M.E.(cvs)-wetenschap

mei 30, 2020

Auto-immuniteit-gerelateerde risico-varianten geassocieerd met M.E.(cvs) met infektueuze aanvang

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 6:42 am
Tags: , , , , , , ,

Onderstaand werk werd o.a. financieel ondersteund door het ‘Solve ME Ramsay Grant Program’ (solvecfs.org). We weten al dat Dr. Carmen Scheibenbogen heel wat research doet omtrent het definiëren van de rol van auto-immuneit bij M.E.(cvs). In een overzicht gepubliceerd in ‘Autoimmunity Reviews’ (2018) – getiteld ‘Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an auto-immune disease’, bespreekt ze (samen met andere researchers van het ‘European Network on ME/CFS’ (EUROMENE), auto-immune aspecten van M.E.(cvs). Ze verwijzen daarbij naar de bevindingen omtrent auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen (inclusief neurotransmitter-receptoren) en studies die bewijs leverden voor ernstige metabole stoornissen die waarschijnlijk worden gemedieerd door auto-antilichamen. Lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie’.

In deze studie hier vergeleek Dr. Scheibenbogen’s team ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) die risico kunnen vormen voor auto-immune aandoeningen tussen groepen met M.E.(cvs) en controles. SNPs zijn varianten in genen die bij alle individuen voorkomen. Deze hier beïnvloeden immuniteit-genen die aanleiding kunnen geven tot een meer aktieve immuun-respons en waarvan de dragers een groter risico op auto-immuun ziekten vertonen.

Het feit dat mensen een bepaald SNP (risico-variant) dragen betekent niet noodzakelijk dat ze een auto-immuun ziekte zullen ontwikkelen. Associatie-studies zoals deze hier kunnen bepalen of een SNP verband houdt met een ziekte en informatie leveren over het mechanisme dat de ziekte veroorzaakt.

Het onderzoeksteam vond dat SNPs geassocieerd met een hoger risico voor auto-immuniteit in de genen PTPN22 & CTLA4 frequenter voorkwamen bij M.E.(cvs)-patiënten waarvan de ziekte was begonnen met een infektie. Deze genen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de aktivatie van B- & T-cellen. Scheibenbogen stelt: “Onze bevinding levert bewijsmateriaal dat M.E./CVS een auto-immuun ziekte is bij de subgroep van patiënten waarvan de ziekte werd getriggerd door een infektie.”.

Ze wil dan ook verder gaan met de klinische studies aangaande behandeling met IgG of immuno-adsorptie om auto-antilichamen aan te pakken. In een piloot-studie (Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove β2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS ONE (2018) 13: e0193672) werden echter slechts 10 patiënten (met post-infekueuze M.E./CVS behandeld) dus conclusies zijn voorbarig…

————————-

Frontiers in Immunology Vol 11, p 578 (april 2020)

Autoimmunity-related risk variants in PTPN22 and CTLA4 are associated with ME/CFS with infectious onset

Sophie Steiner (1), Sonya C. Becker (1), Jelka Hartwig (1), Franziska Sotzny (1), Sebastian Lorenz (1), Sandra Bauer (1), Madlen Lobel (2), Anna B. Stittrich (3,4), Patricia Grabowski (1), Carmen Scheibenbogen (1,3)

1 Institute of Medical Immunology, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universitat (FU) Berlin, Humboldt-Universitat zu Berlin and Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Germany

2 Carl-Thiem-Klinikum Cottbus gGmbH, Research Centre, Cottbus, Germany

3 BIH Center for Regenerative Therapies, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

4 Labor Berlin-Charité Vivantes GmbH, Berlin, Germany

Samenvatting

Er werden ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNP) in verscheidene genen beschreven die geassocieerd bleken met vatbaarheid voor auto-immuun ziekte. In deze studie werd het genotype van patiënten met Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) en controles bepaald voor vijf immuun-gen SNPs: tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22, rs2476601), cytotoxisch T-lymfocyten geassocieerd proteïne-4 (CTLA4, rs3087243), tumor necrose factor (TNF, rs1800629 & rs1799724) en interferon regulerende factor 5 (IRF5, rs3807306), die behoren tot de belangrijkste risico-varianten voor auto-immuun ziekten. Analyse van 305 M.E./CVS-patiënten en 201 gezonde controles toonde significante associaties van de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-allelen bij M.E./CVS. De associaties werden enkel gevonden bij M.E./CVS-patiënten die een infektie als acute aanvang van de ziekte rapporteerden (PTPN22 rs2476601: OR 1.63, CI 1.04-2.55, p = 0.016; CTLA4 rs3087243: OR 1.53, CI 1.17-2.03, p = 0.001), maar niét bij M.E./CVS-patiënten zónder infektie-getriggerde aanvang (PTPN22 rs2476601: OR 1.09, CI 0.56-2.14, p = 0.398; CTLA4 rs3087243: OR 0.89, CI 0.61-1.30, p = 0.268). Deze bevinding levert bewijs dat auto-immuniteit een rol kan spelen bij M.E./CVS met een infektie-getriggerde aanvang. Beide genen spelen een sleutelrol bij de regulering van B- en T-cel aktivatie.

INLEIDING

[…] Het onderliggend pathomechanisme van M.E./CVS wordt nog niet goed begrepen maar er is overtuigend bewijsmateriaal voor het feit dat, ten minste in een subgroep patiënten, auto-immuniteit bijdraagt tot de ziekte-etiologie [Blomberg J et al. Infection elicited autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: an explanatory model. Front Immunol. (2018) 9: 229 /// Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9]. Er werden door verschillende teams auto-antilichamen tegen verscheidene antigenen, inclusief neurotransmitter-receptoren, gerapporteerd. […]

Verhoogde immuun-aktivatie en verstoring van de immunologische tolerantie worden beschouwd als belangrijke risco-factoren voor auto-immuniteit. Auto-immuun ziekten worden als multifactorieel gezien, met betrokkenheid van genetische en milieu-factoren. De ziekte-aanvang wordt dikwijls getriggerd door infekties, en de link tussen infekties en auto-immuun ziekten is welbekend. Genoom-wijde associatie studies hebben onthuld dat ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in verscheidene genen geassocieerd zijn met het risico op het ontwikkelen van auto-immuun ziekten. Voor de meeste van deze SNPs werd gevonden dat ze leiden tot winst- of verlies-van-funktie in enzymen of transcriptie-factoren die een rol spelen bij B- & T-cel aktivatie of cytokine-produktie en -signalisering, wat cruciale mechanismen zijn voor de ontwikkeling van auto-immune ziekten. Bij de meest frequente varianten geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten horen: het tyrosine-fosfatase non-receptor type-22 (PTPN22) SNP rs2476601, het cytotoxische T-lymfocyten-geassocieerde proteïne-4 (CTLA4) SNP rs3087243, het interferon regulerende factor-5 (IRF5) SNP rs3807306 en het SNP rs1800629 in het tumor necrose factor (TNF) gen.

Het PTPN22 SNP rs2476601 is één van de belangrijkste vatbaarheid loci voor auto-immuniteit en is geassocieerd met myasthenia gravis (MG) [ernstige spierzwakte], type-1 diabetes (T1D), Systemische Lupus Erythematosus (SLE), Reumatoïde Artritis (RA) en andere auto-immuun aandoeningen. Dit SNP bleek een belangrijke rol te spelen in T- & B-cel receptor signalisering. Het SNP rs3087243 in CTLA4 is geassocieerd met meerdere auto-immuun ziekten, inclusief SLE, RA, T1D & Graves’ ziekte. Het CTLA4 SNP heeft een beschermend effekt, en het majeur allel-G is geassocieerd met auto-immuniteit. Het G-allel leidt tot een verstoorde negatieve regulering van T-cell aktivatie. Bij Multipele Sclerose (MS) patiënten bleken homozygote dragers van het G-allel significant minder CTLA4 proteïne tot expressie te brengen in CD4+ T-cellen. Een SNP in IRF5, rs3807306, is een ander courant auto-immuun vatbaarheid locus geassocieerd met RA, SLE, MS & Crohn’s (C.D.), en is verbonden met hogere serum interferon-α (IFNα) aktiviteit […] bij SLE. Het SNP rs1800629 in TNF is gelinkt met verscheidene auto-immuun ziekten, inclusief C.D., coeliakie, RA & SLE. Een ander SNP in het TNF gen, rs1799724 is geassocieerd met C.D. en auto-immune hepatitis (AIH). Er werden hogere serum-waarden qua TNFα aangetoond in dragers van het TNF rs1799724 risico-genotype, terwijl voor het SNP rs1800629 de gegevens omtrent een verband met gestegen TNFα serum-waarden niet overtuigend zijn.

Er is een systematisch overzicht dat de studies over genetische varianten die geassocieerd zijn met M.E./CVS samenvat [Wang T et al. A systematic review of the association between fatigue and genetic polymorphisms. Brain Behav Immun. (2017) 62: 230-44]. Er werden meerdere SNPs in cytokinen en humaan leukocyten antigen (HLA) associaties gevonden bij M.E./CVS. Twee SNPs in TNF, rs1800629 (TNF-308) & rs1799724 (TNF-857), werden vergeleken tussen een M.E./CVS- en controle-groep [Carlo-Stella N et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. (2006) 24: 179-82]. Er werd een hogere frequentie van het TNF-857 T-allel gevonden bij M.E./CVS. Analyse van genetische varianten in PTPN22, CTLA4 & IRF5 werden nog niet beschreven bij M.E./CVS.

Hier vergeleken we de prevalentie van de 5 hierboven beschreven SNPs bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. De aanvang van M.E./CVS wordt getriggerd door een infektie bij ca. twee derden van de patiënten. De link tussen infekties als trigger van auto-immuun ziekten is goed ingeburgerd. Daarom bestudeerden we ook een mogelijk verband van deze SNPs met een infektie-getriggerde ziekte-aanvang (ITO).

MATERIALEN & METHODES

Patiënten en controles

M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose in de immunodeficiëntie-kliniek van het ‘Institute for Medical Immunology’ aan de Charité Univeristeit (Berlijn). De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria (CCC) en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Auto-immuun ziekten waren een exclusie-criterium, met uitzondering van Hashimoto’s thyroïditis, wat wordt geklassificeerd als co-morbiditeit bij M.E./CVS. […] 232 op 305 patiënten verklaarden dat hun ziekte een acute aanvang met een infektie (ITO) had gekend. We verzamelden retrospectief de gegevens van de types infektie […]: ‘respiratoire of gastro-intestinale infektie’, ‘primaire EBV’ [Epstein-Barr Virus; veroorzaker van mononucleose] of ‘virale/bakteriële infektie’. […]

DNA-extractie en PCR ter onderscheiding van allelen

[…] Genomisch DNA verkregen uit totaal-bloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) […]

Beoordeling van oplosbare immuniteit-merkers en lymfocyten

Lymfocyten-fenotypering d.m.v. flow-cytometrie: CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen. Serum-proteïnen analyse: C-reaktief proteïne (CRP), complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2 receptor (IL-2R), IgG en TNFα in LPS-gestimuleerde totaal-bloed cellen […].

Statistische analyse

[…] p ≤ 0.05 werd beschouwd als statistisch significant.

RESULTATEN

Analyse van de verdeling van allelen en genotypes

305 M.E./CVS-patiënten [gemiddelde leeftijd 44; ca. 2/1 vrouwen/mannen] en 201 gezonde controles werd geanalyseerd wat betreft mogelijke ziekte-associatie van de PTPN22, CTLA4, TNF & IRF5 SNPs […].

We vonden een significant toegenomen frequentie van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A, wat leidt tot vatbaarheid voor auto-immuniteit, bij M.E./CVS-patiënten (allel-frequentie (AF) 12%, odds ratio (OR) 1.50, p = 0.033) t.o.v. gezonde controles (AF 8%, n = 201). Bij subgroepering van de patiënten volgens het type ziekte-aanvang, zagen het significant verband van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A enkel bij patiënten mét ITO (AF 13%, OR 1.63, n = 232, p = 0.016) maar niet bij deze zonder ITO (AF 9%), vergeleken met gezonde controles (AF 8%).

Ook de frequentie van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G is significant hoger bij M.E./CVS-patiënten (AF 63%, OR 1.34), verleken met gezonde controles (AF 56%). Weerom zagen we een significant verband van het CTLA4 rs3087243 risico-allel G enkel bij patiënten mét ITO (AF = 66%, OR = 1.53, p = 0.001) maar niet bij deze zonder ITO (AF 53%), vergeleken met gezonde controles (AF 56%).

Omgekeerd: de AF van het IRF5 rs3807306 risico-allel T was significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 41%, OR 0.68, p = 0.023), vergeleken met gezonde controles (AF 51%). Er werd geen verschil gezien qua risico AF van het TNF rs1800629 SNP tussen patiënten en controles, maar de AF van het TNF rs1799724 risico-allel T was weer significant lager bij M.E./CVS-patiënten zónder ITO (AF 8%, OR 0.55, p = 0.043), vergeleken met gezonde controles (AF 13%). Er werden geen associaties met IRF5 of TNF gevonden bij patiënten met ITO.

We analyseerden ook de genotype-verdeling voor CTLA4 rs3087243 & PTPN22 rs2476601. We vonden een significant verschil tussen de M.E./CVS-patiënten mét ITO, vergeleken met gezonde controles (CTLA4 rs3087243: p = 0.0061; PTPN22 rs2476601: p = 0.026). M.E./CVS-patiënten zonder ITO hadden een gelijkaardige genotype-verdeling als gezonde controles.

Associatie van infektie-getriggerde aanvang en PTPN22 & CTLA4 varianten met immuniteit-merkers

We vergeleken aantallen CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en CD19+ B-cellen, CPP, complement-proteïnen C3 & C4, oplosbare IL-2R, IgG en TNFα bij M.E./CVS-patiënten mét en zonder ITO. Patiënten mét ITO hadden minder CD19+ B-cellen (p = 0.05) en er was een trend voor lagere lower C3-waarden. Bij patiënten met beide, waren risico-allel in PTPN22 rs2476601 of het homozygoot risico-allel voor CTLA4 rs3087243, C4-waarden (p = 0.06 & 0.004, respectievelijk) maar niet C3-waarden gedaald, terwijl er geen verschil was qua aantallen B-cellen.

CRP-concentraties waren significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en zonder de risico-allelen van PTPN22 rs2476601-A & CTLA4 rs3087243-G.

CD3+, CD4+ & CD8+ T-cellen, en concentraties oplosbare IL-2R, TNFα en IgG verschilden niet tussen patiënten-subgroepen en risico-varianten.

BESPREKING

In deze studie evalueerden we 5 belangrijke SNPs die geassocieerd zijn met verscheidene auto-immuun ziekten bij M.E./CVS-patiënten. De geselekteerde patiënten zijn representatief voor M.E./CVS-groepen waar andere groepen over rapporteerden (twee derden vrouwen, met een ITO en een gemiddelde ziekte-ernst met een Bell-score van 30 [score van 100 = gezonde individuen; < 30 = ernstig]). Overéénkomstige een Amerikaanse studie, werd de M.E./CVS-aanvang bij onze patiënten het meest frequent getriggerd door een acute respiratoire infektie of vermoedelijke virale infektie. Ook een primaire EBV-infektie tijdens de adolescentie is een goed gekende trigger van M.E./CVS en werd gerapporteerd door 19% van onze patiënten. Een primaire EBV-infektie bij volwassen staat bekend als risico-factor voor verscheidene auto-immuun ziekten.

We vonden een sterke associatie van de auto-immuniteit risico-allelen in CTLA4 rs3087243-G & PTPN22 rs2476601-A bij ITO M.E./CVS. Het dragen van het PTPN22 rs2476601 risico-allel A verhoogde de kans op het ontwikkelen van infektie-getriggerde M.E./CVS met 1,6 maal. Bij dragers van het risico-allel G van CTLA4 rs3087243 was de kans op het ontwikkelen van ITO M.E./CVS 1,5 maal hoger. Dienoveréénkomstig was de genotype-verdeling voor beide SNPs significant verschillend bij M.E./CVS-patiënten mét ITO vergeleken met gezonde controles.

Zowel de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 SNPs bleken geassocieerd met talrijke auto-immuun ziekten, inclusief T1D, SLE en RA. PTPN22 codeert voor een lymfoïd tyrosine-fosfatase dat als een sterke negatieve regulator van T-cel aktivatie werkt. Een studie levert bewijs voor het feit dat het auto-immuun risico-allel A van PTPN22 rs2476601 leidt tot winst- of verlies-van-funktie. Dit kan leiden tot lagere T-cel receptor signalisering en het onvermogen om autoreaktieve T-cellen te verwijderen of verminderde aktiviteit van Tregs. Bovendien zou het PTPN22 rs2476601 risico-allel kunnen bijdragen tot het genereren van autoreaktieve B-cellen via stoornissen in de klonale deletie [verwijdering van B- of T-cellen die receptoren tegen lichaamseigen (‘self’) tot expressie brengen, vooraleer ze zich ontwikkelen tot volledig immunocompetente lymfocyten] en receptor-opmaak, wat leidt tot verstoorde centrale [immuun-] tolerantie. Dit wordt ondersteund door de bevinding dat de sterkste verbanden met dit SNP worden gevonden bij auto-immuun ziekten waarbij autoreaktieve T-cellen en auto-antilichamen een grote rol spelen in de pathogenese van de ziekte. In tegenstelling daarmee hebben auto-immuun ziekten waarbij Th17-cellen een belangrijke rol spelen, en die van mucosa [slijmvliezen], de neiging geen associatie met PTPN22 te vertonen.

CTLA4 komt tot expressie op CD4+ & CD8+ T-cellen na aktivatie en heeft een cruciale rol als negatieve T-cel regulator om geaktiveerde T-cellen uit te zetten. Het risico-allel G van rs3087243 leidt tot gedaalde waarden van oplosbaar CTLA4 mRNA, wat resulteert in versterkte T-cel aktiviteit.

Vergelijkbaar met onze bevindingen bleken zowel de PTPN22 rs2476601 als de CTLA4 rs3087243 risico-varianten vatbaarheid-loci te zijn voor auto-immuun ziekten, inclusief anti-neutrofiel cytoplasmatisch antilichaam (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV) en polyglandulaire [met betrokkenheid van meerdere hormoon-producerende klieren] auto-immuniteit zijn. Naar ons weten werd de frequentie van deze SNPs nog niet bestudeerd bij andere M.E./CVS-patiënten.

We correleerden onze SNP-gegevens verder met immuun-merkers. Bij patiënten met zowel het risico-allel in PTPN22 rs2476601 of de homozygote risico-allelen voor CTLA4 rs3087243 waren de C4- maar niet C3-waarden gedaald. Een associatie van deze risico-varianten met C4-waarden werd in de literatuur niet beschreven. Lage C4-waarden komen echter frequent voor bij SLE, een ziekte die geassocieerd is met zowel het risico-allel in PTPN22 als CTLA4.

Bij vergelijking van patiënten-subgroepen hadden enkel deze met ITO minder CD19+ B-cellen. B-cel lymfocytopenie [gering aantal lymfocyten in het bloed] is een frequente bevinding bij SLE & RA, en levert verder bewijs voor een auto-immuun mechanisme bij M.E./CVS-patiënten met ITO. In tegenstelling daarmee waren CRP-waarden significant hoger bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO en deze zonder risico-allelen. Dit zou kunnen suggereren dat, binnen de subgroep M.E./CVS-patiënten zonder ITO, er een aanleg is voor een meer pro-inflammatoire respons gelijkaardig met patiënten met kanker-gerelateerde vermoeidheid.

Voor het IRF5 rs3807306 risico-allel T zagen we een significant lagere AF bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO t.o.v. controles. Deze bevinding is onverwacht en dient te worden bevestigd. We konden geen verschil detekteren wat betreft de frequentie van de TNF rs1800629 AF tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles maar we vonden weer een significant lagere AF voor de TNF rs1799724 bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO vergeleken met controles. Deze bevinding is tegengesteld aan die van een eerdere studie waarbij 80 M.E./CVS-patiënten werden geanalyseerd, waar een hogere frequentie voor het TNF-857 rs1799724 risico-allel werd gevonden [zie Carlo-Stella N et al. hierboven]. We hebben geen voor de hand liggende verklaring voor dit verschil. De patiënten-groep in de studie uit 2006 kreeg de diagnose op basis van de Fukuda criteria, die minder strikt zijn dan de CCC criteria die in onze studie worden gebruikt. Interessant: deze SNPs zijn geassocieerd met verhoogde serum-waarden van TNFα & IFNα, en ook met auto-immuun ziekten van mucosa. Het is verleidelijk om te speculeren dat patiënten die hogere waarden TNFα & IFNα kunnen produceren, een meer doeltreffende mucosale immuniteit hebben en daarom minder vatbaar zijn om M.E./CVS te ontwikkelen. Dit komt overéén met onze eerdere observatie dat een deficiëntie van de complement-factor mannose-bindend lectine (MBL [speelt een rol bij de aangeboren immuniteit]), wat resulteert in vatbaarheid voor infekties, geassocieerd is met M.E./CVS [Guenther S et al. Frequent IgG subclass and mannose binding lectin deficiency in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Hum Immunol. (2015) 76: 729-35].

Er zijn andere varianten van immuun- of immuun-gerelateerde genen beschreven bij M.E./CVS [zie Wang T et al. hierboven]. Meerdere SNPs in HLA klasse-II bleken geassocieerd met M.E./CVS [Smith J et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol. (2005) 58: 860-3 /// Carlo-Stella N et al. Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2009) 22: 745-54 /// lees ook ‘Humaan Leukocyten Antigen allelen gelinkt met M.E.(cvs)]. Dit verband is een ander bewijs voor een auto-immuun pathomechanisme, aangezien de link tussen bepaalde HLA-allelen en auto-immuniteit vastgesteld is. Bovendien zijn er studies die een associatie tonen met meerdere SNPs in het glucocorticoïd receptor gen Nucleaire Receptor Subfamilie-3 Groep-C Lid-1 (NR3C1). Deze receptor speelt een rol in de regulering van de inflammatoire respons voor aantasting van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as (HPA) aktiviteit via cortisol-afgifte [Rajeevan MS et al. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Voor M.E./CVS werd een ontregelde HPA-as gerapporteerd. Op een zelfde manier zouden SNP-varianten van het catechol-O-methyltransferase (COMT) gen en de ß2adrenerge receptor (beschreven bij M.E./CVS) de immuun-respons kunnen moduleren [adolescenten]. Verdere studies vonden associaties met SNPs die niet gerelateerd zijn met het immuunsysteem, zoals varianten geassocieerd met het spier-metabolisme [Golf Oorlog veteranen] en het serotonerg systeem [Smith AK et al. Genetic evaluation of the serotonergic system in Chronic Fatigue Syndrome. Psychoneuroendocrinology. (2008) 33: 188-97].

Tot besluit: onze studie toont dat de PTPN22 rs2476601 & CTLA4 rs3087243 auto-immuniteit risico-varianten frequenter voorkomen bij patiënten met ITO M.E./CVS. Deze bevinding biedt verder bewijs dat er een genetische voorbestemdheid voor M.E./CVS is. De associaties met PTPN22 & CTLA4 SNPs wijzen op een rol van autoreaktieve T- & B- cellen in het pathomechanisme van M.E./CVS. In tegenstelling daarmee suggereren het ontbreken van een associatie van CTLA4 & PTPN22 SNPs, en de lagere frequenties van IRF5 & TNF risico-varianten bij M.E./CVS-patiënten zonder ITO, dat het pathomechanisme verschillend is. Deze associaties dienen te worden bevestigd bij andere M.E./CVS patiënten-groepen. Onze bevindingen zetten ons aan research naar auto-immune mechanismen te intensifiëren en klinische studies met medicijnen gericht tegen autoreaktieve B-cellen uit te voeren.

mei 17, 2020

HHV-6 reaktivatie, mitochondriale fragmentatie en antivirale & metabole fenotypes bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Infektie — mewetenschap @ 6:44 am
Tags: , , , , , , , ,

Onderstaand onderzoek (o.a. gefinancierd door ‘Solve M.E. Initiative’) toont een connectie tussen het courant voorkomend humaan herpes virus-6 (dat DNA-materiaal achterlaat in de cellen) en veel van de symptomen van M.E.(cvs).

Een team researchers van de ‘University of California San Diego School of Medicine’ en drie Duitse universiteiten illustreert hoe de inspanningen die het lichaam levert om de bescherming door het immuunsysteem op te krikken, kunnen leiden tot fysiologische uitputting. Ze focusten daartoe op Humaan Herpes Virus 6 (HHV-6), dat kan sluimeren (virale latentie) door te integreren in de chromosomen.

Eén van de auteurs, Robert Naviaux (de bedenker van de ‘cell-danger response’) stelt voor dat cellen al hun energie aanwenden voor hun verdediging en overleving, zodat ze er niet genoeg over hebben voor een normale cellulaire aktiviteit) liet optekenen: “Deze bevindingen zijn belangrijk omdat ze voor ‘t eerst tonen dat er antivirale aktiviteit in het serum van M.E.(cvs)-patiënten werd aangetroffen die nauw verbonden is met een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verminderde cellulaire energie (ATP-produktie).”. En “Het biedt een verklaring voor de observatie dat M.E.(cvs)-patiënten minder virale infekties ervaren nadat ze de ziekte kregen. Ons werk helpt ook de link met eerdere infektie met Humaan Herpes Virus-6 (HHV-6) of HHV-7 begrijpen.”.

90 % van de bevolking wordt vóór de leeftijd van drie blootgesteld aan HHV-6. Het virus-DNA nestelt zich dan in een chromosoom en blijft er jaren lang latent in slechts enkele cellen. Voor de meeste mensen geeft dit geen problemen.

Hier werd echter gevonden dat blootstelling aan nieuwe metabole of chemische stressoren de cellen (met een geïntegreerde copie van of HHV-6), aanzet om naburige cellen te waarschuwen voor een bedreiging. De aktiviteit (een substantie die door HHV-6 geïnfekteerde cellen wordt gesekreteerd) beschermt andere cellen tegen nieuwe infekties (“super-infektie”) met RNA- & DNA-virussen maar veroorzaakt ook een fragmentatie van het mitochondriaal netwerk en verlaagt hun intracellulaire ATP-reserve (energie-voorraad). De researchers dienden cultuur-medium van cellen met HHV-6 reaktivatie toe aan gezonde cellen: ze zagen wijzigingen in mitochondriale strukturen geassocieerd met een lage metabole toestand. Dezelfde strukturele veranderingen werden ook gevonden als gezonde cellen werden gekweekt in medium met serum van M.E.(cvs)-patiënten. Cellen zonder een geïntegreerde copie van of HHV-6 sekreteren die antivirale activiteit niet.

De resultaten tonen, volgens de auteurs, dat de cellulaire bio-energetische vermoeidheid en cellulaire verdediging twee zijden van hetzelfde muntstuk zijn bij M.E.(cvs): Wanneer energie wordt verbruikt voor de verdediging van de cellen, is die niet meer beschikbaar voor normale cel-funkties (groei, herstel, en de werking van het neuro-endocrien systeem en het autonoom zenuwstelsel).

De bevindingen belichten verder het concept (de ‘cell-danger response’ (CDR) theorie) dat Naviaux al jaren onderzoekt. Deze theorie stelt dat chronische ziekte het gevolg is van de blokkage van een cyclus van natuurlijk herstel door ontwrichtingen op metabool en cellulair niveau. Bij M.E.(cvs) leidt dit alles tot levenslange ziekte.

HHV-6 & HHV-7 spelen dus misschien een rol bij de ziekte maar of ze dé (enige) oorzaak zijn …? Er wordt getoond dat met HHV-6 geïnfekteerde of gereaktiveerde celllen een krachtige metabole en mitochondriale her-modelerende respons kunnen opwekken die zelfs de cellen die geen virus bevatten kunnen leiden naar een hypo- (abnormaal lage) metabole toestand. Dus: zelfs (virus-gereaktiveerde) cellen met een laag aantal copieën van het virus in het bloed hebben nog een impact op de energie-produktie van andere cellen bij M.E.(cvs). De auteurs geloven dat dit mechanisme ook geldt voor gevallen die getriggerd zijn geweest door andere virussen.

Er zijn nu grotere studies nodig om de resultaten te valideren. De vraag blijft ook waarom reaktivatie van latent HHV-6 DNA in slechts enkele cellen genoeg zou om een signaal af te geven dat andere cellen doet ‘slapen’ en waarom dat enkel bij M.E.(cvs) gebeurt? Is er misschien een genetische factor in het spel? Er dient ook te worden gezocht naar de substantie die de cellen in ‘alarm’ zet en hun energie-produktie ondermijnt; en naar manieren om het signaal (waarvan de auteurs denken dat het niet-geïnfekteerde cellen in de ‘cell danger’ modus zet) te blokkeren…

————————-

ImmunoHorizons Vol 4, #4, pp 201-215 (april 2020)

Human Herpesvirus-6 reactivation, mitochondrial fragmentation, and the coordination of antiviral and metabolic phenotypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Philipp Schreiner (1), Thomas Harrer (2), Carmen Scheibenbogen (3), Stephanie Lamer (4), Andreas Schlosser (4), Robert K. Naviaux (5), Bhupesh K. Prusty (1,5,6)

1 Lehrstuhl fur Mikrobiologie, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

2 Medizinische Klinik 3, Universitatsklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nurnberg, Germany

3 Institut fur Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum, Germany

4 Rudolf-Virchow-Zentrum fur Experimentelle Biomedizin, Julius-Maximilians Universität Wurzburg, Germany

5 Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

6 Department of Pediatrics, School of Medicine, University of California, San Diego

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een multi-factoriële aandoening met veel mogelijke triggers. Humaan herpesvirus (HHV)-6 & HHV-7 zijn twee infektueuze triggers waarvoor het bewijsmateriaal omvangrijker werd. Om de mogelijke oorzakelijke rol van HHV-6 bij M.E./CVS te begrijpen, werden metabole en antivirale fenotypes van U2-OS cellen bestudeerd met en zonder chromosomaal geïntegreerde HHV-6, en met en zonder virus-reaktivatie gebruikmakend van de histoon-deacetylase inhibitor trichostatine-A [TSA]. Er werd proteoom-analyse uitgevoerd d.m.v. isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur analyse. De door HHV-6 transaktivatie geïnduceerde antivirale eigenschappen werden bestudeerd in virus-naïeve A549 cellen belast door infektie met influenza-A (H1N1) of HSV-1. Fragmentatie van mitochondrieën, en 1-koolstof metabolisme, dUTPase en thymidylaat-synthase bleken sterk geïnduceerd door HHV-6 reaktivatie, terwijl superoxide-dismutase-2 en proteïnen vereist voor mitochondriale oxidatie van vetzuren, aminozuren en glucose-metabolisme, inclusief pyruvaat-dehydrogenase, sterk waren geïnhibeerd. Transfer van supernatanten van U2-OS cellen na reaktivatie van HHV-6A leidde tot een antivirale toestand in A549 cellen zodat superinfektie met influenza-A en HSV-1 werden voorkomen. Adoptieve transfer van serum van 10 patiënten met M.E./CVS veroorzaakte een gelijkaardige fragmentatie van mitochondrieën en de geassocieerde antivirale toestand in de A549 cel test. Tot besluit: HHV-6 reaktivatie bij M.E./CVS-patiënten aktiveert een multisystemische, pro-inflammatoire, ‘cell-danger’ respons die beschermt tegen bepaalde RNA- en DNA-virus infekties maar ten koste van mitochondriale fragmentatie en ernstig verstoord energie-metabolisme.

INLEIDING

Humaan herpesvirus (HHV)-6A & -6B zijn neurotrope virussen [gericht op het zenuwstelsel] die reeksen telomeer- ‘repeats’ [herhaalde DNA-sequenties] dragen aan beide uiteinden van hun lineair genoom, wat hun genoom-integratie in menselijke chromosomen vergemakkelijkt en leidt tot latentie [virale latentie = de fase in de levenscyclus van een virus waarbij, na initiële infektie, de proliferatie van virus-partikels ophoudt]. Chromosomaal geïntegreerd HHV-6 (ciHHV-6) wordt nu en dan genetisch overgeërfd (iciHHV-6). Ca. 0,2-1% van de bevolking draagt iciHHV-6 en 90-100% is geïnfekteerd op de leeftijd van 3 jaar. HHV-7 is een ander lid van de beta-herpesvirus familie dat gelijkaardige genoom-integratie kenmerken heeft als HHV-6. HHV-6 & HHV-7 zijn dikwijls geassocieerd met meerdere menselijke ziekten, inclusief Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), waar ook mitochondriale dysfunktie bij betrokken is. Er wordt al lang voorspeld dat mitochondriale dysfunktie een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van en/of progressie van M.E./CVS. Een gewijzigde mitochondriale dynamiek, deficiënte mitochondriale ATP-aanmaak en verhoogde oxidatieve stress werden bij M.E./CVS gerapporteerd. Biofysische veranderingen in cellen van M.E./CVS-patiënten die onder osmotische stress werden geplaatst werden gebruikt als een [mogelijke] vernieuwende diagnostische test voor M.E./CVS [Davis RW et al. A nanoelectronics-blood-based diagnostic biomarker for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2019- 116: 10250-10257]. De exacte antecedent voor mitochondriale modulatie bij M.E./CVS is echter grotendeels onbekend. We hebben aangetoond dat HHV-6A reaktivatie mitochondriale fragmentatie induceert [Prusty BK et al. HHV-6 encoded small non-coding RNAs define an intermediate and early stage in viral reactivation. NPJ Genom. Med. (2018) 3: 25]. In deze studie hier onderzochten we potentiële infektueuze oorzaken en molekulaire mechanismen van mitochondriale dysfunktie, die wellicht resulteren in de ontwikkeling en/of progressie van M.E./CVS, gebuikmakend van HHV-6A reaktivatie als model. Onze resultaten tonen een serum-transfereerbare aangeboren immuun-aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten die een toestand van lage mitochondriale aktiviteit gepaard met veranderingen qua mitochondriale dynamiek induceert, wat kan bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte.

MATERIALEN & METHODES

Cel-culturen en virale infektie

A549 [long-carcinoom] cellen […]. U2-OS [beender-osteosarcoom] cellen […] dragen latent HHV-6A.

[…]

Bloed-afname, DNA-extractie en kwantitatieve PCR van HHV-6 & HHV-7 DNA

[…]

RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

[…]

ATP-test

[…]

Microscopie van de mitochondrieën en kwantificaties

[…] Meting van mitochondriale oppervlakte. […]

Fluorescentie in situ hybridisatie analyse

FISH [fluorescentie in-situ hybridisatie; techniek waarbij (delen van) chromosomen gekleurd worden en vervolgens onder een fluorescentie-microscoop worden bekeken] ter detektie van HHV-6A klein niet-coderend RNA-U14 (sncRNA-U14) [volgens Prusty BK et al. (zie hierboven), een merker voor virale reaktivatie].

Cytokine-analyse in PBMCs

De diagnose van M.E./CVS werd gesteld aan de Charité kliniek voor immunodeficiënties op basis van de Canadese Consensus Criteria en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. Gezonde controles (HCs) gematcht voor leeftijd en geslacht werden gerecruteerd bij het personeel […].

Cytokine-produktie door monocyten […] en T-lymfocyten […]: kwantificatie van TNF-α & IL-1β in met LPS-gestimuleerde, en Il-5 & IFN-γ in met ConA gestimuleerde stalen, d.m.v. ELISA […].

Gepulseerde stabiele isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur

[op massa-spectrometie gebaseerde techniek die verschillen qua hoeveelheden proteïnen detekteert gebruikmakend van labeling met niet-radioaktieve isotopen] […]

MS en MS gegevens-analyse

[…]

Statistiek

[…]

Toegankelijkheid van de gegevens

[…]

RESULTATEN

HHV-6A reaktivatie induceert mitochondriale dysfunktie

Verscheidene pathogene infekties wijzigen de mitochondriale dynamiek en funktie ten voordele van hun eigen vereisten. In het bijzonder virale infekties richten zich tegen mitochondrieën om de aangeboren immuniteit te ondergraven. Daarom dachten we dat een virale oorzaak achter de ontwikkeling van M.E./CVS zit, minstens bij een subgroep patiënten. Gebruikmakend van een uniek in-vitro model met menselijke U2-OS cellen, hebben we eerder getoond dat HHV-6A transaktivatie mitochondriale fissie [splijting] induceert, wat geassocieerd is met gewijzigingen van microRNAs (miRNA) alsook van het mRNA-transcriptoom van de gastheer. HHV-6 reaktivatie in U2-OS cellen is niet-produktief [Er worden geen infektueuze virussen aangemaakt.] en wordt gemarkeerd door de initiatie van transcriptie van meerdere virale kleine niet-coderende RNAs [sncRNA] in afwezigheid van substantiële virale DNA-replicatie en virale proteïne-synthese. Het viraal polymerase [enzyme dat DNA- of RNA-molekulen synthetiseert/copieert] is niet detekteerbaar, en er kunnen slechts heel weinig selektieve virale ‘onmiddellijk vroege’ (I.E.) [‘immediate-early’] en ‘vroege’ transcripten en proteïnen [van genen die (heel) vroeg worden overgeschreven] in deze cellen worden gedetekteerd na virus-reaktivatie.

Om de potentiële effekten van HHV-6A transaktivatie op de mitochondriale funktie in U2-OS cellen verder te begrijpen, voerden we onderzoek naar veranderingen in het gastheer-proteoom na virus-reaktivatie in deze cellen. Daartoe werd HHV-6A reaktivatie eerst geïnduceerd d.m.v. TSA [trichostatine-A; kan gen-expressie wijzigen (interfereren met histoon-deacetylasen) door de toegang van transcriptie-factoren tot DNA-molekulen te veranderen] en de mitochondriale fragmentatie werd gedocumenteerd d.m.v. microcopie: we zagen een overheersende gestippelde vorm van mitochondrieën na HHV-6A reaktivatie. Gebruikmakend van kwantitatieve proteomica (gebaseerd op isotopen-labeling van aminozuren in cel-cultuur), observeerden we een effekt van virus-reaktivatie op de proteïnen-dynamiek van de gastheer-cel. Gegevens afgeleid van twee biologische gerepliceerde experimenten toonden sterke reproduceerbaarheid van de identificatie van de proteïnen waarvan de expressie gewijzigd was na virale reaktivatie. We detekteerden veranderingen qua expressie-dynamiek van meerdere belangrijke cellulaire proteïnen. Omwille van onze interesse in HHV-6 gemedieerde mitochondriale dysfunktie, analyseerden we verder de mitochondrieën-specifieke proteïnen. Meerdere belangrijke mitochondriale proteïnen betrokken bij glycolytische mechansimen, foliumzuur- en 1-koolstof metabolisme [groep biochemische reakties die de the transfer van 1-koolstof groepen gemeenschappelijk hebben; speelt een belangrijke rol bij o.a. biosynthese, aminozuur-homeostase, enz.], vetzuur-oxidatie, en aminonozuren-metabolisme bleken gewijzigd na HHV-6A transaktivatie, suggestief voor een potentieel effekt op het cellulair alsook het mitochondriaal metabolisme. De meest interessante observatie was de downregulering qua expressie van de mitochondriale proteïnen [enzymen] pyruvaat-dehydrogenase fosfatase katalytische subunit 1 (PDP1) en mangaan-afhankelijk superoxide-dismutase-2 (SOD2). [zie bespreking] Verhoogde oxidatieve stress – waar dikwijls naar wordt verwezen als de oxidatieve bescherming respons [Naviaux RK. Oxidative shielding or oxidative stress? J. Pharmacol. Exp. Ther. (2012) 342: 608-618; oxidatieve stress is niet het resultaat van een falend anti-oxidant systeem maar een intentionele en beschermende respons] – en gewijzigde pyruvaat-dehydrogenase funktie [Fluge Ø. et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376] zijn sleutel-kenmerken van M.E./CVS. Verminderde SOD2-waarden kunnen bijdragen tot verhoogde reaktieve zuurstof-soorten (ROS) in de cel. In een eerdere studie hebben we verhoogde ROS getoond in HHV-6 geïnfekteerde cellen. Vandaar dat we speculeerden over een directe rol van HHV-6 infektie bij de pathofysiologie van M.E./CVS.

Om de gevolgen te begrijpen van HHV-6 gemedieerde mitochondriale veranderingen op het gastheer-metabolisme, focusten we op de verhoogde mitochondriale fissie in HHV-6 gereaktiveerde cellen. Verhoogde mitochondriale fissie vermindert de respiratoire capaciteit van de cel, met als gevolg verlaging van de cellulaire ATP-produktie. Lagere cellulaire energie kan ook mitochondriale fragmentatie induceren. Vandaar dat we ons afvroegen of HHV-6A transaktivatie ook leidt tot een lagere ATP-inhoud van de cel. We hebben de ATP-inhoud van U2-OS cellen gemeten in aan- of afwezigheid van latent HHV-6A. Bovendien reaktiveerden we HHV-6A in deze cellen d.m.v. de histoon-deacetylase inhibitor TSA en bestudeerden de ATP-inhoud na virus-reaktivatie. Om de mitochondriale ATP-generatie enkel in afwezigheid van de glycolytische ATP-machinerie te meten, vervingen we glucose-bevattende media met een galactose-bevattend in parallelle experimenten. Galactose kan niet efficiënt worden gemetaboliseerd naar pyruvaat op een anaërobe manier en dwingt cellen te verschuiven naar mitochondriale oxidatieve fosforylatie voor energie-metabolisme en overleving. Onze resultaten toonden een afname qua cytoplasmisch én mitochondriaal ATP na HHV-6A reaktivatie. De mogelijkheid van verlies van ATP omwille van een produktieve virale levenscyclus werd uitgesloten, aangezien HHV-6A een niet-produktieve levenscyclus heeft in deze cellen.

HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen zou leiden tot een aangeboren immuun-respons. Zoals veel andere virussen zou HHV-6A echter ook een mechanisme kunnen ontplooien om mitochondriale fissie te induceren. Mitochondriale fissie reduceert het vermogen van cellen om een aangeboren immuun-respons op te zetten. Om dit te controleren, evalueerden we de IFN-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie via qRT-PCR: mRNA-waarden van IFN-β, IFN-responsief en viraal RNA-bindend gen IFIT-1 en TNF-α respons gen ICAM-1 werden gekwantificeerd. Er werden U2-OS cellen na transfektie met een RNA-sequentie van influenza-A (H1N1) virus gebruikt als positieve controle. Onze resultaten tonen een verminderde aangeboren immuun-respons in U2-OS cellen na virus-reaktivatie, met lagere waarden qua IFN-β en TNF-α mRNA. Interessant: we zagen in vergelijking hogere IFIT-1 mRNA waarden in aanwezigheid van latent HHV-6A vóór stimulatie met TSA. Een verhoogde ISG [IFN-gestimuleerd gen; proteïne-produkten van ISGs controleren pathogeen-infekties] -respons […] in latent virus bevattende cellen, versterkt ons argument dat mitochondriale fragmentatie een aanpassing van het virus kan zijn om aangeboren immuun-respons te vermijden op het moment van virale reaktivatie wanneer virale ‘I.E.’ RNAs vrij beschikbaar zijn in het gastheer-cytoplasma. Gefragmenteerde mitochondrieën zijn inefficiënt wat betreft het opwekken van een sterke aangeboren immunieit respons, aangezien ze de interaktie voorkomen tussen mitochondriaal antiviraal signalisering (MAVS) proteïne en stimulator van IFN-genen (STING) op mitochondriale membranen. De mogelijkheid van een produktieve virale levenscyclus in U2-OS cellen werden uitgesloten via het kwantificeren van P41 & U94 mRNAs in dezelfde mRNA-preparaties. HHV-6 P41, een ‘I.E.’ viraal proteïne dat betrokken bleek bij de vroege fases van de virale replicatie, werd gedetekteerd na TSA-behandeling, wat onze eerdere gegevens ondersteunt. Ter zelfder tijd werd het viraal proteïne U94 niet gedetekteerd 48 h na TSA-behandeling, wat aantoont dat de virus-reaktivatie incompleet was. We toonden eerder ook een ontbreken van U94 transcriptie na HHV-6A reaktivatie in U2-OS cellen. Zodoende tonen onze resultaten dat partiële reaktivatie van HHV-6A genoeg is om mitochondriale fragmentatie te induceren die leidt tot een lagere ATP-inhoud gepaard met een verlaagde aangeboren immune respons.

Pro-inflammatoire mitochondriale architectuur kan worden overgedragen via gesekreteerde factoren van HHV-6 gereaktiveerde cellen

Er werd gesuggereerd dat een dergelijke gewijzigde respiratoire toestand van de cel, vergezeld van een afname qua mitochondriale oxidatieve fosforylatie en gefragmenteerde mitochondriale architectuur (M1 mitochondrieën) de pro-inflammatoire ‘cell-danger’ respons (CDR) verhoogt [Naviaux RK. Incomplete healing as a cause of aging: the role of mitochondria and the cell danger response. Biology (2019) 8: E27 /// Naviaux RK. Metabolic features and regulation of the healing cycle – A new model for chronic disease pathogenesis and treatment. Mitochondrion (2019) 46: 278-297] en een kritische rol vervult in de cellulaire verdediging tegen microbiële pathogenen. Om deze hypothese te testen, ontwikkelden we een test-systeem gebruikmakend van menselijke A549 long-carcinoom cellen. A549 cellen werden voor-behandeld met cultuur-supernatant van U2-OS cellen met en zonder geïntegreerd HHV-6A gedurende 48 h. De cellen werden dan grondig gewassen en belast met een RNA- (influenza-A) of DNA-virus (HSV-1) infektie […]. 24 h na infektie werden de cellen verzameld en de virale infektie werd gekwantificeerd via qRT-PCR voor één van de vroeger virale RNAs. Viraal M1 RNA werd gebruikt als indicator voor influenza-virus infektie en ICP0 RNA als indicator voor HSV-1 infektie. Onze resultaten toonden dat cultuur-supernatanten enkel van cellen met ciHHV-6 DNA dat getransaktiveerd was, bescherming konden bieden tegen HSV-1 én influenza-A. Indirecte effekten van virale reaktivatie medicijnen werden uitgesloten door cellen te gebruiken die geen latent viraal genoom droegen maar wel behandeld waren met het reaktiverend agens (TSA). Deze resultaten tonen dat cellen die latent HHV-6A DNA bevatten dat was getransaktiveerd door TSA, een krachtige aktiviteit sekreteren die kan worden overgedragen en een mitochondriale fragmentatie en pro-inflammatoire CDR induceren in naïeve responder-cellen, en zo sterke bescherming tegen DNA- én RNA-virus infekties verlenen. Het is echter niet nodig dat zowel de mitochondriale fragmentatie als de antivirale bescherming fenotypes van elkaar afhankelijk zijn en worden veroorzaakt door dezelfde factor.

Op basis van de bovenstaande resultaten, stelden we ons de volgende vraag: kan een cel-vrij cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen gelijkaardige veranderingen veroorzaken in de mitochondriale architectuur van nabijgelegen cellen? Daartoe verzamelden we cel-vrij cultuur-supernatant van U2-OS cellen na 2 dagen virale reaktivatie en incubeerden ze met verse U2-OS cellen zonder enig virus maar met expressie van een oplosbaar mitochondriaal GFP (mitoGFP) [Groen Fluorescerend Proteïne; gebruikt om andere proteïnen te labelen en visualiseren; merker voor virale reaktivatie]. Oplosmiddel-gecontroleerd behandeld cel-vrij cultuur-supernatant én cel-vrij cultuur-supernatant van niet virus-dragende cellen dienden als controle. Bij analyse van de mitochondriale architectuur, detekteerden we significante wijzigingen qua mitochondriale morfologie na incubatie van gezonde cellen met cel-vrij cultuur-supernatant verkregen van HHV-6A gereaktiveerde cellen. Er werd verhoogde mitochondriale fragmentatie, leidend tot gedaalde gemiddelde mitochondriale oppervlakte gezien in de cellen die waren behandeld met cultuur-supernatant van HHV-6A gereaktiveerde cellen t.o.v. controles. Dit effekt van virale reaktivatie op de mitochondriale morfologie van nabijgelegen cellen biedt een interessant scenario dat kan worden aangewend om M.E./CVS-pathofysiologie te bestuderen. Een transfereerbaar hypo-metabool fenotype in responder-cellen werd verder ondersteund door observaties omtrent verminderde intracellulaire ATP-inhoud. Een potentiële rol van verhoogde immuun-respons in responder-cellen die dient als een antivirale factor werd uitgesloten door het kwantificeren van de IFN-respons in deze cellen. Er werd een zeer milde (2-3 voudige) toename van IFN-β & TNF-α respons gedetekteerd in de U2-OS cellen met latent virus, onafhankelijk van TSA. Een mogelijke door viraal RNA geïnduceerde immuun-respons werd echter uitgesloten in U2-OS én A549 cellen omwille van het ontbreken van geïnduceerd IFIT-1 mRNA. Deze resultaten suggereren dat een onbekende en IFN-onafhankelijke transfereerbare factor van HHV-6A gereaktiveerde cellen een hypo-metabool, gefragmenteerd mitochondriaal fenotype kan induceren in responder-cellen.

HHV-6 & HHV-7 als potentiële oorzakelijke factor voor M.E./CVS

Aangezien onze in-vitro HHV-6A reaktivatie studies wezen in de richting van mogelijke gelijkenissen tussen virale reaktivatie en M.E./CVS-pathofysiologie, bekeken we de mogelijkheid van een virale oorzaak achter M.E./CVS bij 25 M.E./CVS-patiënten (n = 25) en 10 controles (n = 10) gebruikmakend van DNA qPCR. We argumenteerden dat een hoge virale lading dient te worden gedetekteerd in het bloed van M.E./CVS-patiënten om virale infektie te to associëren met de ziekte. Patiënten met een M.E./CVS-diagnose gebaseerd op de Canadese Consensus Criteria werden willekeurig geselekteerd (leeftijd 21-59 jaar). De controles waren individuen zonder M.E./CVS alsook personen met andere klinische aandoeningen. Er werd DNA verkregen uit totaal bloed, geïsoleerde PBMCs, serum en haar-follikels van alle patiënten. De haar-folikels werden getest op viraal DNA om te zoeken naar potentiële iciHHV-6 [zie inleiding] gevallen, die een hoge virale lading dragen (één tot twee copieën per cel). Serum werd getest op extracellulair viraal DNA dat het resultaat zou kunnen zijn van viremie [aanwezigheid van virus in het bloed], suggestief voor een mogelijke virale aktivatie/infektie.

qPCR-studies detekteerden geen viraal DNA in geen enkel van de 25 M.E./CVS haar-follikel stalen. Twee controles hadden echter ca. 1 copie van HHV-6A of HHV-6B in hun haar-follikels, suggestief voor, respectievelijk, mogelijks iciHHV-6A en iciHHV-6B. Er werden gelijkaardige hoeveelheden viraal DNA gedetekteerd in bloed, PBMCs en serum van deze twee controles, wat latente virale integratie bevestigt. De afwezigheid van enig viraal mRNA bij deze twee gevallen bevestigde ook de latente virale toestand. Serum-stalen van deze twee werd gebruikt als controle in alle volgende experimenten. Drie M.E./CVS-patiënten bleken positief voor HHV-6 in totaal-bloed alsook PBMCs. Een andere M.E./CVS-patient bleek ook HHV-6 positief in PBMCs maar niet in totaal-bloed, dus slechts 16% (4 op 25) van de M.E./CVS-patiënten had HHV-6 DNA in het bloed. Een zeer lage hoeveelheid viraal DNA in het bloed kan te wijten zijn aan latent virus of potentiële virale aktivatie in zeer weinig cellen, die kunnen resulteren in het verminderen van viraal DNA en RNA in totaal-bloed. We hebben HHV-6 gecodeerd sncRNA-U14 geïdentificeerd als krachtige merker voor virale reaktivatie. Aangezien we verwachtten dat de hoeveelheid viraal RNA bij reaktivatie/infektie hoger kan zijn dan de hoeveelheid viraal DNA en dat het makkelijker detekteerbaar zou zijn, voerden we FISH-studies uit gebruikmakend van geconcentreerde PBMCs of bloedklonters van een deel van deze M.E./CVS-gevallen (n = 20). FISH-analyse verhoogde het aantal HHV-6 positieve gevallen tot 40% (8 op 20). FISH beeld-analyse bevestigde onze hypothese dat slechts een klein deel van de HHV-6 sncRNA-U14 droeg. Geen enkele van de controles, inclusief de twee iciHHV-6 gevallen, kleurde positief voor sncRNA-U14. 36% van de M.E./CVS-patiënten testte positief voor HHV-7 DNA, (gemiddeld 1.835-26.056 copieën viraal DNA per miljoen cellen). We karakteriseerden latente of aktieve HHV-7 infektie niet. Tot besluit: we detekteerden een zeer laag aantal copieën viraal genoom bij M.E./CVS-patiënten, niet genoeg om te duiden op een directe rol van aktieve virale infektie bij de ziekte.

Serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles induceerde veranderingen in de mitochondriale architectuur van gezonde cellen

Een laag aantal copieën van virus-DNA en -RNA in het bloed van M.E./CVS-patiënten leidde tot een verwarrend scenario waarbij de oorzakelijke rol van deze virussen bij ziekte-progressie moeilijk te begrijpen is. Een plausibele verklaring kan gelokaliseerde virale infektie/aktivatie in afgelegen delen van het lichaam zijn, waarbij enige geïnfekteerde cellen die geaktiveerd virus dragen worden vrijgesteld of enkele aktivatie-gemedieerde cellulaire factoren in het bloed worden afgegeven. Interessant is dat eerder werk [Fluge Ø et al; zie hierboven] heeft getoond dat serum van M.E./CVS-patiënten met ernstige ziekte het mitochondriaal oxidatief metabolisme en respiratie verhoogt in gezonde spiercellen onder belasting. We vroegen ons zodoende af of serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale morfologie in gezonde cellen op een zelfde manier kan wijzigen, zoals werd gezien bij HHV-6 infektie. We kweekten zodoende U2-OS cellen die oplosbaar mitoGFP hebben maar geen HHV-6, in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten alsook van controles. De mitochondriale dynamiek werd geanalyseerd via microscopie. Onze resultaten toonden verhoogde mitochondriale fragmentatie (gekwantificeerd door gemiddelde mitochondriale oppervlakte) in gezonde gecultiveerde cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten maar niét van gezonde controles. Directe kwantificatie van de mitochondriale oppervlakte in PBMCs van M.E./CVS-patiënten was niet nuttig, aangezien PBMCs kleiner zijn en een ronde vorm hebben, wat […] kwantificatie van de mitochondriale grootte hindert. Onze resultaten suggereren dat wijzigingen qua mitochondriale architectuur om een meer pro-inflammatoire vorm van de mitochondrieën te verkrijgen, een belangrijk kenmerk bij M.E./CVS-patiënten is en geen directe viral infektie in elke cel vereist.

Serum-transfereerbare aangeboren immuniteitbij M.E./CVS-patiënten

Aangezien verhoogde CDR een transfereerbaar kenmerk van HHV-6A reaktivatie in vitro was, testten we of een gelijkaardige pro-inflammatoire aktiviteit kon worden gemeten in het bloed of M.E./CVS-patiënten. Als test-systeem kweekten we A549 cellen in aanwezigheid van serum van 10 M.E./CVS-patiënten en 5 controles. Na 2 dagen blootstelling aan serum, werden de cellen gewassen en blootgesteld aan influenza-A of HSV-1 […]. Kwantificatie van virale infektie onthulde tot 99% afname van virale infektie voor zowel HSV-1 als influenza na behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten. Slechts 1 van de 10 M.E./CVS-patiënten had geen negatief effekt van influenza-A infektie. In feite zagen we een toename van 2,5 maal qua influenza-infektie in aanwezigheid van serum van deze patient. 4 van de 5 controle-sera gaf geen negatief effekt op influenza-A infektie. Slechts 1 van de controle-sera verminderde influenza-infektie tot 50%. Deze afname was echter vergelijkbaar met de mate van bescherming die we zagen in aanwezigheid van M.E./CVS sera. In het geval van HSV-1 infektie gaf geen enkel van de controle-sera bescherming. Statistische analyse toonde sterke significantie en uitstekende prestatie-karakteristieken voor de diagnostische bruikbaarheid van dit test-systeem. De positieve voorspellende waarde voor de influenza-A inhibitie test om serum van M.E./CVS-patiënten te identificeren was 0.9 (95% CI = 0.6-0.99; p = 0.017). De positieve voorspellende waarde voor de HSV-1 inhibitie test was 1.0 (95% CI = 0.72-1.0; p = 0.0003). Om de mogelijkheid te testen van een hypo-metabole toestand in de responder A549 cellen, hebben we intracellulaire ATP-waarden gemeten in A549 cellen na incubatie met serum van M.E./CVS-patiënten of HCs. We zagen een lager intracellulair ATP in deze cellen. Omwille van de kleinere grootte van het staal konden we echter geen statistisch significant verschil qua ATP-inhoud zien.

Uitsluiten van TNF-α & IFN respons

Eén van de meest prominente kandidaat-molekulen die een sterke antivirale verdediging kan bieden, is IFN [interferon]. Vandaar dat we de IFN-respons testten in A549 cellen na behandeling met M.E./CVS- of HC-serum. We zagen een sterke afname qua mRNA-waarden van IFN-β, IFIT-1 & ICAM-1 in de A549 cellen in aanwezigheid van M.E./CVS-serum in vergelijking met HC-serum. Dan vroegen we ons af of de sekretorische IFN-respons in geïsoleerde PBMCs hoger is bij M.E./CVS-patiënten. Daartoe gebruikten we een andere groep van 22 M.E./CVS-patiënten en 22 HCs. Na behandeling met LPS vonden we lagere waarden qua gesekreteerd TNF-α (p < 0.01) & IFN-γ (p < 0.05) voor M.E./CVS-patient PBMCs vergeleken met die van HCs. Er werden geen significante verschillen gezien voor IL-1β & IL-5. Deze resultaten sluiten een potentiële rol uit voor IFN-respons wat betreft de mitochondriale fragmentatie en antivirale respons bij M.E./CVS-patiënten.

BESPREKING

HHV-6 infektie en reaktivatie wijzigen het gastheer-cel transcriptoom, inclusief het miRNAoom. miRNAs reguleren de intra-organel mechanismen, waarbij ze de job uitoefenen van het fijnregelen van de funkties die vereist zijn om de metabole vereisten van een orgaan of cel-type te vervullen. Onze ‘deep-sequencing’ benadering eerder onthulde belangrijke veranderingen in de expressie van een groot panel menselijke miRNAs na HHV-6A reaktivatie dat wijst op een brede waaier aan effekten op mitochondrieën en geassocieerde metabole funkties na virale aktivatie. Hier bestudeerden we kwantitatieve veranderingen in cellulaire en mitochondriale proteomica na HHV-6A reaktivatie en vonden meerdere significante wijzigingen sterk lijkend op M.E./CVS-pathofysiologie. PDP1 was ge-downreguleerd in respons op HHV-6A reaktivatie. PDP1 helpt bij het terugdraaien van de negatieve effekten van pyruvaat-dehydrogenase kinasen op pyruvaat-dehydrogenase. Een afname van PDP1 suggereert een mogelijke daling qua funkties van pyruvaat-dehydrogenase, die ook wordt gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten [Fluge Ø et al; zie hierboven].We vonden ook een daling van de SOD2-waarde die kan leiden tot hoge hoeveelheden ROS in de cel. We hebben eerder getoond dat HHV-6 infektie ROS induceert in gastheer-cellen en de expressie van of glutathion-reductase wijzigt. Deze observaties ondersteunen sterk een pathologische link tussen HHV-6 reaktivatie en M.E./CVS.

Hypo-metabole toestand van bloedcellen is een kenmerk van M.E./CVS [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-E5480]. Hoewel we geen metabole studies deden, heeft onze studie omtrent de mitochondriale architectuur in aanwezigheid van serum van M.E./CVS-patiënten maar niet van controles transfereerbare aktiviteit in M.E./CVS-serum onthuld die mitochondrieën fragmenteert en een gecoördineerde antivirale toestand in naïeve responder cellen in vitro. Deze test was zeer gevoelig (0.9-1.00; 95% CI = 0.6-1.0) en specifiek (0.8-1.0; 95% CI = 0.38-1.0) wat betreft de identificatie van serum van M.E./CVS-patiënten. In onze studies bleek virale reaktivatie alsook behandeling met serum van M.E./CVS-patiënten een typische (M1) toestand van de mitochondrieën te induceren [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] in gastheer-cellen, wat ook gepaard ging met een sterke pro-inflammatoire toestand van de cel die de gastheer-cellen beschermde tegen binnenkomende DNA- én RNA-virussen, consistent met oxidatieve bescherming. Er zijn veel mogelijke manieren waarop een nabijgelegen gezonde cel een potentieel infektueus risico in de omgeving kan voelen. Een verhoogde IFN-respons van de virus-getransaktiveerde cellen kan resulteren in gesekreteerd IFN dat kan worden gevoeld door nabijgelegen cellen, leidend tot een hypo-metabole toestand. Er werd gerapporteerd dat meerdere type-I [o.a. IFN-α & IFN-β] en type-II [IFN-γ] IFNs [cytokinen], alsook IFN respons genen, sterk aanwezig zijn in het serum van M.E./CVS-patiënten [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158 /// Moss RB et al. TNF-alpha and Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Immunol. (1999) 19: 314-316]. We zagen echter geen toename qua IFN-γ in PBMCs van een kleine groep M.E./CVS-patiënten. Daarnaast zagen we een significante daling qua ISG-expressie na behandeling met M.E./CVS-serum. Vandaar dat het sterk antiviraal fenotype in ons test-systeem IFN-onafhankelijk lijkt te zijn. Gefragmenteerde mitochondrieën kunnen kapot mitochondriaal DNA in het cytoplasma en de extracellulaire ruimte afgeven, dat TLR-gemedieerde cytokine-produktie in nabijgelegen cellen kan induceren. Nieuw gesynthetiseerd, 8-hydroxyguanosine [biomerker voor oxidatieve stress] bevattend mitochondriaal DNA (ox-mtDNA) kan direct de assemblage van het NLRP3 inflammasoom [lees: ‘NLRP3 Inflammasoom geaktiveerd bij Fibromyalgie]. aktiveren. Interessant is dat een overmaat aan bepaalde cytokinen ook het mitochondriaal metabolisme kan veranderen om verdere groei van pathogenen te voorkomen. Bepaalde complexe aandoeningen, zoals Amyotrofe Laterale Sclerose, zijn geassocieerd met een hypo-metabole toestand die wordt gekenmerkt door een kleinere grootte en hoeveelheid mitochondrieën.

Auto-immuniteit is courant bij M.E./CVS [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609]. Meerdere auto-antilichamen zijn in staat een pro-inflammatoire toestand te induceren in doelwit-cellen. Interessant: HHV-6 is gelinkt met meerdere auto-immune ziekten, inclusief Multipele Sclerose en Hashimoto thyroïditis. Auto-antilichamen tegen β2-adrenerge receptoren (β2R) bleken ge-upreguleerd in een subgroep M.E./CVS-patiënten [Loebel M, Fluge Ø et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52: 32-39]. Dergelijke antilichamen behoren tot een netwerk van natuurlijke antilichamen tegen adrenerge, acetylcholine (cholinerge) en andere GPCR-receptoren die dysfunktioneel bleken bij verscheidene auto-immune ziekten. [lees ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie] Autonome ontregeling is een hoofdkenmerk van M.E./CVS. Er is bewijsmateriaal voor het feit dat de β2R-gemedieerde regulering van cytokinen door terbutaline [β₂-adrenerge receptor agonist] wordt verstoord in totaal-bloed immuuncellen van M.E./CVS-patiënten [Kavelaars A, Heijnen CJ et al. Disturbed neuroendocrine-immune interactions in Chronic Fatigue Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. (2000) 85: 692-696]. Een artikel toonde dat influenza-replicatie wordt geïnhibeerd door α2-adrenerge stimulatie via cAMP-inhibitie. In tegenstelling daarmee staat β2R-stimulatie bekend cAMP te stimuleren. Zodoende: een onevenwicht van adrenerge stimulatie die cAMP-downregulering begunstigt, zou ook een verklaring kunnen zijn voor onze bevindingen. Gelijkenissen tussen transfer van HHV-6A reaktivatie cultuur-supernatant en M.E./CVS-serum suggereert echter een potentiële metabole rol naast andere mogelijkheden.

Het ontbreken van een sterke HHV-6 en HHV-7 infektie bij M.E./CVS-patiënten in meerdere studies heeft twijfel gezaaid omtrent de betrokkenheid van deze virussen bij M.E./CVS. In deze studie tonen we echter dat onvolledige HHV-6 reaktivatie, zelfs in een klein aantal latent geïnfekteerde cellen, er de oorzaak van is dat gereaktiveerde cellen een aktiviteit sekreteren die kan worden getransfereerd in serum, en mitochondriale fragmentatie veroorzaakt en een krachtig programma coördineert in reagerende cellen. Onze studies toonden dat enkel ‘I.E.’-gebeurtenissen, zoals de transcriptie van meerdere kleine niet-coderende virale RNAs, nodig waren om de aanmaak en sekretie van de mitochondriale fragmentatie-factor en transfereerbare antivirale toestand te triggeren. Er worden geen HHV-6 proteïnen gemaakt tijdens de onvolledige reaktivatie die hier in dit artikel wordt beschreven. Specifiek: er werd geen belangrijke wijziging qua HHV-6 replicatie geobserveerd. Dit verklaart het falen van anti-herpesvirus medicijnen in een subgroep patiënten, omdat het HHV-6 polymerase niet tot expressie komt tijdens een onvolledige virus-reaktivatie, en medicijnen gericht tegen het viraal DNA-polymerase dus geen viraal doelwit hebben.

De virus-reaktivatie experimenten die in deze studie werden beschreven, tonen dat een antivirale toestand ontstaat zowel in cellen met ongereaktiveerd en gereaktiveerd HHV-6. Dit lijkt in te gaan tegen de virale groei en kan daarom dus de korte-termijn voordelen van virale reaktivatie vanuit pathogeen standpunt niet verklaren, tenzij passieve transmissie van viraal genoom naar dochter-cellen na mitose een belangrijke rol speelt in HHV-6 genoom propagatie. Een gedaalde IFN-respons in virus-gereaktiveerde cellen kan een voordeel bieden voor het overleven van ‘I.E.’ RNAs in het gastheer-cel cytoplasma. In deze studie hebben we echter enkel de niet-produktieve transaktivatie-toestand van het virus getest. Produktieve virale infektie, met virion [compleet virus-partikel met een buitenste proteïnen-omhulsel (capside) en in de kern nucleïnezuur] -aanmaak en -afgifte, zou bijkomende virale factoren kunnen binnenbrengen die het vermogen van de cel schaden om een hypo-metabole toestand te ondergaan om succesvolle virus-groei te bewerkstelligen. Bijkomend: mitochondriale fragmentatie laat het virus dikwijls toe een persistente of latente toestand onder hypo-metabole toestand te verwerven.

In deze studie vonden we dat geen enkele van de 25 patiënten met M.E./CVS bewijs van een volledig gereaktiveerde HHV-6 of HHV-7 infektie in het perifeer bloed had en slecht 8 op 20 (40%; 95% CI = 0.19-0.64) vertoonden partiële reaktivatie gemeten via FISH-analyse van HHV-6 klein niet-coderend RNA U14 in totaal-bloed. Gebruikmakend van een in-vitro reporter-cel test, toonden we echter dat serum van M.E./CVS-patiënten een aktiviteit bevatte die mitochondriale fragmentatie, gedaalde mitochondriale ATP-produktie verzaakt, en een krachtige antivirale toestand induceert. In 2016 onthulde een metaboloom-analyse bij ME./CVS-patiënten een chemische signatuur die gelijkaardig is met de evolutionair bewaarde, hypo-metabole toestand die bekend staat als ‘dauer’ [zie Naviaux RK (2016) hierboven]. Deze ‘dauer’-achtige toestand bleef behouden door versperringen van genezing, voortkomend uit een abnormale persistentie van CDR. De CDR bleek direct betrokken bij zowel genezing als de biologie van het ouder-worden. In dit eerder werk, was de hypothese dat de metabole kenmerken van de CDR bij M.E./CVS-patiënten kan beschermen tegen bepaalde infekties, maar de antivirale aktiviteit werd niet direct getest [zie Naviaux RK (2016)& (2019) hierboven] []. Onze huidige gegevens tonen dat slechts een klein deel cellen latent geïnfekteerd moet zijn met HHV-6 om een sekretorisch fenotype te triggeren dat sterk beschermt tegen sommige RNA- en DNA-virussen in nabij- en af-gelegen cellen zonder HHV-6 DNA. Er dienen in de toekomst grotere studies met meerdere groepen M.E./CVS-patiënten van verschillende leeftijden te worden uitgevoerd, en met methodes die zowel produktieve als non-produktieve (incomplete) virale reaktivatie gebeurtenissen detekteren en kwantificeren. Bovendien zouden potentiële factoren die de mitochondriale dynamiek bij M.E./CVS-patiënten aantasten systematisch moeten worden geëvalueerd wat betreft hun vermogen om een krachtige antivirale toestand te induceren. Ons mitochondriaal, reporter-gebaseerd cel-systeem zal de mogelijkheid bieden om een diagnostische test voor M.E./CVS te ontwikkelen alsook een platform te bieden voor verdere identificatie van potentiële factoren die M.E./CVS-pathofysiologie definiëren.

mei 3, 2020

Het effekt van de ernst van M.E.(cvs) op de cellulaire bioenergetische funktie

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 6:28 am
Tags: , , , ,

Onderstaande studie werd o.a. gefinancierd door ‘ME Research UK’. Het is een vervolg op een voorafgaande studie door dezelfde onderzoeksgroep (zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’). Dit team deed ook al opmerkelijke vondsten wat betreft de cellulaire energie-produktie: o.a. een daling van de cellulaire energie (ATP-waarden) en problemen betreffende de AMPK-signalisering (verantwoordelijk voor het regelen van de energie in cellen; zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’).

De belangrijkste bevindingen zijn dat mensen met matige M.E.(cvs) een mitochondriale dysfunktie hebben en dat patiënten met ernstige M.E.(cvs) mitochondriale én glycolyse-stoornissen vertonen.

De onderzoekers her-onderzochten resultaten van hun eerder werk waarbij ze M.E.(cvs)-patiënten in twee groepen opdeelden: mensen die matig (huisgebonden) en ernstig (bedlegerig) ziek zijn. Ze maten de respiratie (cellulaire ademhaling) in bloedcellen van patiënten en controles om te bepalen of er een verschil was wat betreft de mitochondriale funktie en metabole mechanismen zoals glycolyse. Mitochondrieën voorzien in het grootste deel van de energieproduktie in cellen en glycolyse is het proces waarbij glucose wordt verbruikt om energie te leveren.

Ze vonden dat de mitochondriale funktie voor beide groepen patiënten in dezelfde mate verminderd was, vergeleken met gezonde individuen. De gereduceerde mitochondriale werking was dus niet gelinkt met de ernst van de ziekte, wat suggereert dat het dus een gevolg is van de M.E.(cvs) en niét van deconditionering. Beide groepen patiënten vertoonden ook gedaalde ATP-gelinkte respiratie, wat wijst op een mogelijk defekt van metabole mechanismen (zoals glycolyse en/of OXPHOS (oxidatieve fosforylatie in de mitochondrieën), allebei belangrijke manieren van ATP (energie)-produktie bij M.E.(cvs)-patiënten. De verminderde output was verbonden met de ernst van de ziekte: er was een grotere daling in de ernstig aangetaste groep.

In hun voorafgaande studie hadden de researchers geen verschil gevonden tussen controles en patiënten voor de glycolyse. Door de patiënten echter te verdelen op basis van de ernst van de ziekte, kon worden vastgesteld dat patiënten die ernstig ziek zijn eigenlijk gereduceerde glycolyse vertonen, wat niet het geval is bij patiënten die matig ziek zijn. Dus: degenen die matig aangetast zijn hebben een mitochondriale stoornis, deze die ernstig aangetast zijn hebben zowel een mitochondriale stoornis als problemen met de glycolyse.

Dit betekent dat de post-exertionele malaise en vermoeidheid bij M.E.(cvs) kan worden veroorzaakt door een defekt in – of gerelateerd met – één van de metabole mechanismen (zoals glycolyse of OXPHOS). De studie beklemtoont ook het belang van onderzoek bij patiënten met ernstige M.E.(cvs) – waar mogelijk.

————————-

PLoS One Vol 15 (2020): e0231136

The effect of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS) severity on cellular bioenergetic function

Cara Tomas (1), Joanna L. Elson (1,2), Victoria Strassheim (3), Julia L. Newton (1,3), Mark Walker (1)

1 Translational and Clinical Research Institute, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) bleek verbonden met abnormaliteiten qua mitochondriale funktie. In deze studie analyseerden we eerdere bio-energetica gegevens in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) gebruikmakend van nieuwe technieken om verschillen tussen groepen met M.E./CVS en gezonde controles verder op te helderen. We deelden onze M.E./CVS-groep op in twee aparte groepen met matig en ernstig aangetaste patiënten om te bepalen of ziekte-ernst geassocieerd is met de bio-energetische funktie in PBMCs. Beide M.E./CVS-groepen vertoonden een verminderde mitochondriale funktie t.o.v. een groep gezonde controles. Dit toont aan dat ziekte-graad niet correleert met mitochondriale funktie en dat zelfs degenen met een milde vorm van de ziekte mitochondriale dysfunktie blijken te vertonen. Vergelijkingen ontworpen door een andere research-groep hebben ons in staat gesteld de mate van ATP-gelinkte respiratie en glycolytische parameters te berekenen. Parameters van de glycolytische funktie werden berekend door respiratoire verzuring in rekening te brengen. Dit onthulde dat ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten een hogere mate van respiratoire verzuring hebben en toonde het belang aan van het meenemen van de respiratoire verzuring bij het berekenen van parameters van de glycolytische funktie. Analyse van eerder gepubliceerde glycolyse-gegevens, na het in rekenschap brengen van de respiratoire verzuring, toonde dat ernstig aangetaste patiënten gedaalde glycolyse hebben vergeleken met matig aangetaste patiënten en gezonde controles. De ATP-gelinkte respiratie werd ook berekend en bleek lager bij beide M.E./CVS-groepen. Deze studie toont dat ernstig aangetaste patiënten mitochondriale en glycolytische stoornissen hebben, wat hen onderscheidt van matig aangetaste patiënten die enkel een mitochondriale stoornis hebben. Dit kan verklaren waarom deze patiënten zich manifesteren met een ernstiger fenotype.

Inleiding

[…]. Onze groep heeft eerder extracellulaire flux analyse aangewend om te tonen dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten een significant lagere mitochondriale funktie hebben dan gezonde controles [Tomas C, Newton J et al. Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2017) 12: e0186802]. Bio-energetische profilering gebruikmakend van bloedstalen is geen nieuwe techniek en werd aangewend in andere studies die een reeks ziekte-types bekeken. De technieken vereist voor onderzoek van de mitochondriale funktie in bloedcellen zijn minimaal invasief maar leveren een weelde aan gegevens die toelaten de pathofysiologie van ziekte verder te begrijpen. Bloedcellen vindt men systemisch, daarom wordt gedacht dat het bio-energetisch profiel van deze cellen representatief is voor het ganse lichaam. Er dient echter nog te worden bepaald of mitochondriale veranderingen in het bloed een oorzaak of gevolg zijn van ziekte. De M.E./CVS-groep in onze eerdere studie omvatte matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten maar bekeek niet of de achteruitgang qua bio-energetische funktie gecorreleerd was met ziekte-ernst. In deze studie voerden we een her-onderzoek uit van eerder gepubliceerde gegevens om de rol na te gaan van de mitochondriale en glycolytische funktie in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) omtrent de ziekte-ernst bij M.E./CVS. Er zijn eigenlijk zeer weinig studies op gebied van M.E./CVS-research die ernstig aangetaste patiënten omvatten. Dit is te wijten aan het feit dat dergelijke patiënten als ‘moeilijk te bereiken’ worden geacht, gezien ze aan huis gebonden of zelfs bedlegerig zijn. Het onvermogen van klinici en onderzoekers om toegang te krijgen tot deze patiënten, betekent dat ze uitgesloten blijven van de meerderheid van de M.E./CVS-studies ondanks de dringende klinische nood. Dit artikel is de eerste studie die de cellulaire bio-energetica bekijkt bij patiënten met ernstige M.E./CVS en onderzoek of ze verschillen van deze die matig aangetast zijn.

Deze studie bekijkt ook de relatieve bijdrage van glycolytische verzuring aan de algemene extracellulaire verzuring en hoe het een impact heeft op de berekening van glycolytische parameters. De glycolyse-stress-test van Agilent Technologies, die wordt gebruikt om de mate van extracellaire verzuring (ECAR) te meten en de glycolyse in cellen te berekenen, is gebaseerd op de veronderstelling dat de meerderheid van de protonen [H+; verhoging => verzuring] die naar het extracellulair milieu gaan, geproduceerd worden door de omzetting van pyruvaat naar lactaat en de daaropvolgende uitdrijving van protonen uit de cel. In sommige cel-types is dit wellicht echter niet het geval. Er werd eerder aangetoond dat het percentage bijdrage van respiratoire verzuring enorm kan variëren tussen cel-types met resultaten die een percentage bijdrage 0-100% voor verschillende cel-types tonen [Mookerjee SA et al. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta (2015) 1487: 171-81]. Respiratoire verzuring wordt veroorzaakt door de produktie van CO2 bij substraat-oxidatie. Het CO2 wordt gehydrateerd tot koolzuur dat daarna dissocieert tot bicarbonaat en een proton. Bij de glycolyse-stress-test kan respiratoire verzuring verkeerdelijk worden toegeschreven een cellulaire glycolyse aangezien de glycolyse-stress-test geen onderscheid kan maken tussen glycolytische verzuring en respiratoire verzuring wanneer deze wordt aangewend zoals voorgeschreven door de producent. Het gebruik van een vergelijking beschreven door Mookerjee SA et al. Laat toe het percentage bijdrage van respiratoire en glycolytische verzuring in rekening te brengen bij het berekenen van glycolytische parameters bij de glycolyse-stress-test.

Bijkomend voerden we een berekening uit van de ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van de M.E./CVS-groep en de gezonde controles, ontworpen door Mookerjee SA et al., die ons toeliet de individuele bijdrage van glycolyse en oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) aan cellulaire ATP-gelinkte respiratie te bepalen [Mookerjee SA et al. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry (2017) 292: 7189-202]. We waren dan in staat te onderzoeken hoe extracellulaire glucose-concentraties het evenwicht tussen glycolytisch en OXPHOS-afgeleid ATP beïnvloedt.

Dit werk beschrijft nieuw onderzoek omtrent het funktioneren van energie-produktie mechanismen in M.E./CVS-cellen en is uniek omwille van de inclusie van een groep ernstig aangetaste patiënten in bio-energetica studies voor de eerste keer.

Materialen & methodes

Informatie over de deelnemers

De M.E./CVS-patiënten kregen de diagnose […] op basis van de Fukuda criteria maar alle patiënten voldeden ook aan de Canadese Consensus Criteria. […]

Er werden twee groepen M.E./CVS-patiënten met verschillende ziekte-graad opgenomen deze studie. De mild aangetaste groep had verminderde mobiliteit omwille van de ziekte maar ze waren in staat de lokale ‘fatigue clinic’ te bezoeken. De meeste van de matig aangetaste patiënten waren in staat zonder hulp naar de kliniek te wandelen maar een klein deel had ondersteuning (krukken of rolstoel) nodig. De ernstige aangetaste groep was aan huis gebonden of bedlegerig, en niet in staat de kliniek te bezoeken, zelfs niet met een rolstoel. […]. De ogenschijnlijk willekeurige categorieën worden gebruikt omwille van de afwezigheid van biomerkers  […].

[…] We waren er ons bewust van hoe vermoeiend een bloedafname/bezoek voor de patiënten kan zijn en besloten daarom, om het effekt op de patiënten minimaal te houden, dat er geen verdere informatie tijdens het bezoek zou worden verzameld. Daarom kunnen we de patiënten-demografie tussen de groepen niet vergelijken.

PBMC-preparatie

[…] Alle bloedstalen werden verwerkt binnen 4 uur na afname.

Extracellulaire flux analyse

[…] Voor de mitochondriale respiratie werd het zuurstof-verbruik (OCR) van cellen gemeten (Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser). […] Als glycolytische parameters werd de extracellulaire verzuring (ECAR) van cellen gemeten (Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser). […] [voor uitleg zie link in onze inleiding]

Extracellulaire verzuring analyse

Extracellulaire verzuring is toe te schrijven aan respiratoire of glycolytische aktiviteit. Deze twee parameters dragen bij tot de totale protonen-produktie (PPRtot) gemeten in cellen. PPR is ECAR gedeeld door de buffer-capaciteit van het milieu dat in het experiment wordt gebruikt […]. In deze studie hebben we rekening gehouden met de glycolytische verzuring bij het berekenen van cellulaire glycolytische parameters. De glycolytische verzuring werd berekend via de formule van Mookerjee SA et al. […]. De respiratoire verzuring (PPRresp) is de PPRtot gemeten via de extracellulaire flux analyser min de PPRglyc. Deze studie keek ook naar de ATP-gelinkte respiratie van cellen gebruikmakend van de stalen van het eerder gepubliceerd werk. We berekenden de totale ATP-gelinkte respiratie, glycolyse ATP-gelinkte respiratie, OXPHOS ATP-gelinkte respiratie en % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. [ATPglyc & ATPOX werden ook berekend via formules van van Mookerjee et al.] ATPtot = ATPglyc + ATPOX

Statistiek

[…] Significantie: p < 0.01.

Resultaten

Mitochondriale funktie is verstoord bij M.E./CVS ongeacht de ziekte-ernst

De cellulaire respiratie gegevens getoond in Tomas C et al. [zie hierboven] werden opnieuw geanalyseerd om te bepalen of de ziekte-ernst de mitochondriale funktie beïnvloedt. Op basis van de eerder gepubliceerde gegevens maakten we een onderscheid tussen matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten, en vergeleken mitochondriale parameters van de twee groepen en ook de twee patiënten-groepen met de gezonde controles cohort.

Voor de cellulaire respiratoire parameters bleken er verschillen tussen de groepen voor de parameters van de basale respiratie, ATP-gelinkte respiratie, proton-lek, maximale respiratie en reserve-capaciteit (p < 0.001). Wanneer we de groepen verder statistisch analyseerden, bleek dat de matig én ernstig aangetaste groepen significant lager waren wat betreft alle vijf de parameters dan de gezonde controles (p ≤ 0.05). Dit komt overéén met de eerder gepubliceerde gegevens die toonden dat de M.E./CVS-groep als geheel significant lagere waarden had voor deze vijf parameters.

De parameters gemeten via deze test zijn onderling afhankelijk omdat sommige uit andere worden berekend. Om te bekijken of de verbanden tussen de parameters verschillen tussen de groepen van deze studie, voerden we multi-variate analyse uit. […]

De correlatie tussen basale respiratie en ATP-gelinkte respiratie is zeer sterk voor alle drie de groepen. Dit toont dat de strakke koppeling tussen deze twee parameters wordt behouden, zelfs bij de ernstige aangetaste patiënten. Sommige parameters van de mitochondriale stress test worden berekend op basis van andere parameters, dus verbanden tussen sommige parameters kunnen worden verwacht, bv. basale respiratie bestaat uit ATP-gelinkte respiratie en proton-lek.

Te samen tonen de gegevens van de parameter-correlaties dat de verbanden tussen sommige parameters verschillen tussen de drie groepen waarbij de enige parameters die consistent gecorreleerd zijn in alle drie de groepen basale respiratie en ATP-gelinkte respiratie zijn. Er is meer experimenteel werk vereist om te onderzoeken waarom en hoe bepaalde verbanden ontregeld worden in M.E./CVS PBMCs.

Glycolytische verzuring is lager bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten

Het percentage bijdrage van glycolytische verzuring in PBMCs werd berekend voor de gezonde controles, de totale M.E./CVS-groep, en de matig en ernstig aangetasten.

De glycolytische verzuring in PBMCs van de M.E./CVS-groep als geheel werd vergeleken met die van de gezonde controles. Er werden significante verschillen gezien wat betreft het percentage bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale extracellulaire verzuring tussen de twee groepen M.E./CVS-patiënten, met een lagere bijdrage van glycolytische verzuring t.o.v. gezonde controles (p < 0.001). Wanneer de M.E./CVS-groep echter wordt opgedeeld in matig en ernstig aangetaste groepen, wordt het duidelijk dat de resultaten voor de ganse M.E./CVS-groep worden scheefgetrokken door de resultaten van de ernstig aangetasten. Er is een afname van het percentage van de extracellulaire verzuring dat kan worden toegeschreven aan glycolytische verzuring in de PBMCs van de ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten vergeleken met de gezonde controles en de matig aangetaste M.E./CVS-patiënten (p ≤ 0.002). De afname qua bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale extracellulaire verzuring in de ernstig aangetaste groep is te wijten aan een groter percentage respiratoire verzuring. De matig aangetasten en gezonde controles hebben vergelijkbare waarden qua glycolytische verzuring (p = 0.257). Er dient te worden opgemerkt dat het een subgroep van ernstig aangetaste patiënten is die een gedaalde glycolytische verzuring vertoont, waarbij veel van de ernstig aangetasten vergelijkbare waarden vertoont met de matig aangetasten. CO2 verzuring, of respiratoire verzuring, draagt substantieel bij tot de totale cellulaire verzuring in PBMCs van ernstig aangetasten en daarom dient daar rekening mee te worden gehouden wanneer men ECAR in PBMCs meet. Dit toont het belang aan van het onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische verzuring […].

Glycolyse is lager bij ernstige aangetaste M.E./CVS-patiënten

Onze groep heeft eerder gegevens gepubliceerd op basis van PBMCs van M.E./CVS en gezonde controles om de glycolytische funktie van cellen te vergelijken. Glycolyse werd berekend via het meten van de extracellulaire verzuring na toediening van glucose aan de celllen, aangezien glycolyse protonen produceert die worden getransporteerd naar het extracellulair milieu. Onze eerdere publicatie toonde dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles een vergelijkbare glycolyse vertonen. We vonden hier hogere waarden qua respiratoire verzuring in een subgroep patiënten met ernstige M.E./CVS; wat betekent dat de oorspronkelijke resultaten de glycolytische aktiviteit in de cellen misschien niet accuraat weerspiegelen, aangezien een minimale bijdrage van respiratoire verzuring werd verondersteld. Her-analyse van de eerder gepubliceerde gegevens, om de echte bijdrage van glycolytische verzuring aan de globale ECAR in rekening te brengen, toonde dat er geen significante verschillen waren tussen de PBMCs van de ganse M.E./CVS-groep en de groep gezonde controles voor geen enkele van de glycolytische parameters berekend via een glycolyse stress test (p ≥ 0.263).

Er waren geen significante verschillen qua glycolyse tussen de groepen wanneer de M.E./CVS-groep werd opgedeeld in matig en ernstig aangetasten. Dit is consistent met de eerdere resultaten van ons team, waarbij geen significante verschillen qua glycolyse werden gevonden wanneer alle M.E./CVS-patiënten als één enkele groep werden geanalyseerd [ref. zie hierboven]. Wanneer de matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten echter werden gescheiden en er rekening werd gehouden met de respiratoire verzuring, bleek de ernstig aangetaste groep significant lagere waarden qua glycolyse te hebben dan de matig aangetaste en de gezonde controles (p ≤ 0.036). Deze significante verschillen tussen groepen wordt veroorzaakt door de lagere waarden qua glycolytische verzuring die wordt gezien bij de ernstig aangetaste groep. Wanneer de M.E./CVS-groep werd opgedeeld in matig en ernstig aangetasten, en beoordeeld voor en na aanpassing voor respiratoire verzuring, waren er geen verschillen tussen de groepen voor de andere drie glycolyse-parameters – glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring.

ATP-gelinkte respiratie

De ATP-gelinkte respiratie van PBMCs werd berekend voor cellen van gezonde controles, en patiënten met matige en ernstige M.E./CVS. Er werden vier aspecten gemeten van ATP-gelinkte respiratie in ingevroren PBMCs geïncubeerd in laag (1 mM) en hoog (10 mM) extracellulair glucose – totale ATP-gelinkte respiratie (ATPtot); glycolysie ATP-gelinkte respiratie (ATPglyc); OXPHOS ATP-gelinkte respiratie (ATPOX); % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie. Vergelijkingen tussen de drie groepen toonden dat ernstig aangetaste groep significant lagere waarden hadden dan de gezonde controles voor alle vier de parameters bij zowel laag- en hoog-glucose (p ≤ 0.024). De matig aangetasten bleken significant lager dan de gezonde controles voor drie van de vier parameters (ATPglyc; ATPOX; ATPtot) bij zowel laag- en hoog-glucose (p ≤ 0.007) maar de groepen waren niet verschillend wat betreft % bijdrage van glycolyse aan globale ATP-gelinkte respiratie (p = 0.271). In laag-glucose, wanneer de matig en ernstig aangetasten werden vergeleken, waren er geen significante verschillen (p ≥ 0.126). In hoog-glucose werden echter verschillen tussen de twee groepen gezien: de patiënten met ernstige M.E./CVS hadden een significant lagere ATPtot (p < 0.001), ATPglyc (p = 0.002) en % bijdrage (p = 0.007). Wanneer we keken naar het effekt van glucose-concentratie op ATP-gelinkte respiratie parameters bij de drie groepen, zagen we significante verschillen bij de gezonde controles en matig aangetasten. Bij de groep gezonde controles veroorzaakte de incubatie van cellen in laag-glucose dalingen qua ATPtot, ATPglyc en % bijdrage t.o.v. incubatie in hoog-glucose (p ≤ 0.018). De ATPOX nam toe in cellen van gezonde controles geïncubeerd in laag-glucose (p < 0.001). Bij de matige aangetaste M.E./CVS-patiënten bleken ATPglyc en % bijdrage significant verminderd in laag-glucose (p ≤ 0.049). De ernstig aangetaste groep vertoonde geen significante verschillen wat betreft ATP-gelinkte respiratie van cellen geïncubeerd in laag- en hoog glucose (p ≥ 0.744).

Bespreking

In deze studie analyseerden we gegevens die eerder door onze groep werden gepubliceerd, om te bekijken hoe ziekte-ernst bij M.E./CVS verbonden is met de mitochondriale en glycolytische funktie in PBMCs. We hebben ook ATP-gelinkte respiratie en glycolyse berekend gebruikmakend van nieuwe technieken. Eerdere studies hebben getoond dat er een correlatie is tussen bloedcel bio-energetische capaciteit en zowel aërobe als anaërobe aktiviteit [bij overgewicht en ouderen].

Er waren geen verschillen tussen de matig en ernstig aangetaste M.E./CVS-groepen voor enige cellulaire respiratoire parameters. Dit suggereert dat mitochondriale funktie van PBMCs niet correlereert met ziekte-ernst bij M.E./CVS en dat zelfs degenen die matig zijn aangetast een stoornis van de bio-energetische funktie hebben. Het ontbreken van een associatie tussen ziekte-ernst en mitochondriale funktie suggereert dat de eerder gerapporteerde vermindering qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS niet te wijten is aan deconditionering. Als de bij M.E./CVS gerapporteerde gedaalde mitochondriale werking te wijten zou zijn deconditionering zou men verwachten een significant lagere mitochondriale werking te zien bij de ernstig aangetaste groep t.o.v. de matig aangetasten.

Noch is het te wijten aan de aanwezigheid van schadelijke mtDNA-varianten. Een artikel vond geen mtDNA-verschillen tussen matig en ernstig aangetaste patiënten ondanks verschillen tussen deze twee groepen en controles [Schoeman EM, Newton J et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18: 29] Dit werk levert dus belangrijk experimenteel bewijsmateriaal ter ondersteuning van één van de weinige genetische studies uitgevoerd bij M.E./CVS-patiënten.

We onderzochten de relatieve bijdragen van glycolytische en respiratoire verzuring aan de globale extracellulaire verzuring in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. Glycolytische verzuring bleek significant lager in de M.E./CVS-groep. Dit suggereert dat de bijdrage van respiratoire verzuring bij M.E./CVS PBMCs significant hoger is dan bij controle-cellen. Wanneer de M.E./CVS-groep echter werd opgedeeld in matig en ernstig aangetaste patiënten, konden we tonen dat de ernstig aangetaste patiënten degenen waren met significant lagere glycolytische verzuring, terwijl de matig aangetaste groep glycolytische verzuring waarden had vergelijkbaar met deze van gezonde controles. Dit toont het belang van een accurate bepaling van glycolytische verzuring voor het berekenen van glycolytische parameters. We hebben getoond dat wanneer de glycolyse wordt berekend zoals de producent van de test aangeeft, er geen significante verschillen bestaan tussen controles, matige aangetaste patiënten en ernstig aangetaste patiënten. Wanneer we echter de respiratoire verzuring in rekening brengen, zien we dat glycolyse significant lager is bij de groep met ernstige M.E./CVS. De hier gepresenteerde gegevens komen overéén met een metabole profilering studie die een daling qua specifieke metabole merkers in bloed en urine van M.E./CVS-patiënten toonde, wijzend op een reductie qua glycolytische aktiviteit bij M.E./CVS [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39]. Er dient echter voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van deze resultaten aangezien de lagere glycolytische funktie representatief kan zijn voor deconditionering in de ernstig aangetaste groep. Om dit te bevestigen of verwerpen zijn verdere studies nodig.

Wanneer we de ATP-gelinkte respiratie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles onderzochten, en het effekt van de glucose-concentratie op de ATP-gelinkte respiratie, vonden we significante verschillen tussen de gezonde controles en de M.E./CVS-groepen. Er werd lagere ATP-gelinkte respiratie gezien bij de matig én de ernstig aangetaste M.E./CVS-groepen vergeleken met de controles. Dit weerspiegelt eerder gepubliceerd werk, dat berekeningen van een mitochondriale stress test gebruikte om ATP-gelinkte respiratie te benaderen. Deze resultaten geven aan dat er een defekt in de glycolyse en/of OXPHOS-mechanisme is dat patiënten-cellen verhindert voldoende ATP te produceren. Dit kan bijdragen aan de vermoeidheid en post-exertionele malaise die hoofdkenmerken zijn van M.E./CVS. De ernstig aangetaste groep had een significant lagere ATPglyc en ATPtot dan de matig aangetaste groep in hoog-glucose. De verschillen qua ATP-gelinkte respiratie tussen de twee patiënten-groepen kan verklaren waarom de ernstig aangetaste patiënten bedlegerig worden door de ziekte, aangezien ze een zelfs lagere ATP-gelinkte respiratie hebben dan de matig aangetasten. Of de verschillen een oorzaak of gevolg van de ziekte zijn, dient echter nog te worden bepaald.

We hebben getoond dat verschillen in glucose-concentratie de ATP-produktie uit glycolyse en OXPHOS beïnvloeden in cellen van gezonde controles. De veranderingen in controle PBMCs in laag-glucose volgden het patroon dat we hypothiseerden – een afname van de glycolyse en een toename van het OXPHOS-gebruik. Dit is omdat de lagere glucose-concentratie cellen dwingt om OXPHOS in grotere mate te gebruiken omwille van de hogere opbrengst van ATP per glucose-molekule t.o.v. bij glycolyse. De matig aangetaste patiënten vertonen dezelfde trends voor alle vier de parameters als de controles, hoewel niet alle verschillen significant waren. De ernstig aangetaste groep vertoonde heel weinig verschil tussen laag- en hoog-glucose. We hebben getoond dat PBMCs van controles en matig aangetasten glycolytisch gedragen in hoog-glucose maar verschuiven naar OXPHOS als overheersende energie-bron in laag-glucose. Cellen van ernstig aangetaste patiënten produceren hun ATP voornamelijk via cellulaire respiratie (OXPHOS) in zowel laag- als hoog-glucose met zeer weinig wijziging qua energie-produktie tussen de twee glucose-condities. Het kan zijn dat M.E./CVS-patiënten, bijzonderlijk de ernstig aangetaste groep, reeds maximaal ATP produceren bij hoog-glucose, daarom heeft het verlagen van de glucose-concentratie geen effekt van ATP-gelinkte respiratie. Dit kan duiden op abnormaliteiten in factoren zoals glucose-transport, glycolytische/ OXPHOS enzyme-aktiviteit of AMPK funktie, wat eerder werd aangetoond abnormaal te zijn in M.E./CVS skeletspier-cellen [Brown AE, Newton JL et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Het kan ook zijn dat PBMCs van M.E./CVS-patiënten minder in staat zijn zich aan te passen of trager adapteren in laag-glucose.

Er zijn meerdere beperkingen omtrent deze studie. PBMCs zijn een zeer heterogene cel-populatie die bestaat uit een aantal verschillende cel-types met verschillende bio-energetische vereisten. Bij deze studie hebben we PBMCs gebruikt i.p.v. de populatie op te delen in subpopulaties. Dit omwille van het hoog aantal cellen dat vereist is om elke PBMC-subpopulatie te bekijken. Als echter ethische goedkeuring kan worden verkregen om genoeg cellen te verkrijgen, dan zou deze opdeling een voordeel kunnen bieden. Toekomstige studies zouden moeten kijken naar het lipiden-metabolisme (wat in andere studies gewijzigd bleek bij M.E./CVS [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight( 2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480 /// Germain AR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9]), en of het verschilt tussen de groepen en hoe het verband houdt met de resultaten wat betreft glucose-metabolisme die we hier zagen. De beperking van het enkel onderzoeken van het glucose-metabolisme in deze cellen betekent dat een globale beoordeling van cellulaire bio-energetica nog niet kon gebeuren. Er zou waardevolle informatie kunnen worden verkregen via het herhalen van dit type experimenten en analyses in andere cel-types om te zien of deze veranderingen specifiek zijn voor PBMCs of meer systemisch. Dit werk zou ook voordeel kunnen halen uit het bestuderen van andere ziekte-groepen met vermoeidheid als kern-symptoom om te bepalen of de bio-energetische veranderingen een merker van de ziekte M.E./CVS of van het symptoom vermoeidheid zijn. Hoewel in deze studie duidelijke verschillen tussen de groepen werden geïdentificeerd, zelfs gebruikmakend van robuuste en conservatieve statistische technieken, zouden grotere aantallen deelnemers, inclusief stalen van meerdere internationale lokaties, de bevindingen nog meer kracht geven.

Besluiten

Het is van vitaal belang dat mensen met verschillende ziekte-graden worden opgenomen M.E./CVS-studies als we vooruitgang willen boeken naar een beter begrip omtrent de pathofysiologie van of M.E./CVS. De inclusie van de twee ziekte-ernst patiënten-groepen heeft ons toegelaten verschillen en gelijkenissen te identificeren tussen personen met een matige en ernstige vorm van de ziekte. Het ontbreken van een associatie tussen ziekte-ernst en mitochondriale funktie die hier werd getoond, geeft aan dat abnormaliteiten in mitochondriale funktie een kenmerk zijn van de ziekte, ongeacht de ernst. De verminderde glycolytische funktie bij de ernstig aangetaste patiënten-groep die we hebben geïdentificeerd is ook vitaal, aangezien het toont dat deze patiënten een glycolytische stoornis hebben naast de mitochondriale problemen, wat kan verklaren waarom deze patiënten een ernstiger fenotype vertonen. Lagere waarden wat betreft zowel mitochondriale als glycolytische funktie kunnen worden veroorzaakt door een hypo-metabole toestand bij M.E./CVS die gelinkt is met ziekte-ernst. Dit werk heeft ons begrip omtrent cellulaire energie-produktie abnormaliteiten bij M.E./CVS en hoe dit de ziekte-ernst beïnvloedt, uitgebreid.

april 23, 2020

Humaan Leukocyten Antigen allelen gelinkt met M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 6:45 am
Tags: , , , , ,

HLAs (Humaan leukocyten antigenen zijn antigenen die aanwezig zijn op het oppervlak van alle lichaamscellen (niet enkele de witte bloedcellen, leukocyten), behalve de rode bloedcellen. Ze staan bekend als ‘ transplanatie-antigenen’ omdat ze tussen donor of ontvanger zo weinig mogelijk mogen verschillen om de kans op afstoting te verkleinen (HLA-compatibiliteit). Ze helpen het immuunsysteem onderscheid te maken tussen lichaam-eigen (‘self’) en lichaam-vreemde (‘non-self’) strukturen. Het HLA-systeem of MHC (‘major histocompatabilty complex’) is een deel van het genoom dat codeert voor de HLA-proteïnen; een soort bloedgroep-systeem maar veel complexer dan het beter gekende ABO. Er zijn nl. een miljoen verschillende combinaties mogelijk door het voorkomen van verschillende allelen (allel = bepaalde variant van een gen; twee gelijke allelen = homozygoot, twee verschillende allelen = heterozygoot) per HLA-gen en de co-dominante overerving (de HLA-genen geërfd van zowel vader als van moeder komen tot expressie). De HLA-eiwitten op het celmembraan vormen uiteindelijk een unieke ‘barcode’ om een cel te herkennen. Ze presenteren ook antigeen aan de antigeen-receptoren van T-lymfocyten.

Daarnaast is van veel ziekten aangetoond dat het voorkomen van een bepaald HLA-type de kans op het ontwikkelen van die ziekte groter of kleiner maakt. Dragers van bepaalde HLA-types hebben dan meer of minder kans om die ziekte te ontwikkelen. Omdat het HLA-type erfelijk is, krijgt de ziekte daardoor een erfelijke component.

Het MHC is een groep genen op chromosoom-6 bevindt. Er zijn 6 HLA-loci (locus = vaste positie van een gen op een chromosoom) die coderen voor 2 klassen proteïnen. MHC klasse I: HLA-A, HLA-B & HLA-C genen coderend voor eiwitten die voorkomen op het membraan van alle cellen met kernen, en trombocyten. Ze presenteren endogene proteïnen (eiwitten afkomstig van binnenin de cel, bv. virussen) aan CD8+ T-lymfocyten. MHC klasse II: HLA-DQ, HLA-DR & HLA-DP genen coderend voor proteïnen die tot expressie komen op het membraan van antigeen-presenterende cellen, zoals B-lymfocyten, monocyten, macrofagen en dendritische celen. Deze presenteren exogene proteïnen (eiwitten afkomstig van buiten de cel) aan CD4+ T-lymfocyten.

De hier gevonden verbanden bij M.E.(cvs) hebben een matige effekt-grootte maar er gebeurde wel een correctie voor multipele vergelijkingen. Ze geven aanwijzingen naar mogelijke auto-immuniteit toe. Prof. Ron Davis (biochemie & genetica), directeur van het ‘Stanford Genome Technology Centre’, verkreeg financiering (van de ‘US National Institutes of Health’) om te kijken naar HLA-genen dus wellicht volgt er replicatie…

————————-

Sci Rep. 2020 Mar 24;10(1):5267

Human Leukocyte Antigen alleles associated with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (M.E./CFS)

Lande A1,2, Fluge Ø3, Strand EB4,5, Flåm ST6, Sosa DD7, Mella O3, Egeland T8,9, Saugstad OD10, Lie BA6,8,9, Viken MK6,9

1 Department of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital, Oslo, Norway

2 Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, Oslo, Norway

3 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital and Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

4 National Advisory Unit on CFS/ME, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

5 Faculty of Health Science, VID Specialized University, Stavanger, Norway

6 Department of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 CFS/ME Centre, Oslo University Hospital, Oslo, Norway.

8 Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, Oslo, Norway

9 Department of Immunology, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

10 Department of Pediatric Research, Oslo University Hospital, University of Oslo, Oslo, Norway

Samenvatting

De etiologie en pathogenese van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) zijn onbekend, maar auto-immuniteit is één van de vele voorgestelde mechanismen. Humaan Leukocyten Antigen (HLA) associaties zijn hoofdkenmerken van auto-immune ziekte en werden nog niet diepgaand onderzocht bij een grote groep M.E./CVS-patiënten. We voerden hoge-resolutie HLA -A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 & -DPB1 genotypering uit d.m.v. ‘next-generation’ sequentie-bepaling bij 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de Canadese Consensus Criteria). HLA-associaties werden beoordeeld door vergelijking met 4.511 gezonde en ethnisch gematchte controles. Er werd klinische informatie verzameld via vragenlijsten ingevuld door patiënten of verwanten. We ontdekten twee onafhankelijke HLA-associaties, met als labels de allelen HLA-C*07:04 (OR 2.1 [95% CI 1.4-3.1]) & HLA-DQB1*03:03 (OR 1.5 [95% CI 1.1-2.0]). Deze allelen werden gedragen door 7,7% & 12,7% van de M.E./CVS-patiënten, respectievelijk. Het deel van de individuen dat één of beide van deze allelen draagt, was 19,2% in de patiënten-groep en 12,2% in de controle-groep (OR 1.7 [95% CI 1.3-2.2], pnc = 0.00003). M.E./CVS is een complexe ziekte, mogelijks met substantiële heterogeniteit. We rapporteren nieuwe HLA-associaties die wijzen in de richting van betrokkenheid van het immuunsysteem bij M.E./CVS-pathogenese.

Inleiding

[…]

De pathogenese en etiologie van M.E./CVS zijn niet gekend maar er werden meerdere modellen voorgesteld. Een centrale hypothese stelt dat auto-immuniteit deel uitmaakt van de pathophysiologie [Sotzny F, Scheibenbogen C et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmunity Reviews (2018) 17: 601-609 /// Blomberg J et al. Infection Elicited Autoimmunity and Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: An Explanatory Model. Frontiers in Immunology (2018) 9: 229]. Er werd gerapporteerd dat M.E./CVS deels erfelijk is [Albright F, Light K et al. Evidence for a heritable predisposition to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Neurology (2011) 11: 62 /// Schur E et al. Twin analyses of fatigue. Twin Research and Human Genetics (2007) 10: 729-733], consistent met een multi-factoriële etiologie afhankelijk van zowel genetische als omgeving-factoren. Dit is het heersend model voor een groot aantal ziekten, inclusief gevestigde auto-immune ziekten (AID). Meerdere publicaties maken melding van immunologische veranderingen bij M.E./CVS-patiënten, bv. wijzigingen qua ‘natural killer’ (NK) cel funktie, cytokine-waarden en DNA-methylatie patronen consistent met immuniteit-ontregeling. Sommige van deze bevindingen konden niet worden gereproduceerd in andere studies, wat te wijten kan zijn aan verschillen qua methodologie, de complexiteit en heterogeniteit van M.E./CVS, en het gebrek aan ‘power’ omwille van de beperkte grootte van de groepen. Ten gevolge rechtvaardigt de auto-immuniteit hypothese verdere evaluatie. Een karakteristiek kenmerk van AID is de genetische associatie met bepaalde humaan leukocyten antigen (HLA) allelen. Zodoende is een grondig onderzoek van HLA-associaties bij M.E./CVS relevant, hoewel HLA-associaties per se niet kunnen worden gezien als bewijsmateriaal betreffende ziekte-etiologie. Er werden studies van HLA-verbanden bij M.E./CVS gepubliceerd maar met grote variatie betreffende inclusie-criteria en HLA-typering methodologie. Er kwamen geen evidente reproduceerbare, significante associaties uit deze studies voort. In de grootste studie (110 patiënten) was de sterkste significante associatie met HLA-DQ3 (OR 1.8 (95% CI 1.2-2.8) [Keller RH et al. Association between HLA class II antigens and the chronic fatigue immune dysfunction syndrome. Clinical Infectious Diseases (1994): S154-156]. [De ‘odds ratio’, OR, is een statistische waarde die de sterkte van een verband tussen twee gebeurtenissen kwantificeert; bij een OR = 1 zijn de gebeurtenissen onafhankelijk, bij OR > 1 zijn ze geassocieerd), bij OR < 1 zijn ze negatief gecorreleerd. CI (confidence-interval), betrouwbaarheid-interval : een intervalschatting voor een parameter, stelt een bereik van aannemelijke waarden voor.] Er werden ook associaties met de HLA-allelen DQA1*01, DRB1*13:01 & DQB1*06:02 gerapporteerd. De meerderheid van deze studies omvatte minder dan 50 patiënten en hadden onvoldoende ‘power’ voor de detektie van matige tot zwakke verbanden. Daarom trachtten we in deze studie een uitgebreid onderzoek naar HLA-associaties uit te voeren in een grote M.E./CVS-groep, met toepassing van moderne, hoge-resolutie HLA-typering.

Materialen & methodes

[…] Er werd een totaal van 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten opgenomen. Allen kregen een diagnose op basis van de 2003 Canadese Consensus Criteria, uitgezonderd vier patiënten waarbij de evenzeer strikte 2010 Internationale Consensus Criteria werden toegepast. […] Alle patiënten gaven de identiteit op van eerste-, tweede- of derde-graad verwanten met M.E./CVS […]. […] De controle-groep bestond uit 4.511 ethnisch gematchte, gezonde individuen uit het ‘Norwegian Bone Marrow Donor Registry’. […] Infektie of vaccinatie als initiërende gebeurtenis was zelf-gerapporteerd […].

HLA-genotyping d.m.v. ‘next generation’ sequentiebepaling

Voor 426 M.E./CVS-patiënten voerden we hoge-resolutie, ‘next-generation’ sequentiebepaling uit van de HLA klass-I genen HLA-A, -B & -C, en klasse-II genen HLA-DRB1, -DQB1, -DPB1, -DQA1. […] De 4.511 gezonde controles waren eerder HLA-getypeerd. Zowel patiënten- en controle-genotypes werden geanalyseerd op ‘2nd field’ resolutie voor HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 & -DPB1. […] ‘2nd field’ resolutie onderscheidt allelen die aminozuur verschillen coderen, d.w.z. specifieke HLA-proteïnen, en dit is daarom van grotere biologische relevantie. […]. [De WHO nomenclatuur (geeft de naam van het gen-locus gevolgd door 4 cijfers die de verschillende variaties in de DNA-sequentie aangeven. Het eerste definieert de allel-groep die gewoonlijk correspondeert met de serologisch (interaktie met antilichamen) gedefinieerde specificiteit van het HLA-proteïne. Het tweede geeft verschillen aan in de DNA-sequentie aan die aanleiding geven tot een verschil in de aminozuur-sequentie van het resulterend proteïne. Hoge-resolutie geeft een set allelen aan die dezelfde proteïne-sequentie voor het peptide-bindend gebied van een HLA-molekule aan, dentificeert HLA-allelen tot op ‘2nd field’ resolutie niveau.]

Gegevens-analyses […] Genetische associaties werden onderzocht op allel- en haplotype [genetische variant; combinatie van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] -niveau, en ORs met 95% betrouwbaarheid-intervallen (95% CI) werden berekend […]. Risico-allel ORs werden ook berekend na geslacht-stratificatie […]. Er werden LD-berekeningen [‘linkage disequilibrium’ = de niet-willekeurige associatie van allelen op verschillende loci; Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.] en testen [correctie van p-waarden] uitgevoerd om de mate van onafhankelijkheid tussen de geassocieerde allelen te onderzoeken. De LD maatstaf D’ werd berekend volgens de formule D’ = D/Dmax […], D is de standaard mathematische definitie voor LD tussen allelen A & B […]. Omwille van de vergelijking van meerdere allel-frequenties voerden we correcties [pc] uit. Voor elk locus werden niet-gecorrigeerde p-waarden [pnc] vermenigvuldigd met het totaal aantal allelen gedetekteerd op dat locus, waarbij allelen met een frequentie < 3% in zowel de controle-groep als de patiënten-group werden uitgesloten. Het significantie-niveau was 0.05. Enkel haplotypes met geassocieerde allelen werden onderzocht, en ‘multiple test’ correctie gebeurde dus niet op haplotype-niveau.

Onderzoek van klinische gegevens

[…] De patiënten-groep werd gestratificeerd op basis van de aanwezigheid van specifieke HLA-allelen en 8 […] klinische variabelen werden beoordeeld via OR-bereking […].

Resultaten

Karakterisatie van patiënten- en controle-groepen

Er namen 426 M.E./CVS-patiënten en 4.511 gezonde, etnisch gematchte controles deel. Alle patiënten kregen de diagnose in Noorwegen volgens de 2003 Canadese Consensus Criteria, uitgezonderd vier waarbij de evenzeer strikte 2010 Internationale Consensus Criteria werden toegepast. De gemiddelde leeftijd bij diagnose was 34,7 jaar voor M.E./CVS-patiënten, 82,8% waren vrouwen en de meeste patiënten (45,5%) hadden een ziekte-duur van 5-10 jaar (van aanvang van de symptomen tot inclusie in de studie). 12,5% van de patiënten waren ernstig of zeer ernstig ziek (bedlegerig). Een bijkomende 28,6% was matig tot ernstig ziek (huisgebonden). Een totaal van 41,1% van de M.E./CVS-patiënten waren bedlegerig of huisgebonden en 86,8% waren niet in staat te werken (deel- of voldtijds) gedurende de voorbije 6 maand.

HLA-allelen geassocieerd met M.E./CVS

We verkregen ‘2nd field’ resolutie genotypes van HLA klasse-I genen HLA-A, -B & -C en klasse-II genen HLA-DRB1, -DQB1 & -DPB1 voor alle patiënten en controles. Deze resolutie onderscheidt HLA-allelen die voor specifieke HLA-proteïnen coderen. Er werden geen significante afwijkingen van Hardy-Weinberg equilibrium [Dit principe stelt dat de genetische variatie in een populatie constant blijft van één generatie op de andere als er geen verstorende factoren (bv. mutaties, natuurlijke selektie, enz.) zijn.] opgemerkt voor geen enkele van de HLA-loci, noch in de patiënten-groep noch in de controle-groep. We berekenden de allel-frequenties voor alle geobserveerde HLA klasse-I & klasse-II allelen. Globale associatie testen voor elk HLA-locus waren significant voor HLA-C (p = 0.04) en HLA-DQB1 (p = 0.04). Bij vergelijking van individuele allel-frequenties tussen patiënten en controles, doken 4 HLA risico allelen op: C*07:04 (OR = 2.1 [95% CI 1.4-3.1], pnc = 0.0001, pc = 0.001), B*57:01 (OR = 1.6 [95% CI 1.2-2.3], pnc = 0.004, pc < 0.05), DQB1*03:03 (OR = 1.5 [95% CI 1.1-2.0], pnc = 0.005, pc < 0.05) en B*44:02 (OR = 1.3 [95% CI 1.0-1.6], pnc = 0.03, pc = n.s.). Om de afhankelijkheid van deze associaties te evalueren, hebben we de mate van ‘linkage disequilibrium’ (LD) tussen de 4 allelen binnen de patiënten-groep gemeten. Er werd een sterk LD geobserveerd tussen C*07:04 en B*44:02 (D’ = 0.90) alsook tussen B*57:01 en DQB1*03:03 (D’ = 0.69), wat aangeeft dat deze allelen kunnen voorkomen op twee afzonderlijke haplotypes. Het eerste haplotype, C*07:04 – B*44:02, had een geschatte frequentie van 3,5% in de patiënten-groep en 1,7% in de controle-groep, resulterend in een OR van 2.1 (95% CI 1.4-3.1, pnc = 0.0002). Het tweede haplotype, B*57:01 – DQB1*03:03, had een geschatte frequentie van 3,3% in de patiënten-groep en 2,0% in de controle-groep, resulterend in een OR van 1.7 (95% CI 1.1-2.5 pnc = 0.01). Om verder te evalueren welk allel op elk van de twee haplotypes de meest significante associatie geeft, voerden we analyses uit tussen C*07:04 & B*44:02 alsook tussen B*57:01 & DQB1*03:03. Geen van de twee allelen van elk van de twee haplotypes bereikte significantie bij het testen van hun onafhankelijke associatie, wat niet verrassend is omwille van het hierboven vermelde sterk LD. We rapporteren C*07:04 & DQB1*03:03 als label-allelen voor de M.E./CVS-associaties, aangezien deze allelen voorkomen op de twee loci die initieel globale associatie vertoonden.

Daarna wilden we verzekeren dat deze HLA-associaties niet te wijten waren aan geslacht-verschillen tussen de gevallen en controles (respectievelijk 82,8% vs. 59,8% vrouwen). Er werden geen significante geslacht-verschillen gezien tussen de drager-frequenties van deze allelen voor gevallen of controles (C*07:04 3,7% bij vrouwen en 4,0% bij mannen; p = 0.6; DQB1*03:03 9,0% bij vrouwen en 8,3% bij mannen; p = 0.4). Bovendien werd, na stratificatie van gevallen en controles volgens geslacht, heterogeniteit verworpen (p > 0.5) tussen de OR-waarden verkregen voor enkel vrouwen en enkel mannen, wat aangeeft dat er geen geslacht-verschillen tussen de HLA-associaties bij M.E./CVS bestaan.

De twee loci HLA-DRB1 & HLA-DQB1 liggen fysiek dicht bijéén en vertonen een bijzonder sterk LD. In onze gegevens-set, kwam DQB1*03:03 het meest frequent voor met DRB1*07:01. Het haplotype DRB1*07:01 – DQB1*03:03 had geschatte frequenties van 4,7% en 2,9% in de patiënten- en controle-groep, respectievelijk (OR 1.7 [95% CI 1.2-2.3], pnc = 0.003). Bij de patiënten werd geschat dat dit zonder uitzondering DQA1*02:01 droeg. Genotype-gegevens voor het HLA-DQA1 locus werden enkel verkregen voor de patiënten en waren niet beschikbaar voor de controles.

Er waren twee allelen met een negatief verband met M.E./CVS, suggestief voor mogelijke bescherming, namelijk B*08:01 (OR = 0.7 [95% CI 0.6-0.9], pnc = 0.01, pc = n.s.) en DPB1*02:01 (OR = 0.7 [95% CI 0.6-0.9], pnc = 0.02, pc = n.s.). Deze allelen waren niet in LD (D’ = -0.29), wat aangeeft dat de associaties onafhankelijk zijn. Het meest frequente B*08:01 haplotype in Noorwegen is het sterk geconserveerde zogenaamde auto-immuun en voorouderlijk AH8.1 haplotype (C*07:01-B*08:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01). Dit haplotype had een gereduceerde geschatte frequentie in de patiënten-groep vergeleken met de controle-groep (8,2% vs. 10,3%, OR = 0.8, pnc = 0.06), ofschoon niet significant.

HLA risico allel dragers en klinische karakteristieken

Het deel individuen dat het allel C*07:04 draagt, was 7,7% in de patiënten-groep en 3,8% in de controle-groep, terwijl 12,7% van de patiënten en 8,7% van de controles DQB1*03:03 droegen. Het deel van de individuen dat één van beide allelen draagt, was 19,2% in de patiënten-groep en 12,2% in de controle-groep (OR 1.7, pnc = 0.00003, 95% CI 1.3-2.2). Na stratificatie voor C*07:04 en/of DQB1*03:03 bleek dat geslacht noch initiërende gebeurtenissen, co-morbiditeit met depressie of fibromyalgie, of AID of M.E./CVS bij de eerste-graads verwanten geassocieerd waren met de risico-allelen. M.E./CVS-patiënten die echter drager van één of beide risico-allelen waren, hadden een significant hoger aandeel co-morbide AID (OR = 2.3 [95% CI 1.2-4.3], pnc =-0.01). De frequentie van co-morbide AID was ook significant verhoogd bij stratificatie voor C*07:04 alleen (OR = 2.9 [95% CI 1.2-6.6], pnc = 0.01) maar niet bij stratificatie voor DQB1*03:03 alleen (OR = 1.6 [95% CI 0.8-3.4], pnc = n.s.). Deze patiënten, dragers van HLA risico-allelen, hadden de volgende AID, gerangschikt volgens frequentie: Hashimoto’s thyroiditis [auto-immuunziekte van de schildklier]/ hypothyreosis [tekort aan schildklier-hormonen], psoriasis [auto-immune huidziekte], Reumatoïde Artritis, alopecia areata [pleksgewijze kaalheid] en Crohn’s of ulceratieve colitis.

Bespreking

In dit project voerden we hoge-resolutie HLA-genotypering uit d.m.v. ‘next-generation sequencing’ bij 426 volwassen, Noorse M.E./CVS-patiënten (diagnose volgens de Canadese Consensus Criteria). Er zijn geen voorafgaande publicaties met uitgebreide HLA-genotypering by d.m.v. bij deze patiënten. We ontdekten twee onafhankelijke HLA-associaties, gelabeld door de allelen HLA-C*07:04 & HLA-DQB1*03:03.

Naar ons weten werden associaties met HLA-C allelen nog niet eerder bestudeerd bij M.E./CVS. In 1994 voerden Keller RH et al. [zie hierboven] serologische HLA-DR en DQ typering uit bij 110 patiënten met Chronische Vermoeidheid Immune Dysfunktie Syndroom (CFIDS). De patiënten kregen de diagnose op basis van de Holmes Criteria en CFIDS werd gedefinieerd als een subgroep met positieve bevindingen wat betreft virale reaktivatie patronen, and B- & T-cel testen, wijzend op een post-infektueuze aanvang en een zekere mate van immuun-dysfunktie. De auteurs vonden een significant verband (OR = 1.8) met het serotype HLA-DQ3. Serologische HLA-typering heeft een lage resolutie vergeleken met genetische typering. HLA-DQ3 correspondeert met HLA-DQB1*03 in de genetische nomenclatuur, waarbij DQB1*03:03 één van de drie grootste subgroepen is. Er werd hogere resolutie HLA-DQB1 typering uitgevoerd bij twee kleinere groepen (< 58 patiënten), en zelfs al was het statistisch niet significant: DQB1*03:03 bleek lichtjes frequenter bij de CVS-patiënten (diagnose met de Fukuda criteria) dan bij controles. [bv. Smith J, Kerr JR et al. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. Journal of Clinical Pathology (2005) 58: 860-863] De bevindingen in de literatuur zijn dus vergelijkbaar met de associatie tussen M.E./CVS en DQB1*03:03 hier.

HLA-B*08:01 vertoonde in ons materiaal een gedaalde frequentie bij M.E./CVS t.o.v. controles. Dit allel komt meest dikwijls voor op het haplotype C*07:01-B*08:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01, wat ook minder prevalent was bij onze M.E./CVS-patiënten. Dit voorouderlijk haplotype, AH8.1, is een risico-factor voor een brede waaier aan AID, inclusief myasthenia gravis, Systemische Lupus Erythematosus en coeliakie, maar beschermend tegen Reumatoïde Artritis. In de literatuur aangaande HLA en CVS, is HLA-DRB1 het meest frequent bestudeerde locus. In vier van de vijf studies, was de frequentie van DR3/DRB1*03 lager in de patiënten-groep, terwijl in de vijfde studie de frequentie gelijkaardig was in beide groepen. Dit haplotype lijkt dus echt minder prevalent bij M.E./CVS-patiënten.

Sommige HLA-associaties die eerder werden gerapporteerd bij CVS worden niet ondersteund door onze resultaten. Het dikwijls geciteerd verband met DQA1*01 gerapporteerd door Smith J et al. [zie hierboven] kon in ons materiaal niet worden geëvalueerd aangezien het HLA-DQA1 locus niet werd gegenotypeerd in de controle-groep. In onze patiënten-groep, kwam DQA1*01 voor op het haplotype met de volgende DQB1-allelen (gerangschikt volgens frequentie): DQB1*06:02, DQB1*05:01, DQB1*06:03, DQB1*06:04 & DQB1*05:03, en geen enkele daarvan (pnc > 0.1), noch alle gecombineerd (OR = 1.0, pnc = 0.6) bleken geassocieerd met M.E./CVS.

De huidige HLA-studie bij M.E./CVS is naar ons weten de grootste die tot op heden werd uitgevoerd (andere studies omvatten ≤ 110 CVS-patiënten). Onze studie had 80% ‘power’ om HLA-associaties met OR ≥ 1.5 (specifiek een allel-frequentie > 0.05) te ontdekken. Interessant is dat zowel C*07:04 als DQB1*03:03 significant bleven na correctie […]. We voerden een correctie uit voor het aantal allelen getest op elk locus, aangezien allelen op verschillende HLA-loci in sterk LD zijn, en daarom geen onafhankelijke testen vertegenwoordigen. De methode die we hanteerden, wordt beschouwd als een strikte correctie maar anderzijds neemt dergelijke correctie het gebrek aan complete LD tussen de onderzochte loci niet in rekening. Te samen genomen betekent dit dat onze resultaten dienen te worden geverifieerd bij onafhankelijke groepen. In het algemeen zijn gevestigde HLA-associaties reproduceerbaar over verschillende populaties maar susceptibiliteit-loci kunnen ook variëren tussen populaties. Daarom moeten HLA-associaties bij M.E./CVS ook worden onderzocht in populaties van verschillende afkomst.

Beide door ons geobserveerde M.E./CVS-associaties waren evident bij ‘2nd field’ resolutie (t.t.z. C*07:04 & DQB1*03:03), welke allelen onderscheidt die coderen voor aminozuur verschillen. Interessant: de andere C*07 en DQB1*03 allelen bleken niet geassocieerd, wat het belang van hoge-resolutie HLA-genotypering benadrukt.

We rapporteren C*07:04 & DQB1*03:03 als label-allelen voor 2 onafhankelijke HLA risico verbanden bij M.E./CVS, aangezien deze allelen in ‘linkage equilibrium’ (D’ = 0.06) zijn. Ze kunnen echter nog merkers zijn voor één van beide gemeenschappelijke, of twee onafhankelijk geassocieerde varianten buiten de hier geteste loci. Anderzijds kunnen de hier gerapporteerde geassocieerde allelen zelf een funktionele relevantie hebben. HLA klasse-I allelen, zoals C*07:04, kunnen het ziekte-risico beïnvloeden via hun interakties met CD8-positieve cytotoxische T-lymfocyten. Er werden stoornissen van CD8-positieve T-lymfocyten bij M.E./CVS gerapporteerd, hoewel de resultaten enigszins tegenstrijdig zijn [zie Sotzny F et al. hierboven]. Een andere belangrijke funktie van HLA klasse-I allelen is dat ze dienst doen als liganden voor NK-cel receptoren. [Lees in dit verband ook ‘Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS] Er werd door meerdere onafhankelijke researchers melding gemaakt van gewijzigde aantallen en funktie van NK-cellen bij M.E./CVS. Het andere geassocieerd allel, DQB1*03:03, is een HLA klasse-II allel, wat ook interessant is met betrekking tot de hypothese omtrent auto-immuniteit bij M.E./CVS. In bepaalde goed bestudeerde AID bleken geassocieerde HLA klasse-II allelen unieke peptide-bindende eigenschappen te vertonen, alsook HLA-TCR restrictie [MHC-restrictie of door MHC beperkte antigen-herkenning, verwijst naar het feit dat een T-cel met een ‘self’ MHC-molekule en een daarop gevonden vreemd peptide kan interageren, maar enkel op het antigen zal reageren wanneer het gebonden is met een bepaalde MHC-molekule], waardoor de verworven immuun-respons direct wordt beïnvloed, bv. door de aanmaak van specifieke auto-antilichamen. Een ontregelde aktiviteit van CD4-positieve T-lymfocyten, het voornaamste cel-type dat interfereert met HLA klasse-II allelen, werd besproken als een centraal mechanisme bij M.E./CVS [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Translational Medicine (2011) 9: 81]. Meerdere studies rapporteren verhoogde waarden aan specifieke auto-antilichamen bij M.E./CVS-patiënten [Ortega-Hernandez OD, Shoenfeld Y. Infection, vaccination, and autoantibodies in Chronic Fatigue Syndrome, cause or coincidence? Annals of the New York Academy of Sciences (2009) 1173: 600-609; zie ook Vaccinatie en CVS], bv. tegen neurotransmitter-receptoren, hoewel voor de meeste geverificatie ontbreekt in bijkomende groepen.

Een andere interessante vraag is of deze HLA-associaties worden bepaald door subgroepen patiënten en zo dus sterkere risico-allelen vertegenwoordigen. Het is een relevant aspect bij een complexe ziekte zoals M.E./CVS, waar verschillende oorzakelijke mechanismen kunnen spelen in verschillende subgroepen. In onze studie hadden M.E./CVS-patiënten met HLA risicio allelen een significant hogere co-morbiditeit van gevestigde AID. We hebben geen weet van publicaties die melding maken van associaties tussen C*07:04 of DQB1*03:03 en AID die sommige van onze patiënten aantasten. Daarom is het onwaarschijnlijk dat de associaties hier worden gestuurd door HLA-associaties met reeds gevestigde AID. Er wordt familiale aggregatie gezien is voor veel specifieke AID, alsook voor auto-immuniteit in het algemeen. In onze studie hebben eerste-graad verwanten van M.E./CVS-patiënten een hoge prevalentie voor AID. Deze observaties kunnen mogelijks te wijten zijn aan een element van auto-immuniteit bij M.E./CVS, of binnen een subgroep. Er bleken geen andere patiënten-karakteristieken te overheersen bij de M.E./CVS-patiënten met HLA risico allelen, specifiek: noch zelf-gerapporteerde infektueuze aanvang of huidige ziekte-ernst. Er kan worden geargumenteerd dat het gebrek aan validiteit van zelf-gerapporteerde gegevens de detektie van mogelijke subgroep-identificatoren uitsluit.

Tot besluit: we melden nieuwe HLA-associaties in een grote groep M.E./CVS-patiënten die voldoen aan de Canadese Consensus Criteria, wat de betrokkenheid van het immuunsysteem bij de M.E./CVS-pathogenese ondersteunt.

april 11, 2020

Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 6:19 am
Tags: , , , , ,

Enkele wetenschappers uit verschillende richtingen (o.a. Yehuda Shoenfeld, Carmen Scheibenbogen & Manuel Martinez-Lavin) brengen hun kennis samen omtrent de auto-immune aspecten, klinische beelden en diagnostische parameters van overlappende ziektebeelden, inclusief M.E.(cvs). Dikwijls zijn bij aanvang triggers aanwezig waarvan bekend staat dat ze een hyperstimulatie van het immuunsysteem opwekken. Ze verzamelen in dit overzicht ook bewijsmateriaal voor auto-immuniteit bij deze aandoeningen in. Ze stellen een concept voor met een rol voor ‘single fibre’ neuropathie (SFN) en auto-anilichamen tegen ‘G-proteïne gekoppelde receptoren’ (anti-GPCR AAb) bij de ontwikkeling van de gemeenschappelijke symptomen. Er is wel nog verdere research nodig om na te gaan of  SFN en anti-GPCR AAb kunnen dienen als mogelijke diagnostische biomerkers. Er is ook gebleken dat vordeel te halen valt uit bepaalde therapeutische modaliteiten, die zich richten tegen auto-immuniteit (bv. immuno-adsorptie of intraveneuze toediening van immunoglobulinen.

Lees bv. ook ‘Rol voor auto-immuniteit, neuro-inflammatie & ‘small-fibre’ neuropathie bij FM & CVS’.

————————-

Clin Immunol. 2020 Mar 17;214:108384

Complex syndromes of chronic pain, fatigue and cognitive impairment linked to autoimmune dysautonomia and small fiber neuropathy

Shoenfeld Y1, Ryabkova VA2, Scheibenbogen C3, Brinth L4, Martinez-Lavin M5, Ikeda S6, Heidecke H7, Watad A8, Bragazzi NL9, Chapman J10, Churilov LP2, Amital H10.

1 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel; Laboratory of the Mosaics of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Russia

2 Laboratory of the Mosaics of Autoimmunity, Saint Petersburg State University, Russia

3 Institute for Medical Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

4 Department of Nuclear Medicine, Herlev Gentofte Hospital, Hellerup, Denmark

5 Rheumatology Department, National Institute of Cardiology, Mexico City, Mexico

6 Intractable Disease Care Centre, Shinshu University Hospital, Matsumoto, Japan

7 CellTrend GmbH, Luckenwalde, Brandenburg, Germany

8 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel; Section of Musculoskeletal Disease, Leeds Institute of Molecular Medicine, University of Leeds, NIHR Leeds Musculoskeletal Biomedical Research Unit, Chapel Allerton Hospital, Leeds, UK

9 Postgraduate School of Public Health, Department of Health Sciences (DISSAL), University of Genoa, Genoa, Italy

10 Zabludowicz Centre for Autoimmune Diseases, Sheba Medical Centre, Tel-Aviv, Israel

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom, posturaal orthostatisch tachycardie syndroom, complex regionale pijn syndroom en siliconen-implantaat incompatibiliteit syndroom zijn het onderwerp van discussie onder klinici en researchers. Zowel de pathogenese als de behandeling van deze aandoeningen vereist verder onderzoek. In dit artikel vatten we het bewijsmateriaal aangaande de rol van auto-immuniteit samen bij deze vier syndromen, met betrekking tot immunogenetica, auto-immune co-morbiditeiten, veranderingen qua subsets immuuncellen, aanmaak van auto-antilichamen en voorkomen in dieren-modellen. Deze syndromen kunnen worden opgenomen in een nieuw concept van auto-immune neurosensorische dysautonomie met als gemeenschappelijke factoren auto-antilichamen tegen G-proteïne gekoppelde receptoren en ‘small-fibre’ neuropathie. Sjögren’s syndroom, een klassieke auto-immune ziekte, zou als ziekte-model kunnen dien, en het concept illustreren. De ontwikkeling van dit concept heeft als doel het identificeren van een klaarblijkelijk auto-immune subgroep van de aandoeningen die in dit overzicht worden geadresseerd, en welke voordeel kunnen halen uit immunotherapie.

1. Inleiding

Er werd in de gescheidenis van de geneeskunde herhaaldelijk opgemerkt dat meerdere ziekten, die aanvankelijk als afzonderlijke nosologische entiteiten [nosologie = klassificatie van ziekten] werden beschouwd, mettertijd vormen of componenten van één enkele ziekte bleken te zijn. Een groep complexe aandoeningen geassocieerd met vermoeidheid en autonome dysfunktie staat der discussie, inclusief Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), posturaal orthostatisch tachycardie syndroom (POTS), complexe regionale pijn syndroom (CRPS) en siliconen-implantaat incompatibiliteit syndroom (SIIS). Er is een gebrek aan consensus omtrent de etiologie en pathogenese van elke van hen. Deze aandoeningen delen echter gemeenschappelijke kenmerken, die suggereren dat onderliggende wijzigingen van het immuunsysteem plaatsvinden. De constellatie typische symptomen is zeer gelijkaardig bij deze aandoeningen. In dit artikel analyseren we het bewijsmateriaal voor auto-immune processen bij elk van de boven-vermelde aandoeningen, beschrijven we een gemeenschappelijke symptoom-cluster en stellen we mogelijke mechanismen (namelijk ‘small-fibre’ neuropathie (SFN) en auto-antilichamen (AAb) tegen G-proteïne gekoppelde receptoren [(GPCR) signaal-overdragers, werkend via een trans-membranair systeem, de G-proteïne receptor] (anti-GPCR)) voor, die aan de basis liggen van deze schijnbaar onverwante symptomen. We leveren bewijs voor het feit dat deze mechanismen kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van gelijkaardige symptomen bij een klassieke auto-immuun ziekte (Sjögren’s syndroom, SjS [chronische auto-immune aandoening met ontsteking van het hoornvlies/oog-bindvlies en droge mond], die sommige pathogenese-mechanismen lijkt te delen met de beschreven complexe medische aandoeningen. Gezien de potentiële auto-immune bijdragen tot de pathogenese van CVS, POTS, CRPS & SIIS, bekijken we ook de doeltreffendheid van behandelingen die auto-immuniteit proberen te managen.

2. ‘Small-fibre’ neuropathie & anti-G proteïne gekoppelde receptoren auto-antilichamen

SFN is een subtype neuropathie die wordt gekenmerkt door selektieve betrokkenheid van ongemyeliniseerde of dun-gemyeliniseerde sensorische vezels. De pathogenese ervan omvat een brede waaier aan immuun-gemedieerde, metabole, toxische, erfelijke en genetische aandoeningen. SFN bij anderzijds gezonde kinderen en jong-volwassenen blijkt echter meestal inflammatoir, met betrokkenheid van auto-reaktieve B-cellen. Met betrekking tot auto-immuniteit werd SFN gerapporteerd in verband met Sjögren’s syndroom, coeliakie [chronische darm-aandoening door gluten-intolerantie], Systemische Lupus Erythematosus, Reumatoïde Arthritis, diabetes mellitus type-1, inflammatoire darm-ziekte, sarcoïdose [abnormaal voorkomen van nodules chronisch inflammatoire cellen (granulomas) in meerdere organen] en paraneoplastisch syndroom [complex van verschijnselen bij mensen die een kwaadaardige tumor hebben, zonder dat dit het gevolg is van tumorcellen in de getroffen regio]. Sommige gegevens veronderstellen ook de associatie met Hashimoto’s thyroiditis [auto-immuunziekte van de schildklier]. De klinische symptomen van SFN kunnen zich manifesteren als geïsoleerde sensorische stoornissen, geïsoleerde autonome aandoeningen en gemengde aandoeningen [Basantsova NY, Shoenfeld Y et al. Small-fibre neuropathy definition, diagnosis and treatment. Neurol. Sci. (2019) 40: 1343-1350]. Therapie met intraveneuze immunoglobulinen werd in stijgende mate aangewend, met significante doeltreffendheid bij de behandeling van patiënten met ogenschijnlijk auto-immune SFN in twee grote retrospectieve reeksen met gelijkaardige mate van respons (77% & 83% van de patiënten) [o.a. Liu X, Oaklander AL et al. IVIg for apparently autoimmune small-fibre polyneuropathy: first analysis of efficacy and safety. Ther. Adv. Neurol. Disord. (2018) 11: 1-12]. Aangezien 25-90% van de SFN-gevallen idiopathische blijven, verdient de aard van deze aandoening verder te worden bestudeerd.

Er werden de voorbije 20 jaar met stijgende frequentie AAb tegen GPCR gerapporteerd bij verscheidene medische aandoeningen: van neurologische en cardiovasculaire ziekten tot afstoting van vasculaire transplanten. Het fundamenteel kenmerk van deze AAb is hun vermogen te binden op cel-receptoren, en intracellulaire signalisering mechanismen te aktiveren (agonistische auto-antilichamen) of te inhiberen (antagonistische auto-antilichamen) die normaaal getriggerd worden door endogene liganden. Er is bewijs dat deze antilichamen behoren tot een funktioneel netwerk van natuurlijke AAb, die in lage concentraties aanwezig zijn in de sera van gezonde personen, maar ontregeld en waarschijnlijk causatief zijn bij verscheidene ziekten inclusief auto-immune.

3. Chronische Vermoeidheid Syndroom

CVS, ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), is een ingewikkelde ziekte die zich aandient met uitgesproken uitputtende vermoeidheid, mentale en lichamelijke post-exertionele malaise, pijn, slaap- en cognitieve stoornissen. Diagnostische criteria beklemtonen bijkomend symptomen van immuunsysteem-ontregeling, dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel en metabole stoornissen. […]

Er is bewijsmateriaal voor immuunsysteem-stoornissen, en in het bijzonder voor de auto-immune mechanismen bij CVS. Er is ook een dieren-model met immunologisch geïnduceerde CVS (injektie van of poly-I:C, een virus-nabootsend synthetisch dubbelstrengig RNA, dat een ‘Toll-like’ receptor 3 agonist is [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]). Interessant is dat de aktivatie van het poly(I:C)-geïnduceerde ‘Toll-like’ receptor 3 signalisering mechanisme ook resulteert in de verergering van lupus nefritis [auto-immuunziekte met ontsteking van de ‘nier-filters’] en ontwikkeling van auto-immune diabetes bij muizen.

3.1. SFN & anti-GPCR AAb bij CVS

Er werd duidelijk omschreven en waarschijnlijke ‘small-fibre’ neuropathie, gedefinieerd als een epidermale zenuwvezel-densiteit lager dan het 5e centiel en tussen het 5e en 15e centiel, gedetekteerd bij 30% en 13% van patiënten met CVS, en lage biventriculaire vulling-drukken van het hart tijdens inspanning. Deze bevindingen kunnen aan de basis liggen van de pathofysiologie van de autonome dysfunktie bij CVS.

AAb tegen GPCR zijn van bijzonder belang bij CVS. Er werden hogere AAb-waarden tegen M1, M3 & M4 muscarine AChR [acetylcholine receptor] & β2 AdR [β2 adrenerge receptor] gevonden bij CVS-patiënten in vergelijking met controles [Loebel M, Fluge Ø, Mella O, Scheibenbogen C et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2016) 52: 32-39 /// Tanaka S, Kuratsune H et al. Autoantibodies against muscarinic cholinergic receptor in Chronic Fatigue Syndrome. Int. J. Mol. Med. (2003) 12: 225-230]. De anti-M1 AChR AAb zijn geassocieerd met spier-zwakte. Gestegen anti-β2 AdR AAb correleren met immuun-aktivatie, inclusief de aanwezigheid van geaktiveerde HLA-DR+ CD8+ T-cellen, verhoogde anti-nucleaire antilichamen, anti-thyroperoxidase AAb [auto-antilichamen gericht tegen het enzyme schildklier-peroxidase] & waarden van IgG1-3. Deze correlatie kan worden toegeschreven aan het feit dat β AdR tot expressie komen in lymfocyten, en aktivatie, differentiatie, cytokine- en antilichaam-produktie reguleren. Loebel M et al. [zie hierboven] zagen een significante afname van anti-β2 AdR & anti-M4 AChR AAb na behandeling met rituximab [monoclonaal antilichaam tegen het proteïne CD20 op het oppervlak van B-lymfocyten dat deze cellen helpt vernietigen] bij klinische responders. Scheibenbogen C et al. [Immunoadsorption to remove ß2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS One (2018) 13: e0193672] hebben in een piloot-studie getoond dat immuun-adsorptie anti-ß2 AdR & anti-M3/M4 AChR AAb efficiënt kan verwijderen bij M.E./CVS en kan resulteren in een snelle, matige tot uitgesproken verbetering van symptomen. Aangezien β2 AdR de voornaamste adrenerge receptoren zijn die vasodilatie [bloedvat-verwijding] veroorzaken bij mensen en anti-β2 AdR AAb ook bij POTS verhoogd bleken, zou men kunnen veronderstellen dat ze de vasculaire regulering bij CVS aantasten.

3.2. Behandeling gericht op auto-immuniteit bij CVS

De positieve effekten van immuun-adsorptie werd hierboven beschreven. Er werden significante klinische verbeteringen van M.E./CVS-symptomen vastgesteld bij twee patiënten met langdurende M.E./CVS die adjuvante chemotherapie met cyclofosfamide [geneesmiddel dat de deling van cellen stopt] kregen voor borstkanker, ook bij één M.E./CVS-patient die chemotherapie met cyclofosfamide kreeg voor Hodgkin-lymfoom [lymfeklier-kanker].

Drie M.E./CVS-patiënten zonder oncologische co-morbiditeiten werden daarna in een piloot-studie behandeld met zes intraveneuze infusies of cyclofosfamide (4 weken tussentijd); twee daarvan met een significante klinische respons. Er loopt een ‘open-label’, fase-2 proef met cyclofosfamide bij 40 M.E./CVS-patiënten. Gegevens over de doeltreffendheid van intraveneus immunoglobuline (IVIg) en rituximab blijven controversieel. Dit zou echter een weerspiegeling kunnen zijn van de heterogeniteit van de patiënten met negatieve resultaten omtrent de aanwezigheid van AAb [Rowe PC. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: trial fails to confirm earlier observations of rituximab’s effectiveness. Ann. Intern. Med. (2019) 170: 656].

4. Posturaal orthostatisch tachycardie syndroom

POTS is een heterogene vorm van autonome dysfunktie gekenmerkt door een abnormale toename van de hartslag (> 30 bpm binnen 10 min of boven 120 bpm) na het rechtop staan. […] De rol van auto-immuniteit in de pathofysiologie van POTS wordt ondersteund door meerdere aspecten. […]

4.1. SFN & anti-GPCR AAb bij POTS

In vier verschillende studies werd SFN gedetekteerd bij 20% tot 50% van de patiënten met POTS. Een lage intra-epidermale zenuwvezel-densiteit correleerde met gereduceerde myocardiale [myocard = hartspier] sympathische innervatie [bezenuwing] […]. […].

Er werden AAb tegen GPCR gerapporteerd bij de meerderheid van POTS-patiënten: anti-β1AdR AAb […], anti-β2AdR AAb […], anti-angiotensine-II type-I receptor AAb […], anti-M1 & M2 AChR AAb […] en anti-α1AdR AAb […]. […] Overmatige toename van de hartslag in respons op excessieve vasodilatie kan minstens gedeeltelijk Aab-geïnduceerd zijn bij POTS. […]

4.2. Behandeling gericht op auto-immuniteit bij POTS

Er zijn tot op heden geen prospectieve proeven betreffende plasmaferese [manier om schadelijke (auto-)antilichamen te verwijderen door het plasma te vervangen] bij POTS. In één studie bleek de respons op IVIg bij patiënten met POTS en seropositiviteit voor één of meerdere AAb geassocieerd met autonome dysfunktie bij 88,4% van de deelnemers. […] Er loopt één klinische test met IVIg bij POTS. […].

5. Complex regionaal pijn syndroom

CRPS is een enigmatische pijnlijke aandoening die zich typisch ontwikkelt na letsel of chirurgie aan een lidmaat. Men spreekt over type-I & type-II, afhankelijk van het feit of er een definieerbaar zenuw-letsel is (afwezig bij type-I). CRPS wordt reeds geruime tijd erkend als een pijn-aandoening met regionale sensorische, motorische en autonome abnormaliteiten in het aangetast lidmaat. Gegevens […] suggereren nu ook een algemeen autonoom onevenwicht. […] Regionale en systemische manifestaties zijn bekend. Er is bewijs voor auto-immuniteit bij CRPS. […].

5.1. SFN & anti-GPCR AAb bij CRPS

[…]. Meerdere studies vonden een daling qua epidermale zenuwvezels en in zweetklieren, en vasculaire innervatie [bezenuwing van de bloedvaten] in huidbiopten van patiënten met CRPS […]. […].

Er werden anti-α1 AdR AAb, anti-β2 AdR AAb & anti-M2 AChR Aab […] gerapporteerd bij de meerderheid van de CRPS-patiënten maar niet bij gezonde controles. […]

5.2. Behandeling gericht tegen auto-immuniteit bij CRPS

Er bestaan geen overtuigende doeltreffende behandelingen voor CRPS. Gegevens omtrent IVIg-therapie blijft controversieel. Plasma-uitwisseling therapie bleek efficiënt voor het verminderen van pijn bij CRPS maar er zijn uitgebreidere proeven vereist om deze resultaten te bevestigen. Behandeling met corticosteroïden bleek […] parallel te lopen met pijn-reductie. […] De rol van cytokinen […]: toediening van een TNF-α antilichaam (infliximab) kan merkbare reducties qua CRPS-symptomen geven bij sommige patiënten. […]

6. Siliconen implantaat incompatibiliteit syndroom

[…] Siliconose, SIIS werd ook beschreven in de context van auto-immuun/ inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten (ASIA) [Shoenfeld Y, Agmon-Levin N.‘ASIA’ – Autoimmune/ inflammatory syndrome induced by adjuvants. J. Autoimmun. (2011) 36: 4-8; lees ook ‘Vaccinatie en CVS’, ‘CVS & FM na immunisatie met hepatitis-B vaccin’, ‘ASIA (auto-immuun/inflammatoir syndroom geïnduceerd door adjuvanten) syndroom’, ‘Aanhoudende aanwezigheid & hersen-translocatie van vaccin-adjuvanten’ & ‘Voorspellen van post-vaccinatie auto-immuniteit’.]. Veel patiënten met SIIS voldoen ook aan de criteria voor CVS/M.E., fibromyalgie, sarcoïdose en/of ongedifferentieerde bindweefsel-ziekte. Er zijn indicaties voor auto-immuniteit bij SIIS. […]

6.1. SFN & anti-GPCR AAb bij SIIS

Er zijn geen artikels specifiek over SFN bij SIIS. In één studie stelden de auteurs de diagnose van een polyneuropathie syndroom bij 83 op 100 patiënten met SIIS […]. […]

Een studie van AAb tegen GPCR-receptoren bij SIIS is aan de gang. […]

6.2. Behandeling gericht tegen auto-immuniteit bij SIIS

Verbetering die wordt geïnduceerd door de verwijdering van het implantaat is één van de belangrijkste criteria voor ASIA syndroom. […]. In sommige gevallen reageren SIIS-patiënten op agentia zoals hydroxychloroquine [middel tegen malaria; door zijn ontsteking-remmende eigenschappen ook gebruikt bij auto-immuunziekten], steroïden, methotrexaat [geneesmiddel dat het afweersysteem onderdrukt] en plasmaferese.

7. Sjögren’s syndroom

SjS, een chronische systemische inflammatoire aandoening behoort tot de meest courante reumatische ziekten en kan voorkomen als primaire aandoening of in associatie met andere auto-immune aandoeningen (Reumatoïde Artritis, Systemische Lupus Erythematosus, systemische sclerose [chronische auto-immuunziekte met verharding van (huid)bindweefsel] & primaire biliaire cirrose). SjS […] kan virtueel om het even welk orgaan-systeem aantasten en veroorzaakt worden via meerdere mechanismen – niet beperkt tot dysfunktie van exocriene klieren en lymfocyten-infiltratie van andere organen, maar ook hyper-aktivatie en ontregeling van het adaptieve en aangeboren immuunsysteem. […]. Vermoeidheid is het meest courante systemisch symptoom van SjS (70-80% van de patiënten). Neurologische manifestaties (inclusief autonome, sensorische, affectieve en cognitieve symptomen) komen ook voor bij in ca. 70% van patiënten met SjS. Dit toont de mogelijkheid van betrokkenheid van zowel het perifeer als het centraal zenuwstelsel. […]. De aanvang van SjS is dikwijls gelinkt aan infektueuze agentia (voornamelijk virussen) en er werden gevallen van SjS beschreven die mogelijks geassocieerd zijn met adjuvanten (inclusief siliconen). Virale infektie, voornamelijk met het Epstein-Barr virus (EBV), neemt een prominente plaats in als trigger van primaure SjS […]. […] De afbraak van de immuun-regulering, B-cel immortalisatie en stimulatie van B-cel proliferatie van de gastheer behoren tot erkende mechanismen bij SjS […]. Er bestaat ‘molecular mimicry’ [zie ‘‘Molecular mimicry’, auto-immuniteit & infektie] tussen het primair SjS AAb (Ro-60) en het viraal proteïne (EBNA-1) […].[…]

7.1. SFN and anti-GPCR AAb in SjS

SjS is van de courante systemische auto-immune aandoening het meest gelinkt met SFN. De eerstelijn behandeling van SFN bij SjS is gericht op symptoom-management maar IVIg, zoals bleek uit een kleine gevallen-reeks, kan bijkomende verlichting bieden […]. Deze gegevens suggereren de rol van immune mechanismen bij de ontwikkeling van SFN bij SjS, hoewel er praktisch niets is geweten omtrent hoe systemische auto-immune ziekten ‘small fibres’ aantasten. Wat betreft anti-GPCR Aab is er bewijsmateriaal voor een rol van AAb tegen M3 AChR bij de ontwikkeling van SjS. […].[…]

8. Besluiten

In dit artikel focussen we op het bewijsmateriaal voor auto-immuniteit bij CVS, POTS, CRPS & SIIS, de courante manifestaties van deze medische aandoeningen, waarschijnlijke onderliggende mechanismen en enkele therapeutische modaliteiten gericht op het immuunsysteem. We suggereren dat autonome dysfunktie, minstens bij een subset patiënten, kan ontwikkelen te wijten aan de aanwezigheid van AAb tegen GPCR, wat werd gerapporteerd bij elk van de besproken aandoeningen. Deze veronderstelling wordt bijkomend ondersteund door het bewijs dat één van deze AAb (anti-M3 AChR AAb) verantwoordelijk is voor autonome dysfunktie bij de welgekende auto-immune ziekte SjS. Er werd ook aangetoond dat de waarden van anti-GPCR AAb in het serum significant hoger zijn bij adolescente meisjes met klachten die courant zijn voor POTS & CRPS na vaccinatie met humaan papillomavirus vaccin t.o.v. van ongevaccineerde controles. Deze bevindingen suggereren dat de toegenomen produktie van anti-GPCR AAb, waarvan werd gerapporteerd dat ze aanwezig zijn in de sera van gezonde individuen weliswaar in mindere hoeveelheden, een weerspiegeling is van de hyper-stimulatie van het immuunsysteem. Wat betreft de klinische manifestaties: patiënten met al de hier beschreven medische aandoeningen vertonen symptomen die typisch zijn voor perifere auto-immune autonome dysfunktie én voor betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel, wat ook kenmerkend is voor SjS. Men zou een rol voor anti-GPCR Aab kunnen voorstellen: niet enkel bij de ontwikkeling van dysautonomie maar ook bij de pathogenese van met het centraal zenuwstelsel gerelateerde symptomen; aangezien AdR & muscarine AChR tot expressie komen in het perifeer en centraal zenuwstelsel. Inderdaad: een PET-studie toonde een reductie aan van neurotransmitter-receptor binding in de hersenen van CVS-patiënten met hoge waarden aan anti-M1 AChR AAb in hun sera [Yamamoto S et al. Reduction of [11C](+)3-MPB binding in brain of Chronic Fatigue Syndrome with serum autoantibody against muscarinic cholinergic receptor. PLoS One (2012) 7: e51515]. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid dat de AAb direct interageren met de muscarine AChR in het brein (hoewel de cognitieve funktie van de CVS-patiënten in deze studie niet verschilde van gezonde controles). De andere oorzaak van dysautonomie en sensorische stoornissen, namelijk SFN, is ook relevant voor sommige patiënten met elk van de medische aandoeningen, alsook voor sommige patiënten met Sjögren’s syndroom. SFN & anti-GPCR AAb onderling zouden verbonden kunnen zijn. Primaire sensorische neuronen brengen normaal α1, α2 & β2 AdR tot expressie, welke is gewijzigd na letsels van perifere zenuwvezels of inflammatoire processen. α1AdR & M2 AChR komen ook tot expressie op zenuwvezels in de huid. Verdere studies zijn nodig voor een duidelijke definiëring van de subgroepen van patiënten met CVS, POTS, CRPS & SIIS van kennelijk auto-immune aard, die mogelijks voordeel kunnen halen uit behandeling gericht op auto-immuniteit (bv. immuno-adsorptie/ plasmaferese, IVIg, biologische agentia, enz.). Naar onze mening kunnen anti-GPCR AAb en SFN dienen als aannemelijke biomerkers voor deze subgroepen.

maart 27, 2020

Perifere endotheliale dysfunktie bij M.E.(cvs)

Filed under: Fysiologie — mewetenschap @ 1:38 pm
Tags: , , , ,

We hadden het op deze pagina’s reeds over (ontregeling van) de werking het endotheel (bedekkende binnenste laag van bloedvaten) bij M.E.(cvs): zie bv. ‘‘Bloed-circulatie abnormaal bij mensen met CVS’ & ‘Endotheliale dysfunktie in bloedvaten bij CVS’.

Ook bij fibromialgie wordt geopperd dat subklinische inflammatie en endotheliale dysfunktie belangrijk zijn bij de pathofysiologie (‘Could Endocan, a Marker of Inflammation and Endothelial Dysfunction, be a New Diagnostic Marker for Fibromyalgia?’; Clin Lab. (2018) 64: 405-410).

Het besluit van onderstaande studie is dat endothelaile dysfunktie frequent voorkomt bij M.E.(cvs)-patiënten, en dat dit verband houdt de ernst van de ziekte en de immuniteit-symptomen.

—————————

ESC Heart Fail (Pre-print maart 2020)

Peripheral endothelial dysfunction in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Nadja Scherbakov (1,2,3,4), Marvin Szklarski (5), Jelka Hartwig (5), Franziska Sotzny (5), Sebastian Lorenz (5), Antje Meyer (1,3,4), Patricia Grabowski (5), Wolfram Doehner (1,2,3,4), Carmen Scheibenbogen (1,5)

1 Berlin‐Brandenburg Centre for Regenerative Therapies (BCRT), Berlin, Germany

2 DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), partner-site Berlin, Germany

3 Department of Cardiology, Charite ‐ Universitatsmedizin Berlin, Germany

4 Center for Stroke Research Berlin (CSB), Charite ‐ Universitatsmedizin Berlin, Germany

5 Institute of Medical Immunology, Campus Virchow, Charite ‐ Universitatsmedizin Berlin, Germany

Samenvatting

Doelstellingen Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe multisysteem ziekte. Er is bewijsmateriaal voor verstoorde vasculaire regulering gevonden via verscheidene studies die cerebrale hypoperfusie en orthostatische intolerantie tonen. De perifere endotheliale dysfunktie (ED) werd nog onvoldoende onderzocht bij patiënten met M.E./CVS. Het doel van de huidige studie was om de perifere endotheliale funktie te onderzoeken bij patiënten met M.E./CVS.

Methodes & resultaten Er werden 35 patiënten – mediane leeftijd 40 (18-70) jaar, gemiddelde body-mass-index 23,8 p/m 4,2 kg/m2, 31% mannen – met M.E./CVS bestudeerd wat betreft perifere endotheliale dysfunktie bepaald via perifere arteriële tonometrie (EndoPAT2000). De klinische diagnose van M.E./CVS was gebaseerd op de Canadese Criteria. Van de patiënten kregen er 9 met gestegen antilichamen tegen beta2‐adrenerge receptor immuno-adsorptie, en de endotheliale funktie werd gemeten bij ‘baseline’ en 3, 6 & 12 maanden follow‐up. ED werd gedefinieerd als een reaktieve hyperemie index ≤ 1,81. Er werden 20 gezonde individuen met gelijkaardige leeftijd en body-mass-index gebruikt als controle-groep. Er werd perifere ED gevonden bij 18 van de 35 M.E./CVS-patiënten (51%) en bij 4 gezonde individuen (20%; p < 0.05). De patiënten met ED rapporteerden, in tegenstelling tot patiënten met normale endotheliale funktie, meer ernstige ziekte op basis van de Bell-score (31 p/m 12 vs. 40 p/m 16; p = 0.04), alsook meer ernstige vermoeidheid‐gerelateerde symptomen (8,62 p/m 0,87 vs. 7,75 p/m 1,40; p = 0.04), inclusief een hogere nood aan rustpauzes [9,0 vs. 7,5; p = 0.04]. Perifere ED correleerde met ernstiger immuun‐geassocieerde symptomen (r = -0.41, p = 0.026), zoals keelpijn (r= -0.38, p = 0.038) en pijnlijke lymfe-klieren (r = -0.37, p = 0.042), alsook meer ernstige ziekte op basis van de Bell- (r = 0.41, p = 0.008) en symptoom-score (r = -0.59, p = 0.005). Er waren geen verschillen tussen de patiënten-groep met ED en deze met normale endotheliale funktie betreffende demografische, metabole en laboratorium-parameters. Verder was er geen verschil qua ‘soluble vascular cell adhesion molecule’ en ‘soluble intercellular adhesion molecule’ waarden. Er werd perifere ED gezien bij 6 patiënten die immuno-adsorptie ondergingen bij ‘baseline’. Na 12 maanden was de endotheliale funktie verbeterd bij 5 van deze 6 patiënten (reaktieve hyperemie index 1,58 p/m 0,15 vs. 2,02 p/m 0,46; p = 0.06).

Besluiten Perifere ED komt frequent voor bij M.E./CVS-patiënten, en is verbonden met ziekte-ernst en ernst van de immune symptomen. Als ED een risico-factor is voor cardiovasculaire ziekte, is het belangrijk om op te helderen of perifere ED geassocieerd is met verhoogde cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit bij M.E./CVS.

Inleiding

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) […] hoofdkenmerkend symptoom inspanning-intolerantie. […] Het pathofysiologisch mechanisme is nog niet opgelost maar er is voldoende bewijs voor een ontregeling van het immuunsysteem en het autonoom zenuwstelsel. […]

Endotheliale dysfunktie (ED) [vasculair endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten; het endothelium is van essentieel belang voor het behoud van de vasculaire tonus, het neemt deel aan de regulering van de bloeddoorstroming in respons op verandering qua perfusie-behoeften in weefsels en organen] is een gevestigde cardiovasculaire (CV) risico-factor die bijdraagt tot de ontwikkeling van atherosclerose [“aderverkalking”; afzetting van vet-achtige stoffen in de wand van slagaders] en CV voorvallen voorspelt. ED beschrijft de abnormale werking en wijziging van endotheliale cellen leidend tot een verminderde vasodilatatieve respons [vaatverwijding]. De verminderde beschikbaarheid van stikstof-oxide en andere endothelium-ontspannende en -contracterende factoren worden beschouwd als een pathofysiologisch mechanisme. ED wordt gezien bij verscheidene aandoeningen, inclusief diabetes mellitus, arteriële hypertensie, chronisch hart-falen en beroerte. Er werden CV symptomen zoals autonome ontregeling, posturale hypotensie, posturale tachycardie syndroom, en gedaald hart- en bloed-volume gezien bij M.E./CVS-patiënten. Er is steeds meer bewijsmateriaal voor het feit dat ED frequent voorkomt bij auto-immune ziekten en geassocieerd is met chronische inflammatie.

Er zijn consistente meldingen van vasculaire dysfunktie bij M.E./CVS. Er werd door bij verscheidene groepen een diagnose van cerebrale hypo-perfusie gesteld d.m.v. ‘single-photon emission computed tomography’ [SPECT] en andere technieken. [Boissoneault J, Staud R et al. Abnormal resting state functional connectivity in patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin-labeling fMRI study. Magn Reson Imaging (2016) 34: 603-608 (zie ook ‘Abnormale funktionele connectiviteit (brein in rust) bij CVS’ /// Staud R et al. Task related cerebral blood flow changes of patients with Chronic Fatigue Syndrome: an arterial spin labeling study. Fatigue (2018) 6: 63-79] Er werd getoond dat cerebrale hypo-perfusie correlereert met vermoeidheid en orthostatische intolerantie. [Boissoneault J, Staud R et al. Cerebral blood flow and heart rate variability predict fatigue severity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Imaging Behav (2018) 13: 789-797] Eerder vond men ED van grote en kleine arterieën als men gebruik maakte van flow-gemedieerde dilatatie [Als de bloeddoorstroming in een bloedvat verhoogt, zet het uit; dit fenomeen wordt ‘flow-mediated dilatation’ genoemd.]. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Er werd een verminderde post-occlusieve [na afknelling] hyperemie respons [toename van de bloeddoorstroming] van de brachiale [boven-arm] arterie en onder-arm huid-microcirculatie gezien. In tegenstelling daarmee rapporteerde een studie die cytokine-waarden met verscheidene CV parameters (inclusief endotheliale funktie bepaald via EndoPAT [niet invasieve techniek om de perifere arteriële tonus te meten]) vergeleek, geen verschil tussen M.E./CVS-patiënten en controles. Een andere studie meldde echter een versterkte acetylcholine-geïnduceerde vaatverwijdende respons van de perifere microvasculatuur bij M.E./CVS. [Khan F, Spence V, Kennedy G, Belch JJ. Prolonged acetylcholine-induced vasodilatation in the peripheral microcirculation of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Physiol Funct Imaging (2003) 23: 282-285; zie ‘Bloed-circulatie abnormaal bij mensen met CVS]

Het doel van de huidige studie was het onderzoeken van de perifere endotheliale funktie bij M.E./CVS-patiënten en het correleren daarvan met symptoom-ernst en biomerkers. Endotheliale funktie werd bepaald d.m.v. niet-invasieve vinger-plethysmografie [meting van perifere doorbloeding] (EndoPAT2000). Door gebruik te maken van deze methode worden veranderingen van de perifere arteriële tonus in de wijsvinger (als respons op hyperemie geïnduceerd door onder-arm ischemie [zuurstof-gebrek]) bepaald.

Materialen & methodes

Studie-deelnemers

35 patiënten met post-infektueuze […] M.E./CVS op basis van de Canadese Criteria en exclusie van andere medische of neurologische ziekten die vermoeidheid kunnen veroorzaken. De patiënten hadden de chronische ziekte variërend tussen < 1 en 40 jaar. 9 patiënten met verhoogde [auto-] antilichamen tegen β2-adrenerge receptor [bindt met de neurotransmitter epinefrine, die fysiologisch responsen zoals ontspanning van gladde spieren (bv. rond bloedvaten) en verwijding van de bronchiën (luchtwegen) medieert] namen deel aan een prospectieve klinische studie met immuno-adsorptie (om IgG uit het plasma te verwijderen) op 5 achteréénvolgende dagen. [Scheibenbogen C et al. Immunoadsorption to remove ß2 adrenergic receptor antibodies in Chronic Fatigue Syndrome CFS/ME. PLoS One (2018) 13: e0193672 (piloot-studie)] 20 gezonde individuen met gelijkaardige leeftijd (24-75 jaar) en ‘body-mass-index’ fungeerden als een controle-groep. […]

Beoordeling van de symptomen

De aanwezigheid en ernst van symptomen werd beoordeeld gebruikmakend van een vragenlijst op basis van de Canadese Criteria. De symptomen werden kwantitatief geklassificeerd volgens een schaal van ‘1’ tot ‘10’, waarbij ‘1’ wijst op geen symptomen en ‘10’ op zeer ernstige symptomen. De vermoeidheid-score werd berekend als het gemiddelde van vermoeidheid, malaise na inspanning, nood aan pauzes in het dagdagelijks leven en het dagelijks funktioneren; de cognitieve score als het gemiddelde van geheugen-stoornissen, concentratie-vermogen en mentale moeheid; en de immuun-score als het gemiddelde van pijnlijke lymfe-klieren, keelpijn en griep-achtige symptomen. Verder beoordeelde de vragenlijst the spierpijn en de cumulatieve ernst van de gerapporteerde symptomen (ziekte-ernst). De symptoom-klassificatie was gebaseerd op zelf-rapportering. De symptomen van autonome dysfunktie werden beoordeeld aan de hand van de ‘Composite Autonomic Symptom Score’ (COMPASS-31) vragenlijst die de autonome funkties onderzoekt op gebied van orthostatische, vasomotorische, secretomotorische, gastro-intestinale, blaas- en pupillomotor [beweging van de oogpupil] -regulering. Op basis daarvan werd een gewogen totale score berekend: ‘0’ voor geen en ‘100’ voor ernstige symptomen van autonome dysfunkte. Daarnaast werd ziekte-ernst onderzocht d.m.v. de Bell-score, die focust op de mate van beperkingen wat betreft het dagdagelijks funktioneren. Volledig bedlegerige patiënten krijgen de klassificatie ‘0’ en mensen met die niet beperkt zijn in hun funktioneren ‘100’.

Beoordeling van de endotheliale funktie

Perifere endotheliale funktie werd geëvalueerd via perifere arteriële tonometrie (PAT) (EndoPAT2000). De vaststellingen gebeurden bij ‘baseline’ onder gestandaardiseerde omstandigheden (na minstens 15 min liggen in een rustige kamer met air-conditioning). EndoPAT kwantificeert de endothelium-gemedieerde veranderingen qua vasculaire tonus, opgewekt door de brachiale arterie 5 min af te sluiten (occlusie met een standaard bloeddruk-manchet). Wanneer de manchet wordt ontspannen, veroorzaakt de golf van stromend bloed een dilatatie. De post-occlusie in relatie tot pre-occlusie dilatatie [vaatverwijding na t.o.v. vóór afknelling] wordt berekend als reaktieve hyperemie index (RHI). ED werd gedefinieerd als RHI ≤ 1,81 (op basis van eerdere studies). Bij de patiënten die werden behandeld d.m.v. immuno-adsorptie werd de perifere endotheliale funktie bijkomend bepaald na 12 maanden.

Bloedafname

Veneus bloed […] ‘s morgens. Standaard biochemische parameters […]. ‘Soluble vascular cell adhesion molecule’ (sVCAM) & ‘soluble intercellular adhesion molecule’ (sICAM) werden bepaald via ELISA. [‘soluble cell adhesion molecules’ (oplosbare cel-adhesie molekulen) zijn cel-oppervlakte bindende proteïnen die biomerkers kunnen zijn voor inflammatoire processen waarbij aktivatie of beschadiging van cellen – zoals bloedplaatjes of het endothelium – betrokken is]

Statistische analyse

[…] Een p-waarde van < 0.05 werd als statistisch significant beschouwd […].

Resultaten

Er was geen verschil tussen de M.E./CVS-patiënten en controle-individuen wat betreft demografische en klinische karakteristieken uitgezonderd hartslag, albumine en creatinine. De RHI was echter significant gedaald bij de patiënten t.o.v. de gezonde controles (1,95 ± 0,47 vs. 2,21 ± 0,37; p < 0.05).

Wat betreft de ziekte-specifieke kenmerken van de patiënten-groep: de mediane ziekte-duur was 5 jaar (< 1 tot 40) en de mediane ziekte-ernst (Bell-score) was 35 (10 – 70). Een perifere ED (gedefinieerd als RHI ≤ 1,81) werd gezien bij 18 patiënten en 4 gezonde individuen (51% vs. 20%; p < 0.05). Vervolgens werden de patiënten opgedeeld in 2 subgroepen. Patiënten met ED vertoonden ernstiger ziekte: mediane Bell-score 30 vs. 40 en gemiddelde symptoom-score 8,6 vs. 7,0; vergeleken met patiënten met normale endotheliale funktie (p < 0.05). Daarnaast rapporteerden patiënten met ED ernstiger vermoeidheid-gerelateerde symptomen (gemiddeld 8,62 vs. 7,75; p < 0.05) t.o.v. patiënten met normale endotheliale funktie. Van de biochemische parameters en immunologische merkers waren geen (uitgezonderd basaal thyrotropine [TSH (‘thyroid stimulating hormone’) hormoon dat de schildklier stimuleert]) significant verschillend bij patiënten met normale perifere endotheliale funktie en patiënten mét ED.

Correlatie-analyses

In de totale patiënten-groep werd een correlatie gevonden tussen lagere RHI en ernstiger ziekte volgens de symptoom-score (p = 0.005) en Bell-score (p = 0.008), ernstiger immune symptomen (p = 0.026), keelpijn (p = 0.038), pijnlijke lymfeklieren (p = 0.042) en griep-achtige symptomen (p = 0.073). Er werd geen significante correlatie gevonden voor cognitieve scores, spierpijn, noch COMPASS-31 score voor autonome dysfunktie (niet getoond). Verder was er geen correlatie tussen leeftijd, geslacht, infektueuze ziekte aanvang & ziekte-duur, en RHI.

Oplosbare intercellulaire adhesie en vasculaire cel adhesie molekule

Er werden geen significante verschillen geobserveerd voor de waarden van sVCAM en sICAM tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles (niet getoond). Verder waren de waarden voor beide adhesie-molekulen niet verschillend tussen patiënten met normale en gedaalde RHI ( ≤ 1,81).

Perifere endotheliale funktie na immuno-adsorptie

9 patiënten met gestegen waarden qua auto-antilichamen tegen β2-adrenerge receptor kregen immuno-adsorptie. Bij 5 op de 6 patiënten met perifere ED bij ‘baseline’, bleek de endotheliale funktie genormaliseerd na 12 maand (RHI 1,58 ± 0,15 vs. 2,02 ± 0,46; p = 0.06), terwijl er bij 3 patiënten met normale endotheliale funktie vóór behandeling, geen significante verandering werd gezien op 12 maanden.

Bespreking

Onze studie toonde dat de helft van de of M.E./CVS-patiënten een gedaalde RHI hadden, duidend op de aanwezigheid van perifere ED. We vonden een correlatie tussen de perifere ED en ziekte-ernst alsook immune symptomen. Verder vonden we het eerste bewijsmateriaal voor het feit dat perifere ED bij patiënten met verhoogde waarden qua auto-antilichamen tegen β2-adrenerge receptor, kunnen verbeteren na immuno-adsorptie.

Onze resultaten betreffende ED bij M.E./CVS aangetoond d.m.v. vinger-plethysmografie komen overéén met een eerdere studie door Newton J et al. [zie hierboven] Zij toonden een significant verminderde post-occlusieve hyperemische respons van de brachiale arterie en van de huid-microcirculatie van de voorarm, vergeleken met gezonde controles. In een studie door Moneghetti KJ et al. [Value of circulating cytokine profiling during submaximal exercise testing in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Sci Rep (2018) 8: 2779] die cytokine-waarden vergeleek met verscheidene parameters van CV, werd een trend naar verminderde endotheliale funktie (beoordeeld via EndoPAT) bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles geobserveerd.

Het is geweten dat endotheliale dysfunktie een belangrijke risico-factor is voor CV voorvallen. Meerdere studies hebben perifere ED getoond bij patiënten met verscheidene ziekten (inclusief chronisch hartfalen, beroerte en pulmonaire arteriële hypertensie) op basis on EndoPAT-metingen van de RHI.

ED wordt gekenmerkt door het onvermogen van endotheliale cellen om de vasculaire tonus te reguleren. Naast traditionele CV risico-factoren kunnen inflammatoire cytokinen, reaktieve zuurstof soorten en anti-endotheliale auto-antilichamen de endotheliale cellen aktiveren, leidend tot ED. Er werd in de huidige studie geen bewijs gevonden voor een verband tussen ED met een pro-inflammatoire of metabole biomerker. Verder werd geen associatie geobserveerd tussen de oplosbare endotheliale adhesie molekulen sVCAM & sICAM en ED. sICAM bleek te correleren met atherosclerose en sVCAM met endotheliale ontregeling bij oudere personen. Eerder toonden we dat waarden voor het ‘lang niet-coderend RNA myocardiaal infarct geassocieerd transcript’ [MIAT lnc] significant waren verhoogd bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [lees: Yang CA, Scheibenbogen C et al. The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2018) 16: 231] Dit ‘myocardiaal infarct geassocieerd transcript’ reguleert ED en kan ge-upreguleerd worden door inflammatoire stimuli.

We observeerden in onze studie echter een verband tussen immuun-symptomen en endotheliale funktie. Inderdaad: M.E./CVS-patiënten met lagere RHI rapporteerden ernstiger immuun-geassocieerde symptomen en ernstiger ziekte. Hoewel het pathofysiologisch mechanisme van de immuun-symptomen bij M.E./CVS niet goed begrepen wordt, is er bewijs dat het een hoofdkenmerkend symptoom van de ziekte is. Een studie door Ohanian D et al. [Identifying key symptoms differentiating Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome from Multiple Sclerosis. Neurology (2016)4: 41-45] toonde dat immuun-symptomen de best onderscheidende symptomen tussen M.E./CVS- en MS-vermoeidheid waren. Bij veel patiënten komen immuun-symptomen voor of nemen ze toe na inspanning. Onze bevindingen suggereren dat het pathomechanisme van immuun-symptomen gerelateerd is met ED. Dit komt overéén met studies die verhoogde oxidatieve stress, stikstof-oxide en een pro-inflammatoir fenotype bij ED vertonen. Er werd getoond dat inspanning vooraf-bestaande immune abnormaliteiten bij M.E./CVS kan versterken. Studies rapporteerden dat inspanning door M.E./CVS-patiënten resulteert in versterkte produktie van cytokinen, C4-complement aktivatie en verhoogde oxidatieve stress. [Light AR et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and Fibromyalgia Syndrome. J Intern Med (2012) 271: 64-81 /// Nijs J et al. Altered immune response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exerc Immunol Rev (2014) 20: 94-116] Bovendien kan er een directe link zijn tussen vermoeidheid en ED. In een studie met klaarblijkelijk gezonde individuen zonder risico-factoren voor CV, werd getoond dat ED geassocieerd is met het niveau van subjectieve vermoeidheid.

Ten slotte zagen we een normalisering van de endotheliale funktie bij patiënten met verhoogde waarden aan β2-adrenerge antilichamen die immuno-adsorptie ondergingen. Er is bewijsmateriaal van experimentele studies duidend op een rol van β-adrenerge auto-antilichamen bij de ontwikkeling van ED.

Tot besluit: de aanwezigheid van ED bij M.E./CVS als een belangrijke risico-factor voor CV is in overéénstemming met rapporten van een vroegere CV mortaliteit gemeld bij deze patiënten. Daarom kan ED een prognostische merker zijn om het risico op CV morbiditeit en mortaliteit bij M.E./CVS te bepalen; dit dient verder te worden geanalyseerd d.m.v. klinische proeven. Verder is het belangrijk om de mechanismen die leiden tot ED op te helderen ten einde z’n rol in het pathomechanisme van M.E./CVS te begrijpen.

Beperkingen

De huidige studie is beperkt omwille van de relatief kleine groep: er werden 35 patiënten en 20 controles van gelijkaardige leeftijd en ‘body-mass-index’ opgenomen. Deze observationele klinische proef omvat echter een groep met een grootte die gelijkaardig is met andere vergelijkbare studies beschreven in de literatuur. In onze studie bleek de helft van de patiënten ED te vertonen. Onze resultaten tonen duidelijk een significant hogere RHI in de controle-groep t.o.v. de patiënten. Daarnaast werd de aanwezigheid van ED frequenter gezien bij patiënten met M.E./CVS dan bij controles (51% vs. 20%; p < 0.05). De resultaten van onze klinische proef vergen bevestiging in toekomstige studies met grotere groepen.

maart 14, 2020

Uitgebreide metabolomica-studie bij M.E.(cvs): ontregeld metabolisme van acyl-lipiden & steroïden

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:35 am
Tags: , , , , ,

Onderstaande studie is een vervolg op ‘Metabolomica-biomerkers voor M.E.(cvs) impliceren een redox-onevenwicht’.

De researchers bekeken de waarden van verschillende metabolieten (molekulen aangemaakt tijdens verscheidene metabole reakties) in het bloed van 26 vrouwen met M.E.(cvs) en vergeleken ze met die van 26 gezonde vrouwen. Ze onderzochten deze die significant verschilden (hogere of lagere waarden) ook verder. Metabolieten die bleken te verschillen waren: acyl-cholinen, dipeptiden en and steroïden (androgene, progestine & corticosteroïden); de waarden of sfingolipiden en ceramiden waren verhoogd. Ze onderzochten dan de mechanismen (metabole paden) at waarbij deze metabolieten betrokken zijn om een idee te hebben omtrent hoe deze verschillende waarden een invloed op het lichaam kunnen hebben en hoe ze verband kunnen houden met de symptomen van M.E.(cvs). Verstoringen in het metabolisme van deze molekulen kan gelinkt worden aan veel van de M.E.(cvs)-symptomen. Er zijn wel nog grotere studies nodig om dit alles te bevestigen.

De auteurs stellen: “We hebben nog geen plasma-biomerker of set biomerkers ondubbelzinnig geïndenticifeerd met hoeveelheden die drastisch verschillen tussen controls en M.E.(cvs)-patiënten. Niettemin dienen de metabolieten die door onze analyse naar voorkomen (specifiek acyl-cholinen en steroïden) in acht worden genomen.

Enige verder informatie over specifieke molekulen:

Acyl-cholinen maken deel uit van het verzuren-metabolisme. Meerdere bleken meer dan dubbel zo laag bij de patiënten. Verlaagde waarden kunnen een verklaring zijn voor verstoorde bloeddruk-regulering (o.a. orthostatische intolerantie). Ze zijn ook gelinkt aan darm-problemen en betrokken bij de regulering van het zenuwstelsel en de cognitieve funktie.

Dipeptiden zijn kleine proteïnen. Eén dat verlaagd bleek, is betrokken bij het hersen-metabolisme en een ander bij het vitamine-B6 metabolisme. De kennis omtrent variaties in het plasma is echter nog beperkt.

Steroïden zijn betrokken bij veel lichamelijke funkties (stress-respons, regulering van zout en water, immuun-response, regulering van inflammatie, proteïnen-metabolisme en hormoon-regulering). Ze zijn ook betrokken bij de hypothalamus-hyposyse-bijnieren as (reguleert o.a. energie-verbruik, temperatuur, immuun-systeem, vertering en stemming).

Sfingolipiden worden aangetroffen in hersen-weefsel en hebben een grote impact op neuraal weefsel wanneer ze uit evenwicht zijn.

————————-

Metabolites Vol 10, #1, p 34 (January 2020)

Comprehensive circulatory metabolomics in ME/CFS reveals disrupted metabolism of acyl lipids and steroids

Arnaud Germain (1), Dinesh K. Barupal (2), Susan M. Levine (1), Maureen R. Hanson (1)

1 Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

2 UC Davis Genome Centre – Metabolomics, University of California, Davis, CA, USA

 

Samenvatting

De laatste prevalentie-meting wereldwijd stelt dat meer dan 65 miljoen patiënten lijden aan Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS), een ziekte met gekende effekten op de funktie van het immuunsysteem en het centraal zenuwstelsel. We voerden een uitgebreide metabolomica-analyse uit op het plasma van 52 vrouwelijke individuen, evenredig verdeeld over controles en M.E./CVS-patiënten, wat gegevens verschafte voor ca. 1.750 molekulen in het bloed van 20 super-mechanismen, onderverdeeld in 113 sub-mechanismen. Statistische analyse gecombineerd met ‘pathway enrichment analysis’ duidt op enkele ontregelde metabole mechanismen met veel ononderzochte molekulen. De meest intrigerende bevinding betreft acyl-cholinen, die behoren tot het vetzuren-metabolisme sub-mechanisme van lipiden, waarvan alle molekulen consistent verminderd bleken in twee afzonderlijke groepen M.E./CVS-patiënten. We verzamelden de erg beperkte kennis omtrent deze molekulen en beschouwen ze al veelbelovend bij de zoektocht om veel van de M.E./CVS-symptomen te verklaren. Een andere klasse van lipiden met ver-reikende aktiviteit aangaande bijna alle orgaan-systemen zijn steroïden; androgene, progestine en corticosteroïden zijn in brede lijnen verminderd in onze patiënten-groep. We rapporteren ook over gedaalde dipeptiden en gestegen sfingolipiden hoeveelheden bij patiënten vergeleken met controles. Verstoringen van het metabolisme van veel van deze molekulen kunnen worden gelinkt aan de diepgaande symptomen die M.E./CVS-patiënten ondervinden.

1. Inleiding

[…]

De circulatie is fundamenteel voor alle andere systemen aangezien het hen voorziet van de noodzakelijke molekulen terwijl metabool afval wordt verwijderd. De inspanning om het bloed-metaboloom van M.E./CVS-patiënten te karakteriseren, met het dubbel doel van het vastleggen van een routinematige diagnostische strategie en het inwinnen van verder inzicht omtrent de onderliggende oorzaak van de ziekte, werd door meerdere groepen bij afzonderlijke populaties van beperkte grootte uitgevoerd […]. De belangrijkste besluiten van deze rapporten, inclusief de onze, draaien over het algemeen om verschillen qua aminozuren, lipiden, en een onevenwicht qua energy- en redox-metabolismen. Hoewel deze studies informatief zijn, bleek tot op heden niet één enkel metaboliet consistent significant gewijzigd bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles – een verbijsterend resultaat gezien de ernst van de ziekte-symptomen.

Deze studie omvatte plasma-stalen van 52 vrouwelijke individuen, gelijk verdeeld over controles en patiënten, die werden geanalyseerd d.m.v. Metabolon®’s massa-spectrometrie. De metabole panels leverden gegevens op voor ca. 1.750 bloed-molekulen met een sterke nadruk op lipiden (meer dan 70%). Onze analyse biedt nieuwe inzichten aangaande plasma-metabolomica bij M.E./CVS op meerdere beloftevolle gebieden. Allereerst tonen we een reproduceerbare ontregeling van het acyl-choline metabolisme, een klasse lipiden dat grotendeels onbestudeerd is gebleven maar waarvan theoretisch wordt gedacht dat het een fundamentele werking heeft. Een andere belangrijke observatie, mogelijks relevant voor het ontwricht centraal zenuwstelsel bij M.E./CVS, heeft betrekking met sfingolipiden, die ook breed getroffen bleken in onze patiënten-groep. We vonden ook, voor de tweede keer, dat dipeptiden gewijzigd zijn. Ten slotte bleken drie klassen steroïden (androgene, progestine en corticoïde) consistent gedaald in onze groep M.E./CVS-patiënten, een stoornis die belangrijke repercussies kan hebben voor het welzijn van patiënten.

2. Resultaten

2.1. Populatie-statistieken en behandeling van de gegevens

2.1.1. Groep-statistieken

De groep vrouwen opgenomen in deze studie bestaat uit 26 gezonde controles en 26 M.E./CVS-patiënten (leeftijd 22-72 jaar) met een vergelijkbare ‘body-mass-index’ (BMI). […] 58% met plotse ziekte onmiddellijk voorafgaand aan de start van de ziekte, 42% graduele aanvang.

De helft van de patiënten maakte ook melding van darm-inflammatie symptomen en 69% rapporteerde een diagnose van orthostatische intolerantie. De Bell-scores geven de ernst van de symptomen van de patiënten aan (bijna allemaal onder 50, ver onder de score van 100 die wordt verwacht bij gezonde individuen). Bovendien toonden de SF‐36 gegroepeerde samenvattingen (fysieke & mentale componenten) voor beide groepen dat de stoornissen van de patiënten (SF‐36 PCS score van 26), ver beneden de norm van de algemene bevolking in de V.S. (50) ligt.

2.1.2. Globaal metabolomica-panel

Het globaal metabolomica-panel onderzocht in het plasma levered metingen op voor 768 geïdentificeerde molekulen, onderverdeel in 9 metabole super‐mechanismen, volgens de standaarden van Metabolon®. De opdeling is als volgt: aminozuren (196), koolhydraten (25), co-factoren & vitaminen (29), energie (10), lipiden (259), nucleotiden (33), gedeeltelijk gekarakteriseerde molekulen (2), peptiden (33) en xenobiotica [lichaamsvreemde stoffen] (181). Voor de 52 individuen zijn er 39.936 gegevens-elementen, die verder onderverdeel kunnen worden in 94 sub‐mechanismen. Bv.: als we focussen op de 7 sub‐mechanismen in het xenobiotica super‐mechanisme, vinden we bakterieel/schimmel-metabolisme (3), benzoaat-metabolisme (21), chemicaliën (23), medicijnen (64), voedsel-componenten/planten (49), tabak-metabolieten (6) en xanthine-metabolisme (15).

Een dergelijke detaillering is cruciaal bij het omgaan met ontbrekende gegevens (afwezigheid van een molekule of aanwezigheid in hoeveelheden onder de detektie-drempel). Voor deze gegevens-set ontbraken 15,5% van de waarden (6.170), gelijkaardig met de 14% bij onze eerdere studie [Germain A, Hanson MR et al. Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology. Metabolites (2018) 8: 90]. Het omgaan met ontbrekende gegevens zal afhangen van het feit of een metaboliet vereist is voor het menselijk metabolisme of een substantie ingenomen door enkele individuen in onze studie. Zodoende veronderstellen we dat ontbrekende waarden voor tabak-metabolieten en medicijnen (3.138 of 50,9% ontbrekende waarden) te wijten zijn aan de echt ontbrekende molekulen in het bloed van die individuen en kunnen worden gezien als nul-waarden. In tegenstelling daarmee omvatten andere sub‐mechanismen metabolieten die biologisch vereist zijn ook al worden ze niet gedetekteerd. Onze strategie was daarom verschillend en volgde de aanbevelingen van Metabolon® om de minimum waarde van elke biochemische molekule in het project aan te geven. Van de 698 overblijvende metabolieten, werden er 418 gemeten bij alle individuen, hadden 163 ontbrekende waarden bij minder dan 20% van de individuen en werden 657 toeschrijven uitgevoerd (10,5% van de ontbrekende waarden), terwijl 117 metabolieten ontbrekende waarden hadden bij meer dan 20% van de individuen, voor een totaal van 2.375 toeschrijvingen (38,4%). De mate van toeschrijving is gelijkaardig voor elke groep.

2.1.3. Panel complexe lipiden

In tegenstelling met de relatieve hoeveelheden die werden gerapporteerd in het globaal metabolomica-panel, genereerde het complex lipiden panel gegevens voor 1.007 complexe lipiden in 11 super‐mechanismen en 19 sub-mechanismen, volgens de nomenclatuur van Metabolon®. Dit omvatte de volgende super‐mechanismen: cholesterol-esters (26), diacyl-glycerolen (58), vrije vetzuren (25), lysofosfatidyl-cholinen (18), lysofosfatidyl-ethanolaminen (17), monacyl-glycerolen (26), fosfatidyl-cholinen (103), fosfatidyl-ethanolaminen (127), fosfatidyl-inositolen (28), sfingolipiden (61) en (de grootste) triacyl-glycerolen (518). Deze gegevens-set had 3.472 ontbrekende gegevens-elementen (50,7% bij de controles en 49,3% bij de patiënten), voornamelijk bij de volgende super‐mechanismen: lysofosfatidyl-ethanolaminen, fosfatidyl-cholinen, fosfatidyl-ethanolaminen en fosfatidyl-inositolen (respectievelijk 23, 20, 37 & 14% ontbrekende gegevens). De strategie beschreven voor het globaal metabolomica-panel was identiek voor deze set gegevens.

2.2. Statistische analyse van de globale metabolomica gegevens

2.2.1. Analyse van de totale gegevens

* Niet‐parametrische testen: We vonden 41 metabolieten op 768 (5,3%) die significant verschilden tussen controles en patiënten (p < 0.05). Slechts 8 daarvan (20%) komen in hogere hoeveelheden voor bij de patiënten t.o.v. de controles. Meer dan 60% behoort tot het lipiden super‐mechanisme, 20% zijn aminozuren, en de overblijvende 20% zijn evenredig verdeeld over peptiden en xenobiotica. […].

* Analyse van ‘fold-change’ [“mate van verandering”; maatstaf voor het beschrijven hoeveel een hoeveelheid/grootheid verandert (oorspronkelijke vs. volgende meting), gedefinieerd als verhouding tussen de twee; dikwijls gebruikt bij het analyseren van meerdere metingen in een biologisch systeem]: Deze analyse vond dat 25 metabolieten veranderingen qua absolute waarden tussen de twee groepen hebben met een drempel van 2. Slechts 5 daarvan (20%) vertonen hogere metingen in de patiënten-groep vergeleken met de controles. De helft van de 25 metabolieten behoort bij de xenobiotica, waarbij de verschillen kunnen worden teruggebracht tot enkele uitschieters, soms bij controles en soms bij patiënten.

Het meest opmerkenswaardig is de aanwezigheid van meerdere lipiden die behoren tot het sub‐mechanisme van het vetzuren-metabolisme (acyl-cholinen). Inderdaad: de gemiddelden van oleoyl-choline, dihomo‐linoleoyl‐choline, linoleoyl-choline, stearoyl-choline & palmitoyl-choline lagen meer dan tweemaal lager bij patiënten. Daarnaast tonen we dat de gegevens-distributie van alle 7 metabolieten behorend tot dit sub‐mechanisme lager liggen in de patiënten-groep t.o.v. de controles. […]

Het ander lipide dat meer dan 3-maal gereduceerd is in de patiënten-groep, is cholaat, een belangrijk galzuur dat geproduceerd wordt in de lever en gekend is om het feit dat het de vet-absorptie faciliteert […]. Alle andere metabolieten die in dat sub‐mechanisme worden geklassificeerd lagen ook lager in de patiënten-groep (1,3 tot 1,6 maal).

Ook pyridoxaat [verbinding van de vitamine-B6 groep] is meer dan 3-maal verminderd in de patiënten-groep. Het enig ander gemeten metaboliet behoort tot het vitamine-B6 sub‐mechanisme is pyridoxal (2,3 maal gedaald bij patiënten).

* ‘Volcano-plot’ analyse [statistische methode; grafiek die wordt gebruikt om snel veranderingen in grote gegevens-sets te identificeren]: […] Dit levert weerom geen significant verschillende metabolieten op. Wanneer echter ‘fold-change’ wordt gecombineerd met een p < 0.1, blijkt dat 5 op de 10 metabolieten die significant worden geacht, behoren tot het acyl-choline mechanisme: dihomo‐linoleoyl‐choline, oleoyl-choline, stearoyl-choline, linoleoyl-choline & palmitoyl-choline.

4 van de andere metabolieten zijn xenobiotica verbonden met het dieet. Bv.: erythritol is een zoetstof [suiker-vervanger], die over het algemeen meer overvloedig is bij patiënten […]; piperine en z’n gesulfateerde vorm zijn verbonden met peper-consumptie en minder overvloedig bij patiënten (die waarschijnlijk gekruid voedsel vermijden omwille van spijsvertering-problemen); dimethyl-sulfon is gekend als een organische zwavel-verbinding in het plasma die gedeeltelijk voortkomt van het intestinaal bakterieel metabolisme, (wat verstoord is bij M.E./CVS-patiënten) [Hanson MR; Giloteaux L. The gut microbiome in Myalgic Encephalomyelitis. Biochemist (2017) 39: 10-1; zie ook ‘Verminderde diversiteit & gewijzigde samenstelling van het darm-microbioom bij M.E.(cvs)]. Ten slotte bleek 4‐hydroxy-glutamaat dubbel zo hoog bij patiënten. Dit metaboliet maakt deel uit van het glutamaat-metabolisme (dat substantiële implicaties heeft voor de hersen-funktie.

2.2.2. Super‐mechanisme analyse

Zoals bij onze eerdere studie, splitsten we onze gegevens-set op (gebaseerd op de super‐mechanisme nomenclatuur van Metabolon®) met de bedoeling meer statistische ‘power’ te verkrijgen. Het super‐mechanisme der peptiden omvat 3 dipeptiden die significant lager liggen bij patiënten. Dipeptiden zijn produkten van de onvolledige afbraak van proteïnen en van enkele is geweten dat ze een effekt hebben op lichaam-funkties. […]

2.3. Statistische analyse van de lipidomica-gegevens

Een niet‐parametrische statische test vond 3 metabolieten (van 1.007) die significant (p < 0.05) verschillend zijn tussen controles en patiënten. Alle 3 behoren tot het sfingolipiden super‐mechanisme, namelijk de ceramiden CER (18:0), CER (18:1) & CER (20:0), die hogere waarden vertoonden in de patiënten-groep. Ceramiden zijn gemaakt van een sfingosine (d18:1) […] en hoewel ze een meerderheid van de dubbel-laag van het het cel-membraan opmaken, komen ze vooral overvloedig voor in de myeline-schede. Ze dragen ook bij tot signalisering bij cel-differentiatie, proliferatie en cel-dood.

Een analyse van de ‘fold-change’ leverde 5 molekulen op die allen deel uitmaken van het triacyl-glycerol mechanisme maar zorgvuldig kritisch onderzoek toont dat dit te wijten is aan extreme uitschieter bij de controles en enkele minder extreme bij de patiënten. Deze individuen zijn specifiek uitschieters voor een aantal triacyl-glycerolen (TAG) maar niet allemaal, en kunnen niet als uitschieters worden beschouwd voor onze gegevens-sets.

Een ‘volcano-plot’ analyse onthulde geen verschil tussen controles en patiënten.

2.4. Inzichten wat betreft metabolomica-gegevens

Als we proberen om de biologische relevantie na te gaan, is het cruciaal om onze gegevens-sets vanuit een ander en uitgebreider perspectief te interpreteren. Daartoe gebruikten we ‘MetaboAnalyst Pathway Enrichment’ alsook ‘ChemRICH’ (een ‘Chemical Similarity Enrichment’ Analyse voor metabolomica) om onze gegevens verder te exploreren.

2.4.1. Mechanisme-aanrijking

* Globaal metabolomica-panel: voor deze module worden molekulen in kaart gebracht om mechanismen te definiëren op basis van hun HMDB identificatie (ID) (‘Human Metabolome Database’). Van de 768 geanalyseerde metabolieten hadden er 527 een dergelijke ID en 477 waren geschikt na ID-standardisatie. Ten gevolge daarvan maakten 38% van de metabolieten geen deel uit van deze analyse, inclusief alle molekulen van het acyl-choline mechanisme bv. Sommige super‐mechanismen waren meer aangetast dan andere: ca. 50% van de peptiden- en xenobiotica-metabolieten afwezig, ca. 40% van de energie- en lipiden-metabolieten afwezig, en ca. 20% van de metabolieten in de overblijvende super‐mechanismen.

Filter- en normalisatie-stappen […] op deze gereduceerde HMDB gegevens-set gaf 61 mechanismen maar slechts 3 hebben significante aanrijking (p < 0.05): het glutathion-metabolisme, de steroïd-hormonen biosynthese en het propanoaat-metabolisme [metabolisme van propionzuur; dit komt voort uit de produktie van microben in de darm of op de huid]. Geen enkel daarvan zijn echter significant aangerijkt na correctie voor ‘multiple testing’ [in de statistiek: simultaan testen van meer dan één hypothese] en hun impact-score is zeer laag (onder 0,08). 4 mechanismen hadden een relatief hoge impact-score (boven 0,4) […]: het alanine-, aspartaat- & glutamaat-metabolisme, taurine- & hypotaurine-metabolisme, cafeïne-metabolisme en linol-metabolisme. Hoewel weinig van deze mechanismen werd besproken in gepubliceerd werk, en gelinkt kunnen worden aan redox-onevenwicht en aminozuur-metabolisme bv., voldeed geen enkele daarvan aan de drievoudige criteria […].

* Complexe lipiden panel: Van de 1.007 geanalyseerde lipiden, hebben er 392 een HMDB ID en 380 werden opgenomen in de mechanisme-aanrijking analyse (38% van de gegevens-set. De output omvat 8 mechanismen en het sfingolipiden-metabolisme had een impact-score van 0,34 […]. […].

In deze module komen alle molekulen van belang meer overvloedig voor bij patiënten, zo ook de besproken ceramiden. Deze met het grootste belang zijn sfingomyelinen (KEGG = C00550), gevolgd door ceramiden (KEGG = C00195) en ten slotte glucosyl-ceramiden (KEGG = C01190) alsook lactosyl-ceramiden (KEGG = C01290). Het is belangrijk om op te merken dat elk KEGG-nummer [‘Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes’; verzameling databases die betrekking hebben op genomen, systeembiologie, ziekten, geneesmiddelen en biochemische stoffen] hierboven 8 tot 9 molekulen elk (struktuur van een sfingosine (d18:1) en vetzuur-ketens inclusief verzadigd of onverzadigd C16, C18, C20, C22, C24 & C26) omvat. Ceramiden, ook bekend als N‐acyl-sfingosine, zijn één van de hydrolyse-nevenprodukten van sfingomyelinen. Glucosyl-ceramiden en lactosyl-ceramiden zijn betrokken bij talrijke mechanismen en dysfunkties die voorkomen bij meerdere ziekten.

2.4.2. Statistische Aanrijking

* Globaal metabolomica panel: Anders dan bij mechanisme-‘mapping’, is de ‘ChemRICH’ benadering gebaseerd op strukturele overéénkomsten en chemische ontologieën om studie‐specifieke metabolieten in kaart te brengen. Om die te bereiken, is ‘Pubchem ID’ één van de gebruikte identificatoren om chemische molekulen en hun aktiviteiten in biologische testen te labelen. De informatie vereist voor dit online-instrument omvatte de naam van de molekule, de ‘InChiKeys’ (internationaal Chemisch identificatie-systeem), de ‘Pubchem ID’, de SMILES (vereenvoudigd molekulair input-systeem) identiteit (een nummering-systeem voor het in- en weergeven van molekulen) en ten slotte p‐waarden […]. Van de 768 metabolieten met gegevens van Metabolon® waren er 623 geschikt voor analyse. Dit betekent dat 19% van de metabolieten geen deel uitmaakten van deze analyse en, hier, 3 van de molekulen geklassificeerd als deel van het acyl-choline mechanisme werden opgenomen (oleoyl-choline, palmitoyl-choline & stearoyl-choline).

Slechts één van de 86 cluster-namen die via deze analyse werd gegeneerd wordt als significant beschouwd (p = 0.025) […]. De cluster-naam kreeg het label ‘dipeptiden’ en omvat 52 molekulen, waarvan er 9 gewijzigd zijn. De sleutel-molekule van deze cluster is 4‐hydroxy-glutamaat (eerder vernoemd), dat toegenomen is bij patiënten, net zoals 2 andere metabolieten in dezelfde cluster (hydroxy-asparagine & gamma-glutamyl-tyrosine). Anderzijds zijn 6 molekulen met klassificatie als dipeptiden (via ‘ChemRICH’) afgenomen bij patiënten (fenyl-alanyl-alanine & fenyl-alanyl-glycine, cysteinyl-glycine, valyl-leucine, 3‐hydroxy-lauraat & etiocholanolon-glucuronide.[…]

Geen enkele van de andere 85 cluster-namen verschillen significant. De cluster genaamd ‘New Cluster 16’ (p = 0.057) bevat echter 2 acyl-carnitinen (arachidoyl-carnitine (C20) & adipoyl-carnitine (C6‐DC)) die overvloediger voorkomen bij patiënten.

* Complexe lipiden panel: Zoals eerder gesteld hebben 392 van de lipiden een HMDB ID, wat werd gebruikt om de ‘ChemRICH’ analyse uit te voeren. Uiteindelijk werden er 347 opgenomen in de mechanisme-aanrijking analyse (slechts 34% van de gegevens-set). Geen enkel van de 26 monoacyl-glycerolen en geen enkel van de 518 triacyl-glycerolen had een HMDB ID en werden daarom niet opgenomen in deze analyse.

2 clusters (van 20 cluster-namen) zijn significant verschillend . De eerste ‘Onverzadigde Ceramiden’ genoemd (p = 0.0004) omvat 3 op 9 molekulen die verhoogd zijn bij M.E./CVS-patiënten (CER (18:0), CER (18:1) & CER (24:1)). De eerste 2 werden reeds vermeld, terwijl CER (20:0) niet in deze analyse werd opgenomen omdat het niet voldoet aan de veresiten voor ‘ChemRICH’. De tweede cluster-naam is ‘Sfingomyelinen’ (p = 0.035), waar 2 op 9 molekulen verhoogd zijn bij M.E./CVS (SM (18:0) & SM (18:1)). Sfingomyelinen werd reeds vernoemd als deel van de ‘MetaboAnalyst’ mechanisme analyse-resultaten. Volgens de Metabolon® nomenclatuur zijn alle 5 de metabolieten die hier werden besproken als onderdeel van het super‐mechanisme sfingolipiden, voor het eerst ontdekt in hersen-extracten in de jaren 1870 en hebben een ernstige impact op neuraal weefsel wanneer zich een onevenwicht voordoet.

* Sub‐mechanisme aanrijking-analyse: Om de hierboven beschreven beperkingen te omzeilen, werd een op sub‐mechanisme gebaseerde analyse uitgevoerd (gebruikmakend van het ‘ChemRICH’ concept). Deze analyse combineerde beide volledige gegevens-sets om te zoeken naar verschillen in patronen tussen onze controle- en patiënten-groepen […]. 6 van de 7 hadden een significante (p < 0.05) impact op metabolieten-clusters (niet geklassificeerd als medicijnen). Deze 6 zijn androgene steroïden, acyl-cholinen, ceramiden, dipeptiden, acyl-carnitinen & sfingomyelinen. […] Al deze clusters kwamen naar voor in onze analyse als we enkel naar de p‐waarden keken maar, voor het eerst, bleven er 3 significant na correctie […]. De trend binnen elke cluster is uniek: alle gewijzigde androgene steroïden en acyl-cholinen daalden bij patiënten, alle gewijzigde ceramiden stegen, terwijl van de 8 veranderde acyl-carnitinen afgenomen waren. Corticosteroïden zijn een andere klasse steroïden en die waren de volgende significante cluster […]. Net zoals androgene steroïden zijn beide veranderde corticosteroïden gedaald bij patiënten.

2.4.3. Inclusieve observatie van de metabolomica-gegevens

Een opvallende observatie is dat er geen groot verschil wordt gezien bij het vergelijken van de controle-groep met de patiënten. Dit is, op zich, een opmerkelijk resultaat dat we later zullen bespreken. Niettemin is het ook essentieel om na te denken over de gebruikte methodes en hun beperkingen, in het bijzonder in het licht van de talrijke genegeerde (19 tot 66%) bij ‘MetaboAnalyst’ én ‘ChemRICH’. Hoewel de ‘ChemRICH’ sub‐mechanisme analyse waardevolle en statistisch sterke inzichten in onze gegevens-set biedt, opteerden we voor een eenvoudig ontwerp dat evenzeer uitgebreide berekeningen toelaat om onze gegevens-sets te analyseren met minder strikte statistische nauwkeurigheid om ons toe te laten de metabolomica-toestand van M.E./CVS-patiënten volledige te begrijpen. Daarom besloten we de verhouding (controles/patiënten) van de mediaan voor elk metaboliet (geanalyseerd met Metabolon®) te becijferen. De mediaan werd gekozen boven het gemiddelde omdat sommige metabolieten een groot bereik overspannen en sommige gemiddelden vooringenomen bleken wanneer er geen verdere statistische controle werd toegepast […]. Verder groepeerden we de metabolieten overéénkomstig Metabolon®’s sub‐mechanisme verdelingen, door het gemiddelde te maken van de verhouding van de medianen voor alle molekulen van een bepaald sub‐mechanisme; wat resulteerde in 94 gegevens-punten voor het globaal metabolomica-panel. Hetzelfde proces werd geïmplementeerd gebruikmakend van het complexe lipiden panel (gegevens niet getoond), zonder meldenswaardige verschillen.

Binnen de super-mechanismen hebben de meerderheid van de sub‐mechanismen een gemiddelde ‘fold-change’ van de mediaan dicht bij 1, wat een weerspiegeling is van het feit dat er geen algemene ontregeling bestaat tussen de controle- en patiënten-groepen. Niettemin sprongen enkele sub‐mechanismen eruit omdat een meerderheid van (zo niet alle) hun metabolieten in dezelfde richting ontregeld waren voor een bepaalde groep t.o.v. de ander.

De meest opvallende wijziging zijn de acyl-cholinen met een verhouding van 1,9. Alle leden daarvan liggen lager in de M.E./CVS-groep, en 5 daarvan zijn significant verschillend volgens onze ‘volcano-plot’ analyse.

Deze analyse vestigt ook de aandacht op androgene steroïden (verhouding = 1,7). Opnieuw liggen alle leden van dit sub‐mechanisme lager bij M.E./CVS vs. controles. Zeven hebben p‐values < 0.05, zelfs al negeerden we ze initieel op basis van correctie voor ‘multiple testing’. Androgene steroïden werden reeds benadrukt in de ‘ChemRICH’ analyse. Alle 18 metabolieten komen minder overvloedig voor bij in M.E./CVS (verhoudingen variërend van 1,1 tot 4). Androgene steroïden omvatten DHEA (dehydro-epiandrosteron) en zijn overvloedig circulerende steroïden met wisselende biologische funkties, inclusief belangrijke effekten op het centraal zenuwstelsel. Twee andere steroïd-mechanismen lijk ook ge-downreguleerd bij M.E./CVS: progestine steroïden & corticosteroïden. Van de 6 metabolieten van het eerste sub‐mechanisme, hadden er 5 een verhouding tussen 1,3 en 1,7 en de zesde lag op 0,94. Progestine steroïden zijn nauwer betrokken bij de vrouwelijke menstruele cyclus. Aan de andere kant zijn corticosteroïden betrokken bij een zeer brede waaier aan fysiologische processen, inclusief maar niet beperkt tot de immuun-respons, de inflammatie-regulering en het proteïnen-katabolisme. Terwijl één een verhouding van 0,98 had, lagen de andere 3 op 1,36, 1,46 en 1,65 (2 groepen van elk 26 vrouwelijke individuen).

Dipeptiden maken ook deel uit van de sub‐mechanismen met een hoge gemiddelde verhouding van ‘fold-change’ medianen. Van de 6 dipeptiden in onze gegevens-set werden er 4 vernoemd in onze gegevens-analyse. Valyl-glycine kwam niet naar voor gezien z’n mediane ‘fold-change’ van 1 en ook leucyl-glutamine niet, zelfs al had dit een ‘fold-change’ van 1,48. Over het algemeen is het dipeptide sub‐mechansime ge-upreguleerd bij M.E./CVS-patiënten.

Twee andere sub‐mechanismen dienen te worden vermeld: het pyrimidine-metabolisme (cytidine-bevattend) en het vitamine-B6 metabolisme aangezien dit terugkerende resultaten zijn in de M.E./CVS-metabolomica literatuur [Nagy‐Szakal D et al. Insights into Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome phenotypes through comprehensive metabolomics. Sci. Rep. (2018) 8: 10056 /// Germain A, Hanson MR et al. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Mol. Biosyst. (2017) 13: 371)379 /// Germain A, Hanson MR et al. Prospective biomarkers from plasma metabolomics of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome implicate redox imbalance in disease symptomatology. Metabolites (2018) 8: 90] en eerder vernoemd.

Ten slotte: één molecule geklassificeerd als een acyl-glutamine (hexanoyl-glutamine) had de laagste verhouding (0,77). Een hogere concentratie van dit metaboliet bij patiënten zou wijzen op een toename qua mitochondriale vetzuren β‐oxidatie (FAO) en zou het energie-niveau bij patiënten kunnen beïnvloeden. Dergelijke veranderingen werden ook gelinkt aan Parkinson’s, hoewel niet als enige biomerker.

3. Bespreking

3.1. Acyl-cholinen zijn gedaald

Deze klasse molekulen is zeer intrigerend in de context van M.E./CVS. Hoewel dit slechts de tweede keer is dat acyl-cholinen werden bepaald bij M.E./CVS, zijn de resultaten reproduceerbaar tussen twee afzonderlijke groepen. Onze eerdere studie bevat gegevens over vier acyl-cholinen (arachidonoyl-choline, linoleoyl-choline, oleoyl-choline & palmitoyl-choline), en ze bleken allemaal ook gedaald in de patiënten-groep vergeleken met controles. […]

Acyl-cholinen zijn een onduidelijke klasse molekulen die voor het eerst werden beschreven in 1911: in combinatie met bloeddruk, bleek uit een opmerkelijk uitgebreide studie dat korte-keten choline-esters een verlagend effekt hadden terwijl lange-keten choline-esters neigden naar een verhogend effekt. Deze bevindingen werden tussen 1914 & 1956 verder bekrachtigd door meerdere groepen. Op dat moment werden farmacologische effekten van acyl-cholinen aangetoond […]. De molekulen die door ons werden gemeten (beschouwd als lange-keten acyl-cholinen) bleken het effekt van acetylcholine op weefsels (van konijn en cavia) te blokkeren, en onderdrukten de spontane zoutzuur-sekretie door rat-maag. Bloeddruk-problemen zijn één van de vele symptomen bij M.E./CVS-patiënten, bijzonderlijk wanneer we de courante dysfunktie orthostatische intolerantie in overweging nemen. Een afname qua lange-keten acyl-cholinen kan een ontregeling van de bloeddruk-controle (welke zich manifesteert via duizeligheid, lichthoofdigheid, troebel zicht, en neigende syncope bij staan) verklaren. We weten ook dat patiënten prikkelbare darm syndroom kunnen hebben, naast veel andere intestinale stoornissen. Een daling van lange-keten acyl-cholinen kan de zoutzuur-sekretie ontregelen met gevolgen zoals ‘leaky gut’ [lekke(nde) darm] symptomen en gewijzigde darm-microbioom populaties. Ten slotte, en hoewel acetyl-choline niet tot de gemeten metabolieten behoort, noteren we dat lange-keten acyl-cholinen antagonistische aktiviteit voor acetyl-choline vertonen. Acetyl-choline was de eerste neurotransmitter die werd geïdentificeerd en staat bekend als cruciaal voor het centraal zenuwstelsel (CZS) en het perifeer zenuwstelsel (PZS). In het CZS ondersteunt het de cognitieve funkties van de hersenen (waaronder kennis-verwerving en begrijpen via gedachten, ervaringen en bewustzijn). Dit zijn allemaal vaardigheden waarvan M.E./CVS-patiënten melden dat ze verminderd zijn; hun cognitieve problemen, die dikwijls worden beschreven als ‘hersen-mist’, omvatten – om er maar enkele op te noemen – concentratie-problemen, dyscalculie [problemen met vlot en accuraat oproepen en toepassen van het rekenen], geheugen-verlies, ruimtelijke desoriëntatie. In het PZS werkt acetyl-choline in de neuromusculaire verbindingen. Acetyl-choline fungeert in het autonoom zenuwstelsel, zowel als een interne transmitter voor het sympathisch zenuwstelsel (SZS), ook het ‘fight or flight’ system genaamd, en als het uiteindelijk produkt afgegeven door het parasympathisch zenuwstelsel (PZS), ook ‘rest & digest’ systeem genaamd. Inderdaad: naast de talrijke hierboven vernoemde digestieve problemen, is het kenmerkend symptoom van M.E./CVS de overweldigende vermoeidheid die niet verbetert door rust en die tot uiting komt na aktiviteit, beschreven als post-exertionele malaise (PEM).

Acyl-cholinen zijn enorm verwaarloosd sinds de jaren ‘50. Linoleoyl-choline, oleoyl-choline, palmitoyl-choline en stearoyl-choline werden slecht karig besproken als versterkers van medicijn-absorptie door het gastro-intestinaal kanaal (een farmacologisch experiment vond dat arachidonoyl-choline cholinomimetische aktiviteit [cholinomimetica = parasympaticomimetica] vertoont, wat het PZS stimuleert). Vooral omwille van Metabolon®’s expertise werden acyl-cholinen vernoemd in enkele nutritionele metabolomica-studies (plasma & serum). In één geval werd het effekt van koffie-consumptie op het bloed-metabolisme van individuen geëvalueerd, en hoewel zes acyl-cholinen significant geassocieerd bleken met koffie-inname, waren er 99 bijkomende ongerelateerde metabolieten met dezelfde associatie. Zoals verwacht was cafeïne er één van, met een ‘fold-change’ van 73 maal; onze groep toont echter geen enkel verschil tussen controles en patiënten (1,1 maal). Er werden door dezelfde groep gelijkaardige resultaten gerapporteerd bij het focussen op lipidomica. In een ander geval bleek een invloed van de consumptie van rijst-zemelen en kleine witte bonen op 71 plasma-molekulen t.o.v. controles, inclusief enkele acyl-cholinen. Opnieuw bleek geen enkel van de andere door ons gemeten metabolieten zich op dezelfde manier te gedragen, wat laat doorschemeren dat de haast exclusieve acyl-choline verschillen tussen controles en M.E./CVS-patiënten niet te wijten zijn aan nutritionele verschillen maar i.p.v. daarvan aan specifieke aan acyl-choline gerelateerde mechanismen. Een andere studie, bij een andere populatie, beperkt tot de consumptie van rijst-zemelen, leidde tot hetzelfde besluit.

3.2. Dipeptiden zijn gedaald

Dipeptiden zijn een andere klasse molekulen waarvan de waarden bleken te zijn afgenomen in onze patiënten-groep, zowel via statistisch testen als ‘ChemRICH’ analyse. Ons begrip omtrent variaties in plasma dipeptide-waarden is nog beperkt maar we merken op dat de meeste van de in onze eerdere studie bepaalde dipeptiden, zij het niet dezelfde, ook minder overvloedig waren in de patiënten-groep dan bij de controles. Als we focussen op de literatuur en symptomen van M.E./CVS-patiënten, wordt onze aandacht getrokken op het therapeutisch potentieel van sommige dipeptiden voor vermoeidheid, veroudering en spier-herstel.

3.3. Sfingolipiden zijn gedaald

Ceramiden en sfingomyelinen werden op verschillende tijdstippen opgemerkt: beide bleken significant verhoogd (statistische en aanrijking-analyse) voor het complex lipiden-panel gebruikmakend van ‘MetaboAnalyst’ én ‘ChemRICH’. Er werden bij M.E./CVS-patiënten reeds mechanisme-abnormaliteiten beschreven voor sfingolipiden maar de resultaten zijn inconsistent. In een groep van gelijkaardige grootte, vonden Naviaux et al. dat ceramiden en sfingomyelinen verhoogd waren bij de patiënten, ongeacht het geslacht [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-5480]. Dit resultaat kon niet worden gereproduceerd door Nagy‐Szakal et al. [zie hierboven]: zij zagen geen consistente daling qua ceramide-waarden maar meldden verminderde waarden van langere ceramiden bij patiënten zonder IBS. Onze gegevens toonden in plaats daarvan een toename van de ceramiden bij onze patiënten t.o.v. controles. Wanneer we onze patiënten-groep opsplitsten op basis van darm-symptomen, neigden de ceramide-waarden van patiënten zonder darm-symptomen zelfs verder gestegen voor CER (18:0), CER (18:1) & CER (20:0).

De inconsistenties die tussen de studies over ceramide-metabolisme, en meer algemeen sfingolipiden, naar voor kwamen, wijzen op een ingewikkeld landschap bij M.E./CVS. Hun prevalentie in cel-membranen, en hun betrokkenheid bij vele cel-processen, alsook de talrijke ongerelateerde pathologieën gelinkt aan een onevenwicht wat betreft hun waarden, suggereert dat veranderingen met betrekking tot sfingolipiden niet direct gelinkt zijn met M.E./CVS, maar eerder een gevolg zijn van de ziekte en de levensstijl dat het de patiënten oplegt (verstoord dieet, gebrek aan fysieke aktiviteit en medicatie).

3.4. Drie klassen steroïden gedaald

De hieronder besproken steroïden worden aangemaakt in de bijnier-schors, de geslachtsorganen en de placenta. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van de water- en zout-balans, het metabolisme en de stress-respons, alsook sexuele differentiatie en reproduktie. Via onze analyse vonden we dat drie categorieën steroïden gemiddeld minder overvloedig waren bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles. Er werden achttien androgene steroïden gemeten, inclusief enkele afgeleiden van dehydro-epiandrosteron (DHEA), maar geen enkele bleek de meest overvloedige in de circulatie. DHEA is gekend voor een waaier aan biologische effekten (van intermediair voor de biosynthese van geslacht-steroïden tot direct bindend op cel-receptoren en werkzaam als een neuro-steroïd). Drie van de vier gemeten corticosteroïden (cortisol, cortison & corticosteron) waren lager bij patiënten. Ze hebben rollen bij de stress-respons, het geheugen en inflammatie. Ten slotte waren vijf van de zes gemeten progestine-steroïden ook lager bij patiënten. Deze categorie van steroïden is voornamelijk gelinkt met het vrouwelijk reproduktief systeem, met gekende gevolgen als er onevenwichten optreden, bv. de maandelijkse pijn die vrouwen ervaren wanneer dit systeem zich reset, of tijdens de menopauze.

Het gebruik van steroïden om te proberen de symptomen van M.E./CVS-patiënten te verlichten werd vele malen geprobeerd; met merkbare verbeteringen voor sommige patiënten. De medische consensus is echter dat de meerdere risico’s en nevenwerkingen die deze krachtige metabolieten meebrengen, niet opwegen tegen hun voordelen. Niettemin suggereren sommige onderzoeken dat M.E./CVS gecorreleerd is met een verminderde funktie van de hypothalamus‐hypofyse‐bijnier (HPA) as en een hypersensitiviteit van het CZS [de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Med Genom. (2017) 10: 11]. De rol van de HPA-as is wordt niet helemaal begrepen omdat het zoveel funkties in het lichaam reguleert (energie-verbruik, temperatuur, immuunsystem, vertering, stemming en sexualiteit). In de context van steroïden zijn de implicaties van de HPA-as bij M.E./CVS erg breed en de daling van drie klassen steroïden zou gelinkt kunnen worden met een meerderheid van de symptomen en aangetaste systemen bij M.E./CVS-patiënten.

3.5. Acylen en M.E./CVS

Acyl-groepen zijn een deel van een molekule met een dubbel‐gebonden zuurstof-atoom en een alkyl-groep (RCO-); wat betekend dat de acyl-groep verbonden is aan een grotere molekule zoals het geval is voor al de acyl-molekulen in deze analyse. Hoewel de acetyl-groep een subtype van acyl is, bleek geen acetyl-molekule verschillend tussen controles en patiënten. In plaats daarvan legden we een klasse lipiden bloot behorend tot het acyl-choline sub‐mechanisme als één van de zeldzame molekulen die consistent lager waren bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles. Dit zette ons aan de analyse te dupliceren bij onze eerdere gepubliceerde gegevens. Hoewel het tocoferol-metabolisme en keton-lichamen oorspronkelijk werden besproken, worden de andere vier opnieuw bekeken. Onder hen zijn acyl-cholinen en acyl-glutamine gemeenschappelijk, terwijl mono-acyl-glycerolen als bijkomend acyl‐gerelateerd sub‐mechanisme opduikt. Mono-acyl-glycerolen maken geen deel uit van de gegevens van deze laatste analyse. Het disaccharide en oligosaccharide [suikers] sub-mechanisme is onderdeel van het koohydraten super‐mechanisme en verwijst enkel naar sucrose, dat verminderd was bij patiënten vergeleken controles. Acyl-carnitinen bleken ook gewijzigd.

We hebben een zeer beperkte kennis van zowel het synthese-pad als de funkties van de meerderheid van deze molekulen, maar ze maken deel uit van het lipiden super‐mechanisme en er kunnen enkele links tussen hen worden gevonden. Bv.: mono-acyl-glycerolen komen voort uit diacyl-glycerolen via verscheidene lipasen, inclusief hormoon-sensitieve lipasen die in sommige gevallen betrokken zijn bij steroïden-produktie. Een ander voorbeeld is de lengte van de vetzuur-keten van praktisch alle gemarkeerde molekulen, tussen 16 en 28 koolstoffen.

3.6. Reproduceerbaarheid

In onze eerdere studie werd het bloed anders verwerkt: de bloedstalen werden ‘s nachts verstuurd […] vergeleken met de snelle verwerking in deze studie. Het bewaren van levende cellen gedurende gemiddeld 24 h heeft toen wellicht een invloed gehad op de hoeveelheden van sommige metabolieten, wat mogelijks een verklaring is voor verschillen in sommige metabolieten van beide studies. Cellen die overnacht geïncubeerd zijn in plasma geven wellicht metabolieten af in het plasma, of absorberen deze uit het plasma. Onze huidige studie is meer representatief voor de metabolieten die circuleren in het bloed van M.E./CVS-individuen en controles. Resultaten van de twee studies kunnen ook niet exact worden vergeleken omdat niet allemaal dezelfde metabolieten werden gedetekteerd via Metabolon®. Bv.: 458 metabolieten met een HMDB-identificatie zijn gemeenschappelijk voor de studies, waarbij 25% van de gegevens van onze eerdere studie niet aanwezig zijn in deze set gegevens, en omgekeerd: 13% van de gegevens in deze set zijn niet aanwezig.

4. Materialen & Methodes

4.1. Studiegroep & bloedafname

52 vrouwelijke individuen, 26 gezonde controles, 26 patiënten met M.E./CVS diagnose door een specialist (dr Susan Levine), CDC criteria. […]. Er werd een inspanning geleverd om te matchen voor leeftijd en BMI.

[…].

4.2. Metabolomica-panels

[…] Metabolon® […] globale-metabolomica en lipidomica-panels […].

4.3. Gegevens-analyse

Twee online diensten. ‘MetaboAnalyst’ (statistische analyse en pad-analyse) modules […]. ‘ChemRICH’ (statistische verbetering). […].

4.4. Beschikbaarheid van gegevens

[…]

4.5. Goedkeuring voor de studie

[…]

5. Besluiten

We rapporteren hier over het grootste aantal metabolieten bij M.E./CVS tot op heden: ca. 1.750 plasma-molekulen, die 20 super‐mechanismen en 113 sub‐mechanismen beslaan. We hebben echter geen plasma-biomerker of set biomerkers ondubbelzinnig kunnen identificeren waarbij de hoeveelheden drastisch zouden verschillen tussen controles en M.E./CVS-patiënten, ondanks het feit dat onze klinische gegevens er op wijzen dat onze patiënten-groep een substantiële mate van invaliditeit vertoonde. Dezelfde conclusie kan worden getrokken uit het onderzoek-rapporten van verscheidene research-groepen, inclusief het onze, waarbij afzonderlijke populaties werden gerecruteerd, andere instrumenten werden gebruikt, of zelfs serum werd geanalyseerd i.p.v. plasma.

Niettemin dienen de metabolieten die op basis van onze analyse werden beklemtoond, vooral acyl-cholinen en steroïden, te worden beschouwd in het licht van de metabole impact die zelf bescheiden veranderingen kunnen hebben te samen met de complexiteit van de bronnen die metabolieten in de circulatie brengen. Inderdaad: de geobserveerde veranderingen kunnen het resultaat zijn van een stoornis die optreedt in een ander deel van het lichaam (bv. hersenen, spieren), met een impact die ‘verdund’ optreedt in het plasma. Het verkrijgen van stalen onder omstandigheden die de symptomen van patiënten (bv. PEM) versterken, zouden de geobserveerde kloof tussen het plasma-metaboloom van patiënten en controles verder kunnen verbreden. Omdat bloeistof-biopten zoals plasma en serum de meest toegankelijke bron blijven bij mensen, zullen onze resultaten gecombineerd met meer exploratieve metabolomica onze inspanningen help stimuleren vooraleer evolueren naar andere, meer invasieve staal-name technieken. Bovendien kan een controle voor vals-positieven worden aangewend om chemische groepen te identificeren i.p.v. individuele metabolieten die geassocieerd kunnen zijn met een ziekte of fenotype. Follow‐up studies kunnen nieuwe doelgerichte analytische methodes ontwikkelen om die chemische groepen te meten […].

februari 29, 2020

Diagnostische waarde van microRNAs (uit PBMCs & extracellulaire vesikels) bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:50 am
Tags: , , , ,

Onderstaande studie (door Dr Elisa Oltra’s research-team, Universiteit van Valencia, Spanje), werd gefinancierd door het ‘MEA Ramsey Research Fund’ en gebruikte stalen van de ‘UK ME Biobank’. De onderzoekers analyseerden microRNAs in PBMCs (perifeer bloed mononuclaire cellen) & EVs (extracellulaire vesikels) in het bloed van mensen met ernstige M.E.(cvs) om te bekijken of ze een diagnostische biomerker konden identificeren. Ze bevestigden de dalingen qua creatine-fosfokinase (zie ‘Verlaagd creatine-kinase bij ernstig zieke M.E.(cvs)’) en vonden verschillen (met gezonde controles) van het aantal en de grootte van extracellulaire vesikels.

M.E.(cvs)-patiënten hadden méér maar kleinere EVs, overéénkomstig met andere studies (zie ‘Extracellulaire vesikels: potentiële biomerkers voor M.E.(cvs)?’ en lees voor meer uitleg ook de stukken waar naar wordt gerefereerd in de inleiding van het artikel).

27 miRNAs (17 miRNA’s in PBMCs & 10 miRNA’s in EVs) bleken significant verschillend. 15 van die 27 miRNAs zouden mogelijks aangewend kunnen worden als diagnostische biomerkers voor M.E.(cvs). Maar er zijn verdere studies vereist om dit na te gaan (o.a. vergelijkingen met andere ziekten zoals bv. Multipele Sclerose).

————————–

Scientific Reports Vol 10, #1, article number 2064 (February 2020)

Assessing diagnostic value of microRNAs from peripheral blood mononuclear cells and extracellular vesicles in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Eloy Almenar-Perez (1), Leonor Sarria (2), Lubov Nathanson (2), Elisa Oltra (3)

1 Escuela de Doctorado, Universidad Catolica de Valencia San Vicente Martir, Valencia, Spain

2 Institute for Neuro Immune Medicine, Dr. Kiran C. Patel College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, Florida, USA

3 School of Medicine, Universidad Catolica de Valencia San Vicente Martir, Valencia, Spain

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een slopende multi-systemische ziekte met een onbekende etiologie, die wereldwijd duizenden individuen treft. De diagnostiek steunt nog op het uitsluiten van medische problemen die leiden tot onverklaarde vermoeidheid, dit omwille van een compleet gebrek aan ziekte-specifieke biomerkers.

Onze groep en anderen hebben de potentiële waarde van microRNA-profielen (miRNomen) als diagnostische instrumenten voor deze ziekte verkend. De heterogeniteit van en de lage aantallen deelnemers, de variëteit van de geteste stalen en andere pre-analytische variabelen hebben echter de identificatie van met ziekte geassocieerde miRNomen belemmerd.

In deze studie heeft ons team, voor het eerst, M.E./CVS miRNomen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en extracellulaire vesikels (EVs) van ernstig zieke patiënten – gerecruteerd door ‘UK ME biobank’ – geëvalueerd, om – gebruikmakend van standaard procedures – bloed-frakties te bepalen met een optimale diagnostische ‘power’ voor een snelle vertaling van een op miR gebaseerde diagnostische methode naar de kliniek.

Onze resultaten tonen dat creatine-kinase (CK) waarden in het bloed, fysieke kenmerken van plasma-EVs (tellingen, grootte en zeta-potentiaal), en een beperkt aantal differentieel tot expressie komende PBMC & EV miRNAs significant geassocieerd blijken met ernstige M.E./CVS (p < 0.05).

Genen-aanrijking analyse wijst epigenetische en neuro-immune ontregelde mechanismen aan, in overéénstemming met eerdere rapporten. Populatie-validatie via een kosten-effektieve benadering beperkt tot deze enkele potentieel discriminerende variabelen is aangewezen.

Inleiding

[…]

Ondanks het aanzienlijk aantal studies die significante verschillen op immuun en metabool niveau tonen, en het rapport door het ‘Institute of Medicine (IOM)’ van de ‘Academy of Sciences USA’ dat beklemtoont dat de aard van M.E./CVS fysiologisch/medisch is en niet een psychiatrische ziekte, steunen de huidige diagnostische methodes nog steeds op het uitsluiten van andere ziekten met gelijkaardige symptomen.

MicroRNAs, miRNAs of miRs zijn korte niet-coderende RNAs (20-24 nucleotiden [bouwstenen voor DNA & RNA] lang) met gen-expressie regulerende funkties. Hun abnormale expressie bij ziekte ligt al behoorlijk goed vast [kanker, neuro-inflammatie, …], wat hen tot aantrekkelijke biomerker-kandidaten maakt in menig scenario, inclusief M.E./CVS.

Onze groep en anderen hebben in het verleden de mogelijkheid onderzocht om miRNomen of molekulaire miRNA-profielen te identificeren voor M.E./CVS en co-morbide ziekten, via het analyseren van de inhoud van PBMCs (perifeer bloed mononucleaire cellen) of het bewijzen van hun aanwezigheid in lichaamsvochten (plasma, serum & cerebrospinaal vocht) [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J. Affect Disord. (2012) 141: 261-269 /// Cerdá-Olmedo G, Oltra E et al. Identification of a microRNA signature for the diagnosis of fibromyalgia. PLoS One. (2015) 10: e0121903 /// Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One. (2014) 9: e102783 /// Petty RD, Kerr JR et al. MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: potential diagnostic biomarkers in natural killer (NK) cells of patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One. (2016) 11: e0150904 /// Baraniuk JN et al. Exercise-induced changes in cerebrospinal fluid miRNAs in gulf war illness, Chronic Fatigue Syndrome and sedentary control subjects. Sci. Rep. (2017) 7, 15338 /// Al-Rawaf HA et al. MicroRNAs as biomarkers of pain intensity in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Pain Pract. (2019) 19: 848-860]. Alle lichaamsvochten bevatten vrije miRNAs, met proteïnen gecomplexeerde miRNAs maar ook miRNAs verpakt in extracellulaire vesikels (EVs). De ‘International Society for Extracellular Vesicles’ (ISEV) ondersteunt “extracellulair vesikel (EV) als de generische term voor partikels die worden afgegeven door de cellen die worden omgeven door een lipiden-dubbellaag en niet kunnen repliceren, d.w.z. geen funktionele kern bevatten”. Het is geweten dat EV een mengeling van exosomen, microvesikels, micropartikels, ectosomen, oncosomen, apoptotische lichaampjes en vele membraneuze strukturen met andere namen omvatten.

De aanwezigheid van de beschermende lipiden-dubbellag van EVs vormt een fysieke barrière tegen RNA-afbrekende enzymen, wat mogelijks leidt tot betere repliceerbaarheid van testen gebaseerd op RNA-kwantificatie. Daarnaast is geweten dat sommige van deze vesikels, exosomen [vesikels met dubbel membraan gekenmerkt door de expressie van merkers zoals tetraspaninen], op een gerichte manier miRNAs verpakken, en ziekte onderhouden en verspreiden, en daarom kunnen ze biomerker-voordelen bieden voor op vloeistof-bioptie gebaseerde diagnostische methodes. Aangezien EVs in het bloed hun oorsprong kunnen vinden in eender welke lichaam-cel, inclusief het microbioom en andere organismen, kan hun inhoud mogelijks informeren over dysbiose in het algemeen, naast immuun-dysfunkties. Dit laatste lijkt van bijzonder belang bij multi-systemische ziekten, zoals M.E./CVS, waarbij patiënten zich aandienen met neuro-immune veranderingen, hormonale onevenwichten, uitgeputte spieren, lekke darmen, enz. Ondanks het potentieel, is er nog geen studie uitgevoerd om bepaalde miRNAs in EVs geassocieerd met M.E./CVS systematisch te evalueren.

Het doel van deze studie het, voor de eerste maal, evalueren van M.E./CVS miRNomen in EVs bij ernstig zieke patiënten en ze vergelijken met die van hun PBMCs, als een manier om bloed-frakties te bepalen met optimale diagnostische ‘power’, voor een snelle vertaling van een miR-gebaseerde methode om de diagnose van M.E./CVS te stellen in de kliniek. Ter zelfder tijd kan de informatie verkregen uit de analyse van EV-inhoud leiden tot de identificatie van molekulaire doelwitten, om ons begrip omtrent de communicatie tussen een dysfunktioneel immuunsysteem en de rest van het organisme bij M.E./CVS-pathofysiologie te verbeteren.

Resultaten

Populatie-demografie. Bloedstalen van 30 deelnemers (15 patiënten met ernstige M.E./CVS & 15 voor leeftijd gematchte gezonde individuen), verkregen via de ‘UK ME Biobank’. M.E./CVS-diagnose op basis van de Canadese Consensus en/of CDC-1994 (‘Fukuda’) criteria. De opgenomen individuen waren allemaal vrouwen […]. Mediaan 48 jaar voor de M.E./CVS-groep en 47 voor de gezonde controles (HC). Gemiddelde tijd sinds ziekte-aanvang mediaan 18,4 jaar.

Verschillen in klinische variabelen. De SF-36 en ‘General Health Questionnaire’ (GHQ) scores […] indicatief voor de ernstig aangetaste gezondheid van de M.E./CVS-deelnemers.

Van de 30 klinische parameters die men evalueerde bij de ‘UK Biobank’ vertoonden enkel de creatine-fosfokinase (CPK) waarden statistisch significante verschillen tussen de groepen (p < 0.05): deze van de M.E./CVS-patiënten lagen ca. 1,5 maal hoger. […]

Kenmerken van plasma-EV verschillen tussen M.E./CVS & HCs. Aangezien het uiteindelijk doel van de studie was om de diagnostische waarde van miRNA-profielen van PBMCs en plasma-EVs te bepalen bij ernstige M.E./CVS, en aangezien de miRNA-lading in EVs afhankelijk is van de geïsoleerde vesikel-subpopulaties, besloten we dat het nodig was de geïsoleerde EVs die zouden worden gebruikt voor RNA-extractie te karakteriseren.

Op basis van eerdere rapporten die de superioriteit (in termen van of EV-opbrengst) toonde van op precipitatie [vorming van een neerslag, bezinksel] gebaseerde methodes t.o.v. andere, meer arbeid-intensieve klassieke methodes, en onze interesse voor een snelle, technisch eenvoudige diagnostische methode (in een klinische context), besloten we dat het gebruik van een precipitatie-benadering voor EV-isolatie het meest geschikt was. […]

De verkregen EV-opbrengsten uit equivalente volumes plasma waren hoger bij M.E./CVS dan HCs, hoewel niet statistisch significant (p < 0.1). Interessant: de geïsoleerde EVs vertoonden statistisch significante grootte-verschillen; ze waren gemiddeld kleiner bij de M.E./CVS-groep. Om uit te sluiten dat de geobserveerde resultaten te wijten konden zijn aan verschillen qua plasma-proteïnen die interfereren met de isolatie-methode, herhaalden we de procedure met een voor-behandeling met proteinase-K […]. We konden zo bevestigen dat er kwalitatieve verschillen bestaan, zowel qua aantal vesikels als hun grootte, in het plasma van M.E./CVS-patiënten t.o.v. HCs (p < 0.05).

Om de gepaste diverse geïsoleerde EVs verder te karakteriseren, hebben we hun zeta-potentiaal gemeten, een parameter die een weerspiegeling is van de oppervlakte-lading van het vesikel die informatief kan zijn voor verschillende membraan-samenstelling en indicatief voor vesikel-stabiliteit of de kans dat deze colloïdale oplossingen [colloïde (of colloïdaal deeltje = klein partikel dat groter is dan een molekule, met een diameter tussen 1 en 1000 nm] zouden aggregeren. Hoewel de verkregen waarden, over het algemeen, passen bij deze gerapporteerd in de literatuur (zeta-potentiaal van EVs geïsoleerd uit menselijk plasma: -10 to -50 mV), werden significante verschillen gevonden. In het bijzonder: EVs van M.E./CVS-patiënten gaven meer negatieve waarden dan deze van HCs (met of zonder proteinase-K). Dit suggereert dat er verschillen qua lipiden en/of andere membraan-componenten bestaan en dat, over het algemeen, M.E./CVS EVs mogelijks lichtjes stabieler zijn dan deze van HCs. Bovendien werden er, wanneer de EVs van elke groep onafhankelijk werden vergeleken, met betrekking tot voor-behandeling met of zonder proteinase-K, significante verschillen gezien voor zowel HCs als de M.E./CVS-groep. Aangezien in beide gevallen de proteinase-K voor-behandeling leidde tot meer positieve resultaten (minder negatieve zeta-waarden), werden de resultaten geïnterpreteerd als bewijs voor de rol van proteïne-factoren aanwezig in plasma-EVs bepalend voor membraan-elektronegativiteit, stabiliteit in oplossing en, mogelijks, hun werking.

Geïsoleerde plasma-EVs vertonen exosoom-kenmerken. TEM (Transmissie Elektronen Microscopie) beelden van geïsoleerde EVs en ‘western-blot’ analyse [immun-detektie van proteïnen] tonen dat de geïsoleerde EV-frakties (uit M.E./CVS- & HC-plasma’s), meerdere exosoom-kenmerken vertonen, inclusief morfologie (dubbel-lagig membraan ‘schotel-vormig’ [met een deuk in het centrum]), grootte (diameter 30-100 nm), en aanwezigheid van de tetraspaninen [familie van membraan-proteïnen] CD9 & CD81. Deze vesikel-subset medieert lange-afstand communicatie, draagt naar verluidt differentiële miRNA-ladingen bij ziekte, bleken potentiële diagnostische waarde te hebben in andere contexten en waren, daarom, van belang voor ons project. Aangezien het echter ons uiteindelijk doel was om een technisch eenvoudige diagnostische strategie te vinden onafhankelijk van de gekozen methode voor isolatie van EV-subsets, deden we geen verdere inspanningen naar detektie van exosomale merkers toe; er werden ook geen bijkomende zuivering-stappen uitgevoerd.

RNA-stalen in miRNA-profilering testen. De RNA-opbrengsten voor de 30 PBMC-stalen varieerden tussen 810-2.800 ng, en die voor de EVs tussen 102-514 ng. Enkel PBMC RNA-stalen met RIN (‘RNA integrity number’ [methode om de integriteit/kwaliteit van RNA na te gaan; schaal 1-10, waarbij 10 staat voor ‘intact’]) -waarden boven 7 werden meegnomen voor verdere analyse. 28 van de 30 stalen voldeden aan dit criterium, duidend op een globale aanvaardbare kwaliteit van de PBMC-stalen van de ‘UK ME Biobank’. Beide stalen met een lage RIN behoorden tot de HC-groep. Daardoor was het uiteindelijk aantal RNA-stalen van PBMCs die we geschikt achten voor verdere analyse 28 (15 M.E./CVS & 13 HCs).

Aangezien er geen kwaliteit-controle kan worden toegepast op totaal klein RNA verkregen uit EVs, en hun RNA-profielen gelijkaardige kenmerken vertoonden – onafhankelijk van het EV-isolatie protocol (met of zonder proteinase-K voor-behandeling) of de geanalyseerde groep (M.E./CVS or HC) – werden alle 30 RNA-stalen uit EVs (15 M.E./CVS & 15 HCs) opgenomen voor de microRNA-profilering.

Verschillen qua RNA-voorraden tussen PBMCs and plasma-EVs. De totale inhoud klein RNA in EVs vertoonde gelijkaardige patronen ongeacht de groep (M.E./CVS of HCs). Er werden geen belangrijke soorten (pieken met betrekking tot grootte) gedetekteerd voor deze van 4 tot > 150 nucleotiden. In tegenstelling daarmee werd een brede piek gezien voor de 20-40 nt en een tweede smalle piek voor deze rond a 60 nt voor totaal RNA uit PBMCs; dit ondersteunt differentiële sortering van klein RNA in vesikels (zoals eerder door andere auteurs werd beschreven).

Na toepassing van aanbevolen normalisatie-parameters, werden slechts 136 miRNAs uit PBMCs en 639 van 798 uit EVs gebruikt voor differentiële expressie analyse. Daarna verwijderden we de stalen met tellingen onder de achtergrond in 40% of meer van de genormaliseerde miRNAs. Bij de PMBCs verloren we er 3 (2 M.E./CVS & 1 HC) en bij de EVs nog es 3 (toevallig ook 2 M.E./CVS a 1 HC). Deze nieuwe filter verminderde het totaal aantal geanalyseerde stalen tot 13 M.E./CVS & 12 HCs voor PBMCs, en tot 13 M.E./CVS & 14 HCs voor EVs. De stalen die geëlimineerd werden, correspondeerden niet met dezelfde donoren voor PBMC- en EV-frakties, wat aangeeft dat de kwaliteit van de oorspronkelijke biobank-stalen geen verband hield met deze bevinding.

Er werd een derde filter toegepast om nauwkeurig miRNAs af te bakenen met ‘readings’ in minstens 75% van de stalen van de groepen: dit gaf slechts 91 miRNAs uit PBMCs en 150 uit EVs die voldeden aan deze criteria. Daarvan waren er 49 aanwezig in beide sets stalen, terwijl 42 en 101 exclusief waren voor PBMCs of EVs, respectievelijk. Deze miRNAs werden beschouwd als zijnde robuust en reproduceerbaar tot expressie komend in PBMCs & EVs. De beperkingen die werden ingesteld, leidden tot klassificatie van 606 miRNAs uit de 798 geteste als zijnde niet sterk tot expressie komend in PBMCs of EVs.

M.E./CVS PBMC miRNomen. Daarna onderwierpen we al deze 241 miRNAs aan een differentiële expressie (DE) analyse. Aangezien het gedaald aantal stalen aanleiding kon geven tot het verwijderen van miRNAs die, hoewel ze geen statistische significantie bereikten, toch relevant kunnen zijn voor de ziekte, gingen we verder met het detekteren en filteren van mogelijke uitschieters onder de DE miRNAs (p < 0.1) […]. De methode bestaat uit de detektie van een acceptabele band van gegevens rond het gemiddelde. Waarden buiten die band (> 2-maal SD) werden als uitschieters beschouwd.

Statistische analyse van de DE miRNAs uit PBMCs toonde, na deze aanpassing, 17 miRNAs met significante verschillen (p < 0.05), waarvan 9 met over-expressie en 8 met onder-expressie in de M.E./CVS-groep. De miRNAs met significant verhoogde waarden (p < 0.05) waren: hsa-miR-374a-5p, hsa-miRNA-4516, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p & hsa-miR-106b (dalende significantie). De verschillen varieerden tussen 20 en 65%. De miRNAs die significant gedaalde waarden toonden, waren: hsa-miR-644a, hsa-miR-451a, hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, hsa-miR-549a, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-1253 and hsa-miR-590-5p (dalende significantie). De verschillen expressie bij deze laatste groep varieerde tussen 13 en meer dan 200%. Daarnaast vertoonde hsa-miR-21-5p een p-value > 0.05 en < 0.1, wijzend op een tendens tot over-expressie bij M.E./CVS PBMCs t.o.v. HCs.

Interessant genoeg waren 3 van de geïdentificeerde DE miRNAs (hsa-miRNA-146a-5p, hsa-miR-17-5p & hsa-miRNA-451a) eerder als ontregeld gerapporteerd door andere auteurs, bij zowel M.E./CVS of fibromyalgie (FM) -patiënten. [zie hierboven & Leinders M, et al. Increased cutaneous miR-let-7d expression correlates with small nerve fiber pathology in patients with fibromyalgia syndrome. Pain. (2016) 157: 2493-2503]

M.E./CVS plasma-EV miRNomen. Op dezelfde manier vonden we bij M.E./CVS 10 DE (p < 0.05) miRNAs in EVs: 8 met over-expressie en 2 met onder-expressie. De miRNAs met significant verhoogde waarden (p < 0.05) waren: hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, hsa-miR-150-5p; hsa-miR-15a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-374a-5p & hsa-miR-130a-3p. De verschillen qua expressie in deze groep varieerden tussen 17 en 243%. De 3 miRNAs met significante onder-expressie bij M.E./CVS EVs (p < 0.05) waren: hsa-miR-183-3p & hsa-miR-33a-5p. De berekende onder-expressie waarden waren respectievelijk 47 en 17%. Er werden grote verschillen voor bepaalde miRNA-waarden opgemerkt tussen patiënten, wat kan wijzen op het bestaan van patiënten-subgroepen.

Daarnaast vertoonden hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320e, hsa-miR-203a-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-607, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-369-3p & hsa-miR-93-5p allemaal p-waarden > 0.05 & < 0.1 (oplijsting met dalende significantie). Hsa-miR-21-5p, hsa-miR-320e, hsa-miR-185-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-223-3p & hsa-miR-93-5p vertoonden over-expressie, terwijl hsa-miR-203a-5p, hsa-miR-607 & hsa-miR-369-3p onder-expressie vertoonden in M.E./CVS EVs t.o.v. die van HCs.

Drie van de miRNAs met significante DE in PBMCs waren ook DE in EVs (hsa-miR-374a, hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, en één ervan vertoonde een tendens (p < 0.1): hsa-miRNA-21-5p. Bij deze ontregelde miRNAs, zowel in PBMCs als EVs, vertoonden hsa-miR-374a & hsa-miRNA-21-5p over-expressie in beide frakties, terwijl voor hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 onder-expressie werd gevonden in PBMCs en over-expressie in EVs. De betekenis van deze verschillen wordt nog niet begrepen.

De ‘heatmap’s [grafische voorstelling, met kleuren, van gegevens in een matrix] van miRNAs met DE tussen M.E./CVS en HCs (p < 0.05) in PBMCs of EVs illustreert de beschreven verschillen in miRNA-waarden.

Er werd altijd een minimum van 10 stalen per groep opgenomen voor alle miRNAs die werden geëvalueerd in PBMCs, terwijl een minimum van 11 werd opgenomen voor die in EVs.

Potentiële mechanismen en molekulaire funkties aangegeven door DE miRNAs. In een poging om de fysiologische betekenis van de geïdentificeerde DE miRNAs bij M.E./CVS te bepalen, voerden we Gen Ontologie (GO) aanrijking analyse uit op basis van de genen die mogelijks aangeduid werden door de DE miRNAs met p-waarden < 0.05, gebruikmakend van de miRDIP en ‘Reactome pathway’ databases (zie methodes).

Interessant: de voornaamste getroffen mechanismen in PBMCs omvatten post-transcriptionele ‘silencing’ [regulering van de gen-expressie om de expressie van een bepaald gen te voorkomen; in dit geval na translatie (vertaling in proteïnen)] door kleine RNAs, circadiaanse klok, chromatine-organisatie en chromatine-modificerende enzymen, naast meerdere mechanismen verbonden met het X-chromosoom gecodeerd MECP2 (methyl-CpG bindend proteïne 2 [essentieel voor de normale werking van zenuwcellen]) gen, beiden bij de miRNAs met over- en onder-expressie bij M.E./CVS. Het feit dat MECP2 onderwerp is van X-chromosoom inaktivatie [proces waarbij één van de kopieën van het X chromosoom geïnaktiveerd wordt bij vrouwen, door het te verpakken zodat het een transcriptioneel inaktieve struktuur krijgt] ondersteunt mogelijke geslacht-bepaalde omgeving-effectoren voor de ziekte.

Daarnaast vonden we ook MECP2-mechanismen bij de ‘top hits’ in DE miRNAs met over-expressie in EVs met p < 0.05. De bevinding dat er neuronale en endocriene mechanismen bij de DE miRNA hits bij M.E./CVS EVs zijn, kan wijzen op defekten in het funktioneren van endocrien weefsel, zoals velen melden. Neurotrofe receptor tyrosine-kinase (NTRK [zenuw-groeifactor receptor]) signalisering lijkt ook een impact te ondervinden van significante DE miRNAs (p < 0.05), zowel in PBMCs als EVs, wat verband kan houden met de symptomen zoals cognitieve stoornissen en zintuigelijke dysfunkties (veranderde pijn-sensitiviteit).

Bepaling van de diagnostische waarde van geëvalueerde variabelen. Aangezien het voornaamste doel van studie was om de mogelijke diagnostische waarde van de gemeten variabelen te bepalen, voerden we ‘response operating characteristic’ (ROC) analyses uit voor elk van de miRNAs met significante DE (p < 0.05), op individueel niveau.

15 van de 27 significante DE miRNAs die in deze studie werden gedetekteerd, vertonen waarden voor de ‘area under the curve’ (AUC) boven 0.75, wat er op wijst dat ze een acceptabel vermogen hebben om bloedstalen van M.E./CVS-patiënten te onderscheiden van HCs met betrekking tot hun miRNAs. De microRNAs met beter onderscheidend vermogen zijn: hsa-miR-374a-5p (AUC: 0.876), hsa-miR-4516 (AUC:0.865), hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 (AUC: 0.847) en hsa-miR-340 (AUC: 0.8106), allemaal uit PBMCs, met uitzondering van hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 die kunnen worden beschouwd als de beste potentiële biomerker-kandidaat uit EVs (AUC boven 0.8).

Validatie van door DE miRNAs voorspelde doelwit-genen. Om de impact te bepalen van DE miRNAs op het PBMC-transcriptoom, ontwierpen we een set ‘primers’ [primer = startplaats voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’)] om de waarden van representatieve genen binnen courant aangetaste mechanismen te kwantificeren via RT-qPCR. Meer bepaald kozen we voor: het AGO2 gen ([coderend voor een proteïne dat is vereist bij RNA-] ‘silencing’ door kleine RNAs, incl. R-HSA-426496 & R-HSA-426486), het MECP2 gen van MECP2-gerelateerde mechanismen [zie hierboven] (incl. R-HSA-9022707, R-HSA-9022699, R-HSA-9022692, R-HSA-8986944, R-HSA-9022534, R-HSA-9005891, R-HSA-9022538, R-HSA-9022927, R-HSA-9022537 & R-HSA-9022702) en het NTRK1 gen [zie hierboven] (R-HSA-187037 & R-HSA-9028731 neurotrofine-signalisering [inductie van overleving, ontwikkeling & funktie van neuronen]). AGO2 en MECP2 vertoonden onder-expressie, terwijl NTRK1 was toegenomen in M.E./CVS PBMCs. Zoals hierboven besproken, suggereert de connectie van deze mechanismen met symptomen hun bijdrage in de pathofysiologie van M.E./CVS.

Bespreking

Researchers en klinici zijn het eens dat er een dringende nood is aan onbevooroordeelde, specifieke diagnostische biomerkers voor M.E./CVS om de diagnose en behandeling te bespoedigen, en voor goed een einde te maken aan ziekte-stigma’s. Er bestaat ook een consensus aangaande voordelen die miRNA-profielen van verschillende bloed-frakties, inclusief EVs, vertonen als molekulaire diagnostische kandidaten, en toch wordt er een schaarste wat betreft studies die focussen op M.E./CVS miRNA profilering gezien.

Een beperking voor biomerker-ontdekking studies bij M.E./CVS is dat het tot op heden bij piloot-studies met een klein aantal deelnemers is gebleven, en ons huidig werk (30 deelnemers), is geen uitzondering. Het belang van ons ontwerp, steunt echter op het feit dat, voor het eerst, miRNomen in PBMCs en EVs werden bestudeerd bij dezelfde individuen, naast 34 analytische variabelen in het bloed en 6 bijkomende EV-kenmerken (opbrengst, grootte en zeta-waarden, met of zonder proteinase-K behandeling), en meerdere gezondheid-vragenlijsten (SF-36 & GHQ28), leidend tot de meest volledige fenotype-registratie van individuen met ernstige M.E./CVS waar we weet van hebben.

Om bijkomende beperkingen die biomerker-ontdekking in M.E./CVS belemmeren te voorkomen, probeerden we patiënten-heterogeniteit en bevooroordeling geassocieerd met pre-analytische variabelen te minimaliseren door enkel stalen op te nemen uit de ‘UK ME biobank’, die procedures gebruikt die voldoen aan die van de NINDS (‘National Institute of Neurological Disorders and Stroke’) voor de studie van M.E./CVS. […]

Creatine-fosfokinase (CK) waarden in het bloed bleken significant gedaald in onze M.E./CVS-groep […], overéénkomstig het rapport door Nacul L et al. [Evidence of clinical pathology abnormalities in people with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) from an analytic cross-sectional study. Diagnostics (2019) 9: E41] […]. Serum-CK kan daarom een biomerker zijn voor ernstige M.E./CVS-gevallen (96% sensitiviteit) ook al hebben ze een lage specificiteit (< 50%). Hoewel een bias omwille van patiënten-inaktiviteit op dit moment niet kan worden uitgesloten, rechtvaardigt het feit dat een multi-variaat model dat controleert voor aktiviteit significant blijft, naast z’n potentieel om PEM bij M.E./CVS te verklaren, verdere exploratie.

Omdat technische eenvoud wenselijk is voor klinische testen, besloten we dat i.p.v. het betrachten van de isolatie van sterk gezuiverde EV-subpopulaties op basis van lange protocollen, het gebruik van geoptimaliseerde commerciële kits die hoge EV-opbrengsten geven via eenvoudige/snelle procedures te verkiezen is.

Er dient te worden opgemerkt de beschikbaarheid van deze zeer waardevolle stalen nogal beperkt is. Dat was een bijkomende reden om te kiezen voor TEIR reagent [zie methodes] als isolatie-methode voor EVs, aangezien het de hoogste (vergeleken met andere commerciële produkten of andere isolatie-methodes) opbrengsten geeft uit slechts 0,5 ml plasma. Daardoor kon het totaal volume staal beperkt worden gehouden. Auteurs zijn het eens dat EVs geïsoleerd met polyethyleen-glycol (PEG [een polymeer; zorgt voor minder enzyme-afbraak en gedaalde immunogeniciteit van proteïnen]) 6000 (zoals bij TEIR) partikels van vergelijkbare grootte geven als andere methodes (ultracentrifugatie, ultrafiltratie en gel-chromatografie), en met verhoogde opbrengsten […].

Het was de intentie van de huidige studie om de weg te effenen voor de exploratie van bloed-EV kenmerken bij M.E./CVS en, zodoende, de mogelijkheid te openen voor het evalueren van miRNA-netwerken aangetast door M.E./CVS-pathofysiologie in het ganse organisme. Een ander hoofd-aspect van het project was om te bepalen of EVs mogelijks een meer sensitieve, of anderzijds betere fraktie dan PBMCs, vormen voor het detekteren van miRNA-veranderingen bij M.E./CVS, voor diagnostische doeleinden. ROC-analyse wijst echter op superieure diagnostische waarde van miRNomen uit PBMCs vergeleken met EVs. De hoge variabiliteit en het laag miRNA ‘copy-number’ in EVs t.o.v. PBMCs (17 vs. 69) kan, ten minste gedeeltelijk, deze bevinding verklaren. Verrassend genoeg bleken opbrengsten, grootte en zeta-waarden van EVs ziekte-onderscheidende parameters.

Overéénkomstig met bevindingen bij andere pathologieën, inclusief kanker [melanoma] en neurodegeneratieve ziekten [Alzheimer’s], vonden we hogere aantallen EVs. Interessant: een piloot-studie die het aantal en de grootte van EVs in serum evalueerde, vond ook verhoogde aantallen bij M.E./CVS-patiënten [Castro-Marrero J et al. Circulating extracellular vesicles as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an exploratory pilot study. J Extracell Vesicles. (2018) 7: 1453730]. Naast de verhoogde EV-opbrengsten zagen we ook dat de gemiddelde grootte van M.E./CVS EVs gedaald is: een gemiddelde diameter onder 100 nm. Dit is ook in overéénstemming met de bevindingen van Castro-Marrero J et al. Hoewel we plasma gebruikten i.p.v. serum, leken de gevonden parameter-verschillen samen te vallen, wat bewijs is voor reproduceerbaarheid in meer dan één type staal en bij verschillende groepen. De vraag of één cel EVs produceert van verschillende groottes of dat het grootte-verschil EV-produktie door verschillende cellen weerspiegelt, blijft tot op heden onbeantwoord.

EV-grootte hangt niet enkel af van het type membraan-fosfolipiden maar ook van de aan- of afwezigheid van bepaalde membraan-proteïnen en het verschil kan funktionele gevolgen hebben. Bv.: er werd voorgesteld dat cytokinen op het EV-oppervlak kunnen dienen als ‘bar-code’ molekulen die worden herkend door overvloedige cel-specifieke cytokine-receptoren. Massa-spectrometrie (MS) dient zeker te worden opgenomen in follow-up studies ter evaluatie van mogelijke kwalitatieve verschillen geassocieerd met M.E./CVS.

Aangezien het proces van invriezen/ontdooien de eigenschappen van de vesikels – inclusief vesikel-flocculatie [vlok-vorming; proces waarbij de vesikels zich aan elkaar hechten] – kan beïnvloeden, werden al onze experimenten uitgevoerd met één enkele ontdooi-stap. We kunnen echter niet uitsluiten dat vesikel-‘collaps’ [proces waarbij een vesikel zijn inhoud afgeeft] bij HCs een verklaring is voor hun toegenomen grootte. In feite vertoonden EVs van patiënten een hogere stabiliteit (binnen een initieel instabiliteit-bereik) overéénkomstig hun hogere aboslute zeta-potentiaal waarden.

De observatie dat M.E./CVS EV zeta-waarden meer negatief zijn dan die van de HCs suggereert dat de buitenste laag fosfolipiden, of de membraan-proteïnen (of beide), een hogere negatieve lading dragen. Siaalzuur [familie van derivaten van neuraminezuur, ook de naam voor het meest voorkomende lid van deze groep, N-acetylneuraminezuur; komen voor aan het eind van suiker-ketens verbonden met de oppervlakken van cellen en oplosbare eiwitten] op membraan-gebonden oligosacchariden leidt tot een verhoogde netto negatieve lading van door tumor-cellen gesekreteerde vesikels. Het zal interessant zijn om te bepalen of er een aanrijking is van siaalzuur in M.E./CVS EVs.

Het feit dat voor-behandeling met proteinase-K de membraan-elektronegativiteit reduceert bij zowel M.E./CVS als HC wijst op een bijdrage van proteïnen in de netto vesikel-lading. Er dient echter te worden opgemerkt dat de globale lading van M.E./CVS EVs hoger blijft na proteinase-K behandeling, in vergelijking met behandelde EVs van HCs; wat lipiden en koolhydraten als belangrijkste kandidaten aanduidt als verklaring voor de geobserveerde lading-verschillen tussen M.E./CVS en HCs. Onbevooroordeelde distributie van lipiden in vesikel-omhulsels en/of verschillen qua suiker-verhoudingen zijn interessante mogelijkheden om na te gaan, aangezien ze indicatief kunnen zijn voor verschillende subpopulaties bij ziekte vs. gezondheid.

Ondanks het feit dat EVs geïsoleerd met TEIR-reagent vesikels met exosomale morfologie […] omvatten, en de aanwezigheid van exosomale merkers CD9 & CD81 werd bevestigd d.m.v. ‘western blotting’, waren onze procedures beperkt wat betreft het schatten van de relatieve hoeveelheden exosomen en andere vesikel-subgroepen in het algemeen, en daarom is enige mogelijke bijdrage van exosomen of ander vesikel-subtype bij M.E./CVS enkel speculatief.

Het uiteindelijk totaal aantal miRNAs met expressie hoger dan de achtergrond leek opvallend laag: slechts 91 in PBMCs en 150 in EVs, van de ca. 800 opgenomen in het ‘nCounter Human miRNA Panel v3’ (NanoString Technologies). Aangezien de stalen veeleisende kwaliteit-controles ondergingen, moet het laag aantal ‘hits’ in PBMCs te wijten zijn aan de beperkte bloedcel-type expressie, zoals beschreven door andere auteurs, samen met de strikte selektieve criteria in deze studie. Van de 27 miRNAs DE bij M.E./CVS (p < 0.05) (17 in PBMCs & 10 in EVs), vonden we, na een database-‘search’ die eerder door onze groep werd beschreven, dat hsa-miR-18a-5p ge-upreguleerd kan zijn door het anti-psychotisch medicijn desipramine [antidepressivum], terwijl hsa-miR-146a-5p & hsa-miR-150-5p expressie geïnduceerd kan worden door morfine, wat de mogelijkheid opwerpt dat de geobserveerde over-expressie van deze miRNAs kan voortkomen uit blootstelling aan medicijnen en niet de ziekte zelf. Dit beklemtoont het enorm belang van een gedetailleerde registratie bij het bestuderen van molekulaire veranderingen bij deze patiënten, zoals aanbevolen door de NINDS [zie hierboven] CDEs [‘Common Data Elements’; gemeenschappelijke gegevenselementen] voor M.E./CVS.

Het feit dat het aantal in EVs gedetekteerde miRNAs met expressie boven de achtergrond groter is dan in PBMCs werd enigszins verwacht aangezien de verschillende bronnen [cel-types] van EVs aanleiding zou geven tot hogere miRNA-complexiteit. Omwille van de selektieve verpakking van miRNAs zouden EV-miRNomen nuttig kunnen zijn voor het traceren van de cellen maar we dienen eerst de ‘regels’ voor dit proces te begrijpen. In tegenstelling daarmee suggereren sommige gegevens niet-selekteive miRNA-verpakking in EVs. Interessant was dat een Duits research-team toonde, gebruikmakend van een elegant genetisch tracering systeem […], dat het niet enkel het cel-type is dat van belang is, maar dat ook de gezondheid-toestand van het individu dat de gerichte verpakking van molekulen en funktie van EVs bepaalt. In hun experimenten bewezen de auteurs dat de transfer van signalisering-RNA tussen immuun-cellen en het brein, de darm en bijkomende weefsels wordt bevorderd door inflammatoire letsels [Ridder K et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of genetic information between the hematopoietic system and the brain in response to inflammation. PLoS Biol. (2014) 12: e1001874].

MiRNA weefsel-specifieke expressie zou hints kunnen bieden betreffende de cellulaire oorsprong van plasma-EVs. In dit opzicht bepaalden andere Duitse onderzoekers de relatieve hoeveelheden van 1.997 miRNAs in 61 weefsel-biopten van verschillende organen die post-mortem bij twee individuen werden genomen. Op basis van een weefsel-specificiteit index (TSI), vonden de auteurs dat de meerderheid van de miRNAs (82,9%) bij de middenste TSI-waarden behoorde, wat betekent dat ze niet specifiek waren voor één enkel weefsel (TSI > 0.85) noch voor ‘housekeeping’ [huishoudelijke (referentie/controle)] miRNAs (TSI < 0.5). De expressie van veel verschillende miRNAs en miRNA-families was echter overheersend in bepaalde weefsels. Bovendien waren miRNAs TSI-waarden van menselijke weefsels goed gecorreleerd met die van ratten, wat ondersteuning is voor bewaarde weefsel-aangerijkte miRNAs binnen soorten. Er waren slechts 5 miRNAs die zeer specifiek bleken voor haematopoïetische cellen: miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 & miR-223. Enkel miRNA-150 was DE (p < 0.05) bij onze EV-profilering, en voor miR-223 was er een DE-tendens (0.05 > p < 0.1). Gebruikmakend van een zoek-instrument […], vonden we dat EV DE miRNAs (p < 0.05) – hsa-miR-150-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR33a-5p, let-7d-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-374a-5p & hsa-miR-130a-3p – voornamelijk tot expressie kwamen in spieren en fascia, hersenen en zenuwen, en hormonale klieren (voornamelijk schildklier) […]. Allen correspondeerden met weefsels die aangetast zijn bij M.E./CVS.

Hoewel hsa-miR-4454 & hsa-miR-7875 niet in de vernoemde database voorkomen, rapporteerde men de detektie van hsa-miR-4454 in serum, als een potentiële marker voor colitis ulcerosa [chronische ontsteking van de dikke darm met zweer-vorming] met een hogere sensitivieit en specificiteit dan C-reaktief proteïne. Dit past bij het feit dat inflammatie dikwijls verband houdt met M.E./CVS [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc Natl Acad Sci USA (2017) 114: E7150-E7158]. Misschien relateren de grote verschillen voor dit miRNA die worden gezien bij EVs van patiënten, met de intestinale dysbiose die bij sommige patiënten aanwezig is. De registratie van een gedetailleerde klinische geschiedenis van de deelnemers zal belangrijk zijn om deze vraag te beantwoorden, zoals aangegeven door de M.E./CVS CDEs.

Er waren slechts 4 miRNAs die werden gevonden in beide frakties (PBMCs & EVs). Daarvan waren er 2 (hsa-miR-21-5p & hsa-miR-374a-5p) die dezelfde trend volgden – over-expressie in beide frakties – terwijl de nauw verwante hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975 onder-expressie bleken te vertonen in PBMCs en over-expressie in EVs, wat kan worden verklaard door gerichte verpakking in immuun-cellen. Het lijkt bijzonder interessant dat hsa-miR-4454 & hsa-miR-7975, door sommige auteurs gelinkt met inflammatie, bij de top DE miRNAs met mogelijke diagnostische waarde lijkt te behoren volgens ROC-analyse. Op dit moment kunnen we echter enkele speculeren over de potentiële betekenis van deze bevindingen. Resultaten van GO mechansime analyse en RT-qPCR wijzen op potentiële epigenetische en signaal-transductie mechanismen die verband houden met M.E./CVS, wat goed overéénstemt met de differentiële methylatie-patronen die eerder door onze groep werden gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten [Trivedi MS, Oltra E et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome associated DNA methylation patterns. PLoS One. (2018) 13: e0201066].

Ten slotte: anders dan bij micro-chips, vereist NanoString-technologie geen validatie van de resultaten verkregen via andere methodes. We gingen niettemin verder met het testen of differentiële expressie-profielen die op deze manier werden gedetekteerd, in onze stalen konden worden vastgesteld d.m.v. kosten-efficiënte RT-qPCR. Zowel miRNAs die willekeurig werden gekozen uit de groep met over-expressie (hsa-miR-106b) als die met onder-expressie (hsa-miR-549a) werden als statistisch DE bevestigd in M.E./CVS PBMCs. Dit opent de opwindende mogelijkheid voor een richtgevende lage-kosten screening-methode, met slechts enkele miRNAs te samen met routine analytische parameters van het bloed en enkele EV-kenmerken, ter evaluatie van grotere M.E./CVS-groepen en populatie-validatie van de hier gedetekteerde potentiële biomerkers voor M.E./CVS. Inclusie van ziekte-controles, zoals Multiple Sclerose (MS), Systemische Lupus Erythematosus (SLE) of andere ziekten met overlappende symptomen zullen van belang zijn.

Methodes

Stalen & verwante klinische gegevens. […] ‘UK ME Biobank’.

[…] PBMCs (> 106 cellen) en plasma van 15 ernstig zieke vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 15 vrouwelijk, voor leeftijd gematchte gezonde individuen, […].

[…] Canadese Consensus en/of CDC-1994 (‘Fukuda’) criteria […]. Exclusie-criteria: (i) antivirale medicatie of medicijnen die de immuun-funktie veranderen in de 3 voorafgaande maanden (ii) vaccinaties in de 3 voorafgaande maanden; (iii) geschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekten (hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV; maar niet herpes-virus of andere retrovirus-infektie); (iv) een andere chronische ziekte zoals kanker, coronaire hart-ziekte of ongecontroleerde diabetes; (v) een ernstige stemming-aandoening; (vi) zwangerschap of borstvoeding in de 12 voorafgaande maanden; of (vii) morbide obesitas (BMI ≥ 40). […]

[…]

RNA-isolatie & RNA kwaliteit-controle. […]

EV-purificatie. […] plasma […] ‘Total Exosome Isolation Reagent’ (TEIR) […] met of zonder proteinase-K voor-behandeling.

EV-karakterisatie. Opbrengst en grootte-distributie: ‘Nanoparticle Tracking Analysis’ (NTA), licht-verstrooing […]. Zeta-potentiaal: ‘Dynamic Light Scattering’ (DLS) […]. Transmissie elektronen-microscopie (TEM) […].

‘Western-blotting’ […] anti-CD9 antilichaam, anti-CD81 antilichaam, anti-HSP70 antilichaam & anti-β-actine antilichaam […].

NanoString miRNA-profilering & analyse. […] evaluatie van 800 miRNAs […].

[…]

Stalen met tellingen boven vastgestelde drempel-waarden in minder dan 40% van de miRNAs werden geëlimineerd. Enkel miRNAs met waarden boven de drempel in minstens 75% van de stalen, in beide groepen (M.E./CVS & HCs), werden gebruikt voor de differentiële expressie analyse (PBMCs of EVs). […].

[…]

RT-qPCR validatie. […].

Gen-aanrijking & mechanisme-analyse. Bij gen-aanrijking analyse warden potentiële doelwit-genen van de DE miRNAs met statistische significantie (p < 0.05) geïdentificeerd d.m.v. de miRDIP database [‘microRNA Data Integration Portal’] en de ‘Human miRNA-gene interaction (adjacency) matrix setting’. […] De ‘pathway’-analyse van de doelwit-genen werd bepaald d.m.v. de ‘Reactome’ database [‘Reactome pathway Knowledgebase’, een ‘peer-reviewed’ mechanisme-database]. Enkel doelwit-paden met p-waarden < 0.05 werden als potentiële effectoren van de statistisch significante DE miRNAs beschouwd.

ROC-curves, statistische analyse & plotting. ‘Response Operating Characteristic’ voor elk van de miRNAs met significante DE tussen M.E./CVS & HC (p < 0.05) […].

[…]

februari 14, 2020

Hoe psychiatrische doorverwijzing stigma beïnvloedt bij M.E.(cvs)

Filed under: Gezondheidszorg — mewetenschap @ 7:49 am
Tags: , , , , , ,

De bevindingen van onderstaand onderzoek (door de groep van Prof. Lenny Jason) geven aan dat M.E.(cvs)-patiënten die naar psychiaters werden doorverwezen waarschijnlijk stigmatisering omwille van hun ziekte ondervinden en zich vervreemd voelen van anderen. De verbanden worden bepaald door het land (V.S.A. vs. V.K.) waar men woont. De implicaties van dergelijke verwijzingen door artsen worden besproken…

Lees ook ‘Contestatie tegen de psychiatrische kadering van M.E.(cvs)’.

————————-

Community Psychology in Global Perspective Vol 5, #2, p. 19-29 (2019)

How psychiatric referrals influence stigmatization in patients with Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome: An examination of American and British models

Julia Terman, Joseph Cotler, Leonard A. Jason

DePaul University, Chicago, USA

Samenvatting

Myalgische encefalomyelitis (M.E.) en Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) zijn controversiële chronische ziekten met een groot aantal invaliderende symptomen. Deze studie had tot doel ervaren stigma en vervreemding voor patiënten met M.E. & CVS te exploreren, na verwijzingen door artsen naar psychiaters of psychologen. De bevindingen geven aan dat patiënten die werden doorverwezen naar psychiaters waarschijnlijk ziekte-stigma zullen ervaren en zich vervreemd van anderen zullen voelen omwille van hun ziekte. Deze verbanden worden bepaald door het land waar ze wonen (de Verenigde Staten en het Verenigd Koninkrijk). De implicaties van verwijzingen door artsen voor mensen met M.E. en CVS worden besproken.

1. Inleiding

Individuen met Myalgische encefalomyelitis (M.E.) en Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) ervaren een waaier aan symptomen, inclusief uitputtende vermoeidheid, post-exertionele malaise, cognitieve stoornissen en autonome symptomen. Jammer genoeg rapporteren individuen met M.E. en CVS consistent negatieve ervaringen met artsen [Åsbring P & Närvänen A. Women’s experiences of stigma in relation to Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia. Qualitative Health Research (2002) 12: 148-160 /// Dickson A et al. Stigma and the delegitimation experience: An interpretative phenomenological analysis of people living with Chronic Fatigue Syndrome. Psychology & Health (2007) 22: 851-867] en slechte arts/patient-relaties kunnen doeltreffende behandeling belemmeren [lees ook ‘Arts-Patient: Partnerschap; GEEN Paternalisme’, ‘Omgaan met een Arrogante Arts’, ‘Arts/patient conflicten bij medische onzekerheid]. Patiënten melden dat verzorgers dikwijls hun lichamelijke klachten buiten beschouwing laten en hen behandelen alsof de ziekte psychologisch is. Eerdere research vond dat, in sommige populaties, tot 68% van de M.E./CVS-patiënten een verkeerde diagnose kregen: die van een psychiatrische ziekte, ondanks het feit dat er geen bewijs is voor een lopende of eerdere psychiatrische ziekte. Er worden frequent symptomen toegeschreven aan depressie i.p.v. M.E. & CVS, en patiënten worden doorverwezen naar psychiaters of psychologen en krijgen antidepressiva voorgeschreven. Zelfs wanneer patiënten overtuigd zijn dat hun symptomen niet psychologisch van aard zijn, accepteren ze dikwijls psychologische voorschriften om zich te schikken naar de aanbevelingen van een arts, en dit kan leiden tot verslechtering wat betreft het gevoel van eigenwaarde en zelf-respect. [Werner A & Malterud K. It is hard work behaving as a credible patient: Encounters between women with chronic pain and their doctors. Social Science and Medicine (2003) 57: 1409-1419]

Ervaringen omtrent de afwijzing door artsen correleren met vervreemding voor patiënten met onzichtbare ziekten. Vervreemding wordt gedefinieerd als een emotioneel gebrek aan intimiteit met anderen en een sociaal gebrek aan verbondenheid met de omgeving, en is een constructie met diepe banden met eenzaamheid en het sociaal netwerk [Andersson L. A model of estrangement – including a theoretical understanding of loneliness. Psychological Reports (1986) 58: 683-695]. Sommigen conceptualiseerden vervreemding als een factor die bestaat onder de paraplu van stigma, aangezien leden van gestigmatiseerde groepen dikwijls sterke vervreemding ervaren. Een vervreemde persoon voelt zich geïsoleerd en kan z’n ware zelf niet zijn in aanwezigheid van anderen, wat leidt tot het vervullen van rollen en andere psychologische belastingen. Ironisch genoeg kan het opzij zetten van lichamelijke chronische ziekte klachten als zijnde psychologisch in feite een risico-factor betekenen voor toekomstige psychologische belastingen, via vervreemding.

Ervaren stigma kan de link verklaren tussen psychiatrische doorverwijzingen en vervreemding. Stigma wordt vaak geciteerd als een ‘situatie van het individu dat wordt uitgesloten van volledige sociale acceptatie’. Dit impliceert dat pogingen om het individu te helpen d.m.v. psychiatrische verwijzing, hun sociale opportuniteiten beperkt, en zodoende hun sociale status. Sommige patiënten met M.E. & CVS ondervinden sterke stigmatisering door familie, vrienden en het algemeen publiek [bv. Green J et al. Stigma and Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Chronic Fatigue Syndrome (1999) 5: 63-95], wat een negatieve impact kan hebben op hun welzijn. Individuen die vervreemd raken, ontberen sociale ondersteuning die hen kan beschermen tegen geïnternaliseerd stigma en het herstel-proces kan helpen. Een studie vond dat M.E./CVS-patiënten die melding maken van depressie en zelfmoordneiging een hogere mate van ervaren stigma en vervreemding ervaren [McManimen SL, Jason LA et al. Effects of unsupportive social interactions, stigma and symptoms on patients with Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Community Psychology (2018) 46: 959-971]. Aangezien stigma verband houdt met andere indicatoren voor het welzijn, kan dit het verband tussen attitudes van artsen en vervreemding mediëren.

Gezondheidzorg-praktijken en attitudes omtrent psychologische behandeling, en sociaal stigma zijn diep geworteld in de context van cultuur. Cultuur kan fungeren als een mechanisme dat beïnvloedt of stigmatiserende overtuigingen worden geïnternaliseerd en leiden tot sociale en psychologische belastingen. Bijvoorbeeld: er bestaan algemene verschillen tussen Britse en Amerikaanse maniërismen, gedragingen en waarden van medisch professionalisme. Specifiek voor M.E. & CVS: Britse (t.o.v. Amerikaanse) patiënten ervaren een langere aanvang-periode en significant meer stoornissen met betrekking tot gevoelige keel, gewricht-pijn, verstoord geheugen/concentratie en schrijven de ziekte frequenter toe aan psychologische oorzaken [Zdunek M et al. A cross cultural comparison of disability and symptomatology associated with CFS. International Journal of Psychology and Behavioral Sciences (2015) 5: 98]. Deze culturele verschillen hebben waarschijnlijk een impact op de manieren waarop gezondheidzorg-personeel de ziekte conceptualiseren en patiënten behandelen.

Eerdere research heeft het verband tussen stigma en gezondheid-uitkomsten bij andere zieketen onderzocht. In een studie bij tuberculose, bleek de relatie tussen kennis omtrent TBC, arts/patient-communicate en familie-vervreemding te worden gemedieerd door stigmatisatie van tuberculose. Hoewel de studie de verwijzing door artsen naar psychiaters niet onderzocht, kan dit in de context van M.E. & CVS worden bekeken als een ontoereikend begrijpen omtrent de ziekte en worden toegepast op een gelijkaardige manier. In de huidige studie was de hypothese dat psychiatrische doorverwijzing verschillen qua stigma en vervreemding zou beïnvloeden. Bovendien werd gehypothiseerd dat ervaren stigma het verband tussen psychiatrische doorverwijzing en vervreemding zou mediëren voor Britse en Amerikaanse deelnemers.

2. Methode

2.1. Procedure

Recrutering van deelnemers via websites van patiënten-organisaties, nieuwsbrieven van patiënten-pleitbezorgers, internet-forums en sociale media. De deelnemers hadden zelf-gerapporteerde diagnoses van M.E. of CVS. […]

2.2. Deelnemers

De gegevens van 182 Amerikaanse (gemiddelde leeftijd 52,93) en 135 Britse (gemiddelde leeftijd 47,03) deelnemers met M.E. en/of CVS werden in de huidige studie geanalyseerd. In het Amerikaans staal waren 91,21% (n = 166) vrouwen en 8,24% (n = 15) mannen. […] Een meerderheid van de Amerikanen (98,90%, n = 180) was zwart en slechts 3,30% (n = 6) had een Latijns-Amerikaanse origine. Het Brits staal omvatte 80,74% (n = 109) vrouwen en 19,26% (n = 26) mannen. Een meerderheid van de Britten was blank (97,78%, n = 132) en 1,48% (n = 2) had een Latijns-Amerikaanse origine. […]

2.3. Metingen

Psychiatrische doorverwijzing. Dit werd gemeten via het ja/nee item: “Ben je ooit verwezen naar een psychiater of psycholoog voor je lichamelijke symptomen?” […]

Ervaren stigma. Dit werd gemeten d.m.v. de psychologische attributie subschaal van de ‘M.E. & CFS Stigma Scale’ [Terman JM, Jason LA et al. Confirmatory Factor Analysis of a Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome Stigma Scale. (2018)]. Deze subschaal meet het ervaren stigma omtrent M.E. & CVS, en omvat 5 items (telkens van 1 = volledig niet akkoord tot 5 = volledig akkoord). De items van deze meting stelden, “1) Als mensen te weten komen dat je werd behandeld voor M.E. of CVS, beginnen ze te zoeken naar gebreken in je persoonlijkheid. 2) Veel mensen veronderstellen dat het hebben van M.E. of CVS een teken van persoonlijke zwakheid is. 3) De meeste mensen geloven dat een persoon met M.E. of CVS net zo emotioneel stabiel is als een gemiddelde mens. 4) Veel mensen veronderstellen dat een persoon die lijdt aan M.E. of CVS ook een dieper-liggend psychologisch probleem heeft. 5) Mensen hebben een manier van het associëren van het voorkomen van M.E. of CVS met psychiatrische problemen.”. […]

Vervreemding. Dit werd gemeten m.b.v. de vervreemding-subschaal van de ‘M.E. & CFS Stigma Scale’ en meet de mate waarin patiënten zich vervreemd voelen van anderen omwille van hun ziekte [zie Terman JM et al. hierboven]. Deze meting omvat 6-items (telkens van 1 = volledig niet akkoord tot 5 = volledig akkoord): “1) Er is een deel van mezelf dat enkel andere mensen met M.E. of CVS kunnen begrijpen. 2) Een probleem omtrent het hebben van M.E. of CVS is dat mensen niet geloven dat je echt ziek bent. 3) Ik heb soms gewenst dat mensen m’n ziekte konden zien. 4) Het hebben van M.E. of CVS heeft me zeer verschillend van andere mensen gemaakt. 5) De meeste mensen hebben geen idee hoe het is om M.E. of CVS te hebben. 6) Ik voel me dikwijls helemaal alleen met mijn ziekte.” […]

Attitudes van arsten. Dit werd gemeten via het item “De arts lijkt negatieve attitudes of overtuigingen te hebben over individuen met M.E. of CVS.” [Sunnquist M et al. Access to medical care for individuals with Myalgic Encephalomyelitis and Chronic Fatigue Syndrome: A call for centers of excellence. Modern Clinical Medicine Research (2017) 1: 28] (van 1 = volledig niet akkoord tot 5 = volledig akkoord).

Attitudes van specialisten. Dit werd gemeten via het item “De specialist lijkt negatieve attitudes of overtuigingen te hebben over individuen met M.E. of CVS.” [zie Sunnquist M et al. hierboven] (van 1 = volledig niet akkoord tot 5 = volledig akkoord).

Sociodemografie. De deelnemers beantwoorden socio-demografische vragen betreffende leeftijd, geslacht, ras, ethniciteit en nationaliteit.

2.4. Statistische analyses

Er werden analyses van de variantie uitgevoerd om de effekten van verwijzingen door artsen en residentie op ervaren stigma en vervreemding te evalueren. […]

3. Resultaten

Er was een significant verschil qua leeftijd tussen deelnemers uit de Verenigde Staten (gemiddeld 52,94 jaar) en deelnemers uit het Verenigd Koninkrijk (gemiddeld 47,01 jaar). Er was een hoger percentage vrouwen in het Amerikaans staal (91,6%) dan de Britse groep (80,6%). Er waren geen significante verschillen wat betreft invaliditeit tussen de V.S. (46,9%) en het V.K. (50,0%); geen significante verschillen wat betreft gehuwden (V.S. 53,4% & V.K. 47,8%) en geen significante verschillen qua raciale samenstelling.

De Britse deelnemers ervaarden meer negatieve attitudes van artsen (gemiddeld 2,36, SD = 1,07) dan de Amerikanen (gemiddeld 1,68, SD = 0,82), alsook meer negatieve attitudes van specialisten (gemiddeld 2,04, SD = 1,03) dan de Amerikanen (gemiddeld 1,47, SD = 0,85). Er was een tendens tot verband tussen het land van verblijf en psychiatrische doorverwijzing. Deelnemers uit de Verenigde Staten (62,4%) bleken 1,82 maal meer te worden doorverwezen naar psychiaters dan de Britten (54,5%).

Er werd een analyse van de variantie (ANOVA) uitgevoerd om de effekten van residentie en psychiatrische verwijzing op ervaren stigma te evalueren. Er was een significant effekt van psychiatrische doorverwijzing op stigma maar geen significant effekt van het land of interaktie-effekt op ervaren stigma. De deelnemers die werden doorverwezen naar een psychiater vertoonden een grotere mate van ervaren stigma (gemiddelde 2,83, SD = 0,48) dan deelnemers die niet naar een psychiater werden verwezen (gemiddelde 2,61, SD = 0,51). Er werd een tweede ANOVA uitgevoerd ter evaluatie van de effekten van het land van verblijf en psychiatrische verwijzing op vervreemding. Er was een significant effekt van psychiatrische doorverwijzing op vervreemding. Degenen die werden doorverwezen naar een psychiater vertoonden een grotere mate van vervreemding (gemiddelde 3,58, SD = 0,42) dan deelnemers die niet naar een psychiater werden verwezen (gemiddelde = 3,39, SD = 0,45). Er was geen significant effekt van het land of interaktie-effect op vervreemding.

Er werd gekeken naar correlaties tussen de belangrijkste variabelen. Ervaren stigma was gecorreleerd met vervreemdingen voor de Amerikanen maar deze correlatie was significant sterker voor de Britse deelnemers. Daarnaast was vervreemding niet gecorreleerd met negatieve attitudes van artsen voor de Amerikanen maar vervreemding was echter gecorreleerd met negatieve attitudes van artsen voor Britse deelnemers. Deze correlaties waren significant verschillend.

Er werden regressie-analyses uitgevoerd om het model te testen: hierbij zou het land waar men verblijft tussenkomen in het verband van stigma tussen psychiatrische doorverwijzing en vervreemding […]. […] Voor de Amerikanen was het effekt op de stigma => vervreemding relatie minder dan voor de Britse deelnemers […] De resultaten gaven aan dat ervaren stigma een groter effekt had op het mediëren van de relatie tussen psychiatrische doorverwijzing en vervreemding voor Britse dan voor Amerikaanse deelnemers.

4. Bespreking

De huidige bevindingen geven aan dat patiënten met M.E. & CVS die werden doorverwezen naar psychiaters waarschijnlijk ziekte-stigmatisering ondervinden en zich van anderen vervreemd voelen omwille van hun ziekte. Aangezien eerdere studies een grote tendens voor M.E./CVS-patiënten met een verkeerde diagnose (psychiatrische aandoening) hebben getoond, zijn deze doorverwijzingen wellicht een oorzaak van angst en stigma voor de patient. Het verband tussen psychiatrische verwijzing en vervreemding werd gemedieerd door ervaren stigma, toch was de impact sterker voor de Britse groep. Ondanks de verschillende mediatie-model uitkomsten (moderatie-effekt van het land), correleerden alle drie de variabelen met elkaar voor individuen van beide landen. Deze bevindingen bekrachtigen de kwalitatieve verklaringen die in eerdere literatuur werden gerapporteerd, die suggereerde dat attitudes van artsen verband houden met stigma en vervreemding bij individuen met M.E. en CVS.

Bevindingen gaven aan dat patiënten risico lopen voor vervreemding en sterke stigmatisering. Stigma kan het zoeken van hulp moeilijker maken en belasting van de mentale gezondheid voorspellen [zie McManimen SL, Jason LA et al. hierboven]. Vervreemding is ook een risico-factor voor patiënten omdat sociaal geïsoleerde individuen eenzaamheid kunnen ervaren, en eenzaamheid voorspelt daaropvolgende depressie. Zodoende kunnen individuen met chronische ziekte die zich vervreemd voelen een risico lopen op depressie, alsook op vroege mortaliteit.

De verschillen tussen de Amerikaanse en Britse modellen kunnen, ten dele, worden verklaard door verschillende ziekte-profielen en culturele verschillen. Britse individuen ervaren ernstiger symptomen dan Amerikanen (meerdere indicatoren) [zie Zdunek M et al. hierboven], die een impact kunnen hebben op hun ervaringen met gezondheidzorg-verstrekkers en gelijken. Het is mogelijk dat een patient met ernstiger symptomen meer negatief behandeld wordt door artsen dan iemand met minder ernstige symptomen, bijzonderlijk als de arts een stigmatiserend beeld van de ziekte handhaaft. Een andere mogelijkheid kan te wijten zijn aan verschillen qua diagnostische en behandeling-richtlijnen tussen de twee landen. In het V.K. stipuleren de ‘National Institute for Health and Care Excellence’ (NICE) richtlijnen voor M.E. en CVS dat cognitieve gedrag therapie (CGT) en graduele oefen therapie (GOT) onderdeel moeten zijn van het behandel-programma voor M.E./CVS-patiënten. Hoewel dit positieve uitkomsten voor patiënten met depressie geeft, rapporteren patiënten dat GOT dikwijls de symptomen verergert en hen meer vermoeide en zieker maakt dan er voor [Wilshire C, Tuller, D. Geraghty K et al. Rethinking the Treatment of Chronic Fatigue Syndrome – a Reanalysis and Evaluation of Findings from a Recent Major Trial of Graded Exercise and CBT. BMC Psychology (2018) 6]. CGT geeft meer controversiële bevindingen maar er werd aangetoond dat de doeltreffendheid ervan direct verbonden is met een co-morbide diagnose van depressie [Sunnquist M & Jason LA. A Reexamination of the Cognitive Behavioral Model of Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Psychology (2018) 74: 1234-1245; zie ‘Her-onderzoek van het cognitief gedrag model voor CVS: weinig overtuigend]. Hoewel deze richtlijnen in voege zijn bij behandelaars in het V.K., heeft het ‘Institute of Medicine’ in de V.S. geen specifieke richtlijnen voor het behandelen van M.E. of CVS. Attitudes omtrent de ziekte en behandeling zijn waarschijnlijk anders tussen Groot-Brittanië en Amerika omwille van deze genuanceerde verschillen, zoals werd aangetoond met attitudes omtrent de oorzaak van M.E. en CVS [zie Zdunek M et al. hierboven]. Deze uitkomsten benadrukken het belang van samenwerking betreffende patiënten-gezondheidzorg, aangezien stigmatisatie in de patiënten-gezondheidzorg kan worden verminderd door de betrokkenheid van patiënten bij de planning en implementatie van hun behandeling en uitkomst-opties. Gemeenschap-psychologen kunnen deze bevindingen gebruiken om patiënten te identificeren die een risico kunnen lopen op verdere sociale en familiale vervreemding omwille van vals-positieve doorverwijzingen, en te helpen bij het toedienen van geschikte therapieën gericht op re-integratie in sociale omstandigheden die het ervaren stigma te niet doen.

Hoewel de huidige studie één van de eerste is die artsen-behandeling, stigma en vervreemding voor mensen met M.E. en CVS bij verschillende culturen verkent, dienen beperkingen en richtingen voor de toekomst in acht te worden genomen. Deze ‘cross’-sectionele gegevens kunnen niet worden gebruikt om longitudinale oorzakelijke besluiten te trekken en dienen te worden opgenomen in toekomstige studies. Bijkomend: aangezien de psychiatrische doorverwijzing zelf-gerapporteerd was, konden we niet met zekerheid vaststellen welke van die verwijzingen als ongepast of gepast konden worden beschouwd. Daarom zouden toekomstige studies gediend kunnen zijn van klinische interviews met de deelnemers, om te identificeren welke deelnemers in aanmerking zouden kunnen komen voor een psychiatrische doorverwijzing, en welke deelnemers niet.

Samengevat: behandeling door artsen, maatschappelijk stigma en de sociale vervreemding van individuen met M.E. en CVS zijn met elkaar verbonden in onze twee patiënten-stalen. De bevindingen geven aan dat doorverwijzingen voor psychiatrische behandeling beschadigend kunnen zijn wanneer ze aan iemand worden voorgeschreven als een middel om hun lichamelijke klachten af te wijzen. Artsen kunnen een behandel-model met gedeelde besluitvorming hanteren om patiënten met M.E. en CVS te behandelen. Deze methode omvat wederzijdse uitwisseling van informatie tussen arts en patient, aangezien de arts medische kennis bezit en de patient kennis aangaande individuele gezondheid-ervaringen. Dit model bleek doeltreffend voor personen met chronische onzichtbare ziekten en laat artsen beter toe om patiënten die voelen dat hun symptomen lichamelijk en niét psychologisch zijn, te helpen. Door sensitief te blijven, kunnen artsen, vrienden en familie het leven van mensen met M.E. en CVS proberen te verbeteren.

februari 1, 2020

Circulerend GDF15 bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:31 am
Tags: , , , ,

Journal of Translational Medicine (Pre-print november 2019)

Circulating levels of GDF15 in patients with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Audrey Melvin (1), Eliana Lacerda (2), Hazel Dockrell (2,3), Stephen O’Rahilly (1), Luis Nacul (1)

1 MRC Metabolic Diseases Unit, Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge, Addenbrookes Treatment Centre, Cambridge, UK

2 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

3 Department of Immunology and Infection, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

4 Department of Clinical Research, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, UK

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door vermoeidheid en post-exertionele malaise. De pathogenese wordt niet goed begrepen. GDF15 is een circulerend proteïne dat door cellen wordt gesekreteerd in respons op verscheidene stressoren. De receptor voor GDF15 komt tot expressie in de hersenen, waar z’n aktivatie resulteert in een waaier aan responsen. De aandoeningen met sterk gestegen GDF15-waarden zijn o.a. mitochondriale aandoeningen, waarbij skelet-spier vermoeidheid een sleutel symptoom is. Onze hypothese was dat GDF15 een merker voor cellulaire stress bij M.E./CVS zou kunnen zijn.

Methodes GDF15 werd gemeten in het serum van patiënten met M.E./CVS (n = 150; 100 met milde/matige en 50 met ernstige symptomen), ‘gezonde vrijwilligers’ (n = 150) en een groep patiënten met Multipele Sclerose (n = 50).

Resultaten Circulerend GDF15 bleef stabiel in een subset M.E./CVS-patiënten waarbij stalen op twee momenten met ca. 7 maanden tussentijd werd afgenomen […]: 720 pg/ml (95% CI = 625-816) vs. 670 pg/ml (95% CI = 598-796), P = 0.5. De GDF15-waarden waren 491 pg/ml bij controles (95% CI = 429-553), 546 pg/ml (95% CI = 478-614) bij MS-patiënten, 560 pg/ml (95% CI = 502-617) bij patiënten met milde/matige M.E./CVS en 602 pg/ml (95% CI = 531-674) bij ernstig aangetaste M.E./CVS-patiënten. Rekening houdend met mogelijke storende factoren, hadden patiënten met ernstige M.E./CVS GDF15-concentraties die significant verhoogd waren vergeleken met gezonde controles (P = 0.01). De GDF15-waarden waren positief gecorreleerd (P = 0.026) met vermoeidheid-scores bij M.E./CVS.

Besluiten Ernstige M.E./CVS is geassocieerd met verhoogde warden van GDF15, een circulerende biomerker voor cellulaire stress die stabiel blijkt te blijven gedurende meerdere maanden over.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende aandoening met een geschatte populatie-prevalentie tussen 0,2 en 2,6% en de meest courante schattingen liggen tussen 0,2 en 0,7%. M.E./CVS wordt gedefinieerd dor de aanwezigheid van onverklaarde persistente of terugkerende vermoeidheid gedurende een periode van meer dan 6 maanden, die resulteert in een daling van de capaciteit van het individu om voorheen getolereerde niveaus van werk-gerelateerde, sociale, onderwijs- en persoonlijke aktiviteit te behouden. De aktiviteit-beperkende symptomatologie is heterogeen en blijft niet beperkt tot vermoeidheid. De etiologie van M.E./CVS blijft moeilijk en hoewel een reeks mechanismen werd voorgesteld, is de voornaamste focus voor onderzoek gericht op ontregeling van het immuunsysteem hoewel er geen consensus bestaat. Er is steeds meer interesse omtrent de mogelijke bijdrage van abnormaliteiten qua spier bio-energetica aan het fenotype van spier-vermoeidheid [Rutherford G et al. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) /// Nacul L et al. Evidence of clinical pathology abnormalities in people with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) from an analytic cross-sectional study. Diagnostics. (2019) 9: 41]. Oxidatieve stress, mitochondriale dysfunktie, acidose en verstoorde AMP-kinase aktiviteit werden allemaal voorgesteld als mogelijke mechanismen die bijdragen aan spier-vermoeidheid bij M.E./CVS [Tomas C, Newton J. Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a mini-review. Biochem Soc Trans. (2018) 46: 547-53; zie ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]. Abnormale vermoeidheid en post-exertionele malaise zijn invaliderende symptomen van M.E./CVS, die mogelijks kunnen worden verklaard door abnormaliteiten van het energie-metabolisme. De diagnose van M.E./CVS is gebaseerd op klinische parameters en vooralsnog is er geen biochemische merker voor de aandoening: pogingen om ziekte-specifieke biomerkers te identificeren werden belemmerd door het onvolledig begrijpen van de ziekte-pathofysiologie. Groei-differentiatie factor 15 (GDF15) is een circulerend peptide dat een gewicht-verlagend effekt bleek te hebben wanneer het werd toegediend aan knaagdieren en niet-menselijke primaten. Een aantal observaties hebben ons er toe geleid te speculeren over de rol van GDF15 bij M.E./CVS, waarbij we het beschouwen als een mogelijke biomerker voor de ziekte en misschien een bijdragende factor tot de symptomatologie. Ten eerste is er bewijsmateriaal opgedoken dat GDF15 geëvolueerd is als een signaal voor cellulaire stress, met groeiende interesse omtrent z’n rol als een biomerker voor aandoeningen van de mitochondriale funktie. Ten tweede werd ook aangetoond dat GDF15 verhoogt na lichamelijke aktiviteit, wat interessant is wanneer we het beschouwen in de context van de post-exertionele symptomen die worden beschreven bij M.E./CVS. Ten derde: bij knaagdier-modellen wordt gerapporteerd dat stijgingen qua circulerend GDF15 geassocieerd zijn met verminderde fysieke aktiviteit. Tot op heden werd GDF15 nog niet formeel bestudeerd in de context van M.E./CVS. Om dit aan te pakken, hebben we circulerende waarden van GDF15 gemeten in een klinisch en biochemische gefenotypeerde M.E./CVS-groep, en die vergeleken met afzonderlijke groepen gezonde individuen en patiënten met Multipele Sclerose (MS); allemaal deelnemers van de ‘UK ME/CFS Biobank’ (UKMEB).

Methodes

Recrutering van de deelnemers

Mogelijke deelnemers van de ‘UK ME/CFS Biobank’ (UKMEB) werden uitgenodigd […] en de mensen met ernstige symptomen kwamen voornamelijk via steun-groepen. […]. Inclusie-criteria: (i) tussen de 18 en 60 jaar oud & (ii) een klinische diagnose van of M.E./CVS, volgens CDC-1994 of Canadese consensus criteria, bevestigd door een klinisch onderzoeker (beoordeling en laboratorium-testen) […]. Exclusie: (i) gebruik van medicijnen die de immuune-funktie wijzgigen (bv. azathioprine, cyclosporine, methotrexaat, steroïden), en/of anti-virale medicatie en vaccinaties in de voorafgaand 3 maanden; (ii) voorgeschiedenis van acute en chronische infektueuze ziekten zoals hepatitis-B & -C, tuberculose, HIV (maar niet herpes-virussen); en/of (iii) andere ziekte en stemming-aandoeningen. […]

Klinische beoordeling assessments

Vragenlijsten

[…] (i) persoonlijke en familiale geschiedenis, (ii) socio-demografische gegevens, (iii) mogelijke risico-factoren (o.a. roken en aktiviteit-niveau) en (iv) symptomen de voorbije week. Dit laatste omvatte gestandardiseerde beoordeling instrumenten zoals de ‘Medical Outcomes Survey Short Form’ – SF-36v2™ (funktionele capaciteit), de analoge pijn-schaal (pijn-ernst) en de vermoeidheid-ernst schaal […]. […]

Antropometrie

[…] (i) bloeddruk (liggend en staand), (ii) handgreep-sterket test […], (iii) lende- en heup-omtrek, (iv) lengte, (v) gewicht, BMI en bio-impedantie [meting van lichaamsvet & spier-massa], (vi) spirometrie [meting van long-funktie/capaciteit], (vii) puls-oxymetrie [meting van de zuurstofsaturatie].

Afname en analyse van de bloedstalen

[…] GDF15: elektro-chemiluminescentie immuno-assay […], detektie-bereik 3,0 tot 32.000 pg/ml […].

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Waarden van circulerend GDF15 blijven stabiel met verloop van tijd

Bij het beschouwen van GDF15 als een potentiële ziekte-biomerker wilden we z’n stabiliteit met verloop van tijd onderzoeken. We analyseerden circulerend GDF15 bij ‘baseline’ beoordeling en follow-up bij een groepje 100 willekeurig geselekteerde individuen, inclusief 40 gezonde vrijwilligers, 40 deelnemers met M.E./CVS en 20 MS-patiënten. De mediane tijd tussen de metingen was 7,4 maand […]. Bij de gezonde deelnemers bleven de GDF15-waarden opmerkelijk stabiel met een gemiddelde waarde bij ‘baseline’ van 491 pg/ml (95% CI 429-553) en bij follow-up of 495 pg/ml (95% CI 434-556), p = 0.7. Er werd een gelijkaardig patroon geobserveerd bij M.E./CVS, met GDF15-waarden van 720 pg/ml (95% CI 625-816) & 670 pg/ml (95% CI 598-796) (p = 0.5). Bij de deelnemers met MS (een progressieve neurologische ziekte) zagen we een toename (baseline naar follow-up) met een gemiddeld circulerend GDF15 van 677 pg/ml (95% CI 580-776) & 729 pg/ml (95% CI 619-839) (p = 0.01).

GDF15 is verhoogd bij patiënten met ernstige M.E./CVS

Wat betreft de ‘baseline’ karakteristieken van de studie-populatie: deze omvatte M.E./CVS-patiënten (n = 150) met milde/matige ziekte (n = 100) en ernstig aangetasten (aan huis gebonden of bedlegerig, n = 50), mensen met MS (n = 50) en ‘gezonde controles’ (n = 100). De MS-groep werd in de studie opgenomen als een vergelijking-groep met patiënten die ook een chronische ziekte geassocieerd met vermoeidheid hadden. De groep met MS was gemiddeld ouder (49 jaar), vergeleken met zowel M.E./CVS & ‘gezonde controles (gemiddeld ca. 42 jaar). Een groter deel van de individuen met MS rookten (26%), vergeleken met 7,5% bij M.E./CVS en 4% bij de gezonde controles. Wanneer de mensen met ersntige en niet-ernstige M.E./CVS vergeleken, vonden we een lagere BMI en hogere eGFR (‘estimated Glomerular Filtration Rate’ [glomerulaire filtratiesnelheid = totaal volume urine gefilterd door beide nieren; geeft een idee van de nier-funktie]) bij die met ernstige ziekte. De andere geanalyseerde parameters waren gelijkaardig tussen de groepen. De gemiddelde ‘baseline’ GDF15-waarden waren 491 pg/ ml (95% CI 429-553) voor gezonde controles, 546 pg/ml (95% CI 478-614) voor mensen met MS, 560 pg/ml (95% CI 502-617) voor de M.E./CVS-patiënten met milde/matige ziekte en 602 pg/ml (95% CI 531-674) voor de ernstig zieke M.E./CVS-patiënten. Er was geen significant verschil tussen de groepen bij univariate analyse [één variabele]. Het is goed geweten dat GDF15 verhoogd is bij een aantal fysiologische en pathologische toestanden. We voerden zodoende een multi-variate analyse uit om te bepalen of er mogelijke verschillen waren qua GDF15-waarden tussen de groepen, na controle voor onafhankelijke variabelen, zoals geslacht, leeftijd, body-mass-index, aktiviteit-niveau, rook-status, ‘estimated Glomerular Filtration Rate’ (eGFR) & C-reaktief proteïne (CRP) – een frequent gebruikte merker voor inflammatie. We vonden een significant direct verband met de leeftijd, BMI & CRP, en een omgekeerde relatie met eGFR. De resultaten van de multi-variate analyse tonen dat gevallen van ernstige M.E./CVS (maar niet van milde/matige) waarden voor GDF15 hebben die significant hoger zijn dan de gezonde groep (P = 0.01). Er waren geen significante verschillen qua GDF15 tussen M.E./CVS-patiënten met milde/matige ziekte, MS-individuen en gezonde vrijwilligers.

Circulerend GDF15 is geassocieerd met zelf‑gerapporteerde vermoeidheid

Om het verband tussen GDF15 en symptoom-ernst verder af te lijnen, onderzochten we de correlatie tussen de waarden van circulerend GDF15 en een reeks zelf-gerapporteerde uitkomsten bij onze patiënten en controles. Deze omvatten de vermoeidheid-ernst schaal (FSS), analoge pijn-schaal, en de genormaliseerde lichamelijke en mentale opgetelde scores van het SF-36v2™ instrument. De FSS-scores variëren van 9 (geen vermoeidheid) tot 63 (zeer ernstige vermoeidheid). De analoge pijn-schaal beslaat scores tussen 0 en 100, waarbij ‘0’ staat voor afwezigheid van symptomen en ‘100’ voor extreme pijn. Wat betreft de opgetelde scores van de SF-36v2™: hoe lager de genormaliseerde scores, hoe slechter de levenskwaliteit (lichamelijke en mentale domeinen). [] Er was een directe correlatie tussen zowel vermoeidheid & pijn-intensiteit, en GDF15-concentraties in alle gevallen van M.E./CVS, MS en controles. Er was een omgekeerde relatie tussen lichamelijk welzijn en GDF15: een lagere score op de SF-36v2™ wijst op verminderde lichamelijke gezondheid. In deze [totale] groep zagen we geen significant verband tussen GDF15 en de opgetelde score van de SF-36v2™ mentale gezondheid. [] Wat betreft de impact van veranderingen qua GDF15-waarden op de ernst-scores van de symptomen: bij de M.E./CVS-deelnemers zagen we een [significant] directe correlatie tussen vermoeidheid en GDF15-waarden.

Bespreking

GDF15 werd initieel geïsoleerd als een transcript geproduceerd door geaktiveerde macrofagen, coderend voor een proteïne dat enige homologie vertoont met de transformerende groei-factor beta (TGFβ) superfamilie. Verhoogde waarden circulerend GDF15 werden gezien na fysieke aktiviteit en tijdens de zwangerschap (stijgingen tot zelfs 40 maal bij dit laatste). Toenames qua GDF15 blijven niet beperkt tot deze fysiologische toestanden en gedurende de 20 jaar sinds z’n ontdekking, werden stijgingen van het peptide gerapporteerd bij een waaier aan pathologische aandoeningen (inclusief veroudering, hart-falen, chronische nier-ziekte, mitochondriale ziekte en kwaadaardigheid). Het was echter de identificatie van GFRAL, een transmembraan-receptor in de achterste hersenen, als vermoedelijk doelwit voor GDF15 en mediator van z’n gewicht-verlagende effekten bij knaagdieren, dat GDF15 kaderde als een mogelijke anti-obesitas behandeling.

Naar gelang het bestuderen van de gewicht-verlagende effekten van GDF15 verder ging, was het intrigerend om te zien dat GDF15 niet wordt gereguleerd door nutritionele stimuli waarvan is geweten dat ze andere hormonen (geïmpliceerd bij de energie-homeostase) beïnvloeden. Dit suggereert dat GDF15 niet voor dit biologisch doel is geëvolueerd. Het spectrum aandoeningen waarvan werd gerapporteerd dat ze geassocieerd zijn met stijgingen van GDF15 delen een rode draad van cellulaire stress, wat de mogelijkheid opwerpt dat GDF15 geëvolueerd kan zijn als deel van een stress-respons signaal dat de energie-balans zou kunnen beïnvloeden. Inzichten omtrent de rol van GDF15 als signaal van cellulaire stress werden ondersteund door de studie van aandoeningen van de mitochondriale funktie. Een studie door Zuid-Koreaanse onderzoekers illustreerde dat bij muizen met een spier-specifieke ‘knock-out’ [met uitgeschakeld gen] voor crif1 [GADD45GIP1, ‘Growth arrest and DNA-damage-inducible proteins-interacting protein 1’], een proteïne dat een geheel vormt met de mito-ribosomale subunit 39S [mitochondriaal ribosoom: proteïnen-complex aktief in mitochondrieën betrokken bij de vertaling van mitochondriale mRNAs gecodeerd door het mtDNA], [] verhoogde GDF15-expressie medieert []. Zo ook reageert, in vitro, GDF15-expressie op aktivatie van de geïntegreerde stress-respons (IRS), een adaptieve respons op een stressvolle stimulus in eukaryote cellen [eukaryoten = cellen met een echte kern die het DNA bevat en door een membraan omlijnd is]. Duidelijk verhoogde waarden van circulerend GDF15 werden gerapporteerd bij een reeks erfelijke mitochondriale ziekten. De klaarblijkelijke symptoom-overlap tussen patiënten met M.E./CVS en met mitochondriale aandoeningen heeft discussie gegenereerd omtrent de mogelijkheid van een gedeelde pathofysiologie tussen deze aandoeningen [Fulle S et al. Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis. J Muscle Res Cell Motil. (2007) 28: 355-62]. Gezien GDF15’s potentieel als een nieuwe merker voor mitochondriale dysfunktie, hypothiseerden we dat het een biomerker voor mitochondriale stress bij M.E./CVS kan vertegenwoordigen.

Onze analyse omvatte zowel gezonde controle-individuen als een groep patiënten met de diagnose van Multipele Sclerose. De observatie dat GDF15-metingen niet significant veranderen na follow-up van patiënten met M.E./CVS verzekert ons van z’n waarde als een potentiële biomerker. Het is interessant dat we in de subgroep van deelnemers met MS zagen dat GDF15 significant steeg t.o.v. ‘baseline’. De GDF15-waarden zijn significant verhoogd in een groep patiënten met ernstige M.E./CVS bij vergelijking met een groep gezonde controles. De observatie dat GDF15-waarden verband houden met ernstige, eerder dan milde/matige, ziekte wijst op een verband tussen de ernst van M.E./CVS en GDF15. Deze bevindingen zijn een afspiegeling van de studie bij primaire mitochondriale aandoeningen: Japanse researchers toonden een positieve correlatie tussen GDF15 en de ‘Japanese Mitochondrial Disease Rating Scale’ en de ‘Newcastle Mitochondrial Scale for Adults’ [Yatsuga S et al. Growth differentiation factor 15 as a useful biomarker for mitochondrial disorders. Ann Neurol. (2015) 78: 814-23], wat semi-kwantitatieve klinische beoordeling-schalen zijn. In het geval van onze M.E./CVS studie-groep vertoonde de vermoeidheid-ernst schaal correlatie met GDF15-waarden. Deze bevindingen bieden verdere ondersteuning voor een rol van GDF15 als merker voor de ernst van de symptomen bij M.E./CVS.

Het is echter belangrijk om op te merken dat, in tegenstelling tot de geobserveerde waarden bij primaire stoornissen van de mitochondriale funktie, de gemiddelde GDF15-waarden die werden gemeten in onze M.E./CVS-groep vele keren lager liggen. Dit is niet verrassend gezien de wijdverspreide mitochondriale dysfunktie die wordt gezien bij aandoeningen zoals Leigh’s syndroom [neurologische afwijking omschreven als sub-acute necrotiserende encefalopathie; de hersencellen worden aangetast omdat ze niet genoeg energie krijgen] maar het suggereert dat significante verstoring van de mitochondriale funktie wellicht niet zo’n prominent kenmerk van M.E./CVS is. Aanrijking voor pathogene mutaties in het mitochondriaal DNA werd dan ook niet gezien bij patiënten met M.E./CVS [Schoeman EM, Newton JL et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Med Genet. (2017) 18: 29]. Er zijn echter een aantal tegenstrijdige meldingen betreffende het verband tussen mitochondriale dysfunktie en ziekte-ernst bij M.E./CVS [zie Tomas C, Newton J hierboven]. We verwachten dat het opduiken van GDF15 als een biomerker voor mitochondriale dysfunktie, de inspanning om dit verband te bestuderen zal ondersteunen.

Bij M.E./CVS is het niet duidelijk welk weefsel of weefsels bijdragen aan de gestegen GDF15-waarden die werden vastgesteld bij ernstige ziekte. We weten dat bij mensen GDF15 tot expressie komt verscheidene weefsels, waarbij die het hoogst is in de lever, nieren, prostaat, colon, vet-weefsel en placenta. Interessant: GDF15 of MIC-1 [‘macrophage inhibitory factor 1’] werd initieel gekloond uit een macrofagen cel-lijn. Sweetman E et al. [Changes in the transcriptome of circulating immune cells of a New Zealand cohort with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. (2019) 33] rapporteerden echter geen significante verandering qua GDF15-transcriptie in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We hebben bij primaire mitochondriale stoornissen geassocieerd met duidelijke myopathie gezien dat GDF15-expressie massief ge-upreguleerd is in skelet-spieren en dit is geassocieerd met een toename qua circulerende waarden. Er bestaan echter geen rapporten over GDF15-expressie in spieren of andere weefsels van mensen met M.E./CVS. Er is verder onderzoek vereist om de bron te bepalen van het gestegen circulerend GDF15 dat wordt gezien in een subgroep of M.E./CVS-patiënten.

Tot hier toe hebben we GDF15 beschouwd als een potentiële biomerker bij M.E./CVS, eerder dan een bijdragende factor tot de symptomatologie die bij deze groep wordt gezien. Vermoeidheid wordt frequent gerapporteerd bij de aandoeningen geassocieerd met verhoogd GDF15, hoewel het verband tussen vermoeidheid en deze ziekte-toestanden en GDF15 niet formeel werd bestudeerd bij mensen. Er werd gedaalde locomotor-aktiviteit gerapporteerd bij transgene muizen met een over-expressie van GDF15 en ‘wild-type’ dieren blootgesteld aan farmacologische dosissen van het peptide. De reden voor de gedaald aktiviteit werd niet opgehelderd. Er wordt echter gespeculeerd dat dit een weerspiegeling kan zijn van verminderd voedsel-zoekend gedrag. Bij mensen zal het begrijpen of GDF15 bijdraagt tot de vermoeidheid-symptomen of eenvoudigweg een circulerende merker is voor het onderliggend ziekte-proces, verdere studies vereisen. Na verloop van tijd kan de toediening van GDF15 aan mensen en/of farmacologische manipulatie van de GDF15/GFRAL-as bij specifieke ziekten die toename van GDF15 kunnen geven, echter waardevol inzicht bieden omtrent de bijdrage van GDF15 aan vermoeidheid-symptomen. Bij M.E./CVS is de biologische relevantie van de circulerende waarden van GDF15 die we hebben gezien nog onduidelijk.

Besluiten

We hebben aangetoond dat in rust het circulerend GDF15 verhoogd is bij patiënten met ernstige M.E./CVS en dat de waarden van GDF15 stabiel blijven voor een periode van maanden. Verdere studies zijn vereist om de weefsel(s) vast te stellen die bijdragen tot de stijgingen van GDF15, en het mechanisme waarmee het verhoogd is bij M.E./CVS. Het zal ook belangrijk zijn na te gaan of een stijging qua GDF15-waarden kan bijdragen tot de symptomatologie van M.E./CVS, zelfs al is het maar bij een subgroep patiënten.

Volgende pagina »

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.