met M.E.(cvs) in vergelijking met 248 controles [Torpy DJ, Bachmann AW, Gartside M, Grice JE, Harris JM, Clifton P et al. Association between Chronic Fatigue Syndrome and the corticosteroid-binding globulin gene ALA SER224 polymorphism. Endocr Res. 2004; 30(3):417-429]. Andere ‘single nucleotide’ polymorfismen [SNPs; variaties in een DNA-sequentie die voorkomt wanneer één enkel nucleotide (A, T, C of G) in een genoom verschilt] van belang bij HPA-as worden verder beschreven.

HLA-genotype: Of HLA-genotypes geassocieerd zijn met M.E.(cvs) of niet is controversieel. Eén studie toonde geen significante verbanden vergeleken met controls [Underhill JA, Mahalingam M, Peakman M, Wessely S. Lack of association between HLA-genotype and Chronic Fatigue Syndrome. Eur J Immunogenet. 2001; 28(3):425-428] en één studie suggereerde een verhoogde frequentie van HLA-DQ A1*01 [Humaan Lymocyt Antigen klasse II, DQ alfa 1, een gen coderend voor een eiwit dat vereist is bij de vorming van een receptor op het cel-oppervlak die essentieel is voor de werking van het immuunsysteem.] [Smith J, Fritz EL, Kerr JR, Cleare AJ, Wessely S, Mattey DL. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol. 2005; 58(8):860-863]. Beide studies waren klein (respectievelijk 58 en 49 patiënten) […].

Cytokinen: Eén studie bij italiaanse patiënten met M.E.(cvs) onderzocht promoter [plaats in het DNA, voor een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie te starten] -polymorfismen voor IL-10, IL-6 en IFNγ, en toonde een verhoging qua TNF-genotypes vergeleken met controles met een daling van lage IFNγ  producenten [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma 874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24(2):179-182]. Dit is echter slechts één enkele studie waarvan tot nu toe and de bevindingen niet werden her-bevestigd. [De ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ leverde in 2008 ook bewijs voor het feit dat genetisch bepaalde variaties in de intensiteit van de inflammatoire respons aan de basis liggen van de ernst van de acute ziekte-respons; zie: ‘Cytokine polymorfismen & respons op infektie’]

Het belangrijkste aspekt wat betreft associatie-studies in dit domein moet zijn dat ze ernstig onderbemand zijn, dus is  het niet onverwacht dat er geen robuste bevindingen zijn opgedoken. Realistische veronderstellingen over de effekt-grootte die zou kunnen bestaan tussen courante genetische varianten en een complexe niet-homoge ziekte zoals M.E.(cvs) zouden suggereren dat, om informatief te zijn, studies vereist zijn met aantallen die ten minste een orde groter zijn dan de huidige studies. De inspanning is het echter waard, aangezien ze het potentieel hebben ons te informeren over modificeerbare risico-factoren voor M.E.(cvs), door gebruik te maken van de ‘Mendeliaanse Randomisering’ hierboven bessproken. Indien studies met voldoende grote aantallen bevestigde associaties tussen genetische varianten en risico voor M.E.(cvs) opleveren, dan suggereert dit tevens dat de bestudeerde M.E.(cvs) patiënten-groep ten minste een subgroep met een coherente diagnose vertegenwoordigt; want als de diagnose eigenlijk volledig incoherent is, kunnen geen echte verbanden worden gevonden.

Naast onderzoeken van genetische varianten en M.E.(cvs)-risico, zijn er studies geweest over verschillen qua gen-expressie – d.w.z. hoeveelheden RNA transcriptie-produkten – in patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met controles. Deze studies zijn informatief in de zin dat ze ons vertellen over mogelijke mechanismen van ziekte-ontwikkeling maar uiteindelijk zijn gen-expressie gegevens metingen van de lichamelijke toestand en reaktie, in tegenstelling tot genotype-gegevens. Aangezien patiënten met een diagnose van M.E.(cvs) worden onderscheiden van degenen die er geen krijgen op basis van fenotypische verschillen, wordt verwacht dat verschillen qua gen-expressie zullen bestaan. Er rijzen echter problemen omdat sedentaire aktiviteit zelf, laat staan verschillen qua medicatie of dieet, even goed gen-expressie kunnen wijzigen. Gen-expressie studies zijn daarom minder informatief over de ontologie [het ontstaan] van M.E.(cvs) dan genetische associatie-studies, hoewel studies die gen-expressie en genetische variantie combineren bijzonder doortastend kunnen zijn wanneer ze overeenstemmende informatie verstrekken.

Drie relatief kleine studies hebben gewijzigde gen-expressie beschreven bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met controles [***]. Elke studie identificeerde genen met differentiële expressie-patronen (tabel 1). De geïdentificeerde verbanden werden echter niet herhaald en elke studie beschreef verschillende biologische mechanismen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de geringe grootte van het staal van wat vermoedelijk een niet-homogene ziekte is, samen met de problemen hierboven besproken.

Meer recent dook meer genetische informatie op uit een uitgebreid onderzoek bij 227 inwoners van Wichita [o.a. Vollmer-Conna U, Aslakson E, White PD. An empirical delineation of the heterogeneity of chronic unexplained fatigue in women. Pharmacogenomics. 2006; 7(3):355-364], uitgevoerd door het ‘Centres for Disease Control and Prevention’. [zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC]

Naast het bestuderen van gen-expressie (tabel 2), keek de CDC-groep ook naar genomisch DNA. Eén onderzoeksgroep testte of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) de vijf groepen kon onderscheiden, terwijl een andere groep onderzoch of SNP-profielen konden worden gebruikt om te voorspellen of een patient M.E.(cvs) had of niet.

In de eerste studie vond men dat drie van de op basis van klinische en laboratorium-gegevens beschreven klassen geassocieerd waren met genen betrokken bij de HPA-as funktie of stemming-gerelateerde neurotransmitter-systemen (monoamine-oxidase A en B, en tryptofaan-hydroxylase). In de tweede studie bleek één bepaalde combinatie van 5 SNPs in staat patiënten te identificeren tegenover controls (OR 8.94, p<0.00001). De meest belangrijke genen van deze studie codeerden voor neuronaal tryptofaan-hydroxylase (TPH2), catechol-o-methlyltransferase en een glucocorticoid receptor NR3C1. (TPH2 is bepalende enzyme bij de synthesr van serotonin, zelf een voorloper van melatonine). Genen voor corticotropine-afgevend hormoon [CRH] receptoren bleken ook betrokken. Alhoewel potentieel interessant wat betreft betrokken biologische mechansimen, zijn deze studies zwaar onderbemand en is herhaling vereist vooraleer de bevindingen enige geloofwaardigheid kunnen krijgen.

————————-

Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. 2002; 18(4):193-199

Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S, Almond J. Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients. Clin Exp Allergy. 2003; 33(10):1450-1456

[zie ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’]

Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P,…, Kerr JR. Gene-expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. 2005; 58(8):826-832

“Analyse van micro-array data reveleerde differentiële expressie van 35 genen. Real-time PCR bevestigde dezelfde differentiële expressie voor 16 van deze genen; 15 ervan waren ge-upreguleerd (ABCD4, PRKCL1, MRPL23, CD2BP2, GSN, NTE, POLR2G, PEX16, EIF2B4, EIF4G1, ANAPC11, PDCD2, KHSRP, BRMS1 en GABARAPL1) en één ge-downreguleerd (IL-10RA). Dit profiel suggereert T-cel aktivatie en verstoring van neuronale en mitochondriale funktie.”

————————-

Samengevat: er is groeiend en sterk bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is. Het lijkt er op dat de erfelijkheid bijdraagt tot het ervaren van vermoeidheid alsook tot de ontwikkeling van M.E.(cvs) zelf. Het zou daarom niet moeten verrassen dat M.E.(cvs) familiaal voorkomt en pediaters zullen families tegenkomen waar meer dan één persoon is aangetast. Alhoewel er enige instemming is dat een model moet worden aangewend waarbij de samenwerking van genen en omgevingsfactoren vereist is, is er momenteel weinig overeenkomst betreffende de eigenlijke betrokken genen en omgevingsfactoren.

Het feit dat M.E.(cvs) heterogeen is, hindert de research op dit vlak. Het beter doorzien van de verschillende biologische processen en de betrokken genen bij M.E.(cvs) is echter een belangrijke stap bij het begrijpen en ontwikkelen van methoden ter preventie of behandeling van deze belangrijke aandoening. Genetische studies kunnen deze research vooruitstuwen en een anker-punt vormen waardoor M.E.(cvs) kan worden begrepen, en de wijzigbare risico-factoren bepaald die een invloed hebben.

*************************

Tabellen 1 & 2 kunnen worden bekeken op

http://www.cfids-cab.org/rc/Crawley-1.pdf

augustus 1, 2009

Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 1:04 pm
Tags: , , ,

In een artikel in het Journal of Clinical Pathology uit 2007 (‘Current research priorities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: disease-mechanisms, a diagnostic test and specific treatments’) schreef Professor Jonathan Kerr (van de Collaborative Clinical Study Group): “Verscheidene groepen hebben gen-expressie bestudeerd in perifeer bloed van patiënten met CVS […] We kennen echter de precieze gen-signatuur en de betrokken metabole mechansimen nog niet. […] Het zal belangrijk zijn te verzekeren dat eens een gen-signatuur geïdentificeerd is, deze specifiek is voor CVS en niet voorkomt bij andere ziekten en infekties.”.

Onderstaand artikel pretendeert dat er GEEN verschillen in gen-expressie zijn tussen chronisch vermoeiden en controles. Hoewel er in de vele publikaties door andere groepen daaromtrent nog niet één gen als specifieke CVS-merker kon worden aangeduid, is de bewering van dit team voorbarig. Zeker als men rekening houdt met de fouten die ze maken. Lees daarom ook de commentaren van andere wetenschappers op dit vlak…

Ook dit is wetenschap: discussie en (her-)evaluatie!

Zoals in de kritieken op dit artikel werd aangegeven, zijn er wel meer publikaties dan die waarnaar hier wordt gerefereerd. Maar, inderdaad: een merker is (nog) niet aangeduid. Daarom werd er op deze paginas ook nog geen melding van gemaakt.

http://www.plosone.org

PLoS One. 2009 Jun 5;4(6):e5805

Gen-expressie in perifeer bloed leukocyten in monozygote tweelingen met en zonder chronische vermoeidheid: geen bewijs voor een biomerker

Byrnes A, Jacks A, Dahlman-Wright K, Evengard B, Wright FA, Pedersen NL, Sullivan PF

Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, United States of America

ACHTERGROND: Chronische vermoeiende ziekte wordt nog steeds een slecht begrepen syndroom met ongekende pathogenese. We probeerden biomarkers hiervoor te identificeren d.m.v. ‘micro-chips’ om het transcriptoom [verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’ , tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen] in perifeer bloed leukocyten te onderzzoeken.

METHODEN: De gevallen waren 44 individuen die klinisch werden geëvalueerd en bleken te voldoen aan de standaard internationale criteria voor Chronische Vermoeidheid Syndroom of idiopathische chronische vermoeidheid, en de controles waren hun monozygote [‘ééneiïge’] tweeling-helften die klinisch werden geëvalueerd en nooit, zelfs niet één maand invaliderende vermoeidheid hadden. De omstandigheden voor de biologische staalname waren gestandardiseerd en RNA-stabiliserende media werden gebruikt. Deze methodologische kenmerken bieden rigoureuze controle voor bias […] en experimentele fouten. Individuele gen-expressie profielen werden beoordeeld met ‘Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0’ chips.

BEVINDINGEN: Er waren geen significante verschillen qua gen-expressie voor om het even welk transcript.

BESLUITEN: In tegenstelling tot onze verwachtingen, konden we geen biomerker voor chronische vermoeiende ziekte in het transcriptoom van perifeer bloed leukocyten identificeren; wat suggereert dat positieve bevindingen in vroegere studies wellicht het resultaat zijn van experimentele bias.

Inleiding

[…] De beschikbaarheid van een biomerker voor CVS zou van bijzonder nut zijn voor klinisch en fundamenteel onderzoek.

Gen-expressie studies met perifeer bloed leukocyten (PBLs) zijn een potentieel veelbelovende bron voor biomerkers voor CVS. PBLs zijn makkelijk verkrijgbaar en van belang voor CVS gezien de prominentie van immuniteit- en infektie-theorieën. Bovendien zijn gen-expressie patronen in menselijke PBLs niet ongerelateerd met minder toegankelijke weefsels zoals de hersenen. We hebben weet van vier gepubliceerde niet-overlappende studies die gen-expressie in PBLs vergelijken bij gevallen met CVS en controles [***]. Deze kleine studies omvatten totaal slechts 45 gevallen (5, 7, 8 en 25) en van de 108 transcripten waarvan werd gerapporteerd dat ze een gewijzigde expressie hebben, was slechts één enkel transcript veranderd in meer dan één studie (MSN, moesin) [‘membrane-organizing extension spike protein’, lid van een familie proteïnen die blijkbaar werken als cross-linkers tussen plasma-membranen en actine-cytoskeleton, ze  zijn betrokken bij signalisering-mechanismen; moesin blijkt cruciaal te zijn bij T-cel aktivatie].

Gezien het gebrek aan duidelijkheid bij de bestaande studies bij CVS, ondernamen we een ‘onbevooroordeelde’ zoektocht over het ganse transcriptoom naar veranderingen qua gen-expressie geassocieerd met PBLs bij CVS. Onze studie had twee opmerkenswaardige ontwerp-kenmerken. Ten eerste: we gebruikten een controle-groep die optimaal is voor het detekteren van wijzigingen in status-gerelateerde gen-expressie en minimaliseerden vals-positieve resultaten te wijten aan genetische mis-matching tussen gevallen en controles aangezien we 44 individuen met klinisch geëvalueerde chronische vermoeiende ziekte tegenover hun 44 onaangetaste monozygote tweeling-helften stelden. Gebruik van strikt tegenstrijdige, monozygote tweelingen geeft de beste controle qua genetische achtergrond die momenteel mogelijk is bij mensen en laat gepaarde statistische testen met een grotere statistische kracht toe. Ten tweede: we standardiseerden zorgvuldig de staalname-condities zodat de PBL-stalen werden afgenomen in RNA-stabiliserende media en op dezelfde tijd en plaats voor beide tweeling-helften.

Materialen en Methoden

[…]

We screenden ca. 61.000 individuele tweelingen uit het Zweeds Tweelingen Register op de symptomen van vermoeiende ziekte. […] CVS screening-vragen identificeerden 140 paar tweelingen die voldeden aan preliminaire inclusie-criteria: […] tegenstrijdigheid voor chronische vermoeiende ziekte (d.i. één tweeling rapporteerde substantiële vermoeidheid en de andere tweeling was klaarblijkelijk gezond). Via een telefonisch interview beoordeelden we de geschiktheid voor deelname. Tweelingen die geschikt bleken, werden gedurende een halve dag klinisch geëvalueerd door een speciaal getrainde arts. Daarbij werd een op CVS gericht medisch onderzoek uitgevoerd met inbegrip van een gestandardiseerde anamnese, fysiek onderzoek en biochemische, hormonale en haematologische screening overeenkomstig internationale aanbevelingen.

[…] Na uitsluiting van 83 tweelingen-paren, woonden 57 paar de klinische evaluatie-sessies bij: 10 paar bleken niet aan de inclusie-criteria te voldoen. […] Zygositeit werd bevestigd d.m.v. genotypering van 46 ‘single nucleotide’ polymorfismen. [DNA-onderzoek waarbij SNPs – kleine wijzigingen van slechts één bouwsteentje worden vergeleken]

Het analyse-staal bestond uit 44 paar of strikt tegenstrijdige en genetisch bewezen monozygote tweelingen. De definitie van verschil was: één tweeling voldoet aan criteria voor idiopathische chronische vermoeidheid (ICF, 12 paar) of CVS (32 paar) [Fukuda] en de co-tweeling had nooit invaliderende ongewone vermoeidheid of moeheid van langer dan een maand gehad. Alle aangetaste tweelingen moesten dus aktuele, langdurige (≥6 maand), medisch onverklaarde vermoeidheid geassocieerd met substantiële stoornis qua sociaal en beroepsmatig funktioneren hebben en de niet-aangetaste co-tweelingen waren effektief gezond. Een diagnose van CVS vergt bijkomend ≥4 van 8 specifieke symptomen (bv. niet-verfrissende slaap, spier-pijn) naast die van ICF. We legden eerder al de rationale uit voor de inclusie van ICF samen met CVS op basis van fenotypische [Sullivan PF, Jacks A, Pedersen NL, Evengard B. ‘Chronic fatigue in a population sample: definitions & heterogeneity’. Psychologal Medicine 35(2005): 1337-1348] en tweelingen-analyses [Sullivan PF, Evengard B, Jacks A, Pedersen NL. ‘Twin analyses of chronic fatigue in a Swedish national sample’. Psychol Med 35(2005): 1327-1336].

[Wat betreft deze rationale: Deze auteurs hebben het over het gebrek aan empirische ondersteuning voor de vereiste van vier van acht kardinale CVS-symptomen. Ze stelden eerder dat een “CVS-achtige ziekte” bestaat maar dat de dominante benadering enkel variaties op bevolkingsniveau weergeeft. Ze suggereerden dat een meer “spaarzame” definitie moet worden betracht… Dit weerspiegelt de ganse discussie van ‘splitters’ en ‘lumpers’ (het samenvoegen van CVS met andere chronisch vermoeiden). zie:Evaluatie van de CDC Empirische Definitievoor kritiek op deze aanpak.]

Voorbijgaande/situationele factoren kunnen metingen van gen-expressie beïnvloeden. Biologische staal-name werd gestandardiseerd door het bloed van beide tweeling-helften af te nemen op dezelfde plaats en tijd (ca. 09:00) na overnacht vasten. […] zonder acute ziekte of recente verslechtering. Het was niet praktisch noch ethisch om de individuen vrij van medicatie te bestuderen maar we stelden de beoordeling uit als er recent significante veranderingen qua dosis waren geweest.

[…]

Resultaten

[…]

De voornaamste analyse stelde gen-expressie in PBLs bij 44 monozygote tweelingen met CVS of ICF tegenover die van hun gezonde tweeling-helft. Aangezien inclusie van mannen de ‘ruis’ zou kunnen verhogen, vergeleek een tweede analyse 39 vrouwelijke tweelingen met CVS of ICF en een derde analyse vergeleek 28 vrouwelijke tweelingen met CVS. Voor elk van deze drie sets statistische vergelijkingen, weken de geobserveerde resultaten niet af van deze die worden verwacht door toevalligheid. Wanneer we onze bevindingen vergeleken met een lijst van 108 transcripten met een verschillende expressie bij CVS gerapporteerd in eerdere studies, waren er 107 die ook in ons experiment werden bestudeerd, 101/107 hadden p>0.1 [niet significant] in onze studie en slechts twee hadden p<0.05 (CXCR4 p=0.03 en RAP2C p=0.04) [p staat voor ‘probalilty’, een maat voor statische significantie]. Op het niveau van alleenstaande transcripten, was er geen biologisch bewijs voor gewijzigde gen-expressie in PBLs dat correleerde met chronische, invaliderende en medische onverklaarde vermoeiende ziekte. Ter verificatie gebruikten we qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] om de expressie te bepalen van zeven genen geselekteerd uit de CVS gen-expressie literatuur en onze empirische bevindingen (ANKLE2, BLKE, BRD1, CPA3, DCTN1, ICAM en ORC). Alle p-waarden van gepaarde t-testen die zieke en gezonde monozygote tweelingen tegen over elkaar stelden waren ≥0.26 [niet significant].

Het is mogelijk dat funktioneel-gerelateerde genen belangrijke gen-expressie veranderingen per set vertonen zonder dat een individueel transcript voldoet aan de criteria voor significantie. Hypothese-genererende analyses […] reveleerden significante verschillen in cel-replicatie processen en aminozuur en lipiden metabole mechanismen. Deze resultaten verwijzen niet direct naar de huidige theorieën voor CVS-pathogenese […].

Bespreking

Belangrijkste bevinding

Het overkoepelende doel van deze studie was te proberen één of meerdere biomerkers te identificeren voor chronische vermoeiende ziekte via een uitvoerig onderzoek van het transcriptoom in een toegankelijk weefsel (perifeer bloed leukocyten, PBLs) die mogelijks betrokken zijn bij de pathofysiologie van dit idiopathisch [onbekende oorzaak] syndroom. We poogden methodologische kwesties in eerdere rapporten te corrigeren door zorgvuldig te controleren op bronnen van mogelijke bias (bv. door het bestuderen van tegenstrijdige monozygote tweelingen-paren, het gebruik van RNA-stabiliserende media en gestandardiseerde staalname-condities). We vonden geen bewijs voor verschillen qua gen-expressie in PBL die de aan- of afwezigheid van CVS of ICF zouden kenmerken. Daarom, in tegenstelling tot de meeste eerder gepubliceerde studies, vonden we geen bewijs voor een gen-expressie biomarker voor chronische vermoeiende ziekte.

Methodologische kwestie: genetische overeenkomsten in gen-expressie studies

Deze resultaten kunnen een les inhouden voor ‘case-control’ gen-expressie studies bij mensen. Er zijn zeker voorbeelden waarbij transcriptoom-studies resultaten hebben opgeleverd die het potentieel hebben om de prognose en het management van een ziekte te verbeteren (bv. borst-kanker); gen-expressie studies hebben echter het potentieel vals positieve bevindingen op te leveren als de afstamming van de gevallen en controles niet op een passende manier zijn gematcht. Genetische achtergrond wordt normaal gezien niet in overweging genomen hoewel gen-expressie én erfelijk kan zijn én onder strikte genetische controle kan staan. Studies met relatief lage resolutie in onsterfelijk gemaakte PBLs suggereren dat honderden menselijke genen onder relatief sterke genetische controle staan van courante genetische varianten […]. Als gevallen en controles niet extreem goed gematcht zijn voor genetische achtergrond (inclusief voor ligging in Europa) zouden sterk significante verschillen kunnen worden genoteerd omwille van bias door het ongeschikt matchen van gevallen en controles. Deze bezorgdheid is bijzonder belangrijk voor studies met PBLs aangezien genen waarvan de expressie onder strenge genetische controle staat, sterk zijn aangerijkt qua genen die tot expressie komen in lymfe-weefsel en lymfocyten-populaties […].

Gebruik van discordante monozygote tweelingen vertegenwoordigt op dit moment de beste controle voor genetische achtergrond die mogelijk is bij mensen. Uitgaande van het feit dat er identificatie op DNA-niveau en controle voor experimentele bias is, kunnen gen-expressie verschillen in niet overéénstemmende monozygote tweelingen netjes aan de ziekte-toestand worden toegeschreven. […] Gebruik van tegenstrijdige monozygote tweelingen levert beter interpreteerbare resultaten op, bijzonderlijk omdat er grote aantallen niet-causale loci onder genetische controle zijn. We zouden ook moeten argumenteren dat een gen-expressie studie een slechte manier is om genetische loci, oorzakelijk voor een ziekte, te identificeren als een alternatief studie-ontwerp (de ‘genome-wide association study’)

[Onderzoek van genetische variatie over gans het genoom, ontworpen om genetisch verbanden met observeerbare eigenschappen te identificeren. Het ‘Human Genome Project’ maakte het mogelijk om de genetische bijdragen te vinden voor ziekten en stalen te analyseren voor genetische variaties die bijdragen tot hun aanvang.] zo succesvol is geweest.

Besluiten

We waren niet in staat een biomerker te identificeren voor chronische vermoeiende ziekte in het transcriptoom van perifeer bloed leukocyten; wat suggereert dat de positieve bevindingen in eerdere studies het resultaat zou kunnen zijn geweest van experimentele bias.

————————-

Volgens de auteurs de enige meldingen van positieve resultaten betreffende gen-expressie profielen/sub-types bij CVS???!!!… Merk op: kleine groepen en verschillende methodologie.

Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. ‘Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome’. Dis Markers. 2002;18:193-199

Acht genen kwamen verschillend tot expressie [1.764 genen op filter-arrays met RNA uit PBMCs] in een gevallen-controle-analyse (gematcht voor leeftijd) én bij vergelijking van alle CVS-gevallen [n = 5] met alle controles. Meerdere van die genen zijn geassocieerd met immunologische funkties (bv. CMRF35 antigen [cel-membraan antigen betrokken bij de interaktie tussen T-cellen], IL-8, HD proteïne [‘Huntingdon Disease’ eiwit, wellich teen link met neurologische schade zoals Alzheimer’s en Parkinson’s]) en impliceren immuun-dysfunktie bij de pathophysiologie van CVS.

Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S et al. ‘Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients’. Clin Exp Allergy. 2003;33:1450-1456

“Twaalf korte sequenties met over-expressie werden geïdentificeerd in lymfocyten van CVS-patiënten [n = 7]. Twee ervan corresponderen met cathepsine-C en MAIL1 – genen met gekende upregulering in geaktiveerde lymfocyten. Bijkomend bewijs voor het idee dat CVS een ziekte is die wordt gekenmerkt door subtiele veranderingen in het immuun-systeem.”

Grans H, Nilsson P, Evengard B. ‘Gene-expression profiling in the Chronic Fatigue Syndrome’. J Intern Med. 2005;258:388-390

“We vonden geen aanwijzingen voor verschillende expressie tussen de ganse patiënten-groep [n = 20] en de controle-groep. […] Verdere analyses werden uitgevoerd bij enkel de vrouwelijke studie-deelnemers. […] Significante verschillen qua gen-aktiviteit werd gedetekteerd voor drie genen (CD83 [funktionele rol in het immuunsysteem], BOLA1 [enzyme betrokken bij de synthesie van nicotinamide] en NRK1 [funktie onbekend]).”

Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D et al. ‘Gene-expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome / Myalgic Encephalomyelitis’. J Infect Dis. 2008;197:1171-1184

“… differentiële expressie van 88 genen bij M.E(cvs). …12 genen ge-upreguleerd die elders ook ge-upreguleerd bleken, direct of indirect, bij EBV-infektie: NF-KB1, EGR1, ETS1, GABPA, CREBBP, CXCR4, EBI2, HIF1A, JAK1, IL6R, IL7R en PIK3R1.”

*************************

Commentaren

Dr Jonathan Kerr (St George’s University of London) 08 juli 2009

Dit artikel beschrijft een kleine studie (totaal of 28 CVS-patiënten en 28 controles) en besluit dat gen-expressie in PBL niet nuttig is voor het vinden van een biomerker voor CVS. Er zijn echter meerdere zwakheden en enkele onverenigbare aspekten aan deze studie.

De patiënten werden geïdentificeerd via screening van symptomen en daaropvolgende klinische beoordeling. Maar er werd niet gemeld hoeveel van de 28 CVS-patiënten voorheen de diagnose van CVS hadden gekregen. Deze recrutering-strategie zal een verschillende populatie identificeren dan de studies die focussen op patiënten met een voorafgaande diagnose van CVS die een CVS-kliniek bezoeken.

Daarenboven is de opname van patiënten met ‘idiopathische chronische vermoeidheid slechts vulling (vermoedelijk was het moeilijk om aan een voldoende aantal te komen), aangezien deze diagnose (ICF) er niet één is die formeel wordt erkend. De titel bevat ook de formele diagnose ‘Chronische Vermoeidheid Syndroom’ niet maar ‘chronische vermoeidheid’, waarvoor geen diagnostische criteria werden vermeld in het artikel.

Er wordt gemeld dat nadat micro-chip bevindingen negatief bleken, de auteurs probeerden om 7 eerder gerapporteerde met CVS geassocieerde genen te bevestigen via ‘real-time’ PCR met 18S-rRNA als endogene controle. We hebben echter gevonden dat 18S-rRNA statisch significant verschillend tot expressie komt bij CVS-patiënten en normale bloed-donoren (ongepubliceerd). Dus is dit geen bruikbaar endogeen controle-gen en zal het misleidende resultaten geven in deze context. Wij gebruikten in onze studies in plaats daarvan GAPDH, dat niet verschilt tussen CVS- en normale populates (Kaushik et al. 2005; Kerr et al. 2008); Powell et al. 2003 gebruikten ook GAPDH.

De auteurs melden dat het gen MSN (moesin) het enige is tot op heden dat gemeenschappelijk werd gevonden bij CVS gen-studies (dit is niet correct – wat te zeggen over PRKARIA, EIF4G1, EGR1, CXCR4, enz.); dit gen, MSN, werd als eerste geïdentificeerd door Powell en bevestigs door Kaushik en Kerr, gebruikmakend van PCR, bij een totaal van 62 CVS-patiënten en >100 normale controles (gecombineerde individuen van deze studies). Dus zou dit zeker een ideaal gen zijn geweest om te testen en ev. als biomerker te weerleggen, gezien zijn achtergrond en PCR-bevestiging. Daarnaast rapporteerden we 88 menselijke genen via micro-chips en PCR (Kerr et al. 2008); 16 daarvan werden eerder geïdentificeerd in een afzonderlijke studie via micro-chips en PCR (Kaushik et al. 2005). Maar in plaats daarvan kozen de auteurs 7 genen geïdentificeerd in een kleine studie die 8 CVS-gevallen en 7 normalen omvatte (Gow et al. 2009), en dit enkel via micro-chips zonder PCR bevestiging, waarbij 366 genen werden geïdentificeerd. Waarom gebruikten de auteurs niet de identieke PCRs en endogene controles uit eerdere studies om eventueel bevestigde CVS gen-merkers, zoals MSN en om het even welke van de 87 andere te weerleggen? Dit is duidelijke bevooroordeling wat betreft gen-selektie.

De grootste zwakte in het artikel is dat de SF36 [vragenlijst peilend naar lichamelijke pijn, algemene gezondheid, vitaliteit, sociaal funktioneren] -scores van de patiënten versus controles niet bijzonder verschillend waren. Het ziet er naar uit dat de patiënten lage SF36-scores hadden maar de ‘normale’ controles vertoonden scores die deze van de patiënten benaderden en zelfs overlapten! De SF36 fysieke funktie was 41,2 (bereik 28-48) voor CVS en 48,2 (bereik 40-52) voor normalen. Om de selektie van hun gevallen te ondersteunen, zou een [statistische] t-test nuttig geweest zijn maar ik vermoed dat dit zou hebben aangetoond dat deze 2 populaties niet statistisch verschillend waren, gebaseerd op deze scores. Deze SF36-resultaten zijn erg problematisch en zijn niet overtuigend voor het feit dat de fenotypes [het geheel van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken) van een organisme] van deze 2 populaties significant verschillen.

Waarom publiceerden de auteurs niet de volledige SF36-score in al zijn domeinen en niet enkel de fysieke en mentale funktie. De totale score is de meest nuttige en zou duidelijk het globaal funktioneren van de individuen hebben aangetoond, en zou een vergelijking van de funktionaliteit tussen gevallen en controles hebben makkelijker gemaakt. In onze studies, waren de gemiddelde SF36 totale scores <50 voor CVS en >80 voor controles, een weerspiegeling van afzonderlijke fenotypes. We gebruikten ook neurocognitieve funktie-testen (Cantab software), die ook de defekten van de CVS-patiënten bevestigden (Kerr et al. 2008).

Er zijn zoveel zwakheden aan deze studie dat de resultaten niet betrouwbaar kunnen worden geïnterpreteerd.

Dr Suzanne Vernon (CFIDS Association of America) 06 juli 2009

De studie van gen-expressie bij tweelingen is inderdaad een unieke en belangrijke kans om status-gerelateerde gen-expressie te detekteren. Het is onfortuinlijk dat de auteurs niet dezelfde stiptheid hanteerden in het laboratorium en qua methodologie als voor de selektie van de studie-populatie. Deze fouten, bovenop de overdrijvingen/ verkeerde voorstellingen moeten onder de aandacht van de lezer worden gebracht.

De inleiding geeft vier niet-overlappende studies over gen-expressie bij CVS aan. Een zoekopdracht voor ‘gene-expression’ en ‘Chronic Fatigue Syndrome’ in PubMed levert meer dan 50 publikaties op waarvan ten minste 10 niet-overlappende studies.

Bij de methodologie, gooien de auteurs CVS en ICF op één hoop [‘to lump’; vandaar ‘lumpers’] en negeren daardoor alle gepubliceerd bewijsmateriaal (uitgezonderd hun eigen) dat aantoont dat CVS klinisch en biologisch kan worden onderscheiden van ICF. De auteurs overwegen niet de uitdagingen gen-expressie te vergelijken tussen verschillende testen en berekening-technieken. Wellicht de meest ongehoord fout in deze publikatie is de vergelijking van gen-expressie in vol bloed met gen-expressie in perifeer bloed mononucleaire cellen. Veel voorkomende transcripten (bv. globine) zijn gekend om hun interferentie met gen-expressie. Er werd aangetoond dat de overvloed aan globine-genen in vol bloed de onderligggende biologische verschillen tussen stalen vol bloed van hetzelfde individu kan maskeren. Maskering van differentieel tot expressie komende genen bij de discordante tweelingen in deze studie is de waarschijnlijke verklaring voor het gebrek aan significante bevindingen in dit artikel, in plaats van het gebrek aan verschillende gen-aktiviteit. Het is opmerkelijk dat de auteurs dit gegeven niet in acht namen gezien het feit dat meer dan 50 artikels differentiële gen-expressie bij CVS hebben beschreven.

De auteurs wijten hun gebrek aan significante bevindingen aan experimentele bevooroordeling van andere onderzoekers terwijl het er, in feite, op lijkt dat hun eigen methodologische fouten en bias zijn die aanleiding geven tot hun onverwachte resultaten. Werd dit artikel haastig geschreven? Bovenop de eerder vermelde kwesties, staan er verscheidene typografische fouten in de bespreking, waardoor men zich gaat afvragen hoeveel aandacht de auteurs eigenlijk schonken bij het publiceren van dergelijke gebrekkige resultaten.

*************************

In een persoonlijke communicatie beschrijft Prof. Martin Pall (Professor of Biochemistry and Basic Medical Sciences, Washington State University, USA) nog enkele extra mogelijkheden:

Dit is een interessant artikel maar de interpretatie ervan is onduidelijk, omwille van meerdere redenen. Er zijn zowat acht verschillende studies die rapporteerden dat gen-expressie bij M.E.(cvs)-patiënten verschillend is van die van normale controles. En deze studies rapporteerden dat enkele wijzigingen qua gen-expressie, met betrekking tot genen die in verband staan met funkties die compleet verschillende types bewijs vormen, geïmpliceerd zijn bij M.E.(cvs). Deze omvatten bv. genen betrokken bij mitochondriale funktie en genen betrokken bij inflammatoire responsen.

Deze studie gebeurde bij paren identieke (monozygote) tweelingen waarbij één tweeling-helft ziek was en de andere niet. Deze studie is dus beter dan de andere studies in de zin dat er werd gecontroleerd qua exacte genetica. Deze studie was echter relatief klein. Daarenboven waren er bij de 44 tweeling-paren, 12 paren waarvan de zieke tweeling-helft ‘idiopathische chronische vermoeidheid’ had en bij de andere 32 was de M.E.(cvs) van de aangestaste tweeling-helft gebaseerd op de Fukuda criteria. Dit mengen van de groepen zou problematisch kunnen zijn als de gen-expressie patronen verschillend zijn bij de beide.

De eind-conclusie is dat ze niet in staat waren enige statistisch significante veranderingen qua gen-expressie te vinden bij de vergelijking van zieke tweeling-helften met gezonde.

Het gebruik van gepaarde identieke tweelingen is duidelijk een sterk punt van deze studie. Het mixen van twee verschillende types vermoeidheid is in mijn opinie een zwakte en het is mogelijk dat een grotere studie nodig is, één waarbij M.E.(cvs)-patiënten  worden bestudeerd.

Anderzijds suggereren de auteurs enkele mogelijke interpretaties voor het schijnbare verschil van deze studie in vergelijking met de andere. Eén mogelijke interpretatie is dat de ethniciteit van de controles en de zieke individuen in de andere studies onvoldoende [afgestemd] was; wat leidt tot verschillen qua gen-expressie die niets te maken hebben met de oorzaak van M.E.(cvs). Ik betwijfel dit ten zeerste omdat de gen-expressie wijzigingen in de eerdere studies duidelijk gerelateerd zijn met wat we weten over de veranderingen die voorkomen bij M.E.(cvs)-patiënten.

Er is een tweede mogelijke verklaring, één die heel interessant is. Het is mogelijk dat er genetisch bepaalde veranderingen qua gen-expressie zijn die voorkomen bij veel M.E.(cvs)-patiënten maar dat de wijziging qua gen-expressie gelinkt is met veranderingen die hen eenvoudigweg meer vatbaar maken om M.E.(cvs) te krijgen. In dit geval zouden gepaarde monozygote tweelingen geen verschillen tonen qua gen-expressie, maar willekeurige M.E.(cvs)-patiënten zouden verschillen van controles. Deze verschillen zouden voorafgaan aan het krijgen van M.E.(cvs). Dit zou werkelijk interessant zijn omdat dan de verschillen qua gen-expressie ons iets zouden vertellen over de genetische controle van vatbaarheid voor de ziekte. In dit geval vertellen de eerder gepubliceerde wijzigingen qua gen-expressie ons nog steeds iets heel belangrijk over M.E.(cvs), alhoewel iets redelijk verschillend van wat de auteurs dachten te bestuderen.

Er zijn gepubliceerde studies die aantonen dat pro-inflammatoire allelen van cytokine-genen geassocieerd zijn met verhoogde incidentie van M.E.(cvs). En Boles en zijn collegas hebben bewijs gepubliceerd voor het feit dat het dragen van mutant mitochondriaal DNA mensen meer vatbaar maakt voor een brede waaier aan ziekten, inclusief M.E.(cvs). Dus heeft de hypothese die ik suggereerde ten minste een beetje experimentele ondersteuning, hoewel deze indirect is. Ik denk dat we, op dit punt, veel meer moeten te weten komen over de reproduceerbaarheid van de verscheidene types relevante data. En we moeten ook te weten komen of de verschillende research-groepen patiënten-populaties bestuderen met gelijkaardige ziekte-ernst. Iets dat is makkelijk duidelijk wordt bij ernstig aangetaste patiënten kan moeilijk te onderscheiden zijn in meer matig-aangetaste patiënten.

Mijn mening is dat het vergelijken van gen-expressie bij M.E.(cvs)-patiënten versus normale controles, of dat nu co-tweelingen of andere zijn, niet de manier is om een specifieke biomerker-test te ontwikkelen voor M.E.(cvs). Het meest specifieke symptoom van M.E.(cvs) is de zogenaamde post-exertionele malaise, waarbij inspanning het hele spectrum van symptomen die kenmerkend zijn voor M.E.(cvs)-patiënten upreguleert. Ik denk dat de zoektocht naar specifieke biomerker-testen zou moeten focussen op specifieke responsen op inspanning, responsen waar M.E.(cvs)-patiënten verschillen van normale controles.

Blog op WordPress.com.