M.E.(cvs)-wetenschap

juni 1, 2012

Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 5:22 am
Tags: , , , , , , , ,

De Australische onderzoek-groep die dit artikel publiceerde rapporteerde eerder al over abnormaliteiten met betrekking tot de ‘Natural Killer’ cellen, o.a. de aantallen CD56brightCD16 NK-cellen (zie ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’). In een ander artikel (‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’) dachten ze verder na over de molekulaire en/of cellulaire componenten die mogelijks als diagnostische merker voor M.E.(cvs) zouden kunnen dienen…

Er werd daartoe nagegaan (Brenu EW, van Driel ML, Staines DR, Ashton KJ, Hardcastle SL, Keane J, Tajouri L, Peterson D, Ramos SB, Marshall-Gradisnik SM. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Translational Medicine (2012) 10: 88 * geïnteresseerden kunnen het artkel opvragen) hoe het zit met de evolutie over tijd (12 maanden) van NK-cel cytotoxische aktiviteit, NK-cel subsets (CD56brightCD16 & CD56dimCD16+) en cytokinen. Er werd uit dit onderzoek besloten dat NK cytotoxicsche aktiviteit en mogelijks and CD56brightCD16 NK cellen potentiële biomerkers zijn bij de diagnose-stelling van M.E.(cvs).

Er treden natuurlijk ook veranderingen qua cytokine-sekretie op tijdens het verloop van de ziekte en op verschillende tijdstippen kan er een verschuiving zijn naar een overwegende Th1 of Th2 immuun-respons. M.E.(cvs)patiënten kunnen op bepaalde tijdstippen ofwel een versterkte of onderdrukte anti-inflammatoire of pro-inflammatoire cytokine-profiel vertonen. Dit maakt het moeilijk om een uniek, aan M.E.(cvs) verbonden, inflammatoir cytokine-profiel op te stellen (merk op dat cytokine-profielen gemeten na mitogene stimulatie van PMBCs of metingen van cytokinen in serum zowiezo ook al verschillende resultaten kunnen geven).

In onderstaand artikel wordt nagegaan wat een mogelijke oorzaak zou kunnen zijn van de verstoorde werking van cytotoxische cellen…

microRNAs (miRNAs) zijn kleine RNAs van 18 tot 24 nucleotiden lang die een spil-funktie vervullen bij het reguleren van gen-expressie. In plaats van vertaald te worden naar proteïnen, bindt het enkel-strengig miRNA op boodschapper-RNAs (mRNAs) om te interfereren met het translationeel proces (‘vertaling’ van RNA naar eiwitten). Er wordt geschat dat, hoewel slechts 1% van de genoom-transcripten (transcriptie: ‘overschrijving’ van DNA naar RNA) in zoogdier-cellen voor miRNA coderen, bijna één derde van de coderende genen wordt gereguleerd door miRNA. miRNA bieden een nieuwe benadering voor het begrijpen van het mechanisme van de ‘fine-tuning’ van gen-regulering.

————————-

Journal of Affective Disorders (Pre-print mei 2012)

Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis

Ekua W. Brenu (a,b), Kevin J. Ashton (b), Mieke van Driel (a,b,d), Donald R. Staines (a,e), Daniel Peterson (a,f), Gunn M. Atkinson (b), Sonya M. Marshall-Gradisnik (a,b,c)

a Faculty of Health Science and Medicine, Population Health and Neuroimmunology Unit, Bond University, Robina, Queensland, Australia

b Faculty of Health Science and Medicine, Bond University, Robina, Queensland, Australia

c School of Medical Science, Griffith Health Institute, Griffith University, Gold Coast Campus, Gold Coast, QLD, Australia

d Discipline of General Practice, School of Medicine, The University of Queensland, Brisbane, Australia

e Queensland Health, Gold Coast Public Health Unit, Robina, Gold Coast, Queensland, Australia

f Sierra Internal Medicine, Incline Village, Nevada, USA

Samenvatting

Achtergrond Immuun-dysfunktie geassocieerd met een ziekte heeft vaak een molekulaire basis. Een nieuwe groep molekulen, bekend als microRNA (miRNAs), bleken geassocieerd met onderdrukking van translationele processen betrokken bij cellulaire ontwikkeling en proliferatie, eiwit-sekretie, apoptose, immuun-funktie en inflammatoire processen. MicroRNAs kunnen betrokken zijn bij Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (ME/CVS), waar het immuunsysteem verstoord is. Het doel van deze studie was om de associatie tussen miRNAs in cytotoxische cellen en ME/CVS te bepalen.

Methodes Natural Killer (NK) en CD8+ T-cellen werden geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen van alle deelnemers (ME/CVS: n = 28; gemiddelde leeftijd = 41,8 ± 9,6 jaar en controles: n = 28; gemiddelde leeftijd = 45,3 ± 11,7 jaar) […]. Na extraktie van totaal RNA en daaropvolgende synthese van cDNA, werd ‘reverse transcriptase’-kwantitatieve polymerase ketting-reaktie (RT-qPCR) gebruikt om de expressie-niveaus van 19 miRNAs te bepalen.

Resultaten Er was een significante vermindering qua expressie-waarden van miR-21, in zowel de NK- en CD8+ T-cellen bij de CVS/ME-patiënten. Daarnaast was de expressie van miR-17-5p, miR-10a, miR-103, miR-152, miR-146a, miR-106, miR-223 en miR-191 aanzienlijk verminderd in NK-cellen bij CVS/ME-patiënten in vergelijking met de niet-vermoeide controles.

Beperkingen De resultaten van deze onderzoeken zijn nog niet te transfereren naar een klinische setting, verdere validatie-studies zijn nu nodig.

Conclusies Te samen genomen bleken deze miRNAs geassocieerd met apoptose, de cel-cyclus, ontwikkeling en het immuun-funktie. Veranderingen qua miRNAs in cytotoxische cellen kunnen de funktionele capaciteit van deze cellen verminderen en de effektieve cytotoxische aktiviteit, samen met andere immuun-funkties bij CVS/ME-patiënten verstoren.

1. Inleiding

Chronische Vermoeidheids Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME) is een multi-symptoom multi-factoriële en heterogene aandoening. ME/CVS komt voor bij ongeveer 1-4% van de individuen over de hele wereld en wordt gekenmerkt door gebreken qua korte-termijn geheugen en concentratie, gevoelige lymfe-klieren, spierpijn, ernstige hoofdpijn, slaap-stoornissen, ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise. Er werden immuniteit-merkers, waaronder verminderde cytotoxische aktiviteit geïdentificeerd [zie o.a. ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’, ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ & Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA: Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol (2005) 142: 505-511]. Differentiële expressie van genen betrokken bij immunologische, neurologische en metabole processen bleken ook betrokken bij ME/CVS [zie elders op deze paginas * o.a. Kerr et al.]. Een aantal van deze genen coderen voor transcriptie-factoren die gekend zijn voor het reguleren van immuun-funktie, zoals cytotoxiciteit, cytokinen en apoptose, en bleken verlaagd bij CVS/ME-patiënten.

Er werden andere regulerende molekulen geïdentificeerd die kenmerken kunnen hebben die vergelijkbaar zijn met transcriptie-factoren, deze molekulen staan bekend als microRNAs (miRNAs). Er werd voorspeld dat het menselijk genoom voor meer dan 1000 miRNAs kan coderen. MicroRNAs zijn sterk geconserveerde, niet-coderende RNA-molekulen van 18 tot 24 nucleotiden lang die zich bij voorkeur richten op 3’ niet-vertaalde gebieden [3’UTR, ‘untranslated regions’ stukje RNA na het zgn. stop-codon] van hun doelwit-mRNAs. MicroRNA komen tot expressie en worden omgezet in een primair miRNA uit introns van proteïne-/niet-coderende sequenties van exclusieve miRNA-genen of gastheer-genen. Het gevormde pri-miRNA wordt verwerkt tot een pre-miRNA en geïntegreerd in een ‘RNA-induced silencing complex’. [RISC; een multi-proteïne complex met één streng van een klein interfererend RNA (‘small interfering’ siRNA) of microRNA (miRNA). Het gebruikt het siRNA of miRNA als een patroon voor het herkennen van complementair mRNA. Wanneer het een complementaire streng vindt, aktiveert het RNase.] Het miRNA-RISC klieft complementaire mRNA-molekulen of inhibeert proteïne-translatie, wat resulteert in een verminderde synthese van het overéénkomstig eiwit [Behm-Ansmant I, Rehwinkel J, Izaurralde E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology (2006) 71: 523-530]. De interakties tussen miRNAs en mRNAs zijn belangrijk voor het behoud van coherente fysiologische processen, zoals het immuunsysteem. MicroRNAs zijn nodig tijdens de ontwikkeling, rijping, proliferatie, antigen-herkenning, apoptose-inductie en cytokine-sekretie van immuun-cellen [Liston A, Linterman M, Lu LF. MicroRNA in the adaptive immune system, in sickness and in health. Journal of Clinical Immunology (2010) 30: 339-346].

Ontregeling van de expressie van miRNAs kan een nadelige invloed op de homeostase van het immuunsysteem hebben. Bijvoorbeeld: tekortkomingen qua miR-155 bevorderen een verschuiving naar T-helper 2 (Th2) anti-inflammatoire immuun-reakties, terwijl in afwezigheid van miR-101 er auto-reaktieve T-cel gemedieerde auto-immuniteit optreedt. MicroRNAs zijn ook essentieel voor het moduleren van het immuun-responsen op bakteriële en virale infekties. Veranderingen in deze miRNAs kunnen een grote invloed hebben op immuun-reakties zoals cytotoxische aktiviteit, waarvan bekend staat dat deze aangetast is bij ME/CVS.

Het doel van deze studie was het beoordelen van de de mogelijke rol van miRNAs in cytotoxische cellen van het aangeboren (NK-cellen) en adaptief (CD8+ T-cellen) immuunsysteem bij CVS/ME-patiënten. Onze hypothese was dat aangezien miRNAs de expressie van verschillende genen kunnen verhogen of verlagen, ze ook betrokken kunnen zijn bij de regulering van cytotoxische cellen bij CVS/ME-patiënten. Voor zover we weten, is dit de eerste studie die de rol van miRNAs in cytotoxische cellen bij ME/CVS-patiënten onderzoekt.

2. Methodes

2.1. Recrutering

[…] De inclusie-criteria voor CVS/ME (n = 28; leeftijd = 42,0 ± 9,4 jaar) waren gebaseerd op de ‘Centres for Disease Control and Prevention (CDC)’ 1994 definitie, de niet-vermoeide gezonde controles (n = 28; leeftijd = 45,0 ± 14,0 jaar) […].

2.2. Staal-collectie en cel-isolatie

[…] NK en CD8+T Cel Isolatie Kit (Miltenyi Biotec) […]. De zuiverheid van de aangerijkte NK- of CD8+ T-cellen werd bepaald met de FACSCalibur flow-cytometer (BD Bioscience) na labelen met CD16/CD56 of CD8/CD3 monoclonale antilichamen (BD Bioscience). […] De ‘recovery’ [opbrengst] van geïsoleerde cellen werd berekend op basis van de observatie dat NK- en CD8+ T-cellen respectievelijk 2% en 5% van de lymfocyten in het perifeer bloed vertegenwoordigen […]. Recovery = verhouding van het percentage van het totaal aantal geïsoleerde cellen (NK- of CD8+ T-cellen) op het percentage cellen (NK- of CD8+ T-cellen) aanwezig in het volume bloed. […]

2.3. RNA-extractie en cDNA-synthese

[…] miRNeasy isolation kit (Qiagen) […]. Synthese van cDNA: NCode™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) […].

2.4. Analyse van miRNA gen-expressie

Een panel van 19 miRNAs die tot expressie komen in NK- en CD8+ T-cellen werd geselekteerd op basis van hun betrokkenheid bij immuun-cel funktie. Zes kleine niet-coderende RNA-genen (SNORD25, SCARNA17, SNORA73A, RNU5A, RNU1A en RNU6B) (Qiagen) werden beoordeeld d.m.v. GeNorm [populair algoritme om het meest stabiele referentie- (huishoudelijk) gen te bepalen] om hun bruikbaarheid te bepalen als referentie-gen. RNU1A bleek het meest stabiel en diende daarom als de endogene referentie-controle voor alle miRNAs in deze studie. RT-qPCR: CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). […]

2.5. Data- en statistische analyse

[…]

3. Resultaten

3.1. Eigenschappen van de deelnemers

De deelnemers aan deze studie werden willekeurig geselekteerd uit een groep met gekende dalingen qua NK- en CD8+ T-cel cytotoxische aktiviteit. […] Er waren geen significante verschillen qua aantallen witte bloedcellen tussen CVS/ME-patiënten en controles; het gemiddeld bloedplaatjes-volume was echter significant verschillend tussen de twee groepen.

3.2. Cel-zuiverheid en ‘recovery’

Er werden een hoge zuiverheid (> 93%) vastgesteld na isolatie en aanrijking. De ‘recovery’ (gemeten als het percentage van de geïsoleerde cellen na aanrijking op het verwacht aantal NK- of CD8+ T-cellen aanwezig in het veneus bloed). was hoger voor de NK-cellen (> 90%) in vergelijking met de CD8+ T-cellen (> 83%).

3.3. RT-qPCR resultaten

De keuze van een stabiel referentie-gen is kritiek voor een accurate gen-experiment analyse, daarom werd een aantal van de referentie-genen onderzocht om te bepalen welke het best mogelijke gen is. De expressie van niet-coderende RNAs varieerde in de NK- én de CD8+ T-cellen. In beide waren er […] geen significante verschillen tussen de twee groepen wat betreft expressie van de referentie-genen. RNU1A bleek het meest stabiele referentie-gen voor beide cel-types; daarnaast leek zijn relatieve aanwezigheid het meest op de gemiddelde aanwezigheid van de onderzochte miRNAs. […]

De expressie-niveaus van 19 miRNAs werden vergeleken tussen CVS/ME en niet-vermoeide controles. Globaal hadden NK-cellen het meest gedownreguleerde miRNAs in de CVS/ME-populatie vergeleken met de niet-vermoeide controles. Van de geselekteerde miRNAs zijn er acht met een regulerende rol met betrekking tot apoptose, en vier daarvan (miR-10a, miR-146a, miR-191 en miR-223) bleken significant gedaald in de NK-cellen, terwijl geen enkele significant waren gedaald in de CD8+ T-cellen. Ook van de zes onderzochte miRNAs betrokken bij cel-proliferatie waren er vier (miR-17-5p, miR-21, miR-106 en miR-152) significant verminderd in de NK-cellen. Een tweevoudige toename werd ook geobserveerd voor miR-21 in de CD8+ T-cellen van de CVS/ME-groep. Van de resterende vijf miRNAs met een brede werking bij immuniteit, was enkel miR-103 significant verminderd in NK-cellen.

4. Bespreking

We onderzochten de expressie van miRNAs en de bijdrage van miRNAs aan het immuun-profiel van cytotoxische cellen (NK- en CD8+ T-cellen) bij CVS/ME-patiënten. Niet-coderende RNA-molekulen beïnvloeden fysiologische processen en bepaalde pathologische aandoeningen. Onze patiënten-groepen hadden vergelijkbare cel-aantallen, wat betekent dat ME/CVS niet geassocieerd is met veranderingen qua cel-aantallen. Er waren ook geen significante verschillen qua aantal geïsoleerde cellen voor elke groep. Het gemiddeld bloedplaatjes-volume was echter verminderd bij de niet-vermoeide controles, in vergelijking met de CVS/ME-patiënten; dit kan te wijten zijn aan individuele kenmerken en de heterogene aard van CVS/ME. Er werd elders gerapporteerd dat het gemiddelde bloedplaatjes-volume verlaagd is bij CVS/ME-patiënten en dit was niet geassocieerd met een verhoogde bloedplaatjes-aktivatie of een hyper-coagulatie toestand [Kennedy G, Norris G, Spence V, McLaren M, Belch JJ. Is Chronic Fatigue Syndrome associated with platelet activation? Blood Coagulation & Fibrinolysis (2006) 17: 89-92].

Dit onderzoek heeft significante downregulering qua expressie van miRNAs bij een ME/CVS-populatie aangetoond in vergelijking met een niet-vermoeide controle-groep. Deze bevindingen impliceren miRNAs in de pathogenese van ME/CVS, mogelijks verband houdend met de cytotoxische werking van NK- en CD8+ T-cellen, welke consequent verlaagd bleek bij patiënten met CVS/ME. Als de cytotoxische aktiviteit van NK-cellen beschouwd wordt als een mogelijke biomerker voor CVS/ME [zie ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?’], dan is het noodzakelijk om alle onderdelen van het proces, die erdoor kunnen worden aangetast, te bepalen.

NK- en CD8+ T-cellen zijn belangrijke apoptose-inductoren, daarom zou een downregulering van miR-10a, miR-146a, miR-223 en miR-191 invloed kunnen hebben op de efficiëntie van deze cellen om apoptose van doelwit-cellen te induceren [Subramanian S, Steer CJ. MicroRNAs as gatekeepers of apoptosis. Journal of Cellular Physiology (2010) 223: 289-298]. Deze miRNAs bevorderen apoptose door zich te richten op de 3’UTR-regio van BCL2 [apoptose-regulator], CDK6 [cel-deling proteïne] en BAX [bevordert apoptose], en inhiberen daarmee hun expressie op post-transcriptioneel niveau, wat mogelijks leidt tot verhoogde geprogrammeerde cel-dood.

Hoewel de werking van deze miRNAs in cytotoxische cellen niet expliciet gekend is, zouden de genen waarop deze miRNAs zich richten, een rol bij de cytotoxische aktiviteit van NK-cellen kunnen suggereren. Vandaar dat een daling van hun expressie de inductie van cel-dood kan induceren en mogelijks ook een invloed kan hebben op de betrokkenheid van deze cellen bij apoptose van virus-geïnfekteerde cellen bij CVS/ME. Interessant is dat miR-146a wordt gemoduleerd door NF-κB [zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’ & ‘NF-κB en Inspanning] en de expressie onderdrukt van de met Toll-like receptor signalisering gerelateerde eiwitten TRAF6 en IRAK1 in immuun-cellen. Dit resulteert in een afname van TNF-α en helpt het handhaven van inflammatoire tolerantie bevorderende cel-overleving en het voorkomen van een hyper-aktief immuunsysteem. Bij onze CVS/ME-patiënten was de TNF-α sekretie door PMBCs na mitogene stimulatie significant verhoogd op het moment dat de metingen werden uitgevoerd. NF-κB reguleert ook de expressie van pro-inflammatoire cytokinen TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2 en IL-12, waardoor een daling qua miR-146a geassocieerd kan zijn met een verlaging van NF-kB en zo cytokine-expressie kan beïnvloeden. Overigens werden aanzienlijke verlagingen van IFN-G waargenomen in de NK-cellen bij onze CVS/ME-groep vergeleken met de niet-vermoeide controles. Dit suggereert een mogelijke afname van de IFN-G geïnduceerde cytotoxische aktiviteit bij CVS/ME-patiënten.

Daarnaast vergemakkelijkt miR-191 de p53-funktie [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] door zich te richten op p53-inhibitoren, zoals Mdm4 [speelt een rol bij apoptose], waardoor lage niveaus van miR-191, bij CVS/ME-patiënten een invloed zouden kunnen hebben op cel-cyclus gebeurtenissen gerelateerd met p53-regulering. Met behulp van de microrna.org database [voorspelde microRNA doelwitten & downregulering-scores] hebben we ook potentiële doelwit-sites voor miR-191 gevonden; deze omvatten BCL214 en IL2RA. Een directe associatie van miRNAs en cytotoxische aktiviteit kan gepaard gaan met miR-152, dat zich richt op inhiberend humaan leukocyt antigen [HLA] -G [histocompatibiliteit-antigen met een rol bij immuun-tolerantie tijdens zwangerschap] richt. CVS/ME-patiënten hebben een verminderde cytotoxische cel funktie en miR-152 kan betrokken zijn bij dit mechanisme. Belangrijk is dat miR-223 zich bleek te richten op de 3’UTR-regio van GZMB [gen coderend voor Granzyme-B] mRNA bij muizen. Hoewel niet bekend is welke andere miRNAs zich richten op granzymen [enzymen die cellen doden door apoptose (geprogrammeerde cel-dood) te veroorzaken; ze komen voor in de granulen van NK-cellen en cytotoxische T-cellen; de varianten zijn A, B, H, K en M. Bij het aanvallen van cellen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen komt ook het enzyme perforine vrij; dat maakt porieën in het celmembraan.], werd in onze eerdere studie een vermindering van GZMA en GZMK [genen coderend voor Granzyme-A & -K] waargenomen bij de CVS/ME-groep in vergelijking met de niet-vermoeide controles. Granzyme-funktie en -regulering zijn misschien geassocieerd met de aanwezigheid van bepaalde miRNAs op de 3’UTR-gebieden van deze granzyme-genen.

De miRNAs miR-21, miR-106, miR-152 en miR-17-5p bevorderen cel-proliferatie. Zij inhiberen apoptose door het negatief reguleren van apoptotische tumor-suppressor gerelateerde genen (PDCD4, PTEN, TMPI en RECK). De waarneming van dalingen van deze miRNAs is anders dan men zou verwachten, aangezien soortgelijke bevindingen werden waargenomen bij apoptotische promoters. Dit veronderstelt dat deze miRNAs betrokken kunnen zijn bij andere aspekten van de immuun-funktie bij CVS/ME. Zo reguleren deze miRNAs ook bepaalde door NK-cellen geproduceerde cytokinen. Bijvoorbeeld: miR-21 downreguleert IL-12, die cytotoxische aktiviteit inhibeert; zodat een downregulering van miR-21 resulteert in een over-expressie van IL-12, die de cytotoxische aktiviteit sterk kan dempen in NK-cellen. miR-21 is belangrijk tijdens de ontwikkeling en differentiatie van effector CD8+ T-cellen, hoewel het doel van deze toename onduidelijk is. Tijdens pathogeen-invasie of immuun-aanval kunnen CD8+ T-cellen en NK-cellen door miR-21 worden voorbereid, en dit kan de cytotoxische aktiviteit van deze cellen vergemakkelijken, aangezien ze beide een vergelijkbare afname qua miR-21 vertoonden. miR-103 was significant verminderd bij de NK-cellen van CVS/ME-patiënten. Het kan een rol spelen bij het creëeren van de RISC.

Er kunnen parallellen worden getrokken tussen de bevindingen van deze studie en deze van ons eerder werk. In het bijzonder: miR-146a en miR-21 reguleren FOXP3 en Treg funktie, die verstoord bleek in onze vorige studie. Zo ook kunnen dalingen qua expressie van miR-152 en miR-21 verantwoordelijk zijn voor de verminderde cytotoxiciteit van, respectievelijk, NK- en CD8+ T-cellen bij CVS/ME-patiënten. Verhoogde waarden van miR-152 kunnen doeltreffende NK cytolytische aktiviteit bevorderen, terwijl miR-21 van vitaal belang is voor effector-cellen [Een antigen-specifieke ‘memory’ T-cel expandert tot grote aantallen effector T-cellen bij her-blootstelling aan het oorspronkelijk antigen.].

De hierboven genoemde miRNAs kunnen dienen als potentiële biomarkers voor de diagnose en het vaststellen van CVS/ME-patiënten. De methodiek die in dit artikel beschreven wordt, kan omslachtig zijn in klinische settings, maar identificatie van miRNA biomerkers in plasma of serum kan nuttiger zijn. Analyse van circulerende miRNAs in het plasma en serum kunnen dienen als biomerkers voor kanker en andere auto-immuun-ziekten [Chen X et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Research (2008) 18: 997-1006]. Identificatie van miRNAs als biomerkers voor ME/CVS kunnen ons begrip van de ziekte-presentatie verbeteren en betere diagnostische strategieën voor deze patiënten helpen vinden.

5. Besluit

Samengevat: miRNAs zouden een rol kunnen spelen bij de immunologische veranderingen die gepaard gaan met ME/CVS. Deze studie heeft miRNAs geïdentificeerd die zouden kunnen worden gebruikt als potentiële biomerkers voor CVS/ME; meer bepaald: miR-146a, miR-223 en miR-21. Hoewel de huidige literatuur over de invloed van deze miRNAs op NK- en CD8+ T-cel gerelateerde lytische eiwitten, receptoren en cytotoxische aktiviteit beperkt is, suggereert de aanwezigheid van gelijkaardige expressie-niveaus van miRNAs in beide cellen een gemeenschappelijk mechanisme. Cellen die door deze miRNAs worden gereguleerd kunnen van belang zijn bij het begrijpen van het mechanisme bij CVS/ME. Verdere studies zijn nodig om de exacte genen te bepalen die worden gereguleerd door deze miRNAs in cytotoxische cellen en hun longitudinale expressie-patronen.

Advertenties

mei 5, 2011

Mest-cellen & Substantie-P

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 3:07 pm
Tags: , , , , , , , ,

In 2006 kreeg Prof. dr Theoharis C. Theoharides van de ‘Tufts University School of Medicine’ van de ‘National Institutes of Health’s (NIH) Office of Research on Women’s Health (ORWH)’ en de ‘Trans-NIH Working Group for Research in Chronic Fatigue Syndrome (CFSWG)’ een beurs voor onderzoek naar ‘Mast Cells, Antidepressants and Chronic Fatigue Syndrome’. Daarbij zou hij het belang onderzoeken van menselijke mest-cellen in de hersenen bij de ontwikkeling van CVS. Hij gaf op de ‘State of the Knowledge Workshop’ over M.E./CVS (‘National Institutes of Health) in april 2011 de voordracht ‘Substance-P stimulated TNF-secretion from human mast-cells involves fission and translocation of mitochondria with extracellular DNA release that induces auto-inflammation, processes blocked by the natural flavonoid luteolin’. Daar tot op heden een publicatie specifiek over deze materie bij patiënten met M.E.(cvs) ontbreekt, geven we hieronder een artikel mee aangaande zijn hypothese omtrent de mogelijke betrokkenheid van mest-cellen bij fibromyalgie (FMS); waarbij natuurlijk dient te worden onthouden dat FMS en M.E.(cvs) weliswaar samen kunnen voorkomen maar niet hetzelfde zijn!

Er werd in de literatuur reeds gerapporteerd over zgn. mest-cel aktivatie ziekte (MCAD – Disorder of MCAS – Syndrome): aandoeningen gekenmerkt door accumulatie van genetisch gewijzigde mest-cellen en/of abnormale release van mediatoren door deze cellen, die funkties in mogelijks elk orgaan-systeem aantasten, maar dikwijls zonder abnormale routine-laboratorium (normale of bijna normale aantallen) of radiologisch onderzoek. Bij deze aandoeningen is er iets mis met apoptose, geprogrammeerde cel-dood: de mest-cellen sterven niet waardoor hun aantal verhoogt. Ze worden makkelijk gestimuleerd en dan ‘degranuleren’ ze: hun inhoud komt in één keer vrij of ze lekken.

Een Italiaanse onderzoek-groep vond eerder ook al dat het NF-kappa B mechanisme (hier reeds meermaals aan bod gekomen) ook betrokken is bij de transcriptie-regulering van TNF-alfa en IL-6 over-expressie in door Substantie-P gestimuleerde mest-cellen. (Azzolina A, Bongiovanni A, Lampiasi N. Biochim Biophys Acta (2003) 7;1643(1-3): 75-83)…

Substantie-P (SP) is een neuropeptide dat funktioneert als een neurotransmitter en als een neuromodulator. Het wordt afgegeven door de uiteinden van specifieke sensorische zenuwen, wordt gevonden in de hersenen en het ruggemerg, en is geassocieerd met inflammatoire processen en pijn. Substantie-P is verhoogd in het cerebrospinaal vocht bij FMS maar blijkbaar werd dit tot hier toe niet bij M.E.(cvs) gevonden. Na binding op de neurokinine-1 (NK-1) receptor, reguleert SP ook biologische funkties gerelateerd met kanker: tumor-cel proliferatie, angiogenese (vorming van bloedvaten) en migratie van de tumor-cellen (invasie en metastase). SP oefent ook een anti-apoptotisch effekt uit.

Mest-cellen (of mastocyten) zijn een type immuun-cellen die een rol spelen bij allergie en overgevoeligheid, ze zijn ook betrokken bij wond-heling en verdediging tegen pathogenen. Ze komen in alle weefsels voor (ook in spieren, en in het brein waar ze zich dicht bij zenuw-uiteinden bevinden) maar worden vooral gevonden in de slijmvliezen en de huid. Ze dragen IgE-antilichamen op hun oppervlak. Bij contact met het allergeen (antigen waarop het antilichaam bindt) geven ze een reeks mediatoren af: histamine, leukotriënen, prostaglandinen, chemotactische factoren, enzymen en cytokinen. Ze kunnen ook worden geprikkeld door andere mediatoren (bv. leukotriënen), door sommige geneesmiddelen (bv. morfine, codeïne, vancomycine) en – direct – door histamine-vrijmakende bestanddelen uit voeding. Dit subtype witte bloedcellen speelt niet alleen een rol bij allergie(waarbij ze degranueleren – hun inhoud vrijgeven) maar ook bij inflammatie en wellicht verschillende aandoeningen (o.a. M.S. en misschien ook M.E.(cvs) – waarbij ze niet degranuleren)…

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology Vol. 19, no. 1, 5-9 (2006)

Fibromyalgia – New Concepts of Pathogenesis and Treatment

H.J. Lucas, C.M. Brauch1, L. Settas2 & T.C. Theoharides3

1 The Feller Pharmacy, Fell, Germany

2 Department of Rheumatology, Aristotle University of Thessaloniki, AHEPA Hospital, Thessaloniki, Greece

3 Departments of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Internal Medicine and Biochemistry, Tufts University School of Medicine, Tufts-New England Medical Centre, USA

(delen van het werk werden ondersteund door ‘Theta Biomedical Consulting and Development Co., Inc.’, Brookline, MA [bedrijfje van Theoharides dat advies geeft op vlak van biomedische wetenschappelijke research aan de biomedische industrie en patenten houdt i.v.m. mast-cellen])

Fibromyalgie (FMS) is een invaliderende aandoening gekenmerkt door chronische diffuse spierpijn, vermoeidheid, slaap-stoornissen, depressie en huid-sensitiviteit. Er zijn geen genetische of biochemische merkers, en de patiënten hebben dikwijls co-morbide ziekten zoals migraine, interstitiële cystitis [chronische, niet-infektueuze inflammatie van de blaas] en prikkelbare darm syndroom. De diagnose omvat de aanwezigheid van 11/18 trigger-punten, maar veel patiënten met vroege symptomen zouden wel es niet aan deze definitie kunnen voldoen. De pathogenese is nog onbekend maar er is bewijs voor verhoogde ‘corticotropin-releasing’ hormoon (CRH) en substantie-P (SP) in het cerebrospinaal vocht van FMS-patiënten, alsook verhoogd SP, IL-6 en IL-8 in hun serum. Verhoogde aantallen geaktiveerde mest-cellen werden ook opgemerkt in huid-biopten. We stellen de hypothese voor dat FMS een neuro-immuno-endocriene aandoening is waarbij verhoogde afgifte van CRH en SP door neuronen op specifieke plaatsen in spieren lokale mest-cellen triggert om pro-inflammatoire en neuro-sensitiserende molekulen af te geven. Er is geen genezende behandeling alhoewel lage dosissen of tricyclische antidepressiva en de serotonine-3 receptor-antagonist tropisetron nuttig zijn. Voeding-supplementen die het natuurlijk anti-inflammatoir en mest-cel inhiberend flavonoïde quercetine bevatten, zijn veelbelovend, aangezien ze samen kunnen worden gebruikt met andere behandel-modaliteiten.

Fibromyalgie (FMS) is een aandoening die wordt gekarakteriseerd door chronische diffuse spierpijn over gans het lichaam. Andere ermee geassocieerde symptomen omvatten vermoeidheid, alsook slaap-, cognitieve en emotionele stoornissen, die leiden tot invalidering en een slechte leven-kwaliteit. Fibromyalgie komt voor bij zowat 3-13% van de bevolking, afhankelijk van de gebruikte definitie en de bestudeerde populatie; het is meer courant bij mensen van middelbare leeftijd, voornamelijk bij vrouwen. Andere co-morbide ziekten omvatten allergische reakties, Chronische Vermoeidheid Syndroom, migraine, interstitiële cystitis (IC) en prikkelbare darm syndroom (IBS). […]

Het meest courante symptoom is veralgemeende spierpijn met graduele aanvang, dikwijls na een ziekte of operatie. FMS kan zich ook voordoen met chronische vermoeidheid en het is meestal een uitsluiting-diagnose. […] De ‘Fibromyalgia Impact Questionnaire’ (FIQ) werd ontwikkeld aan de ‘Oregon University’ (www.myalgia.com/FIQ/FIQ). De ‘FibroFatigue’ schaal werd ontwikkeld om symptomen tijdens behandeling te monitoren. De criteria opgesteld door de ‘American College of Rheumatology’ in 1990 vereisen dat wijdverspreide pijn moet aanwezig zijn in alle vier de lichaam-kwadranten, alsook het axiale skelet [schedel, wervelkolom, ribbenkast, borstbeen], tesamen met 11/18 ‘tender-points’. Er zijn studies die de noodzaak voor 11/18 ‘tender-points’ in vraag hebben gesteld, in het bijzonder bij patiënten met een recente diagnose, zowat 60% van de FMS-patiënten. […] De symptomen bij onbehandelde patiënten verergeren met de tijd. ‘Tender-points’ moeten worden gedifferentieerd van ‘trigger-points’ die myofasciale pijn syndroom kenmerken. FMS-patiënten blijken een veralgemeende lage pijn-drempel voor een waaier aan stimuli te hebben. Het is interessant dat veel FMS-patiënten ook klagen van huid-‘sensitiviteit’ zonder enig bewijs voor huid-erythema [roodheid] of indicatie voor atopische dermatitis [“eczeem”; chronische huid-ontsteking].

Het is nogal intrigerend dat veel FMS-patiënten gewag maken van de aanvang van de symptomen na een psychologische of inflammatoire stressor. FMS is misschien wel geen afzonderlijke klinische entiteit; er zou tenminste één subgroep van patiënten kunnen zijn waarbij stress-factoren de meest voorspellende indicator voor pijn waren. […] Het is echter nuttig voor patiënten te identificeren tot welke afzonderlijke medische entiteit ze behoren omdat dit hen toelaat zich geaccepteerd te voelen en het hen de kracht geeft een behandeling te zoeken. Of FMS nu een afzonderlijke entiteit is of niet: het is zeker een significante belasting voor de gezondheid-zorg en vereist betere informatie voor artsen én patiënten.

Pathogenese

Studies bij aangetaste personen en hun familie hebben geen bewijs voor genetische factoren opgeleverd. Er is op dit moment geen precieze pathogenese. Sommige gegevens wijzen op gemeenschappelijke risico-factoren tussen FMS en psychiatrische stoornissen. Publicaties geven aan dat er een afwijking is bij de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, met een verhoogde aktiviteit van het corticotropine-‘releasing’ hormoon (CRH) en substantie-P (SP), die niet alleen een invloed heeft op de HPA-as maar ook andere endocriene en immuunsysteem processen.

In het licht van deze bevinding en de waarneming dat FMS-symptomen vaak optreden na een psychologische of inflammatoire stressor, zou FMS een andere inflammatoire aandoening kunnen zijn die verergert door stress [Theoharides TC, Cochrane DE. Critical role of mast-cells in inflammatory diseases and the effect of acute stress. J. Neuroimmunol (2004) 146: 1]. Bijvoorbeeld: pijn-perceptie bleek te worden versterkt door de gelijktijdige aanwezigheid van stressvolle gebeurtenissen en herhaalde geluid-stress bleek inflammatoire hyper-algesie bij ratten te verhogen. Eén studie toonde een omgekeerde relatie tussen serum-waarden van de serotonine-metaboliet 5-hydroxy-indol-azijnzuur (5-HIAA) en lage pijn-scores, evenals met serum-SP en slaap-stoornissen.

Andere publicaties hebben verhoogde niveaus gerapporteerd van cytokinen in het serum van FMS-patiënten. In één studie verschilden serum IL-1 en IL-6 spiegels niet van controles, maar IL-8 was significant verhoogd. Niettemin was IL-6 gestegen in de bovenstaande vloeistof van perifeer bloed mononucleaire cellen van FMS-patiënten. Bovendien veroorzaakte injektie van IL-6 buitensporige hartslag-reakties bij FMS-patiënten. Interessant was dat jonge FMS-patiënten met mildere symptomen significant verhoogde IL-8 in hun serum niveaus hadden.

Deze bevindingen zijn van bijzonder belang, aangezien werd voorgesteld dat mest-cellen het doelwit van CRH buiten de hersenen zijn, wat leidt tot versterkte inflammatoire processen die kunnen bijdragen tot pijn [Theoharides TC, Donelan JM, Papadopoulou N, Cao J, Kempuraj D, Conti P. Mast-cells as targets of corticotropin-releasing factor and related peptides. Trends Pharmacol. Sci  (2004) 25: 563]. In feite werd er aangetoond dat menselijke mest-cellen funktionele CRH-receptoren tot expressie brengen, en dat CRH selektieve afgifte van vasculaire endotheliale groeifactor [VEGF; zorgt voor verhoogde vorming van nieuwe bloedvaten * wordt ook onderdrukt door anthocyaninen (zie ‘Anthocyaninen & NF-kB, oxidatieve stress, inflammatie, inspanning’)] kan induceren, wat inflammatie zou kunnen versterken [Cao J, Papadopoulou N, Kempuraj D, Boucher WS, Sugimoto K, Cetrulo CL, Theoharides TC. Human mast-cells express corticotropin-releasing hormone (CRH) receptors and CRH leads to selective secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). J. Immunol (2005) 174: 7665]. Zodra inflammatie optreedt, kan IL-1 dan mest-cellen stimuleren om selektief IL-6 af te geven [Kandere-Grzybowska K, Letourneau R, Boucher W, Bery J, Kempuraj D, Poplawski S, Athanassiou A, Theoharides TC. IL-1 induces vesicular secretion of IL-6 without degranulation from human mast cells. J. Immunol (2003) 171: 4830]. Met andere woorden: mestcellen moeten niet degranuleren zoals gebruikelijk wordt gezien bij allergische reakties en hun aktivatie kan dus worden gemist bij routine-pathologisch onderzoek van biopten van FMS-patiënten. Verhoogde geaktiveerde mest-cellen werden gerapporteerd in associatie met IgG-afzettingen in huid-biopten van FMS-patiënten.

Deze hypothese zou ook de huidgevoeligheid – aanwezig bij veel FMS-patiënten – kunnen verklaren. Bijvoorbeeld: huid-biopten van FMS-patiënten hadden een hoge IL-6 expressie en biopten van de trapezius-spier vertoonden meer SP-immunoreaktiviteit. CRH-inhoud [Lytinas M, Kempuraj D, Huang M, Boucher W, Esposito P, Theoharides TC. Acute stress results in skin corticotropin-releasing hormone secretion, mast-cell activation and vascular permeability, an effect mimicked by intradermal corticotropin-releasing hormone and inhibited by histamine-1 receptor antagonists. Int. Arch. Allergy Immunol (2003) 130: 224] en vasculaire doorlaatbaarheid daalde in de huid van ratten in respons op stress [Singh LK, Pang X, Alexacos N, Letourneau R, Theoharides TC. Acute immobilization stress triggers skin mast-cell degranulation via corticotropin releasing hormone, neurotensin and substance-P: A link to neurogenic skin-disorders. Brain Behav. Immunity (1999) 13: 225], een proces dat wordt nagebootst door intradermale [in de huid] toediening van CRH [Theoharides TC, Singh LK, Boucher W, Pang X, Letourneau R, Webster E, Chrousos G. Corticotropin-releasing hormone induces skin mast-cell degranulation and increased vascular permeability, a possible explanation for its pro-inflammatory effects. Endocrinology (1998) 139: 403]. CRH zou kunnen samenwerken met SP of andere neurokinine-1 receptor-agonisten [Kandere-Grzybowska K, Gheorghe D, Priller J, Esposito P, Huang M, Gerard N, Theoharides TC. Stress-induced dura vascular permeability does not develop in mast-cell deficient and neurokinin-1 receptor knockout mice. Brain Res (2003) 980: 213] [Antagonisten van neurokinine-1 (NK-1) receptoren, waarlangs substantie-P werkt, werden voorgesteld als een nieuwe klasse antidepressiva met een uniek werking-mechansime.].

Behandeling

Er is noch een doeltreffende, noch een gestandardiseerde behandeling voor FMS. Lage dosissen tricyclische antidepressiva, samen met non-steroïdale anti-inflammatoire medicijnen of tramadol, vormen de belangrijkste therapeutische benadering. Er werd gerapporteerd dat toediening van interferon-alfa onder de tong aanzienlijk voordeel biedt [Russell IJ, Vipraio GA, Michalek JE, Craig FE, Kang YK, Richards AB. Lymphocyte-markers and natural killer cell activity in fibromyalgia syndrome: effects of low-dose, sublingual use of human interferon-alpha. J. Interferon Cytokine Res (1999) 19: 969]. Studies wijzen er op dat lokale injektie van de serotonine-3 receptor-antagonist tropisetron analgetische effekten zou kunnen hebben bij FMS [Muller W, Stratz T. Local treatment of tendinopathies and myofascial pain syndromes with the 5-HT3 receptor antagonist tropisetron. Scand. J. Rheumatol. (2004) 119(S): 44]. Intraveneus tropisetron bleek echter slechts bij 50% van FMS-patient ‘responders’ te helpen, deze behandelingen reducren serum-SP significant [Stratz T, Fiebich B, Haus U, Muller W. Influence of tropisetron on the serum substance-P levels in fibromyalgia patients. Scand. J. Rheumatol (2004) 119(S): 41]. In het algemeen zijn de resultaten inconsistent en er werden een aantal nadelige effekten gerapporteerd [Spath M Current experience with 5-HT3 receptor antagonists in fibromyalgia. Rheum. Dis. Clin. North Am (2002) 28: 319]. […]

Er is bewijs dat aangeeft dat een preparaat dat het natuurlijk voorkomend flavonoïde quercetine bevat aanzienlijk voordeel zou kunnen bieden bij neuro-inflammatoire aandoeningen, zoals FMS [Theoharides TC, Bielory L. Mast-cells and mast-cell mediators as targets of dietary supplements. Ann. Allergy Asthma Immunol (2003) 93: S24]. Flavonoïden hebben een sterke anti-inflammatoire en cel-beschermende werking [Middleton E Jr, Kandaswami C, Theoharides TC. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart-disease and cancer. Pharmacol. Rev (2000) 52: 673] en zijn bijzonder krachtige inhibitoren van cytokine-release door menselijke mest-cellen [Kempuraj D, Madhappan B, Christodoulou S, Boucher W, Cao J, Papadopoulou N, Cetrulo CL, Theoharides TC. Flavonols inhibit pro-inflammatory mediator release, intracellular calcium-ion levels and protein kinase C theta phosphorylation in human mast-cells. Br. J. Pharmacol (2005) 145:934]. Eén preparaat in het bijzonder (algonot.com [Prof. Theoharides ontwikkelde Algonot’s nutraceuticals en is lid van de wetenschappelijke advies-raad van dit bedrijf]) (Algonotplus®) bevat quercetine met chondroïtine-sulfaat en er werd aangetoond dat het ook mest-cel secretie inhibeert [Theoharides TC, Patra P, Boucher W, Letourneau R, Kempuraj D, Chiang G, Jeudy S, Hesse L, Athanasiou A. Chondroitin-sulfate inhibits connective tissue mast-cells. Br. J. Pharmacol (2000) 131:1039] in combinatie met oliijfpit-extract dat de absorptie van de aktieve ingrediënten verhoogt [Theoharides TC. Dietary supplements for arthritis and other inflammatory conditions: key role of mast-cells and benefit of combining anti-inflammatory and proteoglycan products. Eur. J. Inflamm (2003) 1: 1]. Toekomstige research zou zich moeten focussen op CRH – mest-cel interakties en CRH-receptor expressie in huid- of spier-biopten van FMS-patiënten. Klinische studies zouden CRH receptor-antagonisten kunnen gebruiken of mest-cel aktivatie-inhibitoren, zoals Algonot-plus®.

————————-

Theoharides’ hierboven vermelde voordracht, getiteld ‘Door substantie-P gestimuleerde TNF-secretie door menselijke mest-cellen omvat splitsing en translokatie (verplaatsing) van mitochondrieën met extracellulaire afgifte van DNA, dat auto-inflammatie induceert; deze processen worden geblokkeerd door het natuurlijke flavonoïde luteoline’, spitste zich dus toe op mogelijke betrokken sub-cellulaire mechanismen…

Individuele mitochondrieën zijn in staat tot fusie en fragmentatie. Deze twee processen sluiten elkaar niet uit en kunnen samen optreden. Fragmentatie en fusie van mitochondrieën wisselen regelmatig af in de cel-cyclus. De splitsing van mitochondrieën gaat ook gepaard met de opsplitsing van mitochondriale genomen en de produktie van specifieke halter-vormige tussen-produkten. Het aantal en de morfologie van mitochondrieën wordt nauwkeurig gecontroleerd via het mitochondriaal proces van fusie en splitsing d.m.v. mitochondrium-vormgevende proteïnen. Mitochondriale splitsing vergezelt apoptotische cel-dood en lijkt belangrijk voor de vooruitgang van het apoptotisch mechanisme. Een evenwicht tussen mitochondriale splitsing en fusie is vereist voor normale mitochondriale en cellulaire werking. Een verschuiving in de verhouding splitsing/fusie kan een verklaring bieden voor de mitochondriale dysfunktie bij neurodegeneratieve aandoeningen en een doelwit zijn voor therapeutische interventies.

In het kort hier enkele krachtlijnen uit Prof. Theoharides’ voordracht:

Normaal liggen mitochondrieën dicht bij de kern van de mest-cellen maar Theoharides vond dat, bij stimulatie door substantie-P, ze zich gaan verspreiden naar het cel-oppervlak toe en dat ze kleiner zijn. Hij besloot dat er sprake is van spltsing en translocatie naar het oppervlak bij stimulatie door SP. Maar er zijn ook andere triggers die dat kunnen (bv. Neuropeptide-Y). Hij toonde ook dat dit mechanisme (splisting) nodig is voor degranulatie van de mest-cellen (gerapporteerd in J Allergy Clin Immunol 2011). Later vond zijn team ook dat mitochondriaal DNA (samen met andere componenten) wordt gesecreteerd buiten de cel tijdens aktivatie van de mest-cel zonder dat er apoptose of necrose optreedt. Wat is het effekt van dat mtDNA (dat buiten de cel treedt – iets dat normaal niet gebeurt) op andere cellen? Uit zijn onderzoek bleek dat ze andere mest-cellen aanzetten tot degranulatie en afgifte van TNF en IL-8.

De concrete relatie met M.E.(cvs) zal moeten blijken uit het artikel ‘Amitriptyline and Prochlorperazine Inhibit Proinflammatory Mediator Release From Human Mast Cells: Possible Relevance to Chronic Fatigue Syndrome’ (Clemons A, Vasiadi M, Kempuraj D, Kourelis T, Vandoros G, Theoharides TC in J Clin Psychopharmacol (2011) 31(3): 385-387).

Luteoline is een flavonoïde, een ‘opruimer’ (‘scavenger’) van vrije radikalen (anti-oxidant) en een immuunsysteem-modulator, en zou inflammatie en kanker (helpen) voorkomen. Het bootst tevens een molekule na die beschermt tegen zenuw-schade: luteoline werkt nl. ook als een aktivator van monoamine-transporters (spelen een belangrijke rol bij het regelen van normale en abnormale synaptische aktiviteit; zijn verantwoordelijk voor de heropname van amine-neurotransmitters serotonine, dopamine, norepinefrine). De stof komt vooral in planten-bladeren voor (o.m. van peterselie, selderij, tijm, enz.) maar in voeding-bronnen zoals groene peper, kamille, wortelen, munt, olijf-olie, enz.

Theoharides’ team vond dat voor-behandeling met luteoline de door SP geïnduceerde DNA-fragmentatie en cytokine-release in mest-cellen blokkeert. Ze onderzochten ook het effekt van luteoline op vermoeidheid na inspanning bij ratten en het bleek dat die een inspanning (5x) langer konden aanhouden. (Zie ook Gupta A et al. ‘Possible role of oxidative stress and immunological activation in mouse model of Chronic Fatigue Syndrome and its attenuation by olive extract’ in J Neuroimmunol (2010) 226(1-2): 3-7) Het hierboven vermelde bedrijfje (waar hij dus medisch adviseur is) heeft een supplement op de markt dat zou kunnen getest worden bij M.E.(cvs)-patiënten: NeuroProtek® bevat de flavonoïden luteoline, samen met quercetine & rutine (beiden anti-inflammatoir), opgelost in olijfpit-olie (ook een krachtig anti-oxidant) om ze beter te kunnen absorberen; en zou oxidatieve stress en inflammatie in de darm én het brein reduceren…

oktober 11, 2010

Biochemische & vasculaire aspecten van CVS bij kinderen

Filed under: Celbiologie,Fysiologie — mewetenschap @ 5:50 am
Tags: , , , , , , ,

Uit deze studie bij kinderen (7-14 jaar) met M.E.(cvs), gesponsord door ‘ME Research UK’ en de ‘Young ME Sufferers (Tymes) Trust’ blijkt duidelijk dat M.E.(cvs) geen mentale aandoening maar een lichamelijke ziekte is – zoals één van de auteurs, Professor Jill Belch, stelt. Er werden veranderingen in het bloed vastgesteld die chronische inflammatie suggereren. Dr Neil Abbot van ‘ME Research UK’: “Hoewel de oorzaak van M.E. onbekend is, weten we dat de helft alle patiënten zegt dat hun ziekte begint met een infektie. De studie geeft ongetwijfeld meer wetenschappelijk gewicht  aan het bestaan van deze aandoening die velen jammer genoeg niet willen aanvaarden ondanks de ernst ervan.”.

De onderzoeksgroep van de Universiteit van Dundee publiceerde al gelijkaardige resultaten bij volwassen M.E.(cvs)-patiënten, en die werden hier voorheen reeds weergegeven. Voor de terminologie (arteriële golf reflektie, puls-golf, AIx) en achtergrond over arteriële stijfheid verwijzen we naarArteriële Stijfheid en Inflammatie bij CVS’.

————————-

Arch Pediatr Adolesc Med. (2010) 164: 817-823

Biochemical and Vascular Aspects of Paediatric Chronic Fatigue Syndrome

Gwen Kennedy, PhD; Faisel Khan, PhD; Alexander Hill, PhD; Christine Underwood, MBBS; Jill J. F. Belch, MD

Onderzoek-eenheid voor Vasculaire en Inflammatoire Ziekten, Instituut voor Cardiovasculaire Research, Centrum voor Cardiovasculaire en Long Biologie, Afdeling Medische Wetenschappen, ‘Ninewells Hospital & Medical School’, Dundee, Schotland

Doelstelling Evalueren van de biochemische en vasculaire aspecten van paediatrische Chronisch Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (M.E./CVS).

Deelnemers 25 kinderen met M.E./CVS en 23 gezonde kinderen gerecruteerd van over gans het Verenigd Koninkrijk.

Interventies De deelnemers ondergingen een volledig klinisch onderzoek om een diagnose van M.E./CVS vast te stellen en werden gevraagd hun M.E./CVS-symptomen te beschrijven en te scoren. Biochemische merkers werden gemeten. Arteriële golf reflektie werd bepaald om systemische arteriële stijfheid vast te stellen.

Belangrijkste Uitkomst Metingen Merkers voor oxidatieve stress en vrije radikalen, C-reactief proteïne niveau, apoptose van witte bloedcellen en arteriële golf reflektie.

Resultaten [Zie hieronder voor alle exacte waarden] De kinderen met M.E./CVS hadden verhoogde oxidatieve stress vergeleken met controle-individuen en verhoogde witte bloedcellen apoptose. De arteriële stijfheid variabelen verschilden niet significant tussen de groepen; de afgeleide variabelen correleerden echter significant met totale en lage-densiteit lipoproteïnen cholesterol bij de patiënten met M.E./CVS maar niet bij controles.

Besluiten Biomedische anomalieën die worden gezien bij volwassenen met M.E./CVS – verhoogde oxidatieve stress en verhoogde apoptose van witte bloedcellen – worden ook geobserveerd bij kinderen met klinisch gediagnostiseerde M.E./CVS vergeleken met gematchte controles. Anders dan bij hun volwassen tegenhangers bleef de arteriële stijfheid echter binnen de referentie-waarden bij deze paediatrische patiënten.

[…]

Het wordt algemeen erkend dat M.E./CVS ook kinderen en adolescenten treft, hoewel hun prognose wordt geacht beter te zijn dan die voor volwassenen met deze diagnosis. Schattingen van het aantal aangetaste personen variëren afhankelijk van de gebruikte methodes en de opgenomen populaties […] maar een ‘community-based’ studie in de Verenigde Staten [Jordan KM, Jason LA, Mears CJ et al. Prevalence of paediatric Chronic Fatigue Syndrome in a community-based sample. JCFS (2006) 13(2/3):75-77] vond een globale prevalentie van 60 gevallen per 100.000 (0,06%), overeenkomstig met andere ramingen. Studies concludeerden dat M.E./CVS een aanzienlijk probleem is bij jongeren maar toch blijft het onduidelijk of de ziekte waargenomen bij kinderen en adolescenten dezelfde is als bij volwassenen in termen van ziekte-mechanisme en manifestaties; er bestaat hieromtrent weinig onderzoek.

We meldden significante verschillen tussen volwassenen met M.E./CVS en gematchte controle-individuen qua vroege dood van witte bloedcellen (WBC) (neutrofielen-apoptose) [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’] en verhoogde cardiovasculaire risico-merkers (lipiden, merkers voor oxidatieve stress en inflammatoir C-reaktief proteïne) [Kennedy G, Spence VA, McLaren M, Hill A, Underwood C, Belch JJF. Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms. Free Radic Biol Med (2005) 39(5):584-589.; zie ook:Oxidatieve stress’]. Apoptose speelt een cruciale rol bij de ontwikkeling en het handhaven van de gezondheid door het elimineren van ongezonde cellen, oude cellen en onnodige cellen; versnelde apoptose van neutrofielen (die worden gerecruteerd naar de plaats van het letsel binnen minuten na het trauma en het hoofd-kenmerk van acute inflammatie) wordt waargenomen bij patiënten met infektie. Oxidatieve stress beschrijft cel-schade veroorzaakt door een overvloed van oxidanten, met inbegrip van reaktieve zuurstof molekulen [ROS] (bv. zuurstof-ionen, vrije radikalen en peroxide), die met andere molekulen in de cellen kunnen interageren en oxidatieve schade aan proteïnen, membranen en genen kunnen veroorzaken. We rapporteerden ook dat andere onafhankelijke determinanten voor cardiovasculair risico en uitkomst, zoals arteriële golf reflektie, significant zijn gestegen bij mensen met M.E./CVS en gerelateerd zijn met het inflammatie-niveau. [zie Arteriële Stijfheid en Inflammatie bij CVS’] De augmentatie-index (AIx) is een meting voor arteriële slagaderlijke golf reflektie en wordt bepaald door de snelheid waarmee de golf zich verplaatst, de amplitude van de weerspiegelde golven en de elastische eigenschappen van de aorta. Er werd aangetoond dat deze een belangrijke determinant van cardiovasculair risico en uitkomst is en een onafhankelijke merker voor de ernst van coronaire obstructie. Daarnaast is de AIx een significante voorspeller van belangrijke ongunstige cardiovasculaire gebeurtenissen bij patiënten met vaststaande kransslagader-ziekte. Uit deze bevindingen hebben we voorlopig geconcludeerd dat, bij volwassenen, M.E./CVS een chronische inflammatoire aandoening zou kunnen zijn, resulterend in een significant risico op toekomstige cardiovasculaire gebeurtenissen.

De hoofd-doelstelling van deze studie was daarom om een groep van kinderen met een goed gedefinieerde M.E./CVS, bij wie de mogelijkheid op langdurige gezondheid-problemen bestaat, te onderzoeken op de aanwezigheid van vroege afwijkingen in het cellulair gedrag met betrekking tot cardiovasculaire risicos, die reeds waargenomen bij volwassenen met de ziekte. Daarnaast wilden we bepalen of de verandering qua arteriële golf reflektie gevonden bij volwassenen met M.E./CVS ook wordt gezien bij kinderen met de ziekte.

METHODES

[…]

RESULTATEN

Vijfentwintig kinderen met M.E./CVS en 23 controles gematcht voor geslacht, leeftijd en puberteit-status namen deel aan het onderzoek. […] Hartslag was significant hoger in de M.E./CVS-groep dan bij de controle-groep (p = .001). Er waren geen grote verschillen qua bloeddruk tussen liggende en staande houding voor beide groepen, hoewel de M.E./CVS-groep een bijna significante, lagere systolische bloeddruk bij ruglig vertoonde (p =. 056).

Het belangrijkste diagnostisch criterium, uitputtende vermoeidheid van meer dan 3 maanden, werd door 13 van 25 kinderen (52%) beschreven als ernstig hun leven beïnvloedend en door 12 (48%) als matig. Met betrekking tot de symptomen van de CDC’s mineure criteria (1994), werd post-exertionele malaise gemeld een matig of ernstig effekt te hebben op het dagelijkse leven door 19 van 25 kinderen (76%); […].

Zeventien van de 25 kinderen (68%) zeiden dat hun ziekte zich snel had ontwikkeld, dat wil zeggen, binnen dagen of weken; en 22 kinderen (88%) rapporteerden dat de ziekte een infekueueze start had gekend. Kinderen met M.E./CVS waren reeds 6 maanden tot 10 jaar ziek; de mediane ziekte-duur was 3 jaar. De mediane leeftijd van de groep bij de start van de ziekte was 12 jaar. Twaalf kinderen waren al gedurende 3 jaar of langer ziek en 13 waren minder dan 3 jaar ziek. Bij het opsplitsen van de groep in 2 op basis van de ziekte-duur (≤ 3 jaar of ≥ 4 jaar), waren er geen significante verschillen voor de bloed-variabelen of arteriële golf reflektie metingen (p > .05). De patiënten werden dan ook behandeld als één groep en vergeleken met hun gematchte controle-groep. Slechts 1 kind met CVS ging voltijds naar school en 12 kregen deeltijds onderwijs (1-8 uur/week).

Er waren geen significante verschillen tussen de groepen voor om het even welke bloedcel-telling. Hoewel de lipiden- en inflammatoire merkers niet verschilden tussen groepen, waren de merkers voor oxidatieve stress beduidend verhoogd. De niveaus van 8 iso-prostaglandine F2α-isoprostaan waren significant hoger in de M.E./CVS-groep (252,30 versus 215,60 pg/ml, p = .007) en de plasma-waarden voor vitamine-E en vitamine-C waren significant verminderd (gemiddelde [SD] 8,72 [2,39] versus 10,94 [3,46] μg/ml, p = .01 en 0,84 [0,26] versus 1,15 [0,28] mg/dl, p < .001, respectievelijk). Gemiddelde waarden voor geoxideerd LDL, myeloperoxidase [enzyme dat de reaktie van waterstofperoxide met chloor-ionen katalyseert; mechanisme bij neutrofielen om ROS te elimineren bij de zgn. ‘respiratory burst’] en C-reaktief proteïne waren hoger, en gemiddelde waarden van hoge-densiteit lipoproteïnen en glutathion waren lager bij de M.E./CVS, hoewel deze verschillen geen statistische significantie bereikten.

Er was een significant hoger percentage apoptotische neutrofielen in de M.E./CVS-groep dan in de controle-groep (53,7% vs 35,7%, p = .005). Bovendien vertoonden lymfocyten van patiënten met M.E./CVS significant hogere niveaus van apoptose en een verminderde percentage levensvatbare gezonde WBC. Toch werden geen verschillen gevonden tussen de 2 groepen qua tumor necrosis factor receptor 1 en CD95 (Fas) [Fas = trans-membraan proteïne van de TNF-familie, binding van het Fas-ligand met zijn receptor induceert apoptose] of in de intrinsieke apoptotische merkers (Bcl-2 [onderdrukt apoptose in allerlei cellen; remt caspase-aktiviteit] of caspase-1 [apoptotisch enzyme; bleek ge-upreguleerd bij CVS]).

[…] Er werden geen significante verschillen gevonden tussen de groepen wat betreft brachiale [aan de boven-arm] en centrale [in de aorta] bloeddruk, AIx en gereflecteerde golf. Er was een trend voor een grotere AIx (genormaliseerd voor een hartslag van 75 bpm) in de M.E./CVS-groep (p = .09). In de M.E./CVS-groep correleerde AIx (genormaliseerd voor een hartslag van 75 slagen per minuut) significant met de totale (p = .02) en LDL- (p = .004) cholesterol. De gereflecteerde golf was negatief gecorreleerd met de totale (p = .03) en LDL- (p = .02) cholesterol, hetgeen duidt op een grotere puls-golf snelheid met toenemende totaal en LDL-cholesterol.

COMMENTAAR

Deze studie toont dat de biomedische anomalieën die worden gezien bij volwassenen met M.E./CVS – verhoogde oxidatieve stress en hogere waarden qua WBC apoptoseook worden waargenomen bij een groep kinderen met klinisch gediagnostiseerde M.E./CVS vergeleken met voor leeftijd en geslacht gematchte controles. Wat betreft oxidatieve stress vertoonde de paediatrische M.E./CVS groep significant verhoogde waarden voor F2-isoprostanen met verminderde anti-oxidante plasma-waarden voor vitamine-C en vitamine-E. Dit is een belangrijke bevinding gezien de gevoeligheid en betrouwbaarheid van isoprostanen als indicatoren voor oxidatieve stress en hun associatie met ander metingen voor lipiden-peroxidatie in vivo. F2-isoprostanen zijn een groep prostaglandine-F2α isomeren beschreven als produkten van […] oxidatieve modificaties van arachidonzuur [voorloper van prostaglandinen (mediatoren van inflammatoire en anafylactische reakties)] of circulerende LDL-partikels die het resultaat zijn van een aanval door vrije radikalen op celmembraan-fosfolipiden. Bij deze studie maten we plasma-waarden van 8-iso-prostaglandine-F2α-isoprostaan omdat dit het meest voorkomende van de familie isoprostanen is, met plasma-waarden die deze van in vivo weerspiegelen. Isoprostanen zijn niet alleen een afspiegeling van oxidatieve stress in geïntegreerde systemen maar ze hebben ook sterke biologische effekten geassocieerd met de peroxidatie van membraan-lipiden, verhoogde cel-doorlaatbaarheid en een daaropvolgende stijging van intracellulair calcium. Ze bleken ook enorm bloedvat-vernauwend en zijn betrokken bij endotheliale letsels. Het is niet duidelijk of deze verhoogde oxidatieve stress secundair is aan voeding-tekorten qua anti-oxidantia of aan aanhoudende chronische WBC-stimulatie en afgifte van vrije radikalen. We geloven dat dit laatste mechanisme betrokken zou kunnen zijn, gezien de gestegen WBC-apoptose die werd geobserveerd maar verdere studies, inclusief voeding-bepalingen, zijn vereist. Ongeacht het mechanisme wordt overmatige oxidatieve stress gezien bij deze patiënten-groep.

Overmatige generatie van vrije radikalen bij patiënten met M.E./CVS waarbij de oxidatie van lipiden en proteïnen is betrokken, zou kunnen voortkomen uit verscheidene gewijzigde biologische processen. Bijvoorbeeld: spieren bij inspanning zijn de belangrijkste uitlokkers van overmatige produktie van vrije radikalen en recente cijfers toonden correlaties tussen de verschillende bloed-merkers voor oxidatieve schade bij patiënten met M.E./CVS [Vecchiet J, Cipollone F, Falasca K et al. Relationship between musculoskeletal symptoms and blood-markers of oxidative stress in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Neurosci Lett (2003) 335(3):151-154; zie ook: ‘Oxidatieve stress] en spierpijn-drempels en vermoeidheid. In een recent pilot-onderzoek bij patiënten met M.E./CVS en gematchte controles, vonden we voor beide groepen dat F2-isoprostaan waarden onmiddellijk na een gestandaardiseerde sub-maximale inspanning-test waren verhoogd en terugkeren naar hun respectievelijke baseline-niveau 24 uur later maar patiënten met M.E./CVS hadden significant hogere F2-isoprostaan waarden dan controles op alle tijdstippen. [zie ‘Interleukine-6 en isoprostanen bij CVS na inspanning] Deze bevinding kan belangrijke implicaties hebben voor cardiovasculair risico op langere termijn. Er is bewijs voor virale persistentie in spierweefsel in ten minste sommige mensen met M.E./CVS en ook voor oxidatieve schade aan DNA en lipiden [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] in spier-biopten van patiënten met CVS, in overeenstemming met metabole afwijkingen aan de mitochondrieën en fosfolipiden.

Wat betreft apoptose, toonden we aan dat neutrofielen en lymfocyten van paediatrische patiënten met M.E./CVS beduidend minder levensvatbaar zijn vergeleken met die van gezonde kinderen; beide types WBC vertoonden een verhoogd percentage cellen die apoptose doormaken. De kenmerken die apoptose bepalen zijn complex en de waargenomen hoeveelheid apoptose kan een gevolg zijn van enkel- of meervoudige factoren, met inbegrip van een aanhoudende of reaktiverende virale infektie, of een toxische toestand, het herprogrammeren van apoptotische mechanismen door een infektueus of giftig agens, of snellere neutrofielen- en lymfocyten-turnover secundair aan een abnormale gastheer-reaktie op schadelijke stimuli.

De verhoogde hartslag in de M.E./CVS-groep vergeleken met gematchte controles komt overéén met de bevindingen van andere onderzoekers, net als de suggestie dat de bloeddruk lager zou kunnen zijn bij kinderen met M.E./CVS. Deze verhoogde hartslag in rust kan een gevolg zijn van een verminderde fysieke conditie en de verlaagde bloeddruk zou secundair kunnen zijn aan de verminderde vasculaire tonus die werd gemeld.

Wij vonden een borderline tendens voor verhoogde arteriële stijfheid (AIx) bij patiënten met M.E./CVS, hoewel dit geen statistische significantie bereikte. Deze bevinding contrasteert met die van een vorige studie bij volwassenen waarbij de AIx significant was verhoogd bij patiënten met M.E./CVS; de ziekte-duur was echter veel korter bij de kinderen in de huidige studie (gemiddeld 3,7 versus 9,2 jaar in de volwassenen-studie) en deze veranderingen zouden kunnen worden verwacht hoger te worden met stijgende ziekte-duur. Het is ook mogelijk, gezien de subtielere veranderingen qua waargenomen arteriële stijfheid, dat de statistische ‘power’ van deze studie (gebaseerd op een volwassen populatie) te laag was om significante veranderingen adequaat vast te stellen. We vonden echter ook associaties voor AIx, totaal cholesterol en LDL-cholesterol, en voor ‘reflected wave’, totaal cholesterol en LDL-cholesterol, wat er op wijst dat zelfs in dit vrij vroege stadium qua ziekte-duur er zich een clustering aftekent van merkers indicatief voor toekomstig cardiovasculair risico. Metingen voor arteriële golf-reflektie zijn nuttige merkers voor cardiovasculair risico bij gezonde individuen en bij patiënten met cardiovasculaire ziekte en onafhankelijk geassocieerd met ongunstige cardiovasculaire gebeurtenissen.

Bij gelijkaardig research-studies door onze eenheid, onderzochten 2 van ons cardiovasculaire risico-factoren bij gezonde kinderen en adolescenten (11-14 jaar) en toonde aan dat een clustering van cardiovasculaire risicofactoren reeds bestond bij sommige van deze kinderen ondanks hun leeftijd. Daarnaast onderzochten we oxidatieve stress bij patiënten in de leeftijd 9-22 jaar met type 1 diabetes mellitus en vonden een toename qua vrije radikalen en verminderde vitamine-C en vitamine-E waarden in het plasma, vergeleken met controles. Deze studies onderlijnden het belang van het monitoren van indexen voor vasculaire dysfunktie en oxidatieve stress bij mensen van de leeftijd 9-22 jaar, gezien de associatie tussen deze merkers en een verhoogd risico op hart- en vaat-ziekten.

Wij toonden, naar ons weten, voor het eerst aan dat oxidatieve stress (lagere anti-oxidante waarden en verhoogde isoprostaan-niveaus in het plasma) en verhoogde WBC-apoptose voorkomen bij kinderen met M.E./CVS. We geloven dat de gegevens die hier worden voorgesteld consistent zijn met de bevinding dat vele patiënten met M.E./CVS een onderliggende opspoorbare abnormaliteit vertonen qua gedrag van hun immuun-cellen, verenigbaar met een geaktiveerd inflammatoir proces. De gegevens zijn ook consistent met een reaktivatie of persistente virale infektie die WBC-apoptose triggert, met een verhoogde produktie van vrije radikalen ten gevolge de daaropvolgende neutrofielen ‘respiratory burst’. [de snelle afgifte van ROS (superoxide radikalen en waterstof- hperoxide) – zie ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS] […] Oxidatieve stress zal de vasculatuur op een tijd-afhankelijke manier beïnvloeden; de gegevens die significant verhoogde arteriële stijfheid bij volwassenen en een minder significante verhoging bij kinderen vertonen, zijn verenigbaar met deze suggestie/veronderstelling. Bij volwassenen is er vaak verhoogde arteriële stijfheid wanneer verhoogde oxidatieve stress wordt gedetekteerd; bij deze jongere leeftijd-groep heeft het echter nog niet een niveau bereikt waarop het de vasculatuur schijnt te compromitteren.

januari 24, 2010

Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 5:23 pm
Tags: , , , , , ,

In de jaren ’80 wierp Dr. Les Simpson (een gepensioneerd medisch researcher uit Nieuw-Zeeland) zich n.a.v. de ‘Tapanui Flu’ (een M.E.(cvs) epidemie) op de (haemo)rheologie, de studie van de bloed-doorstroming, van deze aandoening. De slechte doorbloeding bij M.E.(cvs) zou kunnen worden veroorzaakt door problemen met de capillaire vaatjes en/of de vorm van de of rode bloed-cellen (erythrocyten)… Hij gelooft dat bloed-viscositeit en verminderde hoeveelheden capillair bloed de aandoening significant beïnvloeden. Terwijl vorm-veranderingen van rode bloed-cellen (erythtrocyten) ook bij gezonde mensen voorkomen, zegt Simpson dat het aandeel van de verschillende types rode bloed-cellen, alsook een lager capillaire diameter in subsets van patiënten een grote rol kunnen spelen bij het ondermijnen van behoorlijke bloed-verdeling. Hij publiceerde enkele artikels en suggereerde een behandeling maar zijn werk werd niet echt opgepikt door de internationale gemeenschap van M.E.(cvs)-researchers/-klinici. Wellicht wilden de onderzoekers van het artikel hieronder dit daarom nog es her-bekijken. Ze kwamen tot andere bevindingen (wellicht omdat Simpson’s vaststellingen werden gedaan in de acute fase van de ziekte) maar gelukkig combineerden ze dit met het verder exploreren van (ook eerdere meldingen over dysfunktie van) de NK-cellen bij een (jammer genoeg) kleine groep patiënten… De immunologische stoornissen (bij neutrofielen en vooral NK-cellen) bevestigen/verbreden eerder onderzoek en vergen duidelijk verdere research!

De ‘Respiratory burst’ (of ‘oxidative burst’) is de snelle afgifte van ROS, reaktieve zuurstof molekulen (superoxide-radikalen en waterstof-peroxide), door bepaalde types cellen. Gewoonlijk wordt de release van chemische stoffen door immuun-cellen (bv. neutrofielen en monocyten) bedoeld, die in contact komen met binnendringende bakterieën of schimmels. ‘Respiratory burst’ speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem. Het is een cruciale reaktie in fagocyten (cel-‘opruimers’ of -‘opeters’ om de opgenomen ziekte-verwekkers af te breken. Ons aangeboren immuun-systeem verhoogt het zuurstof-verbruik van fagocyten door het enzyme NADPH-oxidase dat superoxide aanmaakt, dat tesamen met andere molekulen ‘vrije radikalen’ produceert die sterk anti-microbieel zijn maar ook schade aan het omringend weefsel en apoptose (‘geprogrammeerde cel-dood’) kunnen veroorzaken in andere immuun-cellen.

Menselijke NK (Natural Killer) -cellen kunnen worden onderverdeeld in een CD56(dim) subset en een CD56(bright) subset volgens funktionele en fenotypische verschillen. Kleuring van PMBCs met fluorescent-gemerkte antilichamen tegen CD16 en CD56 (celwand-antigenen) levert na scheiding d.m.v. FACS (fluorescentie-geaktiveerde cel-sortering) ongeveer 1 à 2% CD56bright en CD16 op; deze vertonen geen directe cytotoxiciteit maar hebben een hoog cytokine-produktie vermogen (vooral IFN-γ) en hebben dus een immuun-regulerende rol. In perifeer bloed domineren CD56(dim) NK-cellen, terwijl in lymfe-klieren CD56(bright) NK-cellen meer voorkomen.

Journal of Translational Medicine 2010, 8:1 [pre-publicatie]

Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome

Ekua W Brenu1,2 Donald R Staines1,3, Oguz K Baskurt4, Kevin J Ashton2, Sandra B Ramos2, Rhys M Christy2, Sonya M Marshall-Gradisnik1,2

1 Faculty of Health Science and Medicine, Population Health and Neuroimmunology Unit, Bond University, Robina, Queensland, Australia

2 Faculty of Health Science and Medicine, Bond University, Robina, Queensland, Australia

3 Queensland Health, Gold Coast Population Health Unit, Southport, Gold Coast, Queensland, Australia

4 Department of Physiology, Akdeniz University Faculty of Medicine, Antalya, Turkey

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een multifactoriële aandoening die verscheidene fysiologische systemen treft, inclusief immuun- en neurologische systemen. Het immuunsysteem werd aanzienlijk onderzocht bij CVS, met dubbelzinnige resultaten echter. Er is weinig geweten over de rol of neutrofielen en ‘natural killer’ (NK) fenotypes in het patho-mechanisme van deze aandoening. Daarenboven werd de rol van erythrocyten-rheologische kenmerken bij CVS niet volledig opgehelderd. De doelstelling van deze huidige studie was gebreken in lymfocyten-funktie en erythrocyten-rheologie bij CVS-patiënten te bepalen.

Methodes Flow-cytometrische metingen werden uitgevoerd om de neutrofiel-funktie, aantallen lymfocyten, NK-fenotypes (CD56dimCD16+ en CD56brightCD16) en NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Erythrocyten-aggregatie [samen-klontering], -vervormbaarheid en fibrinogen [proteïne dat een belangrijke rol speelt bij de coagulatie (= bloedstolling)] -waarden werden ook bepaald.

Resultaten CVS-patiënten (n = 10) hadden significant gedaalde neutrofiel ‘respiratory burst’, NK cytotoxische aktiviteit en CD56brightCD16 NK-fenotypes in vergelijking met gezonde controles (n = 10). Haemo-rheologische kenmerken, aggregatie, vervormbaarheid en fibrinogeen, lymfocyten-aantallen en CD56dimCD16+ NK-cellen waren echter gelijkaardig in beide groepen.

Besluit Immuun-dysfunktie kan een belangrijke bijdragende factor tot het mechanisme van CVS zijn, zoals aangegeven door de gedaalde neutrofiel ‘respiratory burst’, NK-cel aktiviteit en NK-fenotypes. Immuun-cel funktie en fenotypes zijn dus mogelijke diagnostische merkers voor CVS.

Achtergrond

[…]

Tot op heden blijven de exacte mechanismen van CVS ongrijpbaar; immuniteit-gebreken, in het bijzonder lymfocyten- funktie en -aantal, werden echter opgemerkt als een mogelijke factor. Belangrijk is dat consistente dalingen qua NK cytotoxische aktiviteit werden geobserveerd bij verschillende populaties CVS-patiënten [bv. Klimas N, Salvato F, Morgain R, Fletcher MA: Immunologic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Microbiol 1990, 28:1403-1410 /// Ojo-Amaise EA, Conley EJ, Peters JB: Decreased natural killer cell activity is associated with severity of Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis 1994, 18 (Suppl 1):157-159 /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA: Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol 2005, 142:505-511]. Enkele studies suggereerden dat bij deze dalingen qua NK-funktie lage waarden aan granzymen, perforine-proteïnen [Perforine proteïne dat een gaatje boort in het membraan van te vernietigen cellen – wordt samen met granzymen – enzyme in de granulen van NK-cellen en cytotoxische T-cellen, in het bijzonder granzyme-B, afgegeven en vergemakkelijkt de passage van deze molekulen door het membraan van de doelwit-cel, om dan de apoptotische mechanismen van de caspasen te aktiveren; zie ook ‘CVS: inflammatie, immuun-funktie en neuro-endocriene interakties] en verminderingen qua expressie van het granzyme-gen GZMA kunnen betrokken zijn. Hoewel NK-subsets in zeker mate werden onderzocht bij CVS [bv. Robertson MJ, Schacterle RS, Mackin GA, Wilson SN, Bloomingdale, Ritz J, Komaroff AL: Lymphocyte-subset differences in patients with Chronic Fatigue Syndrome, Multiple Sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol 2005, 141:326-332], hebben deze bevindingen niet noodzakelijk de rol van CD56brightCD16negative (neg) NK en CD56dimCD16postive (pos) NK-fenotypes bij CVS opgehelderd. NK-cellen en hun subsets zijn belangrijk bij immuun-regulering en pathogeen-lyse. CD56brightCD16negative NK-cellen secreteren bij voorkeur hoge waarden cytokinen en hebben beperkte cytotoxische funktie terwijl CD56dimCD16postive NK-cellen hoofdzakelijk cytotoxisch zijn. Bovendien hebben fagocyten zoals neutrofielen weinig aandacht gekregen, slechts één enkele studie heeft blootgelegd dat neutrofielen bij CVS meer vatbaar zijn voor apoptose, dit werd benadrukt door het voorkomen van grote hoeveelheden TGF-β1 [Kennedy G, Spence V, Underwood C, Belch JJF: Increased neutrophil apoptosis in Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol 2004, 57:891-893; zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’].

De multifactoriële en heterogene aard van CVS suggereert wijzigingen in andere bloed-indicatoren, zoals erythrocyten. Sommige CVS-patiënten vertonen veranderingen qua bloeddoorstroming, erythrocyten-rheologie en erythrocyten-morfologie [bv. Yoshiuchi K, Farkas J, Natelson BH: Patients with Chronic Fatigue Syndrome have reduced absolute cortical blood-flow. Clin Physiol Funct Imaging 2006, 26:83-86]. Abnormaal gevormde erythrocyten kunnen voorkomen als non-discocytisch [die niet de normale biconcave vorm hebben], stomatocytisch [stomatocyten = afwijkende rode bloed-cellen met een ovale, i.p.v. ronde, opheldering in het centrum] of beker-vormig [Simpson LO, Shand BI, Olds RJ: Blood-rheology and Myalgic Encephalomyelitis: a pilot-study. Pathol 1986, 18:190-192]. Daarnaast werden ook dalingen in erythrocyt-breedte en -massa, en veranderingen qua bloedplaatjes-aggregatie gedetekteerd bij sommige CVS-patiënten.

Plasma-proteïnen zoals fibrinogeen die de erythrocyten-rheologie beïnvloeden, zijn verhoogd bij sommige CVS-gevallen, en dit zou kunnen gerelateerd zijn met verstoorde coagulatie [Simpson LO, O’Neill DJ: Red blood-cell shape, symptoms and reportedly helpful treatments in Americans with Chronic Disorders. J Orthomol Med 2001, 16:157-165] Een verband tussen erythrocyten-aggregatie en fibrinogeen-waarden bij CVS is echter heden niet gekend. Wijzigingen qua erythrocyten-rheologie kunnen aanwezig zijn bij CVS. Deze observaties suggereren, hoewel ze wijzen op indirecte veranderingen in vervorming en aggregatie, de nood aan verder onderzoek om de mogelijke link tussen immuun-funktie en rheologie bij CVS te bevestigen.

De doelstelling van deze studie was dus immuun-funktie en rheologische eigenschappen van perifeer bloed cellen te bekijken. Deze studie onderzocht NK-abnormaliteiten bij CVS om deze van andere studies te bevestigen. NK-fenotypes, NK cytotoxische aktiviteit, neutrofiel-funktie, lymphocyt-aantallen, fibrinogeen-waarden en erythrocyt-rheologie werden gemeten bij CVS-patiënten. De CVS-data werden vergeleken met een voor leeftijd en geslacht gematchte groep gezonde vrijwilligers.

Materialen en methodes

Deelnemers

[…] De CVS-groep bestond uit 10 CVS-patiënten […] gekozen na het invullen van een vragenlijst op basis van de CDC 1994 CVS definitie; de duur van CVS was meer dan 5 jaar. […]

Lymfocyten-test

[…] d.m.v. fluorochroom-geonjugeerde monoklonale antilichamen […] fluorescentie-geaktiveerde cel-sorterining (FACS) […] lymfocyten-subsets CD3+/CD19 (B-cellen), CD3+ (T-cellen), CD3+/CD4+ (T-helper cellen), CD3+/CD8+ (T-cytotoxische cellen, T-suppressor), CD3-/CD16+/CD56+ (Natural Killer cellen).

Bepaling van NK-lymfocyten aktiviteit

[…] NK-cellen gelabeld met PKH-26 [fluorescente cel-membraan merker] […] K562 cell-lijn [leukemie-cellen die makkelijk worden gedood door NK-cellen] als doelwit-cellen […] Apoptose werd gemeten via flow-cytometrie, [biotechnologische techniek om cel-populaties aan te tonen] d.m.v. annexine [zie ook ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’] -antilichamen […].

Kwantificering van NK-fenotypes

[…] d.m.v. CD16 flow-cytometrie [zie inleiding].

Neutrofiel funktie test

[…] fagocyten-aktiviteit en ‘ respiratory burst’ gebruikmakend van de Phagotest en Phagoburst kit […] bepalen van fagocytose: incubatie van bloed-stalen met fluorochroom [fluorescerende kleurstof of stof die na omzetting resulteert in fluorescentie] -gemerkte geopsoniseerde [opsoniseren = het oppervlak van pathogenen bedekken met proteïnen, antilichamen/complement, zodat ze makkelijker kunnen opgenomen worden door fagocyten] E. coli [Escherichia coli, een bakterie die overvloedig aanwezig is in de darm] […]. Intracellulaire oxidatie met forbol 12-myristaat 13-acetaat [PMA; een krachtig promotor van de cel-deling], Dihydrohodamine [DHR; een fluorochroom] […] indicator voor neutrofiel ‘respiratory burst’ […].

Meting van of erythrocyt-aggregatie en fibrinogeen-concentratie

Erythrocyten-aggregatie d.m.v. aggregometer [toestel dat de samenklontering meet d.m.v. de verandering in elektrische ‘weerstand’ of licht-verstrooiing] […] twee metingen […] stilstaand (M0) en bij lage beweging (M1) […]. Fibrinogeen-bepaling […] plasma […].

Meting van de erythrocyten-vervormbaarheid

Bloed-stalen […] RheoScan-D ektacytometer […] binnen 6 uur na afname […]. [Laser-licht dat wordt verstrooid door erythrocyten onderworpen aan een zekere beweging, kan worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen betreffende de veranderingen van cel-vorm tijdens het verschuiven in een vloeistof.]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Verdeling van leukocyten-subsets

Het totaal aantal of circulerende leukocyten bij CVS-patiënten en controles was vergelijkbaar. Er was geen statistisch verschil qua percentages voor B (CD3-/CD19+), T (CD3+/CD19-), CD4+T (CD3+/Cd4+), CD8+T (CD3+/CD8+) and NK (CD3-/CD56+/CD16+) -lymfocyten. Ook het totaal aantal circulerende monocyten en granulocyten verschilde niet tussen de groepen.

Veranderde verdeling van NK-fenotypes

Het totaal aantal of NK-fenotypes, meer bepaald CD56brightCD16 en CD56dimCD16+ NK-cellen, werd bepaald d.m.v. flow-cytometrie. CD56brightCD16 NK-lymfocyten waren significant verminderd (P<0.05) bij CVS-patiënten (4% ± 0,5) vergeleken met controles (10% ± 2,1). CD56dimCD16+ verschilde statistisch niet […].

Gedaalde NK cytotoxische aktiviteit

NK cytotoxische aktiviteit werd gemeten via het bepalen van het vermogen van NK-lymfocyten […] om apoptose te induceren in K562-cellen. Het percentage lyse voor de gezonde indviduen en de CVS-patiënten was significant verschillend. NK cytotoxische aktiviteit was significant lager bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (13,6% ± 5,1 en 34,3% ± 6.6, respectievelijk, P<0.05). […]

Gestoorde neutrofiel-funktie

Fagocytose door neutrofielen werd gemeten via flow-cytometrie gebruikmakend van de Phagotest kit, waar neutrofielen na fagocytose van FITC-gemerkte E. coli FITC-positief zijn. […] Fagocytose van E. coli was niet significant verschillend tussen CVS-patiënten (1.507 units ± 54) en gezonde individuen (1.471AU ± 85). Intracellulaire oxidatie, d.i. het vermogen van de neutrofielen om ‘reactive oxygen species’ te produceren na opname van E. coli, werd vastgesteld gebruikmakend van de Phagoburst kit. Bij de gezonde individuen […] is er een significant hogere hoeveelheid neutrofielen met intracellulaire oxidatie voor E. coli, terwijl bij de CVS-patiënten significant minder neutrofielen positief waren voor ‘oxidative burst’ na fagocytose van E. coli (P<0.05).

Erythrocyten-aggregatie en -vervormbaarheid

Erythrocyten-aggregatie op het einde van suspensie in autoloog plasma was niet significant verschillend bij M0 (stilstaand) én M1 (bij lage beweging). […] Hoewel plasma fibrinogeen-waarden uitgesproken hoger waren bij CVS-patiënten (3,59±0,38) vergeleken met gezonde individuen (2,95±1,11), bleek dit niet statistisch verschillend. Zo was er ook geen significante verandering qua vervormbaarheid tussen de groepen. […]

Bespreking

Het hoofddoel van deze studie was de immunologische en rheologische karakteristieken van vermoeidheid-gerelateerde aandoeningen zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) te bepalen. Dit is de eerste studie die significant veranderingen in NK-fenotypes bij CVS bevestigd, in het bijzonder dalingen qua CD56brightCD16 NK-cellen. Vergelijkbaar met ander bevindingen was NK cytotoxische aktiviteit ook verminderd. Deze studie heeft voor de eerste keer significante dalingen in neutrofiel ‘respiratory burst’ bij CVS-patiënten aangetoond. Het blijkt echter uit deze bevindingen dat CVS-patiënten normale aantallen lymfocyten en normale erythrocyt-rheologie, in het bijzonder aggregatie en vervormbaarheid, hebben; wat er misschien op wijst dat de symptomatologie van CVS geen afwijkingen qua erythrocyt-aktiviteit meebrengt. CVS kan mogelijks immuun-dysfunktie impliceren, waarbij de defekten lymfocyt-aktiviteiten en ander verwante immuun-molekulen kunnen aantasten.

NK-fenotypes bleken differentieel tot expressie te komen, zonder consistent subtype dat zou kunnen gewijzigd zijn qua expressie bij CVS [eerdere studies door verscheidene onderzoek-groepen]. Onze gegevens toonden significante dalingen qua CD56brightCD16 NK-cellen bij CVS-patiënten; dit kan gerelateerd zijn aan gestoorde chemotaxis [beweging van cellen als reaktie op een chemische prikkel]. CD56brightCD16 NK-cellen brengen bij voorkeur de chemokine-receptor 7 (CCR7) en hogere waarden van chemokine-receptor (CXCR) 3 tot expressie, in respons op chemokinen CCL19, CCL21 en CXCL10, CXCL11 respectievelijk [zie ook: ‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’; chemokinen = chemotactische cytokinen; sommige chemokine-receptoren kunnen aan diverse pathogenen binden]. Deze chemokinen worden afgegeven door pathogenen en secundaire lymfoïde organen [lymfe-klieren/-knopen, milt, enz.; waar proliferatie en differentiatie plaatsvindt – primaire: waar de vorming van T- (thymus) en B-lymfocyten (beenmerg) uit stamcellen plaatsvindt], en laten de verplaatsing toe van CD56brightCD16 NK-cellen naar de epithelia, periferie en andere lymfoïde organen tijdens een inflammatoire respons. Verstoorde chemokine-receptoren kunnen dus mogelijks de migratie van deze subsets van NK-cellen aantasten. Data van gen-expressie studies bij CVS hebben gewezen op differentiële expressie van de chemokine-receptor CXCR4 [Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D, Sinclair LI, Mattey Dl, Richards SC, Montgomery J, Baldwin DA, Kellam P, Harrison TJ, Griffin GE, Main J, Enlander D, Nutt DJ, Holgate ST: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome / Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis 2008, 197:1171-1184 * zie ‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’], waarvan het proteïne CXCR4 tot expressie komt op beide subtypes van rustende NK-cellen. Aangezien geen significante veranderingen werden gezien qua aantal CD56dimCD16+ NK-cellen tussen de groepen, is het aannemelijk dat een slechte chemokine-receptor funktie de CD56brightCD16 NK-cel migratie naar de periferie beïnvloedt. Interessant is dat geaktiveerde CD56brightCD16 NK-cellen ook de chemokinen CXCL8, CCL4, CCL5 en CCL22 produceren. CXCL8 is vereist voor de migratie en recrutering van CD56dimCD16+ NK-cellen. Veranderingen in hun expressie kunnen de recrutering van CD56brightCD16 NK-cellen beïnvloeden en de immuun-respons op pathogenen beperken met mogelijke stoornissen bij aktivatie van andere immuun-cellen tot gevolg.

NK-cellen zijn verantwoordelijk voor de produktie van de cytokinen interferon (IFN)-γ (NK-cellen zijn de voornaamste producenten), tumor necrose factor (TNF)-α, granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor [GM-CSF; cytokine dat als een groeifactor voor witte bloed-cellen fungeert, stimuleert stamcellen tot vorming van granulocyten/monocyten], interleukine (IL)-10, IL-8 en IL-13; nodig voor de aktivatie en rijping van of macrofagen, dendritische cellen en T-cellen, en immunosuppressie. Afgifte van IFN-γ aktiveert het Fas-ligand cytotoxische mechanisme [Fas = trans-membraan proteïne van de TNF-familie, binding van het Fas-ligand met zijn receptor induceert apoptose; belangrijk bij de regulering van het immuunsysteem en de progressie van kanker] op NK-cellen dat een cascade van caspasen [eiwit-afbrekende enzymen, die een essentiële rol vervullen bij de apoptose] in gang zet die de doelwit-cellen effektief lyseren. TNF-α, eens geproduceerd door CD56brightCD16 NK-cellen, kan ofwel direct binden op TNF-α receptoren op de geïnfekteerde cel en apoptose van de doelwit-cel induceren, of TNF-gerelateerde apoptose-inducerend ligand [TRAIL; behoort tot de TNF-familie van cytokinen, induceert apoptose via dood-receptoren bij een brede waaier tumoren] initiëren op NK-cellen om zo caspase te aktiveren en cytotoxische aktiviteit te induceren. CD56brightCD16 NK-cellen zijn daarom belangrijk voor NK cytotoxische aktiviteit en er bestaat een correlatie tussen deze subtypes NK-cellen en NK cytotoxische aktiviteit.

Een verminderd aantal CD56brightCD16 NK-cellen werd ook geobserveerd bij patiënten met coronaire hart ziekte, allergische rhinitis en juveniele reumatoïde arthritis, in al deze gevallen was ook de NK cytotoxische aktiviteit gereduceerd. De daling qua cytotoxische aktiviteit werd verklaard door een vermindering van IFN-γ producerende CD56brightCD16 NK-cellen die leidden tot slechte cytotoxische aktivatie. Bijkomende veranderingen in de aanmaak van IFN-γ zijn geassocieerd met herhaalde infekties, produktie van adequate hoeveelheden IFN-γ tijdens initiële infektie zijn cruciaal voor bescherming tegen daaropvolgende infekties. Belangrijk is dat CD56brightCD16 NK-cellen kritiek zijn voor de vroege aangeboren en adaptieve immuun-respons aangezien ze meer proliferatief zijn en immuun-regulerende effekten op andere lymfocyten uitoefenen door de cytokinen en chemokinen die ze afgeven.

Neutrofielen zijn essentiële cellen van het aangeboren immuunsysteem. Ze werken hoofdzakelijk door het opslokken en lyseren van pathogenen via fagocytose en ‘respiratory burst’. Effektieve lyse gebeurt tijdens de ‘respiratory burst’, waar de oxidatie van super-peroxiden door NADPH resulteert in de aanmaak van een cascade van reaktieve zuurstof molekulen, die allen tesamen het pathogeen elimineren. Verminderingen qua neutrofiel-funktie wijzen op verstoorde immuun-funktie bij CVS. Tot hier toe heeft slechts één studie aangetoond dat neutrofielen bij CVS-patiënten zeer apoptotisch zijn, met een verhoogd TGF-β en TNFR1 [Kennedy et al.; zie eerder]. Vertraagde of beperkte apoptose correleert met een stijging qua ‘respiratory burst’; dus kan een situatie waarbij dalingen qua ‘ respiratory burst’ aanhouden mogelijks wijzen op verhogingen qua apoptotische neutrofielen. Dit verlengt mogelijks het leven van bakterieën en andere pathogenen in het lichaam, aangezien ze niet efficiënt worden gelyseerd omwille van de beperkte intracellulaire oxidatieve processen. Afnemende waarden van CD56brightCD16 NK-cellen kunnen de aanmaak beperken van TNFs, cytokinen die vereist zijn voor aktivatie van ‘respiratory burst’ in neutrofielen. TNF-α en GM-CSF, geproduceerd door CD56brightCD16 NK-cellen, zijn belangrijk voor de inductie van super-peroxide en het aldus aanzetten van de neutrofielen tot ‘ respiratory burst’.

Dalingen qua NK cytotoxische aktiviteit werden consistent gerapporteerd in eerder studies. Verminderde NK-aktiviteit kan gecorreleerd zijn met dalingen qua perforine- en granzyme-produktie en wijzigingen in granzyme (GZMA) gen-expressie [Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker-genes for differential diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med 2008, 14:599-607]. Deze deficiënties in NK-aktiviteit kunnen de virale lading bij CVS doen stijgen. […]. Virussen kunnen mogelijk aspekten van de immuun-respons, zoals cytotoxische aktiviteit, wijzigen en zo hun overleving in bepaalde immuun-cellen bevorderen. NK-cel en neutrofiel-deficiënties bij CVS kunnen gerelateerd zijn met de aanwezigheid van auto-antilichamen. Enkele van deze auto-antilichamen, specifiek voor proteïnen die kunnen interageren met immuun-cellen, werden gedetekteerd in serum-stalen van CVS-patiënten; maar auto-antilichamen specifiek tegen receptoren die tot expressie komen op immuun-cellen of bij cellulaire lytische mechanismen werden echter nog niet gevonden.

Er was geen verandering qua in erythrocyten-vervormbaarheid of -aggregatie, hoewel andere studies wijzigingen qua erythrocyt-vorm bij CVS-patiënten hebben bevestigd, meer bepaald een verhoogd aantal stomatocyten [zie eerder] of lepotocyten [abnormaal dunne of afgeplatte rode bloed-cellen met weinig kleur]. Er bleek ook geen statistische significantie tussen de twee groepen. Wellicht komt dit door de heterogeniteit van CVS. Niettemin zijn observeerbare rheologische veranderingen misschien wel geassocieerd met de acute fase van CVS terwijl ze afwezig zijn tijdens de chronische stadia van de aandoening. Alle CVS-patiënten in deze studie zaten in de chronische fase. Erythrocyten-vervormbaarheid en -aggregatie zijn dus wellicht geen duidelijke merkers voor CVS.

Gezien de schaarste aan CD56brightCD16 NK-cellen bij CVS-patiënten in deze studie en hun rol bij immuun-regulering en -aktivatie, zouden gedaalde aantallen CD56brightCD16 NK-cellen belangrijk kunnen zijn bij het pathomechanisme van CVS, een aandoening waarvan werd aangetoond dat ze wordt gekenmerkt door verminderingen qua NK cytotoxische aktiviteit. Hoewel wijzigingen in NK-cel merkers eerden werden gerapporteerd, werd een mechanisme die aan de basis ligt van afnemende NK-cel merkers en fenotypes nog niet gevonden. Dergelijk mechanisme kan ook veranderingen op genomisch niveau impliceren die resulteren in deficiënte cytokine- en chemokine-receptor expressie. Bijvoorbeeld: er werden wijzigingen in RNA expressie-niveaus van CD56brightCD16 NK-cel receptoren aangetoond bij patiënten met Autisme Spectrum Stoornis, waar cytotoxische activiteit en NK-cel aantallen ook waren gedaald als NK-cellen werden gestimuleerd d.m.v. een pathogeen. Blootstelling aan pathogenen in aanwezigheid van differentiële expressie van bepaalde NK cytokine- en chemokine-receptor genen kan een afname qua CD56brightCD16 NK-cellen en NK cytotoxiciteit bij CVS triggeren.

De heterogeniteit en multifactoriële aard van CVS suggereert echter variaties in molekulaire wijzigingen en cellulaire mechanismen bij patiënten. Bepaalde cytokinen verhogen het cytotoxisch vermogen (IL-2) en de IFN-γ produktie (IL-12 en IL-18) van CD56brightCD16 NK-cellen, daarom zou een mogelijk mechanisme dat de aanmaak van deze cytokinen beperkt, de rol van CD56brightCD16 NK-cellen tijdens invasie van en lyse pathogenen ten nadele kunnen veranderen. Hoge waarden TFG-β veroorzaken ook een stijging qua neutrofiel-apoptose en dit gebeurt bij sommige gevallen met CVS. Ten slotte zouden virus-specifieke infekties nodig kunnen zijn voor NK-deficiënties bij CVS, gezien het feit dat het Humaan Immunodeficiëntie Virus type 1 Viraal Proteïne R (HIV-1 Vpr) TGF-β upreguleert en de produktie van IL-12 door macrofagen doet dalen, met een afname qua cytotoxische aktiviteit en IFN-γ tot gevolg. Deze mechanismen zouden aanwezig kunnen zijn bij CVS en deficiënties impliceren in het vermogen van andere leukocyten – meer bepaald macrofagen en dendritische cellen – om de NK-cellen te aktiveren.

Besluit

De informatie voorgesteld in deze studie bevestigt een significante vermindering qua immuun-funktie bij CVS, specifiek wat betreft CD56brightCD16 NK-cel aantallen, NK-cytotoxiciteit en neutrofielen ‘respiratory burst’. Dit is de eerste studie die gelijktijdig aangeboren immuun-funktie, fagocytose en cytotoxische aktiviteit bij CVS beoordeelt. De in deze studie geobserveerde defekten in aangeboren immuun-funktie suggereren mogelijks een gewijzigde adaptieve immuun-respons bij CVS en dit zou van belang kunnen zijn voor het begrijpen van het pathomechanisme van CVS. Verdere studies zijn echter vereist om cytokine- en chemokine-expressie bij CVS-patiënten te bepalen. Neutrofiel-apoptose in relatie tot ‘respiratory burst’, cytotoxische aktiviteit in CD8 T-cellen, perforine- en granzyme-produktie, en CD4+T-cel cytokine-secretie bij CVS-patiënten zijn mogelijke onderwerpen voor toekomstig onderzoek. Deze studies zullen een uitgebreide analyse van de de globale immuun-funktie bij CVS-patiënten toelaten.

november 23, 2009

Transcriptie-profiel van spieren bij CVS

Filed under: Celbiologie,Genetica — mewetenschap @ 2:21 pm
Tags: , , , , , , , ,

Dit is het vervolg op de eerdere studie betreffende de morfologie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten (‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS’). In feite gaat het over dezelfde groep patiënten en experimenten die gelijktijdig werden ondernomen.

Samengevat: er werd bij CVS-patiënten veranderde gen-expressie in de spieren gevonden en deze wijzigingen bleken terug te brengen naar de volgende processen en mechanismen: energie-produktie, oxidatieve stress, spierweefsel-morfolgie (vezel-type), spier-groei/-afbraak en geleiding van zenuwprikkels naar de spieren.

Wederom dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology (2009) 22: 795-807

Transcription profile analysis of vastus lateralis muscle from patients with Chronic Fatigue Syndrome

Pietrangelo T, Mancinelli R, Toniolo L, Montanari G, Vecchiet J, Fanó G, Fulle S

Department of Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Aging (CeSI), University G. d’Annunzio Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Vele lichaam-systemen zijn aangetast en de etiologie werd nog niet geïdentificeerd. Naast immunologische en psychologische aspekten, zijn skeletale spieren symptomen prominent bij CVS-patiënten. In een poging vast te stellen welke mechanismen mogelijks betrokken zijn bij de aanvang en ontwikkeling van spier-symptomen, gebruikten we algemene transcriptoom [verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen – ‘transcripten’ , tot expressie komende genen – geproduceerd in een cel of populatie van cellen] -analyse om genen te identificeren die differentieel tot expressie komen in de vastus lateralis spier [spier aan de voorzijde van het dijbeen, deel van de quadriceps] van vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten. We vonden dat de expressie van genen die een sleutel-rol spelen bij mitochondriale funktie en oxidatief evenwicht, inclusief superoxide-dismutase 2, was gewijzigd, net zoals genen betrokken bij energie-produktie, musculaire groei/ontwikkeling en bepaling van het vezel-fenotype. Belangrijk was dat de expressie van een gen coderend voor een component van de nicotine-cholinergische receptor-bindingsplaats verminderd was, wat een gestoorde neuromusculaire transmissie suggereert. We argumenteren dat deze belangrijke biologische processen betrokken kunnen zijn bij en/of verantwoordelijk voor de spier-symptomen van CVS.

[…]

Het is niet verrassend dat skelet-spieren het meest onderzochte orgaan zijn bij studies die zich richten op de lage tolerantie voor inspanning. Oxidatieve stress, door anderen en ons eigen laboratorium voorgesteld als een mogelijke bijdrage tot de pathofysiologie en klinische symptomen van CVS, is het brandpunt voor research geworden. [zie artikels van het lab van S. Fulle] Een studie vond dat reaktieve zuurstof soorten [ROS] niet enkel verantwoordelijk zijn voor molekulaire schade maar ook fungeren als belangrijke signalisering-molekulen die de samentrekbaarheid moduleren in niet-vermoeide én vermoeide skelet-spieren. Meerdere biochemische en metabole manifestaties in spiervezels bij CVS werden onderzocht maar de besluiten waren controversieel. Er werd getoond dat CVS-patiënten verminderde serum-concentraties aan acetylcarnitine hadden (Kuratsune et al. 1994) [zie ook: ‘Acetylcarnitine – verminderde opname in de hersenen], wat mogelijks duidt op een verminderde mitochondriale energie-produktie in de spier. Matige inspanning veroorzaakt sustantiële musculaire verzuring en de aktiviteiten van adenylaat- en creatine-kinase kinase [enzymen die een rol spelen bij de energie-voorziening van spieren] in de spier zijn gebrekkig bij CVS-patiënten. Bovendien werden spier-pijn in afwezigheid van perifere weefsel-schade en gedaalde zuurstof-verzadiging na inspanning gerapporteerd. In het licht van het beschikbare maar controversiële bewijsmateriaal betreffende de betrokkenheid van spiervezels bij CVS en de karakterisatie van enkelvoudige spiervezels, met inbegrip van de bepaling van contractie-eigenschappen in vivo [zie: ‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS], beslisten we een benadering te gebruiken die niet nog niet werd toegepast om skelet-spieren van CVS-patiënten te bestuderen: de identificatie van veranderingen qua gen-expressie m.b.v. micro-arrays. Ons doel was te bepalen of consistente gen-expressie wijzigingen konden worden geïdentificeerd bij CVS-patiënten. […]

Materialen en Methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria. […] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar en 5,4±0,7 jaar ziek) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar en 7,8±1,9 jaar ziek). […] controles hadden geen huidige of vroegere geschiedenis van diffuse musculoskeletale pijn/vermoeidheid die langer dan 10 dagen duurde. […]

Om de klinische diagnose van CVS te bevestigen en, in het bijzonder, patiënten met fibromyalgie uit te sluiten, gebruikten we ook een directe test. In een eerdere studie toonden we aan dat oxidatieve schade bij CVS de fluïditeit [omschrijvig van de viscositeit van de lipiden-lagen van een cel-membraan] en de vetzuur-samenstelling veranderde van membranen van skelet-spieren, resulterend in een specifiek en eigenaardig patroon dat volledig verschillend was van dat van fibromyalgie-patiënten. Deze laatsten, die over het algemeen hogere gelijkaardige symptomen hebben als CVS-ers, vertonen hogere membraan-fluïditeit dan CVS-patiënten en controles. [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] Om deze reden werd voorgesteld dat deze specifieke schade aan de membranen van skelet-spieren in staat is de excitatie-contractie [de elektrische aktivatie van de spiercel zet de samentrekking in werking] mechanismen te wijzigen [zie ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS] en het zou dus nuttig kunnen zijn een onderscheid te maken tussen de twee aandoeningen. Tijdens het voorbereiden van de stalen in deze studie werden bij willekeurige biopten testen uitgevoerd om de membraan-fluïditeit te verifiëren als een inclusie-criterium; en de resultaten bevestigden de klinische diagnose.

[…]

Micro-array

De totale spier biopten hier gebruikt als RNA-bron zullen waarschijnlijk gecontamineerd zijn met andere cel-types (gladde spier, endotheliale cellen, ‘end-plates’ [uiteinden van een motor-neuron], fibroblasten) die kunnen bijdragen tot verschillen qua gen-expressie. Daarom werd een algemene micro-array i.p.v. een spier-specifieke gebruikt.

De humane oligonucleotide-set die hier werd gebruikt bestaat uit 21.329 oligonucleotiden […].

Analyse van gen-expressie profiel werd uitgevoerd bij vier patiënten (twee vrouwen, allebei 48 jaar, 4 en 65 jaar ziek; twee mannen, 27 en 36 jaar, respectievelijk 7 en 12 jaar ziek) aangezien slechts deze in aanmerking kwamen voor de analyse. […]

RNA-isolatie, amplificatie en labeling

[…]

Micro-array co-hybridisatie

[…]

Array-scan en statistische analyse van expressie-data

Resultaten

Samenvatting van het transcriptie-profiel

[…]

Transcriptie-analyse werd gebruikt om de expressie-waarden van duizenden genen gelijktijdig te monitoren, met de specifieke bedoeling transcripten en/of mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij CVS spier-symptomen. Ons experimenteel ontwerp vergeleek het RNA van elke CVS-patient met een ‘pool’ van controle-RNA verkregen van alle controle-individuen van het zelfde geslacht. Dit controle-RNA werd aangewend om de effekten van inter-indiviu heterogeniteit onder de controles te minimaliseren en een meer homogene ‘baseline’ te creëeren, om zo een grotere betrouwbaarheid te verkrijgen dat up- of downregulering van transcripten geïdentificeerd bij individuele CVS-patiënten gelinkt zijn met spier-symptomen van het syndroom.

Genen die differentieel tot expressie komen bij vrouwelijke én mannelijke CVS-patiënten

De ‘Significantie Analyse van Micro-Array’ (SAM) identificeerde 218 genen die differentieel tot expressie kwamen (96 ge-upreguleerde en 122 ge-downreguleerde) bij de twee vrouwelijke patiënten, en 453 genen (19 ge-upreguleerde en 434 ge-downreguleerde) bij de twee mannelijke patiënten.

[…]

Terwijl de expressie van 218 genen was gewijzigd bij de vrouwelijke patiënten en de expressie van 453 genen bij de mannelijke patiënten, was de expressie van slechts 47 genen significant veranderd in de bioptie-stalen van alle patiënten: twee genen waren die ge-upreguleerd en 38 waren ge-downreguleerd in biopten van van én mannelijke én vrouwelijke patiënten; zeven genen waren ge-upreguleerd bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten. Deze genen met differentiële expressie werden gebruikt als basis van onze poging om wijzigingen in sigalisering-mechanismen in spieren te identificeren bij dit syndroom.

Specifieke metabole veranderingen

De genen met differentiële expressie wijzen naar de mogelijke betrokkenheid van meerdere sigalisering-mechanismen en cellulaire processen in skelet-spieren bij de ontwikkeling van CVS. Ze omvatten (a) controle van de oxidatieve toestand, (b) DNA-herstel, (c) energie-balans, (d, e) trofische/inflammatoire processen, (f, g) groei-/apoptose-mechanismen, (h) neuromusculaire transmissie en (i) vezel-fenotype.

[We beperken ons hier tot een opsomming van de genen zonder al te veel wetenschappelijke uitleg; anders zouden we een ganse cursus biochemie en molekulaire biologie moeten meegeven. Geïnteresseerden kunnen altijd contact nemen voor meer informatie. Meer duiding ook in de bespreking…]

a) Oxidatieve stress. Ten minste drie mitochondriale genen die coderen voor proteïnen die direct of indirect gecorreleerd zijn met een onevenwicht in de oxidatieve status in de spier, waren ge-downreguleerd bij zowel vrouwelijke als mannelijke patiënten: (i) superoxide-dismutase 2 (SOD2), dat betrokken is bij het metabolisme van superoxide-anionen en een ‘opruimer’ van ROS gegenereerd in de mitochondrieën; (ii) ferrodoxine 1 (FDX1), dat een ijzer-zwavel proteïne is, in staat om elektronen te transfereren van NADH naar cytochroom-p450 en ook betrokken bij ROS-generatie; en (iii) NADPH-dehydrogenase-quinone 1 (NQO1), dat codeert voor een enzyme in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] dat in staat is te beschermen tegen toxische agentia.

Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (IHPK3), belangrijk in de context van verhoogde oxidatieve schade. […]

b) DNA-herstel en gen-expressie. Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren bij CVS-patiënten was het gen coderend voor […] (POLB), een enzyme dat DNA dubbele helixen herstelt […]. Belangrijk was ook dat we vonden dat het gen […] (CITED2), een proteïne dat het start-complex vormt voor […] acetylering, ge-downreguleerd was. Verminderde acetylering […] aktiviteit van POLB verhoogt. Van het gen […] (SFPQ), dat ook ge-downreguleerd was, werd aangetoond dat het interageert met RNA-polymerase II om de transcriptie te reguleren. Naast een mogelijke rol bij oxidatieve stress, zou downregulering van IHPK3 kunnen resulteren in […], wat het DNA-herstel vermogen wijzigt of mRNA-export verstoort. Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (SRRM2), een component voor een proteïne van de cel-kern matrix dat funktioneert als een co-acktivator voor pre-mRNA ‘splicing’ [verandering van genetische informatie na transcriptie van DNA naar mRNA: tijdens het RNA-processing worden ‘introns’ (overbodige, niet-coderende stukken) uit het pre-mRNA geknipt en de exons van het pre-mRNA aan elkaar geplakt].

Downregulering van het gen coderend voor […] (NM23A/NME1) zou een poging tot compensatie-respons kunnen zijn, bedoeld om DNA-schade te verlichten.

Het is moeilijker de funktionele betekenis te interpreteren van genen die bleken ge-upreguleerd te zijn bij vrouwen maar ge-downreguleerd bij mannen. Deze genen omvatten […] (DYRK2), dat p53 [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] reguleert om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] te induceren in respons op DNA-schade; […] (TBL1XR1), die betrokken is gebleken bij histoon-binding [eiwitten die aan DNA binden; zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB]; en […] (PDE4B), dat waarschijnlijk geen rol speelt in CVS-spieren.

c) Energie-balans. Eén kenmerk van het CVS-spier gen-profiel was de onderdrukte transcriptie van meerdere genen betrokken bij het energie-meatbolisme van skeletale spiervezels. We vonden dat twee […enzymen, […] (PFKFB3) en […] (PFKFB1) ge-downreguleerd waren; wat suggereert dat glycolyse [afbraak van glucose, waarbij energie vrijkomt, tot pyrodruivenzuur, dat verder kan verbrand worden of anäeroob omgezet tot lactaat] en/of gluconeogenese [vorming van glucose uit niet-koolhydraat bronnen zoals bv. aminozuren, maar vooral uit pyrodruivenzuur] verstoord waren. […] Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (PDK4), dat pyruvaat-dehydrogenase fosforyleert, een enzyme dat belangrijk is voor de oxidatieve [omzetting] van pyruvaat dat uiteindelijk wordt gebruikt voor oxidatieve fosforylatie [ox-fos; mitochondriaal proces waarbij energie-rijke elektronen hun energie afgeven in een serie redox-reakties; zie ook: ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte]. Bovendien was […] (GOT1) ge-downreguleerd, wat suggestief is voor een toename van de gluconeogenese zonder verbruik van aminozuren., consistent met een poging van de CVS-spieren om glucose te besparen. Genen betrokken bij de fosforylatie van nucleoside-difosfaten waren ook ge-downreguleerd: inclusief […] (AMPD3), een belangrijk enzyme in purine-afbraak [purine is één van de stikstof-basen waaruit nucleïnezuren zijn opgebouwd] in spieren. Het […] (ABCA5) bleek ook ge-downreguleerd, wat suggereert dat de efflux [verwijdering van opgestapeld cholesterol uit de vaatwanden] van cholesterol uit de vezel geïnhibeerd is.

Slechts één met een mogelijk belang voor het energie-evenwicht bleek ge-upreguleerd bij vrouwen én mannen: […] (VLDLR). Dit gen codeert voor de receptor die verantwoordelijk is voor de opname van VLDL [‘very low density’ lipoproteïnen; deeltjes die vetten en cholesterol uit de lever via het bloed naar weefsels transporteren] in de spiervezel en betrokken is bij het primair mechanisme voor vetzuur-transport in skelet-spieren.

d) Atrofische processen. Een ge-downreguleerd tanscript betrokken bij de atrofische processen was […] (FOXO3A). Proteïnen van deze familie zijn transcriptie-factoren die de expressie reguleren van meerdere genen [FOXO transcriptie-factoren controleren fundamentele cellulaire processen zoals metabolisme, cel-differentiatie, cel-cyclus, DNA-herstel en andere reakties op cellulaire stress] die ge-downreguleerd bleken bij onze screening (inclusief PDK4, SOD2 en GADD45, die van belang zijn bij cellulaire responsen zoals glucose-metabolisme, regulering van de cel-cyclus en apoptose). Het is het vermelden waard dat een ander gen dat betrokken is bij het FOXO-mechanisme, […] (H1FX), coderend voor een nucleosoom-proteïne dat DNA linkt met het nucleosoom [complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt], ge-downreguleerd was.

Belangrijk in de context van atrofische processen: het ubiquitine-afhankelijk katabolisme [merken van proteïnen, door koppeling met ubiquitine, waardoor ze kunnen worden afgebroken] was waarschijnlijk ook onderdrukt; wat blijkt uit de downregulering van ubiquinatie-factor E4A (UBE4A), coderend voor de bijkomende conjugatie-factor E4. Deze factor, die sterk tot expressie komt in skelet-spieren, vervangt het E3-enzyme en is in staat ubiquitine te transfereren naar zijn doel. De onderdrukking van ubiquitine-afhankelijke processen in CVS-spieren wordt verder bevestigd door de downregulering bij vrouwelijke patiënten van […] (PSMD3), coderend voor een non-ATPase subunit [betrokken bij de afbraak van ge-ubiquitineerde proteïnen] van het proteasoom [proteasoom = cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende – overbodige of beschadigde – proteïnen afbreken via proteasen]. Bij mannelijke patiënten werd de downregulering van […] (PSMB2), coderend voor een beta subunit van het 20S proteasoom [onderdeel van het proteasoom dat ge-ubiquitineerde molekulen afbreekt], vastgesteld.

e) Inflammatoir proces. De volgende genen waren ge-downregeuleerd bij alle patiënten, wat een vermindering van de inflammatoire respons in CVS-spieren suggereert: (i) […] (SLPI), een gen coderend voor een serine-protease [proteasen die peptide-verbindingen, waarin één van de aminozuren serine is, doorknippen] met meerdere funkties bij aangeboren gastheer-verdediging, inflammatie en infektie; (ii) GRO2 oncogen [gen dat ervoor zorgt dat een cel zich als een kanker-cel gaat gedragen], […], een krachtig chemotactisch agens voor polymorfonucleaire leukocyten [stof die meerkernige witte bloedecellen aantrekt]; (iii) […] (GBP2), coderend voor een proteïne dat de proliferatie en de angiogene respons [angiogenese = vorming van nieuwe bloedvaten] van endotheliale cellen [bedekkende cellen van bloed-/lymfe-vaten en lichaamsholten] op inflammatie tegenwerkt, en ook weerstand biedt tegen de proliferatie van vesikulair stomatitis virus en encefalomyocarditis vrius; (iv) […] (TSC22D3/GILZ), een gen coderend voor de mediator van glucocorticoïd-geïnduceerde immunosuppressie, dat interfereert met AP-1 [zie Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB] […] om de binding van aktief AP-1 met zijn doelwit-DNA te inhiberen.

f, g) Groei/apoptose en cytoskeletale regulering. Meerdere ge-downreguleerde genen gemeenschappelijk bij mannelijke en vrouwelijke CVS-patiënten zijn betrokken bij cellulaire groei en apoptose-mechanismen, suggestief voor een relatieve uitdoving van deze inter-connecterende mechanismen. We vonden dat […] (FOS) en […] (MYC) ge-downreguleerd waren. FOS en MYC zijn transcriptie-factoren betrokken bij de proliferatie en cel-cyclus regulering […] maar ze induceren ook apoptose in gevoelige cellen. FOS downregulering is consistent met de downregulering van het met FOS interagerend proteïne TCS22/GILZ, waarmee het een gemeenschappelijke signaal-transductie mechanisme deelt. Ook ge-downreguleerd waren […] (AATF), een transcriptie-factor die EF2-transcriptie [EF = elongatie-factor; proteïne dat het verlengen van peptide-ketens bij proteïne-synthese vergemakkelijkt] stimuleert en cel-cyclus progressie bevordert, en […] (CEBPD), die werd gelinkt aan cel-groei en apoptose in spiercellen.

Vele genen betrokken bij controle van focale adhesie [cel-matrix adhesies of FAs; specifieke types grote macro-molekulaire samenstellingen waarmee mechanische kracht en regulerende signalen worden doorgegeven] en cytoskeletale en/of regulering van de extracellulaire matrix bleken ook ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Onder andere: (i) […] (PRELP), coderend voor een eiwit dat type-I collageen linkt met heparaan-sulfaat basale membranen [heparaan-sulfaat speelt een rol bij angiogenese, coagulatie en tumor-metastase]; (ii) collageen type-V alfa 3 (COL5A3); (iii) […] (LIMK1), coderend voor en proteïne dat eiwitten betrokken bij de organisatie van het actine-cytoskeleton linkt; en (iv) […] (SAT1), coderend voor een eiwit betrokken bij de regulering van apoptose, cellulaire proliferatie en cel-cyclus progressie.

Ook meldenswaardig is de downregulering van twee bijkomende proteïnen: (i) […] (PTK2/FAF), coderend voor een cytoplasmatisch proteïne gelokaliseerd op focale adhesies tussen groeiende cellen, dat belangrijk is voor transductie van externe signalen; en (ii) prion-proteïne (PRNP), ook bekend van bv. Creutzfel-Jakob ziekte […], coderend voor een glycoproteïne gehecht aan het cel-membraan […]; kenmerken die consistent zouden kunnen zijn met rollen qua cel-adhesie en trans-mebraan signalisering. Een ander gewijzigd gen in CVS-spieren, een anti-angiogene factor met een rol in de focale adhesie, is thrombospondine (FLJ14440, THBS1, THBS2), dat ge-upreguleerd blijkt bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten.

h) Neuromusculaire transmissie. Het gen CHRNA1, coderend voor een component van de acetylcholine binding-plaats van de nicotine-receptor […] bleek ge-downreguleerd. De afwezigheid van dit gen-produkt zou een verstoord vermogen om te antwoorden op motor-neuron ‘vuren’, belangrijk voor trage-vezel-type specificatie, kunnen impliceren.

h) Spiervezel-fenotype. De transcriptie-factor […] (MYF6/MRF4/herculine) bleek ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Bij muizen accumuleert MRF4 in trage vezels en er is bewijs dat dit gen de verschuiving naar het trage vezel-type reguleert. Dit suggereert dat her-modelering van spieren gericht is naar het snelle fenotype bij CVS-patiënten, een interpretatie die overeenstemt met de resultaten van vezel-typering op eiwit-niveau [zie Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS].

Downregulering van de volgende genen geïdentificeerd in de huidige transcriptoom-analyse ondersteunt ook deze visie: (i) calmoduline 1 (CALM1/fosforylase-kinase delta), coderend voor een belangrijk calmoduline-afhankelijk kinase dat betrokken is bij het decoderen van intracellulaire calcium-oscillaties tijdens myogenese en de differentiatie van het trage-vezel fenotype [calmoduline, CaM, ‘CALcium MODULated proteIN’, een calcium-bindend proteïne dat verschillende doelwit-proteïnen kan binden en reguleren, en zo verscheidene cellulaire funkties beïnvloeden]; en (ii) […] (Egralfa3), coderend voor een transcriptie-factor die sterk tot expressie komt bij ontwikkelende spier-spoelen [sensorische receptoren in de ‘buik’ van een spier die veranderingen detekteert in de lengte van deze spier]. Aangezien spier-spoelen meer aanwezig zijn in de delen van de spier waar type-I vezels geconcentreerd zijn, zou downregulering van dit gen consistent kunnen zijn met een spier-modelering in de richting van het snelle-vezel type. Andere observaties consistent met de visie dat gen-expressie veranderingen bij CVS een verschuiving van het vezel-type van traag naar snel weerspiegelen omvatten: (i) upregulering (beperkt tot vrouwelijke patiënten) van myosine lichte-keten kinase 2 (MYLK2), coderend voor een calmoduline-afhankelijk kinase dat sterk tot expressie komt bij regenererende en volwassen snelle vezels; en (ii) verandering (downregulering bij mannen, upregulering bij vrouwen) […] (CASQ2), coderend voor een proteïne dat kenmerkend is voor trage spiervezels, en belangrijk voor de opslag van calcium in het sarcoplasmatisch reticulum en regulering van de ryanodine-receptor [zie ‘Molekulair mechanisme voor verminderde inspanningscapaciteit].

Bespreking

In deze studie vergeleken we de gen-expressie profielen van de vastus lateralis skelet-spier bij CVS-patiënten en gezonde controles. In deze context was het doel van onze analyse te bepalen of er consistente gen-expressie wijzigingen zijn bij CVS-patiënten die mogelijks de betrokkenheid kunnen tonen van skelet-spieren bij de manifestaties van deze ziekte en aanwijzingen zouden kunnen geven over welke cellulaire processen betrokken zijn. Eerdere studies door onze groep hebben specifieke oxidatieve veranderingen in DNA en lipiden in spier-stalen van CVS-patiënten aangetoond. Het is het vermelden waard dat Mn-SOD [superoxide-dismutase] deficiëntie geassocieerd is met ernstige lipiden-peroxidatie en andere ge-downreguleerde genen, zoals FDX1, NQO1 en IHPK3, kunnen mogelijks bijdragen tot de verstoring van anti-oxidante mechanismen. Daarenboven argumenteerden we dat oxidatieve schade zou kunnen voortkomen uit mitochondriale dysfunktie, gezien de gedocumenteerde strukturele veranderingen van mitochondriale cristae van de spier-mitochondrieën bij CVS, zoals eerder geobserveerd. [zie ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS] Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren in spieren van mannelijke én vrouwelijke CVS-patiënten is het gespecialiseerd DNA-polymerase POLB (zeer belangrijk omwille van zijn ‘base excision’ [cellulair mechanisme dat beschadigd DNA herstelt door het verwijderen van kleine base-paar gebreken] herstel-aktiviteit), dat mogelijks betrokken is bij de respons op verhoogde oxidatieve schade. POLB-aktiviteit kan post-transcriptioneel verhoogd zijn door een vermindering van POLB-acetylering, die een verwacht gevolg zou zijn van CITED2 downregulering. We zouden ook kunnen speculeren dat het cyclisch voorkomen en de variabiliteit van spier-symptomen bij dit syndroom een weerspiegeling zou kunnen zijn van het weefsel-specifiek vermogen van POLB om ROS-geïnduceerde schade te herstellen. In een eerdere studie werd verhoogde anti-oxidante aktiviteit in CVS-spieren aangetoond, te wijten aan verhoogde aktiviteit van peroxidase, transferase en katalase. Deze uitkomst lijkt een poging van de CVS-spieren te vertegenwoordigen om zichzelf te beschermen tegen oxidatieve stress, gebruikmakend van anti-oxidante enzymen die tegen ROS werken in het cytoplasma, en POLB dat in de cel-kern DNA-mutaties helpt herstelllen. Deze positieve feedback is in overeenstemming met de hypothese van verhoogd peroxinitriet (Lane er al. 1998) die reeds werd voorgesteld. In feite zou stikstof-oxide kunnen reageren met ROS en het krachtige oxidant peroxinitriet genereren dat op zijn beurt het niveau van Mn-SOD zou kunnen doen dalen.

De downregulering van fosfofructokinase-transcripten bij al onze geteste patiënten suggereert de hypothese dat CVS, in bepaald opzichten, vergelijkbaar zou kunnen zijn met type-VII glycogenose of Tarui-ziekte, een zeldzame erfelijke ziekte veroorzaakt door fosfofructokinase-deficiëntie in spieren. Een tekort aan dit enzyme resulteert in glycogeen [polymeer van glucose, als energie-reserve opgesalgen in de lever en spieren] opstapeling in weefsels, wat symptomen veroorzaakt die inspanning-intolerantie of voortijdige vermoeidheid, zwakte en stijfheid bij inspanning, en pijnlijke spier-krampen omvatten. In veel gevallen heeft dit defekt systemische consequenties maar in andere gevallen beperken compenserende mechanismen de effekten tot bepaalde weefsels. In enkele patiënten met Tarui-ziekte werd de AMP-deaminase aktiviteit van erythrocyten verhoogd door calmoduline-afhankelijke intracellulaire calcium-verhoging. Bij CVS-spieren vonden we dat AMP-deaminase én calmoduline-fosforylase-kinase ge-downreguleerd waren. Dit is direct bewijs dat CVS en Tarui-ziekte verschillend zijn, gezien beide pathologieën klinisch significante spier-zwakte veroorzaken maar enkel bij CVS zijn de patiënten niet in staat hun verzwakte toestand te verhelpen met rust. De geobserveerde downregulering bij mannelijke én vrouwelijk patiënten van het gen coderend voor AMP-deaminase verdient bijkomende commentaar. AMP-deaminase is een enzyme dat van uiterst belang is bij het behouden van de beschikbaarheid van ATP bij inspanning. Eerdere studies hebben bewijs geleverd van gebrekkige adenylaat-aktiviteit in spieren van CVS-patiënten na matige inspanning [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259]. Deze verandering zou kunnen gelinkt zijn met de hoge vermoeibaarheid van CVS-patiënten tijdens uitputtende arbeid. De verstoorde afbraak van purine-nucleotiden in de spier werd geobserveerd bij andere ziekten zoals glycolytisch defekt ziekte en ook bij mitochondriale ziekten waarbij de lipiden- en koolhydraten-oxidatie zijn aangetast.

Het intense gebruik van anaërobe glycolyse voor de nood aan ATP tijdens matige inspanning en het verhoogd aantal glycolytische vezels impiceert lactaat-accumulatie. We kunnen suggereren dat in CVS-spieren er een samenloop is van metabool falen die een verstoring van aërobe energie-produktie, onderdrukking van de purine-afbraak en verhoogd lipiden-verbruik omvat.

Alle spier-stalen van CVS-patiënten vertoonden downregulering van FOXO3A, coderend voor […] één van de vooraanstaande regulators van ubiquitine-ligasen. Als we de mogelijke rol van fosforylatie bij FOXO-inaktivatie ter zijde laten, wat we niet bestudeerden, vonden we dat meerdere aan ubiquitine-proteïne-ligase verwante genen, die molekulaire doelwitten zijn voor FOXO-aktiviteit, waren ge-downreguleerd. Te samen genomen, wijzen deze gegevens naar een onderdrukking van atrofie-signalen in CVS-spieren.

Immuun-dysfunktie werd bij sommige CVS-patiënten gedocumenteerd […]. In onze analyse vonden we geen aanwijzing voor veranderde immuniteit noch enige indicatie voor inflammatoire respons. In tegenstelling daarmee vonden we dat enkele inflammatoire respons genen ge-downreguleerd waren.

Eén van de meest opvallende wijzigingen bij de huidige transcriptoom-analyse bij CVS-patiënten, is de uitgesproken downregulering van CHRNA1, coderend voor […] een component van de acetylcholine-bindingsplaats. De vermoeidheid ervaren door CVS-patiënten zou een centrale óf perifere oorzaak kunnen hebben. Het eerste hangt af van de ‘vuur-frequentie’ en het tweede van neuromusculaire transmissie en/of excitatie/contractie-koppeling. Eerdere rapporten suggereren dat de symptomen van vermoeidheid bij CVS kunnen worden afgeleid van een falen qua ‘vuur-frequentie’ van motor-neuronen en niet van een perifeer defekt in de spier-contractie. Onze resultaten leveren sterk bewijs voor deze opinie, suggererend dat daling van de transcripten leidend tot insufficiëntie wat betreft deze belangrijke cholinergische receptor component zou kunnen bijdragen tot verstoorde neuromusculaire transmissie.

[Dit zou ietwat contradictorisch kunnen lijken… Vroegere studies wijzen NIET op een perifeer defekt en de resultaten hier ondersteunen dit. TOCH wijst de bevinding van gestoorde neuromusculaire transmissie WEL op perifere betrokkenheid… Dr Pietrangelo verklaart (persoonlijke communicatie): “We hebben geen bewijs voor de etiopathogenese van CVS, dus weten we niet of de oorzaak centraal of perifeer is, maar toonden dat skelet-spieren bij CVS-patiënten (vezels en geaktiveerde genen) veranderd zijn. Dit wijst er op dat ook de periferie betrokken is door bv. gestoorde neurotransmissie, mitochondriale defekten, oxidatie enz. Meldenswaardig is dat bewijs is gevonden dat de toestand van de spieren het lot van motor-neuronen beïnvloedt (Musaro A et al., Cell Metabolism (2008) 8, 425-436, ‘Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity’) dus denken we dat de interaktie spier-zenuw, en vice versa, heel belangrijk is.”. Voor een overzicht van hun ideëen aangaande CVS en spieren, zie: Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis’.]

Een aantal hier gemelde wijzigingen qua gen-expressie wijzen consistent naar een verschuiving van trage- naar snelle-vezel fenotype zolas reeds aangetoond. Down-regulering van MRF4 en calmoduline-kinase suggereren dat regulerende mechanismen die het trage-vezel fenotype ondersteunen onderdrukt zijn. De downregulering van een gen zoals CASQ2, typisch voor het trage-vezel fenotype, en upregulering van MYLK2, hoewel beperkt tot een subgroep patiënten, is volledig consistent met deze interpretatie.

Ondanks de aanwezigheid van individuele en geslacht-specifieke variaties, zijn er significante en consistente wijzigingen in de transcriptie-profielen van spieren bij vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten; in het bijzonder zijn energie-produktie, management van oxidatieve schade, neuromusculaire transmissie en bepaling van het vezel-fenotype de belangrijkste biologische processen die betrokken zijn. Het is het melden waard dat vele processen gesuggereerd bij transcriptie-profiel analyse onafhankelijk ondersteuning vinden in eerdere rapporten, zoals in het geval van veranderde oxidatieve status en vezel-fenotype wijziging. Deze studie ondersteunt sterk de visie dat spiervezels direct betrokken zijn bij de funktionele en strukturele veranderingen die aan de basis liggen van de pathogene mechanismen van de ziekte en we kunnen besluiten dat spieren op molekulair en cellulair niveau betrokken zijn bij CVS-patiënten.

De twee studies (over veranderingen in vezel-fenotype en dit hier) plus het feit dat dit waarschijnlijk niet het resultaat is van deconditionering is opwindend. We vroegen hoe deze veranderingen ev. zouden kunnen worden omgekeerd Oefen-programmas lijken geen mogelijkheid, gezien vele patiënten een flinke terugval kennen na inspanning. Is er een andere (farmacotherapeutische) optie? Dr Pietrangelo: “ De enige suggestie die we hebben is uithouding-oefeningen. Dit zou het vezel-fenotype kunen doen verschuiven naar het trage type. Dit is echter slechts een opinie, we weten niet of dit effektief zou kunnen werken, en of het mogelijk is dit te doen bij deze patiënten en welk soort protocol zou moeten worden voorgesteld.”.

augustus 17, 2009

Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 6:36 am
Tags: , , , , ,

Ten einde een beetje duidelijkheid te krijgen over de stand van zaken aangaande gen-expressie bij M.E.(cvs), volgt hier een uitgebreid rapport van Prof. Dr Dr John W Gow (Senior Lecturer in Clinical Neuroscience; University Dept. of Neurology, Southern General Hospital, Glasgow, Scotland) en medewerkers. Er wordt regelmatig verwezen naar en vergeleken met anders studies; en biedt daarom een goed overzicht.

Samen met Prof. Chaudhuri en de ‘University of Glasgow’ heeft Gow in 2006 een patent aangevraagd onder de titel ‘Materials and Methods for Diagnosis and Treatment of Chronic Fatigue Syndrome’: “… Een aantal genen werden geïdentificeerd die tot een abnormale expressie kwamen bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met normal gezonde individuen. Deze genen omvatten deze encoderen voor defensine-α1, haemoglobine-γ, CXCR4, tubuline-beta-1, serine/threonine-kinase-17B, HLA DRss4 en prostaglandine-D2 synthase. De geïdentificeerde genen bieden objectieve ziekte-merkers die mogelijks gebruikt kunnen worden bij diagnostische testen om de diagnose van M.E.(cvs) te ondersteunen of bij het monitoren van de effektiviteit van een therapie. Ze bieden ook een rationele basis voor het klassificeren van M.E.(cvs)-patiënten volgens het onderliggend biochemisch letsel en voor geschikte doelgerichte therapieën.”.

In de leken-pers doken al verklaringen op gaande van “CVS is geen ziekte die veroorzaakt wordt door een erfelijk gen-defekt maar is een verworven aandoening.” tot “Een medicijnen-cocktail zou kunnen worden aangewend om de genen ‘uit te schakelen’, zodat patiënten een ‘redelijk normaal’ leven zouden kunnen leiden.”. In onderstaand artikel is men ietwat meer genuanceerd en minder voortvarend… Zoals eerder al aangegeven: ‘Nature’ en ‘Nurture’ bepalen een aandoening…

————————-

BMC Medical Genomics (2009) 2: 38 [Published: June 2009]

A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome

John W Gow1, Suzanne Hagan1, Pawel Herzyk2, Celia Cannon3, Peter O Behan1, Abhijit Chaudhuri4

1 Dept. of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, Glasgow, G4 0BA, UK;

2 The Sir Henry Wellcome Functional Genomics Facility, Faculty of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, G12 8QQ, UK;

3 Glasgow Veterinary School, University of Glasgow, UK;

4 Essex Centre for Neurological Sciences, Oldchurch Hospital, Romford, RM7 0BE, UK

Achtergrond

Aanhoudende vermoeidheid na infektie wordt erkend en maakt deel uit van een klinisch gedefinieerd syndroom (Chronische Vermoeidheid Syndroom). CVS is een zeer heterogene ziekte die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van nieuwe, persistente of terugkerende vermoeidheid, zo ernstig dat ze interfereert met de normale aktiviteit. Patiënten melden ook verstoord korte-termijn geheugen en concentratie, spier-pijn en post-exertionele malaise. Het klinisch voorkomen van CVS in de bevolking varieert van 0,23-2% en bijna 75% van de patiënten zijn vrouwen. De oorzaak en pathogenese van CVS zijn niet gekend en, tot op heden, is er geen standaard laboratorium-test die op een betrouwbare manier CVS-patiënten onderscheidt van gezonde individuen. Ten gevolgde daarvan wordt de persistentie van anderzijds medisch-onverklaarde chronische vermoeidheid dikwijls toegeschreven aan psychologische factoren. De voorbije jaren werden talrijke micro-chip studies ondernomen om patiënten met chronische vermoeidheid te onderscheiden van gezonde controles. Dit onderwerp werd ook behandeld in een speciale uitgave (2006) van het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’ [zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC’]. Daarin gebruikten meerdere artikels […], bioinformatica, algorithmen en rekenkundige analyses van micro-chip gegevens om een betere discriminatie te bekomen tussen individuen met onverklaarde chronische vermoeidheid en CVS, en gezonde controles.

Hoewel chronische vermoeidheid na bepaalde infekties bekend is (bv. Epstein-Barr virus), wordt CVS gewoonlijk niet beschouwd als te wijten aan een blijvende infektie. […]. [zie bv. ‘Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS’] Er zijn echter weinig studies die specifiiek de veranderingen qua gen-expressie bij post-infektueuze individuen hebben onderzocht.

Onze hypothese stelde dat patiënten met aanhoudende vermoeidheid die zich ontwikkelen na infekties biologisch verschillend zijn van individuen en dat dit zou worden weerspiegeld in een verschillende gen-signatuur. Recente vooruitgang in genoom sequentie-bepaling en geautomatiseerde chip-fabricage hebben DNA-chip (‘micro-array’) technologie makkelijk beschikbaar gemaakt. Deze technologie laat simultane differentiële expressie profilering toe voor een groot aantal genen in weefsel-stalen van CVS-patiënten en controles. Een eerdere studie, gebruikmakend van micro-array technologie met 1.764 genen en RNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC), toonde het nut van witte bloed-cellen voor gen-expressie profilering bij een ziekte zonder gekend pathologisch letsel, zoals CVS. Een meer recente micro-array studie met 9.522 genen concludeerde dat patiënten met CVS reproduceerbare veranderingen qua gen-regulatie vertonen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST, Kerr JR: Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol 2005, 58:826-832]. Daarenboven toonde een studie over inspanning-responsieve genen met een 3.800 oligonucleotide micro-chip significante verschillen in membraan ion-transport genen bij vrouwen met CVS, vergeleken met controle-individuen [Whistler T, Jones JF, Unger ER, Vernon SD: Exercise responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control subjects. BMC Physiology 2005, 5:5].

In onze studie, was het doel een complete ‘gen-signatuur’ te verkrijgen voor niet-psychiatrische patiënten met post-infektueuze, aanhoudende chronische vermoeidheid. We sloten vrouwelijke individuen uit om storende factoren voortkomend door de maandelijkse reproduktieve cyclus te voorkomen. Door gebruik te maken van een ‘Affymetrix GeneChip Human Genome U133’ dubbele chip set met bijna 45.000 probe-sets [een probe bij molekulaire genetica is een stukje erfelijk materiaal dat gemerkt werd om de aanwezigheid van een (deel van een gen) te detekteren of identifceren] – die 39.000 transcripten afgeleid van meer dan 33.000 gen-sequenties bevatten – werd het meeste van het gekende menselijk genoom in dit werk omvat.

Resultaten

Identificatie van genen met differentiële expressie.

Een aantal genen hadden een significante over- of onder-expressie bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde controles, bij micro-array analyse van het ganse genoom. De ‘Rank Products’ (RP) analyse [statistische berekening voor de detektie van differentieel tot expressie komende genen bij herhaalde micro-array experimenten] toonde dat 413 Affymetrix probe-sets significant waren ge-upreguleerd en 189 significant ge-downreguleerd (602 in totaal) bij de CVS-stalen. Van de significant ge-upreguleerd probe-sets, vertoonden 141 een verandering qua expressie van ten minste het 2-voud en 20 ten minste het 3-voud. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde probe-sets zijn respectievelijk 57 en 2.

IPA-resultaten.

[‘Ingenuity Pathway Analysis’, IPA, is software om via RP gegenereerde expressie-profielen te analyseren.]

Na analyse van de 602 probe-sets met differentiële expressie bleken 366 niet-overbodige ‘focus’ genen opgenomen in de IPA-database. Daarvan waren 286 genen significant ge-upreguleerd en 80 significant ge-downreguleerd bij de CVS-patiënten. Van de significant ge-upreguleerde genen waren er 105 waarvan de expressie ten minste verdubbelde en 16 ten minste ver-3-voudigde. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde genen zijn respectievelijk 25 en 3. De tien hoogst ge-upreguleerde genen en de drie hoogst ge-downreguleerde genen zijn te vinden op: http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T1.

Om de biologische context van genen met differentiële expressie bij CVS-patiënten te onderzoeken, werd de IPA-software gebruikt. […] De netwerk-analyse toonde het bestaan van 21 netwerken met een significante score tussen 9 en 47, die tesamen 349 van de 366 genen bevatten. De top drie netwerken, met 5 van de top 10 ge-upreguleerde genen, omvatten lactotransferrine (7,2 x ge-upreguleerd), CXCR4 (3,6 x ge-upreguleerd), de integrinen α2B en β3 (respectievelijk 4,1 x en 3,8 x ge-upreguleerd) en defensine-α1 (6 x ge-upreguleerd).

Veranderde bio-systemen bij CVS.

De gen-signatuur van CVS benadrukte veranderingen qua gen-expressie in drie belangrijke gebieden: oxidatieve stress, apoptose en viraal-achtige immuun- dysfunktie. (http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T2)

Oxidatieve stress

Er is een grote hoeveelheid bewijsmateriaal bij CVS dat er op wijst dat oxidatieve stress bijdraagt tot ziekte-progressie en symptomen. Ons gen-array bevestigt bewijs van oxidatieve stress door een grote verandering in de genen coderend voor prostaglandine-endoperoxide synthase 1 en 2 (ook gekend als COX-1 en -2). Deze enzymen zijn verantwoordelijk voor de regulering van de synthese van de pro-inflammatoire mediatoren: prostaglandinen. De induceerbare vorm van COX-2 katalyseert de omzetting van arachidonzuur naar prostaglandinen, de afgifte van prostanoïden [prostaglandinen (mediatoren van inflammatoire en anafylactische reakties), prostacyclinen (aktief bij de resolutie-fase van inflammatie) en tromboxanen (mediatoren van vasoconstrictie)], die perifere nociceptor [een sensorische receptor die reageert op pijn] -uiteinden sensitiseren en gelokaliseerde hyper-gevoeligheid voor pijn veroorzaken. Er werd ook aangetoond dat COX-2 tot over-expressie komt op plaatsen met inflammatie en bij verscheidene tumoren, met verhoogde expressie van het belangrijkste arachidonaat-metaboliet, prostaglandine-E2 (PGE2). Van COX-2 afgeleid PGE2 is ook gekend de expressie te verhogen van ‘decay-accelerating factor’ (DAF of CD55). DAF is én van de belangrijke beschermende complement-receptor genen en een immuun-regulator, wat van belang is aangezien DAF ge-upreguleerd was op onze chip. Dit is zeer betekenisvol wat betreft immuun-suppressie/ontwrichting en cel-verspreiding (verder besproken bij immuun-modulering). Gecultiveerde, door TNFα gestimuleerde lymfocyten van CVS-patiënten bleken te resulteren in over-expressie van NF-kappaB (NFκB) [zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]. COX-2 is verantwoordelijk voor meerdere inflammatoire akties, Terwijl NFκB het belangrijkste mechanisme is dat inflammatoire en oxidatieve stress mediatoren, zoals pro-inflammatoire cytokinen en COX-2 regelt, en de aanmaak van induceerbaar NOS (iNOS). De over-expressie van genen voor oxidatieve stress bij CVS is ook consistent met de upregulering van de haemoglobine-genen, in het bijzonder gamma-haemoglobine, dat gewoonlijk alleen tot expressie komt in de foetus. Bijkomende ge-upreguleerde genen betrokken bij oxidatieve stress bleken leukotriene B4, cytochroom-P450, superoxide-dismutase en de mono-oxygenasen. Indirect bewijs voor een O2--aanval komt van de upregulering van gamma- en alfa-haemoglobine, in het bijzonder gamma-haemoglobine. De unieke eigenschap van verhoogde zuurstof-binding van dit proteïne zou kunnen worden geïnduceerd ten gevolge een oxidatieve aanval.

Apoptose

Er is aktieve apoptose in de cellen van patiënten met CVS en consistent daarmee is de bevinding dat veel met apoptose geassocieerde genen, o.a. caspase-1, ge-upreguleerd zijn. Meerdere factoren kunnen apoptose triggeren: cellulaire beschadiging, virus-infektie en homeostase. Het signaal voor apoptose kan van binnenin de cel komen, van het omringend weefsel of van een cel behorend tot het immuun-systeem. Bij de top 100 ge-upregueerde genen is er een overwicht van met apoptose geassocieerde genen. Apoptotische cellen en hun kernen krimpen en fragmenteren dikwijls. Ze kunnen dan efficiënt via fagocytose worden verwijderd door macrofagen of naburige cellen. Uit het gen-array blijkt ook bewijs voor macrofaag-aktivatie, via de upregulering van Toll-like receptor (TLR)4 en TLR8 [Toll-Like receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren; er zijn ca. 10 types geïdentificeerd], en monocyt-naar-macrofaag differentiatie genen. Omtrent welke cellen apoptose ondergaan, zijn er theorieën te over. Kennedy en co hebben eerder verhoogde in neutrofiel-apoptose bij CVS gerapporteerd [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’]. Het kan zijn dat het deze groep cellen is die het doelwit is voor apoptose en onze array-gegevens omvatten zeker veel genen die gerelateerd zijn met neutrofielen, alsook eosinofielen.

Immuun-modulatie

Ontwijking van het immuunsysteem is een goed gedocumenteerd mechanisme waarbij virussen, bakterieën, parasieten en kanker-cellen vernietiging door de gastheer voorkomen. Immuun-modulaties kunnen uitéénlopend en complex zijn. Ze omvatten doelgerichte verstoring van T-cel funktie, onderdrukking van T-cel cytotoxische dood-receptoren [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’], inductie van apoptose-proteïnen, inhibitie van aangeboren immuunsystemen zoals dendritische cel en ‘natural killer’ (NK) receptoren. Uit deze studie blijkt dat meerdere genen die verbonden zijn met het immuunsysteem ge-upreguleerd zijn bij patiënten met CVS, wat wijst op mogelijke funktionele wijzigingen. Onder die genen die geïdentificeerd werden, zijn 2 genen die behoren tot het ‘Major Histocompatibility Complex’ [MHC; genen die coderen voor eiwitten op de membranen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]: HLA-DRB4 en HLA-DQB1; deze genen coderen voor β-ketens [bepaalde eiwitten, isoformen, die samen met andere het volledige proteïne vormen] van MHC klasse II molekulen. MHC klasse II molekulen worden gevonden op antigen-presenterende cellen, namelijk B-cellen, dendritische cellen en macrofagen [klasse I molekulen komen voor op élke cel van het lichaam met een kern]. Antigenen geassocieerd met MHC klasse II worden aangeboden aan CD4+ cellen, een sub-groep van T-cellen. Vroegere studies hebben storingen geïdentificeerd in de expressie van MHC klasse II genen bij patiënten met CVS. Steinau en collegas wezen op een downregulering van MHC klasse II molekulen; dit werk identificeerde echter geen individuele MHC klasse II genen [Steinau M, Unger ER, Vernon SD, Jones JF, Rajeevan MS: Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in chronic fatigue syndrome. J Mol Med 2004, 82:750-755]. Vervolgens duidden Smith et al. [Smith J, Fritz EL, Kerr JR, Cleare AJ, Wessely S, Mattey DL: Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol 2005, 58:860-863] verhoogde expressie van HLA-DQB1 aan en benadrukten een aantal andere MHC-genen die waren veranderd bij CVS. De hier voorgestelde data ondersteunen daarom enkele van deze bevindingen maar ze identificeren ook veranderingen qua expressie van HLA-DRB4 bij patiënten met CVS, wat eerder niet werd aangetoond.

Naast het MHC zitten bij de top van de ge-upreguleerde genen meerdere genen die coderen voor immuun-proteïnen die behoren tot het aangeboren immuunsysteem. Van patiënten met CVS worden verondersteld dat ze subtiele immuun-dysfunktie hebben. Veranderde NK-cel funktie bij CVS-patiënten werd eerder gerapporteerd door Morrison et al. en werd geverifieerd via de significante downregulering van NK KIR receptoren op onze gen-chip. Deze gegevens helpen te bevestigen dat immuun-modulerende gen-expressie significant verschillend is bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde individuen. Immuun-dysfunktie lijkt aanwezig te zijn bij patiënten met CVS in afwezigheid van eender welk pathogen. De klassieke Th1 naar Th2 omschakeling laat intracellulaire pathogenen toe opsporing te ontwijken. Zoals hierboven gemeld is DAF een regulator van het complement-systeem en een immuun-regulator. DAF lijkt NK-cellen te inhiberen en is gekend als één van de meest krachtige aktivatoren van tumor-genese/virale verspreiding. DAF is ook gekend als een receptor voor bepaalde virussen (inclusief enterovirussen) en andere micro-organismen. […] Het is geweten dat gen-expressie profielen van totale gemengde PBMC-populaties gen-expressie in sub-groepen van cellen kunnen maskeren. Deze studie toont echter zeer hoge expressie van een aantal MHC klasse II genen die normaal wordt gezien in de minder belangrijke delen van de PBMCs, wat wijst op significante veranderingen binnen deze cel-groepen.

Ge-upreguleerede immuun-gerelateerde genen bij patiënten omvatten lactotransferrine, defensine-α1 en integrinen. Lactotransferrine is een ijzer-bindend proteïne dat verantwoordelijk is voor immunologische reakties, terwijl defensinen een familie van bakterie-dodende en cytotoxische peptiden zijn, afgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Defensinen zijn ook betrokken bij de anti-microbiële verdediging van epithelia (van het ademhaling- en urinogenitaal systeem). Van patiënten met CVS is geweten dat ze meer vatbaar zijn voor infekties […]. Integrinen zijn extra-cellulaire matrix proteïnen betrokken bij in cel-adhesie en aktiveren ook signalisering-mechanismen voor cel-groei en -regulering in het cytosol. Arginase is een belangrijk enzyme waarvan wordt gedacht dat het aktief is bij immuun-modulering en is ook betrokken bij NK-cel funktie. Andere opmerkenswaardige ge-upreguleerde genen zijn haemoglobinen, in het bijzonder foetaal haemoglobine, en dit zou een respons op verhoogde oxidatieve stress kunnen suggereren. Een andere familie ge-upreguleerde genen staat in verband met cellulaire apoptose en serine-threonine kinase is een lid van de hersen kinase familie betrokken bij neurale apoptose en vorming van corpora amylacea [kleine korrels in neuroglia, bestaande uit gedegenereerde cellen]. Van de ge-downreguleerde genen, zijn ribosomaal proteïne [proteïnen die, samen met rRNA, de ribosomale subunits vormen die betrokken zijn bij de vertaling van RNA naar eiwitten] gen en ‘zinc-finger’ proteïne [grote super-familie van proteïne-domeinen die op DNA kunnen binden] genen betrokken bij de cel-cyclus en cellulaire groei.

Validatie van gen-array gegevens via RT-PCR en ‘western blotting’.

[RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) is een variant van PCR waarbij RNA i.p.v. DNA het uitgangspunt is voor amplificatie. Hiervoor wordt het RNA (enkel-strengig) eerst omgezet in cDNA (‘complementary DNA’) door gebruik te maken van het enzym reverse-transcriptase. Het cDNA kan vervolgens met PCR worden geamplificeerd om het dan te visualiseren en ev. te kwantificeren. Het is de meest gevoelige techniek om mRNA te detekteren.

‘Western blotting’: Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.]

Twee leden van de defensine gen-familie bleken zich onder de genen met de hoogste expressie te bevinden: defensine-α1 en -α4. Defensinen zijn een groep cytotoxische peptiden die te vinden zijn in de bakterie-dodende granulen van neutrofielen en macrofagen, en worden vrijgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Deze proteïnen spelen dus waarschijnlijk een rol bij fagocyten-gemedieerde gastheer-verdediging. Ten gevolde de hoge defensine-waarden die werden gemeten via de micro-chip, werd defensine-α1 gekozen voor verder analyse. We probeerden de gegevens te bevestigen op RNA- en proteïne-niveau, aan de hand van een andere groep of bloed-stalen van 10 CVS-patiënten en 10 normale, gezonde controles. We gebruikten oligonucleotiden [korte DNA-sequenties] (bij RT-PCR) en specifieke antilichamen (bij ‘western blotting’) om defensine-α1 veranderingen te detekteren op RNA- en proteïne-niveau. We tonen upregulering van defensine-α1 op het RNA-niveau bij patiënten met CVS, vergeleken met normale gezonde controles. Bovendien toont de immuno-blot upregulering van defensine-α1 bij alle CVS-patiënten (uitgezonderd één), vergeleken met controles die weinig of geen defensine-proteïne vertoonden. […]

Bespreking

Er werd een uitgebreide gen-signatuur van niet-psychiatrische patiënten met CVS gegenereerd d.m.v. een micro-chip test van het ganse genoom. De micro-array data die hier werden gepresenteerd, illustreren verschillen in gen-expressie verspreid over het ganse genoom tussen post-infektueuze, niet-psychiatrische mannelijke patiënten met CVS en gezonde controles. Analyse van de gen-signatuur van CVS suggereert dat drie significante mechanismen zijn veranderd in patiënten: oxidatieve stress, apoptose en virus-achtige immuun-modulering. Eerder voerden Gu et al. een micro-array met 588 genen uit waarbij patiënten met spondyloarthropathie [chronische inflammatoire ziekte van de gewrichten], reumatoïde arthritis en psoriatische arthritis [specifieke vorm van ontstekingsreuma gepaard met bepaalde vorm van huiduitslag] werden vergeleken met normale, gezonde individuen. Van belang was hun bevinding dat expressie van CXCR4 onverwacht hoog was bij alle individuen met arthritis. Dit gen codeert een CXC chemokine receptor [chemokinen = chemotactische cytokinen; geproduceerd door mest-cellen en afgegeven om leukocyten aan te trekken; sommige chemokine-receptoren kunnen aan diverse pathogenen binden] die specifiek is voor één ligand (‘stromal cell-derived factor-1’) [SDF-1; klein cytokine behorend tot de chemokine-familie] en CXCR4 is gekend samen te werken met CD4 proteïne [eiwit op het oppervlak van helper T-lymfocyten dat hen toelaat te interageren met cellen die MHC klasse II gen-produkten tot expressie brengen] om toegang van HIV in cellen te ondersteunen. DNA micro-chip studies door Watanabe en co toonde significante upregulering van het CXCR6 motief [chemokine receptor 6] in patiënten met colitis ulcerosa [chronische ontsteking van de de dikke darm met zweer-vorming]; terwijl ander werk er op wees dat de CXCL12/CXCR4 interaktie betrokken is bij meerdere inflammatoire aandoeningen, inclusief inflammatoire darm ziekte. Daarom wijst de bevinding van onze studie (dat CXCR4 significant was ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten) er op dat dit gen wellicht niet specifiek is voor CVS. We noteren echter dat in de CVS-studies door Kerr et al. [Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D, Sinclair LI, Mattey DL, Richards SC, Montgomery J, Baldwin DA, Kellam P, Harrison TJ, Griffin GE, Main J, Enlander D, Nutt DJ, Holgate ST: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis 2008, 197:1171-1184 — Kerr JR, Burke B, Petty R, Gough J, Fear D, Mattey DL, Axford JS, Dalgleish AG, Nutt DJ: Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol 2008, 61:730-739], CXCR4 ook was ge-upreguleerd.

Het algemeen beeld dat naar voor komt uit deze resultaten wijst naar een significante, hoewel fenotypisch subtiele, verstoring van de microbiële afweer, virale immuun-bewaking en cel-groei bij patiënten met post-infektueuze chronische vermoeidheid. Een mogelijke kritiek op dit werk is dat vrouwelijke patiënten werden uitgesloten. Zoals reeds uitgelegd was de reden hiervoor het vermijden van verstorende endocriene invloeden op de gen-signatuur. Eerdere research heeft weinig geslacht-gebonden verschillen wat betreft symptoom-ernst gevonden. Er was geen geslacht-effekt in een ‘prospective cohort’ studie [volgt gedurende een tijd een groep van gelijkaardige individuen die verschillen met betrekking tot bepaalde te onderzoeken (risico-)factoren, om te bepalen hoe die factoren met verloop van tijd een bepaalde uitkomst (bv. ziekte) opleveren] van patiënten met post-infektueuze vermoeidheid uit de eerstelijn-zorg. Over het algemeen onderscheiden demografische, klinische en psychosociale factoren mannelijke niet van vrouwelijke patiënten met CVS en we geloven dat de resultaten van onze research toepasbaar zijn op CVS-patiënten van de beide geslachten.

Besluiten

Recente studies hebben geprobeerd de molekulaire basis voor CVS te bepalen [zie eerder Kerr et al. — Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker genes for differential diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med 2008, 14:599-607 — Gräns H, Nilsson P, Evengård B: Gene expression profiling in the Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Internal Medicine 2005, 258:388-390]. Onderstaande tabel illustreert overlappende genen geobserveerd bij CVS-patiënten in onze analyse en in eerdere micro-array studies (en één filter-array studie), door andere researchers. Hoewel er enige overlap is, is er over het algemeen een gebrek aan correlatie tussen verschillende publikaties over gen-arrays tot nu toe. Of dit verschillende patiënten-populaties en selektie-criteria weerspiegelt, blijft onduidelijk. Het moet echter in gedachten worden gehouden dat veel mRNAs zeer korte half-waarde tijden [tijd waarin de helft van het mRNA wordt afgebroken] hebben (d.i. minder dan 2 min) en daarom is wat wordt geobserveerd met een micro-array een moment-opname en weerspiegelt het niet noodzakelijk het chronische biologische proces inherent aan deze aandoening. Het is, daarom, noodzakelijk de micro-array gegevens te valideren d.m.v. meer gevestigde technologieën zoals RT-PCR, ‘western blotting’ en ELISA, en grotere populaties met zorgvuldige geselekteerde patiënten te gebruiken om de resultaten te bevestigen.

De data die hier worden voorgesteld illustreren duidelijk belangrijke verschillen qua gen-expressie tussen patiënten met post-infektueuze CVS en gezonde controles. Niettegenstaande deze verschillen in gen-signaturen een rationele verklaring voor de symptomen kunnen bieden, en bevestigen dat CVS een echte en biologische ziekte is, impliceren gen micro-array resultaten niet dat CVS hoofdzakelijk een genetische aandoening is. Daarenboven bewijzen de research-data niet of differentieel tot expressie komende genen de voorbestemmende oorzaak of verder gevolg van CVS zijn. We geloven echter dat de hier voorgestelde gegevens een belangrijke eerste stap voorwaarts zijn naar het doel, nl. het identificeren van vermeende biomerkers om de klinische diagnose van CVS te ondersteunen. Bovendien bieden de geïdentificeerde (via genen met over-expressie) biologische mechanismen, een rationeel begrip en mogelijke verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van CVS – wat een potentieel invaliderende ziekte, op zoek naar een effektieve genezing, blijft.

CVS-genen met over-expressie bij verschillende micro-chip studies

-063-B tabel - Gene Signature for Post-Infectious CFS

mei 23, 2009

Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 2:00 pm
Tags: , , , ,

Het BMJ (British Medical Journal) dat gewoonlijk niet echt belangstelling heeft voor research aangaande een fysieke oorzaak voor M.E.(cvs) schreef op 21 augustus 2004 (bmj.bmjjournals.com) over onderstaand artikel: “Er komt steeds meer bewijs dat mensen met Chronische Vermoeidheid Syndroom een detekteerbare immunologische abnormaliteit zouden kunnen hebben. Ze melden dikwijls symptomen die verenigbaar zijn met een onderliggende virale ziekte, en verhoogde apoptose (geprogrammeerde cel-dood) bij neutrofielen (een type witte bloedcel) wordt gevonden bij patiënten met infektie. […]”

Op een opmerking als zou neutrofiel-apoptose te wijten zijn aan een primaire psychologische aandoening laten de auteurs van onderstaand artikel in het BMJ noteren dat er geen studies zijn die aantonen dat neutrofielen bij depressieve patiënten significant apoptotisch zouden zijn en dat deze een verhoogd TGF-β1 zouden vertonen. De CVS-patiënten in de studie waren overigens niet depressief, noch overdreven angstig. Kennedy et al. laten ook weten dat de CVS-patiënten in deze studie zelfs accurater zouden kunnen worden omschreven als lijdend aan Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) zoals gedefinieerd door Ramsay [Ramsay M.A. (1988). Myalgic Encephalomyelitis and post-viral fatigue states: The saga of Royal Free disease (2nd ed.). Hampshire, UK: Gower].

Neutrofielen of neutrofiele granulocyten zijn kort-levende witte bloedcellen die zowel in het bloed als weefsels voorkomen. Ze maken deel uit van de primaire immuun-respons die snel infekties onder controle probeert te krijgen. Neutrofielen fagocyteren (= ‘opeten’, d.w.z. opnemen en intracellulair doden) bakterieën en schimmels en zorgen ervoor dat deze vernietigd worden. Neutrofiele granulocyten hebben het vermogen zich te verplaatsen in ons lichaam naar de plaats van een infektie, kunnen micro-organismen binden aan receptor-eiwitten op hun buiten-membraan om deze dan in een afgesloten pakketje (fagosoom) binnen de cel op te nemen en ze te doden d.m.v. van toxische eiwitten en zuurstof-produkten. Dat deze ‘a-specifieke’ tak van de immunologische afweer heel belangrijk is, blijkt duidelijk uit de levensbedreigende infekties die optreden bij patiënten met ernstig tekort aan neutrofielen (neutropenie) of met stoornissen in de funktie van deze cellen.

Een cel kan op twee manieren sterven. Necrose is het proces waarbij een cel op een abrupte manier doodgaat. Hierbij wordt de inhoud van de cel, het cytoplasma, in het omringende weefsel vrijgelaten (zogenaamde ‘cel-lyse’ door membraan-schade). Dit aktiveert het immuunsysteem, waardoor er een ontstekingsreaktie kan ontstaan. Apoptose is een voor een cel meer georganiseerde manier van sterven. Dit wordt ‘geprogrammeerde cel-dood’ (soms ook ‘cel-zelfmoord’) genoemd omdat in elke cel de mechanismen aanwezig zijn die apoptose mogelijk maken. Als een cel signalen van zijn omgeving krijgt die de cel tot apoptose aanzetten of als de cel zoveel schade heeft opgelopen dat verder bestaan niet mogelijk is, wordt een intracellulair mechanisme geaktiveerd. Door het tot expressie komen van een specifieke set genen wordt de cel aangezet om dood te gaan. Dit mechanisme leidt uiteindelijk tot de aktivatie van eiwit-splitsende enzymen (proteasen), de zogenaamde caspasen (cysteine-aspartyl-proteasen). Deze en andere enzymen zetten de cel aan tot het afbreken van proteïnen maar ook van DNA in de celkern en het cytoplasma. Een cel die apoptose ondergaat, vertoont een aantal kenmerken. Er worden kleine bolletjes cytoplasma (apoptotische lichaampjes) met cel-inhoud (mitochondrieën en cel-organellen) afgesplitst. Het erfelijk materiaal (DNA) van apoptotische cellen wordt in stukken geknipt (ladder-vorming) door het enyme endogeen-endonuclease. Cellen die apoptose ondergaan verliezen hun oppervlakte-strukturen en de cel-cel verbindingen worden verbroken (ze krimpen). Ze vertonen ook negatief geladen fosfolipiden op hun cel-oppervlak. die door fagocyten (‘etende cellen’) herkend worden. Na herkenning verwijdert de fagocyt de apoptotische cel en recycleert de bouwstenen.

Voor de lezer die niet geïnteresseerd is in de technische uitleg: lees de benadrukte passages…

Journal of Clinical Pathology 57:891-893 (2004)

Increased neutrophil apoptosis in Chronic Fatigue Syndrome

G Kennedy, V Spence, C Underwood and JJF Belch

Vascular Diseases Research Unit, University Department of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee DD1 9SY, UK

SAMENVATTING

Achtergrond/Doelstellingen: Veel patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) hebben symptomen die consistent zijn met een onderliggende virale of toxische ziekte. Omdat gestegen neutrofiel apoptose voorkomt bij patiënten met infektie, onderzocht deze studie of dit fenomeen ook voorkomt bij patiënten met CVS.

Methoden: Apoptose werd bepaald bij patiënten met CVS samen met concentraties van het anti-inflammatoir cytokine, ‘transforming growth factor-β1’ (TGF-β1).

Resultaten: De 47 patiënten met CVS hadden hogere aantallen apoptotische neutrofielen, lagere aantallen levensvatbare neutrofielen, verhoogde annexine-V binding en verhoogde expressie van de ‘dood’-receptor, tumor necrose factor receptor-I op hun neutrofielen dan de 34 gezonde controles. Patiënten met CVS hadden ook verhoogde concentraties aktief TGF-β1 (p<0.005).

Besluiten: Deze bevindingen leveren nieuw bewijs dat patiënten met CVS een onderliggende detekteerbare abnormaliteit in hun immuun-cellen hebben.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening zonder gekende etiologie of pathofysiologie. Bij de zoektocht naar een diagnostische test, heeft gen-profielering research de heterogene aard van CVS bevestigd, wat de nood illustreert voor volgehouden klinische screening gebaseerd op de uitsluiting van andere ziekten, te samen met de aanwezigheid van specifieke symptomen. Enkele van deze symptomen suggereren een onderliggende virale of toxische ziekte geassocieerd met aanhoudende infektie en immuun-aktivatie. Er zijn verscheidene rapporten geweest van immunologische stoornissen en virale infekties bij de ziekte.

50-60% van de totale circulerende witte bloed-cellen zijn neutrofielen. Het zijn kort-levende, reaktieve cellen die fundamenteel zijn voor het funktioneren van een intact immuunsysteem. Minieme veranderingen qua werking van neutrofielen kunnen diepgaande immunologische consequenties hebben: amplificatie van de inflammatoire respons en produktie van cytokinen. Als onderdeel van het antwoord op inflammatie, worden geaccumuleerde neutrofielen verwijderd via apoptose, een proces waarbij ongewenste of beschadigde cellen worden geëlimineerd zonder hun toxische inhoud af te geven en de inflammatoire respons aan te wakkeren. Het is ook een proces geassocieerd met de release van anti-inflammatoire mediatoren; in het bijzonder de produktie van ‘transforming growth factor-beta-1’ (TGF-β1) [Fadok VA, Bratton DL, Konowal A et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit pro-inflammatory cytokine-production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2 and PAF. J Clin Invest 1998;101:890-8], wat reeds betrokken is gebleken bij de pathogenese van CVS.

Hoewel verhoogde neutrofiel-apoptose aanwezig is bij patiënten met infektie, zijn er geen meldingen geweest over de funktie van neutrofielen bij patiënten met CVS. Het doel van onze studie was elementen van neutrofiel-apoptose en TGF-β1 bij patiënten met CVS te vergelijken met een controle-groep gezonde individuen van dezelfde leeftijd en geslacht.

METHODEN

Zevenenveertig patiënten die na klinisch onderzoek voldeden aan de ‘Centres for Disease Control’ klassificatie voor CVS en 34 gezonde individuen van dezelfde leeftijd en geslacht namen vrijwillig deel aan de studie. Alle individuen gaven schriftelijk hun geïnformeerde toestemming en de het plaatselijk medisch-ethisch comité gaf toelating voor de studie.

Neutrofielen werden geïsoleerd uit bloed […]. Ze werden onmiddelijk geïncubeerd met annexine-V en/of propidium-jodide (PI). Blootstelling aan fosfatidylserine op de buitenste laag van het cytoplasmisch membraan is kenmerkend voor vroege apoptose en is verbonden met preferentiële binding van annexine-V. Cellen met een intact plasma-membraan stoten PI uit en deze eigenschap blijft gehandhaafd in die cellen die zich in de vroege stadia van apoptose bevinden. In tegenstelling hiermee hebben necrotische cellen hun membraan-integriteit verloren en kleuren ze met PI. Neutrofielen die positief waren voor annexine-V werden als vroeg-apoptotisch beschouwd, neutrofielen die positief waren voor annexine-V én PI werden laat-apoptotisch en/of necrotisch genoemd, en neutrofielen die positief waren voor geen van beide werden geklassificeerd als leefbare cellen.

[M.a.w. Annexine-V bindt specifiek met fosfatidylserine, een molekule aan de buitenkant van het celmembraan dat al vroeg in het apoptose-proces verschijnt; door annexine-V te labelen met een fluorescerende kleurstof kan met behulp van flow-cytometrie het percentage annexine-V-positieve – dus vroeg-apoptotische – cellen worden bepaald. PI bindt aan de celkern en dus aan laat apoptotische, permeabele cellen; zo kan een onderscheid worden gemaakt tussen vroeg en laat-apoptotische cellen: drie populaties cellen kunnen worden onderscheiden: levend (annexine V en PI), vroeg-apoptotisch (annexine V+, PI) en laat-apoptotisch (annexine V+ en PI+)]

Expressie van tumor necrose factor receptor 1 (TNFR-1) op het oppervlak van leucocyten werd gemeten op een tweede bloed-staal d.m.v. een fluorescent gelabeld antilichaam […].

Het overblijvende bloed-staal werd gebruikt om bloedplaatjes-arm plasma (PPP) te bereiden en geaktiveerd TGF-β1 werd gemeten in het PPP d.m.v. ‘enzyme linked immunosorbent assay’ [ELISA, een immunologische techniek]. TGF-β1 is aanwezig in de granulen van bloedplaatjes en wordt afgegeven na aktivatie van de bloedplaatjes; daarom zijn de waarden in het PPP representatief voor concentraties in de circulatie. [Grainger DJ, Mosedale DE, Metcalf JC. TGF-beta in blood: a complex problem. Cytokine Growth Factor Rev 2000;11:133-45]

Alle bloedstalen werden op hetzelfde tijdstip van de dag genomen en alle testen uitgevoerd bij dezelfde persoon. De data waren normaal verdeeld […].

RESULTATEN

Kleuring met annexine-V en PI toonde dat patiënten met CVS significant (p = 0.002) meer apoptotische en significant (p = 0.002) minder leefbare neutrofielen hadden dan gezonde controles. Er was een trend bij patiënten met CVS tot het hebben van later-apoptotische/ necrotische neutrofielen (p = 0.075).

De neutrofielen van patiënten vertoonden ook verhoogde annexine-V binding (p = 0.001; 37,4% vergeleken met 22,8% in de controle-group). De gemiddelde expressie van annexine-V in de controle-groep (22,8%) was gelijkaardig met die gemeld door anderen (12,3-35,0%). De relatief brede spreiding is een resultaat van de methodologische verschillen in verscheidene laboratoria; er is ‘good laboratory practice’ vereist om te verzekeren dat alle stalen identiek worden behandeld. De expressie van neutrofielen TNFR-1 was ook significant hoger in de patiënten-groep (p = 0.004).

Er waren significant grotere hoeveelheden geaktiveerd TGF-β1 in het PPP van patiënten met CVS dan bij de gematchte gezonde controle-individuen (p = 0.005).

BESPREKING

We hebben aangetoond dat er een groter deel apoptotische cellen is bij de neutrofielen van patiënten met CVS en dat deze cellen significant minder leefbaar zijn vergeleken met deze van gezonde indviduen. Dezelfde neutrofielen brachten meer TNFR-1 ‘dood’-receptor molekulen tot expressie en vertoonden meer binding van annexine-V, wat wijst op fosfatidylserine-blootstelling.

[De TNF receptor (TNFR) super-familie is verdeeld in drie verschillende subgroepen: ‘dood’-receptoren, ‘afleider’-receptoren en aktiverende receptoren. De aktivatie van TNFR zorgt voor aktivatie van hun intracellulaire signalen door een aantal adaptor-eiwitten, ‘TNF receptor-associated factors’ (TRAFs). In het kort: De TNFR en TNF super-families reguleren het leven en de dood van geaktiveerde cellen van het immuunsysteem.

Dood-receptoren zijn receptoren op het cel-oppervlak die apoptotische signalen geïnitieerd door specifieke liganden (o.a. TNF-α) doorgeven. Ze spelen een belangrijke rol bij apoptose en kunnen de caspase-cascade zeer snel aktiveren.

TNF wordt aangemaakt door T-cellen en geaktiveerde macrofagen in respons op een infektie. Door zijn receptor TNFR-1 te aktiveren, kan TNF meerdere effekten uitoefenen. In sommige cellen zorgt dit voor aktivatie van NF-κB en AP-1 (zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB) wat leidt tot de inductie van een brede waaier aan genen. Soms kan TNF ook apoptose induceren – naast het mediëren van inflammatie en immuniteit. Binding van TNF-α aan TNFR-1 resulteert in receptor-trimerisatie en clusteren van intracellulaire ‘dood’-domeinen.

Het ‘death domain’ (DD) ontleent zijn naam aan het feit dat het betrokken is bij signalisering-processen die uiteindelijk leiden tot geprogrammeerde cel-dood via apoptose. Dit ‘dood-domein’ is een gebied binnen bepaalde proteïnen (o.a. TNFR) waardoor ze met zichzelf of met andere kunnen associëren.]

Apoptose wordt getriggerd door signalen die worden op gang gebracht door externe stimuli én interne sensoren. Het mechanisme gemedieerd door de ‘dood’-receptor, ook bekend als het extrinsieke mechansime, begint met de binding van liganden uit de TNF-familie op de ‘dood’-receptor TNFR-1. Dit resulteert in de recrutering van een adaptor-proteïne: ‘TNFR geassocieerd dood-domein’, dat op zijn beurt een andere adaptor-molekule recruteert: ‘Fas-geassocieerd dood-domain’. Dit recruteert dan pro-caspase 8 of pro-caspase 10 om een ‘dood’-inducerend signaal-complex te vormen. Tijdens de vorming van dit signaal-complex, worden pro-caspase vormen gesplitst en omgezet, zodat geaktiveerd caspase 8 of caspase 10 wordt afgegeven, die direct andere pro-caspasen converteren naar hun aktieve vormen, waardoor apoptose in werking wordt gesteld. Er is echter communicatie tussen de extrinsieke en intrinsieke (mitochondrieën-afhankelijke) mechanismen, en splitsing van het pro-apoptotisch proteïne ‘Bid’, door caspase 8, kan gebeuren. Deze splitsing kan resulteren in de release van cytochroom-C [eiwit in de respiratoire keten van cellen, voorafgaand aan apoptose begint het te lekken uit de mitochondrieën; eens dat lekken goed op gang komt, is de cel ten dode opgeschreven: cytochroom-C aktiveert in de celvloeistof proteasen die de grootschalige eiwitafbraak op gang brengen] en het triggeren van verdere apoptotische mechanismen. In onze studie hebben we getoond dat de neutrofielen van patiënten met CVS verhoogde expressie van TNFR-1 vertonen en we kunnen enkel veronderstellen dat de versnelde apoptose van deze cellen een gevolg is van extrinsieke factoren die apoptotische mechansimen beïnvloeden.

Daarnaast vonden we dat de concentraties aan geaktiveerd TGF-β1 significant waren verhoogd in het PPP van patiënten met CVS. Een stijging van geaktiveerd TGF-β1 samen met neutrofiel-apoptose is een belangrijk proces bij de downregulering van cytokinen en produktie van eicosanoïden [zie o.a. ‘Chronische microglia aktivatie na overmatige immuun-stimulatie] tijdens het chronisch inflammatoir proces. TGF-β1 is ook cruciaal bij het apoptotisch proces omdat het leukocyten-adhesie en trans-migratie [cytokines, vrijgelaten door geaktiveerde macrofagen, induceren adhesie-molekulen op de wanden van vasculaire endotheelcellen waardoor neutrofielen, monocyten en lymfocyten aangetrokken worden voor ze uit het bloedvat treden, via een proces dat extravasatie genoemd wordt, naar het aangedane weefsel] intoomt [Smith WB, Noack L, Khew-Goodall Y et al. Transforming growth factor-beta 1 inhibits the production of IL-8 and the transmigration of neutrophils through activated endothelium. J Immunol 1996;157:360-8] en deze stoornis van het transmigratie-proces van neutrofielen kan onafhankelijk apoptose bevorderen. Neutrofielen die transmigreren door het endothelium verliezen TNF-receptoren en dit verlies aan receptor-densiteit is nodig voor het overleven van de neutrofielen.

[Onder de TGF (‘transforming growth factor’) familie valt een aantal polypeptiden die een rol spelen bij het reguleren van de groei en differentiatie van cellen. De veelvuldig onderzochte TGF-β met zijn drie isotopen TGF-β1, TGF-β2 en TGF-β3 heeft een funktie in het aanzetten van cellen tot groei en differentiatie voor vele weefsels in het lichaam. Bovendien heeft het daarnaast nog meer fuknkies, waaronder voor sommige celtypes zelfs ook remming van groei en differentiatie, bijvoorbeeld bij B-lymfocyten.. TGF-beta-1 is een cytokine dat in het CZS in verhoogde concentraties aanwezig is bij inflammatie en een belangrijke rol speelt bij de vorming van astrogliose (zie: ‘Gliale Cellen, Astrocyten en M.E.’); daarnaast is het ook betrokken bij apoptose en immunosuppressie.]

Het feit dat neutrofielen van patiënten met CVS verhoogde oppervlakte-expressie van TNFR-1 vertonen is een bijkomende indicatie dat die cellen meer vatbaar zijn voor apoptose.

De neutrofielen van patiënten met CVS vertonen meer apoptose en dit kan het aangeboren immuunsysteem van deze patiënten beïnvloeden, gezien het feit dat neutrofielen de belangrijkste effector-cellen van dit systeem zijn. De controle van apoptose is ingewikkeld en de stijging van apoptose bij patiënten met CVS kan een gevolg zijn van meerdere factoren. Versnelde apoptose wijst op een persistente of reaktiverende virale infektie of een toxische toesatnd, herprogrammering van apoptotische mechanismen door een infektueus of toxisch agens of snellere neutrofiel-turnover, secundair aan een abnormale gastheer-respons op schadelijke stimuli.

Met de komst van gen-profielering is de zoektocht naar causatieve agentia bij CVS van start gegaan. De gegevens die hier worden gepresenteerd zijn consistent met het feitt dat vele patiënten met CVS een onderliggende, detekteerbare abnormaliteit in het gedrag van hun immuun-cellen hebben, overeenkomend met een geaktiveerd inflammatoir proces.

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.