M.E.(cvs)-wetenschap

september 8, 2018

Expressie van zeer lange niet-coderende RNAs bij M.E.(cvs)

Er wordt op allerlei vlakken verder gezocht naar molekulaire merkers voor M.E.(cvs)…

De ontdekking van duizenden lange niet-coderende (lnc) RNAs – eenvoudig uitgedrukt: ze worden niet vertaald naar proteïnen – in het menselijk genoom, zet researchers aan om hun mogelijke rol te onderzoeken. Er is al gebleken dat veel lncRNAs betrokken zijn bij belangrijke biologische processen: ‘dosage-compensation’ (proces waarbij organismen de expressie van genen tussen de geslachten gelijkstelt; de geslacht-chromosomen bevatten nl. een verschillend aantal genen), genomische ‘imprinting’ (epigenetische veranderingen worden ‘vastgelegd’ in de spermatozoïden of oöcyten van de ouders en dan doorgegeven via cel-deling aan de biologische cellen van het organisme), chromatine-regulering, alternatieve ‘splicing’ van pre-mRNA (proces waarbij tijdens het verwerken van RNA – na de transcriptie van DNA – niet-coderende stukken – intronen – uit het pre-mRNA worden geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt) en cel-kern organisatie (verdeling van chromatine in de cel-nucleus). Er zijn studies die rapporteerden dat lncRNAs ontregeld zijn bij een aantal ziekten (kankers en neurologische aandoeningen). Dikwijls kunnen de lncRNAs niet als oorzaak aangeduid maar er worden wel mogelijke rollen gesuggereerd die dieper onderzoek rechtvaardigen.

Onderstaand artikel verkent de mogelijkheid van de betrokkenheid van lncRNAs bij M.E.(cvs). Ze worden (omwille van hun belangrijke werking bij transcriptie, translatie en epigenetica) beschouwd als potentiële merkers voor neurologische ziekte. Er werden hier bij M.E.(cvs)-patiënten significant verhoogde waarden gevonden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS en bovendien waren er 2 gecorreleerd met de ernst van de ziekte.

Dit piloot-onderzoek werd uitgevoerd door Taiwanese onderzoekers die al eerder onderzoek verrichten op het gebied van lncRNAs in samenwerking met de Berlijnse immunologe (en één van de directeuren van EUROMENE – het Europees Netwerk voor M.E./CVS) Prof. Dr Carmen Scheibenbogen, die vooral geïnteresseerd is in een mogelijke auto-immune etiologie voor M.E.(cvs).

————————-

Journal of Translational Medicine Vol 16, #1, p 231 (augustus 2018)

The expression signature of very long non-coding RNA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Chin-An Yang (1,2,3,4), Sandra Bauer (5), Yu-Chen Ho (3), Franziska Sotzny (5), Jan-Gowth Chang (1,3,4), Carmen Scheibenbogen (5)

1 Department of Laboratory Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

2 Division of General Pediatrics, Children’s Hospital of China Medical University, Taichung, Taiwan

3 College of Medicine, China Medical University, Taichung, Taiwan

4 Centre for Precision Medicine, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

5 Institute for Medical Immunology, Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische invaliderende ziekte met een enorme socio-economische impact. Er werd gesuggereerd dat immune ontregeling, nitro-oxidatieve stress en metabole stoornissen kunnen bijdragen tot de pathogenese. De etiologie van M.E./CVS blijft echter grotendeels onduidelijk en diagnostische/prognostische ziekte-merkers ontbreken. Er werd gerapporteerd dat meerdere lange niet-coderende RNAs (lncRNA, > 200 bp) rollen spelen bij immunologische ziekten of bij stress-responsen.

Methodes In onze studie onderzochten we de expressie-signatuur van 10 zeer lange lncRNAs (> 5 kb, CR933609, His-RNA, AK124742, GNAS1-AS, EmX2OS, MIAT, TUG1, NEAT1, MALAT1, NTT) in perifeer bloed mononucleaire cellen van 44 M.E./CVS-patiënten.

Resultaten Waarden van de lncRNAs NTT, MIAT & EmX2OS bleken significant verhoogd bij M.E./CVS-patiënten i.v.m. gezonde controles. Bovendien stegen de waarden van NTT & EmX2OS met de ernst van de ziekte. Stimulatie van de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 met H2O2 (oxidatieve stress) en poly (I:C) (dubbel-strengig RNA, representatief voor virale aktivatie) verhoogden de expressie-waarden van NTT & MIAT.

Besluiten Onze studie onthulde een met M.E./CVS geassocieerde expressie-signatuur van zeer lange lncRNA, die de regulerende respons op oxidatieve stress, chronische virale infektie en hypoxemie [tekort aan zuurstof in het bloed] bij M.E./CVS-patiënten zou kunnen weerspiegelen. Er dient verder onderzoek te gebeuren om de funkties en potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs bij M.E./CVS bloot te leggen.

Achtergrond

[…]. De pathogenese van M.E./CVS is ingewikkeld en blijft tot op heden grotendeels moeilijk te begrijpen. Er is bewijs dat bij een subset van patiënten infekties resulteren in chronische immuun-aktivatie en auto-immuniteit. Er werden auto-antilichamen tegen neurotransmitters gevonden in een subgroep of M.E./CVS-patiënten. [Loebel M et al. (Fluge O, Mella O, Scheibenbogen C) Antibodies to beta adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain Behav Immun. (2016) 52: 32-9] Daarnaast faciliteren verhoogde cytokinen en oxidatieve/nitrosatieve stress mogelijks de ontwrichting van de blood-hersen-barrière, neuro-inflammatie, en gliale aktivatie en hypersensitiviteit, welke verder de ontregeling van neurotransmitters en versterking van inflammatoire signalen triggert. Er werd ook gerapporteerd dat mitochondriale dysfunktie en metabole stoornissen aan de basis liggen van de mogelijke mechanismen voor M.E./CVS. [Naviaux RK et al. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: E5472-80 /// Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci Rep. (2016) 6: 34990] Ondanks dit bewijsmateriaal, ontbreken er nog steeds diagnostische merkers en de diagnose wordt gewoonlijk gesteld op basis van klinische criteria.

Lange niet-coderende RNAs worden gedefinieerd als RNAs van meer dan 200 nucleotiden, die niet coderen voor proteïnen. Via RNA-DNA, RNA-RNA of RNA-proteïne interakties, kunnen lncRNA verschillende stadia van de gen-regulering beïnvloeden. LncRNAs zijn belangrijke regulatoren van de chromatine [complex van DNA en eiwitten in de celkern] -toestand, die een groot vermogen hebben om te interageren met meer dan één proteïne in verschillende contexten en de cellulaire respons af te stellen. Er werd gerapporteerd dat lncRNAs essentiële rollen spelen bij complexe ziekten, zoals kanker en auto-immune ziekten. Hoewel er meer en meer lncRNAs ontdekt worden, zijn de meeste van hun funkties en werking-mechanismen nog onbekend, bijzonderlijk voor de zeer lange lncRNAs met afmetingen van meer dan 5.000 nucleotiden. We hadden bijzondere interesse in 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb), waarvan ofwel betrokkenheid bij immuun-regulering werd gerapporteerd ofwel dat ze gelokaliseerd zijn in de buurt van genen die de stress-respons, metabole en neurologische processen reguleren, en dus mogelijks een rol spelen bij M.E./CVS.

De 10 lncRNAs zijn: NTT (17 kb), NEAT1 (23 kb), MALAT1 (7,5 kb), TUG1 (7,1 kb), MIAT (9,9 kb), His-1 RNA (8,4 kb), GNAS1-AS (8,9 kb), EMX2OS (7,3 kb), CR933609 (8,8 kb) & AK124742 (6 kb). NTT werd voor het eerst beschreven in geaktiveerde T-cellen, terwijl werd gerapporteerd dat NEAT1 betrokken was bij lupus en bij de immuun-respons op virale infekties. MALAT1 bleek de door LPS geïnduceerde inflammatoire respons te reguleren en TUG1 is betrokken bij de regulering van door koude geïnduceerde oxidatieve stress en inflammatie. Wat betreft MIAT: het is geweten dat dit tussenkomt bij een waaier aan ziekte-processen, inclusief myocard-infarct, microvasculaire dysfunktie, schizofrenie, enz. His-1 RNA bleek geïmpliceerd in leukemogenese [inductie en ontwikkeling van leukemie] en GNAS1-AS is een anti-sense transcript [‘anti-sense’ sequenties zijn er die het mRNA inaktiveren] op de locus van GNAS1, coderend voor neuro-endocrien secretorisch proteïne. Volgens de lncrnadb database is EMX2OS een tegengestelde streng transcript van het EMX2 gen dat mogelijks EMX2 reguleert. Zowel EMX2OS als EMX2 RNAs werden gedetekteerd in weefsels van het centraal zenuwstelsel (CZS). Omtrent CR933609: we hebben eerder z’n rol bij de bescherming van INO80D tegen downregulering door miRNA-5096 geïdentificeerd. Aangezien INO80D een belangrijke component is van het chromatine-hermodelerend INO80 complex dat glycolytische en respiratoire capaciteiten van de cel reguleert, kan CR933609 betrokken zijn bij het behouden van de metabole stabiliteit. Ten slotte: er werd gerapporteerd dat AK124742 een anti-sense RNA is voor het gen PSMD6, dat codeert voor componenten van het proteasoom [groot eiwit-complex dat afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreekt] waarbij antigen-presentatie door MHC klasse-I en herstel van DNA-schade betrokken zijn.

In deze studie was ons doel het onderzoeken van de expressie-signaturen en potentiële diagnostische waarden van de 10 zeer grote lncRNAs (> 5 kb) bij M.E./CVS-patiënten. En verder werden de effekten van oxidatieve stress (H2O2) en ‘Toll like’ receptor 3 (TLR3 [‘Toll-like’ receptoren zijn op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren die molekulaire patronen (van indringers) herkennen]) ligand poly (I:C) (dat virale infektie nabootst) op de waarden van zeer grote lncRNAs geëvalueerd in menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma [tumor-type ontstaand in gliale cellen] cel-lijn KALS1.

Methodes

Individuen

Er werden 44 M.E./CVS-patiënten met de diagnose gesteld volgens de Canadese criteria en 30 voor geslacht en leeftijd gematchte gezonde controles gerecruteerd. [64% vrouwen bij M.E./CVS (60% bij controles); 25/44 met Bell-score < 30 (ernstig)]. […]

RNA-extractie en RT-PCR voor lncRNAs

RNAs werden geïsoleerd uit PBMCs [perifeer bloed mononuclaire cellen] […] Omgekeerde transcriptie naar cDNA voor ‘real-time’ PCR [RT-PCR; monitort de amplificatie van een doelwit DNA/RNA tijdens de PCR, in ‘real-time’, en niet op het einde (zoals bij conventionele PCR)]. GAPDH-expressie was de endogene controle. […]

[CT, ‘cycle-treshold’, staat voor het aantal PCR-cycli waarbij de geamplificeerde sequentie boven de ‘background’ komt: op dat punt wordt een detekteerbare hoeveelheid van het te amplificeren stuk DNA/RNA gegenereerd. De CT is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke expressie van het gen: hoe meer er van aanwezig, hoe minder PCR-cycli nodig om het detekteerbaar te maken. ΔCT = CT(een doelwit-gen) minus CT(een referentie-gen)]

Cel-lijn studies

[…]

Bio-informatica en statistische analyse

[…]

Resultaten

PBMC lncRNA-profiel bij patiënten met chronische vermoeidheid en controles

De expressie van de 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles werden geëvalueerd d.m.v. RT-PCR. De waarden van de 10 ΔCT (CTlncRNA – CTGAPDH) van elke individu werden gebruikt om een correlatie-matrix [matrix met als elementen de paar-gewijze co-varianties] op te bouwen en ‘principle component analysis’ (PCA). [hoofd-componenten-analyse; objectieve techniek om het aantal variabelen op een zinvolle manier te reduceren; een wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten).] De PCA toonde dat het M.E./CVS en controle lncRNA expressie-profiel konden hoofdzakelijk worden gescheiden door component 2. […]

Associatie van lncRNA expressie-waarden met M.E./CVS en ziekte-ernst

Om de test-aantallen van lncRNAs nodig voor het differentiëren van M.E./CVS en gezonde controles te reduceren en het verband tussen lncRNA expressie-waarden en M.E./CVS ziekte-ernst te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid van elk lncRNA in PBMCs van controles, mild-matige M.E./CVS (Bell-score ≥ 30) en ernstige M.E./CVS (Bell-score < 30). Interessant was dat de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS significant hoger bleken in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles. M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: NTT 8,86 vs. 10,05 (p < 0.0001), MIAT 6,22 vs. 6,89 (p < 0.05), EMX2OS 20,69 vs. 18,59 (p < 0.001). Verder: NTT & EMX2OS expressie-waarden correleerden met M.E./CVS ziekte-ernst, waarbij de grootste hoeveelheid werd gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten met een Bell-score van 10 of 20 (< 30).

PBMC NTT, MIAT en EMX2OS expressie-signatuur als M.E./CVS diagnostische merkers

Aangezien we hebben ontdekt dat bij de 10 geteste lncRNAs, slechts de waarden van NTT, MIAT & EMX2OS geupreguleerd waren bij M.E./CVS, zetten we een nieuw PCA-grafiek uit gebruikmakend van een correlatie-matrix met NTT, MIAT & EMX2OS ΔCT-waarden. De M.E./CVS-patiënten konden van de gezonde controles worden gescheiden op basis van component 1. De M.E./CVS groep kon nog steeds van de controle-groep worden gescheiden wanneer de gebruikte lncRNA-waarden werden verminderd tot die van NTT & MIAT of die van NTT & EMX2OS. De M.E./CVS- en controle-groep konden echter niet goed van elkaar gedifferentieerd worden op basis van MIAT & EMX2OS.

Om de diagnostische waarde van het combineren van de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te evalueren, berekenden we eerst de optimale ‘cut-off’ ΔCT-waarde van elk van die 3 lncRNAs d.m.v. ROC-curves [ROC (receiver operating characteristic’) -analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument; de ROC-curve is een grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit /// area under the curve’ (AUC) of oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden: een AUC = 1 betekent een perfeke test; AUC = 0.90-1 is excellent (hoge sensitiviteit en hoge specificiteit), 0.80-0.90 is goed]. Deze waren: 9,49 (AUC = 0.82); 6,82 (AUC = 0.65); 19,06 (AUC = 0.77), voor NTT, MIAT & EMX2OS respectievelijk. Er werd dan een bijkomende ROC-analyse uitgevoerd en die onthulde dat de criteria van verhoogde expressie (ΔCT onder de optimale ‘cut-off’) van eender welke 2 van deze 3 lncRNAs bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS een gevoeligheid van 67,4 en een specificiteit van 86,7 had, AUC = 0.82 […].

Expressie-waarden van genen die mogelijks gereguleerd worden door de lncRNAs bij M.E./CVS

Om mogelijke werking-mechanismen van de lncRNAs NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS op te helderen, analyseerden we het expressie-profiel van hun potentiële ‘downstream’ genen bij patiënten en controles. Er werd gesuggereerd dat NTT werkt op nabijgelegen genen, inclusief IFNGR1 [coderend voor interferon-gamma receptor 1] & PBOV1 [‘Prostate And Breast Cancer Overexpressed 1’; coderend voor een proteïne dat geupreguleerd is bij sommmige types kanker]. Er werd gerapporteerd dat ZEB1 ‘downstream’ van MIAT ligt; en er werd voorgesteld dat EMX2 gereguleerd wordt door EMX2OS. Terwijl EMX2 niet kon worden gedetekteerd in PBMCs (gegevens niet getoond), bleek ZEB1 matig maar significant verhoogd in M.E./CVS PBMCs t.o.v. controles (M.E./CVS mediane ΔCT vs. controle mediane ΔCT: 7,60 vs. 7,82, p < 0.05). De expressie-waarden van IFNGR1 & PBOV1 bleken niet significant verschillend tussen M.E./CVS en controles. Wat betreft de correlatie tussen de expressies van lncRNAs en ‘downstream’ genen: er werd een positieve relatie tussen ZEB1- en MIAT-waarde gedetekteerd d.m.v. lineaire regressie analyse bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. Ook bleek de IFNGR1-waarde positief gecorreleerd met de NTT-waarde bij M.E./CVS (p < 0.0001) maar niet bij controles. De lineaire regressie analyse tussen NTT en PBOV1 toonde geen statistische significantie, noch voor M.E./CVS en controles.

Upregulering van NTT & MIAT door H2O2 en poly (I:C) in menselijke monocytische en glioma cel-lijnen

Het is geweten dat oxidatieve stress en terugkerende herpesvirus-infektie bijdragen tot de M.E./CVS-pathologie. [Sotzny F et al. (Scheibenbogen C). Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – evidence for an autoimmune disease. Autoimmun Rev. (2018) 17: 601-9] Om de mogelijke effekten van deze stressoren op de expressie van NTT, MIAT & EMX2OS te onderzoeken, gebruikten we de menselijke monocytische cel-lijn THP-1 en glioma cel-lijn KALS1 als modellen, en behandelden deze met H2O2 (oxidatieve stress) of poly (I:C) (TLR3-agonist, die een herpesvirus-infektie nabootst) gedurende 6h. Terwijl NTT & MIAT geupreguleerd bleken na de stimulaties, kon EMX2OS niet worden gedetekteerd in beide cel-lijnen. In THP-1 cellen verhoogde de NTT expressie-waarde tot gemiddeld 1,47 en 3,06 maal na stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Verder steeg de MIAT-waarde tot gemiddeld 1,26 en 3,38 maal na THP-1 stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. Er werden ook hogere expressie-waarden voor het potentieel NTT ‘downstream’ gen PBOV1 en het potentieel NTT ‘downstream’ gen ZEB1 gedetekteerd in THP-1 na stimulaties met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk; de waarde van IFNGR1 (een ander potentieel NTT ‘downstream’ gen) vertoonde echter geen evidente verandering na beide stimulaties. In KALS1-cellen, was NTT geupreguleerd tot gemiddeld 1,49 maal bij 100 μM H2O2 en tot gemiddeld 1,65 maal bij 50 μM poly (I:C). Wat betreft MIAT-expressie: in KALS1 werd een stijging van 1,26 maal en 1,31 maal gezien na 6h stimulatie met 10 nM H2O2 en 100 μM poly (I:C), respectievelijk. De expressie-waarden van de potentiële NTT en MIAT ‘downstream’ genen na stimulatie met H2O2 en poly (I:C) in KALS1 vertoonden een gelijkaardig patroon als bij THP-1.

Bespreking

Er werden rollen van zeer grote (> 5 kb) lncRNAs bij immuun-regulering en ziekte-processen ondekt. Hier rapporteren we over de expressie-signatuur van 10 lncRNAs (NTT, NEAT1, MALAT1, TUG1, MIAT, His-1 RNA, GNAS1-AS, EMX2OS, CR933609 & AK124742) in PBMCs afkomstig van M.E./CVS-patiënten. We hebben dit screening-panel geselekteerd op basis van hun mogelijke regulering van immune, stress-, metabole en neurologische responsen, waarvan werd gehypothiseerd dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van M.E./CVS. Niettemin is het opmerkelijk om op een PCA-grafiek te zien dat M.E./CVS kon worden gedifferentieerd van gezonde controles via dit lncRNA-profiel. Van de 10 lncRNAs verklaarden NTT, MIAT & EMX2OS expressie-waarden de meeste variantie tussen M.E./CVS en controles. Een verdere ondersteuning voor hun potentiële rol in het ziekte-pathomechanisme is dat hogere NTT- en EMX2OS-waarden geassocieerd bleken met ernstiger M.E./CVS (Bell-score < 30). Op basis van het feit dat de expressie van een combinatie van 2 van deze 3 lncRNAs (NTT, MIAT & EMX2OS) bij het onderscheiden van M.E./CVS en gezonden een AUC van 0.82 gaf, suggereren we een potentiële diagnostische waarde van deze lncRNAs voor M.E./CVS.

Consistent met de hypothese dat de ziekte-pathologie van M.E./CVS kan worden bepaald door oxidatieve stress en virale infekties, vonden we dat de waarden van NTT en MIAT in THP-1 en KALS1 cel-lijnen verhoogd waren na stimatie met H2O2 of poly (I:C), een expressie-patroon dat gelijkaardig is met deze gevonden in PBMCs van M.E./CVS-patiënten. We weten echter nog niet of het hier gevonden lncRNA-profiel specifiek is voor M.E./CVS of bij andere ziekten (gepaard met immuun-ontregeling of oxidatieve stress; zoals auto-immune ziekten en kanker) kan worden gevonden. Er werd gerapporteerd dat MIAT-waarden geupreguleerd kunnen zijn onder hoog-glucose omstandigheden en bij long-kanker, en NTT-expressies kunnen worden gevonden bij processen waarbij T-cel aktivatie is betrokken. Het verder vergelijken van de PBMC expressie-signatuur van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS met patiënten die lijden onder chronische vermoeidheid te wijten aan auto-immune ziekten of kanker is belangrijk om de lncRNA test-specificiteit te bepalen bij het stellen van de diagnose van M.E./CVS.

De mechanismen van NTT, MIAT & EMX2OS bij M.E./CVS-pathogenese vereisen verder onderzoek. In onze studie detekteerden we een verband van een hogere waarde van ZEB1, een gen dat wordt gereguleerd door MIAT, met M.E./CVS. THP-1 en KALS1 cel-lijnen vertoonden consistent hogere expressie-waarden van MIAT en ZEB1 na stimulatie met poly (I:C), een synthetisch analoog van dubbel-strengig RNA dat representatief is voor een aktieve virale infektie, een mogelijke trigger van M.E./CVS. Er werd gerapporteerd dat ‘Zinc-finger E-box-binding’ proteïne (ZEB) 1, een transcriptie-factor die repressor-complex [proteïne-complex dat transcriptie verhindert of downreguleert] recruteert, IL-2 aktivatie in T-cellen onderdrukt. Upregulering van ZEB1 zou geassocieerd kunnen zijn met de respons op chronische inflammatie bij M.E./CVS. In ‘non-small-cell’ long-kanker cel-lijn resulteerde de ‘knockdown’ [experimentele reductie van de expressie van een gen] van MIAT in verminderde ZEB1-expressie, wat wijst op cis-werking [regulering van expressie van nabijgelegen genen op dezelfde DNA-streng] van MIAT op het reguleren van ZEB1. Interessant is dat MIAT ook betrokken is bij endotheliale dysfunktie, wat frequent wordt gezien bij M.E./CVS. [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-6] Wat betreft NTT: er werd voorgesteld dat het z’n funktie uitoefent op nabijgelegen genen omwille van z’n grootte (17 kb). Meerdere genen betrokken bij cel-proliferatie, apoptose of inflammatie (inclusief IFNGR1, PBOV1, TNFAIP3, HIVEP2, BCLAF1 & MYB) zijn gelegen dicht bij de chromosoom-positie van NTT. We vonden geen significant verschil qua IFNGR1- en PBOV1-expressie tussen M.E./CVS en controles. Er werd echter een uitgesproken positieve correlatie tussen NTT- en IFNGR1-waarden gezien bij M.E./CVS, niet bij controles. Deze observatie suggereert dat de NTT/IFNGR1-as een subtiele rol kan spelen in de M.E./CVS-pathogenese. Er zijn meer experimenten nog om te weten of andere ‘downstream’ genen beïnvloed worden door de upregulering van NTT bij M.E./CVS en mogelijks belangrijker rollen spelen in de ziekte-pathobiologie. Ten slotte: volgens de lncrnadb, de lncRNA database, is het expressie-niveau van EMX2OS onder normale fysiologische omstandigheden hoger in het brein, gemiddeld in lymfeknopen en zeer laag in leukocyten. Consistent hiermee konden we EMX2OS niet detekteren in PBMCs van verscheidene individuen. De meeste M.E./CVS-patiënten bleken echter verhoogd EMX2OS te hebben in hun PBMCs. De rol van EMX2OS in PBMCs is nog onduidelijk en het potentieel ‘downstream’ gen EMX2 dat gewoonlijk to expressie komt in het CZS kon niet bij alle studie-individuen worden gedetekteerd. Er loopt een EMX2OS over-expressie experiment in THP-1 in ons lab, om deze vraag te beantwoorden. Interessant is dat er EMX2-upregulering werd gevonden bij hersen-hypoxemie. M.E./CVS-patiënten hebben sterke dalingen qua cerebrale bloeddoorstroming, wat kan resulteren in hypoxemie. [Biswal B, Kunwar P, Natelson BH. Cerebral blood flow is reduced in Chronic Fatigue Syndrome as assessed by arterial spin labeling. J Neurol Sci. (2011) 301: 9-11]

Naast onze studie over het gebruiken van een lncRNA-signatuur als diagnostische merker voor M.E./CVS, werd gesuggereerd dat mRNA-expressie profielen in het bloed en plasma-metabolieten diagnostische waarde hebben voor M.E./CVS. Zoals beschreven door Kerr et al. [Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84] waren er 88 genen met differentiële expressie vereist om M.E./CVS diagnostische en prognostisch te groeperen. Bovendien stelden Naviaux et al. [zie ref. hierboven] een set van 8 metabolieten voor om de diagnose van M.E./CVS te stellen bij mannen en een set van 13 metabolieten bij vrouwen. Onze resultaten tonen dat een lncRNA-expressie panel bestaande uit slechts 3 zeer grote lncRNAs (NTT, MIAT, EMX2OS) kunnen leiden tot een goede diagnostische waarde en informatie kunnen bieden over de M.E./CVS ziekte-ernst (NTT, MIAT).

Besluit

Hoewel de pathogene mechanismen van zeer grote lncRNAs bij M.E./CVS nog dient te worden opgehelderd, vonden het eerste bewijs dat een lncRNA expressie-signatuur diagnostische waarde kan hebben bij M.E./CVS.

Advertenties

augustus 12, 2018

Identificatie van M.E.(cvs) DNA-methylatie patronen

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:47 am
Tags: , , , , ,

Methylatie van genen – het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide van DNA) – verandert hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA). DNA-methylatie komt dus voornamelijk voor op de cytosinen van CpG dinucleotide ‘sites’.

CpG-eilanden zijn gebieden/ DNA-fragmenten waar veel CpG-‘sites’ voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 baseparen (bp) met een GC (cytosine-guanosine dinucleotiden) -percentage > 50%. Meestal liggen die ‘upstream’ (vóór) van genen. Ze komen voor in ongeveer de helft van gen-promoters, zijn resistent voor methylatie en veelal geassocieerd met genen die frequent ‘aan’ staan.

Een promoter is een nucleotide-sequentie vóór een gen dat dient als startplaats, aanknopingspunt voor DNA-transcriptie; waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie – vrij vertaald ‘overschrijving’ naar RNA – te starten.

————————-

PLoS One Vol 13, #7, p e0201066 (juli 2018)

Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns

Malav S. Trivedi (1), Elisa Oltra (2), Leonor Sarria (3), Natasha Rose (1), Vladimir Beljanski (4), Mary Ann Fletcher (3,5), Nancy G. Klimas (3,5), Lubov Nathanson (3)

1 College of Pharmacy, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

2 School of Medicine and Dentistry, Catholic University of Valencia, Valencia, Spain

3 Institute for Neuro Immune Medicine, Dr. Kiran C. Patel College of Osteopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

4 Cell Therapy Institute, Dr. Kiran C. Patel College of Allopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, United States of America

5 Miami VAMC, Miami, Florida, United States of America

Samenvatting

Achtergrond Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe aandoening waarbij meerdere orgaan-systemen betrokken zijn en die wordt gekenmerkt door aanhoudende uitputtende vermoeidheid, immuun-dysfunktie, neurologische problemen en andere symptomen, gedurende minstens 6 maanden. Verstoring van DNA-methylatie patronen werd reeds gelinkt met verscheidene immuun- en neurologische ziekten; de status van M.E./CVS blijft echter onzeker. Onze studie probeerde wijzigingen van de DNA-methylatie patronen te identificeren die verband houden met M.E./CVS.

Methodes We haalden genomisch DNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen van 13 M.E./CVS studie-deelnemers en 12 gezonde controles, en bekeken de globale DNA-methylatie d.m.v. een op ELISA lijkende methode en de plaats-specifieke methylatie-status d.m.v. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays [‘genen-chips’]. Een validatie d.m.v. pyro-sequentie-bepaling omvatte 33 M.E./CVS-patiënten en 31 controles van 2 geografisch uitéénliggende lokaties.

Resultaten De globale DNA-methylatie waarden van M.E./CVS-individuen waren gelijkaardig met die van controles. De micro-array benadering liet echter toe de detektie toe van 17.296 differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen op 6.368 genen (regulerende elementen en binnen coderende gebieden van genen). Analyse van de DNA-methylatie in promoter-gebieden onthulde 307 differentieel gemethyleerde promoters. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ gaf aan dat genen die geassocieerd zijn met differentieel gemethyleerde promoters voorkwamen in ten minste 15 verschillende mechanismen, meestal gerelateerd met cel-signalisering en met een sterke immune component.

Besluiten Dit is de eerste studie die genoom-brede epigenetische veranderingen heeft onderzocht die geassocieerd zijn met M.E./CVS, gebruikmakend van de geavanceerde ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die ca. 850.000 CpG-sites beslaan en dit in 2 geografisch verwijderde of M.E./CVS-groepen en gematchte controles. Onze resultaten komen overéén met eerdere studies die een ontregeling van het immuunsysteem aangaven bij M.E./CVS. Ze suggereren ook een mogelijke rol van epigenetische ontregeling bij de pathobiologie van M.E./CVS. We stellen screening van grotere M.E./CVS-groepen voor om de externe validiteit van deze epigenetische wijzigingen te bepalen, om ze ev. te implementeren als potentiële diagnostische merkers in een klinische setting.

Inleiding

[…]

Een beter begrip van de molekulaire mechanismen van M.E./CVS en de dysfunktie binnen regulerende systemen zal zich vertalen in geschikte diagnostische methodes en management-strategieën, en meer gerichte behandel-benaderingen bieden.

Verstoring van epigenetische mechanismen is gelinkt met verscheidene immuun-, neurologische en endocriene ziekten. Bovendien werd gevonden dat DNA-methylatie patronen gewijzigd waren bij meerdere ziekten waarvan dikwijls wordt gemeld dat ze co-morbide met M.E./CVS zijn, zoals fibromyalgie (FM) en prikkelbare darm syndroom (IBS) [Ciampi de Andrade D et al. Epigenetics insights into chronic pain: DNA hypomethylation in fibromyalgia-a controlled pilot-study. Pain (2017) 158: 1473-80 /// Mahurkar S et al. Genome-wide DNA methylation profiling of peripheral blood mononuclear cells in irritable bowel syndrome. Neurogastroenterol Motil. (2016) 28: 410-22]. Met betrekking tot M.E./CVS, hebben we weet van slechts enkele studies, waar verschillen in DNA-methylatie patronen werden onderzocht tussen individuen met M.E./CVS en controles [de Vega WC et al. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS one (2014) 9: e104757 /// de Vega WC et al. Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Medical Genomics (2017) 10: 11 /// Brenu EW et al. Methylation Profile of CD4+ T Cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228]. Deze studies maakten gebruik van ‘Illumina Human Methylation450 BeadChip’ micro-arrays, die de analyse van meer dan 450.000 methylatie-sites per staal (‘single-nucleotide’ resolutie) toelaten. Twee andere bijkomende studies beperkten de analyse tot specifieke gen-promoter-gebieden d.m.v. een plaats-specifieke benadering voor het meten van DNA-methylatie bij M.E./CVS [Vangeel E et al. Chronic Fatigue Syndrome and DNA Hypomethylation of the Glucocorticoid Receptor Gene Promoter 1F Region: Associations With HPA Axis Hypofunction and Childhood Trauma. Psychosomatic medicine (2015) 77: 853-62 /// Falkenberg VR et al. Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome. Genet Epigent. (2013) 5: 1-9]. De ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays laten toe DNA-methylatie veranderingen te analyseren op meer dan 850.000 CpG-‘sites’. Deze grotere omvang zou het blootleggen van bijkomende wijzigingen qua transcriptie-regulering bij M.E./CVS-patiënten moeten faciliteren. Door validatie van DNA-methylatie patronen geassocieerd met M.E./CVS bij 64 deelnemers van 2 geografisch uitéénliggende plaatsen d.m.v. pyro-sequentie-bepaling [‘pyro-sequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling], konden we bovendien consensus CpG hypo-gemethyleerde plaatsen identificeren die kunnen worden gebruikt bij toekomstige screenings aangaande verbanden van deze epigenetische wijzigingen bij M.E./CVS. Het was dan ook de intentie van deze om de eerdere analyse van genomische DNA-methylatie veranderingen bij M.E./CVS te valideren en uit te bouwen, en dergelijke bevindingen uit te breiden door gebruik te maken van meer CpG-sites. Toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-patiënten zijn gerechtvaardigd om betrouwbare epigenetische merkers voor M.E./CVS te vinden.

Materialen & methodes

Staal-afname &-verwerking

Recrutering. 2 lokaties: Miami/Fort Lauderdale (Florida) en Valencia, Spanje […]. Alle individuen hadden een vergelijkbare leeftijd en BMI. […] enkel vrouwelijke deelnemers […]. We gebruikten de Fukuda en Canadese definities. […]

All M.E./CVS-individuen zaten voor de ‘Medical Outcomes Study 36-item short-form survey’ (SF-36) samengevatte lichamelijke score onder het 50e percentiel […]. Alle individuen waren tussen 30 & 60 jaar oud.

Exclusie-criteria: […]

[…]

Isolatie van PBMCs & DNA-extracties. […]

Genomische DNA-methylatie profilering

Globale epigenetische metingen: ‘MethylFlash Methylated DNA 5-mC Quantification Kit’ (EpiGentek) & ‘MethylFlash Methylated DNA 5-hmC Quantification Kit’ (EpiGentek). […]

Beoordeling DNA-methylatie over het ganse genoom […] Bisulfiet-conversie van genomisch DNA [ongemethyleerd cytosine wordt omgezet naar uracil in DNA, gemethyleerd cytosine niet; via direct sequentie-bepaling kan dan de plaats van ongemethyleerde cytosinen en 5-methylcytosinen worden bepaald] d.m.v. de ‘EZ DNA Methylation Kit’ (Zymo Research) […] hybridisatie van het DNA op ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays.

Analyse van de genomische DNA-methylatie gegevens

[…]

De analyse van differentiële methylatie werd uitgevoerd gebruikmakend van 2 strategieën: op basis van genomisch gebied en op basis van de plaats. Terwijl de op genoom-gebied gebaseerde benadering kijkt naar het gemiddeld methylatie-niveau van het genoom-gebied (CpG-eilanden, promoters, genen en ‘tiling-regions’ [overlappende gebieden]) en dan de methylatie-toestand van de gebieden voor de stalen vergelijkt, worden bij de op plaats (‘site’) gebaseerde benadering de CpG-loci één per één geanalyseerd. Om gebieden of loci [meervoud van locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt] te detekteren die differentieel gemethyleerd zijn bij M.E./CVS t.o.v. controles, gebruikten we [gespecialiseerde] software voor de analyse van DNA-methylatie gegevens. CpG-plaatsen werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende selektie-criteria: het verschil qua absolute beta-waarde [onderscheidend vermogen] tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05, en de ‘false discovery-rate’ (FDR [aantal vals positieve resultaten]) ≤ 0.05 […] voor micro-array analyse en p ≤ 0.05 […] voor pyro-sequentie-bepaling. Promoter-gebieden (1.500 bp ‘upstream’ van de transcriptie-start-plaats (TSS) en 500 bp ‘downstream’ van de TSS) werden als differentieel gemethyleerd beschouwd als ze voldeden aan de volgende criteria: FDR ≤ 0.1 […] en het verschil qua absolute beta-waarde tussen de gemiddelde waarden van patiënten en controles > 0.05. […]

[…]

Validatie van differentieel gemethyleerde promoters via pyro-sequentie-bepaling

De gegevens verkregen uit de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays werden gevalideerd via pyro-sequentie-bepaling […]. Methylatie van het DNA wordt gekwantificeerd d.m.v. bisulfiet-behandeling van het DNA en simultane PCR. […]. De resultaten worden gerapporteerd als percentage gemethyleerde cytosinen t.o.v. totaal (gemethyleerde & on-gemethyleerde) cytosinen. […]

‘Ingenuity pathway analysis’

De ‘Ingenuity Pathway Analysis’ software (IPA [software om expressie-profielen te analyseren om overheersende mechanismen en het betrokken interaktie-netwerk te bepalen]) werd aangewend om genen met differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) en de rangschikking van de geassocieerde kanonieke mechanismen aan te geven Analyse van de kanonieke mechanismen identificeert de mechanismen uit de IPA mechanismen-bibliotheek die meest significant zijn voor de set genen met DMPs. De significantie van het verband tussen de genen-set en een kanoniek mechanisme wordt gemeten via het bepalen van de verhouding tussen het aantal genen in de lijst die wordt in kaart gebracht, gedeeld door het totaal aantal van alle bekende genen van dat mechanisme. […]

Resultaten

Studie-ontwerp en demografie

[…] Genomisch DNA van 13 M.E./CVS-patiënten en 12 controles (‘experimentele groep’) werd gehybridiseerd [hybridisatie = samenvoegen van twee complementaire DNA-strengen] op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. deze kunnen testen voor meer dan 850.000 CpG-‘sites’ en beslaan verschillende gebieden van meerdere genen, inclusief promoter-, 5’UTR- [‘untranslated region’, onvertaald gebied; sequentie vóór het translatie start-codon], eerste exon [exon = deel van een gen dat codeert voor een deel van het uiteindelijk RNA/proteïne; het eerste exon omvat ook het 5’UTR], ‘gene-body’ [geheel van coderend stukken van een gen] & 3’UTR- [sequentie volgend op het translatie start-codon], alsook afgelegen gebieden. […]. Na analyse van de gegevens werden de verkregen resultaten gevalideerd d.m.v. pyro-sequentie-bepaling van de stalen van de experimentele groep, alsook (bijkomend) 8 M.E./CVS-patiënten & 8 controles uit de Miami/Fort Lauderdale regio en 12 M.E./CVS-patiënten & 11 controles uit Valencia.

Het is het vermelden waard dat eerdere studies (met ‘Illumina Human Methylation450’ micro-arrays) een gelijkaardig aantal patiënten en controles gebruikten: Brenu et al. [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie van T-cellen bij 25 M.E./CVS- patiënten & 18 controles; De Vega et al. (2014) [zie referentie in de inleiding] bepaalden de methylatie-status in PMBCs bij 12 M.E./CVS-patiënten & 12 controles. […] Bovendien ligt het belangrijkste sterkte-punt van de huidige bevindingen in de validatie van specifieke CpG-‘sites’ bij een uitgebreide groep M.E./CVS-patiënten en controles van verschillende geografische lokaties. […].

[…] Energie-status, sociaal funktioneren, emotionele rol en mentale gezondheid waren significant lager bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Daarnaast werden statistisch significante verschillen qua lichamelijk gezondheid geconstateerd (SF-36 scores). […]

Globale methylatie bij M.E./CVS

We vonden geen statistisch significante verschillen qua globale DNA-methylatie levels […] in PBMCs […]. Deze analyse toont echter algemene cytosine-modificaties maar blijft beperkt tot de detektie van specifieke schommelingen op afzonderlijke lokaties in het genoom.

Aangezien voorgaande studies plaats-specifieke methylatie-verschillen bij M.E./CVS hadden getoond, gingen we over tot de evaluatie van deze mogelijkheid bij onze experimentele groep maar we gebruikte echter een opgewaardeerde versie van de micro-arrays voor humane genoom-methylatie. Deze nieuwe technologie heeft bijna een 2 maal groter bereik en laat validatie en uitbreiding van eerdere bevindingen toe bij onafhankelijke, geografisch verwijderde groepen M.E./CVS-individuen.

Differentieel gemethyleerde CpG-sites bij M.E./CVS

De gegevens toonden hypo-methylatie van differentieel gemethyleerde ‘sites’ (DMS) (98%) in PBMCs van M.E./CVS-patiënten t.o.v. controles. Er bleven 649.836 ‘probes’ [sondes; sequenties die kunnen hybridiseren] over voor verdere analyse na filtering en voor-verwerking van de ruwe genomische DNA-methylatie gegevens […]. Analyse van deze ‘probes’ leidde tot de vondst van 17.296 DMS gelegen in 6.368 genen, wijzend op epigenetische verschillen tussen de M.E./CVS-patiënten en controles […]. Bovendien toonde ‘Principal Component Analysis’ (PCA) [Statistische analyse-methode een grote hoeveelheid gegevens te beschrijven met een kleiner aantal relevante grootheden, de hoofd- of principale componenten.] van de volledige methylomen duidelijke differentiatie tussen M.E./CVS en controles. Daarnaast toonde ongecontroleerde hiërarchisch groeperen van de 500 meest variabele ‘CpG-sites’ duidelijke afscheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles, wat bevestigt dat DNA-methylatie patronen in PBMCs van M.E./CVS-individuen verschillen van deze van controles.

Van de 17.296 DMS, werd in het totaal 14.261 DMS (82%) gevonden binnen of in de nabijheid van genen (t.t.z. gen-lokaties), wijzend op het feit dat ze een rol kunnen spelen bij de regulering van gen-expressie. Ca. 98% van de DMS binnen de gen-gebieden vertoonden hypo-methylatie en 2% hyper-methylatie. Deze DMS waren meestal gelijk verdeeld tussen gen-lichamen (43,68%) en gen-regulerende elementen (TSS1500, TSS200 [1.500 – 200 nucleotiden ‘upstream’ van transcriptie-start-‘sites’], 5’UTR & 3’UTR) (43,84%). Er werd hypo-methylatie van M.E./CVS DNA gezien op 21,87% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden; 17,21% in 5’UTRs; 3,08% in eerste exonen en 4,25% in 3’UTRs. Anderzijds kwam hyper-methylatie voor op 0,16% van DMS gelokaliseerd in TSS-gebieden, 0,34% in 5’ en 3’UTRs, en 0,79% in gen-lichamen. Wat betreft de lokalisatie t.o.v. CpG-eilanden: van de 17.296 DMS waren er 46,8% gelokaliseerd in CpG-eilanden, terwijl 53,2% (8.089 DMS) in de nabijheid van CpG-eilanden lagen. De plaatsbepaling van 8.089 DMS t.o.v. hun lokatie CpG-eilanden toont dat 99,3% van deze 8.089 DMS hypo-methylatie vertoonden en slechts 0,7% hyper-methylatie. Van deze 8.089 DMS waren er 25,25% gelokaliseerd binnen CpG-eilanden, 61,9% 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-eilanden (‘N, S shores’ [‘oevers’, gebieden kort (0-2 kb) bij CpG-eilanden]), en 12,8% in gebieden 2 kb ‘upstream’ & ‘downstream’ van CpG-‘shores’ (‘N, S shelves’ [‘klippen’, gebieden verder (2-4 kb) van CpG-eilanden]). Binnen deze gebieden vertoonden 74,1% van de ‘shores’ & ‘shelves’ hypo-methylatie, terwijl slechts 0,63% van de CpG-eiland-‘shores’ & -‘shelves’ hyper-methylatie vertoonden; wat consistent is met de globale bevinding dat hypo-methylatie geassocieerd is met M.E./CVS. Minder strenge criteria (FDR ≤ 0.1 & gemiddelde beta-verschillen > 0.05) lieten toe 27.129 DMS te identificeren.

Differentieel gemethyleerde promoters bij M.E./CVS

Aangezien methylatie van promoter-gebieden op een directe manier het niveau van gen-expressie beïnvloedt, gingen we verder met het analyseren van differentieel gemethyleerde promoters (DMPs) in onze experimentele groep. Zoals beschreven werden promoters gedefinieerd als gebieden gelegen binnen de 1.500 bp ‘upstream’ van TSS en 500 bp ‘downstream’ van TSS. De criteria voor DMPs waren FDR ≤ 0.1 en de gemiddelde beta-verschillen > 0.05. Op basis van deze criteria vonden we 307 DMPs in PBMCs van M.E./CVS-individuen. 306 van deze DMPs vertoonden hypo-methylatie bij de M.E./CVS-groep […]. We bekeken de verdeling van deze promoters volgens gen-biotype. Bijna de helft van de geïdentificeerde DMPs behoren tot de proteïne-coderende genen (47,6%) en meer dan de helft (52,1%) behoren tot de regulerende RNA-genen. Deze laatste bestaan uit korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire [van de cel-kern] RNAs, kleine nucleolaire RNAs [nucleolus, kern-lichaampje]) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief anti-sense RNAs [sequenties die het mRNA inaktiveren] en inter-gen RNAs) (30,6%) en pseudo-genen [genen met een gelijksoortige DNA-struktuur als normaal funktionerende genen maar die niet tot expressie kunnen komen] (11,4%). Deze verdeling van DMPs ondersteunt onze hypothese dat de differentiële methylatie die we vaststellen kan leiden tot ontregeling van gen-expressie bij M.E./CVS. We identificeerden ook 144 DMPs met striktere criteria (FDR ≤ 0.05 en de gemiddelde beta verschillen > 0.05 […]; en dit vertegenwoordigt gelijkaardige gen-funktie patronen als de DMPs geïdentificeerd met FDR ≤ 0.1.

Analyse van funktionele mechanismen van DMPs

Om de mogelijke funkties en interakties tussen de 307 genen die worden gecontroleerd door DMPs beter te begrijpen binnen de context van cel-biologische mechanismen, voerden we een Gen Ontologie [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] analyse uit d.m.v. ‘Ingenuity Pathway Analysis’ (IPA). Deze analyse onthulde veranderingen in talrijke immuun-regulerende/ stress-respons mechanismen zoals het p38MAPK mechanisme (betrokken bij de respons op een waaier omgeving-stressoren en op inflammatoire cytokinen), de IL-10, IL-17A, Il-1 & IL-8 signalisering-mechanismen (allen met belangrijke immuun-regulerende rollen), het AMPK-mechanisme (belangrijkste regulator van de cellulaire energie-homeostase die wordt geaktiveerd in respons op stressoren die de cellulaire ATP-voorraden uitputten [zie ‘Abnormale AMPK-aktivatie & glucose-opname in spiercellen bij CVS & ‘Aktivatie van AMPK & glucose-opname in M.E.(cvs) spiercellen]) en metabole mechanismen zoals PPARα/RXRα [nucleaire receptoren] -aktivatie, en uracil- & thymine [DNA-basen] -afbraak mechanismen. Verder onthulde funktionele analyse van talrijke individuele genen hypo-methylatie in promoters van de IGHJ1, IGHJ1P, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ6, IGHJ3P, IGHV3-7, IGHD7-27, IGLL1 & LRMP genen die gerelateerd zijn met de B-cel immuun-respons, differentiatie, proliferatie en overleving. Op dezelfde manier vertoonden M.E./CVS-patiënten verminderde DNA-methylatie in promoters van genen verantwoordelijk voor T-cel generatie en aktiviteit, zoals ZCCHC11, CAPN5, IL21R, P2RX5, TREML2, AKNA & CD248. Samen met een robuuste impact op immuun-respons mechanismen, vertoonden PMBCs van M.E./CVS-patiënten verminderde methylatie van promoters van genen geassocieerd met cel-groei die gericht waren op de MAP-kinase, NF-kB & TGF signalisering-mechansimen. Daarnaast werd een onderscheidend patroon van hypo-methylatie van gen-promoters betrokken bij miRNA-expressie (miR-4435, miR-181, miR-148a, miR-193b, miR-1284, miR-10A, miR-1203, miR-3934, miR-4487 & miR-4710) [zie o.a. ook ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.] en bij bio-metaal regulering – inclusief metaal-transporter SLC39A13 (ZIP-transporter) en meerdere ‘zinc-finger’ [‘zinc-finger’ proteïnen zijn een super-familie van proteïnen die op DNA kunnen binden] genen (ZCCHC8, ZCCHC11, ZBTB18, BAZ2B, ZNF225 and ZNF732) – geïdentificeerd.

Validatie van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-array resultaten d.m.v. pyro-sequentie-bepaling

Om de resultaten van onze analyse-resultaten van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays te valideren, selekteerden we 2 DMPs met een hoge densiteit aan CpG-‘sites’ en mogelijke rol in de neuro-immune signalisering bij M.E./CVS. De eerste, het ‘Zinc Finger and BTB Domain Containing 18’ (ZBTB18), is een ‘zinc-finger’ transcriptie-onderdrukker met een cruciale rol in hersen-ontwikkeling en neuronale differentiatie. De tweede, TABPB, codeert voor een trans-membraan glycoproteïne dat de interaktie medieert tussen nieuw geassembleerd majeur histocompatibiliteit complex (MHC) klasse-I molekulen en de transporter geassocieerd met antigen-verwerking, die vereist is bij het transport van antigen-peptiden door het endoplasmatisch reticulum. ZBTB18 zit in het bovenste deel van de lijst met DMPs […] (positie 8 op 307); terwijl TABPB in het onderste deel zit (positie 246 op 307); zodat we bij de validatie-stap DMPs opnamen met waarden aan beiden uiteinden van het spectrum. Voor elk van de 2 geselekteerde genen, bepaalden we het DNA-methylatie niveau van 6 CpG-‘sites’ in het promoter-gebied. Voor ZBTB18 correspondeerden 3 van de CpG-‘sites’ met oligonucleotiden op de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays en 3 bijkomende CpG-‘sites’ – niet opgenomen op de micro-array maar gelegen in het gen promoter-gebied tussen cg15896892 & cg19698993 – werden ook getest. In het geval van TABPB correleerden alle geteste CpG-‘sites’ met probes van de ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays. Pyro-sequentie-bepaling analyse valideerde de richting van methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-individuen en controles sterk (p < 0.01) […] voor alle geteste CpG-‘sites’. Belangrijk: we zagen dat de methylatie-niveaus gedetekteerd via pyro-sequentie-bepaling bij M.E./CVS-patiënten gelijkaardig waren met deze vastgesteld d.m.v. ‘MethylationEPIC’ micro-arrays voor alle DMS, en dat de verschillen qua methylatie-niveaus bepaald via pyro-sequentie-bepaling zelfs meer uitgesproken waren dan dezelfde verschillen bepaald d.m.v. micro-arrays.

Bespreking

DNA-methylatie speelt een belangrijke rol bij de wisselwerking tussen externe (omgeving) en interne (gen-expressie) factoren en kan zodoende de late of door een stimulus getriggerde aanvang van complexe multi-systeem ziekten zoals M.E./CVS verklaren. Slechts enkele studies hebben echter gerapporteerd over wijzigingen qua DNA-methylatie geassocieerd met M.E./CVS. Hier gebruikten we een nieuwere en verbeterde technologie – ontwikkeld door Illumina Inc.; die nog niet beschikbaar was ten tijde dat de voorafgaande studies werden uitgevoerd – met de bedoeling de eerdere bevindingen uit te breiden. ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays beslaan bijna 2 maal zoveel CpG-‘sites’ als de oudere ‘Illumina HumanMethylation450’ micro-arrays, inclusief 333.265 bijkomende CpGs gelegen regulerende gebieden […].

We identificeerden hier differentieel gemethyleerde CpG-‘sites’ en promoters in PBMCs van M.E./CVS-individuen vergeleken met controles in groepen van twee uitéénliggende geografische lokaties. De associatie van hypo-methylatie van DMPs met immuun-regulerende mechanismen komt overéén met eerdere studies. Deze eerdere studies vonden bij immuun-cel regulering de grootste gecoördineerde aanrijking qua differentieel gemethyleerde mechanismen en rapporteerde genomisch DNA hypo-methylatie van genen in immuun-mechanismen in PBMCs geïsoleerd bij M.E./CVS-patiënten [zie de Vega WC et al. hierboven] en ook in CD4+ T-cellen bij M.E./CVS [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: we vonden significante verschillen qua DNA-methylatie tussen M.E./CVS en controles op 17.296 CpG-‘sites’ in 6.368 genen globaal (FDR ≤ 0.05), in promoters alsook andere gen-regulerende elementen en binnen coderende gen-gebieden. Er werd DNA hypo-methylatie gevonden in 98% van deze plaatsen bij M.E./CVS, terwijl slechts 2% hyper-methylatie vertoonden, t.o.v. controles.

Differentiële methylatie van promoters [in de gebruikte software beschreven als gebieden 1500 bp ‘upstream’ en 500 bp ‘downstream’ van TSS] kan een invloed hebben op de expressie van de corresponderende aangetaste genen. Interessant genoeg houden minder dan de helft van de DMPs (47,6%) verband met proteïne-coderende genen; terwijl meer dan 50% aangetaste niet-proteïne-coderende DMPs overéénkomen met promoters van regulerende gen-elementen, inclusief korte niet-coderende RNAs (inclusief miRNAs, kleine nucleaire RNAs, kleine nucleolaire RNAs) (10,1%), lange niet-coderende RNAs (inclusief ‘anti-sense’ RNAs en ‘inter-gen’ RNAs) (30,6%) en pseudo-genen (11,4%). Kleine nucleaire RNAs en kleine nucleolaire RNAs participeren in RNA-‘splicing’ [tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt], terwijl lange niet-coderende RNAs en pseudo-genen belangrijke rollen spelen bij de regulering van transcriptie en mRNA-stabiliteit […]. Het is belangrijk op te merken dat het grootste beta-verschil (hypo-methylatie 14%) in de DMP-lijst werd gezien voor de promoter van het gen dat verband houd met de werking van ‘natural killer’ (NK) cellen.

Op het niveau van enkelvoudige genen, tonen onze resultaten hypo-methylatie van promoters van genen gerelateerd met die van referentie-studies, zoals sommige ‘solute carriers’ [membraan-transport-proteïnen], RNA-bindende proteïnen, ‘homeobox’ [binden op DNA en beïnvloeden zo de expressie van genen] en ‘PHD-finger’ [betrokken bij gen-regulering] -proteïnen [zie Brenu EW et al. hierboven]. Bij deze vonden we het MED13L gen [codeert voor een sub-unit van een groot transcriptioneel co-aktivator complex waarvan wordt gedacht dat het vereist is voor de expressie van bijna alle genen] dat geassocieerd is met verlaagde spier-spanning en neurocognitieve stoornissen, symptomen die verbonden zijn met M.E./CVS. We vonden ook DMPs gelinkt met de expressie van ribosomale proteïnen (RPL23A & RPL7) alsook met de 5S-ribosomale RNA pseudo-genen (RNA5SP245, RNA5SP77 & RNA5SP97) suggestief voor mogelijke verstoring van proteïne-synthese. Met betrekking tot de methylatie-status van de met glucocorticoïde respons geassocieerde genen, vonden we significante hypo-methylatie van de SGK3 (serum glucocorticoid gereguleerd kinase [o.a. rol bij regulering van verscheidene transporter-systemen]) gen-promoter [zie de Vega WC et al. hierboven].

Transcriptie-profilering studies bij M.E./CVS-patiënten gaven verstoringen aan van T- & B-cel aktivatie en ontregeling van gen-expressie die gerelateerd is met immuun-responsen in brede zin, en dergelijke veranderingen passen bij andere studies die een gewijzigde aanmaak van interleukine en interferon cytokinen aantoonden als kenmerken voor M.E./CVS immuun-dysfunktie [Broderick G et al. A formal analysis of cytokine networks in Chronic Fatigue Syndrome. Brain, behavior and immunity. (2010) 24: 1209-17]. In de huidige studie, rapporteren we hypo-methylatie van DMPs van genen waarvan bekend is dat ze de adaptieve immuun-respons zoals immunoglobulinen en pseudo-genen (bv. IGDCC3, IGHD7-27, IGHJ1, IGHJ3 en andere) reguleren, wat overéénkomt met de gemelde verbetering van M.E./CVS-patiënten na B-cel depletie-therapie. We zagen ook hypo-methylatie van promoters van MMP14, MAP4K4, MAPK12 & CREB5 die mogelijks het TNF-signalisering mechanisme aktiveren, wat past bij de gerapporteerde over-expressie van pro-inflammatoire cytokinen bij M.E./CVS. Daarnaast toonden we ook hypo-methylatie van miRNA-148a promoter die mogelijks kan bijdragen tot over-expressie. Het is bekend dat de miRNA-148-152 familie de aangeboren immuun-respons en antigen-presentatie […] kan verstoren. Bovendien kan miRNA-148a bijdragen tot DNA hypo-methylatie CD4+ T-cellen bij lupus [systemische lupus erythematosus; een auto-immune aandoening] door het onderdrukken van de expressie van DNA-methyltransferase-1 [DNA-methyltransferasen zijn enzymen die een methyl-groep toevoegen aan de 5’ positie]. Het is meldenswaardig dat bij de DMPs die in deze studie geassocieerd zijn met miRNA-expressie, ook werd gemeld dat miRNA-10a, miRNA-181 & miRNA-4710 aangetast waren op DNA-methylatie niveau in minstens één eerdere M.E./CVS-studie [zie Brenu EW et al. hierboven]. Specifiek: miRNA-10a bleek geassocieerd met M.E./CVS in NK-cellen [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9] en miR-181 gerelateerd met de TLR-gemedieerde inflammatoire respons, dat geassocieerd is met M.E./CVS [Gambuzza ME et al. The Role of Toll-Like Receptors in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: A New Promising Therapeutic Approach? CNS Neurol Disord Drug Targets (2015) 1: 903-14].

Hypo-methylatie van de IL21R gen-promoter kan wijzen op verhoogde expressie van de IL21-receptor. De ligand-binding van deze receptor leidt tot de aktivatie van meerdere ‘downstream’ signalisering-molekulen, inclusief JAK1, JAK3, STAT1 & STAT3. ‘Studies suggereren een rol voor dit gen bij het reguleren van de immunoglobulinen-produktie. IL21 reguleert aangeboren én adaptieve immuun-responsen, en oefent ook belangrijk effekten uit op inflammatoire responsen die de ontwikkeling van auto-immune ziekten en inflammatoire aandoeningen bevorderen. Belangrijk: IL21-signalisering is cruciaal voor de inductie van spontane experimentele auto-immune encefalomyelitis. De in onze studie gerapporteerde DMPs zijn niet enkel consistent en valideren de eerdere studies betreffende gen-regulerende elementen in genen binnen de immuun-cel regulering cluster maar ze bieden ook een beter begrip door het gebruik van geavanceerde technologie alsook de validatie via groepen van verwijderde geografische lokaties.

Het is meldenswaardig dat het nog te vroeg is om te besluiten uit eerdere studies of onze huidige studie, of de significante epigenetische modificaties die geassocieerd bleken met M.E./CVS op een compenserend homeostatisch mechanisme wijzen of het resultaat zijn van een adaptieve immuun-respons op inductoren uit de omgeving. Deze resultaten geven echter aan dat DNA-methylatie een potentieel gen-regulerend mechanisme vormt dat in staat is langdurige veranderingen bij M.E./CVS-patiënten te mediëren, zoals eerder opgemerkt door andere auteurs. Samengevat: de associatie van differentiële DNA-methylatie met M.E./CVS suggereert zeker een potentiële rol voor epigenetische wijzigingen in de pathofysiologie van M.E./CVS.

Besluiten

Naar ons weten is dit de eerste studie die epigenetische veranderingen in relatie tot M.E./CVS over gans het genoom heeft onderzocht gebruikmakend van ‘Illumina MethylationEPIC’ micro-arrays die meer dan 850.000 CpG-‘sites’ beslaan en die de resultaten heeft gevalideerd in 2 geografisch van elkaar gelokaliseerde groepen M.E./CVS-patiënten. Onze bevindingen bouwen verder op eerdere preliminaire rapporten die een verband tonen tussen gewijzigde methylatie-profielen van genen met immuun-funkties en DNA-methylatie bevestigen als een epigenetisch regulerend mechanisme geassocieerd met M.E./CVS. Er zijn toekomstige validatie-studies bij grotere groepen M.E./CVS-indviduen nodig om deze bevindingen te bevestigen en de effekten van dergelijke methylatie-patronen op gen-expressie te evalueren.

maart 22, 2017

Epigenetische modificaties & glucocorticoïden sensitiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:58 pm
Tags: , , , , , ,

Lees, ter introductie, o.a. nog es ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’…

Epigenetica betreft de chemische wijzigingen die voorkomen op het DNA van onze genen – dikwijls het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide) – die veranderen hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA).

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS(de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757). Nu werden hier 12.608 verschillen op het DNA (“differentieel gemethyleerde sites”) gevonden bij M.E.(cvs)-patiënten in vergelijking met gezonde mensen; een groot biologisch verschil. Deze verschillen op het DNA beïnvloeden ook de werking van immuniteit-cellen. Er werd meer hyper-methylatie gevonden bij de M.E.(cvs)-patiënten (71,6% t.o.v. 28,4% hypo-methylatie) vergeleken met controles. 1.600 differentieel gemethyleerde genen waren gelinkt met lichamelijke stoornissen (RAND-36 score) bij M.E.(cvs). Vele van deze genen zijn betrokken bij cellulaire energie-produktie, metabolisme en immuun-signalisering.

Er werd ook bekeken of deze verschillen een invloed hadden op de immuun-funktie. Daartoe werden cellen uit het bloed onderworpen aan een specifieke test waarbij de immuuncellen worden geaktiveerd (simulatie van een immuun-respons) en deze respons dan wordt gestopt met een synthetische vorm van cortisol. Bij een subgroep M.E.(cvs)-patiënten waren de cellen hyper-sensitief voor cortisol (de hoeveelheid nodig om gezonde immuuncellen te ‘kalmeren’ veroorzaakte bij M.E.(cvs) dat deze cellen werden uitgezet. Er waren differentieel gemethyleerde genen geassocieerd met deze hyper-sensitiviteit voor cortisol.

Eens te meer wordt hier aangegeven dat M.E.(cvs) een biologische oorzaak heeft… De auteurs: “Deze bevindingen komen overéén met ander werk die aangeven dat de energie-produktie verstoord is in de cellen van mensen met M.E.(cvs).”.

 

————————-

BMC Med Genomics. 23 (2017) 10: 11

Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

de Vega WC1,2, Herrera S1,3, Vernon SD4,5, McGowan PO6,7,8,9

1Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

3Department of Biological Sciences, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA

4Solve ME/CFS Initiative, Los Angeles, CA, USA

5Present affiliation: The Bateman Horne Centre of Excellence, Salt Lake City, UT, USA

6Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, M1C 1A4, Canada

7Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

8Department of Psychology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

9Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

Samenvatting

Achtergrond: Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende idiopathische ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verdwijnt door voldoende rust. De diagnose is gebaseerd op een lijst symptomen en uitsluiting van andere vermoeidheid-gerelateerde gezondheid-aandoeningen. Ondanks de heterogene patiënten-populatie komen verschillen qua immuniteit en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, zoals versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden, steeds terug in M.E./CVS-studies. Het is geweten dat epigenetische modificaties, zoals CpG-methylatie [DNA-methylatie komt voornamelijk voor op de cytosines van CpG dinucleotide sites], lange-termijn fenotypische verschillen reguleren en eerder werk door ons groep toonde DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] verschillen bij M.E./CVS; het verband tussen DNA-methyloom modificaties, klinische en funktionele karakteristieken geassocieerd met M.E./CVS werd echter niet onderzocht.

Methodes: We onderzochten het DNA-methyloom in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van een grotere groep vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (‘Illumina Human Methylation 450 BeadChip Array’ [‘chip’ waarmee > 485.000 methylatie-sites per staal kunnen worden geanalyseerd]). Parallel met de analyse van het DNA-methyloom, bekeken we de glucocorticoïden-gevoeligheid ‘in vitro’ door het stimuleren van PBMCs met fyto-haemagglutinine [PHA] en onderdrukten de groei met dexamethason [synthetisch glucocorticoid]. We gingen DNA-methylatie verschillen na d.m.v. bisulfiet-pyrosequentie-bepaling [‘pyrosequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling] en statistische permutatie. Er werd lineaire regressie [statistische analyse] toegepast om epigenomische gebieden geassocieerd met zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit te ontdekken, en netwerk-analyse van gen-ontologische termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] om de resultaten in een biologische context te plaatsen.

Resultaten: We detekteerden 12.608 verschillende gemethyleerde plaatsen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voornamelijk gelokaliseerd in genen m.b.t. het cellulair metabolisme; enkele daarvan waren ook gerelateerd met scores van zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit. Bij de M.E./CVS-patiënten was glucocorticoid-sensitiviteit geassocieerd met differentiële methylatie op 13 loci. [locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt]

Besluiten: Onze resultaten geven aan dat DNA-methylatie modificaties in het cellulair metabolisme bij M.E./CVS – ondanks een heterogene patiënten-populatie – deze processen in immune en HPA-as dysfunktie bij M.E./CVS impliceren. Modificaties op epigenetische loci geassocieerd met verschillen qua glucocorticoid-gevoeligheid kunnen belangrijk zijn als biomerkers. Globaal genomen komen deze bevindingen overéén met werk dat wijst op stoornissen bij de cellulaire energie-produktie in deze patiënten-populatie.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een idiopathische ziekte gekenmerkt door ernstige en invaliderende vermoeidheid, cognitieve stoornissen, niet-verfrissende slaap, autonome verschijnselen en post-exertionele malaise. Andere ziekten of gezondheid-aandoeningen die de persistente aanwezigheid van vermoeidheid kunnen verklaren, zoals majeure depressie, anorexie en boulimie, worden uitgesloten voor het stellen van de diagnose M.E./CVS. De heterogeniteit wat betreft de klinische kenmerken van M.E./CVS is een obstakel bij het bepalen van de biologische oorzaak.

Veel studies die de pathofysiologie van M.E./CVS onderzochten, hebben wijzigingen in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as gerapporteerd. De HPA-as is een belangrijke component van het neuro-endocrien systeem dat homeostatische processen, het circadiaans ritme en stress-responsen reguleert via een hormonen-cascade die leidt tot de afgifte van glucocorticoïden (GCs). GCs interageren met de GC-receptor (GR) om de stress-respons en inflammatie te reguleren. M.E./CVS-patiënten vertonen een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback responsen op GCs, wat een belangrijke rol van de HPA-as bij deze ziekte suggereert.

Naast de veranderde werking van de HPA-as, werden ook wijzigingen qua immuun-fenotype alom gedocumenteerd bij M.E./CVS. Hoewel de specifieke patronen van de verschillen nog niet zijn opgelost, bleek M.E./CVS geassocieerd met abnormale cytokine-profielen, lymfocyten-proporties en verstoorde immuun-funktie (in het bijzonder verminderde cytotoxiciteit). Verhoogde inflammatie in het darm-microbioom bleek ook geassocieerd met M.E./CVS. Dit omvat gedaalde diversiteit van het darm-microbioom, verschuivingen naar pro-inflammatoire bakteriële soorten en een proliferatie van merkers voor pro-inflammatoire processen in het serum [Giloteaux L, Goodrich JK, Walters WA, Levine SM, Ley RE, Hanson MR. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30].

Epigenetische modificaties, inclusief de methylatie van DNA op CpG-dinucleotiden, kan lange-termijn fenotypische veranderingen beïnvloeden in respons op externe stimuli. DNA-methylatie modificaties in genen betrokken bij de HPA-as en het immuunsysteem bleken sterk gelinkt met omgeving-stress. We documenteerden eerder DNA-methyloom abnormaliteiten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van ‘sudden-onset’ M.E./CVS-patiënten (gevalideerd via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling) [de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757]; deze abnormaliteiten waren significant geconcentreerd in genen gelinkt met immuun-regulering. Er bleven belangrijke vragen over het feit of deze epigenetische modificaties een impact hadden op de werking van immuun-cellen en hun relatie met klinische kenmerken van M.E./CVS.

In de huidige studie brachten we loci in kaart die epigenetische gemodificeerd waren in PBMCs en onderzochten hun gevoeligheid voor glucocorticoïden. Onze doelstellingen waren te bepalen hoe epigenetische patronen in verband staan met HPA-as signalisering in immuun-cellen bij M.E./CVS-patiënten, en de identificatie van neuro-immune mechanismen die waren beïnvloed bij M.E./CVS.

Methodes

Criteria voor selektie van deelnemers

[…] De diagnose M.E./CVS werd gesteld op basis van de Fukuda en Canadese criteria. […] Vragenlijsten over symptomen, medicatie en medische geschiedenis, en de RAND-36 voor zelf-rapportering over gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit. [36 items ter beoordeling van 8 gezondheid-concepten: lichamelijk funktioneren, beperkingen veroorzaakt door fysieke gezondheid problemen, beperkingen veroorzaakt door emotionele problemen, sociaal funktioneren, emotioneel welzijn, energie/vermoeidheid, pijn & algemene gezondheid percepties] […] We selekteerden vrouwen voor deze studie. […] 49 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles voldeden aan de volgende criteria: 1) negatief voor HIV, AIDS en/of hepatitis-C, en 2) blanke non-obese vrouwen (BMI < 30) die geen immunomodulerende en/of epigenetisch aktieve medicatie gebruikten. […]

Isolatie en bewaring van PBMCs

[…]

DNA Extractie en zuivering van genomisch DNA

[…]

DNA-methyloom chips

[…]

Normalisatie en statistische analyses va, DNA-methyloom gegevens

[…]

DNA-methylatie validering via by bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

[…]

Dexamethason-suppressie test en verband met DNA-methylatie verschillen

[…]

Associatie tussen klinische gegevens en DNA-methylatie

[…]

Resultaten

RAND-36 scores significant lager bij M.E./CVS-patiënten

Globaal hadden de M.E./CVS-patiënten een lagere gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit dan de gezonde controles (significant lager voor 7 van 8 RAND-36 categorieën (alle p-waarden ≤ 0.05). Er waren geen verschillen qua gemiddelde leeftijd of BMI. […] Verdere analyse toonde een duidelijke scheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles […].

DNA-methyloom verschillen bij M.E./CVS

We vonden – na correctie voor leeftijd, BMI en verschillen qua in cel-proporties – 12.608 significant verschillend gemethyleerde loci in onze groep. 5.544 daarvan waren toegekend aan een gekend proteïne-coderend gen (UCSC Genome Browser). […] In termen van de richting van de methylatie-verschillen bij de M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, waren 71,6% van de differentieel gemethyleerde sites hyper-gemethyleerd en 28,4% hypo-gemethyleerd. […] Hoewel er geen significante verschillen waren qua proportie hypo-/hyper-gemethyleerde sites volgens genetische lokatie, waren er significante verschillen wat betreft deze proporties wanneer de afstand van een CpG-eiland in acht werd genomen. De hoeveelheid hyper-methylatie daalde naar gelang de afstand tot een CpG-eiland vergrootte. […]

Glucocorticoïden-gevoeligheid in PBMCs bij bij M.E./CVS-subgroepen

Globaal genomen was er een significant gemiddelde toename qua glucocorticoïden-sensitiviteit in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (p ≤ 0.05). Een visuele inspectie van de gegevens onthulde een bimodale verdeling van de glucocorticoïden-gevoeligheid binnen de M.E./CVS-groep: een GC-hypersensitieve groep (die een verhoogde respons op glucocorticoid-behandeling vertoonde t.o.v. de gemiddelde controle) en een GC-typische groep (die een respons vertoonde gelijkaardig met de gezonde controles). De verschillen qua GC-sensitiviteit waren niet geassocieerd met het type M.E./CVS-aanvang of de RAND-36 (scores voor de ganse vragenlijst of bepaalde categorieën; p > 0.10).

DNA-methylatie verschillen in dexamethason-test subgroepen via pyrosequentie-bepaling en permutatie-testen

Om het verband te bepalen tussen verschillen qua DNA-methylatie en glucocorticoïden-gevoeligheid, pasten we dezelfde statistische criteria toe die werden gebruikt om methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te identificeren toe op 3 verschillende vergelijkingen: 1) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch; 2) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles; en 3) M.E./CVS GC-typisch vs. controles. We vonden dat er geen methylatie-verschillen voldeden aan deze statistische criteria. Een groot aantal loci vertoonden echter significant nominale p-waarden ≤ 0.05 [De ‘significantie’ is een nominale p-waarde die de researcher selekteert als ‘cut-off’ punt voor het interpreteren of iets statistisch significant ka worden beschouwd of niet.]. Als alternatieve methodes voor statistische analyse van de 3 glucocorticoïden-gevoeligheid vergelijkingen, evalueerden we de verschillen die werden gevonden met de ‘450K array’ via 2 doelgerichte statistische methodes.

Wat betreft de pyrosequentie-bepaling analyse was onze strategie het selekteren van 3 loci die nominaal significante verschillen vertoonden tussen M.E./CVS GC-hypersensitief en M.E./CVS GC-typisch: 2 loci in JRK [gen coderend voor een proteïne lijkend op DNA-bindende proteïnen] & 1 locus in SLC6A4 [codeert voor de serotonine-transporter]. Deze sites werden gekozen om de betrouwbaarheid te onderzoeken van de ‘450K array’ om significante verschillen te detekteren zowel boven als onder de 5% cut-off die we implementeerden bij het zoeken naar significant differentieel gemethyleerde plaatsen bij M.E./CVS, en om DNA-methylatie verschillen te valideren die zowel potentieel gerelateerd zijn met GC-sensitiviteit verschillen, alsook uniek voor M.E./CVS. De JRK-sites weden geselekteerd voor de volgende redenen: ze waren bij de top sites in termen van verschil-grootte > 5% methylatie-verschil op de ‘450K array’ […] en ze lagen ook dicht bijéén in het genoom (5 bp uit elkaar), wat ons toeliet af te leiden hoe de DNA-methylatie status wordt gereflekteerd binnen hetzelfde gen-gebied. […] Na pyrosequentie-bepaling werden de JRK-sites significant verklaard (p ≤ 0.05) of ‘trending’ (p ≤ 0.10) naargelang de resultaten. Het < 5% nominaal significant verschil gevonden op de ‘450K array’ gegevens voor SLC6A4 was hier echter niet significant; wat er op wijst dat methylatie-verschillen < 5% op de ‘450K array’ niet op een betrouwbare manier werden gedetekteerd voor deze vergelijkingen.

Wat betreft de permutatie-analyse [een type statistische significantie-test] onderzochten we de mate van overlapping tussen de sites met een > 5% gemiddeld methylatie-verschil die nominaal significant waren op de ‘450K array’ […] en de sites die significant verschillende werden verklaard bij 10.000 permutaties. We vonden dat een meerderheid van de nominaal significanten ook significant waren volgens de permutatie-test: 76,8% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch, 84,5% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles, en 99,6% bij de vergelijking M.E./CVS GC-typisch vs. controles; wat er op wijst dat de meerderheid van de methylatie-verschillen die nominaal significant waren met > 5% gemiddeld methylatie-verschil waarschijnlijk differentiële methylatie reflekteerden.

Gezien deze resultaten implementeerden we de 5% verschil cut-off voor de verschillende dexamethason-test subgroep-vergelijkingen, en onderzochten sites die significant bleken […]. Om potentiële epigenomische loci geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit te bepalen, onderzochten we de overlap qua nominaal significante loci voor de 3 vergelijkingen. Er waren 5 sites die differentieel gemethyleerd waren bij de 3 vergelijkingen; één die correspondeerde met een coderend gen: NPAS3 [transcriptie-factorNeuronal PAS domain protein 3’], een gen betrokken bij neurogenese. We vonden 13 loci die differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles én M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch. Deze loci […] zijn waarschijnlijk geassocieerd met glucocorticoïden-gevoeligheid. De top 3 sites met de grootste verschillen bij vergelijking van M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch correspondeerden met GSTM1 [Glutathion S-transferase Mu 1] (14,3% verhoogde methylatie), MYO3B [myosine IIIB] (13,7% stijging) en GSTM5 [Glutathion S-transferase Mu 5] (12,0% stijging). Naast deze glucocorticoïden-sensitieve sites vonden we 4.699 loci die waarschijnlijk geassocieerd zijn met M.E./CVS, aangezien ze differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles en de M.E./CVS GC-typisch vs. controles vergelijkingen. GO-analyse van deze sites onthulde een aanrijking van differentiële methylatie bij M.E./CVS geassocieerd met regulerende processen, inclusief neuronale cel ontwikkeling, signaal-transductie, metabole regulering en transcriptie-regulering. Er waren 203 significant differentieel gemethyleerde sites die uniek waren voor M.E./CVS GC-typische individuen maar er waren echter geen GO-termen significant geassocieerd met deze sites.

Verbanden tussen differentieel gemethyleerde gebieden en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

Om het verband te onderzoeken tussen DNA-methylatie en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit […] onderzochten we gen-gebieden om potentiële epigenomische plaatsen te bepalen die een significante relatie vertonen met levenskwaliteit-scores. Na lineaire regressie analysis vonden we meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden met een > 5% methylatie-verschil (M.E./CVS en controles) die een significant verband vertoonden met de globale RAND-36 score. De top 5 differentieel gemethyleerde gebieden correspondeerden met TSS-methylatie [TSS = ‘transcription start site’; plaats waar de transcriptie start] in GRAMD1A [GRAM Domain Containing 1A’], ATP6V0E2 [ATPase H+ Transporting V0 Subunit E2’] & LOC144571 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne], en gen-‘body’ methylatie [in het gen zelf] in LOC401431 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne] & IL6R [IL-6 receptor].

Bespreking

In deze studie detekteerden we 12.608 differentieel gemethyleerde sites in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, sommige daarvan waren significant geassocieerd met scores van zelf-gerapporteerde levenskwaliteit. 71,6% van deze sites vertoonden hyper-methylatie bij M.E./CVS en de hyper-methylatie bleek te delen naar gelang de afstand van een CpG-eiland steeg; dit suggereert dat epigenetische ontregeling bij M.E./CVS significant varieert afhankelijk van de relatieve plaats t.o.v. CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. Binnen de groep M.E./CVS-patiënten zagen we 2 subgroepen op basis van de in vitro [‘in een proefbuis’] sensitiviteit voor blootstelling aan glucocorticoïden. Het verschil qua glucocorticoïden-gevoeligheid was geassocieerd met differentiële methylatie op 13 sites (op basis van vergelijkingen van differentiële methylatie bij M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. M.E./CVS GC-typisch en M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. gezonde controles).

DNA-methylatie modificaties in cellulaire processen/metabolisme-mechanismen bij M.E./CVS

Genen geassocieerd met cellulaire en metabole regulering waren belangrijke mechanismen met differentiële epigenetische profielen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Deze bevindingen zijn consistent met een eerder rapport van onze groep bij M.E./CVS-patiënten waarbij de ziekte plots startte [zie link/ref. in onze inleiding] en met andere rapporten over genomische, transcriptomische en metabolomische verschillen bij M.E./CVS [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U, Rajeevan MS. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-86 /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T, Rajeevan MS, Vernon SD, Horvath S. Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol. (2008) 2: 95 /// Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405 /// Naviaux RK, Naviaux JC, Li K, Bright AT, Alaynick WA, Wang L, Gordon E. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences (2016) 113: E5472-E5480], die een rol aangeven voor DNA-methylatie modificaties bij de metabole stress die wordt vastgesteld bij deze ziekte. Oxidatieve en nitrosatieve stress werden gedocumenteerd in immuuncellen van M.E./CVS-patiënten, en een daling van metabolieten van de elektronen-transport-keten suggereert een rol in de M.E./CVS-pathologie voor processen die de mitochondriale werking beïnvloeden. Er is een gekend verband tussen oxidatieve stress en epigenetische modificaties. DNA-beschadigingen zijn dikwijls het resultaat van oxidatieve stress, en deze beïnvloeden op hun beurt de epigenetische regulering, wat leidt tot afwijkende DNA-methylatie en gen-expressie patronen. Het is mogelijk dat oxidatieve stress, zoals in onze studie aangegeven door de verschillen gevonden in genen betrokken bij cellulaire en metabole regulering (inclusief ARL4C & HOXA11), sommige van de epigenetische veranderingen bij M.E./CVS kunnen aansturen. Er is echter bijkomend werk – zoals het karakteriseren van het effekt van ARL4C [‘ADP-Ribosylation Factor Like Protein 4C’] & HOXA11 [transcriptie-factor ‘Homeobox protein Hox-A11’] op DNA-methylatie patronen – vereist om dit verband te onderzoeken.

Genen geassocieerd met neuronale cel ontwikkeling bleken ook een belangrijke klasse genen met differentiële methylatie bij M.E./CVS-patiënten. Ten minste 2 eerdere studies die gen-expressie patronen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten onderzochten, rapporteerden ook significante verschillen voor genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling en regulerende processen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9]. Het is ook bekend dat genen die geassocieerd zijn met psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen rijke expressie-profielen vertonen in PBMCs [Vernon SD, Nicholson A, Rajeevan M, Dimulescu I, Cameron B, Whistler T, Lloyd A. Correlation of psycho-neuroendocrine-immune (PNI) gene expression with symptoms of acute infectious mononucleosis. Brain Res. (2006) 1068: 1-6]. DNA-methylatie verschillen op neuronale genen in PBMCs kunnen sommige centrale verschillen in psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen bij M.E./CVS weerspiegelen, zoals wordt gesuggereerd door de resultaten van onze glucocorticoïden-sensitiviteit test, die overéénkomen met werk dat perifeer bloed en immuuncellen identificeert als geschikte kandidaten die differentiële DNA-methylatie in het brein weerspiegelen.

Dexamethason-respons subgroepen bij bij M.E./CVS

We stelden een gemiddelde toename qua glucocorticoïden-gevoeligheid vast bij M.E./CVS-patiënten, die niet kon worden verklaard op basis van het type M.E./CVS-aanvang of levenskwaliteit. Daarnaast onthulde een meer gedetailleerd onderzoek van onze resultaten 2 subgroepen bij de M.E./CVS-patiënten. Er werd een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden geobserveerd in meerdere studies van de GC-responsen bij M.E./CVS. De aanwezigheid van een GC-typische en GC-hypersensitieve subgroep binnen onze M.E./CVS-groep komt dus overéén met de geobserveerde heterogeniteit van HPA-gerelateerde verschillen in deze eerdere rapporten.

Glucocorticoïden staan bekend om hun anti-inflammatoire effekten en worden typisch gebruikt om immuun-responsen te onderdrukken. Een ongepaste respons op behandeling met glucocorticoïden is echter geassocieerd met verhoogde vatbaarheid voor metabole en hart-ziekten. Onze resultaten op basis van PHA, een T-cel mitogen [molekule die een cel aanzet tot delen], als immuun-stressor gaven een funktionele stoornis qua T-cel GR-gevoeligheid bij GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten aan. Bijkomend bewijsmateriaal suggereert dat T-cellen kandidaten zijn voor een primaire immuuncel-populatie bij M.E./CVS-pathologie. Bv.: een GWAS [‘genome-wide association study’] vond significante verschillen qua polymorfismen geassocieerd met T-cel receptoren bij M.E./CVS-patiënten [Schlauch KA, Khaiboullina SF, Rawat S, Petereit J, Rizvanov AA, Blatt N, Mijatovic T, Kulick D, Palotas A et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry. (2016) 6: e730]. Daarnaast werden DNA-methylatie verschillen gerapporteerd in CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brenu EW, Staines DR, Marshall-Gradisbik SM. Methylation profile of CD4+ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228], een cel-populatie die een verhoogde dexamethason-sensitiviteit lijkt te vertonen bij M.E./CVS [Visser J, Blauw B, Hinloopen B, Brommer E, de Kloet ER, Kluft C, Nagelkerken L. CD4 T-lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4].

We vonden 13 sites geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit bij in GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten in vergelijking met zowel GC-typische M.E./CVS-patiënten als gezonde controles. Naar ons weten zijn er geen andere EWAS [‘epigenome-wide association study’] of GWAS studies die specifiek de epigenetische of genetische verschillen onderzochten in de context van GC-sensitiviteit. Genomische studies bij M.E./CVS hebben echter polymorfismen in GC-signalisering genen bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd. Interessant: deze genen lijken niet te overlappen met andere aandoeningen die worden gekenmerkt door verstoorde GC-signalisering [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Daarnaast was FKBP5 [gen met een rol bij post-traumatische stress, depressie en angst], een gen dat differentieel gemethyleerd bleek bij het syndroom van Cushing [hormonale aandoening gekenmerkt door een verhoogd gehalte aan cortisol in het bloed], niét bij de genen die in onze studie werden geïdentificeerd. De potentiële link tussen M.E./CVS en epigenetische modificatie van deze genen zou dus echter met voorzichtigheid moeten worden bekeken. Niettemin suggereren de resultaten dat epigenetische verschillen op deze sites nuttige informatie kunnen bieden betreffende geassocieerde GC-sensitiviteit bij sommige M.E./CVS-patiënten.

6 van de 13 sites waren onderdeel van coderende genen, 4 daarvan met rollen in het cellulair metabolisme. ‘Patatin Like Phospholipase Domain Containing 4’ (PNPLA4) is een fosfolipase dat een rol speelt bij het lipiden-metabolisme en sterk tot expressie komt in metabool aktief weefsel. PNPLA4 maakt ook deel uit van de PNPLA-familie, die aktiveert na interaktie met glucocorticoïden. D-aspartaat-oxidase (DDO) is een enzyme dat D-aspartaat en N-methyl-D-aspartaat, overvloedig aanwezig in neuro-endocrien weefsel, deaminiseert. Gen ‘knock-out’ studies over DDO in muizen hebben onthuld dat dit enzyme belangrijk is bij de produktie van melanocortinen [groep of peptide-hormonen] en betrokken is bij de regulering van basale corticosteron-waarden. Fosfodiesterase-1C (PDE1C) is verantwoordelijk voor de hydrolyse van cyclische nucleotiden, wat belangrijk is voor fysiologische regulering, calcium-signalisering mechanismen en circadiaans ritme. Stiudies met cel-culturen hebben getoond dat inhibitie van PDE1C […] resulteert in geïnhibeerde cel-proliferatie en dat PDE1C geaktiveerd wordt na behandeling met dexamethason.

De top 3 sites, op basis van grootte-verschillen tussen on GC-hypersensitieve en GC-typische (M.E./CVS & controle) individuen, correspondeerden met GSTM1, MYO3B & GSTM5 [zie eerder], die alle een > 10% toename van de methylatie vertoonden. GSTM1 & GSTM5 maken deel uit van de mu-klasse van de GST genen-familie, waarvan de primaire rol detoxificatie is van milieu- en exogene toxinen, specifiek polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Genetische polymorfismen in GSTM zijn gekende voorspellers van de potentiële respons op glucocorticoïden bij acute lymfoblastische leukemie, wat er op wijst dat GSTM een significante rol zou kunnen spelen bij glucocorticoïden-signalisering in immuuncellen. MYO3B is een ATPase dat geaktiveerd wordt door actine [onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en betrokken is bij kinase-aktiviteit. MYO3B en z’n meerdere interakties worden echter nog niet goed begrepen vergeleken met andere myosine-genen [van belang bij spier-samentrekking], zo dat het onduidelijk is hoe verschillen in MYO3B verband kunnen houden met glucocorticoïden-signalisering.

De 13 differentie gemethyleerde sites zouden als biomerkers voor of glucocorticoïden-hypersensitiviteit beschouwd kunnen worden maar er is echter nog bijkomend werk vereist om de funktionele impact van hyper-methylatie op deze genen en het verband met glucocorticoïden-signalisering te begrijpen en te bevestigen. Gen ‘knock-out’ en RNA ‘knock-down’ studies kunnen helpen bij het bepalen van de precieze impact die deze genen op glucocorticoïden-signalisering hebben. Het meten van mRNA-transcripten, methylatie-verschillen en proteïne-waarden van deze genen bij baseline, PHA-gestimuleerd en DEX-onderdrukt in vitro en in vivo, kunnen tot een beter begrip van de dynamiek die aan de basis ligt van GC-sensitiviteit verschillen bij M.E./CVS leiden.

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met levenskwaliteit-scores

We vonden meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden die significant geassocieerd waren met de globale RAND-36 score, waarbij variatie in methylatie in deze gebieden significant was geassocieerd met variatie in de globale RAND-36 score. De scores van deze vragenlijst kunnen wijzen in de richting van veranderingen in biologische systemen. Van de top 5 differentieel gemethyleerde gebieden [zie ‘resultaten’] vermelden we de volgende. ATP6V0E2 is een isoform van de H+-ATPase V0 e subunit (belangrijk is voor cellulaire energie [ATPases pompen protonen (H+) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types]), LOC401431 codeert de het anti-sense RNA voor ATP6V0E2 (suggererend dat de regulering-dynamiek van dit gen beïnvloed zou kunnen zijn bij M.E./CVS), IL6R codeert voor de IL-6 receptor (een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]) en LOC144571 is het anti-sense RNA [inaktiveert het mRNA] voor alfa-2-macroglobuline (een protease-inhibitor en cytokine-transporter). De lage ‘Physical Health’ scores bij de M.E./CVS-patiënten suggereren dat de lichamelijke stoornissen bij M.E./CVS geassocieerd zijn met een epigenetisch onevenwicht qua cellulaire energie, metabolisme en immuun-signalisering.

Besluiten

We rapporteren hier DNA-methylatie verschillen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, waarvan sommige significant geassocieerd waren met de globale levenskwaliteit alsook met glucocorticoïden-hypersensitiviteit in een subgroep M.E./CVS-patiënten. We bepaalden epigenetische loci geassocieerd met verschillen in glucocorticoïden-sensitiviteit die de onderliggende M.E./CVS-pathologie van sommige patiënten kan weerspiegelen. Er is bijkomend werk vereist om de mogelijke mechanistische verbanden tussen DNA-methylatie in deze genen, gen-expressie en proteïne-profielen, en M.E./CVS-fenotype te bevestigen. Er zijn longitudinale studies (zowel in vivo als in vitro) nodig om de stabiliteit te bepalen van deze epigenetische modificaties, inclusief veranderingen qua symptoom-profielen en in respons op behandeling met glucocorticoïden. Bv.: cytokines zoals IL-10 & IFN-gamma, die differentieel gemethyleerd bleken in onze studie, staan bekend om hun interaktie met GR en vertonen expressie-verschillen in vitro na dexamethason-behandeling [Visser J, Graffelman W, Blauw B, Haspels I, Lentjes E, de Kloet ER, Nagelkerken L. LPS-induced IL-10 production in whole blood cultures from Chronic Fatigue Syndrome patients is increased but supersensitive to inhibition by dexamethasone. J Neuroimmunol. (2001) 119: 343-9]. Hoewel GR-densiteit en binding-affiniteit in PBMCs van M.E./CVS niet lijken te verschillen qua ‘steady-state’ [evenwicht-toestand] condities, staat GR bekend om z’n upregulering tijdens inspanning bij M.E./CVS [Meyer JD, Light AR, Shukla SK, Clevidence D, Yale S, Stegner AJ, Cook DB. Post-exertion malaise in Chronic Fatigue Syndrome: symptoms and gene expression. Fatigue (2013) 1: 190-204]. Toekomstig werk zou DNA-methylatie signaturen moeten onderzoeken tijdens inspanning bij M.E./CVS om de dynamiek van glucocorticoïden-signalisering beter te kunnen begrijpen. Niettemin kunnen de differentieel gemethyleerde sites die in deze studie werden geïdentificeerd op z’n minst belangrijk zijn als biomerkers voor toekomstige klinische testen om te bepalen of epigenetische wijzigingen in deze genen verband houden met ziekte-aanvang of -progressie.

De resultaten van deze studie onderlijnen het potentieel nut van immuuncel-subtypering binnen de M.E./CVS-populatie en geven aan dat epigenetische gegevens kunnen helpen bij het ophelderen van relevante biologische mechanismen die bij M.E./CVS beïnvloed zijn. Klinisch onderzoek naar de regulering van het cellulair metabolisme is nodig om deze mogelijkheid te beoordelen, aangezien we vonden dat genen zoals GSTM1, MYO3B, GSTM5 & ATP6V0E2 significante epigenetische modificaties vertoonden bij M.E./CVS. Een beter begrip van M.E./CVS-subtypes zal patiënten en artsen helpen de geschikte interventies te bepalen om symptomen te behandelen en de gezondheid te verbeteren.

december 3, 2016

Differentiële expressie van mitochondriale proteïnen bij CVS

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 8:25 am
Tags: , , , , , , ,

Een artikel dat voor zichzelf spreekt… Er worden hier 2 proteïnen (betrokken bij de cellulaire energie-produktie) aangeduid die (in combinatie) een diagnostische merker zouden kunnen zijn voor M.E.(cvs).

Over aconitase (aconitaat-hydratase; omzetting van citraat naar isocitraat in de TCA-cyclus) werd ook al gesproken in onze stukken ‘Inspanning-geïnduceerde mitochondriale dysfunktie’ & ‘Dysfunktie van de TCA- & de ureum-cyclus bij CVS’…

Er werd tevens afwijkende expressie van ACON en ATPB in het speeksel gevonden. Dit zou een afname bij een eventuele test veel makkelijker maken.

Lees ook ‘Metabole kenmerken van M.E.(cvs)’ & ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’.

————————-

Transl Psychiatry. (2016) 6: e904

Bottom-up proteomics suggests an association between differential expression of mitochondrial proteins and Chronic Fatigue Syndrome

Ciregia F1, Kollipara L2, Giusti L1, Zahedi RP2, Giacomelli C3, Mazzoni MR1, Giannaccini G1, Scarpellini P4, Urbani A5,6, Sickmann A2,7,8, Lucacchini A1, Bazzichi L3

1Department of Pharmacy, University of Pisa, Pisa, Italy

2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften-ISAS, Dortmund, Germany

3Division of Rheumatology, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

4Division of Psychiatry, Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, Pisa, Italy

5Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica, Rome, Italy

6Proteomics and Metabonomics Unit, IRCCS-Fondazione Santa Lucia, Rome, Italy

7Department of Chemistry, College of Physical Sciences, University of Aberdeen, Aberdeen, UK

8Medizinische Fakultät, Medizinische Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende en complexe aandoening die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verbetert door rust. Dysfunktie van de mitochondrieën is een research-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS. In eerder werk onderzochten we het proteoom-profiel in speeksel van een monozygote tweeling met en zonder CVS. Hierna analyseerden we mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. We gebruikten een gesofisticeerde techniek (nano-LC-MS) om de mitochondrieën uit bloedplaatjes te bestuderen. Daarna selekteerden we 3 proteïnen die waren gevalideerd d.m.v. ‘western blot’ analyse bij een grote groep individuen (n = 45 CVS; n = 45 gezond), in het speeksel. De gekozen proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). De resultaten voor ATPB & ACON bevestigden hun upregulering bij CVS. De MDHM-verandering werd echter niet bevestigd. Daarna beslisten we, gezien de grote variabiliteit qua klinische kenmerken van CVS-patiënten, de expressie van onze proteïnen te analyseren na opsplitsing van de patiënten volgens klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger bij de groep patiënten die klinische kenmerken vertoonden die gelijkaardig waren met de zieke tweeling-helft. We besluiten dat deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de criteria zou kunnen zijn die in rekening kunnen worden gebracht bij het helpen stellen van de diagnose. Bovendien zou de identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kunnen helpen bij het werpen van een licht op de complexe aandoening CVS. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van aangepaste behandelingen.

Inleiding

[…] De moeilijkheden bij het definiëren van CVS, door het gebrek aan diagnostische merkers, maakt epidemiologische studies ingewikkeld. […] Tot nu toe blijft de etiologie van CVS onduidelijk; waarschijnlijk is het een heterogene aandoening die kan worden verklaard via een multi-factorieel model waar genetische, infektueuze, neuro-endocriene en psychologische factoren samenkomen. […]

Een ander onderzoek-gebied met een waarschijnlijk verband met CVS is een gebrekkige mitochondriale funktie. Studies betreffende het metabolisme bij CVS suggereren onregelmatigheden qua energie-metabolisme en oxidatieve stress. [Armstrong CW, McGregor NR et al. Metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. Adv Clin Chem (2014) 66: 121-172; zie ook referenties onze inleiding] Er wordt in het bijzonder steeds meer erkend dat mitochondriale dysfunkties aan de basis van CVS kunnen liggen [Booth NE, Myhill S, McLaren-Howard J]; bovendien is vermoeidheid een prominent symptoom bij patiënten met mitochondriale ziekte. Dit is een aantrekkelijke hypothese, aangezien een metabole wijziging op mitochondriaal niveau een energie-deficiëntie met zich mee kan brengen en de uitzonderlijke vermoeidheid verklaren.

Er werd dikwijls gesuggereerd dat een genetische voorbestemdheid aan de basis van CVS kan liggen; daarom voorziet het bestuderen van tweelingen de best gematchte controles. Zodoende onderzochten we in eerder werk het proteoom-profiel in van een monozygote tweeling, waarvan één met en één zonder CVS. [Ciregia F et al. A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the Chronic Fatigue Syndrome: a focus on potential salivary biomarkers. J Transl Med (2013) 11: 243] Onze resultaten beklemtoonden de betrokkenheid van de inflammatoire respons bij de pathogenese van CVS. Na de bemoedigende resultaten verkregen via deze preliminaire studie, wilden we meer kennis verwerven betreffende mechanismen bij CVS via het analyseren van mitochondriale proteïnen bij dezelfde tweeling. De verwachting was dat onze bevindingen bewijs zouden kunnen leveren voor een mitochondriale rol bij de pathogenese van CVS.

Met dit doel isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes. Dit zijn circulerende bloedcellen die essentieel zijn voor de hemostase [preventie van bloedverlies] en coagulatie [bloedstolling] maar ook voor de aangeboren en adaptieve immuniteit. Bloedplaatjes hebben funktioneel aktieve mitochondrieën, waarvan de betrokkenheid bij de cel-fysiologie en bij pathologische aandoeningen werden aangetoond. De beoordelingen van de mitochondriale funktie in bloedplaatjes bieden meerdere voordelen voor diagnostische doeleinden: hun overvloed in het perifeer bloed, het betrekkelijk gemak om ze te verkrijgen, hun beperkte complexiteit, het aanzienlijk aantal mitochondrieën in de bloedplaatjes en de mogelijkheid voor herhaalde metingen bij elke patient.

Bloedplaatjes werden reeds aangewend bij onderzoeken naar de mitochondriale betrokkenheid bij enkele aandoeningen, bv. sepsis, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze studies bleven echter beperkt tot analyse van het mitochondriaal DNA en elektron-transfer aktiviteiten, terwijl er geen onderzoek werd verricht naar de totale proteïnen-inhoud van de mitochondrieën. Daarom analyseerden we de mitochondrieën uit bloedplaatjes via ‘nano-liquid chromatography electrospray-ionization mass-spectrometry’ (nano-LC-MS [ultra-geavanceerde scheiding- en detektie-methoden]) bij hetzelfde tweeling-paar als in de eerdere studie. Daarna werden de meest beloftevolle biomerkers gevalideerd via ‘western blot’ [WB] analyse [Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.] bij een grote groep patiënten, gebruikmakend van speeksel, dat op een niet-invasieve, eenvoudige, veilige en stress-vrije manier kan worden gecollecteerd en die makkelijk toepasbaar is bij grote groepen individuen.

Gezien de heterogeniteit van de ziekte was het doel biomerkers te suggereren om gevallen van CVS te stratificeren, eerder dan het selekteren van enkele biomerkers voor de identificatie van CVS. Dit kan helpen de behandeling op maat van de patient te snijden.

Materialen & methodes

Studie-ontwerp

Deze studie werd opgedeeld in 3 verschillende stappen. De eerste ‘ontdekking’-fase was gericht op het karakteriseren van het mitochondriaal proteoom-profiel van een CVS-patient in vergelijking met z’n gezonde monozygote tweeling-helft. Dit doel werd bereikt d.m.v. een proteoom-benadering (nano-LC-MS). De tweede ‘verkennende’ fase was gericht op het onderzoeken van de veranderende proteïnen (Ingenuity Pathway Analysis – IPA [software om expressie-profielen te analyseren]). Dit platform laat toe de mogelijke interakties te visualiseren tussen de geïdentificeerde biomerker-signaturen in mitochondrieën, wat ons helpt enkele kandidaten te selekteren voor de ‘validatie’-fase. De geselekteerde proteïnen werden eerst gezocht in het speeksel van de tweeling-broers en, eens de verschillen bevestigd werden, werd de validatie verbreed naar een groter aantal patiënten en controles. Tenslotte hebben we onze analyse versterkt door te kijken naar klinische gegevens, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers correleren met de klinische parameters van de patiënten. Dit leidt ons tot de identificatie van mitochondriale proteïnen die bruikbaar zijn bij het subtyperen van CVS-patiënten.

Patiënten

[…] 45 CVS-patiënten (gemiddelde leeftijd 38,6 ± 11,9 jaar); 45 gezonde controles (36,4 ± 10,9) 25 vrouwen, 20 mannen […]. De patiënten werden geklassificeerd op basis van de criteria volgens Fukuda et al. […] De individuen vulden de ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) in […]. Vermoeidheid werd ook beoordeeld d.m.v. de ‘Functional Assessment of Chronic Illness Therapy-Fatigue Scale’ (FACIT). […] Om de individuen beter te klassificeren, werden de volgende parameters geëvalueerd: anti-nucleaire antilichamen, ‘extraheerbare nucleaire antigenen’ [ENA] antilichamen [voor auto-immuunziekten], reumatoïde factor & anti-cardiolipine antilichamen (immunologische parameters); cortisol en adrenocorticotroop hormoon, serotonine, groei-hormoon, IGF-1 & vitamine-D3 (hormoon-profiel); tumor necrose factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, interleukine (IL)-6, IL-10, IL-2, IL-8 & IL-1b (cytokine-profiel).

Speeksel-stalen

[…]

Bloedplaatjes & aanrijking mitochondrieën

[…]

Kwantificatie op basis van LC-MS

[…]

LC-MS stalen

[…]

LC-MS analyse

[…]

Analyse van signalisering-mechanismen

[…] Alle proteïnen met differentiële expressie gelijk aan of meer dan 2 maal (CVS t.o.v. controle) werden opgenomen voor de bio-informatische analyse, om de molekulaire funkties te identificeren die het sterkt geassocieerd waren met de proteïnen-lijst.

WB voor validatie

Om de expressie-veranderingen in speeksel te valideren, gebruikten we ‘western blot’ analyse. De geselekteerde proteïnen waren: aconitaat-hydratase (ACON), ATP-synthase subunit-beta (ATPB) en malaat-dehydrogenase (MDHM). […]

[…]

Statistische analyse

[…]

Klinische correlaties

[…]

Resultaten

Proteoom-analyse

Om het profiel op te maken van de mitochondriale proteïnen bij CVS, isoleerden we mitochondrieën uit bloedplaatjes van hetzelfde tweeling-koppel met en zonder CVS dat eerder werd onderzocht. Om de kwaliteit te evalueren van de geïsoleerde mitochondrieën gebruikten we enzymatische testen en WB-analyse: de mitochondriale aanrijking was bevredigend. We verkregen een mitochondriale fractie van 450 μg proteïnen startend van ca. 5×109 bloedplaatjes. Met als doel de grens van reproduceerbaarheid van het mitochondriaal preparaat te overwinnen, werden de experimenten in 3-voud uitgevoerd. De mitochondrieën die werden verkregen uit elk van de 3 experimenten werden samengevoegd en geanalyseerd in drievoud.

De proteïnen-samenstelling van de mitochondrieën werd geanalyseerd via nano-LC-MS en er werd een differentiële analyse tussen de CVS-patient en z’n gezonde broer uitgevoerd. Globaal identificeerden we 1.007 proteïnen […]. Van die 1.007 gedetekteerde proteïnen waren er 194 mitochondriale proteïnen significant gemodificeerd bij CVS. Van deze 194 proteïnen waren er 41 met een variatie bij CVS t.o.v. controle groter dan 2,0: 34 waren ge-upreguleerd bij CVS en 7 waren ge-downreguleerd. […] Deze 41 proteïnen werden opgenomen in de IPA. Van elk geïdentificeerd proteïne werd het overéénkomstig gen in de IPA kennis-databank gezocht.

We gebruikten IPA om de gekende funkties van elk proteïne terug te vinden. Aangezien één proteïne meerder funkties kan hebben, selekteerden we de funkties met de hoogste statistische significantie. De eerste 3 hoogst-gerangschikte biologische funkties waren: metabolisme van isocitraat, metabolisme van NADH & metabolisme van nucleïnezuur-componenten of afgeleiden. […] Voor de validatie selekteerden we een proteïne uit elke categorie op basis van de hoeveelheid variatie en de P-waarde [indicatie voor de statistische significantie] van proteïnen uit de proteoom-analyse.

Expressie van biomerkers in speeksel

We selekteerden 3 mitochondriale proteïnen voor de validatie via WS – ACON, ATPB & MDHM. We beoordeelden eerst of hun variatie bij CVS t.o.v. controle bevestigd werd via de WS van de tweelingbroers. De upregulering bij CVS werd via WB bekrachtigd voor al de proteïnen. ACON, ATPB & MDHM vertoonden een toename van 3,1, 1,5 & 4,7. […]

Vervolgens gingen we over tot de analyse van deze proteïnen in een ruime groep CVS-patiënten (n = 45) en gezonde individuen (n = 45). We begonnen met een globale analyse van de expressie van deze proteïnen in het speeksel om dan verder te gaan met het onderzoek van verschillende CVS-subtypes. De veranderingen voor ACON & ATPB waren consistent met de resultaten van de nano-LC-MS, maar niet voor MDHM.

Dan klassificeerden we patiënten volgens hun klinische kenmerken (vragenlijsten): FACIT, FIQ, VAS-pijn, VAS-vermoeidheid & VAS-slaap. De CVS-patiënten werden in 2 groepen gesplitst met als referentie de tweeling-helft met CVS: een groep met de klinische kenmerken waarvan de waarden overéénkwamen met (of groter dan) die van de zieke tweeling-helft (groep A) en de tweede met de patiënten met lagere waarden (groep B). De intensiteiten waren hoger voor elk van de 3 merkers in groep A t.o.v. groep B.

ROC-curves

Er werden ROC-curves [grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] berekend ter beoordeling van het klinisch potentieel van onze geselekteerde en gevalideerde proteïnen om CVS te onderscheiden van gezonde individuen (in speeksel). De AUCs [oppervlakte onder de curve; samenvattende maatstaf die in wezen het gemiddelde maakt van de diagnostische accuraatheid over het spectrum van de test-waarden] werden voor elk proteïne individueel berekend, om aan te tonen of elke merker apart dit onderscheid kan maken. ATPB & ACON bleken betere differentiërende biomerkers dan MDHM. ATPB: sensitiviteit 54% en specificiteit 78%; ACON: sensitiviteit 61% en specificiteit = 78%. Daarenboven onderzochten we via logistische regressie analyse of het onderscheidend vermogen van elke merker mogelijks verhoogd was door combinatie van meerdere merkers. Met deze doelstelling testten we alle verschillende combinaties om de beste combinatie van biomerkers te selekteren die bruikbaar is om mensen met CVS te onderscheiden van gezonde individuen. Zodoende vonden we dat het onderscheidend vermogen lichtjes steeg als ATPB werd gecombineerd met ACON. De sensitiviteit steeg tot 85% maar de specificiteit was 72%. Tenslotte berekenden we ook ROC-curves om te testen of de biomerkers patiënten en controles kunnen differentiëren volgens de klinische parameters – enkel FACIT gaf goeie resultaten. Wanneer we patiënten opsplitsen volgens FACIT, gaven ATPB en ACON ROC-curves (groep A versus controles) met een AUC van 0.780 en 0.722, respectievelijk, terwijl de gecombineerde ROC-curve een AUC had van 0.844 (sensitiviteit = 93%, specificiteit = 70%).

Klinische correlaties

Tenslotte bekeken we statistische correlaties voor de volgende klinische parameters: leeftijd, leeftijd bij aanvang, ziekte-duur en de hematochemische parameters (bv. TNF-α, IL-6, enz.). ACON correleerde negatief met IL-2 […]. ATPB correleerde positief met TNF-α & IFN-γ. […] MDHM correleerde ook met TNF-α […].

Bespreking

De ontdekking en validatie van meer objectieve merkers kunnen een belangrijke ondersteuning betekenen voor het stellen van de diagnose en behandeling van CVS. Aangezien bewijsmateriaal suggereert dat mitochondriale dysfunkties aan de grondslag liggen van CVS, analyseerden we mitochondriale proteïnen verkregen uit bloedplaatjes. Deze kwamen van een monozygoot tweeling-koppel met en zonder CVS. Nano-LC-MS markeerde de wijzigingen qua expressie van 41 proteïnen met een P < 0.05 en een vermenigvuldiging met meer dan 2. Voor de validatie selekteerden we hieruit 3 proteïnen van elk van de 3 meest significante ‘biologische funkties’ die met onze proteïnen geassocieerd bleken na IPA-analyse.

Deze 3 proteïnen waren: ACON (‘metabolisme van isocitraat’), MDHM (‘metabolisme van NADH’) en ATPB (‘metabolisme nucleïnezuur-componenten of afgeleiden’). De validatie van onze kandidaat proteïne-biomerkers werd beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die de detektie van proteïnen in speeksel-stalen toelaten.

Ondanks het feit dat deze studie slechts 2 individuen analyseerde, kunnen de verschillen qua proteïne-expressie gelinkt worden aan de ziekte, aangezien de tweeling slechts verschilde wat betreft de aanwezigheid van CVS. Op deze manier liet onze studie toe te focussen op enkele biomerkers die kunnen worden onderzocht bij een groter aantal patiënten om hun bruikbaarheid bij de diagnose van CVS te bevestigen. We beslisten speeksel van CVS-patiënten te onderzoeken (een niet-invasieve procedure). Hoewel speeksel een minder complex vocht is, werd bewezen dat het een beloftevol diagnostisch instrument is, dat de fysiologische werking van het lichaam weerspiegelt. Eerst was het aangewezen om te controleren of de significante toename van deze proteïnen bij CVS (t.o.v. de controle) kon worden geverifieerd in het speeksel van de tweeling-broers. We bevestigden de resultaten.

De analyse van de mechanismen markeerde het ‘metabolisme van NADH’ als één van de meest belangrijke biologische funkties betrokken bij CVS. De verhouding NAD+/NADH speelt een alomtegenwoordige rol bij het reguleren van de intracellulaire redox-status en vertegenwoordigt daardoor een funktie van de metabole toestand. Enkele studies suggereren dat NADH-concentraties significant lager liggen bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles. [Mikirova N et al. The assessment of the energy metabolism in patients with Chronic Fatigue Syndrome by serum fluorescence emission. Altern Ther Health Med (2012) 18: 36-40 /// Castro-Marrero J et al. Does oral coenzyme Q10 plus NADH supplementation improve fatigue and biochemical parameters in Chronic Fatigue Syndrome? Antioxid Redox Signal (2015) 22: 679-685 /// Castro-Marrero J et al. Effect of coenzyme-Q10 plus nicotinamide adenine dinucleotide supplementation on maximum heart rate after exercise testing in Chronic Fatigue Syndrome – a randomized, controlled, double-blind trial. Clin Nutr (2015) 35: 826-834] Het is waarschijnlijk dat de hoge waarden MDHM en isocitraat-dehydrogenase die worden gezien bij CVS een adaptieve verandering kunnen zijn voor deficiënties qua NADH dat, op z’n beurt, een cruciale rol speelt bij ATP-produktie in de mitochondrieën.

ATPB is de subunit-beta van ATP-synthase, het belangrijkste enzyme voor de aanmaak van ATP. Naast de toename van ATPB bij CVS, detekteerden we (d.m.v. nano-LC-MS) ook significante verhogingen van de subunit-alfa en -gamma (P = 0.005 & 0.001, respectievelijk). Moeheid en energie zijn nauw verbonden; daarom is een aantrekkelijke hypothese dat er een metabole dysfunktie is met als resultaat dat er niet genoeg energie wordt geproduceerd. In dit perspectief kan de toename worden verklaard als een poging om de ATP-produktie te verhogen. Er zijn inderdaad studies die suggereren dat daling qua mitochondriale ATP-synthese bij CVS-patiënten niet wordt veroorzaakt door een defekt in de enzyme-complexen die de oxidatieve fosforylatie katalyseren maar in een andere factor. [Vermeulen RC et al. Patients with Chronic Fatigue Syndrome performed worse than controls in a controlled repeated exercise study despite a normal oxidative phosphorylation capacity. J Transl Med (2010) 8: 93] Opdat ADP kan worden gerecycleerd en ATP naar het cytosol van de matrix kan gaan, is de uitwisseling van cytoplasmatisch ADP met mitochondriaal ATP via het binnenste membraan nodig. Deze funktie wordt voorzien door een translocator-proteïne. Consistent met ander werk is de expressie van mitochondriaal ADP/ATP-translocase [transporter-proteïnen die zorgen voor de uitwisseling van ADP in het cytosol en mitochondriaal ATP via het binnenste membraan] gewijzigd in onze studie: translocase-2 & -3 daalde [x 0,65 & x 0,80 t.o.v. controle] bij CVS (P = 0.009 & 0.002, respectievelijk).

Samen met ATPB lijkt ACON de meest beloftevolle biomerker. Dit is de mitochondriale vorm van aconitase, een enzyme dat de omzetting van citraat naar isocitraat katalyseert via cis-aconitaat in de TCA-cyclus. [inhibitie van dit enzyme vermindert de cellulaire energie-voorraad] ACON wordt courant gebruikt als een biomerker voor oxidatieve stress en werd gesuggereerd dienst te doen als een sensor voor de redox-status. Inderdaad: de reaktie tussen ACON en superoxide genereert vrije hydroxyl-radikalen. Het is waarschijnlijk dat de reaktie tussen superoxide en ACON de mitochondriale oxidatieve schade geassocieerd met de pathofysiologie van CVS kan versterken. De buitensporige produktie van ROS en stikstof-soorten wordt trouwens gewoonlijk in verband gebracht met CVS en we vonden een significante upregulering [x 2,2 t.o.v. controle] van superoxide-dismutase [SOD; enzyme dat zuurstof-radikalen ‘opruimt’] (P = 0.001).

Na de validatie in het speeksel van de tweeling, hebben we de validatie uitgebreid naar een grote groep CVS-patiënten. De resultaten voor ATPB & ACON bevestigen de upregulering bij CVS en hun klinisch potentieel om patiënten van controles te onderscheiden werd geëvalueerd. De ROC-curves gaven een goede specificiteit maar lage sensitiviteit aan. Als de biomerkers geombineerd werden, verkregen we een betere diagnose en de sensitiviteit verhoogde tot 85%, met een kleine daling qua specificiteit.

Anderzijds werd de gevonden MDHM-wijziging niet bevestigd in de grotere groep patiënten maar we konden een stijging zien wanneer we enkel de patiënten beschouwden met gelijkaardige of hogere klinische parameters dan de tweeling-helft met CVS. Deze bevinding bracht ons ertoe te bekijken of andere vermoedelijke biomerkers ook duidelijke CVS-subgroepen zouden kunnen afbakenen, gezien de grote variabiliteit van de klinische kenmerken van onze patiënten. Daarom hebben we onze analyse opgedreven door de klinische gegevens van dichterbij te bekijken, met als specifiek doel te onderzoeken hoe de biomerkers gelinkt zijn met de klinische kenmerken van de patiënten. We analyseerden de expressie van onze proteïnen na de patiënten te hebben opgesplitst volgens de klinische parameters. Voor elke merker waren de waarden hoger in de groep patiënten met klinische kenmerken die gelijkaardig waren met die van de zieke tweeling-helft. Het leek er op dat de toename qua expressie van deze proteïnen overéénkwam met een slechte patiënten-uitkomst.

Daarnaast gaf de combinatie van ATPB met ACON een sensitiviteit van 93% en specificiteit van 70% wanneer we de FACIT-waarden gebruikten van de patiënten die groter dan deze van de tweeling-helft met CVS.

Het valt op te merken dat CVS-patiënten met co-morbide bipolaire stoornis (en niet met andere psychiatrische co-morbiditeiten) een significante upregulering van de ATPB-expressie vertoonden (P = 0.03). In onze groep CVS-patiënten waren er slechts 8 met een co-morbide bipolaire aandoening; maar dit aspect verdient verder onderzoek gezien het feit dat een belemmerde mitochondriale funktie bij bipolaire patiënten werd besproken.

Tenslotte onderzochten we de correlatie van onze proteïnen met hematochemische parameters. Cytokine-abnormaliteiten zijn courant bij CVS maar de bevindingen zijn gemengd en er wordt geen individuele merker gebruikt als een objectieve biomerker voor de diagnose of het management van CVS. Het is opmerkenswaardig dat de toename van bij CVS positief correleerde met de stijging van IFN-γ & TNF-α. Immunologische ontregeling werd altijd voorgesteld als een significante component van CVS en CVS-patiënten hebben gewoonlijk hoge waarden pro-inflammatoire cytokinen, zoals IFN-γ & TNF-α. [Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2011) 9: 81 /// Klimas NG et al. Biomarkers for chronic fatigue. Brain Behav Immun (2012) 26: 1202-1210] Daarnaast was er een positieve correlatie van MDHM met TNF-α. Deze correlaties brengen ons iets bij, aangezien al deze variabelen als merkers kunnen worden beschouwd. Het is interessant aan te geven dat de ACON-waarden negatief correleerden met IL-2, in lijn met het feit dat de tweeling-helft met CVS lagere waarden van IL-2 had t.o.v. zijn gezonde tweeling-broer.

Besluit: deze resultaten suggereren dat onze potentiële merkers één van de te overwegen criteria kunnen zijn bij het helpen stellen van de diagnose. Daarenboven: zelfs als deze proteïnen niet noodzakelijk bruikbaar blijken voor een universele CVS-diagnose (gezien de enorme heterogeniteit van de ziekte), bieden ze een sterk potentieel om subsets te karakteriseren. De identificatie van biomerkers aanwezig bij bepaalde subgroepen CVS-patiënten kan helpen de complexe entiteit die CVS is, op te helderen. Verder kan het helpen bij het ontwikkelen van op maat gemaakte behandelingen. Op die manier zou dit werk kunnen bijdragen aan de gestage ontwikkeling van een duidelijker kader voor een ingewikkelde en genuanceerde ziekte zoals CVS.

april 1, 2016

MicroRNAs: Potentiële diagnostische biomerkers in NK-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 2:47 pm
Tags: , , , , , ,

Na het bestuderen van gen-expressie en SNPs bij M.E.(cvs) (‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’ / ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’), bekijkt Prof. Jonathan Kerr hier afwijkende gen-expressie van microRNAs in bloedcellen. Andere (Australische) onderzoekers bekeken dit al in het plasma (‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’) en zelfs in NK-cellen (‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’). Kerr et al. breiden dit laatste uit…

Eerst werd de miRNA gen-expressie geanalyseerd: 34 miRNAs bleken een afwijkende expressie te hebben. 4 konden via een andere techniek worden bevestigd. Daarna werd gekeken in welke immuun-cellen deze afwijkende gen-expressie voorkwam. Tenslotte werd nagegaan in welke effekten deze gewijzigde gen-expressie had bij NK-cellen. Er werden aanwijzingen gevonden voor een immuun-dysfunktie.

De lezer kan elders op deze paginas ook reeds één en ander bestuderen over bevindingen omtrent NK-cellen bij M.E.(cvs)…

 

“MicroRNA (of miRNA) hebben anders dan bv. mRNA (boodschapper-RNA, die een ‘positieve’ rol hebben bij het ontstaan van proteïnen) de neiging om mRNA-molekulen het ‘zwijgen’ op te leggen door ze te splitsen, ze te destabiliseren of er mee te interfereren. Ze bleken al betrokken bij verscheidene ziekten bij mensen (bv. een rol bij kanker) en bij het reguleren van de vorming van bloedcellen en het beïnvloeden van de immuniteit. Aangezien miRNAs ‘beschermd’ zijn en stabiel blijven in verscheidene lichaamsvochten en weefsels zijn ze erg in trek als mogelijke biomerkers (bij kanker maar ook epilepsie, malaria & Multipele Sclerose).” – Dr Neil Abbot; ‘ME Research UK’

————————-

PLoS One Vol 11, #3, e0150904 (maart 2016)

MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: Potential Diagnostic Biomarkers in Natural Killer (NK) Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome (CFS)/ Myalgic Encephalomyelitis (M.E.)

Robert D. Petty (1,2), Neil E. McCarthy (3), Rifca Le Dieu (2), Jonathan R. Kerr (1,4)

1 CFS Group, St George’s University of London, Cranmer Terrace, London, United Kingdom

2 Centre for Haemato-Oncology, Bart’s cancer institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

3 Centre for Immunobiology, The Blizzard institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

4 Grupo de Salud Publica, Escuela de Medicine y Ciencias de la Salud, Universidad del Rosario, Quinta de Mutis, Bogotá 111221, Colombia

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS/M.E.) is een complexe multisysteem ziekte met een onbekende etiologie die invaliderende symptomen veroorzaakt bij 1% van de globale bevolking. Hoewel een grote groep genen gewijzigde expressie bleek te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten, is het nog niet geweten microRNA (miRNA) molekulen die gen-translatie reguleren, bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. We hypothiseerden dat veranderingen qua microRNA-expressie in leukocyten van patiënten bijdragen tot de CVS/M.E.-pathogoloie, en daarom bruikbare diagnostische biomerkers kunnen zijn die kunnen worden gedetekteerd in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten.

Methodes miRNA-expressie in mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de Ambion Bioarray V1. miRNA die differentiële expressie bleken te vertonen werden gevalideerd d.m.v. qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] en daarna gerepliceerd in subgroepen bloed-leukocyten van een onafhankelijke patiënten-groep. De via deze experimenten geïdentificeerde, met CVS/M.E. geassocieerde miRNA werden dan getransfecteerd in primaire NK-cellen en er werden gen-expressie analyses uitgevoerd om hun gen-doelwitten te identificeren.

Resultaten Micro-array [‘gen-chips’] analyse identificeerde differentiële expressie van 34 miRNA, die allemaal ge-upreguleerd waren. Van 4 op de 34 miRNA werden expressie-wijzigingen bevestigd via qRT-PCR. Het fractioneren van PBMC-stalen (van een onafhankelijke patiënten-groep) in verschillende cel-types, identificeerde veranderingen qua miRNA-expressie in NK-cellen, B-cellen en monocyten waarbij de meest significante abnormaliteiten voorkwamen bij NK-cellen. Transfectie [inbrengen van DNA of RNA in cellen] van primaire NK-cellen met hsa-miR-99b of hsa-miR-330-3p, resulteerde in gen-expressie wijzigingen consistent met NK-cel aktivatie maar verminderde cytotoxiciteit, wat suggereert dat gebrekkige NK-cel funkie bijdraagt tot CVS/M.E.-pathologie.

Besluit Deze studie toont gewijzigde microRNA-expressie aan in de perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS/M.E.-patiënten, die potentiële diagnostische biomerkers zijn. De grootste miRNA-ontregeling werd geïdentificeerd in NK-cellen, met doelwitten die verband houden met cellulaire aktivatie en gewijzigde effector-funktie [een effector-cel pakt daadwerkelijk zijn doelwit-cel aan (herkenning en eliminatie)].

Inleiding

[…] Er is een echte klinische noodzaak om een diagnostische biomerker voor CVS/M.E. te identificeren. Een aantal studies hebben naar biomerkers voor CVS/M.E. gezocht in het mRNA [Frampton D, Kerr J et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD et al. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9] of serum [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76] van CVS/M.E.-patiënten, echter met beperkt succes. Research focust zich op het karakteriseren van immuniteit-defekten aangezien de aanvang van de symptomen dikwijls wordt voorafgegaan door een aanval op de immuniteit. Wijzigingen in populaties en aantallen leukocyten in het perifeer bloed van patiënten werden bevestigd. Onderzoek identificeerde significante immune ontregeling bij CVS/M.E.; met gewijzigde cytokine-expressie en vermindering van de dodende capaciteit van cytotoxische cellen als meest consistente bevinding. Veranderingen in mRNA-expressie in het perifeer bloed zijn goed gedocumenteerd bij CVS/M.E., met overwegend genen betrokken bij: immuun-funktie, apoptose, transcriptie, translatie en virus-infektie. mRNA gen-expressie studies waren ook succesvol bij het definiëren van CVS/M.E.-subtypes, elk met een afzonderlijk symptoom-profiel [Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84]. Een groep molekulen die een rol spelen bij het reguleren van de translatie van mRNA en die nog systematisch dienen te worden onderzocht in bloedcellen van CVS/M.E.-individuen zijn microRNAs (miRNAs).

miRNA zijn een groep kleine, niet-coderende RNAs (~23 nucleotiden) met als funktie het reguleren van de translatie van mRNA post-transcriptie via directe afbraak van mRNA-transcripten of onderdrukking van de translatie. miRNAs zijn cruciaal voor het behouden van een normale haematopoïese [vorming van bloedcellen] en als bemiddelaars bij immuun-signalisering cascades, wat hun nut als biomerkers voor deze ziekte suggereert.

In deze studie screenden we bloedstalen van patiënten met een vastgestelde klinische diagnose van CVS/M.E. t.o.v. gematchte gezonde controles, en identificeerden we ontregeling van miRNAs die funkties hebben overéénkomend met gepubliceerde veranderingen qua mRNA-expressie bij CVS/M.E. Om te bepalen in welk cel-type deze miRNA-expressie veranderingen optreden, werd de ontregeling bevestigd in gefractioneerde perifere bloedcellen van een onafhankelijke patiënten-groep. De expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p in ‘natural killer’ cellen vertoonde de meeste over-expressie. In NK-cellen bleken deze (door miRNA beïvloedde) genen betrokken bij aktivatie, effector-funktie, actine-cytoskeleton [actine is een proteïne, onderdeel van het cytoskelet dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren in cellen, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en beweeglijkheid. Dit werk is ondersteuning en uitbreiding van de concepten van immuniteit-ontregeling bij CVS/M.E. en identificeert vermeende biomerkers voor ziekte-diagnose.

Resultaten

34 miRNA met verhoogde expressie in CVS/M.E. perifeer bloed

Om miRNA met differentiële expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werd RNA gehaald uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en gescreend m.b.v. Ambion Bioarray micro-arrays (385 miRNA-sequenties). 15 stalen van CVS/M.E.-individuen (Fukuda diagnostische criteria) en 30 van voor leeftijd en geslacht gematchte controles werden geanalyseerd. Een vergelijking identificeerde 34 miRNAs met differentiële expressie (verandering > 1,5 maal) […].

Ongecontroleerde cluster-analyse van de micro-array gegevens groepeerde de stalen in 2 clusters. Deze analyse kon de CVS/M.E.- en controle-stalen niet volledig in afzonderlijke clusters opdelen. Ongeveer de helft van de controle-stalen (n = 14) en 4 CVS/M.E.-stalen vormen een groep met lage globale miRNA-expressie. De overblijvende controles clusterden met de meerderheid van de CVS/M.E.-individuen, die hogere miRNA-expressie bij de meerderheid van de geanalyseerde miRNAs vertoonden. Het niveau van homogeniteit tussen de stalen is hoog (gemiddelde correlatie-coëfficient of 0.922 +/- 0.068), wat kan bijdragen tot de onvolledige klassificatie van de stalen.

Onderzoek van deze gegevens per miRNA toonde de deugdelijkheid van de expressie-gegevens […]. We bekeken de correlatie tussen miRNA gen-expressie gegevens en scores van klinische vragenlijsten (5 vragenlijsten over algemene gezondheid) maar vonden er echter geen. Deze gegevens tonen aan dat miRNAs ontregeld waren in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten en dat de waarden van deze miRNAs onafhankelijk waren van de symptoom-ernst.

Significante upregulering van de microRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E.-bloedstalen

De veranderingen qua miRNA-expressie van 29 op 34 miRNAs werden in hetzelfde staal gevalideerd in d.m.v. Taqman kwantitatieve PCR. 5 miRNAs (ambi-miR-7058, hsa-miR-331, mmu-miR-140-AS, mmu-miR-409, rno-miR-151-AS) werden niet opgenomen aangezien de testen niet beschikbaar waren. 4 op 29 miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-30c & hsa-miR-126) vertoonden significante differentiële expressie (≥ 1,5 maal, CVS vs. Controle, p ≤ 0.05 […]).

4 miRNAs hebben het potentieel als doeltreffende biomerkers bij CVS/M.E. op basis van ROC-analyse

Om te weten te komen of de 4 met differentiële expressie bevestigde miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) zouden kunnen dienen als biomerkers bij de diagnose van CVS/M.E., werd ‘Receiver Operating Characteristics’ (ROC) [statistische analyse waarbij men in een grafiek de gevoeligheid (sensitiviteit) in funktie van de specificiteit uitzet; gebruikt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] uitgevoerd voor elke relatieve hoeveelheid van elk miRNA. Deze statistiek beschrijft de mogelijkheid van een variabele om een bepaald staal te klassificeren in 2 groepen en werd eerder al gebruikt om serum-biomerkers bij CVS/M.E.te definiëren. […] De 4 geteste miRNAs vertoonden statistische significante verschillen t.o.v. het de hypothese van toevalligheid. Hsa-miR-330-3p werd via deze analyse geïdentificeerd als de variabele die ‘t meest waarschijnlijk CVS/M.E.-patiënten van controles differentieert […]. Deze gegevens tonen aan dat (binnen de grenzen van deze studie) deze 4 miRNAs diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. zouden kunnen zijn.

Hsa-miR-99b is significant ge-upreguleerd in NK-cellen van in CVS/M.E.-patiënten

Om te onderzoeken of de miRNA-veranderingen gezien in vol-bloed stalen specifiek waren voor een bepaalde PBMC-populatie, werden 20 patiënten en 20 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde vrijwilligers gerecruteerd (dezelfde klinische diagnostische criteria als de eerdere studie). Er werden bloedstalen genomen en PBMCs geïsoleerd. De cellen werden gefractioneerd via positieve selektie op basis van CD14+ (monocyten), CD19+ (B-cellen), CD56+ (NK-cellen) en CD3+ (T-cellen) microparels. Flow-cytometrie van de gefractioneerde populaties gaf een zuiverheid aan van 96,9% (+/- 2,1%) voor monocyten, 88,9% (+/- 7,6% SD) voor NK-cellen, 84,4% (+/- 8,8%) voor B-cellen en 91,2% (+/- 5,3%) voor T-cellen. Absolute cel-tellingen na fractionatie kon geen statistisch significante verschillen aantonen tussen de populatie-groepen voor de 4 onderzochte leukocyt-subgroepen.

De 4 miRNAs waarvan differentiële expressie werd bevestigd – via array & qRT-PCR – (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) werden onderzocht in RNA uit deze 4 belangrijkste bloed-leukocyten populaties. 3 van de geteste miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-126 & hsa-miR-330-3p) vertoonden significante ge-upreguleerde expressie in één of meer PBMC-subsets bij de CVS/M.E.-populatie. Hsa-miR-30c vertoonde geen significant expressie-verschil. het grootste verschil in expressie was de expressie van hsamiR-99b in NK-cellen (2-voudige toename in CVS/M.E.-stalen). Dit miRNA was ook 1,6 maal ge-upreguleerd in B-cellen maar niet gewijzigd in T-cellen en monocyten. Hsa-miR-330-3p was ook significant ge-upreguleerd in NK-cellen maar in veel mindere mate (1,3-voudige toename). Hsa-miR-126 was 1,45-voudig ge-upreguleerd in monocyten in de CVS/M.E.-groep. Deze gegevens toonden dat de ontregeling van miRNAs bij CVS/M.E. specifiek is per leukocyten-populatie en suggereren dat de dysfunktie van B-cellen, NK-cellen en monocyten bijdragen tot de ziekte-pathologie.

Hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p reguleren mechanismen die bijdragen tot NK-cel aktivatie en effector-funktie

Om de gen-doelwitten van hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p in NK-cellen identificeren, werd precursor miRNA [enkelstrengige (ss) miRNAs komen van ‘pri-miRNAs’; de twee strengen worden enzymatisch gesplitst, resulterend in voorloper miRNA of ‘pre-miRNA’] getransfecteerd in NK-cellen (die werden geïsoleerd uit PBMCs). De NK-cel zuiverheid na de aanrijking was 89,6% (bepaald via flow-cytometrie).

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-99b identificeerde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle [mRNA dat leidt tot een afgebroken, onvolledig, niet-funktioneel proteïne]) 37 genen met differentiële expressie (volgens de inclusie-criteria; p ≤ 0.05, verandering ≥ 1,5 maal). 21 genen vertoonden downregulering tussen 1,5 en 1,8 maal. 16 genen vertoonden verhoogde expressie tussen 1,5 en 2,6 maal. Interferon-gamma (IFN-γ), een belangrijke mediator van NK-cel aktivatie, was het sterkst geïnduceerde gen (2,6 maal). Granzyme-B (GZMB), dat codeert voor een component van de cytotoxische granules die door NK-cellen worden afgegeven na herkenning van doelwit-cellen, was 1,6 maal meer geïnduceerd. Genen betrokken bij cellulaire aktivatie, vesikel-vorming [vesikels = kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], beweeglijkheid en modulatie van het actine-cytoskeleton waren ook ge-upreguleerd […]. Cathepsine-L (CTSL) [enzyme betrokken bij proteïne-afbraak] was het meest ge-downreguleerde gen door hsa-miR-99b. Dit proteïne is vereist voor splitsing en aktivatie van perforine & granzyme-B in de lytische vesikels [bevatten cel-afbrekende stoffen]. CD6 & IL-8 (interleukine-8) waren ook ge-downreguleerd (1,6 & 1,5 maal, respectievelijk). Verminderde expressie van deze genen is geassocieerd met NK-cel rijping na aktivatie. Er werd ook verminderde expressie geïdentificeerd bij genen betrokken bij autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten] en bepaalde signalisering-mechanismen […].

Om te bepalen of de genen die worden gereguleerd door hsa-miR-99b konden worden gegroepeerd in een specifieke funktionele klasse, voerden we een ‘over-representatie analyse’ uit [bekijkt de eventuele aanrijking van bepaalde mechanismen, molekulaire funkties en biologische processen]: dit identificeerde een significante aanrijking voor genen betrokken bij processen en mechanismen van de NK-cel funktie, inclusief cel-aktivatie, immuunsysteem-processen en cellulaire respons op een stimulus.

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-330-3p leverde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle) slechts 2 wijzigingen op: voor SOD2 [codeert voor mitochondriaal superoxide-dismutase-2] en MMP9 [codeert voor matrix-metallopeptidase 9] -expressie; ze waren allebei 1,6 maal gedownreguleerd. SOD2-expressie verstoort de normale T-cel differentiatie en cellulaire aktivatie, en verminderde expressie is geassocieerd met verstoorde neutrofiel effector-funktie. MMP9 reguleert NK-cel cytotoxiciteit en lymfocyten-beweeglijkheid.

Deze resultaten toonden aan dat verhoogde miRNAs expressie in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten gen-expressie wijzigingen bevordert die consistent zijn met cellulaire aktivatie maar verminderde effector-funktie.

Bespreking

De klinische diagnose van CVS/M.E. is gebaseerd op goed omschreven klinische criteria maar de diagnose omvat echter ook de uitsluiting van andere oorzaken voor vermoeidheid, wat kan leiden tot een langere diagnose-tijd. Zodoende is er een echte klinische noodzaak om diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. te identificeren. We wilden de rol van miRNA bij patiënten met een vastgestelde diagnose of CVS/M.E. bestuderen, om te bepalen of deze regulerende molekulen bijdragen tot de ziekte-pathogenese en of het kandidaat diagnostische biomerkers zijn.

We identificeerden over-expressie van 34 miRNA die niet eerder werden beschreven bij CVS/M.E. [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One (2014) 9: e102783; zie ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’ /// Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9; zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?] in stalen perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten. De micro-array analyse groepeert op een robuste manier de miRNAs met gecoördineerde expressie (hsa-miR-107 & hsa-miR-103) en levert zeer homogene resultaten. Wat gemeenschappelijk is met andere CVS/M.E.-studies is dat gen-expressie het miRNA-profiel CVS/M.E.-patiënten niet van controles onderscheidde Een studie van Brenu et al. [zie eerder] analyseerde plasma-stalen van CVS/M.E.-patiënten en identificeerde ontregeling van 19 menselijke miRNAs. Van deze 19, zaten er slechts 12 in onze array. Daarvan waren er 8 met een verschil van ≥ 1,5 maal (CVS/M.E. vs. normaal) maar allemaal met insignificante p-waarden; die werden niet verder onderzocht. Het feit dat de 2 studies niet overéénstemmen is niet verrassend, aangezien cellulaire en plasma miRNA-profielen van hetzelfde individu beperkt overlappen. Er werd voorgesteld dat deze beperkte overlap het resultaat is van het feit dat miRNAs opgeslagen zijn in vesikels die worden gesecreteerd met verschillende doeltreffendheid, of van de variabele stabiliteit van de verschillende miRNAs in het extracellulair milieu. De CVS/M.E.-populatie vertoonde een brede waaier aan klinische symptoom scores wijzend op subgroepen van de ziekte, die ook elders worden beschreven en kunnen bijdragen tot het niet volledig onderscheiden van de stalen in deze analyse. Deze observatie kan ook de slechte correlatie tussen klinische symptoom score en miRNA-expressie verklaren, en suggereert dat validatie in een meer uitgebreide patiënten-groep wenselijk is.

Bevestiging van de array-bevindingen d.m.v. qRT-PCR ondersteunde de upregulering van hsa-miR- 99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E. PBMCs. De mate van overéénkomst tussen de 2 methodes is bescheiden wat betreft het vergelijken van mRNA-expressie studies bij CVS/M.E. Er werd gesuggereerd dat deze discrepantie ten dele te wijten is aan de verschillen in methodologie: veranderingen onder +/- 2 maal en lagere transcriptie zouden kunnen gelinkt zijn met een slechtere overéénstemming tussen de methodes. Dit onderstreept een consistent probleem bij miRNA-studies aangezien de ‘cut-off’ die gewoonlijk wordt gehanteerd voor miRNA gen-expressie experimenten een verandering van 1,5 maal is, wat kan leiden tot uitsluiting van positieve gegevens.

De miRNAs met verhoogde expressie bij CVS/M.E. zouden mogelijks kunnen dienen als biomerkers voor de ziekte, die dan kunnen worden gebruikt om de diagnose te verbeteren en te bespoedigen. Dit werd eerder al geprobeerd in een aantal studies die potentiële biomerkers in het serum, cytokine-expressie, dipeptidyl-peptidase-4 (CD26) [Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817; zie ‘Natural Killer Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?] en lymfocyten gen-expressie [Steinau M, Unger ER et al. Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. J Mol Med (2004) 82: 750-5 /// Light AR et al. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS] identificeerden. Om te bepalen of de 4 ge-upreguleerde miRNAs geschikte merkers zijn om CVS/M.E.-individuen te onderscheiden van een gematchte controle-groep, werd een ROC-analyse uitgevoerd. Deze toonde aan dat alle 4 de merkers patiënten van controles konden onderscheiden, met een specificiteit vergelijkbaar met die van gepubliceerde studies. Deze miRNAs zouden specifiek voor CVS/M.E.-patiënten kunnen zijn […]. Validering bij grotere geblindeerde groepen patiënten is echter nodig vooraleer de diagnostische buikbaarheid van de in deze studie geïdentificeerde miRNAs volledig kan worden benut.

Lymfocyten uit perifeer bloed werden reeds intensief onderzocht bij CVS/M.E.-patiënten en dit identificeerde wijzigingen qua cytokine-secretie, en veranderingen in cellulaire populaties en aktiviteit [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]. De cellulaire mechanismen en processen die worden gereguleerd door miRNAs zijn dikwijls cel-specifiek. Om te proberen de leucocyten-populatie die bijdraagt tot gewijzigde miRNA-expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werden de 4 miRNAs met verhoogde expressie gekwantificeerd in PBMC-fracties van een nieuwe patiënten-groep. Hsa-miR-126 vertoonde verhoogde expressie in monocyten. Hoewel er tot op heden nog geen specifiek defekt in monocyten-aktiviteit werd aangetoond bij CVS/M.E., bleek hsamiR-126 CRK-proteïne expressie te downreguleren. Dit proteïne inhibeert cel-invasie en -migratie en bleek proliferatie in dendritische cellen te controleren, wat suggereert dat verhoogde monocyten-aktiviteit gemedieerd door miRNA kan bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E.

Hsa-miR-330-3p & hsa-miR-99b wijzen op verhoogde expressie in B-cel en NK-cel populaties. Deze miRNAs bleken geassocieerd met kanker, endometriose, beslissingen aangaande het lot van cellen en angiogenese. Hsa-miR-99b bleek gericht te zijn op componenten van NF-κB, mTOR en AKT signalisering-mechanismen. mTOR signalisering is cruciaal voor normale proliferatie, cytotoxische en cytokine-effector funkties in gezonde NK-cellen, en normale BCR (B-cel receptor) signalisering en proliferatie in B-cellen. Verhoogde hsa-miR-99b expressie die mTOR reguleert, ondersteunt de vermindering qua effector-funktie die wordt geobserveerd in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten die wordt gerapporteerd in de literatuur, en ondersteunt de ontregeling van genen betrokken bij B-cel rijping en ontwikkeling die werd geïdentificeerd via gen-expressie studies [Vernon SD, Broderick G et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct. (2008) 4: 44; zie ‘Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS]. Hsa-miR-330-3p bleek cellulaire beweeglijkheid te reguleren […] in prostaatkanker-celllen en proliferatie […] bij colorectale kanker.

Hsa-miR-30c vertoont geen veranderde expressie in de cellulaire fracties: dit suggereert dat de geobserveerde over-expressie in de oorspronkelijke PBMC-groep wellicht specifiek is voor die groep. Dit toont de noodzaak aan voor validering van de bevindingen bij afzonderlijke niet-gerelateerde groepen of patiënten.

Om de effekten van de gewijzigde miRNA-expressie geïdentificeerd bij CVS/M.E op cellulair mRNA te bestuderen, verkozen we transfectie van de miRNAs met de grootste over expressie (hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p) in gezonde NK-cellen (het meest consistent geïdentificeerd als zijnde funktioneel verstoord bij CVS/M.E.-patiënten). Interferon-gamma (IFN-γ) vertoonde de grootste expressie-wijziging in respons op introductie van hsa-miR-99b: een toename qua expressie van 2,6 maal. Dit gen codeert voor een cytokine gesecreteerd door NK-cellen met een cruciale rol in anti-virale, anti-tumor en immuun-regulerende effekten gecombineerd met het bevorderen van NK-cel aktiviteit. Meting van IFN-γ gaf in een aantal CVS/M.E.-studies variabele resultaten. Er werd verhoogd mRNA in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten aangetoond, ondersteund door een verhoging qua circulerende IFN-γ secreterende CD3 CD56+ NK-cellen beschreven bij CVS/M.E.-patiënten [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42; zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Plasma-concentraties van IFN-γ bleven echter onveranderd bij 40 vrouwelijke CVS/M.E.-patiënten t.o.v. gematchte controles [Fletcher MA et al. Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2009) 7: 96; zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS].

Eén consistente bevinding bij CVS/M.E.-patiënten is de vermindering qua cytotoxische aktiviteit van NK-cellen, dikwijls geassocieerd met een verandering qua niveau van componenten van cytotoxische granules – granzyme & perforine. In deze studie was Granzyme-B (GZMB) significant ge-upreguleerd door hsa-miR-99b, wat een versterkte cytotoxische capaciteit suggereert. CTSL (Cathepsine-L) vertoonde echter de grootste downregulering door hsa-miR-99b. Dit enzyme is nodig voor het verwerken (van precursor tot aktieve vormen) van componenten uit lytische granules (granzyme & perforine), wat een verklaring suggereert voor het verhoogd GZMB mRNA – dat hier en in de literatuur wordt gemeld – leidend tot verminderde effector-funktie. Dit mechanisme suggereert een opéénstapeling van precursor-proteïnen voor GZMB en perforine in lytische vesikels met verminderde cytotoxische werking, wat wordt ondersteund door gegevens die gedaalde NK-cel cytotoxiciteit identificeerden bij CVS/M.E.-patiënten zonder een geassocieerde verstoring van de degranulatie. Over-expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p induceerde een gen-expressie patroon dat consistent is met NK-cel aktivatie verhogende IFN-γ expressie en genen betrokken bij cellulaire beweeglijkheid, vesikel-vorming en modulatie van het actine-cytoskeleton (KLRF1, STOM, S100A4, FEZ1, ARPC3 & TPM3P5). Er werd gepostuleerd dat geaktiveerde NK-cellen in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten het resultaat kunnen zijn van een onvolledig verdwijnen van virale infektie, wat de meest geciteerde trigger is als aanvang van CVS/M.E.-symptomen. Deze gegevens tonen ook een molekulaire basis voor de vermindering qua NK-cytotoxiciteit, die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten, gemedieerd door miRNA, via directe downregulering van enzymen die vereist zijn voor het verwerken van componenten van cytotoxische vesikels, en downregulering van genen in autofagie-, WNT- en AKT-mechanismen [bepaalde signaal-traansductie mechanismen] (ULK1, ATG2A, PMEPA1, DKK3, PDCD4) vereist voor normale proliferatie en rijping van geaktiveerde NK-cellen. Bijkomende validering van de proteïne-doelwitten die worden gereguleerd door de geïdentificeerde miRNAs is wenselijk om de miRNA-gemedieerde NK-cel dysfunktie bij in CVS/M.E. volledig te definiëren.

De voorgestelde gegevens identificeren ontregeling van miRNA-expressie in cellen van het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten, bevestigd in 2 patiënten-groepen, in PBMCs en cellulaire subgroepen, en identificeert 4 mogelijke diagnostische biomerkers. ‘Natural killer’ cellen vertoonden de grootste veranderingen qua miRNA-expressie met upregulering van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p. Deze bevindingen zijn funktioneel consistent met het begrip van de pathogenese van CVS/M.E. Het werk dat hier wordt gepresenteerd levert nieuw bewijsmateriaal voor een gewijzigde NK-cel aktivatie-mechanisme bij CVS/M.E. waarbij hsa-miR-99b is betrokken en suggereert een mechanisme voor de verminderde effector-funktie die wordt gezien bij CVS/M.E., wat eerder nog niet werd aangetoond.

juli 25, 2015

Genetische evaluatie van met immuniteit & inflammatie gerelateerde genen bij CVS

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 8:12 am
Tags: , , , , , , , ,

We hebben het op deze pagina’s al meermaals over SNPs bij M.E.(cvs) gehad. Een onderzoek-groep van het CDC heeft bekeken of patiënten meer van dergelijke variaties in genen betrokken bij immuniteit/inflammatie hadden dan normaal. Dergelijke polymorfismen zijn dikwijls niet zeldzaam (10-30%) maar het punt is dat ze niet onder de courante vorm voorkomen. Tot nu toe waren slechts enkele immuniteit-genen bekeken maar in deze studie werd een chip gebruikt die 11.000 SNPs in 1000 genen van 38 immune sub-mechanismen kan bepalen. De gen-polymorfismen die werden gevonden bleken niet verspreid te liggen in genen over het immuunsysteem maar waren geclusterd.

Het CDC-team categoriseerde de polymorfismen volgens type. Niet-synonieme: gen-wijzigingen die zorgen voor een veranderde vorm van het proteïne (3 genen waarvan 2 die een rol spelen bij het complement-systeem). Synonieme: waarbij het proteïne niet verandert (4 gen-varianten die ongewoon courant of zeldzaam waren bij M.E.(cvs); 2 daarvan behorend tot complement-pad). Genen in de onvertaalde gebieden (‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie (2 genen van de complement-cascade). SNPs in de intronische gebieden (intron = DNA-sequentie in een gen die niet codeert voor het eiwit): beïnvloeden ook de gen-expressie. Daarnaast keken ze nog naar 6 extra gen-varianten van het complement-pad en ze vonden afwijkingen in hun voorkomen (ongebruikelijk hoog of laag) bij M.E.(cvs).

Het complement-systeem is een onderdeel van de aangeboren immuun-respons dat antilichamen en fagocyterende cellen ‘complementeert’ (aanvult) in de strijd tegen pathogenen. Het bestaat uit een 30-tal proteïnen. Bij een invasie van een pathogen of inflammatie worden deze proteïnen gesplitst door enzymen (proteasen), wat aanleiding geeft tot de afgifte van cytokinen. Polymorfismen in complement-genen bleken eerder al gelinkt met meerdere aandoeningen…

In 2003 hebben Bristol Sorensen en medewerkers al getoond dat M.E.(cvs)-patiënten 6h na inspanning een significante verhoging van het complement splitsing-produkt C4a vertoonden. Een team van het CDC (toen nog met Suzanne Vernon) bevestigde in 2005 dat complement-aktivatie één van de door inspanning geïnduceerde verschillen was tussen M.E.(cvs) en controles (zie ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS’). Samen stelden ze dat complement-aktivatie een merker kan zijn voor met M.E.(cvs) geassocieerde post-exertionele malaise (zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’).

Het CDC zette dus dit werk verder en deze studie hier toonde weer een verband tussen M.E.(cvs) en SNPs in o.a. het complement-aktivatie mechanisme. Het complement-systeem blijkt dus een belangrijke rol te spelen bij de aandoening, wat een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij M.E.(cvs) verder ondersteunt. Hopelijk volgen er nog studies om dit verder uit te klaren en de effekten van inspanning op complement gen-expressie en concentraties in het bloed te onderzoeken. Dit zou een immune oorzaak voor post-exertionele malaise kunnen aantonen.

————————-

Hum Immunol. 2015 Jun [pre-print]

Pathway-focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome

Rajeevan MS, Dimulescu I, Murray J, Falkenberg VR, Unger ER

Division of High-Consequence Pathogens & Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

Samenvatting

Er is bewijsmateriaal dat suggereert dat immuniteit- en inflammatoire wijzigingen belangrijk zijn bij Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS). Deze studie werd uitgevoerd om het verband van funktioneel belangrijke genetische varianten in inflammatie- en immune mechanismen bij CVS te exploreren. Er werd DNA uit perifeer bloed geïsoleerd van 50 CVS- en 121 niet-vermoeide (NF) controle-deelnemers in een populatie-studie. Er werd genotypering uitgevoerd met de Affymetrix Immuniteit en Inflammatie Chip die 11.000 ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) omvat. De accuraatheid van de genotypering voor de specifieke genen werd gevalideerd via pyrosequentiebepaling. Er werd Golden Helix SVS software gebruikt voor de genetische analyse. […] CVS bleek geassocieerd met 32 funktioneel belangrijke SNPs: 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 ‘untranslated regulatory region’ (UTR) varianten en 6 intron-varianten. Enkele van deze SNPs bevonden zich in genen van mechanismen gerelateerd met de complement-cascade (SERPINA5, CFB, CFH, MASP1 & C6), chemokinen (CXCL16, CCR4, CCL27), cytokine-signalisering (IL18, IL17B, IL2RB) en ‘toll-like’ receptor signalisering (TIRAP, IRAK4). Van bijzonder belang is de associatie van CVS met 2 mis-sense varianten in genen va de complement-aktivatie: rs4151667 in CFB en rs1061170 in CFH. Een 5’-UTR polymorfisme (rs11214105) in IL-18 was ook geassocieerd met lichamelijke vermoeidheid, lichaam-pijn en de score voor CVS-definiërende symptomen. Deze studie identificeerde nieuwe verbanden tussen CVS en genetische varianten in mechanismen, waaronder complement-aktivatie, wat bijkomende ondersteuning biedt voor een gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

1. Inleiding

[…] Inflammatoire merkers bleken geassocieerd met specifieke symptomen die gemeenschappelijk zijn voor CVS; chronische vermoeidheid, hartslag-variabiliteit, slaap-kwaliteit, cognitieve problemen en post-exertionele malaise. Er werden wijzigingen in cytokine-profielen gesuggereerd als biomerkers voor CVS. Polymorfismen met een impact op gen-funktie, direct of via interaktie met andere risico-factoren, dragen bij tot de genetische vatbaarheid voor CVS. Er werd slechts een klein aantal polymorfismen in enkele genen betrokken bij immune en inflammatoire respons bestudeerd. De Affymetrix Menselijke Immuniteit en Inflammatie Chip werd ontwikkeld om systematische genetische evaluatie van of immuniteit- en inflammatie-mechanismen te een vergemakkelijken. We gebruikten dit platform om de genetica van de immune en inflammatoire respons bij CVS te onderzoeken.

2. Materialen en methodes

2.1. Individuen

[…] De deelnemers […] werden als CVS geklassificeerd als ze voldeden aan de internationale research-definitie (1994). […] Individuen die niet aan de criteria voor CVS voldeden, werden geklassificeerd als niet-vermoeide (NF) controles. De groep omvatte […] 121 NF-controles en 50 CVS-patiënten. […]

2.2. Multiplex Affymetrix genotypering

[…]

2.3. Genotypering d.m.v. pyrosequentiebepaling

[…]

2.4. Data-analyse en bio-informatica

[…]

3. Resultaten

3.1. Demografie van de deelnemers opgenomen in deze analyse

[…] De mediane tijd sinds aanvang van de vermoeidheid voor de CVS-deelnemers was 8,97 jaar (0,39-40,2 jaar) en 82,2% vertoonde een gradueel begin van de ziekte. […]

3.2. Mogelijke funktionele SNPs geassocieerd met CVS

De resultaten identificeerden 427 SNPs geassocieerd met CVS op allel-niveau en 405 op genotype-niveau. De 38 SNPs met een mogelijke funktionele betekenis […] werden samen met 14 van hun nabijgelegen SNPs die niet op de Affymetrix chip zaten, gegenotypeerd via ‘pyrosequencing’ [moderne vorm van sequentie-bepaling]. […] 32 van de 38 SNPs en 10 van de 14 proxy SNPs waren significant geassocieerd met CVS. De 32 funktionele SNPs werden gegroepeerd […]: niet-synonieme varianten (11 SNPs), synonieme variants (4 SNPs), gelegen in de ‘untranslated regulatory regions’ (UTR) van genen (11 SNPs) of intronische (6 SNPs). […]

[uitleg in de bespreking]

3.3. C2/CFB en CFH allelen, en haplotypes geassocieerd met CVS

[uitleg in de bespreking]

3.4. SNPs geassocieerd met kwantitatieve metingen van CVS

[uitleg in de bespreking]

4. Bespreking

Deze studie identificeerde meerdere eerdere niet erkende genetische associaties met CVS die het waard zijn verder te worden bestudeerd voor validering. Wanneer ze worden gevalideerd, zullen deze associaties de hypothese dat immuniteit- en inflammatie-mechanismen betrokken zijn bij CVS ondersteunen. Vele van de SNPs geassocieerd met CVS zijn gelegen in genen die betrokken zijn bij complement-aktivatie, chemokinen en cytokinen, en ‘toll-like’ receptor (TLR) signalisering. De bevindingen aangaande het complement-systeem zijn van bijzonder belang, aangezien er een rol voor complement-aktivatie bij CVS werd gesuggereerd door een melding over een geval en eerdere gen-expressie en proteoom-studies. Uit een rapport over één chronisch vermoeide patient bleek dat de waarden van de complement splitsing-produkten verhoogd waren maar dat de CVS-symptomen verbeterden binnen 2 maand na of normalisering van de splitsing-produkten. Gen-expressie studies duiden op differentiële expressie van het complement-proteïne MASP2, wat bijdraagt tot het C4a splitsing-produkt bij CVS na inspanning [Sorensen B et al. Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J. Allergy Clin. Immunol. (2003) 112: 397-403 /// Sorensen B, Jones JF, Vernon SD, Rajeevan MS. Transcriptional control of complement-activation in an exercise-model of Chronic Fatigue Syndrome. Mol. Med. (2009) 15: 34-42; zie ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS]. Complement-proteïnen in het cerebrospinaal vocht van individuen met CVS bleken verhoogd vergeleken met gezonde controles [zie ‘Verschillende proteomen in ruggemergvocht bij CVS & Lyme].

Het complement-systeem speelt belangrijke rollen bij de verdediging van de gastheer tegen infektie, coördineert gebeurtenissen tijdens inflammatie, en vormt een brug tussen aangeboren en adaptieve immuun-responsen. Complement-aktivatie wordt geïnitieerd via 3 sub-mechanismen (klassiek, alternatief en lectine-mechanisme), die allemaal leiden tot de vorming van C3-convertase [enzyme] dat nodig is voor de splitsing van C3. CFH [complement-factor H] en CFB [complement-factor B] spelen een centrale maar tegengestelde rol bij het alternatief mechanisme. CFB aktiveert de complement-cascade via zijn bijdrage tot de vorming van C3-convertase en CFH inhibeert hetzelfde mechanisme via het versnellen van de afbraak van C3-convertase. C2 lijkt op CFB, maar draagt bij tot de vorming van C3-convertase via het klassiek mechanisme.

Interessant is dat van 2 met CVS geassocieerde mis-sense varianten [coderend voor een verkeerd aminozuur] in genen van de complement-aktivatie – rs4151667 in CFB & rs1061170 in CFH – een associatie met ‘age-related macular degeneration’ [AMD; een oog-aandoening] was gevonden. Het SNP rs9332739 in C2 […] – waarvan ook een associatie met AMD werd gerapporteerd – was ook geassocieerd met CVS in onze studie; het risico en de beschermende varianten waren echter omgewisseld (m.a.w. de allelen die beschermen tegen AMD waren geassocieerd met het risico op CVS). Een rapport gaf aan dat beschermende allelen (van CFH & CFB) voor AMD verband houden met lagere waarden qua complement-aktivatie. Aangezien dezelfde allelen geassocieerd zijn met het risico op CVS in deze studie, stellen we als hypothese dat lagere complement-aktivatie geassocieerd kan zijn met te minste een subgroep CVS-individuen.

Bij ons weten is dit de eerste studie die CVS in verband brengt met met polymorfismen in chemokine-liganden/receptoren, molekulen die leukocyten-bewegingen reguleren. Eén van de sterkste associaties was met de synonieme risico-variant rs2228428 die mogelijks ‘splicing’ [Tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.] reguleert in CCR4, een chemokine-receptor waarvan is gemeld dat die tot expressie komt op Th2 en Treg cellen. Er werden ook associaties gevonden met varianten in CXCL16 [chemokine (C-X-C motief) ligand 16], een lid van de CXC-familie der chemokinen. rs1051007 in het 3’UTR van CXCL16, waarvan werd gerapporteerd dat het een impact heeft op zijn gen-expressie, was geassocieerd met het risico op CVS, terwijl een mis-sense polymorfisme (rs2277680) in CXCL16 geassocieerd was met bescherming. Deze resultaten suggereren dat verdere studies van CCR4 en CXCL16 bij CVS gerechtvaardigd zijn.

Studies hebben gerapporteerd over het feit dat enkele polymorfismen in cytokinen geassocieerd zijn met CVS [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma-874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24: 179-182; zie ook ‘Circadiaans ritme voor cytokine-secretie]. Deze SNPs werden niet opgenomen in de ‘Affymetrix Human Immune and Inflammation Chip’ die we gebruikten. We identificeerden echter bijkomende cytokine-polymorfismen, nl. rs11214105 in IL-18, een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend] dat door perforine [enzyme dat vrijkomt wanneer cellen worden aangevallen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen en dat porieën boort in het membraan van te vernietigen cellen] gemedieerde T-cel en NK-cel cytotoxiciteit versterkt. IL-18 bleek ook bij te dragen tot de ontwikkeling en de pathogenese van infektueuze en neuro-inflammatoire ziekten met immuniteit- en cognitieve dyfunktie [Alzheimer’s, hepatitis-C virus infektie]. Dieren-studies linkten IL-18 aan ziekten met geslacht-specifieke prevalentie en ingewikkelde, regionale en geslacht-specifieke ouderlijke effekten in de hersenen. We vonden dat dit IL18-polymorfisme geassocieerd is met CVS en kwantitatieve metingen van de CVS-symptomen: lichaam-pijn, fysieke vermoeidheid, symptoom-scores en aantal CVS-symptomen. Onze resultaten suggereren bijkomend onderzoek naar IL-18 als een kandidaat-gen bij CVS-pathofysiologie.

Meerdere met CVS geassocieerde 3’UTR-polymorfismen verdienen verdere analyse aangezien ze een impact kunnen hebben op binding-plaatsen voor microRNAs [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)] die nog niet werden onderzocht bij CVS. Hoewel de impact van deze SNPs op microRNA-binding nog experimenteel dient te worden geverifieerd, suggereren onze resultaten een mechanisme voor microRNA-regulering van genen geassocieerd met CVS. Sommige van de microRNAs die worden beïnvloed door met CVS geassocieerde SNPs zijn gelinkt met in IL17B & en SERPINA5 [‘serpin peptidase inhibitor clade A member 5’]. Een mis-sense variant in SERPINA5 (rs6115) was ook geassocieerd met CVS. Aangezien deze SERPINA5-varianten niet in ‘linkage disequilibrium’ zijn [Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.], kunnen ze een onafhankelijk risico op CVS betekenen. SERPINA5, een inhibitor van geaktiveerd proteïne-C [APC is in staat om, samen met proteïne-S de stolling te stoppen], is gelegen op chromosoom 4 met andere leden van de serpent protease-familie – inclusief corticosteroid-bindend globuline (SERPINA6), waarvan werd gerapporteerd dat het verband houdt met CVS [Torpy DJ et al. Association between Chronic Fatigue Syndrome and the corticosteroid-binding globulin gene ALA SER224 polymorphism. Endocr. Res. (2004) 30:417-29]. De met CVS geassocieerde intron-variant rs11257804 in CAMK1D is van belang. CAMK1D is een proteïne-kinase in het calcium-signalisering mechanisme. Het speelt een belangrijke rol bij de werking van granulocyten en heeft weinig of geen expressie in monocyten en lymfocyten. Dit suggereert dat een verdere verkenning van de granulocyten-funktie en gastheer-verdediging bij CVS gerechtvaardigd is.

De beperkte grootte van de groep, samen met het ontbreken van een correctie voor multipele testen is de belangrijkste beperking van deze verkennende studie. [Complexe uitleg hoe hier werd aan verholpen…]

Onze studie identificeerde 11 mis-sense varianten, 4 synonieme varianten, 11 3’UTR- en 6 intron-varianten met mogelijke regulerende werking […]. De specificiteit van de associaties met CVS kon in deze studie niet worden bepaald aangezien er enkel werd vergeleken met niet-vermoeide controles. Het identificeren van met CVS geassocieerde abnormaliteiten in een ‘case-control’ studie is een belangrijke eerste stap bij het identificeren van kandidaat-genen en mechanismen die betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CFS.

Tot besluit: deze studie identificeerde meerdere nieuwe genetische verbanden tussen CVS en varianten in de complement-aktivatie, chemokinen, cytokinen en ‘toll-like’ receptor signalisering. Associaties met deze mechanismen leveren bijkomende ondersteuning voor een rol van gewijzigde aangeboren immuun-respons bij CVS. Er zijn bijkomende studies met grotere patiënten-groepen nodig om de bevindingen van deze verkennende studie te valideren.

juli 10, 2015

Gen-expressie factor analyse differentieert FM, CVS & depressie

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:21 am
Tags: , , , , , , , ,

Het echtpaar Light en hun medewerkers van de ‘ University of Utah’ hebben al heel wat onderzoek gericht naar gen-expressie patronen bij M.E.(cvs) (en fibromyalgie). Links naar hier reeds besproken artikels zijn terug te vinden in de tekst. Ze houden daarbij rekening met de geleverde inspanning en vergelijken hun resultaten ook bij groepen met andere aandoeningen (bv. kanker – zie ‘Piloot-studie gen-expressie bij kanker versus M.E.(cvs)’).

In onderstaande studie werd gekeken naar de effekten van de aanwezigheid van co-morbide aandoeningen (FM en depressie): er werd bepaald welke mechanismen deze aandoeningen al dan niet delen. Daartoe werd gekeken of bepaalde genen konden worden gegroepeerd in relevante biologische ‘factoren’ en of deze konden worden gelinkt aan een bepaalde diagnose.

Op basis van de resultaten besloot hun team dat gen-expressie die relevant is voor fibromyalgie, M.E.(cvs) en depressie kan ondergebracht worden in biologische ‘clusters’; en dat M.E.(cvs) en depressie geassocieerd zijn met dezelfde 2 clusters – waarbij M.E.(cvs) een verhoogde expressie vertoont terwijl depressie een verlaagd expressie-patroon voor deze genen heeft.

————————-

Arthritis Care & Research (Pre-print juni 2015)

Gene expression factor analysis to differentiate pathways linked to fibromyalgia, Chronic Fatigue Syndrome and depression in a diverse patient sample

Eli Iacob (1), Alan R. Light (2), Gary W. Donaldson (1), Akiko Okifuji (1), Ronald W. Hughen (2), Andrea T. White (3) & Kathleen C. Light (2)

1 Department of Anesthesiology Pain Research Centre, University of Utah, Salt Lake City, UT

2 Department of Anesthesiology, University of Utah, Salt Lake City, UT

3 Department of Exercise and Sport Science, University of Utah, USA, Salt Lake City, UT

Samenvatting

Doelstelling Bepalen of onafhankelijke kandidaat-genen gegroepeerd kunnen worden tot betekenisvolle biologische factoren en of deze factoren geassocieerd zijn met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en fibromyalgie (FMS) als men controleert voor co-morbide depressie, geslacht en leeftijd.

Methodes We bekeken de mRNA gen-expressie in leukocyten van 261 individuen: gezonde controles (n = 61), patiënten met enkel FMS (n = 15), enkel CVS (n = 33), co-morbide CVS & FMS (n = 79) en medicatie-resistente (n = 42) of medicatie-responsieve (n = 31) depressie. We gebruikten ‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) voor 34 kandidaat-genen om factor-scores te bepalen en regressie-analyse om te onderzoeken of deze factoren geassocieerd waren met specifieke diagnoses.

Resultaten EFA resulteerde in 4 onafhankelijke factoren met een minimale overlap van genen tussen de factoren, die 51% van de variantie kunnen verklaren. We labelden deze factoren op basis van funktie: 1) purinerge en cellulaire modulatoren; 2) neuronale groei en immuun-funktie; 3) nociceptie en stress-mediatoren; 4) energie en mitochondriale funktie. Regressie-analyse onthulde dat grotere expressie van factoren 1 & 3 positief geassocieerd was met CVS en negatief geassocieerd met depressie-graad (QIDS score), maar niet geassocieerd met FMS.

Besluit Expressie van kandidaat-genen kan gegroepeerd worden in betekenisvolle ‘clusters’, en CVS en depressie zijn geassocieerd met dezelfde 2 ‘clusters’ maar in omgekeerde richting – wanneer wordt gecontroleerd voor co-morbide FMS. Gezien het veel voorkomen van co-morbide ziekte en inter-relaties tussen biomerkers, zou EFA kunnen helpen om patiënten-subgroepen in deze populatie vast te leggen op basis van gen-expressie.

Inleiding

1-5 miljoen Amerikanen lijdt aan fibromyalgie-syndroom (FMS) en Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS). Beide aandoeningen zijn multi-symptoom syndromen met klachten zoals spier- en gewricht-pijn, vermoeidheid, slaapstoornissen en and stemming-problemen. Deze 2 syndromen komen dikwijls samen voor; bijna 70% van de individuen met FMS voldoen aan de criteria voor co-morbide CVS. Stemming-problemen komen ook samen voor met FMS en CVS: ca. 50% van de patiënten melden significante depressie.

Het is goed gedocumenteerd dat de aanwezigheid van depressie gepaard gaat met verergering van pijn, funktionele stoornissen, slechte slaap en slechte gezondheid in het algemeen. Hoewel er geen doorslaggevende oorzakelijke verbanden werden beschreven, is het zo dat patiënten met een geschiedenis van depressie later meer kans hebben op het ontwikkelen van chronische pijn en met vermoeidheid gerelateerde aandoeningen en, omgekeerd, degenen met [chronische] pijn hebben meer kans om een depressie te krijgen. Een nauw verband tussen CVS, FMS en depressie suggereert de aanwezigheid van gemeenschappelijke mechanismen die bijdragen tot deze aandoeningen. Ander bewijs suggereert echter dat FMS en CVS vergeleken met gezonde mensen perifere dysfunktie – wat betreft pijn, zenuw- en spier-vezels, immuun-merkers en mRNA gen-expressie patronen – vertonen, die niet volledig verklaard kunnen worden door depressie.

Leukocyten gen-expressie (mRNA) is een betrekkelijk niet-invasieve methode om de funktionele status van meerdere neurale en immune mechanismen gelijktijdig te bepalen in één enkel bloedstaal. Ons eerder werk gaf aan dat na matige inspanning, de ‘baseline’ gen-expressie is verhoogd bij CVS-patiënten en FMS voor één cytokine (IL-10), samen met zuur-detekterende (ASIC3), ‘transient vanilloid’ (TRPV1) en purinerge (P2RX4) ion-kanaal genen [Light AR, Bateman L, Jo D, Hughen RW, Vanhaitsma TA, White AT, et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and Fibromyalgia Syndrome. J Intern Med. (2012) 271: 64-81; zie ‘Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM /// Light AR, White AT, Hughen RW, Light KC. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS]. In dieren-modellen werd aangetoond dat dezelfde ASIC3, TRPV1 en P2RX4 receptoren samenwerken, differentieel geaktiveerd worden door metabolieten aan waarden die corresponderen met deze die worden opgewekt door vermoeiende vs. pijnlijke inspanning [Light AR, Hughen RW, Zhang J, Rainier J, Liu Z, Lee J. Dorsal root ganglion neurons innervating skeletal muscle respond to physiological combinations of protons, ATP and lactate mediated by ASIC, P2X and TRPV1. J Neurophysiol. (2008) 100: 1184-201; zie ‘Spier-metaboreceptoren]. Interessant is dat meerdere van deze genen die veranderd zijn bij CVS na inspanning ge-upreguleerd bleken bij depressieve mensen. Belangrijk: de meeste studies onderzochten de expressie van elk gen individueel in plaats van als gen-groepen, en bestudeerden CVS/FMS- of depressie-groepen afzonderlijk, waarbij de effekten van co-morbiditeit op gen-expressie werden genegeerd.

Onderzoek van gen-expressie geassocieerd met FMS, CVS en depressie kan ons helpen beter te begrijpen welke mechanismen deze aandoeningen gemeenschappelijk hebben. Er zijn veel kandidaat-genen maar het onderzoeken van een groot aantal genen is analytisch uitdagend en maakt de interpretatie van de resultaten lastig. Identificatie van coherente subgroepen genen zou moeten helpen leiden tot een beter begrip van de gen-expressies die een belangrijke kunnen spelen bij deze aandoeningen. In dit artikel stellen we een alternatieve strategie voor, gebruikmakend van ‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) gebaseerd op de premisse dat een set kandidaat-genen gegroepeerd kan worden in een veel eenvoudiger set ‘cluster’-factoren. We kunnen dan conventionele analyse toepassen op een klein aantal ‘super-variabelen’ in plaats van op een veel grotere set individuele genen met hoge variabiliteit. Onze studie probeerde 2 research-vragen te beantwoorden: 1) Kunnen kandidaat-genen onderverdeeld worden in betekenisvolle autonome ‘clusters’ d.m.v. factor-analyse? 2) Vertonen FMS, CVS en depressie-graad unieke of overlappende verbanden met specifieke gen-expressie ‘clusters’ of factoren als met controleert voor co-morbiditeiten?

Methodes

Deelnemers

Dit is een ‘cross-sectionele’ studie [analyse van gegevens van een populatie op één specifiek tijdstip] die leukocyten mRNA gen-expressie van meerdere overéénkomende ‘case-control’ studies onderzoekt. De deelnemers […] omvatten mannen en niet-zwangere vrouwen tussen 18 & 73 jaar oud: 33 individuen met CVS (‘Centre for Disease Control’ criteria, Fukuda 1994), 15 individuen met FMS (‘American College Rheumatology’ criteria, 1990), 79 met co-morbide CVS en FMS (beide criteria), 31 met medicatie-responsieve depressie (RESP; voorafgaande diagnose door arts, symptomen onder controle met medicatie), 42 met medicatie-resistente depressie (REF; voorafgaande diagnose door arts, in een depressieve toestand en niet reagerend op medicatie) en 61 gezonde controles zonder pijn, vermoeidheid of depressie. […] Exclusie-criteria omvatten aktieve virale of bovenste-luchtwegen infekties, chronische cardiovasculaire of long-aandoeningen, of andere chronische aandoeningen zoals bloedarmoede of kanker.

Bepalingen

[…] Depressie-graad: ‘Quick Inventory of Depression Symptomatology’ (QIDS) zelf-rapportering (gevalideerde vragenlijst met 16 items). Voor de deelnemers in de REF-groep: ‘Hamilton Rating Scale of Depression’ (HRSD)-24 […].

mRNA leukocyten gen-expressie

[…]

Statistische Methodes

[…]

Factor Analyse

‘Exploratory Factor Analysis’ (EFA) laat toe te onderzoeken hoe niet-gemeten latente variabelen (factoren), patronen van correlaties – die worden gevonden in de gemeten verbanden tussen genen – weergeven. [EFA is een statistische methode om de onderliggende struktuur van een relatief grote variabelen bloot te leggen. Het doel is de onderliggende verbanden tussen gemeten variabelen te identificeren.] De Pearson correlatie [meest gebruikte correlatie-coëfficiënt] onthulde dat veel van de 34 genen significante inter-correlaties vertonen. […] De factor-score determinatie-coëfficiënt, de theoretische correlatie tussen score en factor, geeft de betrouwbaarheid en validiteit aan van de scores. Coëfficiënten groter dan 0,9 duiden op een excellente overéénkomst. [hoge ‘loading’ = grote regressie-coëfficiënt van het gen op de factor]

Lineaire Regressie

Eénmaal dat de factoren bepaald waren via de EFA, gebruikten we multi-variate lineaire regressie om te bekijken of de factoren voorspeld konden worden door demografische/diagnostische variabelen (FMS-diagnose, CVS-diagnose, QIDS depressie-graad, leeftijd en geslacht). We voerden lineaire regressie analyse uit voor het volledig staal en het staal zonder de REF-groep. […] p < 0.05 significantie-level. Er dienen strengere criteria te worden gehanteerd wanneer een bevestigende FA wordt uitgevoerd.

Resultaten

Beschrijving van het staal

[…] Personen met CVS of FMS bleken ouder en voornamelijk vrouwen. Leeftijd en geslacht werden dus behouden als and co-variabelen. […]

Resultaten van de Verkennende Factor Analyse

[…] 4 factoren bleek optimaal voor een eenvoudige struktuur; […] minstens 4 genen per factor en een minimaal aantal genen met een hoge coëfficiënt voor meerdere factoren. […] 7 genen hadden hoge (> 0,4) coëfficiënten voor 2 factoren: HSPA2, PPARA [andere naam voor NR1C1, het proteïne is een transcriptie-factor en belangrijke regulator van het lipiden-metabolisme in de lever], SULT1A1, LTA, SIRT1, TRPV1 en TLR4. Er waren 3 genen zonder significante coëfficiënt (i.e. < 0,4), voor geen enkele factor: ADR2A [adrenerge receptor], OXTR [oxytocine-receptor], SPARC [coderen voor osteonectine; een glycoproteïne in beenderen dat calcium bindt].

Biologische Groepen op basis van de Factor Analyse

Factor 1 wordt voornamelijk gekenmerkt door genen betrokken bij purinerge and cellulaire modulator mechanismen inclusief purinerge ion-kanalen P2RX4 en P2RX7 (beiden geassocieerd met neuropathische pijn) alsook cellulaire/immune modulatoren NFKB1 [het proteïne NF-κB is een transcriptie-factor die wordt geaktiveerd door cytokinen, bakteriële/viral produkten, enz.], DBI [diazepam-bindende inhibitor; gen betrokken bij energie-regulering via lipiden-metabolisme, modulering van stemming via de GABA-A receptor en transcriptie van bijnier-steroïden], TNFA & IL10. Factor 2 wordt gekenmerkt door deze genen met hoge ‘loading’: glucocorticoid receptor NR3C1 [zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS], neureguline (NRG)-1 [neuregulinen zijn proteïnen met diverse funkties in de ontwikkeling van het CZS], chemokine-receptor CXCR4 [‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’: “CXCR4 is significant ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten maar dit is wellicht niet specifiek voor CVS.”], ‘amyloid precursor protein’ [APP; ge-upreguleerd in het cerebrospinaal vocht bij CVS-patiënten; zie: ‘CVS-gerelateerd proteoom in cerebrospinaal vocht] & Toll-Like receptor 4 (TLR4) [Toll-like receptoren’ = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren], die allemaal een rol hebben bij neuronale groei en immuun-funktie. Factor 2 deelt deze genen met hoge ‘loading’: SULT1A1 [coderend voor een enzyme betrokken bij de verwerking van hormonen, neurotransmitters, enz.], LTA [gen coderend voor lymfotoxine-α of Tumor Necrose Factor-β], SIRT1 [betrokken bij mitochondriale biogenese] & TLR4 met Factor 3, en HSPA2 [coderend voor ‘Heatshock-related’ 70 kDa proteïne-2] met Factor 4. Factor 3 wordt voornamelijk gekenmerkt door het ASIC3-TRPV1 complex [zie eerdere artikels Light et al.], de NR3C2 mineralocorticoid receptor en cytokinen LTA & IL6, en daarom klassificeerden we deze set bij nociceptie en stress-mediatoren. Factor 4 wordt gekenmerkt door een hoge ‘loading’ voor genen die belangrijk zijn voor mitochondriale funktie (HSPA2, NDUFS5, ATP5E & COX5B), en de purinerge receptoren P2RY1 & P2RY2 die reageren op metabolieten die worden gegenereerd door de mitochondriale machinerie en dus voorlopig geklassificeerd als behorende tot energie en mitochondriale funktie.

Verband tussen factoren en diagnostische kenmerken (lineaire regressie [β-coëfficiënten])

[…] De factor-score coëfficiënten waren allemaal hoger dan 0,95 – wat wijst op een uitstekende betrouwbaarheid en validiteit […].

[…]

Voor het volledig staal vonden dat Factor 1 een significante positief verband met CVS (β-coëfficiënt = 0.34, p = 0.03), leeftijd (β = 0.16, p < 0.01) en geslacht (β = 0.57, p < 0.01). vertoonde Zonder de REF-groep werden gelijkaardige of sterkere associaties gevonden voor CVS, leeftijd en geslacht met een negatief verband met QIDS [depressie-graad] (β = -0.23, p = 0.05). Factor 2 had enkel een negatieve associatie voor leeftijd (β= -0.20, p < 0.01) […]. Factor 3 vertoonde een negatief verband voor leeftijd (β = -0.27, p < 0.01). Zonder de REF-groep was er ook een positieve associatie voor CVS (β = 0.39, p = 0.02), negatieve associatie met QIDS (β = -0.27, p = 0.02) en negatief verband met leeftijd. Factor 4 vertoonde een negatieve associatie voor depressie-graad (β = -0.16, p = 0.01). Deze relatie verdween als de REF-groep werd weggelaten. […].

Anders dan wat verwacht werd, was FMS niet significant geassocieerd met om het even welke factor; noch voor het volledig staal, noch wanneer de REF-groep werd weggelaten.

Bespreking

Het is goed gedocumenteerd dat FMS en CVS dikwijls samen voorkomen, en co-morbide depressie is courant bij beide. Jammer genoeg heeft het wetenschappelijke onderzoek – ondanks de goed gedocumenteerde heterogeniteit onder de patiënten binnen deze ziekten – vertrouwd op eenvoudige groep-vergelijkingen tussen patiënten en gezonde controles waarbij co-morbiditeiten werden genegeerd. Gezien de schaarste aan studies die biologische factoren geassocieerd met co-morbiditeiten en patiënten-heterogeniteit identificeren, is het overwegen van deze factoren kritisch voor de vooruitgang van onze kennis over de pathofysiologie van deze aandoeningen.

De mRNA gen-expressie gerelateerd met FMS, CVS en depressie is complex. Deze aandoeningen zouden kunnen worden bestendigd door de expressie van een zeer grote aantallen genen, die bijna zeker interageren via ingewikkelde patronen die de diverse fenotypische co-morbiditeiten opleveren. De conventionele kandidaat-gen benadering beschouwt dergelijke genen als grotendeels onafhankelijk en in staat om individueel te moduleren. Zelfs met het betrekkelijk klein aantal van 34 kandidaat-genen, is totale onafhankelijkheid echter biologisch onaannemelijk en statistisch onmogelijk. De voornaamste doelstelling van deze verkennende studie was om een alternatieve strategie voor te stellen om te bekijken of kandidaat-genen van bloed-leukocyten gegroepeerd zouden kunnen worden in betekenisvolle biologische ‘clusters’ in een gemengde populatie van FMS, CVS, depressie en gezonde controles. De tweede doelstelling was om te zien of de factoren zouden samenlopen met diagnostische variabelen in deze populatie.

Er werd een gen-panel van 34 genen gebruikt dat elementen vertegenwoordigt van biologische mechanismen die eerder betrokken bleken bij pijn, vermoeidheid en depressie: ion-kanalen, mitochondriale funktie, immuniteit/inflammatie, monoamine receptoren [membraan-receptoren die bij stimulatie een cascade intracellulaire gebeurtenissen initiëren die cellulaire biochemische reakties begeleiden], transcriptie-factoren en cellulaire signalisering modulatoren. Door middel van EFA identificeerden we 4 onafhankelijke factoren die 51% variantie voor hun rekening nemen en we hebben deze geklassificeerd op basis van de belangrijkste van elke groep: Factor 1 (purinerge en immune modulatoren), Factor 2 (neuronale groei en immuun-funktie), Factor 3 (nociceptie en stress-mediatoren) & Factor 4 (energie en mitochondriale funktie). Het is niet verrassend dat genen van één familie, bv. deze coderend voor IL-10, IL-6, TNF-α en LTA, bij verschillende factoren opduiken. Dit houdt éénvoudigweg verband met het feit dat binnen de grotere klasse van immuun-merkers, bepaalde subsets gecorreleerd zijn met genen van andere families. We onderzochten dan of deze factor-scores geassocieerd waren met diagnostische variabelen van FMS & CVS, alsook depressie-graad. Daarom hebben we bij effektief analyses uitgevoerd op de 4 gen-expressie super-variabelen i.p.v. de 34 genen, wat het dus minder onderhevig aan toeval maakt. Op dit moment begrijpen we deze groeperingen dan misschien wel niet volledig en kunnen we enkel speculeren wat betreft hun mogelijke relaties en biologische betekenis. Hieronder bespreken we kort de biologische rationale voor elke factor en hoe deze factor geassocieerd kan zijn met klinische variabelen van onze regressie-resultaten.

Factor 1: purinerge en cellulaire immuun-modulatoren

De eerste factor wordt gekenmerkt door de purinerge ion-kanalen P2RX4 en P2RX7, en meerdere cellulaire/immune modulatoren inclusief TNFA, NFKB1, DBI en IL10. De P2-ligand kanalen worden geopend door ATP […]. Ze komen tot expressie in vele cel-types inclusief immune, microglia en gliale cellen, en spelen rollen in immuniteit- en inflammatie-mechanismen. Overzicht-artikels beschrijven de vele funktionele rollen die deze receptoren zouden kunnen spelen bij stemming-aandoeningen en pijn in dieren en mensen. Onder hun signalisering-doelwitten [genen] bevinden zich de transcriptie-factor NFKB1 en deze coderend voor cytokinen zoals TNF-α en IL-10. Deze bleken allemaal betrokken bij FMS, CVS en depressie. Onze resultaten suggereren een associatie tussen CVS en deze factor wanneer wordt gecontroleerd voor FMS en depressie-graad. Depressie-graad vertoonde een negatieve associatie in de kleinere groep zonder de medicatie-resistente depressie (REF) patiënten. Onze eerdere research aangaande gen-expressie na inspanning toonde geen verschillen voor CVS bij ‘baseline’. De huidige resultaten suggereren dat deze super-variabelen bijzonder belangrijk kunnen zijn voor CVS. Dit kan ook een argument zijn voor het feit dat CVS te differentiëren is van depressie, hoewel ze beide dysfunktionele kunnen vertonen; omdat hogere expressie gelinkt was met de aanwezigheid van CVS maar ook met een lagere depressie-graad. Bovendien: aangezien meerdere studies hebben aangetoond dat inspanning geassocieerd is met abnormale veranderingen in inflammatoire mechanismen, zou toekomstige research factor-scores moeten onderzoeken vóór en na inspanning [Nijs J et al. Altered immune-response to exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a systematic literature review. Exercise immunology review (2014) 20: 94-116].

Factor 2: neuronale groei en immuun-funktie

Factor 2 heeft positieve ‘loading’ voor genen die betrokken zijn bij neuronale groei en immuun-funktie. Vergeleken met Factor 1 – met immune cellulaire modulatoren zoals IL10 en NFKB1 – hebben de genen in deze groep rollen bij het controleren van deze modulatoren daardoor immuun-cel groei en funktie. In beide modellen met en zonder de REF-groep was er geen associatie tussen Factor 2 en CVS of FMS. Aangezien groeifactoren gewijzigd kunnen zijn na een aanval of uitdaging, zouden ‘baseline’ waarden geen verschillen kunnen vertonen, wat de nood aan meerdere metingen op verschillende tijdstippen beklemtoont.

Factor 3: nociceptie en stress-mediatoren

Factor 3 wordt gekenmerkt door positieve ‘loading’ voor het ion-kanaal receptor complex TRPV1-ASIC3 en de mineralocorticoïde receptor (MR) NR3C2. Zoals eerder beschreven, hebben deze receptoren belangrijke rollen bij de sensatie van pijn, inflammatie en vermoeidheid [Pollak KA et al. Exogenously applied muscle metabolites synergistically evoke sensations of muscle fatigue and pain in human subjects. Experimental physiology. 2014;99(2):368-80; ook het echtpaar Light werkte mee aan deze studie. Hier wordt gesuggereerd dat de combinatie van een ASIC-receptor en een P2X receptor vereist is voor het signaliseren van vermoeidheid en pijn.], en zijn ze geassocieerd met verergering van post-exertionele pijn en vermoeidheid bij CVS-patiënten. Ze kunnen ook een rol spelen bij depressie en angst. Het blokkeren van de MR kan pijn doen dalen in dieren-modellen en betrokken zijn bij pijn bij diabete neuropathie. Factor 3 heeft ook ‘loadings’ voor LTA en IL-6, inflammatoire cytokinen waarvan is geweten dat ze interageren met de TRPV1-, ASIC3- en MR-receptoren. Regressie-analyse suggereert dat de diagnose van CVS positief is geassocieerd met deze factor: er is een positieve trend in het volledig staal en een significant verband wanneer individuen met ernstige behandeling-resistente depressie niet worden uitgesloten. Verder is de QIDS-score negatief geassocieerd met deze factor maar slechts wanneer de REF-groep wordt uitgesloten. Gezien de rol voor deze receptoren bij pijn, vermoeidheid en depressie, suggereren deze resultaten dat CVS-patiënten dysfunktie in dit mechanisme (verhoogde expressie) vertonen en net zoals met de genen van Factor 1, is depressie gelinkt met een tegengestelde dysfunktie dan CVS in hetzelfde mechanisme (verminderde expressie).

Factor 4: energie en mitochondriale funktie

Factor 4 wordt gekenmerkt door genen betrokken bij energie en mitochondriale funktie. Deze verzameling genen was van groot belang gezien hun betrokkenheid bij spier-funktie en vermoeibaarheid bij FMS en CVS [Castro-Marrero J, Cordero MD, Saez-Francas N, Jimenez-Gutierrez C, Aguilar-Montilla FJ, Aliste L et al. Could mitochondrial dysfunction be a differentiating marker between Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia? Antioxidants & redox signaling. (2013) 19: 1855-60; zie ‘Mitochondriale dysfunktie – Differentiërende merker tussen CVS & FM?]. Studies hebben ook mitochondriale funktie gen-expressie onderzocht bij stemming-aandoeningen. Ondanks zijn mogelijk belang, bleek uit onze regressie-modellen dat Factor 4 ongerelateerd was met de diagnose van FMS of CVS, en enkel geassocieerd was met depressie als patiënten met ernstige behandeling-resistente depressie werden opgenomen. Eerder dan te besluiten dat deze factor niet ontregeld is bij CVS of FMS, suggereren we in plaats daarvan echter dat toekomstige studies expressie-wijzigingen moeten onderzoeken na een energie-verbruikende uitdaging zoals aanhoudende inspanning.

GLOBAAL ondersteunen de resultaten van de Factor Analyse het gebruik van EFA ter aflijning van een kleinere set super-variabelen gebruikmakend van gen-gen inter-correlaties van een groot aantal individuele genen. De huidige set kandidaat-genen werd gekozen op basis van eerdere literatuur die de betrokkenheid bij de aandoeningen documenteerde. […] De huidige regressie-resultaten suggereren eigenlijk dat ten minste bij ‘baseline’ de gen-expressie gerelateerd was met CVS en depressie-graad bij Factor 1 & 3, zonder verband met FMS voor enige factor. Daarom is het mogelijk dat deze genen meer verband houden met vermoeidheid dan met FMS-pijn, wat wordt ondersteund door sterkere wijzigingen na inspanning bij de CVS- maar niet de FMS-populatie. Toekomstige studies zouden de inclusie van andere interessante genen […] moeten overwegen. Bovendien: hoewel deze studie focuste op FMS-pijn en CVS-vermoeidheid, kunnen deze individuen ook pijn van andere oorsprong hebben. Het is mogelijk en waarschijnlijk dat gen-expressie factoren verschillend zullen zijn bij andere pijn-aandoeningen (artritis, lage-rug pijn, neuropathische pijn en kanker-pijn).

Onze studie omvatte het ganse spectrum: gezonde mensen, mensen met enkel depressie, met enkel FMS/CVS en co-morbide groepen. Dit is tegengesteld aan andere eerdere studies die deze aandoeningen vergeleken met niet-depressieve, niet-gemediceerde gezonde controles. Vergelijkingen tussen patiënten met chronische pijn/stemming-aandoeningen en gezonde controles zijn moeilijk te begrijpen omwille van de meerdere verstorende factoren. Het wegwerken van al die potentiële verstorende factoren is een moeilijke taak; toekomstige bevestigende analyse zou echter andere factoren die evenzeer belangrijk zijn (levensstijl, fitheid, obesitas, slaap-kwaliteit/kwantiteit en -aandoeningen, en medicatie) moeten opnemen; deze dragen allemaal bij tot de ernst van de ziekte en mogelijke wijzigingen qua gen-expressie.

Er zijn meerdere opmerkenswaardige beperkingen bij deze studie. Ten eerste: de data-set is ‘cross-sectioneel’ en vertegenwoordigt slechts één tijdstip. Er is research die suggereert dat individuen met CVS hun biologische verschillen in vergelijking met controles vertonen na een experimentele belasting. Daarom is het niet verrassend dat individuen minder verschillen vertonen (FMS, CVS en depressie t.o.v. controles) bij ‘baseline’. Het is kritisch dat toekomstige studies deze factoren onderzoeken na een experimentele belasting of behandeling (waarvan is geweten dat ze de symptomen verbetert). Ten tweede: deze studie startte met de focus op sterke co-morbiditeit van CVS en FMS met depressie. Deze aandoeningen komen echter ook vaker voor samen met o.a. prikkelbare darm, rusteloze benen syndroom en temporomandibulair gewricht aandoeningen disorders. Deze co-morbiditeiten dragen bij tot ziekte-heterogeniteit en kunnen zorgen voor een verdoezeling van de mogelijke verbanden van gen-expressie met FMS of CVS. Ten derde: we hebben er voor gekozen de factoren te benoemen op basis van kenmerken van de genen met de hoogste ‘loading’. Deze indeling omvat echter de diverse funkties van alle opgenomen genen niet. Toekomstige studies die de kandidaat-genen verder bekijken en een bevestigende factor-analyse, zouden hun voordeel halen uit het gebruik van gen-ontologie [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] instrumenten om overéénkomende genen verdere te onderzoeken.

De doelstelling van deze studie was om ‘clusters’ van genen te identificeren die funktionele autonomie vertoonden (sterke correlaties binnen ‘clusters’ maar zwakke correlaties tussen ‘clusters’). Het is een ganse uitdaging om deze verkennende doelstelling standvastig in een bevestigende setting te vatten. […] We kunnen niet beweren dat de geïdentificeerde ‘clusters’ ondubbelzinnig nauwkeurig zijn, enkel dat ze een aanvaardbare benadering bieden voor de correlaties tussen de 34 genen die in deze studie werden onderzocht.

Besluit

De resultaten van deze ‘Exploratory Factor Analysis’ studie ondersteunen de notie dat gen-expressie relevant voor FMS, CVS en depressie kan worden gegroepeerd in biologische coherente en betekenisvolle categorieën. Omdat de indelingen gebaseerd zijn op gen-gen-correlaties en genen combineren die zich in meerdere overlappende mechanismen bevinden, zouden toekomstige research-studies verder de aard van de verbanden moeten onderzoeken d.m.v. bevestigende factor-analyse van longitudinale gegevens. We onderzochten ook of gen-factoren, in plaats van individuele genen, zouden kunnen samengaan met specifieke symptomen. Preliminaire verkennende resultaten suggereren dat CVS en depressie-graad, maar niet FMS, geassocieerd zijn met de factor-scores wanneer wordt gecontroleerd voor leeftijd, geslacht en co-morbide symptomen, maar dat CVS gelinkt is met verhoogde expressie terwijl depressie gelinkt is met gedaalde expressie van de geclusterde genen. Met het vorderen van het wetenschappelijk onderzoek en beter begrijpen van deze complexe aandoeningen, is het belangrijk om heterogene populaties en hoe co-morbide aandoeningen de fysiologie kunnen moduleren, beter te leren begrijpen. Gezien het feit dat klinische interventies voor CVS en FMS dikwijls multi-modale behandelingen vereisen, zouden research-studies deze populaties ook moeten behandelen als zijnde een combinatie van ziekten en symptomen i.p.v. enkelvoudige klassificaties.

december 28, 2014

Stress verandert expressie & methylatie van perforine bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Uit ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS’ onthielden we dat er een toegenomen aanwezigheid is van differentieel gemethyleerde genen gerelateerd aan de immuun-respons, het cellulair metabolisme en kinase-aktiviteit. Genen geassocieerd met immuun-cel regulering, de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde mechanismen, vertoonden hypo-methylatie in promoters en andere gen-regulerende elementen bij M.E.(cvs). Epigenetische modificaties, zoals DNA-methylatie, die voornamelijk voorkomen op de cytosines van CpG dinucleotide sites (CpG) doorheen het genoom, zouden gen-expressie kunnen reguleren zonder de onderliggende gen-sequentie te wijzigen en optreden door genetische en milieu-factoren.

De onderzoek-groep van het CDC die onderstaande studie uitvoerde had blijkbaar eerder al bevindingen in die richting gedaan, meer bepaald dat er een link zou kunnen zijn tussen epigenetica (voor wat meer algemene achtergrond, zie ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’) en de dysfunkties qua ‘natural killer’ cellen. De resultaten werden echter pas een jaar na publicatie aan het algemeen publiek bekend gemaakt…

Bij het aanvallen van cellen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen komt ook het enzyme perforine vrij; dat porieën boort in het celmembraan. De porie-achtige strukturen vergemakkelijken de toegang van granzymen in de target-cel en deze aktiveren meerdere apoptose (geprogrammeerde cel-dood) -mechanismen die het effektief doden van de target-cel verzekeren. Perforine en granzymen bleken verminderd in NK- én CD8+T-cellen bij M.E.(cvs).

Lees hier meer over de verminderde funktie van NK-cellen bij M.E.(cvs) en de mogelijke rol van een daling qua perforine-gehalte in de pathogenese van CVS: ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS? & Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS.

In het stuk ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ wordt gemeld dat basale expressie-niveaus van perforine significant verhoogd bleken bij M.E.(cvs) in vergelijking met de controle-populatie. Uit de studie hieronder komt naar voor dat PRF1-expressie significant lager is bij M.E.(cvs)-individuen dan bij niet vermoeide-controles onmiddellijk na een psychosociale belasting. Bij het CDC wordt stress nogal snel gelimiteerd tot psychologische stress. Ook inspanning is een stress en wij vragen ons dan ook af hoe de resultaten zouden zijn mocht men dergelijke metingen doen na een inspanningtest…

————————-

Genet Epigenet. (2013) 5: 1-9

Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome

Virginia R. Falkenberg, Toni Whistler, Janna R. Murray, Elizabeth R. Unger & Mangalathu S. Rajeevan

Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Samenvatting

Perforine (PRF1) is essentieel voor immuniteit-bewaking en er zijn studies die rapporteren over verminderd perforine bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een ziekte die mogelijk geassocieerd is met stress en/of infektie. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST) als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress en evalueerden het effekt op PRF1-expressie en methylatie bij CVS-patiënten (n = 34) vergeleken met NF (n = 47) controles. Tijdens de TSST bleken ‘natural killer’ (NK) cellen significant verhoogd bij CVS- (P ≤ 0.0001) en NF-individuen (P ≤ 0.0001). Anders dan bij eerdere rapporten, was er geen significant verschil qua PRF1-expressie bij baseline of tijdens TSST tussen CVS en NF. PRF1-expressie in vol-bloed verhoogde echter 1,6 maal tijdens de TSST bij CVS (P = 0.0003) en NF (P ≤ 0.0001). Verder was de piek-respons onmiddellijk na de TSST lager bij CVS vergeleken met NF (P = 0.04). Daarnaast was de PRF1-expressie 1,5 uur na de TSST verhoogd bij CVS in vergelijking met NF (vol-bloed: P = 0.06; PBMC: P = 0.02). Methylatie van 7 CpG-sites in het methylatie-gevoelige gebied van de PRF1-promoter varieerde tussen 38% en 79%, zonder significante verschillen tussen CVS en NF. Hoewel de gemiddelde baseline methylatie van alle 7 CpG-sites niet verschilde tussen de CVS- en de NF-groep, was er een significante negatieve correlatie met PRF1-expressie op alle TSST-tijdstippen bij zowel CVS (P ≤ 0.0001) en NF (P ≤ 0.0001). Bij de deelnemers met een hoge gemiddelde methylatie (≥ 65%), was de PRF1-expressie significant lager bij CVS-individuen dan NF-controles onmiddellijk na TSST. Deze bevindingen suggereren dat methylatie mogelijks een belangrijke epigenetische determinant is voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie, en dat de verschillen qua PRF1-expressie en methylatie tussen CVS en NF bij de acute stress-respons verder onderzoek vereisen.

Inleiding

Stress, zowel lichamelijk of psychosociaal, leidt tot aktivatie van de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPA) as en de afgifte van cortisol. Studies bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) identificeerden een verminderde cortisol-respons bij ontwaken die voortkomt uit glucocorticoïden-resistentie, hypersensitiviteit voor de negatieve feedback werking van cortisol of gewijzigde serotonerge aktivatie van de hypothalamus. Naast deze HPA-as bevindingen werden bij CVS veranderingen qua immuun-funktie gedocumenteerd. Deze omvatten een verschuiving van Th1- naar Th2-type T-cel responsen [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason LA, Maher K, Fletcher MA. Evidence for T-helper 2 shift and association with illness parameters in Chronic Fatigue Syndrome. Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33] en gereduceerde cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) en CD8+ cytotoxische T-cellen [Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9:81 – zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Stress kan het immuunsysteem beïnvloeden via zijn interakties met de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel (SZS). Er werd verhoogde SZS-aktiviteit aangetoond bij CVS en dit zou de gereduceerde cytotoxiciteit kunnen beïnvloeden door het onderdrukken van Th1 en versterken van Th2 T-cel responsen, resulterend in gereduceerde cytotoxiciteit aktiviteit bij mensen en muizen. Perforine is een porie-vormend proteïne dat samenwerkt met granzymes en caspases om apoptose in doelwit-cellen te induceren, en verminderde perforine-expressie of -werking resulteert in verminderde cytotoxiciteit van NK en CD8+ T-cellen. Aangezien perforine belangrijk is voor de cytolytische aktiviteit van NK en cytotoxische CD8+ T-cellen, zou stress-regulering van het immuunsysteem gedeeltelijk gemedieerd kunnen worden via perforine. Studies door 3 verschillende groepen identificeerden verminderd perforine bij CVS-individuen. Een daling (maal 8) van perforine (PRF1) boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd geïdentificeerd via ‘differential display’ Polymerase Ketting Reaktie (PCR) [techniek om veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau te vergelijken en identificeren]. Verminderde werking of expressie van PRF1 bij CVS-patiënten werd herhaaldelijk aangetoond; in het algemeen is verminderd intracellulair perforine-proteïne gecorreleerd met PRF1 mRNA downregulering, hoewel één studie vond dat gereduceerde cytotoxiciteit voorkwam bij toegenomen PRF1 mRNA expressie. Studies geven aan dat methylatie een rol speelt bij de regulering van PRF1-expressie. Hypo-methylatie van de PRF1-promoter, bijzonderlijk in het methylatie-gevoelige gebied (MSR), bleek geassocieerd met verhoogde expressie van PRF1. In vitro testen toonden aan dat 70% van de totale PRF1 mRNA expressie zou kunnen gereduceerd zijn door methylatie van de 7 CpG-sites in het MSR. Daarenboven leidde behandeling van T-cellen met een methylatie-inhibitor, 5-azacytidine, tot verhoogde PRF1 mRNA expressie.

Stress-regulering van perforine werd nog niet direct onderzocht. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST), een erkende en gevalideerde methode om de stress-respons te bestuderen via aktivatie van het sympathisch zenuwstelsel en de HPA-as, als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress, en evalueerden het effekt ervan op PRF1-expressie en methylatie bij CVS (n = 34) in vergelijking met NF (n = 47) deelnemers.

Materialen & Methodes

Individuen

[…] Deze studie omvatte 81 individuen (34 CVS en 47 NF) uit een follow-up bevolking-studie naar CVS in Georgia (V.S.) die de TSST ondergingen als onderdeel van een 3-dagen durende studie […]. De CVS-gevallen voldeden aan de 1994 internationale research-definitie voor CVS (evaluatie d.m.v. gestandaardiseerde vragenlijsten, inclusief de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’, de ‘SF-36® Health Survey’ en de ‘CDC Symptom Inventory’. Er waren geen statistische verschillen tussen CVS en NF qua gemiddelde leeftijd (CVS: 45 ± 9 jaar, NF: 46 ± 9 jaar; P = 0.75), geslacht (CVS: 82% vrouwen, NF: 77% vrouwen; P = 0.53), ras (CVS: 76% Kaukasisch; NF: 85% Kaukasisch; P = 0.23) of BMI (CVS: 28 ± 5, NF: 26 ± 5; P = 0.075).

Trier sociale stress test

De TSST werd uitgevoerd om stress-geïnduceerde regulering van neuro-endocriene, autonome en immuun-responsen te bepalen. De TSST werd consistent op hetzelfde tijdstip van de dag gestart om een gelijkaardige diurnale [de dagelijkse cyclus volgende] respons voor alle deelnemers te verzekeren. De test bestaat uit een voorbereidende en anticipatie-fase (start om 1:15 pm) gevolgd door 10 min. spreken voor een publiek en een mentale rekenkundige test van 10 min. voor 3 getrainde staf-medewerkers (het TSST-panel, 1:30 pm tot 1:50 pm). Er werd een katheter voor bloedafname ingebracht om 7:30 am. Er werd bloed afgenomen voor micro-array analyse om 8:00 am en om 1:00 pm (baseline), alsook onmiddellijk vóór het TSST-panel om 1:30 pm, onmiddellijk ná het TSST-panel om 1:50 pm, en op opéénvolgende 15 minuten intervallen tot 3:05 pm. Er werd ook bloed afgenomen voor PBMC-isolatie om 10:00 am (3,5 uur vóór de TSST) en om 3:05 pm (1,5 uur ná de TSST). Er werden ook cel-tellingen gedaan.

DNA/RNA-extractie

Micro-array procedure

Kwantitatieve ‘reverse’ transcriptie PCR (qRT-PCR)

Kwantitative methylatie via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

Bioinformatische analyse van het PRF1 MSR [methylatie-gevoelige gebied]

Statistische analyse

Resultaten

Impact van TSST op bloedcel-tellingen en PRF1-expressie

Er was een significante toename in globaal percentage NK-cellen bij CVS- (P < 0.0001) en NF- (P < 0.0001) individuen tijdens de TSST, zonder significant verschil tussen de groepen. Ook de andere cel-type percentages (neutrofielen, T-cellen en B-cellen) verhoogden in respons op TSST en verschilden niet met betrekking tot ziekte-status (gegevens niet getoond).

Micro-array analyse van vol-bloed toonde een significante toename qua PRF1-expressie tussen de introductie/voorbereiding-fase en onmiddellijk vóór de TSST mondelinge presentatie (1:00 pm-1:30 pm) van ca. 1,6 maal in NF (P < 0.0001) en CVS (P = 0.0003). PRF1-expressie bleef stijgen bij NF-individuen tijdens de TSST mondelinge presentatie (1:30-1:50 pm) terwijl de expressie lichtjes daalde bij de CVS-individuen, resulterend in een significant verschil tussen NF- en CVS-individuen (P = 0.04) om 1:50 pm. Gedurende de 45 min. na de TSST, daalde de PRF1-expressie en keerde terug naar baseline waarden in beide groepen (om 2:35 pm). PRF1-expressie bij NF-individuen bleef afnemen maar nam toe bij CVS-individuen, resulterend in 1,3 maal hogere expressie bij CVS i.v.m. NF op dat moment (P = 0.06).

PRF1-expressie om 10:00 am en 3:05 pm in PBMCs – bepaald via qRT-PCR – was over het algemeen consistent met de resultaten van de vol-bloed micro-array. PRF1-expressie in PBMCs verschilde niet tussen CVS en NF om 10:00 am, maar om 3:05 pm was de PRF1-expressie hoger bij CVS dan NF (1,4 maal; P = 0.02).

Impact van TSST op PRF1-methylatie

Site-specifieke CpG-methylatie in het MSR om 10 am varieerde tussen 38% en 79%, en steeg op alle 7 CpG-sites met 2,1% tot 4% na de TSST (om 3:05 pm) voor de ganse studie-populatie (P < 0.0001 tot P = 0.01). Bij CVS-individuen was de toename qua methylatie na TSST echter significant voor slechts 2 CpG-sites, terwijl bij NF-controles de stijging significant was voor 4 CpG-sites. Er waren geen significante globale verschillen tussen CVS en NF in termen van site-specifiieke methylatie of gemiddelde methylatie voor alle 7 CpG-sites voor of na de TSST.

Impact van PRF1-methylatie op zijn expressie

Om te impact te onderzoeken van PRF1-methylatie op PRF1-expressie, bekeken we correlaties tussen gemiddelde methylatie van de 7 CpG-sites en gen-expressie voor elke deelnemer en tijdstip in vol-bloed en PBMCs. De gemiddelde baseline methylatie (10:00 am) was negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed op alle 8 tijdstippen in CVS en NF, statistisch significant voor alle tijdstippen uitgenomen één bij NF (2:35 pm). De gemiddelde methylatie om 3:05 pm was ook negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed om 3:05 pm bij NF- en CVS-individuen, hoewel de correlatie niet significant was bij CVS. Er werden gelijkaardige negatieve correlaties tussen PRF1-methylatie en PRF1-expressie in PBMCs geobserveerd bij NF- en CVS-individuen.

We gebruikten lineaire regressie om het verband te kwantificeren tussen PRF1 gemiddelde methylatie om 10:00 am en vol-bloed PRF1-expressie op alle tijdstippen. Bij CVS-individuen voorspelde deze analyse een stijging van 3% qua PRF1-expressie […] bij elke 1% toename van de PRF1-methylatie […]. Er werd een gelijkaardig omgekeerd verband gevonden bij NF-individuen, maar 31% en 14% van de variantie qua PRF1-expressie werd verklaard door PRF1-promoter methylatie bij CVS en NF, respectievelijk.

We gebruikten de mediane opsplitsing van het gemiddeld methylatie-niveau van de 7 CpG-sites om 10:00 am om de individuen te categoriseren met hoge (≥ 65%) en lage (< 65%) methylatie. Vol-bloed PRF1-expressie was significant hoger in de lage-methylatie groep op alle TSST tijdstippen (P-waarde van 0.0002 tot 0.05). Wanneer de groepen met hoge- of lage-methylatie werden gestratificeerd op basis van ziekte, werd enkel om 1:50 pm (onmiddellijk na TSST) een significant verschil opgemerkt tussen CVS en NF. De CVS hoge-methylatie groep had een significant lagere PRF1-expressie dan de NF hoge-methylatie groep (P = 0.005).

Bespreking

Deze studie toont aan dat acute psychosociale stress een impact heeft op PRF1 gen-expressie en dat PRF1-methylatie bijdraagt tot individuele verschillen qua PRF1-expressie. De PRF1-expressie steeg ca. 1,6 maal (t.o.v. baseline) in respons op TSST en dit niveau van verandering valt binnen de relatieve perforine-expressie verandering die wordt gezien bij andere paradigma’s. De piek PRF1-expressie in respons op TSST was echter verminderd bij CVS– t.o.v. NF-individuen (P = 0.04). NK-cellen namen af in respons op de TSST bij CVS en NF, en aangezien PRF1-expressie grotendeels beperkt blijft tot NK-cellen, is het waarschijnlijk dat de toegenomen expressie van PRF1 in respons op de TSST gerelateerd kan zijn met NK-cel aantallen. Aangezien we de heterogeniteit qua NK-cellen naar gelang hun ontwikkeling niet beschreven, kunnen we niet onderscheiden of alle NK-cellen of slechts een deel van de rijpe NK-cellen bijdroegen tot de PRF1-expressie na TSST. Verdere analyses gebruikmakend van aangerijkte NK-cellen zijn nodig ter evaluatie van de toename qua PRF1-expressie in termen van transcript-copieën/cel, en het verband met NK-cel heterogeniteit in respons op acute stress.

We vonden ondersteuning voor het feit dat methylatie een regulering-mechanisme van PRF1-expressie is, aangezien er een significante negatieve correlatie bestond tussen de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites in de PRF1-promoter en zijn expressie. We zagen dit verband op alle TSST-tijdstippen, wanneer de methylatie op een continue schaal werd uitgezet of gecategoriseerd op basis van alge of hoge status. Op basis hiervan is het mogelijk dat ontbreken van een significant verschil qua gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites tussen CVS en NF zou kunnen bijdragen tot het ontbreken van een verschil qua PRF1-expressie tussen CVS en NF in deze studie. Onze resultaten suggereren dat methylatie een belangrijke epigenetische determinant voor inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie zou kunnen zijn en zodoende dat de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites verantwoordelijk kan zijn voor de gerapporteerde discrepanties (stijging, daling of geen verandering) qua PRF1-expressie bij verschillende CVS-studies. Deze resultaten impliceren verder het belang van het meten van PRF1-methylatie én -expressie voor het begrijpen van de mechanismen van PRF1-expressie bij immuniteit-bewaking. Hoewel er geen verschil was qua methylatie-niveaus tussen CVS en NF, vertoonden deze groepen enkele verschillen wat betreft het verband tussen methylatie en expressie, onmiddellijk na TSST (1:50 pm) en op het laatste tijdstip na TSST (3:05 pm). Het lijkt er op dat om 1:50 pm (na de TSST), een subgroep CVS-individuen met hoge baseline methylatie (10:00 am) in het MSR bijdroeg tot de afgestompte respons qua PRF1-expressie in vergelijking met NF-individuen. Op het laatste tijdstip na de TSST (3:05 pm) wanneer PRF1-expressie significant steeg bij CVS (zowel vol-bloed als PBMCs), werd zijn negatieve relatie met methylatie op het dichtste tijdstip (3:05 pm) niet-significant. Een verklaring voor de ziekte-specifieke verschillen die werden gezien in deze studie blijkt ingewikkeld. We focusten ons op het verband tussen PRF1-promoter methylatie en mRNA, maar er zouden veel andere mechanismen kunnen betrokken zijn om de expressie van PRF1 te reguleren, inclusief een GRE [glucocorticoïd responsief element; korte DNA-sequentie in de promoter van een gen dat kan binden met de glucocorticoïd receptor] en de op IL-2 reagerende regulering van ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] in de PRF1-promoter. Er zijn ook mechanismen waarbij post-transcriptionele, post-translationele en circadiane regulering van PRF1 betrokken zijn, die kunnen bijdragen tot de differentiële expressie of aktiviteit.

Er zijn meerdere beperkingen bij deze studie. De grootte van de groep is beperkt, hoewel deze vergelijkbaar is met eerdere studies die gebruik maken van de TSST. De deelnemers aan de studie werden gescreend op medicatie en niemand gebruikte immunosuppressors. De impact van medicijnen op HPA-as responsiviteit, als er al één is, is echter onbekend. Hoewel statistisch significant, waren de geobserveerde verschillen (2.6%-6.8%) qua CpG-site specifieke methylatie in het MSR tussen pre- (10:00 am) en post- (3:05 pm) TSST stalen klein, mogelijks verstoord door de mengeling van cel-types aanwezig bij PBMCs. Het methylatie-profiel van het PRF1 MSR in deze studie (81 individuen) was verschillend van een eerdere studie (5 individuen), mogelijks omwille van een substantieel verschil tussen deze studies wat betreft het aantal stalen. Eén van de belangrijke vragen is echter of het klein percentage veranderingen qua methylatie dat werd gezien bij deze studie een belangrijk biologisch mechanisme voor de regulering van PRF1-expressie is. Enkele studies suggereren dat kleine wijzigingen qua DNA-methylatie (2%-10%) zich inderdaad kunnen vertalen naar veranderingen (1,5- tot 32 maal) qua gen-expressie. [geen studies bij M.E.(cvs)-patiënten maar bv. hartfalen] Hoewel deze gerapporteerde schattingen van de impact van DNA-methylatie op expressie aanzienlijk variëren afhankelijk van het gen, weefsel, milieu en statistische analyse, komt onze schatting van een 3% toename qua PRF1-expressie met elke 1% afname qua methylatie overéén met de schatting van de impact of FXN [gen coderend voor het mirochondriaal proteïne frataxine] -methylatie op zijn expressie. Deze resultaten ondersteunen de visie dat subtiele epigenetische wijzigingen de gen-expressie kunnen beïnvloeden in respons op de omgeving.

Besluit

We documenteerden een toename qua PRF1-expressie die evenwijdig loopt met een verhoging van NK-cellen in respons op acute psychosociale stress, waarbij patiënten met CVS een afgestompte respons vertoonden vergeleken met NF-controles. Deze afgestompte expressie bij CVS zou kunnen verband houden met de hoge baseline PRF1-promoter methylatie die een belangrijke epigenetische determinant bleek voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie. Er zijn verdere studies nodig om deze resultaten te bevestigen en verklaringen voor de geobserveerde PRF1-expressie dynamiek te evalueren. Het zal ook interessant zijn de signaal-transductie die resulteert in perifere influx van NK-cellen te onderzoeken, alsook PRF1-expressie en zijn funktionele rol in de context van acute stress, en de molekulaire mechanismen te identificeren die overéénkomen bij stress en infektie.

november 1, 2014

Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 8:10 am
Tags: , , ,

Prof. Jonathan Kerr, destijds verbonden aan de afdeling Cellulaire & Molekulaire geneeskunde van de St. George’s University of London, publiceerde in 2008, samen met onderzoekers van andere universiteiten en ziekenhuizen het artikel: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (in J Infect Dis (2008) 197: 1171-84; en zie ook Curr Rheumatol Rep (2008) 10: 482-491). Daarin werd gen-expressie in perifeer bloed van 25 M.E.(cvs)-patiënten onderzocht. De genen met veranderde expressie (t.o.v. gezonde bloed-donoren) werden via een tweede methode verder geanalyseerd bij 55 M.E.(cvs)-patiënten. Er werd differentiële expressie gevonden voor 88 genen. Veel voorkomende funkties waren hematologische aandoeningen, immunologische ziekte, kanker, cel-dood, immuun-respons en infektie. De patiënten konden worden onderverdeeld in 7 subtypes.

In een bijkomend artikel (Kerr JR, Burke B, Petty R et al. Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol (2008) 61: 730-9) wordt gerapporteerd hoe van elk M.E.(cvs)-subtype die genen werden geïdentificeerd waarvan de expressie significant verschilde van normale bloed-donoren, en hoe gen-interakties, associaties met ziekten en molekulaire & cellulaire funkties van die genen-sets werden bepaald. Er werden enkele gemeenschappelijke (neurologische, hematologische, kanker) en enkele afzonderlijke (metabole, endocriene, cardiovasculaire, immunologische, inflammatoire) ziekte-associaties voor subtypes gevonden.

Gegevens uit de eerste studie werden later – door een team waartoe hij zelf ook behoorde – bevestigd bij 62 nieuwe M.E.(cvs)-patiënten (Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Pathol (2009) 63:156-64).

Ook de Schotse onderzoekers John Gow, Peter Behan & Abhijit Chaudhuri (A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genomics (2009) 2:38) vonden “verschillen in gen-expressie verspreid over het ganse genoom tussen post-infektueuze, niet-psychiatrische mannelijke patiënten met CVS en gezonde controles” (zie Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’) maar zijn merkten op dat er een “gebrek aan correlatie tussen verschillende publikaties over gen-arrays” is. Zij stipten aan: “een micro-array is een moment-opname en niet noodzakelijk het chronische biologische proces inherent aan de aandoening weerspiegelt”.

Het bleef geruime tijd stil rond dit alles maar hier rapporteert Prof. Kerr over zijn vervolg-onderzoek met een andere, wellicht meer reproduceerbare techniek. Hij onderzocht kleine mutaties – ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) – in genen met differentiële expressie bij M.E.(cvs) en vond er die significant geassocieerd zijn met de ziekte en met afzonderlijke subtypes. Het vinden van deze SNPs zou kunnen leiden tot het ontwikkelen van een subtype-specifieke diagnostische test. Over de betekenis van de ‘aangetaste’ genen / transcriptie-factoren wordt (nog) niet gespeculeerd.

Het onderzoek werd mede gefinancierd door ‘ME Research UK’.

————————-

J Clin Pathol (Publicatie September 2014)

Use of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) to distinguish gene expression subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Nana Shimosako (1), Jonathan R Kerr (1,2)

1 CFS Group, Department of Cellular & Molecular Medicine, St George’s University of London, London, UK

2 Escuela de Medicina y Ciencias de Salud, Universidad del Rosario, Bogota, Colombia

Samenvatting

Doelstellingen We rapporteerden eerder over gen-expressie veranderingen bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) en het feit dat dergelijke gen-expressie gegevens kunnen worden gebruikt om subtypes van CVS/M.E. met afzonderlijke klinische fenotypes te identificeren. Omwille van moeilijkheden bij het gebruik van een vergelijkende gen-expressie methode als hulpmiddel bij de diagnose van CVS/M.E. en de subtypes, hebben we geprobeerd een dergelijke methode gebaseerd op ‘single-nucleotide’ polymorfisme (SNP) analyse te ontwikkelen.

Methodes Om SNP-allel associaties met CVS/M.E. en CVS/M.E.-subtypes te identificeren, hebben we genomisch DNA getest van patiënten met CVS/M.E. (n = 108), patiënten met endogene depressie (n = 17) en normale bloed-donoren (n = 68) op 504 menselijke SNP-allelen gelokaliseerd in 88 met CVS geassocieerde menselijke genen gebruikmakend van een SNP genotypering test. 360 ‘afkomst informatieve merkers’ (AIM) werden ook onderzocht.

Resultaten 21 SNPs bleken significant geassocieerd met CVS/M.E. vergeleken met depressie en normale controle. 148 SNP-allelen vertoonden een significant verband met één of meer CVS/M.E.-subtypes. Voor elk subtype hadden de geassocieerde SNPs de neiging zich te groeperen in afzonderlijke genen. AIM SNPs gaven aan dat 4 individuen van Aziatische origine waren en de rest Kaukasisch. Hiërarchisch clusteren van de AIM-data onthulde het verwantschap tussen 2 koppels patiënten met CVS en bevestigde de globale heterogeniteit van alle individuen.

Besluiten Deze studie levert bewijs dat menselijke SNPs gelokaliseerd in met CVS/M.E. geassocieerde genen gerelateerd zijn met afzonderlijke genomische subtypes van CVS/M.E. Er is verder werk vereist om dit te ontwikkelen tot een klinisch bruikbare subtype-specifieke diagnostische test.

Inleiding

[…] De precieze onderliggende ziekte-mechanismen en manieren waarop de abnormaliteiten verband houden bij patiënten met CVS/M.E. moeten nog worden opgehelderd.

We hebben eerder gerapporteerd over de differentiële expressie van 88 menselijke genen bij CVS/M.E. die werden geïdentificeerd m.b.v. een omvangrijke micro-array [‘gen-chips’] studie met bevestiging van de of genen via ‘real-time’ PCR. [Kerr JR, Petty R, Burke B et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME). J Infect Dis (2008) 197: 1171-84] Deze gegevens werden later geconfirmeerd in een follow-up studie. [Zhang L, Goudh J, Christmas D et al. Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Pathol (2009) 63:156-64] Clusteren van gen-expressie gegevens onthulde 8 genomische CVS/M.E.-subtypes met duidelijke verschillen qua Short Form-36 (SF-36) scores, klinische fenotypes, ziekte-graad en geografische distributie.

Het werd al erkend dat CVS/M.E.-subtypes bestaan en er wordt gedacht dat dergelijke subtypes, ten minste gedeeltelijk, de afzonderlijke etiologische factoren kunnen weerspiegelen. [Jason LA, Corradi K, Torres-Harding S et al. Chronic Fatigue Syndrome: the need for subtypes. Neuropsychol Rev (2005) 15: 29-58] Een op symptomen gebaseerde benadering heeft wat succes gekend wat betreft de identificatie van musculoskeletale, inflammatoire en neurologische subtypes; deze groepen vertoonden echter slechts kleine verschillen in algemene funktionele ernst in tegenstelling met deze van onze gen-expressie studies.

Hoewel het intrigerend is dat dergelijke subtypes kunnen worden geïdentificeerd door gebruik te maken van gen-expressie methodes, is het onwaarschijnlijk dat zo’n benadering bruikbaar zou kunnen zijn in de klinische praktijk om dergelijke subtypes te identificeren, aangezien het moeilijk is referentie-waarden te definiëren voor elk gen bij elk subtype. Daarom probeerden we zo’n test te bekomen gebruikmakend van ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) gelokaliseerd in de 88 met CVS/M.E. geassocieerde genen. Deze studie toont aan dat er 148 menselijke SNPs waren die significante associaties hadden met één of meer CVS/M.E. genomisch subtype. Hoewel deze studie geen robuust subtype-differentiërende test voorstelt, bieden de resultaten bewijs dat zo’n benadering haalbaar is.

Methodes

Recrutering van indviduen en klinische karakterisatie

CVS/M.E.-patiënten (n = 108) Fukuda diagnostische criteria. 6 na Q-koorts; de rest idiopathisch. Majeure psychiatrische ziekte uitgesloten, alsook drug- of alkohol-misbruik […]. De patiënten maakten deel uit van een eerder gepubliceerde studie over gen-expressie waar ze een genomisch subtype was toegewezen. [zie Zhang et al. hierboven]

[…]

[…] Lichamelijke en mentale vermoeidheid werd bepaald d.m.v. de Chalder vermoeidheid-schaal [niet de meest geschikte voor M.E.(cvs)], mate van invaliditeit vai de ‘Medical Outcomes Survey SF-36’; symptomen werden gekarakteriseerd d.m.v. de ‘Somatic and Psychological Health Report’; slaap-abnormaliteiten d.m.v. de ‘Pittsburgh Sleep Questionnaire’; en type en ernst van de pijn d.m.v. de ‘McGill Pain Questionnaire’.

[…]

Bloed-afname en DNA-extractie

[…]

Totaal-genoom amplificatie

[…]

Afkomst informatieve merkers

Om de DNA-stalen te screenen op test-prestaties vóór het uitvoeren van de genotypering en wat informatie te verkrijgen betreffende de afkomst van elk individu, gebruikten we 360 SNPs gekozen als genomische controles die wellicht niet met ziekte geassocieerd zijn.

SNPs in CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen

We zochten naar SNPs in de promoter- en coderende gebieden (inclusief introns [overbodige, niet-coderende stukken] in 88 menselijke genen die eerder differentiële expressie bleken te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten vergeleken met normale bloed-donoren. Zo selekteerden we 504 SNPs voor de analyse: 1-8 SNPs per CVS/M.E.-geassocieerd menselijk gen.

SNP-genotypering test

Van de te testen SNPs (360 afkomst informatieve merkers (AIM) SNPs & 504 CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs) werd het waarschijnlijk succes van elk SNP voor het ontwikkelen van een test bepaald. Enkel SNPs met een goede waarschijnlijkheid op succes werden verder bekeken.

[…]

Mogelijke invloed van CVS/M.E.-geassocieerde SNPs op eerdere gen-expressie resultaten

[voor techneuten:] We onderzochten elk van de SNPs die geassocieerd bleken met CVS/M.E. op hun positie t.o.v. de zogenaamde ‘interrogatie-positie’ van de sondes die worden gebruikt in de gen-expressie array. Deze ‘interrogatie-positie is het nucleotide dat doelbewust werd gemuteerd in de ‘mismatch’ sonde-sequentie vergeleken met de perfect gematchte sonde. De mogelijkheid bestaat dat bij een SNP in deze positie, de ‘mismatch’ sonde sterker bindt dan de perfect gematchte sonde […].

Vergelijkende sequentie-analyse voor het detekteren van gewijzigde transcriptie-factor binding-plaatsen

Elk van de 21 SNP loci die CVS/M.E. van depressie / normaal of CVS/M.E. van normaal differentieerden werd onderzocht op mogelijke lokalisatie binnen binding-plaatsen van CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factoren en mogelijke effekten op CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factor (TF) binding op CVS/M.E.-geassocieerde genen. […] (NFKB1 [nucleaire factor NF-kappa-B], NHLH1 [helix-lus-helix proteïne 1], GABPA [GA-bindende proteïne alfa keten], REPIN1 [replicatie initiator 1], EGR1, EGR3 [EGR = ‘early growth response’ proteïne], ETS1 [ETS = familie transcriptie-factoren]) […]

Gegevens-analyse en visualisering

Voor de patiënten met CVS/M.E., werden de CVS/M.E.-geassocieerde SNP haplotypes [genetische varianten; combinaties van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] omgezet naar nummers (AA=1, AB=2, BB=3, waar A = allel A en B is allel B) en geanalyseerd d.m.v. grafische programma’s […]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Individuen

Deze studie omvatte 108 CVS/M.E.-patiënten, 17 patiënten met endogene depressie en 68 normale bloed-donoren. […]

Afkomst informatieve merkers

Er werden gegevens betreffende AIM SNP-allelen verkregen voor alle CVS/M.E.-patiënten, alle patiënten met endogene depressie en 29 van de 68 normale bloed-donoren. Deze gaven aan dat alle normale bloed-donoren en depressie-patiënten van Europese origine waren; alsook alle CVS/M.E.-patiënten, uitgezonderd 4 die van Aziatische origine waren.

Bij onderzoek naar de graad van verwantschap tussen de deelnemers aan de studie bleek dat – met uitzondering van 6 individuen – ze niet nauw verwant waren met elkaar […].

CVS/M.E.-gessocieerd gen SNP-allelen bij CVS/M.E., depressie en normale controles

We vonden dat 21 CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs een frequentie-distributie over de CVS/M.E-., depressie- en normale groepen hadden, die niet als toevallig kan worden beschouwd en die significant was. Interessant was dat 7 van deze SNPs in het BMP2K gen [coderend voor een kinase-enzyme dat een rol speelt bij skelet-ontwikkeling] & 2 in het IL6ST gen [interleukine-6 signaal-transducer; deel van het cytokine receptor complex] lagen. Wat betreft CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs die een onverwachte distributie tussen CVS/M.E. en normalen vertoonden, waren er 10 die significant bleken [Deze worden genoemd maar er wordt verder niet over uitgewijd.].

SNP-allelen bij CVS/M.E.-subtypes

Er waren 148 SNPs met een distributie over de CVS/M.E.-subtypes die niet alles toevallig kan worden beschouwd. Alle 148 werden geïdentificeerd door de allel-distributie in één subtype te vergelijken met deze in alle andere subtypes gecombineerd. […]. De distributie van afzonderlijke SNP-allelen over afzonderlijke CVS/M.E.-subtypes is interessant en toont dat elk subtype geassocieerd is met afzonderlijke SNP-allelen en dat deze SNP-allelen gegroepeerd zijn in afzonderlijke genen voor elk CVS/M.E.-subtype, op die manier dat bv. SNP-allelen in ACTR3 [actine-gerelateerd proteïne 3; maakt deel uit van een complex dat essentieel is voor cel-vorm en -beweeglijkheid] geassocieerd zijn met subtype-F, terwijl SNP-allelen AKAP10 [codeert voor A-kinase anker-proteïne dat gelokaliseerd is in mitochondrieën] geassocieerd zijn met subtype-G [De rest wordt ook opgesomd maar er wordt verder niet over uitgeweid.].

Mogelijke invloed van CVS/M.E.-geassocieerde SNPs op eerdere gen-expressie resultaten

We vonden dat slechts 1 SNP zich in de interrogatie-positie van een sonde-sequentie van één van de 88 CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen bevond. Dit SNP was rs2228431 in het ARSD gen […]. Bij het her-bekijken van de eerder gepubliceerde data-set over gen-expressie bij CVS/M.E. versus normale controles, zagen we dat deze sonde deze resultaten niet beïnvloedde aangezien het werd uitgesloten van de analyse omwille van zijn gebrek aan specificiteit voor het ARSD gen.

Vergelijkende sequentie-analyse voor het detekteren van gewijzigde transcriptie-factor binding-plaatsen

Vergelijkende sequentie-analyse voorspelde dat 4 van de 21 CVS/M.E.-geassocieerde SNPs gewijzigde CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factor binding met CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen vertoonden. [NHLH1, GABPA, REPIN1, ETS1]

Gegevens-analyse en visualisering

[…] Gebruikmakend van de SNP-haplotype gegevens kwam er enige mate van afscheiding van de verschillende CVS/M.E.-subtypes naar voor […]. Deze subgroepen vertoonden 73% correlatie met de gen-expressie subtypes (gegevens niet getoond).

Bespreking

Deze studie werd ondernomen om CVS/M.E.-geassocieerde SNPs te identificeren die voorkomen in de promoter- en coderende sequenties van 88 CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen. Deze 88 menselijke genes werden oorspronkelijk geïdentificeerd via analyse van het perifeer bloed van 55 CVS/M.E.-patiënten en 75 normale bloed-donoren gebruikmakend van uitgebreide gen-expressie micro-array (en bevestiging van de resultaten via ‘real-time’ PCR.

Het is belangrijk te bevestigen dat er geen significante verwantschap onder de individuen – die de resultaten zou verstoren – in de studie werd vastgesteld; dit werd geconfirmeerd via de AIM SNP-allel gegevens van het DNA test-panel. Het is ook belangrijk te verzekeren dat elke gevonden SNP-allel associaties niet het resultaat zijn van een significante over-vertegenwoordiging van een ras vergeleken met de andere in een groep, en dit werd ook uitgesloten door de resultaten van de AIM SNP gegevens.

We hebben getoond dat de allel-frequentie voor elk van de 21 SNPs een statistisch significante en onverwachte verdeling over de CVS-M.E./ depressie/ normale groepen heeft en dat voor 10 van deze 21 SNPs, afzonderlijke allelen geassocieerd zijn met CVS/M.E. vergeleken met normale controles. Hoewel SNP-allel associaties eerder werden gerapporteerd bij CVS/M.E., kan deze lage opbrengst (21 van 504) verrassend lijken gezien het feit dat deze SNP-loci voorkwamen in genen waarvoor differentiële expressie werd gevonden bij CVS/M.E. Deze observatie is echter waarschijnlijk te verklaren door de gekende heterogeniteit van CVS/M.E. in het algemeen en het bestaan van subtypes in deze CVS/M.E.-groep, die werden onthuld gebruikmakend van clustering van de gen-expressie gegevens [zie Zhang L et al.]. Deze subtypes hadden een apart klinisch fenotype en ernst-graad. Deze veronderstelling wordt verder ondersteund door de vondst van 148 SNP-allelen die geassocieerd bleken met één of meer CVS/M.E.-subtypes. De verdeling van afzonderlijke SNP-allelen over afzonderlijke CVS/M.E.-subtypes is interessant. Dit hield echter geen waarneembaar verband met de gen-expressie gegevens voor elk van deze subtypes (gegevens niet getoond) in.

Het is geruststellend dat onze analyse van de lokatie van deze SNPs t.o.v. de sonde-sets van de gen-array, die oorspronkelijk werd gebruikt om de differentiële expressie van deze genen te identificeren, geen significante invloed van de gen-expressie gegevens in het algemeen ondersteunde.

Het feit dat werd voorspeld dat 4 van de SNP-allelen die geassocieerd bleken met CVS/M.E. verminderde binding met CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factoren zou vertonen [Deze worden genoemd maar er wordt hier verder niet over uitgewijd.], suggereert dat dergelijke mutaties wel eens de gen-expressie signaturen die werden gevonden bij patiënten met CVS/M.E. zouden kunnen beïnvloeden; in het bijzonder omdat bij 3 van de 4, het allel geassocieerd was met de ganse CVS/M.E.-groep en niet enkel één subtype en aangezien deze transcriptie-factoren talrijke binding-plaatsen hebben in de promoter-gebieden van deze genen.

Een mogelijke toepassing van de kennis dat deze SNPs significant verschillende distributie vertonen over de CVS/M.E.-subtypes, is de ontwikkeling van een subset SNPs voor een subtype-specifieke diagnostische test. Dit kan nuttig zijn eens het bestaan van de eerder gepubliceerde gen-expressie CVS/M.E.-subtypes onafhankelijk werd bevestigd en wanneer we meer over ze weten in termen van natuurlijke geschiedenis, triggers, respons op verschillende behandelingen, enz. Een dergelijk op SNPs gebaseerde test is zeer wenselijk vergeleken met een op gen-expressie gebaseerde test aangezien dit robuust en makkelijk reproduceerbaar is; anders dan de vergelijkende gen-expressie methode die werd gebruikt om deze 88 menselijke genen te identificeren. Dit zal echter uitgebreide verdere testen en validering vereisen vooraleer het kan worden aanbevolen voor dit doel.

Tot besluit: in dit artikel rapporteren we over 21 SNP-allelen die significant geassocieerd zijn met CVS/M.E. vergeleken met depressie-patiënten en normale controles, en over 148 SNP-allelen die geassocieerd zijn met één of meer CVS/M.E.-subtypes – waarvan er 27 een p-waarde ≤ 0.05 vertoonden. De grootte van de groep in deze studie, en bijzonderlijk de grootte van elk gen-expressie subtype, is te klein om stevige conclusies te trekken. Als we echter veronderstellen dat deze resultaten kunnen worden gerepliceerd, zou het mogelijk moeten zijn om een subtype-specifieke diagnostische test te ontwikkelen gebruikmakend van een SNP-subset, wat het onderzoek en klinisch management van patiënten met CVS/M.E zou kunnen helpen.

oktober 10, 2014

MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 5:55 am
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel komt van dezelfde onderzoeksgroep die eerder rapporteerde over veranderingen qua miRNAs in cytotoxische cellen die de funktionele capaciteit van deze cellen kunnen verminderen en de effektieve cytotoxische aktiviteit, samen met andere immuun-funkties bij CVS/ME-patiënten verstoren. Zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)’.

‘High-Throughput Sequencing’ is een techniek voor de bepaling van de sequentie (de volgorde van de nucleotiden) van DNA of RNA waarbij er veel materiaal in één keer (geautomatiseerd) kan worden verwerkt. Het wordt ook ‘next-generation sequencing’ genoemd en levert duizenden of miljoenen sequenties terzelfder tijd op. RT-qPCR, ‘reverse transcriptase’-kwantitatieve polymerase ketting-reaktie, is een techniek waarbij met vertrekt van RNA dat via ‘omgekeerde transcriptie’ wordt omgezet in cDNA (complementair DNA) om zo de gen-expressie te bepalen.

————————-

PLoS One. 2014 Sep 19;9(9): e102783

High-Throughput Sequencing of Plasma MicroRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis

Brenu EW (1), Ashton KJ (2), Batovska J (2), Staines DR (3), Marshall-Gradisnik SM (1)

1 School of Medical Science, Griffith Health Centre, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia

2 Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University, Robina, Queensland, Australia

3 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; Queensland Health, Gold Coast Public Health Unit, Robina, Gold Coast, Queensland, Australia

Samenvatting

ACHTERGROND: MicroRNAs (miRNAs) reguleren vele biologische processen en hun ontregeling bleek geassocieerd met een waaier aan ziekten inclusief Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME). De ontdekking van stabiele en reproduceerbare miRNAs in plasma heeft de mogelijkheid verhoogd dat circulerende miRNAs zouden kunnen dienen als diagnostische merkers. De doelstelling van deze studie was het bepalen van de rol van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

RESULTATEN: Gebruikmakend van Illumina ‘high-throughput sequencing’ [HTS] identificeerden we 19 miRNAs met differentiële expressie in het plasma van CVS/M.E.-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Na RT-qPCR analyse, waren we in staat de significante upregulering van 3 miRNAs (hsa-miR-127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p [hsa = Homo sapiens]) bij de CVS/M.E.-patiënten te bevestigen.

BESLUIT: Onze studie is de eerste om circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te identificeren en ook om 3 differentieel tot expressie komende circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te bevestigen, en zo een basis te bieden voor verdere studie om bruikbare CVS/M.E.-biomerkers te vinden.

Inleiding

[…]. Er is bewijsmateriaal dat een belangrijke ontwrichting van immunologische processen bij CVS/M.E. suggereert en deze zou gekenmerkt kunnen zijn door verminderde cytotoxische aktiviteit en verhoogde regulerende T-cellen [zie onze inleiding]. Daarnaast kunnen patiënten met CVS/M.E. differentiële expressie van mRNA en microRNA (miRNA) genen – die verscheidene fysiologische processen reguleren waarvan is geweten dat ze ontregeld zijn bij CVS/M.E., inclusief cytotoxiciteit, cytokine-secretie en apoptose – vertonen. Ondanks intensieve research wordt de pathofysiologie van CVS/M.E. nog niet volledig begrepen en blijven duidelijke diagnostische biomerkers ongrijpbaar.

MicroRNAs zijn een klasse van kleine (typisch 18-25 nucleotiden groot) enkel-strengige, niet-coderende RNAs die gen-expressie reguleren op post-transcriptioneel niveau [optredend na de overschrijving van DNA naar RNA]. Hun regulerende rollen bleken betrokken bij de meeste biologische processen, ook immunologische, neurologische en fysiologische. Differentiële expressie van miRNAs bleek geassocieerd met meer dan 300 ziekten, waaronder kanker, cardiomyopathieën [hartspier-ziekten], neurologische aandoeningen en onverklaarde aandoeningen zoals CVS/M.E. Er circuleren stabiele en reproduceerbare extracellulaire miRNAs in het bloed en andere bio-vloeistoffen, waar ze werden geïdentificeerd. Er werd voorgesteld dat deze miRNAs het potentieel hebben om te worden aangewend als niet-invasieve nieuwe biomerkers voor ziekte-diagnose en -prognose.

In deze studie gebruikten we ‘high-throughput sequencing’ om het profiel te tekenen van de expressie van circulerende miRNAs. Dit werd gevolgd door bevestigende ‘reverse transcription-quantitative’ PCR (RT-qPCR) om de differentiële miRNA-expressie bij CVS/M.E. te bepalen.

Materialen en Methodes

Deelnemers

CVS/M.E.-patiënten (n = 20, 44,5 ± 6,0 jaar) […]. Inclusie-criteria […] CDC 1994 definitie. Niet-vermoeide controles (n = 20, 47,3 ± 6,7 jaar) […].

Staal-verwerking en RNA-extractie

[…] 10 ml vol bloed […].

MicroRNA-profilering d.m.v. sequentie-bepaling

De 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles met de hoogste hoeveelheid klein RNA werden gebruikt voor HTS. […] cDNA constructie via ‘reverse transcription-PCR’ (RT-PCR) uit klein RNA, zuivering, isolatie van miRNAs en sequentie-analyse […]

Sequentie data-analyse

[…]

Kwantificering van miRNAs d.m.v. RT-qPCR

De expressie van 8 miRNAs werd gevalideerd […]. Daarnaast werd van 4 miRNAs (miR-10, miR-15b, miR-16 & miR-24) bekeken om te zien of ze geschikt zijn als een stabiel referentie-gen. […].

Statistische analyse

[…] Statistische significantie P < 0.05.

Resultaten

Karakteristieken van de individuen

[…] Er waren geen significante verschillen qua leeftijd en tellingen op vol bloed tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen. […] Er werd een significant verschil qua percentages lymfocyten en granulocyten, aantal lymfocyten en distributie-breedte van rode bloedcellen gezien tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen [telkens de 6 hierboven vermelde stalen].

HTS van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

Om kandidaat plasma-miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E. te selekteren, voerden we een initiële screening uit naar klein RNA over het ganse genoom bij 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles d.m.v. HTS. [verwerking van de gegevens leidde tot een ‘bibliotheek’] Initiële analyse van de RNA-lengtes in de ‘bibliotheek’ toonde pieken aan bij 22 en 32 nucleotiden. Deze RNA-groepen bleken miRNA en lang niet-coderend RNA (lncRNA) sequenties te bevatten. […] 17% was matuur miRNA, 80,5% was ander RNA (inclusief lncRNA en snoRNA [‘small nucleolar RNA’; klasse van kort enkelstrengig RNA dat tussenkomt bij modificaties van andere RNAs]). 75,1% van het ander RNA bestond uit lncRNA dat gekend staat als ‘Ro-associated’ RNA Y4 (RNY4) [Y RNAs zijn kleine niet coderende RNAs; oorspronkelijk geïdentificeerd als de RNA-component van ribonucleoproteïnen] […]. Bij het bekijken van de unieke RNA-stukken, bestond 44,3% uit miRNA, de andere RNA-soorten uit slechts 7%.

Differentiële expressie van plasma-miRNA bij CVS/M.E.

[…] Een totaal van 19 microRNAs was significant ontregeld bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles. Van die 19 miRNAs waren er 16 waarvan de hoeveelheid als laag werd beschouwd […], hun detektie bleek onbetrouwbaar […]. De overblijvende 3 miRNAs (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) waren allemaal ge-upreguleerd bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles.

RT-qPCR bevestiging van de plasma-miRNA sequentie-gegevens

De keuze van een stabiel referentie-gen is kritiek voor accurate gen-expressie analyse via RT-qPCR. Van de 4 vermeende referentie-genen die werden getest, bleek hsa-miR-16-5p de meest stabiele expressie te vertonen. Om de RNA-Seq resultaten (n = 6/groep) te valideren, voerden we RT-qPCR uit bij uitgebreidere groepen (n = 20/groep). Drie miRNAs met differentiële expressie (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) en vier miRNAs met niet-differentiële expressie (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103-3p, hsa-miR-146a-5p & hsa-miR-223-3p) werden geselekteerd en hun expressie gekwantificeerd gebruikmakend van RT-qPCR. De vier miRNAs met niet-differentiële expressie werden geselekteerd omdat ze eerder ontregeld bleken in cytotoxische lymfocyten van CVS/M.E.-patiënten, hoewel HTS geen differentiële expressie in plasma identificeerde. Alle RT-qPCR resultaten voor de overblijvende drie miRNAs waren consistent met de RNA-Seq gegevens.

Bespreking

Screenen op CVS/M.E. is tot nu toe gebaseerd op wel-omschreven definities. Profilering van circulerende miRNAs zou kunnen dienen om de molekulaire diagnose van CVS/M.E. te versterken. Gebruikmakend van Illumina HTS, identificeerde de huidige studie 19 miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E.-patiënten. Daarvan werden er slechts 3 bevestigd als zeer overvloedig bij de CVS/M.E.-patiënten in vergelijking met controles. Deze resultaten suggereren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CVS/M.E.

Hoewel er momenteel geen definitieve bron werd geïdentificeerd voor de aanwezigheid van miRNAs in bio-bloeistoffen, zouden bloedcellen – in het bijzonder reticulocyten [voorlopers van erythrocyten], myeloïde cellen [differentiëren naar erythrocyten, leukocyten en bloedplaatjes], lymfoïde cellen [differentiëren naar B-, T-, NK- en dendritische cellen], bloedplaatjes – cellen uit de lever, longen en nieren of gelyseerde cellen miRNAs kunnen afgeven in de circulatie. Ook zouden miRNAs in het plasma kunnen worden uitgescheiden na weefsel-schade – circulerend miR-1 & miR-133a zijn bv. significant verhoogd na acuut hart-infarct. De miRNAs in de huidige studie komen tot expressie in verscheidene weefsels. MiR-127-3p wordt gevonden in de testikels en het zenuwstelsel, miR-143-3p komt tot expressie in het colon, terwijl miR-142-5p tot expressie komt in cellen van het immuunsysteem. Er werd echter gerapporteerd dat miR-142-5p & miR-143-3p behoren tot de miRNAs die frequent worden gevonden in plasma en serum. Over-expressie van miR-142-5p werd gezien bij de meeste kanker-gerelateerde en immunologische aandoeningen. Dit miRNA komt overvloedig voor in de meeste haematopoïetische [haematopoïese = vorming van bloedcellen] cel-lijnen en zou betrokken kunnen zijn bij het counteren van inflammatoire processen. Bij Systemische Lupus Erythematosus (SLE) voorkomt verhoogde expressie van miR-142-5p in CD4+ T-cellen auto-immuniteit, terwijl een downregulering zou kunnen leiden tot autoreaktieve T-cellen en hyperaktieve B-cellen.

MiR-142-5p is belangrijk voor T-cel ontwikkeling […]. Inhibitie van miR-142-5p zou de expressie van CD84, IL-10, SAP [met SLAM – ‘signaling lymphocyte activation molecule’ – geassocieerd proteïne, een signaal-overdragend eiwit dat tot expressie komt op immuun-cellen] en IgG-produktie kunnen verhogen. CD84 is een belangrijke T-cel regulerende merker aangezien het cytokine-produktie, funktie, adhesie en interaktie met B-cellen reguleert. De waarden van IL-10 bleken dubbelzinnig bij CVS/M.E.-patiënten. De oorzaak van een stijging qua miR-142-5p is onbekend; het is echter waarschijnlijk dat dit verband zou kunnen houden met verhoogde Treg-suppressie en bijkomende auto-immune responsen.

MiR-143-3p […] is een tumor-suppressor gen en is sterk gedownreguleerd bij dikkedarm-kanker. Het inhibeert het oncogen KRAS [mutatie in het KRAS gen is essentieel voor de ontwikkeling van veel kankers]. Over-expressie van miR-143-3p doet in de meeste kanker-cellen de groei van tumoren en kanker-cellen stagneren aangezien het BCL2 [B-cell lymfoma 2] mRNA kan reduceren, waardoor het de proliferatie van tumor- of kanker-cellen voorkomt en apoptose bevordert. miR-143-3p werd geïdentificeerd als een neutrofiel-specifiek miRNA. Belangrijk: de expressie ervan wordt ge-upreguleerd in gevallen van verhoogde erythropoïese [vorming van rode bloedcellen] zoals bij polycytemie [abnormale toename van het aantal rode bloedcellen in het bloed]. Bij CVS/M.E. komt verhoogde neutrofiel-apoptose voor bij sommige patiënten [Zie: Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS] en dit komt mogelijks voort uit gestegen waarden van miR-143-3p.

MiR-127-3p interfereert met ERK-signalisering [‘extracellular signal-regulated kinases’], een tumor-suppressor, en upregulering bleek apoptose te verhogen. Belangrijk: het richt zich op BCL6 [B-cell lymfoma 6], een transcriptie-factor die p53 expressie verhoogt [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor]. BCL6 inhibeert de produktie van IL-10; daarom: het dempen van BCL6 tengevolge miR-127 upregulering zou kunnen resulteren in significante toenames van IL-10. In CVS/M.E. waren de rapporteringen over IL-10 waarden dubbelzinnig en een over-expressie van miR-127-3p zou in zekere matige sommige van deze patronen kunnen verklaren. BCL6 is een belangrijke transcriptie-factor die nodig is voor ontwikkeling van kiem-centra B-cellen [kiem-centra of ‘germinal centres’ zijn plaatsen in de lymfeknopen en het perifeer lymfe-weefsel waar rijpe B-lymfocyten snel prolifereren] en folliculaire [in de lymfe-klieren] helper T-cellen. Onregelmatigheden in de expressie van BCL6 zouden kunnen leiden tot afwijkende inflammatoire responsen en de ontwikkeling van verscheidene lymfomas.

[De volgende 3 alinea’s bespreken de technische uitdagingen qua methodiek.]

De aanwezigheid van een een hoog perecntage RNA Y4 in bij de kleine RNAs reduceerde de capaciteit van de miRNA sequentie-bepaling. Y RNAs zijn componenten van Ro ribonucleoproteïnen (RNPs) en werden eerst geïdentificeerd in het serum van patiënten met de auto-immune aandoening lupus erythematosus. Y RNAs zijn gelijkaardig qua grootte en struktuur als miRNAs aangezien ze beide vergelijkbare strukturen hebben. Deze overéénkomsten zouden de aanwezigheid van Y RNA na constructie van de kleine-RNA ‘bibliotheek’ kunnen verklaren. Efficiënte depletie van Y RNA zou ‘HTS’ miRNA gegevens van hogere kwaliteit opleveren, leidend tot diepere sequentie-bepaling. Methodes voor het verminderen van Y RNA op een zelfde manier als rRNA-depletie zou aangewend kunnen worden om de ratio van bruikbare miRNA-gegevens te verbeteren. De meeste studies over extracellulair miRNA zeggen niets over de overvloedigheid van Y RNAs in de circulatie […].

Plasma-miRNAs lijken beloftevol als mogelijke niet-invasieve biomerkers maar momenteel zijn de precieze en accurate meting nog een uitdaging. Een aantal factoren, inclusief cellulaire contaminatie, haemolyse en lage kwantitieit, kan leiden tot een vertekend beeld dat de oorspronkelijke biologische toestand van het staal niet weerspiegelt. De huidige research omtrent circulerend miRNA wijst aan dat haemolyse de beschikbaarheid van circulerende miRNAs kan beïnvloeden. Haemolyse kan worden geëvalueerd in gearchiveerde gegevens via het onderzoeken van de delta Cq [methode voor het bepalen van de genormaliseerde concentratie in een staal bij qPCR] van miR-451 en miR-23a. In gezonde individuen kunnen 194 miRNAs worden gedetekteerd in zowel gehaemolyseerde als niet-gehaemolyseerde bloedstalen; 40,2% vertoont upregulering bij haemolyse, 13% downregulering en 28,9% blijkt onveranderd door haemolyse. In de huidige studie zijn onze 3 kandidaat-miRNAs (miR-127-3p, miR-143-3p & miR-142-5p) bij de miRNA-genen die niet veranderen door haemolyse (bij gezonde individuen).

Het voordeel van circulerende miRNAs als biomerkers voor ziekten houdt verband met een aantal kenmerken zoals mindere complexiteit vergeleken met proteïnen, stabiliteit, geconserveerde sequenties bij verscheidene soorten en beperkte expressie in specifieke weefsels en biologische processen. Er werd gesuggereerd dat 206 miRNAs tot expressie komen in bloedcellen, serum en plasma; dus is het bij de meeste plasma- en serum-studies heel erg noodzakelijk strikte staal-verwerking-procedures in acht te nemen om er zeker van te zijn dat de stalen cel-vrij zijn. Contaminatie van bio-vloeistoffen met cellulaire inhoud kan worden beperkt door gebruik te maken van bijkomende centrifugatie-stappen tijdens de initiële plasma-afscheiding om mogelijke contaminatie met cellulair afval en haemolyse te verminderen. Daarnaast kan het belangrijk zijn bloedcel-aantallen en lyse te bepalen tijdens de staalname aangezien variatie qua plasma-waarden van miRNAs in sommige gevallen werd toegeschreven aan de effekten van circulerende bloedcellen. De begin-concentratie van miRNA varieert naar gelang het individu door de leeftijd, het geslacht en andere factoren, en dit kan een significante impact hebben op de uitkomsten van verschillende expressie-studies. Tot op heden zijn er geen vastgelegde referentie-waarden voor miRNAs bij normale individuen en dit kan noodzakelijk zijn wil men ze als diagnostische merker gaan gebruiken; vandaar dat de inclusie van geschikte calibrator-controles tijdens de RT-qPCR analyse noodzakelijk is. Niettemin: ondanks deze uitdagingen zijn miRNA-signaturen van normale individuen reproduceerbaar, met gelijklopende expressie-patronen en een beperkte mate variabiliteit.

Besluiten

De huidige studie suggereert dat plasma een bevredigende parameter zou kunnen zijn voor het bepalen van miRNAs als biomerkers bij CVS/M.E. De gegevens illustreren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p mogelijke plasma-biomerkers voor CVS/M.E.-diagnose zouden kunnen zijn. Verdere studies zijn echter vereist om deze bevindingen te valideren bij een grotere groep om de diagnostische kracht van deze bevindingen vast te stellen. De tekortkomingen bij het gebruik van bio-vloeistofen is de minieme hoeveelheid RNA, dus is een grote hoeveelheid staal dikwijls vereist om hoge opbrengsten en kwaliteit van het RNA te verkrijgen. Momenteel staat het gebruik van HTS als een middel om mogelijke veranderingen in miRNAs bij ziekten te detekteren in zijn kinderschoenen. Verdere studies zijn vereist om de methode ter verbetering van de detektie en het verkrijgen van betrouwbare gegevens die over verschillende studies kunnen worden gerepliceerd, te evalueren en verfijnen.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.