M.E.(cvs)-wetenschap

juni 9, 2019

Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:44 am
Tags: , , , , , ,

Hieronder volgt nog een artikel van de groep rond Luis Nacul van de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB). Lees o.a. ook: ‘Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)’, ‘Blijvende vereiste voor een accurate M.E.(cvs)-diagnose & -definitie’ & ‘Selektie-bias & mis-klassificatie ondermijnen M.E.(cvs)’.

Er wordt al lang een dysfunktie van het immuunsysteem vermoed bij M.E.(cvs) maar de resultaten van immuun-studies spreken elkaar tegen. In onderstaande studie werd gekeken naar meerdere aspecten van de immuun-funktie van bloedcellen bij een grote groep mensen met de ziekte (waaronder zowat een vijfde die ernstig ziek zijn) en vergeleken met gezonde controles en mensen met Multipele Sclerose.

Er werd gecontroleerd op antilichamen tegen een aantal herpesvirussen (bv. Epstein-Barr) en er werd geen verschil gevonden tussen M.E.(cvs) en controles. Er werd ook gekeken naar immuun-cellen (o.a. T-cellen en NK-cellen). In tegenstelling tot wat andere onderzoekers vonden, bleken er geen verschillen wat betreft NK-cellen (M.E.(cvs) versus controles). Lees de op onze pagina’s besproken artikels over andere studies omtrent ‘Natural Killer’ cellen… Er zijn enkele verschillen (misschien te wijten aan het aanwenden van andere methodologieën en kleinere onderzoeksgroepen). Er wordt echter ook gewezen op het belang van blootstelling aan cytomegalovirus die significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie veroorzaakt.

Er werden ook geen verschillen gevonden in het globaal aantal T-cellen maar wel wat betreft de hoeveelheden van verschillende types T-cellen (M.E.(cvs) versus controles); wat dit betekent moet nog worden onderzocht. De meest betekenisvolle bevinding was het sterk gestegen aantal van een bepaald subtype T-cel, de zgn. ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT), bij de mensen met ernstige M.E.(cvs) t.o.v. controles. Deze bevinding alleen kan echter niet worden aangewend als een diagnostische merker maar het zou daartoe wel kunnen bijdragen, samen met andere factoren. MAIT-cellen worden voornamelijk in de lever, longen en darm gevonden en richten zich tegen cellen die geïnfekteerd zijn met bepaalde types bakterieën. Ze reageren ook op en produceren pro-inflammatoire cytokinen (cel-signalisering proteïnen), die al verhoogd bleken bij M.E.(cvs). MAIT-cellen zijn ook betrokken bij auto-immune ziekten. Het is interessant dat gestegen aantallen MAIT-cellen gezien werden na inspanning bij gezonde individuen. Dit suggereert dat M.E.(cvs)-patiënten een post-exercitionele toestand vertonen in rust. Het is mogelijk dat de toename in MAIT-cellen bij M.E.(cvs) wordt gestuurd door veranderingen van het darm-microbioom, maar dit dient ook nog te worden onderzocht.

De resultaten tonen een gewijzigde immunologische toestand aan bij M.E.(cvs). Het is de eerste keer dat sterk verhoogde aantallen MAIT-cellen bij ME.(cvs) worden gemeld en meer research is nodig om eventueel uit te wijzen of deze bijdragen tot de pathologie van de ziekte.

Ter herinnering: CD4 wordt gevonden op T helper cellen (en monocyten, macrofagen en and dendritische cellen), het is een co-receptor voor de T-cel (TCR) en helpt bij de communicatie met antigen-presenterende cellen. CD8 dient als co-receptor voor the T-cel receptor en komt voornamelijk tot expressie op cytotoxische T-cellen. De zgn. ‘memory’ T-cellen zijn een subset van de T-lymfocyten die infektie en kanker bestrijden die eerder het betreffend antigen zijn tegengekomen, en er dus ‘geheugen’ voor hebben…

————————-

Frontiers in Immunology (Pre-print Mei 2019)

Cellular immune function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

Jacqueline M. Cliff (1), Elizabeth C. King (1), Ji-Sook Lee (1), Nuno Sepulveda (1,2), Asia-Sofia Wolf (1), Caroline Kingdon (1), Erinna Bowman (1), Hazel M. Dockrell (1), Luis C. Nacul (1), Eliana Lacerda (1), Eleanor Riley (3)

1 Immunology and Infection Department, London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM), United Kingdom

2 Centro de Estatistica e Aplicacoes, Faculdade de Ciencias, Universidade de Lisboa, Portugal

3 Roslin Institute, University of Edinburgh, United Kingdom

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met onbekende etiologie, onduidelijke pathofysiologie en zonder beschikbare diagnostische test of biomerker. Veel patiënten melden dat hun M.E./CVS begon na een acute infektie, en een daaropvolgende hogere frequentie van infekties (zoals verkoudheden, griep) is courant. Deze factoren impliceren dat er een immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, ten minsten bij een deel van de patiënten, maar toch bleken eerdere studies aangaande de perifere immuniteit tegenstrijdig en niet éénduidig.

De Britse ‘ME/CFS Biobank’, die bloedstalen verzamelde van 300 klinisch-bevestigde M.E./CVS-patiënten, laat grootschalige studies toe van de immunologische funktie fenotypisch goed-gekarakteriseerde deelnemers. In deze studie werden de herpesvirus serologische toestand, en populaties T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten van 251 M.E./CVS-patiënten onderzocht, inclusief 54 die ernstig aangetast zijn, en vergeleken met die van 107 gezonde deelnemers en46 patiënten met Multipele Sclerose. Er waren geen verschillen qua seroprevalentie voor zes menselijke herpesvirussen tussen M.E./CVS en gezonde controles, hoewel de seroprevalentie voor het Epstein-Barr virus hoger was bij Multipele Sclerose patiënten. In tegenstelling met andere rapporten, werden geen significante verschillen gezien qua aantallen NK-cellen, hoeveelheden subtypes of in vitro responsiviteit tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Anderzijds was het T-cel compartiment veranderd bij M.E./CVS, met gedaalde hoeveelheden effector ‘memory’ CD8+ T-cellen en intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen. Omgekeerd was er een significant verhoogd deel ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) [zie hieronder], in het bijzonder bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten.

Deze abnormalitieiten tonen aan dat een gewijzigde immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, bijzonderlijk bij de mensen die ernstig zijn aangetast. Dit zou eenvoudigweg een lopende of recente infektie kunnen weerspiegelen, of toekomstige verhoogde vatbaarheid voor infektie kunnen aangeven. Er zijn longitudinale studies bij M.E./CVS-patiënten nodig om oorzaak en gevolg, en zodoende potentiële voordelen van immuun-modulerende behandelingen voor M.E./CVS te helpen bepalen.

INLEIDING

[…:] Ondanks de significante vooruitgang, blijft M.E./CVS nog slecht begrepen. Jammer genoeg blijken veel schijnbaar interessante research-bevindingen niet reproduceerbaar, ten dele omwille van de kleine groepen en de ‘cross-sectionele’ aard van veel studies, en de variabiliteit tussen studies wat betreft research-methodes en hun kwaliteit.

Acute virale infekties bleken frequent geassocieerd met de aanvang van M.E./CVS maar er is geen bevestiging van specifieke virale etiologie en er is geen consistent verband tussen persistente of chronische virus-infektie en M.E./CVS. Eén mogelijkheid is dat mensen met M.E./CVS (PWME) vatbaar zijn voor acute virale infekties ten gevolge een onderliggende immuun-dysfunktie. Er werden talrijke immuun-abnormaliteiten, inclusief gewijzigde plasma cytokine-profielen, abnormale T-lymfocyt aktivatie en verstoorde cytotoxische respons, beschreven bij individuen met M.E./CVS maar systematische en observationele studies waren niet in staat om robuuste en reproduceerbare immuun-biomerkers voor ziekte of ziektegraad te identificeren [bv. Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116].

Er zijn een aantal rapporten over inconsistente abnormaliteiten qua ‘natural killer’ (NK) cel funktie. NK-cellen zijn grote granulaire lymfocyten die funktioneren als effectoren van de aangeboren immuniteit die, d.m.v. cytokine-produktie of cytotoxiciteit, infekties (of neoplasieën [vorming van goed- of kwaadaardige gezwellen door cel-vermeerdering]) binnen de perken houden tot een doeltreffende adaptieve respons kan worden opgezet. Individuen met overgeërfde NK-cel aandoeningen zijn zeer vatbaar voor systemische herpesvirus- en andere opportunistische infekties. Directe NK-cel aktivatie volgt op interaktie met cellen waarop ‘major histocompatibility complex’ (MHC [genen die coderen voor membraan-proteïnen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]) klasse-I liganden voor inhiberende NK-cel receptoren ontbreken en/of waarop stress-geïnduceerde liganden voor NK-cel aktiverende receptoren tot expressie komen. Indirecte NK-cel aktivatie treedt op na microbiële ligatie van patroon-herkenning receptoren [binding van bakterie-antigenen op receptoren die bepaalde proteïnen herkennen] […] en wordt gemedieerd door cytokinen (IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α) en contact-afhankelijke stimuli. Er werd meermaals gerapporteerd dat PWME verhoogde, gedaalde of normale aantallen circulerende NK (CD16+ of CD56+ [menselijke NK-cellen kunnen worden onderverdeeld in verschillende populaties op basis van de expressie van de oppervlakte-merkers CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG) & CD56 (neurale cel-adhesie molekule)], CD3[T cel co-receptor die cytotoxische T-cellen en T helper cellen helpt aktiveren]) cellen vertonen; hun NK-cellen zijn naar verluidt ontoereikend [Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11] of vertonen versterkte expressie van het cytotoxisch perforine [Brenu EW et al. Pilot study of natural killer cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis. Scand J Immunol. (2016) 83: 44-51]; zijn minder (of onvolledig) in staat MHC klasse-I deficiënte ‘target’-cellen te lyseren [bv. Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]; en vertonen een defekte of geen upregulering van aktivatie-merkers na in vitro stimulatie. Nogmaals: de reproduceerbaarheid van veel van deze studies werd beperkt door hun relatief beperkte grootte, de diverse klinische presentaties van de gevallen of de beperkte mate immunologische karakterisatie.

Belangrijk: slechts één van deze immunologische studies [Rivas JL et al. Association of T and NK cell phenotype with the diagnosis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol. (2018) 9:1028.] hield rekening met de prevalentie van menselijk cytomegalovirus (CMV) infektie bij gevallen en controles. CMV-infektie laat een permanente voetafdruk op het immuunsysteem na, inclusief oligoclonale expansie [proliferatie afgeleid van één of enkele cellen] en terminale differentiatie [cellen stoppen de celcyclus permanent en brengen genen tot expressie die karakteristiek zijn voor de uiteindelijke funktie van die cellen] van CD8+ T-cellen, en expansie van een subset sterk gedifferentieerde NKG2C+ NK-cellen [NKG2C = membraan-proteïne; binding met z’n ligand HLA-E stuurt de expansie van een subset NK-cellen in respons op virale infekties]; deze NK-populatie wordt verder uitgebreid door latere virale infektie. Het blijft daarom mogelijk dat de gerapporteerde verschillen qua T-cel & NK-cel fenotype en funktionele capaciteit tussen PWME en gezonde controles het resultaat kunnen zijn van verschillen wat betreft de prevalentie van immuun-modulerende virussen zoals CMV. We rapporteren hier over een diepgaande analyse van perifeer bloed leucocyten-fenotype en -funktie bij een klinisch goed-gedefinieerde groep matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-gevallen vergeleken met niet-vermoeide gezonde controles en, ter controle voor verminderde fysieke aktiviteit, mensen met Multipele Sclerose. Alle deelnemers werden gescreend voor serologisch bewijsmateriaal voor infekties met humaan cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), herpes simplex virus 1 (HSV1), Herpes simplex virus 2 (HSV2), varicella-zoster virus (VZV) en humaan herpesvirus (HHV6).

MATERIALEN & METHODES

Recrutering en klinische evaluatie

[…] Alle potentiële deelnemers werden rigoureus beoordeeld om te verzekeren dat ze voldeden aan de definities voor M.E./CVS. […]

Alle deelnemers met M.E./CVS of MS hadden voorafgaandelijk een bevestigde medische diagnose gekregen. […] De PWME werden opnieuw beoordeeld door de klinische research staf op het voldoen aan de Canadese Consensus en/of CDC-1994 (“Fukuda”) criteria (de definities van de studie) [punt van kritiek: de Fukuda definitie vereist geen post-exertionele malaise; anderzijds: we verwachten dat ernstig zieken wel PEM hebben], vóór recrutering. De deelnemers werden uitgesloten al ze (i) 3 maand voorafgaand aan de studie antivirale medicatie hadden genomen die de immuun-funktie wijzigt; (ii) 3 maand voorafgaand aan de studie vaccinaties hadden gekregen; (iii) een voorgeschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekte zoals hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV (maar niet herpesvirus- of andere retrovirus-infektie) hadden; (iv) een andere chronische ziekte zoals kanker, coronaire hart ziekte of ongecontroleerde diabetes hadden; (v) een ernstige stemming-aandoening hadden; (vi) zwanger waren of borstvoeding gaven 12 maanden voorafgaand aan de studie; of (vii) morbide obees (BMI ≥ 40) waren. […] De ernstig zieke deelnemers werden thuis bezocht. […]

Berekening van de statistische ‘power’

404 deelnemers: 251 met M.E./CVS (54 ernstig en 197 matig zieken), 46 met MS en 107 gezonde controles. […]

Afname & verwerking van de stalen

[…]

Fenotypering van de leukocyten

[cultuur / trypaan-blauw vitaliteit-kleuring / fenotypering (flow-cytometrie) of cultuur voor funktionele analyse]

Funktionele testen

[cel-stimulatie / incubatie met antilichamen / flow-cytometrie]

Analyse van de gegevens

De primaire gegevens analyse omvatte vier groepen: mensen met milde/matige M.E./CVS (ME-M), mensen met ernstige M.E./CVS (ME-S), gezonde controles (C) en mensen met Multipele Sclerose (MS). Alle gegevens-analyses werden blind uitgevoerd (groepen geïdentificeerd d.m.v. een code-number; code verbroken enkel nadat alle analyses compleet waren).

[…]

RESULTATEN

Karakteristieken van de deelnemers aan de studie

De uiteindelijke groep omvatte 251 mensen met M.E./CVS (197 mild/matig & 54 ernstig), 46 mensen met MS en 107 gezonde controles. […] Symptomen die typisch verbonden zijn met infektie of inflammatie kwamen frequenter voor en waren ernstiger bij PWME dan bij MS-patiënten, hoewel er milde inflammatie-symptomen aanwezig waren bij bijna 50% van de mensen met MS. De meeste gezonde controle vertoonden geen enkel symptoom (P < 0.0001). De vermoeidheidgraad-scores lagen, zoals verwacht, hoger bij PWME, met een trend voor hogere scores bij de ernstig zieken, gevolgd door mensen met milde/matige M.E./CVS, dan MS-patiënten en gezonde controles met zeer lage vermoeidheid-scores (P < 0.001). De erythrocyten-sedimentatie-snelheid (ESR), een niet-specifieke merker voor inflammatie, was lichtjes verhoogd bij mensen met milde/matige M.E./CVS, en er waren gelijkaardige mediane waarden voor alle andere groepen (P = 0.01). Mensen met MS waren ietsje ouder vergeleken met de andere studie-groepen maar de verdeling per geslacht, deprivatie-index [maat voor de socio-economisch status] en totale witte bloedcellen en lymfocyten was gelijkaardig voor de groepen.

Serologie

De plasma-stalen werden getest (kwantitatieve ELISA) voor zes humane herpesvirussen: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV & HHV6. Er waren geen significante verschillen tussen de groepen qua aantallen individuen die seropositief waren voor deze virussen. De concentraties anti-EBV VCA varieerden echter significant onder de groepen (P = 0.016) en dit was te wijten aan hogere concentraties anti-EBV VCA antilichamen bij de mensen met MS.

Leucocyten-fenotypering

Ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen werden ontdooid en geanalyseerd d.m.v. flow-cytometrie […]. Er werd een ruim leucocyten-venster ingesteld om alle levende cellen te omvatten en daarna een meer beperkend lymfocyten-venster. Binnen het leucocyten-venster werden de monocyten […] en dendritische cellen [DC; antigen-presenterende die antigenen verwerken en deze aanbieden aan T-cellen; ze fungeren als boodschappers tussen het aangeboren en adaptief immuunsysteem] – myeloïde [van het aangeboren immuunsysteem] of plasmacytoïde [sekreteren interferon in respons op virale infektie; circuleren in het bloed en worden gevonden in perifere lymfoïde organen] […] – geïdentifceerd. Binnen het lymfocyten-venster: de T-cellen […], B-cellen […] en ‘natural killer’ (NK) cellen […]. De NK-cellen werden daarna geanalyseerd voor expressie van of NKG2C [zie hierboven], NKp46 [‘Natural cytotoxicity triggering receptor 1’] en CD57 [antigen dat terminaal gedifferentieerde cellen met gereduceerd proliferatie-vermogen identificeert].

Uit een statistische analyse bleek dat er significante verschillen waren tussen de groepen qua hoeveelheden levende leucocyten die monocyten (P = 0.0133), myeloïde DCs (P < 0.0121) en plasmacytoïde DCs (P < 0.0001) waren: deze verschillen waren te wijten aan veranderde frequenties bij de MS-patiënten, en verdwenen na aanpassing voor geslacht, leeftijd en herpesvirus seropositiviteit (niet getoond). In tegenstelling daarmee bleken de hoeveelheden leucocyten die B-cellen, T-cellen of NK-cellen waren, niet significant verschillend tussen de groepen (noch bij aangepaste of niet-aangepaste analyse).

Binnen het lymfocyten-venster waren de hoeveelheden cellen CD4+ T-cellen of CD8+ T-cellen (en, bijgevolg, de CD4/CD8-verhouding) significant verschillend tussen de groepen bij niet-aangepaste analyse (P < 0.0001) en deze verschillen beleven na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren (P < 0.0001). Deze verschillen waren echter volledig te wijten aan de significant hogere hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere hoeveelheden CD8+ T-cellen en dus hogere CD4/CD8-verhouding bij de MS-patiënten; er waren geen significante verschillen qua lymfocyten-distributie tussen ME/CFS-patiënten en gezonde controles. Ook waren er geen significante verschillen tussen de groepen qua absolute aantallen van de verschillende leucocyten- en lymfocyten-populaties.

Een meer gedetailleerde fenotypering van de circulerende T-cel populatie onthulde geen belangrijke verschillen qua verdeling van CD45RA [CD45 = merker voor naïeve T-cellen] en CCR7 [C-C chemokine receptor type 7] -gedefinieerde naïeve en ‘memory’ T-cel populaties. Bij een meer gedetailleerde fenotype-analyse van de CD4+ en CD8+ T-cellen op basis van CD28 [zorgt voor co-stimulatie signalen vereist voor T-cel aktivatie en overleving] en CD57 [zie eerder] naast CCR7 en CD45RA, vonden we dat er geen verschillen waren qua CD4+ T-cel differentiatie subpopulaties bij mensen met M.E./CVS, hoewel er veranderde cel-populatie frequenties waren bij mensen met MS. Er werden echter bescheiden verschillen gezien in meerdere differentiatie-populaties van de CD8+ T-cellen, met een kleine toename van de hoeveelheid EM [effector ‘memory’ (zie onze inleiding)] -cellen […] en een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde cytotoxische effector TEMRA-cellen [effector ‘memory’ T-cel die CD45RA tot expressie brengt] […] bij mensen met M.E./CVS. Er waren ook kleine veranderingen in andere [minder belangrijke] CD8+ T-cel populaties […].

Van groter potentieel belang echter, was dat we – gebruikmakend van TCR Vα7.2 [deel van T-cel recpetor] en CD161 [‘killer’ cel lectine-achtige receptor subfamilie-B, lid-1] om circulerende populaties ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) te definiëren – zeer significante verschillen zagen tussen de groepen wat betreft de hoeveelheid T-cellen die MAIT-cellen zijn en de hoeveelheid MAIT-cellen die CD8 tot expressie brengen (P < 0.001). Na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren, onthulde statistische analyse dat dit te wijten was aan verhoogde hoeveelheden MAIT-cellen (P < 0.001) en bijzonderlijk CD8+ MAIT-cellen, bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. gezonde controles (P < 10-5). Belangrijk is echter dat, hoewel de globale hoeveelheden MAIT-cellen niet hoger waren bij mensen met MS dan bij gezonde controles, hun MAIT-cellen ook sterk scheefgetrokken waren naar de CD8+ subset; wat aangeeft dat dit is geen diagnostisch kenmerk voor ernstige M.E./CVS is. ROC-analyse toonde dat de totale MAIT-cel frequentie in de T-cel populatie een zwak vermogen had om patiënten met ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonde controles, maar dat de patiënten met milde/matige M.E./CVS niet door deze meting konden worden voorspeld. Mogelijks belangrijker: de hoeveeheid MAIT-cellen die CD8+ waren, hadden een groter vermogen om ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonden (AUC 0.756). [ROC-analyse is een statistische methode om de voorspellende waarde van een variabele of instrument te toetsen; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] Overéénkomstig met eerdere rapporten had de overgrote meerderheid van de MAIT-cellen bij alle individuen een ongedifferentieerd (CD28+ CD57 [zie hierboven]) fenotype.

Als we in meer detail kijken naar het fenotype van de NK-cel populatie, zagen we geen significante verschillen qua hoeveelheden CD56bright cellen, verdeling van CD57, CD57+ of CD57++ cellen of hoeveelheden cellen die NKG2C of NKp46 tot expressie brengen, of wat betreft expressie van zes verschillende ‘killer’ cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIR [receptoren op het oppervlak van NK-cellen waarmee ze ‘self’ MHC klasse-I molekulen (KIR-liganden) op het cel-oppervlak herkennen om dan een inhiberend signaal te geven om zo de eliminatie van normale cellen te voorkomen]) (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

T-cel & NK-cel funktie

We vergeleken daarna het vermogen van T-cellen en NK-cellen om te reageren op in vitro stimulatie, van gezonde controles, mensen met MS en PWME. Voor het bepalen van de of T-cel responsiviteit, werden PBMCs gedurende 4 h gecultiveerd met de mitogene cocktail [molekulen die cellen aanzetten tot delen] van PMA en ionomycine, en dan gekleurd voor intracellulaire cytokinen. De hoeveelheid cellen die IL-2, IFN-γ of een combinatie van de twee produceren, werd beoordeeld voor de CD3+ CD4+ en de CD3+ CD8+ cel-populaties maar er werden geen significante verschillen geobserveerd (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

De NK-cel funktie werd beoordeeld via het cultiveren van PBMCs gedurende 18 h […]. De CD3/CD56+ NK-cellen werden geïsoleerd en geanalyseerd voor intracellulair IFN-γ, of voor cel-oppervlakte expressie van de aktivatie-merker CD25 [IL-2 receptor α-keten] of de degranulatie-merker CD107a (LAMP-1 [lysosomaal geassociaeerd membraan proteïne 1]). Weerom werden geen significante verschillen gedetekteerd tussen mensen met M.E./CVS en controles, voor geen enkele van de responsen.

Interaktie tussen herpesvirus-infektie toestand en lymfocyten-fenotype en -funktie

Herpesvirus-infektie, vooral infektie met CMV, staat er om bekend zowel het maturatie-fenotype en de funktie van menselijke CD8+ T-cellen en NK-cellen te beïnvloeden. Daarom vergeleken we lymfocyten-fenotype en funktie bij die individuen die seropositief of niet voor CMV waren. In alle studie-groepen hadden deelnemers die CMV-seropositief waren, significant minder CD4+ en meer of CD8+ T-cellen bij hun PBMCs. Na stimulatie met PMA en ionomycine, produceerden meer CD4+ en CD8+ T-cellen IFN-γ, en meer cellen waren IL-2 en IFN-γ dubbel-positief, bij de CMV-seropositieve individuen. Het deel van de PBMCs die CD3+CD56+ (‘NKT-like’) cellen waren, was zeer significant verhoogd bij de CMV-positieve deelnemers. In de NK-cel populatie, waren meer cellen NKG2C+, en er waren gedaalde hoeveelheden CD56dimCD57intermediate en verhoogde hoeveelheden CD56dimCD57bright bij de CMV-seropositieve deelnemers. Bij de CMV-seropositieve individuen was er een verminderde in vitro respons na IL-12 en IL-18 stimulatie, met significant gedaalde CD25, CD107 en IFN-γ expressie.

BESPREKING

In een groep van 250 goed-gekarakteriseerde mensen met M.E./CVS, waaronder een aantal die ernstig ziek zijn, hebben we verschillen geïdentificeerd qua fenotype van perifere immuun-cellen in vergelijking met gezonde controles. Deze omvatten zeer significant verhoogde hoeveelheden ‘mucosal associated invariant’ T-cellen, bijzonderlijk CD8+ MAIT cellen, in PWME t.o.v. gezonde controles, en deze waren verder gestegen bij ernstig zieke individuen. We vonden ook een verhoogd aandeel van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen, een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde effector TEMRA cellen en kleine veranderingen qua CD8+ T-cel differentiatie subcompartimenten bij PWME. De funktionele rol en consequentie van de wijziging binnen deze CD8+ T-cel subpopulaties dient nog te worden bepaald. We vonden geen bewijs voor veranderde funktie van T-cellen bij PWME. Van belang: we vonden geen verschillen qua hoeveelheden NK-cellen bij PWME noch wat betreft differentiatie-toestand, hun expressie van KIR-receptoren of aktivatie-merkers ex vivo of na in vitro stimulatie. Op basis van eerdere rapporten over abnormale NK-cel funktie bij M.E./CVS was dit een onverwachte bevinding, hoewel het consistent is met een klein aantal eerdere rapporten over normale NK-cel hoeveelheden en funktie. In ons systeem, cultiveerden we PBMCs gedurende 18 h om genoeg tijd te geven voor directe en indirect cel-aktivatie: het is mogelijk dat verschillen qua degranulatie of cytokine-produktie worden gezien bij een kortere stimulatie-periode. We vonden echter significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie bij deelnemers in alle klinische groepen die CMV-positief waren, detekteerbaar na de 18 h cultuur. CMV heeft een dramatisch effekt op NK-cellen en het is mogelijk dat een onzekere CMV-status een verstorende factor was die ten gronde ligt aan eerdere meldingen van NK-cel dysfunktie bij M.E./CVS. Belangrijk: de verschillen die we zagen qua MAIT-cellen en CD8+ T-cellen bij PWME waren consistent wanneer we CMV sero-status in rekening brachten.

M.E./CVS wordt dikwijls beschouwd te worden getriggerd door een acute virale infektie en verscheidene leden van de herpesvirus-familie bleken betrokken. Hier vonden we geen verschil qua prevalentie van de seropositiviteit voor zes herpesvirussen (CMV, EBV, HSV-1, HSV-2, VZV, HHV6) tussen PWME en gezonde controles, noch qua concentratie van aanwezige anti-virus antilichamen. Niettemin blijft de mogelijkheid bestaan dat herpesvirussen belangrijk zijn voor de M.E./CVS-pathogenese, dat virus-reaktivatie een verslechtering van symptomen kan triggeren, en dat meting van antilichaam-titers tegen andere virale antigenen een meer relevante meting kunnen betekenen [Loebel M et al. Deficient EBV-specific B- and T-cell response in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE. (2014) 9: e85387]. Dus: hoewel de sero-prevalentie van EBV niet verschilde tussen MS-patiënten, PWME of gezonde controles, hadden MS-patiënten significant hogere titers van antilichamen tegen EBV ‘Viral Capsid Antigen’, overéénkomstig met eerdere rapporten en een mogelijke aanwijzing voor recente virus-reaktivatie.

De verhoogde frequentie van of CD8+ MAIT-cellen bij individuen met ernstige M.E./CVS die hier werd gezien, werd niet eerder gerapporteerd. In het bijzonder: een klein aantal ernstig zieke M.E./CVS-patiënten had buitengewoon hoge hoeveelheden van deze cellen. Er werd gemeld dat de hoeveelheden perifere MAIT-cellen bij gezonde vrijwilligers verdubbelen na acute inspanning, suggererend dat het perifeer immuun-fenotype in rust bij sommige PWME lijkt op een post-exertionele toestand. Meer opmerkelijk was echter de overweldigende overheersing van CD8+ cellen in de MAIT-cel populatie bij ernstig zieke PWME. Daarenoven: hoewel de globale frequenties van MAIT-cellen niet verschilden tussen MS-patiënten en gezonde controles, waren hun MAIT-cellen ook sterk aangerijkt voor CD8+ cellen, wat een eerder rapport over hoge frequenties CD8+ CD161+ T-cellen bij MS-patiënten bevestigt. MAIT-cellen zijn aangeboren-achtige T-cellen die met vitamine-B gerelateerde antigenen van microben (gepresenteerd in de context van het MHC klasse-I gerelateerd molekule ‘MR1’) herkennen en ook kunnen reageren op cytokine-stimulatie. CD8+ MAIT-cellen zijn in staat geïnfekteerde cellen te doden via perforine/granzyme-sekretie en hebben daarom een beschermende rol bij microbiële infekties, maar ze bleken ook geïmpliceerd bij de pathologie van verscheidene niet-infektueuze ziekten zoals kanker, colitis en auto-immune ziekten zoals Reumatoïde Artritis en type-1 diabetes. Bij MS werden deze cellen beschreven als pro-inflammatoir en pathogeen. Het is mogelijk dat de toename qua MAIT-cellen bij sommige PWME wordt aangedreven door veranderingen in het darm-microbioom of, alternatief, gerelateerd kunnen zijn met andere, nog niet gekarakteriseerde wijzigingen in het immuunsysteem. In toekomstige studies kan het funktioneel fenotype van deze CD8+ MAIT-cellen bij PWME worden nagegaan, om te bepalen of ze misschien bijdragen tot de ziekte-pathologie. Het darm-microbioom bij M.E./CVS dient ook verder te worden onderzocht. Er kan eventueel een biomerker-signatuur worden ontwikkeld voor de diagnose van M.E./CVS: in deze context had het aandeel CD8+ MAIT-cellen in het perifeer bloed op zich een bescheiden onderscheidend maar het zou kunnen bijdragen tot combinatie-factor signatuur. In dit opzicht zal het testen van kandidaat biomerker-signaturen in grote, onafhankelijke, longitudinale validatie-groepen essentieel zijn; bijzonderlijk als we de gemengde rapporten over het biologisch fenotype van M.E./CVS in overweging nemen.

De reden voor de gewijzigde frequenties van verscheidene intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen bij M.E./CVS is onduidelijk en is waarschijnlijk funktioneel gelinkt met de begeleidende vermindering van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen. Aangezien er geen verschil was in de frequentie van of naïeve of terminaal gedifferentieerde CD8+ T-cellen, is het mogelijk dat bij M.E./CVS de cellen snel door deze intermediaire fase naar terminale differentiatie wordt gestuurd en dan verloren gaan via cel-dood. Het studie-ontwerp liet ons niet toe om de interaktie tussen het versterkt MAIT-cel compartiment en de gewijzigde globale T-cel differentiatie status na te gaan: dit kan worden aangepakt in toekomstige studies. De aandrijvende factor achter de snellere transitie naar terminale differentiatie zou een aan de gang zijnde antigen-stimulatie kunnen zijn, mogelijks te wijten aan persistente virale infektie of auto-immuniteit. De gereduceerde effector ‘memory’ T-cel populaties bij PWME kunnen gedeeltelijk de verhoogde vatbaarheid voor infektie, die courant wordt gerapporteerd bij ME./CVS, verklaren.

De hoeveelheden CD4+ en CD8+ T-cellen waren normaal bij PWME. Bij MS-patiënten was er echter een significante verschuiving naar verhoogde hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere CD8+ T-cellen een daardoor een verhoogde CD4+/CD8+ T-cel verhouding. Voorheen waren er tegenstrijdige rapporten bij PWME, met verhoogde of verlaagde CD4+/CD8+ T-cel ratios, hoewel heterogeniteit courant is en mogelijks verstoring door de CMV-infektie status optreedt.

Samengevat: in een grote groep zorgvuldig gefenotypeerde mensen met M.E./CVS, hebben we significante verschillen qua perifere T-lymfocyt fenotypes vastgesteld maar we waren niet in staat eerdere rapporten over verstoord NK-cel fenotype of funktie te bevestigen. Belangrijk: voor deze studie waren individuen met bewijs voor een aan de gang zijnde acute infektie uitgesloten, alsook deze met voor de hand liggende co-morbiditeiten en deze die immuun-modulerende medicijnen nemen. We bevestigden ook dat CMV-seropositiviteit een belangrijke impact heeft op het fenotype en funktie van NK-cellen en T-cellen, wat het opperste belang onderlijnt van het beoordelen van de status van CMV- en andere herpesvirus-infektie bij studies betreffende de menselijke immune toestand. Elk van deze factoren had de analyse van eerdere studies kunnen verstoren. De meest opvallende bevinding van deze studie – de verhoogde hoeveelheid circulerende MAIT-cellen bij mensen met ernstige M.E./CVS, en de zeer grote proportie CD8+ MAIT-cellen bij patiënten met ernstige M.E./CVS en MS – rechtvaardigt verder onderzoek. Deze observatie onderstreept ook het belang van het opnemen van niet-vermoeide individuen met andere invaliderende ziekten (zoals MS-patiënten) in studies omtrent M.E./CVS, om te controleren voor de fysiologische effekten van verminderde lichamelijke aktiviteit. Hoewel men kan discussiëren over het feit of MS-patiënten de meeste geschikte dergelijke groep is, vergemakkelijkt de zeer grote immunologische database voor MS het evalueren van observaties en kan het inzicht verschaffen in de pathogenese-mechanismen van M.E./CVS door vergelijking met een meer uitgebreid gedocumenteerde ziekte.

————————-

Prof. dr Derya Unutmaz (immunoloog) van het ‘Jackson Laboratory ME/CFS Collaborative Research Centre’ – co-auteur van ‘Tuning of human MAIT cell activation by commensal bacteria species and MR1-dependent T-cell presentation’ (Mucosal Immunology (2018) 11, 1591-1605) – speculeerde (‘Nature News Feature’ 3 Januari 2018) dat de inflammatie die wordt gezien bij M.E.(cvs) het resultaat zou kunnen zijn van een probleem bij de T-cel respons op onschadelijke virussen, schimmels en andere stimuli. Een andere co-auteur van dit artikel, Dr. Julie Oh, sprak op de ‘Accelerating Research on ME/CFS Meeting’ (NIH conferentie, 2019) over research naar welke bakterie-soorten/-stammen de aanmaak van die bepaalde T-cellen, MAIT-cellen, zouden kunnen triggeren en hoe die ev. kan worden afgezet. Unutmaz kreeg van het ‘National Institutes of Health’ geld ter beschikking om onderzoek te verrichten bij M.E.(cvs). Publicaties bij M.E.(cvs) zijn er op dit moment nog niet…

Advertenties

mei 25, 2019

Spierpijn en M.E.(cvs) na vaccinatie

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:39 am
Tags: , , , , ,

Vaccinatie is efficient maar de kwestie blijft: is massa-vaccinatie wel zo doeltreffend als algemeen wordt geclaimd. Op onze pagina’s houden we altijd een kritische houding aan, ook wat betreft (zogenaamde beloftevolle en soms gehypte) voorgestelde therapieën. Wanneer het over vaccinatie gaat, worden kritische stemmen echter nogal snel gestigmatiseerd als ‘sektaire anti-vaxxers’ en het zwijgen opgelegd. Dergelijke houding vinden wij zeer onwetenschappelijk. Zoals we al meegaven en zoals hieronder uitvoerig wordt besproken zijn er wel degelijk vragen te stellen bij massale vaccinatie-campagnes. Een minderheid gevaccineerden ondervindt zeker nadelige (soms desastreuze) effekten van een vaccinatie (of de toegevoegde stoffen die de antigeniciteit moeten versterken). We roepen dus niet op tot afschaffing van immunisatie(-campagnes) maar (zoals eerder geopperd) tot (genetische) screening voorafgaand aan vaccinatie bij mensen waarbij nadelige gevolgen kunnen worden vermoed.

De belangrijke mee te nemen punten uit onderstaand artikel zijn: M.E./CVS is multi-factoriële ziekte maar aluminium-bevattende vaccins kunnen een trigger vormen, M.E./CVS kan verbonden zijn met persistentie van intracellulaire aluminium-adjuvanten, dieren-modellen onthullen verspreiding over het lichaam en neurotoxische effekten van aluminium-adjuvanten, er is degelijk wetenschappelijk onderzoek nodig omtrent de veiligheid, en vatbaarheid-genen en co-factoren moeten worden geïdentificeerd. Er moet dan ook aandacht komen voor veiliger adjuvanten.

Het artikel is zeer uitgebreid en alle elementen uit artikel ten gronde uitleggen, zou een cursus immunologie op zich zijn. Mensen die meer uitleg nodig hebben, kunnen ons contacteren. Idem voor geïnteresseerden die de volledige referentielijst wensen. In elk geval wordt aangetoond dat een verband tussen de adjuvant-partikels in vaccins en M.E.(cvs) helemaal niet absurd is!

Voor meer over macrofagen-myofasciitis lees: Aanhoudende aanwezigheid & hersen-translocatie van vaccin-adjuvanten’.

En over het werk van Yehuda Shoenfeld: ‘Vaccinatie en CVS’, ‘ASIA (auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten) syndroom’), ‘CVS & FM na immunisatie met hepatitis-B vaccin’ & ‘Voorspellen van post-vaccinatie auto-immuniteit’.

————————-

Autoimmunity Reviews (2019) [pre-print]

Myalgia and Chronic Fatigue Syndrome following immunization: macrophagic myofasciitis and animal studies support linkage to aluminum adjuvant persistency and diffusion in the immune system

Romain K. Gherardia (b) Guillemette Crépeaux (a,c), François-Jérome Authier (a,b)

a Inserm U955 E10 (Biology of the neuromuscular system), Paris Est Créteil University, 94010 Créteil, France

b Neuromuscular Pathology Expert Centre, Henri Mondor University hospital, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, 94010 Créteil, France

c Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Maisons-Alfort, France

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een multifactoriële en slecht begrepen invaliderende ziekte. We presenteren epidemiologisch, klinisch en experimenteel bewijsmateriaal voor het feit dat M.E./CVS een belangrijk type nadelig effekt van vaccins uitmaakt, bijzonderlijk deze die slecht afbreekbare aluminium-adjuvant deeltjes bevatten. Er is maar traag bewijs opgedoken omwille van de verscheidenheid, het gebrek aan specificiteit, de trage start en frequente medische onderschatting van M.E./CVS-symptomen. Het werd ondersteund door een epidemiologische studie die gevaccineerde en niet-gevaccineerde militairen die niet werden ingezet tijdens Golf Oorlog II vergeleek. De aangetaste patiënten vertonen cognitieve dysfunktie die de aandacht, het geheugen en inter-hemisferische [tussen de hersenhelften] verbindingen beïnvloedt, goed gecorreleerd met defekten van de hersen-doorbloeding en geassocieerd met een stereotiep en onderscheidend patroon van cerebraal glucose-hypometabolisme. Schouderspier-biopten uitgevoerd om myalgie te onderzoeken levert typisch macrofagen-myofasciitis (MMF) op – een histologische biomerker ter beoordeling van persistentie van aluminium-agglomeraten in cellen van het aangeboren immuunsysteem op de plaats van eerdere immunisatie. MMF lijkt gelinkt met gewijzigde detoxificatie van mineraal-partikels door de autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert] / xenofagie [verwijderen van vreemde stoffen] machinerie. Het vergelijken van de toxicologie van verschillende vormen van aluminium en verschillende types blootstelling is misleidend en ontoereikend, en experimenten met kleine dieren hebben oude dogma’s onderste-boven gekeerd. In plaats van snel te worden gesolubiliseerd in de extracellulaire ruimte, worden geïnjekteerde aluminium-partikels snel door immuuncellen gevangen, en naar afgelegen organen en het brein getransporteerd, waar ze een inflammatoire respons opwekken en selektieve lage-dosis langdurige neurotoxiciteit veroorzaken. Klinische observaties en experimenten bij schapen (grote dieren lijkend op mensen) bevestigden zowel systemische diffusie en neurotoxische effekten van aluminium-adjuvanten. Post-immunisatie M.E./CVS vertegenwoordigt de kern-manifestatie van “auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten” (ASIA).

1. Inleiding

Vaccins en zuiver water hebben belangrijke rollen gespeeld bij de bestrijding van levensbedreigende infektueuze ziekten. De voorbije eeuw zorgde vaccinatie voor de uitroeiing van pokken, bijna uitroeiing van poliomyelitis, en aanzienlijke afname van mazelen en bof. Een grote vaccinatie-dekking bleek de heropleving van meerdere infektie-ziekten te vermijden door het verminderen van het aantal mensen die de pathogenen kunnen doorgeven. Vaccins vertegenwoordigen de meest kosten-effektieve methode ter controle van meerdere infektie-ziekten en lijken globaal veilig. Het risico op nadelige effekten dat inherent is aan elk doeltreffend farmaceutisch produkt bestaat echter ook voor vaccins. Ondanks de lage aantallen gesignaliseerde gevallen verdienen nadelige effekten volgend op immunisatie (‘adverse effects following immunization’; AEFI) speciale aandacht omdat (i) anders dan bij conventionele medicijnen, vaccins worden toegediend aan gezonde individuen; (ii) een uitbreiding zonder precedent van vaccinatie-programma’s werd aangekondigd door Amerikaanse biofarmaceutische research bedrijven, met meer dan 260 nieuwe vaccins die worden ontwikkeld; en (iii) omdat AEFI waarschijnlijk grotendeels vermeden kan worden door het optimaliseren van vaccinologie-produkten en -praktijken gebaseerd op de kennis omtrent AEIs pathofysiologische mechanismen en risico-factoren. Een belangrijke bezorgdheid aangaande vaccin-veiligheid houdt verband met de adjuvant-molekulen die in de meest vaccins worden gebruikt om sterke en blijvende immunisatie op te wekken. Er werd bijzonder aandacht besteed aan aluminium-zouten die empirisch werden geïntroduceerd in vaccins door Alexander Glenny [Brits immuunoloog] in 1926 en de belangrijkste klasse adjuvanten vormen met een licentie voor wereldwijd gebruik bij mensen en dieren. Er zijn twee belangrijke aluminium (Al) -zouten die als vaccin-adjuvanten worden gebruikt. Al-oxy-hydroxide (AlOOH, Alhydrogel®), gewoonlijk Al-hydroxide genoemd, is samengesteld uit nanopartikels van ca. 2,2 nm x 4,5 nm x 10 nm die spontaan micron aggregaten vormen met een nanofibreus [bestaande uit nanovezels] voorkomen (elektronen-microscopie); terwijl Al-hydroxyfosfaat (AlOHPO4, Adju-Phos®), gewoonlijk Al-fosfaat genoemd, amorf is. Beide adjuvanten potentiëren in sterke mate de produktie van antilichamen met weinig aanmaak van cytotoxische T-lymfocyten. De mechanismen die aan de basis liggen van hun adjuvant effekt werden slechts in recente jaren intens onderzocht en blijven nog niet volledig begrepen. Al-hydroxide is een stabiele gehydrateerde gel met een positieve oppervlakte-lading en hoge antigen-adsorptie capaciteiten gestuurd door hydrostatische interakties en uitwisselingen van hydroxyl-groep met de fosfaat-groep van het ligand. Al-fosfaat heeft een negatieve lading, minder hydroxyl-groepen en lagere adsorptie-capaciteiten. De bio-dispositie kinetieken van de twee adjuvanten zijn ook significant verschillend: Al-hydroxide wordt minder snel gesolubiliseerd, en wordt gretiger geïnternaliseerd en is minder toxisch voor fagocytische cellen dan Al-fosfaat.

Deze review hier zal focussen op de mogelijke implicatie van Al-adjuvant bevattende vaccins bij patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Onze eigen ervaring op dat gebied komt door de klinische fenotypering van een grote groep patiënten waarvan een ongewoon langdurige persistentie van Al-hydroxide werd gedetekteerd in immuun-cellen op de plaats van eerdere immunisatie, met vorming van een specifiek letsel: macrofagen-myofasciitis (MMF). In 2011 gebruikte Yehuda Shoenfeld dit MMF-syndroom als één paradigma voor de aandoening die hij “auto-immune/inflammatory syndrome induced by adjuvants” (ASIA) noemde [Shoenfeld Y & Agmon-Levin N. ‘ASIA’ – autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants. J Autoimmun. (2011) 36: 4-8].

2. M.E./CVS-definities

[…]

[…] M.E. is een neurologische ziekte (ICD G93.3). Naast spierpijn en inspanning-intolerantie, vertonen M.E.-patiënten dikwijls neurologische dysfunkties […].

[…]

Samengevat: de waaier aan voorgestelde definities en de klaarblijkelijke discrepanties geven aan dat er geen echte consensus is aangaande de nomenclatuur of klassificatie […].

3. M.E./CVS overlapt met andere aandoeningen

[…] Er is discussie over het feit of M.E./CVS en fibromyalgie afzonderlijke aandoeningen zijn of slechts fenotypische variaties van één ziekte vertegenwoordigen, waarbij ernstige vermoeidheid aan de ene kant van het spectrum zit (M.E./CVS) en meer spierpijn aan de andere kant (fibromyalgie). Tot op heden blijft de kwestie onopgelost. Tot dat een globale consensus wordt bereikt, e aangezien de WHO officieel fibromyalgie klassificeert bij de musculoskeletale aandoeningen (WHO ICD10M79.7) en niet bij de neurologische ziekten zoals M.E./CVS, zullen we het onderscheid maken aan de hand van de 1990 ACR [American College of Rheumatology] criteria voor fibromyalgie, die gebaseerd zijn op druk-gevoeligheid (‘tender-points’) op minstens 11 van 18 gespecifieerde plaatsen en de aanwezigheid van wijdverspreide pijn. […]

IBS [prikkelbare darm syndroom] is één van de meest courante funktionele darm-aandoeningen. Het wordt gekenmerkt door abdominaal ongemak e, verstoorde darmen. Ca. 50% van de IBS-patiënten vertonen co-morbiditeit: 14% hebben M.E./CVS, en 35-90% van de M.E./CVS-patiënten hebben IBS.

POTS [posturaal orthostatisch tachycardia syndroom] wordt gekenmerkt door een excessieve toename van de hartslag (> 30 slagen/min) bij verandering van de houding van liggend naar staand. Het wordt gelinkt met dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel. POTS is dikwijls co-morbide met M.E./CVS, bijzonderlijk bij jonge patiënten. Ongeveer 40% van de M.E./CVS-patiënten kan leiden onder POTS en 64% van de patiënten met POTS voldoen aan de criteria voor M.E./CVS.

Complex Regionaal Pijn Syndroom (CRPS) is een andere chronische pijn en dysautonome aandoening [dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel]. Het tast de armen, handen, benen of voeten aan, en manifesteert zich via intense brandende pijn met hyperalgesie en dramatische veranderingen qua huid-temperatuur, kleur en textuur die niet meer verklaard kan worden door een initiërende schadelijke gebeurtenis. CRPS kan gepaard gaan met een verstoorde lichaamsperceptie en beweging-stoornissen.

4. M.E./CVS en vaccins

Idiopatische M.E./CVS vertoont gelijkenissen met post-infektueuze vermoeidheid-syndromen maar er kan geen pathogeen worden aangetoond bij alle patiënten, wat aanleiding geeft tot de opkomende visie dat gelijkaardige symptomen getriggerd kunnen worden door een waaier aan verschillende pathogenen en toxische stoffen. Bij de mogelijke triggerende factoren worden vaccins en hun componenten al lang verdacht een rol te spelen [Hyde B et al. The clinical and scientific basis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Nightingale Research Foundation, Ottowa, Canada (1992) /// Shepherd CB. Is CFS linked to vaccinations? The CFS Research Review (2001) 2: 6-8].

4.1. Eerste sterk signaal: HBV-vaccinatie

Na de eerste immunisatie-campagne tegen Hepatitis-B virus (HBV) in Canada, verklaarde een verpleegster in 1992 op de Canadese TV dat ze M.E./CVS had opgelopen na het vaccin te hebben gekregen. Er werd de kijkers gevraagd elke gelijkaardige ervaring te melden. Er werden 69 individuen bekendgemaakt aan het ‘Department of National Health and Welfare’ die een ad hoc werkgroep startte om de zaak te onderzoeken. Het comité bevestigde de verbanden tussen immunisatie tegen HBV en M.E./CVS maar maakte geen aanbeveling om research te financieren aangaande een mogelijk causaal verband op basis van argumenten zoals: (1) de afwezigheid van een strakke tijd-clustering tussen immunisatie en aanvang van de symptomen; (2) het klein deel Canadese M.E./CVS-patiënten dat werd gevaccineerd tegen HBV binnen 3 maanden voorafgaand aan de aanvang van de symptomen; en (3) het ontbreken van biologische plausibiliteit [Working group on the possible relationship between hepatitis-B vaccination and the Chronic Fatigue Syndrome. Report. Canad Med Assoc J. (1993) 149: 314-9]. Sindsien werd in de literatuur melding gemaakt van talrijke patiënten met verhalen over M.E./CVS optredend op verschillende tijdstippen na immunisatie tegen HBV [Agmon-Levin N & Shoenfeld Y. Chronic Fatigue Syndrome with autoantibodies – the result of an augmented adjuvant effect of hepatitis-B vaccine and silicone implant. Autoimmun Rev. (2008) 8: 52-5 /// Agmon-Levin N et al. Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia following immunization with the hepatitis-B vaccine: another angle of the ‘autoimmune (auto-inflammatory) syndrome induced by adjuvants’ (ASIA). Immunol Res. (2014) 60: 376-83] en het aluminium-hydroxide adjuvant gebruikt in HBV-vaccins bleek slecht afbreekbaar, en veel langer in het immuunsysteem aan te houden en te verspreiden dan voorheen werd geloofd. In retrospect kunnen deze nieuwe gegevens en deze verzameld over andere Al-bevattende vaccins (zie verder) twijfel zaaien over de validiteit van de argumenten van het Canadese ad hoc comité.

4.2. Beperkingen van epidemiologische studies bij de beoordeling van M.E./CVS als een AEFI

In 2012 gaf het ‘Institute of Medicine’ (IOM) aan dat het bewijsmateriaal “inadequaat” was “om een oorzakelijk verband te aanvaarden of verwerpen voor de grote meerderheid van de nadelige effekten van vaccins die ze onderzochten”, omwille van het beperkt aantal bevredigende epidemiologische studies. Toegegeven: het erkennen van M.E./CVS als een AEFI en het vaststellen van de causale rol van multipele immunisaties bij M.E./CVS zijn een uitdaging omdat alle geïdentificeerde beperkingen van AEFI epidemiologische studies in deze setting een rol spelen. Volgens het IOM omvatten deze beperkingen:

* Gebrek aan ‘long-term’ follow-up studies wat de detektie van vertraagde effekten belet;

* Kleine stalen, wat de detektie van zeldzame gebeurtenissen belet;

* Gebrek aan evaluatie van multipele vaccinaties als geheel;

* Gebrek aan of symptomen die specifiek zijn voor vaccinatie;

* Multipele symptomen die optreden in combinatie, met een hoog risico om te worden getrivialiseerd en niet te worden herkend als één entiteit, zoals aangestipt in de leken-pers over M.E./CVS-symptomen in pre-licentie HPV-vaccin veiligheidstesten;

* onder-rapportering inherent aan passieve surveillance-systemen, waarbij M.E./CVS-symptomen dikwijls niet als dramatische genoeg worden beschouwd om verdiend te worden dat ze gemeld worden; tijd verstreken sinds blootstelling die zeer variabel en dikwijls zeer lang is, zodat het beeld vertroebeld; het ongeloof/negeren dat M.E./CVS mogelijks gelinkt kan zijn met een vaccin; en ontbrekende ijver wat betreft rapportage als algemene regel;

* Hoge vaccinatie-aantallen en toediening van multipele vaccins die de vergelijking beletten met controle-groepen die geen vaccins kregen;

* Beperkte populatie vaccinatie-testen die resultaten opleveren die niet veralgemeenbaar kunnen zijn voor de algemene bevolking (bv. testen bij kinderen of individuen zonder risico-factoren);

* Veranderingen in vaccin-technologie, die zorgt voor een beletting van de veralgemeenbaarheid van substantieel verschillende nieuwe vaccins op basis van veiligheid-ervaringen omtrent vroegere vaccins (zie nieuwe Al-adjuvanten, hieronder).

4.3. Inzichten vanuit ‘Gulf War Illness’ in ingezette en niet-ingezette veteranen

Gelukkiglijk werden in bevoorrechte epidemiologische studies verbonden met ‘Gulf War Illness’ (GWI) gevaccineerde en niet-gevaccineerde individuen vergeleken, en die linkten toediening van multipele vaccins met M.E./CVS. Ten minste een vierde van de Golf oorlog veteranen die terugkeerden van de Perzische Golf oorlog (PGW) in februari 1991 rapporteerde een waaier aan chronische symptomen die enigszins variëren maar opvallende gelijkenissen vertonen met M.E./CVS. […] Omwille van bevooroordeling die regelmatig optrad in het verloop van de onderzoeken, is er nog onzekerheid omtrent de exacte oorzakelijke factoren van GWI maar onder andere multipele vaccinaties toegediend binnen een korte periode werden herhaaldelijk verdacht. Een Britse ‘cross-sectionele’ studie toonde een sterk verband tussen CDC-gedefinieerde GWI en meerdere vaccinaties toegediend tijdens ontplooiing […]. Bovendien werden “consistente, specifieke en geloofwaardige relaties” gevonden tussen het aantal inoculaties en gezondheid-indicatoren bij Britse Golf oorlog veteranen.

Zowel vaccinatie tegen biologische oorlogsvoering agentia (anthrax en pest met pertussis als een adjuvant om immuun-responsen te ‘boost’en) als multipele routine vaccinaties bleken geassocieerd met het CDC multi-symptoom syndroom in de Britse Golf oorlog groep. In Canada werd een significant verband gerapporteerd tussen “niet-routinematige immunisaties” en meerdere symptoom-gedefinieerde uitkomsten bij Golf oorlog veteranen. In de V.S. waren dalingen qua lange-termijn subjectieve gezondheid van Golf oorlog veteranen geassocieerd met het krijgen van anthrax-vaccin en veteranen die meer ernstige reakties op vaccins meldden rapporterden meer dalingen qua subjectieve gezondheid. Het Amerikaans gelicentieerd anthrax-vaccin (AVA; Biothrax®) is geadsorbeerd op aluminium-hydroxide en kan MMF induceren. Daarnaast werd het vaccin er van verdacht squaleen [adjuvant dat de immuun-respons sterk verhoogt] te bevatten omwille van de detektie van circulerende squaleen-antilichamen bij aangetaste veteranen, maar er werd door het ‘Department of Defense’ geen relatie gevonden tussen squaleen-antilichamen en chronische symptomen. Daarom bleef de rol van vaccins bij GWI moeilijk te vatten, omdat de focus meer lag op de rol van chemische blootstellingen zoals pyridostigmine-bromide [cholinesterase-remmer] (profylaxis [voorkomen van ziekte] bij chemische aanvallen) of persoonlijk pesticiden-gebruik. Blootstelling aan voor de Perzische Golf oorlog specifieke toxische stoffen konden echter amper worden aangeduid bij veteranen die niet werden ingezet of elders dan in de Perzische Golf dienden, en ontwikkelden minder frequent chronische symptomen gelijkend op GWI. De ‘Kansas Commission on Veterans Affairs’ bestudeerde specifiek de mogelijke effekten van vaccins bij veteranen uit Kansas die niet in de PGW dienden (niet-PGW veteranen): vergeleken met niet-gevaccineerde veteranen hadden niet-PGW veteranen die melding maakten van vaccin-toediening significant meer vermoeidheid/ slaap-problemen, pijn-symptomen, neurologische/ cognitieve/ stemming-symptomen en gastro-intestinale symptomen. Gevaccineerde (n = 208) vs niet-gevaccineerde (n = 187) non-PGW veteranen hadden een significant veel hogere prevalentie van GWI […]. In tegenstelling met PGW-veteranen bij wie GWI mogelijks het resultaat was van “clusters van oorzaken” en “combinatie van effekten”, werd geen andere oorzaak dan zelf-gerapporteerde vaccinatie gevonden bij niet-PGW veteranen.

5. M.E./CVS bij Al-adjuvant geïnduceerde macrofagen-myofasciitis

De accuraatheid van zelf-gerapporteerde vaccinatie staat klassiek ter discussie maar dit is niet het geval wanneer vaccinatie-raporten beschikbaar zijn en wanneer een zeer specifieke histologische merker op een onbetwistbare manier eerdere immunisatie kan vaststellen, zoals het geval is bij patiënten met MMF.

5.1. Macrofagen-myofasciitis: een biomerker voor Al-adjuvant biopersistentie

5.1.1. Karakterisatie bij mensen

Macrofagen-myofasciitis (MMF), voor het eerste beschreven in 1998, is een specifiek door Al-hydroxide geïnduceerd granuloma [nodule chronisch inflammatoire cellen] dat wordt gedetekteerd op een plaats waar eerder een vaccin werd geïnjekteerd. Het letsel wordt gekenmerkt door lagen grote macrofagen die constant agglemeraten (grootte-orde sub-µm tot µm) van aluminium nano-kristallen in hun cytoplasma, vermengd met lymfocyten-infiltraten. Dit immunologisch aktief letsel is niet geassocieerd met vorming van ‘giant’-cellen [meerkernige cellen].

De eerste 75 patiënten uit review van 2003 hadden voornamelijk Al-hydroxide gekregen via HBV (84%), Tetanus Toxoïd bevattende vaccins (TT 58%) of Hepatitis-A virus vaccins (HAV 19%), gewoonlijk toegediend als een combinatie. Het aandeel van de vaccin-types veranderde uitgesproken met verloop van tijd: onze laatste 70 patiënten (januari 2013 tot juni 2018; 56 met complete vaccinatie-rapporten) hadden voornamelijk TT-bevattende vaccins (86%, 48/56) als laatste immunisatie of binnen de jaar vóór de bioptie gekregen, gevolgd door HBV (27%, 15/56), HAV (11%, 6/56), HPV (11%, 6/56) en meningitis-C (<1% , 1/56). TT-bevattende vaccins (voornamelijk Difterie-Tetanus-Poliomyelitis, Difterie-Tetanus-Pertussis (DTP) [perstussis = kinkhoest] & Difterie-Tetanus-Pertussis-Poliomyelitis), alleen toegediend of in combinaties met niet-TT vaccins, waren de meest recente toegediende in 64% van de gevallen. Deze gegevens geven duidelijk aan dat MMF niet specifiek is geassocieerd met het HBV-vaccin. MMF wordt zelden gedetekteerd ondanks het groot aantal geïmmuniseerde individuen maar, kort na de initiële beschrijving, werd een opvallende toename van hat aantal MMF-detekties opgetekend door alle Franse gespecialiseerde centra. De prominente detektie van MMF in Frankrijk van 1993 was waarschijnlijk te wijten aan: (1) de aanbevolen vervanging bij het begin van het decennium van de subcutane door de intramusculaire route; (2) de enorme immunisatie-campagne tegen hepatitis-B in Frankrijk (90 miljoen dosissen verkocht op tien jaar, waarvan twee derde toegediend aan volwassenen); en (3) de gebruikelijke keuze van de schouderspier voor bioptie bij volwassenen in Franbkrijk terwijl deze spier niet de voorkeur heeft in andere landen. Bv.: slechts 10% van de spier-biopten bij volwassenen werd uitgevoerd in de schouderspier in één Amerikaans centrum, waarbij MMF werd gedetekteerd in 1% daarvan. Ondanks de gebruikelijke routine keuze van een incongruente spier-site, wat de detektie van de meeste MMF-gevallen belet, kon het letsel occasioneel gedocumenteerd worden in Australië, Brazilië, Duitsland, India, Ierland, Israël, Italië, Portugal, Saudi-Arabië, Spanje, het Verenigd Koninkrijk, de V.S.A. en meerdere andere landen (persoonlijke communicatie), wat aangeeft dat MMF niet specifiek is voor Frankrijk.

5.1.2. Opruiming van het letsel in dieren-modellen

Het letsel werd experimenteel opgewekt bij ratten, apen en schapen. In fel contrast met de snelle eliminatie van oplosbaar Al intraveneus geïnjekteerd, is de intramusculaire inspuiting van Al-hydroxide geassocieerd met een veel tragere eliminatie van Al in de urine, wat 6% van de geïnjekteerde dosis vertegenwoordigt 28 dagen na injektie in konijnen.

Op basis van de gegevens van dit uniek toxicokinetisch experiment, werd de duur voor volledige verplaatsing van opgeloste Al-ionen van de injektie-plaats berekend op 5,5 maanden voor Al-hydroxide. Experimentele MMF krimpt steeds met verloop van tijd. Bij apen was MMF (geïnduceerd via DTP-vaccin) volledig verdwenen uit de geïnjekteerde spier tussen 6 en 12 maanden na immunisatie. Op dezelfde manier als bij deze dieren-modellen lijkt de overgrote meerderheid mensen binnen maanden het adjuvant uit de spier te clearen maar bij een klein aantal onder hen kan MMF nog worden geobserveerd tot > 15 jaar na vaccinatie.

Lang-bestaande MMF moet dus worden beschouwd als een biomerker voor het probleem bij zeldzame individuen om het adjuvant uit hun lichaam te krijgen. Om die reden bevelen we aan een bioptie uit te voeren om MMF vast te stellen minstens 18 maanden na de laatste immunisatie om toe te laten ongewoon langdurige persistentie van het letsel toe te beoordelen.

5.1.3. Genetisch voorbestemmende factoren

Er wordt algemeen aangenomen dat er subpopulaties mensen bestaan die gevoeliger zijn voor blootstellingen aan bepaalde chemische stoffen of deeltjes dan de gemiddelde bevolking. Individuele varbaarheid-factoren die gewoonlijk specifieke “genen x omgeving” interakties weerspiegelen, verklaren waarschijnlijk waarom slechts een klein deel van de gevaccineerden nadelige effekten ontwikkelen. De exacte basis voor een dergelijke vatbaarheid kan omvatten: (1) genetisch-bepaalde verstoring van cellulaire verdedingsmechanismen tegen de pro-oxidante effekten van Al; (2) HLA-subgroepen, zoals HLADRB1*0, die bekend staan voor het bevorderen van auto-immune responsen; (3) veroudering en/of genetische inter-individuele verschillen bij de aanmaak van het chemo-attractant MCP1/CCL2 [cytokine/chemokine; chemokine (C-C motief) ligand 2 ook monocyten-aantrekkend proteïne 1 (MCP1) genoemd] dat nodig is voor de verspreiding van immuun-cellen beladen met Al-adjuvant partikels; (4) individuele problemen om Al-adjuvant uit immuun-cellen te krijgen. De grootte van experimentele MMF-letsels bij ratten verschilt aanmerkelijk naargelang de genetische achtergrond en bij mensen bestaat treffende inter-individuele variabiliteit voor aluminium-eliminatie.

Een intracellulair mechanisme genaamd xeno/autofagie is bevorderlijk voor het oplossen en de biologische verplaatsing van geïnternaliseerde minerale partikels, alsook bij metaal-toxiciteit, en veel cruciale funkties in het immuunsysteem en centraal zenuwstelsel. Er werden beloftevol preliminaire gegevens verkregen via by DNA-screening van 34 genen die direct betrokken zijn bij de xeno-autofagie machinerie […], suggererend dat MMF genetisch bepaald onvermogen van sommige individuen om zich op een efficiënte manier te ontdoen van geïnjekteerde aluminium-adjuvanen (patent ingediend) kan weerspiegelen, wat de weg plaveit voor de ontwikkeling van genetische testen die een verhoogd risico op intolerantie gelinkt met adjuvant-retentie kunnen voorspellen.

5.2. Macrofagen-myofasciitis syndroom: post-vaccinatie M.E./CVS

5.2.1. Klinische karakterisatie

Van 1994 tot 2012 hebben we 583 volwassen patiënten met MMF gezien in het ‘Paris East University Hospital Henri Mondor’ […]. Er is geen nationaal MMF-register maar een totaal aantal 445 MMF-gevallen werd officieel bekendgemaakt […]. Uitgezonderd gegevens over cognitieve dysfunktie die specifiek werden verzameld in ons centrum maar die niet werden gecapteerd op nationaal niveau, toonden lokale en nationale bronnen gelijkaardige kenmerken van MMF-patiënten, bevestigd door series uit Portugal en de V.S. De ‘Henri Mondor hospital’ 1994-2018 MMF-database geeft de volgende karakteristieken van patiënten aan: gemiddelde leeftijd 52,5 jaar, overheersing van vrouwen (71%), gemiddeld 5 (1-12) Al-bevattende vaccin-injekties in de 10 jaar voorafgaand aan het biopt (vaccinatie-dossiers beschikbaar bij 236/350), gemiddelde Al-adjuvant persistentie-tijd 71 maanden (9-237 […]), gemiddelde tijd tussen klinische aanvang tot bioptie van 67 maanden, voornaamste symptomen myalgie/arthralgie (92%, 309/335), vermoeidheid (86%, 298/347) en cognitieve klachten (82%, 154/187). Andere symptomen omvatten hoofdpijn (49%), kortademigheid (51%), abdominale pijn (30%), oculaire symptomen (34%), borst-pijn (32%), urinaire symptomen (21%) & koorts (23%).

Patiënten kregen intramusculair een Al-bevattend vaccin toegediend vóór de spier-symptomen aanvingen. De tijd vóór de eerste symptomen varieerde substantieel: van 0 tot 72 maanden in onze initiële reeks. De mediane tijd tussen de laatste vaccinatie tot de eerste spierpijn was 11 maanden, 30% van de patiënten klaagden over myalgieën binnen 3 maanden, 31% tussen 3 en 12 maanden, 19% tussen 12 tot 24 maanden & 20% na 24 maanden. In ons centrum vertoonde één derde van de myalgische patiënten die Al-hydroxide bevattende vaccins kregen in de voorbije 10 jaar MMF in een schouderspier-biopt. De myalgie startte gewoonlijk na een inspanning van ongewone intensiteit, dikwijls in de onderste ledematen en naar boven toe vorderend, om diffuus te worden op het tijdstip van de bioptie. Een myopathisch elektromyogram en verhoogd CK [creatine-kinase; verhoogde waarden kunnen worden gezien bij individuen na extreme inspanning; verlaagd creatine-kinase werd vastgesteld bij ernstig zieke M.E.(cvs)] worden gevonden in minder dan de helft van de patiënten.

Vermoeidheid heeft gewoonlijk een grote impact op het dagelijks leven en de meeste patiënten stoppen met werken na enkele maanden. De cognitieve veranderingen bleken stereotiep bij systematisch testen: er was een impact op aandacht, werk- en visueel geheugen, en connecties tussen de hersenhelften; en deze waren niet toe te schrijven aan chronische pijn noch aan depressie.

Een standaard brein-MRI was gewoonlijk normaal maar er werden in het oog lopende funktionele neuro-beeldvorming veranderingen gevonden, inclusief: (1) focale hersen-perfusie defekten vastgesteld d.m.v. by SPECT (‘single photon emission computerized tomography’), goed gecorreleerd met wijzigingen qua aandacht/geheugen en dysconnectie tussen de hemisferen; (2) een karakteristiek patroon van cerebrale glucose-hypometabolisme vastgesteld via FDG-PET (fluorodeoxyglucose positron-emissie tomografie) waarbij de occipitale cortex, hippocampus en het cerebellum betrokken zijn, en voorspellend voor MMF-detektie na een spier-biopt.

De voornaamste symptomen van patiënten met MMF (arthromyalgie, vermoeidheid en cognitieve stoornissen) kunnen enige tijd geïsoleerd voorkomen. Een grote meerderheid van de patiënten hebben echter meerdere symptomen en voldoen in minstens 50% van de gevallen aan de internationale criteria for M.E./CVS. De aandoening voldoet ook aan de CDC-criteria voor multi-symptoom GWI.

5.2.2. Consistentie-analyse

Het is zeer onwaarschijnlijk dat het voorkomen van spier-/gewricht-pijn, chronische vermoeidheid en cognitieve veranderingen bij patiënten met lang-bestaande MMF per toeval is en een consistent syndroom vormt. Dit wordt vastgesteld door:

(1) post-immunisatie aanvang van symptomen;

(2) gelijkaardige struktuur van symptomen gezien in onafhankelijke Franse en buitenlandse MMF-series;

(3) significant verband tussen myalgie en MMF bij patiënten waarbij een schouderspier-biopt werd uitgevoerd in Franse myopathologische centra vóór de publicatie van de oorzaak van MMF;

(4) significante klinische verschillen afhankelijk van de aan-/afwezigheid van MMF bij gevaccineerden met spierpijn: in scherp contrast met niet-MMF patiënten met spierpijn, slechts een minderheid van de MMF-patiënten had fibromyalgie (ACR 1990 criteria; > 11 ‘tender-points’) (55,5 vs 16,6%, p < 0.04) en MMF-patiënten vertoonden veel meer betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel, […] (p < 0.01). Deze gegevens geven aan dat MMF en niet-MMF patiënten meer verschillen dan enkel via de simpele detektie van MMF;

(5) significant verband tussen chronische vermoeidheid en MMF in een ‘case-control’ studie bevolen door het Frans medicijnen-agentschap: vermoeidheid was “frequenter en ernstiger bij patiënten met MMF dan zonder MMF”; wat in scherp contrast staat met ziekte-controles, MMF-patiënten hadden opvallend weinig medische antecedenten, wat er verder op duidt dat de gevallen meer van controles verschillen dan louter de detektie van MMF;

(6) zeer consistente funktionele neuro-beeldvorming veranderingen (SPECT & FDG-PET) bij MMF-patiënten, niet toe te schrijven aan chronische pijn of depressie, aangevend dat MMF wordt gedetekteerd in een homogene subset patiënten met stereotype aandoening;

(7) perfekte overéénkomst van het MMF-syndroom met het GWI multi-symptoom complex dat uniek geassocieerd bleek met blootstelling aan vaccins bij militair personeel dat niet werd ingezet in de Perzische Golf.

Samengevat: MMF wordt typische gedetekteerd bij volwassen patiënten met een homogene subset post-vaccinale M.E./CVS.

6. M.E./CVS en verwante aandoeningen na toediening van HPV-vaccins

6.1. Huidige discussies

In afwezigheid van een schouderspier-biopt dat zou kunnen bepalen of lang-bestaande MMF aanwezig was of niet, heeft een aantal artikels melding gemaakt van combinaties van myalgie, arthralgie, chronische vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, niet-verfrissende slaap en neurovegetatieve [met betrekking tot het autonome zenuwstelsel] veranderingen (die voldoen aan de internationale criteria voor M.E./CVS, fibromyalgie, POTS, CRPS of worden beschreven als somatoforme manifestaties) die geassocieerd zijn met de toediening van meerdere injekties van Al-adjuvant bevattende vaccins in Australië, Canada, Denemarken, Italië, Israël, Japan, Mexico en de V.S. Of dergelijke associaties een mogelijk causaal verband kunnen vaststellen heeft geleid tot voortdurende controverse.

Er dook voor de eerste controverse op na de HBV-vaccin campagne, parallel met M.E./CVS [zie Agmon-Levin N & Shoenfeld Y. hierboven] en Multipele Sclerose (M.S.), die occasioneel samen voorkomen na immunisatie. De meeste epidemiologische studies konden de weergaloze stijging qua post-HBV immunisatie M.S.-claims niet substantiëren maar deze korte-termijn studies hielden geen rekening met de ‘t’-factor – er werd gewezen op de mogelijkheid voor een vertraagde start van klinische symptomen na HBV-immunisatie: in een unieke ‘case-control’ studie uitgevoerd op lange-termijn bij de Britse bevolking werd een verhoogd risico op M.S. gevonden […] in de 3 jaar na HBV-vaccinatie. Interessant: er was geen verhoogd risico tijdens het eerste jaar […], zoals gerapporteerd in eerdere korte-termijn studies, maar het verhoogd risico op het ontwikkelen van M.S. kwam naar boven op 2 en 3 jaar na immunisatie […]. Dit resultaat is in overéénstemming met de gemelde toename van de incidentie van M.S. in Frankrijk na de HBV-immunisatie campagne.

Daarna steeg de controverse ten top door de discussie omtrent de veiligheid van HPV-vaccins. Zoals het HBV-vaccin geassocieerd bleek met een disproportioneel hoge mate van signalisering van AEFIs vergeleken met andere vaccins (bv. 5-voud voor M.S.), waren HPV-vaccin programma’s in verschillende delen van de wereld geassocieerd met een 10 maal hogere incidentie van gesignaliseerde AEFIs vergeleken met andere vaccins. Post-HPV vaccinatie AEFIs hadden betrekking op ca. 1 per 1000 inoculaties in Spanje en 1 per 1000 gevaccineerden in Canada. HPV-vaccin waarborgen werden echter gesteund door internationale gezondheid-agentschappen (EMA, WHO) en later de ‘Cochrane collaboration’.

Niettemin werd kritiek geleverd, wijzend op belangen-conflicten van de industrie en de openbaring van talrijke methodologische gebreken bij HPV-vaccin veiligheid-studies zelf en de systematische reviews die een basis geven aan institutionele geruststellende claims.

6.2. Beperkingen van epidemiologische studies aangaande M.E./CVS bij ontvangers van HPV-vaccinatie

Voor het huidig overzicht onderzochten we in detail twee studies die er op wezen dat er geen bewijs is dat het voorkomen van M.E./CVS bij HPV-gevaccineerde meisjes anders is dan verwacht voor dezelfde leeftijd-groepen [Donegan K et al. Bivalent human papillomavirus vaccine and the risk of fatigue syndromes in girls in the UK. Vaccine. (2013) 31: 4961-7 /// Feiring B et al. HPV vaccination and risk of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: A nationwide register-based study from Norway. Vaccine. (2017) 35: 4203-12].

Donegan et al. [hierboven] analyseerde het voorkomen van M.E./CVS bij Britse meisjes die werden geïmmuniseerd met het bivalent HPV-vaccin (Cervarix®) dat Al-hydroxide gemengd met 3-O-desacyl-4’-monofosforyl lipide-A bevat. In het eerste deel van hun studie, t.t.z. “geobserveerd vs. verwacht analyse”, overwogen de auteurs dat onder-rapportering kan variëren van 0% tot 90%. De onder-rapportering van nadelige reakties op medicijnen ligt echter hoger (mediaan 94% gevonden bij 37 studies in een systematisch overzicht, inclusief een maximum van 98% in het V.K.); gelijkaardige onder-rapportering geldt ook voor vaccins. Bovendien was de hoogste (90%) onder-rapportering hypothese getest door Donegan et al. geassocieerd met een opvallend boven-de-drempel signaal voor M.E./CVS bij Cervarix®-recipiënten. De auteurs weerhielden dit resultaat niet en verkozen om te focussen op lagere (< 75%) niveaus van onder-rapportering die niet gepaard gingen met een verhoogd signaal. Dit is een zeer betwistbare keuze gezien het gedocumenteerd falen aangaande de beoordeling van M.E./CVS-symptomen bij HPV-gevaccineerden, vaccin-schade en M.E./CVS zijn nl. concepten waartegenover het medisch establishment over het algemeen vijandig blijft.

In het tweede deel van hun studie, t.t.z. “reeks zelf-gecontroleerde gevallen”, schatten de auteurs het risico voor M.E./CVS in het jaar na de eerste Cervarix®-injektie (de eerste van drie gegeven over 6 maanden) en schonken geen aandacht aan andere Al-bevattende vaccins. De gerapporteerde tijd tot de nadelige effekten na de eerste HPV-vaccin dosis varieerde echter van 1 dag tot 51 maanden (gemiddeld 10,7 ± 11,6 maanden) bij een reeks van 72 Japanese meisjes en van 1 dag tot 43 maanden (gemiddeld 14,0 ± 11,6 maanden) bij een andere reeks van 35 meisjes. Op dezelfde manier was de mediane tijd tot de aanvang van de eerste symptomen “11 tot 12 maanden na de laatste Al-hydroxide bevattende vaccin-toediening” bij onze M.E./CVS-patiënten, wat het waarschijnlijk maakt dat een substantieel aantal M.E./CVS-patiënten mogelijks gelinkt is met een gemiste Al-hydroxide bevattende Cervarix®-injektie in de studie door Donegan et al., zelfs wanneer het risico-venster werd uitgebreid tot 18 maanden (d.i. ongeveer 12 maanden na de laatste inspuiting, een periode waarna bijna 40 % van onze MMF-patiënten hun eerste symptomen ontwikkelden). Tenslotte geloofden de auteurs dat er “geen reden” was “om te denken dat meisjes met vermoeidheid-syndroom minder waarschijnlijk HPV-vaccinatie zouden moeten krijgen”, wat een ‘healthy vaccinnee bias’ uitsluit. Dit getuigt niet van een goede praktijk op het gebied van vaccin-veiligheid wetenschap. Het is goed vastgesteld dat onderliggende aandoeningen die voorbestemmen tot medische uitkomsten waarvan wordt gedacht dat het nadelige effekten van vaccins zijn, gelinkt blijken met een lagere vaccin-opname. Bv.: de opname van HPV-vaccin daalde van 82,3% naar 39,4% wanneer Noorse meisjes de diagnose van M.E./CVS kregen voorafgaandelijk aan immunisatie [zie Feiring et al. hierboven]. Dit is een belangrijke bias [vooringenomenheid/bevooroordeling], benadrukt door experten van het ‘Japan Institute of Pharmaco-vigilance’ en van de CDC die stelden dat “studies onvoldoende voor ‘healthy vaccinnee bias’ controleren zodat er een tendens is tot onderschatting van de reëele risico’s geassocieerd met vaccinatie”. [Het feit dat gezonde mensen er meer voor kiezen te worden gevaccineerd dan mensen met chronische ziekten (die vaccinatie-risicos willen vermijden) en het feit dat mensen die voor vaccinatie kiezen, neigen naar een beter dieet, meer bewegen of regelmatiger medische testen; geven aanleiding tot ‘healthy user bias’ (HUB) of ‘healthy user effect’ in vaccin-studies.]

Feiring et al. [zie hierboven] bestudeerden het quadrivalent HPV-vaccin (Gardasil®) waaraan amorf Al-hydroxy-fosfaat-sulfaat is toegevoegd […] dat significant verschilt van Al-hydroxide. De studie vond dat mensen die meer risico lopen op het ontwikkelen van M.E./CVS de neiging hadden het vaccin te vermijden. Ondanks deze ‘healthy vaccinee bias’, bleven de auteurs betrouwen op hun bevinding dat er geen toename van M.E./CVS zou zijn bij gevaccineerde vs niet-gevaccineerde meisjes (na aanpassing voor leeftijd), omdat er geen hogere toename van M.E./CVS was bij meisjes dan bij jongens, terwijl enkel meisjes het HPV-vaccin hadden gekregen. Inderdaad: er werd een gelijkaardig verhoogd aantal M.E./CVS gevonden bij meisjes en jongens tijdens de studie-jaren; wat onverklaard bleef. De mogelijke betrokkenheid van andere vaccins toegediend aan beide geslachten bij deze toename werd klaarblijkelijk niet geëvalueerd. Een ander punt van kritiek ligt in de uitdaging omtrent het onderscheiden van co-morbide aandoeningen van M.E./CVS. Gerapporteerde nadelige effekten aangaande Gardasil® waren gefragmenteerd in meerdere sub-categorieën zoals POTS, CRPS, somatoform syndroom, dysautonoom syndroom, M.E./CVS, fibromyalgie, HPV-vaccin syndroom en HPV-vaccinatie geassocieerd neuro-immunopathisch syndroom (HANS). Het kan daarom misleidend zijn idiopathische M.E./CVS te vergelijken met het HPV-vaccin syndroom, aangezien de symptomen slechts gedeeltelijk co-morbide zijn met M.E./CVS. De verscheidenheid en inaccurate benoemingen van nadelige gebeurtenissen van HPV-vaccins wordt beschouwd als een belangrijk obstakel bij de rapportering.

Op te merken: MMF-syndroom – dat wordt veroorzaakt door een adjuvant dat substantieel verschilt van Al-hydroxy-fosfaat-sulfaat (AAHS) – is veel minder polymorf dan het HPV-vaccin syndroom. POTS en CRPS worden bijna nooit gedocumenteerd in de setting van MMF. In de setting van HPV-vaccinatie, werd de traditionele observationele epidemiologische benadering ingewikkeld door het ontbreken van een definitie voor de multipele symptomen die het signaal vormen, wat nieuwe epidemiologische benaderingen zeer wenselijk maakt.

Bijvoorbeeld: het ‘Uppsala Monitoring Centre’ ontwikkelde een nieuwe, door gegevens gestuurde cluster-analyse van HPV-vaccin rapporten in Vigibase®, de internationale database van de WHO, die natuurlijke groeperingen identificeerde op basis van termen die worden gebruikt om AEFI te melden. De analyse onthulde clusters van ernstige AEFI die frequenter worden gemeld in HPV-vaccin rapporten vergeleken met non-HPV vaccin rapporten bij hetzelfde geslacht en leeftijd. Ze omvatten hoofdpijn, duizeligheid, vermoeidheid en syncope die soms diagnostische labels als POTS, CRPS en M.E./CVS bevatten maar waarvan dikwijls expliciete diagnoses ontbraken; wat wijst op uitgesproken onderschatting van het signaal bij traditionele ‘post-marketing’ veiligheid-evaluatie.

In Japan analyseerde men de tijdsverdeling van de AEFI op bevolkingsniveau, en toonde dat de piek van aanvang van post-vaccinatie syndroom de piek-periode van HPV-vaccinatie volgde en er geen nieuwe gevallen werden gezien na 14 maanden terugtrekking van de regeringsaanbeveling voor HPV-vaccinatie.

Een andere benadering was gebaseerd op zorgvuldige analyse van of HPV-vaccin gerandomiseerde proeven door Spaanse onderzoekers: naast meerdere verontrustende resultaten, wezen die op het verbijsterend feit dat pre-licentie gerandomiseerde proeven bijna altijd vergeleken worden met Al-adjuvants ontvangende groepen – niet met inerte placebo’s. De enige dubbel-blinde test aangaande quadrivalent HPV-vaccin die inerte zout-oplossing als placebo gebruikte, toonde 0,4% (5/1.165) ‘serious adverse events’ bij HPV-gevaccineerde individuen t.o.v. geen enkel (0/584) voor de groep met inerte placebo. Geen enkele van deze effekten werd als vaccin-gerelateerd beschouwd, maar een potentiële rol van Al-adjuvanten werd verder gesuggereerd door de grootste Gardasil® proef waarbij het krijgen van het 9-valent vaccin met 500 µg Al-adjuvant AAHS geassocieerd was met significant meer lokale en systemische effekten, vergeleken met het 4-valent vaccin dat slechts 225 µg AAHS bevat. Een dergelijk veiligheid-onevenwicht tussen de twee Gardasil® vaccins – suggestief voor een dosis-effekt – werd recent bevestigd door een FDA-rapport dat meer injektie-plaats reakties, Multipele Sclerose en spontane abortus met het 9-valent [tegen 9 HPV-types] Gardasil® vaccin toont.

7. Inzichten door experimentele studies

Naast beperkingen van epidemiologische benaderingen is het onvoldoende begrijpen van de biologische mechanismen die aan de basis liggen van ‘vaccine adverse effects’ een belangrijke factor die de beoordeling van causaliteit hindert. Dit zette het ‘Institute of Medicine’ aan te verklaren dat “de waarde van de dialoog tussen epidemiologische en mechanistische benaderingen kan worden overschat. Deze conversaties tussen verschillende types research kan moeilijk zijn, maar de resultaten zijn het waard.”.

Inderdaad: de geschiedenis van vaccins heeft grotendeels op een empirische basis voortgebouwd tijdens de laatste eeuw. Dit was specifiek het geval voor de Al-adjuvanten die voor het eerst werden geïntroduceerd in vaccins in 1926 maar in zeer geringe mate aan de algemene bevolking toegediend bleven tot 1985, wanneer ze massaal werden geïnjekteerd samen met de introductie van Al-bevattend DTP, HiB [Haemophilus influenzae type-b meningitis], HBV, HAV, pneumoccocus, meningoccocus, HPV en andere vaccins. Dit werd gedaan zonder duidelijke kennis omtrent het lot van het geïnjekteerd Al-adjuvant en, sindsdien, werd zeer weinig inspanning gedaan om de kwestie te verduidelijken. Daarom werden de klassieke hypotheses omtrent het lot van geïnjekteerd Al-adjuvant in ons lab getest in muis-modellen.

7.1. Oud dogma onderste-boven gezet

Er werd geloofd dat eens in het weefsel geïnjekteerd, Al-adjuvanten en de vaccin-antigenen adsorbeerden op hun oppervlak om een extracellulair depot te vormen op de plaats van de inspuiting; er werd gedacht dat daarna progressieve solubilisatie van de adjuvant-partikels plaatsvond, gemedieerd door Al-chelerende zuren [chelatie = chemische complexvorming] aanwezig in het interstitieel vocht, wat een graduele desorptie van het vaccin-antigen en het geobserveerd adjuvant-effekt veroorzaakte. In het kader van dit vooroordeel werd geclaimd dat de onschadelijkheid van Al-adjuvant kon worden afgeleid via de kleine hoeveelheid geïnjekteerd Al en z’n snelle eliminatie in de urine. Geen enkele van deze dogmatische hypotheses bleek correct na experimentele testen in ons lab.

We toonden eerst dat, in tegenstelling to wat eerder werd geloofd, dat in de spier ingespoten Al-hydroxide partikels niet worden gesolubiliseerd in het interstitieel vocht en Al uit het vaccin wordt niet snel geëlimineerd in de urine: in plaats daarvan wordt deze bijna onoplosbare stof snel gevangen door cellen van de monocyten-/macrofagen-familie en blijft na injektie in dieren bestaan binnen deze cellen; tot meer dan 15 jaar bij sommige mensen met MMF. Zoals hierboven en (zie 5.1.2.) hieronder (zie 7.2.2.) vermeld, zijn de resultaten van de enige experimentele studie aangaande de toxicokinetiek van Al-adjuvanten incompatibel met vlugge biodispositie en eliminatie via de nieren van vaccin-Al. Daarnaast zijn de theoretische modellen gebaseerd op Flarend’s vooroordelen en korte-termijn resultaten gebrekkig. Bijvoorbeeld: er werd een model voorgesteld om het risico van Al-vaccins bij kinderen te bepalen, door te refereren naar een oraal minimaal risico-niveau (MRL), geëxtrapoleerd uit dier-studies. Ze bekeken enkel gesolubiliseerd Al, met foutieve berekeningen van de absorptie-duur. Systemische Al-partikel diffusie en neuro-inflammatoire effekten werden weggelaten. De MRL die ze gebruikten was ongeschikt (oraal Al-lactaat vs. geïnjekteerd Al-adjuvant) en te hoog op basis van dieren-studies die aangeven dat MRL minstens 7 maal lager moet zijn. Samengevat: systematische analyse van de beschikbare referentie-studies onthulde een compleet falen van hun geruststellende claims en het verplicht maken van nieuwe experimentele studies van Al-adjuvant toxicokinetiek uitgevoerd op lange-termijn en bij een voldoend aantal dieren, onder auspiciën van gezondheid-agentschappen.

We tonen ook dat, in tegenstelling tot de klassieke depot-vorming hypothese, Al-partikels niet volledig gelokaliseerd blijven in het weefsel bij muizen maar in plaats daarvan kunnen uitzaaien in immuun-cellen naar de regionale lymfeknopen, en dan naar meer afgelegen plaatsen en het brein, waar ze zolang persisteren als in de geïnjekteerde spier. De afgelegen organen die collecties van met Al-partikel beladen cellen vertonen, omvatten de regionale lymfeknopen, milt en lever, en de hersenen waar ze binnendringen gebruikmakend van een CCL2-afhankelijk Trojaans-paard mechanisme en van waaruit ze niet recirculeren. Overéénkomstig onze studies, werd getoond dat verwijdering van de vaccin injektie-plaats binnen de 2 uur na toediening geen merkbaar effekt heeft op de immunologische respons bij ratten, wat aangeeft dat het adjuvant z’n effekt uitoefent weg van de injektie-plaats, wat de depot-vorming theorie invalideert. Dit is een belangrijk punt aangezien er een delicaat evenwicht blijkt te zijn tussen de doeltreffendheid van Al-adjuvanten en hun potentiële toxiciteit, en deze zouden één en hetzelfde effekt kunnen zijn. De potentiële toxiciteit van Al-adjuvanten hangt vanzelfsprekend af van het feit of het bio-aktief nano-materiaal gelokaliseerd blijft op de injektie-plaatsen of zich eerder verspreidt en accumuleert in afgelegen organen en weefsels. Het laatste blijkt plaats te vinden aangezien de systemische diffusie van Al-adjuvanten, gerapporteerd bij muizen, ook werd gedocumenteerd bij schapen die Al-geïnduceerde granulomas ontwikkelden die blijven bestaan op injektie-plaatsen geassocieerd met gelijkaardige grote macrofagen-infiltraten met verhoogde Al-waarden in de drainerende lymfeknopen.

We toonden tenslotte dat, in tegenstelling met wat eerder werd geloofd over het feit dat de onschadelijkheid van Al-adjuvants kan worden afgeleid van de lage hoeveelheden Al3+ geïnjekteerd met vaccins (“de dosis maakt het gif” paradigma), dat neurotoxische effekten van Al-hydroxide partikels (Alhydrogel®) op een niet-lineaire manier qua dosis-respons reageren met selektieve toxiciteit van de laagste geteste dosis. Vergeleken met hoge concentraties, die geassocieerd waren met spontane vorming van grote partikel-aggregaten en verrassend genoeg geen toxiciteit gaven, veroorzaakten de laagste Al-hydrogel® concentratie selektief cerebrale Al-accumulatie, microgliale aktivatie en lange-termijn neurotoxiciteit bij muizen. Interessant is dat de toxisch lage concentratie kleine agglomeraten vormde ‘met de grote van bakterieën’, die wellicht makkelijker te vangen waren en te transporteren naar afgelegen plaatsen. Het is daarom waarschijnlijk dat de toxiciteit van partikel-adjuvanten opgenomen door immuun-cellen gehoorzaamt aan de specifieke regels van ‘small-particle’ toxicologie eerder dan een simplistische dosis-respons relatie.

Samengevat: onze experimentele resultaten suggereren dat het vasthouden en de lange-termijn bio-persistentie van Al-hydroxide in fagocyterende cellen een eerste vereiste is voor de neuromigratie en neurotoxiciteit in muizen.

7.2. Vergelijken van de toxicologie van verschillende vormen van Al en verschillende types blootstelling is niet correct

Er wordt dikwijls gesteld dat de inname van oraal hoger is dan de hoeveelheid geïnjekteerd Al bij vaccinatie en dat het daarom geen schade kan veroorzaken. Deze oppervlakkige verklaring negeert de uitgesproken verschillen van het lot van Al in de twee situaties.

7.2.1. Oraal Al (initiële waarde 100%): in het geval van een gezonde intestinale barrière, wordt 99,7% van het oraal Al geëelimineerd via de faeces en slechts 0,3% gaat door de barrière, onder atomische vorm, en wordt gebonden door bloed-transporters zoals transferrine, albumine en citraat. Dan wordt > 0,2 % snel geëlimineerd via de urine en de resterende < 0,1% wordt verdeeld over gans het lichaam. Op te merken valt dat lichaamsruimten 41% van de cellen (35 triljoen cellen) beslaat en 59% van de extracellulaire ruimten. Preferentiële Al-verwijdering gebeurt in de extracellulaire matrix van beenderen maar andere organen kunnen ook afzettingen vertonen, voornamelijk extracellulaire. Intoxicatie kan voorkomen op lange-termijn bijzonderlijk in geval van de combinatie van hoge inname bij gewijzigde intestinale barrière en/of nier-insufficiëntie.

7.2.2. Geïnjekteerd Al-hydroxide (initiële waarde 100%): in tegenstelling tot oraal Al, gaat 100% van het initieel adjuvant door de natuurlijke barrière via de naald en bereikt het intern milieu. Het Al is in een slecht-oplosbare partikel-vorm. Niet meer dan 6% van het geïnjekteerd Al wordt snel geëlimineerd via de urine, de resterende 94% wordt gretig gevangen door macrofagen en naar afgelegen organen getransporteerd waar Al-partikels voornamelijk intracellulair blijven. Dus, in tegenstelling tot oraal Al, diffundeert zeer weinig van het ingespoten Al naar de extracellulaire ruimten, het overgrote deel wordt selektief en erg geconcentreerd in een kleine fraktie van de fagocyterende cellen (één van de 200 cel-types van het lichaam, die ca. 3% van het lichaamsgewicht vertegenwoordigen. Deze incorporatie in fagocyterende cellen beperkt de extracellulaire solubilisatie van de partikels en induceert lang-termijn overleving in de cellen. De zeer trage solubilisatie van Al-adjuvant partikels, bijzonderlijk Al-hydroxide, maakt dat de bepaling van Al bloed-waarden bijna nutteloos om Al-adjuvant toxiciteit te bepalen. Wanneer een enkelvoudige dosis adjuvant corresponderend met 0,85 mg Al intramusculair wordt toegediend aan volwassenen, wordt een toename van de Al-concentratie in het plasma van 0,8% verwacht, wat gemaskeerd wordt door de Al-achtergrond als een adjuvant gelabeld met het isotoop 26Al wordt gebruikt. Om dezelfde reden is de spontane cumulatieve urinaire excretie van Al in de urine een paar dagen na de injektie van Al-hydroxide quasi vlak. Dus: Al-adjuvanten veroorzaken gewoonlijk geen massieve intoxicatie door oplosbaar Al zoals eerder werd gedocumenteerd bij patiënten met nier-falen gedialyseerd met Al-bevattend water. In plaats daarvan concentreren de Al-adjuvant partikels zich exclusief in immuun-cellen, een zeer klein deel van het menselijk lichaam, waar ze chronisch hun immunostimulerende adjuvant effekten uitoefenen, tot hun eventuele verwijdering. Als men schat dat de diffusie-ruimte van een lokaal geïnjekteerd adjuvant nauwelijks 1% van de lichaamsruimte overschrijdt vóór solubilisatie van het artikel, dan zou een ruwe berekening aangeven dat een orale dosis Al ca. 1 miljoen hoger moet zijn dan de vaccin-dosis om hetzelfde niveau Al te induceren in fagocyterende antigen-presenterende cellen.

Gespecialiseerde toxicologen zijn er zich nu van bewust dat het vergelijken van de toxicologische eigenschappen van verschillende vormen van Al (oplosbaar vs partikels) toegediend op verschillende manieren (oraal vs intramusculair) incorrect is en, daarom, ontoelaatbaar. Dit vormt een andere reden om “de dosis maakt het gif” regel af te wijzen, om de toxiciteit van Al-hydroxide adjuvant partikels te adresseren.

7.3. Van Al-toxiciteit naar chronische immuun-stimulatie

Meerdere experimentele studies uit de literatuur hebben de potentiële neurotoxiciteit van Al-adjuvanten gedocumenteerd. In een studie induceerde Al-hydrogel® adjuvant, subcutaan geïnjekteerd in muizen aan dosissen die relevant zijn voor de dosis die Amerikaanse GWI-veteranen kregen, motorische gebreken en cognitieve veranderingen geassocieerd met motor-neuron sterfte en een significante stijging van reaktieve astrocyten die duiden op een inflammatoir proces. Daarna werd toxiciteit voor het volwassen of zich ontwikkelend muizen-brein door Al-adjuvant of totale Al-bevattende vaccins gerapporteerd in Canada, Israël en Frankrijk. Op te merken valt dat kleine dieren-studies die toxische effekten tonen van Al-adjuvanten dikwijls als irrelevant worden beschouwd voor de menselijke situatie maar dit is niet het geval voor modellen met grote dieren. Daarom dient te worden benadrukt dat Spaanse dierenartsen hebben gerapporteerd dat multipele Al-bevattende vaccin-toedieningen bij schapen een bifasische neurologische ziekte (inclusief initiële meningo-encefalomyelitis met gedragsmatige veranderingen gevolgd door progressieve spinale neurodegeneratieve wijzigingen) kunnen induceren, wat een onschatbaar model voor het begrijpen van menselijk ASIA biedt. Bovendien bleken meerdere injekties van het adjuvant alleen (Al-hydroxide) – t.o.v. en zoutoplossing als placebo – voldoende om diffusie van Al en granulomas naar de drainerende lymfeknopen te induceren, en de gedrag-veranderingen die worden gezien bij schapen ASIA (inclusief rusteloosheid, aggressie, stereotyp gedrag, isolering van de groep en lethargische toestanden). Injekties met totaal Al-vaccin resulteerde in nog meer uitgesproken effekten dan Al-adjuvant alleen, op lokaal, regionaal en systemisch niveau. Zowel de groepen met het Al-adjuvant alleen als met het totaal vaccin vertoonden merkers voor biologische ziekte, zoals hoge waarden circulerend cortisol, het stress-hormoon, tijdens de winter.

De pathofysiologie van M.E./CVS blijft nog niet goed begrepen maar de klassieke hypothese dat M.E./CVS-patiënten lijden aan een ongeschikte opruiming van pathogenen of toxische stoffen gepaard met immuun-stimulerende effekten [Rosenblum H et al. The common immunogenic etiology of Chronic Fatigue Syndrome: from infections to vaccines via adjuvants to the ASIA syndrome. Infect Dis Clin North Am (2011) 25: 851-63] die leidt tot “langdurige immuun-stimulatie die niet kan worden stopgezet” en gebeurlijke ‘burn-out’ van het immuunsysteem; goed passend bij het bewijsmateriaal dat M.E./CVS-patiënten worden overspoeld met cytokinen tot rond het derde jaar, het tijdstip waarop het immuunsysteem uitgeput raakt en de cytokine-waarden dalen [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: e1400121]. Consistent met patiënten met langdurige M.E./CVS bestudeerd door Hornig et al., vertonen MMF-patiënten typisch immuunsysteem ‘burn-out’ – vastgesteld door significante daling van bepaalde cytokinen in het bloed, met uitzondering van monocyten-chemoattractant CCL2 dat selektief gestegen is.

Er werd aangetoond dat, zelfs bij afwezigheid van initiële inflammatie van het centraal zenuwstelsel, de hersen-microglia op perifere inflammatie reageren door het verhogen van hun aanmaak van MCP-1/CCL2 dat circulerende CCR2 tot expressie brengende monocyten aantrekt. Deze monocyten-influx stuurt met perifere inflammatoire toestanden geassocieerd ziekte-gedrag (vermoeidheid, stemming-aandoeningen, cognitieve dysfunktie en slaap-stoornissen). In de setting van immunisatie wordt MCP1/CCL2 expressie ge-upreguleerd door Al-hydroxide, die waarschijnlijk de respons op vaccinatie stuurt naar T helper 2 immuun-responsen en bevoordeelt de incorporatie van met Al-adjuvant beladen cellen naar de hersenen. Al-hydroxide partikels wekken inflammatie op door het aktiveren van het zogenaamde NALP3-inflammasoom en deze aktivatie medieert vermoeidheid-achtig gedrag bij muizen via neuro-inflammatie. Het hoofd-kenmerk van deze aktivatie is de afgifte van IL-1β, wat (in onze muis-experimenten) werd gedetekteerd bij zowel immuun-cellen en neuronen van de hersenen die beladen zijn met Al-hydroxide partikels. Op dezelfde manier komen chronische pijn syndromen voort uit de hypersensitisatie in de dorsale hoorn van het ruggemerg, en microglia geaktiveerd door een perifeer toegediend adjuvant zoals ‘Freund’s complete adjuvant’ [stimuleert de cel-gemedieerde immuniteit] bleek hyper-sensitisatie te initiëren via de afgifte van IL-1β en andere inflammatoire cytokinen. Dus: Al-adjuvanten die het centraal zenuwstelsel binnenkomen, kunnen de aktivatie van microgliale cellen versterken, getriggerd door perifere inflammatie dat vermoeidheid en pijn opwekt. Het immuunsysteem speelt ook een cruciale rol bij het moduleren van leren en geheugen, en synaptische plasticiteit in de hippocampus is bijzonder sensitief voor neuro-inflammatie. Er werd consistent aangetoond dat neonatale toediening van Al-hydroxide bevattend HBV-vaccin een T helper 2 (Th2) immuun-respons induceert in de periferie, met verhoging van IL-1ß, IL-6 en TNF-α in de hippocampus, en synaptische plasticiteit in de hippocampus hinderen, terwijl neonatale Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccinatie [tegen tuberculose] tegengestelde effekten induceert. Van belang: Al-hydroxide en Al-fosfaat zijn sterke Th2-adjuvanten die waarschijnlijk in synergie kunnen werken met gekende factoren van een Th1 naar Th2 verschuiving van de adaptieve T-cel responsen, inclusief mentale stress, overmatige sympathische stimulatie, te veel glucocorticoïden, hoge waarden vrouwelijke hormonen, immuun-suppressie, chronische infektie of overweldigende mikrobiële belasting. Langdurige Th2-shift werd lang verondersteld aan de basis te liggen van de klinische manifestaties van GWI en er werd consistent immuun-aktivatie met een Th2-shift gedocumenteerd in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Hornig M et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol Psychiatry. (2016) 21: 261-9].

7.4. Toekomstige richtingen die onderzoek verdienen: aangeboren immuun-geheugen en microbioom

7.4.1. Aangeboren immuun geheugen. Bij bijna alle MMF-patiënten manifesteert zich M.E./CVS na multipele immunisaties. De impact van multipele vaccinaties op het immuunsysteem werd zelden onderzocht maar vertegenwoordigt een kritieke kwestie. Er wordt steeds meer aandacht geschonken aan ‘memory’-achtige karkteristieken van aangeboren immuuncellen, inclusief perifere monocyten/macrofagen en hersen-microglia, genaamd getrainde aangeboren immuniteit. [Immuunresponsen worden onderverdeeld in aangeboren en adaptieve. Er werd gedacht dat enkel de laatste aanleiding geven tot immunologisch geheugen. Later werden ook ‘memory’ eigenschappen van de aangeboren immuniteit beschreven. Daarvoor werd de term ‘trained immunity’ bedacht.] Er werd lang geloofd dat, in tegenstelling tot cellen van het adaptief immuunsysteem, monocyten en macrofagen geen immunologisch ‘geheugen’ hebben, en identiek naïef reageren elke keer dat ze worden gestimuleerd. Studies hebben aangetoond dat het aangeboren immuunsysteem zich eigenlijk kan aanpassen aan een langdurig geaktiveerd fenotype door eerdere ontmoetingen met verscheidene mikrobiële of vaccin-stimuli. Na infektie of vaccinatie kunnen monocyten/macrofagen dus funktioneel geherprogrammeerd worden zodat ze een versterkte respons tegen ongerelateerde infekties vertonen. Bijvoorbeeld (zoals hierboven beschreven): BCG-vaccinatie voorkomt tuberculose maar induceert ook niet-specifieke voordelige effekten tegen bepaalde vormen van maligniteit en ongerelateerde pathogenen, en autofagie speelt een sleutel-rol bij deze niet-specifieke effekten. Naast de voordelige effekten van ‘trained innate memory’ kunnen echter evenzeer schadelijke effekten optreden via daaropvolgende immune stimuli die microgliale ‘priming’ veroorzaken, wat neurodegeneratie begunstigt, of via de inductie of het onderhouden van auto-immune en auto-inflammatoire ziekten in geval van opgepaste aktivatie of individuele vatbaarheid. Naar ons weten werd deze kwestie nog niet onderzocht bij M.E./CVS en ASIA.

7.4.2. Microbioom-dysbiose. Immuun-suppressie die typische geassocieerd is met langdurige M.E./CVS, zoals bevestigd is bij MMF-patiënten (zie 7.3.), maakt het mogelijk dat opportunistische ontwikkeling van nog niet geïdentificeerde pathogenen of, meer waarschijnlijk, microbioom-ontregeling kan bijdragen tot M.E./CVS of dit bestendigen. Zoals gesteld in 5.1.3., weerspiegelt lang-bestaande MMF een beperking van de cellen om zich te ontdoen van partikels door de auto/xenofagie machinerie. Individuele beperking van auto/xenofagie verwerking, verbonden met genetische eigenschappen of met veroudering, kan ‘clearance’ van adjuvant-partikels door macrofagen en de inflammatoire respons belemmeren maar het kan op een gelijkaardige manier de ‘clearance’ en immuun-respons op intracellulaire microben beïnvloeden, zoals eerder gedocumenteerd in intestinale epitheliale cellen van patiënten met de ziekte van Crohn en andere IBDs gelinkt met microbioom-dysbiose. In overéénstemming met deze visie lijden MMF-patiënten dikwijls onder abdominale ongemakken en IBD, en hun algemene symptomen kunnen occasioneel verbeteren na antibiotica-therapie. Zowel toediening van L-carnitine als dieet-maatregelen met inname van probiotica lijken van nut te zijn in veel gevallen. Het feit dat klinische symptomen typisch voorkomen na immunisatie bij mensen en schapen, suggereert dat vaccins en hun adjuvanten, gelijkaardig met de verschillende pathogenen die eerder betrokken bleken bij de oorzaak van M.E./CVS, zouden kunnen interageren met verscheidene stressoren om opéénvolgende gebeurtenissen te triggeren die immunologische, metabole, neuro-endocriene en neuro-vegetatieve funkties compromitteren en het lichaam in de richting van een ziekte-toestand duwen (zie figuur hieronder). Mogelijke implicatie van microbioom-dysbiose bij deze gebeurtenissen wordt gesuggereerd door epifaryngitis [ontsteking van de epifarynx, deel van de neus/keel-holte] gedocumenteerd bij Japanese meisjes met door HPV-vaccin geïnduceerde M.E./CVS en door epidemiologisch bewijs dat Franse meisjes die werden geïmmuniseerd tegen HPV een klein maar significant risico op het ontwikkelen van IBD hebben. Merk op: Aluminium per se en mentale stress zijn gevestigde factoren van chronische intestinale inflammatie. Bovendien werd duidelijk getoond bij muizen dat bepaalde microbioom-stammen belangrijke leveranciers zijn van natuurlijke adjuvanten die nodig zijn om een immuun-respons tegen influenza-vaccin op te wekken. Daarom is het niet uitgesloten dat persistente microbioom-soorten de immunologische wijzigingen die werden gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten kunnen induceren [Proal A & Marshall T. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome in the era of the human microbiome: persistent pathogens drive chronic symptoms by interfering with host metabolism, gene expression and immunity. Front Pediatr. (2018) 6: 373], en de zoektocht naar een onevenwicht van microbioom-gemeenschappen bij ASIA-patiënten met of zonder de via bioptie bewezen MMF kan wel eens een rol blijken te spelen in de toekomst.

8. Post-immunisatie M.E./CVS als een kern manifestatie van ASIA

Yehuda Shoenfeld heeft de grote verdienste gehad het concept ASIA te bedenken in 2011. Er werden eerder al opvallende klinische gelijkenissen tussen GWI, MMF-syndroom en M.E./CVS gemeld maar Shoenfeld breidde het concept uit naar de schadelijke effekten van elke stof met adjuvant-eigenschappen, inclusief pathogenen en niet-vaccinale adjuvant-partikels. Microbiële adjuvanten die op een natuurlijke manier aanwezig zijn in pathogenen, waren van de eerste vaccin-adjuvanten, inclusief Mycobacterium-celwanden in ‘Freund’s complete adjuvant’ (waarvan muramyl-dipeptide en trehalose-dimycolaat immunostimulerende molekulen zijn), en het endotoxine van Gram-negatieve bakterieën genaamd lipopolysaccharide (LPS) en z’n adjuvante afgeleide monofosforyl-lipide-A. Silicone-partikels vertegenwoordigen de voornaamste niet-vaccinale minerale partikels met adjuvant-eigenschappen. Patiënten met lekkende silicone borst-implantaten ontwikkelen siliconose – het vrijlaten van silicone-partikels die, zoals microbiële of vaccin-adjuvant partikels, worden opgenomen door macrofagen en vertransporteerd naar lymfoïde organen, en zich manifesteren als een ziekte-complex dat lijkt op M.E./CVS [zie Rosenblum H et al. hierboven]. Shoenfeld stelde dat de meeste ASIA-patiënten M.E./CVS hebben. Er is echter een tendens om het ASIA-concept uit te breiden naar immuun-ziekten buiten M.E./CVS: auto-immune ziekten met post-vaccinale aanvang onset zoals Sjögren’s syndroom [chronische reumatische systemische auto-immuunziekte], narcolepsie [slaap-waakstoornis], antifosfolipiden syndroom [kan leiden tot trombose] en primair eierstok-falen, alsook lymfoma. Het is waar dat mensen met idiopathische M.E./CVS (tot ca. 60 %) kunnen lijden onder auto-immune responsen [European Network on ME/CFS (EUROMENE). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-609] en dat ASIA gelijkenissen vertoont met ongedifferentieerde bindweefsel-ziekte. Het is ook waar dat M.E./CVS geassocieerd is met een verhoogd risico op lymfoma en dat het dramatisch aantal immuun-aandoeningen dat wordt gezien bij Italiaanse militairen (waaronder lymfomas, leukemieën en auto-immuun ziekten), verbonden is met sub-optimale vaccin-praktijken (zoals 5 vaccin-inspuitingen tegelijkertijd). Een Italiaans Senaat-commité heeft de gecumuleerde hoeveelheid non-antigenische vaccin-stoffen die Italiaanse militairen kregen berekend: Al-adjuvanten (7,65 mg corresponderend met 2,57 mg Al), 44 hulpstoffen en 47 contaminanten; dit ligt boven de officiële veiligheid-drempel. Het te ver uitbreiden van het terrein van ASIA loopt echter een groot risico op het vervagen van het kernbeeld. De initieel voorgestelde definitie van ASIA is waarschijnlijk te los en blijft daarom onderwerp van discussie ondanks het extreem praktisch nut: de erkenning dat gelijkaardige klinische beelden gezien kunnen worden bij patiënten blootgesteld aan een waaier van immuun-stimulerende stoffen.

Of post-vaccinale M.E./CVS een authentieke auto-immuun ziekte vertegenwoordigt, zoals de term ASIA suggereert, is ook nog niet volledig vastgelegd. Er werd een aantal auto-antilichamen gerapporteerd bij patiënten met idiopathische POTS en M.E./CVS [zieEuropean Network on ME/CFS (EUROMENE)’ studie hierboven]. In een subset van deze patiënten zijn de auto-antilichamen specifiek gericht tegen neurotransmitter-receptoren aanwezig in het sympathisch zenuwstelsel (incl. ß2 adrenerge receptoren, muscarine-3 en -4 acetylcholine receptoren) en wellicht spelen ze een rol bij de klinische manifestaties zoals gesuggereerd door immuun-absorptie studies [Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove ß2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS One. (2018) 13: e0193672]. Ook B-cel depletie d.m.v. anti-CD20 (rituximab) bleek geassocieerd met volgehouden klinische responsen in een subgroep patiënten met idiopathische M.E./CVS [ondertussen sterk in vraag gesteld]. Wij vonden ook geen melding in de literatuur over detektie van specifieke anti-neuroceptor auto-antilichamen bij post-vaccinale M.E./CVS en zeer weinig bij post-vaccinale POTS. Onze MMF-patiënten hadden onstandvastig lage titers van courante circulerende auto-antilichamen: voornamelijk antinucleaire antilichamen die werden gedetekteerd bij ca. 30% van de patiënten (laag-gradige auto-immuniteit). Daarnaast had een minderheid MMF-patiënten (10-20%) goed gedefinieerde gelijklopende auto-immune aandoeningen (M.S., thyroiditis, dermatomyositis [spierontsteking-ziekte met typische huidafwijkingen], enz.). We herinneren ons niet MMF-gevallen te hebben gezien die evolueerden van pure initiële M.E./CVS naar voldragen specifieke auto-immuun ziekte. Het is daarom niet uitgesloten dat specifieke auto-immuniteit enkel voorkomt in een subset post-immunisatie M.E./CVS-patiënten, vermoedelijk te wijten aan individuele vatbaarheid om een auto-immuun ziekte te ontwikkelen of een specifieke, mogelijks opportunistische, antigen-aanval. Bijvoorbeeld: er werd gesuggereerd dat persisterende microbioom-pathogenen immunologische wijzigingen kunnen induceren bij M.E./CVS-patiënten (incl. veranderde NK-cel funktie, klonale T-cellen en auto-antilichamen) [zie Proal A hierboven]. Tot op heden blijft de rol van specifieke auto-antilichamen tegen neurotransmitter-receptoren – hoewel ze een fascinerende nieuwe kwestie betekenen bij M.E./CVS – ongrijpbaar bij post-immunisatie M.E./CVS. Niettemin heeft het ASIA-concept meer en meer aan populariteit gewonnen bij menselijke en dierlijke medische gemeenschappen: meer dan 4.000 gerapporteerde gevallen in de literatuur – wat er op wijst dat aan een kritieke nood werd voldaan.

9. Een poging tot pathofysiologisch model

Er wordt erkend dat post-infektueuze vermoeidheid optreedt bij ongeveer één op tien mensen die geïnfekteerd raken met het Epstein-Barr virus of Coxiella burnetti (de veroorzaker van Q-koorts) en in een aantal patiënten geïnfekteerd met enterovirussen, Borrelia burgdorferi en andere infektueuze agentia. Langdurige persistentie bleek herhaaldelijk langdurige immuun-aktivatie en M.E./CVS-achtig syndroom te veroorzaken. Zowel menselijke MMF en relevante kleine/grote dieren-modellen geven aan dat hetzelfde geldt voor M.E./CVS volgend op toediening van Al-adjuvanten die ongewoon lang in immuun-cellen blijven.

M.E./CVS heeft een extreem ingewikkelde pathofysiologie die meerdere systemen beïnvloedt. We verwijzen de lezer naar excellente uitgebreide artikels omtrent elk van de aangetaste systemen en hun interakties. In feite is M.E./CVS geassocieerd met: (1) immuunsysteem abnormaliteiten inclusief verstoorde ‘natural killer’ cel funktie en/of T-cel funktie, eerst verhoogde en dan gedaalde aanmaak van inflammatoire cytokinen en occasionele toename van enkele auto-antilichamen; (2) abnormaliteiten van het cellulair metabolisme met verstoord vermogen om energie te produceren uit zuurstof, glucose, vetzuren en aminozuren, geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en gereduceerd oxidatief metabolisme; deze veranderingen veroorzaken een abnormale respons op inspanning en bootsen een hibernatie-toestand na [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016) 113: E5472-80]; (3) neuro-endocriene en neurovegetatieve verstoringen inclusief ontregeling van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as (HPA-as) en, bijzonderlijk bij adolescenten, orthostatische intolerantie met abnormale bloeddruk- of hartslag-regeling.

10. Besluit

Adjuvant-veiligheid is een “belangrijk en verwaarloosd gebied”, dat lijdt onder zowel verkeerde opvattingen omtrent Al-adjuvant toxicokinetieken en gebrek aan populatie-studies die verbanden evalueren tussen blootstelling aan Al-adjuvanten en klinische uitkomsten.

M.E./CVS is een multifactoriële aandoening met een belangrijke impact op de publieke gezondheid en van klinisch belang. Er is bewijsmateriaal opgedoken voor het feit dat M.E./CVS een belangrijke type AEFI kan zijn, dit gebeurde traag door de verscheidenheid, het schijnbaar gebrek aan specificiteit, de vertraagde aanvang en frequente medische onderschatting van de symptomen, allemaal kenmerken die ook deel uitmaken van de verklaringen voor de “inherente methodologische beperkingen van epidemiologische studies” op het gebied van vaccin-veiligheid (zie 4.2.). Gelukkiglijk heeft een goed uitgevoerde epidemiologische studie met gevaccineerde vs ongevaccineerde individuen sterk bewijsmateriaal voor post-immunisatie M.E./CVS geleverd. Diepgaande klinische analyse van patiënten met post-immunisatie M.E./CVS heeft zeer consistente cognitieve en funktionele neuro-beeldvorming veranderingen onthuld. De biologische geloofwaardigheid van een verband tussen toediening van adjuvant-partikels en M.E./CVS werd ondersteund door lang-persisterend Al-adjuvant in immuun-cellen van aangetaste individuen (vastgesteld via MMF-detektie in spier-biopt) en door Al-adjuvant transport naar afgelegen organen (gedocumenteerd bij kleine en grote dieren-modellen) met langdurige immuun-stimulerende en ‘low dose’ neurotoxische effekten.

Deze gegevens, die passen bij het ASIA-concept, hebben reeds geholpen recht te spreken voor schade-compensatie in de V.S. en Frankrijk, waar de hoogste administratieve rechtbank besliste 8 van onze patiënten te compenseren voor de gevolgen van verplichte vaccinatie die ze voor professionele redenen hadden ondergaan. We hopen dat dit solide bijkomende epidemiologische en basis-research studies zal triggeren aangaande Al-adjuvanten en hun toxiciteit, individuele vatbaarheid factoren en bevredigende alternatieven voor Al-adjuvanten. Er werden reeds meerdere efficiënte biodegradeerbare adjuvanten zonder schadelijke metalen geïdentificeerd [calcium-fosfaat, adjuvant-systeem AS01, microcrystalien tyrosine].

[Figuur uit ‘European Network on ME/CFS (EUROMENE)’ studie hierboven] Verschillende veranderingen gestuurd door immuun-ontregeling die kunnen worden veroorzaakt door vaccin of adjuvant-partikels in vatbare individuen en waarschijnlijk de kern vormen van ASIA-pathofysiologie: net zoals persistente natuurlijke pathogenen kunnen ze immuunsysteem-ontregeling induceren en de metabole, neuro-endocriene en autonome stoornissen die aan de basis liggen van M.E./CVS-symptomen. Het is waarschijnlijk dat een reeks risico-factoren bijdragen.

maart 17, 2019

Veranderingen in het transcriptoom van circulerende immuun-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:29 am
Tags: , , , , , , , ,

Het onderzoeken van het transcriptoom, de verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’, tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen, gebeurt in onderstaande studie via sequentiebepaling van dat RNA. Dit kan bv. worden gehaald uit totaal-bloed of uit bepaalde cel-populaties (bv. perifeer bloed mononucleaire cellen – PBMCs).

Een Noorse onderzoeksgroep (Nguyen CB et al. – ref. zie hieronder) voerde een studie uit a.h.v. bloed van adolescenten met ‘cvs’. Hun resultaten suggereren de mogelijke betrokkenheid van neuro-immune ontregeling. De publicatie (mede gefinancierd door de ‘Associated New Zealand ME Society’, ANZMES) hieronder (over M.E.(cvs)-patiënten uit Nieuw-Zeeland) beschrijft volgens de auteurs de eerste RNA sequentie-analyse op basis van PBMCs. Ze toonden de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress. Resultaten die gelijklopen met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire (maar niet identieke) studies. Wederom aanduidingen voor consistentie van de bevindingen omtrent M.E.(cvs) en het feit dat dit wel degelijk een echte medische aandoening is.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology Volume 33: 1-8 (2019)

Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eiren Sweetman (1), Margaret Ryan (2), Christina Edgar (1), Angus MacKay (1), Rosamund Vallings (3), Warren Tate (1)

1 Department of Biochemistry, University of Otago, Dunedin, New Zealand

2 Department of Anatomy, University of Otago, Dunedin, New Zealand

3 Howick Health & Medical Centre, Auckland, New Zealand

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een slecht begrepen ziekte die 0,2%-2% van de wereld-bevolking treft. Om inzicht te verkrijgen in de pathofysiologie van M.E./CVS in Nieuw-Zeeland, onderzochten we de transcriptomen bij een kleine maar goed gekarakteriseerde groep patiënten (n = 10), en voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles (n = 10). Er bleken 27 gen-transcripten 1,5 tot 6 maal verhoogd en 6 bleken 3 tot 6 maal verlaagd in de patiënten-groep (P < 0.01). De meest verhoogde gen-transcripten, IL8, NFΚBIA & TNFAIP3 zijn funktioneel verbonden met inflammatie, en significante veranderingen werden gevalideerd voor IL8 & NFΚBIA d.m.v. kwantitatieve polymerase-ketting-reaktie (qPCR). Een funktionele netwerk analyse [FNA] van de gewijzigde gen-transcripten (P < 0.01) detekteerde interakties tussen de produkten gerelateerd met inflammatie, circadiaanse klok funktie, metabole ontregeling, cellulaire stress-responsen en mitochondriale funktie. ‘Ingenuity pathway analysis’ [IPA; software om expressie-profielen te analyseren] (P < 0.05) biedt verdere inzichten in de dysfunktionele fysiologie, en markeerde stress en inflammatie mechanismen. Deze analyse levert nieuwe inzichten in de molekulaire veranderingen bij M.E./CVS en draagt bij tot het begrijpen van de pathofysiologische mechanismen van de ziekte.

Inleiding

[…] Hoewel de pathofysiologie van M.E./CVS nog steeds slecht wordt begrepen, wordt als hypothese gesteld dat diepgaande ontregeling van het centraal zenuwstelsel en immuunsysteem, dysfunktie van het cellulair energie metabolisme en cardiovasculaire abnormaliteit belangrijke rollen kunnen spelen bij de pathofysiologie van de ziekte.

Er werden een aantal M.E./CVS immuun-cel gen-expressie studies gepubliceerd. Gezamenlijk hebben ze verstoringen geïdentificeerd in mechanismen verbonden met immune, neuronale, mitochondriale en metabole funktie, maar er is weinig consensus over de genen die specifiek differentieel tot expressie komen. ‘High-throughput’ RNA-‘sequencing’ technologie (RNA-seq) werd eerder aangewend om het M.E./CVS transcriptoom te onderzoeken. [Nguyen CB et al. Whole blood gene expression in adolescent Chronic Fatigue Syndrome: An exploratory cross-sectional study suggesting altered B cell differentiation and survival. Journal of Translational Medicine (2017) 15: 102] Onze RNA-seq studie die hier wordt beschreven, focust op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) bij een goed gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten. Er werd gerapporteerd dat PBMCs stabiel zijn en accuraat de biologische verschillen tussen gezonde en zieke individuen weerspiegelen, bijzonderlijk wat betreft immunologische of inflammatoire mechanismen. We identificeerden 27 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep vergeleken met gezonde controles en 6 significant verlaagde gene-transcripten (P < 0.01), en vonden een aanrijking wat betreft stress- en inflammatie-mechanismen, alsook mitochondriale en circadiaanse klok funkties. Deze resultaten geven diepgang aan het bewijs voor een pathofysiologische basis van M.E./CVS.

Methodes

PBMC-isolatie

[…] 10 M.E./CVS-patiënten [mediane leeftijd 36,4; 6 vrouwen & 4 mannen], diagnose volgens de Canadese consensus criteria (CCC). […]

Transcriptoom-analyse

[…]

RT-qPCR validatie. Er werd een validatie van de gen-expressie (RTqPCR) test uitgevoerd voor de 3 meest significant gewijzigde gen-transcripten IL8, NFKBIA & TNFAIP3. […] De genormaliseerde relatieve expressie-waarden van elk gen werden berekend […].

FNA. Differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden getest op funktionele verbanden tussen de gecodeerde proteïnen […]. Er werden FDR [false discovery rate’, aantal vals positieve resultaten] -aangepaste P-waarden berekend voor elk verrijkt biologisch proces.

IPA. Er werden 125 ge-upreguleerde en 40 gedownreguleerde gen-transcripten geanalyseerd (P < 0.05). IPA gebruikt analytische instrumenten om de ‘upstream’ biologische oorzaken en waarschijnlijke ‘downstream’ effekten op de cellulaire biologie te verhelderen. […]

Resultaten en bespreking

In deze RNA-seq transcriptoom-analyse werden op deze kleine maar klinisch goed gekarakteriseerde patiënten-groep de concepten van ‘Precision Medicine’ [medisch model voor de gezondheidszorg; waarbij medische beslissingen, behandelingen, praktijken of produkten op maat van de individuele patient worden gemaakt] met gepaste statistische analyse toegepast. Deze benadering is succesvol gebleken bij groepen patiënten met zeldzame ziekten, waar het aantal beschikbare patiënten gering is. Daarnaast heeft de RNA-seq analyse zelf gepaste sequentiebepaling-diepte om de beperkte grootte van het staal te compenseren.

RNA-seq analyse onthulde een veranderd PBMC-transcriptoom

Een statistische test van genormaliseerde RNA-seq gegevens vond 27 significant verhoogde gen-transcripten en 6 significant verlaagde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (P < 0.01 [lijst beschikbaar]).

qPCR-validatie van gewijzigde gen-expressie

De top 3 van de significant gewijzigde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep werd geëvalueerd d.m.v. RT-qPCR op de studie-groep. De resultaten waren consistent met de RNA-seq gegevens voor IL8 en NFKBIA. IL8 (FC [‘fold change’, hoeveel maal een parameter is veranderd] = 4,8; P = 0.01) & NFKBIA (FC = 2,0; P = 0.05) waren allebei significant gestegen in de patiënten-groep vergeleken met controles. TNFAIP3 was ook gestegen in de patiënten-groep (FC = 2,1; P = 0.19) met een trend naar significantie.

Analyse van de transcriptoom-gegevens

Via FNA & IPA onderzochten we de verrijkte funktionele interakties, en de biochemische en fysiologische mechanismen die werden afgeleid uit de analyse van de differentieel tot expressie komende gen-transcripten bij M.E./CVS.

FNA. De funktionele associatie netwerken van proteïnen gecodeerd door differentieel tot expressie komende gen-transcripten (n = 33, P < 0.01) werden bepaald d.m.v. het STRING portaal [een omvangrijke database van gekende en voorspelde proteïne/proteïne-interakties]. We vonden een significant niveau van netwerk-aanrijking (P-waarde 6.1×10-5) in deze lijst, wat er op wijst dat de gecodeerde proteïnen biologisch verbonden zijn. Er werden sterke funktionele associaties geobserveerd tussen IL8, NFKBIA, TNFAIP3, JUN, NAMPT, CREM, PMAIP1, PPP1R15A, RBBP6, UBE2D3, SOCS3, RIPK2 & ZC3H12A. Er bleken meerdere overtuigende funktionele mechanismen verrijkt door de toegenomen gecodeerde proteïnen [lijst beschikbaar]. Gezamenlijk bekrachtigen deze mechanismen significant immune en inflammatoire over-aktivatie en ontregeling die optreedt bij de pathologie van M.E./CVS.

IPA toont inflammatie en oxidatieve stress bij M.E./CVS. Er werd IPA uitgevoerd op de transcriptoom-gegevens met een significantie van P < 0.05, wat de pool beschikbaar voor de analyse op 125 verhoogde en 40 verlaagde gen-transcripten bracht [lijst beschikbaar]. Deze analyse identificeerde een aantal overlappende, funktioneel onderling verbonden kanonieke mechanismen. De meeste mechanismen waren direct gerelateerd met inflammatoire signalisering en de stress-respons, wat de resultaten van de FNA ondersteunt [lijst beschikbaar]. Gen-netwerken verbonden met oxidatieve stress, inflammatie en zenuwweefsel-schade [lijst beschikbaar] waren ook significant. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat mitochondriale dysfunktie en verstoord energie-metabolisme leiden tot vermoeidheid, malaise, en de courant ervaren spierpijn en cognitieve stoornissen bij M.E./CVS.

Anti-inflammatoire responders op TNFα & NF-κB

De top 3 ge-upreguleerde genen in onze studie – IL8 [coderend voor interleukine-8 (IL-8); neutrofiel-aktiverende factor (NAF), een chemokine], NFKBIA [coderend voor NF-κB inhibitor alfa] & TNFAIP3 [coderend voor tumor necrose factor alfa geïnduceerd proteïne 3; inhibeert NF-κB aktivatie en TNF-gemedieerde apoptose] – zijn vroegere responders op TNF-geïnduceerde NF-κB aktivatie. De proteïnen A20 (TNFAIP3) en IκBa (NFKBIA) maken deel uit van de twee voornaamste negatieve feedback-loops van NF-κB-gestuurde transcriptie. Bovendien is TNFα een krachtige inducer van IL-8 sekretie, via een transcriptioneel mechanisme dat wordt gereguleerd door NF-κB. Stijgingen qua IL-8 en TNFα warden geïdentificeerd in meerdere cytokine- en immune studies bij M.E./CVS. Chronische inflammatie wordt ook versterkt door het NF-κB signalisering mechanisme. De stijging van de expressie van deze 3 gen-transcripten in de M.E./CVS-groep impliceert sterk een aanhoudende biologische respons tegen ongewenste overmatige aktiviteit van NF-κB en inflammatie bij M.E./CVS, aangestuurd door TNFα.

Significante biologische mechanismen verrijkt in de M.E./CVS-groep, geïdentificeerd door FNA & IPA

Het circadiaans ritme. Meerdere gestegen gen-transcripten in de M.E./CVS-groep coderen voor kern-proteïnen die de circadiaanse klok reguleren, het centraal mechanisme dat ons 24h circadiaans ritme aanstuurt. Een verstoord circadiaans ritme kan direct gelinkt zijn met vele van de M.E./CVS-symptomen, zoals pijn, vermoeidheid, slaapstoornissen, griep-achtige symptomen, cognitieve stoornissen, post-exertionele malaise, en dysfunktie van metabole en immuun-systemen. Deze resultaten suggereren dat ontregeling van het circadiaans ritme waarschijnlijk is bij M.E./CVS een plausibele kandidaat kan zijn voor het doen aanhouden van de symptomen en de ernst van M.E./CVS.

Mitochondriale dysfunktie. Mitochondrieën zijn essentieel voor cellulaire energie produktie, metabolisme en het reguleren van stress-responsen. De resultaten van FNA & IPA duiden op mitochondriale dysfunktie, gekenmerkt door tekenen van oxidatieve stress en downregulering van metabole mechanismen. Er zijn 3 significant verhoogde gen-transcripten in de M.E./CVS-groep (PMAIP1, PMPCB & JUN) die belangrijke rollen spelen bij de mitochondriale funktie en apoptotische mechanismen:

1. Ademhaling. Mitochondriale ademhaling kan worden geïnhibeerd door cytokine-veranderingen en oxidatieve stress. Regulering van cytokine-produktie en oxidatieve stress mechanismen bleken beide verrijkt in de M.E./CVS-groep. M.E./CVS-studies vonden belangrijke indicatoren voor mitochondriale dysfunktie, inclusief gedaalde aanmaak van ATP en verstoring van de oxidatieve fosforylatie. Ter ondersteuning van onze analyse: een studie toonde verlaagde maximale respiratie door mitochondrieën in M.E./CVS PBMCs. Ze vonden metabole verschillen die een onvermogen toonden om te voldoen aan de cellulaire energetische vereisten, bijzonderlijk wanneer mitochondrieën onder stress stonden. [Tomas C et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2017)12: e0186802]

2. Downregulering van het metabolisme. FNA toonde verstoorde regulering van meerdere metabole mechanismen in de M.E./CVS-groep, waarvan vele gerelateerd met mitochondrieën. Metabole profilering studies bij M.E./CVS hebben verstoord metabolisme gelinkt met post-exertionele malaise. Belangrijk: een studie onderzocht metabolieten bij M.E./CVS-patiënten en controles, en ontdekte een homogene afname van diagnostische metabolieten bij alle M.E./CVS-patiënten, consistent met hypometabool syndroom. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (2016) 113: E5472-E5480] Aangezien alle geïdentificeerde metabole abnormaliteiten ofwel direct gereguleerd worden door redox of door de beschikbaarheid van NADPH, speculeerde men dat een mitochondriale betrokkenheid waarschijnlijk was. Accumulatie van melkzuur door het verstoord metabolisme kan de pijn in spieren en gewrichten, die wordt gerapporteerd door M.E./CVS-patiënten, verklaren. Bovendien werd gerapporteerd over lactaat-accumalatie in de ventriculaire ruimtes van de hersenen en het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten en dit zou kunnen bijdragen tot de neuro-inflammatoire symptomen van M.E./CVS.

3. Stress-respons. FNA toonde een verhoogde cellulaire stress respons en positieve regulering van apoptotische processen in de M.E./CVS-groep. IPA vestigde de aandacht op de produktie van stikstof-oxide (NO) en reaktieve zuurstof soorten (ROS) in macrofagen. NO- en ROS-produktie, gestimuleerd door TNFα en NF-κß, speelt een centrale rol bij de controle van infekties, en ROS-produktie wordt ook toegeschreven aan geaktiveerd NADPH-oxidase, een component van de mitochondriale elektron-transport-keten. Mitochondrieën komen veel voor in cellen van het centraal zenuwstelsel, waar ze de essentiële energie voor neuronen leveren en daardoor de synaptische plasticiteit beïnvloeden. Oxidatieve stress, veroorzaakt door verhoogd ROS in mitochondrieën, kan aanleiding geven tot cognitieve stoornissen en apoptose [geprogrammeerde cel-dood] – leidend tot mitochondriale DNA-schade en bijdragend tot cognitieve problemen door aantasting van neurotransmissie en Ca2+-homeostase. Van belang is dat veel M.E./CVS-symptomen, zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en myalgie, ook voorkomen bij primair mitochondriale ziekten.

Chronische inflammatie. Aanhoudende inflammatie wordt benadrukt door het M.E./CVS-transcriptoom, waarbij NF-κB en TNFα centraal zijn voor twee primaire kanonieke mechanismen die door IPA als verrijkt voorspeld werden. Zoals eerder vermeld, zijn IL8, NFKBIA & TNFAIP3 componenten van de bepalende aangetaste mechanismen. Het NF-κB aktivatie mechanisme richt zich op een reeks van cytokine- en chemokine-receptoren die vereist zijn voor immune herkenning, antigen-presentering en adhesie-receptoren. Het TNFR2 signalisering mechanisme reguleert de TNFα-aktiviteit via het tegenwerken van de door TNFα geïnduceerde apoptose, bijzonderlijk in sterk geaktiveerde T-cellen. Door LPS gestimuleerd ‘mitogen activated- protein-kinase (MAPK) [‘mitogen activated protein’ (MAP) kinasen reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en reguleren verscheidene cellulaire aktiviteiten, zoals gen-expressie, celdeling, differentiatie en cel-overleving/apoptose] stuurt de inflammatoire respons in macrofage immuun-cellen. Peroxisoom Proliferator Geaktiveerde Receptoren (PPAR) signalisering [PPAR zijn een groep receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] bleek ook aangetast. PPAR-signalisering molekulen reguleren metabole processen in hartspier-weefsel, inflammatie en oxidatieve stress, en faciliteren interakties tussen circadiaanse, metabole (lipiden-metabolisme) en cardiovasculaire mechanismen. Mitochondriale dysfunktie kan verder beïnvloed worden door verhoogde chronische aktivatie van immuun-inflammatoire stress mechanismen. Inflammatoire mediatoren zoals TNFα bleken in vitro geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en gestegen ROS. Een letsel of infektie kan ook leiden tot gecompromitteerde mitochondriale integriteit, wat inflammatie triggert via NF-κB, MAPKs en interferon regulerende factoren, en pathologie bevordert bij een groeiend aantal ziekten.

Deze resultaten bekrachtigen de betrokkenheid van inflammatie, verstoord circadiaans ritme, metabole ontregeling en oxidatieve stress bij M.E./CVS.

Eerdere M.E./CVS-transcriptoom studies ondersteunen inflammatie en mitochondriale betrokkenheid

Voor zover wij weten is dit de eerste RNA-seq analyse van PBMCs bij M.E./CVS-patiënten. Deze technologie werd echter al gebruikt voor een analyse van totaal-bloed bij adolescente M.E./CVS-deelnemers via gen-aanrijking. [zie Nguyen CB et al. hierboven] Onze analyse was consistent met onze bevindingen, suggestief voor verstoring van of B-cel differentiatie en overleving, versterkte aangeboren antivirale responsen en inflammatie. Co-expressie patronen en afzonderlijke gen-transcripten bleken geassocieerd met neuro-endocriene merkers van gewijzigde HPA-as en autonoom zenuwstelsel aktiviteit, plasma-cortisol, en aantallen monocyten en eosinofielen. We vonden significante molekulaire veranderingen in onze M.E./CVS-groep die consistent zijn met deze die werden gerapporteerd in grotere complementaire maar niet identieke studies. Eerdere micro-array [‘genen-chips’] en ‘differential display’ [vergelijken en identificeren van veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau] studies van de gen-expressie bij M.E./CVS hebben verstoringen qua immuun-mechanismen, mitochondriale funktie, cel-stress en apoptose aangegeven. Een ‘micro-array’ onderzoek van PBMCs bij een kleine groep post-infektueuze M.E./CVS mannen door Gow JW et al. [A gene signature for post-infectious Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genomics (2009) 2: 38] identificeerde differentieel tot expressie komende genen met rollen in immuun-modulatie, oxidatieve stress en apoptose, en – van bijzonder belang – vonden gestegen TNFAIP3, ter ondersteuning van onze resultaten. Ook van belang voor onze studie: Zhang L et al. [Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Clinical Pathology (2010) 63: 156-164] identificeerden een differentiële gen-signatuur van 88 genen via ‘micro-array’ analyse, wat verder werd gesubstantieerd door studies bij andere M.E./CVS-groepen. De gen-signatuur liet sub-groepering van de patiënten-groepen toe, en IPA-analyse van de gen-interakties, ziekte-verbanden en funkties identificeerde immunologische ziekte, met kanker gerelateerde cel-sterfte, immuun-respons en infektie mechanismen, alsook links met indicatoren voor Epstein-Barr en enterovirus infektie.

Onze verkennende benadering stelde ons in staat een rijke dataset van genen die differentieel tot expressie komen te verkrijgen, om de biologische veranderingen bij M.E./CVS te onderkennen. We identificeerden ontregeling van het circadiaans als een nieuwe mogelijke onderliggende oorzaak voor de niet-verfrissende slaap, vermoeidheid en metabole abnormaliteiten die worden gezien bij M.E./CVS. Verder biedt verstoorde mitochondriale funktie en de resulterende oxidatieve stress, gekoppeld met chronische immuun-inflammatoire signalisering, een dwingende verklaring voor de vermoeidheid, cognitieve dysfunktie en post-exertionele malaise die wordt ervaren bij M.E./CVS.

Daarom is deze studie een bijkomende stap naar het beter begrijpen van het ziekte-proces en het identificeren van vermeende biomerkers ter ondersteuning van de klinische diagnose. De geïndentificeerde biologische mechanismen bieden een rationele verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van M.E./CVS.

december 1, 2018

Neuroimmune toepassingen van stamcellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Behandeling — mewetenschap @ 7:38 am
Tags: , , , , ,

Pluripotente stamcellen kunnen differentiëren tot cellen van alle drie de kiemlagen (buitenste ectoderm, middenste mesoderm, binnenste endoderm; waaruit de verschillende organen worden gevormd) van het embryo. Deze kunnen op verschillende manier worden verkregen: uit embryo’s, uit foetaal weefsel van afgebroken zwangerschappen, via celkern-transplantatie of therapeutisch klonen en via her-programmering van gedifferentieerde cellen (iPSCs).

Aan het begin van deze eeuw waren er anecdotische meldingen van “behandelingen” op basis van “stamcellen” (Dr Paul Cheney) maar deze bleken weinig gefundeerd en leverden ook niet echt een blijvend resultaat. Stamcel-onderzoek in relatie met M.E.(cvs) blijkt in de V.S. én in Europa weer in de belangstelling te komen van academische researchers…

Victoria Moreno-Manzano is team-leider van het ‘Neuronal and Tissue Regeneration Lab’ wat onderzoek verricht op het gebied van regeneratieve geneeskunde (therapeutische toepassingen van op stamcellen gebaseerde benaderingen). Elisa Oltra Garcia is professor ‘Cell and Molecular Biology’ en haar werk-gebied omvat stamcellen, kanker, fibromyalgie en genetica; ze werkt ook op het ‘European ME/CFS Biomarker Landscape project’ (een initiatief van het ‘European Network on Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’, EUROMENE).

Onderstaande is een deel van het boek ‘Cell Culture’, uitgegeven door IntechOpen; naar eigen zeggen: “the world’s leading publisher of Open Access books”. Dit is een zgn. ‘open toegang’ uitgever van academische boeken. Niettegenstaande een deel van de boeken geïndexeerd is in het gerenommeerde ‘Web of Science’ wordt de uitgever door een deel van de wetenschappelijke gemeenschap als ‘predatory’ (roofzuchtig) beschouwd… Dit hoofdstuk geeft aan wat de hypothetische mogelijkheden van stamcel-therapie bij M.E.(cvs) kunnen zijn.

————————-

IntechOpen Paper 80714 (november 2018)

Culturing adult stem cells for cell-based therapeutics: neuroimmune applications

Victoria Moreno-Manzano (1,3), Elisa Oltra Garcia (2,3)

1 Centro de Investigacion Principe Felipe, Valencia

2 Catholic University of Valencia, Valencia

3 European network EUROMENE

Samenvatting

Pluripotente stamcellen kunnen op een succesvolle manier worden geïsoleerd uit verscheidene weefsels van volwassen organismen. Dit opent de opwindende mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën voor een groot aantal klinische behandelingen. De ontwikkeling van geoptimaliseerde protocollen om cellen te verkrijgen, laten groeien en cryopreserveren, alsook van doeltreffende klinische behandel-procedures is echter geen gemakkelijke opdracht. Het therapeutisch potentieel van cellen die in vitro worden ontwikkeld, hangt af van een veelvoud van factoren (isolatie-procedures, donor- en weefsel-types, expansie- en bewaar-methoden, enz.). Researchers investeren veel moeite om te bepalen welke van deze vele variabelen een significante impact hebben op de ‘downstream’ prestaties van in vitro ontwikkelde stamcellen via het bestuderen van geassocieerde veranderingen in molekulaire profielen en hun effekt op het immuunsysteem van de gastheer. Dit hoofdstuk biedt een overzicht van de huidige toestand wat betreft de produktie van stamcellen en afgeleiden daarvan, welke het pad effenen voor verschillende behandelingen. Door de onderzoek-interesses van onze laboratoria, wordt een bijzondere nadruk gelegd op de potentiële voordelen van stamcel-gebaseerde therapeutica voor de behandeling van ruggemerg-letsels en de neuro-immuun ziekte Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) niet enkel door differentiatie- en cel-transplantatie mechanismen maar ook omwille van de anti-inflammatoire en immuun-regulerende capaciteiten van deze cellen.

1. Inleiding

Stamcellen vertonen bijzondere kenmerken die hen doen verschillen van andere cel-types. Ten eerste zijn het ongespecialiseerde, zelf-vernieuwende, in weefsels verblijvende cellen en ten tweede kunnen ze worden geïnduceerd om te differentiëren tot gespecialiseerde cel-types; wat beloftevol is naar de regeneratieve geneeskunde toe. Wanneer deze cellen worden geïsoleerd uit volwassen, volledig gedifferentieerde weefsels, worden ze beschouwd als volwassen stamcellen, ook zelfs als ze aanwezig zijn bij zuigelingen en foetussen. Daarom zou het meer gepast zijn er naar te refereren als weefsel-stamcellen of mesenchymale stamcellen [mesenchym = embryonaal bindweefsel] om ze te onderscheiden van residente voorloper-cellen met beperkte differentiatie-capaciteit. Deze MSCs [mesenchymale stamcellen; zie hieronder] kunnen worden geïsoleerd uit een groot aantal weefsels, zoals beenmerg, vet-weefsel, tandpulp, haar-follikels, amniotisch vocht [vruchtwater, beschermende vloeistof rond de foetus], gelei van Wharton [gelatineuze substantie met bindweefsel] in de navelstreng en zelfs uit zenuw- of hart-weefsel. MSCs zijn multipotent [kunnen tot een beperkt aantal celtypes differentiëren] en kunnen onder geschikte omstandigheden differentiëren naar chondrocyten [cellen die kraakbeen aanmaken en onderhouden], adipocyten [vet-cellen] en osteoblasten [cellen die botweefsel opbouwen]. MSCs kunnen in vitro meer dan een miljoen keer worden gekloond en ontwikkeld zonder hun differentiatie-potentieel te verliezen; wat theoretisch een rijke bron voor weefsel-herstel betekent. Hun gevoeligheid voor signalen uit de omgeving en genetische factoren, samen met een gebrek aan ‘standardized good manufacturing’ procedures (GMPs) gebaseerd op gedefinieerde componenten heeft echter hun waarachtig therapeutisch potentieel belemmerd. Sinds de ontdekking dat MSCs ‘mixed lymphocyte reactions’ [mengen van populaties (genetisch verschillende) lymfocyten, bij een transplantatie bv.] inhiberen en de afstoting van allogene huid-transplanten voorkomen, heeft een groot aantal rapporten bewijsmateriaal geleverd dat MSCs immuun-suppressief en immuun-regulerend zijn; eigenschappen die therapeutisch aangewend kunnen worden. Er blijven echter uitdagingen omtrent het volledig begrijpen en controleren van het regeneratief potentieel van MSCs.

Naast MSCs betekende het herprogrammeren van terminaal gedifferentieerde cellen of de inductie van de-differentiatie door de introductie van bepaalde sets of transcriptie-factoren een bijkomende reeks opportuniteiten in het veld van de regeneratieve geneeskunde. iPScs of geïnduceerde pluripotente stamcellen faciliteren de produktie van patient-specifieke cellen die immune afstoting en ook ethische bezorgdheden van antwoord kunnen bieden. Hoewel ze hun waarde hebben bewezen wat betreft het genereren van in vitro modellen voor menselijke ziekte [neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson’s, ALS; autisme, dementie], heeft de lage efficiëntie wat betreft her-programmatie en de bezorgdheden omtrent de veiligheid verbonden met het proces van het herprogrammeren hun gebruik in de kliniek belet.

Op basis van de research-interesses van onze laboratoria zet dit hoofdstuk, via het bespreken van de vooruitgang op gebied van het genereren van stamcellen met klinische kwaliteit of hun neven-produkten, de potentiële voordelen van stamcel-gebaseerde therapeutica voor de behandeling van ruggemerg-letsels (SCI) en de neuro-immune ziekte Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) in de kijker.

2. Stamcel-therapie voor het herstel van ruggemerg-letsels

[…]

3. Stamcel-therapie voor andere neuro-immune gezondheid-problemen: potentiële voordelen voor de behandeling van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS)

Mesenchymale stromale [steun-/ bindweefsel-] cellen (MSCs) werden in klinische testen (CTs) gebruikt voor een brede waaier aan immuun-gerelateerde gezondheid-problemen zoals acute en chronische inflammatoire aandoeningen, auto-immuun ziekten en transplant-afstoting omwille van hun krachtige immuun-suppressieve en anti-inflammatoire eigenschappen. In een overzicht [Wang et al. Human mesenchymal stem cells (MSCs) for treatment towards immune- and inflammation-mediated diseases: Review of current clinical trials. Journal of Biomedical Science (2016) 23: 76; echter niets over M.E.(cvs)] werd gewag gemaakt van meer dan 500 MSC-gerelateerde klinische testen die geregistreerd werden in de ‘clinicaltrials.gov’ database. Hoewel de immuun-modulerende eigenschappen van MSCs pas later werden geïdentificeerd werden of worden bijna de helft van de geregistreerde CTs (42%) uitgevoerd bij immuun- of inflammatie-gemedieerde ziekten [Multiple Sclerosis, type 1 diabetes mellitus, ‘graft-versus-host disease’, osteoartritis, prikkelbare darm syndroom].

Multipele Sclerose (MS) en het dier-model experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) houden verband met inflammatie van het centraal zenuwstelsel, gliose [verhoogd aantal gliale cellen in een beschadigd gebied van de hersenen; non-specifieke neuropathologische reaktie van het brein op beschadiging], demyelinisatie en verlies van axonen. MSCs’ pleiotrope eigenschappen, inclusief immuun-modulatie, immuun-suppressie, neurotrofie en herstel-bevordering, maken hen tot aantrekkelijke kandidaten voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten, zoals MS. De her-myelinisatie voordelen die werden gerapporteerd voor MS worden grotendeels toegeschreven aan paracriene [waarbij door klieren uitgescheiden stoffen op de eigen of buur-cel inwerken] signalen en gesekreteerde oplosbare molekulen zoals tumor groei-factor (TGF-β1), interferon (INF)-γ, indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) en prostaglandine-E2 (PGE2). Anderzijds bevorderen neurale voorlopers verkregen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) de levensvatbaarheid van endogene OPCs [oligodendrocyt (type glia-cel met als voornaamste funktie het myeliniseren van axonen) progenitor (voorloper) cellen] wat de her-myelinisatie door de sekretie van leukemie inhiberende factor (LIF [cytokine dat cel-groei beïnvloedt door het inhiberen van differentiatie]) bij EAE. Er werd getoond dat LIF, een lid van de IL-6 cytokine familie die betrokken bleek in the pathofysiologie van MS, neuroprotectie en axonale regeneratie bood alsook de preventie van demyelinisatie.

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe, multi-orgaan/-systeem ziekte, dikwijls ruïnerend, waar geen diagnostische test voor bestaat. De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op exclusie, wat betekent dat andere medische aandoeningen (inclusief psychiatrische aandoeningen), eerst dienen te worden uitgesloten. De ziekte wordt gekenmerkt door diepgaande vermoeidheid en invaliditeit die minstens 6 maanden aanhoudt, episodes van cognitieve dysfunktie, slaap-stoornissen, autonome abnormaliteiten, chronische of periodieke pijn syndromen, microbioom-abnormaliteiten, cerebrale cytokine-ontregeling, ‘natural killer’ cel dysfunktie en andere symptomen die verslechteren door inspanning. […]. Hoewel de etiologie van M.E./CVS onbekend blijft, lijken de vele hypotheses te wijzen op pathologische immuunsysteem-storing. Auto-immune kenmerken en latente infektie van ongekende micro-organismen, met een chronisch geaktiveerd immuunsysteem leidend tot inflammatoire situaties, hebben onze groep er toe geleid voor te stellen dat op stamcellen gebaseerde therapeutica (zoals bij MS) ook voor deze patiënten mogelijks voordelen hebben. De Wereld Gezondheid Organisatie (WHO) heeft M.E./CVS geklassificeerd als een neurologische aandoening […] op basis van de cognitieve en andere neurologische symptomen waar deze patiënten onder lijden. De neurologische symptomen zouden echter kunnen worden verklaard door microgliale aktivatie en de minder-dan-normale aanmaak van cortisol en adrenocorticotroop hormoon (ACTH) die deze patiënten vertonen, met serotonine en corticotropine (CRH) ontregeling tot gevolg. Een daling van de cortisol-produktie door de bijnieren kan op z’n beurt de aktiviteit van het immuunsysteem beïnvloeden. MSC-therapeutica kunnen, ten minste gedeeltelijk, de normale immune en, misschien, neurale funktie herstellen. Pre-klinische veiligheid-studies dienen echter vooraf te gaan aan CTs bij M.E./CVS.

4. Huidige protocollen voor stamcel-therapeutica

4.1. Mesenchymale stamcellen (MSCs)

Op MSCs komt geen ‘major histocompatibility’ complex klasse-I of -II tot expressie, wat de transfer tussen gastheren zonder het triggeren van acute afstoting toelaat. De ‘International Society for Cellular Therapy’ (ISCT) definieert menselijke MSCs als volgt: […] expressie van CD105, CD73 & CD90, en geen expressie van of CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79α of CD19, en HLA-DR oppervlakte-molekulen; differentiëren in vitro tot osteoblasten, adipocyten en chondroblasten [mesenchymale voorloper-cellen die aanleiding geven tot chondrocyten]. […] Dergelijke cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen (vet, beenmerg, navelstreng-bloed, tandpulp, enz.) maar o.a. de weefsel-bron, leeftijd van de donor, mate en condities van de in vitro ontwikkeling kunnen het regeneratief potentieel beïnvloeden […]. […] De hoge inherente heterogeniteit blijft een uitdaging. […]

Er zijn slechts 13 menselijke op MSC gebaseerde produkten met marketing-autorisatie. […] De belangrijkste bron is het beenmerg, gevolgd door vet-weefsel […]. Aangezien dit laatste minimaal invasief is, zou dit wel eens de voornaamste keuze kunnen worden voor volwassen stamcellen met klinische toepassingen. […]

[…]

Het is duidelijk dat de weefsel-bron en optimale groei-condities voor MSC-produktie afhankelijk zal zijn van de noden opgelegd door de toepassingen. […]

Het regeneratief vermogen van MSCs wordt toegeschreven aan hun anti-inflammatoire, immuun-regulerende eigenschappen […]. In een vroeg stadium van trauma of microbiële invasie, wanneer de concentratie van pro-inflammatoire cytokinen laag is, vertonen MSCs de antimicrobiële, pro-inflammatoire eigenschappen van neutrofielen. Naar gelang de inflammatie vordert en pro-inflammatoire cytokinen opbouwen, switchen MSCs naar een anti-inflammatoir fenotype. […]

4.2. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

NSPCs [neurale stam/progenitor(voorloper)-cellen] kunnen differentiëren naar neurale cellen […]. De voornaamste bronnen zijn het foetaal en volwassen brein, en volwassen ruggemerg […]. Foetale NSPCs kunnen gedurende lange periodes in vitro worden ontwikkeld, terwijl volwassen NSPCs een beperkter vermogen hebben.

[…] Er werd gerapporteerd dat NSPCs neuropathische pijn bevorderen, een zorgwekkende nevenwerking. […]

[…] Studies toonden de veiligheid van menselijke iPSC-afgeleide NSPCs […] en het potentieel gebruik bij ruggemerg-letsels. Ze hebben significante voordelen zoals de afwezigheid van ethische controverse omtrent hun afkomst en hun potentieel bij autologe transplantatie [toediening van eigen cellen], waardoor het risico op afstoting of nevenwerkingen door immuun-suppressie wordt vermeden. […].

[…]

[…] Chromosomale instabiliteit en tumor-ontwikkelend potentieel door oncogene over-expressie doen vragen rijzen omtrent hun gebruik in de kliniek. […]

[…]

4.3. Preconditionering van stamcellen

Het kan voordeel bieden om MSCs of iPSCs vóór transplantatie te preconditioneren naargelang de toepassing of therapie zodat de cellen van een bepaald gewenst fenotype zijn. […]

[…]

[…]. Preconditionering-protocollen omvatten typisch fysieke behandelingen zoals verschillende mates van hypoxie, mechanische stretching, toepassing van elektromagnetische velden of nabootsen van drie-dimensionele omgevingen enerzijds, en chemische of farmacologische behandelingen, inclusief herbale medicijnen of natuurlijke extracten anderzijds. […].

4.4. Op extracellulaire vesikels gebaseerde therapeutica

Hoewel autologe MSCs een veiliger keuze betekenen in termen van het vermijden van ongewenste immuun-responsen, kunnen donor co-morbiditeiten het gebruik van hun eigen stamcellen hinderen. […] Het zal belangrijk zijn DNA-methylatie en wijzigingen qua gen-expressie, die immuun-responsen kunnen opwekken zelfs als de iPSCs autoloog zijn, te monitoren. Daarom kan de mogelijkheid van een therapeutisch cel-vrij produkt zeer relevant zijn naar veiligheid toe.

[…] De therapeutische waarde van stamcellen kan voornamelijk te wijten zijn aan afgegeven factoren of sekretoom [alle factoren gesekreteerd door een cel] inclusief oplosbare en in vesikels verpakte factoren. Deze fraktie, extracellulaire vesikels (EVs [zie ‘Extracellulaire vesikels: potentiële biomerkers voor M.E.(cvs)?]) genaamd, is een heterogene mix van vesikels inclusief exosomen, een subset van vesikels met dubbel membraan gekenmerkt door de expressie van merkers zoals tetraspaninen [familie van membraan-proteïnen], CD9 [adhesie-molekule op het cel-oppervlak], CD63 [trans-membraan-proteïne] & CD81 [ook een cel-oppervlakte proteïne] met een rol bij intercellulaire communicatie, waaronder de transfer van hun lading (DNA, RNA & proteïnen).

[…]. Veel pre-klinische modellen toonden het nut van op EV gebaseerde therapie, inclusief langdurige neuroprotectie. Behandeling met van MSCs afgeleide EVs bevorderden langdurig herstel van cognitieve funkties bij door inflammatie geïnduceerd hersen-lestel. […] De superioriteit van EVs met betrekking tot cel-gebaseerde therapeutica ligt in z’n beschikbaarheid, gemak van opslag en distributie, gereduceerde immuun-antigeniciteit, schaalbaarheid en mogelijkheid van meerdere manieren van toediening. EVs kunnen ook worden aangewend als aflevering-partikels, door molekulen van genetisch gemodificeerde cellen die van belang blijken te zijn, te verpakken en zo het risico van de transfer van getransformeerde levende cellen te vermijden […]. […]

[…]

5. Besluiten

Hoewel CTs over het algemeen bewijs hebben geleverd omtrent de veiligheid van MSCs, is de verwijdering van FBS [‘fetal bovine serum’; foetaal runder serum] uit klinische stamcel-protocollen essentieel. Het verzamelen van een groot aantal donoren voor cellen en op frakties van menselijk bloed gebaseerde media (via het aanwenden van stamcel-banken) of het gebruik van ‘xeno-free’ [alle componenten afkomstig van hetzelfde organisme] synthetische, gedefinieerde media zou zich moeten vertalen in allogene MSC-preparaten die leiden tot meer homogene klinische resultaten. Zo zorgt men voor minimale immuun-gerelateerde veiligheid-overwegingen door FBS en onthult de echte therapeutische waarde van in vitro ontwikkelde MSCs.

De iPSC produktie-technologie biedt de mogelijkheid van het ontwikkelen van op maat van de patient gemaakte cel-therapieën met overéénkomstige veiligheid en immuun-gerelateerde voordelen, aangezien genetisch identieke cellen immune afstoting zouden moeten vermijden. iPSCs kunnen differentiëren tot alle drie de kiemlagen en ze geven, door hun aard, geen aanleiding tot een bio-ethisch debat. Veiligheid-overwegingen verbonden met in vivo eigenschappen van onsterfelijke cel-types en het gebruik van genetisch gemanipuleerde cellen geeft echter aanleiding tot regulering-problemen voor het gebruik in de kliniek.

Preconditionering van in vitro ontwikkelde MSCs om cel-lijn verplichtingen te verzekeren, kan voordelig uitdraaien voor verbeterde behandelingen van bepaalde ziekten. Optimalisatie voor de behandeling van SCI [‘spinal cord injury’, ruggemerg-letsel] en andere neuro-immune gezondheid-problemen zoals M.E./CVS blijven nodig. EVs en in het bijzonder exosoom-aangerijkte, van MSC afgeleide frakties kunnen eventueel de geprefereerde behandeling voor cel-vrije therapeutica (zelfstandig of in combinatie met andere klinische behandelingen) worden, eens de GMP-produktie geoptimaliseerd blijkt.

augustus 12, 2018

Identificatie van M.E.(cvs) DNA-methylatie patronen

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:47 am
Tags: , , , , ,

Methylatie van genen – het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide van DNA) – verandert hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA). DNA-methylatie komt dus voornamelijk voor op de cytosinen van CpG dinucleotide ‘sites’.

CpG-eilanden zijn gebieden/ DNA-fragmenten waar veel CpG-‘sites’ voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 baseparen (bp) met een GC (cytosine-guanosine dinucleotiden) -percentage > 50%. Meestal liggen die ‘upstream’ (vóór) van genen. Ze komen voor in ongeveer de helft van gen-promoters, zijn resistent voor methylatie en veelal geassocieerd met genen die frequent ‘aan’ staan.

Een promoter is een nucleotide-sequentie vóór een gen dat dient als startplaats, aanknopingspunt voor DNA-transcriptie; waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie – vrij vertaald ‘overschrijving’ naar RNA – te starten.

————————-

PLoS One Vol 13, #7, p e0201066 (juli 2018)

Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns

Malav S. Trivedi (1), Elisa Oltra (2), Leonor Sarria (3), Natasha Rose (1), Vladimir Beljanski (4), Mary Ann Fletcher (3,5), Nancy G. Klimas (3,5), Lubov Nathanson (3)

1 College of Pharmacy, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

2 School of Medicine and Dentistry, Catholic University of Valencia, Valencia, Spain

3 Institute for Neuro Immune Medicine, Dr. Kiran C. Patel College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

4 Cell Therapy Institute, Dr. Kiran C. Patel College of Allopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

5 Miami VAMC, Miami, Florida, United States of America

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe aandoening waarbij meerdere orgaan-systemen betrokken zijn en die wordt gekenmerkt door aanhoudende uitputtende vermoeidheid, immuun-dysfunktie, neurologische problemen en andere symptomen, gedurende minstens 6 maanden. Verstoring van DNA-methylatie patronen werd reeds gelinkt met verscheidene immuun- en neurologische ziekten; de status van M.E./CVS blijft echter onzeker. Onze studie probeerde wijzigingen van de DNA-methylatie patronen te identificeren die verband houden met M.E./CVS.

Methodes We haalden genomisch DNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen van 13 M.E./CVS studie-deelnemers en 12 gezonde controles, en bekeken de globale DNA-methylatie d.m.v. een op ELISA lijkende methode en de plaats-specifieke methylatie-status d.m.v. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays [‘genen-chips’]. Een validatie d.m.v. pyro-sequentie-bepaling omvatte 33 M.E./CVS-patiënten en 31 controles van 2 geografisch uitéénliggende lokaties.

Resultaten De globale DNA-methylatie waarden van M.E./CVS-individuen waren gelijkaardig met die van controles. De micro-array benadering liet echter toe de detektie toe van 17.296 differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen op 6.368 genen (regulerende elementen en binnen coderende gebieden van genen). Analyse van de DNA-methylatie in promoter-gebieden onthulde 307 differentieel gemethyleerde promoters. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ gaf aan dat genen die geassocieerd zijn met differentieel gemethyleerde promoters voorkwamen in ten minste 15 verschillende mechanismen, meestal gerelateerd met cel-signalisering en met een sterke immune component.

Besluiten Dit is de eerste studie die genoom-brede epigenetische veranderingen heeft onderzocht die geassocieerd zijn met M.E./CVS, gebruikmakend van de geavanceerde ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die ca. 850.000 CpG-sites beslaan en dit in 2 geografisch verwijderde of M.E./CVS-groepen en gematchte controles. Onze resultaten komen overéén met eerdere studies die een ontregeling van het immuunsysteem aangaven bij M.E./CVS. Ze suggereren ook een mogelijke rol van epigenetische ontregeling bij de pathobiologie van M.E./CVS. We stellen screening van grotere M.E./CVS-groepen voor om de externe validiteit van deze epigenetische wijzigingen te bepalen, om ze ev. te implementeren als potentiële diagnostische merkers in een klinische setting.

Inleiding

[…]

Een beter begrip van de molekulaire mechanismen van M.E./CVS en de dysfunktie binnen regulerende systemen zal zich vertalen in geschikte diagnostische methodes en management-strategieën, en meer gerichte behandel-benaderingen bieden.

Verstoring van epigenetische mechanismen is gelinkt met verscheidene immuun-, neurologische en endocriene ziekten. Bovendien werd gevonden dat DNA-methylatie patronen gewijzigd waren bij meerdere ziekten waarvan dikwijls wordt gemeld dat ze co-morbide met M.E./CVS zijn, zoals fibromyalgie (FM) en prikkelbare darm syndroom (IBS) [Ciampi de Andrade D et al. Epigenetics insights into chronic pain: DNA hypomethylation in fibromyalgia-a controlled pilot-study. Pain (2017) 158: 1473-80 /// Mahurkar S et al. Genome-wide DNA methylation profiling of peripheral blood mononuclear cells in irritable bowel syndrome. Neurogastroenterol Motil. (2016) 28: 410-22]. Met betrekking tot M.E./CVS, hebben we weet van slechts enkele studies, waar verschillen in DNA-methylatie patronen werden onderzocht tussen individuen met M.E./CVS en controles [de Vega WC et al. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS one (2014) 9: e104757 /// de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Medical Genomics (2017) 10: 11 /// Brenu EW et al. Methylation Profile of CD4+ T Cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228]. Deze studies maakten gebruik van ‘Illumina Human Methylation450 BeadChip’ micro-arrays, die de analyse van meer dan 450.000 methylatie-sites per staal (‘single-nucleotide’ resolutie) toelaten. Twee andere bijkomende studies beperkten de analyse tot specifieke gen-promoter-gebieden d.m.v. een plaats-specifieke benadering voor het meten van DNA-methylatie bij M.E./CVS [Vangeel E et al. Chronic Fatigue Syndrome and DNA Hypomethylation of the Glucocorticoid Receptor Gene Promoter 1F Region: Associations With HPA Axis Hypofunction and Childhood Trauma. Psychosomatic medicine (2015) 77: 853-62 /// Falkenberg VR et al. Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome. Genet Epigent. (2013) 5: 1-9]. De ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays laten toe DNA-methylatie veranderingen te analyseren op meer dan 850.000 CpG-‘sites’. Deze grotere omvang zou het blootleggen van bijkomende wijzigingen qua transcriptie-regulering bij M.E./CVS-patiënten moeten faciliteren. Door validatie van DNA-methylatie patronen geassocieerd met M.E./CVS bij 64 deelnemers van 2 geografisch uitéénliggende plaatsen d.m.v. pyro-sequentie-bepaling [‘pyro-sequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling], konden we bovendien consensus CpG hypo-gemethyleerde plaatsen identificeren die kunnen worden gebruikt bij toekomstige screenings aangaande verbanden van deze epigenetische wijzigingen bij M.E./CVS. Het was dan ook de intentie van deze om de eerdere analyse van genomische DNA-methylatie veranderingen bij M.E./CVS te valideren en uit te bouwen, en dergelijke bevindingen uit te breiden door gebruik te maken van meer CpG-sites. Toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-patiënten zijn gerechtvaardigd om betrouwbare epigenetische merkers voor M.E./CVS te vinden.

Materialen & methodes

Staal-afname &-verwerking

Recrutering. 2 lokaties: Miami/Fort Lauderdale (Florida) en Valencia, Spanje […]. Alle individuen hadden een vergelijkbare leeftijd en BMI. […] enkel vrouwelijke deelnemers […]. We gebruikten de Fukuda en Canadese definities. […]

All M.E./CVS-individuen zaten voor de ‘Medical Outcomes Study 36-item short-form survey’ (SF-36) samengevatte lichamelijke score onder het 50e percentiel […]. Alle individuen waren tussen 30 & 60 jaar oud.

Exclusie-criteria: […]

[…]

Isolatie van PBMCs & DNA-extracties. […]

Genomische DNA-methylatie profilering

Globale epigenetische metingen: ‘MethylFlash Methylated DNA 5-mC Quantification Kit’ (EpiGentek) & ‘MethylFlash Methylated DNA 5-hmC Quantification Kit’ (EpiGentek). […]

Beoordeling DNA-methylatie over het ganse genoom […] Bisulfiet-conversie van genomisch DNA [ongemethyleerd cytosine wordt omgezet naar uracil in DNA, gemethyleerd cytosine niet; via direct sequentie-bepaling kan dan de plaats van ongemethyleerde cytosinen en 5-methylcytosinen worden bepaald] d.m.v. de ‘EZ DNA Methylation Kit’ (Zymo Research) […] hybridisatie van het DNA op ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays.

Analyse van de genomische DNA-methylatie gegevens

[…]

De analyse van differentiële methylatie werd uitgevoerd gebruikmakend van 2 strategieën: op basis van genomisch gebied en op basis van de plaats. Terwijl de op genoom-gebied gebaseerde benadering kijkt naar het gemiddeld methylatie-niveau van het genoom-gebied (CpG-eilanden, promoters, genen en ‘tiling-regions’ [overlappende gebieden]) en dan de methylatie-toestand van de gebieden voor de stalen vergelijkt, worden bij de op plaats (‘site’) gebaseerde benadering de CpG-loci één per één geanalyseerd. Om gebieden of loci [meervoud van locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt] te detekteren die differentieel gemethyleerd zijn bij M.E./CVS t.o.v. controles, gebruikten we [gespecialiseerde] software voor de analyse van DNA-methylatie gegevens. CpG-plaatsen werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende selektie-criteria: het verschil qua absolute beta-waarde [onderscheidend vermogen] tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05, en de ‘false discovery-rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]) ≤ 0.05 […] voor micro-array analyse en p ≤ 0.05 […] voor pyro-sequentie-bepaling. Promoter-gebieden (1.500 bp ‘upstream’ van de transcriptie-start-plaats (TSS) en 500 bp ‘downstream’ van de TSS) werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende criteria: FDR ≤ 0.1 […] en het verschil qua absolute beta-waarde tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05. […]

[…]

Validatie van differentieel gemethyleerde promoters via pyro-sequentie-bepaling

De gegevens verkregen uit de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays werden gevalideerd via pyro-sequentie-bepaling […]. Methylatie van het DNA wordt gekwantificeerd d.m.v. bisulfiet-behandeling van het DNA en simultane PCR. […]. De resultaten worden gerapporteerd als percentage gemethyleerde cytosinen t.o.v. totaal (gemethyleerde & on-gemethyleerde) cytosinen. […]

‘Ingenuity pathway analysis’

De ‘Ingenuity Pathway Analysis’ software (IPA [software om expressie-profielen te analyseren om overheersende mechanismen en het betrokken interaktie-netwerk te bepalen]) werd aangewend om genen met differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) en de rangschikking van de geassocieerde kanonieke mechanismen aan te geven Analyse van de kanonieke mechanismen identificeert de mechanismen uit de IPA mechanismen-bibliotheek die meest significant zijn voor de set genen met DMPs. De significantie van het verband tussen de genen-set en een kanoniek mechanisme wordt gemeten via het bepalen van de verhouding tussen het aantal genen in de lijst die wordt in kaart gebracht, gedeeld door het totaal aantal van alle bekende genen van dat mechanisme. […]

Resultaten

Studie-ontwerp en demografie

[…] Genomisch DNA van 13 M.E./CVS-patiënten en 12 controles (‘experimentele groep’) werd gehybridiseerd [hybridisatie = samenvoegen van twee complementaire DNA-strengen] op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. deze kunnen testen voor meer dan 850.000 CpG-‘sites’ en beslaan verschillende gebieden van meerdere genen, inclusief promoter-, 5’UTR- [‘untranslated region’, onvertaald gebied; sequentie vóór het translatie start-codon], eerste exon [exon = deel van een gen dat codeert voor een deel van het uiteindelijk RNA/proteïne; het eerste exon omvat ook het 5’UTR], ‘gene-body’ [geheel van coderend stukken van een gen] & 3’UTR- [sequentie volgend op het translatie start-codon], alsook afgelegen gebieden. […]. Na analyse van de gegevens werden de verkregen resultaten gevalideerd d.m.v. pyro-sequentie-bepaling van de stalen van de experimentele groep, alsook (bijkomend) 8 M.E./CVS-patiënten & 8 controles uit de Miami/Fort Lauderdale regio en 12 M.E./CVS-patiënten & 11 controles uit Valencia.

Het is het vermelden waard dat eerdere studies (met ‘Illumina Human Methylation450’ micro-arrays) een gelijkaardig aantal patiënten en controles gebruikten: Brenu et al. [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie van T-cellen bij 25 M.E./CVS- patiënten & 18 controles; De Vega et al. (2014) [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie-status in PMBCs bij 12 M.E./CVS-patiënten & 12 controles. […] Bovendien ligt het belangrijkste sterkte-punt van de huidige bevindingen in de validatie van specifieke CpG-‘sites’ bij een uitgebreide groep M.E./CVS-patiënten en controles van verschillende geografische lokaties. […].

[…] Energie-status, sociaal funktioneren, emotionele rol en mentale gezondheid waren significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Daarnaast werden statistisch significante verschillen qua lichamelijk gezondheid geconstateerd (SF-36 scores). […]

Globale methylatie bij M.E./CVS

We vonden geen statistisch significante verschillen qua globale DNA-methylatie levels […] in PBMCs […]. Deze analyse toont echter algemene cytosine-modificaties maar blijft beperkt tot de detektie van specifieke schommelingen op afzonderlijke lokaties in het genoom.

Aangezien voorgaande studies plaats-specifieke methylatie-verschillen bij M.E./CVS hadden getoond, gingen we over tot de evaluatie van deze mogelijkheid bij onze experimentele groep maar we gebruikte echter een opgewaardeerde versie van de micro-arrays voor humane genoom-methylatie. Deze nieuwe technologie heeft bijna een 2 maal groter bereik en laat validatie en uitbreiding van eerdere bevindingen toe bij onafhankelijke, geografisch verwijderde groepen M.E./CVS-individuen.

Differentieel gemethyleerde CpG-sites bij M.E./CVS

De gegevens toonden hypo-methylatie van differentieel gemethyleerde ‘sites’ (DMS) (98%) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Er bleven 649.836 ‘probes’ [sondes; sequenties die kunnen hybridiseren] over voor verdere analyse na filtering en voor-verwerking van de ruwe genomische DNA-methylatie gegevens […]. Analyse van deze ‘probes’ leidde tot de vondst van 17.296 DMS gelegen in 6.368 genen, wijzend op epigenetische verschillen tussen de M.E./CVS-patiënten en controles […]. Bovendien toonde ‘Principal Component Analysis’ (PCA) [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.] van de volledige methylomen duidelijke differentiatie tussen M.E./CVS en controles. Daarnaast toonde ongecontroleerde hiërarchisch groeperen van de 500 meest variabele ‘CpG-sites’ duidelijke afscheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles, wat bevestigt dat DNA-methylatie patronen in PBMCs van M.E./CVS-individuen verschillen van deze van controles.

Van de 17.296 DMS, werd in het totaal 14.261 DMS (82%) gevonden binnen of in de nabijheid van genen (t.t.z. gen-lokaties), wijzend op het feit dat ze een rol kunnen spelen bij de regulering van gen-expressie. Ca. 98% van de DMS binnen de gen-gebieden vertoonden hypo-methylatie en 2% hyper-methylatie. Deze DMS waren meestal gelijk verdeeld tussen gen-lichamen (43,68%) en gen-regulerende elementen (TSS1500, TSS200 [1.500 – 200 nucleotiden ‘upstream’ van transcriptie-start-‘sites’], 5’UTR & 3’UTR) (43,84%). Er werd hypo-methylatie van M.E./CVS DNA gezien op 21,87% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden; 17,21% in 5’UTRs; 3,08% in eerste exonen en 4,25% in 3’UTRs. Anderzijds kwam hyper-methylatie voor op 0,16% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden, 0,34% in 5’ en 3’UTRs, en 0,79% in gen-lichamen. Wat betreft de lokalisatie t.o.v. CpG-eilanden: van de 17.296 DMS waren er 46,8% gelokaliseerd in CpG-eilanden, terwijl 53,2% (8.089 DMS) in de nabijheid van CpG-eilanden lagen. De plaatsbepaling van 8.089 DMS t.o.v. hun lokatie CpG-eilanden toont dat 99,3% van deze 8.089 DMS hypo-methylatie vertoonden en slechts 0,7% hyper-methylatie. Van deze 8.089 DMS waren er 25,25% gelokaliseerd binnen CpG-eilanden, 61,9% 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-eilanden (‘N, S shores’ [‘oevers’, gebieden kort (0-2 kb) bij CpG-eilanden]), en 12,8% in gebieden 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-‘shores’ (‘N, S shelves’ [‘klippen’, gebieden verder (2-4 kb) van CpG-eilanden]). Binnen deze gebieden vertoonden 74,1% van de ‘shores’ & ‘shelves’ hypo-methylatie, terwijl slechts 0,63% van de CpG-eiland-‘shores’ & -‘shelves’ hyper-methylatie vertoonden; wat consistent is met de globale bevinding dat hypo-methylatie geassocieerd is met M.E./CVS. Minder strenge criteria (FDR ≤ 0.1 & gemiddelde beta-verschillen > 0.05) lieten toe 27.129 DMS te identificeren.

Differentieel gemethyleerde promoters bij M.E./CVS

Aangezien methylatie van promoter-gebieden op een directe manier het niveau van gen-expressie beïnvloedt, gingen we verder met het analyseren van differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) in onze experimentele groep. Zoals beschreven werden promoters gedefinieerd als gebieden gelegen binnen de 1.500 bp ‘upstream’ van TSS en 500 bp ‘downstream’ van TSS. De criteria voor DMPs waren FDR ≤ 0.1 en de gemiddelde beta-verschillen > 0.05. Op basis van deze criteria vonden we 307 DMPs in PBMCs van M.E./CVS-individuen. 306 van deze DMPs vertoonden hypo-methylatie bij de M.E./CVS-groep […]. We bekeken de verdeling van deze promoters volgens gen-biotype. Bijna de helft van de geïdentificeerde DMPs behoren tot de proteïne-coderende genen (47,6%) en meer dan de helft (52,1%) behoren tot de regulerende RNA-genen. Deze laatste bestaan uit korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire [van de cel-kern] RNAs, kleine nucleolaire RNAs [nucleolus, kern-lichaampje]) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief anti-sense RNAs [sequenties die het mRNA inaktiveren] en inter-gen RNAs) (30,6%) en pseudo-genen [genen met een gelijksoortige DNA-struktuur als normaal funktionerende genen maar die niet tot expressie kunnen komen] (11,4%). Deze verdeling van DMPs ondersteunt onze hypothese dat de differentiële methylatie die we vaststellen kan leiden tot ontregeling van gen-expressie bij M.E./CVS. We identificeerden ook 144 DMPs met striktere criteria (FDR ≤ 0.05 en de gemiddelde beta verschillen > 0.05 […]; en dit vertegenwoordigt gelijkaardige gen-funktie patronen als de DMPs geïdentificeerd met FDR ≤ 0.1.

Analyse van funktionele mechanismen van DMPs

Om de mogelijke funkties en interakties tussen de 307 genen die worden gecontroleerd door DMPs beter te begrijpen binnen de context van cel-biologische mechanismen, voerden we een Gen Ontologie [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] analyse uit d.m.v. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ (IPA). Deze analyse onthulde veranderingen in talrijke immuun-regulerende/ stress-respons mechanismen zoals het p38MAPK mechanisme (betrokken bij de respons op een waaier omgeving-stressoren en op inflammatoire cytokinen), de IL-10, IL-17A, Il-1 & IL-8 signalisering-mechanismen (allen met belangrijke immuun-regulerende rollen), het AMPK-mechanisme (belangrijkste regulator van de cellulaire energie-homeostase die wordt geaktiveerd in respons op stressoren die de cellulaire ATP-voorraden uitputten [zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS & ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]) en metabole mechanismen zoals PPARα/RXRα [nucleaire receptoren] -aktivatie, en uracil- & thymine [DNA-basen] -afbraak mechanismen. Verder onthulde funktionele analyse van talrijke individuele genen hypo-methylatie in promoters van de IGHJ1, IGHJ1P, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ6, IGHJ3P, IGHV3-7, IGHD7-27, IGLL1 & LRMP genen die gerelateerd zijn met de B-cel immuun-respons, differentiatie, proliferatie en overleving. Op dezelfde manier vertoonden M.E./CVS-patiënten verminderde DNA-methylatie in promoters van genen verantwoordelijk voor T-cel generatie en aktiviteit, zoals ZCCHC11, CAPN5, IL21R, P2RX5, TREML2, AKNA & CD248. Samen met een robuuste impact op immuun-respons mechanismen, vertoonden PMBCs van M.E./CVS-patiënten verminderde methylatie van promoters van genen geassocieerd met cel-groei die gericht waren op de MAP-kinase, NF-kB & TGF signalisering-mechansimen. Daarnaast werd een onderscheidend patroon van hypo-methylatie van gen-promoters betrokken bij miRNA-expressie (miR-4435, miR-181, miR-148a, miR-193b, miR-1284, miR-10A, miR-1203, miR-3934, miR-4487 & miR-4710) [zie o.a. ook ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.] en bij bio-metaal regulering – inclusief metaal-transporter SLC39A13 (ZIP-transporter) en meerdere ‘zinc-finger’ [‘zinc-finger’ proteïnen zijn een super-familie van proteïnen die op DNA kunnen binden] genen (ZCCHC8, ZCCHC11, ZBTB18, BAZ2B, ZNF225 and ZNF732) – geïdentificeerd.

Validatie van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-array resultaten d.m.v. pyro-sequentie-bepaling

Om de resultaten van onze analyse-resultaten van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays te valideren, selekteerden we 2 DMPs met een hoge densiteit aan CpG-‘sites’ en mogelijke rol in de neuro-immune signalisering bij M.E./CVS. De eerste, het ‘Zinc Finger and BTB Domain Containing 18’ (ZBTB18), is een ‘zinc-finger’ transcriptie-onderdrukker met een cruciale rol in hersen-ontwikkeling en neuronale differentiatie. De tweede, TABPB, codeert voor een trans-membraan glycoproteïne dat de interaktie medieert tussen nieuw geassembleerd majeur histocompatibiliteit complex (MHC) klasse-I molekulen en de transporter geassocieerd met antigen-verwerking, die vereist is bij het transport van antigen-peptiden door het endoplasmatisch reticulum. ZBTB18 zit in het bovenste deel van de lijst met DMPs […] (positie 8 op 307); terwijl TABPB in het onderste deel zit (positie 246 op 307); zodat we bij de validatie-stap DMPs opnamen met waarden aan beiden uiteinden van het spectrum. Voor elk van de 2 geselekteerde genen, bepaalden we het DNA-methylatie niveau van 6 CpG-‘sites’ in het promoter-gebied. Voor ZBTB18 correspondeerden 3 van de CpG-‘sites’ met oligonucleotiden op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays en 3 bijkomende CpG-‘sites’ – niet opgenomen op de micro-array maar gelegen in het gen promoter-gebied tussen cg15896892 & cg19698993 – werden ook getest. In het geval van TABPB correleerden alle geteste CpG-‘sites’ met probes van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. Pyro-sequentie-bepaling analyse valideerde de richting van methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-individuen en controles sterk (p < 0.01) […] voor alle geteste CpG-‘sites’. Belangrijk: we zagen dat de methylatie-niveaus gedetekteerd via pyro-sequentie-bepaling bij M.E./CVS-patiënten gelijkaardig waren met deze vastgesteld d.m.v. ‘MethylationEPIC’ micro-arrays voor alle DMS, en dat de verschillen qua methylatie-niveaus bepaald via pyro-sequentie-bepaling zelfs meer uitgesproken waren dan dezelfde verschillen bepaald d.m.v. micro-arrays.

Bespreking

DNA-methylatie speelt een belangrijke rol bij de wisselwerking tussen externe (omgeving) en interne (gen-expressie) factoren en kan zodoende de late of door een stimulus getriggerde aanvang van complexe multi-systeem ziekten zoals M.E./CVS verklaren. Slechts enkele studies hebben echter gerapporteerd over wijzigingen qua DNA-methylatie geassocieerd met M.E./CVS. Hier gebruikten we een nieuwere en verbeterde technologie – ontwikkeld door Illumina Inc.; die nog niet beschikbaar was ten tijde dat de voorafgaande studies werden uitgevoerd – met de bedoeling de eerdere bevindingen uit te breiden. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays beslaan bijna 2 maal zoveel CpG-‘sites’ als de oudere ‘Illumina HumanMethylation450’ micro-arrays, inclusief 333.265 bijkomende CpGs gelegen regulerende gebieden […].

We identificeerden hier differentieel gemethyleerde CpG-‘sites’ en promoters in PBMCs van M.E./CVS-individuen vergeleken met controles in groepen van twee uitéénliggende geografische lokaties. De associatie van hypo-methylatie van DMPs met immuun-regulerende mechanismen komt overéén met eerdere studies. Deze eerdere studies vonden bij immuun-cel regulering de grootste gecoördineerde aanrijking qua differentieel gemethyleerde mechanismen en rapporteerde genomisch DNA hypo-methylatie van genen in immuun-mechanismen in PBMCs geïsoleerd bij M.E./CVS-patiënten [zie de Vega WC et al. hierboven] en ook in CD4+ T-cellen bij M.E./CVS [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: we vonden significante verschillen qua DNA-methylatie tussen M.E./CVS en controles op 17.296 CpG-‘sites’ in 6.368 genen globaal (FDR ≤ 0.05), in promoters alsook andere gen-regulerende elementen en binnen coderende gen-gebieden. Er werd DNA hypo-methylatie gevonden in 98% van deze plaatsen bij M.E./CVS, terwijl slechts 2% hyper-methylatie vertoonden, t.o.v. controles.

Differentiële methylatie van promoters [in de gebruikte software beschreven als gebieden 1500 bp ‘upstream’ en 500 bp ‘downstream’ van TSS] kan een invloed hebben op de expressie van de corresponderende aangetaste genen. Interessant genoeg houden minder dan de helft van de DMPs (47,6%) verband met proteïne-coderende genen; terwijl meer dan 50% aangetaste niet-proteïne-coderende DMPs overéénkomen met promoters van regulerende gen-elementen, inclusief korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire RNAs, kleine nucleolaire RNAs) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief ‘anti-sense’ RNAs en ‘inter-gen’ RNAs) (30,6%) en pseudo-genen (11,4%). Kleine nucleaire RNAs en kleine nucleolaire RNAs participeren in RNA-‘splicing’ [tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt], terwijl lange niet-coderende RNAs en pseudo-genen belangrijke rollen spelen bij de regulering van transcriptie en mRNA-stabiliteit […]. Het is belangrijk op te merken dat het grootste beta-verschil (hypo-methylatie 14%) in de DMP-lijst werd gezien voor de promoter van het gen dat verband houd met de werking van ‘natural killer’ (NK) cellen.

Op het niveau van enkelvoudige genen, tonen onze resultaten hypo-methylatie van promoters van genen gerelateerd met die van referentie-studies, zoals sommige ‘solute carriers’ [membraan-transport-proteïnen], RNA-bindende proteïnen, ‘homeobox’ [binden op DNA en beïnvloeden zo de expressie van genen] en ‘PHD-finger’ [betrokken bij gen-regulering] -proteïnen [zie Brenu EW et al. hierboven]. Bij deze vonden we het MED13L gen [codeert voor een sub-unit van een groot transcriptioneel co-aktivator complex waarvan wordt gedacht dat het vereist is voor de expressie van bijna alle genen] dat geassocieerd is met verlaagde spier-spanning en neurocognitieve stoornissen, symptomen die verbonden zijn met M.E./CVS. We vonden ook DMPs gelinkt met de expressie van ribosomale proteïnen (RPL23A & RPL7) alsook met de 5S-ribosomale RNA pseudo-genen (RNA5SP245, RNA5SP77 & RNA5SP97) suggestief voor mogelijke verstoring van proteïne-synthese. Met betrekking tot de methylatie-status van de met glucocorticoïde respons geassocieerde genen, vonden we significante hypo-methylatie van de SGK3 (serum glucocorticoid gereguleerd kinase [o.a. rol bij regulering van verscheidene transporter-systemen]) gen-promoter [zie de Vega WC et al. hierboven].

Transcriptie-profilering studies bij M.E./CVS-patiënten gaven verstoringen aan van T- & B-cel aktivatie en ontregeling van gen-expressie die gerelateerd is met immuun-responsen in brede zin, en dergelijke veranderingen passen bij andere studies die een gewijzigde aanmaak van interleukine en interferon cytokinen aantoonden als kenmerken voor M.E./CVS immuun-dysfunktie [Broderick G et al. A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain, behavior and immunity. (2010) 24: 1209-17]. In de huidige studie, rapporteren we hypo-methylatie van DMPs van genen waarvan bekend is dat ze de adaptieve immuun-respons zoals immunoglobulinen en pseudo-genen (bv. IGDCC3, IGHD7-27, IGHJ1, IGHJ3 en andere) reguleren, wat overéénkomt met de gemelde verbetering van M.E./CVS-patiënten na B-cel depletie-therapie. We zagen ook hypo-methylatie van promoters van MMP14, MAP4K4, MAPK12 & CREB5 die mogelijks het TNF-signalisering mechanisme aktiveren, wat past bij de gerapporteerde over-expressie van pro-inflammatoire cytokinen bij M.E./CVS. Daarnaast toonden we ook hypo-methylatie van miRNA-148a promoter die mogelijks kan bijdragen tot over-expressie. Het is bekend dat de miRNA-148-152 familie de aangeboren immuun-respons en antigen-presentatie […] kan verstoren. Bovendien kan miRNA-148a bijdragen tot DNA hypo-methylatie CD4+ T-cellen bij lupus [systemische lupus erythematosus; een auto-immune aandoening] door het onderdrukken van de expressie van DNA-methyltransferase-1 [DNA-methyltransferasen zijn enzymen die een methyl-groep toevoegen aan de 5’ positie]. Het is meldenswaardig dat bij de DMPs die in deze studie geassocieerd zijn met miRNA-expressie, ook werd gemeld dat miRNA-10a, miRNA-181 & miRNA-4710 aangetast waren op DNA-methylatie niveau in minstens één eerdere M.E./CVS-studie [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: miRNA-10a bleek geassocieerd met M.E./CVS in NK-cellen [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9] en miR-181 gerelateerd met de TLR-gemedieerde inflammatoire respons, dat geassocieerd is met M.E./CVS [Gambuzza ME et al. The Role of Toll-Like Receptors in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: A New Promising Therapeutic Approach? CNS Neurol Disord Drug Targets (2015) 1: 903-14].

Hypo-methylatie van de IL21R gen-promoter kan wijzen op verhoogde expressie van de IL21-receptor. De ligand-binding van deze receptor leidt tot de aktivatie van meerdere ‘downstream’ signalisering-molekulen, inclusief JAK1, JAK3, STAT1 & STAT3. ‘Studies suggereren een rol voor dit gen bij het reguleren van de immunoglobulinen-produktie. IL21 reguleert aangeboren én adaptieve immuun-responsen, en oefent ook belangrijk effekten uit op inflammatoire responsen die de ontwikkeling van auto-immune ziekten en inflammatoire aandoeningen bevorderen. Belangrijk: IL21-signalisering is cruciaal voor de inductie van spontane experimentele auto-immune encefalomyelitis. De in onze studie gerapporteerde DMPs zijn niet enkel consistent en valideren de eerdere studies betreffende gen-regulerende elementen in genen binnen de immuun-cel regulering cluster maar ze bieden ook een beter begrip door het gebruik van geavanceerde technologie alsook de validatie via groepen van verwijderde geografische lokaties.

Het is meldenswaardig dat het nog te vroeg is om te besluiten uit eerdere studies of onze huidige studie, of de significante epigenetische modificaties die geassocieerd bleken met M.E./CVS op een compenserend homeostatisch mechanisme wijzen of het resultaat zijn van een adaptieve immuun-respons op inductoren uit de omgeving. Deze resultaten geven echter aan dat DNA-methylatie een potentieel gen-regulerend mechanisme vormt dat in staat is langdurige veranderingen bij M.E./CVS-patiënten te mediëren, zoals eerder opgemerkt door andere auteurs. Samengevat: de associatie van differentiële DNA-methylatie met M.E./CVS suggereert zeker een potentiële rol voor epigenetische wijzigingen in de pathofysiologie van M.E./CVS.

Besluiten

Naar ons weten is dit de eerste studie die epigenetische veranderingen in relatie tot M.E./CVS over gans het genoom heeft onderzocht gebruikmakend van ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die meer dan 850.000 CpG-‘sites’ beslaan en die de resultaten heeft gevalideerd in 2 geografisch van elkaar gelokaliseerde groepen M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen bouwen verder op eerdere preliminaire rapporten die een verband tonen tussen gewijzigde methylatie-profielen van genen met immuun-funkties en DNA-methylatie bevestigen als een epigenetisch regulerend mechanisme geassocieerd met M.E./CVS. Er zijn toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-indviduen nodig om deze bevindingen te bevestigen en de effekten van dergelijke methylatie-patronen op gen-expressie te evalueren.

augustus 17, 2016

Karakterisatie van mest-cel fenotypes uit PBMCs bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 2:26 pm
Tags: , , , , , ,

In ‘Mest-cellen & Substantie-P’ hadden we het over de concepten van Prof. dr Theoharis C. Theoharides van de ‘Tufts University School of Medicine’. Een ander research-team had ook al gerapporteerd over de rol van mest-cellen bij Posturaal Orthostatisch Tachycardie Syndroom (‘Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS ?)’). Theoharides beschreef wetenschappelijk onderzoek betreffende de rol van mest-cellen en histamine in de hersenen. Dit zou ook van belang kunnen zijn bij M.E.(cvs). Lees ook: ‘Hersen-mist, inflammatie – behandeld met luteoline?’, ‘Mest-cel aktivatie aandoeningen bij POTS (& CVS?)’ & ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie’.

De hieronder gerapporteerde resultaten zijn preliminair en dienen zeker te worden bevestigd. Ze geven aan dat er een verschil is wat betreft de mest-cellen tussen patiënten met matige en ernstige M.E.(cvs). Meer mest-cellen en of een verandering van mest-cel aktiviteit zou inflammatoire reakties kunnen veroorzaken. Als de bevindingen stand houden bij replicatie (het gaat hier nl. over een zeer beperkte groep), dient men na te gaan wat oorzaak en wat gevolg is; en het zou ook interessant zijn meer te weten over wat er gebeurt bij inspanning. In elke geval is dit artikel het eerste dat experimentele gegevens over mest-cellen bij M.E.(cvs)-patiënten biedt.

————————-

Asian Pacific Journal of Allergy & Immunology 2016 [pre-print]

Novel characterisation of mast cell phenotypes from peripheral blood mononuclear cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis patients

Thao Nguyen (1,2), Samantha Johnston (1,2), Anu Chacko (1,2), Damien Gibson (1,2), Julia Cepon (1,2), Peter Smith (2), Donald Staines (1,2), Sonya Marshall-Gradisnik (1,2)

1 School of Medical Science, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD Australia

Samenvatting

ACHTERGROND: Mest-cellen (MCs) mediëren inflammatie via neuropeptiden en cytokinen, samen met histamine en reaktieve zuurstof soorten (ROS). Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een ziekte die wordt gekenmerkt door een onverklaarde uitputtende vermoeidheid met meerdere fysiologische stoornissen en ontregelde cytokine-profielen.

DOELSTELLING: Het bepalen van mest-cel fenotypes in geïsoleerde menselijke PBMCs, van gezonde controles en CVS/M.E.-patiënten. Het bepalen van receptor expressie van RAGE en z’n ligand ‘high mobility group box 1’ proteïne (HMGB1).

METHODE: Patiënten met matige CVS/M.E. (n = 12, gemiddelde leeftijd 39,25 ± SD 3,52 jaar), patiënten met ernstige CVS/M.E. (n = 6, gemiddelde leeftijd 43,00 ± SD 4,02 jaar) en gezonde controles (n = 13, gemiddelde leeftijd 42,69 ± SD 3,87 jaar) werden in deze studie opgenomen. De CVS/M.E.-patiënten kregen de diagnose via de 2011 Internationale Consensus Criteria [Carruthers BM et al. Myalgic Encephalomyelitis: International Consensus Criteria. J Intern Med. (2011) 270: 327-38]. Er werd flow-cytometrie aangewend voor het identificeren van de fenotypische perifere mest-cel populatie in PBMCs gebruikenmakend van een exclusie-merker cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) en inclusie-merkers (CD117 [cel-oppervlakte proteïne gebruikt om bepaalde types bloedcel-voorlopers te identificeren], CD34 [antigen van hematopoietische (bloedvormende) voorloper-cellen], FCεRI [receptor met hoge affiniteit voor een deel van immunoglobuline-E, een antilichaam betrokken bij allergie en immuniteit tegen parasieten], chymase [type protease (proteïne-splitsend enzyme) voornamelijk aanwezig in mest-cellen], HLA-DR & CD154). De expressie van HMGB1 en oplosbaar RAGE werd gemeten in het plasma.

RESULTATEN: Er was een significante toename qua CD117+CD34+FCεRIchymase mest-cel populaties bij patiënten met matige en ernstige CVS/M.E. t.o.v. de gezonde controles. Er was een significante toename qua CD40-ligand en MHC-II receptoren op gedifferentieerde mest-cel populaties bij ernstige CVS/M.E. in vergelijking met gezonde controles en patiënten met matige CVS/M.E. Er waren geen significante verschillen voor HMGB1 & sRAGE tussen de groepen.

BESLUITEN: Deze preliminaire studie onderzocht mest-cel fenotypes in PBMCs van gezonde controles. We rapporteren een significante stijging van naïeve MCs bij matige en ernstige CVS/M.E. vergeleken met gezonde controles. Bovendien was er een significante toename qua CD40-ligand en MHC-II receptoren op gedifferentieerde mest-cellen bij ernstige CVS/M.E. Perifere MCs zouden van belang kunnen zijn bij CVS/M.E.-pathologie maar er is echter verder onderzoek vereist om hun rol te bepalen.

Inleiding

Mest-cellen (MCs) worden gevonden in het bloed waar ze circuleren in een onrijpe vorm, vooraleer ze migreren naar weefsels, waar ze differentiëren naar funktionele cellen zoals bindweefsel- (serosale [van de serosa of sereuze – vochtafscheidende – membranen vliezen]) en mucosale [van de musoca (slijmvliezen)] MCs. Belangrijk: rijpe cellen circuleren gewoonlijk niet in het perifeer bloed aangezien ze vrijkomen als onrijpe cellen in het perifeer bloed waarna ze migreren over het gans het lichaam naar weefsels zoals de huid, mucosa, hersenen en luchtwegen, waar ze rijping ondergaan. Stamcel-factor, ook gekend als c-kit [CD117], is het ligand voor de receptor die verantwoordelijk is voor de overleving en ontwikkeling van MCs. Bijkomend zijn immuun-modulatoren – zoals groei-factoren, cytokinen en chemokinen – in staat MCs en hun fenotypes te beïnvloeden. MC-fenotypes worden verder gedefinieerd volgens hun protease-inhoud. MC-aktivatie en -degranulatie kan gebeuren via FCεRI (IgE ‘cross-linking’ [Binding van antigenen met IgE dat reeds gebonden is met FcεRI op mest-cellen veroorzaakt ‘cross-linking’ van gebonden IgE en de aggregatie van het FcεRI, wat aanleiding geeft tot degranulatie en de afgifte van mediatoren door de cellen.]) of onafhankelijke mechanismen zoals andere immunoglobulin-receptoren (FCγR), cytokinen, chemokinen, neuropeptiden en via receptoren betrokken bij mest-cel interaktie met omringende immuun-cellen (MHC-II, CD40L, OX40). Het MC-fenotype wordt bepaald door het niveau van oppervlakte-expressie van de belangrijkste differentiërende CD-merkers zoals CD117 (c-kit), FCεRI & CD33, waarbij ‘bright’ [helder] & ‘dim’ [dof] populaties kunnen worden gezien, samen met de oppervlakte-expressie van CD34. De CD34 merker komt tot expressie tijdens de onrijpe stadia van de MC. Mest-cellen die gedifferentieerd, rijp of geaktiveerd zijn, brengen FCεRI & HLA-DR tot expressie. Geaktiveerde MCs produceren meerdere pro-inflammatoire mediatoren en geven ze af uit intracellulaire voorraden die de inflammatoire omgeving veranderen om immuun-cellen te mobiliseren naar de plaats van de pathogene infektie en om lymfeknopen te draineren. Belangrijk is dat menselijke MC-fenotypes werden gekarakteriseerd in beenmerg en weefsels bij pathologische ziekten. Ze werden nog niet goed gekarakteriseerd in het perifeer bloed.

Onderzoeken hebben MC-fenotypes gekarakteriseerd uit beenmerg en weefsels bij pathologische ziekten gebruikmakend van methodes die slecht reproduceerbaar/duur zijn, met biologische eigenschappen die verschillen van in vivo (menselijk primair cel-cultuur model of primaire cel-lijnen). Er is dus nood aan het ontwikkelen van een relevant, reproduceerbaar en goedkoop in vitro model om de morfologische en biologische eigenschappen weer te geven van MCs die worden gevonden in vivo. Daarom zal de identificatie van MCs uit het perifeer bloed d.m.v. flow-cytometrische methodes, MC-fenotype en -funktie bij gezonde mensen en bij ziekten vergemakkelijken en ophelderen.

Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) is een invaliderende heterogene aandoening met immune, neurologische, musculoskeletale, gastro-intestinale en autonome symptomen. De etiologie van CVS/M.E. is niet gekend maar immuun-dysfunktie bleek echter consistent betrokken bij het pathomechanisme van de ziekte. Atypische niveaus van regulerende T-cellen (Treg), en pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokinen, aanmaak van stikstof-oxide en hypersensitiviteit-responsen suggereren dat bij de pathofysiologie van CVS/M.E. de aktivatie van inflammatoire mechanismen betrokken zijn. [Buchwald D et al. Markers of inflammation and immune activation in chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J. Rheumatol. (1997) 24: 372-6 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88] Nucleaire factor kappa beta (NF-κB) is een transcriptie-factor die een rol speelt bij inflammatoire mechanismen, cel-proliferatie, -differentiatie en -overleving. Andere onderzoekers rapporteerden significante stijgingen qua NF-κB bij CVS/M.E.-patiënten.

De ‘Receptor for Advanced Glycation End-products’ (RAGE) [glycatie = niet-enzymatische glycosylatie; binden van suiker-molekulen] is een multi-ligand lid van de immunoglobuline-superfamilie van cel-oppervlakte molekulen. De liganden omvatten het ‘high mobility group box 1’ proteïne (HMGB1 [een celkern-proteïne dat passief wordt afgegeven door necrotische cellen en aktief wordt gesecreteerd in respons op inflammatoire stimuli]) en AGEs, die gekend zijn om hun belangrijke rol bij de amplificatie van chronische inflammatie en geassocieerd zijn met inflammatie. Vandaar dat het belangrijk is te weten of zelf-bestendigende inflammatoire signalen aangekondigd worden door mest-cellen geaktiveerd door RAGE bij CVS/M.E.

Het doel van dit onderzoek was MC-fenotypes te identificeren in geïsoleerde menselijke PBMCs d.m.v. flow-cytometrie en de oplosbare receptor RAGE, alsook z’n ligand ‘high mobility group box 1’ protïne (HMGB1), bij gezonde controles en CVS/M.E.-patiënten.

Methodes

Individuen

De CVS/M.E.-patiënten werden gematcht voor leeftijd met de gezonde controles: 13 gezonde controles (42,69 ± 3,87 jaar), 12 patiënten met matige CVS/M.E. (39,25 ± 3,52 jaar) en 6 met ernstige CVS/M.E. (43,00 ± 4,03 jaar). De diagnose CVS/M.E. werd gesteld volgens de Internationale Consensus Criteria […]. De ernst van de vermoeidheid en groepering van de CVS/M.E.-patiënten werd bepaald op basis van Dr David Bell’s invaliditeit-schaal (DBDS). Matige CVS/M.E. = score van 30% of hoger op de DBDS. Ernstige CVS/M.E. = score van minder dan 30% op de DBDS (huis- of bed-gebonden). […]

[…]

Mest-cel fenotype immuun test

Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werden geïsoleerd om granulocyten (neutrofielen, basofielen en eosinofielen) te helpen verwijderen en kleuring met trypaan-blauw stelde de cel-leefbaarheid vast. […].

Flow-cytometrie

[…] Exclusie-merkers: Lin2 [lineage = afstammingslijn] cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) om lymfocyten, monocyten, eosinofielen en neutrofielen uit te sluiten. Inclusie-merkers en proteïne ter identificatie van de mest-cellen: CD117, CD34, FCεRI & chymase. De mest-cellen werden verder gekarakteriseerd d.m.v. interaktie-merkers: HLA-DR (MHC-II), CD154 (CD40L). De mest-cel subsets werden gedefinieerd als mest-cel voorloper (CD117+CD34+FCεRIchymase), rijpe mest-cel (CD117+CD34FCεRI) en geaktiveerde mest-cel (CD117+CD34FCεRIHLA-DR+CD40L+).

HMGB1 & sRAGE ELISA

[..]

Statistische analyses

[…]

Resultaten

Er waren geen significante verschillen tussen de groepen wat betreft geslacht, leeftijd en pathologie [gezond – matige CVS/M.E. – ernstige CVS/M.E.]. Er was een significant verschil tussen de groepen voor de Dr Bell’s vermoeidheid-score: de gemiddelde score voor de gezonde controle-groep was 92%; de gemiddelde score voor de groepen met matige en ernstige CVS/M.E. was 53% & 25%, respectievelijk.

Identificatie van menselijke mest-cellen in perifeer bloed

De Lin2 monoclonale antilichamen cocktail (anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD20 & anti-CD56) werd gebruikt om immuun-cellen (T-cellen, B-cellen, ‘Natural Killer’ cellen, monocyten, eosinofielen en neutrofielen) te labelen De cellen gelabeld met een myeloïde receptor (anti-CD117) werden beschouwd als CD117+ [voorbestemd om (rijpe) mest-cellen te worden]. CD117+ mest-cellen werden verder gelabeld met anti-CD34 & anti-FCεRI om 4 verschillende fenotypes te differentiëren: FCεRI+CD34, FCεRI+CD34+, FCεRICD34 en FCεRICD34+. De 4 fenotypes vertoonden ook lage en sterke expressie voor intracellulair chymase, en interaktie-receptoren CD40L [CD40 ligand; regelt de B-cel rijping, pro-inflammatoire merker] en ‘major histocompatibility complex’ klasse-II (MHC-II). De FCεRI+CD34 vertoonden hogere expressie qua CD40L & MHC-II. Terwijl de FCεRI+CD34+ en de FCεRICD34+ populatie ‘low/dim’ expressie qua MHC-II receptoren en negatieve expressie qua CD40L vertoonden. Zowel MHC-II & CD40L receptoren vertoonden negatieve expressie op de FCεRICD34.

Verhoogde waarden van mest-cel voorlopers bij matige en ernstige CVS/M.E.

Mest-cellen met CD117+CD34+FCεRI die geen intracellulair chymase tot expressie brachten werden vergeleken (controle, matige & ernstige CVS/M.E.). CD117+CD34+FCεRIchymase cellen bleken significant verhoogd bij de patiënten met matige én ernstige CVS/M.E. vergeleken met de gezonde controle groep. Er werd geen verschil gezien tussen andere subsets.

Upregulering van perifere mest-cel interaktie receptoren bij ernstige CVS/M.E.

De oppervlakte-merkers CD154 en HLA-DR receptoren werden vergeleken tussen controle, matige en ernstige CVS/M.E. Er was een significante toename qua CD154 (CD40L) & HLA-DR (MHC-II) receptoren voor de patiënten met ernstige CVS/M.E. vergeleken met de gezonde controles en de patiënten met matige CVS/M.E.

sRAGE en z’n ligand HMGB1 bij ernstige CVS/M.E.-patiënten

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft HMGB1 & sRAGE.

Bespreking

Dit artikel rapporteert, voor de eerste keer, over de identificatie van MC-fenotypes in PBMCs van gezonde individuen. Er werden voor het eerst flow-cytometrische methodes gebruikt op basis van een cocktail met inclusie en exclusie cel-merkers, samen met cel-oppervlakte merkers CD154 & MHC-II (HLA-DR). We konden MC-voorlopers (CD117+CD34+FCεRIchymase), rijpe MCs (CD117+CD34FCεRI) en geaktiveerde MCs (CD117+CD34FCεRIHLA-DR+CD40L+) identificeren in menselijke PBMCs van gezonde individuen. In het vergelijkend onderzoek rapporteren we ook nieuwe bevindingen van een significante toename qua CD117+CD34+FCεRIchymase MC bij matige en ernstige CVS/M.E. in vergelijking met gezonde controles. We waren ook de eersten om een significante toename qua CD40 ligand en MHC-II receptoren te rapporteren op gedifferentieerde MC-populaties bij patiënten met ernstige CVS/M.E. (t.o.v. de groep gezonde controles en patiënten met matige CVS/M.E.).

Een bijzondere sterkte van deze studie is dat het de identificatie ondersteunt van MC-fenotypes en receptor-expressie in geïsoleerde menselijke PBMCs d.m.v. flow-cytometrische technieken zonder de nood aan morfologische en op cel-culturen gebaseerde karakterisatie.

Onze research-bevindingen rapporteren een significante toename qua mest-cel voorlopers (MCPs) (CD117+CD34+FCεRIchymase) bij zowel matige als ernstige CVS/M.E. t.o.v. controles. MCPs circuleren in het bloed en lymfatische kanalen, en migreren naar perifere weefsels bij inflammatie. MCPs hebben een uitgebreid proliferatie-potentieel en kunnen differentiëren naar bindweefsel en mucosale mest-cellen afhankelijk van de factoren aanwezig in de micro-omgeving van het weefsel. Rijpe mest-cellen zijn afgeleid van MCPs onder de invloed van stamcel-factor (SCF) die lokaal wordt gesecreteerd door fibroblasten, stromale cellen [steun-cellen] en endotheliale cellen. Mest-cel rijping en biologische expressie in de micro-omgeving van het weefsel wordt beïnvloed door cytokinen – in het bijzonder IL-4, IL-10, IL-17, TNF-α & IFN-γ – waarvan werd gerapporteerd dat ze verhoogd zijn bij in CVS/M.E.-patiënten: dit suggereert dat deze cytokinen de micro-omgeving van het weefsel kunnen beïnvloeden bij CVS/M.E.-patiënten en bijgevolg de proliferatie en differentiatie van MCPs naar rijpe mest-cellen. [Peterson D, Brenu EW et al. Cytokines in the Cerebrospinal Fluids of Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Mediators Inflamm. (2015) 2015: 4 /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. ( 2012) 10: 88]

Mest-cellen brengen een brede waaier aan cel-oppervlakte receptoren en liganden tot expressie, die de communicatie met immuun-cellen behorend tot de aangeboren en verworven immuniteit mediëren, alsook met niet-immune weefsel-specifieke cel-types. Onze nieuwe ontdekking betreffende de significante toename qua CD154 (CD40L) & HLA-DR (MHC-II) receptoren bij ernstige CVS/M.E. vs. gezonde controles en bij matige CVS/M.E. suggereert dat MCs, macrofagen en gliale cellen die CD40L tot expressie brengen, mogelijks een rol spelen bij het mediëren van immune ontregeling van B- & T-cel responsen, alsook bijdragen tot neuro-inflammatie bij CVS/M.E. MHC-II expressie op MC ondersteunt de T-cel proliferatie en effector-funkties, wat daaropvolgend leidt tot expansie van Tregs en B-cel proliferatie. Belangrijk: andere onderzoekers hebben verhoogde aantallen Tregs, B-cel fenotypes en inflammatie bij in CVS/M.E.-patiënten gerapporteerd. [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42]

Het is bekend dat RAGE een rol spelt bij in MC-aktivatie: het werd geïdentificeerd op serosale en mucosale mest-cellen. De mechanismen die werden voorgesteld met betrekking tot RAGE-aktivatie van MC omvatten de produktie van reaktieve zuurstof soorten (ROS) en histamine-afgifte die betrokken zou kunnen zijn bij sensitiviteit, allergische reakties en immuun-inflammatie. Multipele chemische sensitiviteit bv., is een co-morbiditeit van CVS/M.E. Afgescheiden RAGE en z’n ligand, HMGB1, verschilde niet significant tussen de groepen. Verder onderzoek naar de RAGE-receptor op MC kan de MC inflammatoire respons bij in CVS/M.E.-patiënten helpen begrijpen.

Mest-cel aktivatie bleek geassocieerd met dysfunktie van de bloed-hersen-barrière (BBB) zoals neuro-inflammatie. Neuro-inflammatie werd d.m.v PET-scans vastgesteld bij CVS/M.E.-patiënten. [Nakatomi Y, Mizuno K, Ishii A, Wada Y, Tanaka M, Tazawa S et al. Neuro-inflammation in Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Nuclear Medicine (2014) 55: 945-50] Tijdens neuro-inflammatie kunnen mest-cellen reageren op neuropeptiden, zoals vaso-aktief intestinaal polypeptide (VIP [zie o.a. ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiële biomerkers bij M.E.(cvs)’ & ‘Cerebrale inflammatie? TNF-α, Microglia, Bloed-Hersen-Barrière]) […]. We hebben gerapporteerd over verhoogde VIP receptor (VPAC2) [Ook Light et al. rapporteerden dat de vaso-aktief intestinaal peptide receptor (ook VIPR2 genaamd) gelinkt bleek met vermoeidheid- en pijn-ernst bij M.E(cvs); zie ‘Piloot-studie gen-expressie bij kanker versus M.E.(cvs)’.] op CD4+ T-cellen en gedaald IL-10 in cerebrospinaal vocht van CVS/M.E.-patiënten. Verder hadden CVS/M.E.-patiënten, vergeleken met controles, significant verhoogd serum IFN-γ, IL-5 & IL-10. [Wong N, Nguyen T, Brenu EW, Broadley S, Staines D, Marshall-Gradisnik S. A Comparison of Cytokine Profiles of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis Patients. Intl J Clin Med (2015) 6: 769-783; zie ook ‘Variaties qua cytokinen bij M.E.(cvs)] Stijging qua IFN-γ is opmerkenswaardig, omdat het een sterk cytokine is voor antigen-presentatie en expressie van MHC-II op mest-cellen. Detektie van perifere MC kan mogelijks verdere mechanismen van neuro-inflammatie in de hersenen van CVS/M.E.-patiënten ophelderen.

Besluit

We hebben geaktiveerde mest-cellen ontdekt, voor de eerste keer, bij CVS/M.E.-patiënten alsook mest-cel fenotypes geïdentificeerd in het bloed van gezonde controles. Bovendien vereist de vermoedelijke distributie van geaktiveerde mest-cellen in bijna alle weefsels en organen in het lichaam verder onderzoek om vast te stellen of ze een rol spelen in het pathomechanisme van CVS/M.E. Belangrijk: neuro-inflammatoire processen en hun gevolgen met betrekking tot de bloed-hersen-barrière en het brein-parenchym [funktioneel orgaan-weefsel] dienen verder te worden onderzocht bij deze patiënten.

————————-

Lawrence B. Afrin een klinicus, hematoloog en ook specialist op gebied van mest-cellen (Division of Hematology, Oncology and Transplantation, University of Minnesota, Minneapolis, USA) schrijft in één van zijn artikels (‘Mast cell activation disease and the modern epidemic of chronic inflammatory disease’; (Translational Research (2016) 174: 33-59) dat mest-cel aktivatie syndroom een mogelijke onderliggende/verenigende verklaring is voor een diverse waaier aan kwalen met een inflammatoire component (bv. astma, prikkelbare darm syndroom, fibromyalgie, M.E.(cvs), obesitas, diabetes mellitus, artheriosclerose). In verband met M.E.(cvs) verwijst hij ook naar het werk van Theoharides…

mei 27, 2016

NK-cellen & SNPs in ion-kanalen en receptor-genen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:19 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel is een integratie van resultaten betreffende TRP (‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’) en AChR (‘SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS’) gevonden in vol-bloed bij M.E.(cvs)-patiënten en het verder onderzoeken van deze bevindingen bij geïsoleerde NK-cellen. De lezer wordt aangeraden vooraf missschien ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ (en ev. andere artikels betreffende NK-cellen alhier ook nog eens na te lezen…

In essentie rapporteert men hier over abnormale genen coderend voor ion-kanalen & receptoren in (geïsoleerde) ‘natural killer’ cellen. Men legt uit, op basis hiervan, waarom NK-cellen (onderdeel van het immuunsysteem) bij M.E.(cvs) niet goed funktioneren. Deze genen worden ook niet enkel gevonden in NK-cellen en met stelt dat de anomalieën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor andere de andere symptomen van de ziekte.

Het research-team van het ‘National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases’ (NCNED) – waartoe deze onderzoekers behoren – blijken op termijn ook een screening-test op de markt te willen brengen op basis van “nieuwe merkers geïdentificeerd op witte bloedcellen”. Het is niet helemaal duidelijk of de hieronder beschreven SNPs daar ook onder vallen maar naar aanleiding van het persbericht daarover sprak Prof. Staines echter over “zeer specifieke delen van genen die coderen voor bepaalde receptoren of proteïnen die belangrijke rollen spelen bij het metabolisme, neuronale en cardiovasculaire funktie, enz.”. Wellicht zal het een combinatie zijn met de door deze onderzoeksgroep eerder gerapporteerde en gepatenteerde miRNAs…

————————-

Application of Clinical Genetics Vol. 9, pp 39-47 (2016)

Natural killer cells and single nucleotide polymorphisms of specific ion channels and receptor genes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Teilah Huth (1,2), Anu Chacko (1,2), Samantha Johnston (1,2), Pete Smith (2), Donald Staines (2)

1School of Medical Science, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases [NCNED], Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Samenvatting

Doelstelling Het doel van dit artikel is om de cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) cellen te bepalen, en te kijken of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en genotypes in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen en acetylcholine-receptoren (AChRs) aanwezig waren in geïsoleerde NK-cellen van patiënten die eerder de diagnose Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kregen.

Individuen en methodes Er werd een totaal van 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar oud) en 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar oud) in deze studie opgenomen. Patiënten kregen de diagnose op basis van de CDC criteria. Er werd flow-cytometrie aangewend om de NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Er werd een totaal van 678 SNPs in geïsoleerde NK-cellen onderzocht (voor 21 zoogdier TRP ion-kanaal genen en 9 zoogdier AChR genen […]). SNP-associatie en genotype werd bepaald […].

Resultaten M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua percentage lysis van doelwit-cellen door NK (17% ± 4,68%) t.o.v. de niet-vermoeide controle-groep (31% ± 6,78%). Van de 678 onderzochte SNPs, werden 11 SNPs voor TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) geïdentificeerd in de M.E./CVS-groep. 5 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3, terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8, TRPC2 & TRPC4 (P < 0.05). 14 SNPs bleken geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen: 6 met CHRNA3, de rest met CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5 & CHRNE (P < 0.05). Er werden 16 genotypes geïdentificeerd met SNPs in TRP ion-kanalen en AChRs voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1) (P < 0.05).

Besluit We identificeerden een aantal SNPs en genotypes voor TRP ion-kanalen en AChRs bij geïsoleerde NK-cellen bij patiënten met M.E./CVS, wat suggereert dat deze SNPs en genotypes betrokken kunnen zijn bij veranderingen qua NK-cel funktie en de ontwikkeling van M.E./CVS-pathologie. Deze anomalieën suggereren een rol voor de ontregeling van Ca2+ in AChR en TRP ion-kanaal signalisering in het pathomechanisme van M.E./CVS.

Inleiding

‘Natural killer’ (NK) cellen zijn granulaire [gekorrelde] lymfocyten die worden gevonden in het perifeer bloed, het beenmerg, de milt en in lymfeknopen. In het perifeer bloed beslaan NK-cellen 15% van de lymfocyten en ze kunnen worden gegroepeerd in 4 subtypes volgens de expressie op het cel-oppervlak en de densiteit van CD56 (neurale cel-adhesie molekule) en CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG). Deze fenotypes omvatten CD56brightCD16-/dim, CD56dimCD16bright, CD56dimCD16 & CD56CD16bright. Ongeveer 90% van de NK-cellen in het perifeer bloed zijn CD56dimCD16bright en de CD56bright beslaan ca. 10%. NK-cel cytotoxische aktiviteit vereist een aantal gereguleerde processen om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] van de doelwit-cel te verzekeren.

Hoewel er weinig is geweten over Ca2+-signalisering in NK-cellen, werd er gezien dat het granule-afhankelijk pad voor apoptose calcium-afhankelijk is, terwijl het ‘death’-receptor mechanisme dat niet is. Bij apoptose bleken het transport van lytische proteïnen, exocytose [proces waarbij een vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan samensmelten en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte] en fusie duidelijk calcium-afhankelijk. Ca2+ is ook vereist voor de her-oriëntatie van microtubules [buisvormige proteïne-strukturen die deel uitmaken van het cel-skelet] en het actine-skelet [het proteïne actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], alsook de aktivatie van cytokinen gen-transcriptie. Bovendien hebben studies aangetoond dat er een verband bestaat tussen calcium-mobilisatie en het stopzetten van de degranulatie in PLCγ2-deficiënte NK-cellen [PLC = fosfolipase; PLC-gamma is een belangrijke regulator van intracellulair Ca2+].

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen komen tot expressie op bijna alle cellen en hebben een significant effekt op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, zoals kanker, skeletale abnormaliteiten, pijn-syndroom, enz. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd bij aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen, en hebben een belangrijke rol bij Ca2+-signalisering.

Acetylcholine (ACh) bindt op 2 membraan-proteïnen, namelijk de muscarine receptor (mAChR) en de nicotine receptor (nAChR), waarvan meerdere isoformen bestaan. ACh heeft niet-neuronale funkties, het non-neuronaal cholinerg system genaamd, in pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, ooglens-cellen en vasculair endothelium [= bedekkende cellen van bloedvaten] van het brein, dat gemedieerd wordt door Ca2+-signalisering. AChRs brengen aktivatie-signalen over in een waaier van menselijke weefsels, inclusief skelet- en gladde spieren, alle pre-ganglionische [van het CZS tot de ganglia (zenuw-knopen)] autonome zenuw-vezels, post-ganglionische [van de ganglia naar een orgaan] autonome parasympathische zenuwen, en op veel plaatsen over gans het centraal zenuwstelsel.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) heeft een ongekende etiologie en er is geen specifieke diagnostische test. De ziekte wordt grotendeels gekenmerkt door significante stoornissen van de lichamelijke aktiviteit en uitputtende vermoeidheid, en kan gepaard gaan met stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie, meer spier- en gewricht-pijn, hoofdpijn, pijnlijke keel en lymfeknopen. Het is verder geassocieerd met ontregeling van het gastro-intestinaal, cardiovasculair en immuunsysteem. Belangrijk: NK-cel dysfunktie, in het bijzonder verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit, is een courante bevinding bij M.E./CVS-patiënten. We hebben eerder ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in TRP ion-kanaal genen (TRPM3, TRPA1, TRPC4) en AChR genen (CHRM3, CHRNA10, CHRNA5 & CHRNA2) in perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten. [Marshall-Gradisnik SM, Smith P, Brenu EW, Nilius B, Ramos SB, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in transient receptor potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights. (2015) 7:1-6 /// Marshall-Gradisnik S, Smith P, Nilius B, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms in acetylcholine receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights (2015) 7: 7-20; zie links onze inleiding] Deze SNP-anomalieën in genen coderend voor TRP ion-kanalen en AChRs kunnen gewijzigde receptor-proteïnen opleveren, die mogelijks de strukturen van TRP ion-kanalen en AChR, en ook hun funkties kunnen veranderen.

Het doel van deze studie was de NK cytotoxische aktiviteit te bepalen, alsook of SNPs en hun genotypes aanwezig waren in TRP ion-kanaal en AChR genen in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten.

Individuen en methodes

[…]

Resultaten

Deelnemers

Er waren 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar) waarvan 71,79% vrouwen. Er waren 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar) waarvan 56,67% vrouwen. […] Er werden geen significante verschillen gevonden qua tellingen van witte bloedcellen tussen M.E./CVS-patiënten en de niet-vermoeide controle-groep. […]

NK-cel zuiverheid

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft NK zuiverheid-graad. De zuiverheid van de NK-cellen na isolatie en aanrijking was > 93%.

NK-cel cytotoxische aktiviteit

Er was een significant verschil voor NK cytotoxische aktiviteit tussen de groepen wat betreft de E:T [effector/target’] ratio van 25:1 [de optimale verhouding voor het bepalen van de cytotoxische aktiviteit]. M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua NK percentage lyse van doelwit-cellen (17% ± 4,68%) vergeleken met de controle-groep (31% ± 6,78%).

SNP-analyse

Van de 678 SNPs geïdentificerd in TRP ion-kanaal and AChR genen van geïsoleerde NK-cellen, waren er 11 SNPs in TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) die significant geassocieerd waren met de M.E./CVS-groep. Daarvan waren er 5 geassocieerd met TRPM3 […] terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8 […] & TRPC4 […].

Er waren 14 SNPs geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen, waarvan er 6 met CHRNA3 […] en de rest met CHRNA2 […], CHRNB4 […], CHRNA5 […] & CHRNE […].

Genotype-analyse

Er werden 16 genotypes met SNPs geïdentificeerd die significant bleken voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1). Van de als significant geïdentificeerde SNPs gingen we verder na of genotypes verschilden tussen de groepen. […] De ‘odds ratio’s [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] voor specifieke genotypes met SNPs in TRP & AChR genen in geïsoleerde NK-cellen varieerde tussen 3.13 & 11.39 voor M.E./CVS vergeleken met de niet-vermoeide controle-groep.

Bespreking

Verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit werd eerder al gerapporteerd bij M.E./CVS en de studie hier ondersteunt deze bevindingen. Het huidig onderzoek ondersteunt nieuwe bevindingen aangaande een aantal SNPs in genen coderend voor AChR en TRP varianten en genotypes van geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Een bijkomende nieuwe bevinding is de identificatie van SNPs in TRPM3 & TRPM8 bij geïsoleerde NK-cellen, suggererend dat er TRPM3 & TRPM8 receptoren gelokaliseerd zijn op NK-cellen.

We rapporteren een significante reductie van de NK-lyse bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de niet-vermoeide controles. De rol van TRP ion-kanalen bij Ca2+-signalisering, en aangeboren en adaptieve immuun-cellen wordt meer en meer gedocumenteerd. De TRPs bleken TRP kation-kanalen [TRPC worden geaktiveerd door fosfolipase-C, membraan enzymen die fosfolipiden splitsen] en TRP-melastatine [TRPM; melastatine is een vermeende tumor-suppressor] subfamilies, voornamelijk TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPM2, TRPM4 & TRPM7 tot expressie te brengen. Deze kanalen zijn niet-selektief en doorlaatbaar voor calcium. Ca2+ speelt een sleutelrol bij fusie van lytische granules in NK-cellen, alsook bij het verzekeren dat lytische granules zich naar de immuun-synaps [de interface tussen een antigeen-presenterende cel of doelwit-cel en een lymfocyt zoals een effector-T-cel of NK-cel] verplaatsen om perforine en granzymes af te geven om doelwit-cellen te doden. Rho GTPase Miro [Mitochondriaal Rho GTPase; een enzyme met een belangrijke rol bij mitochondriaal transport, betrokken bij mitochondriale homeostase en apoptose] biedt een link tussen de mitochondrieën en de microtubules, waar het de Ca2+-afhankelijke stopzetting van de mitochondriale motiliteit medieert. Aangezien Miro mitochondriale polarisatie [ontstaan/opbouw van een spanningsverschil over de mitochondriale membranen] modificeert, zou het ook transport van lytische granules naar de immuun-synaps kunnen veranderen, alsook de lytische funktie, te wijten aan de modulatie door de Ca2+-concentratie in het cytosol via TRP-melastatine en AChR genen. Het is duidelijk: mitochondrieën spelen een belangrijke rol bij de werking van NK-cellen. De ontdekking dat mitochondrieën een waaier aan AChR-subtypes tot expressie brengen, inclusief nicotine-α3, die differentieel tot expressie komen naar gelang het weefsel-type, suggereert dat nAChRs een impact kunnen hebben op de mitochondriale funktie en regulering van oxidante stress. Interessant: we rapporteerden eerder een significante daling van de ‘respiratory burst’ [of ‘oxidative burst’; snelle afgifte van reaktieve zuurstof molekulen; speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem] funktie van neutrofielen bij M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW, Staines DR et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8:1; zie link onze inleiding]

TRPM2 en TRPM3 mobiliseren Ca2+, waarbij de laatste de Ca2+-signalisering bleek te mediëren voor polarisatie van cytolytische granules en degranulatie. [Na de herkenning van doelwit-cellen door NK-cellen worden NK-cel receptoren geaktiveerd, wat helpt bij de vorming van een immuun-synaps, waarbij cytolytische granules die perforine en granzymes bevatten, in dezelfde richting worden geleid.] […] Interessant is ook dat gelijkaardige bevindingen voor NK-cel funkties werden gerapporteerd in de M.E./CVS-research [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One. (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012)10: 88 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81], wat mogelijks suggereert dat de genotype-wijzigingen die hier werden gerapporteerd voor TRPM3 ook een gelijkaardige rol kunnen spelen bij polarisatie en degranulatie van cytolytische granules.

Van de 678 SNPs die werden onderzocht, waren er 11 varianten van TRP ion-kanalen en 14 varianten van AChRs die significant geassocieerd waren met M.E./CVS vergeleken met niet-vermoeide controles. De variante TRP-SNPs waren gelegen in de gen-sequentie van 2 [kanonieke] TRP ion-kanalen (TRPC2 & TRPC4) en 2 melastatine TRP ion-kanalen (TRPM3 & TRPM8). We rapporteren ook variante SNPs in genen coderend voor 2 van de CHRM3receptoren, 2 CHRM1receptoren, 6 CHRNA3receptoren, 3 CHRNA2receptoren en 1 CHRNA5receptor, alsook 1 CHRNB4-receptor en 1 CHRNE-receptor.

Deze research hier rapporteert significante SNP associaties van genotypes van AChRs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Lymfocyten brachten muscarine en nicotine AChRs tot expressie, T- en B-cellen en monocyten brachten alle 5 de subtypes van mAChRs (M1-M5) tot expressie, terwijl nAChRs werden gevonden voor α2-α7, α9, α10, β2 & β10 subunits. Lymfocyten maken deel uit van een cholinerg systeem dat onafhankelijk is van cholinerge zenuwen, wat resulteert in de regulering van de immuun-funktie. AChR-agonisten bleken lymfocyten-cytotoxiciteit te versterken en hun intracellulair cyclisch guanosine-monofosfaat [cGMP; een cyclisch nucleotide met een belangrijke rol in verscheidene biochemische processen in de cel, een zgn. secundaire boodschapper voor intracellulaire signaal-overdracht] en inositol-1,4,5-trifosfaat [IP3; secundaire boodschapper bij signaal-overdracht en lipiden-signalisering] te verhogen, wat suggereert dat het lymfocyten cholinerg systeem betrokken is bij de regulering van de immuun-funktie via AChRs gekoppeld met fosfolipase-C via veranderingen in Ca2+. Er is onderzoek dat het belang heeft benadrukt van varianten bij het beïnvloeden van gen-transcripten door het veroorzaken van alternatieve ‘splicing’ [splicing = tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.], wat resulteert in anomalieën in het boodschapper-RNA en translatie-produkten. We identificeerden ook SNPs en een genotype in CHRNE bij M.E./CVS-patiënten. Het is interessant dat deze SNP gelegen is in het 3’ onvertaald gebied [‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie], waar een bindingplaats is voor regulerende proteïnen alsook voor microRNAs (miRNAs). Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript. Onze eerdere research vond significante verschillen qua NK cytotoxische aktiviteit, alsook qua miRNAs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269]

[Uitleg voor experten =>] Onderzoeken hebben gesuggereerd dat alternatieve ‘splicing’ in de coderende en ook niet-coderende sequenties significante onverwachte resultaten wat betreft het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. Het ‘splicen’ van genetische varianten gelegen in de exonen & intronen en de assemblage van het spliceosoom [complexe cellulaire ‘machine’ met een rol bij gen-expressie] dragen allemaal bij tot het ‘splicing’-mechanisme voor het correct coderen van een proteïne-sequentie. Bovendien zijn ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] en ‘silencers’ [transcriptie-regulerende factoren die zorgen voor verlaging of volledige onderdrukking van de vorming van RNA] gelegen in de exonen of intronen een integraal deel bij de herkenning van de correcte exon-sequentie. Belangrijk is dat intronen in staat zijn aktieve spliceosomen te genereren, wat aanleiding geeft tot alternatieve ‘splicing’. Gen 80036 (TRPM3) is geassocieerd met calcium-binnenkomst en calcium-opslag depletie via verschillende isoformen die geïdentificeerd werden via alternatieve ‘splicing’. Een gebied dat onontbeerlijk is voor kanaal-funktie [‘indispensable for channel function’; ICF] is een gebied van 18 aminozuren waarvan de afwezigheid zorgt dat de kanalen funktioneel niet in staat zijn om calcium-binnenkomst te mediëren, en dat bleek te ontbreken in een TRPM3 variant. Co-expressie van deze TRPM3 ICF varianten met funktionele TRPM3 ion-kanalen toonde daarenboven verstoorde calcium-mobilisatie. Aangezien TRPM3 ICF varianten overvloedige expressie vertonen in vele weefsels en cel-types, en 15% van alle TRPM3 isoformen uitmaken, kan de expressie op NK-cellen een mogelijke verklaring bieden voor gedaalde cytotoxische aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten. Bepaalde ‘splice’-varianten, zoals TRPM3α1, kunnen mogelijks begunstigd zijn, culminerend in een gedaalde NK-cel cytotoxische respons en hitte-detektie, inclusief ontregeling van thermoregulerende responsen, nociceptie en transmissie van pijn, zoals centrale en perifere pijn-perceptie. Bovendien bleek TRPM8 ook geaktiveerd bij koude en schadelijke stimuli, wat suggereert dat de hier gerapporteerde genotype-wijzigingen overéénkomen met de klinische presentatie van thermoregulerende responsen, nociceptie, en transmissie van centrale en perifere pijn bij M.E./CVS-patiënten.

Onze resultaten suggereren dat SNP-varianten en genotypes gerapporteerd in NK-cellen wellicht niet exclusief zijn voor dit type immuun-cel. AChRs en TRP ion-kanaal receptoren komen overvloedig voor op meerdere cel-types en controleren andere funkties in lichamelijke systemen. Ca2+-signalisering in de context van TRP ion-kanalen en AChR-funktie is vitaal voor de werking van het centraal zenuwstelsel, en er is veel variëteit qua nicotine receptoren die tot expressie komen in dierlijke en menselijke immuun-cellen. Op te merken valt dat nAChRs betrokken bleken bij het wakker worden, slaap en vermoeidheid, alsook de funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie, die allemaal klinische symptomen bij M.E./CVS zijn.

Besluit

In deze studie identificeerden we, voor de eerste keer, SNPs in genen coderend voor TRPM3 en TRPM8 ion-kanalen in geïsoleerde NK-cellen. We identificeerden ook talrijke SNPs in nAChRs samen met andere TRP-kanalen in geïsoleerde NK-cellen, wat de belangrijke rol van het niet-neuronale ACh systeem bij NK-cel funktie zou kunnen verklaren. Anomalieën in genotypes van TRP ion-kanalen en AChRs suggereren dat veranderd calcium een belangrijke funktionele consequentie kan zijn, niet enkel voor NK-cellen maar ook afhankelijk van weefsel-type, vatbaarheid of voorbestemdheid voor M.E./CVS.

mei 14, 2016

Verband tussen leptine en pijn bij vrouwen

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 6:37 am
Tags: , , , , , , ,

Via ons stuk ‘Leptine – verband met cytokinen & vermoeidheid bij CVS’ gaven we al mee dat Jared Younger en zijn team een (kleine) groep vrouwen had geïdentificeerd die sterke correlaties vertonen tussen leptine-concentraties en vermoeidheid-graad. Ondertussen startte hij zijn eigen ‘Neuro-inflammation, Pain and Fatigue Lab’ aan de Universiteit van Alabama en zette hij dit onderzoek (naast andere research met betrekking tot vermoeidheid en pijn) verder…

Onderstaand verslag gaat meer over fibromyalgie i.p.v. over M.E.(cvs) maar gezien de overlap tussen de 2 aandoeningen, zijn hier ook aanwijzingen te vinden voor M.E.(cvs); te meer omdat leptine microglia cellen (immuun-cellen in de hersenen) sensitiseren – na voorbehandeling van deze cellen met leptine is er een sterke aktivatie na blootstelling aan een trigger (lees goed: leptine alleen volstaat niet voor de overdreven ‘inflammatie-respons’).

Leptine onderdrukt ook de eetlust: na een maaltijd stijgen de waarden. Aangezien veel M.E.(cvs)-patiënten een verergering van hun symptomen ervaren na een maaltijd, is het dus inderdaad mogelijk dat het een rol speelt.

 

————————-

J Womens Health (2016) [pre-print]

Association of Leptin with Body Pain in Women

Younger J1, Kapphahn K2, Brennan K3, Sullivan SD4, Stefanick ML5

1 University of Alabama at Birmingham , Birmingham, Alabama

2 Stanford University , Stanford, California

3 University of California , Los Angeles, California

4 Georgetown University , Washington, DC

5 Department of Medicine, Stanford Prevention Research Centre, Stanford University , Stanford, California

Samenvatting

Leptine, een eetlust-regulerend hormoon, staat ook bekend als een pro-inflammatoir adipokine [cytokine dat wordt afgegeven door vet-weefsel]. Eén van de effekten van verhoogde systemische leptine-concentraties kan een hogere sensitiviteit voor pijn zijn. We rapporteren de resultaten van 2 studies die het verband onderzochten tussen leptine en pijn: een kleine piloot-studie, gevolgd door een grote studie. In Studie 1 werd van 3 vrouwen met een diagnose van fibromyalgie dagelijks bloed afgenomen gedurende 25 opéénvolgende dagen, tevens werd de zelf-gerapporteerde musculoskeletale pijn geregistreerd. Dagelijkse schommelingen qua serum-leptine bleken positief geassocieerd met pijn bij alle 3 de deelnemers (p < 0.001); leptine voorspelde ca. 49% van de pijn-variantie. In Studie 2 werd de relatie tussen leptine en lichaam-pijn onderzocht in een retrospectieve ‘cross-sectionele’ analyse [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] van 5.676 over het algemeen gezonde post-menopausale vrouwen van het ‘Women’s Health Initiative’. Leptine-waarden verkregen via één enkele bloedafname, werden getest wat betreft een verband met zelf-gerapporteerde lichaam-pijn. Body-mass-index (BMI) werd ook opgenomen als voorspeller van pijn. Zowel leptine als BMI bleken onafhankelijk geassocieerd met zelf-gerapporteerde pijn (p = 0.001 & p < 0.001, respectivelijk), waarbij hogere leptine-waarden en hogere BMI elk geassocieerd waren met meer pijn. Leptine lijkt een voorspeller voor lichaam-pijn intra- en inter-individueel en zou een aandrijvende kracht kunnen zijn voor veralgemeende pijn zoals fibromyalgie.

Inleiding

In deze 2 studies verkenden we de relatie tussen leptine en gegeneraliseerde musculoskeletale pijn. Leptine is een proteïne dat voornamelijk door ‘wit’ vet-weefsel [Bruin vet-weefsel kan warmte produceren door de oxidatie van vet. De vet-cellen in dit weefsel hebben grote hoeveelheid (minder efficiënte) mitochondrieën die zorgen voor de bruine kleur. Dit in tegenstelling tot vet-cellen in het wit vet-weefsel, die minder mitochondrieën hebben.] wordt aangemaakt. Het wordt erkend als een eetlust-regulerend hormoon, maar er werd ook aangetoond dat leptine werkt als een pro-inflammatoir adipokine. Toediening van leptine aan mensen bleek meerdere klinische merkers voor systemische inflammatie, inclusief C-reaktief proteïne, te doen stijgen.

Door leptine gemedieerde inflammatie is geassocieerd met verhoogde pijn-sensitiviteit. Een klein aantal dieren-studies hebben getoond dat intrathecaal [binnen de hersen- of ruggemerg-vliezen] of perifeer geïnjekteerd leptine systemische hyperalgesie [verhoogde pijngevoeligheid] en allodynia [ervaring van pijn bij een gewoonlijk niet-pijnlijke prikkel] kunnen induceren. Hoewel er geen pijn-studies bij mensen werden uitgevoerd waarbij experimenteel leptine werd toegediend, zijn er meerdere meldingen dat leptine-waarden in synoviaal vocht [gewrichtsvocht] en in het perifeer bloed positief geassocieerd zijn met pijn-ernst bij individuen met osteoarthritis. Serum-leptine kan ook verhoogd zijn bij de pijn-aandoening fibromyalgie [Fietta P, Fietta P. Counterbalance between leptin and cortisol may be associated with fibromyalgia. Psychiatry Clin Neurosci (2006) 60: 529-529 /// Homann D et al. Acylated ghrelin: A potential marker for fibromyalgia? Eur J Pain (2013) 17: 1216-1224], hoewel niet alle studies een leptine-fibromyalgie link ondersteunden. [Ablin JN et al. Evaluation of leptin-levels among fibromyalgia patients before and after three months of treatment, in comparison with healthy controls. Pain Res Manag (2012) 17: 89-92]

We hebben eerder gerapporteerd dat dag-na-dag schommelingen qua serum-leptine dagelijkse vermoeidheid-ernst bij vrouwen met Chronische Vermoeidheid Syndroom voorspellen. [Stringer EA, Baker KS, Carroll IR et al. Daily cytokine fluctuations, driven by leptin, are associated with fatigue severity in Chronic Fatigue Syndrome: Evidence of inflammatory pathology. J Transl Med (2013) 11: 93; zie onze inleiding] Op dagen wanneer de leptine-concentraties hoger zijn, rapporteren vrouwen zelf een grotere vermoeidheid. Van de 50 in die studie onderzochte cytokinen en chemokinen, was leptine de molekule die meest consistent geassocieerd was met symptoom-ernst.

Veel vrouwen met Chronische Vermoeidheid Syndroom voldoen ook aan de diagnostische criteria voor fibromyalgie. Hoewel dit niet noodzakelijk overlappende etiologieën suggereert, zijn de kenmerkende symptomen voor de 2 aandoeningen gelijkaardig. Fibromyalgie is een chronische pijn aandoening met een onbekende etiologie die wordt gekarakteriseerd door wijdverspreide musculoskeletale pijn en gevoeligheid voor mechanische druk in zachte weefsels. Mensen die er aan lijden melden ook dikwijls diepgaande vermoeidheid, ontregeling van cognitieve processen, slaap-moeilijkheden en verergering van de symptomen na fysieke of mentale inspanning. Omwille van de mogelijke overlap tussen Chronische Vermoeidheid Syndroom en fibromyalgie, wilden we de rol onderzoeken die leptine ook zou kunnen spelen bij wijdverspreide musculoskeletale pijn.

In dit rapport onderzoeken we de resultaten van 2 studies die het verband nagingen tussen leptine en wijdverspreide lichamelijke pijn. Studie 1 was een kleine ‘proof-of-concept’ analyse [om de haalbaarheid of het principe/ de theorie aan te tonen] bij 3 vrouwen met fibromyalgie. De deelneemsters gaven bloed en scoorden hun pijn gedurende 25 opéénvolgende dagen. Onze hypothese was dat het serum-leptine dagelijks positief gecorreleerd zou zijn met zelf-gerapporteerde pijn. Terwijl leptine onze primaire voorspeller was, waren we ook geïnteresseerd in de rol van inflammatoire processen die chronische pijn aansturen. We onderzochten daarom 50 andere cytokinen en chemokinen in een verkennende analyse, om potentiële voorspellers van pijn te identificeren voor verdere studie.

In Studie 2 voerden we een ‘cross-sectionele’ analyse uit tussen leptine en algemene lichamelijke pijn bij meer dan 5.000 vrouwen van de ‘Women’s Health Initiative (WHI) Observational Study’ die eerder bloed hadden gegeven en scores kregen voor lichamelijke pijn. De body-mass-index (BMI) van de deelneemsters werd ook vastgesteld. Omdat BMI positief gecorreleerd is met leptine en geassocieerd is met zelf-gerapporteerde pijn en fibromyalgie [Okifuji A et al. Relationship between fibromyalgia and obesity in pain, Function, mood and sleep. J Pain (2010) 11:1329-1337 /// Ursini F et al. Fibromyalgia and obesity: The hidden link. Rheumatol Int (2011) 31:1403-1408], controleerden we in onze analyses voor BMI. De data-set bood daarom de kans om de eerste grootschalige ‘cross-sectionele’ analyse van de verbanden tussen leptine en lichamelijke pijn uit te voeren. Onze algemene hypothese was dat hogere serum leptine-concentraties en hogere BMI onafhankelijk geassocieerd zouden zijn met zelf-gerapporteerde algemene pijn. Onze specifieke hypotheses waren:

Hypothese 1: Gesecreteerd leptine is positief geassocieerd met meer zelf-gerapporteerde pijn.

Hypothese 2: BMI is positief geassocieerd met pijn.

Hypothese 3: Leptine is positief geassocieerd met pijn na controle voor BMI.

Hypothese 4: BMI is positief geassocieerd met pijn na controle voor leptine.

Omdat Studie 1 en Studie 2 substantieel verschillende studie-ontwerpen en analytische benaderingen hadden, worden ze apart weergegeven in dit artikel.

Studie 1: Pilootstudie Longitudinale Analyse van Dagelijks Leptine & Pijn in 3 Vrouwen met Fibromyalgie

Methodes

Deelnemers. De deelnemers in deze piloot-studie waren 3 Kaukasische vrouwen met een leeftijd van 31, 35 & 40 jaar, die voldeden aan de ‘American College of Rheumatology 1991’ én de 2010 diagnostische criteria voor fibromyalgie. […] Omwille van de kost van de dagelijkse immuniteit-monitoring, werden slechts 3 individuen gerecruteerd en opgenomen. Geen van de deelneemsters had een voorgeschiedenis van auto-immune of reumatologische aandoening. Alle deelneemsters hadden een normale erythrocyten-sedimentatie-snelheid, C-reaktief proteïne, schildklier-hormoon waarden, reumatoïde factor en antinucleaire antilichamen. Alle deelneemsters rapporteerden een gemiddelde waarde qua dagelijkse pijn van minstens 60 op 100 (visuele analoge schaal) en niemand nam geneesmiddelen op voorschrift.

Protocol. […] De pijn-ernst werd gerapporteerd gedurende de ganse duur van de studie (32 dagen). Tijdens de eerste week werd de pijn bij baseline en tijdens een gewenning-periode opgemeten. Er werd geen bloed afgenomen tijdens de eerste week. De baseline week liet het studie-team ook toe er voor te zorgen dat de deelneemsters hun symptomen op een betrouwbare manier zouden rapporteren.

Leptine- en cytokine-meting. […]

Statistische analyse. […]

Resultaten

[…] Voor alle 3 de deelneemsters waren er 72 bruikbare dagen (96%).

Het lichaamsgewicht voor de 3: 60,2, 82,1 en 101,2 kg. Leptine-concentraties: 0,7 ng/ml (0,2-2,0), 10,2 ng/ml (5,8-17,1) en 20,5 ng/ml (11,21-38,7). De gemiddelde leptine-waarden waren typisch voor gezonde vrouwen met het geobserveerde lichaamsgewicht.

De dagelijkse leptine-waarden waren significant geassocieerd met dagelijkse pijn-scores (p = 0.0007). Op dagen met meer zelf-gerapporteerde pijn lagen de leptine-waarden hoger. […] Geen enkel ander cytokine bereikte de statistische drempel. […]

Studie 2: Cross-Sectionele Analyse van Leptine en Lichaamspijn in 6.000 Post-menopausale Vrouwen

Methodes

Deelnemers. Dit betrof een subgroep post-menopausale vrouwen (50-79) die werden opgenomen in de ‘WHI Observational Study’ tussen 1993 en 1998. […] Van de 6.286 deelneemsters waarvan minstens één keer het serum-leptine werd gemeten, werden er 123 uitgesloten omwille van ontbrekende gegevens omtrent BMI of zelf-gerapporteerde pijn. Nog 472 vouwen extra werden uitgesloten omwille van een diagnose van auto-immune of reumatologische ziekte (Reumatoïde Artritis, Multipele Sclerose, lupus en Amyotrofe Laterale Sclerose) of omwille van zelf-gerapporteerd gebruik van opioïde pijnstillers. De uiteindelijke analyse-groep bestond uit 5.676 individuen.

Protocol. Bij de start van de studie werd lichamelijke pijn bepaald via één vraag: “Hoeveel lichamelijke pijn heeft u de voorbije 4 weken gehad?” De opties waren: geen, zeer licht, licht, matig en ernstig. […] De antwoorden kregen een cijfer tussen 1 en 5 – 1 corresponderend met ‘geen’ en 5 met ‘ernstig’. Pijn door andere oorzaken (bv. Ziekte of letsels) werd bepaald via andere vragen en werden in deze analyse niet onderzocht. […]

Leptine-meting. […]

Statistische analyse. De enige afhankelijke variabele was zelf-gerapporteerde lichamelijke pijn. Er werden 2 voorspellende variabelen gebruikt: serum-leptine en BMI. BMI werd als volgt gegroepeerd: onder-/normaal gewicht (BMI 0 – 25 kg/m2), overgewicht (BMI 25 – 29,925 kg/m2) en obees (BMI > 30 kg/m2). […] Er werden 3 modellen getest: In Model 1 (testen van Hypothese 1) was lichamelijke pijn de afhankelijke variabele; onafhankelijke variabelen waren: leptine, type, leeftijd en ras. In Model 2 (testen van Hypothese 2) was lichamelijke pijn de afhankelijke variabele; onafhankelijke variabelen waren: BMI, leeftijd en ras. In Model 3 (testen van Hypothese 3 & 4) was lichamelijke pijn de afhankelijke variabele; onafhankelijke variabelen waren: leptine, BMI, leptine-BMI interaktie, specimen, leeftijd en ras.

Resultaten

[…] De mediane waarden voor leptine (ng/ml) waren: 13,8 (geen pijn), 15,3 (zeer lichte pijn), 18,3 (lichte pijn), 20,3 (matige pijn) en 23,0 (ernstige pijn). De correlatie-coëfficiënt voor de 2 voorspellende factoren (leptine & BMI) was 0.64 [hoe dichter bij 1, hoe sterker de correlatie].

[…] In Model 1 werd serum-leptine getest als voorspeller voor zelf-gerapporteerde lichamelijke pijn. Het verband was significant ( p < 0.001). Hogere pijn-scores waren geassocieerd met hogere leptine-concentraties; een tweevoudige toename qua leptine was geassocieerd met een gemiddelde toename van 0,17 […] punten op de 0-4 pijn-schaal.

In Model 2 vonden we een significant positieve correlatie tussen BMI en zelf-gerapporteerde lichamelijke pijn (p < 0.001). Hogere pijn-scores waren geassocieerd met hogere BMI, waarbij individuen met overgewicht een gemiddelde pijn-score hadden van 0,30 […] punten hoger dan deze met onder-/normaal gewicht (p < 0.001). Obese individuen hadden een gemiddelde pijn-score van 0,69 […] punten hoger dan deze met onder-/normaal gewicht (p < 0.001).

In Model 3, was de leptine x BMI interaktie niet significant geassocieerd met zelf-gerapporteerde pijn (p = 0.38). Zowel leptine als BMI bleven significante voorspellers van pijn wanneer werd gecontroleerd voor de ene of andere factor (p = 0.001 & p < 0.001, respectievelijk). […] Bij het bekijken van de ruwe waarden zagen we dat elke ng/ml toename van leptine geassocieerd was met een 0,4% toename qua pijn (gemiddelde pijn-waarde 1.4). Dit zou een toename van 74% qua pijn betekenen tussen de minimum en maximum leptine-waarden geobserveerd in ons staal.

Als we leptine constant houden, hadden de individuen met overgewicht gemiddelde pijn-scores die 0,20 […] punten hogen lagen dan deze met onder-/normaal gewicht, obese individuen hadden gemiddelde pijn-scores die 0,51 […] punten hogen lagen dan deze met met onder-/normaal gewicht.

Algemene Bespreking

We zagen dat leptine geassocieerd is met zelf-gerapporteerde lichamelijke pijn zowel longitudinaal bij dezelfde persoon als tussen personen. In Studie 1 co-varieerde serum-leptine met de dagelijkse schommelingen qua pijn. In Studie 2 waren de leptine-waarden positief gecorreleerd met pijn, zelfs na controleren voor BMI. Onze resultaten komen overéén met eerdere dieren- en menselijke studies die suggereren dat leptine pijn-gevoeligheid kan verhogen, wellicht via pro-inflammatoire aktiviteit. Leptine bleek geassocieerd met een groot aantal inflammatoire ziekten zoals Reumatoïde Artritis, lupus en Multipele Sclerose.

Er werden meerdere mechanismen voor leptine-geïnduceerde inflammatie voorgesteld. Deze links omvatten STAT3 [‘signal transducer and activator of transcription 3’; een transcriptie-factor], IL-6 & IL-18. Leptine-provocatie van macrofagen kan leiden tot verhoogde output van factoren die pijn-verwerking verhogen. Leptine bleek ook microglia te ‘primen’ [voorbereiden], wat leidt tot overdreven IL-1beta produktie in respons op stimuli en microgliale produktie van IL-6 te triggeren. Abnormale microgliale aktiviteit wordt nauwkeurig onderzocht als een belangrijke factor bij chronische pijn [Ji RR et al. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain (2013) 154 Suppl 1: S10-S28] en signaalgevers zoals leptine die de microgliale aktiviteit moduleren kunnen belangrijke doelwitten voor toekomstige pijn-therapieën zijn. Leptine zou ook andere aspecten van de pijn-verwerking kunnen reguleren, zoals het verminderen van afdalende pijn-modulerende signalen […].

Steeds meer wordt obesitas gezien als een pro-inflammatoire toestand met verscheidene nadelige gevolgen. Leptine is één mechanisme dat obesitas zou kunnen linken met inflammatie en de geassocieerde lichamelijke en psychologische ziekten die meer frequent bij zwaarlijvige individuen worden gezien. Leptine-waarden worden echter ook gecontroleerd door factoren die niet geassocieerd zijn met BMI, zoals slaap en acute infektie.

Verdere informatie betreffende de link tussen leptine en pijn zou nieuwe behandelingen voor chronische pijn kunnen aansturen. Er zijn een aantal gedragmatige technieken voor het verlagen van leptine-waarden, zoals calorie-restrictie en gewicht-vermindering, alsook lichamelijke inspanning. Leptine-waarden kunnen ook farmacologisch worden gemoduleerd via nieuwe onderdrukkende en antagonistische middelen [bv. het fytohormoon genisteïne of de leptine-antagonist PEG-MLA] en modulatie van natuurlijk voorkomende hormonen zoals ghreline [‘growth hormone-releasing peptide’; hormoon dat honger opwekt en dus de voedsel-inname stimuleert]. Er is bewijsmateriaal dat suggereert dat toediening van leptine-antagonisten de door letsel geïnduceerde neuropathische pijn kan voorkomen en omkeren in dieren-modellen. Bij leptine-modulerende farmaceutica dient er echter voor gezorgd te worden dat bijwerkingen (wat betreft eetlust, calorie-inname en voortplanting) worden vermeden.

Geen van onze studies werd ontworpen om oorzakelijkheid te bepalen. Hoewel leptine beschikbaar is voor menselijk gebruik (injekteerbaar metreleptine [synthetisch analoog van leptine]), maken de significante nevenwerkingen het tot op heden onmogelijk het te gebruiken voor onderzoek-doeleinden. We merken op dat bij dieren-research de toediening van leptine een causaal verband van leptine met pijn ondersteunt. Verder suggereren beperkte gegevens van mensen dat leptine-waarden de toekomstige pijn-ernst kunnen voorspellen.

Hoewel leptine geassocieerd bleek met pijn-ernst (intra- en inter-individueel), was de effekt-grootte het meest significant bij de intra-individuele analyses […]. De link tussen leptine en pijn in de ‘cross-sectionele’ studie – niettegenstaande statistisch significant – was zwak en zou waarschijnlijk geen klinisch nut hebben als een merker voor pijn in de algemene bevolking. We hebben geen weet van andere bloed-merkers voor algemene pijn gerapporteerd in een zeer heterogene en grotendeels gezonde groep, en dergelijke merkers zijn typisch meer bruikbaar als indicatoren voor specifieke pijn-aandoeningen. Onze analyses werden uitgevoerd bij een [willekeurig] staal dat voor handen bleek. waarbij de pijn-metingen en bloedstalen werden verkregen op afzonderlijke dagen. Leptine kan significant variëren bij individuen, zelfs binnen dagen, dus was de timing in de studie niet optimaal om zeker te zijn dat het testen van de hypothese het meest sensitief was. […] Verdere studies die pijn en leptine onderzoeken, zouden de bedoeling moeten hebben de metingen zo dicht mogelijk bij elkaar uit te voeren.

De grote studie gebruikte ook een ruwe meting van de pijn-ernst met slechts 5 mogelijke pijn-gradaties. Meer geavanceerde benaderingen [netwerk-analyse] kunnen ook nuttig zijn bij het bepalen van de relatieve bijdrage van lichaamsgewicht en leptine aan de pijn-ernst, alsook bij het beschrijven van belangrijke […] effekten. Sterke correlaties tussen voorspellers kunnen de lineaire regressies nadelig beïnvloeden, hoewel zagen we dat de correlatie tussen BMI en leptine redelijk was (0.64). Niettemin dient te worden opgemerkt dat BMI een significante bepalende factor is van leptine zodat het moeilijk is de 2 conceptueel te scheiden. Verdere studies zouden ook meer accurate methodes voor lichaam-compositie moeten gebruiken, inclusief deze die vet-weefsel kunnen kwantificeren. Ondanks deze beperkingen vonden we dat pijn lineair daalde bij hogere leptine-waarden (zoals voorspeld).

Het dient ook te worden benadrukt dat Studie 1 individuen omvatte met een gediagnostiseerde pijn-aandoening, terwijl in Studie 2 individuen werden opgenomen met auto-immune aandoeningen zoals Reumatoïde Artritis (hoewel kan worden vermoed dat individuen die ‘ernstige’ pijn rapporteren een niet-gediagnostiseerde aandoening kunnen hebben). Jammer genoeg laat de WHI database niet toe op een betrouwbare manier de diagnose van fibromyalgie te stellen, dus waren we niet in staat te bepalen of leptine-waarden bij die individuen verhoogd zijn. Het is waarschijnlijk dat het staal enkele individuen met een diagnose van fibromyalgie bevatte. Toekomstige analyses zouden leptine-waarden moeten onderzoeken bij individuen met goed gekarakteriseerde diagnoses met chronische pijn. Omdat we ook een link identificeerden tussen leptine en vermoeidheid, zou het nuttig kunnen zijn dat toekomstige research ook meerdere klinische uitkomsten onderzoekt om alle implicaties van fluctuerende leptine-waarden te begrijpen.

We merken op dat, niettegenstaande het feit dat de meeste beschikbare literatuur wijst op een positief verband tussen leptine en pijn, er enkele studies zijn die rapporteren dat leptine eigenlijk de ervaring van pijn reduceert [neuropathische pijn bij ratten] en een neuroprotectieve funktie heeft [bij knaagdieren]. Ook is er minstens één studie die rapporteerde dat lagere leptine-waarden geassocieerd zijn met hogere pijn-ernst bij fibromyalgie-patiënten. [Egyptische vrouwen] Gezien de grote dag-na-dag veranderingen qua leptine-concentraties (zelfs al was het tijdstip van de dag constant) dient zorg te worden besteed aan de interpretatie van de resultaten van ‘cross-sectionele’ studies. Het is mogelijk dat één enkele leptine-bepaling niet volstaat voor het bepalen van de gemiddelde leptine-concentratie van een individu.

De gemiddelde leptine-waarden die we zagen in Studie 1 vielen alle binnen de waarden die worden verwacht voor een bepaald lichaamsgewicht maar er zijn geen klinische standaarden voor het bepalen van gestegen leptine-waarden voor een bepaald individu. Het is onwaarschijnlijk dat een leptine-bepaling klinisch nut heeft als enkelvoudige of onfrequente screening. Leptine werkt wellicht best als een longitudinale variabele, hoewel het niet is geweten of het een biomerker voor fibromyalgie is. De relatie tussen leptine en pijn zou gemoduleerd kunnen worden door andere factoren, (oestrogeen is een mogelijkheid). Ook: concepten zoals leptine-insensitiviteit [Ainslie DA et al. Estrogen deficiency causes central leptin insensitivity and increased hypothalamic neuropeptide Y. Int J Obes Relat Metab Disord (2001) 25: 1680-1688] dienen zorgvuldig te worden overwogen bij het onderzoeken van leptine en pijn. Toekomstige studies zouden factoren die bekend staan te interageren met leptine of zijn signalisering-mechanismen (ghreline, geslacht-hormonen, insuline & neuropeptide-Y) moeten onderzoeken.

Hoewel de statistische drempel niet werd bereikt, identificeerden we andere molekulen die mogelijks geassocieerd zijn met zelf-gerapporteerde pijn, inclusief IL-17F & eotaxine [een chemokine]. Hoewel het bespreken van de mogelijke rol hiervan bij pijn buiten de scope van dit artikel valt, merken we op dat IL-17 en eotaxine verhoogd bleken bij fibromyalgie-patiënten. [Pernambuco AP et al. Increased levels of IL-17A in patients with fibromyalgia. Clin Exp Rheumatol (2013) 31:S60-S63 /// Zhang Z et al. High plasma levels of MCP-1 and eotaxin provide evidence for an immunological basis of fibromyalgia. Exp Biol Med (2008) 233:1171-1180] Deze molekulen, en andere, zouden meer aandacht moeten krijgen in verdere studies. We waarschuwen echter dat deze bevindingen verkennend van aard zijn, dat er geen a priori hypothesen zijn en een zeer kleine groep individuen betreft.

Samengevat: we dragen bij aan de groeiende literatuur die een rol voor leptine bij acute en chronische pijn suggereert. Aangezien de waarden van gesecreteerd leptine substantieel hoger zijn bij vrouwen dan bij mannen, kan het helpen verklaren waarom vrouwen over het algemeen meer gevoelig zijn voor pijn dan mannen en meer de diagnose van een chronische pijn aandoening krijgen. Toekomstige research bij chronische pijn zou nieuwe doelwitten gebaseerd op leptine-mechanismen bij mensen kunnen verkennen. Leptine vertegenwoordigt één van vele fysiologische agentia die meerdere lichaam-systemen kunnen overbruggen en belangrijke aanwijzingen kunnen geven over hoe het best chronische pijn aan te pakken.

april 1, 2016

MicroRNAs: Potentiële diagnostische biomerkers in NK-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 2:47 pm
Tags: , , , , , ,

Na het bestuderen van gen-expressie en SNPs bij M.E.(cvs) (‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’ / ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’), bekijkt Prof. Jonathan Kerr hier afwijkende gen-expressie van microRNAs in bloedcellen. Andere (Australische) onderzoekers bekeken dit al in het plasma (‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’) en zelfs in NK-cellen (‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’). Kerr et al. breiden dit laatste uit…

Eerst werd de miRNA gen-expressie geanalyseerd: 34 miRNAs bleken een afwijkende expressie te hebben. 4 konden via een andere techniek worden bevestigd. Daarna werd gekeken in welke immuun-cellen deze afwijkende gen-expressie voorkwam. Tenslotte werd nagegaan in welke effekten deze gewijzigde gen-expressie had bij NK-cellen. Er werden aanwijzingen gevonden voor een immuun-dysfunktie.

De lezer kan elders op deze paginas ook reeds één en ander bestuderen over bevindingen omtrent NK-cellen bij M.E.(cvs)…

 

“MicroRNA (of miRNA) hebben anders dan bv. mRNA (boodschapper-RNA, die een ‘positieve’ rol hebben bij het ontstaan van proteïnen) de neiging om mRNA-molekulen het ‘zwijgen’ op te leggen door ze te splitsen, ze te destabiliseren of er mee te interfereren. Ze bleken al betrokken bij verscheidene ziekten bij mensen (bv. een rol bij kanker) en bij het reguleren van de vorming van bloedcellen en het beïnvloeden van de immuniteit. Aangezien miRNAs ‘beschermd’ zijn en stabiel blijven in verscheidene lichaamsvochten en weefsels zijn ze erg in trek als mogelijke biomerkers (bij kanker maar ook epilepsie, malaria & Multipele Sclerose).” – Dr Neil Abbot; ‘ME Research UK’

————————-

PLoS One Vol 11, #3, e0150904 (maart 2016)

MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: Potential Diagnostic Biomarkers in Natural Killer (NK) Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome (CFS)/ Myalgic Encephalomyelitis (M.E.)

Robert D. Petty (1,2), Neil E. McCarthy (3), Rifca Le Dieu (2), Jonathan R. Kerr (1,4)

1 CFS Group, St George’s University of London, Cranmer Terrace, London, United Kingdom

2 Centre for Haemato-Oncology, Bart’s cancer institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

3 Centre for Immunobiology, The Blizzard institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

4 Grupo de Salud Publica, Escuela de Medicine y Ciencias de la Salud, Universidad del Rosario, Quinta de Mutis, Bogotá 111221, Colombia

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS/M.E.) is een complexe multisysteem ziekte met een onbekende etiologie die invaliderende symptomen veroorzaakt bij 1% van de globale bevolking. Hoewel een grote groep genen gewijzigde expressie bleek te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten, is het nog niet geweten microRNA (miRNA) molekulen die gen-translatie reguleren, bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. We hypothiseerden dat veranderingen qua microRNA-expressie in leukocyten van patiënten bijdragen tot de CVS/M.E.-pathogoloie, en daarom bruikbare diagnostische biomerkers kunnen zijn die kunnen worden gedetekteerd in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten.

Methodes miRNA-expressie in mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de Ambion Bioarray V1. miRNA die differentiële expressie bleken te vertonen werden gevalideerd d.m.v. qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] en daarna gerepliceerd in subgroepen bloed-leukocyten van een onafhankelijke patiënten-groep. De via deze experimenten geïdentificeerde, met CVS/M.E. geassocieerde miRNA werden dan getransfecteerd in primaire NK-cellen en er werden gen-expressie analyses uitgevoerd om hun gen-doelwitten te identificeren.

Resultaten Micro-array [‘gen-chips’] analyse identificeerde differentiële expressie van 34 miRNA, die allemaal ge-upreguleerd waren. Van 4 op de 34 miRNA werden expressie-wijzigingen bevestigd via qRT-PCR. Het fractioneren van PBMC-stalen (van een onafhankelijke patiënten-groep) in verschillende cel-types, identificeerde veranderingen qua miRNA-expressie in NK-cellen, B-cellen en monocyten waarbij de meest significante abnormaliteiten voorkwamen bij NK-cellen. Transfectie [inbrengen van DNA of RNA in cellen] van primaire NK-cellen met hsa-miR-99b of hsa-miR-330-3p, resulteerde in gen-expressie wijzigingen consistent met NK-cel aktivatie maar verminderde cytotoxiciteit, wat suggereert dat gebrekkige NK-cel funkie bijdraagt tot CVS/M.E.-pathologie.

Besluit Deze studie toont gewijzigde microRNA-expressie aan in de perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS/M.E.-patiënten, die potentiële diagnostische biomerkers zijn. De grootste miRNA-ontregeling werd geïdentificeerd in NK-cellen, met doelwitten die verband houden met cellulaire aktivatie en gewijzigde effector-funktie [een effector-cel pakt daadwerkelijk zijn doelwit-cel aan (herkenning en eliminatie)].

Inleiding

[…] Er is een echte klinische noodzaak om een diagnostische biomerker voor CVS/M.E. te identificeren. Een aantal studies hebben naar biomerkers voor CVS/M.E. gezocht in het mRNA [Frampton D, Kerr J et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD et al. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9] of serum [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76] van CVS/M.E.-patiënten, echter met beperkt succes. Research focust zich op het karakteriseren van immuniteit-defekten aangezien de aanvang van de symptomen dikwijls wordt voorafgegaan door een aanval op de immuniteit. Wijzigingen in populaties en aantallen leukocyten in het perifeer bloed van patiënten werden bevestigd. Onderzoek identificeerde significante immune ontregeling bij CVS/M.E.; met gewijzigde cytokine-expressie en vermindering van de dodende capaciteit van cytotoxische cellen als meest consistente bevinding. Veranderingen in mRNA-expressie in het perifeer bloed zijn goed gedocumenteerd bij CVS/M.E., met overwegend genen betrokken bij: immuun-funktie, apoptose, transcriptie, translatie en virus-infektie. mRNA gen-expressie studies waren ook succesvol bij het definiëren van CVS/M.E.-subtypes, elk met een afzonderlijk symptoom-profiel [Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84]. Een groep molekulen die een rol spelen bij het reguleren van de translatie van mRNA en die nog systematisch dienen te worden onderzocht in bloedcellen van CVS/M.E.-individuen zijn microRNAs (miRNAs).

miRNA zijn een groep kleine, niet-coderende RNAs (~23 nucleotiden) met als funktie het reguleren van de translatie van mRNA post-transcriptie via directe afbraak van mRNA-transcripten of onderdrukking van de translatie. miRNAs zijn cruciaal voor het behouden van een normale haematopoïese [vorming van bloedcellen] en als bemiddelaars bij immuun-signalisering cascades, wat hun nut als biomerkers voor deze ziekte suggereert.

In deze studie screenden we bloedstalen van patiënten met een vastgestelde klinische diagnose van CVS/M.E. t.o.v. gematchte gezonde controles, en identificeerden we ontregeling van miRNAs die funkties hebben overéénkomend met gepubliceerde veranderingen qua mRNA-expressie bij CVS/M.E. Om te bepalen in welk cel-type deze miRNA-expressie veranderingen optreden, werd de ontregeling bevestigd in gefractioneerde perifere bloedcellen van een onafhankelijke patiënten-groep. De expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p in ‘natural killer’ cellen vertoonde de meeste over-expressie. In NK-cellen bleken deze (door miRNA beïvloedde) genen betrokken bij aktivatie, effector-funktie, actine-cytoskeleton [actine is een proteïne, onderdeel van het cytoskelet dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren in cellen, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en beweeglijkheid. Dit werk is ondersteuning en uitbreiding van de concepten van immuniteit-ontregeling bij CVS/M.E. en identificeert vermeende biomerkers voor ziekte-diagnose.

Resultaten

34 miRNA met verhoogde expressie in CVS/M.E. perifeer bloed

Om miRNA met differentiële expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werd RNA gehaald uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en gescreend m.b.v. Ambion Bioarray micro-arrays (385 miRNA-sequenties). 15 stalen van CVS/M.E.-individuen (Fukuda diagnostische criteria) en 30 van voor leeftijd en geslacht gematchte controles werden geanalyseerd. Een vergelijking identificeerde 34 miRNAs met differentiële expressie (verandering > 1,5 maal) […].

Ongecontroleerde cluster-analyse van de micro-array gegevens groepeerde de stalen in 2 clusters. Deze analyse kon de CVS/M.E.- en controle-stalen niet volledig in afzonderlijke clusters opdelen. Ongeveer de helft van de controle-stalen (n = 14) en 4 CVS/M.E.-stalen vormen een groep met lage globale miRNA-expressie. De overblijvende controles clusterden met de meerderheid van de CVS/M.E.-individuen, die hogere miRNA-expressie bij de meerderheid van de geanalyseerde miRNAs vertoonden. Het niveau van homogeniteit tussen de stalen is hoog (gemiddelde correlatie-coëfficient of 0.922 +/- 0.068), wat kan bijdragen tot de onvolledige klassificatie van de stalen.

Onderzoek van deze gegevens per miRNA toonde de deugdelijkheid van de expressie-gegevens […]. We bekeken de correlatie tussen miRNA gen-expressie gegevens en scores van klinische vragenlijsten (5 vragenlijsten over algemene gezondheid) maar vonden er echter geen. Deze gegevens tonen aan dat miRNAs ontregeld waren in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten en dat de waarden van deze miRNAs onafhankelijk waren van de symptoom-ernst.

Significante upregulering van de microRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E.-bloedstalen

De veranderingen qua miRNA-expressie van 29 op 34 miRNAs werden in hetzelfde staal gevalideerd in d.m.v. Taqman kwantitatieve PCR. 5 miRNAs (ambi-miR-7058, hsa-miR-331, mmu-miR-140-AS, mmu-miR-409, rno-miR-151-AS) werden niet opgenomen aangezien de testen niet beschikbaar waren. 4 op 29 miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-30c & hsa-miR-126) vertoonden significante differentiële expressie (≥ 1,5 maal, CVS vs. Controle, p ≤ 0.05 […]).

4 miRNAs hebben het potentieel als doeltreffende biomerkers bij CVS/M.E. op basis van ROC-analyse

Om te weten te komen of de 4 met differentiële expressie bevestigde miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) zouden kunnen dienen als biomerkers bij de diagnose van CVS/M.E., werd ‘Receiver Operating Characteristics’ (ROC) [statistische analyse waarbij men in een grafiek de gevoeligheid (sensitiviteit) in funktie van de specificiteit uitzet; gebruikt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] uitgevoerd voor elke relatieve hoeveelheid van elk miRNA. Deze statistiek beschrijft de mogelijkheid van een variabele om een bepaald staal te klassificeren in 2 groepen en werd eerder al gebruikt om serum-biomerkers bij CVS/M.E.te definiëren. […] De 4 geteste miRNAs vertoonden statistische significante verschillen t.o.v. het de hypothese van toevalligheid. Hsa-miR-330-3p werd via deze analyse geïdentificeerd als de variabele die ‘t meest waarschijnlijk CVS/M.E.-patiënten van controles differentieert […]. Deze gegevens tonen aan dat (binnen de grenzen van deze studie) deze 4 miRNAs diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. zouden kunnen zijn.

Hsa-miR-99b is significant ge-upreguleerd in NK-cellen van in CVS/M.E.-patiënten

Om te onderzoeken of de miRNA-veranderingen gezien in vol-bloed stalen specifiek waren voor een bepaalde PBMC-populatie, werden 20 patiënten en 20 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde vrijwilligers gerecruteerd (dezelfde klinische diagnostische criteria als de eerdere studie). Er werden bloedstalen genomen en PBMCs geïsoleerd. De cellen werden gefractioneerd via positieve selektie op basis van CD14+ (monocyten), CD19+ (B-cellen), CD56+ (NK-cellen) en CD3+ (T-cellen) microparels. Flow-cytometrie van de gefractioneerde populaties gaf een zuiverheid aan van 96,9% (+/- 2,1%) voor monocyten, 88,9% (+/- 7,6% SD) voor NK-cellen, 84,4% (+/- 8,8%) voor B-cellen en 91,2% (+/- 5,3%) voor T-cellen. Absolute cel-tellingen na fractionatie kon geen statistisch significante verschillen aantonen tussen de populatie-groepen voor de 4 onderzochte leukocyt-subgroepen.

De 4 miRNAs waarvan differentiële expressie werd bevestigd – via array & qRT-PCR – (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) werden onderzocht in RNA uit deze 4 belangrijkste bloed-leukocyten populaties. 3 van de geteste miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-126 & hsa-miR-330-3p) vertoonden significante ge-upreguleerde expressie in één of meer PBMC-subsets bij de CVS/M.E.-populatie. Hsa-miR-30c vertoonde geen significant expressie-verschil. het grootste verschil in expressie was de expressie van hsamiR-99b in NK-cellen (2-voudige toename in CVS/M.E.-stalen). Dit miRNA was ook 1,6 maal ge-upreguleerd in B-cellen maar niet gewijzigd in T-cellen en monocyten. Hsa-miR-330-3p was ook significant ge-upreguleerd in NK-cellen maar in veel mindere mate (1,3-voudige toename). Hsa-miR-126 was 1,45-voudig ge-upreguleerd in monocyten in de CVS/M.E.-groep. Deze gegevens toonden dat de ontregeling van miRNAs bij CVS/M.E. specifiek is per leukocyten-populatie en suggereren dat de dysfunktie van B-cellen, NK-cellen en monocyten bijdragen tot de ziekte-pathologie.

Hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p reguleren mechanismen die bijdragen tot NK-cel aktivatie en effector-funktie

Om de gen-doelwitten van hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p in NK-cellen identificeren, werd precursor miRNA [enkelstrengige (ss) miRNAs komen van ‘pri-miRNAs’; de twee strengen worden enzymatisch gesplitst, resulterend in voorloper miRNA of ‘pre-miRNA’] getransfecteerd in NK-cellen (die werden geïsoleerd uit PBMCs). De NK-cel zuiverheid na de aanrijking was 89,6% (bepaald via flow-cytometrie).

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-99b identificeerde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle [mRNA dat leidt tot een afgebroken, onvolledig, niet-funktioneel proteïne]) 37 genen met differentiële expressie (volgens de inclusie-criteria; p ≤ 0.05, verandering ≥ 1,5 maal). 21 genen vertoonden downregulering tussen 1,5 en 1,8 maal. 16 genen vertoonden verhoogde expressie tussen 1,5 en 2,6 maal. Interferon-gamma (IFN-γ), een belangrijke mediator van NK-cel aktivatie, was het sterkst geïnduceerde gen (2,6 maal). Granzyme-B (GZMB), dat codeert voor een component van de cytotoxische granules die door NK-cellen worden afgegeven na herkenning van doelwit-cellen, was 1,6 maal meer geïnduceerd. Genen betrokken bij cellulaire aktivatie, vesikel-vorming [vesikels = kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], beweeglijkheid en modulatie van het actine-cytoskeleton waren ook ge-upreguleerd […]. Cathepsine-L (CTSL) [enzyme betrokken bij proteïne-afbraak] was het meest ge-downreguleerde gen door hsa-miR-99b. Dit proteïne is vereist voor splitsing en aktivatie van perforine & granzyme-B in de lytische vesikels [bevatten cel-afbrekende stoffen]. CD6 & IL-8 (interleukine-8) waren ook ge-downreguleerd (1,6 & 1,5 maal, respectievelijk). Verminderde expressie van deze genen is geassocieerd met NK-cel rijping na aktivatie. Er werd ook verminderde expressie geïdentificeerd bij genen betrokken bij autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten] en bepaalde signalisering-mechanismen […].

Om te bepalen of de genen die worden gereguleerd door hsa-miR-99b konden worden gegroepeerd in een specifieke funktionele klasse, voerden we een ‘over-representatie analyse’ uit [bekijkt de eventuele aanrijking van bepaalde mechanismen, molekulaire funkties en biologische processen]: dit identificeerde een significante aanrijking voor genen betrokken bij processen en mechanismen van de NK-cel funktie, inclusief cel-aktivatie, immuunsysteem-processen en cellulaire respons op een stimulus.

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-330-3p leverde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle) slechts 2 wijzigingen op: voor SOD2 [codeert voor mitochondriaal superoxide-dismutase-2] en MMP9 [codeert voor matrix-metallopeptidase 9] -expressie; ze waren allebei 1,6 maal gedownreguleerd. SOD2-expressie verstoort de normale T-cel differentiatie en cellulaire aktivatie, en verminderde expressie is geassocieerd met verstoorde neutrofiel effector-funktie. MMP9 reguleert NK-cel cytotoxiciteit en lymfocyten-beweeglijkheid.

Deze resultaten toonden aan dat verhoogde miRNAs expressie in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten gen-expressie wijzigingen bevordert die consistent zijn met cellulaire aktivatie maar verminderde effector-funktie.

Bespreking

De klinische diagnose van CVS/M.E. is gebaseerd op goed omschreven klinische criteria maar de diagnose omvat echter ook de uitsluiting van andere oorzaken voor vermoeidheid, wat kan leiden tot een langere diagnose-tijd. Zodoende is er een echte klinische noodzaak om diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. te identificeren. We wilden de rol van miRNA bij patiënten met een vastgestelde diagnose of CVS/M.E. bestuderen, om te bepalen of deze regulerende molekulen bijdragen tot de ziekte-pathogenese en of het kandidaat diagnostische biomerkers zijn.

We identificeerden over-expressie van 34 miRNA die niet eerder werden beschreven bij CVS/M.E. [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One (2014) 9: e102783; zie ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’ /// Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9; zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?] in stalen perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten. De micro-array analyse groepeert op een robuste manier de miRNAs met gecoördineerde expressie (hsa-miR-107 & hsa-miR-103) en levert zeer homogene resultaten. Wat gemeenschappelijk is met andere CVS/M.E.-studies is dat gen-expressie het miRNA-profiel CVS/M.E.-patiënten niet van controles onderscheidde Een studie van Brenu et al. [zie eerder] analyseerde plasma-stalen van CVS/M.E.-patiënten en identificeerde ontregeling van 19 menselijke miRNAs. Van deze 19, zaten er slechts 12 in onze array. Daarvan waren er 8 met een verschil van ≥ 1,5 maal (CVS/M.E. vs. normaal) maar allemaal met insignificante p-waarden; die werden niet verder onderzocht. Het feit dat de 2 studies niet overéénstemmen is niet verrassend, aangezien cellulaire en plasma miRNA-profielen van hetzelfde individu beperkt overlappen. Er werd voorgesteld dat deze beperkte overlap het resultaat is van het feit dat miRNAs opgeslagen zijn in vesikels die worden gesecreteerd met verschillende doeltreffendheid, of van de variabele stabiliteit van de verschillende miRNAs in het extracellulair milieu. De CVS/M.E.-populatie vertoonde een brede waaier aan klinische symptoom scores wijzend op subgroepen van de ziekte, die ook elders worden beschreven en kunnen bijdragen tot het niet volledig onderscheiden van de stalen in deze analyse. Deze observatie kan ook de slechte correlatie tussen klinische symptoom score en miRNA-expressie verklaren, en suggereert dat validatie in een meer uitgebreide patiënten-groep wenselijk is.

Bevestiging van de array-bevindingen d.m.v. qRT-PCR ondersteunde de upregulering van hsa-miR- 99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E. PBMCs. De mate van overéénkomst tussen de 2 methodes is bescheiden wat betreft het vergelijken van mRNA-expressie studies bij CVS/M.E. Er werd gesuggereerd dat deze discrepantie ten dele te wijten is aan de verschillen in methodologie: veranderingen onder +/- 2 maal en lagere transcriptie zouden kunnen gelinkt zijn met een slechtere overéénstemming tussen de methodes. Dit onderstreept een consistent probleem bij miRNA-studies aangezien de ‘cut-off’ die gewoonlijk wordt gehanteerd voor miRNA gen-expressie experimenten een verandering van 1,5 maal is, wat kan leiden tot uitsluiting van positieve gegevens.

De miRNAs met verhoogde expressie bij CVS/M.E. zouden mogelijks kunnen dienen als biomerkers voor de ziekte, die dan kunnen worden gebruikt om de diagnose te verbeteren en te bespoedigen. Dit werd eerder al geprobeerd in een aantal studies die potentiële biomerkers in het serum, cytokine-expressie, dipeptidyl-peptidase-4 (CD26) [Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817; zie ‘Natural Killer Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?] en lymfocyten gen-expressie [Steinau M, Unger ER et al. Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. J Mol Med (2004) 82: 750-5 /// Light AR et al. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS] identificeerden. Om te bepalen of de 4 ge-upreguleerde miRNAs geschikte merkers zijn om CVS/M.E.-individuen te onderscheiden van een gematchte controle-groep, werd een ROC-analyse uitgevoerd. Deze toonde aan dat alle 4 de merkers patiënten van controles konden onderscheiden, met een specificiteit vergelijkbaar met die van gepubliceerde studies. Deze miRNAs zouden specifiek voor CVS/M.E.-patiënten kunnen zijn […]. Validering bij grotere geblindeerde groepen patiënten is echter nodig vooraleer de diagnostische buikbaarheid van de in deze studie geïdentificeerde miRNAs volledig kan worden benut.

Lymfocyten uit perifeer bloed werden reeds intensief onderzocht bij CVS/M.E.-patiënten en dit identificeerde wijzigingen qua cytokine-secretie, en veranderingen in cellulaire populaties en aktiviteit [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]. De cellulaire mechanismen en processen die worden gereguleerd door miRNAs zijn dikwijls cel-specifiek. Om te proberen de leucocyten-populatie die bijdraagt tot gewijzigde miRNA-expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werden de 4 miRNAs met verhoogde expressie gekwantificeerd in PBMC-fracties van een nieuwe patiënten-groep. Hsa-miR-126 vertoonde verhoogde expressie in monocyten. Hoewel er tot op heden nog geen specifiek defekt in monocyten-aktiviteit werd aangetoond bij CVS/M.E., bleek hsamiR-126 CRK-proteïne expressie te downreguleren. Dit proteïne inhibeert cel-invasie en -migratie en bleek proliferatie in dendritische cellen te controleren, wat suggereert dat verhoogde monocyten-aktiviteit gemedieerd door miRNA kan bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E.

Hsa-miR-330-3p & hsa-miR-99b wijzen op verhoogde expressie in B-cel en NK-cel populaties. Deze miRNAs bleken geassocieerd met kanker, endometriose, beslissingen aangaande het lot van cellen en angiogenese. Hsa-miR-99b bleek gericht te zijn op componenten van NF-κB, mTOR en AKT signalisering-mechanismen. mTOR signalisering is cruciaal voor normale proliferatie, cytotoxische en cytokine-effector funkties in gezonde NK-cellen, en normale BCR (B-cel receptor) signalisering en proliferatie in B-cellen. Verhoogde hsa-miR-99b expressie die mTOR reguleert, ondersteunt de vermindering qua effector-funktie die wordt geobserveerd in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten die wordt gerapporteerd in de literatuur, en ondersteunt de ontregeling van genen betrokken bij B-cel rijping en ontwikkeling die werd geïdentificeerd via gen-expressie studies [Vernon SD, Broderick G et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct. (2008) 4: 44; zie ‘Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS]. Hsa-miR-330-3p bleek cellulaire beweeglijkheid te reguleren […] in prostaatkanker-celllen en proliferatie […] bij colorectale kanker.

Hsa-miR-30c vertoont geen veranderde expressie in de cellulaire fracties: dit suggereert dat de geobserveerde over-expressie in de oorspronkelijke PBMC-groep wellicht specifiek is voor die groep. Dit toont de noodzaak aan voor validering van de bevindingen bij afzonderlijke niet-gerelateerde groepen of patiënten.

Om de effekten van de gewijzigde miRNA-expressie geïdentificeerd bij CVS/M.E op cellulair mRNA te bestuderen, verkozen we transfectie van de miRNAs met de grootste over expressie (hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p) in gezonde NK-cellen (het meest consistent geïdentificeerd als zijnde funktioneel verstoord bij CVS/M.E.-patiënten). Interferon-gamma (IFN-γ) vertoonde de grootste expressie-wijziging in respons op introductie van hsa-miR-99b: een toename qua expressie van 2,6 maal. Dit gen codeert voor een cytokine gesecreteerd door NK-cellen met een cruciale rol in anti-virale, anti-tumor en immuun-regulerende effekten gecombineerd met het bevorderen van NK-cel aktiviteit. Meting van IFN-γ gaf in een aantal CVS/M.E.-studies variabele resultaten. Er werd verhoogd mRNA in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten aangetoond, ondersteund door een verhoging qua circulerende IFN-γ secreterende CD3 CD56+ NK-cellen beschreven bij CVS/M.E.-patiënten [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42; zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Plasma-concentraties van IFN-γ bleven echter onveranderd bij 40 vrouwelijke CVS/M.E.-patiënten t.o.v. gematchte controles [Fletcher MA et al. Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2009) 7: 96; zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS].

Eén consistente bevinding bij CVS/M.E.-patiënten is de vermindering qua cytotoxische aktiviteit van NK-cellen, dikwijls geassocieerd met een verandering qua niveau van componenten van cytotoxische granules – granzyme & perforine. In deze studie was Granzyme-B (GZMB) significant ge-upreguleerd door hsa-miR-99b, wat een versterkte cytotoxische capaciteit suggereert. CTSL (Cathepsine-L) vertoonde echter de grootste downregulering door hsa-miR-99b. Dit enzyme is nodig voor het verwerken (van precursor tot aktieve vormen) van componenten uit lytische granules (granzyme & perforine), wat een verklaring suggereert voor het verhoogd GZMB mRNA – dat hier en in de literatuur wordt gemeld – leidend tot verminderde effector-funktie. Dit mechanisme suggereert een opéénstapeling van precursor-proteïnen voor GZMB en perforine in lytische vesikels met verminderde cytotoxische werking, wat wordt ondersteund door gegevens die gedaalde NK-cel cytotoxiciteit identificeerden bij CVS/M.E.-patiënten zonder een geassocieerde verstoring van de degranulatie. Over-expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p induceerde een gen-expressie patroon dat consistent is met NK-cel aktivatie verhogende IFN-γ expressie en genen betrokken bij cellulaire beweeglijkheid, vesikel-vorming en modulatie van het actine-cytoskeleton (KLRF1, STOM, S100A4, FEZ1, ARPC3 & TPM3P5). Er werd gepostuleerd dat geaktiveerde NK-cellen in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten het resultaat kunnen zijn van een onvolledig verdwijnen van virale infektie, wat de meest geciteerde trigger is als aanvang van CVS/M.E.-symptomen. Deze gegevens tonen ook een molekulaire basis voor de vermindering qua NK-cytotoxiciteit, die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten, gemedieerd door miRNA, via directe downregulering van enzymen die vereist zijn voor het verwerken van componenten van cytotoxische vesikels, en downregulering van genen in autofagie-, WNT- en AKT-mechanismen [bepaalde signaal-traansductie mechanismen] (ULK1, ATG2A, PMEPA1, DKK3, PDCD4) vereist voor normale proliferatie en rijping van geaktiveerde NK-cellen. Bijkomende validering van de proteïne-doelwitten die worden gereguleerd door de geïdentificeerde miRNAs is wenselijk om de miRNA-gemedieerde NK-cel dysfunktie bij in CVS/M.E. volledig te definiëren.

De voorgestelde gegevens identificeren ontregeling van miRNA-expressie in cellen van het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten, bevestigd in 2 patiënten-groepen, in PBMCs en cellulaire subgroepen, en identificeert 4 mogelijke diagnostische biomerkers. ‘Natural killer’ cellen vertoonden de grootste veranderingen qua miRNA-expressie met upregulering van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p. Deze bevindingen zijn funktioneel consistent met het begrip van de pathogenese van CVS/M.E. Het werk dat hier wordt gepresenteerd levert nieuw bewijsmateriaal voor een gewijzigde NK-cel aktivatie-mechanisme bij CVS/M.E. waarbij hsa-miR-99b is betrokken en suggereert een mechanisme voor de verminderde effector-funktie die wordt gezien bij CVS/M.E., wat eerder nog niet werd aangetoond.

februari 18, 2016

‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie

Filed under: Immunologie,Infektie — mewetenschap @ 10:00 am
Tags: , , , ,

In ‘Heterologe immuniteit – overzicht’ lazen we al dat auto-immune ziekten kunnen worden geïnitieerd door infektie met virussen die coderen voor T-cel epitopen die kruis-reaktief zijn met ‘zelf’-antigenen, of geïnfekteerd met virussen die voor ‘zelf’-epitopen coderen. De aanwezigheid van kruis-reaktieve responsen die ‘zelf’ pathogeen-antigenen herkennen leidt niet noodzakelijkerwijs tot auto-immuniteit. Er moet een uitlokkende gebeurtenis, zoals een virale infektie, plaatsvinden…

Donald R. Staines (Australië) schreef in ‘Is Chronic Fatigue Syndrome an auto-immune disorder of endogenous neuropeptides, exogenous infection and molecular mimicry?’ (Medical Hypotheses (2004) 62: 646-652) reeds over een mogelijk mechanisme voor de ontwikkeling van CVS dat gebaseerd is op het verlies van immunologische tolerantie voor vaso-aktieve neuropeptiden (die werken als hormonen, neurotransmitters, immuun-modulatoren en neurotrofen (substanties die de overleving/groei van neuronen beschermen en bevorderen); en een rol spelen bij bloeddoorstroming in organen, thermoregulering, geheugen en concentratie) na infektie of significante lichamelijke inspanning.

Wellicht omwille van de complexiteit van de behandelde materie kreeg deze hypothese niet de aandacht die ze wellicht verdiende. In onderstaand artikel benaderen Britse onderzoekers dit alles iets breder en proberen ze de zaken wat éénvoudiger uit te leggen. Hopelijk wordt dit nu opgepikt en is dit een aanzet voor meer onderzoek op dit gebied.

Eenvoudig uitgelegd betekent ‘molecular mimicry’ (‘mimic’ = imiteren of nabootsen) dat een deel van een bepaald proteïne (peptide) sterk gelijkt op een deel van een totaal verschillend proteïne. De types proteïnen die een rol kunnen spelen bij auto-immune ziekte zijn ‘self’-proteïnen (‘eigen’, deel uitmakend van het menselijk lichaam; bv. myeline bij MS), proteïnen van infektueuze agentia (virus/bakterie) en voedsel-proteïnen. Het immuunsysteem herkent een deel van het proteïne van een indringer d.m.v. T-cellen – die receptoren (TCR) dragen die korte segmenten herkennen – geholpen door zgn. antigen-presenterende cellen (zoals macrofagen; die de indringer afbreken). De macrofaag gaat dan een proteïne-fragment (peptide) op zijn oppervlak dragen en ‘presenteert’ het dan aan de miljoenen circulerende T-cellen. Een T-cel met een passende receptor hecht zich aan het gepresenteerde proteïne-fragment, waardoor deze geaktiveerd wordt en andere delen van het immuunsysteem stimuleert (immuun-respons). Er is gebleken dat verscheidene gelijkaardige, maar ietwat verschillende fragmenten, door dezelfde T-cel kunnen worden herkend. Zo kan ‘molecular mimicry’ een auto-immune reaktie triggeren. Als het proteïne-fragment van een vreemde indringer, dat aan de T-cel wordt gepresenteerd, nauw verwant is met een deel van een ‘self’-proteïne (autoreaktive T-cel) dan zal het geaktiveerde immuunsysteem dit ook aanvallen (kruis-aktivatie => auto-immune respons). Het auto-immuniteit mechanisme kan ook via een antilichaam (i.p.v een T-cel) verlopen. En soms is het nog wat ingewikkelder dan dit maar dat zou ons te ver brengen… Auto-immuniteit is dus het resultaat van verlies van de immunologische tolerantie, de capaciteit van een individu om het onderscheid te maken tussen ‘self’ (eigen aan het lichaam) en ‘non-self’.

Merk op dat ook deze hypothese aangeeft dat niet één enkel micro-organisme de oorzaak van M.E.(cvs) zou zijn…

————————-

Med Hypotheses (2016) 87: 40-3

Microbes, molecular mimicry and molecules of mood and motivation

Morris JA (1), Broughton SJ (2), Wessels Q (2)

1 Department of Pathology, Royal Lancaster Infirmary, Lancaster LAI 4RP, UK

2 Faculty of Health and Medicine, Lancaster University, Lancaster LA1 4YQ, UK

De hypothese stelt dat funktionele aandoeningen [‘functional disorder’ of ‘functional somatic syndrome’ = lichamelijk syndroom zonder een verklaring voor organische ziekte, aantoonbare strukturele veranderingen of vastgestelde biochemische abnormaliteiten”. O.i. eigenlijk niet van toepassing op M.E.(cvs) waar wel degelijk abnormaliteit worden gevonden!], zoals prikkelbare darm syndroom, Chronische Vermoeidheid Syndroom en anorexia nervosa worden veroorzaakt door auto-antilichamen tegen neuronale proteïnen geïnduceerd door molekulaire ‘mimicry’ [nabootsing] met microbiële antigenen. De leeftijd-incidentie [voorkomen per leeftijd] van deze aandoeningen, het uitgesproken overwicht bij vrouwen, toename bij economische en technologische vooruitgang, het versneld worden door infektie en het ontbreken van histologische veranderingen zijn allemaal consistent met de hypothese. Ze kan direct worden getest aan de hand van menselijke serum-stalen, door te zoeken naar kruis-reaktie met hersen-proteïnen in model-systemen zoals Drosophila melanogaster [fruitvlieg]. De aandoeningen zouden in aanmerking kunnen komen voor behandeling met gepoold immunoglobuline. Identificatie en eliminatie van bakterieën die de kruis-reagerende antigenen tot expressie brengen, zou mogelijk moeten zijn.

Inleiding

Funktionele aandoeningen, zoals prikkelbare darm syndroom, Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en anorexia nervosa (AN) zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit. Ze vormen een aanzienlijk deel van de belasting van de gemiddelde huisarts maar de pathogenese blijft een mysterie. Anders dan de meeste ziekten die bij mensen voorkomen, zijn er geen consistente microscopische veranderingen in lichaamsweefsels die een aanwijzing zijn voor de oorzaak. Deze funktionele aandoeningen hebben echter een aantal gemeenschappelijke kenmerken:

  1. Ze komen veel meer voor bij vrouwen dan bij mannen.
  2. De aanvang van de aandoening is meestal rond middelbare leeftijd. De leeftijd-incidentie bereikt een piek tussen de 20 en de 40, afhankelijk van de specifieke aandoening. De incidentie neemt dan af en een aanvang op oudere leeftijd is ongewoon.
  3. Er is bewijsmateriaal dat ze meer courant voorkomen bij technologische, sociale en economische vooruitgang in de maatschappij.
  4. Er wordt gesuggereerd dat infektie de aandoeningen kan versnellen en verergeren maar de verbanden blijven vaag.
  5. Diagnostische histologische veranderingen in weefsels zijn afwezig.
  6. Psychologische factoren kunnen belangrijk zijn maar zijn niet overtuigend als primaire of belangrijke oorzaak.

De hypothese die hier wordt onderzocht is dat deze kenmerken kunnen worden verklaard door molekulaire ‘mimicry’ tussen onze microbiële flora en neuronale proteïnen van de hypothalamus en darm; wat leidt tot auto-antilichamen die stemming en motivatie beïnvloeden.

De microbiële flora

Er zijn ongeveer 10 keer meer bakteriële cellen aanwezig in de darm dan dat er menselijke cellen in het lichaam zijn. Het aantal verschillende bakterie-soorten die kunnen aanwezig zijn, ligt in de grootte-orde van 400-800 […]. Elke bakterie heeft, gemiddeld, 3.000-5.000 genen die coderen voor 3.000-5.000 proteïnen. De grootte en complexiteit van het bakterieel proteoom is daarom immens maar kan niet precies bepaald worden omdat er genetische overlap is tussen verschillende soorten en genetische diversiteit binnen een soort.

Het menselijk genoom telt ongeveer 20.000 genen. Het aantal proteïnen bedraagt echter meer dan 250.000. Menselijke genen hebben meerdere exonen en differentiële ‘splicing’ [verandering van genetische informatie na transcriptie van DNA naar mRNA: tijdens het RNA-processing worden ‘introns’ (overbodige, niet-coderende stukken) uit het pre-mRNA geknipt en de resterende ‘exons’ van het pre-mRNA aan elkaar geplakt] van de RNA-transcripten van de exonen kan meerdere verschillende proteïnen opleveren. Verder zijn er menselijke enzymen die chemische groepen toevoegen en afsplitsen waardoor de proteïne-diversiteit verhoogt.

Het verwerven van immuniteit en het genereren van specifieke antilichamen vergt de gecoördineerde werking van macrofagen, T-lymfocyten en B-lymfocyten. Macrofagen fagocyteren bakterieën, doden ze d.m.v. intracellulaire enzymen en splitsen hun proteïnen in polypeptiden van 8-12 aminozuren. De polypeptiden worden dan op het oppervlak van de macrofaag geplaatst in de gleuf van een oppervlakte-proteïne genaamd MHC2 (‘major histocompatibility’ proteïne type-2). De taak van de T- en B-lymfocyten, die samenwerken, is het polypeptide te gebruiken als een code voor het proteïne waarvan het werd afgeleid. Als wordt geoordeeld dat proteïne verschillend is van ‘zelf’ [‘Self’ antigenen worden gewoonlijk getolereerd door het immuunsysteem, ‘Non-self’ antigenen worden als indringers geïdentificeerd en aangevallen. Auto-immuniteit is wanneer een organisme niet is staat is om de eigen onderdelen als ‘self’ te herkennen, waardoor een immuun-respons tegen de eigen cellen en weefsels toegelaten wordt.] en als het van een potentieel pathogeen organisme komt, dan zullen antilichaam-molekulen worden gegenereerd die het proteïne herkennen. Maar als het proteïne lijkt op ‘zelf’-proteïnen zal de produktie van antilichamen schadelijk zijn. Het precieze mechanisme wordt niet volledig begrepen maar een belangrijk deel is de vorming van een complex tussen de T-cel oppervlakte-receptor, het polypeptide en de MHC2 molekule. De herkenning is daarom afhankelijk van de vorm van de specifieke T-cel receptor. Er zijn zowel helper en suppressor T-cellen, en op een bepaalde manier leiden de helper T-cellen tot antilichaam-produktie door B-cellen, terwijl de T-cel suppressor antilichaam-produktie inhibeert.

De taak van het immuunsysteem is extreem ingewikkeld en kan worden geanalyseerd in statistische termen [Morris JA. Autoimmunity; a decision theory model. J Clin Pathol, 40 (1987) 40: 210-215]. Er zijn 10 triljoen mogelijke manieren waarop 20 aminozuren kunnen combineren om een polypeptide-keten van 10 aminozuren lang te vormen (2010 = 1013). Het totaal aantal proteïnen in het gecombineerd menselijk en bakterieel proteoom is waarschijnlijk minder dan een miljoen en met een gemiddelde proteïne-lengte van 300 aminozuren, is het totaal aantal polypeptiden van 10 aminozuren lang minder dan 109. Zodoende volstaan polypeptide-ketens van 7 aminozuren (207 = 1,28 x 109) waarschijnlijk om te coderen voor elk mogelijk proteïne. De belangrijkste receptor is de T-cel receptor en de sleutel-beslissing is de differentiatie tussen lijkend op en verschillend van ‘zelf’.

Een belangrijk probleem bij het beslissing-proces is dat er een omvangrijke overlapping is tussen bakteriële genen en proteïnen, en menselijke genen en proteïnen. Proteïne-strukturen die essentiële funkties hebben blijven behouden tijdens in evolutie en we delen letterlijk ons genoom en proteoom met de rest van de biologische wereld. Als een pathogeen proteïnen deelt met een menselijke gastheer dan zal de taak om antilichamen op te wekken die enkel de niet-gemeenschappelijke proteïnen veel moeilijker zijn. Als de eerste blootstelling aan het pathogeen een hoge dosis heeft en een levensbedreigende infektie optreedt, dan moet de beslissing vlot verlopen en het risico op fouten zal verhogen. Ook als de eerste blootstelling later in het leven (wanneer het immuunsysteem verslechterd) optreedt, zal het risico op vergissing verhogen.

Gender-verschillen

Beslissingen worden in onzekerheid genomen en zelfs een zeer gesofisticeerd beslissing-systeem op basis van een optimale beslissing-strategie is vatbaar voor fouten; hoe ingewikkelder het systeem, hoe meer overbodigheid in het systeem wordt ingebouwd, hoe lager de fouten-marge zal zijn. Maar fouten kunnen niet volledig worden geëlimineerd.

Laat ons het falen om te reageren op een vreemd proteïne op een pathogeen als een vals-negatieve beslissing definiëren. Omgekeerd is het reageren op een proteïne dat lijkt op ‘zelf’ een vals-positieve beslissing. Aanpassing van de beslissing-criteria om vals-negatieven automatisch te reduceren, verhoogt het aantal vals-positieven en vice versa. Dit is wederom een eigenschap van de zgn. ‘statistical decision theory’. Een vals-negatieve respons zal het risico op infektie verhogen. Een vals-positieve repsons zal het risico op auto-immune ziekte verhogen. Sommige individuen zullen fouten maken aan de ene kant en sommigen aan de andere kant. Het is daarom opmerkenswaardig dat mannen over het algemeen meer neigen tot infektie terwijl vrouwen een verhoogd risico op auto-immune ziekte hebben. Dit is in het bijzonder van toepassing op orgaan-specifieke auto-immune ziekten waarvan wordt gedacht dat auto-antilichamen een rol spelen, bv. schildklier-ziekte, pernicieuze anemie [kwaadaardige bloedarmoede veroorzaakt door een vitamine-B12 opname-probleem], myasthenia gravis [ernstige spierzwakte] en primaire biliaire cirrhose [PBC, een auto-immune lever-aandoening]. De vrouw/man-verhouding bij deze aandoening ligt rond 10. De overmaat vrouwen bij prikkelbare darm syndroom, CVS en AN is even extreem en daarom past dit bij het idee dat auto-antilichamen tegen zenuw-cellen deel zouden kunnen uitmaken van de pathogenese van deze aandoeningen.

Voorkomen per leeftijd

Morbiditeit en mortaliteit komen meer voor bij stijgende leeftijd omdat de meerderheid van de ziekten een gevolg zijn van een graduele verslechtering van de prestaties van onze complexe informatie-verwerking systemen. Ziekte veroorzaakt door courante pathogenen bij de eerste blootstelling genereert echter een verschillende leeftijd-incidentie curve. De waarschijnlijkheid van een eerste blootstelling aan courante organismen daalt exponentieel na de geboorte. Hoe couranter het organisme, hoe sneller de exponentiële afname. Maar de waarschijnlijkheid op fouten na eerste blootstelling zal stijgen in funktie van de leeftijd omdat het immuunsysteem veroudert, net zoals andere lichaam-systemen. Dus zal de leeftijd-incidentie curve die we zouden voorspellen voor een auto-immuun ziekte (optredend ten gevolge ‘molecular mimicry’) er één zijn die piekt op middelbare leeftijd en dan daalt. Verder zal hoe couranter het organisme is, hoe vroeger de piek zal optreden; hoe minder courant het organisme, hoe later de piek.

Deze vorm van leeftijd-incidentie wordt gezien bij de funktionele aandoeningen. AN piekt rond de 20, terwijl prikkelbare darm syndroom en CVS pieken rond de 30-40. Deze aandoeningen ontstaan niet op latere leeftijd omdat men tegen dan vrijwel geen nieuwe bakterieën tegenkomt.

Veranderingen met de tijd

De verspreiding van microben wordt beïnvloed door technologische, sociale en economische verandering. Een opvallend historisch voorbeeld is lepra. Lepra is een ziekte van armoede, overbevolking en slechte hygiëne; die wordt verspreid door langdurig persoonlijk contact. De ziekte was niet ongewoon in Europa in de Middeleeuwen maar is nu zeer zeldzaam. Een ander voorbeeld, relevanter voor deze hypothese, is poliomyelitis [polio, kinderverlamming]. Epidemieën van paralytische poliomyelitis kwamen voor bij zij die het beter stelden in de maatschappij, tegen het einde van de 19e eeuw. In dit geval veroorzaakten armoede, overbevolking en slechte hygiëne een snelle verspreiding van het virus en kinderen met deze aandoening werden blootgesteld tijdens het eerste levensjaar. Verbeterde sociale omstandigheden vertraagden de verspreiding van het virus en onder deze omstandigheden trad de eerste blootstelling later in de kindertijd op. Om redenen die niet volledig worden begrepen, leidde latere blootstelling tot een verhoogd risico op verlamming.

Een ander voorbeeld is klierkoorts veroorzaakt door het Epstein-Barr virus. De ziekte klierkoorts is zeldzaam bij Afrikaanse kinderen en bij de lagere sociale klassen in Europa en Noord-Amerika. Deze kinderen worden op vroege leeftijd aan het virus blootgesteld en vertonen slechts een milde ziekte. Midden-klasse kinderen in Europa Noord-Amerika kunnen de leeftijd van teenager bereiken zonder aan het virus te zijn blootgesteld. Eerste blootstelling als teenager zal meer waarschijnlijk leiden tot een ernstige ziekte.

Er zijn waarschijnlijk meerdere factoren betrokken bij de stijgende ernst van ziekte bij latere blootstelling:

  1. Kinderen blootgesteld tijdens de eerste 6 maand van hun leven zullen gedeeltelijke bescherming hebben door maternale IgG en, indien ze borstvoeding kregen, door IgA in de moeder-melk.
  2. Een verminderde circulatie van organismen leidt tot een wijziging van endemische naar epidemische verspreiding. Epidemische verspreiding leidt tot latere blootstelling en een hogere dosis bij eerste blootstelling.
  3. Het Epstein-Barr virus wordt verspreid via lichaamsvochten en nauw contact als teenager zou geassocieerd kunnen zijn met een hogere dosis bij eerste blootstelling.
  4. Het immuunsysteem verslechtert met de leeftijd, net zoals alle lichaam-systemen, zodat fouten meer waarschijnlijk worden. Dit betekent zowel vals-positieven als vals-negatieven. Een verstoorde respons zal meer waarschijnlijk leiden tot een ernstige infektie alsook auto-immune ziekte.

Een ganse reeks van immuun-gemedieerde ziekten komen meer voor in technologisch geavanceerde landen de voorbije 50 jaar. Deze omvatten: astma, hooikoorts, eczema, type-1 diabetes mellitus en Multipele Sclerose. De term ‘hygiëne-hypothese’ wordt dikwijls gebruikt. Dit impliceert dat sociale vooruitgang leidt tot een gewijzigd patroon van blootstelling aan microben en dit leidt op z’n beurt tot een verhoogd risico op immuun-gemedieerde ziekte.

Prikkelbare darm syndroom, CVS en AN nemen ook toe in technologisch geavanceerde landen. Eens te meer past dit bij het concept van een auto-immuun mechanisme.

Infektie

Er is bewijs dat infektie funktionele aandoeningen kunnen teweegbrengen of verergeren. De aanvang van prikkelbare darm syndroom volgt gewoonlijk na een episode van infektueuze diarree. CVS kan getriggerd worden door infektueuze mononucleose en virale hepatitis. Er is een toenemende interesse in het concept van ‘cross-talk’ tussen de microbiële flora en het darm-, autonoom en centraal zenuwstelsel. Er zijn een aantal manieren waarop bakteriële secretorische produkten neuronale funktie zouden kunnen beïnvloeden maar die werken bij zowel mannen als vrouwen van alle leeftijden. Slechts de vorming van auto-antilichamen is overheersend vrouwelijk en ontstaat op middelbare leeftijd.

Histologische veranderingen afwezig

Infektie veroorzaakt normalerwijs schade aan de weefsels en triggert inflammatie. Bakterieën en virussen kunnen cellen direct beschadigen en ze stimuleren een immuun-respons die ook cellulaire schade veroorzaakt en inflammatie uitlokt. Inderdaad: veel van onze kennis over ziekte en onze klassificatie-systemen van ziekten hangen af van het voorkomen van pathologische veranderingen vastgesteld via licht-microscopie.

De aanwezigheid van histologische veranderingen is een aanwijzing voor de oorzaak maar een afwezigheid van histologische veranderingen betekent niet noodzakeljk een afwezigheid van aanwijzingen voor de oorzaak. Molekulen, zoals bakteriële toxinen of auto-antilichamen, kunnen funktionele effekten veroorzaken zonder histologische verandering. Er is steeds meer bewijs dat bakteriële toxinen kunnen inwerken op de neurale systemen die de ademhaling controleren voor de oorzaak van ‘sudden infant death syndrome’ [wiegedood]. Dit resulteert in sterfte zonder diagnostische histologische bij autopsie. Een ander voorbeeld, meer direct relevant voor de hypothese van dit artikel, is myasthenia gravis. Een auto-antilichaam tegen het acetylcholine-receptor proteïne veroorzaakt spierzwakte. De ziekte is meer courant bij vrouwen dan bij mannen en de piek-incidentie ligt rond de 30 jaar. Er werden auto-antilichamen, die circulerende regulerende peptiden en neuronale proteïnen in de hypothalamus herkennen, gevonden bij patiënten met anorexia nervosa. Er zijn ook meldingen van auto-antilichamen tegen serotonine bij CVS. Post-streptococcen chorea [een neurologisch symptoom: plotse, snelle en ongerichte bewegingen] wordt veroorzaakt door auto-antilichamen tegen basale ganglia proteïnen die kruis-reageren met streptococcen oppervlakte-antigenen. In al deze gevallen is er een afwezigheid van of een gebrek aan histologische veranderingen, zeker wat betreft diagnostische microscopische veranderingen.

Auto-antilichamen tegen darm-, autonome of centrale neuronen zijn een plausibele verklaring voor funktionele aandoeningen. De bloed-hersen-barrière zal de toegang verhinderen tot een groot deel van het centraal zenuwstelsel maar capillairen in de hypothalamus laten IgG-antilichamen door [via poriën in de endotheliale cellen] tot de plaats die de autonome respons en emotionele responsen controleert.

Psychologische theorieën

De funktionele aandoeningen worden dikwijls ‘psychosomatische ziekten’ genoemd. Deze term heeft 2 betekenissen. In oudere literatuur was de term synoniem met ‘psychogeen’ (wat ‘tussen de oren’ of ingebeelde ziekte impliceert). De modernere betekenis is echter dat psychosomatische aandoeningen worden veroorzaakt door de interaktie van psychologische en lichamelijke factoren.

[Funktionele somatische syndromen (FSS) – multipele chemische sensitiviteit, ‘sick building’ syndroom, repetitieve stress letsel, bijwerkingen van siliconen borst-implantaten, Golf Oorlog syndroom, chronische ‘whiplash’, Chronische Vermoeidheid Syndroom, prikkelbare darm syndroom, fibromyalgie, enz. – worden door de aanhangers van de psychologische school verkeerdelijk gelijkgesteld met psychosomatisch. Een aantal klinici aanvaarden dat deze aandoeningen reëel zijn. Psychologen/psychiaters stellen echter (pseudo-wetenschappelijk): “Hoewel discrete pathofysiologische oorzaken uiteindelijk kunnen worden aangetoond; wordt bij sommige patiënten met FSS hun lijden verergerd door een zichzelf in stand houdende, zelf-bevestigende cyclus, waarbij courante symptomen foutief worden toegeschreven aan een ernstige abnormaliteit en waardoor het geloof van de patient dat zij/hij een ernstige ziekte heeft, wordt versterkt. Enz.”… Een funktioneel symptoom is een medisch symptoom dat wordt beschouwd als ontstaan door een probleem in de werking van het zenuwstelsel en niet veroorzaakt door een struktureel probleem of pathologische gedefinieerde ziekte. Het mag uit onze bijdragen hier duidelijk zijn dat er bij M.E.(cvs) wel degelijk strukturele/organische/somatische problemen zijn. FSS is, zoals cvs, een ‘vuilbak-diagnose’. De term wordt door sommigen gebruikt als synoniem voor ‘onverklaard’ (men erkent de symptomen maar er lijkt niets abnormaals te worden gevonden).]

Het is het eerste idee dat leidt tot niet-overtuigende verklaringen. Er zou, bijvoorbeeld, een verhoogde incidentie van lichamelijk en sexueel misbruik in de kindertijd geweest kunnen zijn bij mensen die funktionele aandoeningen gaan vertonen. Het is makkelijk om te begrijpen hoe dit symptomen bij volwassen zou kunnen beïnvloeden maar het is lichtgelovig te bedenken dat misbruik de enige en afdoende oorzaak voor de funktionele aandoeningen zou zijn. Zo zullen moderne concepten voor de perfecte lichamelijke vorm die wordt gepromoot door de mode-industrie, teenagers beïnvloeden om te gaan diëten maar er moet zeker iets meer diepgaand en fundamenteel aan de hand zijn om vermagering/uithongering of zelfmoord te induceren.

Bespreking

Auto-antilichamen tegen neuronale proteïnen geïnduceerd door blootstelling aan microbiële antigenen zijn een plausibele verklaring voor funktionele aandoeningen zoals prikkelbare darm syndroom, CVS en AN. De leeftijd-incidentie, verhoogde frequentie bij vrouwen, veranderingen van de incidentie met de tijd, ontbreken van histologische veranderingen en bewijs voor microbiële precipitatie passen allemaal bij een auto-immune aandoening. […] Auto-antilichamen die op het limbisch systeem werken, zouden extreme emoties kunnen induceren, leidend tot afkeer en angst. […].

Er werden auto-antilichamen tegen regulerende peptiden en serotonine gevonden bij patiënten met AN en CVS. Verder werd er in publicaties gesproken over het concept van bakteriële translocatie [passage van (bestanddelen) van bakterieën door het darm-slijmvlies naar het bloed, lymfeklieren en organen] en ‘molecular mimicry’ leidend tot de produktie van auto-antilichamen. Er is dus reeds enige directe experimentele ondersteuning voor de hypothese die we voorstellen.

Om deze hypothese te onderzoeken, moeten we zoeken naar antilichamen tegen neuronale proteïnen bij patiënten met bovenstaande funktionele aandoeningen. Een belangrijk aspect voor de hypothese is dat genen en proteïnen evolutionair behouden blijven, zodat diverse dieren (vliegen, muizen en mensen) gelijkaardige neuronale proteïnen zullen hebben. De gedetailleerde anatomie van de hersenen van vliegen, muizen en mensen is duidelijk verschillend maar de bouwstenen zijn gelijkaardig. Dit betekent dat we vliegen, zoals Drosophila melanogaster, kunnen gebruiken als een primair model-organisme om menselijke auto-antilichamen te detekteren. D. melanogaster werd in feite al meer dan 100 jaar gebruikt in veel research-gebieden van menselijke ziekten en funktie. In de neurowetenschappen is research, die gebruikmaakt van een waaier aan genetische en molekulaire instrumenten in die vlieg, fundamenteel gebleken voor ons begrip van, bijvoorbeeld, leren en geheugen, slaap, circadiaanse ritmes en de neuro-endocriene regulering van ouder-worden. Als menselijke auto-antilichamen binden op neuronale proteïnen van D. melanogaster kan dit gevisualiseerd worden d.m.v. immunofluorescentie en microscopie. De proteïnen kunnen daaropvolgend worden geïdentificeerd en hun sequentie bepaald m.b.v. een brede waaier aan technieken die beschikbaar zijn voor dit model-organisme.

Als auto-antilichamen een significante rol spelen dan zou immunotherapie op basis van gepoold IgG van gezonde individuen een behandel-optie kunnen zijn bij ernstige, in het bijzonder levensbedreigende, gevallen (zoals AN). Op langere termijn dient men de specifieke kruis-reagerende proteïnen van bakterieën in de microbiële flora (die de auto-antilichamen induceren) te identificeren. De bakterieën van de microbiële flora van een individu zijn slechts een subset van alle bakterieën en het zou mogelijk moeten zijn het verantwoordelijk organisme [kan voor elk individu anders zijn] te verdringen en te vervangen met een nauw verwant organisme dat het oorzakelijk proteïne niet vertoont. Verder zijn we steeds meer de mening toegedaan dat enkel bakterieën die het lichaam binnendringen waarschijnlijk hoge concentraties IgG auto-antilichamen opwekken en onderhouden, en daarom is de identificatie van de verantwoordelijke bakterieën en hun vervanging wellicht niet zo moeilijk als op het eerste zicht lijkt.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.