Solide mRNA expressie signatuur voor M.E.(cvs)

Er wordt volop gezocht naar merkers voor de diagnose van M.E.(cvs). Op deze pagina’s hadden we ’t al meermaals over indicaties voor de betrokkenheid van een erfelijke component. Men keek bv. al naar de mRNA-expressie maar de resultaten bleven inconsistent. Epigenetische veranderingen kunnen ook door infekties worden geïnduceerd. Er werden dus ook studies omtrent DNA-methylatie uitgevoerd door verschillende onderzoeksgroepen.

Hier werden gegevens over mRNA-expressie en DNA-methylatie uit eerdere studies gecombineerd en geanalyseerd d.m.v. nieuwsoortige computer-technieken. Er werd een aantal relevante genen gevonden en er werd ook vastgesteld dat deze zeer nauwkeurig een onderscheid kunnen maken tussen patiënten en controles. Het betrof vooral genen met een werking in immuun-mechanismen (MAPK4, ARRB1, GOLGA4, ABCE1 & PHKA2 met funkties bij intracellulaire signalisering; de immuuncel-receptoren en liganden IL2RB, CCR4, HLA-DQA1 & PRG4; en een gen coderend voor een proteïne dat betrokken is bij herstel van DNA-schade). De auteurs concluderen dat er bij M.E.(cvs) sprake is van een ontspoord immuunsysteem.

————————-

Scientific Reports Vol 11, #1, p 4541 (februari 2021)

Recursive ensemble feature selection provides a robust mRNA expression signature for Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Paula I Metselaar (1), Lucero Mendoza-Maldonado (2), Andrew Yung Fong Li Yim (3), Ilias Abarkan (4), Peter Henneman (3), Anje A Te Velde (1), Alexander Schonhuth (5), Jos A Bosch (6,7), Aletta D Kraneveld (4), Alejandro Lopez-Rincon (8,9)

1 Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, AGEM, Amsterdam UMC, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

2 Unidad de Citogenetica, Hospital Civil de Guadalajara ‘Juan I. Menchaca’, Guadalajara, Jalisco, Mexico

3 Department of Clinical Genetics, Amsterdam UMC, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

4 Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Science, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands

5 Genome Data Science, Faculty of Technology, Bielefeld University, Bielefeld, Germany

6 Department of Psychology, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

7 Department of Medical Psychology, Amsterdam UMC, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

8 Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Science, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands

9 Department of Data Science, Julius Centre for Health Sciences and Primary Care, University Medical Centre Utrecht, Utrecht, The Netherlands

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een chronische aandoening die wordt gekenmerkt door invaliderende vermoeidheid. Meerdere studies hebben, met wisselend resultaat, geprobeerd diagnostische biomerkers te identificeren. Hier vernieuwen we dit proces door het combineren van mRNA-expressie en DNA-methylatie gegevens. We voerden ‘recursive ensemble feature selection’ (REFS) uit op publiek beschikbare mRNA-expressie gegevens van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van 93 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles, en vonden een signatuur van 23 genen die in staat zijn gevallen en controles te onderscheiden. REFS overtrof andere methodes zeer sterk, met een AUC van 0,92. We valideerden de resultaten via een ander platform (AUC 0,95) en DNA-methylatie gegevens verkregen uit vier openbare studies aangaande M.E./CVS (99 patiënten en 50 controles), wat leidde tot de identificatie van 48 gen-geassocieerde CpGs die ook ziekte-status voorspelden (AUC 0,97). Ten slotte konden 10 van de 23 genen worden geïnterpreteerd in de context van een ontspoord immuunsysteem bij M.E./CVS.

Inleiding

[…] Er kunnen drie types M.E./CVS worden onderscheiden op basis van de medische voorgeschiedenis: 1) post-infektie gerelateerd, 2) (auto)immune ziekte gerelateerd en 3) van onbekende origine. […] De etiologie blijft onbegrepen, hoewel M.E./CVS een erfelijke component lijkt te hebben: genoom-brede associatie studies identificeren meerdere risico loci [Schlauch KA et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl. Psychiatry (2016) 6: e730 /// Perez M et al. Genetic predisposition for immune system, hormone, and metabolic dysfunction in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study. Front. Pediatr. (2019) 7: 206]. Bewijsmateriaal suggereert dat niet-genetische factoren zoals infekties epigenetische veranderingen kunnen induceren [Almenar-Pérez E et al. Epigenetic components of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome uncover potential transposable element activation. Clin. Therap. (2019) 41: 675-698; zie ook ‘HERV-K & HERV-W transcriptie-aktiviteit bij M.E.(cvs)’ /// Herrera S, de Vega WC et al. Genome-epigenome interactions associated with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Epigenetics (2018) 13: 1174-1190] die ook betrokken kunnen zijn bij de etiologie. Tot op heden is er geen prognostische of diagnostische test beschikbaar.

Meerdere studies focusten op mRNA-expressie om biomerkers te vinden die de diagnose ondersteunen en de etiologie beter helpen begrijpen. Jammer genoeg zijn de resultaten weinig consistent. Fang H et al. [Gene expression profile exploration of a large dataset on Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2016) 7: 429-40] vonden 164 mRNAs die significant differentieel tot expressive kwamen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van vermoeide versus niet-vermoeide deelnemers (n = 167). Presson AP et al. [Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst. Biol. (2008) 2: 95] reconstrueerden deze gegevens en hercodeerden de vermoeidheid-ernst voor de 167 deelnemers. Ze selekteerden 118 deelnemers voor een ‘Integrated Weighted Gene Co-expression Network Analysis’ (IWGCNA) die 20 kandidaat-genen gerelateerd met M.E./CVS-ernst identificeerde. Bij andere groepen vonden Gow JW et al. [A gene signature for post-infectious chronic fatigue syndrome. BMC Med Genom. (2009) 2: 38] 366 differentieel tot expressie komende mRNAs in PBMCs van acht post-infektueuze M.E./CVS-patiënten vs. zeven gezonde controles, en Nguyen CB et al. [Whole blood gene expression in adolescent Chronic Fatigue Syndrome: An exploratory cross-sectional study suggesting altered b cell differentiation and survival. J. Transl. Med. (2017) 15: 102] identificeerden 176 mRNAs in total-bloed van adolescenten (18 gezonde vs. 29 patiënten). Bij deze 366 en 176 mRNAs, gemeten in lichtjes verschillende cel-populaties, waren er slecht tien die overlapten. Ten slotte vonden Byrnes A et al. [Gene expression in peripheral blood leukocytes in monozygotic twins discordant for chronic fatigue: No evidence of a biomarker. PLoS ONE (2009) 4: e5805] geen differentiële expressie in perifeer bloed leukocyten (PBLs) van 44 monozygote tweeling-paren met/zonder M.E./CVS. Uit de resultaten van vier bijkomende differentiële expressie studies met PBLs, overlapte slechts één gen, MSN [‘membrane-organizing extension spike protein’, lid van een familie proteïnen die blijkbaar werken als cross-linkers tussen plasma-membranen en actine-cytoskeleton, ze zijn betrokken bij signalisering-mechanismen; het proteïne blijkt cruciaal te zijn bij T-cel aktivatie], bij twee onder hen.

Overweging van epigenetische factoren kan sommige van de inconsistenties helpen oplossen. Epigenetica bepaalt transcriptionele regulering op een overerfbare manier, maar kan toch worden beïnvloed door niet-genetische factoren. Het omvat een brede waaier aan modificaties die de DNA-sequentie niet veranderen maar waarvan wordt gedacht dat ze de toegankelijkheid aantasten en daardoor hun leesbaarheid. Eén zo’n modificatie is DNA-methylatie, het toevoegen van een methyl-groep op het vijfde koolstof-atoom van cytosine. Dit proces werd overwegend beschreven voor cytosinen gevolgd door guanine-residuen (CpG [cytosine-guanosine dinucleotide]). Er wordt dikwijls een verhoogde concentratie CpGs gezien in het promoter-gebied [promoter = nucleotide-sequentie vóór een gen dat dient als startplaats, aanknopingspunt voor DNA-transcriptie] van genen (dergelijke clusters worden CpG-eilanden genoemd). Promoter-methylatie is typisch omgekeerd gecorreleerd met de expressie van het betrokken gen: een hoge densiteit gemethyleerde CpGs correleren met lagere mRNA-expressie en omgekeerd. De Vega WC et al. hebben differentiële methylatie analyses uitgevoerd op PMBCs van M.E./CVS-patiënten [DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PloS ONE (2014) 9: e104757 /// Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). BMC Med. Genom. (2017) 10: 11 /// Integration of DNA methylation & health scores identifies subtypes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Epigenomics (2018) 10: 539-557] en rapporteerden tussen 1.192 en 12.608 differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen, gerelateerd met 826 tot 5.544 geannoteerde genen [genoom-annotatie = het identificeren van de lokaties van genen en alle coderende gebieden in een genoom, en bepalen wat die genen doen]. Gebruikmakend van een andere ‘micro-array’ methode met meer probes [sondes], vonden Trivedi MS et al. [Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLoS ONE (2018) 13: e0201066] 17.296 differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen gerelateerd met 6.368 genen. Naar ons weten heeft nog geen enkele studie mRNA-expressie gegevens en DNA-methylatie gegevens van M.E./CVS geïntegreerd.

In het licht van de voorafgaande bespreking, probeerden we publiek beschikbare mRNA-expressie en DNA-methylatie gegevens te integreren om biomerker-research bij M.E./CVS te vernieuwen. Daartoe maakten we gebruik van ‘recursive ensemble feature selection’ (REFS [recursief = herhalend/terugkerend; EFS = een techniek waarbij meerdere onstabiele klassificators worden gecombineerd om een stabielere en beter presterende klassificator voor het geheel te verkrijgen]), een klassificatie-methode waarvan […] werd bewezen dat het een betrouwbaar licht kan werpen op corresponderende verbanden. REFS werd gebruik ter identificatie van een robuuste mRNA-expressie signatuur die gevallen en controles kan differentiëren. Vervolgens onderzochten we of de gevonden bij ME./CVS differentieel tot expressie komende genen ook indicatief waren voor differentiële DNA-methylatie. Om methodes en resultaten van eerdere studies gelijk te stellen, vergeleken we ook de prestaties van REFS met IWGCNA en univariate analyses. Ten slotte probeerden we de biologische werking en relevantie van de via REFS geïdentificeerde genen als kandidaat-biomerkers voor M.E./CVS te interpreteren.

Resultaten [meer uitleg bij ‘Methodes’ hieronder]

Selektie van mRNA-expressie kenmerken

We lieten het REFS-algoritme tien keer lopen op de CAMDA mRNA-expressie dataset (118 stalen) en het algortime vond 23 voorspellende genen als optimaal aantal. Multivariate analyse van variantie (MANOVA [statistische test]) gaf een statistisch significant verschil aan tussen gezonde controles en M.E./CVS-patiënten (p < .0001 […]). De mRNA-expressie van al deze 23 voorspellende genen was gedownreguleerd bij M.E./CVS-patiënten. Daarna vergeleken we – om genen te identificeren die geassocieerd waren met M.E./CVS – onze resultaten met IWGCNA en univariate kenmerken-selektie van χ2 [chi-kwadraat, een statistische test voor de onafhankelijkheid van gebeurtenissen; bij ‘feature selection’ is het de bedoeling kenmerken te selekteren die zeer afhankelijk zijn van de respons], die werden gebruikt door Presson AP et al. en Byrnes A et al. [zie hierboven] respectievelijk.

IWGCNA construeert een co-expressie netwerk en geeft prioriteit aan modules van genen gebaseerd op hun associatie met een fenotype in combinatie met de aanwezigheid van een met ziekte geassocieerde genetische variant. Eigenlijk selekteert IWGCNA de belangrijkste genen op basis van de p-waarde. Presson AP et al. rapporteerden 20 kandidaat-genen op basis van mRNA-expressie gegevens van de CAMDA-dataset, dezelfde dataset waar we 23 voorspellende genen vonden via REFS. De resultaten van Presson AP et al. en ons REFS-algoritme konden dus direct worden vergeleken. Univariate kenmerken-selektie reduceert het aantal kenmerken gebruikmakend van univariate metingen (in dit geval χ2). […]. We berekenden de accuraatheid en de geassocieerde ‘receiver-operating characteristic’ (ROC) curve [reeds meermaals uitgelegd op deze pagina’s] voor alle drie de algoritmen. Het REFS-algoritme had een gemiddelde accuraatheid van 91,57% voor het differentiëren van controles en M.E./CVS-patiënten (globaal), de ‘Passive Aggressive’ klassificator [een ander ‘machine-learning’ algoritme] toonde een 95,87% accuraatheid als enkel de 23 kandidaat-genen werden gebruikt. Bovendien was de ‘area under the curve’ (AUC) van de ROC-curve voor REFS 0,92, wat als voortreffelijk wordt beschouwd. De vergeleken methodes waren slechts lichtjes beter dan toeval (IWGCNA: AUC = 0,51, univariate analyse: AUC = 0,56. Bij vergelijking van de belangrijke genen die elk van de drie methodes opleverden, vonden we dat REFS zowel IWGCNA als univariate analyse overtrof op basis van de ROC-curve […].

Validering van de platformen

Door toepassing van de resulterende mRNA-expressie signatuur op een afzonderlijke mRNA-dataset […] werden de platformen gevalideerd. Omwille van de beperkte grootte van het staal (n = 15), voerden we geen kenmerken-reductie uit maar pasten de 23 kandidaat-genen direct toe op de dataset. Aangezien de gegevens werden gemeten via een ander platform, overlapten niet alle genen met de CAMDA-dataset. Gebruikmakend van een genen-funktie instrument [een algoritme om een lijst van genen of geassocieerde biologische termen te condenseren naar georganiseerde klassen van gerelateerde genen of biologie, genaamd biologische modules], verkregen we 18 genen. Na training van het 18-genen model door 5-voudige kruis-validering, bereikten we een globale klassificatie-accuraatheid van 91,11% voor differentiatie van controles en M.E./CVS-patiënten met een ROC AUC van 0,95.

Selektie van DNA-methylatie kenmerken

We reduceerden het aantal CpG-probes tot 278 door selektie van probes geassocieerd met de 23 voorspellende genen. Van deze 278 CpGs, identificeerde REFS 48 CpGs als voorspellend voor M.E./CVS na tien ‘runs’ op de gecombineerde methylatie-gegevens. MANOVA analyse toonde een statistisch significant verschil tussen gezonde controles en M.E./CVS-patiënten (p < .0001 […]). De 48 CpGs bereikten een globale accuraatheid van 90,17% voor het onderscheiden van patiënten en controles. Bij vergelijking van CpG-methylatie tussen gevallen en controles, vertoonden CpG-plaatsen versterkte methylatie bij M.E./CVS-patiënten. ten slotte had de berekende ROC-curve een AUC van 0,97, wijzend op een duidelijk onderscheid tussen patiënten en controles bij toepassing van de 48 voorspellende CpG-plaatsen.

Biologische interpretatie van de gen-signatuur

Om onze bevindingen in een biologische context te plaatsen, bekeken we de bestaande literatuur aangaande de proteïnen gecodeerd door de 23 voorspellende genen die het REFS-algoritme opleverde. Deze resultaten werden verkregen voor PBMCs; daardoor focusten we op tien proteïnen – MAPK4, ARRB1, GOLGA4, ABCE1, PHKA2, IL2RB, CCR4, HLA-DQA1, PRG4 & OGG1 – met een werking in immuun-mechanismen. De mRNA-transcripten coderend voor deze proteïnen waren allen gedownreguleerd bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles.

Intracellulaire signalisering

In respons op extracellulaire stimuli (na binding op immuucel-receptoren) brengen mitogen-geaktiveerde proteïne-kinasen (MAPKs) intracellulaire signalen over via proteïne-fosforylatie cascades, om de cellulaire respons te mediëren. MAPK4 (ook gekend als ERK4) fosforyleert AKT op een directe manier, waardoor het mTOR signalisering-mechanisme [‘mammalian target of rapamycin complex 1’ of ‘mechanistic target of rapamycin complex 1’; proteïnen-complex dat werkt als een sensor voor nutriënten/energie/redox-toestand en proteïnen-synthese controleert] wordt geaktiveerd en uiteindelijk cel-overleving, proliferatie en metabolisme wordt gereguleerd. Verminderde MAPK4-aktiviteit is geassocieerd met gedaalde AKT-aktiviteit en proliferatie. Een andere intracellulaire mediator van de immuunrespons is ARRB1 (β-arrestine-1, ook bekend als arrestine-2). ARRB1 wordt in grote hoeveelheden gevonden in PBLs waar het G-proteïne gekoppelde receptoren inhibeert die gefosforyleerd zijn door β-adrenerge receptor kinase. GOLGA4 (golgine-A4) is een lid van de golgine proteïnen-familie [gelokaliseerd in het Golgi-apparaat van de cel, waar ze deelnemen aan glycosylatie en transport van proteïnen en lipiden]. Na macrofagen LPS aktivatie, wordt de vorming van dragers van GOLGA4 ge-upreguleerd, wat TNF-circulatie en daaropvolgende sekretie bleek te verhogen. Depletie van GOLGA4 verzwakt bijgevolg TNF-sekretie. ATP-bindende cassette subfamilie-E lid-1 (ABCE1), een celmembraan-transporter, inhibeert RNase-L aktiviteit. RNase-L is belangrijk voor in immune verdediging, aangezien het alle RNA binnenin de cel inhibeert na virale infektie en antiviraal IFNγ afgeeft. ABCE1 was gedownreguleerd in PBLs van M.E./CVS-patiënten, wat correleerde met ge-upreguleerd RNase-L [Vojdani A et al. Downregulation of rnase l inhibitor correlates with upregulation of interferon-induced proteins (2-5a synthetase and rnase l) in patients with chronic fatigue immune dysfunction syndrome. J. Clin. Lab. Immunol. (1998) 50: 1-16]. Ten slotte: PHKA2 is de hepatische isoform [vorm die in de lever voorkomt] van de alfa-subunit van fosforylase-b kinase. Dit enzyme fosforyleert glycogeen-fosforylase-b, waardoor het wordt geconverteerd naar het aktieve glycogeen-fosforylase-a, dat dan opgeslagen glycogeen afbreekt tot glucose. Dit glucose wordt via glycolyse omgezet naar ATP, om te voldoen aan de metabole vereisten. PHKA2 is zodoende belangrijk bij het energie-levering aan cellen via het handhaven van glucose-waarden. Mutaties in het PHKA2-gen veroorzaken glycogeen-opslag ziekte type-IXa, gekenmerkt door hypoglycemie, hepatomegalie [abnormaal vergrote lever], verhoogde lever-enzymen, groei-vertraging en motorische vertragiung, hypercholesterolemie en hypertriglyceridemie. Sommige patiënten rapporteren vermoeidheid en spierzwakte.

Immuuncel-receptoren en liganden

IL2RB is de β-subunit van de IL2-receptor, een receptor voor IL2 die betrokken is bij de differentiatie van regulerende, effector-, ‘memory’-, type-1 & -2 helper T-cellen. IL2RB-deficiënte patiënten vertonen ontregelde IL2 en IL15 signalisering, verhoogde waarden qua ‘natural killer’ cellen, en daaropvolgende immunodeficiëntie en verzwakte antivirale immuniteit. Een SNP in een onvertaald gebied van het gen bleek geassocieerd met M.E./CVS, door interferentie met miRNA-binding die de IL2-receptor funktie kan reduceren [Rajeevan MS et al. Pathway-focused genetic evaluation of immune and inflammation related genes with Chronic Fatigue Syndrome. Hum. Immunol. (2015) 76: 553-60]. CCR4 (CC-chemokine type-4 receptor) is een G-proteïne gekoppelde receptor die tot expressie komt op regulerende en type-2 helper T-cellen die CCL17 en CCL22 binden. Deze chemokinen veroorzaken chemotaxis [beweging van cellen als reaktie op een chemische prikkel] van de cel, sturen leukocyten en zijn betrokken bij ontwikkeling, homeostase en werking van het immuunsysteem. Bij mensen induceerde de blokkage van CCR4 door mogamulizumab [monoklonaal antilichaam] vermoeidheid. HLA-DQA1 is de α-keten van de MHC klasse-II receptor die tot expressie komt op antigen-presenterende cellen zoals macrofagen, B-lymfocyten en dendritische cellen [antigen-presenterende die antigenen verwerken en deze aanbieden aan T-cellen; ze fungeren als boodschappers tussen het aangeboren en adaptief immuunsysteem]. De MHC klasse-II receptor presenteert peptiden aan T-cel receptoren om het immuunsysteem te aktiveren na virale infektie. Proteoglycaan-4 (PRG4) is een immuuncel-ligand. Het is een smeermiddel dat de wrijving tussen gewrichten of grensgebieden reduceert, en gewijzigde expressie is betrokken bij Reumatoïde Artritis. Daarnaast werd gevonden dat PRG4 een mantel vormt op neutrofielen en macrofagen, misschien via binding met TLR2, -4, -5 of CD44, waardoor aktivatie door lage waarden pro-inflammatoire cytokinen wordt vermeden. Bij inflammatie, wanneer een immuunrespons is vereist, werd PRG4 door de immuuncellen afgeworpen om aktivatie toe te laten.

Herstel van DNA-schade

DNA-herstel enzyme 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) knipt specifiek de meest pre-mutagene [mutageen = aanleiding gevend tot mutaties] oxidatieve beschadiging 8-oxoguanine weg. Dergelijke DNA-schade veroorzaakt door blootstelling aan reaktieve zuurstof-soorten (ROS) leidt tot mutagenese of celdood. OGG1-aktiviteit voorkomt mutaties en patiënten met Alzheimer’s met een OGG1-polymorfisme vertonen verhoogde DNA-schade.

Bespreking

M.E./CVS is een chronische aandoening gekenmerkt door persistente, invaliderende vermoeidheid waar geen diagnostische of prognostische test voor bestaat, noch een complete behandeling beschikbaar voor is. Meerdere studies hebben geprobeerd biomerkers voor M.E./CVS te definiëren via analyse van differentiële mRNA-expressie of DNA-methylatie. Zoals Byrnes A et al. [zie hierboven] echter aangaven, waren deze resultaten studie-afhankelijk en er werd geen definitieve biomerkers gevonden. We gebruikten een ‘state-of-the-art’ ‘machine-learning’ techniek om M.E./CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles via verschillende platformen, meerdere groepen en op verschillende niveaus van gen-expressie regulering. Naar ons weten was dit de eerste keer dat een dergelijke techniek werd aangewend voor mRNA-expressie gegevens en gevalideerd met DNA-methylatie gegevens.

In deze studie implementeerden we het REFS-algoritme op pubkiek beschikbare mRNA-expressie gegevens en vonden 23 genen waarvan veranderingen qua expressie-niveaus in staat bleken M.E./CVS-patiënten te onderscheiden van gezonde controles. De 23 voorspellende genen differentieerden gevallen en controles met een globale accuraatheid van 91,57% en geven een ROC AUC van 0,92. Daarnaast waren 48 CpG methylatie-plaatsen geassocieerd met deze genen voorspellend voor M.E./CVS in vier samengevoegde DNA-methylatie studies. Bovendien waren alle 23 kandidaat-genen gedownreguleerd bij M.E./CVS-patiënten terwijl DNA-methylatie van bijna alle 48 CpG-plaatsen versterkt was. Deze omgekeerde correlatie tussen mRNA-expressie en DNA-methylatie, bij verschillende stalen en studies, legitimiseert de resultaten van onze studie. Zoals eerder aangetoond, identificeert REFS een meer accurate, robuuste gen-signatuur dan eerder gebruikte methodes. Na vergelijking van de gen-signatuur van de drie verschillende methodes, gebaseerd op dezelfde gegevens, bleek REFS het beter te doen dan zowel IWGCNA als univariate analyse wat betreft de scheiding van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles met een ROC AUC van 0,92. De AUC van de gen-signatuur toegepast op een ander platform was 0,95, en de AUC bereikte zelfs 0,97 bij het uitzetten van de sensitiviteit en specificiteit van de 48 voorspellende CpG-plaatsen.

Om de relevantie van de voorspellende genen te tonen, onderzochten we de biologische funkties van tien gecodeerde proteïnen met aktiviteit in immune mechanismen. Deze beslissing was gebaseerd op de mRNA-expressie gemeten in PBMCs en de literatuur die wijst in de richting van een belangrijke rol voor het immuunsysteem bij M.E./CVS. Sotzny F et al. [Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609] bekeken auto-immuniteit bij M.E./CVS en kwamen tot het besluit dat immunologische en metabole wijzingingen dikwijls werden gerapporteerd. De auteurs beklemtonen het potentieel belang van auto-antilichamen voor de aandoening en de voorgestelde rol van voorafgaande infekties. Downregulering van of ABCE1, één van de gecodeerde proteïnen die in onze studie werden geïdentificeerd, valt samen met de aanwezigheid van voorafgaande virale infekties, aangezien het proteïne de viraal RNA afbrekende aktiviteit van RNase-L inhibeert. Op dezelfde manier was ARRB1-proteïne gedaald na infektie met Epstein-Barr virus bij muizen. De downregulering ervan in onze studie stemt overéén met deze bevinding. Mandarano AH et al. [Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome patients exhibit altered T-cell metabolism and cytokine associations. J. Clin. Investig. (2020) 130: 1491-1505] beschreven bewijsmateriaal voor immune betrokkenheid in hun studie van 53 M.E./CVS-patiënten. Ze focusten specifiek op T-cellen en toonden dat CD8+ T-cellen van patiënten een lager mitochondriaal membraan-potentiaal hadden, wat wijst op T-cel uitputting. PHKA2 is noodzakelijk voor de eerste stap van de afbraak van glycogeen naar glucose. De downregulering ervan kan bijdragen tot verzwakte glycolyse in immuuncellen. Bij M.E./CVS hadden CD4+ en CD8+ T-cellen verstoorde glycolyse in rust, en plasma-glucose was gereduceerd. CD8+ T-cellen vertoonden een verstoorde metabole respons op aktivatie [zie Mandarano AH et al. hierboven]. Een andere studie [met muizen en menselijke gecultiveerde dendritische cellen] vond dat glycogeen-metabolisme de immuun-funkties van dendritische cellen reguleert. Inhibitie van glycogeen-fosforylase verstoorde hun capaciteit om inflammatoire cytokinen te produceren T-cellen te stimuleren. Combinatie van deze bevindingen suggereert dat verminderd PHKA2 in M.E./CVS glycogeen-fosforylase aktivatie kan inhiberen en zodoende de werking van dendritische cellen.

Meerdere (subunits van) immuuncel-receptoren maakten ook deel uit van onze gen-signatuur en bleken gedownreguleerd bij M.E./CVS. IL2RB, CCR4 & HLA-DQA1 zijn vitale elementen voor een gepaste immuunrespons; ontregeling (‘up’ of ‘down’) kan bewijs zijn voor een verstoord immuusysteem of er de oorzaak van zijn. Hetzelfde is waar voor gedaalde MAPK4-expressie, een alomtegenwoordige omzetter van intracellulaire signalen in respons op immuucel receptor-binding. Verder ‘downstream’ was GOLGA4 ge-upreguleerd in respons op LPS-aktivatie van macrofagen om de TNF-sekretie ter verhogen. TNF is het voornaamste pro-inflammatoir cytokine dat wordt afgegeven door inflammatoire macrofagen, en z’n ‘release’ is belangrijk voor het versterken van de aktivatie en recrutering van T-cellen, om robuuste responsen van het aangeboren en adaptief immuunsysteem te verzekeren. In onze studie was GOLGA4 echter gedownreguleerd in PBMCs van M.E./CVS-patiënten; wat mogelijks verzwakte TNF-sekretie en daaropvolgend een verstoorde immuunrespons op inflammatie kan veroorzaken. Verder leidt gedaalde expressie van PRG4 tot verminderde anti-inflammatoire werking van dit proteïne. Door het binden met immuuncel-receptoren voorkomt PRG4 de aktivatie door lage concentraties circulerende pro-inflammatoire cytokinen. PRG4 zou dus belangrijk kunnen zijn bij laaggradige inflammatie die M.E./CVS veroorzaakt [Montoya JG et al. Cytokine signature associated with disease severity in Chronic Fatigue Syndrome patients. Proc. Natl. Acad. Sci. (2017) 114; E7150–E7158].

Ten slotte: er is bewijs opgedoken voor het feit dat oxidatieve stress is toegenomen bij M.E./CVS, bv. in respons op inspanning, wat misschien sommige van de symptomen die worden gezien bij M.E./CVS veroorzaakt [bv. Kennedy G et al. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic. Biol. Med. (2005) 39: 584-9]. DNA-schade veroorzaakt door blootstelling aan ROS leidt tot mutagenese of cel-dood. OGG1 herstelt specifiek deze DNA-schade. OGG1-depletie in menselijke, van monocyten afgeleide dendritische cellen inhibeerde versterkte expressie van cel-oppervlakte molekulen en sekretie van pro-inflammatoire cytokinen na blootstelling aan 8-oxoguanine [meest courante DNA-beschading, het resultaat van modificatie van guanine door ROS]. Dit suggereert dat OGG1 belangrijk is voor aktivatie van dendritische cellen in respons op ROS. Terzelfder tijd veroorzaakten 8-oxoguanine beschadigingen geen acute of systemische inflammatie bij muizen waarbij het OGG1 gen-produkt ontbreekt. Aangezien we vonden dat OGG1 gedownreguleerd is bij M.E./CVS-patiënten, terwijl oxidatieve stress verhoogd is, kan DNA-schade verhoogd zijn; wat op z’n beurt de afgifte van ‘danger associated molecular patterns’ (DAMPs [componenten van de aangeboren immuunrespons afgegeven door beschadigde of stervende cellen na trauma of infektie]) veroorzaakt en het aangeboren immuunsysteem aktiveert. We kunnen besluiten, op basis van de verscheidene rollen van deze tien genen, dat hun downregulering niet enkel kan bijdragen tot immuun-aktivatie, maar ook tot een algemene ontregeling van de immuunrespons. Of alle genen oorzakelijk zijn voor het M.E./CVS-fenotype, of sommige slechts gevolgen van de immune chaos bij M.E./CVS-patiënten dient te worden onderzocht. [Een studie met FM-patiënten toonde ook gemiddeld significant hogere waarden OGG1 en 8-oxoG.]

Onze resultaten leveren een beloftevolle gen-signatuur op voor M.E./CVS die dient te worden gevalideerd in een goed gekarakteriseerde klinische groep om het aanwenden ervan als diagnostisch instrument te bestuderen. In een dergelijke groep dient het aantal gevallen en controles in evenwicht te zijn, aangezien de huidige studie lijdt onder een teveel aan gevallen bij zowel de mRNA-expressie en DNA-methylatie datasets. We compenseerden dit onevenwicht […]. Ten slotte: het onderzoek van de voorspellende genen bleef tot op heden beperkt tot een literatuur-‘review’. In vitro experimenten met PBMCs zouden bijkomende informatie moeten opleveren omtrent de werking van de genen.

Tot besluit: we vonden een mRNA-expressie signatuur met 23 genen voor M.E./CVS die in staat is gevallen en controles te scheiden. Deze kandidaat-genen kunnen mogelijks gebruikt worden als biomerkers voor diagnostische doeleinden. Daarnaast kunnen tien van deze genen worden geïnterpreteerd in de context van een ontspoord immuunsysteem bij M.E./CVS. Deze genen kunnen verder worden onderzocht ter identificatie van doelwitten en ontwikkeling van toekomstige behandelingen voor M.E./CVS.

Methodes

mRNA-expressie gegevens

De mRNA-expressie gegevens in deze studie kwamen van Presson AP et al. [zie hierboven], die beschikbaar waren via het CDC voor de 2006 ‘Critical Assessment of Microarray Data Analysis’ (CAMDA) conferentie. We verwijzen naar deze dataset als de CAMDA-dataset. De CAMDA- en volgende datasets werden gekozen omdat ze de enige grote, publiek beschikbare studies uitgevoerd op PBMCs zijn. Er wordt gedacht dat PBMCs betrokken zijn bij de pathofysiologie van M.E./CVS. In de CAMDA-dataset zijn mRNA-expressie waarden in PBMCs en vermoeidheid-ernst van 118 deelnmers opgenomen. Diagnose van M.E./CVS was op basis van de Fukuda-definitie criteria, en de vermoeidheid-ernst werd geschat op basis van geclusterde scores (SF-36 vermoeidheid-score, ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ & ‘Symptom Inventory Case Definition Score’. mRNA-expressie werd gemeten d.m.v. het ‘MWG Biotech micro-array’ platform (met probes voor ca. 20.000 transcripten).

Om de gegevens te analyseren, hernoemden we eerst de probes opnieuw met HGNC [menselijke genen nomenclatuur] gen-symbolen […], wat 15.419 gen-geassocieerde probes opleverde. De gegevens werden dan genormaliseerd […]. Stalen met lage vermoeidheid-graad werden gecodeerd als 0 (controles) en stalen met matige en hoge vermoeidheid-ernst als 1 (gevallen), op basis van de geclusterde scores. Alles tesamen werden 93 gevallen en 25 controles opgenomen voor REFS. Er werd een 10-voudige kruis-validatie in stappen uitgevoerd om tegemoet te komen aan de onevenwichtige verdeling tussen gevallen en controles.

Als test-dataset voor het algoritme werden mRNA-expressie waarden in PBMCs van post-infektueuze, mannelijke M.E./CVS-patiënten (n = 8) en gezonde mannelijke controles (n = 7) opgenomen [zie Gow JW et al. hierboven] in de […]. M.E./CVS werd bepaald via de Fukuda-definitie en mRNA-expressie werd gemeten met de ‘Affymetrix Human Genome U133A array’. Om die gegevens te analyseren, werd het matrix-bestand gebruikt […]. Gezien het klein aantal stalen werd een 5-voudige kruis-validatie uitgevoerd.

DNA-methylatie gegevens

[…] De DNA-methylatie datasets hebben betrekking op methylatie-profielen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles gemeten met de ‘Illumina HumanMethylation Infinium 450k BeadChip array’ (450k) en z’n opvolger, de ‘Illumina HumanMethylation Infinium EPIC BeadChip array’ (EPIC). De 450k en de EPIC meten de methylatie-status van 485.577 en 865.859 CpGs, respectievelijk, waarbij ca. 90% van de 450k probes aanwezig waren op de EPIC. In alle vier de studies werd M.E./CVS bepaald met de Fukuda & Canadese definities. Uit de ‘Gene Expression Omnibus’-databanken werden series matrix-bestanden met genormaliseerd percentage methylatie per CpG verkregen. De gegevens werd voor-verwerkt door het percentage methylatie per staal te in kaart te brengen, waarna de individuele datasets werden samengevoegd. Vervolgens werden de gegevens gespitst voor 10-voudige getrapte kruis-validatie. In het totaal omvatten de methylatie-gegevens 149 stalen (99 gevallen en 50 controles).

REFS op mRNA-expressie gegevens

Meerdere studies hebben univariate kenmmerken-selektie aangewend, met statistische metingen zoals χ2 [zie hierboven] of F-waarde [vergelijking/verhouding van twee varianties], die de kenmerken reduceren gebruikmakend van de hoogste scores, wat studie-specifieke resultaten oplevert. Om deze kwestie te boven te komen, werd REFS gebruikt om een mRNA-expressie signatuur te identificeren die in staat was ziekte-status te klassificeren in een PMBC-studie van M.E./CVS-patiënten en gezonde controles. De bruikbaarheid en accuraraatheid van REFS t.o.v. andere methodes werd eerder aangetoond met miRNA- & mRNA-datasets. In het kort: het REFS-algoritme reduceert het aantal kenmerken tot de meeste significante door het combineren van de resultaten van afzonderlijke klassificators van afzonderlijke topologieën [plaats-bepaling van de verschillende elementen in een netwerk, de manier waarop ze onderling met elkaar verbonden zijn]. Het algoritme geeft elk kenmerk een score, gebaseerd op hoe elk verschillende algoritme het gebruikte. In geval van een ‘boom’-stuktuur algoritme, hangt het af van hoeveel keer het kenmerk in de ‘boom’ voorkomt. Als het een op een coëfficient gebaseerd algoritme is, hangt het af van de waarde van de coëfficient (de hoogste is het meest belangrijke). […]

Het REFS-algoritme werd geïmplementeerd op de 15.419 gen-geassocieerde probes voa 10-voudige kruis-validatie […]. Tijdens de eerste herhaling reduceerde het algoritme de kenmerken tot de meest significante, waarna het aantal variabelen met 20% per stap werd gereduceerd (als de accuraatheid minder dan 70% is , volgt een bijkomende stap).

REFS op DNA-methylatie gegevens van kandidaat-genen

De DNA-methylatie platformen werden vertegenwoordigd door een groot aantal kenmerken: 485.577 en 865.859 voor de 450k en EPIC [de DNA-methylatie datasets], respectievelijk. Daarom werd de zoek-ruimte gereduceerd via een benadering met kandidaat-genen, waarbij CpGs enkel werden geselekteerd als ze verband hielden met de genen gevonden via REFS op de CAMDA-gegevens-set. In de praktijk werden CpG-probes geselekteerd […] wanneer de naam van het referentie-gen matchte met de genen die eerder werden geselekteerd via de ‘ensemble feature selection’ benadering.

Biologische interpretatie van de mRNA-expressie signatuur

Om de in de mRNA-expressie dataset met het REFS-algoritme geïdentificeerde genen in een biologisch perspectief te plaatsen, werd het proteïne dat door elk gen wordt gecodeerd onderzocht via de bestaande literatuur (Pubmed & Google Scholar, maart 2020). Omdat de analyses werden uitgevoerd met genetisch materiaal van PBMCs, werd de proteïnen-funktie onderzocht in de context van het immuunsysteem. Na initiële analyse werden tien proteïnen die in immuun-mechanismen funktioneerden geselekteerd voor verder literatuur-onderzoek.