Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS

Het BMJ (British Medical Journal) dat gewoonlijk niet echt belangstelling heeft voor research aangaande een fysieke oorzaak voor M.E.(cvs) schreef op 21 augustus 2004 (bmj.bmjjournals.com) over onderstaand artikel: “Er komt steeds meer bewijs dat mensen met Chronische Vermoeidheid Syndroom een detekteerbare immunologische abnormaliteit zouden kunnen hebben. Ze melden dikwijls symptomen die verenigbaar zijn met een onderliggende virale ziekte, en verhoogde apoptose (geprogrammeerde cel-dood) bij neutrofielen (een type witte bloedcel) wordt gevonden bij patiënten met infektie. […]”

Op een opmerking als zou neutrofiel-apoptose te wijten zijn aan een primaire psychologische aandoening laten de auteurs van onderstaand artikel in het BMJ noteren dat er geen studies zijn die aantonen dat neutrofielen bij depressieve patiënten significant apoptotisch zouden zijn en dat deze een verhoogd TGF-β1 zouden vertonen. De CVS-patiënten in de studie waren overigens niet depressief, noch overdreven angstig. Kennedy et al. laten ook weten dat de CVS-patiënten in deze studie zelfs accurater zouden kunnen worden omschreven als lijdend aan Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) zoals gedefinieerd door Ramsay [Ramsay M.A. (1988). Myalgic Encephalomyelitis and post-viral fatigue states: The saga of Royal Free disease (2nd ed.). Hampshire, UK: Gower].

Neutrofielen of neutrofiele granulocyten zijn kort-levende witte bloedcellen die zowel in het bloed als weefsels voorkomen. Ze maken deel uit van de primaire immuun-respons die snel infekties onder controle probeert te krijgen. Neutrofielen fagocyteren (= ‘opeten’, d.w.z. opnemen en intracellulair doden) bakterieën en schimmels en zorgen ervoor dat deze vernietigd worden. Neutrofiele granulocyten hebben het vermogen zich te verplaatsen in ons lichaam naar de plaats van een infektie, kunnen micro-organismen binden aan receptor-eiwitten op hun buiten-membraan om deze dan in een afgesloten pakketje (fagosoom) binnen de cel op te nemen en ze te doden d.m.v. van toxische eiwitten en zuurstof-produkten. Dat deze ‘a-specifieke’ tak van de immunologische afweer heel belangrijk is, blijkt duidelijk uit de levensbedreigende infekties die optreden bij patiënten met ernstig tekort aan neutrofielen (neutropenie) of met stoornissen in de funktie van deze cellen.

Een cel kan op twee manieren sterven. Necrose is het proces waarbij een cel op een abrupte manier doodgaat. Hierbij wordt de inhoud van de cel, het cytoplasma, in het omringende weefsel vrijgelaten (zogenaamde ‘cel-lyse’ door membraan-schade). Dit aktiveert het immuunsysteem, waardoor er een ontstekingsreaktie kan ontstaan. Apoptose is een voor een cel meer georganiseerde manier van sterven. Dit wordt ‘geprogrammeerde cel-dood’ (soms ook ‘cel-zelfmoord’) genoemd omdat in elke cel de mechanismen aanwezig zijn die apoptose mogelijk maken. Als een cel signalen van zijn omgeving krijgt die de cel tot apoptose aanzetten of als de cel zoveel schade heeft opgelopen dat verder bestaan niet mogelijk is, wordt een intracellulair mechanisme geaktiveerd. Door het tot expressie komen van een specifieke set genen wordt de cel aangezet om dood te gaan. Dit mechanisme leidt uiteindelijk tot de aktivatie van eiwit-splitsende enzymen (proteasen), de zogenaamde caspasen (cysteine-aspartyl-proteasen). Deze en andere enzymen zetten de cel aan tot het afbreken van proteïnen maar ook van DNA in de celkern en het cytoplasma. Een cel die apoptose ondergaat, vertoont een aantal kenmerken. Er worden kleine bolletjes cytoplasma (apoptotische lichaampjes) met cel-inhoud (mitochondrieën en cel-organellen) afgesplitst. Het erfelijk materiaal (DNA) van apoptotische cellen wordt in stukken geknipt (ladder-vorming) door het enyme endogeen-endonuclease. Cellen die apoptose ondergaan verliezen hun oppervlakte-strukturen en de cel-cel verbindingen worden verbroken (ze krimpen). Ze vertonen ook negatief geladen fosfolipiden op hun cel-oppervlak. die door fagocyten (‘etende cellen’) herkend worden. Na herkenning verwijdert de fagocyt de apoptotische cel en recycleert de bouwstenen.

Voor de lezer die niet geïnteresseerd is in de technische uitleg: lees de benadrukte passages…

Journal of Clinical Pathology 57:891-893 (2004)

Increased neutrophil apoptosis in Chronic Fatigue Syndrome

G Kennedy, V Spence, C Underwood and JJF Belch

Vascular Diseases Research Unit, University Department of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee DD1 9SY, UK

SAMENVATTING

Achtergrond/Doelstellingen: Veel patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) hebben symptomen die consistent zijn met een onderliggende virale of toxische ziekte. Omdat gestegen neutrofiel apoptose voorkomt bij patiënten met infektie, onderzocht deze studie of dit fenomeen ook voorkomt bij patiënten met CVS.

Methoden: Apoptose werd bepaald bij patiënten met CVS samen met concentraties van het anti-inflammatoir cytokine, ‘transforming growth factor-β1’ (TGF-β1).

Resultaten: De 47 patiënten met CVS hadden hogere aantallen apoptotische neutrofielen, lagere aantallen levensvatbare neutrofielen, verhoogde annexine-V binding en verhoogde expressie van de ‘dood’-receptor, tumor necrose factor receptor-I op hun neutrofielen dan de 34 gezonde controles. Patiënten met CVS hadden ook verhoogde concentraties aktief TGF-β1 (p<0.005).

Besluiten: Deze bevindingen leveren nieuw bewijs dat patiënten met CVS een onderliggende detekteerbare abnormaliteit in hun immuun-cellen hebben.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening zonder gekende etiologie of pathofysiologie. Bij de zoektocht naar een diagnostische test, heeft gen-profielering research de heterogene aard van CVS bevestigd, wat de nood illustreert voor volgehouden klinische screening gebaseerd op de uitsluiting van andere ziekten, te samen met de aanwezigheid van specifieke symptomen. Enkele van deze symptomen suggereren een onderliggende virale of toxische ziekte geassocieerd met aanhoudende infektie en immuun-aktivatie. Er zijn verscheidene rapporten geweest van immunologische stoornissen en virale infekties bij de ziekte.

50-60% van de totale circulerende witte bloed-cellen zijn neutrofielen. Het zijn kort-levende, reaktieve cellen die fundamenteel zijn voor het funktioneren van een intact immuunsysteem. Minieme veranderingen qua werking van neutrofielen kunnen diepgaande immunologische consequenties hebben: amplificatie van de inflammatoire respons en produktie van cytokinen. Als onderdeel van het antwoord op inflammatie, worden geaccumuleerde neutrofielen verwijderd via apoptose, een proces waarbij ongewenste of beschadigde cellen worden geëlimineerd zonder hun toxische inhoud af te geven en de inflammatoire respons aan te wakkeren. Het is ook een proces geassocieerd met de release van anti-inflammatoire mediatoren; in het bijzonder de produktie van ‘transforming growth factor-beta-1’ (TGF-β1) [Fadok VA, Bratton DL, Konowal A et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit pro-inflammatory cytokine-production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2 and PAF. J Clin Invest 1998;101:890-8], wat reeds betrokken is gebleken bij de pathogenese van CVS.

Hoewel verhoogde neutrofiel-apoptose aanwezig is bij patiënten met infektie, zijn er geen meldingen geweest over de funktie van neutrofielen bij patiënten met CVS. Het doel van onze studie was elementen van neutrofiel-apoptose en TGF-β1 bij patiënten met CVS te vergelijken met een controle-groep gezonde individuen van dezelfde leeftijd en geslacht.

METHODEN

Zevenenveertig patiënten die na klinisch onderzoek voldeden aan de ‘Centres for Disease Control’ klassificatie voor CVS en 34 gezonde individuen van dezelfde leeftijd en geslacht namen vrijwillig deel aan de studie. Alle individuen gaven schriftelijk hun geïnformeerde toestemming en de het plaatselijk medisch-ethisch comité gaf toelating voor de studie.

Neutrofielen werden geïsoleerd uit bloed […]. Ze werden onmiddelijk geïncubeerd met annexine-V en/of propidium-jodide (PI). Blootstelling aan fosfatidylserine op de buitenste laag van het cytoplasmisch membraan is kenmerkend voor vroege apoptose en is verbonden met preferentiële binding van annexine-V. Cellen met een intact plasma-membraan stoten PI uit en deze eigenschap blijft gehandhaafd in die cellen die zich in de vroege stadia van apoptose bevinden. In tegenstelling hiermee hebben necrotische cellen hun membraan-integriteit verloren en kleuren ze met PI. Neutrofielen die positief waren voor annexine-V werden als vroeg-apoptotisch beschouwd, neutrofielen die positief waren voor annexine-V én PI werden laat-apoptotisch en/of necrotisch genoemd, en neutrofielen die positief waren voor geen van beide werden geklassificeerd als leefbare cellen.

[M.a.w. Annexine-V bindt specifiek met fosfatidylserine, een molekule aan de buitenkant van het celmembraan dat al vroeg in het apoptose-proces verschijnt; door annexine-V te labelen met een fluorescerende kleurstof kan met behulp van flow-cytometrie het percentage annexine-V-positieve – dus vroeg-apoptotische – cellen worden bepaald. PI bindt aan de celkern en dus aan laat apoptotische, permeabele cellen; zo kan een onderscheid worden gemaakt tussen vroeg en laat-apoptotische cellen: drie populaties cellen kunnen worden onderscheiden: levend (annexine V^– en PI^–), vroeg-apoptotisch (annexine V⁺, PI^–) en laat-apoptotisch (annexine V⁺ en PI⁺)]

Expressie van tumor necrose factor receptor 1 (TNFR-1) op het oppervlak van leucocyten werd gemeten op een tweede bloed-staal d.m.v. een fluorescent gelabeld antilichaam […].

Het overblijvende bloed-staal werd gebruikt om bloedplaatjes-arm plasma (PPP) te bereiden en geaktiveerd TGF-β1 werd gemeten in het PPP d.m.v. ‘enzyme linked immunosorbent assay’ [ELISA, een immunologische techniek]. TGF-β1 is aanwezig in de granulen van bloedplaatjes en wordt afgegeven na aktivatie van de bloedplaatjes; daarom zijn de waarden in het PPP representatief voor concentraties in de circulatie. [Grainger DJ, Mosedale DE, Metcalf JC. TGF-beta in blood: a complex problem. Cytokine Growth Factor Rev 2000;11:133-45]

Alle bloedstalen werden op hetzelfde tijdstip van de dag genomen en alle testen uitgevoerd bij dezelfde persoon. De data waren normaal verdeeld […].

RESULTATEN

Kleuring met annexine-V en PI toonde dat patiënten met CVS significant (p = 0.002) meer apoptotische en significant (p = 0.002) minder leefbare neutrofielen hadden dan gezonde controles. Er was een trend bij patiënten met CVS tot het hebben van later-apoptotische/ necrotische neutrofielen (p = 0.075).

De neutrofielen van patiënten vertoonden ook verhoogde annexine-V binding (p = 0.001; 37,4% vergeleken met 22,8% in de controle-group). De gemiddelde expressie van annexine-V in de controle-groep (22,8%) was gelijkaardig met die gemeld door anderen (12,3-35,0%). De relatief brede spreiding is een resultaat van de methodologische verschillen in verscheidene laboratoria; er is ‘good laboratory practice’ vereist om te verzekeren dat alle stalen identiek worden behandeld. De expressie van neutrofielen TNFR-1 was ook significant hoger in de patiënten-groep (p = 0.004).

Er waren significant grotere hoeveelheden geaktiveerd TGF-β1 in het PPP van patiënten met CVS dan bij de gematchte gezonde controle-individuen (p = 0.005).

BESPREKING

We hebben aangetoond dat er een groter deel apoptotische cellen is bij de neutrofielen van patiënten met CVS en dat deze cellen significant minder leefbaar zijn vergeleken met deze van gezonde indviduen. Dezelfde neutrofielen brachten meer TNFR-1 ‘dood’-receptor molekulen tot expressie en vertoonden meer binding van annexine-V, wat wijst op fosfatidylserine-blootstelling.

[De TNF receptor (TNFR) super-familie is verdeeld in drie verschillende subgroepen: ‘dood’-receptoren, ‘afleider’-receptoren en aktiverende receptoren. De aktivatie van TNFR zorgt voor aktivatie van hun intracellulaire signalen door een aantal adaptor-eiwitten, ‘TNF receptor-associated factors’ (TRAFs). In het kort: De TNFR en TNF super-families reguleren het leven en de dood van geaktiveerde cellen van het immuunsysteem.

Dood-receptoren zijn receptoren op het cel-oppervlak die apoptotische signalen geïnitieerd door specifieke liganden (o.a. TNF-α) doorgeven. Ze spelen een belangrijke rol bij apoptose en kunnen de caspase-cascade zeer snel aktiveren.

TNF wordt aangemaakt door T-cellen en geaktiveerde macrofagen in respons op een infektie. Door zijn receptor TNFR-1 te aktiveren, kan TNF meerdere effekten uitoefenen. In sommige cellen zorgt dit voor aktivatie van NF-κB en AP-1 (zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’) wat leidt tot de inductie van een brede waaier aan genen. Soms kan TNF ook apoptose induceren – naast het mediëren van inflammatie en immuniteit. Binding van TNF-α aan TNFR-1 resulteert in receptor-trimerisatie en clusteren van intracellulaire ‘dood’-domeinen.

Het ‘death domain’ (DD) ontleent zijn naam aan het feit dat het betrokken is bij signalisering-processen die uiteindelijk leiden tot geprogrammeerde cel-dood via apoptose. Dit ‘dood-domein’ is een gebied binnen bepaalde proteïnen (o.a. TNFR) waardoor ze met zichzelf of met andere kunnen associëren.]

Apoptose wordt getriggerd door signalen die worden op gang gebracht door externe stimuli én interne sensoren. Het mechanisme gemedieerd door de ‘dood’-receptor, ook bekend als het extrinsieke mechansime, begint met de binding van liganden uit de TNF-familie op de ‘dood’-receptor TNFR-1. Dit resulteert in de recrutering van een adaptor-proteïne: ‘TNFR geassocieerd dood-domein’, dat op zijn beurt een andere adaptor-molekule recruteert: ‘Fas-geassocieerd dood-domain’. Dit recruteert dan pro-caspase 8 of pro-caspase 10 om een ‘dood’-inducerend signaal-complex te vormen. Tijdens de vorming van dit signaal-complex, worden pro-caspase vormen gesplitst en omgezet, zodat geaktiveerd caspase 8 of caspase 10 wordt afgegeven, die direct andere pro-caspasen converteren naar hun aktieve vormen, waardoor apoptose in werking wordt gesteld. Er is echter communicatie tussen de extrinsieke en intrinsieke (mitochondrieën-afhankelijke) mechanismen, en splitsing van het pro-apoptotisch proteïne ‘Bid’, door caspase 8, kan gebeuren. Deze splitsing kan resulteren in de release van cytochroom-C [eiwit in de respiratoire keten van cellen, voorafgaand aan apoptose begint het te lekken uit de mitochondrieën; eens dat lekken goed op gang komt, is de cel ten dode opgeschreven: cytochroom-C aktiveert in de celvloeistof proteasen die de grootschalige eiwitafbraak op gang brengen] en het triggeren van verdere apoptotische mechanismen. In onze studie hebben we getoond dat de neutrofielen van patiënten met CVS verhoogde expressie van TNFR-1 vertonen en we kunnen enkel veronderstellen dat de versnelde apoptose van deze cellen een gevolg is van extrinsieke factoren die apoptotische mechansimen beïnvloeden.

Daarnaast vonden we dat de concentraties aan geaktiveerd TGF-β1 significant waren verhoogd in het PPP van patiënten met CVS. Een stijging van geaktiveerd TGF-β1 samen met neutrofiel-apoptose is een belangrijk proces bij de downregulering van cytokinen en produktie van eicosanoïden [zie o.a. ‘Chronische microglia aktivatie na overmatige immuun-stimulatie’] tijdens het chronisch inflammatoir proces. TGF-β1 is ook cruciaal bij het apoptotisch proces omdat het leukocyten-adhesie en trans-migratie [cytokines, vrijgelaten door geaktiveerde macrofagen, induceren adhesie-molekulen op de wanden van vasculaire endotheelcellen waardoor neutrofielen, monocyten en lymfocyten aangetrokken worden voor ze uit het bloedvat treden, via een proces dat extravasatie genoemd wordt, naar het aangedane weefsel] intoomt [Smith WB, Noack L, Khew-Goodall Y et al. Transforming growth factor-beta 1 inhibits the production of IL-8 and the transmigration of neutrophils through activated endothelium. J Immunol 1996;157:360-8] en deze stoornis van het transmigratie-proces van neutrofielen kan onafhankelijk apoptose bevorderen. Neutrofielen die transmigreren door het endothelium verliezen TNF-receptoren en dit verlies aan receptor-densiteit is nodig voor het overleven van de neutrofielen.

[Onder de TGF (‘transforming growth factor’) familie valt een aantal polypeptiden die een rol spelen bij het reguleren van de groei en differentiatie van cellen. De veelvuldig onderzochte TGF-β met zijn drie isotopen TGF-β1, TGF-β2 en TGF-β3 heeft een funktie in het aanzetten van cellen tot groei en differentiatie voor vele weefsels in het lichaam. Bovendien heeft het daarnaast nog meer fuknkies, waaronder voor sommige celtypes zelfs ook remming van groei en differentiatie, bijvoorbeeld bij B-lymfocyten.. TGF-beta-1 is een cytokine dat in het CZS in verhoogde concentraties aanwezig is bij inflammatie en een belangrijke rol speelt bij de vorming van astrogliose (zie: ‘Gliale Cellen, Astrocyten en M.E.’); daarnaast is het ook betrokken bij apoptose en immunosuppressie.]

Het feit dat neutrofielen van patiënten met CVS verhoogde oppervlakte-expressie van TNFR-1 vertonen is een bijkomende indicatie dat die cellen meer vatbaar zijn voor apoptose.

De neutrofielen van patiënten met CVS vertonen meer apoptose en dit kan het aangeboren immuunsysteem van deze patiënten beïnvloeden, gezien het feit dat neutrofielen de belangrijkste effector-cellen van dit systeem zijn. De controle van apoptose is ingewikkeld en de stijging van apoptose bij patiënten met CVS kan een gevolg zijn van meerdere factoren. Versnelde apoptose wijst op een persistente of reaktiverende virale infektie of een toxische toesatnd, herprogrammering van apoptotische mechanismen door een infektueus of toxisch agens of snellere neutrofiel-turnover, secundair aan een abnormale gastheer-respons op schadelijke stimuli.

Met de komst van gen-profielering is de zoektocht naar causatieve agentia bij CVS van start gegaan. De gegevens die hier worden gepresenteerd zijn consistent met het feitt dat vele patiënten met CVS een onderliggende, detekteerbare abnormaliteit in het gedrag van hun immuun-cellen hebben, overeenkomend met een geaktiveerd inflammatoir proces.