M.E.(cvs)-wetenschap

januari 18, 2009

Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS

Filed under: Infektie — mewetenschap @ 8:03 am
Tags: , ,

De pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis is nog steeds niet (volledig) gekend; waarschijnlijk spelen verschillende (erfelijke en omgevings-) factoren een rol.

Veel bewijsmateriaal ondersteunt de betrokkenheid van chronische immuun-aktivatie en andere immunologische dysfunkties. De tevens gevonden verhoogde oxidatieve stress is consistent met een chronische inflammatoire toestand. Verhoogde NK-cel aktiviteit, meer allergische en auto-immune beelden wijzen op een Th2-gericht cytokine-patroon. Genetische voorbestemdheid kan ook bijdragen tot de veranderingen in bv. cytokine-profielen.

In Australië is er de ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ waarbij researchers mensen volgen die na verloop van tijd infektueuze ziekten ontwikkelen om te proberen begrijpen waarom sommigen of onder hen niet herstellen maar een aandoening blijven hebben die voldoet aan de criteria voor het Chroniscshe Vermoeidheid Syndroom.

In een artikel uit 2006 in de British Medical Journal (Post-infective and Chronic Fatigue Syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens) rapporteerden Hickie et al. hier over. Ze hebben het percentage vergeleken van mensen die mononucleose (EBV-virus; klierkoorts), Q-fever (veroorzaakt door de intracellulaire bakterie Coxiella burnetii) en Ross River virus gehad hebben en die later voldeden aan de criteria voor CVS.

De auteurs vonden dat het percentage die CVS kregen na de drie infekueuze ziekten hetzelfde was (11% na 6 maand). Dit resultaat is zeer betekenisvol aangezien het suggereert dat de reden dat deze mensen CVS ontwikkelen niet geassocieerd is met een bepaald pathogen maar eerder met hoe hun respons als gastheer hierop wass. Citaat: “Onderzoek van uitkomsten na de drie acute infekties impliceert in hoge mate dat aspekten van de gastheer-respons op infektie (eerder dan het pathogen zelf) bepalend zijn voor een post-infektueus vermoeidheidssyndroom, aangezien het aantal gevallen na infektie met Epstein-Barr virus (een DNA-virus), Ross River virus (een RNA-virus) en Coxiella burnetii (een intracellulaire bakterie) vergelijkbaar waren en de symptoom-karakteristieken na verloop van tijd samenvielen.”. Interessant in dit ‘British Medical Journal artikel is overigens de melding dat psychologische factoren hier geen hoofdreden blijken te zijn voor de persistentie voor de vermoeidheid volgend op infektie.

M.E.(cvs) kan dus door een infektie worden getriggerd maar het zou eigenlijk niet uitmaken door welke. Na verloop van tijd verdwijnt de ‘schuldige’ dikwijls. Er zijn andere factoren bij de getroffene die de buitensporige, afwijkende (hierboven reeds vermelde) dysfunkties tot gevolg hebben. Een hypothese kan zijn dat de aanzet voor CVS wordt veroorzaakt door een combinatie van genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen waarmee deze mensen worden geboren en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren. Zoals bij zovele aandoeningen gaat het dus wellicht om ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren)…

Hoewel de aanzet kan zijn gegeven door (virale of andere) infektes (maar even goed door bv. een toxine) en bij sommige subgroepen sommige infektueuze agentia worden gerapporteerd, is nog steeds niet één enkel infektueus agens gevonden dat verantwoordelijk is voor M.E.(cvs) in het algemeen. Hieronder, een studie van het CDC die dit aantoont: er komen géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties (inidicatief voor bakterieën) voor bij CVS.

[Het bijzondere aan het gen coderend voor 16S rDNA is dat er veel verschillen zijn tussen micro-organismen onderling maar dat het ook juist zeer gelijk is op bepaalde stukken (geconserveerde regio’s). Van die constante gebieden wordt gebruik gemaakt bij het ontwerpen van een primer (startplaats) voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’). Door achteraf de sequentie (volgorde van de nucleotiden waaruit het DNA is opgebouwd) te bepalen, kan worden achterhaald welke prokaryote micro-organismen er aanwezig zijn.]

De ‘Dubbo studie’ vertelt ons overigens niet welke behandeling dient te worden ingesteld (enkel wat de karakteristieken zijn van de CVS-categorie met een post-infektueuze oorsprong). Zomaar aan alle M.E.(cvs)-patiënten antibiotica (tegen bakterieën) – maar ook antivirale middelen – toedienen lijkt niet aangewezen. De risico’s op (multi-)resistente bakterieën en de toxiciteit van sommige (antivirale) middelen nopen tot voorzichtigheid. Wat niet wil zeggen dat dit in specifieke gevallen (waarbij een pathogene infektie werd aangetoond – met internationaal aanvaarde methodieken en in gecertificeerde laboratoria!) wel nodig kan zijn. Het voorkomen van enterovirussen, HHV-n, enz. bewijst ook nog steeds geen oorzakelijk verband voor M.E.(cvs).

BMC Microbiology 2002, 2:39

Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of Chronic Fatigue Syndrome and non-fatigued subjects

Suzanne D Vernon*1, Sanjay K Shukla2, Jennifer Conradt2, Elizabeth R Unger1 and William C Reeves1

1 Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

2 Clinical Research Centre, Marshfield Medical Research Foundation, 1000 North Oak Avenue, Marshfield WI 54449-5790, USA

Dit onderzoek werd deels ondersteund door financiering van het ‘National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention’ aan Sanjay K Shukla van de ‘Marshfield Medical Research Foundation’ [een gerenommeerd molekulair microbioloog en researcher op gebied van infectueuze ziekten].

Samenvatting

Achtergrond: Het associëren van een infektueus agens met het Chronische Vermoeidheid Syndroom is moeilijk en wordt verder bemoeilijkt door het ontbreken van een letsel of ziek weefsel. DNA uit cel-vrij plasma DNA zou kunnen dienen als een ‘schildwacht’ [aanwijzing] voor infektie en ziekte die plaatsgrijpt over het gans het lichaam. Dit type systemisch staal gekoppeld aan amplificatie van een brede waaier aan bakteriële sequenties werd gebruikt om te bepalen of een bakterieel pathogeen gerelateerd is met CVS. Plasma DNA van 34 CVS- en 55 niet-vermoeide individuen werd onderzocht om plasma DNA-concentratie en de aanwezigheid van bakteriële 16S ribosomaal DNA (rDNA) sequenties te bepalen.

Resultaten: DNA werd geïsoleerd bij 81 (91%) van 89 plasma-stalen. De 55 niet-vermoeide individuen hadden hogere plasma DNA-concentraties dan deze met CVS (gemiddeld 151 versus 91 ng) een meer CVS-individuen (6/34, 18%) hadden geen detekteerbaar plasma-DNA dan niet-vermoeide individuen (2/55, 4%) maar deze verschillen waren niet significant. Bacteriële sequenties werden gedekteerd bij 23 (26%) van 89. Bij slechts 4 (14%) CVS-individuen werden16S rDNA sequenties geamplificeerd uit het plasma vergeleken met 17 (32%) van de niet-vermoeiden (P = 0.03). Bij allle uitgezonderd 1 van de 23 16S rDNA amplicon-positieve individuen waren vijf of meer unieke sequenties aanwezig.

Besluiten: CVS-individuen hadden lichtjes lagere concentraties dan niet-vermoeide individuen of geen detekteerbaar plasma-DNA. Er tekende zich een brede waaier aan 16S rDNA sequenties af in plasma-DNA van én CVS én niet-vermoeide indivduen. Er waren géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties bij CVS of niet-vermoeide individuen.

Achtergrond

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een complexe ziekte gedefinieerd door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en een combinatie van niet-specifieke symptomen. Er zijn geen consistente anatomische letsels of klinisch-chemische abnormaliteiten. Hoewel geen bekende infektueuze agentia of immunologische verstoringen op een consistente manier werden geassocieerd met CVS, heeft de ziekte veel kenmerken die suggestief zijn voor een infektueuze ziekte. Vermoeidheid, spier- en gewrichtspijn, pijnlijke keel en gezwollen klieren zijn allen gebruikelijke symptomen die worden gedeeld met infektie en CVS. Daarenboven beschrijven veel mensen met CVS de aanvang van hun ziekte als plots of ‘griep-achtig’, een mogelijke infektueuze etiologie suggererend. Nochtans is de identifikatie van een infektueus agens dat specifiek is geassocieerd met CVS niet mogelijk gebleken via conventionele laboratorium-analyse. Uitgebreide sero-epidemiologische onderzoeken gericht op de detektie van antilichaam-responsen op talrijke gekende virale, bakteriële en rickettsiale agentia hebben geen verschillen tussen CVS-gevallen en normale controles kunnen aantonen [Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, Gary HE Jr, Stewart JA, Reyes M, Steele L, Schmid DS and Reeves WC. Sero-epidemiology of Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Clin Infect Dis 1995, 21:1386-1389. — Buchwald D, Ashley RL, Pearlman T, Kith P and Komaroff A. Viral serologies in patients with chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J Med Virol 1996, 50:25-30].

Zoeken naar gekende of nieuwe infektueuze agentia bij personen met CVS is ingewikkeld door het ontbreken van een gekend letsel of ziek weefsel om te onderzoeken. Recent werd aangetoond dat circulerend cel-vrij DNA uit plasma en serum sequenties van tumorale, virale en bakteriële oorsprong bevat. Dit plasma-DNA dient daarom als een ‘schildwacht’ voor verborgen ziekte voorkomend op diverse plaatsen in het lichaam. We gebruikten dit plasma-DNA om te zoeken naar voordien ongekarakteriseerde zowel als naar gekende bakteriële pathogenen. Om dit te doen, gebruikten we PCR voor bakteriële 16S ribosomaal RNA genen (rRNA) [15]. Dit breed amplificatie-schema is succesvol bij het detekteren en karakteriseren van bakteriële pathogenen bij verscheidene ziekten en bij meerdere types klinische stalen.

We bepaalden het gehalte circulerend plasma-DNA bij CVS-individuen als een mogelijke aanwijzing voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie. We amplificeerden en sequenceten ook het 16S rRNA gen om te zoeken naar gekende en eerder ongekarakteriseerde bakteriële agentia in cel-vrij circulerend DNA om te bepalen of een bakterieel pathogen was geassocieerd met CVS.

Indviduen en methoden

Gevallen en controle-individuen

Als onderdeel van een longitudinale populatie-studie naar CVS in Wichita, Kansas werden stalen perifeer bloed verzameld tijdens de klinische evaluatie van vermoeide individuen die mogelijks CVS zouden hebben en een willekeurige selektie niet-vermoeide individuen. Bij de personen die klinisch geëevalueerd werden, bleken 34 individuen te zijn die voldeden aan de CVS-definition uit 1994. Daarvan werden, alsook uit de 55 niet-vermoeide individuen, die met voldoende plasma geselekteerd voor analyse.

[…]

Polymerase ketting reaktie (PCR)

[…] Water-stalen genomen tijdens het plasma-DNA concentratie- en extraktie-proces werden als stalen meegenomen om ‘background’ bakteriële sequenties aanwezig in reagentia en toebehoren te identificeren. Twee sets 16S rDNA primers, 515F/RD1 en 515F/806R, werden gebruikt in afzonderlijke amplificaties. Deze primers leveren amplificatie-produkten van 1045 en 300 bp op. […]

16S rDNA sequetie-bepaling

[…]

Resultaten

[…]

Karakterisatie van plasma-DNA

De hoeveelheid cel-vrij DNA varieerde van 0 tot 1.320 ng per ml plasma (gemiddeld 128 ng DNA), waarbij 91% (81/89) detekteerbare waarden opleverden. CVS-individuen vertoonden een tendens voor verlaagd plasma-DNA in vergelijking met niet-vermoeide individuen (gemiddeld 91 versus 151 ng) maar dit verschil was niet significant. Zes (18%) van de 34 plasma-stalen van CVS-indivduen hadden geen detekteerbaar cel-vrij DNA, terwijl slechts 2 (4%) van de 55 niet-vermoeide individuen geen detekteerbaar cel-vrij DNA in hun plasma hadden (P = 0.08). Er werd ook geen verschil in plasma DNA-concentratie gevonden als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte.

Alle 89 stalen, of er nu plasma-DNA werd geïsoleerd of niet, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van bakteriële 16S rDNA sequenties. Alles te samen hadden 23 (26%) individuen 16S rDNA sequenties die werden geamplificeerd en gekarakteriseerd. Het gemiddeld aantal 16S rDNA sequenties bij de 23 individuen was 9 (range 3-14). De CVS-individuen hadden gemiddeld 11 16S rDNA sequenties en de niet-vermoeide individuen hadden gemiddeld 9 16S rDNA sequenties. Het plasma-DNA van 4 (14%) van de 28 CVS-individuen had 16S rDNA sequenties vergeleken met 17 (32%) van de 53 of niet-vermoeide individuen (P = 0.03). Er werden geen verschillen genoteerd qua detektie van bakteriële 16S rDNA sequenties als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte. Er was geen verband tussen de hoeveelheid plasma-DNA en de mogelijkheid om 16S rDNA sequenties te amplificeren. […] Sequenties werden gedetekteerd in stalen van CVS- en niet-vermoeide individuen met plasma DNA-concentraties die varieerden van 24 tot 294 ng/ml.

Van alle 16S rDNA geamplificeerde produkten werd de sequentie bepaald om de prokaryote oorsprong te identificeren. Elk van de sequenties was óf identiek óf zeer gelijkaardig (97% of meer) met prokaryote sequenties van de GenBank. Om te bepalen of een bijzondere bakteriële sequentie werd gevonden in CVS-gevallen versus niet vermoeide controles, werd een ‘cluster-analyse’ [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier DNA-patronen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uitgevoerd. Er waren geen 16S rDNA sequenties uniek of predominant bij de CVS- of de niet-vermoeide groep, zoals aangetoond door de willekeurige verdeling en het gebrek aan clustering bij de CVS- of niet-vermoeide individuen. Er was ook geen aanwijzing dat bakterieën die bekend staan langdurige vermoeiende ziekten (e.g. Coxiella sp. of Borellia sp.) te veroorzaken, meer prevalent waren bij CVS-individuen.

Bespreking

Aangezien er bij CVS geen gekende anatomische letsels kunnen worden aangeduid, besloten we cel-vrij plasma-DNA als een systemische aanwijzing voor de ziekte te onderzoeken. Plasma-DNA werd geïsoleerd uit de meeste van de CVS- en niet-vermoeide individuen. We detekteerden een hogere concentratie plasma-DNA bij de niet-vermoeide individuen dan bij de CVS-individuen en er waren minder niet-vermoeide individuen die plasma-DNA negatief waren dan CVS-individuen (de verschillen waren echter niet significant). De fysiologische betekenis en de bron van cel-vrij DNA in het plasma worden niet ten volle geapprecieerd maar we vermoeden dat het kan resulteren uit cellulaire degradatie. Tot op heden wordt plasma-DNA gebruikt als een relatief niet-invasieve manier om aan-de-gang-zijnde pathogene gebeurtenissen, zoals minimale residuele ziekte [symptoomloze rest-aanwezigheid van een aantal maligne tumorcellen tijdens of na een kanker-behandeling] of kanker te detekteren. Onze gegevens tonen geen significant verschil in de waarden van plasma cel-vrij DNA bij CVS- versus niet-vermoeide individuen, wat er op wijst dat er wellicht geen ongebruikelijke celulaire turn-over is bij de CVS-populatie. Het is ook mogelijk dat concentratie cel-vrij plasma-DNA geen gevoelige indicator is voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie.

Niettegenstaande een uitgebreide zoektocht naar gekende pathogenen d.m.v. conventionele laboratorium-methoden, werd geen uniek pathogeen op consistente wijze geïdentificeerd als een oorzaak voor CVS. Bijna elk gekend viraal en bakterieel agens dat vermoeiende ziekte kan veroorzaken werd getest bij CVS-individuen en er was geen verschil in de prevalentie van deze agentia tussen CVS- en gezonde individuen [Koelle DM, Barcy S, Huang ML, Ashley RL, Corey L, Zeh J, Ashton S and Buchwald D. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis 2002, 35:518-525]. Eén verklaring is dat het met CVS geassocieerde pathogen nieuw of eerder ongekarakteriseerd is. Om te zoeken naar prokaryote agentia die mogelijks specifiek geassocieerd zijn met CVS, gebruikten we PCR met consensus-primers [primer die meerdere gerelateerde stukken DNA kan amplificeren; handig voor het screenen van meerdere stammen: men heeft maar één primer-set nodig om een soort virus/bakterie/genenfamilie op te sporen] om de geconserveerde 16S rRNA subunit te detekteren en deze sequenties te karakteriseren. Van de 89 individuen werden bij 4 CVS- en 17 niet-vermoeide individuen 16S rDNA sequenties geamplificeerd. Dit verschil in de aan- of afwezigheid van 16S rDNA tussen CVS en niet-vermoeiden was niet gerelateerd aan verschillen in plasma-DNA concentraties. Er werden geen unieke of eerder niet-gekarakteriseerde prokaryote sequenties geïdentificeerd bij de CVS- noch bij de niet-vermoeide groep. Er werd eerder een diverse serie van gekende prokaryote sequenties gevonden circulerend in het plasma.

Niettegenstaande het onwaarschijnlijk is dat de hier gekarakteriseerde 16S rDNA sequenties te wijten zijn aan experimentele of omgevings-contaminatie, kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de gebruikte bloefafname-buisjes een bron waren van het gedetekteerde bakterieel DNA. Nochtans was dit onwaarschijnlijk aangezien alle plasma-stalen, of er nu DNA aanwezig was of niet, werden onderworpen aan amplificatie voor de 16S ribosomale subunit. Alle plasma-DNA negatieve stalen waren negatief voor het 16S rDNA amplificatie-produkt. Daarenboven waren water-controles die door het hele extraktie-proces werden meegnomen, consistent negatief. Ten slotte waren slechts 23 van de 89 plasma-stalen positief voor 16S rDNA sequenties. Als onze resultaten een weerspiegeling zijn van het voorkomen van 16S rDNA sequenties bij gezonde individuen, is het aanneembaar te stellen dat aanwezigheid, eerder dan afwezigheid, van deze sequenties de normale fysiologische toestand en symbiotische relatie tussen mensen en microben reflekteert. Dit is niet de eerste illustratie van de duidelijke symbiotische relatie die bestaat tussen mensen en bakterieën. Het onderzoek van bloed van gezonde personen via amplificatie van het 16S rRNA gen toonde talrijke bakteriële sequenties die niet werden gevonden bij reagentia-controles. Weber et al. hebben een aantal microbiële en virale transcripten uit humane cDNA verzamelingen geïdentificeerd via de computer-substrakie methode. Het is niet verrassend dat het menselijk lichaam een ‘microbieel observatorium’ wordt genoemd. Verder analyse van de microbiële flora die op verscheidene plaatsen in het lichaam bestaat bij gezonde en zieke personen zou ons begrip i.v.m. inter-relaties tussen microben en hun menselijke gastheren moeten bevorderen.

Het experimenteel ontwerp die bij studie werd gebruikt; heeft enkele beperkingen wat betreft het toetsen van onze hypothese dat een nieuw pathogen zou zijn geassocieerd met CVS. Plasma-DNA zou niet het ideale staal kunnen zijn voor het detekteren van prokaryote sequenties. Granulocyten-subsets zouden meer geschikt kunnen zijn aangezien deze perifeer bloed cel-fraktie neutrofielen en andere opruim-cellen bevat die belangrijk zijn bij het verwijderen van virussen en bakterieën. Deze perifeer bloed stalen zijn misschien niet op optimale wijze verzameld en verwerkt voor preservatie van DNA in plasma maar alle stalen van alle individuen werden wel op dezelfde manier verwerkt. De CVS-individuen waren, ten slotte, al jaren ziek en het agens dat de trigger voor hun ziekte was, werd misschien al lang opgeruimd.

Besluiten

DNA geïsoleerd uit het plasma kan worden gebruikt om de associatie van pathogenen met verborgen ziekte te onderzoeken. De CVS-individuen met plasma-DNA hadden lichtjes gedaalde concentraties vergeleken met de niet-vermoeide individuen en er waren meer CVS-individuen zonder detekteerbaar DNA in het plasma. Er was een brede waaier aan 16S rDNA sequenties in plasma-DNA van én CVS- én niet-vermoeide individuen. Verder onderzoek van 16S rDNA sequenties in perifeer bloed zal zich moeten toespitsen op de granulocyt-cellen.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: