M.E.(cvs)-wetenschap

juni 26, 2020

Metabole dysfunktie bij M.E.(cvs) niet te wijten aan anti-mitochondriale antilichamen

Filed under: Celbiologie,Immunologie — mewetenschap @ 6:49 am
Tags: , , , ,

In verband met auto-immuniteit als ziekte-veroorzakend mechanisme bij M.E.(cvs) hadden we ’t hier al meerdere keren over het werk van Carmen Scheibenbogen en haar medewerkers. In een overzicht hieromtrent (Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17:601-9) werd besloten dat inspanningen om rol van auto-antilichamen af te lijnen noodzakelijk zijn.

Mensen van de onderzoeksgroep van onderstaande publicatie poneerden eerder al de hypothese dat een infektie een auto-reaktief proces (immunisatie tegen auto-antigenen) initieert, dat o.a. het energie-metabolisme (van hersenen en spieren) aantast. Hun model voor M.E.(cvs)-pathogenesie stelt dat patiënten met een genetische voorbestemming gradueel B-cel klonen ontwikkelen die geneigd zijn tot auto-reaktiviteit. (Blomberg J, Gottfries CG, Elfaitouri A, Rizwan M, Rosén A. Infection elicited autoimmunity and ME/CFS syndrome: an explanatory model. Front Immunol. (2018) 9:229). Lees ook bv. ‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie’, ‘Auto-immuniteit-gerelateerde risico-varianten geassocieerd met M.E.(cvs) met infektueuze aanvang’ enz.

Hier werd nu onderzocht of er anti-lichamen aanwezig zijn tegen (componenten van) de mitochondrieën. Dit blijkt niet het geval. Geen erg: een verwerpen van een hypothese is ook een resultaat… Het kan dat er andere mechanismen verantwoordelijk zijn voor het verstoord energie-metabolisme bij M.E./CVS. Er zijn dus verdere studies vereist om de link tussen mitochondriale dysfunktie en ontregeling van de aangeboren immuniteit uit te klaren…

————————-

Frontiers in Medicine (2020) 7: 108

Metabolic dysfunction in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome not due to anti-mitochondrial antibodies

Isabell Nilsson (1), Jeremy Palmer (2), Eirini Apostolou (1), Carl-Gerhard Gottfries (3), Muhammad Rizwan (1), Charlotte Dahle (1) & Anders Rosén (1)

1 Division of Cell Biology, Department of Biomedical and Clinical Sciences, Linköping University, Linköping, Sweden

2 The Medical School, The University Newcastle upon Tyne, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 The Gottfries Clinic AB, Mölndal, Sweden

Samenvatting

Metabole profilering studies hebben dysfunktionele mitochondrieën aangegeven bij Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Dit omvat een verstoorde funktie van het pyruvaat-dehydrogenase complex (PDC), mogelijks aangestuurd door (een) serum-factor(en), wat leidt tot inadequate adenosine-trifosfaat generatie en overmatige lactaat-accumulatie. Er treedt waarschijnlijk een energie-blokkade op die doet denken aan die bij primaire biliaire cholangitis (PBC), veroorzaakt door anti-PDC auto-antilichamen. PBC is geassocieerd met vermoeidheid en post-exertionele malaise [PEM], wat ook tekenend is voor M.E./CVS. We onderzochten hier of M.E./CVS-patiënten auto-reaktieve antilichamen hebben die kunnen interfereren met de mitochondriale werking. We vouden dat slechts 1 op 161 onderzochte M.E./CVS-patiënten positief was voor anti-PDC, terwijl alle PBC-patiënten (15/15) significante IgM, IgG & IgA anti-PDC reaktiviteit vertoonden, zoals reeds eerder werd getoond. Geen enkele van de fibromyalgie-patiënten (0/14), Multipele Sclerose patiënten (0/29) en gezonde controles (bloed-donoren) (0/44) vertoonde reaktiviteiten. Anti-mitochondriale auto-antilichamen (binnenste en buitenste membraan) waren negatief in de M.E./CVS-groep. De waarden van anti-cardiolipine antilichamen [cardiolipine = belangrijk bestanddeel van het binnenste membraan van mitochondrieën; aanwezig in cellen die metabool aktief zijn, zoals hart- en spier-cellen] bij de patiënten verschilde niet significant van de gezonde bloed-donoren. Tot besluit: de mitochondriale/metabole dysfunktie, die wordt gezien bij M.E./CVS, kan niet worden verklaard door de aanwezigheid van circulerende auto-antilichamen tegen de geteste mitochondriale epitopen.

INLEIDING

[…] De biologie van M.E./CVS is complex en de diverse verklarende modellen die werden voorgesteld, omvatten auto-immuniteit, chronische infektie, energie-metabole defekten, onevenwicht in het autonoom zenuwstelsel en/of hormonen […].

Er is steeds meer bewijs dat wijst op een auto-immuun fenotype voor M.E./CVS. De aanwezigheid van zelf-reaktieve antilichamen in de bloedsomloop van patiënten omvatten kern- en membraan-strukturen, neurotransmitters en hun receptoren, auto-antigenen gevormd door oxidatieve of nitrosatieve schade, en auto-antilichamen gericht tegen mitochondriale componenten. Zowel de frequentie als de titers auto-antilichamen, en hun correlatie met ziekte-ernst of symptomen bleker echter beperkt reproduceerbaar over verschillende studies en patiënten-groepen. Toch ondervond een subgroep M.E./CVS-patiënten verbetering van de symptomen na behandeling door verwijdering van antilichamen [Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove b2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS ONE (2018) 13: e0193672]. Specifieke veranderingen in het CSV [hersenvocht] -proteoom [verzameling van alle eiwitten van een organisme of een cel] van M.E./CVS-patiënten hadden betrekking met de accumulatie van complement-componenten [complement-systeem = onderdeel van de aangeboren immuun-respons dat antilichamen en fagocyterende cellen ‘complementeert’ (aanvult) in de strijd tegen pathogenen], die antilichaam-aktiviteit aanduiden [Schutzer SE, Natelson BH et al. Distinct cerebrospinal fluid proteomes differentiate post-treatment Lyme disease from Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One 2011; 6:e17287; zie ook ‘CVS-gerelateerd proteoom in cerebrospinaalvocht]. In een publicatie door onze groep toonde het serologisch profiel van dezelfde M.E./CVS patiënten-groepen bewijsmateriaal van minieme wijzigingen qua antilichaam-reaktiviteiten tegen de overvloedige herpes-virussen vergeleken met gezonde controles [Blomberg J et al. Antibodies to human herpesviruses in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients. Front Immunol. (2019) 10: 1946]. Deze veranderingen kunnen tekortkomingen qua humorale responsen aangeven bij M.E./CVS die hoofdkenmerken van auto-immune ziekten zijn.

Rapporten wijzen naar een centraal metabool defekt bij M.E./CVS, wat de aërobe energie-produktie aantast via de TCA-cyclus in mitochondrieën, leidend tot een verminderde produktie van adenosine-trifosfaat (ATP) en overmatige lactaat-produktie na inspanning, wat mogelijks PEM verklaart [Fluge Ø., Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-80]. De transitie tussen anaërobe en aërobe energie-produktie wordt gekatalyseerd door het pyruvaat-dehydrogenase complex (PDC [geheel van enzymen (60 sub-units die 3 funktionele proteïnen vormen) die pyruvaat omzetten (oxideren) naar acetyl-CoA (een produkt van de aërobe cellulaire ademhaling): dit kan dan worden gebruikt in de citroenzuur-cyclus (ook TCA- of Krebs-cyclus genoemd) die energie levert]). Auto-antilichamen specifiek tegen PDC zijn een hoofdkenmerk van primaire biliaire cholangitis [of prim. bil. cirrhose] (PBC [auto-immune lever-aandoening]), een potentieel ziekte-model voor door auto-antilichamen gemedieerde energie-blokkade. Analoog met PBC, waarbij de energie-produktie wordt geïnhibeerd door antilichamen, werden ook circulerende energie-inhibitoren gedetekteerd bij M.E./CVS [zie Fluge O, Mella O et al. hierboven], maar hun molekulaire aard is echter onbekend. Het zou redelijk zijn te veronderstellen dat deze circulerende inhibitoren immunoglobulinen blijken te zijn, waarschijnlijk gericht tegen mitochondriale antigenen. We hebben daarom de aanwezigheid van anti-mitochondriale antilichamen en anti-PDC reaktieve auto-antilichamen onderzocht bij M.E./CVS-patiënten.

METHODES

Deelnemers

Alle M.E./CVS-patiënten opgenomen in deze studie kregen de diagnose op basis van de Canadese consensus criteria. […] 3 M.E./CVS-groepen. Groep 1 (n = 74): 46 M.E./CVS-patiënten, 17 M.E./CVS + fibromyalgie (FM) patiënten & 11 FM-patiënten. Deze groep omvatte ook 29 Multipele Sclerose (MS) patiënten. Groep 2 (n = 61): 61 M.E./CVS-patiënten. Groep 3 (n = 40): 18 M.E./CVS-patiënten, 19 M.E./CVS/FM-patiënten, 3 FM-patiënten & 15 voor leeftijd gematchte gezonde donoren. […] Plasma-stalen van 15 PBC-patiënten kwamen uit bloedbank van ‘The Medical School’ van de ‘University of Newcastle upon Tyne’, V.K. […]

Ethische verklaring

[…]

Detektie van anti-PDC antilichamen

ELISA om antilichamen tegen humaan PDC (hPDC) te meten […]. […]

Validatie van anti-PDC antilichamen

[…] Immunoblotting […].

Detektie van anti-mitochondriale auto-antilichamen (AMA)

Plasma-stalen van 29 willekeurig geselekteerde M.E./CVS-patiënten werden gescreend [indirecte immunofluorescentie testen voor semi-kwantitatieve bepaling van antilichamen]. […]

Detektie van anti-cardiolipine auto-antilichamen (ACA)

IgG & IgM anti-cardiolipine antilichamen […] fluoro-enzyme-immunoassay […].

Statistische analyse

[…] Statistisch significante verschillen p < 0.05.

RESULTATEN

Auto-antilichamen tegen mitochondriaal pyruvaat-dehydrogenase complex (PDC) niet gedekteerd bij M.E./CVS

In deze studie analyseerden we of dysfunktionele energie-generatie door mitochondrieën bij M.E./CVS verklaard kan worden door de aanwezigheid van reaktieve auto-antilichamen tegen het PDC-enzyme, analoog met wat werd gezien bij PBC. Er werden patiënten met M.E./CVS, PBC, FM, MS en gezonde bloed-donor controles geanalyseerd. De plasma-stalen van PBC-patiënten waren allemaal positief voor IgG, IgM & IgA anti-PDC antilichamen en waren dus statistisch verschillend (p < 0.0001). Bij verdere analyses bleven deze stalen positief tot verdunningen van 1:105-1:106. In tegenstelling met onze hypothese waren de M.E./CVS-stalen negatief voor auto-antilichamen tegen PDC, met uitzondering van 3 M.E./CVS-patiënten […] en één M.E./CVS-patient met FM co-morbiditeit […] die zwak/ intermediair positief bleek. Deze plasma-stalen werden bijkomend getest via immunoblot-analyse ter validatie. Enkel het staal van de M.E./CVS+FM patient was positief, terwijl de andere negatief waren. Auto-reaktiviteit werd geïdentificeerd tegen de majeure auto-reaktieve epitopen van het PDC-complex, dihydrolipoamide-acetyltransferase (E2) en het E3-bindend proteïne (E3BP).

AMA & ACA niet gedekteerd bij M.E./CVS-patiënten

De groep M.E./CVS-patiënten vertoonde geen AMAs; niet tegen het binnenste en buitenste mitochondriaal membraan, noch antilichamen tegen andere mitochondriale strukturen, noch andere strukturen (nucleair, gladde spier, gastrische pariëtale cellen [zorgen voor de neuro-hormonale stimulatie van maagzuur-sekretie]). De waarden van anti-cardiolipine antilichamen (IgG, IgM, IgA) waren niet significant verschillend in plasma van M.E./CVS- of FM-patiënten vergeleken met bloed-donoren.

BESPREKING

Uit de hier gepresenteerde resultaten besluiten we dat, in tegenstelling met onze initiële verwachting, M.E./CVS-patiënten geen auto-antilichamen tegen epitopen van mitochondriale componenten hebben. Dit sluit niet uit dat andere belangrijke indirecte of secundaire mechanismen bestaan die het complex mitochondriaal pyruvaat-metabolisme bij M.E./CVS blokkeren.

Een voorbeeld van auto-immuniteit met auto-reaktieve antilichamen tegen een belangrijke metabole factor is PBC. Er werd eerder aangetoond dat anti-PDC antilichamen bij deze patiënten voornamelijk gericht zijn tegen het binnenste lipoyl-domein van de PDC-E2 component, welke een alfa-liponzuur covalent gebonden heeft op een specifiek lysine-residu, wat een absolute vereiste is voor z’n enzymatische aktiviteit. Lipoylatie [binding met alfa-liponzuur] is een post-translationele modificatie [verandering in de eiwitten na de vertaling vanuit RNA], die ook voorkomt in bakteriën zoals E. coli of Novosphingobium sp. Er werden auto-reaktieve responsen bij PBC gesuggereerd ten gevolge infektie in de darm met deze bakterieën of beta-retrovirussen, of blootstelling aan omgeving-xenobiotica die het natuurlijk liponzuur-deel nabootsen. PBC-patiënten hebben een PEM die doet denken aan PEM bij M.E./CVS- & FM-patiënten [Newton JL et al. Autonomic dysfunction in primary biliary cirrhosis correlates with fatigue severity. Eur J Gastroenterol Hepatol. (2007) 19: 125-32: lees ook ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)]. FM is een courante co-morbiditeit bij M.E./CVS (30-70% van de patiënten) én auto-immuniteit. Metabole stoornissen bij M.E./CVS met verminderde energie-voorziening en verhoogd lactaat kunnen verantwoordelijk zijn voor de malaise van PEM alsook cognitieve en lichamelijke stoornissen. Er werden in het bijzonder accumulatie van lactaat in het bloed en spieren na inspanning, tesamen met gestegen lactaat-concentraties in het cerebrospinaal vocht gevonden bij M.E./CVS [Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. III. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR in Biomedicine (2012) 25: 1073-1087 /// Lien K et al. Abnormal blood lactate accumulation during repeated exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Physiol Rep. (2019) 7: e14138]. Onze huidige vergelijkende analyse van AMA, anti-PDC en anti-cardiolipine auto-antilichamen van de 3 groepen leverde echter geen positieve of ziekte-specifieke resultaten op.

Er wordt een link tussen mitochondriale dysfunktie en ontregeling van de aangeboren immuniteit gesuggereerd die aantoont dat de energie-producerende organellen (mitochondrieën en peroxisomen) gekoppeld zijn via mitochondriale antivirale signalisering proteïnen (MAVS) aan het inflammasoom [inflammasomen = multi-proteïne molekulaire complexen die een brede waaier aan pathogenen ‘voelen’ en een rol spelen bij de inflammatoire respons]. Hypothetisch kunnen ‘danger-associated molecular patterns’ (DAMPs), zoals mitochondriaal DNA (mtDNA), ‘heat-shock’ proteïnen (Hsp) en cardiolipinen afgegeven worden door de mitochondrieën bij M.E./CVS en werken als auto-antigenen. We vonden eerder dat een subgroep M.E./CVS-patiënten hogere waarden IgM-antilichamen tegen epitopen van mitochondriaal en bakterieel Hsp-60 had (ondanks de afwezigheid van een infektueus pathogen) wat mogelijks zou leiden tot dysfunktionele mitochondrieën [Elfaitouri A, Gottfries CG et al. Epitopes of microbial and human heat shock protein 60 and their recognition in Myalgic Encephalomyelitis. PLoS ONE. (2013) 8: e81155]. Onze hypothese omtrent de aanwezigheid van auto-antilichamen tegen cardiolipine bij M.E./CVS-patiënten, gebaseerd op eerdere publicaties, kon hier niet worden bevestigd, mogelijks omwille van verschillende inclusie- en exclusie-criteria voor de patiënten in eerdere studies, waar de Canadese criteria niet werden gebruikt, maar die leukemie/lymfoma en type-1 diabetes patiënten omvatten. Er zijn verdere studies vereist ter analyse van unieke epitoop-wijzigingen zoals oxidatie-epitopen van cardiolipine, lengte en 3D-struktuur, die elk verschillend zouden kunnen signaliseren in dit complex immuun/metabool scenario.

De hypothese van een directe blokkiage van PDC door auto-reaktieve antilichamen is uitgesloten, op basis van onze huidige bevindingen, maar blokkage kan echter secundair zijn en een teken van compenserende inspanningen om enkele andere abnormaliteiten bij M.E./CVS in evenwicht te brengen, zoals werd gesuggereerd door Fluge O et al. [zie ref. hierboven]. Hun gegevens wijzen op een funktionele stoornis van PDC leidend tot verhoogd verbruik van ketogene [die kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA] en anaplerotische aminozuren [anaplerotische reakties zijn er waar tussenprodukten van een metabool mechanisme worden gevormd; simpel uitgedrukt: “ze vullen de voorraden aan”] die alternatieve mechanismen voor ATP-produktie voeden, onafhankelijk van PDC. De resultaten werden ondersteund door toegenomen mRNA-expressie van pyruvaat-dehydrogenase kinasen die inhiberend zijn voor PDC. Studies tonen ook dat veel vetzuren acetyl-CoA zouden kunnen genereren, die de TCA-cyclus van brandstof voorzien, onafhankelijk van PDC [Germain A, Hanson MR et al. Comprehensive circulatory metabolomics in ME/CFS reveals disrupted metabolism of acyl lipids and steroids. Metabolites. (2020) 10: 34]. Gelijkaardige observaties omtrent een gewijzigd energie-metabolisme zouden kunnen optreden bij verschillende types cellulaire stress, zoals uithongering. Blokkage van PDC kan ook door andere mechanismen worden gegenereerd, inclusief redox-reakties waarvan is geweten dat ze het liponzuur-deel van het PDC moduleren. Daarom zou het van belang zijn in toekomstige studies de PDC redox-status bij M.E./CVS-patiënten te onderzoeken. Ten slotte: er zijn meerdere enzymen zoals mitochondriale pyruvaat-carrier [proteïne betrokken bij het transport van pyruvaat over het binnenste mitochondriaal membraan], pyruvaat-carboxylasen, pyruvaat-dehydrogenase-kinasen, pyruvaat-dehydrogenase-fosfatasen, die naast PDC, de globale pyruvaat-stroom moduleren.

mei 30, 2020

Auto-immuniteit-gerelateerde risico-varianten geassocieerd met M.E.(cvs) met infektueuze aanvang

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 6:42 am
Tags: , , , , , , ,

Onderstaand werk werd o.a. financieel ondersteund door het ‘Solve ME Ramsay Grant Program’ (solvecfs.org). We weten al dat Dr. Carmen Scheibenbogen heel wat research doet omtrent het definiëren van de rol van auto-immuneit bij M.E.(cvs). In een overzicht gepubliceerd in ‘Autoimmunity Reviews’ (2018) – getiteld ‘Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an auto-immune disease’, bespreekt ze (samen met andere researchers van het ‘European Network on ME/CFS’ (EUROMENE), auto-immune aspecten van M.E.(cvs). Ze verwijzen daarbij naar de bevindingen omtrent auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen (inclusief neurotransmitter-receptoren) en studies die bewijs leverden voor ernstige metabole stoornissen die waarschijnlijk worden gemedieerd door auto-antilichamen. Lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie’.

In deze studie hier vergeleek Dr. Scheibenbogen’s team ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) die risico kunnen vormen voor auto-immune aandoeningen tussen groepen met M.E.(cvs) en controles. SNPs zijn varianten in genen die bij alle individuen voorkomen. Deze hier beïnvloeden immuniteit-genen die aanleiding kunnen geven tot een meer aktieve immuun-respons en waarvan de dragers een groter risico op auto-immuun ziekten vertonen.

Het feit dat mensen een bepaald SNP (risico-variant) dragen betekent niet noodzakelijk dat ze een auto-immuun ziekte zullen ontwikkelen. Associatie-studies zoals deze hier kunnen bepalen of een SNP verband houdt met een ziekte en informatie leveren over het mechanisme dat de ziekte veroorzaakt.

Het onderzoeksteam vond dat SNPs geassocieerd met een hoger risico voor auto-immuniteit in de genen PTPN22 & CTLA4 frequenter voorkwamen bij M.E.(cvs)-patiënten waarvan de ziekte was begonnen met een infektie. Deze genen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de aktivatie van B- & T-cellen. Scheibenbogen stelt: “Onze bevinding levert bewijsmateriaal dat M.E./CVS een auto-immuun ziekte is bij de subgroep van patiënten waarvan de ziekte werd getriggerd door een infektie.”.

Ze wil dan ook verder gaan met de klinische studies aangaande behandeling met IgG of immuno-adsorptie om auto-antilichamen aan te pakken. In een piloot-studie (Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove β2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS ONE (2018) 13: e0193672) werden echter slechts 10 patiënten (met post-infekueuze M.E./CVS behandeld) dus conclusies zijn voorbarig…

————————-

Frontiers in Immunology Vol 11, p 578 (april 2020)

Autoimmunity-related risk variants in PTPN22 and CTLA4 are associated with ME/CFS with infectious onset

Sophie Steiner (1), Sonya C. Becker (1), Jelka Hartwig (1), Franziska Sotzny (1), Sebastian Lorenz (1), Sandra Bauer (1), Madlen Lobel (2), Anna B. Stittrich (3,4), Patricia Grabowski (1), Carmen Scheibenbogen (1,3)

1 Institute of Medical Immunology, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universitat (FU) Berlin, Humboldt-Universitat zu Berlin and Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Germany

2 Carl-Thiem-Klinikum Cottbus gGmbH, Research Centre, Cottbus, Germany

3 BIH Center for Regenerative Therapies, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

4 Labor Berlin-Charité Vivantes GmbH, Berlin, Germany

Samenvatting

Er werden ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNP) in verscheidene genen beschreven die geassocieerd bleken met vatbaarheid voor auto-immuun ziekte. In deze studie werd het genotype van patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) en controles bepaald voor vijf immuun-gen SNPs: tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22, rs2476601), cytotoxisch T-lymfocyten geassocieerd proteïne-4 (CTLA4, rs3087243), tumor necrose factor (TNF, rs1800629 & rs1799724) en interferon regulerende factor 5 (IRF5, rs3807306), die behoren tot de belangrijkste risico-varianten voor auto-immuun ziekten. Analyse van 305 M.E./CVS-patiënten en 201 gezonde controles toonde significante associaties van de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-allelen bij M.E./CVS. De associaties werden enkel gevonden bij M.E./CVS-patiënten die een infektie als acute aanvang van de ziekte rapporteerden (PTPN22 rs2476601: OR 1.63, CI 1.04-2.55, p = 0.016; CTLA4 rs3087243: OR 1.53, CI 1.17-2.03, p = 0.001), maar niét bij M.E./CVS-patiënten zónder infektie-getriggerde aanvang (PTPN22 rs2476601: OR 1.09, CI 0.56-2.14, p = 0.398; CTLA4 rs3087243: OR 0.89, CI 0.61-1.30, p = 0.268). Deze bevinding levert bewijs dat auto-immuniteit een rol kan spelen bij M.E./CVS met een infektie-getriggerde aanvang. Beide genen spelen een sleutelrol bij de regulering van B- en T-cel aktivatie.

INLEIDING

[…] Het onderliggend pathomechanisme van M.E./CVS wordt nog niet goed begrepen maar er is overtuigend bewijsmateriaal voor het feit dat, ten minste in een subgroep patiënten, auto-immuniteit bijdraagt tot de ziekte-etiologie [Blomberg J et al. Infection elicited autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: an explanatory model. Front Immunol. (2018) 9: 229 /// Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9]. Er werden door verschillende teams auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen, inclusief neurotransmitter-receptoren, gerapporteerd. […]

Verhoogde immuun-aktivatie en verstoring van de immunologische tolerantie worden beschouwd als belangrijke risco-factoren voor auto-immuniteit. Auto-immuun ziekten worden als multifactorieel gezien, met betrokkenheid van genetische en milieu-factoren. De ziekte-aanvang wordt dikwijls getriggerd door infekties, en de link tussen infekties en auto-immuun ziekten is welbekend. Genoom-wijde associatie studies hebben onthuld dat ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in verscheidene genen geassocieerd zijn met het risico op het ontwikkelen van auto-immuun ziekten. Voor de meeste van deze SNPs werd gevonden dat ze leiden tot winst- of verlies-van-funktie in enzymen of transcriptie-factoren die een rol spelen bij B- & T-cel aktivatie of cytokine-produktie en -signalisering, wat cruciale mechanismen zijn voor de ontwikkeling van auto-immune ziekten. Bij de meest frequente varianten geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten horen: het tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22) SNP rs2476601, het cytotoxische T-lymfocyten-geassocieerde proteïne-4 (CTLA4) SNP rs3087243, het interferon regulerende factor-5 (IRF5) SNP rs3807306 en het SNP rs1800629 in het tumor necrose factor (TNF) gen.

Het PTPN22 SNP rs2476601 is één van de belangrijkste vatbaarheid loci voor auto-immuniteit en is geassocieerd met myasthenia gravis (MG) [ernstige spierzwakte], type-1 diabetes (T1D), Systemische Lupus Erythematosus (SLE), Reumatoïde Artritis (RA) en andere auto-immuun aandoeningen. Dit SNP bleek een belangrijke rol te spelen in T- & B-cel receptor signalisering. Het SNP rs3087243 in CTLA4 is geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten, inclusief SLE, RA, T1D & Graves’ ziekte. Het CTLA4 SNP heeft een beschermend effekt, en het majeur allel-G is geassocieerd met auto-immuniteit. Het G-allel leidt tot een verstoorde negatieve regulering van T-cell aktivatie. Bij Multipele Sclerose (MS) patiënten bleken homozygote dragers van het G-allel significant minder CTLA4 proteïne tot expressie te brengen in CD4+ T-cellen. Een SNP in IRF5, rs3807306, is een ander courant auto-immuun vatbaarheid locus geassocieerd met RA, SLE, MS & Crohn’s (C.D.), en is verbonden met hogere serum interferon-α (IFNα) aktiviteit […] bij SLE. Het SNP rs1800629 in TNF is gelinkt met verscheidene auto-immuun ziekten, inclusief C.D., coeliakie, RA & SLE. Een ander SNP in het TNF gen, rs1799724 is geassocieerd met C.D. en auto-immune hepatitis (AIH). Er werden hogere serum-waarden qua TNFα aangetoond in dragers van het TNF rs1799724 risico-genotype, terwijl voor het SNP rs1800629 de gegevens omtrent een verband met gestegen TNFα serum-waarden niet overtuigend zijn.

Er is een systematisch overzicht dat de studies over genetische varianten die geassocieerd zijn met M.E./CVS samenvat [Wang T et al. A systematic review of the association between fatigue and genetic polymorphisms. Brain Behav Immun. (2017) 62: 230-44]. Er werden meerdere SNPs in cytokinen en humaan leukocyten antigen (HLA) associaties gevonden bij M.E./CVS. Twee SNPs in TNF, rs1800629 (TNF-308) & rs1799724 (TNF-857), werden vergeleken tussen een M.E./CVS- en controle-groep [Carlo-Stella N et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. (2006) 24: 179-82]. Er werd een hogere frequentie van het TNF-857 T-allel gevonden bij M.E./CVS. Analyse van genetische varianten in PTPN22, CTLA4 & IRF5 werden nog niet beschreven bij M.E./CVS.

Hier vergeleken we de prevalentie van de 5 hierboven beschreven SNPs bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. De aanvang van M.E./CVS wordt getriggerd door een infektie bij ca. twee derden van de patiënten. De link tussen infekties als trigger van auto-immuun ziekten is goed ingeburgerd. Daarom bestudeerden we ook een mogelijk verband van deze SNPs met een infektie-getriggerde ziekte-aanvang (ITO).

MATERIALEN & METHODES

Patiënten en controles

M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose in de immunodeficiëntie-kliniek van het ‘Institute for Medical Immunology’ aan de Charité Univeristeit (Berlijn). De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria (CCC) en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Auto-immuun ziekten waren een exclusie-criterium, met uitzondering van Hashimoto’s thyroïditis, wat wordt geklassificeerd als co-morbiditeit bij M.E./CVS. […] 232 op 305 patiënten verklaarden dat hun ziekte een acute aanvang met een infektie (ITO) had gekend. We verzamelden retrospectief de gegevens van de types infektie […]: ‘respiratoire of gastro-intestinale infektie’, ‘primaire EBV’ [Epstein-Barr Virus; veroorzaker van mononucleose] of ‘virale/bakteriële infektie’. […]

DNA-extractie en PCR ter onderscheiding van allelen

[…] Genomisch DNA verkregen uit totaal-bloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) […]

Beoordeling van oplosbare immuniteit-merkers en lymfocyten

Lymfocyten-fenotypering d.m.v. flow-cytometrie: CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen. Serum-proteïnen analyse: C-reaktief proteïne (CRP), complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2 receptor (IL-2R), IgG en TNFα in LPS-gestimuleerde totaal-bloed cellen […].

Statistische analyse

[…] p ≤ 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.

RESULTATEN

Analyse van de verdeling van allelen en genotypes

305 M.E./CVS-patiënten [gemiddelde leeftijd 44; ca. 2/1 vrouwen/mannen] en 201 gezonde controles werd geanalyseerd wat betreft mogelijke ziekte-associatie van de PTPN22, CTLA4, TNF & IRF5 SNPs […].

We vonden een significant toegenomen frequentie van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A, wat leidt tot vatbaarheid voor auto-immuniteit, bij M.E./CVS-patiënten (allel-frequentie (AF) 12%, odds ratio (OR) 1.50, p = 0.033) t.o.v. gezonde controles (AF 8%, n = 201). Bij subgroepering van de patiënten volgens het type ziekte-aanvang, zagen het significant verband van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A enkel bij patiënten mét ITO (AF 13%, OR 1.63, n = 232, p = 0.016) maar niet bij deze zonder ITO (AF 9%), vergeleken met gezonde controles (AF 8%).

Ook de frequentie van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G is significant hoger bij M.E./CVS-patiënten (AF 63%, OR 1.34), verleken met gezonde controles (AF 56%). Weerom zagen we een significant verband van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G enkel bij patiënten mét ITO (AF = 66%, OR = 1.53, p = 0.001) maar niet bij deze zonder ITO (AF 53%), vergeleken met gezonde controles (AF 56%).

Omgekeerd: de AF van het IRF5 rs3807306 risico-allel T was significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 41%, OR 0.68, p = 0.023), vergeleken met gezonde controles (AF 51%). Er werd geen verschil gezien qua risico AF van het TNF rs1800629 SNP tussen patiënten en controles, maar de AF van het TNF rs1799724 risico-allel T was weer significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 8%, OR 0.55, p = 0.043), vergeleken met gezonde controles (AF 13%). Er werden geen associaties met IRF5 of TNF gevonden bij patiënten met ITO.

We analyseerden ook de genotype-verdeling voor CTLA4 rs3087243 & PTPN22 rs2476601. We vonden een significant verschil tussen de M.E./CVS-patiënten mét ITO, vergeleken met gezonde controles (CTLA4 rs3087243: p = 0.0061; PTPN22 rs2476601: p = 0.026). M.E./CVS-patiënten zonder ITO hadden een gelijkaardige genotype-verdeling als gezonde controles.

Associatie van infektie-getriggerde aanvang en PTPN22 & CTLA4 varianten met immuniteit-merkers

We vergeleken aantallen CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen, CPP, complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2R, IgG en TNFα bij M.E./CVS-patiënten mét en zonder ITO. Patiënten mét ITO hadden minder CD19+ B-cellen (p = 0.05) en er was een trend voor lagere lower C3-waarden. Bij patiënten met beide, waren risico-allel in PTPN22 rs2476601 of het homozygoot risico-allel voor CTLA4 rs3087243, C4-waarden (p = 0.06 & 0.004, respectievelijk) maar niet C3-waarden gedaald, terwijl er geen verschil was qua aantallen B-cellen.

CRP-concentraties waren significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en zonder de risico-allelen van PTPN22 rs2476601-A & CTLA4 rs3087243-G.

CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en concentraties oplosbare IL-2R, TNFα en IgG verschilden niet tussen patiënten-subgroepen en risico-varianten.

BESPREKING

In deze studie evalueerden we 5 belangrijke SNPs die geassocieerd zijn met verscheidene auto-immuun ziekten bij M.E./CVS-patiënten. De geselekteerde patiënten zijn representatief voor M.E./CVS-groepen waar andere groepen over rapporteerden (twee derden vrouwen, met een ITO en een gemiddelde ziekte-ernst met een Bell-score van 30 [score van 100 = gezonde individuen; < 30 = ernstig]). Overéénkomstige een Amerikaanse studie, werd de M.E./CVS-aanvang bij onze patiënten het meest frequent getriggerd door een acute respiratoire infektie of vermoedelijke virale infektie. Ook een primaire EBV-infektie tijdens de adolescentie is een goed gekende trigger van M.E./CVS en werd gerapporteerd door 19% van onze patiënten. Een primaire EBV-infektie bij volwassen staat bekend als risico-factor voor verscheidene auto-immuun ziekten.

We vonden een sterke associatie van de auto-immuniteit risico-allelen in CTLA4 rs3087243-G & PTPN22 rs2476601-A bij ITO M.E./CVS. Het dragen van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A verhoogde de kans op het ontwikkelen van infektie-getriggerde M.E./CVS met 1,6 maal. Bij dragers van het risico-allel G van CTLA4 rs3087243 was de kans op het ontwikkelen van ITO M.E./CVS 1,5 maal hoger. Dienoveréénkomstig was de genotype-verdeling voor beide SNPs significant verschillend bij M.E./CVS-patiënten mét ITO vergeleken met gezonde controles.

Zowel de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 SNPs bleken geassocieerd met talrijke auto-immuun ziekten, inclusief T1D, SLE en RA. PTPN22 codeert voor een lymfoïd tyrosine-fosfatase dat als een sterke negatieve regulator van T-cel aktivatie werkt. Een studie levert bewijs voor het feit dat het auto-immuun risico-allel A van PTPN22 rs2476601 leidt tot winst- of verlies-van-funktie. Dit kan leiden tot lagere T-cel receptor signalisering en het onvermogen om autoreaktieve T-cellen te verwijderen of verminderde aktiviteit van Tregs. Bovendien zou het PTPN22 rs2476601 risico-allel kunnen bijdragen tot het genereren van autoreaktieve B-cellen via stoornissen in de klonale deletie [verwijdering van B- of T-cellen die receptoren tegen lichaamseigen (‘self’) tot expressie brengen, vooraleer ze zich ontwikkelen tot volledig immunocompetente lymfocyten] en receptor-opmaak, wat leidt tot verstoorde centrale [immuun-] tolerantie. Dit wordt ondersteund door de bevinding dat de sterkste verbanden met dit SNP worden gevonden bij auto-immuun ziekten waarbij autoreaktieve T-cellen en auto-antilichamen een grote rol spelen in de pathogenese van de ziekte. In tegenstelling daarmee hebben auto-immuun ziekten waarbij Th17-cellen een belangrijke rol spelen, en die van mucosa [slijmvliezen], de neiging geen associatie met PTPN22 te vertonen.

CTLA4 komt tot expressie op CD4+ & CD8+ T-cellen na aktivatie en heeft een cruciale rol als negatieve T-cel regulator om geaktiveerde T-cellen uit te zetten. Het risico-allel G van rs3087243 leidt tot gedaalde waarden van oplosbaar CTLA4 mRNA, wat resulteert in versterkte T-cel aktiviteit.

Vergelijkbaar met onze bevindingen bleken zowel de PTPN22 rs2476601 als de CTLA4 rs3087243 risico-varianten vatbaarheid-loci te zijn voor auto-immuun ziekten, inclusief anti-neutrofiel cytoplasmatisch antilichaam (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV) en polyglandulaire [met betrokkenheid van meerdere hormoon-producerende klieren] auto-immuniteit zijn. Naar ons weten werd de frequentie van deze SNPs nog niet bestudeerd bij andere M.E./CVS-patiënten.

We correleerden onze SNP-gegevens verder met immuun-merkers. Bij patiënten met zowel het risico-allel in PTPN22 rs2476601 of de homozygote risico-allelen voor CTLA4 rs3087243 waren de C4- maar niet C3-waarden gedaald. Een associatie van deze risico-varianten met C4-waarden werd in de literatuur niet beschreven. Lage C4-waarden komen echter frequent voor bij SLE, een ziekte die geassocieerd is met zowel het risico-allel in PTPN22 als CTLA4.

Bij vergelijking van patiënten-subgroepen hadden enkel deze met ITO minder CD19+ B-cellen. B-cel lymfocytopenie [gering aantal lymfocyten in het bloed] is een frequente bevinding bij SLE & RA, en levert verder bewijs voor een auto-immuun mechanisme bij M.E./CVS-patiënten met ITO. In tegenstelling daarmee waren CRP-waarden significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en deze zonder risico-allelen. Dit zou kunnen suggereren dat, binnen de subgroep M.E./CVS-patiënten zonder ITO, er een aanleg is voor een meer pro-inflammatoire respons gelijkaardig met patiënten met kanker-gerelateerde vermoeidheid.

Voor het IRF5 rs3807306 risico-allel T zagen we een significant lagere AF bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO t.o.v. controles. Deze bevinding is onverwacht en dient te worden bevestigd. We konden geen verschil detekteren wat betreft de frequentie van de TNF rs1800629 AF tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles maar we vonden weer een significant lagere AF voor de TNF rs1799724 bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO vergeleken met controles. Deze bevinding is tegengesteld aan die van een eerdere studie waarbij 80 M.E./CVS-patiënten werden geanalyseerd, waar een hogere frequentie voor het TNF-857 rs1799724 risico-allel werd gevonden [zie Carlo-Stella N et al. hierboven]. We hebben geen voor de hand liggende verklaring voor dit verschil. De patiënten-groep in de studie uit 2006 kreeg de diagnose op basis van de Fukuda criteria, die minder strikt zijn dan de CCC criteria die in onze studie worden gebruikt. Interessant: deze SNPs zijn geassocieerd met verhoogde serum-waarden van TNFα & IFNα, en ook met auto-immuun ziekten van mucosa. Het is verleidelijk om te speculeren dat patiënten die hogere waarden TNFα & IFNα kunnen produceren, een meer doeltreffende mucosale immuniteit hebben en daarom minder vatbaar zijn om M.E./CVS te ontwikkelen. Dit komt overéén met onze eerdere observatie dat een deficiëntie van de complement-factor mannose-bindend lectine (MBL [speelt een rol bij de aangeboren immuniteit]), wat resulteert in vatbaarheid voor infekties, geassocieerd is met M.E./CVS [Guenther S et al. Frequent IgG subclass and mannose binding lectin deficiency in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Hum Immunol. (2015) 76: 729-35].

Er zijn andere varianten van immuun- of immuun-gerelateerde genen beschreven bij M.E./CVS [zie Wang T et al. hierboven]. Meerdere SNPs in HLA klasse-II bleken geassocieerd met M.E./CVS [Smith J et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol. (2005) 58: 860-3 /// Carlo-Stella N et al. Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2009) 22: 745-54 /// lees ook ‘Humaan Leukocyten Antigen allelen gelinkt met M.E.(cvs)]. Dit verband is een ander bewijs voor een auto-immuun pathomechanisme, aangezien de link tussen bepaalde HLA-allelen en auto-immuniteit vastgesteld is. Bovendien zijn er studies die een associatie tonen met meerdere SNPs in het glucocorticoïd receptor gen Nucleaire Receptor Subfamilie-3 Groep-C Lid-1 (NR3C1). Deze receptor speelt een rol in de regulering van de inflammatoire respons voor aantasting van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as (HPA) aktiviteit via cortisol-afgifte [Rajeevan MS et al. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Voor M.E./CVS werd een ontregelde HPA-as gerapporteerd. Op een zelfde manier zouden SNP-varianten van het catechol-O-methyltransferase (COMT) gen en de ß2adrenerge receptor (beschreven bij M.E./CVS) de immuun-respons kunnen moduleren [adolescenten]. Verdere studies vonden associaties met SNPs die niet gerelateerd zijn met het immuunsysteem, zoals varianten geassocieerd met het spier-metabolisme [Golf Oorlog veteranen] en het serotonerg systeem [Smith AK et al. Genetic evaluation of the serotonergic system in Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology. (2008) 33: 188-97].

Tot besluit: onze studie toont dat de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-varianten frequenter voorkomen bij patiënten met ITO M.E./CVS. Deze bevinding biedt verder bewijs dat er een genetische voorbestemdheid voor M.E./CVS is. De associaties met PTPN22 & CTLA4 SNPs wijzen op een rol van autoreaktieve T- & B- cellen in het pathomechanisme van M.E./CVS. In tegenstelling daarmee suggereren het ontbreken van een associatie van CTLA4 & PTPN22 SNPs, en de lagere frequenties van IRF5 & TNF risico-varianten bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO, dat het pathomechanisme verschillend is. Deze associaties dienen te worden bevestigd bij andere M.E./CVS patiënten-groepen. Onze bevindingen zetten ons aan research naar auto-immune mechanismen te intensifiëren en klinische studies met medicijnen gericht tegen autoreaktieve B-cellen uit te voeren.

april 23, 2020

Humaan Leukocyten Antigen allelen gelinkt met M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 6:45 am
Tags: , , , , ,

HLAs (Humaan leukocyten antigenen zijn antigenen die aanwezig zijn op het oppervlak van alle lichaamscellen (niet enkele de witte bloedcellen, leukocyten), behalve de rode bloedcellen. Ze staan bekend als ‘ transplanatie-antigenen’ omdat ze tussen donor of ontvanger zo weinig mogelijk mogen verschillen om de kans op afstoting te verkleinen (HLA-compatibiliteit). Ze helpen het immuunsysteem onderscheid te maken tussen lichaam-eigen (‘self’) en lichaam-vreemde (‘non-self’) strukturen. Het HLA-systeem of MHC (‘major histocompatabilty complex’) is een deel van het genoom dat codeert voor de HLA-proteïnen; een soort bloedgroep-systeem maar veel complexer dan het beter gekende ABO. Er zijn nl. een miljoen verschillende combinaties mogelijk door het voorkomen van verschillende allelen (allel = bepaalde variant van een gen; twee gelijke allelen = homozygoot, twee verschillende allelen = heterozygoot) per HLA-gen en de co-dominante overerving (de HLA-genen geërfd van zowel vader als van moeder komen tot expressie). De HLA-eiwitten op het celmembraan vormen uiteindelijk een unieke ‘barcode’ om een cel te herkennen. Ze presenteren ook antigeen aan de antigeen-receptoren van T-lymfocyten.

Daarnaast is van veel ziekten aangetoond dat het voorkomen van een bepaald HLA-type de kans op het ontwikkelen van die ziekte groter of kleiner maakt. Dragers van bepaalde HLA-types hebben dan meer of minder kans om die ziekte te ontwikkelen. Omdat het HLA-type erfelijk is, krijgt de ziekte daardoor een erfelijke component.

Het MHC is een groep genen op chromosoom-6 bevindt. Er zijn 6 HLA-loci (locus = vaste positie van een gen op een chromosoom) die coderen voor 2 klassen proteïnen. MHC klasse I: HLA-A, HLA-B & HLA-C genen coderend voor eiwitten die voorkomen op het membraan van alle cellen met kernen, en trombocyten. Ze presenteren endogene proteïnen (eiwitten afkomstig van binnenin de cel, bv. virussen) aan CD8+ T-lymfocyten. MHC klasse II: HLA-DQ, HLA-DR & HLA-DP genen coderend voor proteïnen die tot expressie komen op het membraan van antigeen-presenterende cellen, zoals B-lymfocyten, monocyten, macrofagen en dendritische celen. Deze presenteren exogene proteïnen (eiwitten afkomstig van buiten de cel) aan CD4+ T-lymfocyten.

De hier gevonden verbanden bij M.E.(cvs) hebben een matige effekt-grootte maar er gebeurde wel een correctie voor multipele vergelijkingen. Ze geven aanwijzingen naar mogelijke auto-immuniteit toe. Prof. Ron Davis (biochemie & genetica), directeur van het ‘Stanford Genome Technology Centre’, verkreeg financiering (van de ‘US National Institutes of Health’) om te kijken naar HLA-genen dus wellicht volgt er replicatie…

————————-

Sci Rep. 2020 Mar 24;10(1):5267

Human Leukocyte Antigen alleles associated with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS)

Lande A1,2, Fluge Ø3, Strand EB4,5, Flåm ST6, Sosa DD7, Mella O3, Egeland T8,9, Saugstad OD10, Lie BA6,8,9, Viken MK6,9

1 Department of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital, Oslo, Norway

2 Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, Oslo, Norway

3 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital and Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

4 National Advisory Unit on CFS/ME, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

5 Faculty of Health Science, VID Specialized University, Stavanger, Norway

6 Department of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 CFS/ME Centre, Oslo University Hospital, Oslo, Norway.

8 Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, Oslo, Norway

9 Department of Immunology, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

10 Department of Pediatric Research, Oslo University Hospital, University of Oslo, Oslo, Norway

Samenvatting

De etiologie en pathogenese van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) zijn onbekend, maar auto-immuniteit is één van de vele voorgestelde mechanismen. Humaan Leukocyten Antigen (HLA) associaties zijn hoofdkenmerken van auto-immune ziekte en werden nog niet diepgaand onderzocht bij een grote groep M.E./CVS-patiënten. We voerden hoge-resolutie HLA -A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 & -DPB1 genotypering uit d.m.v. ‘next-generation’ sequentie-bepaling bij 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de Canadese Consensus Criteria). HLA-associaties werden beoordeeld door vergelijking met 4.511 gezonde en ethnisch gematchte controles. Er werd klinische informatie verzameld via vragenlijsten ingevuld door patiënten of verwanten. We ontdekten twee onafhankelijke HLA-associaties, met als labels de allelen HLA-C*07:04 (OR 2.1 [95% CI 1.4-3.1]) & HLA-DQB1*03:03 (OR 1.5 [95% CI 1.1-2.0]). Deze allelen werden gedragen door 7,7% & 12,7% van de M.E./CVS-patiënten, respectievelijk. Het deel van de individuen dat één of beide van deze allelen draagt, was 19,2% in de patiënten-groep en 12,2% in de controle-groep (OR 1.7 [95% CI 1.3-2.2], pnc = 0.00003). M.E./CVS is een complexe ziekte, mogelijks met substantiële heterogeniteit. We rapporteren nieuwe HLA-associaties die wijzen in de richting van betrokkenheid van het immuunsysteem bij M.E./CVS-pathogenese.

Inleiding

[…]

De pathogenese en etiologie van M.E./CVS zijn niet gekend maar er werden meerdere modellen voorgesteld. Een centrale hypothese stelt dat auto-immuniteit deel uitmaakt van de pathophysiologie [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmunity Reviews (2018) 17: 601-609 /// Blomberg J et al. Infection Elicited Autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: An Explanatory Model. Frontiers in Immunology (2018) 9: 229]. Er werd gerapporteerd dat M.E./CVS deels erfelijk is [Albright F, Light K et al. Evidence for a heritable predisposition to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Neurology (2011) 11: 62 /// Schur E et al. Twin analyses of fatigue. Twin Research and Human Genetics (2007) 10: 729-733], consistent met een multi-factoriële etiologie afhankelijk van zowel genetische als omgeving-factoren. Dit is het heersend model voor een groot aantal ziekten, inclusief gevestigde auto-immune ziekten (AID). Meerdere publicaties maken melding van immunologische veranderingen bij M.E./CVS-patiënten, bv. wijzigingen qua ‘natural killer’ (NK) cel funktie, cytokine-waarden en DNA-methylatie patronen consistent met immuniteit-ontregeling. Sommige van deze bevindingen konden niet worden gereproduceerd in andere studies, wat te wijten kan zijn aan verschillen qua methodologie, de complexiteit en heterogeniteit van M.E./CVS, en het gebrek aan ‘power’ omwille van de beperkte grootte van de groepen. Ten gevolge rechtvaardigt de auto-immuniteit hypothese verdere evaluatie. Een karakteristiek kenmerk van AID is de genetische associatie met bepaalde humaan leukocyten antigen (HLA) allelen. Zodoende is een grondig onderzoek van HLA-associaties bij M.E./CVS relevant, hoewel HLA-associaties per se niet kunnen worden gezien als bewijsmateriaal betreffende ziekte-etiologie. Er werden studies van HLA-verbanden bij M.E./CVS gepubliceerd maar met grote variatie betreffende inclusie-criteria en HLA-typering methodologie. Er kwamen geen evidente reproduceerbare, significante associaties uit deze studies voort. In de grootste studie (110 patiënten) was de sterkste significante associatie met HLA-DQ3 (OR 1.8 (95% CI 1.2-2.8) [Keller RH et al. Association between HLA class II antigens and the chronic fatigue immune dysfunction syndrome. Clinical Infectious Diseases (1994): S154-156]. [De ‘odds ratio’, OR, is een statistische waarde die de sterkte van een verband tussen twee gebeurtenissen kwantificeert; bij een OR = 1 zijn de gebeurtenissen onafhankelijk, bij OR > 1 zijn ze geassocieerd), bij OR < 1 zijn ze negatief gecorreleerd. CI (confidence-interval), betrouwbaarheid-interval : een intervalschatting voor een parameter, stelt een bereik van aannemelijke waarden voor.] Er werden ook associaties met de HLA-allelen DQA1*01, DRB1*13:01 & DQB1*06:02 gerapporteerd. De meerderheid van deze studies omvatte minder dan 50 patiënten en hadden onvoldoende ‘power’ voor de detektie van matige tot zwakke verbanden. Daarom trachtten we in deze studie een uitgebreid onderzoek naar HLA-associaties uit te voeren in een grote M.E./CVS-groep, met toepassing van moderne, hoge-resolutie HLA-typering.

Materialen & methodes

[…] Er werd een totaal van 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten opgenomen. Allen kregen een diagnose op basis van de 2003 Canadese Consensus Criteria, uitgezonderd vier patiënten waarbij de evenzeer strikte 2010 Internationale Consensus Criteria werden toegepast. […] Alle patiënten gaven de identiteit op van eerste-, tweede- of derde-graad verwanten met M.E./CVS […]. […] De controle-groep bestond uit 4.511 ethnisch gematchte, gezonde individuen uit het ‘Norwegian Bone Marrow Donor Registry’. […] Infektie of vaccinatie als initiërende gebeurtenis was zelf-gerapporteerd […].

HLA-genotyping d.m.v. ‘next generation’ sequentiebepaling

Voor 426 M.E./CVS-patiënten voerden we hoge-resolutie, ‘next-generation’ sequentiebepaling uit van de HLA klass-I genen HLA-A, -B & -C, en klasse-II genen HLA-DRB1, -DQB1, -DPB1, -DQA1. […] De 4.511 gezonde controles waren eerder HLA-getypeerd. Zowel patiënten- en controle-genotypes werden geanalyseerd op ‘2nd field’ resolutie voor HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 & -DPB1. […] ‘2nd field’ resolutie onderscheidt allelen die aminozuur verschillen coderen, d.w.z. specifieke HLA-proteïnen, en dit is daarom van grotere biologische relevantie. […]. [De WHO nomenclatuur (geeft de naam van het gen-locus gevolgd door 4 cijfers die de verschillende variaties in de DNA-sequentie aangeven. Het eerste definieert de allel-groep die gewoonlijk correspondeert met de serologisch (interaktie met antilichamen) gedefinieerde specificiteit van het HLA-proteïne. Het tweede geeft verschillen aan in de DNA-sequentie aan die aanleiding geven tot een verschil in de aminozuur-sequentie van het resulterend proteïne. Hoge-resolutie geeft een set allelen aan die dezelfde proteïne-sequentie voor het peptide-bindend gebied van een HLA-molekule aan, dentificeert HLA-allelen tot op ‘2nd field’ resolutie niveau.]

Gegevens-analyses […] Genetische associaties werden onderzocht op allel- en haplotype [genetische variant; combinatie van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] -niveau, en ORs met 95% betrouwbaarheid-intervallen (95% CI) werden berekend […]. Risico-allel ORs werden ook berekend na geslacht-stratificatie […]. Er werden LD-berekeningen [‘linkage disequilibrium’ = de niet-willekeurige associatie van allelen op verschillende loci; Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.] en testen [correctie van p-waarden] uitgevoerd om de mate van onafhankelijkheid tussen de geassocieerde allelen te onderzoeken. De LD maatstaf D’ werd berekend volgens de formule D’ = D/Dmax […], D is de standaard mathematische definitie voor LD tussen allelen A & B […]. Omwille van de vergelijking van meerdere allel-frequenties voerden we correcties [pc] uit. Voor elk locus werden niet-gecorrigeerde p-waarden [pnc] vermenigvuldigd met het totaal aantal allelen gedetekteerd op dat locus, waarbij allelen met een frequentie < 3% in zowel de controle-groep als de patiënten-group werden uitgesloten. Het significantie-niveau was 0.05. Enkel haplotypes met geassocieerde allelen werden onderzocht, en ‘multiple test’ correctie gebeurde dus niet op haplotype-niveau.

Onderzoek van klinische gegevens

[…] De patiënten-groep werd gestratificeerd op basis van de aanwezigheid van specifieke HLA-allelen en 8 […] klinische variabelen werden beoordeeld via OR-bereking […].

Resultaten

Karakterisatie van patiënten- en controle-groepen

Er namen 426 M.E./CVS-patiënten en 4.511 gezonde, etnisch gematchte controles deel. Alle patiënten kregen de diagnose in Noorwegen volgens de 2003 Canadese Consensus Criteria, uitgezonderd vier waarbij de evenzeer strikte 2010 Internationale Consensus Criteria werden toegepast. De gemiddelde leeftijd bij diagnose was 34,7 jaar voor M.E./CVS-patiënten, 82,8% waren vrouwen en de meeste patiënten (45,5%) hadden een ziekte-duur van 5-10 jaar (van aanvang van de symptomen tot inclusie in de studie). 12,5% van de patiënten waren ernstig of zeer ernstig ziek (bedlegerig). Een bijkomende 28,6% was matig tot ernstig ziek (huisgebonden). Een totaal van 41,1% van de M.E./CVS-patiënten waren bedlegerig of huisgebonden en 86,8% waren niet in staat te werken (deel- of voldtijds) gedurende de voorbije 6 maand.

HLA-allelen geassocieerd met M.E./CVS

We verkregen ‘2nd field’ resolutie genotypes van HLA klasse-I genen HLA-A, -B & -C en klasse-II genen HLA-DRB1, -DQB1 & -DPB1 voor alle patiënten en controles. Deze resolutie onderscheidt HLA-allelen die voor specifieke HLA-proteïnen coderen. Er werden geen significante afwijkingen van Hardy-Weinberg equilibrium [Dit principe stelt dat de genetische variatie in een populatie constant blijft van één generatie op de andere als er geen verstorende factoren (bv. mutaties, natuurlijke selektie, enz.) zijn.] opgemerkt voor geen enkele van de HLA-loci, noch in de patiënten-groep noch in de controle-groep. We berekenden de allel-frequenties voor alle geobserveerde HLA klasse-I & klasse-II allelen. Globale associatie testen voor elk HLA-locus waren significant voor HLA-C (p = 0.04) en HLA-DQB1 (p = 0.04). Bij vergelijking van individuele allel-frequenties tussen patiënten en controles, doken 4 HLA risico allelen op: C*07:04 (OR = 2.1 [95% CI 1.4-3.1], pnc = 0.0001, pc = 0.001), B*57:01 (OR = 1.6 [95% CI 1.2-2.3], pnc = 0.004, pc < 0.05), DQB1*03:03 (OR = 1.5 [95% CI 1.1-2.0], pnc = 0.005, pc < 0.05) en B*44:02 (OR = 1.3 [95% CI 1.0-1.6], pnc = 0.03, pc = n.s.). Om de afhankelijkheid van deze associaties te evalueren, hebben we de mate van ‘linkage disequilibrium’ (LD) tussen de 4 allelen binnen de patiënten-groep gemeten. Er werd een sterk LD geobserveerd tussen C*07:04 en B*44:02 (D’ = 0.90) alsook tussen B*57:01 en DQB1*03:03 (D’ = 0.69), wat aangeeft dat deze allelen kunnen voorkomen op twee afzonderlijke haplotypes. Het eerste haplotype, C*07:04 – B*44:02, had een geschatte frequentie van 3,5% in de patiënten-groep en 1,7% in de controle-groep, resulterend in een OR van 2.1 (95% CI 1.4-3.1, pnc = 0.0002). Het tweede haplotype, B*57:01 – DQB1*03:03, had een geschatte frequentie van 3,3% in de patiënten-groep en 2,0% in de controle-groep, resulterend in een OR van 1.7 (95% CI 1.1-2.5 pnc = 0.01). Om verder te evalueren welk allel op elk van de twee haplotypes de meest significante associatie geeft, voerden we analyses uit tussen C*07:04 & B*44:02 alsook tussen B*57:01 & DQB1*03:03. Geen van de twee allelen van elk van de twee haplotypes bereikte significantie bij het testen van hun onafhankelijke associatie, wat niet verrassend is omwille van het hierboven vermelde sterk LD. We rapporteren C*07:04 & DQB1*03:03 als label-allelen voor de M.E./CVS-associaties, aangezien deze allelen voorkomen op de twee loci die initieel globale associatie vertoonden.

Daarna wilden we verzekeren dat deze HLA-associaties niet te wijten waren aan geslacht-verschillen tussen de gevallen en controles (respectievelijk 82,8% vs. 59,8% vrouwen). Er werden geen significante geslacht-verschillen gezien tussen de drager-frequenties van deze allelen voor gevallen of controles (C*07:04 3,7% bij vrouwen en 4,0% bij mannen; p = 0.6; DQB1*03:03 9,0% bij vrouwen en 8,3% bij mannen; p = 0.4). Bovendien werd, na stratificatie van gevallen en controles volgens geslacht, heterogeniteit verworpen (p > 0.5) tussen de OR-waarden verkregen voor enkel vrouwen en enkel mannen, wat aangeeft dat er geen geslacht-verschillen tussen de HLA-associaties bij M.E./CVS bestaan.

De twee loci HLA-DRB1 & HLA-DQB1 liggen fysiek dicht bijéén en vertonen een bijzonder sterk LD. In onze gegevens-set, kwam DQB1*03:03 het meest frequent voor met DRB1*07:01. Het haplotype DRB1*07:01 – DQB1*03:03 had geschatte frequenties van 4,7% en 2,9% in de patiënten- en controle-groep, respectievelijk (OR 1.7 [95% CI 1.2-2.3], pnc = 0.003). Bij de patiënten werd geschat dat dit zonder uitzondering DQA1*02:01 droeg. Genotype-gegevens voor het HLA-DQA1 locus werden enkel verkregen voor de patiënten en waren niet beschikbaar voor de controles.

Er waren twee allelen met een negatief verband met M.E./CVS, suggestief voor mogelijke bescherming, namelijk B*08:01 (OR = 0.7 [95% CI 0.6-0.9], pnc = 0.01, pc = n.s.) en DPB1*02:01 (OR = 0.7 [95% CI 0.6-0.9], pnc = 0.02, pc = n.s.). Deze allelen waren niet in LD (D’ = -0.29), wat aangeeft dat de associaties onafhankelijk zijn. Het meest frequente B*08:01 haplotype in Noorwegen is het sterk geconserveerde zogenaamde auto-immuun en voorouderlijk AH8.1 haplotype (C*07:01-B*08:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01). Dit haplotype had een gereduceerde geschatte frequentie in de patiënten-groep vergeleken met de controle-groep (8,2% vs. 10,3%, OR = 0.8, pnc = 0.06), ofschoon niet significant.

HLA risico allel dragers en klinische karakteristieken

Het deel individuen dat het allel C*07:04 draagt, was 7,7% in de patiënten-groep en 3,8% in de controle-groep, terwijl 12,7% van de patiënten en 8,7% van de controles DQB1*03:03 droegen. Het deel van de individuen dat één van beide allelen draagt, was 19,2% in de patiënten-groep en 12,2% in de controle-groep (OR 1.7, pnc = 0.00003, 95% CI 1.3-2.2). Na stratificatie voor C*07:04 en/of DQB1*03:03 bleek dat geslacht noch initiërende gebeurtenissen, co-morbiditeit met depressie of fibromyalgie, of AID of M.E./CVS bij de eerste-graads verwanten geassocieerd waren met de risico-allelen. M.E./CVS-patiënten die echter drager van één of beide risico-allelen waren, hadden een significant hoger aandeel co-morbide AID (OR = 2.3 [95% CI 1.2-4.3], pnc =-0.01). De frequentie van co-morbide AID was ook significant verhoogd bij stratificatie voor C*07:04 alleen (OR = 2.9 [95% CI 1.2-6.6], pnc = 0.01) maar niet bij stratificatie voor DQB1*03:03 alleen (OR = 1.6 [95% CI 0.8-3.4], pnc = n.s.). Deze patiënten, dragers van HLA risico-allelen, hadden de volgende AID, gerangschikt volgens frequentie: Hashimoto’s thyroiditis [auto-immuunziekte van de schildklier]/ hypothyreosis [tekort aan schildklier-hormonen], psoriasis [auto-immune huidziekte], Reumatoïde Artritis, alopecia areata [pleksgewijze kaalheid] en Crohn’s of ulceratieve colitis.

Bespreking

In dit project voerden we hoge-resolutie HLA-genotypering uit d.m.v. ‘next-generation sequencing’ bij 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de Canadese Consensus Criteria). Er zijn geen voorafgaande publicaties met uitgebreide HLA-genotypering by d.m.v. bij deze patiënten. We ontdekten twee onafhankelijke HLA-associaties, gelabeld door de allelen HLA-C*07:04 & HLA-DQB1*03:03.

Naar ons weten werden associaties met HLA-C allelen nog niet eerder bestudeerd bij M.E./CVS. In 1994 voerden Keller RH et al. [zie hierboven] serologische HLA-DR en DQ typering uit bij 110 patiënten met Chronische Vermoeidheid Immune Dysfunktie Syndroom (CFIDS). De patiënten kregen de diagnose op basis van de Holmes Criteria en CFIDS werd gedefinieerd als een subgroep met positieve bevindingen wat betreft virale reaktivatie patronen, and B- & T-cel testen, wijzend op een post-infektueuze aanvang en een zekere mate van immuun-dysfunktie. De auteurs vonden een significant verband (OR = 1.8) met het serotype HLA-DQ3. Serologische HLA-typering heeft een lage resolutie vergeleken met genetische typering. HLA-DQ3 correspondeert met HLA-DQB1*03 in de genetische nomenclatuur, waarbij DQB1*03:03 één van de drie grootste subgroepen is. Er werd hogere resolutie HLA-DQB1 typering uitgevoerd bij twee kleinere groepen (< 58 patiënten), en zelfs al was het statistisch niet significant: DQB1*03:03 bleek lichtjes frequenter bij de CVS-patiënten (diagnose met de Fukuda criteria) dan bij controles. [bv. Smith J, Kerr JR et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. Journal of Clinical Pathology (2005) 58: 860-863] De bevindingen in de literatuur zijn dus vergelijkbaar met de associatie tussen M.E./CVS en DQB1*03:03 hier.

HLA-B*08:01 vertoonde in ons materiaal een gedaalde frequentie bij M.E./CVS t.o.v. controles. Dit allel komt meest dikwijls voor op het haplotype C*07:01-B*08:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01, wat ook minder prevalent was bij onze M.E./CVS-patiënten. Dit voorouderlijk haplotype, AH8.1, is een risico-factor voor een brede waaier aan AID, inclusief myasthenia gravis, Systemische Lupus Erythematosus en coeliakie, maar beschermend tegen Reumatoïde Artritis. In de literatuur aangaande HLA en CVS, is HLA-DRB1 het meest frequent bestudeerde locus. In vier van de vijf studies, was de frequentie van DR3/DRB1*03 lager in de patiënten-groep, terwijl in de vijfde studie de frequentie gelijkaardig was in beide groepen. Dit haplotype lijkt dus echt minder prevalent bij M.E./CVS-patiënten.

Sommige HLA-associaties die eerder werden gerapporteerd bij CVS worden niet ondersteund door onze resultaten. Het dikwijls geciteerd verband met DQA1*01 gerapporteerd door Smith J et al. [zie hierboven] kon in ons materiaal niet worden geëvalueerd aangezien het HLA-DQA1 locus niet werd gegenotypeerd in de controle-groep. In onze patiënten-groep, kwam DQA1*01 voor op het haplotype met de volgende DQB1-allelen (gerangschikt volgens frequentie): DQB1*06:02, DQB1*05:01, DQB1*06:03, DQB1*06:04 & DQB1*05:03, en geen enkele daarvan (pnc > 0.1), noch alle gecombineerd (OR = 1.0, pnc = 0.6) bleken geassocieerd met M.E./CVS.

De huidige HLA-studie bij M.E./CVS is naar ons weten de grootste die tot op heden werd uitgevoerd (andere studies omvatten ≤ 110 CVS-patiënten). Onze studie had 80% ‘power’ om HLA-associaties met OR ≥ 1.5 (specifiek een allel-frequentie > 0.05) te ontdekken. Interessant is dat zowel C*07:04 als DQB1*03:03 significant bleven na correctie […]. We voerden een correctie uit voor het aantal allelen getest op elk locus, aangezien allelen op verschillende HLA-loci in sterk LD zijn, en daarom geen onafhankelijke testen vertegenwoordigen. De methode die we hanteerden, wordt beschouwd als een strikte correctie maar anderzijds neemt dergelijke correctie het gebrek aan complete LD tussen de onderzochte loci niet in rekening. Te samen genomen betekent dit dat onze resultaten dienen te worden geverifieerd bij onafhankelijke groepen. In het algemeen zijn gevestigde HLA-associaties reproduceerbaar over verschillende populaties maar susceptibiliteit-loci kunnen ook variëren tussen populaties. Daarom moeten HLA-associaties bij M.E./CVS ook worden onderzocht in populaties van verschillende afkomst.

Beide door ons geobserveerde M.E./CVS-associaties waren evident bij ‘2nd field’ resolutie (t.t.z. C*07:04 & DQB1*03:03), welke allelen onderscheidt die coderen voor aminozuur verschillen. Interessant: de andere C*07 en DQB1*03 allelen bleken niet geassocieerd, wat het belang van hoge-resolutie HLA-genotypering benadrukt.

We rapporteren C*07:04 & DQB1*03:03 als label-allelen voor 2 onafhankelijke HLA risico verbanden bij M.E./CVS, aangezien deze allelen in ‘linkage equilibrium’ (D’ = 0.06) zijn. Ze kunnen echter nog merkers zijn voor één van beide gemeenschappelijke, of twee onafhankelijk geassocieerde varianten buiten de hier geteste loci. Anderzijds kunnen de hier gerapporteerde geassocieerde allelen zelf een funktionele relevantie hebben. HLA klasse-I allelen, zoals C*07:04, kunnen het ziekte-risico beïnvloeden via hun interakties met CD8-positieve cytotoxische T-lymfocyten. Er werden stoornissen van CD8-positieve T-lymfocyten bij M.E./CVS gerapporteerd, hoewel de resultaten enigszins tegenstrijdig zijn [zie Sotzny F et al. hierboven]. Een andere belangrijke funktie van HLA klasse-I allelen is dat ze dienst doen als liganden voor NK-cel receptoren. [Lees in dit verband ook ‘Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS] Er werd door meerdere onafhankelijke researchers melding gemaakt van gewijzigde aantallen en funktie van NK-cellen bij M.E./CVS. Het andere geassocieerd allel, DQB1*03:03, is een HLA klasse-II allel, wat ook interessant is met betrekking tot de hypothese omtrent auto-immuniteit bij M.E./CVS. In bepaalde goed bestudeerde AID bleken geassocieerde HLA klasse-II allelen unieke peptide-bindende eigenschappen te vertonen, alsook HLA-TCR restrictie [MHC-restrictie of door MHC beperkte antigen-herkenning, verwijst naar het feit dat een T-cel met een ‘self’ MHC-molekule en een daarop gevonden vreemd peptide kan interageren, maar enkel op het antigen zal reageren wanneer het gebonden is met een bepaalde MHC-molekule], waardoor de verworven immuun-respons direct wordt beïnvloed, bv. door de aanmaak van specifieke auto-antilichamen. Een ontregelde aktiviteit van CD4-positieve T-lymfocyten, het voornaamste cel-type dat interfereert met HLA klasse-II allelen, werd besproken als een centraal mechanisme bij M.E./CVS [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Translational Medicine (2011) 9: 81]. Meerdere studies rapporteren verhoogde waarden aan specifieke auto-antilichamen bij M.E./CVS-patiënten [Ortega-Hernandez OD, Shoenfeld Y. Infection, vaccination, and autoantibodies in Chronic Fatigue Syndrome, cause or coincidence? Annals of the New York Academy of Sciences (2009) 1173: 600-609; zie ook Vaccinatie en CVS], bv. tegen neurotransmitter-receptoren, hoewel voor de meeste geverificatie ontbreekt in bijkomende groepen.

Een andere interessante vraag is of deze HLA-associaties worden bepaald door subgroepen patiënten en zo dus sterkere risico-allelen vertegenwoordigen. Het is een relevant aspect bij een complexe ziekte zoals M.E./CVS, waar verschillende oorzakelijke mechanismen kunnen spelen in verschillende subgroepen. In onze studie hadden M.E./CVS-patiënten met HLA risicio allelen een significant hogere co-morbiditeit van gevestigde AID. We hebben geen weet van publicaties die melding maken van associaties tussen C*07:04 of DQB1*03:03 en AID die sommige van onze patiënten aantasten. Daarom is het onwaarschijnlijk dat de associaties hier worden gestuurd door HLA-associaties met reeds gevestigde AID. Er wordt familiale aggregatie gezien is voor veel specifieke AID, alsook voor auto-immuniteit in het algemeen. In onze studie hebben eerste-graad verwanten van M.E./CVS-patiënten een hoge prevalentie voor AID. Deze observaties kunnen mogelijks te wijten zijn aan een element van auto-immuniteit bij M.E./CVS, of binnen een subgroep. Er bleken geen andere patiënten-karakteristieken te overheersen bij de M.E./CVS-patiënten met HLA risico allelen, specifiek: noch zelf-gerapporteerde infektueuze aanvang of huidige ziekte-ernst. Er kan worden geargumenteerd dat het gebrek aan validiteit van zelf-gerapporteerde gegevens de detektie van mogelijke subgroep-identificatoren uitsluit.

Tot besluit: we melden nieuwe HLA-associaties in een grote groep M.E./CVS-patiënten die voldoen aan de Canadese Consensus Criteria, wat de betrokkenheid van het immuunsysteem bij de M.E./CVS-pathogenese ondersteunt.

april 11, 2020

Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 6:19 am
Tags: , , , , ,

Enkele wetenschappers uit verschillende richtingen (o.a. Yehuda Shoenfeld, Carmen Scheibenbogen & Manuel Martinez-Lavin) brengen hun kennis samen omtrent de auto-immune aspecten, klinische beelden en diagnostische parameters van overlappende ziektebeelden, inclusief M.E.(cvs). Dikwijls zijn bij aanvang triggers aanwezig waarvan bekend staat dat ze een hyperstimulatie van het immuunsysteem opwekken. Ze verzamelen in dit overzicht ook bewijsmateriaal voor auto-immuniteit bij deze aandoeningen in. Ze stellen een concept voor met een rol voor ‘single fibre’ neuropathie (SFN) en auto-anilichamen tegen ‘G-proteïne gekoppelde receptoren’ (anti-GPCR AAb) bij de ontwikkeling van de gemeenschappelijke symptomen. Er is wel nog verdere research nodig om na te gaan of  SFN en anti-GPCR AAb kunnen dienen als mogelijke diagnostische biomerkers. Er is ook gebleken dat vordeel te halen valt uit bepaalde therapeutische modaliteiten, die zich richten tegen auto-immuniteit (bv. immuno-adsorptie of intraveneuze toediening van immunoglobulinen.

Lees bv. ook ‘Rol voor auto-immuniteit, neuro-inflammatie & ‘small-fibre’ neuropathie bij FM & CVS’.

————————-

Clin Immunol. 2020 Mar 17;214:108384

Complex syndromes of chronic pain, fatigue and cognitive impairment linked to autoimmune dysautonomia and small fiber neuropathy

Shoenfeld Y1, Ryabkova VA2, Scheibenbogen C3, Brinth L4, Martinez-Lavin M5, Ikeda S6, Heidecke H7, Watad A8, Bragazzi NL9, Chapman J10, Churilov LP2, Amital H10.

1 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel; Laboratory of the Mosaics of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Russia

2 Laboratory of the Mosaics of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Russia

3 Institute for Medical Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

4 Department of Nuclear Medicine, Herlev Gentofte Hospital, Hellerup, Denmark

5 Rheumatology Department, National Institute of Cardiology, Mexico City, Mexico

6 Intractable Disease Care Centre, Shinshu University Hospital, Matsumoto, Japan

7 CellTrend GmbH, Luckenwalde, Brandenburg, Germany

8 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel; Section of Musculoskeletal Disease, Leeds Institute of Molecular Medicine, University of Leeds, NIHR Leeds Musculoskeletal Biomedical Research Unit, Chapel Allerton Hospital, Leeds, UK

9 Postgraduate School of Public Health, Department of Health Sciences (DISSAL), University of Genoa, Genoa, Italy

10 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom, posturaal orthostatisch tachycardie syndroom, complex regionale pijn syndroom en siliconen-implantaat incompatibiliteit syndroom zijn het onderwerp van discussie onder klinici en researchers. Zowel de pathogenese als de behandeling van deze aandoeningen vereist verder onderzoek. In dit artikel vatten we het bewijsmateriaal aangaande de rol van auto-immuniteit samen bij deze vier syndromen, met betrekking tot immunogenetica, auto-immune co-morbiditeiten, veranderingen qua subsets immuuncellen, aanmaak van auto-antilichamen en voorkomen in dieren-modellen. Deze syndromen kunnen worden opgenomen in een nieuw concept van auto-immune neurosensorische dysautonomie met als gemeenschappelijke factoren auto-antilichamen tegen G-proteïne gekoppelde receptoren en ‘small-fibre’ neuropathie. Sjögren’s syndroom, een klassieke auto-immune ziekte, zou als ziekte-model kunnen dien, en het concept illustreren. De ontwikkeling van dit concept heeft als doel het identificeren van een klaarblijkelijk auto-immune subgroep van de aandoeningen die in dit overzicht worden geadresseerd, en welke voordeel kunnen halen uit immunotherapie.

1. Inleiding

Er werd in de gescheidenis van de geneeskunde herhaaldelijk opgemerkt dat meerdere ziekten, die aanvankelijk als afzonderlijke nosologische entiteiten [nosologie = klassificatie van ziekten] werden beschouwd, mettertijd vormen of componenten van één enkele ziekte bleken te zijn. Een groep complexe aandoeningen geassocieerd met vermoeidheid en autonome dysfunktie staat der discussie, inclusief Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), posturaal orthostatisch tachycardie syndroom (POTS), complexe regionale pijn syndroom (CRPS) en siliconen-implantaat incompatibiliteit syndroom (SIIS). Er is een gebrek aan consensus omtrent de etiologie en pathogenese van elke van hen. Deze aandoeningen delen echter gemeenschappelijke kenmerken, die suggereren dat onderliggende wijzigingen van het immuunsysteem plaatsvinden. De constellatie typische symptomen is zeer gelijkaardig bij deze aandoeningen. In dit artikel analyseren we het bewijsmateriaal voor auto-immune processen bij elk van de boven-vermelde aandoeningen, beschrijven we een gemeenschappelijke symptoom-cluster en stellen we mogelijke mechanismen (namelijk ‘small-fibre’ neuropathie (SFN) en auto-antilichamen (AAb) tegen G-proteïne gekoppelde receptoren [(GPCR) signaal-overdragers, werkend via een trans-membranair systeem, de G-proteïne receptor] (anti-GPCR)) voor, die aan de basis liggen van deze schijnbaar onverwante symptomen. We leveren bewijs voor het feit dat deze mechanismen kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van gelijkaardige symptomen bij een klassieke auto-immuun ziekte (Sjögren’s syndroom, SjS [chronische auto-immune aandoening met ontsteking van het hoornvlies/oog-bindvlies en droge mond], die sommige pathogenese-mechanismen lijkt te delen met de beschreven complexe medische aandoeningen. Gezien de potentiële auto-immune bijdragen tot de pathogenese van CVS, POTS, CRPS & SIIS, bekijken we ook de doeltreffendheid van behandelingen die auto-immuniteit proberen te managen.

2. ‘Small-fibre’ neuropathie & anti-G proteïne gekoppelde receptoren auto-antilichamen

SFN is een subtype neuropathie die wordt gekenmerkt door selektieve betrokkenheid van ongemyeliniseerde of dun-gemyeliniseerde sensorische vezels. De pathogenese ervan omvat een brede waaier aan immuun-gemedieerde, metabole, toxische, erfelijke en genetische aandoeningen. SFN bij anderzijds gezonde kinderen en jong-volwassenen blijkt echter meestal inflammatoir, met betrokkenheid van auto-reaktieve B-cellen. Met betrekking tot auto-immuniteit werd SFN gerapporteerd in verband met Sjögren’s syndroom, coeliakie [chronische darm-aandoening door gluten-intolerantie], Systemische Lupus Erythematosus, Reumatoïde Arthritis, diabetes mellitus type-1, inflammatoire darm-ziekte, sarcoïdose [abnormaal voorkomen van nodules chronisch inflammatoire cellen (granulomas) in meerdere organen] en paraneoplastisch syndroom [complex van verschijnselen bij mensen die een kwaadaardige tumor hebben, zonder dat dit het gevolg is van tumorcellen in de getroffen regio]. Sommige gegevens veronderstellen ook de associatie met Hashimoto’s thyroiditis [auto-immuunziekte van de schildklier]. De klinische symptomen van SFN kunnen zich manifesteren als geïsoleerde sensorische stoornissen, geïsoleerde autonome aandoeningen en gemengde aandoeningen [Basantsova NY, Shoenfeld Y et al. Small-fibre neuropathy definition, diagnosis and treatment. Neurol. Sci. (2019) 40: 1343-1350]. Therapie met intraveneuze immunoglobulinen werd in stijgende mate aangewend, met significante doeltreffendheid bij de behandeling van patiënten met ogenschijnlijk auto-immune SFN in twee grote retrospectieve reeksen met gelijkaardige mate van respons (77% & 83% van de patiënten) [o.a. Liu X, Oaklander AL et al. IVIg for apparently autoimmune small-fibre polyneuropathy: first analysis of efficacy and safety. Ther. Adv. Neurol. Disord. (2018) 11: 1-12]. Aangezien 25-90% van de SFN-gevallen idiopathische blijven, verdient de aard van deze aandoening verder te worden bestudeerd.

Er werden de voorbije 20 jaar met stijgende frequentie AAb tegen GPCR gerapporteerd bij verscheidene medische aandoeningen: van neurologische en cardiovasculaire ziekten tot afstoting van vasculaire transplanten. Het fundamenteel kenmerk van deze AAb is hun vermogen te binden op cel-receptoren, en intracellulaire signalisering mechanismen te aktiveren (agonistische auto-antilichamen) of te inhiberen (antagonistische auto-antilichamen) die normaaal getriggerd worden door endogene liganden. Er is bewijs dat deze antilichamen behoren tot een funktioneel netwerk van natuurlijke AAb, die in lage concentraties aanwezig zijn in de sera van gezonde personen, maar ontregeld en waarschijnlijk causatief zijn bij verscheidene ziekten inclusief auto-immune.

3. Chronische Vermoeidheid Syndroom

CVS, ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), is een ingewikkelde ziekte die zich aandient met uitgesproken uitputtende vermoeidheid, mentale en lichamelijke post-exertionele malaise, pijn, slaap- en cognitieve stoornissen. Diagnostische criteria beklemtonen bijkomend symptomen van immuunsysteem-ontregeling, dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel en metabole stoornissen. […]

Er is bewijsmateriaal voor immuunsysteem-stoornissen, en in het bijzonder voor de auto-immune mechanismen bij CVS. Er is ook een dieren-model met immunologisch geïnduceerde CVS (injektie van of poly-I:C, een virus-nabootsend synthetisch dubbelstrengig RNA, dat een ‘Toll-like’ receptor 3 agonist is [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]). Interessant is dat de aktivatie van het poly(I:C)-geïnduceerde ‘Toll-like’ receptor 3 signalisering mechanisme ook resulteert in de verergering van lupus nefritis [auto-immuunziekte met ontsteking van de ‘nier-filters’] en ontwikkeling van auto-immune diabetes bij muizen.

3.1. SFN & anti-GPCR AAb bij CVS

Er werd duidelijk omschreven en waarschijnlijke ‘small-fibre’ neuropathie, gedefinieerd als een epidermale zenuwvezel-densiteit lager dan het 5e centiel en tussen het 5e en 15e centiel, gedetekteerd bij 30% en 13% van patiënten met CVS, en lage biventriculaire vulling-drukken van het hart tijdens inspanning. Deze bevindingen kunnen aan de basis liggen van de pathofysiologie van de autonome dysfunktie bij CVS.

AAb tegen GPCR zijn van bijzonder belang bij CVS. Er werden hogere AAb-waarden tegen M1, M3 & M4 muscarine AChR [acetylcholine receptor] & β2 AdR [β2 adrenerge receptor] gevonden bij CVS-patiënten in vergelijking met controles [Loebel M, Fluge Ø, Mella O, Scheibenbogen C et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52: 32-39 /// Tanaka S, Kuratsune H et al. Autoantibodies against muscarinic cholinergic receptor in Chronic Fatigue Syndrome. Int. J. Mol. Med. (2003) 12: 225-230]. De anti-M1 AChR AAb zijn geassocieerd met spier-zwakte. Gestegen anti-β2 AdR AAb correleren met immuun-aktivatie, inclusief de aanwezigheid van geaktiveerde HLA-DR+ CD8+ T-cellen, verhoogde anti-nucleaire antilichamen, anti-thyroperoxidase AAb [auto-antilichamen gericht tegen het enzyme schildklier-peroxidase] & waarden van IgG1-3. Deze correlatie kan worden toegeschreven aan het feit dat β AdR tot expressie komen in lymfocyten, en aktivatie, differentiatie, cytokine- en antilichaam-produktie reguleren. Loebel M et al. [zie hierboven] zagen een significante afname van anti-β2 AdR & anti-M4 AChR AAb na behandeling met rituximab [monoclonaal antilichaam tegen het proteïne CD20 op het oppervlak van B-lymfocyten dat deze cellen helpt vernietigen] bij klinische responders. Scheibenbogen C et al. [Immunoadsorption to remove ß2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS One (2018) 13: e0193672] hebben in een piloot-studie getoond dat immuun-adsorptie anti-ß2 AdR & anti-M3/M4 AChR AAb efficiënt kan verwijderen bij M.E./CVS en kan resulteren in een snelle, matige tot uitgesproken verbetering van symptomen. Aangezien β2 AdR de voornaamste adrenerge receptoren zijn die vasodilatie [bloedvat-verwijding] veroorzaken bij mensen en anti-β2 AdR AAb ook bij POTS verhoogd bleken, zou men kunnen veronderstellen dat ze de vasculaire regulering bij CVS aantasten.

3.2. Behandeling gericht op auto-immuniteit bij CVS

De positieve effekten van immuun-adsorptie werd hierboven beschreven. Er werden significante klinische verbeteringen van M.E./CVS-symptomen vastgesteld bij twee patiënten met langdurende M.E./CVS die adjuvante chemotherapie met cyclofosfamide [geneesmiddel dat de deling van cellen stopt] kregen voor borstkanker, ook bij één M.E./CVS-patient die chemotherapie met cyclofosfamide kreeg voor Hodgkin-lymfoom [lymfeklier-kanker].

Drie M.E./CVS-patiënten zonder oncologische co-morbiditeiten werden daarna in een piloot-studie behandeld met zes intraveneuze infusies of cyclofosfamide (4 weken tussentijd); twee daarvan met een significante klinische respons. Er loopt een ‘open-label’, fase-2 proef met cyclofosfamide bij 40 M.E./CVS-patiënten. Gegevens over de doeltreffendheid van intraveneus immunoglobuline (IVIg) en rituximab blijven controversieel. Dit zou echter een weerspiegeling kunnen zijn van de heterogeniteit van de patiënten met negatieve resultaten omtrent de aanwezigheid van AAb [Rowe PC. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: trial fails to confirm earlier observations of rituximab’s effectiveness. Ann. Intern. Med. (2019) 170: 656].

4. Posturaal orthostatisch tachycardie syndroom

POTS is een heterogene vorm van autonome dysfunktie gekenmerkt door een abnormale toename van de hartslag (> 30 bpm binnen 10 min of boven 120 bpm) na het rechtop staan. […] De rol van auto-immuniteit in de pathofysiologie van POTS wordt ondersteund door meerdere aspecten. […]

4.1. SFN & anti-GPCR AAb bij POTS

In vier verschillende studies werd SFN gedetekteerd bij 20% tot 50% van de patiënten met POTS. Een lage intra-epidermale zenuwvezel-densiteit correleerde met gereduceerde myocardiale [myocard = hartspier] sympathische innervatie [bezenuwing] […]. […].

Er werden AAb tegen GPCR gerapporteerd bij de meerderheid van POTS-patiënten: anti-β1AdR AAb […], anti-β2AdR AAb […], anti-angiotensine-II type-I receptor AAb […], anti-M1 & M2 AChR AAb […] en anti-α1AdR AAb […]. […] Overmatige toename van de hartslag in respons op excessieve vasodilatie kan minstens gedeeltelijk Aab-geïnduceerd zijn bij POTS. […]

4.2. Behandeling gericht op auto-immuniteit bij POTS

Er zijn tot op heden geen prospectieve proeven betreffende plasmaferese [manier om schadelijke (auto-)antilichamen te verwijderen door het plasma te vervangen] bij POTS. In één studie bleek de respons op IVIg bij patiënten met POTS en seropositiviteit voor één of meerdere AAb geassocieerd met autonome dysfunktie bij 88,4% van de deelnemers. […] Er loopt één klinische test met IVIg bij POTS. […].

5. Complex regionaal pijn syndroom

CRPS is een enigmatische pijnlijke aandoening die zich typisch ontwikkelt na letsel of chirurgie aan een lidmaat. Men spreekt over type-I & type-II, afhankelijk van het feit of er een definieerbaar zenuw-letsel is (afwezig bij type-I). CRPS wordt reeds geruime tijd erkend als een pijn-aandoening met regionale sensorische, motorische en autonome abnormaliteiten in het aangetast lidmaat. Gegevens […] suggereren nu ook een algemeen autonoom onevenwicht. […] Regionale en systemische manifestaties zijn bekend. Er is bewijs voor auto-immuniteit bij CRPS. […].

5.1. SFN & anti-GPCR AAb bij CRPS

[…]. Meerdere studies vonden een daling qua epidermale zenuwvezels en in zweetklieren, en vasculaire innervatie [bezenuwing van de bloedvaten] in huidbiopten van patiënten met CRPS […]. […].

Er werden anti-α1 AdR AAb, anti-β2 AdR AAb & anti-M2 AChR Aab […] gerapporteerd bij de meerderheid van de CRPS-patiënten maar niet bij gezonde controles. […]

5.2. Behandeling gericht tegen auto-immuniteit bij CRPS

Er bestaan geen overtuigende doeltreffende behandelingen voor CRPS. Gegevens omtrent IVIg-therapie blijft controversieel. Plasma-uitwisseling therapie bleek efficiënt voor het verminderen van pijn bij CRPS maar er zijn uitgebreidere proeven vereist om deze resultaten te bevestigen. Behandeling met corticosteroïden bleek […] parallel te lopen met pijn-reductie. […] De rol van cytokinen […]: toediening van een TNF-α antilichaam (infliximab) kan merkbare reducties qua CRPS-symptomen geven bij sommige patiënten. […]

6. Siliconen implantaat incompatibiliteit syndroom

[…] Siliconose, SIIS werd ook beschreven in de context van auto-immuun/ inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten (ASIA) [Shoenfeld Y, Agmon-Levin N.‘ASIA’ – Autoimmune/ inflammatory syndrome induced by adjuvants. J. Autoimmun. (2011) 36: 4-8; lees ook ‘Vaccinatie en CVS’, ‘CVS & FM na immunisatie met hepatitis-B vaccin’, ‘ASIA (auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten) syndroom’, ‘Aanhoudende aanwezigheid & hersen-translocatie van vaccin-adjuvanten’ & ‘Voorspellen van post-vaccinatie auto-immuniteit’.]. Veel patiënten met SIIS voldoen ook aan de criteria voor CVS/M.E., fibromyalgie, sarcoïdose en/of ongedifferentieerde bindweefsel-ziekte. Er zijn indicaties voor auto-immuniteit bij SIIS. […]

6.1. SFN & anti-GPCR AAb bij SIIS

Er zijn geen artikels specifiek over SFN bij SIIS. In één studie stelden de auteurs de diagnose van een polyneuropathie syndroom bij 83 op 100 patiënten met SIIS […]. […]

Een studie van AAb tegen GPCR-receptoren bij SIIS is aan de gang. […]

6.2. Behandeling gericht tegen auto-immuniteit bij SIIS

Verbetering die wordt geïnduceerd door de verwijdering van het implantaat is één van de belangrijkste criteria voor ASIA syndroom. […]. In sommige gevallen reageren SIIS-patiënten op agentia zoals hydroxychloroquine [middel tegen malaria; door zijn ontsteking-remmende eigenschappen ook gebruikt bij auto-immuunziekten], steroïden, methotrexaat [geneesmiddel dat het afweersysteem onderdrukt] en plasmaferese.

7. Sjögren’s syndroom

SjS, een chronische systemische inflammatoire aandoening behoort tot de meest courante reumatische ziekten en kan voorkomen als primaire aandoening of in associatie met andere auto-immune aandoeningen (Reumatoïde Artritis, Systemische Lupus Erythematosus, systemische sclerose [chronische auto-immuunziekte met verharding van (huid)bindweefsel] & primaire biliaire cirrose). SjS […] kan virtueel om het even welk orgaan-systeem aantasten en veroorzaakt worden via meerdere mechanismen – niet beperkt tot dysfunktie van exocriene klieren en lymfocyten-infiltratie van andere organen, maar ook hyper-aktivatie en ontregeling van het adaptieve en aangeboren immuunsysteem. […]. Vermoeidheid is het meest courante systemisch symptoom van SjS (70-80% van de patiënten). Neurologische manifestaties (inclusief autonome, sensorische, affectieve en cognitieve symptomen) komen ook voor bij in ca. 70% van patiënten met SjS. Dit toont de mogelijkheid van betrokkenheid van zowel het perifeer als het centraal zenuwstelsel. […]. De aanvang van SjS is dikwijls gelinkt aan infektueuze agentia (voornamelijk virussen) en er werden gevallen van SjS beschreven die mogelijks geassocieerd zijn met adjuvanten (inclusief siliconen). Virale infektie, voornamelijk met het Epstein-Barr virus (EBV), neemt een prominente plaats in als trigger van primaure SjS […]. […] De afbraak van de immuun-regulering, B-cel immortalisatie en stimulatie van B-cel proliferatie van de gastheer behoren tot erkende mechanismen bij SjS […]. Er bestaat ‘molecular mimicry’ [zie ‘‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie] tussen het primair SjS AAb (Ro-60) en het viraal proteïne (EBNA-1) […].[…]

7.1. SFN and anti-GPCR AAb in SjS

SjS is van de courante systemische auto-immune aandoening het meest gelinkt met SFN. De eerstelijn behandeling van SFN bij SjS is gericht op symptoom-management maar IVIg, zoals bleek uit een kleine gevallen-reeks, kan bijkomende verlichting bieden […]. Deze gegevens suggereren de rol van immune mechanismen bij de ontwikkeling van SFN bij SjS, hoewel er praktisch niets is geweten omtrent hoe systemische auto-immune ziekten ‘small fibres’ aantasten. Wat betreft anti-GPCR Aab is er bewijsmateriaal voor een rol van AAb tegen M3 AChR bij de ontwikkeling van SjS. […].[…]

8. Besluiten

In dit artikel focussen we op het bewijsmateriaal voor auto-immuniteit bij CVS, POTS, CRPS & SIIS, de courante manifestaties van deze medische aandoeningen, waarschijnlijke onderliggende mechanismen en enkele therapeutische modaliteiten gericht op het immuunsysteem. We suggereren dat autonome dysfunktie, minstens bij een subset patiënten, kan ontwikkelen te wijten aan de aanwezigheid van AAb tegen GPCR, wat werd gerapporteerd bij elk van de besproken aandoeningen. Deze veronderstelling wordt bijkomend ondersteund door het bewijs dat één van deze AAb (anti-M3 AChR AAb) verantwoordelijk is voor autonome dysfunktie bij de welgekende auto-immune ziekte SjS. Er werd ook aangetoond dat de waarden van anti-GPCR AAb in het serum significant hoger zijn bij adolescente meisjes met klachten die courant zijn voor POTS & CRPS na vaccinatie met humaan papillomavirus vaccin t.o.v. van ongevaccineerde controles. Deze bevindingen suggereren dat de toegenomen produktie van anti-GPCR AAb, waarvan werd gerapporteerd dat ze aanwezig zijn in de sera van gezonde individuen weliswaar in mindere hoeveelheden, een weerspiegeling is van de hyper-stimulatie van het immuunsysteem. Wat betreft de klinische manifestaties: patiënten met al de hier beschreven medische aandoeningen vertonen symptomen die typisch zijn voor perifere auto-immune autonome dysfunktie én voor betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel, wat ook kenmerkend is voor SjS. Men zou een rol voor anti-GPCR Aab kunnen voorstellen: niet enkel bij de ontwikkeling van dysautonomie maar ook bij de pathogenese van met het centraal zenuwstelsel gerelateerde symptomen; aangezien AdR & muscarine AChR tot expressie komen in het perifeer en centraal zenuwstelsel. Inderdaad: een PET-studie toonde een reductie aan van neurotransmitter-receptor binding in de hersenen van CVS-patiënten met hoge waarden aan anti-M1 AChR AAb in hun sera [Yamamoto S et al. Reduction of [11C](+)3-MPB binding in brain of Chronic Fatigue Syndrome with serum autoantibody against muscarinic cholinergic receptor. PLoS One (2012) 7: e51515]. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid dat de AAb direct interageren met de muscarine AChR in het brein (hoewel de cognitieve funktie van de CVS-patiënten in deze studie niet verschilde van gezonde controles). De andere oorzaak van dysautonomie en sensorische stoornissen, namelijk SFN, is ook relevant voor sommige patiënten met elk van de medische aandoeningen, alsook voor sommige patiënten met Sjögren’s syndroom. SFN & anti-GPCR AAb onderling zouden verbonden kunnen zijn. Primaire sensorische neuronen brengen normaal α1, α2 & β2 AdR tot expressie, welke is gewijzigd na letsels van perifere zenuwvezels of inflammatoire processen. α1AdR & M2 AChR komen ook tot expressie op zenuwvezels in de huid. Verdere studies zijn nodig voor een duidelijke definiëring van de subgroepen van patiënten met CVS, POTS, CRPS & SIIS van kennelijk auto-immune aard, die mogelijks voordeel kunnen halen uit behandeling gericht op auto-immuniteit (bv. immuno-adsorptie/ plasmaferese, IVIg, biologische agentia, enz.). Naar onze mening kunnen anti-GPCR AAb en SFN dienen als aannemelijke biomerkers voor deze subgroepen.

januari 18, 2020

Verstoring van effector & regulerende T-cel subsets bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 8:18 am
Tags: , , , , , , , , , ,

In onderstaande gedetailleerde studie werden de immunologische verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles geanalyseerd. Er werden meerdere belangrijke verschillen gevonden wat betreft de frequenties (aantallen) en werking van subgroepen van T-cellen. Deze zijn zowat de regulatoren van een immuun-respons.

Men vond geen verschillen qua globale aantallen monocyten, B-cellen of T-cellen, maar de verhouding van twee belangrijke subsets van T-cellen, namelijk de CD4+ / CD8+ ratio (verhouding T-helper of T4 cellen op cytotoxische of T8 cellen), was verhoogd bij de M.E./CVS-patiënten. Het is geweten dat deze verhouding wijzigt bij het ouder worden. De onderzoekers splitsten de studie-groepen op in mensen jonger en ouder dan 50, en vonden dat het verschil in CD4+ / CD8+ ratio enkel optrad bij individuen jonger dan 50. Dit is suggestief voor een versnelde veroudering bij M.E./CVS.

Er werd ook een belangrijk verschil gevonden wat betreft de Th17-cel subgroep (subgroep T-helper cellen die pro-inflammatoir interleukine-17 produceren), die betrokken is bij de respons tegen bakterieën en die ook betrokken is bij meerdere auto-immune en chronische inflammatoire aandoeningen. Deze cellen zijn te vinden in slijmvliezen en spelen een belangrijke rol bij bv. M.S., psoriasis, juveniele diabetes, Reumatoïde Artritis, ziekte van Crohn, …). De frequentie van deze cellen was significant hoger bij M.E./CVS maar hun funktionaliteit was verminderd. De auteurs vatten samen: “We denken dat dit betekent dat er een chronische aktivatie van Th17-cellen is bij M.E./CVS, die een toestand van ‘uitputting’ induceert waarbij de cellen slechter werken omwille van hun chronische stimulatie.”.

Er was ook een belangrijk verschil qua ‘mucosal-associated invariant T’ (MAIT) cellen (mucosa = slijmvliezen) bij de patiënten. Deze MAIT-cellen reageren selektief op een brede waaier aan bakterieën. Hoewel hun frequentie niet verschilde, was de funktionaliteit helemaal anders, met o.a. een gedaalde aanmaak van cytokinen. Het is volgens de onderzoekers “ mogelijk dat deze veranderingen wat betreft Th17- & MAIT-cellen verband houden met verschillen qua microbioom-samenstelling, en dat een verstoring daarvan chronische aktivatie van deze subgroepen en een toestand van uitputting veroorzaakt bij M.E./CVS”.

Er werd ook opgemerkt dat regulerende T cellen (Tregs) waren verhoogd bij de patiënten. De funktie van Tregs is het onderdrukken van buitensporige chronische immuun-responsen, wat consistent is met de bevinding dat er chronische aktivatie van belangrijke T-cel subsets lijkt te zijn…

Ten slotte gebruikte het research-team de immuun-profilering parameters voor een ‘machine-learning’ (ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten voorspellingen te maken op basis van empirische gegevens) klassificatie-model en hiermee kom men M.E.(cvs)-patiënten correct identificeren en onderscheiden van gezonde controles, met een hoge sensitiviteit en accuraatheid. Aangezien patiënten dikwijls jaren op een diagnose moeten wachten en er momenteel nog geen duidelijke diagnostische instrumenten zijn, zou dit kunnen helpen als biomerker.

In ons stuk ‘Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)’ maakten we al melding van research aangaande MAIT-cellen bij M.E.(cvs). Prof. dr Derya Unutmaz (immunoloog) van het ‘Jackson Laboratory ME/CFS Collaborative Research Centre’ – ook co-auteur van ‘Tuning of human MAIT cell activation by commensal bacteria species and MR1-dependent T-cell presentation’ (Mucosal Immunology (2018) 11, 1591-1605) – speculeerde (‘Nature News Feature’ 3 Januari 2018) dat de inflammatie die wordt gezien bij M.E.(cvs) het resultaat zou kunnen zijn van een probleem bij de T-cel respons op onschadelijke virussen, schimmels en andere stimuli. Hij en z’n team zetten het werk dus verder…

————————-

BioRxiv (Pre-print december 2019)

Perturbation of effector and regulatory T cell subsets in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS)

Ece Karhan (1), Courtney Gunter (1), Vida Ravanmehr (1), Meghan Horne (1), Lina Kozhaya (1), Stephanie Renzullo (1), Lindsey Placek (1), Joshy George (1), Peter N. Robinson (1), Suzannne D Vernon (2), Lucinda Bateman (2), Derya Unutmaz (1,3)

1 Unutmaz Laboratory, Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, USA

2 Bateman Horne Centre, Salt Lake City, Utah, USA

3 Department of Immunology, University of Connecticut School of Medicine, Farmington, Connecticut, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met onbekende etiologie en de diagnose is grotendeels gebaseerd op klinische symptomen. Onze hypothese was dat immunologische verstoring de belangrijkste aandrijvende factor van deze ziekte is, en analyseerden bloedstalen van een grote groep M.E./CVS-patiënten en controles op zoek naar verschillen qua T-cel subset frequenties en funkties. We vonden dat de verhouding CD4+ op CD8+ T-cellen en het aandeel CD8+ effector geheugen T-cellen verhoogd waren, terwijl NK-cellen verminderd waren bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50, vergeleken met een gezonde controle-groep. Opmerkelijk: er werden belangrijke verschillen gezien wat betreft de funkties van Th1, Th2, Th17 en ‘mucosal-associated invariant’ T (MAIT) T-cel subsets (alle leeftijden) van patiënten, t.o.v. gezonde individuen. Hoewel CCR6+ Th17-cellen bij M.E./CVS minder IL-17 sekreteerden vergeleken met controles, was hun frequentie hoger. Ook MAIT-cellen van patiënten sekreteerden minder IFNgamma, Granzyme-A en IL-17 na aktivatie. Te samen suggereren deze bevindingen chronische stimulatie van deze T-cel populaties bij M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee was de frequentie regulerende T-cellen (Tregs), die buitensporige immuun-aktivatie controleren, hoger bij M.E./CVS-patiënten. Ten slotte bepaalden we, gebruikmakend van een ‘machine-learning’ algoritme (‘random forest’), dat de geanalyseerde set T-cel parameters meer dan 90% van de mensen in de M.E./CVS-groep als patiënten kon identificeren (93% ‘true positive rate’ [aantal echte positieve waarden] of sensitiviteit). Tot besluit: deze verschillende en belangrijke verstoringen of dysfunkties qua T-cel subsets bij M.E./CVS-patiënten suggereert potentiële chronische infekties of microbioom-dysbiose. Deze bevindingen hebben ook implicaties voor de ontwikkeling van specifieke immune biomerkers voor M.E./CVS en onthullen potentiële doelwitten voor nieuwe therapeutische interventies.

Inleiding

[…]

Hoewel de oorzaken van M.E./CVS waarschijnlijk multifactorieel zijn, werd een geschiedenis van initiële infektueuze agentia, inclusief virale (bv. EBV) en bakteriële (bv. ziekte van Lyme) infekties, geassocieerd met het triggeren van de ziekte. Inderdaad: steeds meer bewijsmateriaal impliceert een significante rol voor immunologische abnormaliteiten waarvan wordt gedacht dat ze bijdragen tot ziekte-progressie en/of de chronische symptomatische toestand [Fletcher MA, Klimas NG et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome /Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88 /// Curriu M et al. Screening NK-, B- and T-cell phenotype and function in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2013) 11: 68 /// Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome /Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol (2014) 26: 233-242]. Studies van het immuunsysteem bij M.E./CVS hebben vele abnormaliteiten onthuld, waaronder verstoringen qua aantal en funktie van T-cel subsets, B-cellen en ‘natural killer’ (NK) cellen [referenties hierboven]; veranderingen qua cytokine-sekretie [Torres-Harding S, Fletcher MA et al. Evidence for T helper 2 shift and association with illness parameters Chronic Fatigue Syndrome (CFS). Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33 /// Broderick G et al. A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun (2010) 24: 1209-1217 /// Bansal AS et al. Chronic Fatigue Syndrome, the immune system and viral infection. Brain Behav Immun (2012) 26: 24-31]; wijzigingen in de humorale immuniteit, en inflammatoire immuun-signalisering [Aspler AL, Vernon SD et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct (2008) 4: 44] en hogere frequenties van verscheidene auto-antilichamen [Ortega-Hernandez OD & Shoenfeld Y. Infection, vaccination and auto-antibodies in Chronic Fatigue Syndrome, cause or coincidence? Ann N Y Acad Sci (2009) 1173: 600-609; zie ‘Vaccinatie en CVS]. T-cellen zijn verantwoordelijk voor het orkestreren en moduleren van een optimale immuun-respons, via hun effector of regulerende werkingen. Verstoringen qua T-cel subsets, of effector of regulerende funkties bij M.E./CVS [Lorusso L et al. Immunological aspects of Chronic Fatigue Syndrome. Autoimmun Rev (2009) 8: 287-291] kunnen zodoende resulteren in een immune ontregeling of ongewenste immuun-responsen.

Hier vonden we verstoringen wat betreft CD8+ T-cellen, NK-cellen, Treg cel frequenties en effector-funkties van Th17- en MAIT-cellen bij M.E./CVS-patiënten. Sommige van de verschillen in immuun-parameter, zoals CD8+ effector geheugen T-cellen en NK-cellen, bleken relatief verschillend bij jongere patiënten maar niet bij patiënten ouder dan 50, in vergelijking met gezonde controles. Daarnaast konden we, gebruikmakend van significante immune kenmerken en een ‘machine-learning’ algoritme, M.E./CVS-patiënten identificeren en onderscheiden met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Te samen onthullen onze bevindingen meerdere chronische T-cel dysfunkties bij M.E./CVS, suggestief voor een link met chronische infekties of een ontwrichting van de microbiomen.

Materialen en methodes

Deelnemers

[…] 1994 CDC Fukuda en/of Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. Gezonde controles werden gematcht met 85 patiënten voor leeftijd, geslacht, ras/ethniciteit, geografische/klinische plaats en afname-seizoen. Patiënten of controles die antibiotica/ immunomodulerende medicijnen namen of infekties hadden in de voorafgaande maanden werden uitgesloten. […]

PBMC-isolatie & bewaring

[…]

Oppervlakte & intracellulaire kleuring, en flow-cytometrie analyse

[…]

‘Machine-learning’ & statistische analyse

[…]

Resultaten

[wellicht eerder voor experten (een cursus immunologie is hier niet aan de orde); leken kunnen de bespreking hieronder lezen]

Veranderingen qua subsets T-cellen in het bloed van M.E./CVS-patiënten

Om de fenotypische en funktionele veranderingen in subsets immuun-cellen van M.E./CVS-patiënten te bepalen, ontwikkelden we meerdere merker-combinaties voor flow-cytometrie analyse en voerden immuun-profilering uit bij 198 M.E./CVS-patiënten, en and 91 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles. We analyseerden eerst de voornaamste immune subsets in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs), namelijk T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten. Er was geen significant verschil qua percentage van monocyten (p = 0.9), B-cellen (p = 0.9) of T-cellen (p = 0.1) maar het voorkomen van NK-cellen binnen de lymfocyten was sterk gedaald (p = 0.0005) bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Binnen de T-cellen zagen we dat het aantal CD4+ T-cellen hoger was (p = 0.0193) en, overéénkomstig daarmee, waren CD8+ T-cellen lager (p = 0.0052) bij M.E./CVS; dit werd gereflekteerd in een hogere CD4:CD8 verhouding (p = 0.0078). Er was geen verschil qua CD4CD8 (dubbel-negatieve; DN [nog niet ontwikkelde]) T-cellen (p = 0.9) (gegevens niet getoond).

Het is goed geweten dat veranderingen in de CD4:CD8 verhouding geassocieerd zijn met ouder worden. Inderdaad: de aantallen CD4+ & CD8+ T-cellen en de CD4:CD8 verhouding correleerden met leeftijd bij zowel gezonde controles […] als M.E./CVS-patiënten […]. De leeftijd vertoonde ook een significante correlatie met DN T-cellen bij de controles […] maar niet bij de patiënten […]. Interessant: wanneer we de M.E./CVS-patiënten onderverdeelden op basis van hun mediane leeftijd (jonger of ouder dan 50 jaar), bleef het verschil in percentage CD8+ T-cellen en CD4:CD8 verhouding slechts significant voor M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0082 & 0.0131 respectievelijk) maar niet voor deze ouder dan 50 (p = 0.6 & 0.6 respectievelijk). Leeftijd vertoonde ook een significante correlatie met NK-cellen bij de M.E./CVS-patiënten […] maar niet bij de gezonde controles […]. Deze verandering qua NK-cel frequentie werd ook gezien bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p < 0.0001).

Daarna deelden we de CD4+ & CD8+ T-cellen op in naïeve [rijp maar nog niet geaktiveerd] en ‘memory’ [met ‘geheugen’ of ‘ervaring’; zijn een antigen tegengekomen en hebben er op gereageerd, kunnen bij een nieuwe ontmoeting sneller en sterker een immuun-respons opzetten] subsets op basis van hun differentiatie (funktionele en fenotypische kenmerken). Om de proportie van deze subgroepen bij M.E./CVS te bepalen, gebruikten we de gevestigde CD45RO & CCR7 cel-oppervlakte molekulen als merkers voor CD4+ en CD8+ T-cel subsets. Binnen de CD4+ cellen was er geen significant verschil tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor de CD45ROCCR7+ (naïeve; N) (p = 0.5), CD45RO+CCR7+ (centraal ‘memory’; CM) (p = 0.7), CD45RO+CCR7 (effector ‘memory’; EM) (p = 0.2) of CD45ROCCR7 (effector ‘memory’ RA; EMRA) (p = 0.06) subsets. Er was ook geen verschil qua CD8+ N (p = 0.4), CM (p = 0.1) of EMRA (p = 0.0509) populaties; de CD8+ EM T-cel subset was echter sterk gestegen (p = 0.0001) bij M.E./CVS.

De aantallen of N, CM, EM & EMRA binnen de CD8+ T-cellen correleerden met leeftijd voor beide groepen en dit werk ook gezien in de CD4+ subsets. Er was echter geen significant verschil qua CD8+ N of CM T-cellen voor individuen (controles & M.E./CVS) jonger of ouder dan 50, of voor CD4+ N, CM of EM subsets in verschillende leeftijd-groepen. Interessant: het verschil qua CD8+ EM subset tussen M.E./CVS en controles bleef beperkt tot individuen jonger dan 50. De CD8+ & CD4+ EMRA subsets waren ook enkel significant lager bij M.E./CVS-patiënten jonger dan 50.

Veranderingen qua Th17-cel frequentie en funktie bij M.E./CVS

Onze hypothese was dat M.E./CVS-patiënten ook verstoringen kunnen vertonen binnen de effector T-cel subsets in mucosale weefsels (zoals Th17-cellen), die reageren op bakteriële infekties of microbiomen en ook gelinkt zijn met auto-immune ziekten. Om Th17-cellen te identificeren, gebruikten we eerst CD3, CD4, CD45RO & CCR6 expressie, aangezien bijna alle van deze subset een geheugen-fenotype hebben en ook de chemokine-receptor CCR6 tot expressie brengen. Om de cytokine-sekretie van T-cellen te analyseren, ontdooiden we ingevroren PBMCs en cultiveerden die een dag in IL-7 (d1) om er voor te zorgen dat de cellen herstelden en dat dode cellen duidelijk konden worden geïdentificeerd. We aktiveerden dan de cellen met PMA & ionomycine [mitogene cocktail; molekulen die cellen aanzetten tot delen]. De cellen werden dan intracellulair gelabeld voor IL-17 & IFNγ, en geselekteerd op cel-oppervlakte expressie gebaseerd op CD4+CD45RO+CCR6+ & CD4+CD45RO+CCR6. Binnen de CD4+CD45RO+ (‘memory’ T-cel) populatie was de frequentie van IL-17+ (p = 0.0378), IFNγ+ (p = 0.0231) & IL-17+IFNγ+ (p = 0.0378) sekreterende cellen significant gedaald bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles.

Eerder hadden we getoond dat een deel van de Th17-cellen ‘gereed-gemaakt’ zijn om IL-17 of IL-22 te produceren na ‘priming’ [voorbereiding] met γc [‘common gamma chain’; cytokine-receptor sub-unit gemeenschappelijk voor minstens zes interleukine-receptoren] -cytokinen (namelijk IL-2, IL-15 of IL-7), die hun volledig potentieel van hun IL-17 sekretie onthullen. Daarom cultiveerden we PBMCs van M.E./CVS-patiënten en controles gedurende 6 dagen (d6) met IL-7 om Th17-cellen aan te zetten tot IL-17 sekretie. De PBMCs werden dan gestimuleerd met PMA & ionomycine, en de expressie van cytokinen in de T-cel subsets werd bepaald. Deze test toonde bij de T-cellen van M.E./CVS-patiënten een veel lagere expressie van totaal IL-17+ (p < 0.0001), IFNγ+ (p < 0.0001), IL-17+IFNγ+ (p < 0.0001) & IL-17+ IFNγ (p < 0.0001) cellen, wat een belangrijke dysfunktie van Th17-cellen bij de patiënten onthult.

Na 6 dagen cultuur met IL-7, bleek het deel IL-17 & IFNγ sekreterende cells binnen de CD4+CD45RO+ ‘memory’ populatie van gezonde controles niet te correleren met leeftijd voor de IL-17+, IFNγ+, IL-17+IFNγ+ noch IL-17+IFNγ subsets […]. Bij M.E./CVS, correleerde leeftijd ook niet met IFNγ+ […] maar de IL-17+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ subsets toonde een significante correlatie […]. Wanneer patiënten werden opgedeeld in groepen jonger of ouder dan 50, werden significante verschillen gezien voor de IL-17+, IFNγ+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ subsets tussen controles en M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0017, 0.0018, 0.0009 & 0.0009 respectievelijk), alsook bij die ouder dan 50 (p = 0.0002, 0.0047, 0.0008 & 0.0001 respectievelijk).

Om de ontregeling in de Th17-cel subgroep verder te onderzoeken, vergeleken we de frequentie van CD4+CD45RO+CCR6+ cellen, controles vs. M.E./CVS. In tegenstelling tot IL-17 expressie, vonden we dat CCR6+ cellen significant hoger waren bij M.E./CVS (p = 0.0009). Na 6 dagen cultuur met IL-7 was er echter geen verschil tussen de groepen (p = 0.2), zelfs al lag de gemiddelde frequentie hoger in beide groepen. De frequentie van CCR6+ cellen binnen de ‘memory’ CD4 T-cellen correleerde met leeftijd voor gezonde controles […] maar niet voor M.E./CVS-patiënten […]. Wanneer de patiënten werden gegroepeerd (jonger/ouder dan 50), werd enkel een significant verschil gezien voor het deel CCR6+ bij de individuen jonger dan 50 (p = 0.0002).

Opmerkelijk: M.E./CVS-patiënten vertoonden lagere expressie (t.o.v. controles) van IL-17+ (p = 0.0035), IL-17+IFNγ+ (p = 0.0055) & IL-17+IFNγ (p = 0.0084) maar niet voor totaal IFNγ+ (p = 0.3), binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen. Na 6 dagen cultuur in IL-7, stegen de verschillen verder en kwamen ze voor bij alle cytokine-sekreterende cellen (IL-17+ (p < 0.0001), IFNγ+ (p = 0.0010), IL-17+IFNγ+ (p < 0.0001) IL-17+IFNγ (p < 0.0001) cellen als deel van de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen).

We bepaalden dan de verhoudingen tussen de CCR6+ T-cellen op CD4+ ‘memory’ T-cellen met expressie van IL-17 of IFNγ. Inderdaad: de verhouding CCR6+ cellen op IL-17+ (p < 0.0001) en op IFNγ+ (p < 0.0001) CD4+ ‘memory’ T-cellen waren significant bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Deze verhoudingen tussen CCR6+ cellen en cytokinen aangemaakt door CD4+ cellen bleef ook hoger bij M.E./CVS na 6 dagen cultuur met IL-7, voor de verhouding CCR6+ op IL-17+ cellen (p = 0.0015), maar waren slechts in beperkte mate verschillend voor de verhouding CCR6+ op IFNγ+ cellen (p = 0.0366).

We hebben eerder getoond dat CD161 [‘killer’ cel lectine-achtige receptor] binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ T-cellen deze cellen verder kunnen worden opgedeeld in subsets met verschillen qua IL-17 & IFNγ sekretie. Dus verdeelden we verder de CCR6+ cellen op basis van CD161 expressie. Het deel CD161+ cellen binnen de CCR6+ subgroep was slechts lichtjes verschillend bij M.E./CVS t.o.v. controles (p = 0.0439). We analyseerden dan IL-17 & IFNγ expressie binnen de CD161+ & CD161 subsets van de CD4+CD45RO+CCR6+ cellen na 6 dagen cultuur. Binnen de CD4+CCR6+CD161+ cellen was er een significant verschil qua expressie van IL-17+, IL-17+IFNγ+ & IL-17+IFNγ cellen tussen M.E./CVS en controles (p < 0.0001 voor allemaal), maar niet voor IL-17IFNγ+ cellen (p = 0.06). CD161 cellen binnen de CD4+CD45RO+CCR6+ subgroep vertoonden ook lagere IL-17+, IL-17+IFNγ+, IL-17+IFNγ & IL-17IFNγ+ bij M.E./CVS (p ≤ 0.0001, < 0.0001, 0.0001 & 0.0042 respectievelijk).

Bij CD4+ ‘memory’ T-cellen bepaalden we ook, naast IL-17 expressie, de frequentie van T-cellen die enkel of IFNγ (IFNγ+IL-4) of IL-4 (IFNγIL-4+) tot expressie brachten, welke respectievelijk Th1 en Th2 T-cel subsets definiëren. We vonden dat het deel van IFNγ+IL-4 & IFNγIL-4+ binnen de CD4+ ‘memory’ T-cellen significant lager (p = 0.0157 & p < 0.0001 respectievelijk) lag bij M.E./CVS. De verhouding van Th1 (IFNγ+IL-4) op Th2 (IFNγIL-4+) was echter hoger bij M.E./CVS (p = 0.0196), suggestief voor een onevenwicht van Th1 op Th2 cellen. Te samen accentueren deze bevindingen belangrijke funktionele verstoringen binnen de CD4+ T-cel subgroep in de groep M.E./CVS-patiënten.

Veranderingen qua frequentie MAIT-cellen bij M.E./CVS

‘Mucosal-associated invariant’ T (MAIT) cellen zijn een subgroep van de niet-klassieke T-cel populatie en worden gedefinieerd door een invariante T-cel receptor die wordt getriggerd door riboflavine [vitamine-B2] -metabolieten geproduceerd door bakterieën, inclusief commensale microben. Net als bij de Th17-subset, hypothiseerden we dat dysbiose van het darm-microbioom of voorafgaande bakteriële infekties kunnen resulteren in veranderingen qua MAIT-cel frequenties of funktie. Om MAIT-cellen in PBMCs te identificeren, gebruikten we de oppervlakte-molekulen Vα7.2 [deel van T-cel recpetor] & CD161. We bepaalden dan de frequentie van MAIT-cellen binnen de CD4+, CD8+ & CD4CD8 (dubbel negatief of DN) T-cel compartimenten bij M.E./CVS en controles. Er was geen significant verschil tussen patiënten en controles voor CD4+ (p = 0.7), CD8+ (p = 0.7) of dubbel negatieve (DN) MAIT-cellen (p = 0.2) als deel van de CD4+, CD8+ & DN T-cellen respectievelijk. De CD4+ & CD8+ MAIT-cel frequenties in PBMCs na 6 dagen cultuur in IL-7 toonden echter een significant verschil (p = 0.0250 & p = 0.0221 respectievelijk) (M.E./CVS vs. controles) maar de frequentie DN MAIT-cellen verschilde niet (p = 0.3). Wanneer de verhouding van MAIT-cel frequentie op dag 0 (d0) vs. dag 6 werd bepaald, vonden we dat deze van de CD8+ MAIT-cellen in M.E./CVS PBMCs sterk gereduceerd was na 6 dagen cultuur (p = 0.0008) maar er was geen significant verschil voor CD4+ (p = 0.06) of DN MAIT-cellen (p = 0.8) (M.E./CVS vs. controles). In overéénstemming met deze bevinding, was de verhouding van CD8+ op DN MAIT-cellen bij M.E./CVS en controles slechts lichtjes significant op dag 0 (p = 0.0364) maar deze werd sterk significant na 6 dagen cultuur (p < 0.0001). Te samen suggereren deze bevindingen dat CD8+ MAIT cellen van M.E./CVS-patiënten minder overleefden in cultuur met IL-7.

Omdat CD27 [receptor van de TNF-superfamilie; vereist voor het genereren en onderhouden van T-cel immuniteit] -expressie op MAIT-cellen een recent geaktiveerde of gedifferentieerde subset kan aangeven, zoals bij andere CD8 T-cellen, evalueerden we CD27-expressie in MAIT-subsets. We vonden dat M.E./CVS-patiënten een significant verschil hadden: hoewel er meer CD45RO+CD27 cellen waren (p = 0.0045) werd, interessant genoeg, dit verschil niet gezien bij de DN MAIT-cellen (p = 0.7). De verhouding dag0:dag6 CD8+ MAIT-cellen vertoonde ook een licht positieve correlatie met de frequentie qua CD27CD8+ MAIT-cellen bij patiënten […] maar niet bij controles […]. In tegenstelling daarmee correleerden CD27 DN MAIT-cellen niet met de dag0:dag6 verhouding, noch voor controles […] noch voor patiënten […].

We vroegen ons dan af in welke mate MAIT-cellen funktioneel verschillend waren tussen M.E./CVS en controles. Daartoe stimuleerden we eerst PBMCs met een cocktail van drie cytokinen (IL-12+IL-15+IL18), aangezien van deze combinatie uniek is gebleken dat ze de expressie van IFNγ door MAIT-cellen induceert. Bijgevolg werd IFNγ samen met Granzyme-A expressie aangewend om de respons te evalueren van CD8+ MAIT en CD8+ non-MAIT cellen in PBMCs na stimulatie met de IL-12+IL-15+IL18 cocktail. PBMCs van M.E./CVS-patiënten die waren gestimuleerd met de cytokine-cocktail vertoonden veel minder IFNγ+ MAIT-cellen (p ≤ 0.0001) maar de inductie van IFNγ+ door non-MAIT CD8+ T-cellen was vergelijkbaar (p = 0.1) bij gezonde mensen. MAIT-cellen die Granzyme-A tot expressie brengen waren ook veel talrijker bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar non-MAIT cellen die Granzyme-A tot expressie brengen bleken niet te verschillen (p = 0.8). Daarnaast waren CD27CD8+ MAIT-cellen en IFNγ+ MAIT-cellen na cytokine-stimulatie negatief gecorreleerd bij M.E./CVS-patiënten […] maar niet bij controles […]. CD27CD8+ MAIT-cellen waren niet gecorreleerd met CD8+ non-MAIT IFNγ+ cellen, noch bij controles […] noch bij M.E./CVS […].

Aangezien ook werd getoond dat MAIT-cellen IL-17 tot expressie brengen, zoals Th17-cellen, probeerden we daarna de produktie van IL-17 en IFNγ door MAIT-cellen in respons op PMA & ionomycine stimulatie te bepalen. Er was zeer weinig tot ondetekteerbare IL-17 expressie door MAIT-cellen na een dag in cultuur (gegevens niet getoond). Na 6 dagen in IL-7, was het aantal MAIT-cellen dat IL-17 tot expressie bracht echter sterk toegenomen na stimulatie. IL-17 door non-MAIT CD8+ T-cellen bleef echter ondetekteerbaar. Deze bevinding suggereert dat MAIT-cellen ook ‘priming’ kunnen ondergaan met cytokinen, net zoals de klassieke Th17-cellen […].

Daarnaast bepaalden we ook IFNγ en TNFα sekretie door CD8+ MAIT en CD8+ non-MAIT CD45RO+ (‘memory’) T-cellen na 6 dagen in cultuur met IL-7. Er was geen significant verschil bij M.E./CVS voor IFNγ+ MAIT-cellen (p = 0.5) maar we vonden sterk gereduceerde IL-17+IFNγ+ MAIT-cellen bij de patiënten vergeleken met controles (p = 0.0075). De frequentie van IFNγ+ sekreterende cellen was ook verminderd binnen de CD8+ non-MAIT cellen (p = 0.0057) en binnen de CD8+CD45RO+ ‘memory’ T-cellen (p = 0.0002), in M.E./CVS PBMCs na 6 dagen cultuur met IL-7.

Veranderingen qua regulerende T (Treg) cellen bij M.E./CVS

Regulerende T (Tregs) cellen zijn cruciaal voor het controleren van auto-reaktieve of buitensporige immuun-responsen. Gezien de geobserveerde verstoring van effector-funkties van T-cel subsets die chronische immuun-aktivatie suggereert, hypothiseerden we dat er een corresponderende toename qua Tregs zou optreden bij M.E./CVS-patiënten. Voor dit experiment gebruikten we Foxp3 [‘forkhead box P3’, een proteïne betrokken bij immuun-responsen; belangrijke regulator bij de ontwikkeling en werking Tregs] & Helios [transcriptie-factor] als merkers, om de Treg-cel frequenties na te gaan binnen zowel naïeve als ‘memory’ CD4+ T-cellen. De frequenties van naïeve Tregs (p = 0.0005) en ‘memory’ Tregs (p = 0.0094) waren inderdaad verhoogd bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Na opdeling in groepen (jonger of ouder dan 50) vertoonden naïeve Tregs een zeer significant verschil bij de M.E./CVS-patiënten jonger dan 50 (p = 0.0083) en een lichtjes significant verschil bij deze ouder dan 50 (p = 0.0209). Het verschil in ‘memory’ Tregs was er ook significant verschil bij een leeftijd < 50 (p = 0.0116) maar niet bij > 50 (p = 0.6). Er was geen correlatie met de leeftijd bij M.E./CVS of controles voor naïeve […] of ‘memory’ Tregs […].

De verhouding van Th17-cellen op Tregs is een belangrijk kenmerk dat verstoord is bij chronische inflammatoire aandoeningen of auto-immune ziekten. We bepaalden daarom ook deze verhouding bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Hoewel de Th17 (CCR6+ IL-17-sekreterende cellen) frequentie niet correleerde met ‘memory’ Treg-cellen bij M.E./CVS […] of controles […] was opmerkelijk dat de verhouding van deze twee verwante subsets ook zeer verschillend waren tussen M.E./CVS en controles (p < 0.0001).

‘Machine-learning’ analyse ter identificatie van voorspellende immuun-parameters voor M.E./CVS

Onze immuun-profilering analyse identificeerde veel T-cel subgroep parameters die verschillend waren bij M.E./CVS-patiënten vs. gezonde controles. Van het totaal van 65 immuun-profiel kenmerken, werden er 40 als verschillend geïdentificeerd bij een 5% ‘false discovery rate’ [FDR; aantal vals positieve resultaten]. Hoewel sommige daarvan zeer significant waren, zouden ze echter, gezien de hoge variabiliteit het groot bereik bij mensen, op zichzelf geen klinisch relevante specificiteit en sensitiviteit hebben om patiënten van gezonde mensen te onderscheiden. Daarom beslisten we een klassificeer-model te gebruiken op basis van een ‘machine-learning’ algoritme genaamd de ‘random forest’ (RF) classifier’ [een (computer) leer-methode voor klassificatie die werkt via het construeren van meerdere beslissing-‘bomen’ via training, die dan een klassificatie of voorspelling oplevert].

De ‘RF-classifier’ of algoritme is een methode die afhankelijk is van een groot aantal individuele klassificatie-‘bomen’ [methodiek waarmee informatica-systemen beslissingen nemen]. Elke klassificatie-‘boom’ bepaalt een voorspelde klasse en de klasse met de meeste stemmen wordt de model-voorspelling. De individuele ‘bomen’ worden ontworpen gebruikmakend van een willekeurig geselekteerd aantal stalen [] en een willekeurig geselekteerde set kenmerken om correlatie tussen de ‘bomen’ te minimaliseren. Een groot aantal relatief ongecorreleerde klassificatie-‘bomen’ (modellen) worden gecombineerd om een robuuste klassificatie van het individueel staal te verschaffen. We implementeerden een RF-model om M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te klassificeren gebruikmakend van immuun-profilering gegevens. De prestaties van de RF werden geëvalueerd d.m.v. de ‘receiver operating characteristic’ (ROC) curve [grafiek], die wordt opgemaakt door het uitzetten van de ‘true positive rate’ (TPR) [aantal echt positieve resultaten] tegen de ‘false positive rate’ (FPR) [aantal vals positieve resultaten]. De klasse-voorspelling probabiliteit [waarschijnlijkheid] van een staal kan worden berekend […]. De ‘area under the ROC curve’ (AUC) is gelijk aan de probabiliteit […]. Een perfecte ‘classifier’ zal als maximale ‘area under the curve’ waarde 1 hebben. […] De AUC van de ‘RF-classifier’ gebruikmakend van alle 65 kenmerken is ~0.93, wat betekent dat er een kans is van 93% dat de ‘classifier’ een correct onderscheid zal maken tussen patiënten en controles. De 40 significant verschillende kenmerken of top 10 kenmerken met de hoogste belangrijkheid-score onder deze 40 significant verschillende immuun-parameters hadden lichtjes lagere AUC-scores (~0.92 & ~0.88 respectievelijk), terwijl de top 10 significant verschillende kenmerken een lagere AUC-score (~0.82) hadden.

Bespreking

Meerdere studies van het immuunsysteem bij M.E./CVS hebben ontregelingen onthuld van het aantal en de funktie van of T-cel subsets, B-cellen en ‘natural killer’ (NK) cellen in het bloed [referenties: zie inleiding]. Hier breiden wij deze bevindingen uit en tonen een zeer significante ontregeling wat betreft meerdere belangrijke T-cel subgroep frequenties en, belangrijk, hun effector-funkties. Onze bevindingen onthullen diepgaande veranderingen qua funktionele capaciteit van ‘mucosal associated’ T-cellen (MAIT) & Th17-cellen, Tregs, en tekenen van CD8+ T-cel & NK-cel ontregeling in een subgroep jongere individuen. Gezien het feit dat deze cel-types betrokken zijn bij het reguleren van virale of bakteriële infekties, of de microbiomen, suggereren onze bevindingen dat sommige M.E./CVS-patiënten meerdere immune verstoringen vertonen die waarschijnlijk worden getriggerd door chronische infekties of verband houden met wijzigingen in het microbioom.

Onze observatie dat CD8+ T-cellen én NK-cellen proportioneel gedaald zijn bij M.E./CVS kunnen een weerspiegeling zijn van chronische virale infektie of persistentie (zoals CMV- of EBV-infekties) die een chronische geaktiveerde toestand van deze cellen triggert. Het is belangrijk om op te merken dat dit verschil hoofdzakelijk werd gezien bij individuen jonger dan 50, aangezien gezonde mensen van ouder dan 50 ook een gelijkaardig fenotype beginnen te vertonen als de patiënten die niet statistisch verschilden. Inderdaad: dit is consistent met de toename qua chronische virale infekties die wordt gezien bij normale veroudering, zoals CMV-seropositiviteit. Gezien deze verdeling is het echter onwaarschijnlijk dat deze subset-verschillen alleen de hoofd-oorzaak zijn van M.E./CVS-symptomen omdat het evident is dat er ook meerdere en ernstige veranderingen zijn qua effector-funkties van andere T-cel subsets. Daarnaast was het aandeel van CMV-/EBV-infekties bij gezonde controles en M.E./CVS-patiënten niet significant verschillend in beide leeftijd-groepen (gegevens niet getoond).

Een andere T-cel subgroep die sterk ontregeld bleek bij M.E./CVS waren de Th17-cellen, die worden gekenmerkt door de sekretie van IL-17, expressie van de chemokine-receptor CCR6 en de transcriptie-factor RORC. Th17-cellen spelen een belangrijke rol bij de immuun-respons op bakteriële of schimmel-infekties en bij de pathogenese van auto-immune of chronische inflammatoire ziekten. We vonden eerder dat een significant deel van de cellen die geprogrammeerd worden naar het Th17-fenotype niet onmiddellijk IL-17 sekreteren maar een ‘priming’-fase met IL-7 of IL-15 vereisen, wat we noemen ‘gereed-gemaakte’ Th17-cellen. Inderdaad: wanneer we een test uitvoerden waarbij we PBMCs in cultuur zetten met IL-7 gedurende 6 dagen vooraleer de IL-17 produktie van deze ‘gereed-gemaakte’ CCR6+ Th17-cellen te analyseren, bleken de verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en controles zeer groot. Hoewel er minder Th17-cellen zijn die IL-17 produceren bij M.E./CVS, was het aandeel van CCR6+ Th17-cellen echter paradoxaal significant hoger vergeleken met controles. Te samen suggereren deze bevindingen chronische aktivatie van de Th17-subset die mogelijks een toestand van “uitputting” induceert, op een manier dat wanneer hun aantal gestegen is omwille van chronische stimulatie, ze meer dysfunktioneel worden. Een mogelijke schuldige voor chronische Th17-cel stimulatie zou de veranderingen qua samenstelling van het microbioom kunnen zijn, of dysbiose die wordt veroorzaakt door het verschuiven van het evenwicht van voordelige of schadelijke bakterie-soorten, zoals wordt gezien tijdens HIV-infektie en wat bijdraagt tot auto-immune ziekten. Er is ook bewijsmateriaal voor het feit dat Th17-cellen kunnen reageren op specifieke met het microbioom geassocieerde bakterieën zoals Prevotella. Inderdaad: meerdere rapporten hebben microbioom-wijzigingen bij M.E./CVS geïdentificeerd [Shukla SK, Vernon SD et al. Changes in Gut and Plasma Microbiome following Exercise Challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS One (2015) 10: e0145453 /// Giloteaux L, Hanson MR et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Navaneetharaja N et al. A Role for the Intestinal Microbiota and Virome in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)? J Clin Med (2016) 5:55 /// Nagy-Szakal D, Hornig M et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44].

Regulerende T-cellen (Tregs) hebben als taak het onderdrukken van auto-immune en buitensporige chronische inflammatoire responsen. Onze bevinding dat Tregs verhoogd zijn bij M.E./CVS-patiënten is consistent met onze andere resultaten omtrent het feit dat er een chronische aktivatie (met nog te identificeren stimuli) van belangrijke T-cel subsets blijkt te zijn. Gestegen Tregs bij patiënten kan een weerspiegeling zijn van de verstoring van de Th17 en Th1/Th2 cytokine balans, suggestief voor een belangrijke ontwrichting van de homeostatische handhaving van immuun-responsen. Inderdaad, bv. het evenwicht tussen Th17-cellen en Tregs is ook cruciaal voor de regulering van inflammatie, bijzonderlijk gerelateerd met de darm en het microbioom. Opmerkelijk is dat we een correlatie vonden tussen Th17- en Treg-cellen bij M.E./CVS-patiënten en dat de verhouding zelfs meer significant verschillend was bij patiënten t.o.v. controles. Deze bevindingen onthullen potentiële biomerkers die kunnen worden aangewend bij toekomstige klinische interventies om het microbioom en de mucosale immuun-responsen terug in evenwicht te brengen. Bij toekomstige studies zal het ook belangrijk zijn verder (meer gedetailleerd) de onderdrukkende capaciteit van de verschillende subsets van Tregs te onderzoeken en, zoals bij andere subsets, de mechanismen te identificeren die leiden tot hun stijging bij M.E./CVS.

In onze analyse bleek een andere T-cel subgroep die zeer verschillend was, zowel fenotypisch als funktioneel, de MAIT-cellen. MAIT-cellen reageren selektief op een brede waaier aan bakterieën die beschikken over het biosynthetisch mechanisme voor riboflavine-metabolisme. Een studie vond significante veranderingen wat betreft de frequentie van CD8+ MAIT-cellen bij Multipele Sclerose en patiënten met ernstige M.E./CVS [Cliff JM, Nacul L et al. Cellular Immune Function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol (2019) 10: 796]. We zagen geen significante veranderingen van de frequentie MAIT-cellen (als percentage van PBMCs of T-cellen), wat te wijten kan zijn aan het feit dat deze T-cel subset zeer variabel is en tot 40 maal kan verschillen, zelfs bij gezonde mensen, en dat de meesten van onze patiënten-groep niet als ernstig ziek werd gekenmerkt. We zagen echter sterke verschillen qua funktie en differentiatie-toestand van MAIT-cellen bij M.E./CVS, zoals gedaalde aanmaak van cytokinen (IFNγ, IL-17) of de cytotoxische molekule Granzyme-A, en een toegenomen proportie CD27-negatieve CD8+ MAIT-cellen, wat correleerde met hun lagere overleving in cultuur met IL-7 in vitro. Gezien het feit dat MAIT-cellen specifiek worden geaktiveerd door riboflavine (vitamine-B2, metaboliet geproduceerd door bakterieën), redeneren we dat deze verstoring in MAIT-cellen ook geassocieerd kan zijn met verschillen in de samenstelling van het microbioom van de patiënten. Inderdaad: we toonden dat MAIT-cellen kunnen reageren op een waaier aan microbioom-gerelateerde bakterieën en dat een mogelijke funktie is: het harmoniëren of waarnemen van het microbieel ecosysteem van de mucosale weefsels. Er zijn ook artikels die tonen dat de ontwikkeling en expansie van MAIT-cellen ook direct afhankelijk is van het microbioom. In één artikel tonen de auteurs dat CD4CD8 (dubbel negatieve, of DN) MAIT-cellen een funktioneel verschillende subset zijn die door de huid migreert (bij muizen) en mogelijks betrokken is bij weefsel-herstel. Dus is het interessant om op te merken dat we bij M.E./CVS verschillen qua CD8+ observeerden maar niet in DN MAIT-cellen, suggererend dat deze verschillende nakomelingen of subsets zijn. Te samen genomen is het denkbaar dat een verstoring van het microbioom resulteert in chronische aktivatie van MAIT-cellen en een toestand van uitputting bij M.E./CVS-patiënten, wat gelijkaardig is met wat werd gezien bij de Th17-subset [zie Cliff JM et al. hierboven].

Ten slotte was ons ‘machine-learning’ klassificatie-model op basis van immune parameters, in staat de M.E./CVS-patiënten te identificeren met een hoge sensitiviteit en accuraatheid, gebruikmakend van alle 65 kenmerken, alle 40 significant-verschillende kenmerken en de 10 kenmerken van deze 40 significant-verschillende met de hoogste score. We zagen voor alle patiënten zagen we een hogere waarde qua sensitiviteit dan qua specificiteit, wat er op wijst dat het deel patiënten dat werd geïdentificeerd als M.E./CVS-patiënten hoger is dan gezonde controles die correct worden geïdentificeerd als zijnde gezond. Een mogelijke reden daarvoor kan verband houden met kenmerken zoals leeftijd, die er voor zorgt dat de immuun-profielen van oudere individuen meer gaan lijken op die van M.E./CVS-patiënten, en waardoor het RF klassificatie-model gezonde controles gaat klassificeren als patiënten. Momenteel is de diagnose van M.E./CVS gebaseerd op enkel klinische symptomen en geeft aanleiding tot vals-positieven en -negatieven. Een klassificatie-model op basis van immuun-profielen kan een objectieve oplossing voor een betere diagnose zijn maar bijkomend onderzoek bij grotere en meer diverse klinische groepen zal nodig zijn om de mogelijke klinische bruikbaarheid van een dergelijke benadering na te gaan.

Tot besluit: onze bevindingen openen een opwindend pad voor de ontwikkeling van een set biomerkers die kunnen worden aangewend om te helpen bij de diagnose en het stratificeren van de patiënten-populatie voor doelgerichte of precisie-geneeskundige therapeutica.

januari 5, 2020

Veranderd T-cel metabolisme & cytokine-verbanden bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 8:28 am
Tags: , , , , , , , , , ,

Hier volgt een studie door de groep van Prof. Maureen Hanson, ondersteund door het ‘M.E./CVS Collaborative Research Network’, een consortium van meerdere instituten en centra van het NIH. De bevindingen suggereren dat specifieke immuun-cellen van mensen met M.E.(cvs) verstoringen vertonen wat betreft de manier waarop ze energie produceren. Deze research biedt bijkomend bewijs voor de rol van het immuunsysteem bij de ziekte.

De onderzoeksgroep rond Donald Staines (uit Australië) publiceerde reeds preliminaire resultaten voor een reductie van de glycolytische reserve (meting die aangeeft hoe dicht de glycolyse – een belangrijke vorm van energie-produktie in de cel – bij het theoretisch maximum van de cel zit) in rustende geïsoleerde NK-cellen (een type immuun-cellen) van M.E.(cvs)-patiënten (referentie – Nguyen T et al. – zie tekst) en dat leidde hen er toe te postuleren dat deze NK-cellen het wellicht moeilijk hebben de glycolyse aan te zwengelen als ze (immunologisch) belast worden of bij stress. Ze besloten dat dit verder dient te worden onderzocht.

Anderen (zie Tomas C et al. in de tekst) vonden ook al verminderde mitochondriale respiratie (“cellulaire ademhaling” in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs; mix van lymfocyten – T-cellen, B-celen & NK-cellen – en monocyten) van mensen met M.E.(cvs) maar geen verschil qua glycolyse.

Men weet echter nog niet hoe het metabolisme van specifieke immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast is bij M.E.(cvs). Daarom werd hier werd het metabolisme onderzocht van CD4 T-cellen (die andere immuun-cellen alarmeren bij invaderende pathogenen) en CD8 T-cellen (die geïnfekteerde cellen aanvallen). Het team van Hanson vond geen significante verschillen wat betreft mitochondriale ademhaling tussen de cellen van gezonde individuen en mensen met M.E.(cvs), in rust of na aktivatie. De glycolyse (een minder efficiënte methode van energie-produktie) bleek echter ontregeld te zijn: vergeleken met die van gezonden, vertoonden CD4 en CD8 cellen van M.E.(cvs)-patiënten een mindere mate van glycolyse. Daarnaast vertoonden M.E.(cvs) CD8 cellen minder glycolyse na aktivatie. Prof. Hanson stelt: “Ons werk toont het belang aan van het bekijken van verschillende types immuun-cellen met verschillende taken, i.p.v. ze allemaal te samen te onderzoeken; dit kan problemen verbergen die specifiek zijn voor afzonderlijke cellen.”

Haar groep bekeek ook de grootte van de mitochondrieën en het membraan-potentiaal, indicatoren voor de gezondheid van T-cel mitochondrieën. Bij gezonde controles en M.E.(cvs)-patiënten bleken deze van CD4 cellen niet significant te verschillen qua grootte of funktie. Deze van CD8 cellen van mensen met M.E.(cvs)-patiënten vertoonden een verlaagd membraan-potentiaal t.o.v. gezonde cellen (in rust en geaktiveerd).

Ook verbanden tussen cytokinen en T-cel metabolisme werden onderzocht. Men vond verschillende, en dikwijls tegengestelde, patronen tussen gezonde cellen en die bij M.E.(cvs). Dit suggereert veranderingen in het immuunsysteem. Daarnaast bleek (onverwacht) dat de aanwezigheid van cytokinen die inflammatie veroorzaken correleerden met een verminderd metabolisme in T-cellen.

————————-

Journal of Clinical Investigation (Pre-print December 2019)

Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients exhibit altered T cell metabolism and cytokine associations

Alexandra H. Mandarano (1), Jessica Maya (1), Ludovic Giloteaux (1), Daniel L. Peterson (2), Marco Maynard (3), C. Gunnar Gottschalk (3) & Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

2 Sierra Internal Medicine at Incline Village, Incline Village, NV, USA

3 Simmaron Research Institute, Incline Village, NV, USA

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een ingewikkelde ziekte waarvan het mechanisme niet is gekend. Er is steeds meer erkenning voor de rol van immuun en metabool dysfunktioneren. M.E./CVS heeft zich historisch gepresenteerd in uitbraken, heeft dikwijls een griep-achtige aanvang en resulteert in inflammatoire symptomen. Patiënten lijden onder ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. Er is weinig bekend omtrent het metabolisme van specifieke immuun-cellen van M.E./CVS-patiënten. Om het immune metabolisme bij M.E./CVS te onderzoeken, isoleerden we CD4+ & CD8+ T-cellen van 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles. We analyseerden de glycolyse en mitochondriale respiratie van rustende en geaktiveerde T-cellen, samen met merkers verbonden met het cellulair metabolisme, en plasma-cytokinen. We vonden dat M.E./CVS CD8+ T-cellen een gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal hebben vergeleken met gezonde controles. Zowel CD4+ als CD8+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vertoonden verminderde glycolyse in rust, terwijl CD8+ T-cellen ook verminderde glycolyse na aktivatie. Bij M.E./CVS-patiënten bleken significante correlaties tussen metingen van het T-cel metabolisme en hoeveelheid plasma-cytokinen die verschilden van de gezonde controles. Onze gegevens wijzen er op dat patiënten een verstoord T-cel metabolisme vertonen dat consistent is met immune veranderingen bij M.E./CVS die het mechanisme achter de ziekte kunnen ophelderen.

Inleiding

[…]

Historisch zijn er wereldwijd clusters van uitbraken van M.E./CVS geweest […]. Om die reden, en de aanvang van de ziekte en de symptomen, is de potentiële identificatie van een pathogeen een research-prioriteit. Desondanks is er nog geen viraal, bakterieel of eukaryoot pathogeen geïdentificeerd als oorzaak voor de ziekte.

Het karakteriseren van het immuunsysteem is een alternatieve methode om mogelijke immune of infektueuze componenten bij M.E./CVS te exploreren. Er is substantieel bewijsmateriaal voor het feit dat het immuunsysteem een rol speelt en ontregeld is. Veel studies hebben de hoeveelheden van cytokinen of immuun-cel subpopulaties onderzocht, dikwijls met tegenstrijdige resultaten. Er werden echter wijzigingen qua cytokinen geïdentificeerd met verloop van de ziekte of tussen patiënten met een verschillende ziektegraad [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1 /// Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc Natl Acad Sci USA. (2017) 114: E7150-E8 /// Patarca R. Cytokines and Chronic Fatigue Syndrome. Ann N Y Acad Sci. (2001) 933: 185-200]. Cytokinen die veranderd bleken, omvatten: TNFα, TGFβ, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-6 & IL-4. Sommige studies rapporteerden ook verschillen qua CD4+ vs. CD8+ T-cellen, regulerende T-cellen en/of geheugen T-cellen bij M.E./CVS-patiënten.

Interessant is ook dat consistent werd gerapporteerd dat Natural Killer (NK) cellen van individuen met M.E./CVS verminderde cytotoxiciteit vertonen vergeleken met NK-cellen van gezonde controles. Er zijn ook meldingen van gedaalde CD8+ T-cel cytotoxiciteit bij M.E./CVS-patiënten, alsook verminderd granzyme-A en perforine in CD8+ T-cellen van patiënten [Brenu EW, Staines D et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 /// Maher KJ, Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Anderen hebben verhoogde gevoeligheid voor dexamethason en verlaagde proliferatie van CD4+ T-cellen gerapporteerd, maar geen verschil qua cel-dood bij CD4+ of CD8+ T-cellen [bv. Visser J et al. CD4 T lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4]. Globaal blijft ons begrip omtrent funktionele stoornissen in M.E./CVS T cellen beperkt.

Omwille van de symptomen van vermoeidheid en post-exertionele malaise, werd degelijk onderzoek uitgevoerd omtrent het metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Er is bewijsmateriaal voor oxidatieve stress en voor verminderd coenzyme-Q10 bij M.E./CVS. Er zijn tegenstrijdige bevindingen aangaande cellulaire mitochondriale inhoud bij M.E./CVS, maar meerdere studies vonden geen verschil qua specifieke mitochondriale complex aktiviteiten. Ons laboratorium rapporteerde eerder dat er geen verband is tussen mitochondriale ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en M.E./CVS, hoewel sommige SNPs correleerden met specifieke symptomen bij patiënten [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2016) 14: 19]. Anderen vonden ook dat er geen klinisch relevante mitochondriale SNPs waren bij M.E./CVS-patiënten.

Er werden meerdere metabolomica-analyses op plasma, serum of urine van M.E./CVS-patiënten uitgevoerd. Deze toonden talrijke differentiële metabolieten behorend tot mechanismen zoals vetzuren-metabolisme, de TCA-cyclus, glucose- en aminozuren-metabolisme. Wijzigingen qua plasma-metabolieten betekenen waarschijnlijk dat het cellulair metabolisme is ook veranderd is bij M.E./CVS.

Metabolisme is cruciaal voor de werking van alle cellen maar is bijzonder noodzakelijk voor de correcte werking van het immuunsysteem. Immunometabolisme, of de studie van hoe het metabolisme van immuun-cellen ten grondslag ligt aan de werking en respons van het immuunsysteem, speelt een rol bij veel ziekten. In het bijzonder: slapende T-cellen vertonen weinig anabool metabolisme [opbouwen van molekulen uit kleinere eenheden; dit vereist energie]. In respons op een immune belasting verhogen T-cellen hun gebruik van oxidatieve fosforylatie, glycolyse en glutaminolyse [omzetting van het aminozuur glutamine], terwijl ze vetzuur-oxidatie verminderen. Deze verschuivingen qua metabolisme vereisen vereisen veranderingen in de oppervlakte-expressie van substraat-transporters. Veranderingen in T-cel metabolisme worden aangedreven door specifieke signalisering-mechanismen en zijn zeer sterk gereguleerd. Gepaste metabole programmas in rust en volgend op een immune belasting zijn essentieel voor optimale T-cel effector funktie, proliferatie en levensvatbaarheid.

Dysfunktie van het immunometabolisme kan bijdragen tot het ontstaan en/of handhaven van ziekte. Verhoogd T-cel metabolisme of aanmaak van reaktieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bijdragen tot inflammatie en/of auto-immuniteit. Omgekeerd kan hypometabolisme, het onvermogen om het metabolisme te verhogen na een immune belasting, een chronische infektie of kanker-progressie helpen onderhouden. Specifiek: chronische infektie kan leiden tot T-cel uitputting, waarbij metabolisme en effector-funkties verstoorden worden.

De karakterisatie van immunometabolisme bij M.E./CVS kan inzicht bieden omtrent het mechanisme van de ziekte, potentiële oorzaken en doelwitten voor behandeling. Er werd eerder mitochondriale dysfunktie in neutrofielen van individuen met M.E./CVS gerapporteerd [Myhill S et al. – gecontesteerd]. Een piloot-studie maakte melding van gedaalde glycolytische reserve in M.E./CVS NK-cellen [Nguyen T, Staines D et al. Reduced glycolytic reserve in isolated natural killer cells from Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients: A preliminary investigation. Asian Pac J Allergy Immunol. (2019) 37: 102-108]. Anderen vonden verminderde mitochondriale respiratie in rustende perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van M.E./CVS-individuen, maar geen verschil qua glycolyse [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. We weten echter nog niet hoe het metabolisme van andere immuun-cellen, zoals T-cellen, aangetast zijn bij M.E./CVS. Daarnaast is de capaciteit van specifieke M.E./CVS immuun-cellen om hun metabolisme te her-programmeren onbekend.

Om T-cel metabolisme en z’n potentiële rol bij M.E./CVS te onderzoeken, probeerden we het metabolisme in M.E./CVS CD4+ & CD8+ T-cellen in rust en na aktivatie te karakteriseren. We verzamelden stalen van 45 gezonde controles en 53 patiënten, waaruit we CD4+ & CD8+ T-cellen isoleerden. We verkregen uitgebreide informatie van elke individu. We testten dan zowel het mitochondriaal metabolisme en de glycolyse in rustende en gestimuleerde T-cellen. We karakteriseerden ook de mitochondrieën en keken naar de hoeveelheid GLUT1 [glucose-transporter; zorgt voor diffusie door celmembranen] van deze cellen. Ten slotte bepaalden we de hoeveelheid cytokinen in plasma van dezelfde individuen en analyseerden onze gegevens wat betreft correlaties.

Resultaten

[eerder voor experten; leken kunnen de bespreking hieronder lezen]

Individuen van de studie-populatie

De individuen werden gerecruteerd via Simmaron Research (Incline Village, Nevada) door Dr. Daniel Peterson en ze voldeden aan de Canadese Consensus Criteria. Er werden 53 M.E./CVS-patiënten en 45 gezonde controles opgenomen in de. De groepen waren gelijkaardig qua geslacht en leeftijd. […] De patiënten hadden een gemiddelde ziekte-duur van 21,7 jaar en de meeste waren langer dan 10 jaar ziek. […]

[…]

CD4+ T-cel mitochondriaal metabolisme is niet veranderd bij M.E./CVS-patiënten

[…]

Om te onderzoeken of de mitochondriale respiratie gewijzigd is gebruikten we een ‘Agilent Seahorse XFe96’ extracellulaire flux analyser [zie ‘Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS] en de Mito Stress Test kit [voor het meten van de mitochondriale funktie]. […] Om de mitochondriale ademhaing in rust te vergelijken, alsook het vermogen van de T-cellen om het mitochondriaal metabolisme na aktivatie te her-modeleren, deden we de Mito Stress Test ook na stimulatie (met anti-CD3/anti-CD28 en IL-2). We bevestigden onze aktivatie-methode via flow-cytometrie (op basis van de aktivatie-merker CD69 [trans-membraan proteïne]). De T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles vertoonden significant verhoogde CD69 fluorescente intensiteit na stimulatie overnacht. […]

Wat betreft de CD4+ T-cellen was er geen significant verschil qua basale mitochondriale ademhaling in rust tussen de groepen. Er was een kleine maar niet significante afname van de maximale respiratie [men bootst een fysiologische “vraag naar energie” na door de respiratoire keten aan z’n maximum capaciteit te laten werken] van de M.E./CVS CD4+ T-cellen t.o.v. controle CD4+ T-cellen, maar niet voor de reserve respiratoire capaciteit. Zowel de maximale respiratie als de reserve respiratoire capaciteit [meting van het vermogen van de cel om te beantwoorden aan de energie-vraag] varieerden sterk (controles & and M.E./CVS) in rust. Er was geen significant verschil qua in proton-lek [overblijvende basale respiratie die niet voor ATP-produktie zorgt; dit kan een teken voor mitochondriale schade zijn]. De ATP-produktie [het aandeel van de basale respiratie dat gebruikt wordt om ATP (energie) aan te maken, de hoeveelheid ATP die wordt geproduceerd door de mitochondrieën om te voldoen aan de energie-behoeften van de cel] in rust was lichtjes gereduceerd in CD4+ T-cellen van patiënten […].

Er was geen significant verschil wat betreft basale mitochondriale respiratie na stimulatie tussen de groepen. Er was ook geen verschil qua maximale respiratie of ATP-produktie. Er was een kleine toename qua reserve respiratoire capaciteit en afname van het proton-lek maar geen van deze beide verschillen was statistisch significant.

CD4+ T-cellen van zowel controles als M.E./CVS vertoonden hogere, hoewel niet-significante, basale en maximale mitochondriale ademhaling na aktivatie t.o.v. rust. In beide groepen was er substantiële variatie in het metabolisme na aktivatie. De ATP-produktie na aktivatie was significant gestegen in de controle CD4+ T-cellen en er was een trend naar toename in M.E./CVS CD4+ T-cellen.

Globaal vertoonden CD4+ T-cellen van patiënten geen significante verschillen wat betreft mitochondriale respiratie, noch in rust, noch na stimulatie. Dit suggereert dat er geen belangrijke defekten zijn qua mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4+ T-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS CD4+ T-cellen geen defekt in hun respons na aktivatie via mitochondriale respiratie te vertonen.

M.E./CVS CD8+ T-cellen vertonen een gedaald proton-lek en ATP-produktie

We analyseerden mitochondriale respiratie in CD8+ T-cellen. In rust was er geen significant verschil voor basaal of maximaal mitochondriaal metabolisme van CD8+ T-cellen tussen de groepen. Het proton-lek was echter significant gereduceerd voor de M.E./CVS-patiënten, suggestief voor verhoogde mitochondriale efficiëntie. De ATP-produktie was lichtjes gedaald maar deze was zeer variabel in beide groepen. Er was geen verschil wat betreft reserve respiratoire capaciteit in rust.

Na aktivatie was er een kleine reductie qua basale mitochondriale respiratie in M.E./CVS CD8+ T-cellen. M.E./CVS CD8+ T-cellen vertoonden ook een kleine maar niet-significante daling qua maximale respiratie. Er was geen verschil in reserve respiratoire capaciteit na aktivatie. Het proton-lek vertoonde een trend naar lagere waarden in gestimuleerde M.E./CVS CD8+ T-cellen, consistent met de afname in rustende cellen. De ATP-produktie was echter significant verlaagd in M.E./CVS CD8+ T-cellen na aktivatie, suggestief voor het feit dat het verminderd proton-lek niet resulteert in verbeterde ATP-produktie.

Het metabolisme van gezonde CD8+ T-cellen vertoonde een kleine verhoging qua basale respiratie van rust naar aktivatie. Daarentegen vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen geen verandering of daling van het basaal mitochondriaal metabolisme na aktivatie t.o.v. rustende cellen. Het zelfde patroon werd gevonden voor maximale respiratie en ATP-produktie. Dus: CD8+ T-cellen zijn wellicht minder in staat het metabolisme te induceren na aktivatie.

Globaal duiden deze gegevens er op dat mitochondriale dysfunktie in M.E./CVS CD8+ T-cellen mogelijk is. Het ontbreken van verhoging van het metabolisme in M.E./CVS CD8+ T-cellen bijkomende verschillen tussen controles en patiënten na aktivatie suggereert een verstoord vermogen om het metabolisme te her-programmeren.

CD4+ T-cel mitochondriale massa en membraan-potentiaal verschilt niet tussen patiënten en controles

Om de mitochondrieën van M.E./CVS T-cellen verder te onderzoeken, wilden we de mitochondriale morfologie en het membraan-potentiaal in T-cellen karakteriseren. Zowel CD4+ als CD8+ T-cellen werden simultaan gekleurd met ‘MitoTracker Green’ (MTG) & ‘MitoTracker Red’ (MTR) CMXRos. MTG geeft de mitochondriale massa [totaal mitochondriaal membraan binnen het dynamisch netwerk van mitochondrieën in de cel] aan, terwijl MTR CMXRos sensitief is voor het mitochondriaal membraan-potentiaal [de lading-gradient over het binnenste mitochondriaal membraan, spanning-verschil tussen buitenste en binnenste mitochondriaal membraan]. De mitochondrieën werden beoordeeld via microscopie, alsook via flow-cytometrie. […]

We zagen geen verschil voor MTG noch MTR CMXRos in CD4+ T-cellen. Zowel in rust en na aktivatie was er een goede kleuring voor de CD4+ T-cellen van patiënten en controles. We zagen geen morfologische verschillen in de mitochondriën in CD4+ T-cellen van patiënten en controles, hoewel de fluorescentie resolutie beperkt is.

Bij flow-cytometrie was er geen significant verschil te zien met MTG voor de CD4+ T-cellen, in rust noch na stimulatie, wat er op wijst dat er geen verschil is in mitochondriale massa in geen van beide toestanden. Er waren ook geen significante verschillen met MTR CMXRos. Op zich lijkt er ook geen verschil te zijn qua mitochondriaal membraan-potentiaal tussen patiënten en controle CD4+ T-cellen.

M.E./CVS CD8+ T-cellen vertonen een gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal

We visualiseerden microscopisch ook de mitochondriale morfologie, massa en membraan-potentiaal van CD8+ T-cellen. We zagen geen verschil in mitochondrieën via MTG. We observeerden echter, zowel in rust als na stimulatie, M.E./CVS CD8+ T-cellen met mitochondriën die waren gekleurd door MTG maar weinig of niet met MTR CMXRos. Daarentegen vertoonden CD8+ T-cellen van gezonde controles co-kleuring, zoals bij de CD4+ T-cellen. We zagen geen observeerbaar verschil in mitochondriale morfologie van CD8+ T-cellen tussen controles en M.E./CVS-patiënten in geen van beide toestanden. Verdere experimenten (elektronen-microscopie) zullen nodig zijn om te onderzoeken of er verschillen zijn die niet detekteerbaar zijn met fluorescentie-microscopie.

We wenden dan flow-cytometrie aan om de fluorescentie van de twee mitochondriale kleurstoffen te kwantificeren in CD8+ T-cellen. Consistent met de microscopische beelden was er geen significant verschil voor MTG bij CD8+ T-cellen in rust. Er was een kleine maar niet-significante toename voor MTG na stimulatie bij zowel controle- als patiënten-cellen. MTR CMXRos was ook lichtjes gestegen in CD8+ T-cellen van controles en M.E./CVS na aktivatie. M.E./CVS CD8+ T-cellen vertoonden echter significant minder MTR CMXRos zowel in rust als na aktivatie. Dus: CD8+ T-cellen van patiënten vertonen geen verschil qua mitochondriale massa (beide toestanden) maar hebben wel een verminderd mitochondriaal membraan-potentiaal vergeleken met controle-cellen.

M.E./CVS CD4+ T-cel glycolyse is gereduceerd in rust vergeleken cellen van gezonde controles

Het tweede belangrijk, hoewel minder efficiënt, energie-producerend mechanisme voor de cel is glycolyse [omzetting van glucose naar lactaat]. Glycolyse speelt een significante rol bij de werking van immuun-cellen en is cruciaal voor T-cel aktivatie. We onderzochten daarom of de glycolyse in T-cellen bij M.E./CVS op een vergelijkbare manier funktioneert als bij gezonde controles. Bijkomend bepaalden we of M.E./CVS T-cellen de glycolyse gepast kunnen stimuleren na aktivatie. We gingen de glycolyse na zowel CD8+ als CD4+ T-cellen in rust en na at rest stimulatie m.b.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser. Voor rustende T-cellen (‘Seahorse Glycolytic Rate Assay’) verkregen we kwantitatieve metingen van de basale glycolyse, compenserende glycolyse [glycolyse na toevoeging van mitochondriale inhibitoren (die de oxidatieve fosforylatie inhiberen) en compenserende veranderingen in de cel induceren om glycolyse te gerbuiken om aan de energie-behoeften te voldoen] en post-2DG verzuring [extracellulaire verzuring niet veroorzaakt door glycolyse of mitochondriale TCA-aktiviteit alsook door residuele glycolyse die niet wordt geïnhibeerd door 2-DG (2-deoxyglucose stopt de glycolyse)]. Door het beperkt aantal cellen die beschikbaar waren voor het testen van de glycolyse na aktivatie, gebruikten we in plaats daarvan een combinatie van molekulen die simultane metingen van de glycolyse en mitochondriale respiratie toeliet. […] Omwille van deze strategie, vergeleken we in gestimuleerde cellen de basale glycolyse, alsook de glycolytische capaciteit, of de glycolyse geïnduceerd door de injektie van oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], en post-2DG verzuring. We maakten geen directe vergelijking tussen compenserende glycolyse en glycolytische capaciteit, maar we waren in staat basale glycolyse tussen rust en aktivatie te vergelijken.

Wanneer we de glycolyse bepaalden in CD4+ T-cellen in rust, was de basale glycolyse significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controle cellen. De compenserende glycolyse was ook significant gedaald in rust in M.E./CVS CD4+ T-cellen. De post-2DG verzuring was lichtjes, maar niet significant verminderd in M.E./CVS CD4+ T-cellen vergeleken met gezonde controles. Interessant: er was geen verschil qua basale glycolyse tussen voor CD4+ T-cellen na stimulatie, suggererend dat de aktivatie voldoende is om de gedaalde glycolyse in rust te boven te komen. Er was echter substantiële variatie qua glycolyse in gestimuleerde M.E./CVS-cellen. Zo ook was de glycolytische capaciteit niet significant verschillend tussen controle M.E./CVS CD4+ T-cellen na aktivatie, ondanks een kleine toename in de cellen van patiënten. De post-2DG verzuring was significant hoger in M.E./CVS CD4+ T-cellen vergeleken met gezonde controles, ondanks het feit dat we een lichte afname zagen in rustende cellen. Dit kan duiden op extracellulaire verzuring uit niet-glycolytische bronnen in geaktiveerde M.E./CVS CD4+ T-cellen. Daarnaast kan dit de kleine toename van de glycolyse in vergelijking met controle-cellen verklaren.

De basale glycolyse steeg bij gezonde controle en M.E./CVS CD4+ T-cellen (van rust naar stimulatie) maar dit verschil was enkel significant in M.E./CVS-cellen. De post-2DG verzuring was niet verschillend in gezonde controle CD4+ T-cellen maar was significant hoger in CD4+ T-cellen van patiënten na aktivatie, suggestief voor verhoogde extracellulaire bronnen van verzuring na stimulatie.

Aangezien de glycolyse afhangt van de opname van glucose via de voornaamste glucose-transporter GLUT1, bepaalden we ook de aanwezigheid van of GLUT1 op het cel-oppervlak d.m.v. flow-cytometrie. Het percentage GLUT1+ cellen was significant gestegen bij gezonde individuen en er was een trend tot toename bij M.E./CVS-patiënten na stimulatie, vergeleken met cellen in rust. Er waren geen significante verschillen qua percentage GLUT1+ cellen tussen gezonde en M.E./CVS CD4+ in rust of na aktivatie. Er was echter een kleine toename van GLUT1+ cellen in M.E./CVS CD4+ T-cellen t.o.v. controles in rust, ondanks de daling qua glycolyse.

M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse is verminderd in rust en na aktivatie

Dan onderzochten we de glycolyse in CD8+ T-cellen. Gelijkaardig met CD4+ T-cellen was de basale glycolyse significant gedaald in M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust. De compenserende glycolyse was ook significant verminderd in M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust. De post-2DG verzuring was gereduceerd, hoewel dit verschil niet significant was. Anders dan onze resultaten voor CD4+ T-cellen, vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen ook significant lagere basale glycolyse t.o.v. gezonde controle CD8+ T-cellen na aktivatie. Er was geen significant verschil qua glycolytische capaciteit of post-2DG verzuring in gestimuleerde CD8+ T-cellen (M.E./CVS vs. controle). We stelden een sterke variabiliteit vast qua glycolytische capaciteit in beide groepen.

Er waren minimale veranderingen qua glycolyse (rust vs. aktivatie) in CD8+ T-cellen (controle of M.E./CVS). Interessant: er was een lichte, niet-significante toename qua post-2DG verzuring in M.E./CVS CD8+ T-cellen na stimulatie, overéénkomstig met de respons die we zagen in M.E./CVS CD4+ T-cellen. De gereduceerde basale glycolyse na aktivatie kan wijzen op een verstoord vermogen van CD8+ T-cellen om glycolyse te her-modeleren na aktivatie, zoals we zagen voor de mitochondriale respiratie.

We kwantificeerden ook GLUT1+ cellen (flow-cytometrie) op M.E./CVS en gezonde CD8+ T-cellen. Zoals bij de CD4+ T-cellen, hadden CD8+ T-cellen van beide groepen een hoger percentage GLUT1+ cellen na stimulatie. Daarnaast waren er weer geen significante verschillen qua GLUT1+ cellen, in rust of na aktivatie. Niettemin was er een kleine afname qua GLUT1+ cellen bij de patiënten (in rust).

Plasma-cytokinen correleren op een unieke manier met het T-cel metabolisme van M.E./CVS-patiënten

Naast PBMCs namen we EDTA-plasma af bij alle individuen. Om de immuun-funktie bij M.E./CVS verder te onderzoeken, w analyseerden de de hoeveelheden plasma-cytokinen in stalen van 37 gezonde controles en 36 M.E./CVS-patiënten […]. Van de 48 gemeten cytokinen/chemokinen, warden er 44 gedetekteerd. […] We vonden geen significante verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voor geen enkele van de 44 gedetekteerde cytokinen.

Hoewel we geen verschillen zagen qua hoeveelheden plasma-cytokinen tussen patiënten en controles, waren we geïnteresseerd om te bepalen of het T-cel metabolisme correleerde met de waarden van plasma-cytokinen of bevragings-gegevens. We bepaalden ook of het T-cel metabolisme verschilde tussen patiënten met of zonder IBS [prikkelbare darm] of inflammatoire darm ziekte (IBD).

We vonden geen significante correlaties tussen T-cel metabolisme en bevragings-gegevens bij M.E./CVS-patiënten of gezonde controles. Daarnaast bleek het T cel-metabolisme niet significant verschillend bij IBS- of IBD-patiënten t.o.v. mensen zonder deze ziekten. We zagen echter wel een aantal significante correlaties tussen plasma-cytokinen en het metabolisme. Zeer interessant: deze correlaties waren uniek bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met de controle-groep. Bij M.E./CVS-patiënten vonden we significante negatieve correlaties tussen basale glycolyse in CD8+ T-cellen, en de hoeveelheden IL-2, IL-8, IL-10, IL-12 p70 & SCGFβ [‘stem cell growth factor beta’]. Geen van deze correlaties waren significant bij gezonde controle-individuen. Omgekeerd: we vonden een significante positieve correlatie tussen basale glycolyse in CD8+ T-cellen en IL-9. Dezelfde trend was aanwezig bij gezonde in controles maar dit was niet significant. De compenserende glycolyse van rustende CD8+ T-cellen bleek significant negatief correlerend met M-CSF [‘macrophage colony-stimulating factor’] en TNFα. Interessant was dat tegengestelde trends werden vastgesteld bij gezonde controles. Na stimulatie correleerden in CD8+ T-cellen van patiënten de post-2DG verzuring en glycolytische capaciteit allebei negatief met de hoeveelheid M-CSF. Bij gezonde controles kwamen dezelfde verbanden voor maar deze waren niet significant. Aangezien veel van deze cytokinen pro-inflammatoir zijn, is het verrassend dat ze correleren met gedaald metabolisme in M.E./CVS CD8+ T-cellen.

Er waren vier significante correlaties tussen cytokinen en metingen van het metabolisme bij controles, voornamelijk in geaktiveerde CD4+ T-cellen. De basale mitochondriale respiratie en maximale respiratie van gestimuleerde CD4+ T-cellen waren positief gecorreleerd met het pro-inflammatoir cytokine IL-17. Daarentegen waren bij M.E./CVS-patiënten deze correlaties niet-significant en de maximale respiratie was negatief geassocieerd met IL-17. Er was een significante negatieve correlatie tussen plasma IL-9 en geaktiveerde basale respiratie van CD4+ T-cellen, welke niet aanwezig was bij M.E./CVS-patiënten. Ten slotte was er een significante negatieve correlatie tussen de reserve mitochondriale respiratoire capaciteit in rustende CD8+ T-cellen en GCSF bij gezonde controles, maar niet bij M.E./CVS-patiënten. Globaal vertoonden mensen met M.E./CVS en gezonde controles unieke correlaties tussen plasma-cytokinen en het T-cel metabolisme, wat een verdere indicatie is voor immune veranderingen bij M.E./CVS.

Bespreking

T-cellen bleken eerder al betrokken bij M.E./CVS (funktie-testen en karakterisatie van oppervlakte-merkers). De cluster-uitbraken van M.E./CVS, de ziekte-aanvang en immuun-gerelateerde symptomen suggereren allemaal een infektueuze trigger. Gewijzigde cytokine-profielen, gedaalde NK-cel cytotoxiciteit en succesvolle behandelingen impliceren verder het mechanisme. In onze studie-populatie zagen we bewijs voor immune betrokkenheid bij M.E./CVS. Van de 53 M.E./CVS-patiënten rapporteerden er 41 een gekende virale infektie of een virus-achtige ziekte als trigger voor hun ziekte. M.E./CVS-patiënten hadden een hogere prevalentie van gastro-intestinale symptomen of aandoeningen, wat eerder al werd gerapporteerd en gelinkt met veranderingen qua darm-bakterieën [Giloteaux L, Hanson MR et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30 /// Nagy-Szakal D et al. Fecal metagenomic profiles in subgroups of patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2017) 5: 44]. Bovendien ondersteunt de toegenomen co-morbide diagnose bij patiënten of van familieleden met immuun-gerelateerde aandoeningen, een rol voor het immuunsysteem en potentiële genetische voorbestemdheid voor de ziekte.

Onze studie-populatie was evenwichtig qua geslacht, wat ons toeliet T-cellen te karakteriseren bij zowel mannen als vrouwen. […] Onze studie-groep omvatte voornamelijk patiënten met langdurige ziekte, wat niet verrassend is, gezien het feit dat de gemiddelde tijd tot de diagnose die wordt gemeld bijna zeven jaar bedraagt. Een analyse van het T-cel metabolisme van patiënten met korte vs. lange ziekte was dus niet mogelijk in deze studie, maar een toekomstig onderzoek met meer patiënten met ziekte van kort duur zou bijkomend inzicht kunnen verstrekken.

Op basis van het bewijsmateriaal voor een dysfunktioneel immuunsysteem bij M.E./CVS-patiënten en de toenemende erkenning voor de rol die het immuun-metabolisme speelt bij de werking van T-cellen, wilden we het metabolisme van M.E./CVS CD4+ & CD8+ T-cellen onderzoeken. Een eerdere studie [zie Tomas C et al. hierboven] vond gedaalde mitochondriale respiratie in M.E./CVS PBMCs t.o.v. gezonde controles, maar onze studie is het eerste specifiek onderzoek van het T-cel metabolisme bij M.E./CVS. We karakteriseerden de twee voornaamste energie-producerende mechanismen, oxidatieve fosforylatie en glycolyse, in cellen en hun onderliggende cellulaire componenten. Onze studie van mitochondriale respiratie vond geen dysfunktie van het mitochondriaal metabolisme in M.E./CVS CD4+ T-cellen, noch enige moeilijkheid omtrent het verhogen van de respiratie in respons op aktivatie. De brede variatie bij veel van de metingen voor het metabolisme was verwacht, maar beperkte differentiatie tussen patiënten- en controle-cellen. Onze voornaamste beperking was de grootte van de groep, vooral wat betreft de experimenten met overnacht stimulatie. Zoals verwacht en eerder aangetoond, vonden we een verhoogde mitochondriale respiratie in CD4+ T-cellen van zowel M.E./CVS-patiënten als gezonde controles na aktivatie. Er waren ook geen verschillen qua mitochondriale massa of membraan-potentiaal tussen CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Verrassend: er was geen significante stijging qua mitochondriale massa na aktivatie, wat eerder werd aangetoond. Dit kan verband houden met de gebruikte stimulatie-methodes. Het is het vermelden waard dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MitoTracker ook sterk varieerde in alle populaties.

In CD8+ T-cellen zagen we enkel een significante reductie qua proton-lek in rust bij M.E./CVS-cellen vergeleken met gezonde controles. Een verminderd proton-lek zou verhoogde mitochondriale respiratoire efficiëntie suggereren, maar toch waren de basale respiratie, maximale respiratie en ATP-produktie niet significant verschillend in CD8+ T-cellen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Na aktivatie zagen we een gelijkaardig fenotype. Als geheel verhoogden M.E./CVS CD8+ T-cellen hun basale respiratie niet in dezelfde mate als cellen van gezonde controles na stimulatie, suggestief voor een stoornis van het vermogen tot metabole her-programmering.

Ons onderzoek van mitochondrieën in CD8+ T-cellen via beeldvorming onthulde een significante reductie qua mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS CD8+ T-cellen, zowel in rust als na aktivatie. Dit was verrassend gezien de afname van het proton-lek dat we zagen in patiënten-cellen, Maar wordt niettemin ondersteund door andere observaties van hypo-metabolisme in immuun-cellen bij M.E./CVS [bv. Mensah FFK, Armstrong CW et al. CD24 Expression and B cell maturation shows a novel link with energy metabolism: potential implications for patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Front Immunol. (2018) 9: 2421]. Bovendien had een subgroep M.E./CVS CD8+ T-cellen meer mitochondriale massa dan gezonde controle-individuen in rust. CD8+ T-cellen van zowel gezonde controles als M.E./CVS-patiënten vertoonden de verwachte toenames qua mitochondriale massa en membraan-potentiaal na aktivatie, hoewel dit verschil niet significant was en niet volstond om het gereduceerd mitochondriaal membraan-potentiaal in M.E./CVS-cellen te boven te komen. In feite was het verschil qua mitochondriaal membraan-potentiaal groter na overnacht stimulatie. Dit kan een verstoorde metabole respons na aktivatie en grotere observeerbare verschillen qua mitochondriale respiratie in gestimuleerde cellen helpen verklaren. Er werd gedaald mitochondriaal membraan-potentiaal gezien na chronische virale infektie, en dit is een courant kenmerk van of T-cel uitputting.

Bij zowel CD4+ als CD8+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten vonden we significante dalingen van de basale glycolyse en compenserende glycolyse in rust. Interessant is dat eerder al gedaald plasma-glucose bij M.E./CVS werd gerapporteerd [Germain A, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol Biosyst. (2017) 13: 371-9. Verminderingen qua glucose-metabolisme, zonder overéénkomende verhogingen qua mitochondriale respiratie, duiden op hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Na stimulatie was er geen significant verschil wat betreft CD4+ T-cel basale glycolyse of glycolytische capaciteit, wat er op duidt dat aktivatie voldoende is om defekten in de glycolyse in rust te boven te komen. M.E./CVS en controle CD4+ T-cellen verhoogden allebei de glycolyse (rust naar aktivatie) zoals verwacht, wat weer suggereert dat M.E./CVS CD4+ T-cellen in staat zijn tot gepaste metabole her-programmering. In tegenstelling daarmee vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen nog significant gedaalde basale glycolyse vergeleken met gezonde controles na aktivatie. Samen met onze bevindingen in CD8+ T-cellen over mitochondriale respiratie na aktivatie, ondersteunt dit een verstoring van de metabole respons op aktivatie in CD8+ T-cellen bij M.E./CVS. Niettemin waren er minimale wijzigingen wat betreft glycolyse in CD8+ T-cellen van patiënten of gezonde controles in rust vs. geaktiveerde toestand.

In zowel CD4+ als CD8+ T-cellen was het percentage GLUT1+ cellen verhoogd na stimulatie, zoals eerder werd getoond in T-cellen. Er waren geen significante verschillen tussen patiënten en controles. Er was een lichte toename qua percentage CD4+ GLUT1+ cellen bij M.E./CVS (t.o.v. controles). Er was echter een kleine afname van het percentage GLUT1+ cellen bij de M.E./CVS CD8+ T-cellen in rust vergeleken met controles, wat consistent is met de verminderde glycolyse in rust. Een eerdere studie omtrent T-cel uitputting toonde gestegen, in plaats van gedaalde, GLUT1 bij verstoorde glycolyse. Daarnaast kan glucose worden aangewend voor alternatieve mechanismen die niet worden gemeten met de Seahorse bepalingen.

Wanneer we al onze gegevens analyseerden wat betreft correlaties, vonden we significante correlaties tussen hoeveelheden plasma-cytokinen en metingen van het T-cel metabolisme, die uniek waren bij M.E./CVS-patiënten in vergelijking met controles. M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse vertoonde meerdere significante correlaties met cytokinen die bekend staan als pro-inflammatoir of als groeifactoren. Het is bijzonder interessant gezien de gedaalde basale glycolyse die we zagen bij M.E./CVS-patiënten. Bijzonderlijk IL-2 zou worden verwacht glycolyse in T-cellen te induceren, in plaats van glycolyse te verstoren. Er zou kunnen worden verwacht dat pro-inflammatoire cytokinen positief gecorrelereerd zijn met T-cel metabolisme, maar ze bleken negatief gecorrelereerd met het T-cel metabolisme bij M.E./CVS-patiënten. Bij gezonde controles was het pro-inflammatoir cytokine IL-17 positief gecorrelereerd met basale en maximale respiratie in gestimuleerde CD4+ T-cellen. Interessant: dezelfde verbanden vertoonden negatieve trends bij M.E./CVS-patiënten.

Andere cytokinen die van belang kunnen zijn, vertoonden uniek verbanden met M.E./CVS en controle T-cel metabolisme. IL-10, dat ook negatief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse, is een immunosuppressief cytokine dat eerder werd gelinkt met chronische infektie, immuun-cel uitputting en inhibitie van T-cel aktivatie. Bij deze voorbeelden zou verminderd T-cel metabolisme worden voorspeld zodat een negatieve correlatie met glycolyse in M.E./CVS CD8+ T-cellen wordt verwacht. Niettemin is de afwezigheid van deze correlatie bij gezonde controles opvallend. IL-9, dat positief gecorrelereerd was met M.E./CVS CD8+ T-cel glycolyse, is een T-cel groeifactor maar heeft complexe effekten. Bij borstkanker-patiënten leidden IL-9 producerende Th9-cellen tot verbeterde CD8+ T-cel cytotoxiciteit, wat een toename qua cellulair metabolisme zou vereisen. IL-9 was negatief gecorrelereerd met de basale respiratie van geaktiveerde CD4+ T-cellen bij gezonde controles, wat verband zou kunnen houden met verbetering van de funktie van regulerende T cellen door IL-9. Cytokinen aangemaakt door andere immuun-cellen of T-cel subsets worden ook gesekreteerd in het plasma en droegen bij tot onze metingen. Niettemin vertoonden M.E./CVS CD8+ T-cellen meerdere negatieve correlaties tussen het metabolisme and plasma-cytokinen daar waar positieve correlaties kunnen worden verwacht. Dit suggereert dat het verband tussen pro-inflammatoire cytokinen in plasma en T-cel metabolisme gewijzigd is bij M.E./CVS-patiënten en impliceert specifieke cytokinen voor verder onderzoek bij M.E./CVS. Het is duidelijk dat het immuunsysteem een rol speelt bij M.E./CVS. Onze gegevens wijzen er op dat er reductie qua rustend T-cel metabolisme bij patiënten bestaat. In het bijzonder: CD8+ T-cellen vertonen een gewijzigd mitochondriaal membraan-potentiaal en een verstoring van hun metabole respons op aktivatie. CD4+ en CD8+ T-cellen vertonen beide significante dalingen qua glycolyse. Dit hypo-metabolisme in T-cellen ligt in dezelfde lijn als andere bevindingen aangaande hypo-metabolisme in M.E./CVS-cellen. Bovendien lijken M.E./CVS-patiënten veranderde verbanden te vertonen tussen plasma cytokine-hoeveelheden en T-cel metabolisme, waarbij pro-inflammatoire cytokinen onverwacht correleren met hypo-metabolisme. Een dergelijke ontregeling kan aangeven dat M.E./CVS T-cellen responsiviteit voor sommige pro-inflammatoire cytokinen hebben verloren. Tesamen met een hypo-metabolisme in immuun-cellen, is dit consistent met een aanhoudende infektie, hoewel een dergelijk agens nog niet werd geïdentificeerd. Om vooruit te komen zal het bepalen van het mechanisme achter een hypo-metabolisme in M.E./CVS T-cellen hoge prioriteit moeten krijgen, alsook het nagaan van hoe een gewijzigd metabolisme de funktie van deze cellen beïnvloedt.

Methodes

Studie-populatie

M.E./CVS diagnose door Dr. Daniel Peterson (Simmaron Research in Incline Village, Nevada) op basis van vragenlijsten zoals de SF-36 & ‘Bell Scale’, inventaris van specifieke symptomen en bijkomende vragen (bv. co-morbiditeiten en familiale geschiedenis).

Afname ne verwerking van stalen

[…]

Isolatie van immuun-cellen

[…]

Extracellulaire flux analyse

[…] Seahorse XFe96 […] Seahorse ‘Mito Stress kit’, Seahorse ‘Glycolytic Rate Assay’ (oligomycine, FCCP, rotenon/antimycine-A, 2-DG). Aktivatie: stimulatie met STEMCELL ImmunoCult™ (anti-CD3 & anti-CD28), plus IL-2. [zie hierboven] […]

Flow-cytometrie

[…]

Confocale microscopie

[…]

Analayse van plasma-cytokinen

[…] 48 cytokinen & chemokinen (‘Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel’) […]

Statistiek

[…]

november 23, 2019

Rol voor auto-immuniteit, neuro-inflammatie & ‘small-fibre’ neuropathie bij FM & CVS

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 9:06 am
Tags: , , , , , , ,

Neuro-inflammatie, auto-immuniteit, ‘small-fibre’ neuropathie – allen reeds geïmpliceerd bij M.E.(cvs) en aanverwanten – worden hieronder geïncorporeerd in een nieuwe kijk op/ concept voor fibromyalgie. Er is speciale aandacht voor gelijkenissen/verschillen met M.E.(cvs) – zijn de twee aandoeningen dan toch nauwer verwant dan gedacht of ook weer niet??? – en de mogelijke gevolgen na vaccinatie…

————————-

International Journal of Molecular Sciences (2019)

Neuroimmunology: What Role for Autoimmunity, Neuroinflammation, and Small Fiber Neuropathy in Fibromyalgia, Chronic Fatigue Syndrome, and Adverse Events after Human Papillomavirus Vaccination?

Ryabkova VA1, Churilov LP2,3, Shoenfeld Y4,5

1 Laboratory of the Mosaic of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg 199034, Russian Federation

2 Laboratory of the Mosaic of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg 199034, Russian Federation

3 Saint Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology; Saint-Petersburg 191036, Russian Federation

4 Laboratory of the Mosaic of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg 199034, Russian Federation

5 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, affiliated to Tel-Aviv University School of Medicine, Tel-Hashomer 52621, Israel

Samenvatting

Fibromyalgie is een aandoening die wordt gekenmerkt door chronische wijdverspreide pijn en symptomen zoals vermoeidheid, dysautonomie, en cognitieve en slaap-stoornissen. De pathogenese en behandeling blijven het onderwerp van discussie. We benadrukken de rol van drie mechanismen – auto-immuniteit, neuro-inflammatie & ‘small-fibre’ neuropathie. Het is geweten dat deze mechanismen nauw verbonden zijn (ook op molekulair niveau) en dit overzicht overweegt de implementatie van dit verband bij het zoeken naar therapeutische opties. We schenken ook aandacht aan Chronische Vermoeidheid Syndroom, dat met fibromyalgie overlapt, en stellen een concept voor van “auto-immune hypothalamopathie” voor de pathogenese. Ten slotte analyseren we de molekulaire mechanismen die aan de basis liggen van de neuro-inflammatoire achtergrond bij de ontwikkeling van nadelige gebeurtenissen na HPV-vaccinatie en suggereren dat neuro-inflammatie, die de ontwikkeling van symptomen volgend op HPV-vaccinatie zou kunnen verergeren (hoewel dit fel ter discussie staat), als een model voor de pathogenese van fibromyalgie.

1. Inleiding

Fibromyalgie (FM) wordt door de Wereld Gezondheid Organisatie erkend onder de ICD-10 code M79.7 en gedefinieerd als een aandoening met chronische wijdverspreide pijn geassocieerd met vermoeidheid, slaap- en cognitieve stoornissen, en een waaier aan somatische symptomen. De focus lag gedurende lange tijd op pijn, wat toe te schrijven is aan de klassificatie-criteria van de ‘American College of Rheumatology’ (ACR) uit 1990. Deze criteria vereisen de aanwezigheid van chronische wijdverspreide pijn gedurende meerdere maanden, alsook van minstens 11 van 18 specifieke ‘tender-points’. FM is echter veelzijdig van aard, zoals wordt weerspiegeld in de ACR diagnostische criteria uit 2010, die de definitie van FM wijzigde van een “door perifere pijn gedefinieerde ziekte” naar een “systemische symptoom-gebaseerde ziekte”. De ACR-2010 criteria legde ook een wijdverspreide pijn index vast, die de beoordeling van ‘tender-points’ verving en numerieke beoordeling van 41 mogelijke somatische symptomen vereiste, met individuele beoordeling van de ernst van de 3 belangrijke symptomen vermoeidheid, slaap-verstoring en cognitieve stoornissen. De symptomen die bij FM worden gerapporteerd omvatten (naast chronische wijdverspreide pijn en gevoeligheid) diffuse stijfheid, prikkelbare darm syndroom, vermoeidheid/moeheid, denk- of geheugen-problemen, spier-zwakte, hoofdpijn, buik-pijn/krampen, gevoelloosheid/tintelingen, duizeligheid, slapeloosheid, depressie, bekken-pijn, vaginale pijn, misselijkheid, zenuwachtigheid, borst-pijn, troebel zicht, koorts, droge mond, jeuk, hijgende ademhaling, Raynaud’s fenomeen, netelroos, oor-suizen, braken, maagzuur, mond-zweren, verlies/verandering van smaak of, verminderde reuk-zin, aanvallen, droge ogen, kortademigheid, huid-uitslag, gevoeligheid voor zonlicht, hoor-moeilijkheden, makkelijk kneuzingen oplopen, haar-verlies, frequent urineren, pijnlijke urinering en blaas-spasmen, orthostatische intolerantie en temporomandibulair gewricht [kaak] dysfunktie. Een gemodificeerde versie van de 2010 criteria werd vervangen door de schatting (door een arts) van de hoeveelheid somatische symptomen en zes zelf-gerapporteerde symptomen (vermoeidheid, denk-/geheugen-problemen, niet-verkwikkende slaap, pijn of krampen in de onderbuik, depressie en hoofdpijn) – wat het makkelijker te gebruiken maakt en de sensitiviteit behoudt. De Canadese richtlijnen voor de diagnose en het management van FM (2012) erkennen dat de criteria voor de diagnose, zoals ontwikkeld door het ACR, voornamelijk bedoeld waren voor research-doeleinden. Deze richtlijnen definiëren FM als “een aandoening die kan groeien en afnemen met verloop van tijd en waarvan de diagnose dient gesteld bij een individu met diffuse pijn die zich voordeed gedurende de laatste drie maanden, en die ook in meer of mindere mate symptomen zoals vermoeidheid, slaap-verstoring, cognitieve verandering, stemmingstoornis en andere somatische symptomen vertoonde, en wanneer de symptomen niet kunnen worden verklaard door één of andere ziekte”. Er zijn geen ‘tender-point’ onderzoek of bevestigende laboratorium-testen vereist bij deze definitie. De nieuwste ACTTION [Analgesic, Anesthetic and Addiction Clinical Trial Translations Innovations Opportunities and Networks] – APS [American Pain Society] taxonomie diagnostische criteria voor FM (2016) zijn gelijkaardig met de Canadese richtlijnen (2012) wat betreft het gebruik-gemak in de klinische praktijk. Deze criteria vereisen slechts pijn op meerdere plaatsen (6/9 lichaamsgebieden, gedurende de laatste drie maanden) en slaap-problemen óf vermoeidheid, als matig tot ernstig beoordeeld (geen score) door een gezondheidszorg-professional. Deze criteria beklemtonen daarnaast de rol van milieu-sensitiviteit bij FM door het op te nemen in vier courante kenmerken (samen met gevoeligheid, dyscognitie [‘fibro-mist’] en musculoskeletale stijfheid), wat kan worden gebruikt om de diagnose van FM te ondersteunen. Ter zelfder tijd is het ontbreken van specifieke biomerkers een gekende zwakte en de eliminatie van het ‘ tender-point’ onderzoek bij de moderne criteria maakt het stellen van de diagnose van FM nog meer subjectief.

2. Pathogenese van FM: auto-immuniteit

Meerdere kenmerken van FM wijzen op een auto-immune component in z’n pathogenese. Zowel trauma als infektie, die in staat zijn auto-immuniteit te triggeren, behoren tot de meest courante gebeurtenissen voorafgaand aan het begin van FM. Er zijn gegevens omtrent de rol van verscheidene pathogenen die bekend staan als risico-factoren voor verschillende auto-immune ziekten (Epstein-Barr virus, Herpes simplex virus, hepatitis virus C, Borrelia burgdorferi, enz.) in de etiologie van FM [bv. Buskila D et al. Etiology of fibromyalgia: The possible role of infection and vaccination. Autoimmun. Rev. (2008) 8: 41-43]. In sommige gevallen kan FM in de tijd gerelateerd zijn aan vaccinatie, siliconen borst-implantaten of injektie van minerale olie als onderdeel van een auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten (ASIA syndroom) [bv. Agmon-Levin N, Shoenfeld Y et al. Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia following immunization with the hepatitis B vaccine: Another angle of the ‘autoimmune (auto-inflammatory) syndrome induced by adjuvants’ (ASIA). Immunol. Res. (2014) 60: 376-383]. Zoals vele andere auto-immune ziekten, wordt FM gekenmerkt door het feit dat meer vrouwen het hebben, maar dat varieert met de verschillende criteria-sets en methodologie die worden gebruikt bij epidemiologische studies; wellicht ook omwille van bias, met een vrouw/man-verhouding variërend van 1,5:1 tot 10:1. Met betrekking tot deze gender-bias, bleken serum prolactine [hormoon] -waarden significant hoger bij FM-patiënten vergeleken met controles. Er werd ook een significante positieve correlatie vastgesteld tussen prolactine-waarden en vermoeidheid. Het verband van FM met B58, DR5 & DR8 HLA-allelen veronderstelt waarschijnlijke genetische voorbestemdheid voor het auto-immuun proces. Overéénkomstig daarmee werd bij FM-patiënten een hogere prevalentie gevonden wat betreft meerdere auto-immune ziekten, zoals Reumatoïde Artritis, Systemische Lupus Erythematosus, ankyloserende spondylitis [Ziekte van Bechterew; gewrichtsontsteking van de wervelkolom], Sjögren’s syndroom, vasculitis [inflammatie van bloedvaten], polymyositis [chronische inflammatoire spierziekte gekenmerkt door spierzwakte en ontsteking van het spierweefsel], spondylartritis, inflammatoire darm-ziekten, coeliakie [chronische darm-aandoening door gluten-intolerantie] & diabetes mellitus type-1. Aktivatie van het adaptief immuunsysteem bij FM wordt ondersteund door het immuun-cel profiel van de patiënten (een toename van alle B-lymfocyten subsets, CD4+CD25low geaktiveerde T-lymfocyten en CD4+HLA-DR+ geaktiveerde T-lymfocyten, samen met dalingen qua CD4+CD25high T-lymfocyten en NK-cellen). Er bleken meerdere auto-antilichamen (AAb) gestegen in de sera van FM-patiënten, inclusief tegen 5-hydroxytryptamine, gangliosiden en fosfolipiden. In een groep van 20 vrouwelijke patiënten met primair fibromyalgie-syndroom hadden 55% AAb tegen gladde spieren en 40% tegen gestreepte spieren, t.o.v. geen bij voor leeftijd gematchte gezonde vrouwen. Gegeven geven aan dat FM gepaard kunnen gaan met subklinische stadia van auto-immune ziekten zoals Hashimoto thyroïditis & Sjögren’s syndroom. In meerdere studies bleken anti-thyroperoxidase (TPO) AAb positief geassocieerd met FM, zelfs bij patiënten zonder Hashimoto’s thyroïditis en hypothyroïdisme. In de subgroep FM-patiënten met Sicca syndroom [auto-immune aandoening waarbij kerato-conjunctivitis (= gelijktijdige ontsteking van het hoornvlies en oog-bindvlies) en droge mond samen voorkomen; synoniem voor Sjögren’s syndroom] en/of xerostomie [droogte in de mond], testten 32% positief voor Sjögren’s syndroom AAb en 26% positief voor enkel de vroege Sjögren’s syndroom merkers.

3. Pathogenese van FM: neuro-inflammatie

Neuro-inflammatie krijgt meer aandacht in verband met FM. Er moet worden gezegd dat neuro-inflammatoire mechanismen als belangrijke links worden beschouwd in de pathogenese van vele chronische pijn aandoeningen, waarschijnlijk door het triggeren van centrale sensitisatie. Analyse van 92 met inflammatie gerelateerde proteïnen in het cerebrospinaal vocht (CSV) en in plasma leverde bewijsmateriaal voor neuro-inflammatie en chronische systemische inflammatie bij FM [Bäckryd E et al. Evidence of both systemic inflammation and neuroinflammation in fibromyalgia patients, as assessed by a multiplex protein panel applied to the cerebrospinal fluid and to plasma. J. Pain Res. (2017) 10: 515-525]. Eén van deze proteïnen, die significant verhoogd waren in CSV en plasma, is het chemokine CX3CL1 (ook bekend als fractalkine [chemokine betrokken bij chronische pijn; zie ‘Gliale aktivatie in de hersenen bij fibromyalgie]). Het is een link met het signalisering-mechanisme dat verondersteld wordt het meest prominente te zijn in experimentele modellen voor neuropathische pijn [Clark AK et al. Inhibition of spinal microglial cathepsin S for the reversal of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2007) 104, 10655-10660]. Oplosbaar fractalkine wordt vrijgesteld door uiteinden van primaire afferenten en omringende ruggemerg-neuronen d.m.v. cathepsine-S. Morfolinureum-leucine-homofenylalanine-vinyl sulfon-fenyl (LHVS), een onomkeerbare inhibitor van cathepsine-S, bleek de verhoging van fractalkine te stoppen. Interessant is dat behandeling met LHVS experimentele auto-immune encefalitis bij muizen – een dier-model voor Multipele Sclerose – voorkomt of verlicht. LHVS of anti-fractalkine antilichamen waren in staat tot stand gebracht pijn-gedrag bij ratten met collageen-geïnduceerde artritis (het dier-model voor een andere auto-immune ziekte, Reumatoïde Artritis) om te keren, maar vertraagde de ontwikkeling van de klinische tekenen van de ziekte niet. Met betrekking tot pathofysiologische mechanismen werden in dit model de hypersensitiviteit voor mechanische druk en microgliale respons significant verlicht, zowel met LHVS als anti-fractalkine antilichamen. Inhibitie van fractalkine met anti-fractalkine antilichamen verbeterde experimentele auto-immune myositis [spierontsteking] in het muizen-model. Ter zelfder tijd bleek LHVS neuroprotectieve effekten te hebben bij muizen na een traumatisch hersen-letsel, wat dikwijls eindigt in het verduurzamen van symptomen die courant zijn bij FM, en dit voor meerdere maanden. Het mechanisme voor de immunomodulerende effekten van LHVS werd vastgesteld. Cathepsine-S controleert de proteolyse van de met ‘major histocompatibility complex’ (MHC) II geassocieerde onveranderlijke keten, wat een eerste vereiste is voor antigen-peptide binding van MHC-II. LHVS bleek te zorgen voor de blokkering van de invariante keten verwerking en antigen-presentatie in vitro en in vivo door de inhibitie van cathepsine-S. LHVS kan dus interfereren met de aktivatie van zelf-reaktieve CD4+ T-cellen door auto-antigenen. Overéénkomstig met deze bevindingen, veroorzaakte LHVS een dosis-afhankelijke reductie van Th1-type (IFN), Th2-type (IL-3, IL-5 & IL-13) & Th17-type (IL-17) cytokinen [Baugh M et al. Therapeutic dosing of an orally active, selective cathepsin S inhibitor suppresses disease in models of autoimmunity. J. Autoimmun. (2011) 36, 201-209]. De grootste respons werd echter verkregen voor IFN & IL-17, wat een mogelijke voorkeur voor Th1 & Th17 suppressie aangeeft, door deze cathepsine-S inhibitor. Samenvattend: inhibitie van cathepsine-S combineert regulering van of zowel de neuropathische pijn als de immuun-respons. Deze tweeledige regulering maakt de inhibitie van cathepsine-S tot een veelbelovend doelwit bij de behandeling van FM. [Geaktiveerde microgliale cellen geven cathepsine-S af, dat dan CX3CL1 van neuronen afsplitst; deze oplosbare vorm van het chemokine is aktief bij de stimulatie van microglia (positieve feedback). Chemokinen en cytokinen afgegeven door geaktiveerde microglia produceren een toestand van neuronale hyper-aktiviteit (centrale sensitisatie). In immuun-cellen splits cathepsine-S de onveranderlijke keten, dat een complex vormt met MHC-II molekulen en blokkeert de binding van peptiden. Inhibitie van cathepsine-S verhindert de verwerking van de the onveranderlijke keten, waarbij MHC-II rijping wordt stopgezet.]

Er is bijkomend bewijs voor neuro-inflammatie bij FM. Er werd wijdverspreide aktivatie van microglia (het meest uitgesproken in de mediale en laterale wanden van de frontale en pariëtale kwabben) gedetekteerd d.m.v. positron-emissie tomografie in the cortex FM-patiënten vergeleken met gezonde controles [Albrecht DS et al. Brain glial activation in fibromyalgia – A multi-site positron emission tomography investigation. Brain Behav. Immun. (2019) 75, 72-83]. Hogere subjectieve vermoeidheid-scores bij FM-patiënten waren geassocieerd met een sterker signaal in de anterieure en posterieure middelste cingulate cortexen. Neuro-inflammatie bij FM werd geïnterpreteerd als “neurogeen”, vermoedelijk getriggerd door pijn en stress, en secundair aan begeleidende aandoeningen van FM zoals ‘small intestine bacterial overgrowth’ (een type gastro-intestinale dysbiose [dysbakteriose; microbieel onevenwicht]), vitamine-D deficiëntie en mitochondriale dysfunktie. Opmerkelijk is dat al deze vergezellende aandoeningen zijn gelinkt met auto-immuniteit: ‘small intestine bacterial overgrowth’ en vitamine-D deficiëntie worden beschouwd als factoren die predisponerend zijn voor sommige auto-immune ziekten, en mitochondriale dysfunktie wordt besproken als het gevolg van deze ziekten. In het bijzonder: ‘small intestine bacterial overgrowth’ was geassocieerd met inflammatoire darm-ziekte, Sjögren’s syndroom, voor een gluten-vrij dieet resistente coeliakie en seropositiviteit voor anti-TPO [thyroperoxidase; schildklier-enzyme] AAb. Vitamine-D bleek Multipele Sclerose, systemische sclerose [chronische auto-immuunziekte met verharding van (huid)bindweefsel], auto-immune schildklier-ziekten, Reumatoïde Artritis en primaire biliaire cirrhose [auto-immune lever-aandoening] te moduleren [Rosen Y, Shoenfeld Y et al. Vitamin D and autoimmunity. Scand. J. Rheumatol. (2016) 45, 439-447]. Gelokaliseerde of globale mitochondriale dysfunktie wordt beschouwd als een onveranderlijk kenmerk van auto-immune ziekten en werd gerapporteerd bij Multipele Sclerose, Systemische Lupus Erythematosus, Sjögren’s syndroom & Reumatoïde Artritis. Ongeacht de oorsprong van neuro-inflammatie bij FM, “opent” het echter “de poort” voor immuun-cellen en AAb naar de hersenen. In dit geval zou men kunnen suggereren dat de pathofysiologische relevantie van AAb tegen 5-hydroxytryptamine bij FM (zie hierboven), wat gekarakteriseerd is door lage serotonine-waarden in het serum en een constellatie aan symptomen, typisch is voor serotoninerge abnormaliteiten. Dezelfde suggestie kan worden gemaakt aangaande anti-TPO bij FM. Deze veronderstelling wordt ondersteund door de associatie tussen de diagnose van stemming- of angst-stoornis en anti-TPO seropositiviteit in de algemene bevolking.

4. Pathogenese van FM: ‘Small-Fibre’ Neuropathie

‘Small-fibre’ neuropathie (SFN) is een strukturele abnormaliteit van kleine zenuw-vezels met degeneratie van het distale uiteinde van zenuw-einden [Harte SE; Clauw DJ et al. Reduced intraepidermal nerve fiber density after a sustained increase in insular glutamate: A proof-of-concept study examining the pathogenesis of small fiber pathology in fibromyalgia. Pain Rep. (2017) 2: e590]. De diagnose van SFN werd gesteld in een belangrijke subgroep FM-patiënten via verschillende methodes, inclusief de meest praktische en accurate – huid-bioptie en beoordeling van de intra-epidermale zenuw-vezel densiteit (IENFD) [bv. Oaklander AL et al. Objective evidence that small-fibre polyneuropathy underlies some illnesses currently labeled as fibromyalgia. Pain (2013) 154: 2310-2316]. Een IENFD lager dan 5 percentielen, wat leidt tot een diagnose van SFN, werd gedetekteerd bij 30-76% van de FM-patiënten. Hoewel de pathogenese van SFN bij FM nog niet goed werd bestudeerd, werd een significante omgekeerde correlatie tussen IL-2R en IENFD gedocumenteerd in één studie. Sommige van de kleine neurale vezels behoren tot de sensor-neuronen, die in staat zijn om neuropeptiden met anti-inflammatoire aktiviteit te produceren en sekreteren in bezenuwde gebieden. Hun gebrekkige IENFD kan inflammatie bevorderen. Een ander bewijs voor de auto-immune aard van SFN bij FM komt van de resultaten van behandeling: intraveneuze toediening van polyclonale immunoglobulinen bleek zeer doeltreffend voor het verbeteren van SFN bij FM-patiënten. Er zijn twee hypothesen aangaande het verband tussen SFN, het immuunsysteem en centrale sensitisatie bij FM. Volgens de eerste is SFN (hoogst waarschijnlijk immuun-gemedieerd) de perifere trigger voor centrale sensitisatie en versterkt daarom pijn. De tweede stelt dat SFN een gevolg is van neuro-inflammatie in het centraal zenuwstelsel. De gestage toename qua glutamaat [excitatorische neurotransmitter] in de insula [deel van de hersenschors waar zintuiglijke prikkels worden samengebundeld] triggert SFN in een dieren-model. Stijging van glutamaat in de hersenen is een typisch kenmerk van neuro-inflammatie en verhoogd glutamaat in de insula, geassocieerd met experimentele pijn, werd gedetekteerd bij patiënten met FM. Samenvattend: SFN is het derde belangrijkste aspect van FM-pathogenese. Het verband tussen SFN en neuro-inflammatie lijkt complex te zijn. Ter zelfder tijd is het zeer waarschijnlijk dat SFN van auto-immune aard is bij FM.

5. Chronische Vermoeidheid Syndroom en FM

Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) (ICD-10-CM R53.82 of G93.3 indien post-viraal) is een heterogene ziekte die zich aandient met uitgesproken invaliderende vermoeidheid zonder verlichting door rust, slaap-verstoring en cognitieve problemen. De complexiteit van deze aandoening blijkt uit de autonome, neuro-endocriene en immune manifestaties. Er werd substantieel bewijsmateriaal voor de rol van auto-immuniteit bij CVS gerapporteerd. Dit omvat: (1) genetica gerelateerd met wijzigingen van het immuunsysteem; (2) associatie van de start van de ziekte met de risico-factoren die courant zijn voor auto-immune ziekten; (3) verandering van de subsets immuun-cellen; (4) co-morbiditeit met andere auto-immune ziekten; (5) de aanmaak van AAb [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609 /// Blomberg J et al. Infection Elicited Autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: An Explanatory Model. Front. Immunol. (2018) 9: 229-249 /// Perez M, Klimas NG et al. Genetic Predisposition for Immune System, Hormone, and Metabolic Dysfunction in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: A Pilot Study. Front. Pediatr. (2019) 7: 206]. Van de verschillende AAb-types trok een groep AAb tegen G-proteïne gekoppelde receptoren [betrokken bij signaal-overdracht] de meeste aandacht. Er werd hogere waarden van AAb tegen M1, M3 en M4 acetylcholine receptor (AChR) en β2 adrenerge receptor (AdR) gevonden bij CVS-patiënten in vergelijking met controles [Loebel M, Fluge Ø et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52, 32-39]. Hun pathofysiologische relevantie wordt ondersteund door klinisch bewijs, inclusief de verwijdering van anti-β2 AdR en anti-M3/M4 AChR AAb bij CVS en snelle symptoom-verbetering na immuun-adsorptie [Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove β2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS ONE (2018) 13: e0193672]. Niettegenstaande het feit dat FM veel kenmerken met CVS deelt, verschillen ze in termen van de overheersende vermoeidheid en post-exertionele malaise. Het bewijs voor de dysfunktie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as bij CVS is substantieel, terwijl de gegevens omtrent z’n dysfunktie bij FM controversieel zijn. Immuun-inflammatoire mechanismen bleken mogelijks ten gronde te liggen aan de hypo-funktie van de HPA-as bij CVS. Neuro-inflammatie is een courant kenmerk van CVS én FM. De aktivatie van microglia bij CVS werd geobserveerd via positron-emissie tomografie en de signalen in de amygdala, thalamus en het midden-brein correleerden positief met de cognitieve stoornis score; in de cingulate cortex en thalamus positief met de pijn-score; en in de hippocampus met de depressie-score [Nakatomi Y et al. Neuroinflammation in Patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: An 11C-(R)-PK11195 PET Study. J. Nucl. Med. (2014) 55: 945-950]. Naar ons weten was CVS de eerste waarbij een auto-immune chronische hypothalamitis werd gehypothiseerd (Zaichik & Churilov). Een dieren-model voor CVS gecreëerd via immunisatie met synthetische analogen van virale polyribonucleotiden demonstreerde tekenen van neuro-inflammatie, gliale aktivatie en serotonine-heropname-transporter falen. De ontwikkeling van stoornissen van de werking van het hypothalamus-hypofyse-bijnier systeem werd ook gerapporteerd bij dit model. In het bijzonder: een afname van de adrenocorticotroop hormoon sensitiviteit van bijnier-cellen en suppressie van het negatieve feedback mechanisme. Terwijl sommige researchers geen verschillen vonden tussen de waarden van anti-neuronale AAb bij CVS en gezonde individuen, en anderen zelfs een daling van AAb tegen het gliaal fibrillair zuur proteïne [GFAP; strukturele component van het cytoskeleton] vonden in de sera van CVS-patiënten, wat gecorreleerd was met verslechteringen van de ziekte en de aanwezigheid van Epstein-Barr virus.

Hoewel zowel mest-cellen [Hatziagelaki E, Theoharides TC et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Metabolic Disease or Disturbed Homeostasis due to Focal Inflammation in the Hypothalamus? J. Pharmacol. Exp. Ther. (2018) 367, 155-167] en het aangeboren immuunsysteem werden beschouwd als triggers voor de focale inflammatie in de hypothalamus bij CVS, moet de rol van het adaptieve immuunsysteem ook overwogen worden. AdR en muscarine AChR komen tot expressie in de hypothalamus en reguleren de aktiviteit van de HPA-as en het sympatho-adrenaal systeem. Het concept van “auto-immune hypothalamopathie”, dat het resultaat is van de funktionele effekten van anti G-proteïne gekoppelde receptoren AAb op de AdR en muscarine AChR, lijkt redelijk bij CVS. Het vermogen van serum AAb tegen de muscarine AChR om het cholinergisch systeem van het brein aan te tasten, werd bewezen d.m.v. positron-emissie tomografie. Het verband tussen drie belangrijke links voor de FM-pathogenese (auto-immuniteit, neuro-inflammatie en ‘small-fibre’ neuropathie) wordt samengevat [De hyper-stimulatie van het immuunsysteem, naast de genetische aanleg, verhoogt het risico op inbreuken tegen de ‘self’-tolerantie. Neuro-inflammatie bij FM werd geïnterpreteerd als “neurogeen” vermoedelijk getriggerd door pijn en stress, alsook secundair aan FM-vergezellende aandoeningen (‘small intestine bacterial overgrowth’, vitamine-D deficiëntie en mitochondriale dysfunktie), die ook gelinkt zijn met auto-immuniteit. Ter zelfder tijd bestaat er een relatie in twee richtingen tussen auto-immuniteit en SFN, alsook tussen SFN neuro-inflammatie.]. Deze pathologische mechanismen lijken ook betrokken bij de pathogenese van CVS, wat veel gemeenschappelijk heeft met FM. We postuleren echter dat de eerste gekenmerkt wordt door de specifieke betrokkenheid van de hypothalamus (“auto-immune hypothalamopathie” of “hypothalamitis”).

6. Humaan Papillomavirus vaccinatie en FM

Vaccinatie is een grote verwezenlijking van het publiek gezondheidsysteem. Vaccins kunnen echter nevenwerkingen hebben, zoals bij elk ander therapeutisch middel. Zoals de bijwerkingen van andere medicijnen, manifesteren nevenwerkingen van vaccinatie zich hoogstwaarschijnlijk bij individuen met een genetische voorbestemdheid. De bijwerkingen die werden gerapporteerd volgend op humaan papillomavirus (HPV) vaccinatie omvatten hoofdpijn, veralgemeende vermoeidheid, orthostatische intolerantie, duizeligheid, verstoorde manier van gaan, slaap-problemen, een verminderd vermogen om te leren, geheugenverlies, slik-problemen, afasie, hyperventilatie, koude benen, pijn in/ zwakte van de ledematen, beven, koorts, spierpijn, myositis of spierzwakte, gewrichtspijn en/of artritis, problemen met gastro-intestinale beweeglijkheid en verstoorde menstruatie. Hoewel het moeilijk is deze aandoening te categoriseren binnen een specifieke diagnose, bleek uit een studie op basis van de ACR-2010 vragenlijst (die de diagnose van FM toeliet en de ernst ervan vaststelde) dat 53% van individuen die een chronische ziekte na vaccinatie tegen HPV rapporteerden, voldeden aan de diagnostische criteria voor FM [Martínez-Lavín M et al. HPV vaccination syndrome. A questionnaire-based study. Clin. Rheumatol. (2015) 34: 1981-1983]. Het is belangrijk om aan te geven dat, als een reaktie op onafhankelijke publicaties van gevallen met gelijkaardige symptomen na HPV-vaccinatie door Deense en Japansese auteurs, international gezondheid-authoriteiten in meerdere studies aangaande deze kwestie hebben voorzien.

Het ‘European Medicines Agency’ oordeelde dat er geen verband was tussen het vaccin tegen HPV en de ontwikkeling van complex regionaal pijn syndroom of posturale orthostatische tachycardie. Reviews uitgevoerd door Britse, Canadese en Spaanse gezondheid-authoriteiten ondersteunden de veiligheid van immunisatie tegen HPV. Een krachtig argument dat naar voor werd gebracht door de verdedigers van dit vaccin was dat de grote, dubbel-blinde, gerandomiseerde pre-klinische studies de veiligheid van het HPV-vaccin garandeerden [Martínez-Lavín M. HPV Vaccination Syndrome: A Clinical Mirage, or a New Tragic Fibromyalgia Model. Reumatol. Clin. (2018) 14, 211-214]. Deze gerandomiseerde studies hebben een hogere betrouwbaarheid in de ‘evidence-based’ wetenschappelijke geneeskunde en elimineren gevallen die niet gerelateerd zijn met de vaccinatie op zich. De resultaten zijn totaal onafhankelijk van het oordeel van de researchers. Er werd echter ook een kritische review van gerandomiseerde testen en post-marketing gevallen gepubliceerd. Er werd door Martínez-Lavín gesuggereerd [zie hierboven] dat als de juistheid van het complex aan symptomen na HPV-vaccinatie in genetisch gevoelige individuen bekrachtigd wordt, het een model voor FM-pathogenese zou kunnen worden. De auteur speculeerde dat SFN en dysautonomie de sleutel-mechanismen kunnen zijn die ten gronde liggen van deze aandoeningen. Er zijn redenen voor dit besluit. (1) In twee verschillende studies werd SFN gedetekteerd bij 17/40 en 20/40 patiënten met neurologische symptomen na HPV-vaccinatie. (2) Bij die patiënten die voldeden aan de criteria voor FM, bestond er een correlatie tussen de ernst van FM (gemeten via de ACR-2010) en de intensiteit van dysautonomie (samengestelde autonome symptoom score, COMPASS-31). Dysautonomie na HPV-vaccinatie kan een gevolg zijn van het auto-immuun proces. Er werd gezocht naar AAb tegen verschillende G-proteïne gekoppelde receptoren in de sera van adolescente meisjes (n = 55) met symptomen van langdurige veralgemeende vermoeidheid, orthostatische intolerantie, chronische regionaal pijn syndroom en cognitieve dysfunktie na HPV-vaccinatie. De serum-waarden van AAb tegen α1 AR, α2 AR, β1 AR, β2 AR, M1 AChR, M2 AChR, M3 AChR, M4 AChR, M5 AChR en de endotheline-receptor bleken significant gestegen bij de gevaccineerde meisjes vergeleken met controles.

Naar onze mening zou aandacht moeten worden besteed aan het tweede aspect van de FM-pathogenese – neuro-inflammatie. Deze component is een aanvulling voor post HPV-vaccinatie fenomenen als een model voor FM-pathogenese. Hoewel acute encefalomyelitis, myelitis, optische neuritis, Multipele Sclerose en encefalitis werden gerapporteerd na HPV-vaccinatie, werd geen significant verband gevonden tussen centrale demyelinisatie, Multipele Sclerose, optische neuritis en HPV-vaccinatie. Cognitieve en neurologische symptomen zijn echter een inherent deel van de nadelige voorvallen die worden gerapporteerd na HPV-vaccinatie. Er zijn gegevens die suggereren dat auto-immune encefalitis wel eens ondergewaardeerd zou kunnen zijn in rapporten betreffende post HPV-vaccinatie fenomenen. In één studie vertoonden 71% van patiënten met neurologische symptomen, die zich ontwikkelden na HPV-vaccinatie, een auto-immuun encefalitis patroon (123I-IMP-SPECT studie). Sommige onder hen hadden AAb tegen ganglion-AChR of gangliosiden, terwijl ongeveer de helft van de patiënten goed reageerde op herhaalde immuun-adsorptie plasmaferese [verwijdering van schadelijke antilichamen] onder steroïden en azathioprine [immuunsuppressivum]. Naast vaccin-antigenen, die de ontwikkeling van AAb gericht tegen het centraal zenuwstelsel [CZS] kunnen veroorzaken (door het molecular mimicry fenomeen), kan de tweede component van HPV-vaccin – aluminium-adjuvanten – ook een neuro-inflammatoire achtergrond induceren bij patiënten die nadelige effekten ontwikkelen volgend op HPV-vaccinatie. Tekenen van een inflammatoir proces in het CZS en de toxiciteit van Al-adjuvant/Al-bevattende vaccins werden in verschillende landen gerapporteerd en zowel muizen-modellen als bij grote dieren (schapen) [Gherardi RK et al. Myalgia and Chronic Fatigue Syndrome following immunization: Macrophagic myofasciitis and animal studies support linkage to aluminum adjuvant persistency and diffusion in the immune system. Autoimmun. Rev. (2019) 18, 691-705]. Zoals werd aangetoond kunnen Al-partikels zich verspreiden van de injektie-plaats naar de lymfeknopen en de hersenen, van waaruit ze niet her-circuleren. Het molekulair mechanisme van neuro-inflammatie veroorzaakt door Al-hydroxide partikels omvat de aktivatie van het NALP3 inflammasoom [zie ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie]. Dit is een proteïnen-complex dat een inflammatoire vorm van cel-dood initieert en de afgifte van de pro-inflammatoire cytokinen IL-1β & IL-18 triggert. Ter ondersteuning van dit mechanisme: IL-1β werd gedetekteerd in zowel immuun-cellen van het brein en neuronen beladen met Al-hydroxide partikels in experimenten bij muizen. De effekten van het Al-adjuvant en het HPV-vaccin Gardasil versus placebo op gedrag-parameters in vrouwelijke muizen werd geëvalueerd. Hoewel de locomotor-aktiviteit [beweging van plaats naar plaats] intact bleef, wezen de resultaten betreffende de ‘gedwongen zwemmen’ test op de ontwikkeling van depressief gedrag bij muizen die werden ingespoten met Al en Gardasil.

Er werd microgliale aktivatie in het CA1 [‘Cornu Ammonis’ met pyramidale cellen (multipolaire neuronen)] -gebied van de hippocampus aangetoond bij met Gardasil geïnjekteerde muizen. Bovendien: anti-HPV antilichamen in de sera van met Gardasil geïnjekteerde muizen vertoonden kruis-reaktiviteit met proteïnen-extract van the muizen-hersenen, wat kan dienen als verder bewijsmateriaal voor de rol van het ‘molecular mimicry’ fenomeen bij de ontwikkeling van het beschreven symptomen-complex na HPV-vaccinatie. In het licht van het voorafgaande, steunen we het concept omtrent het beschouwen van het (fel-bediscussieerd) post-HPV vaccinatie syndroom als een model voor FM-pathogenese [zie Martínez-Lavín M hierboven]. Neuro-inflammatie zou een ondergewaardeerde component kunnen zijn dat courant is voor deze syndromen. Zowel vaccin-antigenen (te wijten aan het ‘molecular mimicry’ fenomeen) als aluminium-adjuvanten (te wijten aan mogelijke verspreiding in de hersenen en inflammatoire effekten) in de HPV-vaccins kunnen betrokken zijn bij de ontwikkeling van neuro-inflammatie die aan de basis ligt van het complex van gerapporteerde symptomen. Dit feit zou in rekening moeten worden gehouden wanneer gerandomiseerde controle-testen met het HPV-vaccin worden geanalyseerd, aangezien de meeste geen echte placebo gebruiken als controle, maar een aluminium-adjuvant.

7. Besluiten

Het bestaan van FM wordt niet langer in vraag gesteld. Inzichten omtrent z’n pathogenese (en mogelijke behandelingen dus) blijven echter beperkt. Ter zelfder tijd benadrukken moderne diagnostische criteria dat FM niet enkel chronische wijdverspreide pijn is, maar een multi-systeem entiteit waarbij enige pathogenese en een constellatie aan neurologische symptomen (inclusief cognitieve, autonome en sensorische stoornissen) betrokken is. Er is voldoende bewijs dat auto-immune factoren een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van FM. Deze omvatten genetische voorbestemdheid voor auto-immune processen, een associatie met meerdere auto-immune aandoeningen en een hoge prevalentie van meerdere AAb en wijzigingen qua immuun-cel subsets. In dit artikel vatten we het verband samen tussen de drie belangrijke links voor FM-pathogenese (auto-immuniteit, neuro-inflammatie en ‘small-fibre’ neuropathie). Eén interessante implicatie van dit verband is de connectie tussen de signalisering-mechanismen van neuropathische pijn en het triggeren van auto-immuniteit. We speculeren hier over de mogelijke implementatie van deze connectie voor de behandeling van FM en benadrukken het voorbeeld van de inhibitie van cathepsine-S of fractalkine.

oktober 30, 2019

Neuro-inflammatie aandoeningen verergerd door milieu-stressoren

Filed under: Immunologie,Neurologie — mewetenschap @ 12:35 pm
Tags: , , , ,

Lange tijd werd de naam Myalgische Encefalomyelitis of zelfs Encefalopathie voor de ziekte afgewezen daar er geen sprake zou zijn van ontsteking of inflammatie. Ondertussen wordt door de meeste onderzoekers en klinici toch al M.E./CVS gebruikt. Wat daar dan wordt mee bedoeld is natuurlijk afhankelijk van de gehanteerde definitie. Maar M.E. raakt dus ingeburgerd. Hieronder wordt de aandoening omschreven als één waar de onderliggende neuro-inflammatie kan verergerd en bestendigd worden door milieu-stressoren. Deze onderzoekers – verbonden aan de Amerikaanse ‘Centres for Disease Control and Prevention’ (CDC) – leggen uit hoe neuro-inflammatie ook kan voorkomen zonder dat een cerebrale pathologie/ degeneratie/ schade aanwezig is. M.E.(cvs) wordt hier voorgesteld als een chronische aandoening “zonder een onderliggende oorzaak of begeleidende neuropathologie”. Een belangrijk deel van de wetenschappelijke literatuur is hen blijkbaar toch ontgaan want er is al bewijsmateriaal voor neuro-inflammatie. Hun uitleg lijkt ons dus niet altijd strokend met de stand van zaken qua wetenschappelijk bewijs maar hoe dan ook is ’t naar ons weten de eerste keer dat vanuit het CDC er in de context van M.E.(cvs) wordt naar verwezen. Een ommekeer? Er lijkt nog een lange weg te gaan als men leest dat er “weinig bewijs” is “dat duidt op therapeutische doelwitten/mechanismen” en dat “preventie de beste strategie” zou zijn…

————————-

Metabolism Vol 100, Supplement (November 2019)

Neuroinflammation disorders exacerbated by environmental stressors

James P. O’Callaghan & Diane B. Miller

Centres for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health, Morgantown, WV 26505, United States of America

[Prof. O’Callaghan is hoofd van het Molekulair Neurotoxicologisch Lab van de West Virginia Universiteit & CDC consultant; mede-auteur van ‘A Logic Model of Neuronal-Glial Interaction Suggests Altered Homeostatic Regulation in the Perpetuation of Neuroinflammation’ (Front Cell Neurosci. 2018) – Prof. Miller was (R.I.P. 2017) hoofd van het ‘Chronic Stress & Neurotoxicology Lab’ van het ‘National Institute for Occupational Safety and Health’]

Samenvatting

Neuro-inflammatie is een aandoening die wordt gekenmerkt door de uitwerking van pro-inflammatoire mediatoren in het centraal zenuwstelsel [CZS]. Neuro-inflammatie dook op als een dominant thema in de hedendaagse neurowetenschap omwille van z’n verband met neurodegeneratieve ziekte-toestanden zoals Alzheimer’s, Parkinson’s & Huntington’s. Hoewel neuro-inflammatie dikwijls geassocieerd bleek met schade aan het CZS, kan het ook voorkomen in afwezigheid van neurodegeneratie, bv. in associatie met systemische infektie. De ‘acute fase’ inflammatoire respons op weefsel-schade of infekties zet door neuro-inflammatie aangestuurd ‘ziekte-gedrag’ [lees hierover meer op onze pagina’s via de zoektermen ‘’ziekte-gedrag’ & glia] in gang, d.i. een constellatie van symptomen gekenmerkt door verlies van eetlust, koorts, spierpijn, vermoeidheid en cognitieve problemen. Ziekte-gedrag gaat typisch gepaard met een inflammatoire respons die snel oplost en dient om het lichaam te laten herstellen tot homeostase. Terugkerende en soms chronische ziekte-gedrag aandoeningen kunnen echter voorkomen zonder een onderliggende oorzaak of begeleidende neuropathologie. Hier herbekijken we Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), Golf Oorlog Ziekte (GWI) & ‘chemo-brein’ als voorbeelden voor dergelijke aandoeningen, en stellen voor dat ze verergerd en misschien geïnitieerd kunnen worden door een waaier aan omgeving-stressoren. Diverse omgeving-stressoren kunnen de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as ontwrichten en bijdragen tot de mate en duur van een reeks door neuro-inflammatie gedreven ziekten.

1. Inleiding

Research op het vlak van de psychoneuro-immunologie toont dat neuro-immune ontregeling diepgaande effekten heeft op neuronale funktie en gedrag. Een breed spectrum symptomen zoals lethargie, anorexie, aandacht-stoornissen en slaap-ontregeling, vormen de basis voor voorbijgaand ziekte-gedrag. Chronische mentale gezondheid kwesties, zoals majeure depressie of cognitieve dysfunktie, kunnen ook afwijkingen wat betreft neuro-immune signalisering inhouden. Op molekulair en cellulair niveau zijn deze symptomen het gevolg van gewijzigde funktie van immuun-cellen in de periferie en het brein die leidt tot upregulering van pro-inflammatoire mediatoren. Dienoveréénkomstig worden gedragsmatige responsen beïnvloed door de grootte-orde en de duur van de expressie van pro-inflammatoire mediatoren in het brein, waar naar algemeen wordt gerefereerd als neuro-inflammatie. Fysiologische neuro-inflammatie (bv. ten gevolge systemische infektie) verdwijnt typisch met verloop van tijd en de homeostase wordt hersteld; persistente ontregeling is echter geassocieerd met chronische of terugkerende gedragsmatige effekten die ten grondslag liggen aan een reeks neurologische ziekten.

2. Het continuüm van neuro-inflammatoire responsen: van acute fase letsel tot neurodegeneratie

Voorbijgaande, door aangeboren immuniteit gemedieerde inflammatie in de periferie (de acute fase respons), te wijten aan mild trauma/ infektie van een wonde, leidt tot neuro-inflammatie die zich manifesteert als ziekte-gedrag. Deze respons is een positief aspect van neuro-inflammatie omdat het weefsel-hermodelering toelaat op de plaats van het letsel en een vertraging van het globaal gedrag, wat energie-behoud en herstel toelaat. Aan het ander eind van het neuro-inflammatie continuüm is er een link van neuro-inflammatoire responsen met neurodegeneratie. Dienoveréénkomstig zit de wetenschappelijke en populaire literatuur vol voorbeelden van een verband van neuro-inflammatie met neurodegeneratieve aandoeningen, zoals Alzheimer’s, Parkinson’s, Huntington’s & Multipele Sclerose. Er zijn echter andere neuro-inflammatoire aandoeningen die kunnen optreden zonder bewijs voor onderliggende neurodegeneratie. Bijvoorbeeld: chronisch ziekte-gedrag aandoeningen lijken in het midden van het neuro-inflammatoir continuüm te liggen, waar neuro-inflammatie persisteert maar zonder een begeleidende neuropathologische onderbouwing. Zoals we hieronder opmerken, hebben dergelijke ziekte-gedrag aandoeningen relatief weinig aandacht gekregen in vergelijking met deze die geassocieerd zijn met neuropathologische ziekten. Onze focus hier zal zijn: het in het voetlicht stellen van voorbeelden van neuro-inflammatoire aandoeningen die zich manifesteren als ziekte-gedrag en suggereren dat milieu-stressoren kunnen bijdragen tot de etiologie van deze aandoeningen.

3. Wat is een omgeving-stressor?

Klassiek vertegenwoordigen stressoren factoren die homeostase veranderen en een verschuiving van het organisme ter herstel van de homeostase voortbrengen. Fysiologisch kunnen deze stressoren deze vormen aannemen: hitte, koude, inspanning, enz. Breder bekeken kunnen agentia en omstandigheden in iemand’s persoonlijk milieu, zoals chemische stoffen (inclusief farmaceutica), infektueuze agentia, ontregelingen van het circadiaans ritme, lawaai en luchtvervuiling, alsook psychologische en sociale stressoren, echter samenkomen om de stressor-omgeving te vormen. Alleen of in combinatie kunnen deze stressoren een impact hebben op de neuro-immune/ neuro-inflammatoire as door werkingen in de periferie, een directe werking op het CZS of door interakties met de HPA-as. Deze effekten kunnen zich, op hun beurt, zelf manifesteren als neuro-inflammatie met de begeleidende symptomen (lethargie, anhedonie, anorexie, depressie & cognitieve dysfunktie), d.i. de constellatie van veel van de kenmerken of van veel van de kenmerken van ‘ziekte-gedrag.

Naast leeftijd en geslacht, dienen stressoren (psychologische & fysiologische) als omgeving-factoren dien kunnen bijdragen tot neurodegeneratieve ziekten en geassocieerde neuro-inflammatie. Er zijn echter weinig gegevens die een rol voor milieu-stressoren bij neuro-inflammatoire aandoeningen, die geen neurodegeneratieve component hebben, te documenteren. Psychologische stress en geassocieerde neuro-inflammatie kan de vatbaarheid voor majeure depressie (MDD) verhogen en MDD blijft één van de enkele erkende langdurige neurologische aandoeningen geassocieerd met pro-inflammatoire mediatoren in afwezigheid van neurodegeneratie. Bewijs voor een rol van neuro-inflammatie en stressoren is echter te voorschijn aan het komen voor andere chronische neurologische aandoeningen.

4. De mogelijkheid van chronische niet-neurodegeneratieve ziekte-gedrag aandoeningen

Een neuro-immune/ neuro-inflammatoire respons op infektie (dikwijls gemodeleerd met bakteriële endotoxinen bij research) vertegenwoordigt wellicht het breedst erkende en fysiologisch adaptief mechanisme dat ziekte-gedrag veroorzaakt. Deze aandoening is voorbijgaand en neemt af met de infektie maar verscheidene componenten van ziekte-gedrag en de onderliggende neuro-inflammatie kan verergerd en bestendigd worden door milieu-stressoren. Onder deze omstandigheden wordt neuro-inflammatie geïnitieerd door een inflammagen [molekule die inflammatie uitlokt], zoals endotoxinen, en houdt aan door de voortgezette aktivatie van de HPA-as door verscheidene stressoren. Sommige van de aandoeningen waarbij deze ontregelde neuro-immune respons betrokken kunnen zijn, omvatten: Chronische Vermoeidheid Syndroom, Golf Oorlog Ziekte en ‘Chemo-brein’. Gegevens over deze aandoeningen, met overlappende symptomen die de onderliggende neurodegeneratie niet weerspiegelen, zullen worden bekeken om mogelijke directe en indirecte initiatie van neuro-inflammatie te verkennen en te illustreren, en hoe milieu-stressoren de HPA-as ‘kidnappen’ om een chronische niet-degeneratieve neurologische aandoening te creëeren.

5. Nabootsing van fysiologische stressoren in het laboratorium met het knaagdier stress-hormoon corticosteron: verslechtering, niet inhibitie van neuro-inflammatoire aandoeningen

Behandeling met het klassiek anti-inflammatoir stress-hormoon, cortisol (CORT) (corticosteron bij knaagdieren), kan neuro-inflammatie en neuro-inflammatoire signalisering – veroorzaakt door blootstelling aan neurotoxinen, het bakterieel endotoxine LPS of het virus-nabootsend polyinosine-polycytidine zuur (PIC), een synthetisch dsRNA – onderdrukken. Paradoxaal is dat de literatuur van dieren-experimenten toont dat voorafgaande behandeling met CORT de neuro-inflammatoire respons op neurotoxische stoffen, organofosfaat acetylcholinesterase-inhibitoren en LPS kan versterken i.p.v. van te onderdrukken. Deze resultaten suggereren dat glucocorticoïden de respons op een neuro-inflammagen ofwel kunnen verbeteren of potentiëren, afhankelijke van het feit of de behandeling gebeurt vóór of na een inflammatoire blootstelling. Verder suggereren ze dat milieu-stressoren die de HPA-as aktiveren neuro-inflammatoire aandoeningen kunnen versterken. Deze observaties zijn reeds toepasbaar op de menselijke toestand. Bijvoorbeeld: terugkerende fysiologische stressoren die CORT doen stijgen, kunnen leiden tot versterkt ziekte-gedrag te wijten aan bakterieel endotoxine of virale inflammagenen. Pesticide-sproeiers of het publiek in ‘t algemeen blootgesteld aan organofosfaten voor de bestrijding van Zika [virus-ziekte] (door het elimineren van de overdragende mug), kunnen een versterkte of langdurige neuro-inflammatie/ ziekte-gedrag ondervinden als ze aan een voorafgaande stressor werden blootgesteld. De chronische multi-symptoom aandoening met kenmerken van ziekte-gedrag die bekend staat als Golf Oorlog Ziekte kan een ander voorbeeld zijn van een stressor-versterkt pro-inflammatoir effekt van blootstelling aan insecticide, in dit geval te wijten aan blootstelling in het kader van de 1991 Golf Oorlog. Ten slotte kan de steeds algemener wordende erkenning dat kanker-chemotherapie kan resulteren in cognitieve deficieten met ziekte-gedrag symptomen, wellicht een onderliggende neuro-inflammatoire respons vertegenwoordigen, één die geïnitieerd wordt door of minstens versterkt door de immunosuppressieve werkingen van de therapie.

6. Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS)

Volgens de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ en rapporten van de ‘National Academy of Medicine’, treft M.E./CVS meer dan 2,5 miljoen Amerikanen. Omwille van de moeilijkheid bij het stellen van de diagnose van deze aandoening, hebben wellicht een extra miljoen of meer de aandoening. M.E./CVS wordt gekenmerkt door vermoeidheid die 6 maanden of langer aanhoudt in afwezigheid van ziekten of andere bijdragende factoren die de aandoening kunnen verklaren. De huidige definitie voor M.E./CVS omvat een uitbreiding van de criteria van Fukuda: met een minimum van 4 van 8 symptomen, inclusief geheugen-stoornissen, pijn, hoofdpijn en verstoorde slaap. De pathofysiologische basis van M.E./CVS blijft onbekend maar de etiologie werd toegeschreven aan een aantal factoren, inclusief blootstelling aan chemische en infektueuze agentia. Zoals bij andere ‘ziekte-gedrag’ aandoeningen, wordt gedacht dat neuro-inflammatoire mediatoren ten grondslag liggen.

Vooruitgang bij het begrijpen van de CVS-pathogenese heeft geleid tot de opheldering van patronen van CVS-biomerker expressie, wat de eerste aanwijzingen voor een molekulaire signatuur voor de aandoening opleverde, inclusief factoren geassocieerd met inflammatie, aktivatie van het immuunsysteem, autonome dysfunktie, neuro-endocriene problemen en gewijzigde funktie in de HPA-as. Verdere diepgaande systeem-biologische analyse heeft meerdere cytokinen (bv. IL-1a, IL-6 & IL-8) geïdentificeerd die kunnen funktioneren als biomerkers van M.E./CVS en een indicatie kunnen geven van de duur en ernst van de ziekte [Russell L, Broderick G et al. Illness progression in Chronic Fatigue Syndrome: a shifting immune baseline. BMC Immunol (2016) 17: 1-11]. Het gebruik van deze biomerkers zal een opportuniteit bieden om de mogelijke blootstellingen/triggers die resulteren in CVS te begrijpen en om doeltreffende behandelingen te ontwikkelen.

Stressoren, zowel psychologische (bv. emotioneel trauma) en fysiologische (bv. inspanning) bleken betrokken als bijdragende factor voor het begin, de ernst en duur van de symptomen van M.E./CVS. Stressor en M.E./CVS-symptomen warden gelinkt aan een toename qua waarden van het stress-hormoon cortisol in het speeksel, ’s avonds afgenomen, alsook verhoogde pro-inflammatoire cytokinen in het serum. Deze bevindingen ondersteunen een rol voor HPA-as dysfunktie waarvan is geweten dat die ook geassocieerd is met depressie en verhoogde inflammatie. Hoewel nog niet oorzakelijk gelinkt, zijn deze globale verbanden van stressor/neuro-immune effekten met de ernst van M.E./CVS consistent met een chronische neuro-inflammatoire aandoening die optreedt in afwezigheid van CZS-pathologie. Suggesties over een betrokkenheid van de hippocampus bij M.E./CVS [Saury J-M. The role of the hippocampus in the pathogenesis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Medical Hypothesis (2016) 86: 30-8] waar een ‘allostatic overload’ [overbelasting van regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel; veroorzaakt een afname van de soepelheid van de adaptatie] homeostatische aansturingen ontwricht op een manier dat hippocampus neurocognitieve stoornissen resulteren in een wisselende homeostatische toestand [Craddock TJA, Klimas NG, Broderick G et al. A role for homeostatic drive in the perpetuation of complex chronic illness: Gulf War Illness and Chronic Fatigue Syndrome. PloS One (2014) 9: e84838], leveren de basis voor het integreren van veel van de symptomen van M.E./CVS via de hippocampus en andere hogere centra van het CZS.

7. Golf Oorlog Ziekte

[…]

8. ‘Chemo-brein’

Cognitieve verstoring volgend op chemotherapie […]

9. Mogelijke therapeutica ter behandeling van chronische ziekte-gedrag aandoeningen

Zoals kan worden opgemerkt op basis van de beschrijvingen van M.E./CVS, GWI en ‘chemo-brein’, zijn dit op symptomen gebaseerde aandoeningen. Als dusdanig blijven de etiologie en pathofysiologie van deze ziekten onbekend. Verder dan een sterke link met verstoorde neuro-immune signalisering, en een verslechtering door milieu-stressoren, bestaat er weinig bewijs dat duidt op therapeutische doelwitten/mechanismen. Selekte immuun-therapieën op basis van kleine molekulen, biologische stoffen of stamcellen werden uitgeprobeerd maar de doelwit-selektie blijft moeilijk en waarschijnlijk te gefocust, gezien de complexiteit van deze aandoeningen. Waarschijnlijk zal preventie de beste strategie zijn, en het erkennen en beperken van de rol milieu-stressors lijkt een doeltreffend beginpunt wat betreft het beperken van de ernst en de duur van deze chronische aandoeningen.

10. Richtingen voor de toekomst

Diagnose en behandeling van neuro-inflammatoire aandoeningen zoals deze die hierboven in het voetlicht werden gesteld, zou voordeel kunnen halen uit een beter begrijpen van de pro-inflammatoire mediatoren die aan de basis liggen van deze en verwante ziekte-gedrag syndromen. Diverse maar overlappende groepen cytokinen en chemokinen zijn gestegen in de hersenen bij dieren-modellen voor deze aandoeningen. We dienen te weten of er courante mediatoren zijn voor deze aandoeningen of dat er onderscheidende pro-inflammatoire mediatoren en hun ‘downstream’ effectoren zijn die een bepaalde aandoening kenmerken. De grote aantallen pro-inflammatoire mediatoren en de mogelijke communicatie-mechanismen ertussen zijn een argument voor de noodzaak om niet alleen over te gaan tot uitgebreide analyses van deze signalisering-molekulen maar het ook een computer-biologische te benaderen, om er betekenis aan te geven en medicinale doelwitten te vinden. Verder dienen we te weten of neuro-inflammatie zich vertaalt naar een voorspelbare manier waarop inflammatoire mediatoren zich in het bloed ontwikkelen, en zelfs of veranderingen in het bloed wijzigingen in de hersenen kunnen voorspellen. Weerom: het is waarschijnlijk dat een computer-benadering antwoorden zal bieden op deze vragen. Terwijl versterkte expressie van cytokinen/chemokinen aan de basis ligt van met neuro-inflammatie gerelateerde symptomen, ten minste in dieren-modellen, is er geen vereiste dat deze mediatoren toegenomen zijn opdat het stress-hormoon ze zou voorbestemmen tot uitgesproken expressie volgend op een inflammatoire uitdaging. Dus: een bestaande neuro-inflammatoire aandoening is geen vereiste voor CORT-‘priming’ [voorbereiding/voorbestemming; zie hierboven] van de neuro-inflammatoire respons op een daaropvolgende inflammatoire belasting. We moeten weten wat de basis is voor de voorbereidende respons. Dit stelt de vraag of een stress-hormoon respons bijdraagt tot neuro-inflammatie en wanneer dit zelfde hormoon verbeterende effekten kan hebben. Zonder antwoorden op deze vragen op molekulair niveau, zal de timing wat betreft toediening van CORT als therapeuticum om neuro-inflammatie te behandelen, een vraag blijven.

11. Besluit

Dit overzicht benadrukt de mogelijkheid dat hersen-inflammatie (neuro-inflammatie) in afwezigheid van hersen-schade het gevolg kan zijn van wisselende blootstellingen/stressoren en dat een geaktiveerde HPA-as de neuro-inflammatie toestand versterkt. Deze uitkomsten toen het potentieel van terugkerende stressoren in het milieu om chronische inflammatoire aandoeningen in sterke mate te verergeren en verlengen. De complexiteit van deze aandoeningen blijft een barrière voor het ontwikkelen van therapeutische benaderingen.

juni 9, 2019

Cellulaire immuun-funktie bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:44 am
Tags: , , , , , , ,

Hieronder volgt nog een artikel van de groep rond Luis Nacul van de Britse M.E./CVS Biobank (UKMEB). Lees o.a. ook: ‘Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)’, ‘Blijvende vereiste voor een accurate M.E.(cvs)-diagnose & -definitie’ & ‘Selektie-bias & mis-klassificatie ondermijnen M.E.(cvs)’.

Er wordt al lang een dysfunktie van het immuunsysteem vermoed bij M.E.(cvs) maar de resultaten van immuun-studies spreken elkaar tegen. In onderstaande studie werd gekeken naar meerdere aspecten van de immuun-funktie van bloedcellen bij een grote groep mensen met de ziekte (waaronder zowat een vijfde die ernstig ziek zijn) en vergeleken met gezonde controles en mensen met Multipele Sclerose.

Er werd gecontroleerd op antilichamen tegen een aantal herpesvirussen (bv. Epstein-Barr) en er werd geen verschil gevonden tussen M.E.(cvs) en controles. Er werd ook gekeken naar immuun-cellen (o.a. T-cellen en NK-cellen). In tegenstelling tot wat andere onderzoekers vonden, bleken er geen verschillen wat betreft NK-cellen (M.E.(cvs) versus controles). Lees de op onze pagina’s besproken artikels over andere studies omtrent ‘Natural Killer’ cellen… Er zijn enkele verschillen (misschien te wijten aan het aanwenden van andere methodologieën en kleinere onderzoeksgroepen). Er wordt echter ook gewezen op het belang van blootstelling aan cytomegalovirus die significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie veroorzaakt.

Er werden ook geen verschillen gevonden in het globaal aantal T-cellen maar wel wat betreft de hoeveelheden van verschillende types T-cellen (M.E.(cvs) versus controles); wat dit betekent moet nog worden onderzocht. De meest betekenisvolle bevinding was het sterk gestegen aantal van een bepaald subtype T-cel, de zgn. ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT), bij de mensen met ernstige M.E.(cvs) t.o.v. controles. Deze bevinding alleen kan echter niet worden aangewend als een diagnostische merker maar het zou daartoe wel kunnen bijdragen, samen met andere factoren. MAIT-cellen worden voornamelijk in de lever, longen en darm gevonden en richten zich tegen cellen die geïnfekteerd zijn met bepaalde types bakterieën. Ze reageren ook op en produceren pro-inflammatoire cytokinen (cel-signalisering proteïnen), die al verhoogd bleken bij M.E.(cvs). MAIT-cellen zijn ook betrokken bij auto-immune ziekten. Het is interessant dat gestegen aantallen MAIT-cellen gezien werden na inspanning bij gezonde individuen. Dit suggereert dat M.E.(cvs)-patiënten een post-exercitionele toestand vertonen in rust. Het is mogelijk dat de toename in MAIT-cellen bij M.E.(cvs) wordt gestuurd door veranderingen van het darm-microbioom, maar dit dient ook nog te worden onderzocht.

De resultaten tonen een gewijzigde immunologische toestand aan bij M.E.(cvs). Het is de eerste keer dat sterk verhoogde aantallen MAIT-cellen bij ME.(cvs) worden gemeld en meer research is nodig om eventueel uit te wijzen of deze bijdragen tot de pathologie van de ziekte.

Ter herinnering: CD4 wordt gevonden op T helper cellen (en monocyten, macrofagen en and dendritische cellen), het is een co-receptor voor de T-cel (TCR) en helpt bij de communicatie met antigen-presenterende cellen. CD8 dient als co-receptor voor the T-cel receptor en komt voornamelijk tot expressie op cytotoxische T-cellen. De zgn. ‘memory’ T-cellen zijn een subset van de T-lymfocyten die infektie en kanker bestrijden die eerder het betreffend antigen zijn tegengekomen, en er dus ‘geheugen’ voor hebben…

————————-

Frontiers in Immunology (Pre-print Mei 2019)

Cellular immune function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

Jacqueline M. Cliff (1), Elizabeth C. King (1), Ji-Sook Lee (1), Nuno Sepulveda (1,2), Asia-Sofia Wolf (1), Caroline Kingdon (1), Erinna Bowman (1), Hazel M. Dockrell (1), Luis C. Nacul (1), Eliana Lacerda (1), Eleanor Riley (3)

1 Immunology and Infection Department, London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM), United Kingdom

2 Centro de Estatistica e Aplicacoes, Faculdade de Ciencias, Universidade de Lisboa, Portugal

3 Roslin Institute, University of Edinburgh, United Kingdom

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met onbekende etiologie, onduidelijke pathofysiologie en zonder beschikbare diagnostische test of biomerker. Veel patiënten melden dat hun M.E./CVS begon na een acute infektie, en een daaropvolgende hogere frequentie van infekties (zoals verkoudheden, griep) is courant. Deze factoren impliceren dat er een immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, ten minsten bij een deel van de patiënten, maar toch bleken eerdere studies aangaande de perifere immuniteit tegenstrijdig en niet éénduidig.

De Britse ‘ME/CFS Biobank’, die bloedstalen verzamelde van 300 klinisch-bevestigde M.E./CVS-patiënten, laat grootschalige studies toe van de immunologische funktie fenotypisch goed-gekarakteriseerde deelnemers. In deze studie werden de herpesvirus serologische toestand, en populaties T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten van 251 M.E./CVS-patiënten onderzocht, inclusief 54 die ernstig aangetast zijn, en vergeleken met die van 107 gezonde deelnemers en46 patiënten met Multipele Sclerose. Er waren geen verschillen qua seroprevalentie voor zes menselijke herpesvirussen tussen M.E./CVS en gezonde controles, hoewel de seroprevalentie voor het Epstein-Barr virus hoger was bij Multipele Sclerose patiënten. In tegenstelling met andere rapporten, werden geen significante verschillen gezien qua aantallen NK-cellen, hoeveelheden subtypes of in vitro responsiviteit tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Anderzijds was het T-cel compartiment veranderd bij M.E./CVS, met gedaalde hoeveelheden effector ‘memory’ CD8+ T-cellen en intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen. Omgekeerd was er een significant verhoogd deel ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) [zie hieronder], in het bijzonder bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten.

Deze abnormalitieiten tonen aan dat een gewijzigde immunologische toestand bestaat bij M.E./CVS, bijzonderlijk bij de mensen die ernstig zijn aangetast. Dit zou eenvoudigweg een lopende of recente infektie kunnen weerspiegelen, of toekomstige verhoogde vatbaarheid voor infektie kunnen aangeven. Er zijn longitudinale studies bij M.E./CVS-patiënten nodig om oorzaak en gevolg, en zodoende potentiële voordelen van immuun-modulerende behandelingen voor M.E./CVS te helpen bepalen.

INLEIDING

[…:] Ondanks de significante vooruitgang, blijft M.E./CVS nog slecht begrepen. Jammer genoeg blijken veel schijnbaar interessante research-bevindingen niet reproduceerbaar, ten dele omwille van de kleine groepen en de ‘cross-sectionele’ aard van veel studies, en de variabiliteit tussen studies wat betreft research-methodes en hun kwaliteit.

Acute virale infekties bleken frequent geassocieerd met de aanvang van M.E./CVS maar er is geen bevestiging van specifieke virale etiologie en er is geen consistent verband tussen persistente of chronische virus-infektie en M.E./CVS. Eén mogelijkheid is dat mensen met M.E./CVS (PWME) vatbaar zijn voor acute virale infekties ten gevolge een onderliggende immuun-dysfunktie. Er werden talrijke immuun-abnormaliteiten, inclusief gewijzigde plasma cytokine-profielen, abnormale T-lymfocyt aktivatie en verstoorde cytotoxische respons, beschreven bij individuen met M.E./CVS maar systematische en observationele studies waren niet in staat om robuuste en reproduceerbare immuun-biomerkers voor ziekte of ziektegraad te identificeren [bv. Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116].

Er zijn een aantal rapporten over inconsistente abnormaliteiten qua ‘natural killer’ (NK) cel funktie. NK-cellen zijn grote granulaire lymfocyten die funktioneren als effectoren van de aangeboren immuniteit die, d.m.v. cytokine-produktie of cytotoxiciteit, infekties (of neoplasieën [vorming van goed- of kwaadaardige gezwellen door cel-vermeerdering]) binnen de perken houden tot een doeltreffende adaptieve respons kan worden opgezet. Individuen met overgeërfde NK-cel aandoeningen zijn zeer vatbaar voor systemische herpesvirus- en andere opportunistische infekties. Directe NK-cel aktivatie volgt op interaktie met cellen waarop ‘major histocompatibility complex’ (MHC [genen die coderen voor membraan-proteïnen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]) klasse-I liganden voor inhiberende NK-cel receptoren ontbreken en/of waarop stress-geïnduceerde liganden voor NK-cel aktiverende receptoren tot expressie komen. Indirecte NK-cel aktivatie treedt op na microbiële ligatie van patroon-herkenning receptoren [binding van bakterie-antigenen op receptoren die bepaalde proteïnen herkennen] […] en wordt gemedieerd door cytokinen (IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α) en contact-afhankelijke stimuli. Er werd meermaals gerapporteerd dat PWME verhoogde, gedaalde of normale aantallen circulerende NK (CD16+ of CD56+ [menselijke NK-cellen kunnen worden onderverdeeld in verschillende populaties op basis van de expressie van de oppervlakte-merkers CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG) & CD56 (neurale cel-adhesie molekule)], CD3[T cel co-receptor die cytotoxische T-cellen en T helper cellen helpt aktiveren]) cellen vertonen; hun NK-cellen zijn naar verluidt ontoereikend [Klimas NG et al. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11] of vertonen versterkte expressie van het cytotoxisch perforine [Brenu EW et al. Pilot study of natural killer cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis. Scand J Immunol. (2016) 83: 44-51]; zijn minder (of onvolledig) in staat MHC klasse-I deficiënte ‘target’-cellen te lyseren [bv. Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]; en vertonen een defekte of geen upregulering van aktivatie-merkers na in vitro stimulatie. Nogmaals: de reproduceerbaarheid van veel van deze studies werd beperkt door hun relatief beperkte grootte, de diverse klinische presentaties van de gevallen of de beperkte mate immunologische karakterisatie.

Belangrijk: slechts één van deze immunologische studies [Rivas JL et al. Association of T and NK cell phenotype with the diagnosis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front Immunol. (2018) 9:1028.] hield rekening met de prevalentie van menselijk cytomegalovirus (CMV) infektie bij gevallen en controles. CMV-infektie laat een permanente voetafdruk op het immuunsysteem na, inclusief oligoclonale expansie [proliferatie afgeleid van één of enkele cellen] en terminale differentiatie [cellen stoppen de celcyclus permanent en brengen genen tot expressie die karakteristiek zijn voor de uiteindelijke funktie van die cellen] van CD8+ T-cellen, en expansie van een subset sterk gedifferentieerde NKG2C+ NK-cellen [NKG2C = membraan-proteïne; binding met z’n ligand HLA-E stuurt de expansie van een subset NK-cellen in respons op virale infekties]; deze NK-populatie wordt verder uitgebreid door latere virale infektie. Het blijft daarom mogelijk dat de gerapporteerde verschillen qua T-cel & NK-cel fenotype en funktionele capaciteit tussen PWME en gezonde controles het resultaat kunnen zijn van verschillen wat betreft de prevalentie van immuun-modulerende virussen zoals CMV. We rapporteren hier over een diepgaande analyse van perifeer bloed leucocyten-fenotype en -funktie bij een klinisch goed-gedefinieerde groep matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-gevallen vergeleken met niet-vermoeide gezonde controles en, ter controle voor verminderde fysieke aktiviteit, mensen met Multipele Sclerose. Alle deelnemers werden gescreend voor serologisch bewijsmateriaal voor infekties met humaan cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), herpes simplex virus 1 (HSV1), Herpes simplex virus 2 (HSV2), varicella-zoster virus (VZV) en humaan herpesvirus (HHV6).

MATERIALEN & METHODES

Recrutering en klinische evaluatie

[…] Alle potentiële deelnemers werden rigoureus beoordeeld om te verzekeren dat ze voldeden aan de definities voor M.E./CVS. […]

Alle deelnemers met M.E./CVS of MS hadden voorafgaandelijk een bevestigde medische diagnose gekregen. […] De PWME werden opnieuw beoordeeld door de klinische research staf op het voldoen aan de Canadese Consensus en/of CDC-1994 (“Fukuda”) criteria (de definities van de studie) [punt van kritiek: de Fukuda definitie vereist geen post-exertionele malaise; anderzijds: we verwachten dat ernstig zieken wel PEM hebben], vóór recrutering. De deelnemers werden uitgesloten al ze (i) 3 maand voorafgaand aan de studie antivirale medicatie hadden genomen die de immuun-funktie wijzigt; (ii) 3 maand voorafgaand aan de studie vaccinaties hadden gekregen; (iii) een voorgeschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekte zoals hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV (maar niet herpesvirus- of andere retrovirus-infektie) hadden; (iv) een andere chronische ziekte zoals kanker, coronaire hart ziekte of ongecontroleerde diabetes hadden; (v) een ernstige stemming-aandoening hadden; (vi) zwanger waren of borstvoeding gaven 12 maanden voorafgaand aan de studie; of (vii) morbide obees (BMI ≥ 40) waren. […] De ernstig zieke deelnemers werden thuis bezocht. […]

Berekening van de statistische ‘power’

404 deelnemers: 251 met M.E./CVS (54 ernstig en 197 matig zieken), 46 met MS en 107 gezonde controles. […]

Afname & verwerking van de stalen

[…]

Fenotypering van de leukocyten

[cultuur / trypaan-blauw vitaliteit-kleuring / fenotypering (flow-cytometrie) of cultuur voor funktionele analyse]

Funktionele testen

[cel-stimulatie / incubatie met antilichamen / flow-cytometrie]

Analyse van de gegevens

De primaire gegevens analyse omvatte vier groepen: mensen met milde/matige M.E./CVS (ME-M), mensen met ernstige M.E./CVS (ME-S), gezonde controles (C) en mensen met Multipele Sclerose (MS). Alle gegevens-analyses werden blind uitgevoerd (groepen geïdentificeerd d.m.v. een code-number; code verbroken enkel nadat alle analyses compleet waren).

[…]

RESULTATEN

Karakteristieken van de deelnemers aan de studie

De uiteindelijke groep omvatte 251 mensen met M.E./CVS (197 mild/matig & 54 ernstig), 46 mensen met MS en 107 gezonde controles. […] Symptomen die typisch verbonden zijn met infektie of inflammatie kwamen frequenter voor en waren ernstiger bij PWME dan bij MS-patiënten, hoewel er milde inflammatie-symptomen aanwezig waren bij bijna 50% van de mensen met MS. De meeste gezonde controle vertoonden geen enkel symptoom (P < 0.0001). De vermoeidheidgraad-scores lagen, zoals verwacht, hoger bij PWME, met een trend voor hogere scores bij de ernstig zieken, gevolgd door mensen met milde/matige M.E./CVS, dan MS-patiënten en gezonde controles met zeer lage vermoeidheid-scores (P < 0.001). De erythrocyten-sedimentatie-snelheid (ESR), een niet-specifieke merker voor inflammatie, was lichtjes verhoogd bij mensen met milde/matige M.E./CVS, en er waren gelijkaardige mediane waarden voor alle andere groepen (P = 0.01). Mensen met MS waren ietsje ouder vergeleken met de andere studie-groepen maar de verdeling per geslacht, deprivatie-index [maat voor de socio-economisch status] en totale witte bloedcellen en lymfocyten was gelijkaardig voor de groepen.

Serologie

De plasma-stalen werden getest (kwantitatieve ELISA) voor zes humane herpesvirussen: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV & HHV6. Er waren geen significante verschillen tussen de groepen qua aantallen individuen die seropositief waren voor deze virussen. De concentraties anti-EBV VCA varieerden echter significant onder de groepen (P = 0.016) en dit was te wijten aan hogere concentraties anti-EBV VCA antilichamen bij de mensen met MS.

Leucocyten-fenotypering

Ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen werden ontdooid en geanalyseerd d.m.v. flow-cytometrie […]. Er werd een ruim leucocyten-venster ingesteld om alle levende cellen te omvatten en daarna een meer beperkend lymfocyten-venster. Binnen het leucocyten-venster werden de monocyten […] en dendritische cellen [DC; antigen-presenterende die antigenen verwerken en deze aanbieden aan T-cellen; ze fungeren als boodschappers tussen het aangeboren en adaptief immuunsysteem] – myeloïde [van het aangeboren immuunsysteem] of plasmacytoïde [sekreteren interferon in respons op virale infektie; circuleren in het bloed en worden gevonden in perifere lymfoïde organen] […] – geïdentifceerd. Binnen het lymfocyten-venster: de T-cellen […], B-cellen […] en ‘natural killer’ (NK) cellen […]. De NK-cellen werden daarna geanalyseerd voor expressie van of NKG2C [zie hierboven], NKp46 [‘Natural cytotoxicity triggering receptor 1’] en CD57 [antigen dat terminaal gedifferentieerde cellen met gereduceerd proliferatie-vermogen identificeert].

Uit een statistische analyse bleek dat er significante verschillen waren tussen de groepen qua hoeveelheden levende leucocyten die monocyten (P = 0.0133), myeloïde DCs (P < 0.0121) en plasmacytoïde DCs (P < 0.0001) waren: deze verschillen waren te wijten aan veranderde frequenties bij de MS-patiënten, en verdwenen na aanpassing voor geslacht, leeftijd en herpesvirus seropositiviteit (niet getoond). In tegenstelling daarmee bleken de hoeveelheden leucocyten die B-cellen, T-cellen of NK-cellen waren, niet significant verschillend tussen de groepen (noch bij aangepaste of niet-aangepaste analyse).

Binnen het lymfocyten-venster waren de hoeveelheden cellen CD4+ T-cellen of CD8+ T-cellen (en, bijgevolg, de CD4/CD8-verhouding) significant verschillend tussen de groepen bij niet-aangepaste analyse (P < 0.0001) en deze verschillen beleven na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren (P < 0.0001). Deze verschillen waren echter volledig te wijten aan de significant hogere hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere hoeveelheden CD8+ T-cellen en dus hogere CD4/CD8-verhouding bij de MS-patiënten; er waren geen significante verschillen qua lymfocyten-distributie tussen ME/CFS-patiënten en gezonde controles. Ook waren er geen significante verschillen tussen de groepen qua absolute aantallen van de verschillende leucocyten- en lymfocyten-populaties.

Een meer gedetailleerde fenotypering van de circulerende T-cel populatie onthulde geen belangrijke verschillen qua verdeling van CD45RA [CD45 = merker voor naïeve T-cellen] en CCR7 [C-C chemokine receptor type 7] -gedefinieerde naïeve en ‘memory’ T-cel populaties. Bij een meer gedetailleerde fenotype-analyse van de CD4+ en CD8+ T-cellen op basis van CD28 [zorgt voor co-stimulatie signalen vereist voor T-cel aktivatie en overleving] en CD57 [zie eerder] naast CCR7 en CD45RA, vonden we dat er geen verschillen waren qua CD4+ T-cel differentiatie subpopulaties bij mensen met M.E./CVS, hoewel er veranderde cel-populatie frequenties waren bij mensen met MS. Er werden echter bescheiden verschillen gezien in meerdere differentiatie-populaties van de CD8+ T-cellen, met een kleine toename van de hoeveelheid EM [effector ‘memory’ (zie onze inleiding)] -cellen […] en een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde cytotoxische effector TEMRA-cellen [effector ‘memory’ T-cel die CD45RA tot expressie brengt] […] bij mensen met M.E./CVS. Er waren ook kleine veranderingen in andere [minder belangrijke] CD8+ T-cel populaties […].

Van groter potentieel belang echter, was dat we – gebruikmakend van TCR Vα7.2 [deel van T-cel recpetor] en CD161 [‘killer’ cel lectine-achtige receptor subfamilie-B, lid-1] om circulerende populaties ‘mucosal associated invariant’ T-cellen (MAIT) te definiëren – zeer significante verschillen zagen tussen de groepen wat betreft de hoeveelheid T-cellen die MAIT-cellen zijn en de hoeveelheid MAIT-cellen die CD8 tot expressie brengen (P < 0.001). Na aanpassing voor mogelijk verstorende factoren, onthulde statistische analyse dat dit te wijten was aan verhoogde hoeveelheden MAIT-cellen (P < 0.001) en bijzonderlijk CD8+ MAIT-cellen, bij mensen met ernstige M.E./CVS t.o.v. gezonde controles (P < 10-5). Belangrijk is echter dat, hoewel de globale hoeveelheden MAIT-cellen niet hoger waren bij mensen met MS dan bij gezonde controles, hun MAIT-cellen ook sterk scheefgetrokken waren naar de CD8+ subset; wat aangeeft dat dit is geen diagnostisch kenmerk voor ernstige M.E./CVS is. ROC-analyse toonde dat de totale MAIT-cel frequentie in de T-cel populatie een zwak vermogen had om patiënten met ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonde controles, maar dat de patiënten met milde/matige M.E./CVS niet door deze meting konden worden voorspeld. Mogelijks belangrijker: de hoeveeheid MAIT-cellen die CD8+ waren, hadden een groter vermogen om ernstige M.E./CVS te onderscheiden van gezonden (AUC 0.756). [ROC-analyse is een statistische methode om de voorspellende waarde van een variabele of instrument te toetsen; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfekte test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed] Overéénkomstig met eerdere rapporten had de overgrote meerderheid van de MAIT-cellen bij alle individuen een ongedifferentieerd (CD28+ CD57 [zie hierboven]) fenotype.

Als we in meer detail kijken naar het fenotype van de NK-cel populatie, zagen we geen significante verschillen qua hoeveelheden CD56bright cellen, verdeling van CD57, CD57+ of CD57++ cellen of hoeveelheden cellen die NKG2C of NKp46 tot expressie brengen, of wat betreft expressie van zes verschillende ‘killer’ cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIR [receptoren op het oppervlak van NK-cellen waarmee ze ‘self’ MHC klasse-I molekulen (KIR-liganden) op het cel-oppervlak herkennen om dan een inhiberend signaal te geven om zo de eliminatie van normale cellen te voorkomen]) (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

T-cel & NK-cel funktie

We vergeleken daarna het vermogen van T-cellen en NK-cellen om te reageren op in vitro stimulatie, van gezonde controles, mensen met MS en PWME. Voor het bepalen van de of T-cel responsiviteit, werden PBMCs gedurende 4 h gecultiveerd met de mitogene cocktail [molekulen die cellen aanzetten tot delen] van PMA en ionomycine, en dan gekleurd voor intracellulaire cytokinen. De hoeveelheid cellen die IL-2, IFN-γ of een combinatie van de twee produceren, werd beoordeeld voor de CD3+ CD4+ en de CD3+ CD8+ cel-populaties maar er werden geen significante verschillen geobserveerd (aangepaste of niet-aangepaste analyse).

De NK-cel funktie werd beoordeeld via het cultiveren van PBMCs gedurende 18 h […]. De CD3/CD56+ NK-cellen werden geïsoleerd en geanalyseerd voor intracellulair IFN-γ, of voor cel-oppervlakte expressie van de aktivatie-merker CD25 [IL-2 receptor α-keten] of de degranulatie-merker CD107a (LAMP-1 [lysosomaal geassociaeerd membraan proteïne 1]). Weerom werden geen significante verschillen gedetekteerd tussen mensen met M.E./CVS en controles, voor geen enkele van de responsen.

Interaktie tussen herpesvirus-infektie toestand en lymfocyten-fenotype en -funktie

Herpesvirus-infektie, vooral infektie met CMV, staat er om bekend zowel het maturatie-fenotype en de funktie van menselijke CD8+ T-cellen en NK-cellen te beïnvloeden. Daarom vergeleken we lymfocyten-fenotype en funktie bij die individuen die seropositief of niet voor CMV waren. In alle studie-groepen hadden deelnemers die CMV-seropositief waren, significant minder CD4+ en meer of CD8+ T-cellen bij hun PBMCs. Na stimulatie met PMA en ionomycine, produceerden meer CD4+ en CD8+ T-cellen IFN-γ, en meer cellen waren IL-2 en IFN-γ dubbel-positief, bij de CMV-seropositieve individuen. Het deel van de PBMCs die CD3+CD56+ (‘NKT-like’) cellen waren, was zeer significant verhoogd bij de CMV-positieve deelnemers. In de NK-cel populatie, waren meer cellen NKG2C+, en er waren gedaalde hoeveelheden CD56dimCD57intermediate en verhoogde hoeveelheden CD56dimCD57bright bij de CMV-seropositieve deelnemers. Bij de CMV-seropositieve individuen was er een verminderde in vitro respons na IL-12 en IL-18 stimulatie, met significant gedaalde CD25, CD107 en IFN-γ expressie.

BESPREKING

In een groep van 250 goed-gekarakteriseerde mensen met M.E./CVS, waaronder een aantal die ernstig ziek zijn, hebben we verschillen geïdentificeerd qua fenotype van perifere immuun-cellen in vergelijking met gezonde controles. Deze omvatten zeer significant verhoogde hoeveelheden ‘mucosal associated invariant’ T-cellen, bijzonderlijk CD8+ MAIT cellen, in PWME t.o.v. gezonde controles, en deze waren verder gestegen bij ernstig zieke individuen. We vonden ook een verhoogd aandeel van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen, een daling van de hoeveelheid terminaal gedifferentieerde effector TEMRA cellen en kleine veranderingen qua CD8+ T-cel differentiatie subcompartimenten bij PWME. De funktionele rol en consequentie van de wijziging binnen deze CD8+ T-cel subpopulaties dient nog te worden bepaald. We vonden geen bewijs voor veranderde funktie van T-cellen bij PWME. Van belang: we vonden geen verschillen qua hoeveelheden NK-cellen bij PWME noch wat betreft differentiatie-toestand, hun expressie van KIR-receptoren of aktivatie-merkers ex vivo of na in vitro stimulatie. Op basis van eerdere rapporten over abnormale NK-cel funktie bij M.E./CVS was dit een onverwachte bevinding, hoewel het consistent is met een klein aantal eerdere rapporten over normale NK-cel hoeveelheden en funktie. In ons systeem, cultiveerden we PBMCs gedurende 18 h om genoeg tijd te geven voor directe en indirect cel-aktivatie: het is mogelijk dat verschillen qua degranulatie of cytokine-produktie worden gezien bij een kortere stimulatie-periode. We vonden echter significante verschillen qua NK-cel differentiatie-toestand en cytokine-produktie bij deelnemers in alle klinische groepen die CMV-positief waren, detekteerbaar na de 18 h cultuur. CMV heeft een dramatisch effekt op NK-cellen en het is mogelijk dat een onzekere CMV-status een verstorende factor was die ten gronde ligt aan eerdere meldingen van NK-cel dysfunktie bij M.E./CVS. Belangrijk: de verschillen die we zagen qua MAIT-cellen en CD8+ T-cellen bij PWME waren consistent wanneer we CMV sero-status in rekening brachten.

M.E./CVS wordt dikwijls beschouwd te worden getriggerd door een acute virale infektie en verscheidene leden van de herpesvirus-familie bleken betrokken. Hier vonden we geen verschil qua prevalentie van de seropositiviteit voor zes herpesvirussen (CMV, EBV, HSV-1, HSV-2, VZV, HHV6) tussen PWME en gezonde controles, noch qua concentratie van aanwezige anti-virus antilichamen. Niettemin blijft de mogelijkheid bestaan dat herpesvirussen belangrijk zijn voor de M.E./CVS-pathogenese, dat virus-reaktivatie een verslechtering van symptomen kan triggeren, en dat meting van antilichaam-titers tegen andere virale antigenen een meer relevante meting kunnen betekenen [Loebel M et al. Deficient EBV-specific B- and T-cell response in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE. (2014) 9: e85387]. Dus: hoewel de sero-prevalentie van EBV niet verschilde tussen MS-patiënten, PWME of gezonde controles, hadden MS-patiënten significant hogere titers van antilichamen tegen EBV ‘Viral Capsid Antigen’, overéénkomstig met eerdere rapporten en een mogelijke aanwijzing voor recente virus-reaktivatie.

De verhoogde frequentie van of CD8+ MAIT-cellen bij individuen met ernstige M.E./CVS die hier werd gezien, werd niet eerder gerapporteerd. In het bijzonder: een klein aantal ernstig zieke M.E./CVS-patiënten had buitengewoon hoge hoeveelheden van deze cellen. Er werd gemeld dat de hoeveelheden perifere MAIT-cellen bij gezonde vrijwilligers verdubbelen na acute inspanning, suggererend dat het perifeer immuun-fenotype in rust bij sommige PWME lijkt op een post-exertionele toestand. Meer opmerkelijk was echter de overweldigende overheersing van CD8+ cellen in de MAIT-cel populatie bij ernstig zieke PWME. Daarenoven: hoewel de globale frequenties van MAIT-cellen niet verschilden tussen MS-patiënten en gezonde controles, waren hun MAIT-cellen ook sterk aangerijkt voor CD8+ cellen, wat een eerder rapport over hoge frequenties CD8+ CD161+ T-cellen bij MS-patiënten bevestigt. MAIT-cellen zijn aangeboren-achtige T-cellen die met vitamine-B gerelateerde antigenen van microben (gepresenteerd in de context van het MHC klasse-I gerelateerd molekule ‘MR1’) herkennen en ook kunnen reageren op cytokine-stimulatie. CD8+ MAIT-cellen zijn in staat geïnfekteerde cellen te doden via perforine/granzyme-sekretie en hebben daarom een beschermende rol bij microbiële infekties, maar ze bleken ook geïmpliceerd bij de pathologie van verscheidene niet-infektueuze ziekten zoals kanker, colitis en auto-immune ziekten zoals Reumatoïde Artritis en type-1 diabetes. Bij MS werden deze cellen beschreven als pro-inflammatoir en pathogeen. Het is mogelijk dat de toename qua MAIT-cellen bij sommige PWME wordt aangedreven door veranderingen in het darm-microbioom of, alternatief, gerelateerd kunnen zijn met andere, nog niet gekarakteriseerde wijzigingen in het immuunsysteem. In toekomstige studies kan het funktioneel fenotype van deze CD8+ MAIT-cellen bij PWME worden nagegaan, om te bepalen of ze misschien bijdragen tot de ziekte-pathologie. Het darm-microbioom bij M.E./CVS dient ook verder te worden onderzocht. Er kan eventueel een biomerker-signatuur worden ontwikkeld voor de diagnose van M.E./CVS: in deze context had het aandeel CD8+ MAIT-cellen in het perifeer bloed op zich een bescheiden onderscheidend maar het zou kunnen bijdragen tot combinatie-factor signatuur. In dit opzicht zal het testen van kandidaat biomerker-signaturen in grote, onafhankelijke, longitudinale validatie-groepen essentieel zijn; bijzonderlijk als we de gemengde rapporten over het biologisch fenotype van M.E./CVS in overweging nemen.

De reden voor de gewijzigde frequenties van verscheidene intermediair gedifferentieerde CD8+ T-cellen bij M.E./CVS is onduidelijk en is waarschijnlijk funktioneel gelinkt met de begeleidende vermindering van effector ‘memory’ CD8+ T-cellen. Aangezien er geen verschil was in de frequentie van of naïeve of terminaal gedifferentieerde CD8+ T-cellen, is het mogelijk dat bij M.E./CVS de cellen snel door deze intermediaire fase naar terminale differentiatie wordt gestuurd en dan verloren gaan via cel-dood. Het studie-ontwerp liet ons niet toe om de interaktie tussen het versterkt MAIT-cel compartiment en de gewijzigde globale T-cel differentiatie status na te gaan: dit kan worden aangepakt in toekomstige studies. De aandrijvende factor achter de snellere transitie naar terminale differentiatie zou een aan de gang zijnde antigen-stimulatie kunnen zijn, mogelijks te wijten aan persistente virale infektie of auto-immuniteit. De gereduceerde effector ‘memory’ T-cel populaties bij PWME kunnen gedeeltelijk de verhoogde vatbaarheid voor infektie, die courant wordt gerapporteerd bij ME./CVS, verklaren.

De hoeveelheden CD4+ en CD8+ T-cellen waren normaal bij PWME. Bij MS-patiënten was er echter een significante verschuiving naar verhoogde hoeveelheden CD4+ T-cellen, lagere CD8+ T-cellen een daardoor een verhoogde CD4+/CD8+ T-cel verhouding. Voorheen waren er tegenstrijdige rapporten bij PWME, met verhoogde of verlaagde CD4+/CD8+ T-cel ratios, hoewel heterogeniteit courant is en mogelijks verstoring door de CMV-infektie status optreedt.

Samengevat: in een grote groep zorgvuldig gefenotypeerde mensen met M.E./CVS, hebben we significante verschillen qua perifere T-lymfocyt fenotypes vastgesteld maar we waren niet in staat eerdere rapporten over verstoord NK-cel fenotype of funktie te bevestigen. Belangrijk: voor deze studie waren individuen met bewijs voor een aan de gang zijnde acute infektie uitgesloten, alsook deze met voor de hand liggende co-morbiditeiten en deze die immuun-modulerende medicijnen nemen. We bevestigden ook dat CMV-seropositiviteit een belangrijke impact heeft op het fenotype en funktie van NK-cellen en T-cellen, wat het opperste belang onderlijnt van het beoordelen van de status van CMV- en andere herpesvirus-infektie bij studies betreffende de menselijke immune toestand. Elk van deze factoren had de analyse van eerdere studies kunnen verstoren. De meest opvallende bevinding van deze studie – de verhoogde hoeveelheid circulerende MAIT-cellen bij mensen met ernstige M.E./CVS, en de zeer grote proportie CD8+ MAIT-cellen bij patiënten met ernstige M.E./CVS en MS – rechtvaardigt verder onderzoek. Deze observatie onderstreept ook het belang van het opnemen van niet-vermoeide individuen met andere invaliderende ziekten (zoals MS-patiënten) in studies omtrent M.E./CVS, om te controleren voor de fysiologische effekten van verminderde lichamelijke aktiviteit. Hoewel men kan discussiëren over het feit of MS-patiënten de meeste geschikte dergelijke groep is, vergemakkelijkt de zeer grote immunologische database voor MS het evalueren van observaties en kan het inzicht verschaffen in de pathogenese-mechanismen van M.E./CVS door vergelijking met een meer uitgebreid gedocumenteerde ziekte.

————————-

Prof. dr Derya Unutmaz (immunoloog) van het ‘Jackson Laboratory ME/CFS Collaborative Research Centre’ – co-auteur van ‘Tuning of human MAIT cell activation by commensal bacteria species and MR1-dependent T-cell presentation’ (Mucosal Immunology (2018) 11, 1591-1605) – speculeerde (‘Nature News Feature’ 3 Januari 2018) dat de inflammatie die wordt gezien bij M.E.(cvs) het resultaat zou kunnen zijn van een probleem bij de T-cel respons op onschadelijke virussen, schimmels en andere stimuli. Een andere co-auteur van dit artikel, Dr. Julie Oh, sprak op de ‘Accelerating Research on ME/CFS Meeting’ (NIH conferentie, 2019) over research naar welke bakterie-soorten/-stammen de aanmaak van die bepaalde T-cellen, MAIT-cellen, zouden kunnen triggeren en hoe die ev. kan worden afgezet. Unutmaz kreeg van het ‘National Institutes of Health’ geld ter beschikking om onderzoek te verrichten bij M.E.(cvs). Publicaties bij M.E.(cvs) zijn er op dit moment nog niet…

mei 25, 2019

Spierpijn en M.E.(cvs) na vaccinatie

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:39 am
Tags: , , , , ,

Vaccinatie is efficient maar de kwestie blijft: is massa-vaccinatie wel zo doeltreffend als algemeen wordt geclaimd. Op onze pagina’s houden we altijd een kritische houding aan, ook wat betreft (zogenaamde beloftevolle en soms gehypte) voorgestelde therapieën. Wanneer het over vaccinatie gaat, worden kritische stemmen echter nogal snel gestigmatiseerd als ‘sektaire anti-vaxxers’ en het zwijgen opgelegd. Dergelijke houding vinden wij zeer onwetenschappelijk. Zoals we al meegaven en zoals hieronder uitvoerig wordt besproken zijn er wel degelijk vragen te stellen bij massale vaccinatie-campagnes. Een minderheid gevaccineerden ondervindt zeker nadelige (soms desastreuze) effekten van een vaccinatie (of de toegevoegde stoffen die de antigeniciteit moeten versterken). We roepen dus niet op tot afschaffing van immunisatie(-campagnes) maar (zoals eerder geopperd) tot (genetische) screening voorafgaand aan vaccinatie bij mensen waarbij nadelige gevolgen kunnen worden vermoed.

De belangrijke mee te nemen punten uit onderstaand artikel zijn: M.E./CVS is multi-factoriële ziekte maar aluminium-bevattende vaccins kunnen een trigger vormen, M.E./CVS kan verbonden zijn met persistentie van intracellulaire aluminium-adjuvanten, dieren-modellen onthullen verspreiding over het lichaam en neurotoxische effekten van aluminium-adjuvanten, er is degelijk wetenschappelijk onderzoek nodig omtrent de veiligheid, en vatbaarheid-genen en co-factoren moeten worden geïdentificeerd. Er moet dan ook aandacht komen voor veiliger adjuvanten.

Het artikel is zeer uitgebreid en alle elementen uit artikel ten gronde uitleggen, zou een cursus immunologie op zich zijn. Mensen die meer uitleg nodig hebben, kunnen ons contacteren. Idem voor geïnteresseerden die de volledige referentielijst wensen. In elk geval wordt aangetoond dat een verband tussen de adjuvant-partikels in vaccins en M.E.(cvs) helemaal niet absurd is!

Voor meer over macrofagen-myofasciitis lees: Aanhoudende aanwezigheid & hersen-translocatie van vaccin-adjuvanten’.

En over het werk van Yehuda Shoenfeld: ‘Vaccinatie en CVS’, ‘ASIA (auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten) syndroom’), ‘CVS & FM na immunisatie met hepatitis-B vaccin’ & ‘Voorspellen van post-vaccinatie auto-immuniteit’.

————————-

Autoimmunity Reviews (2019) [pre-print]

Myalgia and Chronic Fatigue Syndrome following immunization: macrophagic myofasciitis and animal studies support linkage to aluminum adjuvant persistency and diffusion in the immune system

Romain K. Gherardi (a,b) Guillemette Crépeaux (a,c), François-Jérome Authier (a,b)

a Inserm U955 E10 (Biology of the neuromuscular system), Paris Est Créteil University, 94010 Créteil, France

b Neuromuscular Pathology Expert Centre, Henri Mondor University hospital, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, 94010 Créteil, France

c Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Maisons-Alfort, France

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een multifactoriële en slecht begrepen invaliderende ziekte. We presenteren epidemiologisch, klinisch en experimenteel bewijsmateriaal voor het feit dat M.E./CVS een belangrijk type nadelig effekt van vaccins uitmaakt, bijzonderlijk deze die slecht afbreekbare aluminium-adjuvant deeltjes bevatten. Er is maar traag bewijs opgedoken omwille van de verscheidenheid, het gebrek aan specificiteit, de trage start en frequente medische onderschatting van M.E./CVS-symptomen. Het werd ondersteund door een epidemiologische studie die gevaccineerde en niet-gevaccineerde militairen die niet werden ingezet tijdens Golf Oorlog II vergeleek. De aangetaste patiënten vertonen cognitieve dysfunktie die de aandacht, het geheugen en inter-hemisferische [tussen de hersenhelften] verbindingen beïnvloedt, goed gecorreleerd met defekten van de hersen-doorbloeding en geassocieerd met een stereotiep en onderscheidend patroon van cerebraal glucose-hypometabolisme. Schouderspier-biopten uitgevoerd om myalgie te onderzoeken levert typisch macrofagen-myofasciitis (MMF) op – een histologische biomerker ter beoordeling van persistentie van aluminium-agglomeraten in cellen van het aangeboren immuunsysteem op de plaats van eerdere immunisatie. MMF lijkt gelinkt met gewijzigde detoxificatie van mineraal-partikels door de autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert] / xenofagie [verwijderen van vreemde stoffen] machinerie. Het vergelijken van de toxicologie van verschillende vormen van aluminium en verschillende types blootstelling is misleidend en ontoereikend, en experimenten met kleine dieren hebben oude dogma’s onderste-boven gekeerd. In plaats van snel te worden gesolubiliseerd in de extracellulaire ruimte, worden geïnjekteerde aluminium-partikels snel door immuuncellen gevangen, en naar afgelegen organen en het brein getransporteerd, waar ze een inflammatoire respons opwekken en selektieve lage-dosis langdurige neurotoxiciteit veroorzaken. Klinische observaties en experimenten bij schapen (grote dieren lijkend op mensen) bevestigden zowel systemische diffusie en neurotoxische effekten van aluminium-adjuvanten. Post-immunisatie M.E./CVS vertegenwoordigt de kern-manifestatie van “auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten” (ASIA).

1. Inleiding

Vaccins en zuiver water hebben belangrijke rollen gespeeld bij de bestrijding van levensbedreigende infektueuze ziekten. De voorbije eeuw zorgde vaccinatie voor de uitroeiing van pokken, bijna uitroeiing van poliomyelitis, en aanzienlijke afname van mazelen en bof. Een grote vaccinatie-dekking bleek de heropleving van meerdere infektie-ziekten te vermijden door het verminderen van het aantal mensen die de pathogenen kunnen doorgeven. Vaccins vertegenwoordigen de meest kosten-effektieve methode ter controle van meerdere infektie-ziekten en lijken globaal veilig. Het risico op nadelige effekten dat inherent is aan elk doeltreffend farmaceutisch produkt bestaat echter ook voor vaccins. Ondanks de lage aantallen gesignaliseerde gevallen verdienen nadelige effekten volgend op immunisatie (‘adverse effects following immunization’; AEFI) speciale aandacht omdat (i) anders dan bij conventionele medicijnen, vaccins worden toegediend aan gezonde individuen; (ii) een uitbreiding zonder precedent van vaccinatie-programma’s werd aangekondigd door Amerikaanse biofarmaceutische research bedrijven, met meer dan 260 nieuwe vaccins die worden ontwikkeld; en (iii) omdat AEFI waarschijnlijk grotendeels vermeden kan worden door het optimaliseren van vaccinologie-produkten en -praktijken gebaseerd op de kennis omtrent AEIs pathofysiologische mechanismen en risico-factoren. Een belangrijke bezorgdheid aangaande vaccin-veiligheid houdt verband met de adjuvant-molekulen die in de meest vaccins worden gebruikt om sterke en blijvende immunisatie op te wekken. Er werd bijzonder aandacht besteed aan aluminium-zouten die empirisch werden geïntroduceerd in vaccins door Alexander Glenny [Brits immuunoloog] in 1926 en de belangrijkste klasse adjuvanten vormen met een licentie voor wereldwijd gebruik bij mensen en dieren. Er zijn twee belangrijke aluminium (Al) -zouten die als vaccin-adjuvanten worden gebruikt. Al-oxy-hydroxide (AlOOH, Alhydrogel®), gewoonlijk Al-hydroxide genoemd, is samengesteld uit nanopartikels van ca. 2,2 nm x 4,5 nm x 10 nm die spontaan micron aggregaten vormen met een nanofibreus [bestaande uit nanovezels] voorkomen (elektronen-microscopie); terwijl Al-hydroxyfosfaat (AlOHPO4, Adju-Phos®), gewoonlijk Al-fosfaat genoemd, amorf is. Beide adjuvanten potentiëren in sterke mate de produktie van antilichamen met weinig aanmaak van cytotoxische T-lymfocyten. De mechanismen die aan de basis liggen van hun adjuvant effekt werden slechts in recente jaren intens onderzocht en blijven nog niet volledig begrepen. Al-hydroxide is een stabiele gehydrateerde gel met een positieve oppervlakte-lading en hoge antigen-adsorptie capaciteiten gestuurd door hydrostatische interakties en uitwisselingen van hydroxyl-groep met de fosfaat-groep van het ligand. Al-fosfaat heeft een negatieve lading, minder hydroxyl-groepen en lagere adsorptie-capaciteiten. De bio-dispositie kinetieken van de twee adjuvanten zijn ook significant verschillend: Al-hydroxide wordt minder snel gesolubiliseerd, en wordt gretiger geïnternaliseerd en is minder toxisch voor fagocytische cellen dan Al-fosfaat.

Deze review hier zal focussen op de mogelijke implicatie van Al-adjuvant bevattende vaccins bij patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Onze eigen ervaring op dat gebied komt door de klinische fenotypering van een grote groep patiënten waarvan een ongewoon langdurige persistentie van Al-hydroxide werd gedetekteerd in immuun-cellen op de plaats van eerdere immunisatie, met vorming van een specifiek letsel: macrofagen-myofasciitis (MMF). In 2011 gebruikte Yehuda Shoenfeld dit MMF-syndroom als één paradigma voor de aandoening die hij “auto-immune/inflammatory syndrome induced by adjuvants” (ASIA) noemde [Shoenfeld Y & Agmon-Levin N. ‘ASIA’ – autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants. J Autoimmun. (2011) 36: 4-8].

2. M.E./CVS-definities

[…]

[…] M.E. is een neurologische ziekte (ICD G93.3). Naast spierpijn en inspanning-intolerantie, vertonen M.E.-patiënten dikwijls neurologische dysfunkties […].

[…]

Samengevat: de waaier aan voorgestelde definities en de klaarblijkelijke discrepanties geven aan dat er geen echte consensus is aangaande de nomenclatuur of klassificatie […].

3. M.E./CVS overlapt met andere aandoeningen

[…] Er is discussie over het feit of M.E./CVS en fibromyalgie afzonderlijke aandoeningen zijn of slechts fenotypische variaties van één ziekte vertegenwoordigen, waarbij ernstige vermoeidheid aan de ene kant van het spectrum zit (M.E./CVS) en meer spierpijn aan de andere kant (fibromyalgie). Tot op heden blijft de kwestie onopgelost. Tot dat een globale consensus wordt bereikt, e aangezien de WHO officieel fibromyalgie klassificeert bij de musculoskeletale aandoeningen (WHO ICD10M79.7) en niet bij de neurologische ziekten zoals M.E./CVS, zullen we het onderscheid maken aan de hand van de 1990 ACR [American College of Rheumatology] criteria voor fibromyalgie, die gebaseerd zijn op druk-gevoeligheid (‘tender-points’) op minstens 11 van 18 gespecifieerde plaatsen en de aanwezigheid van wijdverspreide pijn. […]

IBS [prikkelbare darm syndroom] is één van de meest courante funktionele darm-aandoeningen. Het wordt gekenmerkt door abdominaal ongemak e, verstoorde darmen. Ca. 50% van de IBS-patiënten vertonen co-morbiditeit: 14% hebben M.E./CVS, en 35-90% van de M.E./CVS-patiënten hebben IBS.

POTS [posturaal orthostatisch tachycardia syndroom] wordt gekenmerkt door een excessieve toename van de hartslag (> 30 slagen/min) bij verandering van de houding van liggend naar staand. Het wordt gelinkt met dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel. POTS is dikwijls co-morbide met M.E./CVS, bijzonderlijk bij jonge patiënten. Ongeveer 40% van de M.E./CVS-patiënten kan leiden onder POTS en 64% van de patiënten met POTS voldoen aan de criteria voor M.E./CVS.

Complex Regionaal Pijn Syndroom (CRPS) is een andere chronische pijn en dysautonome aandoening [dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel]. Het tast de armen, handen, benen of voeten aan, en manifesteert zich via intense brandende pijn met hyperalgesie en dramatische veranderingen qua huid-temperatuur, kleur en textuur die niet meer verklaard kan worden door een initiërende schadelijke gebeurtenis. CRPS kan gepaard gaan met een verstoorde lichaamsperceptie en beweging-stoornissen.

4. M.E./CVS en vaccins

Idiopatische M.E./CVS vertoont gelijkenissen met post-infektueuze vermoeidheid-syndromen maar er kan geen pathogeen worden aangetoond bij alle patiënten, wat aanleiding geeft tot de opkomende visie dat gelijkaardige symptomen getriggerd kunnen worden door een waaier aan verschillende pathogenen en toxische stoffen. Bij de mogelijke triggerende factoren worden vaccins en hun componenten al lang verdacht een rol te spelen [Hyde B et al. The clinical and scientific basis of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Nightingale Research Foundation, Ottowa, Canada (1992) /// Shepherd CB. Is CFS linked to vaccinations? The CFS Research Review (2001) 2: 6-8].

4.1. Eerste sterk signaal: HBV-vaccinatie

Na de eerste immunisatie-campagne tegen Hepatitis-B virus (HBV) in Canada, verklaarde een verpleegster in 1992 op de Canadese TV dat ze M.E./CVS had opgelopen na het vaccin te hebben gekregen. Er werd de kijkers gevraagd elke gelijkaardige ervaring te melden. Er werden 69 individuen bekendgemaakt aan het ‘Department of National Health and Welfare’ die een ad hoc werkgroep startte om de zaak te onderzoeken. Het comité bevestigde de verbanden tussen immunisatie tegen HBV en M.E./CVS maar maakte geen aanbeveling om research te financieren aangaande een mogelijk causaal verband op basis van argumenten zoals: (1) de afwezigheid van een strakke tijd-clustering tussen immunisatie en aanvang van de symptomen; (2) het klein deel Canadese M.E./CVS-patiënten dat werd gevaccineerd tegen HBV binnen 3 maanden voorafgaand aan de aanvang van de symptomen; en (3) het ontbreken van biologische plausibiliteit [Working group on the possible relationship between hepatitis-B vaccination and the Chronic Fatigue Syndrome. Report. Canad Med Assoc J. (1993) 149: 314-9]. Sindsien werd in de literatuur melding gemaakt van talrijke patiënten met verhalen over M.E./CVS optredend op verschillende tijdstippen na immunisatie tegen HBV [Agmon-Levin N & Shoenfeld Y. Chronic Fatigue Syndrome with autoantibodies – the result of an augmented adjuvant effect of hepatitis-B vaccine and silicone implant. Autoimmun Rev. (2008) 8: 52-5 /// Agmon-Levin N et al. Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia following immunization with the hepatitis-B vaccine: another angle of the ‘autoimmune (auto-inflammatory) syndrome induced by adjuvants’ (ASIA). Immunol Res. (2014) 60: 376-83] en het aluminium-hydroxide adjuvant gebruikt in HBV-vaccins bleek slecht afbreekbaar, en veel langer in het immuunsysteem aan te houden en te verspreiden dan voorheen werd geloofd. In retrospect kunnen deze nieuwe gegevens en deze verzameld over andere Al-bevattende vaccins (zie verder) twijfel zaaien over de validiteit van de argumenten van het Canadese ad hoc comité.

4.2. Beperkingen van epidemiologische studies bij de beoordeling van M.E./CVS als een AEFI

In 2012 gaf het ‘Institute of Medicine’ (IOM) aan dat het bewijsmateriaal “inadequaat” was “om een oorzakelijk verband te aanvaarden of verwerpen voor de grote meerderheid van de nadelige effekten van vaccins die ze onderzochten”, omwille van het beperkt aantal bevredigende epidemiologische studies. Toegegeven: het erkennen van M.E./CVS als een AEFI en het vaststellen van de causale rol van multipele immunisaties bij M.E./CVS zijn een uitdaging omdat alle geïdentificeerde beperkingen van AEFI epidemiologische studies in deze setting een rol spelen. Volgens het IOM omvatten deze beperkingen:

* Gebrek aan ‘long-term’ follow-up studies wat de detektie van vertraagde effekten belet;

* Kleine stalen, wat de detektie van zeldzame gebeurtenissen belet;

* Gebrek aan evaluatie van multipele vaccinaties als geheel;

* Gebrek aan of symptomen die specifiek zijn voor vaccinatie;

* Multipele symptomen die optreden in combinatie, met een hoog risico om te worden getrivialiseerd en niet te worden herkend als één entiteit, zoals aangestipt in de leken-pers over M.E./CVS-symptomen in pre-licentie HPV-vaccin veiligheidstesten;

* onder-rapportering inherent aan passieve surveillance-systemen, waarbij M.E./CVS-symptomen dikwijls niet als dramatische genoeg worden beschouwd om verdiend te worden dat ze gemeld worden; tijd verstreken sinds blootstelling die zeer variabel en dikwijls zeer lang is, zodat het beeld vertroebeld; het ongeloof/negeren dat M.E./CVS mogelijks gelinkt kan zijn met een vaccin; en ontbrekende ijver wat betreft rapportage als algemene regel;

* Hoge vaccinatie-aantallen en toediening van multipele vaccins die de vergelijking beletten met controle-groepen die geen vaccins kregen;

* Beperkte populatie vaccinatie-testen die resultaten opleveren die niet veralgemeenbaar kunnen zijn voor de algemene bevolking (bv. testen bij kinderen of individuen zonder risico-factoren);

* Veranderingen in vaccin-technologie, die zorgt voor een beletting van de veralgemeenbaarheid van substantieel verschillende nieuwe vaccins op basis van veiligheid-ervaringen omtrent vroegere vaccins (zie nieuwe Al-adjuvanten, hieronder).

4.3. Inzichten vanuit ‘Gulf War Illness’ in ingezette en niet-ingezette veteranen

Gelukkiglijk werden in bevoorrechte epidemiologische studies verbonden met ‘Gulf War Illness’ (GWI) gevaccineerde en niet-gevaccineerde individuen vergeleken, en die linkten toediening van multipele vaccins met M.E./CVS. Ten minste een vierde van de Golf oorlog veteranen die terugkeerden van de Perzische Golf oorlog (PGW) in februari 1991 rapporteerde een waaier aan chronische symptomen die enigszins variëren maar opvallende gelijkenissen vertonen met M.E./CVS. […] Omwille van bevooroordeling die regelmatig optrad in het verloop van de onderzoeken, is er nog onzekerheid omtrent de exacte oorzakelijke factoren van GWI maar onder andere multipele vaccinaties toegediend binnen een korte periode werden herhaaldelijk verdacht. Een Britse ‘cross-sectionele’ studie toonde een sterk verband tussen CDC-gedefinieerde GWI en meerdere vaccinaties toegediend tijdens ontplooiing […]. Bovendien werden “consistente, specifieke en geloofwaardige relaties” gevonden tussen het aantal inoculaties en gezondheid-indicatoren bij Britse Golf oorlog veteranen.

Zowel vaccinatie tegen biologische oorlogsvoering agentia (anthrax en pest met pertussis als een adjuvant om immuun-responsen te ‘boost’en) als multipele routine vaccinaties bleken geassocieerd met het CDC multi-symptoom syndroom in de Britse Golf oorlog groep. In Canada werd een significant verband gerapporteerd tussen “niet-routinematige immunisaties” en meerdere symptoom-gedefinieerde uitkomsten bij Golf oorlog veteranen. In de V.S. waren dalingen qua lange-termijn subjectieve gezondheid van Golf oorlog veteranen geassocieerd met het krijgen van anthrax-vaccin en veteranen die meer ernstige reakties op vaccins meldden rapporterden meer dalingen qua subjectieve gezondheid. Het Amerikaans gelicentieerd anthrax-vaccin (AVA; Biothrax®) is geadsorbeerd op aluminium-hydroxide en kan MMF induceren. Daarnaast werd het vaccin er van verdacht squaleen [adjuvant dat de immuun-respons sterk verhoogt] te bevatten omwille van de detektie van circulerende squaleen-antilichamen bij aangetaste veteranen, maar er werd door het ‘Department of Defense’ geen relatie gevonden tussen squaleen-antilichamen en chronische symptomen. Daarom bleef de rol van vaccins bij GWI moeilijk te vatten, omdat de focus meer lag op de rol van chemische blootstellingen zoals pyridostigmine-bromide [cholinesterase-remmer] (profylaxis [voorkomen van ziekte] bij chemische aanvallen) of persoonlijk pesticiden-gebruik. Blootstelling aan voor de Perzische Golf oorlog specifieke toxische stoffen konden echter amper worden aangeduid bij veteranen die niet werden ingezet of elders dan in de Perzische Golf dienden, en ontwikkelden minder frequent chronische symptomen gelijkend op GWI. De ‘Kansas Commission on Veterans Affairs’ bestudeerde specifiek de mogelijke effekten van vaccins bij veteranen uit Kansas die niet in de PGW dienden (niet-PGW veteranen): vergeleken met niet-gevaccineerde veteranen hadden niet-PGW veteranen die melding maakten van vaccin-toediening significant meer vermoeidheid/ slaap-problemen, pijn-symptomen, neurologische/ cognitieve/ stemming-symptomen en gastro-intestinale symptomen. Gevaccineerde (n = 208) vs niet-gevaccineerde (n = 187) non-PGW veteranen hadden een significant veel hogere prevalentie van GWI […]. In tegenstelling met PGW-veteranen bij wie GWI mogelijks het resultaat was van “clusters van oorzaken” en “combinatie van effekten”, werd geen andere oorzaak dan zelf-gerapporteerde vaccinatie gevonden bij niet-PGW veteranen.

5. M.E./CVS bij Al-adjuvant geïnduceerde macrofagen-myofasciitis

De accuraatheid van zelf-gerapporteerde vaccinatie staat klassiek ter discussie maar dit is niet het geval wanneer vaccinatie-raporten beschikbaar zijn en wanneer een zeer specifieke histologische merker op een onbetwistbare manier eerdere immunisatie kan vaststellen, zoals het geval is bij patiënten met MMF.

5.1. Macrofagen-myofasciitis: een biomerker voor Al-adjuvant biopersistentie

5.1.1. Karakterisatie bij mensen

Macrofagen-myofasciitis (MMF), voor het eerste beschreven in 1998, is een specifiek door Al-hydroxide geïnduceerd granuloma [nodule chronisch inflammatoire cellen] dat wordt gedetekteerd op een plaats waar eerder een vaccin werd geïnjekteerd. Het letsel wordt gekenmerkt door lagen grote macrofagen die constant agglemeraten (grootte-orde sub-µm tot µm) van aluminium nano-kristallen in hun cytoplasma, vermengd met lymfocyten-infiltraten. Dit immunologisch aktief letsel is niet geassocieerd met vorming van ‘giant’-cellen [meerkernige cellen].

De eerste 75 patiënten uit review van 2003 hadden voornamelijk Al-hydroxide gekregen via HBV (84%), Tetanus Toxoïd bevattende vaccins (TT 58%) of Hepatitis-A virus vaccins (HAV 19%), gewoonlijk toegediend als een combinatie. Het aandeel van de vaccin-types veranderde uitgesproken met verloop van tijd: onze laatste 70 patiënten (januari 2013 tot juni 2018; 56 met complete vaccinatie-rapporten) hadden voornamelijk TT-bevattende vaccins (86%, 48/56) als laatste immunisatie of binnen de jaar vóór de bioptie gekregen, gevolgd door HBV (27%, 15/56), HAV (11%, 6/56), HPV (11%, 6/56) en meningitis-C (<1% , 1/56). TT-bevattende vaccins (voornamelijk Difterie-Tetanus-Poliomyelitis, Difterie-Tetanus-Pertussis (DTP) [perstussis = kinkhoest] & Difterie-Tetanus-Pertussis-Poliomyelitis), alleen toegediend of in combinaties met niet-TT vaccins, waren de meest recente toegediende in 64% van de gevallen. Deze gegevens geven duidelijk aan dat MMF niet specifiek is geassocieerd met het HBV-vaccin. MMF wordt zelden gedetekteerd ondanks het groot aantal geïmmuniseerde individuen maar, kort na de initiële beschrijving, werd een opvallende toename van hat aantal MMF-detekties opgetekend door alle Franse gespecialiseerde centra. De prominente detektie van MMF in Frankrijk van 1993 was waarschijnlijk te wijten aan: (1) de aanbevolen vervanging bij het begin van het decennium van de subcutane door de intramusculaire route; (2) de enorme immunisatie-campagne tegen hepatitis-B in Frankrijk (90 miljoen dosissen verkocht op tien jaar, waarvan twee derde toegediend aan volwassenen); en (3) de gebruikelijke keuze van de schouderspier voor bioptie bij volwassenen in Franbkrijk terwijl deze spier niet de voorkeur heeft in andere landen. Bv.: slechts 10% van de spier-biopten bij volwassenen werd uitgevoerd in de schouderspier in één Amerikaans centrum, waarbij MMF werd gedetekteerd in 1% daarvan. Ondanks de gebruikelijke routine keuze van een incongruente spier-site, wat de detektie van de meeste MMF-gevallen belet, kon het letsel occasioneel gedocumenteerd worden in Australië, Brazilië, Duitsland, India, Ierland, Israël, Italië, Portugal, Saudi-Arabië, Spanje, het Verenigd Koninkrijk, de V.S.A. en meerdere andere landen (persoonlijke communicatie), wat aangeeft dat MMF niet specifiek is voor Frankrijk.

5.1.2. Opruiming van het letsel in dieren-modellen

Het letsel werd experimenteel opgewekt bij ratten, apen en schapen. In fel contrast met de snelle eliminatie van oplosbaar Al intraveneus geïnjekteerd, is de intramusculaire inspuiting van Al-hydroxide geassocieerd met een veel tragere eliminatie van Al in de urine, wat 6% van de geïnjekteerde dosis vertegenwoordigt 28 dagen na injektie in konijnen.

Op basis van de gegevens van dit uniek toxicokinetisch experiment, werd de duur voor volledige verplaatsing van opgeloste Al-ionen van de injektie-plaats berekend op 5,5 maanden voor Al-hydroxide. Experimentele MMF krimpt steeds met verloop van tijd. Bij apen was MMF (geïnduceerd via DTP-vaccin) volledig verdwenen uit de geïnjekteerde spier tussen 6 en 12 maanden na immunisatie. Op dezelfde manier als bij deze dieren-modellen lijkt de overgrote meerderheid mensen binnen maanden het adjuvant uit de spier te clearen maar bij een klein aantal onder hen kan MMF nog worden geobserveerd tot > 15 jaar na vaccinatie.

Lang-bestaande MMF moet dus worden beschouwd als een biomerker voor het probleem bij zeldzame individuen om het adjuvant uit hun lichaam te krijgen. Om die reden bevelen we aan een bioptie uit te voeren om MMF vast te stellen minstens 18 maanden na de laatste immunisatie om toe te laten ongewoon langdurige persistentie van het letsel toe te beoordelen.

5.1.3. Genetisch voorbestemmende factoren

Er wordt algemeen aangenomen dat er subpopulaties mensen bestaan die gevoeliger zijn voor blootstellingen aan bepaalde chemische stoffen of deeltjes dan de gemiddelde bevolking. Individuele varbaarheid-factoren die gewoonlijk specifieke “genen x omgeving” interakties weerspiegelen, verklaren waarschijnlijk waarom slechts een klein deel van de gevaccineerden nadelige effekten ontwikkelen. De exacte basis voor een dergelijke vatbaarheid kan omvatten: (1) genetisch-bepaalde verstoring van cellulaire verdedingsmechanismen tegen de pro-oxidante effekten van Al; (2) HLA-subgroepen, zoals HLADRB1*0, die bekend staan voor het bevorderen van auto-immune responsen; (3) veroudering en/of genetische inter-individuele verschillen bij de aanmaak van het chemo-attractant MCP1/CCL2 [cytokine/chemokine; chemokine (C-C motief) ligand 2 ook monocyten-aantrekkend proteïne 1 (MCP1) genoemd] dat nodig is voor de verspreiding van immuun-cellen beladen met Al-adjuvant partikels; (4) individuele problemen om Al-adjuvant uit immuun-cellen te krijgen. De grootte van experimentele MMF-letsels bij ratten verschilt aanmerkelijk naargelang de genetische achtergrond en bij mensen bestaat treffende inter-individuele variabiliteit voor aluminium-eliminatie.

Een intracellulair mechanisme genaamd xeno/autofagie is bevorderlijk voor het oplossen en de biologische verplaatsing van geïnternaliseerde minerale partikels, alsook bij metaal-toxiciteit, en veel cruciale funkties in het immuunsysteem en centraal zenuwstelsel. Er werden beloftevol preliminaire gegevens verkregen via by DNA-screening van 34 genen die direct betrokken zijn bij de xeno-autofagie machinerie […], suggererend dat MMF genetisch bepaald onvermogen van sommige individuen om zich op een efficiënte manier te ontdoen van geïnjekteerde aluminium-adjuvanen (patent ingediend) kan weerspiegelen, wat de weg plaveit voor de ontwikkeling van genetische testen die een verhoogd risico op intolerantie gelinkt met adjuvant-retentie kunnen voorspellen.

5.2. Macrofagen-myofasciitis syndroom: post-vaccinatie M.E./CVS

5.2.1. Klinische karakterisatie

Van 1994 tot 2012 hebben we 583 volwassen patiënten met MMF gezien in het ‘Paris East University Hospital Henri Mondor’ […]. Er is geen nationaal MMF-register maar een totaal aantal 445 MMF-gevallen werd officieel bekendgemaakt […]. Uitgezonderd gegevens over cognitieve dysfunktie die specifiek werden verzameld in ons centrum maar die niet werden gecapteerd op nationaal niveau, toonden lokale en nationale bronnen gelijkaardige kenmerken van MMF-patiënten, bevestigd door series uit Portugal en de V.S. De ‘Henri Mondor hospital’ 1994-2018 MMF-database geeft de volgende karakteristieken van patiënten aan: gemiddelde leeftijd 52,5 jaar, overheersing van vrouwen (71%), gemiddeld 5 (1-12) Al-bevattende vaccin-injekties in de 10 jaar voorafgaand aan het biopt (vaccinatie-dossiers beschikbaar bij 236/350), gemiddelde Al-adjuvant persistentie-tijd 71 maanden (9-237 […]), gemiddelde tijd tussen klinische aanvang tot bioptie van 67 maanden, voornaamste symptomen myalgie/arthralgie (92%, 309/335), vermoeidheid (86%, 298/347) en cognitieve klachten (82%, 154/187). Andere symptomen omvatten hoofdpijn (49%), kortademigheid (51%), abdominale pijn (30%), oculaire symptomen (34%), borst-pijn (32%), urinaire symptomen (21%) & koorts (23%).

Patiënten kregen intramusculair een Al-bevattend vaccin toegediend vóór de spier-symptomen aanvingen. De tijd vóór de eerste symptomen varieerde substantieel: van 0 tot 72 maanden in onze initiële reeks. De mediane tijd tussen de laatste vaccinatie tot de eerste spierpijn was 11 maanden, 30% van de patiënten klaagden over myalgieën binnen 3 maanden, 31% tussen 3 en 12 maanden, 19% tussen 12 tot 24 maanden & 20% na 24 maanden. In ons centrum vertoonde één derde van de myalgische patiënten die Al-hydroxide bevattende vaccins kregen in de voorbije 10 jaar MMF in een schouderspier-biopt. De myalgie startte gewoonlijk na een inspanning van ongewone intensiteit, dikwijls in de onderste ledematen en naar boven toe vorderend, om diffuus te worden op het tijdstip van de bioptie. Een myopathisch elektromyogram en verhoogd CK [creatine-kinase; verhoogde waarden kunnen worden gezien bij individuen na extreme inspanning; verlaagd creatine-kinase werd vastgesteld bij ernstig zieke M.E.(cvs)] worden gevonden in minder dan de helft van de patiënten.

Vermoeidheid heeft gewoonlijk een grote impact op het dagelijks leven en de meeste patiënten stoppen met werken na enkele maanden. De cognitieve veranderingen bleken stereotiep bij systematisch testen: er was een impact op aandacht, werk- en visueel geheugen, en connecties tussen de hersenhelften; en deze waren niet toe te schrijven aan chronische pijn noch aan depressie.

Een standaard brein-MRI was gewoonlijk normaal maar er werden in het oog lopende funktionele neuro-beeldvorming veranderingen gevonden, inclusief: (1) focale hersen-perfusie defekten vastgesteld d.m.v. by SPECT (‘single photon emission computerized tomography’), goed gecorreleerd met wijzigingen qua aandacht/geheugen en dysconnectie tussen de hemisferen; (2) een karakteristiek patroon van cerebrale glucose-hypometabolisme vastgesteld via FDG-PET (fluorodeoxyglucose positron-emissie tomografie) waarbij de occipitale cortex, hippocampus en het cerebellum betrokken zijn, en voorspellend voor MMF-detektie na een spier-biopt.

De voornaamste symptomen van patiënten met MMF (arthromyalgie, vermoeidheid en cognitieve stoornissen) kunnen enige tijd geïsoleerd voorkomen. Een grote meerderheid van de patiënten hebben echter meerdere symptomen en voldoen in minstens 50% van de gevallen aan de internationale criteria for M.E./CVS. De aandoening voldoet ook aan de CDC-criteria voor multi-symptoom GWI.

5.2.2. Consistentie-analyse

Het is zeer onwaarschijnlijk dat het voorkomen van spier-/gewricht-pijn, chronische vermoeidheid en cognitieve veranderingen bij patiënten met lang-bestaande MMF per toeval is en een consistent syndroom vormt. Dit wordt vastgesteld door:

(1) post-immunisatie aanvang van symptomen;

(2) gelijkaardige struktuur van symptomen gezien in onafhankelijke Franse en buitenlandse MMF-series;

(3) significant verband tussen myalgie en MMF bij patiënten waarbij een schouderspier-biopt werd uitgevoerd in Franse myopathologische centra vóór de publicatie van de oorzaak van MMF;

(4) significante klinische verschillen afhankelijk van de aan-/afwezigheid van MMF bij gevaccineerden met spierpijn: in scherp contrast met niet-MMF patiënten met spierpijn, slechts een minderheid van de MMF-patiënten had fibromyalgie (ACR 1990 criteria; > 11 ‘tender-points’) (55,5 vs 16,6%, p < 0.04) en MMF-patiënten vertoonden veel meer betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel, […] (p < 0.01). Deze gegevens geven aan dat MMF en niet-MMF patiënten meer verschillen dan enkel via de simpele detektie van MMF;

(5) significant verband tussen chronische vermoeidheid en MMF in een ‘case-control’ studie bevolen door het Frans medicijnen-agentschap: vermoeidheid was “frequenter en ernstiger bij patiënten met MMF dan zonder MMF”; wat in scherp contrast staat met ziekte-controles, MMF-patiënten hadden opvallend weinig medische antecedenten, wat er verder op duidt dat de gevallen meer van controles verschillen dan louter de detektie van MMF;

(6) zeer consistente funktionele neuro-beeldvorming veranderingen (SPECT & FDG-PET) bij MMF-patiënten, niet toe te schrijven aan chronische pijn of depressie, aangevend dat MMF wordt gedetekteerd in een homogene subset patiënten met stereotype aandoening;

(7) perfekte overéénkomst van het MMF-syndroom met het GWI multi-symptoom complex dat uniek geassocieerd bleek met blootstelling aan vaccins bij militair personeel dat niet werd ingezet in de Perzische Golf.

Samengevat: MMF wordt typische gedetekteerd bij volwassen patiënten met een homogene subset post-vaccinale M.E./CVS.

6. M.E./CVS en verwante aandoeningen na toediening van HPV-vaccins

6.1. Huidige discussies

In afwezigheid van een schouderspier-biopt dat zou kunnen bepalen of lang-bestaande MMF aanwezig was of niet, heeft een aantal artikels melding gemaakt van combinaties van myalgie, arthralgie, chronische vermoeidheid, cognitieve dysfunktie, niet-verfrissende slaap en neurovegetatieve [met betrekking tot het autonome zenuwstelsel] veranderingen (die voldoen aan de internationale criteria voor M.E./CVS, fibromyalgie, POTS, CRPS of worden beschreven als somatoforme manifestaties) die geassocieerd zijn met de toediening van meerdere injekties van Al-adjuvant bevattende vaccins in Australië, Canada, Denemarken, Italië, Israël, Japan, Mexico en de V.S. Of dergelijke associaties een mogelijk causaal verband kunnen vaststellen heeft geleid tot voortdurende controverse.

Er dook voor de eerste controverse op na de HBV-vaccin campagne, parallel met M.E./CVS [zie Agmon-Levin N & Shoenfeld Y. hierboven] en Multipele Sclerose (M.S.), die occasioneel samen voorkomen na immunisatie. De meeste epidemiologische studies konden de weergaloze stijging qua post-HBV immunisatie M.S.-claims niet substantiëren maar deze korte-termijn studies hielden geen rekening met de ‘t’-factor – er werd gewezen op de mogelijkheid voor een vertraagde start van klinische symptomen na HBV-immunisatie: in een unieke ‘case-control’ studie uitgevoerd op lange-termijn bij de Britse bevolking werd een verhoogd risico op M.S. gevonden […] in de 3 jaar na HBV-vaccinatie. Interessant: er was geen verhoogd risico tijdens het eerste jaar […], zoals gerapporteerd in eerdere korte-termijn studies, maar het verhoogd risico op het ontwikkelen van M.S. kwam naar boven op 2 en 3 jaar na immunisatie […]. Dit resultaat is in overéénstemming met de gemelde toename van de incidentie van M.S. in Frankrijk na de HBV-immunisatie campagne.

Daarna steeg de controverse ten top door de discussie omtrent de veiligheid van HPV-vaccins. Zoals het HBV-vaccin geassocieerd bleek met een disproportioneel hoge mate van signalisering van AEFIs vergeleken met andere vaccins (bv. 5-voud voor M.S.), waren HPV-vaccin programma’s in verschillende delen van de wereld geassocieerd met een 10 maal hogere incidentie van gesignaliseerde AEFIs vergeleken met andere vaccins. Post-HPV vaccinatie AEFIs hadden betrekking op ca. 1 per 1000 inoculaties in Spanje en 1 per 1000 gevaccineerden in Canada. HPV-vaccin waarborgen werden echter gesteund door internationale gezondheid-agentschappen (EMA, WHO) en later de ‘Cochrane collaboration’.

Niettemin werd kritiek geleverd, wijzend op belangen-conflicten van de industrie en de openbaring van talrijke methodologische gebreken bij HPV-vaccin veiligheid-studies zelf en de systematische reviews die een basis geven aan institutionele geruststellende claims.

6.2. Beperkingen van epidemiologische studies aangaande M.E./CVS bij ontvangers van HPV-vaccinatie

Voor het huidig overzicht onderzochten we in detail twee studies die er op wezen dat er geen bewijs is dat het voorkomen van M.E./CVS bij HPV-gevaccineerde meisjes anders is dan verwacht voor dezelfde leeftijd-groepen [Donegan K et al. Bivalent human papillomavirus vaccine and the risk of fatigue syndromes in girls in the UK. Vaccine. (2013) 31: 4961-7 /// Feiring B et al. HPV vaccination and risk of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: A nationwide register-based study from Norway. Vaccine. (2017) 35: 4203-12].

Donegan et al. [hierboven] analyseerde het voorkomen van M.E./CVS bij Britse meisjes die werden geïmmuniseerd met het bivalent HPV-vaccin (Cervarix®) dat Al-hydroxide gemengd met 3-O-desacyl-4’-monofosforyl lipide-A bevat. In het eerste deel van hun studie, t.t.z. “geobserveerd vs. verwacht analyse”, overwogen de auteurs dat onder-rapportering kan variëren van 0% tot 90%. De onder-rapportering van nadelige reakties op medicijnen ligt echter hoger (mediaan 94% gevonden bij 37 studies in een systematisch overzicht, inclusief een maximum van 98% in het V.K.); gelijkaardige onder-rapportering geldt ook voor vaccins. Bovendien was de hoogste (90%) onder-rapportering hypothese getest door Donegan et al. geassocieerd met een opvallend boven-de-drempel signaal voor M.E./CVS bij Cervarix®-recipiënten. De auteurs weerhielden dit resultaat niet en verkozen om te focussen op lagere (< 75%) niveaus van onder-rapportering die niet gepaard gingen met een verhoogd signaal. Dit is een zeer betwistbare keuze gezien het gedocumenteerd falen aangaande de beoordeling van M.E./CVS-symptomen bij HPV-gevaccineerden, vaccin-schade en M.E./CVS zijn nl. concepten waartegenover het medisch establishment over het algemeen vijandig blijft.

In het tweede deel van hun studie, t.t.z. “reeks zelf-gecontroleerde gevallen”, schatten de auteurs het risico voor M.E./CVS in het jaar na de eerste Cervarix®-injektie (de eerste van drie gegeven over 6 maanden) en schonken geen aandacht aan andere Al-bevattende vaccins. De gerapporteerde tijd tot de nadelige effekten na de eerste HPV-vaccin dosis varieerde echter van 1 dag tot 51 maanden (gemiddeld 10,7 ± 11,6 maanden) bij een reeks van 72 Japanese meisjes en van 1 dag tot 43 maanden (gemiddeld 14,0 ± 11,6 maanden) bij een andere reeks van 35 meisjes. Op dezelfde manier was de mediane tijd tot de aanvang van de eerste symptomen “11 tot 12 maanden na de laatste Al-hydroxide bevattende vaccin-toediening” bij onze M.E./CVS-patiënten, wat het waarschijnlijk maakt dat een substantieel aantal M.E./CVS-patiënten mogelijks gelinkt is met een gemiste Al-hydroxide bevattende Cervarix®-injektie in de studie door Donegan et al., zelfs wanneer het risico-venster werd uitgebreid tot 18 maanden (d.i. ongeveer 12 maanden na de laatste inspuiting, een periode waarna bijna 40 % van onze MMF-patiënten hun eerste symptomen ontwikkelden). Tenslotte geloofden de auteurs dat er “geen reden” was “om te denken dat meisjes met vermoeidheid-syndroom minder waarschijnlijk HPV-vaccinatie zouden moeten krijgen”, wat een ‘healthy vaccinnee bias’ uitsluit. Dit getuigt niet van een goede praktijk op het gebied van vaccin-veiligheid wetenschap. Het is goed vastgesteld dat onderliggende aandoeningen die voorbestemmen tot medische uitkomsten waarvan wordt gedacht dat het nadelige effekten van vaccins zijn, gelinkt blijken met een lagere vaccin-opname. Bv.: de opname van HPV-vaccin daalde van 82,3% naar 39,4% wanneer Noorse meisjes de diagnose van M.E./CVS kregen voorafgaandelijk aan immunisatie [zie Feiring et al. hierboven]. Dit is een belangrijke bias [vooringenomenheid/bevooroordeling], benadrukt door experten van het ‘Japan Institute of Pharmaco-vigilance’ en van de CDC die stelden dat “studies onvoldoende voor ‘healthy vaccinnee bias’ controleren zodat er een tendens is tot onderschatting van de reëele risico’s geassocieerd met vaccinatie”. [Het feit dat gezonde mensen er meer voor kiezen te worden gevaccineerd dan mensen met chronische ziekten (die vaccinatie-risicos willen vermijden) en het feit dat mensen die voor vaccinatie kiezen, neigen naar een beter dieet, meer bewegen of regelmatiger medische testen; geven aanleiding tot ‘healthy user bias’ (HUB) of ‘healthy user effect’ in vaccin-studies.]

Feiring et al. [zie hierboven] bestudeerden het quadrivalent HPV-vaccin (Gardasil®) waaraan amorf Al-hydroxy-fosfaat-sulfaat is toegevoegd […] dat significant verschilt van Al-hydroxide. De studie vond dat mensen die meer risico lopen op het ontwikkelen van M.E./CVS de neiging hadden het vaccin te vermijden. Ondanks deze ‘healthy vaccinee bias’, bleven de auteurs betrouwen op hun bevinding dat er geen toename van M.E./CVS zou zijn bij gevaccineerde vs niet-gevaccineerde meisjes (na aanpassing voor leeftijd), omdat er geen hogere toename van M.E./CVS was bij meisjes dan bij jongens, terwijl enkel meisjes het HPV-vaccin hadden gekregen. Inderdaad: er werd een gelijkaardig verhoogd aantal M.E./CVS gevonden bij meisjes en jongens tijdens de studie-jaren; wat onverklaard bleef. De mogelijke betrokkenheid van andere vaccins toegediend aan beide geslachten bij deze toename werd klaarblijkelijk niet geëvalueerd. Een ander punt van kritiek ligt in de uitdaging omtrent het onderscheiden van co-morbide aandoeningen van M.E./CVS. Gerapporteerde nadelige effekten aangaande Gardasil® waren gefragmenteerd in meerdere sub-categorieën zoals POTS, CRPS, somatoform syndroom, dysautonoom syndroom, M.E./CVS, fibromyalgie, HPV-vaccin syndroom en HPV-vaccinatie geassocieerd neuro-immunopathisch syndroom (HANS). Het kan daarom misleidend zijn idiopathische M.E./CVS te vergelijken met het HPV-vaccin syndroom, aangezien de symptomen slechts gedeeltelijk co-morbide zijn met M.E./CVS. De verscheidenheid en inaccurate benoemingen van nadelige gebeurtenissen van HPV-vaccins wordt beschouwd als een belangrijk obstakel bij de rapportering.

Op te merken: MMF-syndroom – dat wordt veroorzaakt door een adjuvant dat substantieel verschilt van Al-hydroxy-fosfaat-sulfaat (AAHS) – is veel minder polymorf dan het HPV-vaccin syndroom. POTS en CRPS worden bijna nooit gedocumenteerd in de setting van MMF. In de setting van HPV-vaccinatie, werd de traditionele observationele epidemiologische benadering ingewikkeld door het ontbreken van een definitie voor de multipele symptomen die het signaal vormen, wat nieuwe epidemiologische benaderingen zeer wenselijk maakt.

Bijvoorbeeld: het ‘Uppsala Monitoring Centre’ ontwikkelde een nieuwe, door gegevens gestuurde cluster-analyse van HPV-vaccin rapporten in Vigibase®, de internationale database van de WHO, die natuurlijke groeperingen identificeerde op basis van termen die worden gebruikt om AEFI te melden. De analyse onthulde clusters van ernstige AEFI die frequenter worden gemeld in HPV-vaccin rapporten vergeleken met non-HPV vaccin rapporten bij hetzelfde geslacht en leeftijd. Ze omvatten hoofdpijn, duizeligheid, vermoeidheid en syncope die soms diagnostische labels als POTS, CRPS en M.E./CVS bevatten maar waarvan dikwijls expliciete diagnoses ontbraken; wat wijst op uitgesproken onderschatting van het signaal bij traditionele ‘post-marketing’ veiligheid-evaluatie.

In Japan analyseerde men de tijdsverdeling van de AEFI op bevolkingsniveau, en toonde dat de piek van aanvang van post-vaccinatie syndroom de piek-periode van HPV-vaccinatie volgde en er geen nieuwe gevallen werden gezien na 14 maanden terugtrekking van de regeringsaanbeveling voor HPV-vaccinatie.

Een andere benadering was gebaseerd op zorgvuldige analyse van of HPV-vaccin gerandomiseerde proeven door Spaanse onderzoekers: naast meerdere verontrustende resultaten, wezen die op het verbijsterend feit dat pre-licentie gerandomiseerde proeven bijna altijd vergeleken worden met Al-adjuvants ontvangende groepen – niet met inerte placebo’s. De enige dubbel-blinde test aangaande quadrivalent HPV-vaccin die inerte zout-oplossing als placebo gebruikte, toonde 0,4% (5/1.165) ‘serious adverse events’ bij HPV-gevaccineerde individuen t.o.v. geen enkel (0/584) voor de groep met inerte placebo. Geen enkele van deze effekten werd als vaccin-gerelateerd beschouwd, maar een potentiële rol van Al-adjuvanten werd verder gesuggereerd door de grootste Gardasil® proef waarbij het krijgen van het 9-valent vaccin met 500 µg Al-adjuvant AAHS geassocieerd was met significant meer lokale en systemische effekten, vergeleken met het 4-valent vaccin dat slechts 225 µg AAHS bevat. Een dergelijk veiligheid-onevenwicht tussen de twee Gardasil® vaccins – suggestief voor een dosis-effekt – werd recent bevestigd door een FDA-rapport dat meer injektie-plaats reakties, Multipele Sclerose en spontane abortus met het 9-valent [tegen 9 HPV-types] Gardasil® vaccin toont.

7. Inzichten door experimentele studies

Naast beperkingen van epidemiologische benaderingen is het onvoldoende begrijpen van de biologische mechanismen die aan de basis liggen van ‘vaccine adverse effects’ een belangrijke factor die de beoordeling van causaliteit hindert. Dit zette het ‘Institute of Medicine’ aan te verklaren dat “de waarde van de dialoog tussen epidemiologische en mechanistische benaderingen kan worden overschat. Deze conversaties tussen verschillende types research kan moeilijk zijn, maar de resultaten zijn het waard.”.

Inderdaad: de geschiedenis van vaccins heeft grotendeels op een empirische basis voortgebouwd tijdens de laatste eeuw. Dit was specifiek het geval voor de Al-adjuvanten die voor het eerst werden geïntroduceerd in vaccins in 1926 maar in zeer geringe mate aan de algemene bevolking toegediend bleven tot 1985, wanneer ze massaal werden geïnjekteerd samen met de introductie van Al-bevattend DTP, HiB [Haemophilus influenzae type-b meningitis], HBV, HAV, pneumoccocus, meningoccocus, HPV en andere vaccins. Dit werd gedaan zonder duidelijke kennis omtrent het lot van het geïnjekteerd Al-adjuvant en, sindsdien, werd zeer weinig inspanning gedaan om de kwestie te verduidelijken. Daarom werden de klassieke hypotheses omtrent het lot van geïnjekteerd Al-adjuvant in ons lab getest in muis-modellen.

7.1. Oud dogma onderste-boven gezet

Er werd geloofd dat eens in het weefsel geïnjekteerd, Al-adjuvanten en de vaccin-antigenen adsorbeerden op hun oppervlak om een extracellulair depot te vormen op de plaats van de inspuiting; er werd gedacht dat daarna progressieve solubilisatie van de adjuvant-partikels plaatsvond, gemedieerd door Al-chelerende zuren [chelatie = chemische complexvorming] aanwezig in het interstitieel vocht, wat een graduele desorptie van het vaccin-antigen en het geobserveerd adjuvant-effekt veroorzaakte. In het kader van dit vooroordeel werd geclaimd dat de onschadelijkheid van Al-adjuvant kon worden afgeleid via de kleine hoeveelheid geïnjekteerd Al en z’n snelle eliminatie in de urine. Geen enkele van deze dogmatische hypotheses bleek correct na experimentele testen in ons lab.

We toonden eerst dat, in tegenstelling to wat eerder werd geloofd, dat in de spier ingespoten Al-hydroxide partikels niet worden gesolubiliseerd in het interstitieel vocht en Al uit het vaccin wordt niet snel geëlimineerd in de urine: in plaats daarvan wordt deze bijna onoplosbare stof snel gevangen door cellen van de monocyten-/macrofagen-familie en blijft na injektie in dieren bestaan binnen deze cellen; tot meer dan 15 jaar bij sommige mensen met MMF. Zoals hierboven en (zie 5.1.2.) hieronder (zie 7.2.2.) vermeld, zijn de resultaten van de enige experimentele studie aangaande de toxicokinetiek van Al-adjuvanten incompatibel met vlugge biodispositie en eliminatie via de nieren van vaccin-Al. Daarnaast zijn de theoretische modellen gebaseerd op Flarend’s vooroordelen en korte-termijn resultaten gebrekkig. Bijvoorbeeld: er werd een model voorgesteld om het risico van Al-vaccins bij kinderen te bepalen, door te refereren naar een oraal minimaal risico-niveau (MRL), geëxtrapoleerd uit dier-studies. Ze bekeken enkel gesolubiliseerd Al, met foutieve berekeningen van de absorptie-duur. Systemische Al-partikel diffusie en neuro-inflammatoire effekten werden weggelaten. De MRL die ze gebruikten was ongeschikt (oraal Al-lactaat vs. geïnjekteerd Al-adjuvant) en te hoog op basis van dieren-studies die aangeven dat MRL minstens 7 maal lager moet zijn. Samengevat: systematische analyse van de beschikbare referentie-studies onthulde een compleet falen van hun geruststellende claims en het verplicht maken van nieuwe experimentele studies van Al-adjuvant toxicokinetiek uitgevoerd op lange-termijn en bij een voldoend aantal dieren, onder auspiciën van gezondheid-agentschappen.

We tonen ook dat, in tegenstelling tot de klassieke depot-vorming hypothese, Al-partikels niet volledig gelokaliseerd blijven in het weefsel bij muizen maar in plaats daarvan kunnen uitzaaien in immuun-cellen naar de regionale lymfeknopen, en dan naar meer afgelegen plaatsen en het brein, waar ze zolang persisteren als in de geïnjekteerde spier. De afgelegen organen die collecties van met Al-partikel beladen cellen vertonen, omvatten de regionale lymfeknopen, milt en lever, en de hersenen waar ze binnendringen gebruikmakend van een CCL2-afhankelijk Trojaans-paard mechanisme en van waaruit ze niet recirculeren. Overéénkomstig onze studies, werd getoond dat verwijdering van de vaccin injektie-plaats binnen de 2 uur na toediening geen merkbaar effekt heeft op de immunologische respons bij ratten, wat aangeeft dat het adjuvant z’n effekt uitoefent weg van de injektie-plaats, wat de depot-vorming theorie invalideert. Dit is een belangrijk punt aangezien er een delicaat evenwicht blijkt te zijn tussen de doeltreffendheid van Al-adjuvanten en hun potentiële toxiciteit, en deze zouden één en hetzelfde effekt kunnen zijn. De potentiële toxiciteit van Al-adjuvanten hangt vanzelfsprekend af van het feit of het bio-aktief nano-materiaal gelokaliseerd blijft op de injektie-plaatsen of zich eerder verspreidt en accumuleert in afgelegen organen en weefsels. Het laatste blijkt plaats te vinden aangezien de systemische diffusie van Al-adjuvanten, gerapporteerd bij muizen, ook werd gedocumenteerd bij schapen die Al-geïnduceerde granulomas ontwikkelden die blijven bestaan op injektie-plaatsen geassocieerd met gelijkaardige grote macrofagen-infiltraten met verhoogde Al-waarden in de drainerende lymfeknopen.

We toonden tenslotte dat, in tegenstelling met wat eerder werd geloofd over het feit dat de onschadelijkheid van Al-adjuvants kan worden afgeleid van de lage hoeveelheden Al3+ geïnjekteerd met vaccins (“de dosis maakt het gif” paradigma), dat neurotoxische effekten van Al-hydroxide partikels (Alhydrogel®) op een niet-lineaire manier qua dosis-respons reageren met selektieve toxiciteit van de laagste geteste dosis. Vergeleken met hoge concentraties, die geassocieerd waren met spontane vorming van grote partikel-aggregaten en verrassend genoeg geen toxiciteit gaven, veroorzaakten de laagste Al-hydrogel® concentratie selektief cerebrale Al-accumulatie, microgliale aktivatie en lange-termijn neurotoxiciteit bij muizen. Interessant is dat de toxisch lage concentratie kleine agglomeraten vormde ‘met de grote van bakterieën’, die wellicht makkelijker te vangen waren en te transporteren naar afgelegen plaatsen. Het is daarom waarschijnlijk dat de toxiciteit van partikel-adjuvanten opgenomen door immuun-cellen gehoorzaamt aan de specifieke regels van ‘small-particle’ toxicologie eerder dan een simplistische dosis-respons relatie.

Samengevat: onze experimentele resultaten suggereren dat het vasthouden en de lange-termijn bio-persistentie van Al-hydroxide in fagocyterende cellen een eerste vereiste is voor de neuromigratie en neurotoxiciteit in muizen.

7.2. Vergelijken van de toxicologie van verschillende vormen van Al en verschillende types blootstelling is niet correct

Er wordt dikwijls gesteld dat de inname van oraal hoger is dan de hoeveelheid geïnjekteerd Al bij vaccinatie en dat het daarom geen schade kan veroorzaken. Deze oppervlakkige verklaring negeert de uitgesproken verschillen van het lot van Al in de twee situaties.

7.2.1. Oraal Al (initiële waarde 100%): in het geval van een gezonde intestinale barrière, wordt 99,7% van het oraal Al geëelimineerd via de faeces en slechts 0,3% gaat door de barrière, onder atomische vorm, en wordt gebonden door bloed-transporters zoals transferrine, albumine en citraat. Dan wordt > 0,2 % snel geëlimineerd via de urine en de resterende < 0,1% wordt verdeeld over gans het lichaam. Op te merken valt dat lichaamsruimten 41% van de cellen (35 triljoen cellen) beslaat en 59% van de extracellulaire ruimten. Preferentiële Al-verwijdering gebeurt in de extracellulaire matrix van beenderen maar andere organen kunnen ook afzettingen vertonen, voornamelijk extracellulaire. Intoxicatie kan voorkomen op lange-termijn bijzonderlijk in geval van de combinatie van hoge inname bij gewijzigde intestinale barrière en/of nier-insufficiëntie.

7.2.2. Geïnjekteerd Al-hydroxide (initiële waarde 100%): in tegenstelling tot oraal Al, gaat 100% van het initieel adjuvant door de natuurlijke barrière via de naald en bereikt het intern milieu. Het Al is in een slecht-oplosbare partikel-vorm. Niet meer dan 6% van het geïnjekteerd Al wordt snel geëlimineerd via de urine, de resterende 94% wordt gretig gevangen door macrofagen en naar afgelegen organen getransporteerd waar Al-partikels voornamelijk intracellulair blijven. Dus, in tegenstelling tot oraal Al, diffundeert zeer weinig van het ingespoten Al naar de extracellulaire ruimten, het overgrote deel wordt selektief en erg geconcentreerd in een kleine fraktie van de fagocyterende cellen (één van de 200 cel-types van het lichaam, die ca. 3% van het lichaamsgewicht vertegenwoordigen. Deze incorporatie in fagocyterende cellen beperkt de extracellulaire solubilisatie van de partikels en induceert lang-termijn overleving in de cellen. De zeer trage solubilisatie van Al-adjuvant partikels, bijzonderlijk Al-hydroxide, maakt dat de bepaling van Al bloed-waarden bijna nutteloos om Al-adjuvant toxiciteit te bepalen. Wanneer een enkelvoudige dosis adjuvant corresponderend met 0,85 mg Al intramusculair wordt toegediend aan volwassenen, wordt een toename van de Al-concentratie in het plasma van 0,8% verwacht, wat gemaskeerd wordt door de Al-achtergrond als een adjuvant gelabeld met het isotoop 26Al wordt gebruikt. Om dezelfde reden is de spontane cumulatieve urinaire excretie van Al in de urine een paar dagen na de injektie van Al-hydroxide quasi vlak. Dus: Al-adjuvanten veroorzaken gewoonlijk geen massieve intoxicatie door oplosbaar Al zoals eerder werd gedocumenteerd bij patiënten met nier-falen gedialyseerd met Al-bevattend water. In plaats daarvan concentreren de Al-adjuvant partikels zich exclusief in immuun-cellen, een zeer klein deel van het menselijk lichaam, waar ze chronisch hun immunostimulerende adjuvant effekten uitoefenen, tot hun eventuele verwijdering. Als men schat dat de diffusie-ruimte van een lokaal geïnjekteerd adjuvant nauwelijks 1% van de lichaamsruimte overschrijdt vóór solubilisatie van het artikel, dan zou een ruwe berekening aangeven dat een orale dosis Al ca. 1 miljoen hoger moet zijn dan de vaccin-dosis om hetzelfde niveau Al te induceren in fagocyterende antigen-presenterende cellen.

Gespecialiseerde toxicologen zijn er zich nu van bewust dat het vergelijken van de toxicologische eigenschappen van verschillende vormen van Al (oplosbaar vs partikels) toegediend op verschillende manieren (oraal vs intramusculair) incorrect is en, daarom, ontoelaatbaar. Dit vormt een andere reden om “de dosis maakt het gif” regel af te wijzen, om de toxiciteit van Al-hydroxide adjuvant partikels te adresseren.

7.3. Van Al-toxiciteit naar chronische immuun-stimulatie

Meerdere experimentele studies uit de literatuur hebben de potentiële neurotoxiciteit van Al-adjuvanten gedocumenteerd. In een studie induceerde Al-hydrogel® adjuvant, subcutaan geïnjekteerd in muizen aan dosissen die relevant zijn voor de dosis die Amerikaanse GWI-veteranen kregen, motorische gebreken en cognitieve veranderingen geassocieerd met motor-neuron sterfte en een significante stijging van reaktieve astrocyten die duiden op een inflammatoir proces. Daarna werd toxiciteit voor het volwassen of zich ontwikkelend muizen-brein door Al-adjuvant of totale Al-bevattende vaccins gerapporteerd in Canada, Israël en Frankrijk. Op te merken valt dat kleine dieren-studies die toxische effekten tonen van Al-adjuvanten dikwijls als irrelevant worden beschouwd voor de menselijke situatie maar dit is niet het geval voor modellen met grote dieren. Daarom dient te worden benadrukt dat Spaanse dierenartsen hebben gerapporteerd dat multipele Al-bevattende vaccin-toedieningen bij schapen een bifasische neurologische ziekte (inclusief initiële meningo-encefalomyelitis met gedragsmatige veranderingen gevolgd door progressieve spinale neurodegeneratieve wijzigingen) kunnen induceren, wat een onschatbaar model voor het begrijpen van menselijk ASIA biedt. Bovendien bleken meerdere injekties van het adjuvant alleen (Al-hydroxide) – t.o.v. en zoutoplossing als placebo – voldoende om diffusie van Al en granulomas naar de drainerende lymfeknopen te induceren, en de gedrag-veranderingen die worden gezien bij schapen ASIA (inclusief rusteloosheid, aggressie, stereotyp gedrag, isolering van de groep en lethargische toestanden). Injekties met totaal Al-vaccin resulteerde in nog meer uitgesproken effekten dan Al-adjuvant alleen, op lokaal, regionaal en systemisch niveau. Zowel de groepen met het Al-adjuvant alleen als met het totaal vaccin vertoonden merkers voor biologische ziekte, zoals hoge waarden circulerend cortisol, het stress-hormoon, tijdens de winter.

De pathofysiologie van M.E./CVS blijft nog niet goed begrepen maar de klassieke hypothese dat M.E./CVS-patiënten lijden aan een ongeschikte opruiming van pathogenen of toxische stoffen gepaard met immuun-stimulerende effekten [Rosenblum H et al. The common immunogenic etiology of Chronic Fatigue Syndrome: from infections to vaccines via adjuvants to the ASIA syndrome. Infect Dis Clin North Am (2011) 25: 851-63] die leidt tot “langdurige immuun-stimulatie die niet kan worden stopgezet” en gebeurlijke ‘burn-out’ van het immuunsysteem; goed passend bij het bewijsmateriaal dat M.E./CVS-patiënten worden overspoeld met cytokinen tot rond het derde jaar, het tijdstip waarop het immuunsysteem uitgeput raakt en de cytokine-waarden dalen [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: e1400121]. Consistent met patiënten met langdurige M.E./CVS bestudeerd door Hornig et al., vertonen MMF-patiënten typisch immuunsysteem ‘burn-out’ – vastgesteld door significante daling van bepaalde cytokinen in het bloed, met uitzondering van monocyten-chemoattractant CCL2 dat selektief gestegen is.

Er werd aangetoond dat, zelfs bij afwezigheid van initiële inflammatie van het centraal zenuwstelsel, de hersen-microglia op perifere inflammatie reageren door het verhogen van hun aanmaak van MCP-1/CCL2 dat circulerende CCR2 tot expressie brengende monocyten aantrekt. Deze monocyten-influx stuurt met perifere inflammatoire toestanden geassocieerd ziekte-gedrag (vermoeidheid, stemming-aandoeningen, cognitieve dysfunktie en slaap-stoornissen). In de setting van immunisatie wordt MCP1/CCL2 expressie ge-upreguleerd door Al-hydroxide, die waarschijnlijk de respons op vaccinatie stuurt naar T helper 2 immuun-responsen en bevoordeelt de incorporatie van met Al-adjuvant beladen cellen naar de hersenen. Al-hydroxide partikels wekken inflammatie op door het aktiveren van het zogenaamde NALP3-inflammasoom en deze aktivatie medieert vermoeidheid-achtig gedrag bij muizen via neuro-inflammatie. Het hoofd-kenmerk van deze aktivatie is de afgifte van IL-1β, wat (in onze muis-experimenten) werd gedetekteerd bij zowel immuun-cellen en neuronen van de hersenen die beladen zijn met Al-hydroxide partikels. Op dezelfde manier komen chronische pijn syndromen voort uit de hypersensitisatie in de dorsale hoorn van het ruggemerg, en microglia geaktiveerd door een perifeer toegediend adjuvant zoals ‘Freund’s complete adjuvant’ [stimuleert de cel-gemedieerde immuniteit] bleek hyper-sensitisatie te initiëren via de afgifte van IL-1β en andere inflammatoire cytokinen. Dus: Al-adjuvanten die het centraal zenuwstelsel binnenkomen, kunnen de aktivatie van microgliale cellen versterken, getriggerd door perifere inflammatie dat vermoeidheid en pijn opwekt. Het immuunsysteem speelt ook een cruciale rol bij het moduleren van leren en geheugen, en synaptische plasticiteit in de hippocampus is bijzonder sensitief voor neuro-inflammatie. Er werd consistent aangetoond dat neonatale toediening van Al-hydroxide bevattend HBV-vaccin een T helper 2 (Th2) immuun-respons induceert in de periferie, met verhoging van IL-1ß, IL-6 en TNF-α in de hippocampus, en synaptische plasticiteit in de hippocampus hinderen, terwijl neonatale Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccinatie [tegen tuberculose] tegengestelde effekten induceert. Van belang: Al-hydroxide en Al-fosfaat zijn sterke Th2-adjuvanten die waarschijnlijk in synergie kunnen werken met gekende factoren van een Th1 naar Th2 verschuiving van de adaptieve T-cel responsen, inclusief mentale stress, overmatige sympathische stimulatie, te veel glucocorticoïden, hoge waarden vrouwelijke hormonen, immuun-suppressie, chronische infektie of overweldigende mikrobiële belasting. Langdurige Th2-shift werd lang verondersteld aan de basis te liggen van de klinische manifestaties van GWI en er werd consistent immuun-aktivatie met een Th2-shift gedocumenteerd in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Hornig M et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol Psychiatry. (2016) 21: 261-9].

7.4. Toekomstige richtingen die onderzoek verdienen: aangeboren immuun-geheugen en microbioom

7.4.1. Aangeboren immuun geheugen. Bij bijna alle MMF-patiënten manifesteert zich M.E./CVS na multipele immunisaties. De impact van multipele vaccinaties op het immuunsysteem werd zelden onderzocht maar vertegenwoordigt een kritieke kwestie. Er wordt steeds meer aandacht geschonken aan ‘memory’-achtige karkteristieken van aangeboren immuuncellen, inclusief perifere monocyten/macrofagen en hersen-microglia, genaamd getrainde aangeboren immuniteit. [Immuunresponsen worden onderverdeeld in aangeboren en adaptieve. Er werd gedacht dat enkel de laatste aanleiding geven tot immunologisch geheugen. Later werden ook ‘memory’ eigenschappen van de aangeboren immuniteit beschreven. Daarvoor werd de term ‘trained immunity’ bedacht.] Er werd lang geloofd dat, in tegenstelling tot cellen van het adaptief immuunsysteem, monocyten en macrofagen geen immunologisch ‘geheugen’ hebben, en identiek naïef reageren elke keer dat ze worden gestimuleerd. Studies hebben aangetoond dat het aangeboren immuunsysteem zich eigenlijk kan aanpassen aan een langdurig geaktiveerd fenotype door eerdere ontmoetingen met verscheidene mikrobiële of vaccin-stimuli. Na infektie of vaccinatie kunnen monocyten/macrofagen dus funktioneel geherprogrammeerd worden zodat ze een versterkte respons tegen ongerelateerde infekties vertonen. Bijvoorbeeld (zoals hierboven beschreven): BCG-vaccinatie voorkomt tuberculose maar induceert ook niet-specifieke voordelige effekten tegen bepaalde vormen van maligniteit en ongerelateerde pathogenen, en autofagie speelt een sleutel-rol bij deze niet-specifieke effekten. Naast de voordelige effekten van ‘trained innate memory’ kunnen echter evenzeer schadelijke effekten optreden via daaropvolgende immune stimuli die microgliale ‘priming’ veroorzaken, wat neurodegeneratie begunstigt, of via de inductie of het onderhouden van auto-immune en auto-inflammatoire ziekten in geval van opgepaste aktivatie of individuele vatbaarheid. Naar ons weten werd deze kwestie nog niet onderzocht bij M.E./CVS en ASIA.

7.4.2. Microbioom-dysbiose. Immuun-suppressie die typische geassocieerd is met langdurige M.E./CVS, zoals bevestigd is bij MMF-patiënten (zie 7.3.), maakt het mogelijk dat opportunistische ontwikkeling van nog niet geïdentificeerde pathogenen of, meer waarschijnlijk, microbioom-ontregeling kan bijdragen tot M.E./CVS of dit bestendigen. Zoals gesteld in 5.1.3., weerspiegelt lang-bestaande MMF een beperking van de cellen om zich te ontdoen van partikels door de auto/xenofagie machinerie. Individuele beperking van auto/xenofagie verwerking, verbonden met genetische eigenschappen of met veroudering, kan ‘clearance’ van adjuvant-partikels door macrofagen en de inflammatoire respons belemmeren maar het kan op een gelijkaardige manier de ‘clearance’ en immuun-respons op intracellulaire microben beïnvloeden, zoals eerder gedocumenteerd in intestinale epitheliale cellen van patiënten met de ziekte van Crohn en andere IBDs gelinkt met microbioom-dysbiose. In overéénstemming met deze visie lijden MMF-patiënten dikwijls onder abdominale ongemakken en IBD, en hun algemene symptomen kunnen occasioneel verbeteren na antibiotica-therapie. Zowel toediening van L-carnitine als dieet-maatregelen met inname van probiotica lijken van nut te zijn in veel gevallen. Het feit dat klinische symptomen typisch voorkomen na immunisatie bij mensen en schapen, suggereert dat vaccins en hun adjuvanten, gelijkaardig met de verschillende pathogenen die eerder betrokken bleken bij de oorzaak van M.E./CVS, zouden kunnen interageren met verscheidene stressoren om opéénvolgende gebeurtenissen te triggeren die immunologische, metabole, neuro-endocriene en neuro-vegetatieve funkties compromitteren en het lichaam in de richting van een ziekte-toestand duwen (zie figuur hieronder). Mogelijke implicatie van microbioom-dysbiose bij deze gebeurtenissen wordt gesuggereerd door epifaryngitis [ontsteking van de epifarynx, deel van de neus/keel-holte] gedocumenteerd bij Japanese meisjes met door HPV-vaccin geïnduceerde M.E./CVS en door epidemiologisch bewijs dat Franse meisjes die werden geïmmuniseerd tegen HPV een klein maar significant risico op het ontwikkelen van IBD hebben. Merk op: Aluminium per se en mentale stress zijn gevestigde factoren van chronische intestinale inflammatie. Bovendien werd duidelijk getoond bij muizen dat bepaalde microbioom-stammen belangrijke leveranciers zijn van natuurlijke adjuvanten die nodig zijn om een immuun-respons tegen influenza-vaccin op te wekken. Daarom is het niet uitgesloten dat persistente microbioom-soorten de immunologische wijzigingen die werden gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten kunnen induceren [Proal A & Marshall T. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome in the era of the human microbiome: persistent pathogens drive chronic symptoms by interfering with host metabolism, gene expression and immunity. Front Pediatr. (2018) 6: 373], en de zoektocht naar een onevenwicht van microbioom-gemeenschappen bij ASIA-patiënten met of zonder de via bioptie bewezen MMF kan wel eens een rol blijken te spelen in de toekomst.

8. Post-immunisatie M.E./CVS als een kern manifestatie van ASIA

Yehuda Shoenfeld heeft de grote verdienste gehad het concept ASIA te bedenken in 2011. Er werden eerder al opvallende klinische gelijkenissen tussen GWI, MMF-syndroom en M.E./CVS gemeld maar Shoenfeld breidde het concept uit naar de schadelijke effekten van elke stof met adjuvant-eigenschappen, inclusief pathogenen en niet-vaccinale adjuvant-partikels. Microbiële adjuvanten die op een natuurlijke manier aanwezig zijn in pathogenen, waren van de eerste vaccin-adjuvanten, inclusief Mycobacterium-celwanden in ‘Freund’s complete adjuvant’ (waarvan muramyl-dipeptide en trehalose-dimycolaat immunostimulerende molekulen zijn), en het endotoxine van Gram-negatieve bakterieën genaamd lipopolysaccharide (LPS) en z’n adjuvante afgeleide monofosforyl-lipide-A. Silicone-partikels vertegenwoordigen de voornaamste niet-vaccinale minerale partikels met adjuvant-eigenschappen. Patiënten met lekkende silicone borst-implantaten ontwikkelen siliconose – het vrijlaten van silicone-partikels die, zoals microbiële of vaccin-adjuvant partikels, worden opgenomen door macrofagen en vertransporteerd naar lymfoïde organen, en zich manifesteren als een ziekte-complex dat lijkt op M.E./CVS [zie Rosenblum H et al. hierboven]. Shoenfeld stelde dat de meeste ASIA-patiënten M.E./CVS hebben. Er is echter een tendens om het ASIA-concept uit te breiden naar immuun-ziekten buiten M.E./CVS: auto-immune ziekten met post-vaccinale aanvang onset zoals Sjögren’s syndroom [chronische reumatische systemische auto-immuunziekte], narcolepsie [slaap-waakstoornis], antifosfolipiden syndroom [kan leiden tot trombose] en primair eierstok-falen, alsook lymfoma. Het is waar dat mensen met idiopathische M.E./CVS (tot ca. 60 %) kunnen lijden onder auto-immune responsen [European Network on ME/CFS (EUROMENE). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-609] en dat ASIA gelijkenissen vertoont met ongedifferentieerde bindweefsel-ziekte. Het is ook waar dat M.E./CVS geassocieerd is met een verhoogd risico op lymfoma en dat het dramatisch aantal immuun-aandoeningen dat wordt gezien bij Italiaanse militairen (waaronder lymfomas, leukemieën en auto-immuun ziekten), verbonden is met sub-optimale vaccin-praktijken (zoals 5 vaccin-inspuitingen tegelijkertijd). Een Italiaans Senaat-commité heeft de gecumuleerde hoeveelheid non-antigenische vaccin-stoffen die Italiaanse militairen kregen berekend: Al-adjuvanten (7,65 mg corresponderend met 2,57 mg Al), 44 hulpstoffen en 47 contaminanten; dit ligt boven de officiële veiligheid-drempel. Het te ver uitbreiden van het terrein van ASIA loopt echter een groot risico op het vervagen van het kernbeeld. De initieel voorgestelde definitie van ASIA is waarschijnlijk te los en blijft daarom onderwerp van discussie ondanks het extreem praktisch nut: de erkenning dat gelijkaardige klinische beelden gezien kunnen worden bij patiënten blootgesteld aan een waaier van immuun-stimulerende stoffen.

Of post-vaccinale M.E./CVS een authentieke auto-immuun ziekte vertegenwoordigt, zoals de term ASIA suggereert, is ook nog niet volledig vastgelegd. Er werd een aantal auto-antilichamen gerapporteerd bij patiënten met idiopathische POTS en M.E./CVS [zieEuropean Network on ME/CFS (EUROMENE)’ studie hierboven]. In een subset van deze patiënten zijn de auto-antilichamen specifiek gericht tegen neurotransmitter-receptoren aanwezig in het sympathisch zenuwstelsel (incl. ß2 adrenerge receptoren, muscarine-3 en -4 acetylcholine receptoren) en wellicht spelen ze een rol bij de klinische manifestaties zoals gesuggereerd door immuun-absorptie studies [Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove ß2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS One. (2018) 13: e0193672]. Ook B-cel depletie d.m.v. anti-CD20 (rituximab) bleek geassocieerd met volgehouden klinische responsen in een subgroep patiënten met idiopathische M.E./CVS [ondertussen sterk in vraag gesteld]. Wij vonden ook geen melding in de literatuur over detektie van specifieke anti-neuroceptor auto-antilichamen bij post-vaccinale M.E./CVS en zeer weinig bij post-vaccinale POTS. Onze MMF-patiënten hadden onstandvastig lage titers van courante circulerende auto-antilichamen: voornamelijk antinucleaire antilichamen die werden gedetekteerd bij ca. 30% van de patiënten (laag-gradige auto-immuniteit). Daarnaast had een minderheid MMF-patiënten (10-20%) goed gedefinieerde gelijklopende auto-immune aandoeningen (M.S., thyroiditis, dermatomyositis [spierontsteking-ziekte met typische huidafwijkingen], enz.). We herinneren ons niet MMF-gevallen te hebben gezien die evolueerden van pure initiële M.E./CVS naar voldragen specifieke auto-immuun ziekte. Het is daarom niet uitgesloten dat specifieke auto-immuniteit enkel voorkomt in een subset post-immunisatie M.E./CVS-patiënten, vermoedelijk te wijten aan individuele vatbaarheid om een auto-immuun ziekte te ontwikkelen of een specifieke, mogelijks opportunistische, antigen-aanval. Bijvoorbeeld: er werd gesuggereerd dat persisterende microbioom-pathogenen immunologische wijzigingen kunnen induceren bij M.E./CVS-patiënten (incl. veranderde NK-cel funktie, klonale T-cellen en auto-antilichamen) [zie Proal A hierboven]. Tot op heden blijft de rol van specifieke auto-antilichamen tegen neurotransmitter-receptoren – hoewel ze een fascinerende nieuwe kwestie betekenen bij M.E./CVS – ongrijpbaar bij post-immunisatie M.E./CVS. Niettemin heeft het ASIA-concept meer en meer aan populariteit gewonnen bij menselijke en dierlijke medische gemeenschappen: meer dan 4.000 gerapporteerde gevallen in de literatuur – wat er op wijst dat aan een kritieke nood werd voldaan.

9. Een poging tot pathofysiologisch model

Er wordt erkend dat post-infektueuze vermoeidheid optreedt bij ongeveer één op tien mensen die geïnfekteerd raken met het Epstein-Barr virus of Coxiella burnetti (de veroorzaker van Q-koorts) en in een aantal patiënten geïnfekteerd met enterovirussen, Borrelia burgdorferi en andere infektueuze agentia. Langdurige persistentie bleek herhaaldelijk langdurige immuun-aktivatie en M.E./CVS-achtig syndroom te veroorzaken. Zowel menselijke MMF en relevante kleine/grote dieren-modellen geven aan dat hetzelfde geldt voor M.E./CVS volgend op toediening van Al-adjuvanten die ongewoon lang in immuun-cellen blijven.

M.E./CVS heeft een extreem ingewikkelde pathofysiologie die meerdere systemen beïnvloedt. We verwijzen de lezer naar excellente uitgebreide artikels omtrent elk van de aangetaste systemen en hun interakties. In feite is M.E./CVS geassocieerd met: (1) immuunsysteem abnormaliteiten inclusief verstoorde ‘natural killer’ cel funktie en/of T-cel funktie, eerst verhoogde en dan gedaalde aanmaak van inflammatoire cytokinen en occasionele toename van enkele auto-antilichamen; (2) abnormaliteiten van het cellulair metabolisme met verstoord vermogen om energie te produceren uit zuurstof, glucose, vetzuren en aminozuren, geassocieerd met mitochondriale dysfunktie en gereduceerd oxidatief metabolisme; deze veranderingen veroorzaken een abnormale respons op inspanning en bootsen een hibernatie-toestand na [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016) 113: E5472-80]; (3) neuro-endocriene en neurovegetatieve verstoringen inclusief ontregeling van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as (HPA-as) en, bijzonderlijk bij adolescenten, orthostatische intolerantie met abnormale bloeddruk- of hartslag-regeling.

10. Besluit

Adjuvant-veiligheid is een “belangrijk en verwaarloosd gebied”, dat lijdt onder zowel verkeerde opvattingen omtrent Al-adjuvant toxicokinetieken en gebrek aan populatie-studies die verbanden evalueren tussen blootstelling aan Al-adjuvanten en klinische uitkomsten.

M.E./CVS is een multifactoriële aandoening met een belangrijke impact op de publieke gezondheid en van klinisch belang. Er is bewijsmateriaal opgedoken voor het feit dat M.E./CVS een belangrijke type AEFI kan zijn, dit gebeurde traag door de verscheidenheid, het schijnbaar gebrek aan specificiteit, de vertraagde aanvang en frequente medische onderschatting van de symptomen, allemaal kenmerken die ook deel uitmaken van de verklaringen voor de “inherente methodologische beperkingen van epidemiologische studies” op het gebied van vaccin-veiligheid (zie 4.2.). Gelukkiglijk heeft een goed uitgevoerde epidemiologische studie met gevaccineerde vs ongevaccineerde individuen sterk bewijsmateriaal voor post-immunisatie M.E./CVS geleverd. Diepgaande klinische analyse van patiënten met post-immunisatie M.E./CVS heeft zeer consistente cognitieve en funktionele neuro-beeldvorming veranderingen onthuld. De biologische geloofwaardigheid van een verband tussen toediening van adjuvant-partikels en M.E./CVS werd ondersteund door lang-persisterend Al-adjuvant in immuun-cellen van aangetaste individuen (vastgesteld via MMF-detektie in spier-biopt) en door Al-adjuvant transport naar afgelegen organen (gedocumenteerd bij kleine en grote dieren-modellen) met langdurige immuun-stimulerende en ‘low dose’ neurotoxische effekten.

Deze gegevens, die passen bij het ASIA-concept, hebben reeds geholpen recht te spreken voor schade-compensatie in de V.S. en Frankrijk, waar de hoogste administratieve rechtbank besliste 8 van onze patiënten te compenseren voor de gevolgen van verplichte vaccinatie die ze voor professionele redenen hadden ondergaan. We hopen dat dit solide bijkomende epidemiologische en basis-research studies zal triggeren aangaande Al-adjuvanten en hun toxiciteit, individuele vatbaarheid factoren en bevredigende alternatieven voor Al-adjuvanten. Er werden reeds meerdere efficiënte biodegradeerbare adjuvanten zonder schadelijke metalen geïdentificeerd [calcium-fosfaat, adjuvant-systeem AS01, microcrystalien tyrosine].

[Figuur uit ‘European Network on ME/CFS (EUROMENE)’ studie hierboven] Verschillende veranderingen gestuurd door immuun-ontregeling die kunnen worden veroorzaakt door vaccin of adjuvant-partikels in vatbare individuen en waarschijnlijk de kern vormen van ASIA-pathofysiologie: net zoals persistente natuurlijke pathogenen kunnen ze immuunsysteem-ontregeling induceren en de metabole, neuro-endocriene en autonome stoornissen die aan de basis liggen van M.E./CVS-symptomen. Het is waarschijnlijk dat een reeks risico-factoren bijdragen.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.