Genen-studies bij CVS door het CDC

In hun artikel ‘Is Chronic Fatigue Syndrome (CFS/M.E.) heritable in children, and if so why does it matter?’ in het tijdschrift ‘Archives of Disease in Childhood’ (Dec 2007;92(12):1058-61) besloten Esther Crawley en George Davey Smith dat er meer en meer sterk bewijsmateriaal wordt gevonden voor het feit dat M.E.(cvs) erfelijk is. Dit heeft echter nog niet geleid tot het aanwijzen van specifieke genen (en biologische processen) betrokken bij de ziekte; laat staan tot een merker (en dus betere diagnose) of een behandeling.

Er is wel degelijk een rol voor genen (te samen met omgevingsfactoren). Eén van de grootste moeilijkheden bij het bestuderen van de aandoening blijft echter dat het heterogene groep betreft. Naast een duidelijk definitie (en merker) is er nood aan genetische studies bij grote groepen.

Ondertussen werd daar een begin van gemaakt. Hieronder een inleidende samenvatting over rapporten op basis van een grote hoeveelheid gegevens verzameld door het CDC en verwerkt door specialisten uit allerhande vakgebieden… Deze werden gebundeld in het april-nummer (vol 7, #3) 2006 van het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’. Voor meer over de hieruitvolgende studies: neem contact.

(Geïnspireerd door Cort Johnson…)

De Genen-studies bij CVS door het CDC, gepubliceerd in ‘Pharmacogenomics’

Inleiding

S. Vernon S. en W. Reeves; 2006. De uitdaging van het integreren van een grote hoeveelheid uiteenlopende gegevens: epidemiologische, klinische en laboratorium-data verzameld tijdens een ziekenhuis-studie over het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Pharmacogenomics. 2006 Apr;7(3):345-354

Dit artikel omvat een introduktie betreffende de inspanningen van het CDC om een model voor CVS te vervaardigen. Het werk resulteerde in de simultane publikatie van 14 research-artikels in het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’ in april 2006. Een grote set gegevens verzameld bij een 2-daags ziekenhuisverblijf van CVS-patiënten en controles in Wichita Kansas in 2003 (eerder aangehaald in het artikel over ‘Inflammatoire Immuun-signalisering’) werd door 20 researchers genalyseerd.

Vernon en Reeves, de twee leidinggevende onderzoekers die het werk superviseerden, poneren dat ‘complexe’ chronische ziekten (zoals o.a. CVS) veranderingen in de homeostatische mechanismen van het lichaam vertegenwoordigen die voortvloeien uit de combinatie van genen en omgevingsfactoren. [Dit betekent niet noodzakelijk dat CVS ‘tussen de oren zit’ en moet worden aangepakt met gedragstherapie.] De CDC stelt voor dat deze processen zo ingewikkeld zijn dat ze een multi-disciplinaire benadering vereisen om ze te bestuderen.

De benadering van het CDC bestond er in een vrij grote set gegevens te verzamelen bij CVS-patiënten en controles, die te onderwerpen aan een brede waaier van testen, inclusief gen-expressie onderzoek, en dan de data aan vier groepen onderzoekers te geven en hen te vragen modellen te leveren die zouden kunnen bijdragen tot de klassificatie, diagnose en behandeling van CVS.

Deelnemers

Gedurende meerdere jaren gebruikt het CDC een nieuwe (en eerder lastige) methode voor het recruteren van zijn deelnemers aan studies: genaamd ‘community sampling’ (staalname uit de gemeenschap). Dit is bedoeld om vooroordelen bij het recruteren te elimineren en te voorzien in niet-contesteerbare controle-groepen. ‘Community sampling’ houdt in: het willekeurig opbellen van grote aantallen mensen om zo een willekeurig gerecruteerde, representatieve set studie-deelnemers op te bouwen. In dit geval screende het CDC telefonisch eerst 56.151 mensen in Wichita, Kansas op CVS. Uit deze groep kwam een kern-groep van 7.162 mensen die verder werd geëvalueerd via de telefoon en in een kliniek. Na weglating van degenen met uitsluitende factoren (een andere ziekte, de meeste psychiatrische aandoeningen, idiopathische vermoeidheid) bleven slecht 70 mensen die echt CVS hadden over.

[Men zou zich kunnen afvragen waarom dit aantal zo klein is. In hun poging om een echt representatieve studie-groep te bekomen, zou het kunnen dat het CDC een set CVS-patiënten heeft verzameld die gewoonlijk niet wordt gezien in CVS-klinieken. Sommigen vinden dat een groot percentage van deze CVS-patiënten niet voldeden aan de CDC-criteria voor CVS. Het is mogelijk dat de CDC een populatie CVS-patiënten heeft ontdekt die, hoewel ze al of niet ziek zijn, toch in staat zijn, ten minste volgens de CDC-criteria, sneller de ziekte achter zich te laten dan de CVS-patiënten die hun weg vinden naar de klinieken en centra. Dit is waarschijnlijk geen onverwachte bevinding; de meeste chronische ziekten hebben een wisselende graad van invalidering, de meest ernstige worden natuurlijk echter meer gezien door artsen.]

Van de 70 mensen met CVS, gingen 58 (83%) akkoord om naar een ziekenhuis te komen voor een twee dagen durende test-periode. Ze werden gematcht met 55 controles van het zelfde geslacht, leeftijd, ras en body-mass-index; mensen die ook eerder werden gescreend. Het CDC nam ook 59 mensen op die vermoeid waren maar niet voldeden aan de criteria voor CVS in de studie op, alsook 41 mensen met depressie die wel voldeden aan de CVS-criteria, en 39 mensen met depressie en vermoeidheid maar zonder CVS. Merk op dat melancholische depressie wordt beschouwd als een exclusie-factor voor CVS. Deze personen met een psychiatrische aandoening (ten tijde van de ziekenhuis-studie) die CVS uitlsuit, werden aldus geïdentificeerd en in de studie data-set opgenomen om te kunnen vergelijken.

Aangezien deelnemers aan de studie waren geklassificeerd als CVS (individuen die voldeden aan alle drie de empirische criteria – op basis van de SF-36, MFI en ‘symptom-inventory’), ISF (‘onvoldoende symptomen of vermoeidheid’) of niet-vermoeid tijdens de surveillance tot 6 jaar voordien, en omdat CVS zich cyclisch manifesteert qua voorkomen en ernst van de symptomen, werd ziekte-status van de deelnemers geklassificeerd op het moment dat ze deelnamen aan de klinische studie (in het ziekenhuis). Deze huidige ziekte-klassificatie volgens empirische criteria werd opgenomen in de data-set en de onderzoeksteams konden kiezen of ze die al of niet gebruikten.

Klassificatie van de deelnemers via de definitie uit ‘94 tijdens de voorafgaande surveillance was dus niet steeds in overéénstemming met de empirische klassificatie bij de ziekenhuis-studie. Wellicht door het komen en gaan van de ziekte, naast de heterogene aard van de medisch onverklaarde vermoeidheid. Daardoor negeerden sommige teams de empirische klassificatie en stelden hun eigen op.

Qua fysieke karakteristieken van de groepen, zien we dat ongeveer 85% van de CVS-patiënten had overgewicht [BMI ≥ 25] had, 31% was obees [BMI ≥ 30] en 12% ziekelijk obees [BMI ≥ 35]. Hoe is dit in vergelijking met de obesitas-graad in de algemene bevolking? De percentages voor de controles bedroegen respectievelijk 36, 34 en 11. Volgens de website van het CDC is de prevalentie van obesitas 31-33% bij mannen en bij vrouwen 33-35%. Aangezien obesitas, en in bijzonderlijk ziekelijke obesitas op zichzelf een risico-factor voor veel problemen is zou deze factor alleen de resultaten kunnen hebben verstoord. Het CDC controleerde echter voor deze factor door het opnemen van een groep gezonde controles die even zwaar was. De leeftijd van de CVS-patiënten was ietsjes hoger (mediaan van de verschillende onderzoeksgroepen: rond 50). De populatie hier was bijna helemaal blank (94%) en ongeveer 82% van de ganse groep waren vrouwen (maar in sommige studies van de 4 onderzoeksgroepen werden de mannen niet opgenomen).

Testen

De testen waren vanzelfsprekend een heel belangrijk deel van de studie. Het zijn ten slotte deze gegevens die de onderzoekers gebruiken om hun modellen op te stellen. Uiteraard: hoe meer metingen, hoe beter – maar er zijn financiële grenzen; het CDC moest kiezen welke gegevens zij dachten het meest te zullen bijdragen tot het verbeteren van ons begrip van CVS.

Gedurende twee dagen ondergingen alle deelnemers het volgende:

Fysieke testen – temperatuur, lengte, gewicht en body-mass-index

Laboratorium-testen – complete bloed-cel telling (‘CBC’), C-reaktief proteïne, ALT, albumine, AP, AST, bilirubine, calcium, bicarbonaat, chloride, creatinine, glucose, kalium, total eiwit, natrium, ureum

HPA-as – speeksel-cortisol, androsteendion, SHBG, testosteron, ACTH, DHEA, DHEA-S, T3, reverse T3, T4, TSH, insulin-like growth factor, oestradiol en progesteron (bij vrouwen)

Cytokinen – TNF-α, IL-6, sR-IL-6

Catecholaminen – norepinefrine, epinefrine, normetanefrine [catecholamine-metabolieten], neuropeptide-Y

Mineralocorticoïden – renine, aldosteron

Autonoom Zenuwstelsel – bloeddruk, hartslag (neerliggend, rechtstaand)

Psychiatrische evaluatie

Medical Outcomes Survey Short Form (meting funktionele stoornissen)

Multi-dimensional Fatigue Inventory (vermoeidheid – algemeen, fysiek, mentaal, enz.)

CDC Symptom Inventory

Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (cognitieve testen voor korte-termijn geheugen, patroon-herkenning, reaktie-tijd, enz.)

Slaap-studie (twee nachten)

Perifereer bloed gen-expressie – 20.000 genen

Het CDC noemde dit “een uitgebreide lijst” van klinische, epidemiologische en laboratorium-gegevens. Als men echter de gen-expressie resultaten uitsluit, was dit niet echt de grootste set laboratorium-metingen ooit uitgevoerd bij een groep CVS-patiënten. Buchwald’s team aan de University of Washington onderzocht tijdens een intensieve tweelingen-studie (‘Chronic Fatigue Twin Registry’) prevalentie van pathogenen, immuun-factoren, ze deden beeldvorming van de hersenen en gesofisticeerde testen voor orthostase en aërobe funktie, alsook een slaap-studie. Deze studie van Buchwald leidde ook tot een grote hoeveelheid artikels maar de meeste van de bevindingen waren niet significant. De hier door het CDC uitgevoerde testen kom wel overéén met die van vele anders studies.

[Meten van de ‘allostatic load’ = verzamelen van informatie over fysiologische aktiviteit van meerdere belangrijke regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel, zowel als het cardiovasculair systeem, het immuunsysteem en metabole processen.]

Deze studie was echter ook uniek op meerdere manieren. Het is de eerste poging om gen-expressie data, en laboratorium- en klinische gegvens te integreren om een statistisch model voor CVS op te stellen. Dat moet uitputtend zijn geweest gezien de enorme hoeveelheden data die werden gegenereerd bij de gen-expressie studies. Sommige van deze studies zijn zo veel complexer dan wat ooit is geprobeerd.]

De laboratorium-gegevens omvatten een brede waaier aan neuro-endocriene factoren plus andere merkers waarvan wordt geloofd dat ze de allostatische status van de cardiovasculaire, immuun- en andere systemen in het lichaam weerspiegelen. C-reactief proteïne bv. wordt gebruikt om de inflammatoire toestand van het lichaam te bepalen in één van de studies. Terwijl de laboratorium-data betreffende neuro-endocriene factoren uitgebreid zijn; zijn de data aangaande het immuunsysteem en het cardiovasculair iets minder extensief. De immuun-gegevens bestaan grotendeels uit pro-inflammatoire cytokinen bekend om hun interaktie met het neuro-endocrien systeem. Sommige systemen werden helemaal niet onderzocht; er waren bv. geen metingen van de oxidatieve stress in deze studies.

Met uitzondering van de gen-expressie data zijn vele van deze gegevens niet echt nieuw. Vernon en Reeves noteerden dat studies bij CVS (inclusief de gen-expressie studies) over het algemeen enkel ‘subtiele’ verstoringen blootlegden die voorkomen in verschillende systemen, in het bijzonder het centraal zenuwstelsel, het immuunsysteem en het metabolisme. Gezien deze voorgeschiedenis verwachtte het CDC niet meer dan subtiele abnormaliteiten te vinden in hun laboratorium-gegevens. Ze hoopten echter dat een analyse van deze grote data-set verstoringspatronen zou aantonen die CVS-patiënten kunnen differentiëren van controles.

Het CDC lijkt hier te bevestigen dat het probleem bij CVS het resultaat is van meerdere stoornissen (genetische defekten * nature * en omgevingsgeïnduceerde dysfunkties * nurture *), sommige misschien subtiel, die samen leiden tot het ontstaan van de ziekte die bekend staat als CVS. Eén van de studies suggereert dat CVS kan voorkomen als een zekere graad aan allostatische belasting [term uit de psychosomatiek: opéénstapeling van ontregelde fysiologische regelsystemen waardoor de soepelheid van de adaptatie afneemt; een vorm van slijtage; ook: een slechte stress-reaktie, in plaats van je evenwicht te bewaren gaan de stresshormonen je psychisch en lichamelijk ondermijnen] wordt bereikt. De keuze van het CDC om te focussen op het neuro-endocriene systeem wijst er op dat ze geloven dat de interakties in dit grote en ingewikkelde systeem waarschijnlijk centraal liggen bij de ziekte. Dit systeem regulereert vele van de processen die voorkomen in het lichaam met inbegrip van die van het immuunsysteem. Het bestuderen van alle systemen blijft noodzakelijk. Elders werden ook al aanwijzingen gevonden voor perifere bijdragen bij de pathogenese van CVS.

Teams

Vier ploegen analyseerden de gegevens. De manier waarop ze waren samengesteld was nieuw: het eerste team omvatte experten op gebied van computer-wetenschap, fysica en statistiek, zowel als een immunoloog en een psychiater; team twee omvatte experten scheikundig ingenieur en bio-ingenieur, zowel een immunoloog, een patholoog en een molekulair bioloog; in team 3 zaten experten wiskunde en geïnformatiseerde chemie, zowel als een cardioloog en een infektie-specialist; en het vierde team bestond uit experten wiskunde en bio-informatica, zowel als een epidemioloog en een kinderarts.

Elk team pakte de gegevens verschilled aan. Team 1, dat vier artikels produceerde, hypothiseerde dat CVS heterogeen is qua nosologie en resulteert uit een ontregeling van meerdere genotype-fenotype relaties die interageren met omgevingsfactoren en zo verschillende aandoeningen opleveren. [Het genotype is een gedetailleerde beschrijving en/of klassificatie van de genetische informatie van een bepaald organisme die het heeft overgeërfd en is opgeslagen in het DNA van de genen, in tegenstelling tot het fenotype van dat organisme dat al zijn observeerbare eigenschappen – geërfd of verworven – omvat. Het onderscheid is belangrijk omdat het genotype en niet het fenotype wordt gereproduceerd, maar het is het fenotype en niet het genotype waarop natuurlijke selektie ingrijpt.] Ze stelden hun eigen klassen op (a.h.v. de klinische en epidemiologische gegevens) en probeerden die dan te matchen met gen-expressie en genetische profielen. Team 2, dat drie artikels schreef, reduceerde de complexiteit van de data met behoud van zoveel mogelijk, potentieel belangrijke, biologische informatie. Ze gebruikten de empirische klassificatie en deden een poging om de centrale factoren te vinden in klinische en gene-expressie data, en om gen-expressie signaturen van de fenotypes te identificeren. Team 3, dat twee artikels leverde, verkoos een alternatieve benadering voor de analyse (beginnend met de stelling dat de diagnostische begrenzingen voor CVS vrij willekeurig zijn). Ze gebruikten dus de vragen over symptomen om de waarde te bepalen van de huidige CVS-klassificatie. Team 4 onderzocht de fysiologsiche, genetische en genomische karakteristieken om de vier verschillende groepen (empirische klassificatie) te differentiëren volgens allostatische belasting.

Een Verschillende Benadering

Het CDC gelooft dat drie factoren kunnen verklaren waarom ons begrip van CVS zo traag is vooruitgegaan de voorbije 20 jaar. Ze citeren de 3.000 peer-reviewed artikels die gewoonlijk de revue passeren maar dit is misleidend in die zin dat slechts een kleiner aantal studies zijn die de biomedische kant van de CVS-pathofysiologie exploreren.

Ten eerste geloven ze dat patiënten-recrutering uit specialistische en verwijzingsklinieken resulteert in ‘recruteringsbias’. Ze denken dat niet enkel verschillende soorten patiënten naar CVS-klinieken worden getrokken maar dat elke kliniek een unieke set patiënten heeft. Dit zou er kunnen voor zorgen dat het vergelijken van resultaten tussen studies problematisch is. Ze stellen ook dat deze benadering, die de CVS-research heeft gedomineerd, “kritische vergelijking van resultaten uitsluit”, d.w.z. het onmogelijk maakt om resultaten van de ene met de andere research-groep kritisch te vergelijken. [Misschien toch iets té sterk uitgedrukt?!]

Ten tweede denken ze dat de controle-groepen die zo belangrijk zijn bij het studie-proces veelal onvolkomen zijn; ofwel zijn ze er gewoon niet of het gaat om ‘gemakshalve controles’. Gezonde controles vinden kan moeilijk zijn. Dikwijls gaat het om werknemers van een ziekenhuis of studenten. Deze studie identificeerde echter controles uit dezelfde algemene bevolking als de CVS-gevallen en deze controles waren gelijkaardig.

Ten derde geloofden ze dat het diagnose-proces bij CVS (m.a.w. de definitie) gebrekkig is.

[De meeste researchers zullen zeker met alle drie deze punten akkoord gaan maar de eerste twee zijn misschien ietsje te ongenuanceerd. Het zijn standaard-problemen bij vele research-onderzoeken. Het is echter mogelijk dat ze aangescherpt zijn bij CVS. Als CVS uit subsets bestaat, dan is het mogelijk dat bepaalde subsets geneigd zijn naar bepaalde klinieken te trekken. Patiënten met depressie zullen eerder terechtkomen in klinieken die geleid worden door psychologen, enz.]

Er lijkt een consensus te ontstaan dat het grootste probleem bij CVS-onderzoek de niet zo precieze definitie is, die de inclusie toelaat van subgroepen die uiteindelijk de onderzoeksresultaten vertroebelen. Eén van de doelstellingen van de benadering van het CDC was om de heterogeniteit te ‘vatten’ en aldus te voorzien in een beter klassificatie-schema voor CVS. Dit kan enkel worden gedaan door gebruik te maken van grote aantallen CVS-patiënten en grote data-sets. Men kan zich afvragen of het aantal CVS-patiënten hier, plus de 41 met depressie, een voldoende groot aantal is om dit te doen. Het CDC wierp een redelijk groot net; hun inclusie van patiënten met idiopathische vermoeidheid betekende dat ze een blik wierpen op de oorzaken van vermoeidheid in het algemeen. Het opnemen van CVS-patiënten met majeure depressie – een subset van patiënten die dikwijls wordt uitgesloten bij research-studies – breidde hun staal verder uit. Men zou kunnen argumenteren dat een grotere groep van enkel CVS-patiënten hen beter zou hebben geholpen bij het vinden van meetbare subgroepen. Vreemd genoeg echter, lijkt het CDC in dit opzicht te zijn gehandicapeerd door hun staalname-protocol.

Ze mogen echter wel stellen dat een ingewikkelde ziekte zoals CVS, met stoornissen in meerdere complexe homeostase-systemen, niet het resultaat is van één enkele mutatie of omgevingsfactor; maar van een gecombineerde aktie van meerdere genen, milieu-factoren en de repons van de patient hierop. De gepubliceerde artikels tonen ook de heterogeniteit van de ziekte. Er is op dit moment niet één knop, één software-programma of één onderzoeker die de verscheidenheid kan integreren en interpreteren om inzicht te scheppen in alle complexe biologische systemen. De artikels tonen wel aan dat met samenwerking en multidisciplinaire inspanning nieuwe perspektieven kunnen worden gevonden.

Besluit

De conclusie is fascinerend. Er wordt gesteld dat de integratie van metingen voor verschillende lichaamssystemen en klinische kenmerken ons zal toelaten de subgroepen aanwezig bij CVS en de verstoorde fysiologische mechanismen te identificeren; dat het zal aantonen dat CVS (en andere ziekten met invaliderende vermoeidheid) medisch kunnen worden verklaard. Het CDC gelooft dat algorithmen (complexe formules) die multi-systemische gegevens integreren een objectieve diagnostische merker zal opleveren, de pathofysiologie zal ontcijferen en aangepaste therapieën voor CVS-patiënten zal creëeren.

Gezien de toekomstige tijd werd gebruikt, is het duidelijk dat (nog) niets van het bovengenoemde werd bereikt via deze studies: ze identificeerden nu nog geen aantoonbare subsets, ze gaven geen medisch verklaring voor CVS en er werd geen diagnostische merker gevonden, enz. Vernon en Reeves geloven echter dat de resultaten er op wijzen dat ze op het juiste pad zitten en dat met verloop van tijd men daar wel in zal slagen. De huidige resultaten waren bevredigend genoeg om te besluiten over te gaan tot nieuwe studies om deze uit te breiden en te verifiëren.

Sommigen stellen de vraag of het CDC echt wel gelooft dat ze op de juiste weg zitten? Er staat nl. een merkwaardige disclaimer op het einde van elk van de Pharmacogenomics artikels. Dit werd eerder niet gezien bij Vernon’s andere gen-studies. Er staat: “De bevindingen en besluiten in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de opinies van het agentschap.”. Slaan Vernon en Reeves er hier een beetje een slag in? Betekent dit dat het agentschap niet zeker is van deze creatieve (en dure) nieuwe benadering van CVS? Of is het slechts een standaard clausule?…

*** Wordt vervolgd! ***

Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS

De pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis is nog steeds niet (volledig) gekend; waarschijnlijk spelen verschillende (erfelijke en omgevings-) factoren een rol.

Veel bewijsmateriaal ondersteunt de betrokkenheid van chronische immuun-aktivatie en andere immunologische dysfunkties. De tevens gevonden verhoogde oxidatieve stress is consistent met een chronische inflammatoire toestand. Verhoogde NK-cel aktiviteit, meer allergische en auto-immune beelden wijzen op een Th2-gericht cytokine-patroon. Genetische voorbestemdheid kan ook bijdragen tot de veranderingen in bv. cytokine-profielen.

In Australië is er de ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ waarbij researchers mensen volgen die na verloop van tijd infektueuze ziekten ontwikkelen om te proberen begrijpen waarom sommigen of onder hen niet herstellen maar een aandoening blijven hebben die voldoet aan de criteria voor het Chroniscshe Vermoeidheid Syndroom.

In een artikel uit 2006 in de British Medical Journal (Post-infective and Chronic Fatigue Syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens) rapporteerden Hickie et al. hier over. Ze hebben het percentage vergeleken van mensen die mononucleose (EBV-virus; klierkoorts), Q-fever (veroorzaakt door de intracellulaire bakterie Coxiella burnetii) en Ross River virus gehad hebben en die later voldeden aan de criteria voor CVS.

De auteurs vonden dat het percentage die CVS kregen na de drie infekueuze ziekten hetzelfde was (11% na 6 maand). Dit resultaat is zeer betekenisvol aangezien het suggereert dat de reden dat deze mensen CVS ontwikkelen niet geassocieerd is met een bepaald pathogen maar eerder met hoe hun respons als gastheer hierop wass. Citaat: “Onderzoek van uitkomsten na de drie acute infekties impliceert in hoge mate dat aspekten van de gastheer-respons op infektie (eerder dan het pathogen zelf) bepalend zijn voor een post-infektueus vermoeidheidssyndroom, aangezien het aantal gevallen na infektie met Epstein-Barr virus (een DNA-virus), Ross River virus (een RNA-virus) en Coxiella burnetii (een intracellulaire bakterie) vergelijkbaar waren en de symptoom-karakteristieken na verloop van tijd samenvielen.”. Interessant in dit ‘British Medical Journal artikel is overigens de melding dat psychologische factoren hier geen hoofdreden blijken te zijn voor de persistentie voor de vermoeidheid volgend op infektie.

M.E.(cvs) kan dus door een infektie worden getriggerd maar het zou eigenlijk niet uitmaken door welke. Na verloop van tijd verdwijnt de ‘schuldige’ dikwijls. Er zijn andere factoren bij de getroffene die de buitensporige, afwijkende (hierboven reeds vermelde) dysfunkties tot gevolg hebben. Een hypothese kan zijn dat de aanzet voor CVS wordt veroorzaakt door een combinatie van genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen waarmee deze mensen worden geboren en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren. Zoals bij zovele aandoeningen gaat het dus wellicht om ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren)…

Hoewel de aanzet kan zijn gegeven door (virale of andere) infektes (maar even goed door bv. een toxine) en bij sommige subgroepen sommige infektueuze agentia worden gerapporteerd, is nog steeds niet één enkel infektueus agens gevonden dat verantwoordelijk is voor M.E.(cvs) in het algemeen. Hieronder, een studie van het CDC die dit aantoont: er komen géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties (inidicatief voor bakterieën) voor bij CVS.

[Het bijzondere aan het gen coderend voor 16S rDNA is dat er veel verschillen zijn tussen micro-organismen onderling maar dat het ook juist zeer gelijk is op bepaalde stukken (geconserveerde regio’s). Van die constante gebieden wordt gebruik gemaakt bij het ontwerpen van een primer (startplaats) voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’). Door achteraf de sequentie (volgorde van de nucleotiden waaruit het DNA is opgebouwd) te bepalen, kan worden achterhaald welke prokaryote micro-organismen er aanwezig zijn.]

De ‘Dubbo studie’ vertelt ons overigens niet welke behandeling dient te worden ingesteld (enkel wat de karakteristieken zijn van de CVS-categorie met een post-infektueuze oorsprong). Zomaar aan alle M.E.(cvs)-patiënten antibiotica (tegen bakterieën) – maar ook antivirale middelen – toedienen lijkt niet aangewezen. De risico’s op (multi-)resistente bakterieën en de toxiciteit van sommige (antivirale) middelen nopen tot voorzichtigheid. Wat niet wil zeggen dat dit in specifieke gevallen (waarbij een pathogene infektie werd aangetoond – met internationaal aanvaarde methodieken en in gecertificeerde laboratoria!) wel nodig kan zijn. Het voorkomen van enterovirussen, HHV-n, enz. bewijst ook nog steeds geen oorzakelijk verband voor M.E.(cvs).

BMC Microbiology 2002, 2:39

Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of Chronic Fatigue Syndrome and non-fatigued subjects

Suzanne D Vernon^*1, Sanjay K Shukla², Jennifer Conradt², Elizabeth R Unger¹ and William C Reeves¹

1 Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

2 Clinical Research Centre, Marshfield Medical Research Foundation, 1000 North Oak Avenue, Marshfield WI 54449-5790, USA

Dit onderzoek werd deels ondersteund door financiering van het ‘National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention’ aan Sanjay K Shukla van de ‘Marshfield Medical Research Foundation’ [een gerenommeerd molekulair microbioloog en researcher op gebied van infectueuze ziekten].

Samenvatting

Achtergrond: Het associëren van een infektueus agens met het Chronische Vermoeidheid Syndroom is moeilijk en wordt verder bemoeilijkt door het ontbreken van een letsel of ziek weefsel. DNA uit cel-vrij plasma DNA zou kunnen dienen als een ‘schildwacht’ [aanwijzing] voor infektie en ziekte die plaatsgrijpt over het gans het lichaam. Dit type systemisch staal gekoppeld aan amplificatie van een brede waaier aan bakteriële sequenties werd gebruikt om te bepalen of een bakterieel pathogeen gerelateerd is met CVS. Plasma DNA van 34 CVS- en 55 niet-vermoeide individuen werd onderzocht om plasma DNA-concentratie en de aanwezigheid van bakteriële 16S ribosomaal DNA (rDNA) sequenties te bepalen.

Resultaten: DNA werd geïsoleerd bij 81 (91%) van 89 plasma-stalen. De 55 niet-vermoeide individuen hadden hogere plasma DNA-concentraties dan deze met CVS (gemiddeld 151 versus 91 ng) een meer CVS-individuen (6/34, 18%) hadden geen detekteerbaar plasma-DNA dan niet-vermoeide individuen (2/55, 4%) maar deze verschillen waren niet significant. Bacteriële sequenties werden gedekteerd bij 23 (26%) van 89. Bij slechts 4 (14%) CVS-individuen werden16S rDNA sequenties geamplificeerd uit het plasma vergeleken met 17 (32%) van de niet-vermoeiden (P = 0.03). Bij allle uitgezonderd 1 van de 23 16S rDNA amplicon-positieve individuen waren vijf of meer unieke sequenties aanwezig.

Besluiten: CVS-individuen hadden lichtjes lagere concentraties dan niet-vermoeide individuen of geen detekteerbaar plasma-DNA. Er tekende zich een brede waaier aan 16S rDNA sequenties af in plasma-DNA van én CVS én niet-vermoeide indivduen. Er waren géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties bij CVS of niet-vermoeide individuen.

Achtergrond

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een complexe ziekte gedefinieerd door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en een combinatie van niet-specifieke symptomen. Er zijn geen consistente anatomische letsels of klinisch-chemische abnormaliteiten. Hoewel geen bekende infektueuze agentia of immunologische verstoringen op een consistente manier werden geassocieerd met CVS, heeft de ziekte veel kenmerken die suggestief zijn voor een infektueuze ziekte. Vermoeidheid, spier- en gewrichtspijn, pijnlijke keel en gezwollen klieren zijn allen gebruikelijke symptomen die worden gedeeld met infektie en CVS. Daarenboven beschrijven veel mensen met CVS de aanvang van hun ziekte als plots of ‘griep-achtig’, een mogelijke infektueuze etiologie suggererend. Nochtans is de identifikatie van een infektueus agens dat specifiek is geassocieerd met CVS niet mogelijk gebleken via conventionele laboratorium-analyse. Uitgebreide sero-epidemiologische onderzoeken gericht op de detektie van antilichaam-responsen op talrijke gekende virale, bakteriële en rickettsiale agentia hebben geen verschillen tussen CVS-gevallen en normale controles kunnen aantonen [Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, Gary HE Jr, Stewart JA, Reyes M, Steele L, Schmid DS and Reeves WC. Sero-epidemiology of Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Clin Infect Dis 1995, 21:1386-1389. — Buchwald D, Ashley RL, Pearlman T, Kith P and Komaroff A. Viral serologies in patients with chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J Med Virol 1996, 50:25-30].

Zoeken naar gekende of nieuwe infektueuze agentia bij personen met CVS is ingewikkeld door het ontbreken van een gekend letsel of ziek weefsel om te onderzoeken. Recent werd aangetoond dat circulerend cel-vrij DNA uit plasma en serum sequenties van tumorale, virale en bakteriële oorsprong bevat. Dit plasma-DNA dient daarom als een ‘schildwacht’ voor verborgen ziekte voorkomend op diverse plaatsen in het lichaam. We gebruikten dit plasma-DNA om te zoeken naar voordien ongekarakteriseerde zowel als naar gekende bakteriële pathogenen. Om dit te doen, gebruikten we PCR voor bakteriële 16S ribosomaal RNA genen (rRNA) [15]. Dit breed amplificatie-schema is succesvol bij het detekteren en karakteriseren van bakteriële pathogenen bij verscheidene ziekten en bij meerdere types klinische stalen.

We bepaalden het gehalte circulerend plasma-DNA bij CVS-individuen als een mogelijke aanwijzing voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie. We amplificeerden en sequenceten ook het 16S rRNA gen om te zoeken naar gekende en eerder ongekarakteriseerde bakteriële agentia in cel-vrij circulerend DNA om te bepalen of een bakterieel pathogen was geassocieerd met CVS.

Indviduen en methoden

Gevallen en controle-individuen

Als onderdeel van een longitudinale populatie-studie naar CVS in Wichita, Kansas werden stalen perifeer bloed verzameld tijdens de klinische evaluatie van vermoeide individuen die mogelijks CVS zouden hebben en een willekeurige selektie niet-vermoeide individuen. Bij de personen die klinisch geëevalueerd werden, bleken 34 individuen te zijn die voldeden aan de CVS-definition uit 1994. Daarvan werden, alsook uit de 55 niet-vermoeide individuen, die met voldoende plasma geselekteerd voor analyse.

[…]

Polymerase ketting reaktie (PCR)

[…] Water-stalen genomen tijdens het plasma-DNA concentratie- en extraktie-proces werden als stalen meegenomen om ‘background’ bakteriële sequenties aanwezig in reagentia en toebehoren te identificeren. Twee sets 16S rDNA primers, 515F/RD1 en 515F/806R, werden gebruikt in afzonderlijke amplificaties. Deze primers leveren amplificatie-produkten van 1045 en 300 bp op. […]

16S rDNA sequetie-bepaling

[…]

Resultaten

[…]

Karakterisatie van plasma-DNA

De hoeveelheid cel-vrij DNA varieerde van 0 tot 1.320 ng per ml plasma (gemiddeld 128 ng DNA), waarbij 91% (81/89) detekteerbare waarden opleverden. CVS-individuen vertoonden een tendens voor verlaagd plasma-DNA in vergelijking met niet-vermoeide individuen (gemiddeld 91 versus 151 ng) maar dit verschil was niet significant. Zes (18%) van de 34 plasma-stalen van CVS-indivduen hadden geen detekteerbaar cel-vrij DNA, terwijl slechts 2 (4%) van de 55 niet-vermoeide individuen geen detekteerbaar cel-vrij DNA in hun plasma hadden (P = 0.08). Er werd ook geen verschil in plasma DNA-concentratie gevonden als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte.

Alle 89 stalen, of er nu plasma-DNA werd geïsoleerd of niet, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van bakteriële 16S rDNA sequenties. Alles te samen hadden 23 (26%) individuen 16S rDNA sequenties die werden geamplificeerd en gekarakteriseerd. Het gemiddeld aantal 16S rDNA sequenties bij de 23 individuen was 9 (range 3-14). De CVS-individuen hadden gemiddeld 11 16S rDNA sequenties en de niet-vermoeide individuen hadden gemiddeld 9 16S rDNA sequenties. Het plasma-DNA van 4 (14%) van de 28 CVS-individuen had 16S rDNA sequenties vergeleken met 17 (32%) van de 53 of niet-vermoeide individuen (P = 0.03). Er werden geen verschillen genoteerd qua detektie van bakteriële 16S rDNA sequenties als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte. Er was geen verband tussen de hoeveelheid plasma-DNA en de mogelijkheid om 16S rDNA sequenties te amplificeren. […] Sequenties werden gedetekteerd in stalen van CVS- en niet-vermoeide individuen met plasma DNA-concentraties die varieerden van 24 tot 294 ng/ml.

Van alle 16S rDNA geamplificeerde produkten werd de sequentie bepaald om de prokaryote oorsprong te identificeren. Elk van de sequenties was óf identiek óf zeer gelijkaardig (97% of meer) met prokaryote sequenties van de GenBank. Om te bepalen of een bijzondere bakteriële sequentie werd gevonden in CVS-gevallen versus niet vermoeide controles, werd een ‘cluster-analyse’ [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier DNA-patronen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uitgevoerd. Er waren geen 16S rDNA sequenties uniek of predominant bij de CVS- of de niet-vermoeide groep, zoals aangetoond door de willekeurige verdeling en het gebrek aan clustering bij de CVS- of niet-vermoeide individuen. Er was ook geen aanwijzing dat bakterieën die bekend staan langdurige vermoeiende ziekten (e.g. Coxiella sp. of Borellia sp.) te veroorzaken, meer prevalent waren bij CVS-individuen.

Bespreking

Aangezien er bij CVS geen gekende anatomische letsels kunnen worden aangeduid, besloten we cel-vrij plasma-DNA als een systemische aanwijzing voor de ziekte te onderzoeken. Plasma-DNA werd geïsoleerd uit de meeste van de CVS- en niet-vermoeide individuen. We detekteerden een hogere concentratie plasma-DNA bij de niet-vermoeide individuen dan bij de CVS-individuen en er waren minder niet-vermoeide individuen die plasma-DNA negatief waren dan CVS-individuen (de verschillen waren echter niet significant). De fysiologische betekenis en de bron van cel-vrij DNA in het plasma worden niet ten volle geapprecieerd maar we vermoeden dat het kan resulteren uit cellulaire degradatie. Tot op heden wordt plasma-DNA gebruikt als een relatief niet-invasieve manier om aan-de-gang-zijnde pathogene gebeurtenissen, zoals minimale residuele ziekte [symptoomloze rest-aanwezigheid van een aantal maligne tumorcellen tijdens of na een kanker-behandeling] of kanker te detekteren. Onze gegevens tonen geen significant verschil in de waarden van plasma cel-vrij DNA bij CVS- versus niet-vermoeide individuen, wat er op wijst dat er wellicht geen ongebruikelijke celulaire turn-over is bij de CVS-populatie. Het is ook mogelijk dat concentratie cel-vrij plasma-DNA geen gevoelige indicator is voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie.

Niettegenstaande een uitgebreide zoektocht naar gekende pathogenen d.m.v. conventionele laboratorium-methoden, werd geen uniek pathogeen op consistente wijze geïdentificeerd als een oorzaak voor CVS. Bijna elk gekend viraal en bakterieel agens dat vermoeiende ziekte kan veroorzaken werd getest bij CVS-individuen en er was geen verschil in de prevalentie van deze agentia tussen CVS- en gezonde individuen [Koelle DM, Barcy S, Huang ML, Ashley RL, Corey L, Zeh J, Ashton S and Buchwald D. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis 2002, 35:518-525]. Eén verklaring is dat het met CVS geassocieerde pathogen nieuw of eerder ongekarakteriseerd is. Om te zoeken naar prokaryote agentia die mogelijks specifiek geassocieerd zijn met CVS, gebruikten we PCR met consensus-primers [primer die meerdere gerelateerde stukken DNA kan amplificeren; handig voor het screenen van meerdere stammen: men heeft maar één primer-set nodig om een soort virus/bakterie/genenfamilie op te sporen] om de geconserveerde 16S rRNA subunit te detekteren en deze sequenties te karakteriseren. Van de 89 individuen werden bij 4 CVS- en 17 niet-vermoeide individuen 16S rDNA sequenties geamplificeerd. Dit verschil in de aan- of afwezigheid van 16S rDNA tussen CVS en niet-vermoeiden was niet gerelateerd aan verschillen in plasma-DNA concentraties. Er werden geen unieke of eerder niet-gekarakteriseerde prokaryote sequenties geïdentificeerd bij de CVS- noch bij de niet-vermoeide groep. Er werd eerder een diverse serie van gekende prokaryote sequenties gevonden circulerend in het plasma.

Niettegenstaande het onwaarschijnlijk is dat de hier gekarakteriseerde 16S rDNA sequenties te wijten zijn aan experimentele of omgevings-contaminatie, kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de gebruikte bloefafname-buisjes een bron waren van het gedetekteerde bakterieel DNA. Nochtans was dit onwaarschijnlijk aangezien alle plasma-stalen, of er nu DNA aanwezig was of niet, werden onderworpen aan amplificatie voor de 16S ribosomale subunit. Alle plasma-DNA negatieve stalen waren negatief voor het 16S rDNA amplificatie-produkt. Daarenboven waren water-controles die door het hele extraktie-proces werden meegnomen, consistent negatief. Ten slotte waren slechts 23 van de 89 plasma-stalen positief voor 16S rDNA sequenties. Als onze resultaten een weerspiegeling zijn van het voorkomen van 16S rDNA sequenties bij gezonde individuen, is het aanneembaar te stellen dat aanwezigheid, eerder dan afwezigheid, van deze sequenties de normale fysiologische toestand en symbiotische relatie tussen mensen en microben reflekteert. Dit is niet de eerste illustratie van de duidelijke symbiotische relatie die bestaat tussen mensen en bakterieën. Het onderzoek van bloed van gezonde personen via amplificatie van het 16S rRNA gen toonde talrijke bakteriële sequenties die niet werden gevonden bij reagentia-controles. Weber et al. hebben een aantal microbiële en virale transcripten uit humane cDNA verzamelingen geïdentificeerd via de computer-substrakie methode. Het is niet verrassend dat het menselijk lichaam een ‘microbieel observatorium’ wordt genoemd. Verder analyse van de microbiële flora die op verscheidene plaatsen in het lichaam bestaat bij gezonde en zieke personen zou ons begrip i.v.m. inter-relaties tussen microben en hun menselijke gastheren moeten bevorderen.

Het experimenteel ontwerp die bij studie werd gebruikt; heeft enkele beperkingen wat betreft het toetsen van onze hypothese dat een nieuw pathogen zou zijn geassocieerd met CVS. Plasma-DNA zou niet het ideale staal kunnen zijn voor het detekteren van prokaryote sequenties. Granulocyten-subsets zouden meer geschikt kunnen zijn aangezien deze perifeer bloed cel-fraktie neutrofielen en andere opruim-cellen bevat die belangrijk zijn bij het verwijderen van virussen en bakterieën. Deze perifeer bloed stalen zijn misschien niet op optimale wijze verzameld en verwerkt voor preservatie van DNA in plasma maar alle stalen van alle individuen werden wel op dezelfde manier verwerkt. De CVS-individuen waren, ten slotte, al jaren ziek en het agens dat de trigger voor hun ziekte was, werd misschien al lang opgeruimd.

Besluiten

DNA geïsoleerd uit het plasma kan worden gebruikt om de associatie van pathogenen met verborgen ziekte te onderzoeken. De CVS-individuen met plasma-DNA hadden lichtjes gedaalde concentraties vergeleken met de niet-vermoeide individuen en er waren meer CVS-individuen zonder detekteerbaar DNA in het plasma. Er was een brede waaier aan 16S rDNA sequenties in plasma-DNA van én CVS- én niet-vermoeide individuen. Verder onderzoek van 16S rDNA sequenties in perifeer bloed zal zich moeten toespitsen op de granulocyt-cellen.

‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS

Veelbelovend artikel waarin nogmaals inspanning, oxidatieve stress en mankementen in de respons hierop bij M.E.(cvs) worden gelinkt.

Met dank aan Dr Thambirajah voor de copie van het artikel.

————————-

Clin Invest Med. (2008) 31: E319-27

Verschil in ‘heat-shock’ proteïnen respons op inspanning in CVS

Anita A. Thambirajah BSc¹; Kenna Sleigh RN, MSN, PhD²; H. Grant Stiver MD, FRCPC³; Anthony W. Chow MD, FACP, FRCPC⁴

1 Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, Victoria, Canada

2 Department of Surgery, Division of Urology, Department of Urological Sciences at Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

3 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

4 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

Samenvatting

[zie bij ‘Oxidatieve Stress’]

Inleiding

De ‘heat-shock’ respons is een universeel en essentieel adaptief mechanisme dat cellen toelaat te reageren op een brede waaier van schadelijke condities. Onder normale fysiologische omstandigheden komen ‘heat-shock’ proteïnen [Hsp] tot constitutieve [continue expressie in alle cellen van een organisme – tegengesteld aan geïnduceerde expressie] expressie bij basale waarden en spelen centrale rollen bij proteïne-opvouwing en translokatie over membranen. Geïnduceerd onder stress (temperatuurswijzigingen, glucose-gebrek, oxidatieve stress, virus-infektie en andere pathologische omstandigheden), worden Hsp een cel-beschermende status toegewezen via talrijke cellulaire en metabole responsen.

Hsp worden onderverdeeld in verschillende families gebaseerd op hun molekulaire massa (kleine Hsp, Hsp60, Hsp70 en Hsp90). Kleine Hsp, zoals Hsp27, zijn belangrijk bij in microfilament-organisatie, cel-groei en differentiatie, en bij het beschermen van cellen tegen apoptose geïnduceerd door hyperthermie, inflammatoire cytokinen en oxidatieve stress. […] Hsp60 en Hsp70 zijn betrokken bij de oligomere samenstelling en transport van peptiden geassocieerd met de mitochondriale matrix. Daarenboven medieert Hsp70 ook cel-bescherming bij oxidatieve stress. Hsp90 is één van de meest overvloedige chaperonnes [klasse van proteïnen die het correct opvouwen van eiwitten vergemakkelijken door er op te binden en ze te stabiliseren] in de cytosol [‘vloeistof’ waarin alle cel-organellen zich bevinden en waarin de meeste metabole processen plaatsvinden] bij eukaryoten [cellen met een echte kern die het DNA bevat en door een membraan omlijnd is – tegengesteld aan prokaryoten (= bakterieën)] en speelt een kritieke rol bij het reguleren van cellulaire processen zoals hormoon-signalisering en controle van de cel-cyclus. Belangrijk is dat bij fysieke inspanning en uithoudingstraining bij gezonde atleten een verhoging van beschermende ‘heat-shock’ proteïnen en anti-oxidante enzymen in perifeer bloed leukocyten werd aangetoond. Aangezien fysieke inspanning bekend is om de symptomen van CVS te verergeren en metabole veranderingen, waaronder oxidatieve stress, te kunnen moduleren, is het bepalen van Hsp-expressie in elk van de vier Hsp-families voor en na inspanning bij CVS-patiënten van belang.

[…]

Bespreking

[…] Upregulering van Hsp-waarden kan een belangrijke adaptieve fysiologische respons zijn die een anti-oxidante en cel-beschermende rol speelt in skelet-spieren en andere weefsels na inspanning.[Koh TJ. Do small heat-shock proteins protect skeletal muscle from injury? Exerc Sport Sci Rev 2002;30:117-21] CVS-patiënten zijn minder in staat, vergeleken met gezonde controle-individuen, om oxidatieve stress, zoals tijdens een diepe inspanning, te beantwoorden. […]

Het belang van de bevindingen dient nog te worden bepaald. Niettemin suggereren ze een onderliggende maladaptatatie in respons op oxidatieve en andere vormen van stress bij patiënten met CVS. Hsp27 en andere kleine Hsp komen overmatig tot expressie bij oxidatieve stress en ‘heat-shock’ omstandigheden, waarbij grote oligomeren worden gevormd die de cellen beschermen tegen accumulerende geoxideerde eiwitten. [Arrigo AP. Hsp27: novel regulator of intracellular redox state. IUBMB Life 2001;52:303-7] Hsp27 dient ook om apoptose en de vernietiging van verscheidene anti-oxidante enzymen te voorkomen onder stress-omstandigheden. Bovendien verhoogt de upregulering van Hsp27 de aktiviteit van enzymen die intracellulaire redox-omstandigheden onderhouden (bv. glucose-6-fosfaat-dehydrogenase, glutathion-reductase en glutathion-transferase). Zodoende lijkt Hsp27 cellulaire anti-oxidante bescherming te bieden door het reduceren van het aantal ‘reactive oxygen species’ [ROS; vrije zuurstof radikalen] en door het wegnemen van de toxiciteit van geoxideerde proteïnen […]. Expressie van Hsp27 en andere kleine Hsp werd ook in verband gebracht met dalingen van intracellulaire ijzer-waarden die anders de vorming katalyseren van hydroxyl-radikalen en geoxideerde proteïnen genereren. Anderzijds werd aangetoond dat de constitutieve over-expressie van Hsp27 resulteert in een verhoogde vatbaarheid van cellen voor oxidatieve stress, wat suggereert dat een zorgvuldig evenwicht van Hsp27-expressie moet worden aangehouden.

Onze intrigerende bevindingen dat in PBMC de gehaltes aan Hsp27, Hsp60 en Hsp90 bij CVS-patiënten daalden na inspanning in tegenstelling tot sedentaire controle-indivduen van dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht suggereert een defekte adaptieve respons op oxidatieve stress bij CVS-patiënten. De hogere basale expressie van Hsp27 bij CVS-patiënten komt ook overeen met de notie dat cellen van CVS-patiënten meer vatbaar zijn voor oxidatieve stress. Tesamen genomen doen deze preliminaire observaties de mogelijkheid rijzen dat het CVS-patiënten ontbreekt aan een efficient adaptief of coping-mechanisme in respons op oxidatieve stress na inspanning. Dit wordt ondersteund door eerdere meldingen van verhoogde oxidatieve stress gekoppeld aan een verminderde anti-oxidante verdediging bij CVS-patiënten.

Onze exploratieve studie heeft verschillende beperkingen. Het aantal patiënten en controles in deze preliminaire studie was klein. Het inspanningsprotocol, hoewel gestandardiseerd en voor CVS-patiënten zwaar geacht, zou kunnen worden beschouwd als een onvoldoende grote stressor voor de controle-groep (zoals bewezen door de minimale veranderingen in hun Hsp-gehalten na inspanning. Nochtans werd dit inspanningsregime zo gekozen dat het kon worden beeïndigd door én de studie- én de controle-groepen – een meer rigoureus inspanningsregime zou door CVS-patiënten niet worden getolereerd. Niettemin werden, ondanks de mogelijkheid dat dit inspanningsregime een gepaste adaptieve respons op fysieke inspanningbij de controle-individuen zou kunnen hebben gemaskeerd, significante verschillen in Hsp-expressie tussen CVS-patiënten en controle-individuen vastgesteld. Western blot analyse is ook een vrij ongevoelige methode voor het detekteren van Hsp in PBMC. Intracellulaire of oppervlakte-kleuring voor Hsp gevolgd door FACS-analyse is wellicht een meer sensitieve of accurate benadering. De aanwezigheid van degradatie-produkten bij de Western blots zou ook een storende variabele kunnen zijn. Deze degradatie-produkten zou het resultaat kunnen zijn geweest van een langdurige stockage en herhaald invriezen en ontdooien van de stalen, aangezien geen protease-inhibitoren werden toegevoegd aan de lysaten tijdens het bewaren. Ten slotte, aangezien Hsp60 en Hsp70 allebei werden gelinkt aan inflammatoire processen, zou het interssant kunnen geweest zijn om de expressie-profielen van inflammatoire cytokinen in de PBMCs van deze patiënten te karakteriseren. Niettemin reveleerde onze studie, ondanks deze beperkingen, een consistente trend in Hsp expressie-profielen bij CVS-patiënten die verschilde van gezonde controles voor en na inspanning. Deze intrigerende bevindingen zijn ook consistent met de literatuur die abnormaliteiten suggereert in het energie-metabolisme en capaciteit om oxidatieve stress te verwerken bij CVS. Deze bevindingen verstrekken niet enkel bijkomende benaderingen voor het onderzoeken van de cellulaire en metabole adaptieve responsen bij CVS, maar kunnen ook een meer objectieve biologische merker bieden voor het identificeren van patiënten met deze ziekte.

Oxidatieve stress

Voor wie nog zou twijfelen aan het belang van oxidatieve stress bij M.E.(cvs): hierbij samenvattingen van (enkele van de vele) artikels over de jaren door verscheidene onderzoeksgroepen…

*************************

Life Sci (2001) 68: 2037-49

Anti-oxidant status and lipoprotein-peroxidation in CFS

Manuel y Keenoy B, Moorkens G, Vertommen J, De Leeuw I

University Hospital, University of Antwerp, Belgium

De etiologie en pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) blijven grotendeels onopgelost.

Begeleidende metabole aandoeningen zoals selektieve n-6 vetzuren depletie suggereert dat oxidatieve stress en meer specifiek lipiden-peroxidatie een rol zou kunnen spelen bij de pathogenese. [Oxidatieve stress is het resultaat van een onevenwicht tussen oxidante aanvallen te wijten aan de produktie van vrije radikalen en anti-oxidante verdediging.]

Om deze hypothese te onderzoeken, werd de oxidant/anti-oxidant status [TEAC (Trolox Equivalent Anti-oxidant Capacity), transferrine (ijzer-bindend proteïne) en ceruloplasmine (ijzer-oxiderend proteïne) – zorgen voor bescherming tegen ijzer-geïinduceerde lipiden-peroxidatie, vitamine-E en -A, glutathion (GSH) en glutathion-peroxidase; thiobarbituur-zuur reaktieve substanties (TBARS)] en de impact daarvan op lipoproteïnen-peroxidatie in vitro bestudeerd bij 61 patiënten met onverklaarde vermoeidheid die meer dan een maand duurde.

Ze werden onderverdeeld in 2 groepen: de groep CVS+ (33 individuen) voldeed aan de ‘Centre of Disease Control’ criteria (1988.) voor CVS en groep CVS- deed dat niet maar ze waren wel gelijkwaardig qua leeftijd, geslacht en klinische karakteristieken.

Anti-oxidant status was gelijkaardig voor de 2 groepen uitgezonderd voor het lager serum-transferrine bij CVS+ [serum-waarden van transferrine dalen dikwijls bij chronische inflammatie en trauma; oxidative stress kan ook mRNA voor transferrine doen dalen] (gemiddeld (95 % CI) 2.41 (2.28-2.54) versus 2.73 (2.54-2.92) g/l bij CVS-, p = 0.009) en de hogere lipoproteïnen-peroxidatie in vitro: 6630 (5949-7312) versus 5581 (4852-6310) nmol MDA/mg LDL en VLDL cholesterol x minuten, p = 0.035). CVS intensifieerde de invloed van LDL cholesterol (p = 0.012) en van transferrine (p = 0.045) op peroxidatie in vitro, wat bijkomende pro-oxidante effekten suggereert. [Voor vitamine-E was er ook een tendens naar lagere waarden bij CFS+ patiënten. Zie verder]

Deze resultaten wijzen er op dat patiënten met CVS een verhoogde vatbaarheid hebben qua koper-geïnduceerde lipiden-peroxidatie van LDL en VLDL en dat dit gerelateerd is met hun lagere serum-transferrine waarden en met andere ongeïdentificeerde pro-oxiderende effekten bij CVS.

[De auteurs melden nog dat de chronische inflammatoire status, die dikwijls wordt vastgesteld bij CVS, een mogelijke bron voor de oxidatieve stress is.]

*************************

Neurosci Lett. (2003) 335: 151-4

Relationship between musculoskeletal symptoms and blood-markers of oxidative stress in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Vecchiet J, Cipollone F, Falasca K, Mezzetti A, Pizzigallo E, Bucciarelli T, De Laurentis S, Affaitati G, De Cesare D, Giamberardino MA

Department of Medicine and Science of Aging, G. D’Annunzio University of Chieti, Italy

We onderzochten het oxidant/anti-oxidant evenwicht en zijn correlatie met spier-symptomen in 21 patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) versus 20 normale individuen. De patiënten vertoonden significante verschillen: lagere lag-fase, vitamine-E (Vit E) plasma-concentraties in plasma en lage-densiteit lipoproteïnen (LDL), meer LDL thiobarbituur-zuur reaktieve substanties (TBARS), meer vermoeidheid en lager spierpijn-drempels bij elektrische stimulatie. Er werd ook een significante direct lineaire correlatie gevonden tussen vermoeidheid en TBARS, drempels en lag-fase, drempels en vit-E in plasma en LDL. Een significante omgekeerd lineaire correlatie werd gevonden tussen vermoeidheid en lag-fase, vermoeidheid en Vit-E, drempels en TBARS. Verhoogde oxidatieve stress en verminderde anti-oxidant verdediging zijn verbonden met de symptomatologie bij CVS, suggererend dat anti-oxidant supplementen de spier-symptomen bij dit syndroom kunnen verlichten.

[Spectrofotometrische meting van TBARS verloopt in drie fasen: 1) the lag-time, waarbij de fluorescentie niet significant stijgt, geeft de capaciteit van de anti-oxidanten om lipoproteïnen-peroxidatie te vertragen aan; 2) de stijging bij de propagatie-fase, waarbij de fluorescentie snel toeneemt, geeft de snelheid van de oxidatieve veranderingen aan; 3) de verzadigingsfase, waarbij de fluorescentie een plateau bereikt, geeft de totale hoeveelheid geoxideerde lipiden aan.]

*************************

Free Radic Biol Med. (2005) 39: 584-9

Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms

Kennedy G, Spence VA, McLaren M, Hill A, Underwood C, Belch JJ

Vascular Diseases Research Unit, The Institute of Cardiovascular Research, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee, Scotland DD1 9SY, UK

De etiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is niet gekend; recent bewijsmateriaal suggereert echter dat een overmatige aanmaak van vrije radikalen (VR) betrokken kan zijn. Deze studie onderzocht voor de eerste keer 8-iso-prostaglandine-F(2alfa)-isoprostaan waarden samen met andere plasma-merkers voor oxidatieve stress bij CVS-patiënten en controle-individuen.

[Isoprostanen zijn stabiele produkten van arachidonzuur, gevormd op een niet-enzymatische, door vrije radikalen gekatalyseerde manier. Urinaire excretie van 8-iso-prostaglandine F2alfa, een isomeer van het PGG/H synthase (cyclooxygenase of COX) enzyme-produkt, prostaglandine F2alfa (PGF2alfa), bleek eerder beloftevol als een aanwijzing voor oxidatieve stress en lipiden-peroxidatie in vivo – hier werden ze in het plasma gemeten. Isoprostanen weerspiegelen niet alleen oxidatieve stress maar ze hebben ook krachtige biologische effekten geassocieerd met de peroxidatie van membraan-lipiden, verhoogde cel-permeabiliteit en een daaruit volgende verhoging van intracellulair calcium.]

Zevenenveertig patiënten (18 mannen, 29 vrouwen, gemiddelde leeftijd 48 [19-63] jaar) die voldeden aan de ‘Centres for Disease Control’ klassificatie voor CVS en 34 gezonde vrijwilligers (13 mannen, 21 vrouwen, gemiddelde leeftijd 46 [19-63] jaar) werden opgenomen in de studie. De CVS-patiënten werden ingedeeld in twee groepen: één groep had eerder gedefinieerde cardiovasculaire (CV) risico-factoren voor obesitas en hypertensie (groep 1) en de tweede hadden een normale bloeddruk en waren niet obees (groep 2).

Patiënten vertoonden significant verhoogde waarden aan isoprostanen (groep 1, P = 0.007; groep 2, P = 0.03, ongepaarde t-test vergeleken met controles) en geoxideerde lage-densiteit lipoproteïnen (groep 2, P = 0.02) wat wijst op een VR-aanval op de lipiden. CVS-patiënten hadden ook significant lagere hoge-densiteit lipoproteïnen (groep 1, P = 0.011; groep 2, P = 0.005). CVS-symptomen correleerden met isoprostaan-waarden maar enkel bij laag CV-risico CVS-patiënten van groep 2 (isoprostanen correleerden met de totale symptoom score P = 0.005, gewrichtspijn P = 0.002 en post-exertionele malaise P = 0.027, Pearson).

[De pro-oxidant status bleek een gevolg van de ziekte en geen secundair effekt van een CV-risico. De oxidatieve stress bij CVS is volgens dit onderzoek te wijten aan bovenmatige vorming van vrije radikalen en niet aan uitputting van de anti-oxidant reserves.

Ook te onthouden: ox-LDL, hier significant verhoogd, heeft ook het vermogen om genen geassocieerd met anti-oxidante responsen zoals de gen transcriptie-factor nuclear factor-kappa B (NF-κB) te stimuleren.]

Dit is de eerste keer dat gestegen waarden voor de ‘gouden standaard’ meting van in vivo oxidatieve stress (isoprostanen) en hun associatie met CVS-symptomen worden gerapporteerd.

*************************

Journal of Internal Medicine (2005) 257: 299-310

Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle-excitability in response to incremental exercise

Jammes Y, Steinberg JG, Mambrini O, Bregeon F, Delliaux S

From the Laboratoire de Physiopathologie Respiratoire (UPRES EA 2201), Faculté de Medecine, Institut Federatif de Recherche Jean Roche and Service des Explorations Fonctionnelles Respiratoires, Hopital Nord, Assistance Publique-Hopitaux de Marseille, Marseille, France

Omdat de spier-respons op toenemende inspanning niet goed is gedocumenteerd bij patiënten die lijden aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), combineerden we elektrofysiologische en biochemische (melkzuur-produktie, oxidatieve stress) metingen om vast te stellen of er spier-dysfunktie is in respons op een routine fiets-inspanning.

Deze ‘case-control’ studie vergeleek 15 CVS-patiënten met een controle-groep van gezonde individuen gematcht qua geslacht, leeftijd en gewicht (n = 11).

Alle individuen voerden een fietstest met toenemende inspanning tot uitputting uit.

We maten de zuurstof-opname (VO₂), hartslag (HR), systemische bloeddruk, percutane O₂-saturatie (SpO₂), M-wave [‘compound-evoked muscle action potentials’ – de geschikte zenuw wordt elektrisch gestimuleerd en de opgewekte respons kan worden gemeten; een niet-invasieve manier om perifere spier-vermoeidheid bij inspanning te meten] van de vastus lateralis [spier aan de voorzijde van het dijbeen, deel van de quadriceps] en namen veneus bloed af om zo de zuurtegraad (pHv), PO₂ (PvO₂), melkzuur (LA) en drie merkers voor oxidatieve stress (thiobarbituurzuur-reaktieve substanties – TBARS, gereduceerd glutathion – GSH en ascorbinezuur – RAA) te kunnen meten.

Bij CVS-patiënten verschilde (i) de relatie stijgingsgraad van VO₂ versus inspanningsvolume niet van controle-individuen en er was een tendens voor een aangescherpte PvO₂ daling bij dezelfde inspanningsintensteit, wat wijst op een verhoogde zuurstof-opname in de spieren bij inspanning; (ii) de HR- en bloeddruk-respons bij inspanning varieerde niet; (iii) de anaërobe mechanismen waren niet geaccentueerd; (iv) de door inspanning geïnduceerde oxidatieve stress was versterkt (vroege veranderingen in TBARS en RAA, en verhoogd maximaal RAA-verbruik); en (v) de M-wave duur was duidelijk gestegen tijdens de herstel-periode. [Hierbij werden geen wijzigingen in de neuromusculaire transmissie (geleidingstijd van spiervezels) gemeld maar er worden wel uitgesproken veranderingen van spier-prikkelbaarheid aangetoond vroeg na het beëindigen van de inspanning.]

Besluiten: De respons van CVS-patiënten op toenemende inspanning gaat gepaard met een verlengde en verhoogde oxidatieve stress samen met uitgesproken wijzigingen van de prikkelbaarheid van het spier-membraan. Deze twee objectieve tekenen van spier-dysfunktie volstaan om de spierpijn en post-exertionele malaise, gerapporteerd door onze patiënten, te verklaren.

*************************

Int J Cardiol. (2008) [ahead of print]

Increased oxidative stress suggested by low serum vitamin-E concentrations in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Kunihisa Miwa^a and Masatoshi Fujita^b

^aDepartment of Internal Medicine, Nanto Home and Regional Medical Centre, 577 Matsubara, Nanto, Toyama 939-1518, Japan

^bHuman Health Sciences, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan

Serum alfa-tocoferol [vitamine-E; een belangrijke endogene vet-oplosbare anti-oxidatieve substantie, verbruikt tijdens het lipiden-peroxidatie proces, zou – samen met het mineraal seleen – de oxidatie van cellen en celmembranen tegen gaan. De werking is niet precies bekend.] concentraties werden bepaald bij 50 patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en 40 controle-individuen (Controle).

Prevalentie van om het even welke coronaire risico-factor was niet significant verschillend tussen CVS en Controle. CVS-patiënten vertoonden significant lagere alfa-tocoferol concentraties dan controles. De concentraties waren significant lager bij de individuen met om het even welke coronaire risico-factoren dan deze zonder, bij CVS zowel als Controle. Zelfs onder de individuen met om het even welke coronaire risico-factoren en ook deze zonder, hadden CVS-patiënten significant lagere alfa-tocoferol concentraties dan controles.

Tot bersluit: CVS-patiënten hadden significant lagere alfa-tocoferol concentraties ongeacht coronaire risico-factoren dan controles, wat de aanwezigheid suggereert van verhoogde oxidatieve stress bij CVS. [Of verhoogde oxidatieve stress één van de oorzaken van CVS is of een gevolg blijft onbekend.]

*************************

Clin Invest Med. (2008) 31: E319-27

Differential heat shock protein responses to strenuous standardized exercise in Chronic Fatigue Syndrome patients and matched healthy controls

Anita A. Thambirajah BSc¹; Kenna Sleigh RN, MSN, PhD²; H. Grant Stiver MD, FRCPC³; Anthony W. Chow MD, FACP, FRCPC⁴

1 Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, Victoria, Canada

2 Department of Surgery, Division of Urology, Department of Urological Sciences at Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

3 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

4 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

Doel: Aangezien fysieke inspanning de symptomen van het Chronische Vermoeidheid Syndroom verergert en metabole veranderingen, inclusief oxidatieve stress, de expressie van heat-shock proteïnen (Hsp) kunnen moduleren, wilden we bepalen of Hsp-expressie is gewijzigd bij CVS-patiënten voor en na inspanning.

Methoden: Hsp27, Hsp60, Hsp70 en Hsp90 expressie van 6 CVS-patiënten en 7 controles (gematcht voor leeftijd en geslacht) werden onderzicht m.b.v. ‘western blot’ analyse van perifeer bloed mononucleaire cellen onmiddellijk voor, na en 1 dag en 7 dagen volgend op een gestandardiseerde loopband-inspanning.

Resultaten: Basaal Hsp27 was hoger bij CVS-patiënten dan bij controles (0.54 +/- 0.13 vs. 0.19 +/- 0.06, gemiddelde +/- SEM; P < 0.01). Verder waren deze waarden bij CVS-patiënten gedaald onmiddellijk na inspanning (0.25 +/- 0.09; P < 0.05) en bleven onder basale waarden 1 dag na inspanning (0.18 +/- 0.05; P < 0.05). P < 0.05). […] In tegenstelling hiermee bleven Hsp27-waarden relatief constant na inspanning bij controle-individuen. Gelijkaardige patronen van verminderende Hsp-waarden bij CVS-patiënten worden ook gezien voor Hsp60 (0.94 +/- 0.40 vs. 1.32 +/- 0.46; P < 0.05) en voor Hsp90 (0.34 +/- 0.09 vs. 0.49 +/- 0.10; P < 0.05) op dag 7 na inspanning vergeleken met basale waarden, respectievelijk. Contrasterend was dat Hsp60-waarden bij controle-individuen waren gedaald op dag 1 (1.09 +/- 0.27) en dag 7 (1.24 +/- 0.50) na inspanning vergeleken met corresponderende waarden onmiddellijk na inspanning (0.55 +/- 0.06) (P < 0.05, respectievelijk).

Besluit: Deze voorlopige bevindingen suggereren een abnormale of defekte adaptieve respons op oxidatieve stress bij CVS en de mogelijkheid rijzen dat Hsp-profilering kan voorzien in een meer objectieve biologische merker voor deze ziekte.

*************************

Wordt vervolgd…