M.E.(cvs)-wetenschap

augustus 2, 2019

Post-exertionele malaise is geassocieerd met hypermetabolisme, hypoacetylering & purine-metabolisme ontregeling bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 5:51 pm
Tags: , , , , , , , , ,

Het mag nu wel duidelijk zijn dat er bij M.E.(cvs) sprake is van een probleem met de cellulaire energie-voorziening/produktie. De voorbije jaren zijn er meerdere rapporten geweest over een verstoord metabolisme. Het werk van de Australische metaboloom-specialisten Prof. Neil McGregor & Christopher Armstrong kwam hier dan ook al meermaals ter sprake.

Op het EMERGE 2019 ‘ME/CFS International Research Symposium’ kondigde McGregor onderstaande studie al aan. De bevindingen van McGregor suggereerden nogmaals dat glycolyse – de vroege stap in het proces van energie-produktie – bij M.E.(cvs) uit de hand loopt. Er zijn flink wat enzymen bij glycolyse betrokken dus er kan heel wat mis gaan. Hier wordt weer een stukje van de puzzel ontrafeld…

McGregor gelooft dat een chronische depletie van essentiële metabolieten een cruciale rol speelt bij M.E.(cvs) en aanleiding geeft tot post-exertionele malaise, inflammatie, enz. Het probleem bij de glycolyse zou verband kunnen houden met veranderingen in de acetylering, wat een effekt heeft op de DNA-transcriptie, resulterend in de brede en systemische problemen.

————————-

Diagnostics Vol 9, #3, p 70 (juli 2019)

Post-Exertional Malaise is associated with hypermetabolism, hypoacetylation and purine metabolism deregulation in M.E./CVS cases

Neil R. McGregor (1), Christopher W. Armstrong (2), Donald P. Lewis (3), Paul R. Gooley (2)

1 Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, Parkville VIC 3010, Australia

2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bio21 Molecular Science and Biochemistry Institute, 30 Flemington Road, Parkville VIC 3010, Australia

3 CFS Discovery, Donvale Medical Centre, Donvale VIC 3111, Australia

Samenvatting

Post-exertionele malaise (PEM) is een fundamenteel voorspellend symptoom voor de definitie van Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS). Als de patiënten zich te veel inspannen, ondervinden ze wat ‘payback’ wordt genoemd, resulterend in een verslechtering van de symptomen of een terugval die dagen, weken of zelfs maanden kan aanslepen. Het doel was het beoordelen van de veranderingen in de biochemie geassocieerd met de door de patiënten zelf-gerapporteerde PEM-scores over een periode van 7 dagen en de frequentie waarmee die worden gerapporteerd over een periode van of 12 maanden. 47 M.E./CVS-gevallen en voor leeftijd/geslacht gematchte controles werden klinisch onderzocht, vulden vragenlijsten in, werden onderworpen aan standaard serum-biochemie testen, en hun serum- en urine-metabolomen werden geanalyseerd in een observationele studie. 35 van de 46 M.E./CVS-patiënten rapporteerden PEM in de laatste 7 dagen en deze werden toegewezen aan de PEM-groep. De voornaamste biochemische verandering gerelateerd aan de PEM-ernst van deze 7 dagen was de daling van het purine-metaboliet, hypoxanthine. [purinen = bouwstenen, organische basen van DNA/RNA] Deze afname correleerde met wijzigingen van de glucose/lactaat-verhouding die zeer suggestief is voor een glycolytische anomalie. Verhoogde excretie van urine-metabolieten in de 7-daagse respons-periode geven een hyper-metabole gebeurtenis aan. Er werden stijgingen van de urine-excretie van methylhistidine (spier-proteïne afbraak), mannitol (ontregeling van de intestinale barrière) en acetaat opgemerkt bij het hyper-metabool voorval. Deze gegevens duiden er op dat hypo-acetylatie aan de gang was, wat ook gerelateerd kan zijn met ontregeling van meerdere cytoplasmatische enzymen en DNA-histoon regulering. [Histonen zijn specifieke eiwitten die samen met het DNA in de celkern het chromatine vormen. Een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt.] Deze bevindingen suggereren dat de primaire gebeurtenissen die gepaard gaan met PEM te wijten zijn aan hypo-acetylering [acetyleren = (enzymatisch) plaatsen van acetyl-groepen (O=C-CH3) op proteïnen; in het geval van histoon-eiwitten regelt dit de vertaling van DNA (dat rond de histonen is gewikkeld) naar RNA] en verlies van metabolieten tijdens de acute PEM-respons.

1. Inleiding

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een medisch onverklaarde aandoening die overwegend voorkomt bij vrouwen. Ze wordt gekenmerkt door persisterende of terugkerende vermoeidheid en veranderde responsen op inspanning, en wijzigingen in de normale slaap-struktuur. Post-exertionele malaise (PEM) komt 10,4 keer frequenter voor bij M.E./CVS-patiënten vergeleken controles [Brown A & Jason LA. Meta-analysis investigating post-exertional malaise between patients and controls. J. Health Psychol. (2018)]. Er is echter weinig bekend omtrent de onderliggende pathofysiologie van PEM.

Er werd gerapporteerd dat vrouwen met M.E./CVS biochemische veranderingen vertonen die consistent zijn met de ontregeling van glycolyse en ureum-cyclus aktiviteit [Armstrong CW et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-1639]; deze werden aangegeven door stijgingen van de nuchtere serum metaboloom glucose ‘s morgens vroeg en dalingen qua lactaat en acetaat. De ontregeling van de glycolyse op het niveau van pyruvaat-dehydrogenase werd door andere researchers bevestigd [Fluge O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376]. Deze ontregeling van de glycolyse resulteert in afnames qua acetaat en aktivatie van histoon-deacetylatering, alsook ontregeling van acetylering van cytoplasmatische en mitochondriale enzymen. Belangrijk: histoon-deacetylase 2 (HDAC2) bleek 4 maal hoger en HDAC3 2 maal hoger bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met controles [Jason L et al. Increased HDAC in association with decreased plasma cortisol in older adults with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav. Immun. (2011) 25: 1544-1547]. Ter verdere ondersteuning: een studie van gen-upregulering bij M.E./CVS-patiënten, na een inspanning-test, onthulde dat twee histoon-genen ge-upreguleerd waren [Whistler T et al. Exercise responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control subjects. BMC Physiol. (2005) 5: 5]. Analyse van HDAC binding-plaatsen binnen de genen van die studie, toonde dat 19 van de 20 ge-upreguleerde genen binding-plaatsen hadden voor HDAC1 & HDAC2 maar ook leden van de SMAD transcriptie-factor familie [intracellulaire proteïnen die signalen van buiten de cel overbrengen naar de cel-kern waar ze gen-transcriptie aktiveren] die het signaal overbrengen van de ‘transforming growth factor’ beta (TGF-β) receptor, – namelijk SMAD1, SMAD4 & SMAD5. De studie door Whistler et al. [zie hierboven] ondersteunt ook de hypothese dat wijzigingen qua acetylering kunnen optreden wanneer M.E./CVS-patiënten PEM hebben. Er werden ook anomalieën in TGF-β geïdentificeerd in enkele M.E./CVS-studies [bv. Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad Sci. USA (2017), 114: E7150-E7158; zie ook ‘TGF-β1 expressie in PBMCs bij CVS] maar niet bij alle. Geen enkele daarvan werden echter beoordeeld in funktie van PEM-aktiviteit. Deze gegevens duiden er op dat de verandering qua glycolyse bij M.E./CVS gerelateerd kan zijn met op z’n minst één of een combinatie van effekten: (1) histoon-deacetylering; (2) een chronische daling van de acetaat-produktie via glycolyse; (3) ontregeling van cytoplasmatische en mitochondriale enzyme acetylering.

Er werden ook dalingen van het purine-metaboliet, hypoxanthine, gevonden in de serum-metabolomen van vrouwen in ochtendlijke nuchtere stalen [zie Armstrong CW et al. hierboven] en die wezen mogelijks op reducties van de capaciteit om ATP aan te maken. Tijdens inspanning gebeurt de afgifte van hypoxanthine door spieren gedeeltelijk via een hyper-metabole gebeurtenis wanneer de waarden van mitochondriaal/cytoplasmatisch ATP dalen. De hyper-metabole gebeurtenis van de afgifte van metabolieten door de spieren gaat gepaard met inhibitie van proteïne-synthese in spieren op het moment dat de inspanning start. Die zelfde gebeurtenis treedt op in lymfocyten wanneer de glycolyse geïnhibeerd wordt. Hoewel er meerdere immune kwesties werden ontdekt bij M.E./CVS-patiënten, werd het onderliggende mechanisme achter de veranderingen nog niet geïdentificeerd. Aktivatie van glycolyse en histoon-acetylering zijn essentiële stappen bij in immuun-aktivatie, in het bijzonder voor T-cellen en NK-cellen. Een interessante studie [niet specifiek over M.E.(cvs)] met lymfocyten toonde dat wanneer de ATP-waarden daalden na inhibitie van de glycolyse en de adenosine afbraak-produkten stegen, het inbouwen van leucine [aminozuur] in proteïnen dramatisch werd geïnhibeerd. Dus: de immuunsysteem-kwesties bij M.E./CVS kunnen het resultaat zijn van glycolyse- en acetylering-ontregeling, resulterend in een verminderd vermogen om DNA te vertalen naar proteïnen en daardoor proteïne-synthese. Er is ook bewijsmateriaal dat een switch aangeeft naar het gebruiken van vertakte-keten aminozuren als energiebron, bijzonderlijk tijdens uitputtende omstandigheden [Georgiades E et al. Chronic Fatigue Syndrome: New evidence for a central fatigue disorder. Clin. Sci. (2003) 105, 213-218].

Acetaat [zout of ester van azijnzuur] wordt geassocieerd met controle van meerdere enzymen binnenin de cel, die cruciaal kunnen zijn voor de biochemische veranderingen bij M.E./CVS. Er werden in het totaal of 1.750 cellulaire proteïnen geïdentificeerd met het kenmerk acetaat te binden en de proteïne-funktie te wijzigen; deze omvatten DNA-replicatie (52 proteïnen), DNA-herstel (72 proteïnen), cel-cyclus omschakeling (132 proteïnen), nucleotide uitwisseling factoren (55 proteïnen), en acetylering en deacetylering (21 proteïnen). De biochemie van deze door acetaat gereguleerde gebeurtenissen kan secundair zijn aan de afname van acetaat maar hebben waarschijnlijk diepgaande effekten op de cellulaire funktie bij M.E./CVS.

De doelstelling voor dit artikel was het beoordelen van de 7-dagen PEM-ernst en 12-maanden symptoom-frequentie scores, en gerelateerde biochemie (bloed & urine) bij M.E./CVS-patiënten en controles. Verbanden tussen de PEM-scores werden onderzocht gebruikmakend van standaard serum-biochemie, beoordeling van 24uurs urine, en een bloed- en urine-metaboloom.

2. Methodes

Er werden 46 M.E./CVS-patiënten en 26 individuen voor leeftijd en geslacht gematcht, zonder vermoeidheid gerecruteerd. […] De M.E./CVS-groep had de diagnose gekregen op basis van de Canadese richtlijnen en bijbehorende exclusie-criteria. De ‘Depression Anxiety Stress assessment’ (DASS) werd gebruikt ter beoordeling van de psychiatrische co-morbiditeit. […]

2.1. Klinische metingen

De individuen ondergingen een volledig klinisch onderzoek […] criteria voor de Canadese M.E./CVS-richtlijnen. Ze vulden allemaal meerdere vragenlijsten in. […]

2.2. Biochemie

[…] Bloedafname voor standaard serum-biochemie […] of een metaboloom. Tweede urine-staal na het opstaan […]. Binnen 6 h bloedstaal […] opslag -80 °C […] voor NMR-analyse […]. Er werden 29 metabolieten per serum-staal en 30 per urine-staal geïdentificeerd.

2.3. Data-analyse

De metaboloom-gegevens werden voorbereid in µM en als % (metaboliet-concentratie gedeeld door totale concentratie of metabolieten in elk staal). […]

3. Resultaten

3.1. Demografie

Om de PEM biochemie te onderzoeken, kozen we voor een opdeling van de M.E./CVS-groep op basis van aan-/afwezigheid van significante PEM-responsen gedurende de laatste 7 dagen (PEM, NoPEM – d.w.z. degenen zonder huidige symptomen, controles (C)). […] Er werden geen verschillen gevonden voor plotse vs graduele aanvang of triggers bij aanvang (bv. infekties) (significantie p < 0.01). […] Los va de PEM-scores waren er geen verschillen qua symptoom-profielen tussen de NoPEM- en PEM-groepen. Beiden groepen vertoonden hogere scores t.o.v. controles.

3.2. Biochemie

[…] De M.E./CVS-groepen hadden significante dalingen qua serum-hypoxanthine (NoPEM 4,4 maal lager, PEM 2,4 maal lager vs controles), serum-lactaat (NoPEM 1,9 maal lager, PEM 1,6 maal lager vs controles), fenylalanine [aminozuur] (zowel NoPEM als PEM 1,3 maal lager vs controles). Glucose was gestegen bij de M.E./CVS-patiënten (zowel NoPEM als PEM 1,2 maal hoger vs controles). In de urine was de daling van acetaat het grootst (NoPEM 2,5 maal lager, PEM 1,5 5 maal lager vs controles) en dit was statistisch verschillend tussen de NoPEM- and PEM-subgroepen (p < 0.01). De excretie van methylhistidine was hoger in de PEM-subgroep (1,6 maal) en controle-groep (1,3 maal), respectievelijk, vergeleken met de NoPEM-subgroep. In het faecaal metaboloom was het % butyraat [boterzuur; een neven-produkt van fermentatie met een voordelige impact op de werking van de intestinale barrière en anti-inflammatoire effekten] verhoogd in de NoPEM-groep vergeleken met zowel de PEM- als controle-groep. […]

[…] Uit de correlatie-analyse van de totale groep bleek dat de 7-dagen PEM score en 12-maanden frequentie van PEM scores positief gecorreleerd waren met serum-glucose en negatief gecorreleerd met hypoxanthine, fenylalanine, lactaat en threonine. […] De absolute urine-waarden toonden een significante correlatie tussen de 7-dagen PEM score met mannitol, serine, acetaat, methylhistidine en glucose. De 12-maanden frequentie van PEM correleerde enkel met een afname qua acetaat. De gegevens omtrent urine-percentage toonden afnames qua ureum, pyruvaat en acetaat met zowel de 7-dagen PEM ernst als 12-maanden frequentie scores. De enige faecale component die statistische significantie bereikte, was het percentage uracil [RNA-base]. Deze gegevens tonen dat een significante renale concentrering kwestie speelt bij de M.E./CVS-groep tijdens een PEM-gebeurtenis en dit was hoofdzakelijk gerelateerd met afnames qua ureum en acetaat. Om dit na te gaan, berekenden we de serum/urine-verhoudingen van meerdere metabolieten. De 7-dagen PEM van PEM correleerde met de volgende verhoudingen: serum-acetaat/urine-acetaat (r = -0.44, p < 0.002), serum-tyrosine/urine-tyrosine (r = -0.40, p < 0.006), serum-serine/urine-serine (r = -0.39, p < 0.008), serum-creatine/urine-creatine (r = -0.38, p < 0.009) en serum-leucine/urine-leucine (r = -0.37, p < 0.01). Dus: de 7-dagen ernst van PEM was geassocieerd met een gestegen urinaire excretie van metabolieten in de M.E./CVS-groep en dit was geassocieerd met een reductie van meerdere serum-metabolieten inclusief het belangrijk proteïne-synthese regulerend aminozuur leucine.

De serum glucose/lactaat verhouding is zeer vergelijkbaar met de veranderingen in de urine glucose/lactaat verhouding, die consistent is met de verandering die wordt gezien in de serum-acetaat/urine-acetaat verhouding. Dit suggereert dat de serum en urine veranderingen zeer vergelijkbaar zijn. Het beschikbaar acetaat in het serum lijkt dus significant gereduceerd en is het laagst bij de NoPEM-patiënten.

3.3. Purine-metabolisme veranderingen

Aangezien serum-hypoxanthine de voornaamste voorspellende variabele voor wijzigingen van de PEM-scores was, beoordeelden we de verbanden tussen serum-hypoxanthine en de purine-gerelateerde metabolieten. Serum- en urine-hypoxanthine waren lager in de PEM-subgroep vs controles. Hoewel er geen verschil was qua serum-uraat waarden, was de merker voor purine-degradatie in de lever, de serum hypoxanthine/uraat verhouding lager in de M.E./CVS-groep. De verhouding in de NoPEM-subgroep was 5,4 maal lager terwijl in de PEM-groep ze 3,5 maal lager lag. De hypoxanthine/uraat verhouding was negatief gecorreleerd met serum-glucose (p < 0.001), en positief gecorreleerd met serum-lactaat (p < 0.001), de purine-ring precursor aminozuren (p < 0.001), acetaat (p < 0.001) en de totale serum aminozuren (p < 0.006). De correlatie tussen serum-hypoxanthine en de purine-ring precursoren, indicatief voor purine-synthese, was niet verschillend tussen de M.E./CVS-patiënten en de controles […]. De verhouding was echter was significant lager in de M.E./CVS-groep en de purine-ring precursor aminozuren correleerden positief met serum-acetaat (p < 0.001). Zodoende waren de synthese en mogelijks hergebruik van hypoxanthine gereduceerd terwijl purine-afbraak binnen de normale grenzen lag. De waarden van hypoxanthine in het serum waren geassocieerd met de beschikbaarheid van de purine-ring precursoren, de glucose/lactaat verhouding en acetaat. Dit suggereert dat acetylering een belangrijke factor voor de verandering in het purine-metabolisme ontregeling bij M.E./CVS is. De toename van het verlies qua urine-metabolieten tijdens inspanning bij M.E./CVS-patiënten resulteert dus in een verlies van purine-ring precursoren en een daling qua acetaat en hypoxanthine.

4. Bespreking

Dit artikel identificeerde dat de post-exertionele malaise die wordt ervaren door een Australische groep M.E./CVS-patiënten, geassocieerd is met een ontregeling van het purine-metabolisme en lage acetaat-concetraties. Deze ontregeling van het purine-metabolisme gaat gepaard met een wijziging qua glycolytische aktiviteit en een omschakeling naar de ureum-cyclus creatine-fosfaat energie-verbruik [zie Armstrong CW et al. hierboven]. Dit heeft het effekt van het reduceren van de beschikbaarheid van acetaat en upregulering van de histoon-deacetylase aktiviteit. Een 4- en 2-voudige toename van HDAC2 & HDAC3, respectievelijk, werden bevestigd bij M.E./CVS [zie Jason L et al. hierboven], en een zeer hoge waarde van HDAC1 & HDAC2 binding-plaatsen treedt op in de genen die ge-upreguleerd zijn bij M.E./CVS na inspanning [zie Whistler T et al. hierboven]. Hypoxanthine-fosforibosyltransferase is een belangrijk enzyme voor het hergebruik van purinen, adenosine en guanine. Het coderend gen (HPRT1) ligt op het X-chromosoom en geeft aanleiding tot een ongewoon probleem qua regulering. Acetylering en methylatie van één X-chromosom leggen de aktiviteit bij vrouwen stil, wat resulteert in het feit dat slechts één X-chromosoom aktief is voor transcriptie, zoals bij mannen. Dit vormt een mogelijks belangrijk probleem als er een verlies is wat betreft het stilleggen van het tweede X-chromosoom. Deze studie omvatte te weinig mannen om dit behoorlijk te kunnen beoordelen. Ontregeling van het stilleggen van een of X-chromosoom kan gerelateerd zijn met de daling qua hypoxanthine-hergebruik en het feit dat vrouwen ernstiger ziek zijn dan mannen [zie Brown A & Jason LA. hierboven]. Studies om deze interessante mogelijkheid te onderzoeken, zijn gerechtvaardigd.

Er is verhoogde urine-excretie van metabolieten geassocieerd met de 7-dagen PEM scores, in het bijzonder van mannitol, methylhistidine, acetaat en glucose. Deze gestegen metabolieten-uitscheiding correleert met de door M.E./CVS-patiënten gerapporteerde 7-dagen ernst van PEM-symptomen. De beoordeling van de relatieve hoeveelheid toont dat de uitstroom van metabolieten geassocieerd is met dalingen qua urinair ureum, pyruvaat en acetaat, suggestief voor een energie- en renale concentrering -kwestie, mogelijks geassocieerd met hypo-acetylering, die hoogstwaarschijnlijk optreedt op het tijdstip van het metabolieten-verlies. Bij diabetische nefropathie [langdurig verhoogde glucose-waarden zijn nefast voor de filter-funktie van de nieren], zorgen de renale tubulaire cellen [tubuli = nierbuisjes, onderdelen van de nefronen (filter-eenheden)] voor upregulering van de glycolyse en lactaat-produktie. Dit zou ook het geval kunnen zijn bij deze studie, aangezien de uitscheiding van glucose & acetaat positief gecorreleerd waren met 7-dagen PEM-ernst. Belangrijk: acetaat was negatief gecorreleerd met de 12-maanden frequentie van PEM. Deze wijziging qua renale retentie [al dan niet uitscheiding via de nieren] van acetaat wordt ook ondersteund door de negatieve correlatie tussen de 7-dagen PEM score en de serum-acetaat/urine-acetaat verhouding. Dus: hoe hoger de frequentie aan PEM-gebeurtenissen, hoe groter het verlies aan acetaat. Renale glomerulaire podocyten [glomeruli = groepje capillairen die zorgen voor filtratie van het bloed in de nieren; podocyten = cellen met uitsteeksels die tussenliggende poriën open laten] raken beschadigd door verhogingen van het bloed-glucose bij diabetes-patiënten en dit werd gelinkt aan deacetylering van nefrine [proteïne dat een belangrijk bestanddeel vormt van de filtratie-spleten] en microRNA-aktiviteit. In deze studie lijkt de reductie qua serum-acetaat te resulteren in een conditionele renale hypo-acetylering die verhoogd metabolieten-verlies via de nieren zal toelaten. Renale veranderingen bij diabetes nefropathie gaan ook gepaard met downregulering van beender morfogeen proteïne (BMP [BMP’s = subgroep van de ‘transforming growth factor’s; signaal-molekulen die weefsel-architectuur dirigeren]) receptor funktie en TGF-β gemedieerde transcriptie-factor produktie, en het aanvoeren van BMP-7 herstelt de werking. Hoewel de renale veranderingen gelijkaardig zijn met deze die worden gezien bij centrale diabetes insipidus [stoornis in de produktie van anti-diuretisch hormoon door de hypofyse waardoor het lichaam teveel water gaan verliezen via de urine], proteïne-calorie restrictie en infektie/inflammatoir-gemedieerde gebeurtenissen, waren er geen individuen met diabetes insipidus of met proteïne-calorie restrictie, en ze hadden allemaal een gemiddeld BMI. Deze renale veranderingen bieden bijkomende ondersteuning voor ofwel een inflammatoire oorsprong of mogelijks een energie/acetylering of zelfs een transcriptie-factor probleem. Belangrijk: meerdere studies vonden dat de niveaus van serum-cytokinen niet significant verschillen tussen M.E./CVS en controles, en niet correleren met symptoom-expressie. Daarom zijn studies ter beoordeling van de aktiviteiten van HDAC en BMP transcriptie-factoren bij M.E./CVS aangewezen.

De verandering qua renaal metabolieten-verlies is geassocieerd met gestegen mannitol-excretie, wat suggereert dat een probleem met de gastro-intestinale barrière zou kunnen optreden. NoPEM M.E./CVS-patiënten hadden een 3,2 maal lager urinair mannitol [een suiker-alkohol], anders dan wat wordt gezien bij Multipele Sclerose patiënten. De waarde van urinair mannitol steeg echter met de 7-dagen PEM-scores. Deze toename van mannitol geeft een mogelijke verandering van de intestinale barrière aan, wat consistent is met de bevinding van bakteriemie [aanwezigheid van bakteriën in de bloedbaan] na inspanning bij M.E./CVS [Shukla SK et al. Changes in Gut and Plasma Microbiome following Exercise Challenge in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). PLoS ONE (2015) 10: e0145453]. De aanwezigheid van bakteremie wordt ondersteund door de correlatie tussen faecaal uracil en de 7-dagen PEM-score. De stijging qua faecaal uracil was ook gecorreleerd met de serum-hypoxanthine waarde in de PEM-groep, die aantoont dat ze samen stegen als onderdeel van de PEM-geassocieerde hyper-metabole gebeurtenis. Uracil is een afbraak-produkt van RNA maar kan ook van bakteriële oorsprong zijn. Of dit een afbraak in enterocyten [darmcellen] aangeeft of een wijziging in de faecale flora of hun metabotoxinen/toxinen, is niet geweten. Verder onderzoek van deze veranderingen is gewenst.

Er werd ook een toename van 1,6 maal gezien qua urinaire excretie van methylhistidine bij de PEM-subgroep vergeleken met de NoPEM-subgroep. Methylhistidine is een afbraak-produkt van spier-samentrekking proteïnen, volgend op een kortdurende weerstand-inspanning. De synthese van spier-proteïnen wordt gecontroleerd door het beschikbaar leucine & fenylalanine [aminozuren], en door BMP proteïne receptor aktiviteit. In deze studie was urinair methylhistidine positief gecorreleerd met urinair creatine (p < 0.001), leucine (p < 0.001), fenylalanine (p < 0.001) & acetaat (r = +0.47, p < 0.001) voor alle groepen. Een daling qua beschikbaar acetaat tijdens inspanning is geassocieerd met een vermindering qua fosfocreatine-afbraak en is daardoor geassocieerd met verhoogd fosfocreatine [creatine-fosfaat; een gefosforyleerde creatine-molekule die een belangrijke energie-voorraad in spieren en in de hersenen vertegenwoordigt] en mitochondriale energie-voorziening, wat consistent is met de glycolyse/ureum-cyclus energie omschakeling die bij deze M.E./CVS-groep werd geïdentificeerd [zie Armstrong CW et al. hierboven]. Interessant: 3-methylhistidine in niet-geacetyleerde vorm wordt veel meer uitgescheiden wanneer ratten worden blootgesteld aan bakteriële lipopolysacchariden. Het is waarschijnlijk dat de toegenomen excretie van 3-methylhistidine, die we zagen tijdens de 7-dagen PEM-respons, het resultaat is van de verminderde energie-voorziening en de afname van aminozuren, die gemedieerd kan zijn door acetylering. De respons zou echter ook kunnen worden verslechterd door anomalieën van de gastro-intestinale barrière die wordt gesuggereerd door de gestegen bakteremie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten [zie Shukla SK et al. hierboven]. Een alternatief: er kan ook een anomalie in de BMP-regulering betrokken zijn bij de verhoogde uitscheiding van 3-methylhistidine. Dus: een combinatie van minstens drie verschillende gebeurtenissen kan bijdragen tot de gestegen 3-methylhistidine excretie en dit kan worden weerspiegeld in verschillende genetische vatbaarheden binnen verschillende individuen.

De bevindingen dat de PEM geassocieerd is met een verlies aan metabolieten, daling van de acetylering, ontregeling van het purine-metabolisme, verhoogde afbraak van spier-samentrekking proteïnen en bakteremie geassocieerd met inspanning, suggereert dat behandeling zoals graduele inspanning meer schadelijk dan nuttig (wat in sommige studies wordt geclaimd) zijn. Tot het moment dat deze biologische veranderingen verder kunnen worden onderzocht, zou het gebruik van graduele inspanning als therapie voor mensen met een ernstige vorm van M.E./CVS als potentieel schadelijk worden beschouwd. Ter ondersteuning hiervan: het gebruik van graduele inspanning therapie heeft significant protest uitgelokt vanwege M.E./CVS-patiënten die het als nadelig ervaren [zie bv. Geraghty KJ. & Blease C. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome and the biopsychosocial model: A review of patient harm and distress in the medical encounter. Disabil. Rehabil. (2018) 1-10].

Deze studie werd opgezet om metabole veranderingen te onderzoeken bij M.E./CVS-individuen op basis van een ontdekking-hypothese en niet een specifieke hypothese-gestuurde methode om specifieke biochemische gebeurtenissen te beoordelen. De studie, met deze beperkingen, resulteerde in de ontwikkeling van een hypothese die nu dient te worden nagegaan via een typisch hypothese-gestuurd proces. Hoewel de grootte van de studie-groep klein is, reproduceerde het toch eerdere bevindingen maar die dienen te worden bevestigd bij een grotere groep of via meerdere centra. Het gebruik van zelf-gerapporteerde symptomen kan een herinnering-bias introduceren bij de individuen subjects en in een grotere studie moet elke van de variabelen waarvan wordt gevonden dat ze geassocieerd zijn met de ernst van de symptomen (en de verdeling ervan) worden geëvalueerd via andere methodes. Studies die acetylering en z’n gerelateerde DNA-transcriptie veranderingen, en de wijziging van cytosol enzyme-aktiviteit onderzoeken, zouden moeten toelaten meer kennis te krijgen omtrent de mechanismen van het ontstaan van PEM en geschikte therapieën te vinden op basis van de onderliggende biochemie.

5. Besluiten

Deze studie onthulde dat post-exertionele malaise geassocieerd is met veranderingen in glycolyse en acetylering bij M.E./CVS. Deze wijzigingen zijn consistent met een toestand van hypo-acetylering en veranderen waarschijnlijk op een significante manier de histoon-acetylering, en de werking van acetylering en deacetylering bij het controleren van cellulaire enzymatische gebeurtenissen. Gedegen ontworpen studies die deze belangrijke factoren evalueren, zijn aangewezen.

Advertenties

maart 30, 2019

Mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen bij CVS

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 9:09 am
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome’ uit 2017 (zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’), waar werd aangetoond dat er statistisch significante verschillen zijn in het bio-energetisch profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen van M.E.(cvs)-patiënten t.o.v. controles. Wanneer deze cellen fysiologische stress ondervinden, blijken ze minder capabel om hun respiratie (mitochondriale ademhaling) te verhogen om de stijgende stress te compenseren en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften.

In het huiding artikel (studie gefinancierd door van de ‘Medical Research Council’, ‘Action for ME’, ‘ME research UK’ & de ‘ME Association’) probeerden de onderzoekers na te gaan waaraan de mitochondriale dysfunktie zou kunnen gelegen zijn, door te kijken hoe ’t is gesteld met de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten in dezelfde soort cellen (waar de mitochondrieën direct bereikbaar zijn gemaakt) en in ‘voorlopers van spiercellen’.

Ter herinnering: Oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie. Het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen (I t/m V) gelokaliseerd in het mitochondriaal binnenste membraan: Complex I: NADH/ubiquinon oxidoreductase – krijgt elektronen van NADH en geeft deze door aan co-enzyme Q10 (ubiquinon); elektronen worden verder doorgegeven aan Complex II: succinaat-degydregenase, Complex III: ubiquinol/ferrocytochroom-c oxidoreductase en Complex IV: cytochroom-c oxidase – ze reageren met zuurstof en vormen water; en Complex V: proton-transporterend ATPase gebruikt de protonen om ATP te vormen.

Het lijkt er op dat de mitochondriale dysfunktie bij M.E.(cvs) (waar de al eerder over rapporteerden – zie bv. M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte en elders) te wijten is aan verstoorde cellulaire mechanismen ‘upstream’ (stroomopwaarts) van de werking van de mitochondrieën, m.a.w. niet de mitochondrieën zelf maar systemen die ze sturen zouden zijn aangetast…

—————

PeerJ Vol 7, paper e6500 (March 2019)

Mitochondrial complex activity in permeabilised cells of Chronic Fatigue Syndrome patients using two cell types

Cara Tomas (1), Audrey E. Brown (1), Julia L. Newton (1,2), Joanna L. Elson (3,4)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne Hospitals, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Centre for Human Metabonomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Er werden eerder abnormaliteiten qua mitochondriale funktie bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) aangetoond, wat impliceert dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. Deze studie bouwt verder op eerder werk dat aantoonde dat mitochondriale ademhaling parameters verstoord zijn in cellen van CVS-patiënten en dit via het onderzoeken van de aktiviteit van individuele complexen van de mitochondriale respiratoire keten. Er werden twee verschillende cel-types gebruikt in deze studies, om de aktiviteit te bepalen van individuele complexen lokaal – in skeletspier (myotubes [zich ontwikkelende skeletspier-vezels]) (n = 6) – en systemisch – perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) – bij controles (n = 6) en CVS (n = 13). De aktiviteiten van complex-I, -II & -IV, en respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie en glutaminolyse [reeks biochemische reakties waarbij het aminozuur glutamine wordt omgezet naar o.a. pyruvaat/lactaat] werden gemeten gebruikmakend van extracellulaire flux analyse. De cellen werden doorlaatbaar gemaakt, en er werden voor de bepalingen combinaties van substraten en inhibitoren toegvoegd om toe te laten de toestand van de mitochondriale respiratie na te gaan en de aktiviteit van specifieke aspecten van de respiratoire aktiviteit te meten. De resultaten toonden geen significante verschillen qua individuele mitochondriale complexen aktiviteit of respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie of glutaminolyse tussen groepen gezonde controles en CVS-patiënten, noch voor skeletspier (p ≥ 0.190) of PBMCs (p ≥ 0.065). Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse [flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex] aanwendt om de aktiviteit van individuele mitochondriale complexen te onderzoeken in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. De afwezigheid van verschillen qua complex-aktiviteit in CVS PBMCs suggereert dat de eerder geobserveerde mitochondriale dysfunktie in totale PBMCs te wijten is aan oorzaken ‘upstream’ van de mitochondriale admhaling-keten.

INLEIDING

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook gekend als Myalgische Encefalomyelitis (M.E.), is een uitputtende ziekte die 0,2-0,4% van de bevolking in het V.K. aantast. CVS heeft een significante impact op de levenskwaliteit van patiënten met symptomen zoals ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. De mechanismen achter de etiopathogenese van CVS moeten nog opgehelderd worden. Het gebrek aan kennis omtrent de mechanismen achter de ziekte draagt bij tot de moeilijkheden bij het vormen van een consensus aangaande diagnostische criteria en de ontwikkeling van doeltreffende behandelingen.

Er werden eerder verscheidene aspecten van mitochondriale dysfunktie gepostuleerd als bijdragende factor tot CVS [referenties beschikbaar]. Vermoeidheid bleek courant bij patiënten met primaire mitochondriale ziekte maar er dient echter te worden opgemerkt dat patiënten met CVS geen primaire mitochondriale mutaties dragen [Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18: 29]. Andere onderzoekers toonden dat bepaalde wijzigingen in het mitochondriaal genoom de kans vergroten op specifieke symptomen bij CVS-patiënten (gastro-intestinale, neurologische en inflammatoire) [Billing-Ross P, Hanson MR et al. Mitochondrial DNA Variants Correlate with Symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome’’. Journal of Translational Medicine (2016) 14: 19]; deze genomische veranderingen maken de patiënten echter niet vatbaarder voor het ontwikkelen van de ziekte. Eerdere studies hebben aangetoond dat de energie-produktie, inclusief mitochondriale aktiviteit, van totale PBMCs van CVS-patiënten significant verstoord is in vergelijking met een groep gezonde controles [Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1: e89376 /// Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Eén studie, gebruikmakend van extracellulaire flux analyse van complete cellen, toonde dat CVS PBMCs significant verstoorde mitochondriale funktie hebben onder zowel basale omstandigheden als bij maximale stimulatie, bij een aantal experimentele condities [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Dit suggereerde dat CVS-patiënten niet in staat waren om mitochondriale energie-produktie in dezelfde mate aan te wenden als gezonde controles en impliceerde dat mitochondriale dysfunktie kan bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. De studie die hier wordt gepresenteerd, werd uitgevoerd om verder te onderzoeken of de mitochondriale dysfunktie die werd gezien in CVS PBMCs te wijten was aan a-typische aktiviteit van individuele mitochondriale complexen, door gebruik te maken van dezelfde techniek als de eerdere studie (extracellulaire flux analyse) maar met gepermeabilseerde cellen i.p.v. complete cellen. Het gebruik van doorlaatbaar gemaakte cellen laat toe om mitochondrieën direct toegankelijk te maken voor substraten zonder cellulaire interferentie in termen van substraat-transport of intracellulaire interakties. De permeabilisatie van cellen laat ook toe om de enzymatische aktiviteit van individuele respiratoire keten complexen te meten wat niet makkelijk is complete cellen. Deze studie onderzoekt de aktiviteit van individuele complexen en componenten van de mitochondriale respiratoire keten in myotubes en PBMCs – myotubes werden gebruikt om de mitochondriale aktiviteit lokaal in skeletspier te onderzoeken, terwijl PBMCs werden gebruikt om de aktiviteit van mitochondriale complexen systemisch te bekijken. Dit werd bewerkstelligd door het permeabiliseren van cellen om er zeker van te zijn dat de mitochondrieën intact blijven en het aanwenden van extracellulaire flux analyse om de zuurstof-consumptie van cellen te registreren na opéénvolgende behandeling met mitochondriale aktivitet veranderende molekulen. Respiratoire parameters werden berekend en vergeleken tussen spiercellen en PBMCs van controles en CVS-patiënten.

Voor deze studie werd saponine aangewend om het cel-membraan doorlaatbaar te maken. Saponine is een cel-permeabilsator die werkt door het vormen van complexen met cholesterol, wat leidt tot een vermindering van de integriteit van het cel-membraan, terwijl de mitochondriale membranen intact blijven. Wanneer mitochondrieën uit cellen geïsoleerd worden, wordt de architectuur en de morfologie van de mitochondrieën gewijzigd, maar permeabilisatie van het cel-membraan laat toe om de architectuur en morfologie van de mitochondrieën normaal te houden, een voordeel van het gebruik van geïsoleerde mitochondrieën, aangezien de mitochondriale funktie eerder een sterk verband met struktuur bleek te vertonen. Permeabilisatie van het cel-membraan laat toe het effekt van substraten op mitochondriale aktiviteit uitgebreid na te gaan doordat endogene substraten toegang krijgen tot mitochondrieën. De toediening van verschillende substraten en inhibitoren wijzigt de mitochondriale ademhaling en laat toe de aktiviteit van individuele componenten van mitochondriale respiratie te meten. In 1955 werd al beschreven dat de mitochondriale ademhaling aktiviteit kan worden gemeten in termen van meerdere respiratoire ‘toestanden’. Toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) worden dikwijls gebruikt als merkers voor mitochondriale respiratoire aktiviteit. Toestand-3 respiratie is wanneer mitochondrieën een hoge concentratie ADP extern hebben, en een hoge zuurstof-consumptie en ATP-synthese waardoor een toestand ontstaat waarbij door ADP gestimuleerde ademhaling kan worden gemeten. Toestand-4 respiratie, anderzijds, is wanneer mitochondrieën een zeer lage externe ADP-concentratie hebben, en weinig of geen ATP-synthese omwille van de complete fosforylatie van ADP naar ATP. De respiratoire controle ratio (RCR) is een maatstaf voor het koppelen van ATP-synthese en elektron-flux, en toont de capaciteit van mitochondrieën om ATP te synthetiseren via de oxidatie van respiratoire substraten.

Dit werk had tot doel te bepalen of de enzymatische aktiviteit van verschillende complexen van de mitochondriale respiratoire keten verschillen tussen CVS-patiënten en gezonde controles, en dit lokaal (skeletspier) of systemisch (PBMC)s.

MATERIALEN & METHODES

Deelnemers aan de studie

Primaire myoblasten werden verkregen via spier-bioptie […]. Alle CVS-patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria […].

[…]

Reagentia

[…]

Cel-culturen & voorbereiding

Myotubes

[…]

PBMCs

[…]

Extracellulaire flux analyse

XFe96 analyser (Agilent Technologies) […]. Zuurstof-consumptie (OCR) werd op 12 tijdstippen gemeten. Drie basale metingen vóór de eerste toevoeging met een mix van de substraten van belang, ADP, FCCP [carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS] & saponine. Nog drie volgende metingen en dan de tweede toevoeging, met oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken]. Daarna nog drie metingen van de OCR en dan de laatste toevoeging met ofwel rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] of kalium-azide [inhibeert cytochroom-c oxidase (complex-IV)], en de laatste finale drie OCR-metingen. De concentratie van saponine werd geoptimaliseerd voor myotubes en PBMCs, en de schade aan de mitochondrieën veroorzaakt door saponine werd bepaald gebruikmakend van cytochroom-c. De optimale concentratie van saponine voor myotubes werd bepaald op 25 mg/ml, voor PBMCs 2,5 mg/ml. […]

Voorbereiding van de molekulen

[pyruvaat/malaat => complex-I gemedieerde respiratie /// succinaat => complex-II gemedieerde respiratie /// tetramethylfenylendiamine(TMPD)/ascorbaat => complex-IV aktiviteit /// palmitoyl-l-carnitine => respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie /// glutamine/malaat => respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse /// ADP => toestand-3 respiratoire aktiviteit /// FCCP => maximale respiratoire aktiviteit /// oligomycine => toestand-4 respiratoire aktiviteit / rotenon => metabole inhibitor / kalium-azide => metabole inhibitor]

Berekening van de parameters

[…]

Toestand-3 respiratie = (gemiddelde van de metingen 4-6) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

Toestand-4 respiratie = (gemiddelde van de metingen 7-9) – (gemiddelde van de metingen 10-12)

RCR = Toestand-3 respiratie/ Toestand-4 respiratie.

Data-analyse

[…]

RESULTATEN

Respiratoire keten complex aktiviteit in myobutes

[…] Complex-II respiratie (succinaat) en complex-IV aktiviteit (TMPD [tetramethylfenylendiamine; staat elektronen af aan cytochroom-c] & ascorbaat) bleken niet significant verschillend tussen de controle- (n = 6) en CVS- (n = 6) groep voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR […] (p ≥ 0.190).

Er werd geprobeerd complex-I gemedieerde respiratie (gebruikmakend van pyruvaat en malaat), respiratoire aktiviteit ondersteund door vetzuur-oxidatie (toevoeging van palmitoyl-l-carnitine) en respiratoire aktiviteit ondersteund door glutaminolyse (toevoeging van glutamine en malaat) te meten. De resultaten voor alle drie de experimenten gaven consistent negatieve waarden voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle- (n = 6) myotubes en daarom was het onmogelijk toestand-3, toestand-4 en RCR voor deze experimenten te berekenen.

Respiratoire keten complex aktiviteit in PBMCs

Er werden PBMCs van gezonde controles en CVS-patiënten gebruikt om verschillende aspecten van mitochondriale respiratoire keten aktiviteit te onderzoeken. De resultaten toonden dat er geen verschil voor toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR was tussen PBMCs van CVS-patiënten (n = 13) en gezonde controles (n = 6; succinaat controles n = 4) voor geen enkele van de substraat/inhibitor-combinaties (p ≥ 0.065).

BESPREKING

De aktiviteit van verschillende aspecten van de mitochondriale respiratoire keten funktie werden onderzocht via het toedienen van verscheidene substraten en inhibitoren. Het effekt van de verschillende substraten op toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en respiratoire controle ratio (RCR) werd gemeten.

Er werden vijf verschillende combinaties van substraten onderzocht omtrent hun effekten op myotubes en PBMCs – glutamine & malaat; palmitoyl-l-carnitine; pyruvaat en malaat; succinaat; TMPD & ascorbaat. Deze werden toegediend om respiratie ondersteund door glutaminolyse, respiratie ondersteund door vetzuur-oxidatie, complex-I aktiviteit, complex-II aktiviteit, en complex-IV aktiviteit (respectievelijk) te onderzoeken. Ondanks het ontbreken van een verschil qua OXPHOS tussen de controle- en CVS-groepen aangetoond in complete myotubes [Rutherford G. Investigating the biochemical basis of muscle cell dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. PhD thesis, Newcastle University, Newcastle upon Tyne (2016)], hadden deze experimenten tot doel te onderzoeken of meer subtiele en specifieke verschillen optraden in individuele complexen. Er werden PBMCs gebruikt om te bekijken of de specifieke lokatie van eerder gerapporteerde abnormaliteiten geïdentificeerd in totale cellen kon worden vastgepind op specifieke complexen of mechanismen [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding].

In myotubes gaven slechts twee van de substraten-combinaties nuttige resultaten. De toevoeging van pyruvaat & malaat, palmitoyl-l-carnitine, en glutamine & malaat leverde negatieve waarden op voor OCR bij zowel CVS- (n = 6) als controle-myotubes (n = 6). De toevoeging van de molekulen leek een effekt te hebben op de OCR, maar niet het geanticipateerd effekt. Het resulteerde slechts in meer negatieve OCR-metingen bij elke toediening en gaf niet de verwachte toename na de eerste toediening. Deze experimenten werden een aantal keer herhaald met elke keer gelijkaardige vaststellingen. Dit suggereert dat deze techniek voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in gepermeabiliseerde cellen misschien wel niet geschikt is voor het gebruik in myotubes. Er waren wel succesvolle metingen van het effekt van succinaat, en TMPD & ascorbaat voor controle- en CVS-myotubes. Er werd geen verschil gezien qua toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie of RCR tussen de controle- en CVS-groepen. Dit geeft aan dat er geen abnormaliteiten zijn qua respiratoire aktiviteit gelinkt aan glutaminolyse of complex-IV aktiviteit in CVS-myotubes. Dit stemt overéén met eerdere research waarbij, gebruikmakend van 3 carboxyl-14C gelabelde substraten, werden gevonden dat er geen verschil is tussen CVS en controle skeletspier-cel complex-I, complex-II+III, complex-III of complex-IV aktiviteit [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738]. Echter: gezien de inconsistentie tussen substraten-metingen bij deze studie, waarbij enkele substraten succesvolle metingen gaven en andere niet, en de grote fouten-marges aangegeven voor elk van de substraten (inclusief deze waarvoor we toestand-3 & -4 respiratie succesvol konden afleiden), dient het gebruik van deze techniek in vraag te worden gesteld wat betreft accuraat meten van de aktiviteit van specifieke aspecten van de mitochondriale ademhaling in gepermeabiliseerde myotubes. Andere technieken zoals fosforescentie zuurstof-sensitieve probes en spectrofotometrische enzyme-testen zouden moeten worden aangewend om dezelfde stalen in toekomstige experimenten te analyseren, om te bepalen of ze meer accurate resultaten kunnen geven dan deze die hier met de XFe96 werden bekomen en de consistentie ertussen te bekijken. Er zijn slechts zeer weinig eerder gepubliceerde studies die gebruikmaakten van extracellulaire flux analyse om de mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde myotubes te detekteren. Eén studie gebruikte extracellulaire flux analyse en hoge-resolutie respirometrie [HRR of oxygrafie; gestandardiseerde metingen van de mitochondriale respiratoire funktie] om de verschillen tussen de technieken te bepalen [bij obese mensen]. De studie toonde dat de metingen van de Seahorse XFe24 hogere waarden qua variabiliteit hadden voor elk gegevens-punt, wat de hier gerapporteerde gegevens ondersteunt en aantoont dat extracellulaire flux analyse misschien niet de meest geschikte techniek is voor het detekteren van veranderingen in de aktiviteit van mitochondriale complexen in gepermeabiliseerde myotubes.

In PBMCs waren er succesvolle metingen voor alle vijf de substraten-combinaties. We vergeleken toestand-3 respiratie, toestand-4 respiratie en RCR van controle- (n = 6, succinaat-controles n = 4) & CVS- (n = 13) PBMCs. Er werd geen verschil gezien tussen de twee groepen voor geen enkele van de onderzochte substraten. Dit suggereert dat de aktiviteit van complex-I, -II & -IV, en de respiratie ondersteund door vetzuur-oxidation of glutaminolyse niet verschillend is in CVS-PBMCs vergeleken met gezonde controles. Deze resultaten zijn in overéénstemming met een studie door Lawson N et al. [Elevated energy production in Chronic Fatigue Syndrome patients. Journal of Nature and Science (2016) 2: e221] waar spectrofotometrische technieken gebruikten om te tonen dat gepermeabiliseerde CVS-PBMCs niet verschillen van gezonde controles in termen van complex-I, complex-II+III of complex-IV aktiviteit. De consistentie van de resultaten tussen de verschillende research-groepen, gebruikmakend van verschillende technieken, versterkt de bewijskracht die suggereert dat er geen abnormaliteiten zijn qua individuele mitochondriale complex aktiviteiten in CFS-PBMCs. Het ontbreken van verschillen PBMCs kan suggereren dat de eerder gevonden abnormaliteiten in complete cellen zijn niet te wijten aan abnormaliteiten qua complexen van de mitochondriale respiratoire keten maar eerder aan andere aspecten van het respiratie-mechanisme zoals transport van glucose in de cellen, AMPK-abnormaliteiten of gewijzigd funktioneren van andere mitochondriale enzymes [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding]. Er dient echter omzichtigheid in acht te worden genomen bij het interpreteren van deze resultaten op zich, gezien de verschillen in OXPHOS die worden gezien in complete PBMCs [Tomas C et al. 2017; zie onze inleiding], aangezien de resultaten van complete cellen een weerspiegeling is van een natuurlijker en fysiologisch relevanter milieu voor de mitochondrieën. Hoewel in deze studie relatief kleine groepen werden gebruikt, verhoogt de samenhang van de bevindingen van deze studie met eerdere studies, die andere technieken voor het meten van mitochondriale complex aktiviteit in myotubes en PBMCs van CVS-patiënten, de deugdelijkheid van de resultaten [Lawson N et al. (2016) & Smits B et al. (2011); zie hierboven].

BESLUITEN

Deze studie onderzocht de aktiviteit van specifieke componenten van de mitochondriale ademhaling door te kijken naar individuele complex aktiviteit en mechanismen in myotubes en PBMCs. Op basis van een cel-permeabilisatie protocol en gebruikmakend van de XFe96 extracellular flux analyser werd aangewend om deze experimenten uit te voeren. Dit is de eerste studie die extracellulaire flux analyse gebruikt om individuele mitochondriale complex aktiviteit na te gaan in gepermeabiliseerde cellen in de context van CVS. Uiteindelijk werd een normale mitochondriale funktie opgetekend in CVS-myotubes & -PBMCs; er werden echter relatief kleine groepen gebruikt en daarom dienen de resultaten omzichtig te worden geïnterpreteerd. De bevinding van een normale mitochondriale werking van CVS-myotubes ondersteunt de resultaten van ongepubliceerde gegevens van complete cellen [zie Rutherford G 2016; hierboven]. De resultaten waar geen verschil qua mitochondriale aktiviteit in gepermeabiliseerde PBMCs werden gevonden, waren onverwacht gezien het feit dat de mitochondriale funktie in PBMCs eerder significant lager bleek bij CVS [Tomas et al. 2017; zie onze inleiding]. Het ontbreken van een verschil qua complex-aktiviteit in CFS-PBMCs is echter in overéénstemming met resultaten die door andere groepen werden gerapporteerd – die normale mitochondriale respiratoire keten complex-aktiviteiten toonden [Lawson N et al. (2016); zie hierboven] en postuleerden dat wijzigingen qua mitochondriale ATP-synthese dient te worden toegeschreven aan andere oorzaken zoals de transport-capaciteit van zuurstof [Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8: 93]. Gezien onze resultaten hier, moeten toekomstige bio-energetische studies bij CVS zich concentreren op mechanismen ‘upstream’ van de mitochondriale respiratoire keten.

februari 23, 2019

Hoge energie-kost bij laag-gradige inflammatie

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:18 am
Tags: , , , , , , ,

Prof. Jacoba (Cobi) Heijnen is een belangrijk figuur in het gebied van de psychoneuro-immunologie. Haar research focust op de cellulaire en molekulaire mechanismen van neuronale schade, motorisch gedrag en neuroprotectanten. Ze combineert brein/immuunsysteem-communicatie om de invloed van het neuro-endocrien systeem op de immuunrespons van patiënten met auto-immuunziekten te bestuderen. Samen met Prof. Robert Dantzer richtte ze het ‘Neuroimmunology Laboratory’ aan de universiteit van Texas op; waar onderzoek wordt verricht omtrent pijn, vermoeidheid, neuropathie en cognitieve stoornissen. Dantzer lanceerde het nu het nu aanvaarde idee dat het immuunsysteem de symptomen van ‘sickness-behaviour’ (ziekte-gedrag; vermoeidheid, hoofdpijn, spierpijn, keelpijn, enz.) bepaalt en dat deze fungeren als een manier om het energie-verbruik te reduceren (om, zo wordt gesteld, de verspreiding van pathogenen te voorkomen). Lees ook ‘Identifikatie en behandeling van symptomen geassocieerd met inflammatie’.

In onderstaand ‘review’-artikel focust hun team op twee zaken die op deze pagina’s al veelvuldig aan bod kwamen: de problematische energie-voorziening en de laag-gradige (neuro)inflammatie. Op basis van de literatuur (grotendeels door M.E.(cvs)-researchers) stellen ze voor dat deze inflammatie problemen met de energie-produktie veroorzaakt.

Vroeger had Heijnen het over cognitieve gedrag therapie als hulpmiddel maar daar wordt nu blijkbaar niets meer over geopperd…

————————-

Front Behav Neurosci. (2018) 12: 78

The High Costs of Low-Grade Inflammation: Persistent Fatigue as a Consequence of Reduced Cellular-Energy Availability and Non-adaptive Energy Expenditure

Lacourt TE, Vichaya EG, Chiu GS, Dantzer R, Heijnen CJ

Neuroimmunology Laboratory, Symptom Research Department, The University of Texas MD Anderson Cancer Institute, Houston, TX, United States

Samenvatting

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom bij meerdere ziekten. Persistente vermoeidheid bleek geassocieerd met laag-gradige inflammatie in meerdere modellen voor vermoeidheid (inclusief kanker-gerelateerde vermoeidheid [CRF] en Chronische Vermoeidheid Syndroom). Het is echter onduidelijk hoe laag-gradige inflammatie tot het ervaren van vermoeidheid leidt. We presenteren hier een model voor een onevenwicht qua energie-beschikbaarheid en energie-verbruik als een gevolg van laag-gradige inflammatie. In dit verhalend overzicht, bespreken we hoe laag-gradige inflammatie kan leiden tot verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie. Laag-gradige inflammatie induceert een metabole omschakeling van energie-efficiënte oxidatieve fosforylatie naar snel-werkende, maar minder efficiënte, aërobe glycolytische energie-produktie; doet reaktieve zuurstof soorten verhogen en reduceert insuline-sensitiviteit. Deze effekten resulteren in gedaalde glucose-beschikbaarheid en, daardoor, verminderde cellulaire energie. Daarnaast suggereert nieuw bewijsmateriaal dat chronische laag-gradige inflammatie verbonden is met de bereidheid om inspanning te leveren onder specifieke omstandigheden. Veranderingen in het circadiaans ritme en slaap-stoornissen kunnen de effekten van inflammatie op de beschikbaarheid van cellulaire energie en niet-adaptief energie-verbruik mediëren. In het tweede deel van deze bespreking, presenteren we bewijs voor deze metabole mechanismen in modellen voor aanhoudende vermoeidheid, waarbij we focussen op Chronische Vermoeidheid Syndroom en kanker-gerelateerde vermoeidheid. Het meeste bewijsmateriaal voor gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie met betrekking tot vermoeidheid komt van studies over het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Hoewel het mechanistisch bewijs uit de literatuur omtrent kanker-gerelateerde vermoeidheid nog beperkt is, wijzen de beperkte resultaten ook naar gereduceerde beschikbaarheid van cellulaire energie. Er is ook groeiend bewijs voor het feit dat het energie-verbruik voor aktiviteiten de verminderde beschikbaarheid van cellulaire energie bij patiënten met persisterende vermoeidheid overstijgt. Dit suggereert dat een onvermogen om energie-verbruik aan te passen aan de beschikbare bronnen één mechanisme kan zijn dat aan de basis ligt van persistente vermoeidheid.

Inleiding

Chronische of persisterende vermoeidheid is een courant, uitputtend symptoom van meerdere ziekten. Het is één van de meeste frequent gerapporteerde symptomen bij kanker en kanker-behandeling, en is zeer sterk aanwezig bij meerdere chronische ziekten, zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis. Daarnaast is ‘t het kenmerkend symptoom van het Chronische Vermoeidheid Syndroom, een aandoening waarbij ernstige persistente vermoeidheid wordt ervaren in afwezigheid van een gediagnostiseerde ziekte. Aanhoudende vermoeidheid is anders dan acute vermoeidheid. Acute vermoeidheid is een gezonde, adaptieve respons op fysieke of mentale inspanning, die metabole signalisering induceert om verdere energie-consumptie te vermijden. Acute vermoeidheid verdwijnt typisch na rust of slaap. In tegenstelling daarmee is persisterende vermoeidheid dikwijls disproportioneel met de uitgeoefende aktiviteiten en wordt over het algemeen niet volledig verlicht door rust. Er zijn geen behandelingen voor aanhoudende vermoeidheid die goedgekeurd werden door de Amerikaanse ‘Food and Drug Administration’, ten dele omdat de onderliggende mechanismen nog niet goed worden begrepen.

Er werd gesuggereerd dat aktivatie van inflammatoire mechanismen aan de basis ligt van persistente vermoeidheid bij veel patiënten-populaties [bv. Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) 114: E7150-E7158] en dieren-modellen. Inderdaad: het is goed bekend uit experimentele studies dat acute ernstige inflammatie, zoals deze geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS), acuut ziekte-gedrag, inclusief vermoeidheid, veroorzaakt. Deze respons werd geïnterpreteerd als een adaptief proces dat leidt tot het behoud van energie en reductie van het risico op verdere verspreiding van pathogenen (bv. door het zich terugtrekken uit sociale interakties) [Dantzer R et al. The neuroimmune basis of fatigue. Trends Neurosci. (2014) 37: 39-46]. Bovendien is, bij auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose, diabetes en Reumatoïde Artritis, het vermoeidheid-niveau geassocieerd met een toename van plasma-cytokinen, bijzonderlijk bij opflakkering van symptomen. Verbanden tussen kleine, langdurige verhogingen qua inflammatoire cytokinen en chemokinen in het plasma, en persisterende vermoeidheid werden ook gerapporteerd bij kanker-overlevers; en bij individuen met het Chronische Vermoeidheid Syndroom [zie Montoya JG et al. hierboven]. Bij deze patiënten zijn de waarden van plasma-cytokinen over het algemeen veel lager dan deze die worden gedetekteerd bij patiënten met auto-immune ziekten. De mechanismen waarmee subtiele verhogingen qua inflammatie vermoeidheid induceren zijn nog onduidelijk en zouden verschillend kunnen zijn van wat werd aangetoond voor acute ernstige inflammatie. Het aantal in de literatuur gerapporteerde associaties suggereert echter dat het effekt biologisch significant is.

We stellen voor dat chronische laag-gradige inflammatie persistente vermoeidheid induceert en/of bestendigt door het induceren van een onevenwicht tussen beschikbaarheid van cellulaire energie en cellulair & aktiviteiten energie-verbruik. Inflammatie verhoogt de noodzaak van immuun-cellen om snel cellulaire energie te genereren. Om hieraan te voldoen verschuiven immuun-cellen naar aërobe glycolyse voor energie-produktie, een minder efficiënt maar snel-werkend mechanisme. Tijdens chronische laag-gradige inflammatie wordt verwacht dat het uitgebreid vertrouwen op aërobe glycolyse zal leiden tot gedaalde beschikbaarheid van nutriënten en dus tot minder energie-beschikbaarheid voor de noodlijdende orgaan-systemen. Het energie-evenwicht van het organisme kan verder belast raken door veranderingen qua circadiaanse ritmes en slaap. Daarnaast is er bewijs dat suggereert dat laag-gradige of chronische inflammatie (maar niet acute ernstige inflammatie) gelinkt kan worden aan verhogingen qua energie-verbruik bij aktiviteiten, wat bijdraagt tot het onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid en -verbruik en, daardoor, leidt tot vermoeidheid.

Effekten van laag-gradige inflammatie op energie-produktie en -verbruik

Adenosine-trifosfaat (ATP) is de voornaamste vorm van energie-‘munteenheid’ die door de cellen wordt gebruikt. Het genereren van ATP omvat het katabolisme van macronutriënten (koolhydraten, lipiden en proteïnen), elk startend van een uniek metabool mechanisme, maar dat uiteindelijk leidt tot ATP-produktie door de cellen. Factoren die ATP-produktie negatief kunnen beïnvloeden omvatten gedaalde intracellulaire glucose-beschikbaarheid (door veranderingen in het metabolisme van macronutriënten of verminderde glucose-opname door de cellen), gedaalde funktie van de mitochondrieën wat betreft aërobe energie-produktie en daaropvolgende afhankelijkheid van minder-efficiënte aërobe glycolyse.

Energie-produktie tijdens langdurige inflammatie

Inflammatie vereist een verandering qua metabolisme en deze wijzigingen verschillen voor acute en chronische of langdurige inflammatie. Bij acute inflammatie is snelle ATP-produktie door de immuun-cellen vereist voor de ganse reeks immuun-responsen. Immuun-cellen (lymfocyten en leukocyten) wisselen van oxidatieve fosforylatie naar een groter vertrouwen op aërobe glycolyse voor snelle ATP-produktie. Deze verschuiving is in het voordeel van overhaaste ATP-produktie terwijl de katabole efficiëntie wordt opgeofferd, resulterend in verminderde mitochondriale werking en gestegen aanmaak van lactaat.

Bijkomend is langdurige inflammatie geassocieerd met verhoogde insuline-resistentie en gedaalde glucose-tolerantie, wat leidt tot verminderde glucose-opname door de immuun-cellen en, bijgevolg, minder globale ATP-produktie uit glucose. Tijdens persistente laag-gradige inflammatie worden daarom energie en glucose afgeleid van andere systemen om de immuun-respons te ondersteunen. Ter compensatie doet het lichaam het lipiden- en proteïnen-metabolisme stijgen voor de produktie van ATP. Het lipiden-metabolisme is een traag proces en kan dus niet voldoen aan de snelle energie-vereisten. Daarnaast betekent een verhoogd betrouwen op het proteïnen-metabolisme dat andere funkties, zoals het bevorderen van groei-stimulatie, gecompromitteerd raken. Inflammatie leidt ook tot meer reaktieve zuurstof soorten (ROS) om binnendringende pathogenen te bestrijden. ROS kunnen echter schadelijk zijn voor mitochondrieën en mitochondriaal DNA, en dus draagt langdurige blootstelling aan ROS tijdens chronische inflammatie bij tot mitochondriale dysfunktie.

De effekten van chronische inflammatie zijn bijzonder schadelijk voor neuronen die sterk afhankelijk zijn van oxidatieve fosforylatie voor hun ATP-behoeften. Bij normaal brein-metabolisme vertrouwen neuronen sterk op astrocyten. Astrocyten gebruiken glycolyse om lipiden en glucose om te zetten naar pyruvaat en dan lactaat. Lactaat wordt dan naar neuronen gestuurd, waar het binnenkomt in de TCA-cyclus. Tijdens chronische inflammatie zorgt insuline-resistentie voor een daling van glucose en het proteïnen-metabolisme in het astrocyten, wat resulteert in verminderde beschikbaarheid van lactaat voor neuronen, wat deze er toe dwingt sterker te leunen op het trager proces van het lipiden-metabolisme. Verder is inflammatie in staat om de mitochondriale efficiëntie te verlagen, wat de metabole belasting op neuronen verhoogt. Veranderingen qua neuronaal metabolisme zullen uiteindelijk het neuronaal funktioneren aantasten.

Aktiviteiten energie-verbruik tijdens inflammatie

Er wordt geraamd dat chronische laag-gradige inflammatie het systemisch energie-verbruik met 10% verhoogt. Gezien de gestegen energie-vereisten bij chronische inflammatie en de resulterende gedaalde energie-beschikbaarheid, zou men verwachten dat het aktiviteiten energie-verbruik (d.i. de hoeveelheid energie die wordt gespendeerd aan aktiviteiten) zou verminderen. Meerdere studies in de context van acute, ernstige inflammatie bekrachtigen deze hypothese en tonen de verminderde bereidheid (motivatie) tot inspanning, zowel bij knaagdier-modellen als bij mensen. Resultaten van deze en andere studies suggereren echter ook dat motivatie-gedrag anders beïnvloed kan zijn bij laag-gradige inflammatie.

Studies met dieren-modellen tonen een daling qua inspanning om voedsel te verkrijgen enkel na toediening van hogere dosissen inflammatoire mediatoren. Voor de laagste dosissen was er niet alleen geen verminderde, er bleek ook een trend naar meer aktiviteit. Verder testten onderzoekers dieren 24 h na een acute inflammatoire aanval (LPS-injektie), een punt waar de acute inflammatoire respons en het ziekte-gedrag waren geluwd: er werd een verschuiving vastgesteld wat betreft motivationele prioriteit naar keuzes die een hogere inspanning voor een meer in het oog springende beloning vereisten.

Een vergelijking van de resultaten van de twee beschikbare studies bij mensen wijst ook op afzonderlijke effekten van hoog- vs. laag-gradige inflammatie op keuzes omtrent energie-verbruik. Researchers testten gezonde individuen 2 en 5 h na LPS-injektie en vonden een verminderde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (2, maar niet 5, h na injektie; op 2 h had de inflammatie z’n piek bereikt). In tegenstelling daarmee vonden anderen, bij deelnemers 5 h na LPS, een verhoogde bereidheid om taken uit te voeren die een grote inspanning vergen (maar enkel in omstandigheden die voordelig waren om iets te winnen). Ze merkten verder op dat deelnemers te zwak waren om getest te worden tussen 3 en 4 h na injektie. Op te merken: de 2 studies verschilden wat betreft meerdere belangrijke aspecten, inclusief karakteristieken van het staal (enkel mannen vs. een mix van mannen en vrouwen) en taken (keuze tussen aanvaarden of afwijzen van een taak vs. keuze tussen een taak met grote inspanning/grote beloning of een lage inspanning/kleine beloning). Niettemin, stellen we op basis van deze experimentele gegevens bij muizen en mensen als hypothese dat acute ernstige inflammatie leidt tot veralgemeende adaptieve dalingen van energie-verbruik/inspanning, terwijl milde inflammatie kan leiden tot relatieve stijgingen van energie-verbruik/inspanning op voorwaarde dat de drijfveer groot genoeg is. Deze notie wordt ondersteund door onze bevindingen dat laag-gradige inflammatie geassocieerd was met keuzes voor verhoogde inspanning van een groep kanker-patiënten en -overlevers. Er dient nog te worden nagegaan of deze verschuivingen qua inspanning-gedrag/energie-verbruik overéénkomen met ‘herstel’ of met een omschakeling van de immuun-cellen van een glycolytisch naar een meer oxidatief gestuurd metabool profiel. Daarnaast werden verschuivingen in het gedrag tijdens chronische laag-gradige inflammatie nog niet bestudeerd.

De effekten van inflammatie op inspanning/energie-verbruik bij motivatie-taken lijken te worden gemedieerd door het dopaminerg systeem. Hoewel het mechanisme waardoor inflammatie in staat is de dopamine-neurotransmissie te wijzigen nog onduidelijk is, geeft de literatuur omtrent Parkinson’s aan dat chronische neuro-inflammatie leidt tot oxidatieve stress en mitochondriale schade in dopaminerge neuronen, leidend tot een belangrijke verstoring qua dopaminerge [via dopamine werkende] neurotransmissie. Dopaminerge neuronen zijn bijzonder kwetsbaar voor inflammatie. Hoewel de oorzaak van deze kwetsbaarheid nog niet volledig wordt begrepen, kunnen de verhoogde basale oxidatieve fosforylatie van deze cellen en de auto-oxidatie van overmatig extracellulair dopamine daartoe bijdragen.

Slaap en circadiaanse ritmes als partiële mediatoren van de effekten van chronische laag-gradige inflammatie op energie-beschikbaarheid en -verbruik

Inflammatie kan bijkomend leiden tot meer aanhoudende wijzigingen in het metabolisme via veranderingen van het circadiaans ritme en slaap. Chronische laag-gradige en ernstige inflammatie bleek de slaap-kwaliteit en circadiaanse ritmes te beïnvloeden, en vice versa [Rahman K et al. Sleep-wake behavior in Chronic Fatigue Syndrome. Sleep (2011) 34: 671-678]. Veranderingen qua ritmes van de circadiaanse aktiviteit werden gelinkt met vermoeidheid. Slaap-stoornissen en verminderde slaap-kwaliteit – dikwijls gerapporteerd door individuen met persistente vermoeidheid – kunnen ook leiden tot een gedesorganiseerd/ontregeld circadiaans ritme omwille van dutjes tijdens de dag en strukturele wijzigingen qua slaap-aanvang ‘s nachts.

De meeste metabole processen worden gereguleerd door de circadiaanse klok en veranderingen qua circadiaans ritme of slaap zijn verbonden met metabole veranderingen, zoals verhoogd circulerend glucose en gedaalde insuline-sensitiviteit. Specifiek: expressie van mitochondriale proteïnen betrokken bij veel metabole processen ondergaat post-translationele modificaties die worden gereguleerd door het ‘Clock’-gen [Circadian Locomotor Output Cycles Kaput; beïnvloedt de circadiaanse ritmes]. Daarnaast wordt het mitochondriaal oxidatief metabolisme ook gecontroleerd door de circadiaanse klok via oscillaties in de biosynthese van nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD+) en de beschikbaarheid van mitochondriale enzymen.

Onvoldoende slaap en wijzigingen in circadiaanse ritmes kunnen ook het verbruik van cellulaire energie en aktiviteit veranderen. Pre-klinische studies tonen een verhoogd energie-verbruik na totale slaap-onthouding bij ratten. Zo ook leidde experimenteel geïnduceerde slaap-onthouding bij gezonde menselijke vrijwilligers tot gestegen dagelijks energie-verbruik (bepaald via totale-ruimte calorimetrie; meten van zuurstof-consumptie en koolstof-dioxide produktie). Hoewel dit gepaard ging met een compenserende toename in energie (voedsel-inname, t.t.z. calorische inname hoger dan calorisch verbruik), steeg de fysieke inspanning significant. Als de hierboven beschreven studies steunen op experimenteel geïnduceerde veranderingen qua circadiaans ritme en slaap, is het onduidelijk in welke mate deze bevindingen relevant zijn voor natuurlijk optredende veranderingen. Daarnaast: of meer subtiele, aanhoudende veranderingen qua slaap en circadiaans ritme, zoals deze geobserveerd bij vermoeide individuen, ook energie-verbruik wijzigen, dient nog te worden aangetoond.

Samenvatting van de voorgestelde mechanismen

Chronische laag-gradige inflammatie is gerelateeerd met een persistente metabole switch naar snellere, maar minder efficiënte, glycolytische energie-produktie, en verhoogde aanmaak van ROS. Dit beïnvloedt op z’n beurt de mitochondriale funktie, waardoor het betrouwen op glycolytische mechanismen vergroot. Daarnaast gaat, hoewel chronische inflammatoire processen meer energie vereisen, deze verhoogde nood aan energie niet altijd gepaard met verminderingen qua aktiviteiten energie-verbruik. Dit lijkt in het bijzonder het geval in de context van laag-gradige inflammatie, die motivatie voor inspanning bleek te verhogen. Inflammatie kan ook circadiaanse ritmes en slaap beïnvloeden (en vice versa), wat de effekten op energie-beschikbaarheid en -verbruik verder kan verergeren.

We stellen voor dat dit onevenwicht tussen energie-beschikbaarheid vs. -verbruik aan de basis ligt van het ervaren van vermoeidheid geïnduceerd door chronische laag-gradige inflammatie. Hierna bespreken we het bewijsmateriaal voor deze metabole mechanismen bij persistente vermoeidheid.

Aanhoudende vermoeidheid ten gevolge gereduceerde energie-beschikbaarheid en verhoogd energie-verbruik?

Er werden voornamelijk verbanden tussen laag-gradige inflammatie en aanhoudende vermoeidheid gerapporteerd bij individuen met CVS of CRF. Bij patiënten met CVS, bleek de vermoeidheid-ernst geassocieerd met gestegen cytokine-concentraties in plasma [zie Montoya JG et al. hierboven] en ruggemergvocht [Hornig M et al. Cytokine network analysis of cerebrospinal fluid in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Psychiatry (2016) 21: 261-269]. Er werden ook wijzigingen in de fysiologische stress-respons (overwegend hypothalamus-hypofyse-bijnier as output) bij CVS-patiënten gerapporteerd [bv. Silverman M et al. Neuroendocrine and immune contributors to fatigue. PMR (2010) 2: 338-346], suggererend dat laag-gradige inflammatie het resultaat kan zijn van een gereduceerde sensitiviteit voor immuun-regulerende stress-hormonen zoals cortisol. Voor CRF begint de vermoeidheid gewoonlijk tijdens de kanker-behandeling maar houdt bij overleving aan bij een significante subset patiënten. Het is geweten dat de meeste eerste-lijn behandelingen zoals chemotherapie en chirurgie een inflammatoire respons induceren (bv. door weefsel-beschadiging). Stijgingen van inflammatoire merkers bleken inderdaad geassocieerd met verhoogde vermoeidheid-ernst bij patiënten die behandeling ondergingen, hoewel niet alle inflammatoire merkers geassocieerd met vermoeidheid een respons op kanker-behandeling vertonen, wat de aanwezigheid van andere oorzakelijke factoren suggereert. Bij kanker-overlevers werden ook, ondanks het ophouden van de onmiddellijke inflammatoire effekten van de kanker-behandeling, verbanden tussen gestegen waarden van inflammatoire merkers en verhoogde vermoeidheid gezien. CRF bij overlevers bleek daarnaast geassocieerd met psychosociale stress factoren (zoals angst voor het terugkeren van de kanker) wat suggereert dat inflammatoire processen bij overlevers (ten dele) stress-gerelateerd kunnen zijn.

Gedaalde energie-beschikbaarheid bij aanhoudende vermoeidheid

Bewijs voor verminderde energie-beschikbaarheid bij langdurige vermoeidheid komt voornamelijk uit metaboloom-studies [bv. Fluge Ø et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight (2016) 1: e89376 /// Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113: E5472-5480 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] en van studies omtrent mitochondriale dysfunktie [bv. Filler K et al. Association of mitochondrial dysfunction and fatigue: a review of the literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]

Mitochondriale Dysfunktie

Mitochondrieën worden dikwijls voorgesteld als de ‘krachtcentrales van de cel’. De mitochondriale werking kan gecompromitteerd worden door meerdere factoren, inclusief verminderde beschikbaarheid van de nodige metabolieten en mitochondriale schade door, bijvoorbeeld, oxidatieve stress. De notie dat mitochondriale dysfunktie kan leiden tot vermoeidheid wordt aangegeven door de observatie dat vermoeidheid een courant symptoom bij mitochondriale ziekte is en dat vermoeidheid-achtig gedrag in dieren-modellen geassocieerd is met gedaalde expressie van mitochondriale complexen, verminderingen qua metabole aktiviteit en veranderingen qua mitochondriale morfologie in de hersenen.

Het verband tussen mitochondriale dysfunktie en persistente vermoeidheid werd het meest bestudeerd bij patiënten met CVS. Een systematische ‘review’ rapporteerde dat 21 op 25 artikels beperkt waren tot CVS [zie Filler K et al. hierboven]. Lagere serum-waarden van het anti-oxidant CoQ10 was de meest consistente bevinding van het overzicht, met beperkt bewijs voor lagere waarden van andere anti-oxidanten en verhoogde waarden van oxidatieve stress merkers. Er werden lagere carnitine-waarden gezien in sommige studies maar de resultaten hingen af van het type carnitine dat werd bepaald. Later gepubliceerde studies over CVS bevestigen verhoogde oxidatieve stress, mogelijke dalingen qua efficiëntie van de ATP-aanmaak en verminderingen van de mitochondriale energie-produktie bij CVS-patiënten [Ciregia F et al. Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome. Transl. Psychiatry (2016) 6: e904]. Het bepalen van de zuurstof-consumptie in PBMCs [Tomas C et al. (2017). Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE 12: e0186802] is veelbelovend, wijzend op een gereduceerde capaciteit van de mitochondrieën om te voldoen aan de gestegen energie-vereisten tijdens cellulaire stress; een replicatie omwille van het gebruik van ingevroren en verse bloedstalen, en de beperkte grootte van het staal is aangewezen.

Studies aangaande CRF bleven tot hier toe beperkt tot de onmiddellijke effekten van kanker-behandeling en het is onduidelijk in welke mate deze effekten nog aanwezig zijn bij overlevers. Pre-klinische research heeft aangetoond dat zowel kanker als kanker-therapie geassocieerd zijn met mitochondriale dysfunktie. Op basis van pre-klinische modellen is het onbekend of door behandeling geïnduceerde of door kanker geïnduceerde veranderingen qua mitochondriale funktie verband houden met vermoeidheid. Een handvol observationele studies van één research-groep rapporteren echter over een associatie bij prostaat-kanker patiënten die bestraling-therapie ondergaan. Hun resultaten duiden op verminderd mitochondriaal funktioneren tesamen in associatie met vermoeidheid, zoals bewezen door gedaalde expressie van mitochondrieën-gerelateerde genen, verminderde expressie van mitochondriale elektronen-transport complex-II enzymen en gestegen apoliproteïne-A1 (ApoA1) in associatie met hogere vermoeidheid. ApoA1 is belangrijk voor lipiden-opruiming en een stijging qua ApoA1 is indicatief voor een gedaald gebruik van lipiden voor ATP-synthese.

Een handvol studies en klinische proeven bekrachtigen de hierboven beschreven bevindingen. Twee experimentele studies bij CVS-patiënten toonden wijzigingen in metabole processen. Resultaten van de in vitro stimulatie van skeletspier-cellen van patiënten met CVS gaven insuline-resistentie of verminderde sensitiviteit van insuline-receptoren aan [Brown AE et al. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10: e0122982; zie ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]. Verder vertoonden CVS-patiënten een trager herstel na maximale inspanning-test, leidend tot een snellere afhankelijkheid op het minder efficiënt glycolytisch metabolisme tijdens een daaropvolgende test [Snell CR et al. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys. Ther. (2013) 93: 1484-1492].

Anti-oxidanten supplementering kan doeltreffend zijn naar het verminderen van vermoeidheid toe, wat een oorzakelijk verband suggereert tussen verminderde beschikbaarheid van anti-oxidanten en vermoeidheid. Bij patiënten met CVS deed supplementering met CoQ10 en nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) de vermoeidheid dalen, terwijl dat niet geval was voor een placebo-behandeling [Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid. Redox Signal. (2014) 22: 679-685]. Supplementering bleek ook CRF te verbeteren. Cachexische patiënten [cachexie = veralgemeende zwakte-toestand] met gevorderde gynaecologische kanker leken voordeel te halen uit de toediening van meerdere metabolisme-gerelateerde supplementen naast hun standaard cachexie-behandeling met synthetisch progestogeen; wat verminderingen qua vermoeidheid, inflammatie en energie-verbruik aantoont in vergelijking met enkel de standaard behandeling. Bij patiënten met borst-kanker die chemotherapie ondergaan, leidde supplementering met een aminozuren-gel die CoQ10 en L-carnitine bevat tot minder ernstige vermoeidheid. Aangezien deze studie een ‘standard-of-care’ conditie als controle omvatte, kan een placebo-effekt niet worden uitgesloten. In tegenstelling daarmee werd bij een grote studie met of borst-kanker patiënten die chemotherapie ondergingen, gebruikmakend van supplementering met vitamine-E met of zonder CoQ10, geen enkel effekt van CoQ10 op de ontwikkeling van vermoeidheid gevonden. In dieren-modellen werd ook aangetoond dat verscheidene molekulen met anti-oxidante eigenschappen vermoeidheid-achtig gedrag kunnen verminderen [bv. quercetine, coenzyme-Q10, ginsenoside-Rb1 (steroïd-achtige stof voorkomend in ginseng, agonist voor de oestrogeen-receptor)]. Bij deze studies dient te worden opgemerkt dat de vermoeidheid-modellen een significante beperking betekenen. Aangezien de mechanismen die ten gronde liggen aan CVS nog slecht gedefinieerd zijn, is de validiteit van dieren-modellen voor CVS betwistbaar. Bovendien induceren en kwantificeren veel van deze studies vermoeidheid in dezelfde interventie (bv. gedwongen zwemmen), wat inherent problematisch is. Daarom is nog veel werk vereist om onze model-systemen te verbeteren en deze bevindingen te valideren.

Samengevat: het meeste bewijsmateriaal voor een verband tussen vermoeidheid en mitochondriale werking komt van CVS, wijzend op lagere waarden van anti-oxidanten en mogelijke dalingen qua mitochondriale ATP-produktie. Hoerwel er geen lagere anti-oxidanten concentraties werden gevonden bij kanker-patiënten, duiden wijzigingen van de mitochondriale gen-expressie toch op een rol voor het mitochondriaal funktioneren bij vermoeidheid. Resultaten van klinische en pre-klinische studies wijzen op mogelijke voordelige effekten van mitochondrieën-ondersteunende supplementen. De meeste observationele en interventie-studies lijden echter onder ernstige beperkingen wat betreft staal-grootte of studie-ontwerp. Daarnaast werden de exacte oorzaken van gedaalde waarden van anti-oxidanten of ATP-aanmaak nog niet bestudeerd. Hoewel inflammatie waarschijnlijk de oorzaak is, is het zeker niet de enige kandidaat. Dus zijn bijkomende pre-klinisch onderzoek om de mechanismen te identificeren, als ook klinische replicaties bij grotere groepen, gebruikmakend van placebo-gecontroleerde ontwerpen en relevante biomerkers, dringend aangewezen.

Metabolomica

Metabolomica-studies laten een brede beoordeling van veranderingen in het metabolisme toe. Drie dergelijke studies rapporteerden over CVS, elk met verschillende resultaten maar allemaal wijzend naar gereduceerde metabole aktiviteit. Yamano et al. [ref. zie hierboven] leverden bewijs voor verminderde aktiviteit in de TCA- en de ureum-cyclus. Naviaux [ref. zie hierboven] rapporteerde over gedownreguleerde metabolieten van twee klassen lipiden en Fluge [ref. zie hierboven] over gedaalde concentraties aminozuren die fungeren als voorlopers voor acetyl-Coenzyme A, één van de voornaamste inputs van de TCA-cyclus. Hoewel Yamano et al. & Naviaux et al. geen meldingen maakten over verbanden tussen metabolieten en vermoeidheid-graad, rapporteerde Fluge et al. dat er geen assosciaties waren. Ze observeerden eerder verbanden tussen leeftijd en ‘body-mass-index’, suggererend dat hun bevindingen niet specifiek waren voor vermoeidheid bij de CVS-patiënten.

Er werd slechts beperkt werk verricht aangaande metabolomica in dieren-modellen voor vermoeidheid; bij één studie van inspanning-geïnduceerde vermoeidheid werden echter meerdere potentiële “anti-vermoeidheid” metabolomica biomerkers geïdentificeerd. Eén daarvan was geranyl-difosfaat [wordt beschouwd als een sleutel-intermediair bij de biosynthese van steroïden], dat indirect de lipiden-synthese en proteïnen-afbraak kan reguleren. Sebacinezuur [een dicarbonzuur], een resultaat van het vetzuren-metabolisme dat geoxideerd kan worden tot metabole intermediairen voor de TCA-cyclus [acetyl-CoA & succinyl-CoA], was een ander.

Samengevat: de resultaten van de drie metabolomica-studies duiden op veranderingen in het lipiden- & vetzuren metabolisme en gedaalde TCA-aktiviteit in verband met vermoeidheid, wat lijkt op metabole wijzigingen tijdens chronische laag-gradige inflammatie. Aangezien de TCA-cyclus nodig is om de voorlopers voor het proces van oxidatieve fosforylatie te creëeren, zou een verminderde aktiviteiten wijzen op gedaalde ATP-produktie via gereduceerde oxidatieve fosforylatie. Aangezien het lipiden-metabolisme, of lipolyse, de meeste energie per gram substraat genereert, is het de meest efficiënte manier voor energie-opslag. Het katabolisme van lipiden naar bruikbare energie is een traag proces en wordt hoofdzakelijk aangewend bij uitgebreide energie-vereisten, zoals bij chronische inflammatie. Veranderingen in dit metabool mechanisme kunnen dus resulteren in verminderde beschikbaarheid van efficiënte energie-bronnen, wat leidt tot verhoogde afhankelijkheid van een op koolhydraten gebaseerd metabolisme. Daarnaast zou de gedaalde beschikbaarheid van vetzuren interfereren met de aërobe energie-produktie, wat de nood voor anaërobe glycolytische ATP-produktie verhoogt.

Verhoogd energie-verbruik bij aanhoudende vermoeidheid

Meerdere bevindingen wijzen naar een energie-verbruik voor aktiviteiten die de beschikbare energie overstijgt bij patiënten met CVS & CRF. Bv.: één studie rapporteerde dat ca. de helft van een groep CVS-patiënten een energie-verbruik ervaarde dat hun ervaren energie-beschikbaarheid overschreed [Jason L et al. The impact of energy modulation on physical functioning and fatigue severity among patients with ME/CFS. Patient Educ. Couns. (2009) 77: 237-241]. Daarnaast bleek dat een niet-farmacologische interventie gericht op het verminderen van de vermoeidheid bij CVS-patiënten enkel doeltreffend was bij die patiënten waar energie-beschikbaarheid en -verbruik overéénkwamen [Brown M et al. The role of changes in activity as a function of perceived available and expended energy in nonpharmacological treatment outcomes for ME/CFS. J. Clin. Psychol. (2011) 67: 253-260]. Bij CRF hebben we getoond dat kanker-overlevers die melding maken van ernstiger vermoeidheid, een verhoogde tendens vertoonden om inspanning te leveren. Kanker-patiënten onder behandeling vertoonden dit verband niet maar eerder een gedaalde neiging om inspanning te leveren. Andere onderzoekers rapporteerden significante positieve verbanden tussen vermoeidheid-ernst en gemiddeld dagelijks calorie-verbruik bij patiënten met borst-kanker na de vierde cyclus chemotherapie. Dus is er preliminair bewijs dat suggereert dat energie-verbruik niet overéénkomt met (ervaren) energie-beschikbaarheid.

Veranderingen in circadiaanse ritmes en slaap bij bij aanhoudende vermoeidheid

Zoals hierboven vermeld, kunnen door laag-gradige inflammatie geïnduceerde veranderingen van het metabolisme gemedieerd zijn door wijzingen in circadiaanse ritmes & slaap, mogelijks via veranderingen van de melatonine-ritmiciteit. Hieronder bespreken we de bevindingen omtrent slaap, circadiaans ritme en melatonine in relatie tot chronische vermoeidheid.

Bij CVS werden een slechte slaap en wijzigingen qua melatonine-ritmiciteit, maar niet qua circadiaans ritme, gerapporteerd. CVS-patiënten maken meer melding van slaap-storrnissen en vertonen abnormale slaap-progressie (d.w.z. grotere mate van cyclisch alternerend patroon). Daarnaast was de vermoeidheid-graad geassocieerd met door de patiënten gerapporteerde slechte slaap, wat op z’n beurt verband hield met kleine toenames van de waarden van de pro-inflammatorire cytokinen interleukine-1β & tumor necrose factor-α in het plasma. Hoewel er geen bewijs werd gevonden voor een gewijzigd circadiaans ritme bij CVS, is er bewijs voor veranderde melatonine-ritmiciteit. Bv.: er werden significant hogere nachtelijke melatonine-waarden in het speeksel gezien bij adolescenten met CVS die melding maakten van niet-verfrissende slaap vergeleken met gezonde individuen. Verder was de associatie tussen het circadiaans ritme van de lichaamstemperatuur een melatonine-aanvang, die wordt gezien bij gezonde mensen, afwezig bij CVS-patiënten. Hoewel in één studie de behandeling met melatonine of fototherapie (daglicht-therapie) de vermoeidheid niet deden afnemen bij CVS-patiënten, was melatonine succesvol voor het verminderen van vermoeidheid wanneer de deelnemers werden geselekteerd voor een later-dan-gewoonlijke avondlijke melatonine-start. Deze studie omvatte placebo-controle maar de vermoeidheid-reducties waren significant meer uitgesproken bij patiënten met een zeer late start vs. Deze met een relatief vroege start, suggererend dat de effekten waarschijnlijk niet te verklaren zijn door enkel een placebo-effekt.

Bij kanker-patiënten werden associaties tussen CRF en verstoord circadiaans ritme en slaap gerapporteerd vóór, tijdens en na behandeling. In een longitudinale studie bij borst-kanker patiënten, waren verhoogde vermoeidheid tijdens chemotherapie gerelateerd met meer meldingen van slaap-stoornissen alsook meer dutjes en verminderd wakker-zijn tijdens de dag. In een subgroep van deze patiënten, waarvan info over inflammatie beschikbaar was, bleken verhoogde vermoeidheid of ontregelde slaap geassocieerd met meer inflammatie. Interventies gericht op het normaliseren van het circadiaans ritme bleken succesvol wat betreft het verlichten van CRF. Behandeling met helder wit licht was doeltreffend wat betreft het voorkomen en behandelen van circadiaans ritme desynchronisatie bij patiënten met borst-kanker, en verbeterde vermoeidheid bij overlevers van borst-kanker en in een gemengde groep van overlevers van niet-uitgezaaide kanker. Er werd getoond dat licht-behandeling tijdens chemotherapie voor borst-kanker verhoogde vermoeidheid voorkomt, hoewel verrassend genoeg, deze effekten niet gemedieerd bleken door samenlopende effekten op het circadiaans ritme.

Samengevat: verstoorde slaap en gewijzigde circadiaanse of melatonine-ritmiciteit treden frequent op bij individuen met aanhoudende vermoeidheid, hoewel deze kan worden ervaren in afwezigheid van een veranderde slaap en circadiaans ritme. Slechts enkele studies hebben de verbanden tussen laag-gradige inflammatie en slaap of circadiaans ritme in de context van vermoeidheid beoordeeld, en de resultaten zijn inconsistent. Daarnaast warden associaties tussen slaap of circadiaans ritme en metabole uitkomsten niet bestudeerd in vermoeide populaties.

Samenvatting & besluit

We hebben hier een model voorgesteld van persistente vermoeidheid ten gevolge chronische laag-gradige inflammatie die leidt tot een onevenwicht in energie-beschikbaarheid en -verbruik, wat kan worden gemedieerd en onderhouden door veranderingen qua circadiaans ritme en slaap. De hier besproken literatuur duidt inderdaad op associaties tussen aanhoudende vermoeidheid bij CVS en CRF met veranderingen in cellulair metabolisme, verstoorde slaap en, in mindere mate, ontregelingen van het circadiaans ritme. Voor zowel CRF en CFS werden modellen met meerdere oorzaken gesuggereerd; deze omvatten niet enkel laag-gradige inflammatie en verstoorde slaap, maar ook veranderingen qua in stress-fysiologische responsen, genetische kwetsbaarheid en socio-demografische factoren (o.a.). Deze oorzaken zijn niet wederzijds exclusief en wijzen mogelijks op een beperkter aantal uiteindelijke eindpunten. We bespraken hier een dergelijk finaal gemeenschappelijk mechanisme, waarbij meerdere erkende bijdragende factoren aan persistente vermoeidheid zijn opgenomen.

Er zijn meerdere beperkingen omtrent de huidige stand van de kennis. Ten eerste: de meeste studies warden uitgevoerd bij patiënten met CVS, en dit is in het bijzonder het geval voor studies omtrent metabolisme en energie-produktie. Het is dus zeker onduidelijk in welke mate de bevindingen omtrent metabolisme en energie-produktie ook betrekking hebben op patiënten met CRF. Bovendien zijn slechts weinig rapporten beschikbaar die meer dan één van de gesuggereerde parameters voor ons voorgesteld model omvatten. Slechts twee studies verkenden associaties tussen laag-gradige inflammatie en slaap, één bij CVS-patiënten en één bij vermoeide borst-kanker patiënten. Naar ons weten werden er geen studies gepubliceerd die verbanden beschrijven tussen inflammatie en metabolisme bij patiënten met aanhoudende vermoeidheid. Ondanks dit gebrek aangaande meer allesomvattende studies, suggereert het bewijsmateriaal dat nu beschikbaar is, dat gedaalde beschikbaarheid van cellulaire energie een rol bij chronische vermoeidheid kan spelen wanneer deze vermoeidheid geassocieerd is met laag-gradige inflammatie. Daarnaast is er beperkt bewijs voor gestegen energie-verbruik voor aktiviteiten, wat suggereert dat het energie-verbruik niet aangepast is aan de mate van vermoeidheid of aan de energie-beschikbaarheid.

Interventie-studies gericht op het verbeteren van aspecten van het gepresenteerde model, met als uiteindelijk doel het verlichten van vermoeidheid, zijn nog schaars. Niettemin is het reeds duidelijk dat deelnemers aan dergelijke studies zorgvuldig geselekteerd dienen te worden en niet enkel op basis van hun ervaren van vermoeidheid. De studie waarbij zorgvuldige selektie van individuen met CVS met een avondlijke melatonine-start die later gewoonlijk valt en significant voordelige effekten onthulde van melatonine-supplementering, illustreert dit mooi. Dergelijke effekten werden niet gezien wanneer de deelnemers enkel werden geselekteerd op basis van hun vermoeidheid-toestand.

Samengevat: er is meer research nodig om inéén te puzzelen hoe chronische laag-gradige inflammatie kan leiden tot het ervaren van aanhoudende vermoeidheid. Niettemin ligt een mogelijke belangrijke verklaring bij gereduceerde cellulaire energie gekoppeld met verhoogde of maladaptieve veranderingen qua energie-verbruik. Bewijsmateriaal voor dit model kan worden gevonden voor zowel laag-gradige inflammatie als vermoeidheid.

september 22, 2018

Biomerker voor M.E.(cvs) d.m.v. ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:43 am
Tags: , , , , , ,

‘Single’ cel Raman spectroscopie (SCRS – Raman is een Indiaans fysicus) is een niet-invasieve technologie waarbij geen labeling nodig is en die analyse van individuele levende cellen toelaat ‘in vivo’. Spectroscopie is een wetenschappelijke techniek om stoffen te onderzoeken aan de hand van hun spectrum, een beschrijving van de in een signaal voorkomende golflengtes en hun sterkte. Dit wordt dikwijls gebruikt in de scheikunde. Een ‘single’ cel Raman spectrum omvat gewoonlijk 1.000 Raman-banden die informatie geven over de cel (bv. over nucleïnezuren, proteïnen, koolhydraten en lipiden) en een weerspiegeling zijn van cellulaire genotypes, fenotypes en fysiologische toestanden. Een Raman-spectrum fungeert als een molekulaire/strukturele ‘fingerprint’ van een individuele cel, waardoor het mogelijk wordt verscheidene cellen te identificeren/differentiëren zonder voorafgaande kennis over de cellen. Een belangrijk nadeel van SCRS is het feit dat spontane Raman-signalen van nature zwak zijn…

Monochromatisch licht (één golflengte), gewoonlijk van een laser interageert met de molekulaire vibraties, herschikkingen van atomen/molekulen of excitaties, waardoor de energie van de laser-fotonen (fotonen zijn elementaire deeltjes waaruit licht en alle andere elektromagnetische straling bestaat) wordt verschoven. Deze verschuiving geeft informatie over de vibraties in het systeem. De zgn. Raman ‘scattering’ (verstrooing/verspreiding) of het Raman effekt is de niet-elastische (de kinetische energie van een partikel blijft niet behouden) ‘scattering’ van een foton door molekulen waarbij het wordt geëxciteerd tot een hoger energie-niveau. Wanneer fotonen door een atoom of molekule worden verstrooid, is dat meestal ‘elastisch’: de verspreide fotonen hebben dezelfde energie (frequentie & golflengte) als de verstorende fotonen. Een klein deel (ca. 1 op 10 miljoen) wordt niet-elastisch verstrooid door een excitatie (frequentie en energie is anders en gewoonlijk lager dan die van de veroorzakende fotonen).

Het gebruik van deze techniek in onderstaande piloot-studie gaf (weerom) aanwijzingen voor metabole stoornissen bij M.E.(cvs).

————————-

Analyst (Pre-print augustus 2018)

A new approach to find biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CVS/ME) by single-cell Raman micro-spectroscopy

Jiabao Xu (1), Michelle Potter (2), Cara Tomas (3), Jo Elson (3), Karl J. Morten (2), Joanna Poulton (2), Ning Wang (4), Hanqing Jin (4), Zhaoxu Hou (4) & Wei E. Huang (1)

1. Department of Engineering Science, University of Oxford, Begbroke Science Park, Woodstock Road, Oxford, OX5 1PF, United Kingdom

2. Nuffield Department of Women’s and Reproductive Health, University of Oxford, the Women Centre, John Radcliffe Hospital, Headley Way, Headington, Oxford, OX3 9DU, United Kingdom

3. Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, United Kingdom

4. Mathematical Institute, University of Oxford, Andrew Wiles Building, Radcliffe Observatory Quarter, Woodstock Road, Oxford, OX2 6GG, United Kingdom

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), ook Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) genaamd, is een invaliderende aandoening die wordt gekenmerkt door lichamelijke en mentale uitputting. Er werd onderzoek verricht naar mitochondriale en energetische dysfunktie bij CVS-patiënten omwille van een kenmerkend verband met vermoeidheid; er werd echter nog geen consistent besluit getrokken. ‘Single’ cel Raman spectra (SCRS) zijn label-vrije biochemische profielen, die fenotypische ‘fingerprints’ van individuele cellen aangeven. In deze studie pasten we een nieuwe benadering op basis van ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om ρ0 cellen die mitochondriaal DNA (mtDNA) missen en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te onderzoeken van CVS-patiënten en gezonde controles. De resultaten van de experimenten tonen dat Raman-banden geassocieerd met fenylalanine in ρ0 cellen en PBMCs van CVS-patiënten significant hoger waren dan in het ‘wild type’ model en bij gezonde controles. Opmerkenswaardig is dat er ook een toename van de intensiteiten van Raman fenylalanine banden werd gezien bij CVS-patiënten. Aangezien gelijkaardige veranderingen werden gezien in het ρ0 cel model met een gekende deficiëntie in de mitochondriale respiratoire keten alsook bij CVS-patiënten, suggereren onze resultaten dat de stijging qua cellulair fenylalanine verband kan houden met mitochondriale/energetische dysfunktie in beide systemen. Interessant is dat fenylalanine kan worden gebruikt als een potentiële biomerker voor de diagnose van CVS d.m.v. SCRM. Een ‘machine-learning’ klassificatie-model bereikte een accuraatheid van 98% wat betreft het correct toewijzen van Raman-spectra aan de CVS- of de controle-groep. SCRM gecombineerd met een ‘machine-learning’ algoritme heeft daarom het vermogen om een diagnostisch instrument voor CVS te worden.

Inleiding

[…] Het blijft een uitdaging voor artsen en researchers, en een onvolledig gekarakteriseerde ziekte, ten dele omwille van de controversiële definitie, pathogenese en diagnose. Daarom is het vinden van potentiële biomerkers van groot belang voor het begrijpen van de ziekte en het ontwikkelen van een doelgerichte behandeling.

Mitochondrieën bleken van groot belang voor CVS-onderzoek omwille van nieuw bewijsmateriaal voor mitochondriale dysfunktie als een vermoedelijk biologisch mechanisme voor vermoeidheid. De onderliggende hypothese is dat vermoeidheid en andere vergezellende symptomen ten dele te wijten zijn aan een verstoord energie-metabolisme op cellulair niveau, dat grotendeels wordt bepaald door mitochondrieën als energie-fabriek en z’n ATP-produktie. Het ATP-profiel van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd aangewend als een diagnostisch instrument voor CVS maar de resultaten waren echter controversieel. Meerdere studies hebben gedaald ATP-niveau getoond in patiënten-groepen [bv. Castro-Marrero J et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxid Redox Signal. (2013) 19: 1855-60], terwijl andere geen verschillen konden detekteren of verrassend genoeg een verhoogde energie-produktie vonden bij CVS-patiënten [bv. Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med. (2010) 8: 93].

Hier, in een poging om mitochondriale dysfunktie en CVS-pathogenese te linken, probeerden we ‘single’ cel Raman-spectra (SCRS) te analyseren en universele biomerkers in cellen te identificeren. Een SCRS kan worden beschouwd als een intrinsieke chemische ‘fingerprint’ van een cel met zeer doorslaggevende Raman-banden voor belangrijke cellulaire bouwstenen zoals proteïnen, aminozuren, lipiden en fosfolipiden, en koolhydraten. Daarom zijn SCRS biochemische profielen van individuele cellen die fysiologische toestanden en metabole veranderingen weerspiegelen. Door de rijke en semi-kwantitatieve metabole informatie van afzonderlijke cellen, kan SCRS worden gebruikt om het cellulair metabolisme te beschrijven en ziekte-gerelateerde biomerkers te tonen.

In deze studie gebruikten we ten eerste ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) om fenotypische profielen van menselijke ρ0 cel-lijnen volledig ontdaan van mitochondriaal DNA (mtDNA) te bekomen om het effekt te bestuderen van ernstige mitochondriale dysfunktie. Ten tweede vergeleken we SCRS van PBMCs van 5 CVS-patiënten en 5 gezonde controles als piloot-studie om potentiële biomerkers voor CVS-diagnose te vinden. De vergelijking van de 2 resultaten biedt inzichten omtrent het verband van mitochondriale dysfunktie met de pathofysiologie van CVS en toont een coherente en consistente benadering voor de diagnose van de ziekte.

Experiment

Cel-cultuur, generatie van WT cybriden en PicoGreen-kleuring

De gebruikte 143B ρ0 cel-lijn zonder mtDNA […] wordt veelvuldig gebruikt bij studies die het pathogeen effekt van mtDNA-mutaties onderzoeken. […] De wild-type (WT) lijn werd gegenereerd door 143B ρ0 cellen te fuseren met normaal mtDNA […]. Het ‘herbevolken’ van de ρ0 lijn is een beter controle-systeem dan de originele 143B wild-type cellen […].

De aanwezigheid van mtDNA werd bevestigd d.m.v. kleuring met PicoGreen. […] Het mtDNA ‘copy-number’ van de ρ0 cellen en de WT cellen werd ook bepaald via ‘real-time’ PCR (vergelijking van celkern en mitochondriaal DNA). […]

ATP-metingen van WT en ρ0 cellen

[…]

Ethiek

[…]

Isolatie van PBMCs uit bloed-stalen

[…] Er werden morfologisch 2 types cellen met verschillende groottes (5-7 µm & 15-20 µm) in de PBMC-fractie gezien. Enkel de cellen met grotere afmetingen werden geselekteerd voor de Raman-experimenten na vergelijking van de resultaten (gegevens niet getoond), om de heterogeniteit door de verschillende cell-types te minimaliseren. Er dienen verdere experimenten te worden gedaan om de identiteit van de cellen te bevestigen (nu geloven we dat het monocyten zijn, op basis van de cel-populatie en grootte).

Metingen van ‘single’-cel Raman-spectra (SCRS)

[…] De gefixeerde cellen werden op een specifiek behandeld microscopisch plaatje gelegd (dat geen achtergrond Raman-signaal geeft). SCRS m.b.v. een Raman-microscpop en een 532 nm […] laser. […] Spectraal bereik: 330 tot 1900 cm-1 […] 5 s per spectrum, 10 spectra per cel & 20-30 ‘single’ cellen per conditie.

Voor-verwerking en analyse van Raman-gegevens

[…] Kwantificering van intracellulaire bio-molekulen via integratie van de corresponderende Raman-banden in SCRS. Banden geassocieerd met fenylalanine tussen 993-1013 cm-1 & 1022-1036 cm-1 werden gebruikt om de intracellulaire concentratie te kwantificeren. […]

‘Machine-learning’ klassificatie-model

Er werd een ‘machine-learning’ [wetenschappelijke discipline over het ontwerpen en ontwikkelen van instruktie-lijsten die computers moeten toelaten ‘gedragingen’ te ontwikkelen op basis van empirische gegevens (bv. van sensoren of uit databases; ook wel ‘data-mining’] klassificatie-model geconstrueerd op basis van SCRS van 5 CVS-patiënten en 5 controles (80 & 126 SCRS respectievelijk). Er werd een niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM [een ‘binaire klassificeerder’; wijst, aan de hand van een aantal kenmerken, objecten toe aan één van twee klassen – daarvoor moet ze eerst een numeriek model van deze objecten maken als punten in een wiskundige struktuur; in de training (inoefening) -fase brengt de SVM op basis van een verzameling van voorbeelden, waarvan is aangegeven tot welke klasse ze behoren, een scheiding aan die de twee klassen zo goed mogelijk van elkaar scheidt (die scheiding is een hyper-vlak); nadien kan de SVM dan voor een nieuw te klasseren object beslissen tot welke klasse het behoort door te kijken langs welke kant van het hyper-vlak het corresponderende punt in de ruimte ligt]) algoritme gebruikt om het model op te bouwen […]. Er werden niet-lineaire hyper-vlakken gebruikt om de gegevens te scheiden. ‘Leave-one-out’ kruis-validatie [kruis-validatie = techniek om na te gaan welke resultaten de statistische analyse van een voorspellend model zal hebben voor onafhankelijke gegevens] (LOOCV [zie hieronder]) werd aangewend om het model te evalueren en de sensitiviteit werd voor elke conditie en globaal berekend.

Extracellulaire flux analyse

De OXPHOS van PBMCs werd bepaald d.m.v. de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyser [zie ‘Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)’] […] Daarbij wordt de zuurstof-consumptie (OCR) opgenomen na opéénvolgende toediening van 1 μM oligomycine, 3 μM carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)-fenylhydrazone (FCCP), en een combinatie van 0,5 μM rotenon en 0,5 μM antimycine-A. […]

Resultaten en bespreking

Cellen zonder mtDNA hebben specifieke ‘single’-cel Raman spectra (SCRS)

PicoGreen kan specifiek worden aangewend om mitochondriaal DNA (mtDNA) te kleuren in levende cellen. Na incubatie met de kleurstof vertoonden ρ0 cellen waarin opnieuw wild-type mtDNA werd geïntroduceerd (WT cellen) helder gekleurde cel-kernen omgeven door talrijke heldere cytoplasmatische spikkels, terwijl ρ0 cellen slechts helder gekleurde cel-kernen zonder de omringende spikkels vertoonden, wat de depletie van mtDNA in ρ0 cellen bevestigt.

Aangezien mitochondrieën de primaire energie-fabriek van de meest eukaryote cellen zijn en de cel bevoorraden met metabole energie onder de vorm van ATP, hebben we de ATP-produktie van WT cellen en ρ0 cellen gemeten bij 50.000 of 75.000 cellen. Verrassend was dat bij beide cel-aantallen, ρ0 cellen gelijkaardige hoeveelheden ATP aanmaakten in vergelijking met WT cellen, als de toegevoegde glucose-concentraties hoog waren (11 mM & 25 mM). Aan de andere kant was de ATP-concentratie in ρ0 cellen significant lager dan in WT cellen bij lage glucose-concentraties (0 mM tot 5 mM). Onze resultaten suggereren dat, als er voldoende glucose is, ρ0 cellen zich kunnen aanpassen om ATP-produktie te stimuleren via niet-mitochondriale glycolyse ter compensatie voor de slechte mitochondriale respiratoire keten. Wanneer de glucose laag en ATP-produktie uit glycolyse beperkt is, is de WT cel-lijn in staat om switchen naar een mitochondriale manier van ATP-produktie gebruikmakend van de respiratoire keten via elektronen-transport gekoppelde fosforylatie (ETCP). De ρ0 cellen zijn echter niet in staat de ETCP te gebruiken omwille van de defekte mitochondrieën.

We pasten ‘single’ cel Raman micro-spectroscopie (SCRM) toe om de WT cellen en de ρ0 cellen bij hoog glucose te onderzoeken en de verschillen qua bio-energetisch mechanisme (ondanks een gelijkaardige ATP-aanmaak in de 2 cel-lijnen) te verklaren. […] Er werd een relatief lage standaard-deviatie gezien omwille van de beperkte heterogeniteit bij het in vitro bestuderen van de cel-lijnen. Vergeleken met WT cellen, vertonen ρ0 cellen een verschillend spectraal patroon in het ‘fingerprint’-gebied van hun SCRS (600-1.800 cm-1), wat typisch kan worden gebruikt als een fenotypische ‘fingerprint’ van cellen die de belangrijkste biochemische informatie bevatten.

Er werd dan ongecontroleerde ‘principal component analysis’ (PCA [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.]) aangewend om de vele dimensies van SCRS (omwille van de aanwezigheid van meer dan 1.500 Raman-banden) te reduceren. Een PCA-grafiek […] illustreert 2 duidelijk afscheidbare clusters die de WT cellen en ρ0 cellen weergeven. Er werd een diagram opgesteld voor de karakterisatie van de belangrijke Raman-banden. Het meest prominente kenmerk werd gezien bij 1003 cm-1, wat kan worden toegeschreven aan de aromatische ring [benzeen-ring; zes koolstof-atomen die in een vlakke ring liggen] van fenylalanine. Andere banden gerelateerd met fenylalanine bleken ook een grote bijdrage te leveren, inclusief 1.609 […], 1.030 […] en 618 […] cm-1. Alle banden gerelateerd met fenylalanine waren hoger in de ρ0 cellen vergeleken met de WT cellen, wat een belangrijke rol van het aminozuur fenylalanine in het metabolisme van cellen met mitochondriale dysfunktie aangeeft.

Andere verschillen omvatten banden rondom 1.658 […] en 1.440 […] cm-1, die beide hoger zijn in WT cellen t.o.v. ρ0 cellen. Dit suggereert dat, ondanks een hogere accumulatie van cellulair fenylalanine, ρ0 cellen een globale gedaalde intracellulaire concentratie van proteïnen lipiden te wijten aan een verstoord metabolisme hebben. Aangezien fenylalanine alleen wellicht onvoldoende is om het pathomechanisme te karakteriseren, dienen meer biomerkers te worden geïdentificeerd om mitochondriale dysfunktie simultaan en meer betrouwbaar te identificeren.

PBMCs van CVS-patiënten kunnen worden onderscheiden via één enkele Raman-merker

[…] Aangezien fenylalanine een potentiële biomerker in ρ0 cellen bleek, werd gehypothiseerd dat het een geschikte kandidaat kan zijn om bij CVS-patiënten – waarvan wordt gedacht dat ze een gelijkaardige bio-energetische dysfunktie hebben – te onderzoeken. Van de 5 patiënten vertoonden er 4 Raman-spectra met verhoogde fenylalanine-band op 1.003 cm-1 (CVS 1-4), terwijl de andere (CVS 5) een gelijkaardige intensiteit vertoonde i.v.g. met de controles. Door het gemiddelde te maken van 80 SCRS van de patiënten en 126 spectra van de controles, is het zichtbaarder dat de fenylalanine-band een uitgesproken stijging in de cellen van patiënten vertoont.

PCA van SCRS van 10 stalen toonde een aanzienlijke afscheiding tussen de CVS- en de controle-groep. Terwijl CVS 1-4 kleinere ellipsoïden vertoonden met weinig overlapping met de controles, had CVS 5 een hogere ‘single’ cel verspreiding en overlapte grotendeels met de ellipsoïden van de controles; wat correleert met de observatie aangaande fenylalanine. Om te verifiëren dat de afscheiding tussen de groepen in de PCA-clustering toe te schrijven was aan fenylalanine, zetten we het Raman golfgetal [hoeveel golven (golflengtes) per lengte-eenheid] uit tegenover de componenten die de grootste afscheiding tussen de groepen toonden. Raman-banden rond 1.003 en 1.030 cm-1 werden geïdentificeerd voor het beschrijven van de maximum varianties […]. De intracellulaire concentratie van fenylalanine werd semi-gekwantificeerd door het integreren van de Raman-banden op 1.003 en 1.030 cm-1, respectievelijk. Beide signatuur-banden voor fenylalanine bleken significant hoger bij de patiënten t.o.v. controles (p < 0.0001).

Eerdere research ondersteunt de mogelijkheid dat het pathomechanisme van CVS gelinkt is met veranderingen qua aminozuren. Er werden reducties van de concentraties van bepaalde aminozuren, inclusief fenylalanine, in het serum en urine van CVS-patiënten gerapporteerd [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta. (2012) 413: 1525-31 /// Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metaolomics (2015) 11: 1626-1639 /// Fluge Ø, Mella O et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome. JCI Insight. (2016) 1: e89376]. Deze bevindingen ondersteunen een mogelijk metabool defekt verbonden met het aminozuren-metabolisme bij CVS-patiënten, d.m.v. de analyse van de metabolomica van biologsiche vloeistoffen van de patiënten. Ons werk is, naar ons weten, het eerste dat melding maakt van de veranderingen in ‘single’ perifere bloedcellen van CVS-patiënten. Onze resultaten suggereren dat cellen van patiënten meer aminozuren (bv. fenylalanine) kunnen accumuleren, wat resulteert in een vermindering in de lichaamsvochten die wordt gezien in andere studies. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een inductie van secundaire redding-mechanismen om intracellulair meer aminozuren te accumuleren en een normale ATP-produktie te behouden in de metabool dysfunktionele patiënten-cellen [zie Fluge Ø, Mella O et al. hierboven]. Verder toont onze bevinding de impact van fenylalanine in zowel ρ0 cellen zonder mtDNA en bloedcellen van CVS-patiënten, die mitochondriale defekten ook kan linken met CVS. Niettemin: hoe de gestegen fenylalanine-waarden in PBMCs in verband staan met andere weefsels bij de patiënten is nog onduidelijk. Raman-benaderingen die fenotypische spectra kunnen leveren van weefsels zou zeer nuttig kunnen zijn bij toekomstige onderzoeken.

Er werd een extracellulaire flux analyse uitgevoerd bij 4 CVS-patiënten die het meest ongelijk waren van de controles wat betreft SCRS-resultaten (CVS 1-4), om te onderzoeken of er een correlatie bestaat tussen abnormaliteiten qua oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) en de SCRS-analyse wanneer PBMCs geïncubeerd worden in laag- en hoog-glucose. Twee van de patiënten hadden een zeer lage OXPHOS in beide condities (CVS 2 & 4) en de andere 2 hadden veel hogere OXPHOS-profielen (CVS 1 & 3). Hoewel bij de OXPHOS-analyse er mitochondriale deficiëntie uitgesproken werd gedetekteerd in 2 van de 4 patiënten, was SCRS van PBMCs in staat bij alle 4 de abnormaliteiten op te pikken. Niettemin is het staal patiënten en controles klein als we de mogelijks grote heterogeniteit bij CVS-individuen in acht nemen. Onze resultaten dienen als een piloot-studie om het potentieel te verkennen van SCRM als instrument om biomerkers voor CVS te identificeren. Er wordt een studie op grotere schaal voorbereid om de resultaten van dit werk te consolideren.

‘Machine-learning’ modellen kunnen CVS-patiënten met succes en met hoge accuraatheid klassificeren

Bij Raman-benaderingen is, naast het afleiden van kenmerken om informatieve biomerkers te vinden, de klassificatie gebaseerd op spectra dikwijls wenselijk voor diagnostische doeleinden. ‘Machine-learning’ benaderingen zijn gewoonlijk geschikt om de gecompliceerde Raman gegevens-set op te delen in componenten. Niet-lineaire ‘support vector machine’ (SVM) [uitgelegd bij ‘Experiment’] is een gesuperviseerd [input en output duidelijk gedefinieerd] leer-algoritme […] om verschillende klassen te scheiden die d.m.v. lineaire klassificatie niet te scheiden zijn. Er werd een klassificatie-model ingeoefend via niet-lineaire SVM om het onderscheid te maken tussen de CVS-groep en controle-groep op basis van hun SCRS (80 SCRS voor de CVS-groep, 126 SCRS voor de controle-groep). Er werd ‘leave-one-out’ kruis-validatie gebruikt om het model te evalueren door éénder welke van 205 spectra te gebruiken om het model te trainen en dan te testen of het model het ene weggelaten spectrum correct kan klassificeren. Dit model was in staat de CVS-groep met succes te klassificeren met een sensitiviteit van 96,3% (77 van de 80) en de controle-groep met een sensitiviteit van 99,2% (125 van de 126). De lagere sensitiviteit die wordt gezien voor de patiënten-groep kan worden verklaard door de aanwezigheid van hogere heterogeniteit bij de CVS-patiënten. Er werd een totale accuraatheid van 98,1% bereikt op basis van 206 Raman-spectra. Opmerkenswaardig: bij een groter wordend staal en aantal Raman-spectra om de referentie-database op te bouwen, kunnen klassificatie-modellen met betere deugdelijkheid worden bereikt. Aangezien één Raman-spectrum binnen luttele seconden kan worden verkregen, kan één patient-staal bestaande uit meerdere spectra en meerdere cellen worden gekarakteriseerd en geklassificeerd binnen enkele minuten, wat een enorm potentieel en haalbaarheid in de klinische praktijk impliceert.

Besluiten

Deze studie werd uitgevoerd om de haalbaarheid van of ‘single’ cel Raman-analyse te evalueren bij de detektie van biomerkers gerelateerd met mitochondriale dysfunktie en CVS. Zodoende identificeerden we een verhoogde intracellulaire concentratie van het aromatisch aminozuur fenylalanine [essentieel aminozuur dat nodig is voor diverse biochemische processen; onder andere voor de aanmaak van de neurotransmitters dopamine, adrenaline en noradrenaline] en toonden dat het kan worden gebruikt als een potentiële biomerker in ρ0 cellen zonder mitochondriaal DNA, alsook in perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS-patiënten. Bovendien gaf een ‘machine-learning’ model een accuraatheid van 98,1% correct te klassificeren van patiënten en controles op basis van hun Raman-spectra. De combinatie van Raman-biomerkers en klassificatie-modellen zou kunnen leiden tot verbeteringen omtrent het begrijpen van CVS-pathogenese en het potentieel hebben te worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor CVS.

mei 5, 2018

Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen

Filed under: Behandeling,Celbiologie — mewetenschap @ 7:52 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel betreffende AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) – niet te verwarren met ‘mitogen-activated protein kinase’ (MAPK) – is een vervolg op ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS’. AMPK is een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt; een nutriënten- en energie-sensor die zorgt voor energie-homeostase. Het is ook betrokken bij de ‘cell danger response’, beschreven door Robert Naviaux: “AMPK optimaliseert de energie-efficiëntie en stimuleert de recyclage van cellulaire materialen bij autofagie (opruimen van beschadigde mitochondrieën). De mechanismen die geaktiveerd worden door AMPK ondersteunen regeneratie en zijn anti-inflammatoir omdat ze beschadigde proteïnen, lipiden, glycanen, RNA en DNA afbreken. AMPK faciliteert de her-synthese van deze macromolekulen via nieuw gesynthetiseerde monomeren en ververste bouwstenen.”.

Ook op te merken (zie ons stuk ‘Potentiële speeksel-biomerkers bij M.E.(cvs)’):“Er werd een een downregulering van ZAG (zink alfa-2-glycoproteïne; een belangrijke regulator van het energie-metabolisme in skelet-spieren) gevonden bij CVS. Dit adipokine (cytokine afgegeven door vet-weefsel) speelt een rol bij aktivatie AMPK, een belangrijke regulator van energie-metabolisme in cellen van menselijke skelet-spieren.”…

In een kort overzicht getiteld ‘Metabolic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis’ (Biochemical Society Transactions; 2018) Laat Prof. Julia Newton optekenen: “Studies die veranderingen qua mitochondriale funktie bij M.E./CVS tonen, dienen omzichtig te worden geïnterpreteerd aangezien de mitochondriale veranderingen te wijten kunnen zijn aan de ontregeling van verdergelegen signalisering-mechanismen, zoals het AMPK-mechanisme, eerder dan een defekt in de mitochondrieën zelf.”

AMPK-aktivatie door metformine bleek al de respons op oxidatieve stress en het mitochondriaal metabolisme te verbeteren in fibromyalgie-fibroblasten (‘Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from Fibromyalgia patients’; Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease (2015) 1852: 1257-1267)…

————————-

Bioscience Reports (Pre-print April 2018)

Pharmacological activation of AMPK and glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from patients with M.E./CVS

Audrey E Brown, Beth Dibnah, Emily Fisher, Julia L Newton, Mark Walker

Institute of cellular medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

Samenvatting

Achtergrond Vermoeide skeletspieren en post-exertionele malaise zijn sleutel-symptomen van Myalgische Encefalomyelitis (M.E./CVS). We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord zijn in celculturen van menselijke skeletspieren afkomstig van patiënten M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie, een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro. Het doel van deze studie was vaststellen of AMPK farmacologisch kan worden geaktiveerd bij M.E./CVS.

Methodes

Primaire skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden behandeld met metformine of ‘compound 991’. De AMPK-aktivatie werd beoordeeld via western-blot en de glucose-opname werd gemeten.

Resultaten Zowel metformine als ‘compound 991’ behandeling verhoogde de AMPK-aktivatie en glucose-opname in culturen van spiercellen significant bij controles en M.E./CVS. De cellulaire ATP-inhoud bleef onveranderd door de behandeling hoewel deze significant verminderd was bij M.E./CVS t.o.v. controles.

Besluiten Farmacologische aktivatie van AMPK kan de glucose-opname in spiercel-culturen van patiënten met M.E./CVS verbeteren. Dit suggereert dat het feit dat elektrische puls stimulatie AMPK in dergelijke spiercel-culturen niet kon aktiveren, te wijten is aan een defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defect af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij M.E./CVS-patiënten verbetert.

Inleiding

[…]

AMP-geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK) is een belangrijke mediator van de skeletspier-respons op inspanning. In respons op een energie-tekort, zoals tijdens spier-contractie, wordt AMPK geaktiveerd, resulterend in het uitschakelen van ATP-verbruikende processen en het opstarten van ATP-genererende processen. In skeletspieren omvat dit een verhoging van de opname van glucose in de spiercellen. We hebben eerder aangetoond dat AMPK-aktivatie verstoord is in celculturen van skeletspieren afkomstig van patiënten met M.E./CVS in respons op elektrische puls stimulatie (EPS), een methode die samentrekking van spiercellen induceert in vitro [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982]. Deze abnormale AMPK-aktivatie resulteerde ook in een onvermogen op glucose-opname in de cellen in respons op EPS te verhogen.

AMPK is een heterotrimeer [samengesteld uit 3 verschillende onderdelen] complex van α, β & γ subunits. Er bestaan meerdere isoformen voor elke subunit en sommige isoformen komen tot expressie in een celtype- of weefsel-specifieke manier. AMPK kan allosterisch [verandering (dikwijls door wijziging van de 3-dimensionele vorm) van de aktiviteit van een proteïne/enzyme door de binding van een effector-molekule op een specifieke plaats] worden geaktiveerd, vooral door AMP, of via aktivatie van kinasen [groep enzymen die een fosfaat-groep aanbrengen op een proteïne of andere molekule (fosforylatie)] inclusief lever kinase-B1 (LKB1) en het Ca2+/calmoduline-afhankelijk kinase kinase (CaMKK). AMPK kan ook worden gereguleerd door farmacologische middelen zoals metformine, dat AMPK indirect aktiveert via de inhibitie van de ATP-synthese. Er werd een aantal kleine aktiverende molekulen ontwikkeld die direct op AMPK binden, resulterend in allosterische aktivatie van AMPK.

Het doel van deze studie was om te onderzoeken of AMPK gemodifieerd kan worden door farmacologische behandeling van culturen van menselijke skeletspier-cellen afkomstig van patiënten met M.E./CVS. We gebruikten een indirecte aktivator van AMPK (metformine [medicijn ter behandeling van diabetes type-2]) en een directe aktivator (‘compound 991’ [kleine organische molekule die bindt op AMPK; ontwikkeld door Merck – patent WO2010036613) om AMPK-aktivatie, glucose-opname en ATP-content van spiercellen na te gaan.

Studie-ontwerp en methodes

Studie-individuen

Er werden spier-biopten verkregen van 10 patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom en 7 gezonde controle-individuen. De groepen warden gematcht voor leeftijd, en omvatten vrouwen en mannen. […] Alle patiënten voldeden aan de Fukuda criteria […]. Niemand vertoonde een neurologisch gebrek op basis van de klinische beoordeling. […]

Reagentia

[…]

Celculturen

[…] Alle experimenten warden uitgevoerd op gedifferentieerde myotubes [zich ontwikkelende skelet-spier-vezels] […].

Western-blotting

[…]

ATP-bepaling

[…]

Glucose-opname

[…]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op AMPK-aktivatie

Skeletspier-cellen van 7 gezonde controles en 8 CVS-individuen werden opgekweekt gedurende 7 dagen om te differentiëren. De cellen werden behandeld met 2 mM metformine gedurende 16 h of 1 μM ‘compound 991’ gedurende 2 uur vóór proteïne-extractie en ‘western blotting’. Metformine-behandeling verhoogde significant de AMPK-aktivatie […] bij controle- (p < 0.01) en CVS- (p < 0.05) myotubes (t.o.v. onbehandeld). De behandeling met ‘compound 991’ had een gelijkaardig effect: significante toename van de AMPK-aktivatie t.o.v. onbehandelde myotubes bij controles en CVS (p < 0.05). De fosforylatie van acetyl-CoA carboxylase [enzyme; AMPK is de voornaamste kinase-regulator van ACC] verhoogde op een dosis-afhankelijke manier in respons op ‘compound 991’.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op glucose-opname

Er kan worden verwacht dat de aktivatie van AMPK leidt tot een toename qua glucose-opname. Metformine-behandeling verhoogde significant de glucose-opname bij controle- en CVS-cellen, en het effekt was vergelijkbaar met dat van insuline. Bij de controles verhoogde metformine de glucose-opname van 632,8 ± 50,4 pmol/mg/min tot 1.014 ± 79,2 pmol/mg/min (p < 0.0005), terwijl bij CVS de glucose-opname steeg van 576,4 ± 26,5 pmol/mg/min tot 715 ± 21,2 pmol/mg/min (p < 0.0005). Behandeling met ‘compound 991’ verhoogde ook de glucose-opname bij concentraties van 0,1 μM & 1 μM bij zowel controle- als CVS-cellen. Bij de controles steeg de glucose-opname van 802,2 ± 59,4 pmol/mg/min tot 963,9 ± 37,9 pmol/mg/min en 1.084,3 ± 44,9 pmol/mg/min (p < 0.05) voor 0.1 μM & 1 μM 991, respectievelijk. ‘Compound 991’ verhoogde de glucose-opname van 633,8 ± 56,8 pmol/mg/min tot 933,7 ± 93,3 pmol/mg/min (p < 0.01) en 913,9 ± 105,7 pmol/mg/min (p < 0.01) voor 0,1 μM & 1 μM, respectievelijk. Voor zowel controle- als CVS-cellen was het effekt van de behandeling met ‘compound 991’ vergelijkbaar met dat van insuline.

Effekt van metformine & ‘compound 991’ op cellulaire ATP-inhoud

Behandeling met metformine of ‘compound 991’ verlaagde de cellulaire ATP-inhoud niet. De ATP-inhoud is echter significant gedaald in spiercel-culturen van CVS-patiënten in vergelijking met controles (p < 0.05), ongeacht de behandeling.

Bespreking

Deze studie toont aan dat AMPK en daaropvolgende ‘downstream’ effekten kunnen worden geaktiveerd door zowel een indirecte (metformine) als directe (‘compound 991’) aktivator van AMPK in skeletspier-cellen van patiënten met M.E./CVS. Dit in tegenstelling met onze eerdere studie van dezelfde spiercel-culturen die toonde dat EPS-gemedieerde contractie niet in staat was AMPK en glucose-opname te aktiveren in skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten. Deze bevindingen duiden op een signalisering-defekt in de nabijheid van AMPK en er zijn verdere studies aan de gang om de expressie en werking van de belangrijkste proximale signalisering-molekulen te verkennen in M.E./CVS-culturen. Dit is het eerste rapport dat aantoont dat ‘compound 991’ actief is bij menselijke skeletspiercel-culturen. Er werd eerder aangetoond dat ‘compound 991’ de AMPK-aktiviteit en glucose-opname verhoogt in geïsoleerde skeletspieren van ratten. Deze effekten worden te niet gedaan in AMPKα1-/α2 myotubes van ‘knockout’ muizen, wat suggereert dat ‘compound 991’ specifiek werkt via AMPK. Verder bewijsmateriaal voor de specificiteit van ‘compound 991’ van AMPK wordt aangegeven door een screening van ‘compound 991’ tegen een panel proteïne-kinasen in cel-vrije testen. Dit toonde dat ‘compound 991’ AMPK-aktiviteit versterkt terwijl het geen effekt heeft op ‘upstream’ kinasen inclusief LKB1 & CaMKK.

Bewijsmateriaal geeft aan dat AMPK-aktivatie de glucose-opname verhoogt via aktivatie van AS160 [proteïne dat fosforylatie-afhankelijke glucose-opname in spiercellen medieert] en glucose-transporter translocatie naar het cel-membraan. Als onderdeel van ons lopend werk, onderzochten we hoe het zit met de AMPK-gemedieerde glucose-opname (met bijzondere focus op glucose-oxidatie en glycolyse) in de M.E./CVS-culturen. De regulering van AMPK is complex. Naast allosterische aktivatie door de binding van AMP, kan AMPK geaktiveerd worden door upstream kinasen zoals LKB1 & CaMKK. Een verstoorde inspanning-gestimuleerde glucose-opname in spier-specifieke LKB1 ‘knockout’ [gen coderend voor lever kinase-B1 ontbreekt] muizen suggereert dat LKB1 het voornaamste kinase zou kunnen zijn dat betrokken is bij regulering van AMPK bij contractie van skeletspieren. Het verband tussen AMPK en inspanning-tolerantie werd ook aangetoond bij AMPK-‘knockout’ muizen. Een skeletspier-specifiek AMPK-‘knockout’ model toonde een verminderde inspanning-capaciteit (‘voluntary wheel running’ [aktiviteit-meting bij proefdieren, waarbij ze vrij in een rad lopen] en ‘treadmill running to exhaustion’ [inspanning op een loopband tot uitputting]). Verstoorde spier-funktie werd aangegeven door een gedaalde maximale kracht en resistentie tegen vermoeidheid ex vivo [experiment met levend weefsel, buiten het lichaam]. Het is ook duidelijk dat spier-funktie sterk afhankelijk is van de metabole funktie, bijzonderlijk glucose-opname, zoals getoond in GLUT4-‘knockout’ [gen coderend voor glucose-transporter type-4 ontbreekt] muizen. Deze modellen tonen dat wanneer de glucose-opname verstoord is, de gevoeligheid voor vermoeidheid na inspanning versterkt is. Onderzoekers toonden ook dat de maximale kracht-ontwikkeling en het samentrekking-vermogen gedaald waren in deze muizen-modellen. Zoals werd gezien voor onze M.E./CVS skeletspiercel-culturen, in respons op contractie geïnduceerd door EPS, zijn zowel AMPK-aktivatie en glucose-opname verstoord is. We zouden voorspellen dat het ontbreken van een effekt op glucose-opname door EPS de samentrekking van spieren zou kunnen verstoren, leidend tot inspanning-intolerantie. De huidige studie suggereert dat dit onvermogen om AMPK te aktiveren in respons op contractie zou kunnen worden omzeild d.m.v. een farmacologische interventie, en bijdraagt aan het bewijs voor een klinische test aangaande een AMPK-aktivator in M.E./CVS.

Een andere belangrijke bevinding van deze studie is de significante daling qua cellulaire ATP-inhoud in skeletspieren bij M.E./CVS t.o.v. gezonde controles. Deze afname trad op ongeacht de behandeling en werd op 2 afzonderlijke momenten gemeten. Een gereduceede ATP-inhoud werd eerder al gezien bij M.E./CVS-patiënten na inspanning [Wong R et al. Skeletal muscle metabolism in the Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chest (1992) 102: 1716-1722] en verstoorde ATP-synthese werd ook al vastgesteld bij patiënten in vivo [Vermeulen RC, Kurk RM, Visser FC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93]. De ATP-inhoud beïnvloedt cel-overleving: een met leeftijd gerelateerde afname van de ATP-hoeveelheid in gecultiveerde fibroblasten is gelinkt met een verhoogde gevoeligheid voor cel-dood door necrose. Een andere studie rapporteerde echter verhoogde ATP-waarden in perifeer bloed mononucleaire cellen van patiënten met M.E./CVS [Lawson N et al. Elevated Energy Production in Chronic Fatigue Syndrome Patients. J Nat Sci (2016) 2]. Deze auteurs suggereerden dat vermoeidheid gelinkt zou kunnen zijn met niet-mitochondriale processen die ATP produceren, zoals glycolyse.

Potentiële oorzaken van een reductie qua cellulaire ATP-inhoud omvatten stoornissen van de mitochondriale funktie, een afname van het mitochondriaal membraan potentiaal, of verhoogde produktie van reaktieve zuurstof/stikstof soorten (ROS/RNS). Bewijsmateriaal voor een daling van de mitochondriale funktie in skeletspieren bij M.E./CVS is tegenstrijdig. Sommige studies vonden een verminderde mitochondriale inhoud, maar geen mitochondriale dysfunktie in skeletspier-biopten van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles [Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-738], terwijl anderen metabole abnormaliteiten (consistent met verstoorde mitochondriale werking) identificeerden bij M.E./CVS [Naviaux RK, Naviaux JC et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: E5472-5480]. ROS kunnen een belangrijke rol spelen bij het vermogen van skeletspieren om zich aan te passen bij inspanning maar evenzeer kunnen toegenomen ROS de mitochondriale funktie verstoren, de samentrekkingskracht van spieren reduceren en bijdragen tot spier-dysfunktie. Er is enig bewijsmateriaal dat suggereert dat oxidatieve stress mechanismen geaktiveerd zijn in vivo bij M.E./CVS [Kennedy G, Spence VA, McLaren M et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39: 584-589] maar, naar ons weten, werd dit niet onderzocht in vitro. Toekomstig werk zal zich moeten focussen op het onderzoeken van de mechanismen die er voor zorgen dat contractie AMPK niet kan aktiveren en op de mitochondriale funktie in skeletspieren.

De belangrijk bevindingen van deze studie zijn dat, ten eerste, farmacologische aktivatie van AMPK de glucose-opname in skeletspiercel-culturen van M.E./CVS-patiënten kan verbeteren en, ten tweede, cellulaire ATP-inhoud significant verminderd is in M.E./CVS spiercel-culturen. De vaststelling dat AMPK op een directe manier werd geaktiveerd door metformine en ‘compound 991’ maar niet via EPS in M.E./CVS culturen duidt op een signalisering-defekt proximaal aan AMPK. Er is verder werk vereist om het defekt af te lijnen en te bepalen of farmacologische aktivatie van AMPK de spier-funktie bij patiënten met M.E./CVS verbetert.

januari 25, 2018

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie bij CVS?

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 12:26 pm
Tags: , , , , , , ,

In het artikel ‘Metabolic profiling indicates impaired pyruvate-dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome’ (zie ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’) rapporteerden de Noorse Ritixumab-onderzoekers Øystein Fluge & Olav Mella over een funktionele verstoring van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) op basis van biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. Hun resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van andere metabolisme-researchers.

Een Noorse arts/professor van de afdeling Medische Biochemie van het Universitair Ziekenhuis van Oslo, goed op de hoogte in zake de biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, publiceerde een commentaar/kritiek daarop in een landelijk tijdschrift (enkel in het Noors).

Fluge & Mella hebben het eerder over een PDH-inhibitie (suppressie/onderdrukking). Dit kan misschien een gevolg zijn van een andere dysfunktie in het energie-metabolisme. Nu wordt er geargumenteerd dat er geen deficiëntie is. Spreekt men hier over twee verschillende dingen? Het is bij wetenschappelijk onderzoek ook van belang kritiek in acht te nemen en daarom geven wij dit mee. Bij verder onderzoek kan zeker rekening worden gehouden met de aanbevelingen.

De auteur gaf als belangen-conflict aan dat hij een vergoeding heeft ontvangen voor een lezing op een professioneel forum van psychiaters, ondersteund door het farmaceutisch bedrijf Lundbeck.

————————-

Tidsskr Nor Laegeforen. (2017) 137: 23-24

Tenuous link between Chronic Fatigue Syndrome and pyruvate dehydrogenase deficiency

Yngve Thomas Bliksrud

In een studie van het energie-metabolisme bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom concludeerden onderzoekers verminderde pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit bij patiënten, maar de metingen passen niet bij de veranderingen die we zien bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie.

In een studie gepubliceerd in december 2016 werd een gewijzigd patroon van aminozuren in plasma gevonden bij patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Bovendien werd veranderde gen-expressie gedetekteerd in witte bloedcellen en veranderde de energie-produktie in spiercellen [zie link in onze inleiding]. De auteurs interpreteren de resultaten als expressie van funktionele remming van het enzyme pyruvaat-dehydrogenase, en ze suggereren een ontregeling van dit enzyme-complex als mogelijke belangrijke factor in de pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Het onderzoek kreeg uitgebreide aandacht in de [Noorse] media en de link met pyruvaat-dehydrogenase werd openbaar gemaakt zonder voorbehoud. In ons laboratorium ontvingen we stalen voor de metabole screening van patiënten met mogelijk vermoeidheid-syndroom. Op basis van mijn ervaring met biochemische diagnose van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, wil ik wijzen op gebreken in de studie die moeten aansporen tot een aanzienlijk grotere mate van voorzichtigheid omtrent de conclusies.

Kritiek op methode en interpretatie

In het onderzoek werden aminozuur-concentraties in plasma van 200 patiënten en 102 gezonde controle-personen onderzocht. De onderzoekers vonden significante verschillen tussen de twee groepen maar de betekenis is onduidelijk omdat ze zich niet hebben gebaseerd op de gevestigde diagnose van pyruvate-dehydrogenase deficiëntie en omdat de stalen niet op een gestandaardiseerde manier zijn genomen.

AMINOZUREN-PATROON VOLDOET NIET AAN WAT WIJ ZIEN BIJ PATIËNTEN MET PRIMAIRE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

Pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie verhoogt de concentratie van pyruvaat in bijvoorbeeld spier- en zenuwcellen. Pyruvaat wordt omgezet in lactaat en het aminozuur alanine. Alanine is het enige aminozuur dat naar verwachting buiten het referentie-gebied valt in plasma en cerbrospinaal vocht bij primaire pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie (één tot twee keer de bovengrens van referentie). Het onderzoek meldde echter een neiging tot lagere alanine-spiegels bij de patiënten. Het is verrassend dat deze opvallende discrepantie niet in het artikel wordt genoemd.

VERKEERDE NORMALISATIE VOOR TESTEN KAN HET VERSCHIL TUSSEN DE GROEPEN VERKLAREN

Een vasten-test wordt sterk aanbevolen bij het bepalen van de plasma-concentratie van aminozuren, omdat de niveaus aanzienlijk variëren met het dieet en ook gedurende de dag tot 10-15%. In de studie worden niet-nuchtere aminozuur-patronen met kleine afwijkingen vergeleken. Het is heel vreemd dat de auteurs geen grotere bedenkingen hebben bij dieet als een verstorende factor wanneer ze zelf hebben aangetoond dat het dieet alleen de groep aminozuren beïnvloedt die argumenteren voor verstoord pyruvaat-dehydrogenase. De studie toonde significante verschillen tussen nuchtere en niet-nuchtere patiënten. De nuchtere patiënten werden daarom uitgesloten van verdere statistische analyse. De auteurs moeten ook duidelijker maken dat een mogelijke verborgen vertekening tussen de patiënten-groep en de controle-groep met betrekking tot voeding en staalname een alternatieve verklaring kan zijn voor de gevonden verschillen. Systematische verschillen in voeding tussen de groepen zijn niet ondenkbaar. […]

WAT MET DE PYRUVAAT/LACTAAT-RATIO EN EEN DIRECTE METING VAN DE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE AKTIVITEIT?

De pyruvaat/lactaat-verhouding in het plasma kan patiënten met pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie van andere patiënten met hyperlactacidemie [verhoogd lactaat in het bloed] onderscheiden. Deze ratio heeft daarom een centrale plaats in de biochemische diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. In het onderzoek werd de pyruvaat/lactaat-verhouding niet bepaald. Dat is jammer: de verhouding had een belangrijke aanwijzing kunnen geven voor, mogelijk tegen, pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Een directe bepaling van de enzyme-aktiviteit in de cellen is ook de sleutel bij de routine-matige diagnostiek van pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie. Het is vreemd dat dit in de studie niet is gedaan in spiercellen die groeien in de aanwezigheid van serum van de patiënt.

SPECIFIEKE LINK MET CHRONISCHE VERMOEIDHEID SYDROOM VEREIST MEERDERE CONTROLE-GROEPEN

In de studie heeft de patiënten-groep een ander expressie-patroon dan de controle-groep met betrekking tot genen geassocieerd met het pyruvaat-dehydrogenase complex. Dit is een interessant resultaat maar de studie biedt geen basis voor het interpreteren van het verschil als specifiek voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Volgens de consensus-criteria hebben patiënten een “aanzienlijk verminderd aktiviteiten-niveau” gehad gedurende minimaal zes maanden. Het is bekend dat de expressie van genen geassocieerd met het volledige metabolisme (inclusief pyruvaat-dehydrogenase complex) verandert bij immobilisatie. Spieren groeien en verdwijnen naar gelang het aktiviteit-niveau, daarom zijn er in deze studie verschillende expressie-patronen te verwachten. Vooraleer het expressie-patroon specifiek kan worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom, moet het niet alleen worden vergeleken met gezonde mensen maar met andere patiënten-groepen die een overeenkomstig verminderd aktiviteiten-niveau ervaren, zoals een beroerte, fracturen, nier-falen of ernstige depressie. In het onderzoek werd ook aangetoond dat in spiercellen in vitro het energie-metabolisme kan veranderen in de aanwezigheid van serum van patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het is interessant dat dit experimenteel kan worden aangetoond maar evenmin kan deze waarneming specifiek worden gekoppeld aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Nogmaals: meer controle-groepen van patiënten met verminderde aktiviteiten-niveaus zijn om andere redenen nodig. De studie laat bijvoorbeeld een verminderde produktie van hoge-energie fosfaten (ATP) in vitro zien. In een muizen-model waarin spiercellen worden gekweekt in aanwezigheid van serum van individuen met spier-atrofie en chronisch nierfalen, neemt de ATP-produktie ook af.

CHRONISCHE VERMOEIDHEID IS NIET TYPISCH VOOR PRIMAIRE GENETISCHE PYRUVAAT-DEHYDROGENASE DEFICIËNTIE

De auteurs suggereren dat pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie een sleutel is in de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Chronische vermoeidheid is geen typisch symptoom bij patiënten met primaire genetische pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie, noch ernstig noch mild. Het vereist een opmerking maar wordt met geen woord vermeld.

Pragmatische beoordelingen gevraagd

Onderzoek naar metabole mechanismen voor het Chronische Vermoeidheid Syndroom is interessant, en het grote werk van Fluge en collega’s kan hypotheses genereren die verder onderzoek waard zijn. De auteurs komen echter al heel vroeg vast te zitten bij de opvallende pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie als onderdeel van de pathofysiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Momenteel is het verband tussen bewezen aminozuur-veranderingen en pyruvaat-dehydrogenase deficiëntie te zwak, en de verandering in gen-expressie en energie-metabolisme is te onspecifiek voor een dergelijke harde conclusie.

————————-

De endocrinoloog Emeritus Professor Frank Comhaire (Universitair Ziekenhuis, Gent) staat bekend als specialist op het vlak van de behandeling van mannelijke infertiliteit en ondernemer (het op de markt brengen van testen en complementaire behandelingen). De voorbije jaren ontwikkelde hij ook een interesse voor M.E.(cvs)…

In een artikel getiteld ‘Chronic Fatigue Syndrome (CFS) or “systemic immune disorder” (SID)? (Internal Medicine 2016, 6: 225) rapporteerde hij dat er bewijs voor het feit dat “CVS te wijten” is “aan een systemische immuun-stoornis waarbij oxidatieve, immunologische en epigenetische mechanismen de aktiviteit van pyruvaat-dehydrogenase kinase (PDHK) kunnen verhogen en de pyruvaat-dehydrogenase aktiviteit inhiberen”. Op basis daarvan liet hij een ‘nutriceutical’ (voeding-supplement) testen dat bepaalde organische zuren van algen, vitamine-B1, alfa-liponzuur, acetyl-L-carnitine en oxidoreductase-ubiquinon Q10 bevat. Bij publicatie van een kleine piloot-studie (n = 10; patiënten gediagnosticeerd in Belgische CVS-referentie-centra (!???!)) (‘A Novel Nutriceutical Treatment of Myalgic Encephalitis/Chronic FatigueSyndrome (ME/CFS): “What it is and what it is not”; Internal Medicine 2017, 7:5) bleken er evenveel responders als niet-responders te zijn. Deze laatsten bleken uiteindelijk (na verdere diepgaande screening) aan een andere aandoening dan M.E.(cvs) te leiden. Op het moment van het verschijnen van het artikel was een patent hangende…

Er werd verder meegegeven dat een mogelijke diagnostische methode voor de detektie van deficiënte enzymatische aktiviteit van PDH is: het meten van de concentraties van pyruvaat en acetyl-coenzyme-A in monocyten. “Dit vergt geavanceerde laboratoriumtechnologie”…

Merk op: het tijdschrift Internal Medicine (met slechts een beperkte impact en niet opgenomen in PubMed of Web Of Science) is niet het gerenommeerde Journal of Internal Medicine of het befaamde Annals of Internal Medicine…

november 10, 2017

Cellulaire bio-energetica verstoord bij patiënten met M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:36 am
Tags: , , , ,

Julia Newton en haar collega’s van de ‘Newcastle University’ rapporteren hier dat PBMCs (type witte bloedcellen in het circulerend bloed) van M.E.(cvs)-patiënten niet in staat zijn om voldoende energie te produceren. Bij bevestiging (bij grotere groepen en andere types cellen) zou dit een indicatie kunnen zijn voor een elematair probleem bij de aandoening.

Ze bestudeerden het oxidatieve fosforylatie systeem (‘elektronentransportketen’, mitochondriaal mechanisme voor de produktie van energie (ATP) en de glycolyse (omzetting van glucose waarbij ook energie vrijkomt) onder basale omstandigheden en onder ‘stress’ (belasting), en concludeerden dat de cellen bij fysiologische stress (lees: hogere nood aan glucose) minder in staat zijn om de cellulaire (mitochondriale) ademhaling op te drijven en zo tegemoet te kunen komen aan de energie-behoeften. Een zoveelste aanwijzing dat er iets mis is met de cellulaire energie-produktie bij M.E.(cvs) – zie referenties/links in de tekst.

Bij de mitochondriale stress test wordt d.m.v. de toevoeging van bepaalde chemische stoffen aan het cultuur-milieu van de cellen enkele parameters gemeten waaruit de ATP-produktie, de reserve-capaciteit, het ‘proton-lek’ (mitochondriale ontkoppeling; diffusie van protonen zodat die niet meer kunnen bijdragen tot de synthese van ATP, de energie gaat verloren als warmte), de niet-mitochondriale respiratie, de maximale respiratie (= reserve-capaciteit + ATP-produktie), de basale respiratie (= ATP-produktie + proton-lek) en de koppeling-efficiëntie (graad waarop nuttige energie wordt gemaakt uit de cellulaire brandstof; mate waarop de mitochondriale systemen op elkaar zijn afgestemd) worden berekend.

Voor de glycolyse stress test worden de cellen ‘behandeld’ (ten einde hen glucose te ontzeggen en zo te ‘dwingen’ andere paden aan te wenden om energie te produceren) om de glycolyse, de glycolytische reserve, de glycolytische capaciteit (som van de eerste 2) en de niet-glycolytische verzuring te berekenen.

Het feit dat PMBCs van M.E.(cvs)-patiënten hun energie-output niet kunnen verhogen om aan de behoeften te voldoen voor routine taken lijkt er op te wijzen dat ze metabool uitgeput zijn. Het is een belangrijke bevinding maar de vraag blijft of dit enkel in deze witte bloedcellen is of ook in andere weefsels voorkomt. Het research-team liet optekenen dat ze ook spiercellen op dezelfde manier wil testen…

————————-

PLoS ONE (2017) 12: e0186802

Cellular bioenergetics is impaired in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Cara Tomas (1), Audrey Brown (1), Victoria Strassheim (2,3), Joanna L. Elson (4,5), Julia Newton (1,3), Philip Manning (1)

1 Institute of Cellular Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

2 Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

3 Newcastle upon Tyne Hospitals, NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

4 Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, United Kingdom

5 Centre for Human Metabolomics, North-West University, Potchefstroom, South Africa

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een zeer uitputtende ziekte met een ongekende etiologie. Abnormaliteiten qua bio-energetische funktie werden genoemd als een mogelijke oorzaak voor CVS. Er werden preliminaire studies uitgevoerd om cellulaire bio-energetische abnormaliteiten bij CVS-patiënten te onderzoeken. Er werd een reeks testen uitgevoerd op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten en gezonde controles.

Deze experimenten onderzochten cellulaire patronen met betrekking tot de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS) en glycolyse. De resultaten toonden consistent lagere metingen van de OX-FOS-parameters in PBMCs van CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. Er werden 7 sleutel-parameters van de OX-FOS berekend: basale respiratie, ATP-produktie, protonen-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiration en koppeling-efficiëntie. Hoewel veel van de parameters verschilden tussen de CVS- en controle-groep, werd maximale respiratie aangeduid als sleutel-parameter met betrekking tot de mitochondriale funktie die verschilde tussen CVS- en controle-PBMCs omwille van de consistentie van de stoornis bij CVS-patiënten die werd gevonden doorheen de studie (p ≤ 0.003). De lagere maximale respiratie in CVS-PBMCs suggereert dat wanneer de cellen fysiologische stress ondervinden, ze minder in staat zijn om hun respiratie te verhogen om te compenseren voor stijgende stress en niet in staat te voldoen aan de cellulaire energie-behoeften. De ontdekte metabole verschillen benadrukken het overmogen van CVS-patient PBMCs om de cellulaire energetische eisen te bevredigen onder basale omstandigheden zowel als wanneer de mitochondrieën onder druk komen te staan tijdens periodes met hoge metabole behoeften.

Inleiding

[…]

Er werd voorgesteld dat abnormaliteiten in de bio-energetische werking de oorzaak kan zijn van de ernstige vermoeidheid die wordt ervaren door CVS-patiënten. Factoren zoals mitochondriale dysfunktie, adenosine-monofosfaat geaktiveerd proteïne-kinase (AMPK [een energie-voelend alarm-proteïne dat een dreigende energie-crisis in de cel voorkomt]) verstoring, oxidatieve stress en skeletspier-cel acidose [‘verzuring’] werden allemaal in verband gebracht met het CVS-fenotype [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE (2015) 10 /// Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Chronic Fatigue Syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2009) 2: 1-16 /// Kennedy G, Spence VA et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radical Biology and Medicine (2005) 39: 584-9]. Een abnormaal energie-metabolisme werd geïdentificeerd als een belangrijk interesse-gebied in de CVS-research, met een aantal studies die plasma- en serum-metabolomica onderzochten en wijzigingen qua metabolieten toonden, en de hypothese dat CVS een hypometabool syndroom is [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics (2015) 11: 1626-39 /// Yamano ES et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA- and urea-cycles. Scientific Reports (2016) 6 /// Naviaux RN et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. PNAS (2016) 113 /// Germain AR, Levine SM; Hanson MR. Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism. Molecular Biosystems (2017) 13: 371-9 /// Fluge OM et al. Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Clinical Investigation (2016) 1].

Verworven mitochondriale dysfunktie (bv. post-virale infektie) is ook een research-gebied van belang [o.a. Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J. Mitochondrial dysfunction and the pathophysiology of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2012) 5: 208-20 /// Smits B et al. Mitochondrial enzymes discriminate between mitochondrial disorders and Chronic Fatigue Syndrome. Mitochondrion (2011) 11: 735-8]. Mitochondrieën fungeren als het energie-overdracht centrum van de cel en zijn verantwoordelijk voor de produktie van cellulair ATP via respiratie [‘ademhaling’; metabole reakties en processen in de mitochondrieën die de energie uit voedingsstoffen omzetten naar ATP]. Mitochondriale respiratie kan door meerdere factoren worden geïnhibeerd: van cytokine-veranderingen tot oxidatieve stress. Studies omtrent CVS hebben sleutel-indicatoren voor mitochondriale dysfunktie zoals verlaagde aanmaak van ATP [Myhill S, Booth NE, McLaren-Howard J. Targeting mitochondrial dysfunction in the treatment of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) – A clinical audit. International Journal of Clinical and Experimental Medicine (2013) 6: 1-15 /// Castro-Marrero J, Cordero MD et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants and Redox Signaling (2013) 19: 1855-60] en een verstoring van de oxidatieve fosforylatie (OX-FOS [zorgt voor ATP, bron van cellulaire energie; het Ox-Fos systeem omvat meer dan 100 proteïnen, geordend in 5 enzym-complexen in de mitochondrieën]) mechanismen getoond. Bijkomend komen cruciale symptomen die geassocieerd zijn met CVS (zoals vermoeidheid, inspanning-intolerantie en spierpijn) ook voor bij patiënten met primaire mitochondriale ziekten waarvan is geweten dat ze worden veroorzaakt door mitochondriale dysfunktie die het resultaat is van mutaties van het kern- of mitochondriaal DNA (mtDNA) [Newton JL et al. Perceived fatigue is highly prevalent and debilitating in patients with mitochondrial disease. Neuromuscular Disorders. (2015) 25: 563-6]. Er werd gesuggereerd dat mitochondriale dysfunktie voorkwam bij een subgroep van de CVS-populatie. Door een gebrek aan definitief bewijs voor gans de CVS-populatie hebben anderen echter gesuggereerd dat een dergelijk verband niet significant is [o.a. Vermeulen RCW et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. Journal of Translational Medicine (2010) 8]. Twee research-groepen hebben onafhankelijk van elkaar getoond dat klinisch gevalideerde pathogene mtDNA-mutaties waarschijnlijk zeer zeldzaam zijn in CVS-groepen [Hanson MR et al. Mitochondrial DNA variants correlate with symptoms in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Translational Medicine (2016) 14 /// Schoeman EM et al. Clinically proven mtDNA mutations are not common in those with Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genetics (2017) 18]. Eén studie vond geen enkele klinisch gevalideerde mtDNA-mutatie die voldoende significant heteroplasmie [aanwezigheid van meer dan één type mitochondriaal genoom] vertoont, terwijl de andere er slechts één vond: een LHON (‘Leber hereditary optic neuropathy’ [LHON; mitochondriale neurodegeneratieve ziekte die de oogzenuw aantast]) mutatie. Daarnaast verschillen de sub-klinische waarden van gekende mtDNA-mutaties niet van deze in de algemene bevolking.

De studie hier richtte zich specifiek op het onderzoeken van sleutel-parameters van de mitochondriale funktie, inclusief de twee belangrijkste energie-producerende mechanismen in de cel – glycolyse en OX-FOS. Veranderingen in deze parameters kunnen wijzen op een mitochondriale basis voor CVS, en mechanismen in de etiopathogenese van de ziekte ophelderen en mogelijke doelwitten voor toekomstige studie identificeren.

De doelstelling van deze studie was het detekteren en vaststellen van veranderingen qua mitochondriale funktie en cellulaire energie-profielen (in PBMCs) van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom en gezonde controles. PBMCs kunnen relatief makkelijk worden verkregen via bloed-afname en werden gebruikt om systemisch de mitochondriale funktie na te gaan in controles en CVS-patiënten omwille van hun systemische blootstelling.

Abnormale PBMC bio-energetica werden al onderzocht bij andere chronische ziekten zoals obesitas, type-2 diabetes mellitus (T2DM) en Reumatoïde Arthitis. Er werd een hogere basale respiratie en maximale respiratie getoond bij T2DM-patiënten. Zoals CVS-patiënten ervaren patiënten met T2DM dikwijls vermoeidheid. Eerdere research heeft getoond dat maximale respiratie en reserve-capaciteit in PBMCs correleert met lichamelijk funktioneren en kracht [bij obesitas]. De symptomen beschreven in die studie (zoals spierpijn, zwakte en inspanning-intolerantie zijn ook courante symptomen bij CVS-patiënten. Gezien de gelijkenissen qua symptoom-profielen van deze 2 ziekten, hadden we in deze studie tot doel te onderzoeken of er ook PBMC-abnormaliteiten qua bio-energetische funktie bestaan bij CVS.

Methodes

[…] patiënten voldeden aan de Fukuda diagnostische criteria voor CVS […]

Bereiding van PBMCs

[…]

Extracellulaire flux-analyse

[Flux = doorstroming van het ene naar het andere mitochondriale enzyme-complex]

Werking van OX-FOS en glycolyse werden bepaald gebruikmakend van een ‘extracellular flux analyser’ […] De mitochondriale respiratie wordt gemeten via de afname van de zuurstof-concentratie in het test-medium. […] Veranderingen qua zuurstof- en proton-concentratie worden gedetekteerd. De glycolyse in de cellen wordt gemeten via de daling van de protonen-concentratie in het test-medium (ook gekend als ‘extracellular acidification [verzuring] -rate’, ECAR). Zuurstof-verbruik (OCR) werd gebruikt als een indicator voor OX-FOS, terwijl ECAR werd gebruikt als een indicator voor glycolytische omzetitng van glucose naar lactaat.

De OCR en ECAR werden gemeten na de opéénvolgende toevoeging van test-reagentia. Voor de mitochondriale stress test: oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme ATP-synthase geen ATP meer kan aanmaken], carbonyl-cyanide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP [ontwricht de ATP-synthese door het wegleiden van protonen zodat deze geen energie kunnen leveren via OX-FOS]), en rotenon [blokkeert het enzyme NADH-dehydrogenase en zodoende de respiratoire keten] en antimycine-A [inhibeert de cellulaire respiratie]. Daaruit werden de basale respiratie, ATP-produktie, proton-lek, maximale respiratie, reserve-capaciteit, niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie berekend. Voor de glycolyse stress-test: glucose, oligomycine en 2-deoxyglucose [stopt de glycolyse]. Dit liet toe glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring te berekenen. […]

Trypaan-blauw

Na toevoeging van [de kleurstof] trypaan-blauw worden dode cellen blauw om dat ze doorlaatbaar zijn voor de kleurstof en levende cellen blijven ongekleurd. Het percentage levende cellen (t.o.v. het totaal aantal cellen) geeft de cel-viabiliteit.

Statistiek

[…]

Resultaten

[…]

Effekt van het invriezen op PBMC-OCR

De afname van bloedstalen van de patiënten gebeurde sporadisch en was onvoorspelbaar, daarom werd het nodig geacht dat de stalen werden ingevroren om ze op hetzelfde moment te kunnen testen en de variatie te niet te doen. Om die reden werden mitochondriale stress testen uitgevoerd op vers geïsoleerde en ingevroren (-80˚C) PBMCs om het effekt na te gaan van het invriezen (omwille van eerdere tegenstrijdige resultaten). […]

Er werden significante verschillen gezien tussen CVS-patiënten en controles voor zowel verse als ingevroren PBMCs voor dezelfde 4 parameters: basale respiratie (p ≤ 0.043), proton-lek (p ≤ 0.013), maximale respiratie (p ≤ 0.003) en reserve-capaciteit (p ≤ 0.012).

Wanneer we verse en ingevroren PBMC-stalen van CVS-patiënten vergeleken, verschilden de basale respiratie (p = 0.006), ATP-produktie (p = 0.003), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) significant. Ook bij de gezonde controles werden significante verschillen gezien voor basale respiratie (p = 0.008), ATP-produktie (p = 0.047), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001) tussen verse en ingevroren stalen. Er wordt gedacht dat de consistent significante afname qua basale respiratie en maximale respiratie voor de ingevroren stalen t.o.v. de verse PMBCs freshly isolated PBMCs te wijten is aan de stress ten gevolgde het invries-proces.

Effekt van glucose-concentratie op PBMCs

OCR mitochondriale stress testen werden uitgevoerd in medium met laag (1 mM) en hoog (10 mM) glucose, met de bedoeling te kijken of veranderingen qua cellulaire ATP-produktie konden worden gedetekteerd bij deze 2 concentraties. De hypothese was dat inculatie van PBMCs in laag-glucose de cellen van energie-transductie via glycolyse zou sturen in de reichting van het OX-FOS-mechanisme, en zo een toename qua mitochondriale respiratie zou veroorzaken. Deze hypothese voorspelt een hogere zuurstof-consumptie bij laag-glucose t.o.v. van hoog-glucose. Laag-glucose werd aangewend om een natuurlijke stressor (hypoglycemie) na te bootsen die PBMCs in vivo kunnen ondervinden (en die anders is dan de stress van het invriezen, wat niet voorkomt in vivo).

Bij laag-glucose vertoonde de CVS-populatie significant lagere resultaten dan de controles voor 6 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), maximale respiratie (p < 0.001), reserve-capaciteit (p < 0.001), niet-mitochondriale respiratie (p < 0.001) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Wanneer cellen werden geïncubeerd in hoog-glucose, verschilden CVS- en controle-PBMCs voor 5 van de 7 parameters: basale respiratie (p < 0.001), ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p = 0.013), maximale respiratie (p < 0.001) en reserve-capaciteit (p < 0.001).

De parameters die significante verschillen vertoonden wanneer de resultaten werden vergeleken tussen laag- en hoog-waren ATP-produktie (p < 0.001), proton-lek (p < 0.001), maximale respiratie (p = 0.025), niet-mitochondriale respiratie (p = 0.004) en koppeling-efficiëntie (p < 0.001). Deze verschillen werden echter enkel in de controle-groep gevonden. De glucose-concentratie had geen enkel effekt op de parameters in de CVS-groep.

[Leeftijd bleek geen verstorende factor voor mitochondriale funktie. Ook geslacht kon worden geëmlimineerd als verstorende factor.]. De duur van het invriezen correleerde niet met de cell-viabiliteit (p = 0.100) of maximale respiratie (p = 0.722) en is dus geen verstorende factor. Zelfs een korte periode invriezen veroorzaakt veranderingen qua OX-FOS-funktie, wat bewijst dat het proces van invriezen/ontdooien deze veranderingen veroorzaakt en niet de duur van het invriezen.

[…]

Glycolytische aktiviteit

De resultaten van een glycolyse stress test met PBMCs vertoonden geen verschillen qua glycolyse tussen de patiënten en controles. Geen enkele van de 5 berekende parameters verschilde significant tussen CVS- en controle-stalen (p ≥ 0.075).

De cel-viabiliteit van verse en ingevroren stalen verschilde niet significant en er was geen significant verschil wat betreft de viabiliteit van de CVS- en controle-stalen, vers noch ingevroren (p ≥ 0.346).

Bespreking

Ondanks de grote aantallen mensen met CVS in de bevolking, blijven de oorzaken er van onverklaard. Dit is de eerste studie die gevallen-controle gebruikt om de mitochondriale funktie te onderzoeken in PBMCs bij CVS. Er werden PBMCs gebruikt in deze preliminaire studie aangezien het toelaat potentiële abnormaliteiten te bekijken op systemsch niveau.

Significant gewijzigde mitochondriale stress test parameters in de CVS-groep t.o.v. de gezonde controle groep suggereren dat CVS-patiënten systemische abnormaliteiten qua energie-overdracht kunnen vertonen, bijzonderlijk wanneer geïsoleerde PBMCs onder mitochondriale stress komen te staan. De lagere reserve-capaciteit die wordt gezien bij CVS-patiënten wijst er op dat hun cellen al hun capaciteit aanwenden onder normale omstandigheden (zonder stress) dan gezonde controles. De verlaagde maximale respiratie suggereert dat de PBMCs van CVS-patiënten niet in staat zijn tot dezelfde mate van respiratie als gezonde controles. De resultaten tonen dat CVS-patiënten hun respiratoire capaciteit slechts met 47% (± 37%) kunnen verhogen (van baseline tot maximaal gestimuleerd door FCCP), wat significant (p < 0.001) lager is dan de 98% (± 32%) toename qua respiratoire capaciteit bereikt door controle-PBMCs. De consistent lagere maximale respiratie in de CVS-groep toont het onvermogen van CVS-patiënten tot dezelfde mate van respiratie als de controle-groep onder cellulaire stress. De lagere reserve-capaciteit suggereert dat wanneer CVS-PBMCs onder stress komen te staan, ze minder in staat zijn hun respiratie te verhogen om te compenseren voor de toegenomen stress waardoor patiënten minder in staat zijn om te voldoen aan de cellulaire energie-vereisten. Er wordt gedacht dat gelijkaardige abnormaliteiten qua reserve-capaciteit bijdragen aan een waaier van andere ziekte-pathologieën zoals hart-ziekte, neurodegeneratieve ziekten bij het ouder-worden en gladde-spiercel sterfte.

Het invries-proces had een significante impact op de cellulaire bio-energetica van PBMCs bij zowel de controle- als de CVS-groep. Vier van de onderzochte parameters vertoonden significante verschillen tussen de verse en ingevroren stalen in beide groepen: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. De resultaten tonen dat het invries-proces dezelfde invloed op beide groepen had, met dezelfde dalingen van elk van de vermelde parameters. Het invriezen van PBMCs kan talrijke cellulaire wijzigingen veroorzaken die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de gedaalde OCR die in deze experimenten werd opgetekend. Mogelijke veranderingen veroorzaakt door invriezen omvatten oxidatieve schade, een verlies qua membraan-integriteit door de vorming van ijs-kristallen en wijzingingen in de ion-homeostase.

Hoewel bleek dat invriezen een impact had op bepaalde parameters, werd gezien dat dezelfde parameters significant verschillend waren tussen de controle- en de CVS-groep bij verse en ingevroren stalen. Dit toont aan dat zelfs al zijn de absolute waarden van sommige parameters beïnvloed door het invries-proces, het patroon in beide groepen kan worden gezien en dat daarom verse of ingevroren stalen kunnen worden gebruikt om verschillen te detekteren tussen controles en CVS-patiënten. Voor toekomstige studies waarbij men wil kijken naar de absolute OCR-waarden zouden verse stalen moeten worden gebruikt, voor andere experimenten volstaan echter ingevroren stalen om adequaat de verschillen tussen groepen te tonen cohorts. Er werden ingevroren stalen gebruikt voor de hoge- en lage-glucose experimenten omwille van de sporadische staalnames gedurende een relatief lange periode maar deze bevinding valideert het gebruik van ingevroren stalen voor deze experimenten en suggereert dat het invriezen van stalen het vermogen om groepen te vergelijken niet verandert. Er dient te worden opgemerkt dat tijdens eerdere analyse met ≤ 12 stalen, het moeilijk was om verschillen tussen de 2 groepen te detekteren met ingevroren stalen, daarom is voor een kleiner aantal stalen het gebruik van verse stalen gewenst.

De hypothese was dat PBMC-incubatie in laag-glucose de energie-transductie van cellen van glycolyse zou leiden naar het OX-FOS-mechanisme, wat een toename van de mitochondriale respiratie veroorzaakt. Deze hypothese voorspelt een hogere basale respiratie en maximale respiratie in laag-glucose. Een hogere maximale respiratie in laag-glucose werd enkel gezien in de controle-groep maar niet in de CVS-groep, terwijl de basale respiratie niet significant steeg in om het even welke groep bij lage-glucose omstandigheden. Daarenboven steeg in de controle-groep de ATP-produktie, de niet-mitochondriale respiratie en de koppeling-efficiëntie, en daalde het proton-lek, bij laag-glucose. De CVS-groep vertoonde geen verschillen tussen laag- en hoog-glucose condities voor om het even welke parameter. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de controle-cellen zich beter kunnen aanpassen aan hun omgeving en beschikken over het vermogen om hun ATP-produktie te verhogen via mitochondriale respiratie indien nodig – iets waar de CVS-cellen wellicht niet toe in staat zijn.

Vier van de parameters bleken verschillend tussen de controle- en CVS-groepen bij zowel laag- als hoog-glucose: basale respiratie, ATP-produktie, maximale respiratie en reserve-capaciteit. Dit toont aan dat de verschillen voor deze parameters tussen de 2 groepen die hier werden gezien, kunnen worden gereproduceerd in verschillende glucose-condities en bevestigt het onvermogen van de CVS-PBMCs om hun respiratoire capaciteit te verhogen tot het niveau van de controle-PBMCs zowel bij ‘baseline’ als wanneer ze tot het maximum worden gestimuleerd (door FCCP), zelfs bij laag-glucose wanneer de cellen worden naar ATP-produktie via mitochondriale respirate worden gepusht en weg van de glycolyse als energie-bron. Niet-mitochondriale respiratie en koppeling-efficiëntie verschilden enkel tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, terwijl het proton-lek enkel verschilde bij hoog-glucose.

De koppeling-efficiëntie toonde dat ATP-produktie enkel efficiënter werd in de controle-groep wanneer er stress ontstond door laag-glucose, en niet in de CVS-groep. Er werden verschillen qua koppeling-efficiëntie gezien tussen de controle- en CVS-groepen bij laag-glucose, wat suggereert dat de CVS-cellen reeds aan de maximum efficiënctie zitten wat betreft de aanmaak van ATP wanneer controle-cellen nog in staat zijn die efficiëntie te verhogen en ATP produceren wanneer dit vereist is (bv. bij laag-glucose).

[…] De statistische significante resultaten wijzen op robuste statistische gegevens, ondanks de relatief beperkte grootte van de groepen.

Deze experimenten helpen bij het identificeren van de richting die toekomstige research omtrent cellulaire bio-energetica bij CVS zou moeten nemen voor het detekteren van verschillen betreffende sommige, maar niet alle, parameters van de mitochondriale funktie. Verschillen qua mitochondriale parameters tonen het onvermogen van CVS-PBMCs om het OX-FOS-mechanisme aan te wenden om energie te produceren in dezelfde mate als controle-PBMCs dat doen, zowel onder basale omstandigheden als wanneer ze worden gedwonen tot maximale respiratie. De consistent significante verschillen tussen de 2 groepen bij basale respiratie en maximale respiratie tonen hun belang aan als potentiële merkers voor CVS, een bevinding die kan worden gebruikt om richting te geven aan toekomstig onderzoek omtrent de mitochondriale dysfunktie bij CVS.

In tegenstelling tot eerdere literatuur [zie bv. Armstrong et al. hierboven] die suggereerde dat abnormaliteiten qua PBMC ATP-concentraties kunnen worden veroorzaakt door glycolyse, tonen resultaten van de glycolyse stress test dat glycolyse bij CVS-patiënten niet significant verschilt van de gezonde groep. Dit kan te wijten zijn aan de relatief kleine groepen die in deze studie werden gebruikt. De combinatie van de detektie van significante verschillen in OX-FOS naast het ontbreken van detekteerbare verschillen in glycolyse heeft mogelijks een voorheen ongekend fenotype van CVS-PBMCs blootgelegd, hoewel grotere stalen nodig zullen zijn om dit te bevestigen. Hoewel de belangrijkste beperking van deze studie de grootte van het staal was, resulterend in een minder krachtige analyse (bijzonderlijk voor de vers geïsoleerde controle-groep), dient te worden opgemerkt dat de hier gepresenteerde gegevens enkel preliminaire bevindingen zijn. Grotere stalen en longitudinale afnames zijn nodig om de hier verkregen reulstaten te valideren en te zorgen voor de statistische ‘power’ die vereist is om verschillen in andere parameters te detekteren. Een andere beperking van deze studie is het gebrek aan karakteristieken van de CVS-groep. Demografische, antropometrische en symptoom-gegevens zouden nuttig zijn om te kijken naar links met de mitochondriale abnormaliteiten die in deze studie werden geobserveerd. Het zou interessant zijn om te analyseren of CVS-symptomen – in het bijzonder vermoeidheid-graad – correleerden met de gemeten mitochondriale parameters. Er zouden bijkomende experimenten en technieken kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de mitochondriale inhoud en morfologie, mitochondriale funktie in doorlaatbaar-gemaakte cellen en geïsoleerde mitochondrieën, en metingen van het mitochondriaal membraan potentiaal om deze resultaten verder te valideren. Stratificatie van PBMCs op basis van fluorescentie-gektiveerde cel-sortering (FACS) is een techniek die kan worden aangewend om de cel-types PBMCs verder onder te verdelen om te identificeren welke specifieke cel-populaties verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde OX-FOS-verschillen. Het is momenteel nog niet geweten of factoren zoals recente aktiviteit en dieet voor de bloed-afname een effekt heeft op PBMC bio-energetica en dit is iets dat dient te worden onderzocht. Het gebruik van sedentaire controles en aktiviteit-monitors zou nuttig zijn om het effket op PBMC bio-energetica te tonen. Deze studie maakte gebruik van PBMCs als een voorspeller voor de systemische mitochondriale funktie maar er zounden andere cel-types kunnen worden gebruikt om te onderzoeken of de hier geoberveerde verschillen kunnen worden gezien in andere weefel-types bij CVS-patiënten.

De resultaten van deze studie weerspiegelen de resultaten gevonden bij T2DM-patiënten (een link tussen een andere ziekte met vermoeidheid als kern-symptoom en OX-FOS-parameters: basale respiratie en maximale respiratie. Dit geeft aan dat de PBMC bio-energetische abnormaliteiten een consistente link met vermoeidheid vertonen, maar of de abnormaliteiten optreden ten gevolge de vermoeidheid of de oorzaak van de ziekte zijn blijft onbekend.

Deze preliminaire research heeft duidelijk statistisch significante verschillen in het bio-energetisch profiel van PBMCs van CVS-patiënten getoond in vergelijking met cellen van gezonde controles. Belangrijk: deze resultaten leggen niet vast of de verschillen qua PBMC energie-mechanismen een oorzaak of gevolg van CVS zijn; deze gegevens impliceren echter duidelijk dat deze cellen een rol kunnen spelen in het ziekte-mechanisme. Verder kan het gerbuik van PBMCs een nieuw en waardevol model zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen ter behandeling van CVS.

oktober 27, 2017

Fibromyalgie en microgliaal TNF-α

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 7:05 am
Tags: , , , , , , , ,

Microglia – we hebben het op deze pagina’s al veelvuldig over dit specifiek type of brein-immuuncellen (de “macrofagen van het CZS”) gehad. Een Japanese groep researchers ontwikkelde een techniek om deze aan te maken uit witte bloedcellen uit het bloed zodat ze hun cellulaire eigenschappen bij ziekte kunnen onderzoeken. Ze rapporteren hier over initieel werk dat ze deden bij fibromylagie (niet hetzelfde als M.E.(cvs) maar zoals men weet overlappend).

Wellicht kunnen deze resultaten aanwijzingen geven voor verder onderzoek bij M.E(cvs)…

De met deze technologie gecreëerde microglia van fibromyalgie-patiënten blijken hyper-responsief voor ATP (‘energie-molekule’ maar ook neurotransmitter met een effekt op o.a. microglia) te zijn en meer van het pro-inflammatoir cytokine TNF-α tot expressie te brengen en af te geven (d.w.z. dat ze naburige cellen beïnvloeden). Dit cytokine was ook gelinkt met (subjectieve) pijn en er was een negatief verband met levenskwaliteit. De vraag blijft of de respons op ATP specifiek is voor deze aandoening… Anderzijds werd al gerapporteerd dat een ontoereikende adenosine-trifosfaat (ATP) produktie verband kan houden met de pathofysiologie van M.E.(cvs) door een inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie (zie bv. ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ en ‘Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)’)

Lees (o.a.) ook ‘Gliale aktivatoren: doelwit voor de behandeling van centrale sensitisatie (chronische pijn)?’.

————————-

Sci Rep. (2017) 7: 11882

Fibromyalgia and microglial TNF-α: Translational research using human blood induced microglia-like cells

Ohgidani M1, Kato TA2, Hosoi M3, Tsuda M4, Hayakawa K1, Hayaki C5, Iwaki R3, Sagata N1, Hashimoto R6, Inoue K4, Sudo N3,5, Kanba S1

1 Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

2 Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

3 Department of Psychosomatic Medicine, Kyushu University Hospital, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

4 Department of Life Innovation, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

5 Department of Psychosomatic Medicine, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

6 Research Centre for Children’s Mental Development, United Graduate School of Child Development, Osaka University, Yamadaoka 1-1, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Samenvatting

Fibromyalgie is een hardnekkige ziekte die wordt gekenmerkt door chronische oncontroleerbare pijn en psychologisch lijden, en waarvan de oorzaak nog niet werd opgehelderd omwille van de complexe pathologie. Aktivatie van immuun-cellen in de hersenen – microglia genaamd – heeft de aandacht getrokken als een potentieel onderliggend pathologisch mechanisme bij chronische pijn. Technologische en ethische bezwaren hebben echter het vermogen om research met menselijke microglia uit te voeren beperkt. Om deze beperking te overwinnen, hebben we een techniek ontwikkeld om menselijke ‘induced microglia-like’ (iMG) [geïnduceerde mircroglia-achtige] cellen te creëren vertrekkende van menselijke perifeer bloed monocyten. In deze studie creëerden we iMG-cellen van 14 patiënten met fibromyalgie en 10 gezonde individuen, en vergeleken de aktivatie van iMG-cellen tussen de 2 groepen op cellulair niveau. De expressie van tumor necrose factor (TNF)-α was qua mRNA- en proteïne-waarden significant verhoogd in ATP-gestimuleerde iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie in vergelijking met cellen van gezonde individuen. Interessant: er was een matige correlatie tussen ATP-geïnduceerde upregulering van de TNF-α expressie en klinische parameters van subjectieve pijn en andere mentale manifestaties van fibromyalgie. Deze bevindingen suggereren dat microglia van patiënten met fibromyalgie hypersensitief zijn voor ATP. TNF-α van microglia kunnen een sleutel-factor zijn die aan de basis ligt van de complexe pathologie van fibromyalgie.

Rapport

Fibromyalgie, een vorm van niet-organische pijn, is een chronische ziekte die ernstige systemische pijn met psychologisch lijden veroorzaakt, resulterend in funktie-beperkingen en een verminderde levenskwaliteit. Het klinisch beeld werd sinds lang gedocumenteerd; toch blijft fibromyalgie tot op heden een hardnekkige ziekte met ongekende etiologie. In een klinische studie die gebruik maakte van fMRI vertoonden patiënten met fibromyalgie hyper-responsiviteit op stimuli t.o.v. gezonde deelnemers. Daarnaast suggereren rapporten dat neuro-inflammatie veroorzaakt door immuun-cellen en inflammatoire cytokinen gerelateerd is met de pathofysiologie van fibromyalgie. Er werd gesuggereerd dat fibromyalgie wordt veroorzaakt door ingewikkelde bio-psycho-sociale factoren met het centraal zenuwstelsel (CZS) als de pathologische basis.

Microglia zijn immuun-cellen in het CZS en zijn gekend voor hun inflammatoire funkties via de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen zoals as tumor necrose factor (TNF)-α en interleukine (IL)-1β. Op basis van studies bij knaagdieren rapporteerden we over de abnormaliteiten van microglia als pathologicshe basis van chronische pijn [Tsuda M et al. P2X(4) receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury. Nature. (2003) 424: 778-783 /// Masuda T. et al. Transcription factor IRF5 drives P2X4R(+)-reactive microglia gating neuropathic pain. Nat Commun. (2014) 5: 3771]. Deze knaagdieren-studies wezen op de over-aktivatie van microgliale cellen bij patiënten met chronische pijn, klinische molekulaire gegevens ontbreken echter omwille van ethische en technische kwesties. Zodoende zijn technieken ter ontwikkeling van menselijke microglia-achtige cellen uit niet-hersen weefsels gerechtvaardigd. Er werd gerapporteerd over een techniek om microglia-achtige cellen te induceren uit menselijke pluripotente [die kunnen uitgroeien tot bijna alle celtypes] stamcellen (iPS). De iPS-technologie maakt cel-gebaseerde testen mogelijk in gebieden zoals de embryologie, de farmacologie en de regeneratieve geneeskunde; de iPS-technologie heeft echter enkele beperkingen wat betreft het modelleren van niet-genetische ziekten en vereist veel tijd en uitgaven. Anderzijds hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld om microglia-achtige (iMG) cellen te induceren direct uit menselijk perifeer bloed (monocyten) door gebruik te maken van de 2 cytokinen IL-34 en ‘granulocyte macrophage colony stimulating factor’ (GM-CSF) [fungeert als een groeifactor voor witte bloed-cellen, stimuleert stamcellen tot vorming van granulocyten/monocyten], binnen de 2 weken en zonder enige gen-modificiaties. Vergeleken met de iPS-cellen is onze iMG-techniek eenvoudiger en heeft de voordelen van tijd- en kosten-beheersing. Een andere verdienste is dat we iMG-cellen kunnen produceren zonder enige gen-modificatie. Er is vers bloed vereist om iMG-cells te produceren en we kunnen de iMG-cellen nu nog niet stockeren, wat een belangrijke beperking is. We hebben reeds abnormaliteiten bevestigd qua cellulaire responsen van iMG-cellen van patiënten met ziekte van Nasu-Hakola [zeldzame erfelijke aandoening met neurodegeneratie die leidt tot dementie en vroegtijdige dood], wat een gekende primaire microglia ziekte is. Verder hebben we de gen-expressie patronen geanalyseerd van iMG-cellen in de manische en depressieve fase van patiënten met bipolaire aandoeningen, en onthulden fase-afhankelijke microgliale experessie-patronen. Gen-expressie analyse door een andere research-groep legde bloot dat iMG-cellen de meeste gelijkaardige kenmerken vertonen met primaire menselijke microglia in vergelijking met andere cel-types zoals onsterfelijk gemaakte menselijke microglia en menselijke macrofagen. Onze eerdere studies en dit rapport suggereren sterk dat de iMG-techniek een krachtig instrument is voor het analyseren van dynamische molekulaire pathofysiologieën van microglia, niet enkel bij genetische ziekten maar ook niet-organische ziekten (inclusief fibromyalgie en meerdere psychiatrische aandoeningen).

Hier creëerden we iMG-cellen van gezonde vrijwilligers als controle-groep (HC) en patiënten met fibromyalgie [1990 ‘American College of Rheumatology’ klassificatie-criteria; duur van de pijn = 87 (59-146) maand] om de hypothese te testen dat microglia hyperaktief zijn in patiënten met fibromyalgie.

Het is geweten dat extracellulair ATP als een neurotransmitter en/of neuromodulator funktioneert in het CZS en verscheidene fysiologische funkties van microglia moduleert [Illes P, Ribeiro JA. Molecular physiology of P2 receptors in the central nervous system. Eur J Pharmacol. (2004) 483: 5-17]. We rapporteerden eerder een verband tussen chronische pijn en ATP in dieren-modellen [zie Tsuda M et al. hierboven] en ATP bleek geïmpliceerd in het chronische pijn mechanisme [Milligan ED, Watkins LR. Pathological and protective roles of glia in chronic pain. Nat Rev Neurosci. (2009) 10: 23-36]. We vergeleken door ATP uitgelokte responsen in iMG-cellen van gezonde vrijwilligers en patiënten met fibromyalgie. De gen-expressie van TNF-α was significant hoger in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Daarnaast bleken de TNF-α proteïne-waarden ook significant hoger in het cultuur-supernatant van iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. In tegenstelling daarmee waren er geen statistisch significante verschillen qua gen-expressie van IL-1β. De proteïne-waarden van IL-1β waren echter significant hoger in het cultuur-supernatant van iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Daarnaast waren er geen significante verschillen tussen de 2 groepen qua secretie van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en IL-8, en van het anti-inflammatoir cytokine IL-10. Op basaal niveau lag de TNF-α gen-expressie significant lager in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Anderzijds waren er geen significante verschillen qua fagocytische aktiviteit, en gen-expressie van TNF-α en IL-1β tijdens fagocytose [in de hier gebruikte test nemen de cellen latex-parels (als ‘vreemd’ lichaam) op] tussen gezonde vrijwilligers en patiënten met fibromyalgie. Deze resultaten suggereren dat microglia van patiënten met fibromyalgie hyper-responsief zijn voor ATP-stimulatie, wat kan resulteren in verhoogde afgifte van TNF-α in het CZS.

We voerden verder correlationele analyses uit tussen TNF-α gen-expressie in ATP-gestimuleerde iMG-cellen en verscheidene klinische parameters, inclusief de pijn-graad. We vonden een matig positieve correlatie tussen TNF-α expressie en subjectieve pijn-intensiteit [Visuele Analoge Schaal; FM: 79,1 ± 18,2 vs. controle: 5,6 ± 8,8]. De pijn-intensiteit [FM: 7,2 ± 1,7 vs. controle: 0,5 ± 0,8] en pijn-interferentie [‘BPI Interference Scale’; bepaalt de mate waarop pijn interfereert met aktiviteiten, stemming en slaap; FM: 7,1 ± 2,3 vs. controle: 0,3 ± 0,8] waren ook matig positief gecorreleerd met de TNF-α expressie. Fibromyalgie is een ziekte die dikwijls co-morbide is met psychiatrische aandoeningen. In het bijzonder werd een verband tussen fibromyalgie en psychiatrische symptomen zoals depressie en angst gerapporteerd. Hier tonen we een matig positieve correlatie tussen TNF-α expressie en ernst van angst en depressie. In tegenstelling daarmee was IL-1β niet significant gecorreleerd met eender welke klinische score. Anderzijds werd een matig negatieve correlatie geobserveerd tussen TNF-α expressie en levenskwaliteit. Deze bevindingen suggereren de mogelijkheid dat de ernst van de subjectieve pijn, psychiatrische symptomen (depressie en angst) en levenskwaliteit bij patiënten met fibromyalgie gecontroleerd wordt door de waarden van microglia TNF-α. Inderdaad: studies met knaagdieren hebben getoond dat TNF-α een belangrijke factor bij neuropathische pijn is en we toonden eerder aan dat TNF-α pijn-gerelateerd gedrag opwekt wanneer het wordt toegediend in de hersenen van ratten. TNF-α wordt ook beschouwd als een belangrijke factor in psychiatrische aandoeningen zoals depressie. Daarnaast wordt gesuggereerd dat modulatie van microgliaal TNF-α één van de therapeutische doelwitten is bij psychiatrische aandoeningen [Kato TA et al. Neurotransmitters, psychotropic drugs and microglia: clinical implications for psychiatry. Current medicinal chemistry. (2013) 20: 331-344 /// Sato-Kasai M et al. Aripiprazole inhibits polyI: C-induced microglial activation possibly via TRPM7. Schizophr Res. (2016) 178: 35-43]. Fibromyalgie is dikwijls co-morbide met psychiatrische aandoeningen (in het bijzonder depressie) omwille van de gedeelde pathologische karakteristieken.

Dit is de eerste studie die abnormale aktivatie van microglia bij fibromyalgie op cellulair niveau bij mensen suggereert. De huidige gegevens geven een positief verband aan tussen microgliale abnormaliteiten en klinische symptomen van fibromyalgie. Interessant is dat iMG-cellen van fibromyalgie-patiënten hyper-responsiviteit voor extracellulair ATP en verhogingen qua pro-inflammatoir cytokine TNF-α vertonen. IL-1β is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine in het proces van microgliale aktivatie via inflammasoom-signalisering [inflammasomen = multi-proteïne molekulaire complexen die een brede waaier aan pathogenen ‘voelen’ en een rol spelen bij de inflammatoire respons]. In de huidige studie is de gen-expressie van IL-1β (mRNA) onveranderd, terwijl de proteïne-concentratie van IL-1β in het supernatant gestegen is. Deze gegevens suggereren dat microgliaal IL-1β geaktiveerd wordt in eerdere stadia vergeleken met TNF-α. Gelijkaardig met iMG-cellen was de TNF-α expressie versterkt door ATP-stimulatie in uit PBMC afgeleide macrofagen. Daarom zou ‘t kunnen dat de versterkte TNF-α expressie door iMG-cellen van patiënten door ATP misschien niet specifiek is voor iMG-cellen. Er dient verder onderzoek te worden uitgevoerd om de responsen op ATP tussen iMG-cellen en uit PBMC afgeleide macrofagen te vergelijken. Anderzijds werd gerapporteerd dat fractalkine ([chemokine] CX3CL1) betrokken is bij chronische pijn [zie ‘Systemische inflammatie & neuro-inflammatie bij fibromyalgie] alsook ATP. Het zou dus kunnen dat niet enkel ATP maar ook fractalkine iMG-cellen moduleren. Er zijn verdere studies nodig om op te helderen hoe fractalkine iMG-cellen moduleert bij patiënten met fibromyalgie. Daarnaast dient verdere research op te helderen of inflammasoom-gerelateerde molekulen zoals IL-18 en oppervlakte-expressie van HLA-DR, CD80 en CD86 worden gemoduleerd in iMG-cellen van patiënten met fibromyalgie. Van bijzonder belang is dat statistisch matige correlaties worden gezien tussen ATP-geïnduceerde TNF-α expressie en meerdere subjectieve parameters van pijn, depressie, angst en levenskwaliteit. Tot besluit: microgliaal TNF-α kan een mogelijke belangrijke modulerende factor zijn bij fibromyalgie en er is research nodig om een nieuw diagnostisch systeem en therapeutische strategieën aangaande fibromyalgie vast te stellen. We konden het oorzaak/effekt via het huidig studie-ontwerp niet bekrachtigen, dus zijn er prospectieve studies nodig. Bijvoorbeeld: het met verloop van tijd testen, bij verschillende pijn-gradaties in dezelfde patient, kan onthullen of iMG-analyse kan worden gebruikt als een instrument voor de beoordeling van de ernst van de pijn. We geloven dat de iMG-technolgie een nieuw licht werpt op de dynamische molekulaire pathologieën van microglia en op het ontwikkelen van objectieve meet-instrumenten bij een waaier van niet-organische [“zonder lichamelijke oorzaak”] hersen-ziekten [Jammer dat de auteurs deze gedateerde term gebruiken. Het verwijst naar “funktionele” of “psychogene” neurologische aandoeningen waarbij de neurologische symptomen te wijten zouden zijn aan een psychologische dysfunktie i.p.v. een onderliggend neurologisch probleem. Dit is voorbijgestreefd: de consensus is/zou moeten zijn dat non-organische aandoeningen niet onafhankelijk zijn van hersen-processen of brein-funktie.], en verdere studies zijn gerechtvaardigd.

januari 7, 2017

Verstoorde werking van pyruvaat-dehydrogenase bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 8:37 am
Tags: , , , , , , , , ,

Samen met medewerkers van 5 Noorse ziekenhuizen brachten Oystein Fluge & Olav Mella – die de immunosuppressiva rituximab (en cyclofosfamide) test(t)en als mogelijke (momenteel nog preliminair/experimenteel; want niet bevestigd) behandeling bij M.E.(cvs) – het metabolisme van een behoorlijk grote groep patiënten (en gezonde controles) gedetailleerd in kaart. We geven het uitgebreid artikel hier zo compleet mogelijk weer om (mede-)patiënten zo goed mogelijk te informeren en het belang ervan te onderstrepen naar behandelaars/onderzoekers toe…

De researchers detekteerden specifieke biochemische veranderingen in het bloed van M.E.(cvs)-patiënten. De waarden van bepaalde aminozuren waren gedaald. Het patroon gaf belangrijke informatie over de mechanismen die de symptomen veroorzaken en vooral over het energie-metabolisme bij de patiënten.

De reductie van de specifieke aminozuren werd voornamelijk gevonden bij vrouwen met M.E.(cvs). De verschillen bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten waren minder significant (vergeleken met gezonde mannen). De onderzoekers vonden echter dat de waarden van een bepaald aminozuur dat de afbraak van proteïnen in spierweefsel weerspiegelt gestegen waren bij mannelijke M.E.(cvs)-patiënten. Aangezien mannen meer spiermassa hebben dan vrouwen, zouden proteïnen van spierweefsel kunnen worden gebruikt als extra energie-reserve.

Onder normale omstandigheden gebruiken mensen koolhydraten, vetten (lipiden) en proteïnen (opgebouwd uit aminozuren) als energie-bronnen, in de katabole (afbraak-) processen in de mitochondrieën. Wanneer intense lichamelijke inspanning wordt gevergd, ontstaat een tekort aan zuurstof in de spier-mitochondrieën (anaërobe inspanning), zodat glucose wordt omgezet naar melkzuur (lactaat). Het enzyme pyruvaat-dehydrogenase (PDH) speelt een belangrijke rol bij de regulering van de processen die zorgen voor de omzetting van koolhydraten naar energie. Onderstaande studie suggereert dat PDH geïnhibeerd (onderdrukt) is bij M.E.(cvs)-patiënten.

Als de aktiviteit van PDH verstoord is, kunnen de cellen reageren door het verbruik van alternatieve ‘brandstoffen’ te verhogen, wat de veranderingen in het aminozuren-profiel in het bloed bij M.E.(cvs) kan verklaren. Ondanks de pogingen tot compensatie van het lichaam, zou deze situatie het vermogen van de cellen om de metabole processen aan te passen (om een geschikt antwoord te bieden voor de steeds veranderende vereisten qua energie-produktie) kunnen compromitteren. Lichamelijke aktiviteit kan dan leiden tot een plots energie-gebrek in de spieren, samen met een accumulatie van melkzuur. Bij ernstig zieke M.E.(cvs)-patiënten kan dit worden gezien na een minimale belasting.

Na meting van de gen-expressie (mRNA) in witte bloedcellen (PBMCs) van een aantal factoren die PDH reguleren, vonden de onderzoekers dat meerdere belangrijke factoren die de werking van PDH remmen, verhoogd waren bij de M.E.(cvs)-patiënten. Deze veranderingen waren aanwezig bij de vrouwelijk en mannelijke patiënten. Dit geeft aan dat de PDH-inhibitie zelf optreedt bij de beide geslachten maar dat de effekten op het metabolisme geslacht-specifiiek kunnen zijn.

Het is zeer waarschijnlijk dat M.E.(cvs) ook regulatie-problemen in andere delen van het metabolisme (bv. het verwerken van vetten) omvat en dat wordt verder onderzocht. Er wordt ook onderzoek verricht om te begrijpen hoe een vermoedelijk defekte immuun-respons (Auto-immuniteit?) een inhibitie van het cellulair metabolisme zou kunnen veroorzaken (Welke auto-antilichamen hinderen welke signalisering-mechanismen?).

De resultaten sluiten aan bij (gepubliceerd) werk van Robert Naviaux in de V.S., McGregor & Armstrong et. al. in Australië, Ruud Vermeulen in Nederland, Emi Yamano et al. in Japan en anderen… (zie links in de tekst) Lees ook ‘Geen herstel van acidose na herhaalde inspanning bij CVS’, ‘Computer-model voor inspanning-intolerantie bij M.E.(cvs)’ & ‘Oxidatieve fosforylatie na herhaalde inspanning bij CVS’ alhier.

————————-

Journal of Clinical Investigation Vol. 1, #2 (december 2016)

Metabolic profiling indicates impaired pyruvate dehydrogenase function in Myalgic Encephalopathy/ Chronic Fatigue Syndrome

Oystein Fluge (1), Olav Mella (1,2), Ove Bruland (1,3), Kristin Risa (1), Sissel E. Dyrstad (4), Kine Alme (1), Ingrid G. Rekeland (1), Dipak Sapkota (1), Gro V. Rosland (4), Alexander Fossa (5), Irini Ktoridou-Valen (1), Sigrid Lunde (1), Kari Sorland (1), Katarina Lien (6), Ingrid Herder (6), Hanne Thurmer (7), Merete E. Gotaas (8), Katarzyna A. Baranowska (8), Louis M.L.J. Bohnen (9), Christoph Schafer (9), Adrian McCann (10), Kristian Sommerfelt (11), Lars Helgeland (12), Per M. Ueland (2,10), Olav Dahl (1,2), Karl J. Tronstad (4)

1 Department of Oncology and Medical Physics, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

2 Department of Clinical Science, University of Bergen, Bergen, Norway

3 Department of Medical Genetics and Molecular Medicine, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

4 Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, Norway

5 Department of Oncology, Norwegian Radium Hospital, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

6 CFS/ME Centre, Division of Medicine, Oslo University Hospital, Oslo, Norway

7 Telemark Hospital, Department of Medicine, Notodden, Norway

8 Department of Pain and Complex Disorders, St. Olav’s Hospital, Trondheim, Norway

9 Division of Rehabilitation Services, University Hospital of Northern Norway, Tromso, Norway

10 Bevital AS, Bergen, Norway

11 Department of Pediatrics Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

12 Department of Pathology, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway

[Oystein Fluge & Olav Mella hebben mogelijks een belangen-conflict omwille van hun patenten m.b.t. de B-cel depletie bii M.E./CVS.]

Samenvatting

Myalgische Encefalopathie/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een uitputtende ziekte zonder gekende etiologie, met als kenmerkende symptomen post-exertionele malaise en een slecht herstel. Metabole dysfunktie is een plausibele bijdragende factor. We hypothiseerden dat wijzingen qua aminozuren in het serum specifieke defekten in het energie-metabolisme kunnen blootleggen bij M.E./CVS. Een analyse van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde individuen toonde een specifieke daling van de aminozuren die het oxidatief metabolisme via de TCA-cyclus voeden, voornamelijk bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. De concentratie in het serum van 3-methylhistidine, een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme, was significant gedaald bij mannelijke patiënten. Het aminozuren-patroon suggereerde een funktionele verstoring van pyruvaat-dehydrogenase (PDH), wat werd ondersteund door verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende PDH-kinasen 1, 2 & 4; sirtuine-4 en PPARδ in perifeer bloed mononucleaire cellen [PBMCs] bij beide geslachten. Myoblasten opgekweekt in aanwezigheid van serum van patiënten met ernstige M.E./CVS vertoonden metabole aanpassingen, inclusief verhoogde mitochondriale ademhaling en overmatige lactaat-sekretie. De aminozuren-veranderingen konden niet worden verklaard door symptoom-ernst, ziekte-duur, leeftijd, BMI of niveau van fysieke aktivteit. Deze bevindingen zijn in overéénstemming met de manier waar op de ziekte zich klinisch presenteert: met inadequate ATP-generatie via oxidatieve fosforylatie en excessieve lactaat-produktie bij inspanning.

Inleiding

[…] Research suggereert dat M.E./CVS gepaard gaat met wijzigingen in fundamentele processen van het energie-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al. NMR metabolic profiling of serum identifies amino acid disturbances in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Chim Acta (2012) 413: 1525-1531 /// Filler K et al. Association of Mitochondrial Dysfunction and Fatigue: A Review of the Literature. BBA Clin. (2014) 1: 12-23]. Dergelijke metabole veranderingen kunnen ontstaan door ontregelde fysiologische respons-mechanismen (immuun-aktivatie, inflammatie en receptor-gemedieerde signalisering) [Hornig M et al. Distinct plasma immune signatures in ME/CFS are present early in the course of illness. Sci Adv. (2015) 1: 1]. Er zijn echter geen consistente gegevens die een gemeenschappelijk metabool defekt aangeven die de symptomen van deze patiënten zouden kunnen verklaren. […]

[…] Observaties suggereren dat de systemische inspanning-intolerantie bij M.E./CVS, minstens gedeeltelijk, een omschakeling naar anaërobe glycolyse, waarbij lactaat wordt gegenereerd bij een significant lagere belasting dan bij gezonde mensen, zou kunnen inhouden. Er werden verhoogde lactaat-waarden gevonden in het cerebrospinaal vocht van M.E./CVS-patiënten [Murrough JW et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome measured by 1H MRS imaging at 3.0 T. NMR Biomed. (2010) 23: 643-650 /// Shungu DC et al. Increased ventricular lactate in Chronic Fatigue Syndrome. Relationships to cortical glutathione and clinical symptoms implicate oxidative stress in disorder pathophysiology. NMR Biomed. (2012) 25: 1073-1087; zie ook ‘Lactaat in Ventriculair Cerebrospinaal Vocht is verhoogd bij CVS]. Het vinden van defekten in glucose-gebruik en lactaat-produktie is echter niet evident op basis van routine bloed-analyses, wellicht omdat de afname gebeurt in rust zonder voorafgaande lichamelijke inspanning.

Er werden wijzigingen qua serum- (of plasma-) concentraties van bepaalde aminozuren gerapporteerd bij M.E./CVS-patiënten. Een studie over aminozuren in het serum […] toonde significant lagere waarden glutamine & ornithine, wijzend op een mogelijke stoornis in het aminozuren- en stikstof-metabolisme [Armstrong CW, McGregor NR et al.; zie hierboven]. Dezelfde onderzoekers vonden significant gedaalde serum-waarden voor glutamaat & fenylalanine [vrouwelijke M.E./CVS-patiënten] en ze stelden voor dat verminderde glucose-oxidatie leidt tot toegenomen gebruik van aminozuren als substraat in de TCA-cyclus [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolic profiling reveals anomalous energy metabolism and oxidative stress pathways in Chronic Fatigue Syndrome patients. Metabolomics. (2015) 11: 1626-1639]. In een andere studie werden significante dalingen voor meerdere aminozuren en metabolieten gezien in de urine van M.E./CVS-patiënten [Niblett SH et al. Hematologic and urinary excretion anomalies in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Exp Biol Med (2007) 232: 1041-1049]. Deze gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een metabool defekt maar de specifieke oorzaak werd nog niet geïdentificeerd.

De anaërobe drempel en herstel-tijd na inspanning hangen af van de hoeveelheid geproduceerd lactaat en de opruiming ervan. Lactaat wordt gemaakt uit pyruvaat, hoofdzakelijk door glucose-katabolisme via glycolyse, of de afbraak van bepaalde aminozuren. Onder normale aërobe omstandigheden wordt pyruvaat getransporteerd naar de mitochondrieën waar het wordt omgezet naar acetyl-CoA d.m.v. het pyruvaat-dehydrogenase (PDH) complex. Daarnaast wordt acetyl-CoA geproduceerd zonder tussenkomst van PDH, via degradatie van vetzuren en ketogene aminozuren [die kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA]. Het gevormd acetyl-CoA wordt verder geoxideerd in de TCA-cyclus en dient als brandstof voor de mitochondriale ademhaling en aanmaak van adenosine-trifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylatie. Onder anaërobe omstandigheden, wanneer tekort aan zuurstof mitochondriale ademhaling verhindert, stapelt het pyruvaat zich op in het cytosol, wat leidt tot verhoogde aanmaak en cellulaire excretie van lactaat. Mitochondriale dysfunktie leidt tot overmatige lactaat-produktie én een gebrekkige toevoer van ATP, en werd gesuggereerd een rol te spelen bij M.E./CVS [werk door Myhill]. PDH werkt als een toegangsweg in het oxidatief metabolisme door het coördineren van de afbraak van energie-substraten afgeleid van koolhydraten, vetten en aminozuren. Een daling qua PDH enzymatische aktiviteit kan leiden to accumulatie van pyruvaat en daardoor over-produktie van lactaat, zelfs in aanwezigheid van toereikende zuurstof. De PDH-aktiviteit wordt verder gecontroleerd door PDH-kinasen (PDKs) die de PDH enzyme-aktiviteit remmen via fosforylatie [verbinding met een fosfaat-groep; dergelijke enzymatische reaktie speelt dikwijls een rol bij signaal-overdracht], en PDH-fosfatasen die defosforylatie katalyseren. Sirtuine-4 (SIRT4) werd geïdentificeerd als een mitochondriaal lipoamidase [enzyme] dat de PDH-aktiviteit inhibeert [sirtuinen zijn NAD+-afhankelijke enzymen betrokken bij gen-regulering en het metabolisme]. PDK1-PDK4 worden gereguleerd op transcriptie-niveau via signalisering-aanwijzingen waarbij factoren zoals AMP-afhankelijk proteïne kinase (AMPK [zie link in de ‘Bespreking’]), PPARs [peroxisoom proliferator geaktiveerde receptoren; groep van receptor-eiwitten in de cel-kern die als transcriptie-factoren de expressie van bepaalde genen reguleren] en HIF1 [hypoxie-induceerbare factoren zijn transcriptie-factoren die reageren op dalingen van de beschikbare zuurstof in het cellulair milieu] betrokken zijn. Er werd een mogelijke rol van een verstoorde werking van PDH en abnormale AMPK-aktivatie bij M.E./CVS voorgesteld [Rutherford G, Manning P, Newton JL. Understanding muscle dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. J Aging Res. (2016) 2497348].

Samengevat: eerdere bevindingen ondersteunen dat ontregeling van PDH en veranderingen qua aminozuren in het serum betrokken kunnen zijn bij het pathomechanisme voor M.E./CVS. Onze hypothese was dat M.E./CVS geassocieerd is met een defekt oxidatief metabolisme waarbij PDH betrokken is, leidend tot verhoogd gebruik van ketogene aminozuren om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien. Om deze hypothese te controleren, bestudeerden we de concentraties van aminozuren in serum-stalen van 200 M.E./CVS-patiënten die voldeden aan de ‘Canadian consensus criteria’ en 102 gezonde controles. Om mogelijke ziekte-mechanismen na te gaan, hebben we de mRNA-expressie van relevante genen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles gemeten. We stelden gecultiveerde spiercellen bloot aan serum van M.E./CVS-patiënten om te bepalen of bestanddelen in het bloed het cellulair energie-metabolisme kunnen beïnvloeden.

Methodes

ME/CVS-patiënten en gezonde controles. Alle deelnemende patiënten voldeden aan de Canadese consensus criteria voor M.E./CVS. […] 162 vrouwen [gemiddeld 37,8 jaar oud] en 38 mannen [gemiddeld 36,3 jaar oud]. BMI (kg/m2) gemiddeld 24,9 voor de vrouwelijke & 25,0 voor de mannelijke patiënten. Controles (bloed-donoren en medisch personeel): 67 vrouwen [gemiddeld 34,5 jaar oud] en 35 mannen [gemiddeld 36,2 jaar oud] […].

Van de 200 M.E./CVS-patiënten waren er 47 die overnacht vastten voor de bloed-afname en 153 die dat niet deden. Alle 102 gezonde controles vastten niet. We vergeleken de serum-concentraties van alle aminozuren, van overnacht-vastende en niet-vastende patiënten, per geslacht. […]

Metabolieten-analyse. De 20 standaard aminozuren werden geanalyseerd d.m.v. gas-chromatografie & massa-spectrometrie […] Arg, hArg, ADMA, SDMA, 1-Mhis & 3-MHis d.m.v. vloeistof- chromatografie & massa-spectrometrie […]. […]

Kwantitatieve RT-PCR. Alle M.E./CVS-patiënten en gezonde controles in de gen-expressie studie waren niet-vastend. […] Beoordeling van PDK1, PDK2, PDK3, PDK4, PPARA, PPARD, PPARG, PDHA, MPC1, MPC2, ACOX1, HIF1A & SIRT4 mRNAs van 75 M.E./CVS-patiënten en 43 gezonde controles. […]

Cel-cultuur. […] Om te onderzoeken of blootstelling aan serum van M.E./CVS-patiënten het energie-metabolism in gecultiveerde myoblasten [voorlopers van spier-cellen] beïnvloedde […]. De experimenten werden geblindeerd uitgevoerd wat betreft de groepen (M.E./CVS of gezonde controle).

Cellulair metabolisme. OCR [zuurstof-verbruik] & ECAR [extracellulaire verzuring] [zie ‘Resultaten’] werden gemeten om, respectievelijk, de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie (glycolyse) te beoordelen. […] OCR & ECAR werden gedurende het experiment (waarbij sequentieel specifieke metabole modulatoren werden toegediend) simultaan opgenomen. […] De volgende cellulaire energetische omstandigheden werden gedefinieerd. Conditie-I “Rustend (alleen aminozuren)” (cellen heb enkel energie nodig voor basale fysiologische vereisten.): enkel aminozuren (niet Gln) als energie-substraten toegediend in het test-medium. Conditie-II “Rustend (aminozuren & glucose)”: cellen krijgen glucose (maar nog steeds in rust aangezien de vraag naar ATP onveranderd is). Conditie-III “Anaërobe belasting”: ATP-synthase geïnhibeerd d.m.v. oligomycine [ATP-synthase inhibitor; zorgt ervoor dat het enzyme geen ATP meer kan aanmaken] (cellen vertrouwen op glycolytische ATP-produktie; gelijkaardig aan het anaëroob energie-metabolisme, waarbij de mitochondriale ATP-produktie geïnhibeerd is door zuurstof-depletie). Hier wordt de maximale glycolytische capaciteit gemeten. Deze OCR wordt ‘leak activity’ [‘lek-aktiviteit’] genoemd aangezien het niet is gelinkt aan ATP-produktie via oxidatieve fosforylatie. Een lage ‘leak’-ademhaling betekent dat de integriteit van het mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem intact is. Conditie-IV “Aërobe belasting”: toevoeging van CCCP [carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone; chemische inhibitor van de oxidatieve fosforylatie, vernietigt het mitochondriaal membraan-potentiaal] liet het inhiberend effekt van oligomycine op het mitochondriaal zuurstof-verbruik los […]. Dit weerspiegelt een situatie van ernstige energie-depletie (mitochondriale ademhaling en glycolyse maximaal). […] Tenslotte werden rotenon [blokkeert NADH-dehydrogenase (complex-I) en zodoende de respiratoire keten] & antimycine-A [blokkeert complex-III en zodoende de respiratoire ademahaling] toegediend om (respectievelijk) respiratoir complex-I & -III te inhiberen, en zo de niet-mitochondriale zuurstof-consumptie te bepalen […].

Statistiek. […]

De studie is exploratief en hypothese-genererend […]. […]

Studie-goedkeuring. […]

Resultaten

Serum-concentraties van de 20 standaard aminozuren […]. De initiële analyses toonden een duidelijk patroon bij vergelijking van aminozuren met verschillende startpunten voor oxidatie via de mitochondriale pyruvaat/TCA-cyclus as. Daarom werden de aminozuren onderverdeeld in 3 categorieën […]:

Categorie-I aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat en daarom afhankelijk van PDH zijn voor verdere oxidiatie: alanine (Ala), cysteïne (Cys), glycine (Gly), serine (Ser) & threonine (Thr).

Categorie-II aminozuren treden het oxidatie-mechanisme binnen als acetyl-CoA, dat direct en onafhankelijk van PDH de TCA-cyclus voedt […]: isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenylalanine (Phe), tryptofaan (Trp) & tyrosine (Tyr).

Categorie-III bestaat uit anaplerotische aminozuren [anaplerotische reakties zijn er waar tussenprodukten van een metabool mechanisme worden gevormd; simpel uitgedrukt: “ze vullen de voorraden aan”] die worden omgezet naar TCA-cyclus intermediairen (en zo de metabole capaciteit van de cyclus aanvullen en ondersteunen): enkel aminozuren die niet tot categorieën-I of -II behoren; methionine (Met) & valine (Val) […]; histidine (His), glutamine (Gln), glutamaat/glutaminezuur (Glu), (Gln + Glu = Glx) & proline (Pro) […] en asparagine (Asn) & aspartaat/asparaginezuur (Asp), (Asn + Asp = Asx) […]. […]

Deze klassificatie is een vereenvoudigd model. Verscheidene aminozuren kunnen meerdere afbraak-mechanismen hebben afhankelijk van de fysiologische context. De aminozuren in categorie-I & -III zijn uitsluitend glucogeen [kunnen worden omgezet tot glucose], terwijl die in categorie-II ketogeen [kunnen worden omgezet tot acetyl-CoA] zijn of beide. […]

Aminozuren die voorzien in pyruvaat als substraat voor PDH (categorie-I). Er waren geen significante verschillen qua gemiddelde serum-waarden voor categorie-I aminozuren (Cys, Gly, Ser, Thr) tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles, uitgezonderd voor Ala (kleine maar statistisch significante daling bij de patiënten; P = 0.027). Er waren geen verschillen voor Gly & Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. vrouwelijke controles maar geringe dalingen voor Ser & Thr (telkens P = 0.010). Bij de mannen waren er geen verschillen voor deze aminozuren (M.E./CVS-patiënten versus controles). De som van de serum-concentraties van deze 4 categorie-I aminozuren (zonder Ala) verschilde niet tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles (ook niet per geslacht).

Aminozuren die zorgen voor acetyl-CoA toevoer in de TCA-cyclus (categorie-II). Alle 6 aminozuren in categorie-II waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde (P-waarden < 0.001 voor Ile, Leu, Phe & Tyr; 0.001 & 0.009 voor Lys & Trp). De dalingen waren zeer significant bij vrouwen met M.E./CVS (t.o.v. gezonde vrouwen) […]. Vergelijking van mannelijke M.E./CVS-patiënten met mannelijke controles toonde geen significante verschillen […] (trend tot vermindering voor Tyr; P = 0.086). De som van de serum-concentraties van de 6 categorie-II aminozuren was significant lager voor M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (ook bij vrouwen maar niet bij mannen). […]

Anaplerotische aminozuren (categorie-III). De gemiddelde serum-waarden voor anaplerotische (categorie-III) aminozuren waren significant gedaald tussen niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles […]. […]  De dalingen qua anaplerotische aminozuren werden vastgesteld bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten maar niet bij mannen, t.o.v. controles. De som van de serum-concentraties van de anaplerotische aminozuren was gedaald voor de ganse groep M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. […]

Vergelijking tussen niet-vastende en vastende M.E./CVS-patiënten. […] De serum-concentraties waren lager bij overnacht-vastende patiënten voor categorie-II aminozuren Ile, Phe, Trp & Tyr, naast Ala. Er waren trends voor lagere gemiddelde serum-waarden voor Pro, Met & Arg in serum van overnacht-vastende patiënten maar geen verschillen voor de andere aminozuren of metabolieten.

Andere gemodificeerde aminozuren. Op basis van een studie die endotheliale dysfunktie [endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten] bij M.E./CVS-patiënten aantoonde [Newton DJ et al; zie ‘Bespreking’], beslisten we serum-concentraties te meten van aminozuren en afgeleiden waarvan is geweten dat ze de endotheliale funktie beïnvloeden. Arginine, asymmetrisch dimethylarginine (ADMA) en homo-arginine (hArg) vertoonden gelijkaardige serum-waarden tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen én mannen). Voor symmetrisch dimethylarginine (SDMA) was er een significant gedaald gemiddelde serum-waarde bij vrouwen met M.E./CVS maar niet bij mannen, vergeleken met controles. Voor 1-methylhistidine (1-MHis), een merker voor inname van (voornamelijk dierlijke) proteïnen, was er geen verschil tussen M.E./CVS-patiënten en controles (vrouwen noch mannen). De concentraties van 3-methylhistidine (3-MHis), een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme (bv. spier-atrofie), waren significant hoger bij met M.E./CVS t.o.v. gezonde mannen (P = 0.003), terwijl er geen verschil qua 3-MHis was voor vrouwelijke M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde vrouwen.

Aminozuren en hun verband met andere karakteristieken van M.E./CVS-patiënten. Bij de niet-vastende vrouwen met M.E./CVS werden zeer significante correlaties gevonden voor alle combinaties met de categorie-II aminozuren (Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr) (P < 0.001). Bij de mannelijke M.E./CVS-patiënten werden gelijkaardige correlatie-patronen gezien. In tegenstelling daarmee vonden we minder en zwakkere correlaties met categorie-I & categorie-II aminozuren. Er waren voor Thr echter meerdere uitgesproken correlaties met categorie-II aminozuren; mogelijks een weerspiegeling van het feit dat er alternatieve oxidatie-paden (zonder omzetting naar pyruvaat) zijn voor Thr. Verder waren er zeer significante correlaties voor alle combinaties met de categorie-II en -III aminozuren maar minder significante correlaties met de categorie-I en -III aminozuren.

Geslacht bleek een belangrijke factor bij de interpretatie van de resultaten: er waren significante dalingen voor gemiddelde serum-waarden van categorie-II en -III aminozuren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Om de mogelijkheid te evalueren dat de geobserveerde veranderingen qua aminozuur-patronen veroorzaakt zouden kunnen zijn door andere verstorende factoren, voerden we statistische analyses uit om aminozuur-waarden in het serum te vergelijken met klinische variabelen (leeftijd, BMI, lichamelijke aktiviteit, M.E./CVS-ernst en ziekte-duur). Hogere leeftijd correleerde significant met verhoogde waarden voor Cys, Gly, Ile, Leu, Lys & Tyr bij vrouwen met M.E./CVS maar bij M.E./CVS-mannen enkel met Cys. Er waren geen significante correlaties tussen serum-waarden van aminozuren en fysieke aktiviteit (aantal elektronisch geregistreerde stappen per 24 uur) bij de M.E./CVS-groep, uitgezonderd een significante negatieve correlatie met Cys bij vrouwen. Bij de M.E./CVS-vrouwen waren er significante positieve correlaties tussen BMI en Cys, Ile, Leu, Phe & Tyr, en significante negatieve correlaties tussen BMI en Ser & Thr. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat verschillen qua BMI verantwoordelijk zouden zijn voor de vastgestelde verschillen in aminozuur-waarden in het serum bij vrouwen met M.E./CVS, werden de patiënten onderverdeeld in 4 BMI-groepen (ondergewicht tot obees). Bij vergelijking bleken er significante verbanden tussen hogere BMI en hogere serum-waarden van de categorie-II aminozuren Leu, Phe, Tyr & Ile. Bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten waren in alle BMI-groepen (ook de obese) de gemiddelde serum-waarden van deze aminozuren echter lager dan bij gezonde vrouwen. Bij de mannen met M.E./CVS werden geen significante verbanden gezien tussen BMI-groepen en aminozuren van categorie-I of -II, uitgezonderd een significante positieve associatie tussen Cys en BMI. […]

Verder werden de patiënten ook onderverdeeld in groepen volgens ziekte-ernst, ziekte-duur, lichamelijke aktiviteit en leven-kwaliteit. De serum-waarden van categorie-I of categorie-II aminozuren waren niet geassocieerd met M.E./CVS-ernst. Er werd een significant positief verband gevonden tussen ziekte-duur en serum-waarden van aminozuren enkel voor Phe bij vrouwelijke patiënten. Er waren geen significante associaties tussen gemiddelde aminozuur-waarden (categorie-I & -II) en fysieke aktiviteit, uitgezonderd een negatief verband met Cys bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren significante associaties tussen hogere ADMA-waarden en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.036) en tussen hoger 1-MHis en meer lichamelijke aktiviteit (P = 0.024) bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (een trend bij mannelijke patiënten; P = 0.086). […] Er was een significant verband tussen een hogere “SF36mean5” score [leven-kwaliteit] en een hogere gemiddelde serum-waarde van het categorie-I aminozuur Ser (P = 0.023); er waren trends voor Gly (P = 0.056) en Thr (P = 0.065) maar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten.

PDH-gerelateerde gen-expressie (mRNA) in PBMCs. Om te onderzoeken of de effekten op de aminozuren-profiel in het serum bij M.E./CVS-patiënten kan worden verklaard door veranderingen qua PDH-funktie, vergeleken we mRNA-waarden van PDH-gerelateerde genen in PBMCs van niet-vastende M.E./CVS-patiënten en niet-vastende gezonde controles. We vonden significant verhoogde mRNA-expressie van de inhiberende kinasen PDK1 (P = 0.002), PDK2 (P = 0.022) & PDK4 (P = 0.006) bij M.E./CVS-patiënten, terwijl PDK3 onveranderd bleef. Ook het mitochondriaal lipoamidase en PDH-inhibitor SIRT4 was significant ge-upreguleerd (P = 0.013). Bij de PPAR transcriptie-factoren was PPARδ (PPARD) ge-upreguleerd (P = 0.001). Er waren geen verschillen voor PPARα (PPARA), het PPAR transcriptioneel doelwit en peroxisomaal vetzuur β-oxidatie enzyme acyl-coenzyme-A oxidase 1 (ACOX1) of de transcriptie-factor HIF1α (HIF1A). Pyruvaat-dehydrogenase-E1α (PDHA) mRNA was lichtjes ge-upreguleerd (P = 0.037). De expressie van PPARγ (PPARG) mRNA lag onder de detektie-limiet van de analyse. Analyses van de mitochondriale pyruvaat-dragers (MPCs [mediëren de opname van pyruvaat in de mitochondrieën]) onthulden een nipt-significante upregulering van MPC1 (P = 0.046) maar MPC2 verschilde niet.

Hoewel er geslacht-specifieke verschillen werden vastgesteld qua gemiddelde serum-waarden van aminozuren bij M.E./CVS-patiënten, waren de gestegen mRNA-waarden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten versus gezonde controles gelijkaardig bij mannen en vrouwen wat betreft PDK1, PDK4, PPARA, PPARD & SIRT4.

Wat betreft PDK1 gen-expressie waren er significante verbanden met ziekte-ernst (gestegen PDK1 mRNA in matige/ernstige versus milde/mild-matige groepen), met ziekte-duur (gestegen PDK1 mRNA bij langere duur) en met lichamelijke aktiviteit […] (gestegen PDK1 mRNA bij lagere aktiviteit). De associaties werden niet gevonden voor PDK4 mRNA, PPARA, PPARD of SIRT4.

De mRNA-expressie van PDK1 correleerde sterk met PPARD (P < 0.0001), met SIRT4 (P = 0.003) en zwak, maar significant, met PPARA (P = 0.028). Er was geen significante correlatie tussen PDK1 & PDK4 (P = 0.12). Verder waren er zeer significante correlaties tussen SIRT4 & PPARD (P < 0.0001), en SIRT4 & PPARA (P < 0.0001) maar geen significante correlatie tussen SIRT4 & PDK4 (P = 0.15). Deze gegevens werden onderbouwd met een zeer significante correlatie tussen PPARA & PPARD mRNA (P < 0.0001). Voor expressie van PDK1, PDK4, PPARA of waren er geen significante correlaties met leeftijd of BMI. Bij de 75 niet-vastende M.E./CVS-patiënten waren er geen significante correlaties tussen serum-waarden van categorie-I of -II aminozuren en mRNA-expressie van PDKs, SIRT4, PPARA of PPARD.

Effekten van M.E./CVS-patiënten serum op de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie in gecultiveerde skeletspier-cellen. Bij de verklaring van de kenmerkende M.E./CVS-symptomen (post-exertionele malaise en slecht herstel) zou men relevante metabole defekten in skeletspier-cellen kunnen verwachten. We konden het energie-metabolisme in het spier-weefsel van onze patiënten niet op een directe manier meten. Om de invloed van mogelijke substanties in het bloed op M.E./CVS te bestuderen, onderzochten we het energie-metabolisme in gecultiveerde menselijke skeletspier-cellen blootgesteld aan serum van 12 M.E./CVS-patiënten (waaronder 3 patienten met zeer ernstige ziekte en 6 met ernstige M.E./CVS) en 12 gezonde controles. Deze studie was ontworpen voor het beoordelen van de mitochondriale ademhaling en lactaat-produktie via het meten van (respectievelijk) het zuurstof-verbruik (‘oxygen-consumption rate’, OCR) en extracellulaire verzuring (‘extracellular acidification rate’, ECAR), in aanwezigheid van aminozuren en glucose als substraten. […]

Basale (in rust) aminozuren-gedreven mitochondriale ademhaling (conditie-I) was matig verhoogd in spiercellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum voor 6 dagen en dit effect was ook aanwezig wanneer glucose werd toegevoegd (conditie-II). Daaropvolgende toediening van de ATP-synthase inhibitor oligomycine (conditie-III) toonde aan dat bijna alle respiratoire aktiviteit gelinkt was met ATP-produktie; wat bevestigt dat de integriteit van het oxidatieve fosforylatie systeem intact was. Er was echter een minieme toename qua overgebleven OCR (‘lek-aktiviteit’). Daarna werd via toediening van de ‘ontkoppeler’ carbonyl-cyanide-3-chlorofenylhydrazone [CCCP; ontkoppelt het elektron-transport-systeem van de ATP-produktie] een significant toegenomen respiratoire capaciteit (conditie-IV) onthuld. De gegevens gaven ook aan dat de ATP-gelinkte ademhaling (verschil conditie-II/-III) en de reserve respiratoire capaciteit (verschil conditie-IV/-II) verhoogd waren na blootstelling aan M.E./CVS-serum.

De basale glycolyse (conditie-II) was gelijkaardig tussen cellen blootgesteld aan M.E./CVS- en controle-serum. […] De maximum glycolyse in aanwezigheid van oligomycine neigde lichtjes verhoogd te zijn in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum (conditie-III) en deze trend was ook aanwezig na toediening van CCCP. Verdere analyse onthulde dat de lactaat-productie veroorzaakt door oligomycine (verschil conditie-III/-II) en door CCCP (verschil conditie-IV/-II) significant verhoogd waren in cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum versus controle. Daarom: de cellen blootgesteld aan M.E./CVS-serum vertonen een metabole wijziging waarbij versterkte lactaat-produktie is betrokken bij energetische belasting.

Samengevat: serum van patiënten met ernstige M.E./CVS bleek het mitochondriaal oxidatief metabolisme en de ademhaling in spiercellen te doen stijgen, bijzonderlijk bij energetische belasting. Bijkomende experimenten met kortere blootstelling toonden dat het effekt van M.E./CVS-serum op de mitochondriale ademhaling geleidelijk aan verhoogde afhankelijk van de duur van de blootstelling.

Bespreking

Deze studie vond dat het serum aminozuren-profiel veranderd was in een grote en goed-gekarakteriseerde groep M.E./CVS-patiënten, op een manier die verstoorde mitochondriale pyruvaat-oxidatie suggereert. Deze bevinding wijst, in combinatie met verhoogde mRNA-expressie van PDK1, PDK2 & PDK4 en SIRT4, in PBMCs van patiënten, op abnormaliteiten qua PDH-regulering als een potentiële belangrijke factor bij de pathogenese van M.E./CVS. Blootstelling van gecultiveerde spiercellen aan serum van M.E./CVS-patiënten wees op de aanwezigheid van bloed-bestanddelen die het energie-metabolisme beïnvloeden.

Analyse van het serum van 200 M.E./CVS-patiënten en 102 gezonde controles onthulde dat de concentraties van aminozuren die deelnemen aan het mitochondriaal oxidatief metabolisme op het niveau van acetyl-CoA (categorie-II) significant gedaald waren bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. In tegenstelling daarmee waren er geen grote wijzigingen qua aminozuren die worden omgezet naar pyruvaat (categorie-I). [lees: “de pyruvaat-produktie zelf is in orde”] M.E./CVS lijkt zodoende een specifieke daling te veroorzaken van energetische substraten die worden geoxideerd downstream van PDH [“na de aanmaak van pyruvaat”]. Dit suggereert dat het pyruvaat-katabolisme wordt belemmerd bij M.E./CVS-patiënten [m.a.w. wellicht ligt het probleem bij het PDH enzyme-complex dat pyruvaat omzet naar acetyl-CoA], leidend tot verhoogd gebruik van acetyl-CoA producerende aminozuren als alternatieve substraten die het aëroob metabolisme via de TCA-cyclus van brandstof voorzien. De anaplerotische aminozuren, die dienen om de capaciteit van de TCA-cyclus op peil te houden (categorie-III), waren gedaald bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen komen overéén met eerdere rapporten [door Armstrong et al.] over dalingen qua Gln, Glu & Phe […]. Interessant: een studie bij M.E./CVS-patiënten vond veranderingen qua aminozuren-concentraties in urine die consistent zijn met het specifiek aminozuren-patroon dat we vonden in serum, en een gedaalde urinaire excretie van de TCA-cyclus intermediairen barnsteenzuur [succinaat] en citroenzuur [citraat] werd ook gerapporteerd [zie Niblett SH et al. hierboven]. Een metaboloom-studie rapporteerde gedaalde concentraties TCA-cyclus intermediairen, samen met een gedaalde pyruvaat/isocitraat verhouding, in plasma bij M.E./CVS [Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990]. Dit ondersteunt verder de hypothese dat het bevoorraden van de TCA-cyclus met pyruvaat belemmerd is bij M.E./CVS-patiënten, wat in lijn is met de gesuggereerde PDH-inhibitie.

We vonden significante mRNA-upregulering van of PDK1, PDK2 en PDK4 in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. De expressie van PDK1 mRNA was geassocieerd met klinische kenmerken zoals langere ziekte-duur, ernstiger M.E./CVS en verminderde lichamelijke aktiviteit. De werking van de PDKs is het inhiberen van PDH via fosforylatie onder omstandigheden waar pyruvaat-oxidatie moet worden onderdrukt (bv. uithongering). Een afwijkende toename qua PDK-expressie kan daarom een verstoorde PDH-funktie bij M.E./CVS veroorzaken, mogelijks via aktiviteit van transcriptie-factoren. PPARD mRNA was significant ge-upreguleerd in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, terwijl PPARA niet verschilde van gezonde controles. Er was echter een positieve correlatie tussen de expressie van PDK1 en allebei deze PPARs. Zelfs als expressie van het PPAR target-gen ACOX1 [codeert voor het enzyme peroxisomaal acyl-coenzyme-A oxidase-1 van het vetzuren beta-oxidatie pad] gelijkaardig was bij M.E./CVS-patiënten en controles, kan niet worden uitgesloten dat de PPARs bijdragen tot de regulering van PDKs op een bepaald stadium van de ontwikkeling van de ziekte. Het mitochondriaal enzyme SIRT4 bleek PDH-aktiviteit te inhiberen via hydrolyse van een component van het PDH-complex. We vonden dat SIRT4 mRNA-expressie ge-upreguleerd was in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en significant correleerde met mRNA-expressie van PDK1, PPARA & PPARD. Dit suggereert dat PDH-aktiviteit geïnhibeerd is door gecoördineerde regulerende mechanismen bij deze patiënten. Er was een kleine maar significante toename in PBMC mRNA-expressie van MPC1 maar niet van MPC2. Deze MPCs [zie hierboven] bleken belangrijke rollen te spelen in het mitochondriaal oxidatief metabolisme. De geringe upregulering van MPC1 en van PDH-E1α (PDHA [Het PDH-complex bestaat uit meerdere copieën van 3 enzymatische componenten: pyruvaat-dehydrogenase (E1), dihydrolipoamide-acetyltransferase (E2) & lipoamide-dehydrogenase (E3); E1 enzyme bestaat uit 2 alfa- & 2 beta- subunits.]) mRNAs zou compenserende mechanismen kunnen weerspiegelen die de pyruvaat-accumulatie (te wijten aan gedaalde PDH-aktiviteit) tegenwerken.

De oxidatie-paden van pyruvaat en aminozuren zijn nauw verbonden met de vetzuur-oxidatie machinerie, samenkomend op het niveau van acetyl-CoA in het mitochondriaal compartment. Er zou kunnen worden verwacht dat bij een adaptieve respons op een toestand van lage energie (veroorzaakt door een beperkte acetyl-CoA bevoorrading) meerdere signalisering-factoren betrokken zijn om de energie-homeostase te redden. Dergelijke signalisering-factoren omvatten AMPK, PPARs & HIF1, die context-afhankelijke regulering van vele metabole mechanismen mediëren. Het uibreiden van onze kennis omtrent de relatieve bijdragen van specifieke katabole paden tot de pathogenese van M.E./CVS zal belangrijk zijn om de ontwikkeling van biomerkers en behandelingen te vergemakkelijken.

Er zou kunnen worden verwacht dat de PDH-inhibitie bij M.E./CVS die hier wordt gesuggereerd, met compenserend gebruik van aminozuren als substraten voor TCA-oxidatie, ook de mitochondriale vetzuur β-oxidatie beïnvloedt in een poging om de energie-homeostase te redden. Een studie beoordeelde 612 metaboliteten bij 45 M.E./CVS-patiënten en 39 gezonde controles, en rapporteerde meerdere abnormaliteiten in verscheidene mechanismen betrokken bij het lipiden-metabolisme en het mitochondriaal energie-metabolisme [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E5472-E5480]. De meest prominente veranderingen bij M.E./CVS-patiënten waren uitgebreide dalingen qua sfingolipiden, glycosfingolipiden en fosfolipiden. Deze bevindingen waren consistent met een lagere ATP- en GTP-turnover, en met dalingen qua metabole intermediairen van vertakte aminozuren. Er waren echter ook indicaties voor een gereduceerde mitochondriale vetzuur-oxidatie, mar enkel bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Voegen we daarbij de PDH-inhibitie, dan zou verminderde mitochondriale vetzuur-oxidatie mogelijkerwijs de toevoer van acetyl-CoA verder compromitteren en zodoende de afhankelijkheid van categorie-II aminozuren als alternatieve brandstof voor de TCA-cyclus verhogen, zoals aangetoond in onze studie.

Geslacht-specifieke verschillen betreffende veranderingen in serum aminozuren-patronen waren duidelijk bij onze M.E./CVS-patiënten. Terwijl all 6 de aminozuren die kunnen worden omgezet naar acetyl-CoA significant waren gedaald bij de vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (t.o.v. gezonde vrouwen), vertoonden mannelijke M.E./CVS-patiënten geringe en niet-significante dalingen van Tyr & Phe. Omwille van het relatief laag aantal mannelijke M.E./CVS-patiënten en mannelijke gezonde controles in de studie, was de statistische ‘power’ om een verschil te detekteren lager. De effekt-groottes waren echter groter bij vrouwen. Daarnaast werden bij de 124 niet-vastende vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 67 gezonde vrouwen afzonderlijke analyses uitgevoerd (2 niet-overlappende willekeurige groepen van 33 vrouwelijke M.E./CVS-patiënten en 33 gezonde vrouwen) die dezelfde patronen aantoonden, met een significante daling van de som van de serum-concentraties van zowel categorie-II als categorie-III aminozuren bij vrouwen met M.E./CVS. Dit is een argument voor een differentieel en geslacht-specifiek gebruik van aminozuren. Een eerdere studie rapporteerde een significant verhoogde urinaire excretie van 3-Mhis (een merker voor endogeen proteïnen-katabolisme) in een groep van 100 M.E./CVS-patiënten (waaronder 73 vrouwen) [zie Niblett SH et al.; hierboven]. Wanneer we echter serum 3-MHis per geslacht analyseerden, vonden we enkel bij mannelijke M.E./CVS-patiënten een verhoging. Dit suggereert dat mannen, meer dan vrouwen, endogeen proteïnen-katabolisme [eiwit-afbraak/spier-atrofie] aanwenden om te voorzien in substraten voor de TCA-cyclus. Geslacht-specifieke verschillen qua metabolisme [compensatie-mechanismen anders bij vrouwen dan bij mannen] werden aangetoond en kunnen bij M.E./CVS-patiënten in werking zijn, waarbij vetzuren, aminozuren, oxidatieve fosforylatie en het steroïden-metabolisme betrokken zijn. In tegenstelling met de geslacht-specifieke effekten betreffende aminozuren, was de verhoogde expressie van PDKs & PPARD (mRNA in PBMCs) gelijkaardig bij vrouwen en mannen met M.E./CVS. Tesamen geeft dit aan dat het ziekte-veroorzakende mechanisme verschillende compenserende effekten triggert bij vrouwen en mannen. Een gemeenschappelijk effector-systeem voor het bestendigen van symptomen zou dus de PDK-PDH-lactaat as kunnen omvatten, met gedeeltelijk geslacht-specifieke compenserende (secundaire) effekten gerelateerd met aanpassingen in het energie-metabolisme.

Onze studies met gecultiveerde menselijke spiercellen geven aan dat blootstelling aan M.E./CVS-serum leidde tot verhoogde mitochondriale ademhaling, aaangedreven door aminozuren, alleen of in combinatie met glucose. Dit effekt was bijzonder duidelijk onder omstandigheden van energie-uitputting, wanneer de mitochondriale ademhaling aan een maximum werkt (conditie-IV). Hoewel de lactaat-produktie laag neigde te zijn in rust, was deze buitensporig geïnduceerd bij energetische belasting. Deze observaties zijn compatibel met een metabole belemmering op het niveau van PDH, met een verhoogde omzetting van pyruvaat naar lactaat tot gevolg, en versterkte vraag naar alternatieve substraten downstream van PDH. Het is denkbaar dat de effekten van een dergelijke PDH-ontregeling significant escaleren onder omstandigheden met een verhoogde metabole flux, in overéénstemming met de cel-studies die hier worden gerapporteerd. Er werden ondersteunende bevindingen aangetoond na uitschakeling van PDH in gecultiveerde spiercellen. Op basis van deze observaties lijkt er een substantie(s) aanwezig in serum van M.E./CVS-patiënten die een cellulaire respons induceert ter ondersteuning van de mitochondriale energie-produktie. In overéénstemming daarmee zou optimalisering van de mitochondriale ademhaling kunnen worden beschouwd als een beschermende respons om energie-depletie veroorzaakt door PDH-dysfunktie te vermijden. Het energetisch rendement van zo’n metabole adaptatie zal echter afhangen van de toevoer van energetische substraten als brandstof voor de mitochondriale ademhaling – die gelimiteerd blijkt bij M.E./CVS-patiënten. De huidige bevindingen suggereren dat de mitochondriale brandstof-voorziening gecompromiteerd is door verminderde flux via PDH, wat leidt tot over-consumptie van alternatieve substraten zoals aminozuren gelinkt met de TCA-cyclus. Er zijn bijkomende studies vereist om de substantie(s) in M.E./CVS-serum – die de effekten op gecultiveerde spiercellen mediëren, die direct op het metabool apparaat kunnen werken of indirect via signalisering-factoren – te identificeren.

Onze gegevens – die suggereren dat M.E./CVS geassocieerd is met verminderde efficiëntie van het energie-metabolisme gecombineerd met over-produktie van lactaat – kunnen verklaren waarom veel M.E./CVS-patiënten de anaërobe drempel bereiken bij een lage belasting [Vermeulen RC. Decreased oxygen extraction during cardiopulmonary exercise test in patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2014) 12: 20 /// Snell CR, Stevens SR, Davenport TE, Van Ness JM. Discriminative validity of metabolic and workload measurements for identifying people with Chronic Fatigue Syndrome. Phys Ther. (2013) 93: 1484-1492 (lees ook ‘Dubbele fietstest’) /// Keller BA et al. Inability of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients to reproduce VO2peak indicates functional impairment. J Transl Med. (2014) 12: 104]. Dit wordt ondersteund door een individueel patient-verslag [Vink M. The aerobic energy production and the lactate excretion are both impeded in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. J Neurol Neurobiol. (2015) 1: 4] en onze eigen observaties bij patiënten met ernstige M.E./CVS die lactaat-waarden van boven 8 mM [normaalwaarden bij volwassenen: 0,5-1,7 mM] hadden, enkel en alleen door 10 min rechtop staan. Aangezien M.E./CVS-patiënten normaal gezien geen verhoogde lactaat-waarden in rust vertonen, kan er worden gespeculeerd dat het metabolisme zich aanpast aan de vermoedelijke verstoorde PDH-werking door het verhogen van de oxidatie van acetyl-CoA opleverende aminozuren en misschien ook vetzuren. [zie piloot-studie van Hanson et al. in epiloog] Zodoende kan het PDH-afhankelijk metabolisme toereikend funktioneren om over-produktie van lactaat te vermijden bij rustende patiënten maar niet in staat zijn adequaat te reageren op verhoogde glycolyse wanneer het systeem wordt belast bij inspanning. Er wordt geschat dat de TCA-cyclus 70- tot 100-voud stijgt bij zware inspanning om voldoende ATP te genereren. Dit zou een situatie creëeren met ontoereikende toevoer van acetyl-CoA om de oxidatieve ATP-produktie van brandstof te voorzien alsook accumulatie van pyruvaat en vervolgens lactaat, ondanks aërobe omstandigheden met voldoende zuurstof. Een slechte werking van PDH kan daarom consistent zijn met de verlaging van de aërobe drempel, het slecht herstel en de post-exertionele malaise die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten. Een dergelijk mechanisme zou in overéénstemming zijn met het geobserveerde verschil in inspanning-intolerantie versus ziekte-ernst bij M.E./CVS-patiënten, door het in verband brengen van de symptomen met de grootte-orde van de metabole belemmering.

De bevinding dat PDKs ge-upreguleerd zijn in PBMCs van M.E./CVS-patiënten is suggestief voor metabole ontregeling op systeem-niveau. Deze cellen hebben een funktionele PPAR-PDK interaktie en kunnen daarom een afspiegeling zijn van geassocieerde effekten die optreden in andere weefsels (die verantwoordelijk zijn voor het klinisch beeld en de symptomen van M.E./CVS). Belangrijk: zelfs al waren de verminderingen qua aminozuren zeer significant bij vrouwelijke M.E./CVS-patiënten, de effekt-groottes bleken gematigd. De serum-waarden van de acetyl-CoA producerende en anaplerotische aminozuren lagen binnen het normaal bereik, ook in de meeste vrouwelijke M.E./CVS-patiënten. Er waren zodoende geen tekenen voor een aminozuren-deficiëntie, en er is geen voor de hand liggende noodzaak voor voeding-supplementen. De bij M.E./CVS-patiënten geobserveerde verminderingen qua aminozuren kan louter een weespiegeling zijn van een gewijzigd metabolisme bij pogingen om te adapteren aan een metabole belemmering. Het patroon van aminozuren-wijzigingen kan niet worden verklaard door andere variabelen zoals leeftijd, mate van inaktiviteit (beoordeeld via het aantal stappen per dag), ziekte-ernst of -duur. Zelfs al waren er significante correlaties met BMI: alle categorieën M.E./CVS-vrouwen (inclusief obese vrouwen) hadden lagere gemiddelde waarden qua ketogene aminozuren dan gezonde vrouwen, d.w.z. de BMI-verschillen konden de vastgestelde verminderde serum-waarden van categorie-II aminozuren niet verklaren. We vergeleken de serum-waarden van aminozuren van overnacht-vastende en niet-vastende M.E./CVS-patiënten en vonden hetzelfde patroon van veranderingen qua aminozuren-profielen. Er waren echter significante dalingen van meerdere categorie-II aminozuren bij de overnacht-vastende patiënten. Dus: zelfs al was het effekt van het vasten beperkt, toch sloten we de overnacht-vastende patiënten uit bij de analyses om te vermijden dat deze variabele werd verstoord.

Deze studie identificeert metabole veranderingen die meerdere van de klinische symptomen bij M.E./CVS-patiënten kunnen verklaren; het onderliggend mechanisme(n) voor de oorzaak van deze effekten blijft echter onduidelijk. Onze eerdere bevindingen bij proeven van B-lymfocyten depletie-therapie (monoclonaal anti-CD20 antilichaam rituximab) [momenteel nog geen bevestigingen] suggereren dat M.E./CVS in een subgroep patiënten een variant van een auto-immune ziekte zou kunnen zijn. Verdere research zou de hier gerapporteerde metabole effekten bij M.E./CVS moeten aanpakken in de context van een potentieel immunologisch mechanisme. Auto-antilichamen kunnen mogelijks interfereren met cel-oppervlakte receptoren alsook met andere factoren die betrokken zijn bij cel-signalisering. Een studie toonde dat serum-waarden van auto-antilichamen tegen meerdere autonome receptoren hoger waren bij M.E./CVS-patiënten dan bij gezonde controles [Loebel M et al. Antibodies to β-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-39]. Er werden gelijkaardige auto-antilichamen gedetekteerd bij posturaal orthostatische tachycardie syndroom [POTS] en bij complex regionaal pijn syndroom [CRPS], aandoeningen met enkele gelijkenissen met M.E./CVS […]. Auto-antilichamen bij M.E./CVS zouden kunnen interfereren met belangrijke metabole signalisering-mechanismen waarbij factoren zoals HIF1 & PPARs, alsook AMPK – dat abnormaal geaktiveerd bleek skeletspier-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brown AE, Jones DE, Walker M, Newton JL. Abnormalities of AMPK activation and glucose uptake in cultured skeletal muscle cells from individuals with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2015) 10: e0122982] – betrokken zijn. Deze factoren zijn geassocieerd met PDK & SIRT4 bij de regulering van het oxidatief metabolisme. Bij dergelijke signalisering-mechanismen zijn factoren betrokken die eerder met M.E./CVS werden gelinkt, zoals reaktieve zuurstof soorten geassocieerd met signalisering- en mitochondriale dysfunktie, en stikstof-oxide gerelateerd met endotheliale dysfunktie, wat werd aangetoond bij M.E./CVS [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-336]. AMPK aktiveert het enzyme endotheliaal stikstof-oxide-synthase (eNOS) en foutieve AMPK-signalisering kan een mechanisme zijn bij endotheliale dysfunktie. In de huidige studie was de gemiddelde serum-waarde van de endogene eNOS-inhibitor en L-Arg analoog ADMA gelijkaardig bij M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. ADMA is gewoonlijk verhoogd bij cardiovasculaire endotheliale dysfunktie, wat er op wijst dat de mechanismen voor endotheliale dysfunktie bij M.E./CVS […] verschillen van die bij cardiovasculaire ziekten.

Er werd PDH-deficiëntie aangetoond bij ernstige metabole aandoeningen veroorzaakt door mutaties, waarbij progressieve neurologische degeneratie/acidose/energie-tekort betrokken bleek en associaties met epilepsie te wijten aan gewijzigde neuronale prikkelbaarheid. Bij de auto-immune zieke primaire biliare cirrose [PBC; ‘Verder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)], die gepaard gaat met ernstige vermoeidheid, richten anti-mitochondriale auto-antilichamen zich tegen componenten van het PDH-complex, wat leidt tot inflammatie en weefsel-vernietiging. Bij M.E./CVS is er geen overtuigend bewijsmateriaal voor histologische inflammatie of weefsel-vernietiging, Maar toch zijn er gegevens die aktivatie van pro-inflammatoire én anti-inflammatoire mechanismen tonen (cytokine-analyses), bijzonderlijk tijdens de eerste jaren van de ziekte [Hornig M et al.; zie ‘Inleiding’]. […] Verder werk zal focussen op hoe abnormale immuun-responsen bij M.E./CVS cellulaire signalisering aantast en PDH-inhibitie veroorzaakt.

Tot besluit: deze studie suggereert dat M.E./CVS geassocieerd is met PDH-verstoring, leidend tot verhoogd verbruik van aminozuren die alternatieve paden voor de aanmaak van ATP van brandstof voorzien. Er werd gevonden dat serum van M.E./CVS-patiënten de mitochondriale ademhaling in gecultiveerde spiercellen verhoogt, mogelijks ter compensatie of adaptatie van een inhibitie van metabole energie-mechanismen. De fysiologische gevolgen van dergelijke defekten omvatten waarschijnlijk energie- (ATP) deficiëntie en overmatige lactaat-produktie, wat strookt met de invaliderende inspanning-intolerantie die wordt gezien bij M.E./CVS-patiënten.

————————-

Ongeveer terzelfder tijd als bovenstaand artikel verscheen er ook één van Maureen R. Hanson et al. (‘Cornell University’, New York) in het tijdschrift Molecular BioSystems, getiteld ‘Metabolic profiling of a Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome discovery cohort reveals disturbances in fatty acid and lipid metabolism’. Het betreft een piloot-studie (17 M.E./CVS-patiënten & 15 gematchte controles) waar de ‘metabole signatuur’ in het plasma wordt vergeleken en mogelijke metabole verstoring worden geëxploreerd. Er werden 74 “differentieel accumulerende metabolieten” gevonden op een toaal van 361 onderzochte (35 significant gewijzigd na statistische correctie). Daarbij meerdere “essentiële energie-gerelateerde molekulen” die theoretisch gelinkt kunnen worden aan het algemeen gebrek aan energie dat wordt gezien bij M.E./CVS. Er werden “enkele mechanismen aangewezen met een hoge impact: het taurine-metabolisme (taurine is een zwavel-bevattend organisch zuur, een belangrijk bestanddeel van gal, met fundamentele biologische rollen waaronder anti-oxidatie, modulatie van calcium-signalisering, enz.), het glycerofosfolipiden-metabolisme (of fosfoglyceriden; belangrijkste component van biologische membranen), die in combinatie met het primaire (gesynthetiseerd in de lever) galzuren (ontstaan uit cholesterol) -metabolisme, alsook het glyoxylaat & dicarboxylaat -metabolisme (de glyoxylaat-cyclus is een serie reakties betrokken bij de biosynthese van carbohydraten/suikers uit vetzuren of voorlopers met 2 koolstoffen die het systeem binnenkomen als acetyl-coenzyme A) en enkele andere, allemaal betrokken zijn bij het vetzuren-metabolisme”. Purinen (includsief ADP & ATP), pyrimidines en meerdere metabole aminozuren-mechanismen bleken significant verstoord…

december 3, 2016

Differentiële expressie van mitochondriale proteïnen bij CVS

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 8:25 am
Tags: , , , , , , ,

Een artikel dat voor zichzelf spreekt… Er worden hier 2 proteïnen (betrokken bij de cellulaire energie-produktie) aangeduid die (in combinatie) een diagnostische merker zouden kunnen zijn voor M.E.(cvs).

Over aconitase (aconitaat-hydratase; omzetting van citraat naar isocitraat in de TCA-cyclus) werd ook al gesproken in onze stukken ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’ & ‘Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS’…

Er werd tevens afwijkende expressie van ACON en ATPB in het speeksel gevonden. Dit zou een afname bij een eventuele test veel makkelijker maken.

Lees ook ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’ & ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’.

————————-

Transl Psychiatry. (2016) 6: e904

Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome

Ciregia F1, Kollipara L2, Giusti L1, Zahedi RP2, Giacomelli C3, Mazzoni MR1, Giannaccini G1, Scarpellini P4, Urbani A5,6, Sickmann A2,7,8, Lucacchini A1, Bazzichi L3

1Department of Pharmacy, University of Pisa, Pisa, Italy

2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften-ISAS, Dortmund, Germany

3Division of Rheumatology, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

4Division of Psychiatry, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

5Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica, Rome, Italy

6Proteomics and Metabonomics Unit, IRCCS-Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

7Department of Chemistry, College of Physical Sciences, University of Aberdeen, Aberdeen, UK

8Medizinische Fakultät, Medizinische Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende en complexe aandoening die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verbetert door rust. Dysfunktie van de mitochondrieën is een research-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS. In eerder werk onderzochten we het proteoom-profiel in speeksel van een monozygote tweeling met en zonder CVS. Hierna analyseerden we mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. We gebruikten een gesofisticeerde techniek (nano-LC-MS) om de mitochondrieën uit bloedplaatjes te bestuderen. Daarna selekteerden we 3 proteïnen die waren gevalideerd d.m.v. ‘western blot’ analyse bij een grote groep individuen (n = 45 CVS; n = 45 gezond), in het speeksel. De gekozen proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). De resultaten voor ATPB & ACON bevestigden hun upregulering bij CVS. De MDHM-verandering werd echter niet bevestigd. Daarna beslisten we, gezien de grote variabiliteit qua klinische kenmerken van CVS-patiënten, de expressie van onze proteïnen te analyseren na opsplitsing van de patiënten volgens klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger bij de groep patiënten die klinische kenmerken vertoonden die gelijkaardig waren met de zieke tweeling-helft. We besluiten dat deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de criteria zou kunnen zijn die in rekening kunnen worden gebracht bij het helpen stellen van de diagnose. Bovendien zou de identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kunnen helpen bij het werpen van een licht op de complexe aandoening CVS. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van aangepaste behandelingen.

Inleiding

[…] De moeilijkheden bij het definiëren van CVS, door het gebrek aan diagnostische merkers, maakt epidemiologische studies ingewikkeld. […] Tot nu toe blijft de etiologie van CVS onduidelijk; waarschijnlijk is het een heterogene aandoening die kan worden verklaard via een multi-factorieel model waar genetische, infektueuze, neuro-endocriene en psychologische factoren samenkomen. […]

Een ander onderzoek-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS is een gebrekkige mitochondriale funktie. Studies betreffende het metabolisme bij CVS suggereren onregelmatigheden qua energie-metabolisme en oxidatieve stress. [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172; zie ook referenties onze inleiding] Er wordt in het bijzonder steeds meer erkend dat mitochondriale dysfunkties aan de basis van CVS kunnen liggen [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J]; bovendien is vermoeidheid een prominent symptoom bij patiënten met mitochondriale ziekte. Dit is een aantrekkelijke hypothese, aangezien een metabole wijziging op mitochondriaal niveau een energie-deficiëntie met zich mee kan brengen en de uitzonderlijke vermoeidheid verklaren.

Er werd dikwijls gesuggereerd dat een genetische voorbestemdheid aan de basis van CVS kan liggen; daarom voorziet het bestuderen van tweelingen de best gematchte controles. Zodoende onderzochten we in eerder werk het proteoom-profiel in van een monozygote tweeling, waarvan één met en één zonder CVS. [Ciregia F et al. A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the Chronic Fatigue Syndrome: a focus on potential salivary biomarkers. J Transl Med (2013) 11: 243] Onze resultaten beklemtoonden de betrokkenheid van de inflammatoire respons bij de pathogenese van CVS. Na de bemoedigende resultaten verkregen via deze preliminaire studie, wilden we meer kennis verwerven betreffende mechanismen bij CVS via het analyseren van mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. De verwachting was dat onze bevindingen bewijs zouden kunnen leveren voor een mitochondriale rol bij de pathogenese van CVS.

Met dit doel isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes. Dit zijn circulerende bloedcellen die essentieel zijn voor de hemostase [preventie van bloedverlies] en coagulatie [bloedstolling] maar ook voor de aangeboren en adaptieve immuniteit. Bloedplaatjes hebben funktioneel aktieve mitochondrieën, waarvan de betrokkenheid bij de cel-fysiologie en bij pathologische aandoeningen werden aangetoond. De beoordelingen van de mitochondriale funktie in bloedplaatjes bieden meerdere voordelen voor diagnostische doeleinden: hun overvloed in het perifeer bloed, het betrekkelijk gemak om ze te verkrijgen, hun beperkte complexiteit, het aanzienlijk aantal mitochondrieën in de bloedplaatjes en de mogelijkheid voor herhaalde metingen bij elke patient.

Bloedplaatjes werden reeds aangewend bij onderzoeken naar de mitochondriale betrokkenheid bij enkele aandoeningen, bv. sepsis, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze studies bleven echter beperkt tot analyse van het mitochondriaal DNA en elektron-transfer aktiviteiten, terwijl er geen onderzoek werd verricht naar de totale proteïnen-inhoud van de mitochondrieën. Daarom analyseerden we de mitochondrieën uit bloedplaatjes via ‘nano-liquid chromatography electrospray-ionization mass-spectrometry’ (nano-LC-MS [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]) bij hetzelfde tweeling-paar als in de eerdere studie. Daarna werden de meest beloftevolle biomerkers gevalideerd via ‘western blot’ [WB] analyse [Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.] bij een grote groep patiënten, gebruikmakend van speeksel, dat op een niet-invasieve, eenvoudige, veilige en stress-vrije manier kan worden gecollecteerd en die makkelijk toepasbaar is bij grote groepen individuen.

Gezien de heterogeniteit van de ziekte was het doel biomerkers te suggereren om gevallen van CVS te stratificeren, eerder dan het selekteren van enkele biomerkers voor de identificatie van CVS. Dit kan helpen de behandeling op maat van de patient te snijden.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

Deze studie werd opgedeeld in 3 verschillende stappen. De eerste ‘ontdekking’-fase was gericht op het karakteriseren van het mitochondriaal proteoom-profiel van een CVS-patient in vergelijking met z’n gezonde monozygote tweeling-helft. Dit doel werd bereikt d.m.v. een proteoom-benadering (nano-LC-MS). De tweede ‘verkennende’ fase was gericht op het onderzoeken van de veranderende proteïnen (Ingenuity Pathway Analysis – IPA [software om expressie-profielen te analyseren]). Dit platform laat toe de mogelijke interakties te visualiseren tussen de geïdentificeerde biomerker-signaturen in mitochondrieën, wat ons helpt enkele kandidaten te selekteren voor de ‘validatie’-fase. De geselekteerde proteïnen werden eerst gezocht in het speeksel van de tweeling-broers en, eens de verschillen bevestigd werden, werd de validatie verbreed naar een groter aantal patiënten en controles. Tenslotte hebben we onze analyse versterkt door te kijken naar klinische gegevens, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers correleren met de klinische parameters van de patiënten. Dit leidt ons tot de identificatie van mitochondriale proteïnen die bruikbaar zijn bij het subtyperen van CVS-patiënten.

Patiënten

[…] 45 CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 38,6 ± 11,9 jaar); 45 gezonde controles (36,4 ± 10,9) 25 vrouwen, 20 mannen […]. De patiënten werden geklassificeerd op basis van de criteria volgens Fukuda et al. […] De individuen vulden de ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) in […]. Vermoeidheid werd ook beoordeeld d.m.v. de ‘Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue Scale’ (FACIT). […] Om de individuen beter te klassificeren, werden de volgende parameters geëvalueerd: anti-nucleaire antilichamen, ‘extraheerbare nucleaire antigenen’ [ENA] antilichamen [voor auto-immuunziekten], reumatoïde factor & anti-cardiolipine antilichamen (immunologische parameters); cortisol en adrenocorticotroop hormoon, serotonine, groei-hormoon, IGF-1 & vitamine-D3 (hormoon-profiel); tumor necrose factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, interleukine (IL)-6, IL-10, IL-2, IL-8 & IL-1b (cytokine-profiel).

Speeksel-stalen

[…]

Bloedplaatjes & aanrijking mitochondrieën

[…]

Kwantificatie op basis van LC-MS

[…]

LC-MS stalen

[…]

LC-MS analyse

[…]

Analyse van signalisering-mechanismen

[…] Alle proteïnen met differentiële expressie gelijk aan of meer dan 2 maal (CVS t.o.v. controle) werden opgenomen voor de bio-informatische analyse, om de molekulaire funkties te identificeren die het sterkt geassocieerd waren met de proteïnen-lijst.

WB voor validatie

Om de expressie-veranderingen in speeksel te valideren, gebruikten we ‘western blot’ analyse. De geselekteerde proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). […]

[…]

Statistische analyse

[…]

Klinische correlaties

[…]

Resultaten

Proteoom-analyse

Om het profiel op te maken van de mitochondriale proteïnen bij CVS, isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes van hetzelfde tweeling-koppel met en zonder CVS dat eerder werd onderzocht. Om de kwaliteit te evalueren van de geïsoleerde mitochondrieën gebruikten we enzymatische testen en WB-analyse: de mitochondriale aanrijking was bevredigend. We verkregen een mitochondriale fractie van 450 μg proteïnen startend van ca. 5×109 bloedplaatjes. Met als doel de grens van reproduceerbaarheid van het mitochondriaal preparaat te overwinnen, werden de experimenten in 3-voud uitgevoerd. De mitochondrieën die werden verkregen uit elk van de 3 experimenten werden samengevoegd en geanalyseerd in drievoud.

De proteïnen-samenstelling van de mitochondrieën werd geanalyseerd via nano-LC-MS en er werd een differentiële analyse tussen de CVS-patient en z’n gezonde broer uitgevoerd. Globaal identificeerden we 1.007 proteïnen […]. Van die 1.007 gedetekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant gemodificeerd bij CVS. Van deze 194 proteïnen waren er 41 met een variatie bij CVS t.o.v. controle groter dan 2,0: 34 waren ge-upreguleerd bij CVS en 7 waren ge-downreguleerd. […] Deze 41 proteïnen werden opgenomen in de IPA. Van elk geïdentificeerd proteïne werd het overéénkomstig gen in de IPA kennis-databank gezocht.

We gebruikten IPA om de gekende funkties van elk proteïne terug te vinden. Aangezien één proteïne meerder funkties kan hebben, selekteerden we de funkties met de hoogste statistische significantie. De eerste 3 hoogst-gerangschikte biologische funkties waren: metabolisme van isocitraat, metabolisme van NADH & metabolisme van nucleïnezuur-componenten of afgeleiden. […] Voor de validatie selekteerden we een proteïne uit elke categorie op basis van de hoeveelheid variatie en de P-waarde [indicatie voor de statistische significantie] van proteïnen uit de proteoom-analyse.

Expressie van biomerkers in speeksel

We selekteerden 3 mitochondriale proteïnen voor de validatie via WS – ACON, ATPB & MDHM. We beoordeelden eerst of hun variatie bij CVS t.o.v. controle bevestigd werd via de WS van de tweelingbroers. De upregulering bij CVS werd via WB bekrachtigd voor al de proteïnen. ACON, ATPB & MDHM vertoonden een toename van 3,1, 1,5 & 4,7. […]

Vervolgens gingen we over tot de analyse van deze proteïnen in een ruime groep CVS-patiënten (n = 45) en gezonde individuen (n = 45). We begonnen met een globale analyse van de expressie van deze proteïnen in het speeksel om dan verder te gaan met het onderzoek van verschillende CVS-subtypes. De veranderingen voor ACON & ATPB waren consistent met de resultaten van de nano-LC-MS, maar niet voor MDHM.

Dan klassificeerden we patiënten volgens hun klinische kenmerken (vragenlijsten): FACIT, FIQ, VAS-pijn, VAS-vermoeidheid & VAS-slaap. De CVS-patiënten werden in 2 groepen gesplitst met als referentie de tweeling-helft met CVS: een groep met de klinische kenmerken waarvan de waarden overéénkwamen met (of groter dan) die van de zieke tweeling-helft (groep A) en de tweede met de patiënten met lagere waarden (groep B). De intensiteiten waren hoger voor elk van de 3 merkers in groep A t.o.v. groep B.

ROC-curves

Er werden ROC-curves [grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] berekend ter beoordeling van het klinisch potentieel van onze geselekteerde en gevalideerde proteïnen om CVS te onderscheiden van gezonde individuen (in speeksel). De AUCs [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden] werden voor elk proteïne individueel berekend, om aan te tonen of elke merker apart dit onderscheid kan maken. ATPB & ACON bleken betere differentiërende biomerkers dan MDHM. ATPB: sensitiviteit 54% en specificiteit 78%; ACON: sensitiviteit 61% en specificiteit = 78%. Daarenboven onderzochten we via logistische regressie analyse of het onderscheidend vermogen van elke merker mogelijks verhoogd was door combinatie van meerdere merkers. Met deze doelstelling testten we alle verschillende combinaties om de beste combinatie van biomerkers te selekteren die bruikbaar is om mensen met CVS te onderscheiden van gezonde individuen. Zodoende vonden we dat het onderscheidend vermogen lichtjes steeg als ATPB werd gecombineerd met ACON. De sensitiviteit steeg tot 85% maar de specificiteit was 72%. Tenslotte berekenden we ook ROC-curves om te testen of de biomerkers patiënten en controles kunnen differentiëren volgens de klinische parameters – enkel FACIT gaf goeie resultaten. Wanneer we patiënten opsplitsen volgens FACIT, gaven ATPB en ACON ROC-curves (groep A versus controles) met een AUC van 0.780 en 0.722, respectievelijk, terwijl de gecombineerde ROC-curve een AUC had van 0.844 (sensitiviteit = 93%, specificiteit = 70%).

Klinische correlaties

Tenslotte bekeken we statistische correlaties voor de volgende klinische parameters: leeftijd, leeftijd bij aanvang, ziekte-duur en de hematochemische parameters (bv. TNF-α, IL-6, enz.). ACON correleerde negatief met IL-2 […]. ATPB correleerde positief met TNF-α & IFN-γ. […] MDHM correleerde ook met TNF-α […].

Bespreking

De ontdekking en validatie van meer objectieve merkers kunnen een belangrijke ondersteuning betekenen voor het stellen van de diagnose en behandeling van CVS. Aangezien bewijsmateriaal suggereert dat mitochondriale dysfunkties aan de grondslag liggen van CVS, analyseerden we mitochondriale proteïnen verkregen uit bloedplaatjes. Deze kwamen van een monozygoot tweeling-koppel met en zonder CVS. Nano-LC-MS markeerde de wijzigingen qua expressie van 41 proteïnen met een P < 0.05 en een vermenigvuldiging met meer dan 2. Voor de validatie selekteerden we hieruit 3 proteïnen van elk van de 3 meest significante ‘biologische funkties’ die met onze proteïnen geassocieerd bleken na IPA-analyse.

Deze 3 proteïnen waren: ACON (‘metabolisme van isocitraat’), MDHM (‘metabolisme van NADH’) en ATPB (‘metabolisme nucleïnezuur-componenten of afgeleiden’). De validatie van onze kandidaat proteïne-biomerkers werd beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die de detektie van proteïnen in speeksel-stalen toelaten.

Ondanks het feit dat deze studie slechts 2 individuen analyseerde, kunnen de verschillen qua proteïne-expressie gelinkt worden aan de ziekte, aangezien de tweeling slechts verschilde wat betreft de aanwezigheid van CVS. Op deze manier liet onze studie toe te focussen op enkele biomerkers die kunnen worden onderzocht bij een groter aantal patiënten om hun bruikbaarheid bij de diagnose van CVS te bevestigen. We beslisten speeksel van CVS-patiënten te onderzoeken (een niet-invasieve procedure). Hoewel speeksel een minder complex vocht is, werd bewezen dat het een beloftevol diagnostisch instrument is, dat de fysiologische werking van het lichaam weerspiegelt. Eerst was het aangewezen om te controleren of de significante toename van deze proteïnen bij CVS (t.o.v. de controle) kon worden geverifieerd in het speeksel van de tweeling-broers. We bevestigden de resultaten.

De analyse van de mechanismen markeerde het ‘metabolisme van NADH’ als één van de meest belangrijke biologische funkties betrokken bij CVS. De verhouding NAD+/NADH speelt een alomtegenwoordige rol bij het reguleren van de intracellulaire redox-status en vertegenwoordigt daardoor een funktie van de metabole toestand. Enkele studies suggereren dat NADH-concentraties significant lager liggen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid Redox Signal (2015) 22: 679-685 /// Castro-Marrero J et al. Effect of coenzyme-Q10 plus nicotinamide adenine dinucleotide supplementation on maximum heart rate after exercise testing in Chronic Fatigue Syndrome – a randomized, controlled, double-blind trial. Clin Nutr (2015) 35: 826-834] Het is waarschijnlijk dat de hoge waarden MDHM en isocitraat-dehydrogenase die worden gezien bij CVS een adaptieve verandering kunnen zijn voor deficiënties qua NADH dat, op z’n beurt, een cruciale rol speelt bij ATP-produktie in de mitochondrieën.

ATPB is de subunit-beta van ATP-synthase, het belangrijkste enzyme voor de aanmaak van ATP. Naast de toename van ATPB bij CVS, detekteerden we (d.m.v. nano-LC-MS) ook significante verhogingen van de subunit-alfa en -gamma (P = 0.005 & 0.001, respectievelijk). Moeheid en energie zijn nauw verbonden; daarom is een aantrekkelijke hypothese dat er een metabole dysfunktie is met als resultaat dat er niet genoeg energie wordt geproduceerd. In dit perspectief kan de toename worden verklaard als een poging om de ATP-produktie te verhogen. Er zijn inderdaad studies die suggereren dat daling qua mitochondriale ATP-synthese bij CVS-patiënten niet wordt veroorzaakt door een defekt in de enzyme-complexen die de oxidatieve fosforylatie katalyseren maar in een andere factor. [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93] Opdat ADP kan worden gerecycleerd en ATP naar het cytosol van de matrix kan gaan, is de uitwisseling van cytoplasmatisch ADP met mitochondriaal ATP via het binnenste membraan nodig. Deze funktie wordt voorzien door een translocator-proteïne. Consistent met ander werk is de expressie van mitochondriaal ADP/ATP-translocase [transporter-proteïnen die zorgen voor de uitwisseling van ADP in het cytosol en mitochondriaal ATP via het binnenste membraan] gewijzigd in onze studie: translocase-2 & -3 daalde [x 0,65 & x 0,80 t.o.v. controle] bij CVS (P = 0.009 & 0.002, respectievelijk).

Samen met ATPB lijkt ACON de meest beloftevolle biomerker. Dit is de mitochondriale vorm van aconitase, een enzyme dat de omzetting van citraat naar isocitraat katalyseert via cis-aconitaat in de TCA-cyclus. [inhibitie van dit enzyme vermindert de cellulaire energie-voorraad] ACON wordt courant gebruikt als een biomerker voor oxidatieve stress en werd gesuggereerd dienst te doen als een sensor voor de redox-status. Inderdaad: de reaktie tussen ACON en superoxide genereert vrije hydroxyl-radikalen. Het is waarschijnlijk dat de reaktie tussen superoxide en ACON de mitochondriale oxidatieve schade geassocieerd met de pathofysiologie van CVS kan versterken. De buitensporige produktie van ROS en stikstof-soorten wordt trouwens gewoonlijk in verband gebracht met CVS en we vonden een significante upregulering [x 2,2 t.o.v. controle] van superoxide-dismutase [SOD; enzyme dat zuurstof-radikalen ‘opruimt’] (P = 0.001).

Na de validatie in het speeksel van de tweeling, hebben we de validatie uitgebreid naar een grote groep CVS-patiënten. De resultaten voor ATPB & ACON bevestigen de upregulering bij CVS en hun klinisch potentieel om patiënten van controles te onderscheiden werd geëvalueerd. De ROC-curves gaven een goede specificiteit maar lage sensitiviteit aan. Als de biomerkers geombineerd werden, verkregen we een betere diagnose en de sensitiviteit verhoogde tot 85%, met een kleine daling qua specificiteit.

Anderzijds werd de gevonden MDHM-wijziging niet bevestigd in de grotere groep patiënten maar we konden een stijging zien wanneer we enkel de patiënten beschouwden met gelijkaardige of hogere klinische parameters dan de tweeling-helft met CVS. Deze bevinding bracht ons ertoe te bekijken of andere vermoedelijke biomerkers ook duidelijke CVS-subgroepen zouden kunnen afbakenen, gezien de grote variabiliteit van de klinische kenmerken van onze patiënten. Daarom hebben we onze analyse opgedreven door de klinische gegevens van dichterbij te bekijken, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers gelinkt zijn met de klinische kenmerken van de patiënten. We analyseerden de expressie van onze proteïnen na de patiënten te hebben opgesplitst volgens de klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger in de groep patiënten met klinische kenmerken die gelijkaardig waren met die van de zieke tweeling-helft. Het leek er op dat de toename qua expressie van deze proteïnen overéénkwam met een slechte patiënten-uitkomst.

Daarnaast gaf de combinatie van ATPB met ACON een sensitiviteit van 93% en specificiteit van 70% wanneer we de FACIT-waarden gebruikten van de patiënten die groter dan deze van de tweeling-helft met CVS.

Het valt op te merken dat CVS-patiënten met co-morbide bipolaire stoornis (en niet met andere psychiatrische co-morbiditeiten) een significante upregulering van de ATPB-expressie vertoonden (P = 0.03). In onze groep CVS-patiënten waren er slechts 8 met een co-morbide bipolaire aandoening; maar dit aspect verdient verder onderzoek gezien het feit dat een belemmerde mitochondriale funktie bij bipolaire patiënten werd besproken.

Tenslotte onderzochten we de correlatie van onze proteïnen met hematochemische parameters. Cytokine-abnormaliteiten zijn courant bij CVS maar de bevindingen zijn gemengd en er wordt geen individuele merker gebruikt als een objectieve biomerker voor de diagnose of het management van CVS. Het is opmerkenswaardig dat de toename van bij CVS positief correleerde met de stijging van IFN-γ & TNF-α. Immunologische ontregeling werd altijd voorgesteld als een significante component van CVS en CVS-patiënten hebben gewoonlijk hoge waarden pro-inflammatoire cytokinen, zoals IFN-γ & TNF-α. [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Klimas NG et al. Biomarkers for chronic fatigue. Brain Behav Immun (2012) 26: 1202-1210] Daarnaast was er een positieve correlatie van MDHM met TNF-α. Deze correlaties brengen ons iets bij, aangezien al deze variabelen als merkers kunnen worden beschouwd. Het is interessant aan te geven dat de ACON-waarden negatief correleerden met IL-2, in lijn met het feit dat de tweeling-helft met CVS lagere waarden van IL-2 had t.o.v. zijn gezonde tweeling-broer.

Besluit: deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de te overwegen criteria kunnen zijn bij het helpen stellen van de diagnose. Daarenboven: zelfs als deze proteïnen niet noodzakelijk bruikbaar blijken voor een universele CVS-diagnose (gezien de enorme heterogeniteit van de ziekte), bieden ze een sterk potentieel om subsets te karakteriseren. De identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kan helpen de complexe entiteit die CVS is, op te helderen. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van op maat gemaakte behandelingen. Op die manier zou dit werk kunnen bijdragen aan de gestage ontwikkeling van een duidelijker kader voor een ingewikkelde en genuanceerde ziekte zoals CVS.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.