Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS

Voor een overzicht van ideëen en werk van de researh-groep van door Klimas, zie o.a. ‘CVS: inflammatie, immuun-funktie en neuro-endocriene interakties’. Zoek naar andere bijdragen aangaande cytokinen op deze paginas…

Op basis van het onderstaande claimen dat bepaalde cytokinen merkers voor M.E.(cvs) zijn is voorbarig. Zoals de auteurs zelf aangeven zijn de bevindingen niet noodzakelijk specifiek en is bevestiging door andere labs nodig.

Toch geeft deze studie wel degelijk aanwijzingen dat er iets mis is met het immuun-respons. Dus: ook beweren dat het immuunsysteem níet betrokken is, is een flagrante ontkenning van het bewijsmateriaal. Het veranderd cytokine-patroon wijst op immuun-aktivatie en inflammatie (wat niet hetzelfde betekent als ‘infektie’).

————————-

Journal of Translational Medicine 2009, 7:96

Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome

Mary Ann Fletcher^{* 1,2}, Xiao Rong Zeng^1,2, Zachary Barnes¹, Silvina Levis^1,2 and Nancy G Klimas^{* 1,2}

¹Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 1600 NW 10th Ave, Miami, FL USA

²Miami Veterans Health Care Centre, 1201 NW 16th St, Miami, FL USA

Achtergrond

[…] Veel van de symptomen [van CVS] zijn inflammatoir van aard (spier-pijn, gewricht-pijn, pijnlijke keel, gevoelige lymfe-klieren) en hebben een theorie over infektie-geïinduceerde ziekte aangemoedigd. Bij 60 à 80% van de gepubliceerde stalen kent CVS een acute aanvang, met systemische symptomen gelijkaardig aan influenza-infektie die niet verzwakken. Deze observaties hebben geleid tot rapporten over geassocieerde microbiële infekties of reaktivatie van latente virale infekties. Er is echter geen consensus wat betreft etiologie.

Er is een aanzienlijke hoeveelheid literatuur die immuun-dysfunktie bij CVS beschrijft. Verhoging van pro-inflammatoire cytokinen en bewijs voor T_H2 (T-helper cel-type 2) cytokine-aktivatie werden gemeld. Andere studies rapporteerden dat er geen verschillen waren tussen CVS en controles. De methodes varieerden echter sterk en weinig studies maten meer dan vier of vijf cytokinen. Gebrek aan sensitiviteit van de standaard ELISA [‘enzyme-linked immunosorbent assay’, een immunologische techniek om antilichamen of antigenen te meten] beperkte het gebruik van plasma voor de detektie van verschillen tussen gevallen en controles.

Ondanks bewijzen voor immunologische en molekulaire mediatoren, werd er geen individuele merker of combinatie of merkers gevonden die voldoende geassocieerd bleek met CVS om als een biomerker voor de diagnose of het management van CVS te gebruiken. Het doel van deze studie was te bepalen of, gebruikmakend van nieuwe technologie, plasma-cytokinen voldoende sensitiviteit en specificiteit hadden om CVS-gevallen te onderscheiden van gezonde controles gematcht voor leeftijd. Gebruikmakend van een multiplex bepaling werden 16 cytokinen (T_H1, T_H2, T_H17, pro-inflammatoir, anti-inflammatoir) vergeleken tussen gevallen en controles. Omwille van de sterke geslachtelijke bias bij CVS (80% vrouwen), werden enkel vrouwen opgenomen in de studie.

Methodes

Patiënten

Vrouwelijke CVS-patiënten (n = 40; gemiddelde leeftijd 50) […] diagnose gebruikmakend van de ‘International Case Definition’. Vrouwelijke gezonde controles (n = 59; gemiddelde leeftijd 53) […]. Alle CVS-individuen hadden een SF-36 fysieke score (PCS) onder het 50^e percentiel […]. Exclusie-criteria […] psychiatrische exclusies volgens de ‘International CFS Working Group’. Alle CVS-individuen werden bij recrutering beoordeeld voor psychiatrische diagnose mer de ‘Composite International Diagnostic Instrument’. […] De individuen hadden geen geschiedenis van hart-ziekte, COPD, kwaadaardigheid of andere systemische aandoeningen […].

Ethische kwesties

[…]

Bloed-afname

[…] Plasma werd afgescheiden binnen 2 uur na afname en bewaard bij -80°C.

Cytokine-bepaling

We maten 16 cytokinen in plasma met Quansys reagentia en instrument […] Het Q-Plex™ Human Cytokine – Screen (16-plex) is een kwantitatieve op ELISA gebaseerde test […]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

We clusterden de resultaten van de cytokine-testen in 5 groepen volgens de cytokine-literatuur. […]

Pro-inflammatoire cytokinen

Er werd een significante verhoging van de relatieve hoeveelheden van 4 uit 5 pro-inflammatoire cytokinen in perifeer bloed-plasma van patiënten met CVS gevonden, vergeleken met de controles. Enkel tumor necrose factor (TNF)α bleef onveranderd. Bij de gevallen was lymfotoxine (LT)α gestegen met 257% en IL-6 met 100% tegenover de controles.

T_H2-cytokinen

IL-4 én IL-5 waren verhoogd bij CVS (mediaan voor IL-4 240% en voor IL-5 95% hoger).

Anti-inflammatoire cytokinen

IL-13 was significant lager (15%) bij CVS-patiënten terwijl IL-10 niet verschilde.

T_H1-cytokinen

Mediane plasma-waarden voor IL-2 en IFNγ bij CVS waren gelijkaardig met die bij controles. IL-12 was echter significant gestegen (120%) en IL-15 gedaald (15%).

IL-8 (CXCL8)

Dit chemokine was 42% lager bij de CVS-patiënten.

T_H17-cytokinen

IL-17 en IL-23 waren niet significant verschillend bij CVS-gevallen vergeleken met controles.

ROC-curve analyses

[ROC  = ‘receiver operating characteristic’; ROC-curve; grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument]

‘Area under the curve’ (AUC) voor IL-5 (0. 84), LTα (0.77), IL-4 (0.77), IL-12 (0.76) wees op een goed biomerker-potentieel. […] AUC voor IL-6 (0.73), IL-15 (0.73), IL-8 (0.69), IL-13 (0.68) IL-1α (0.62), IL-1β (0.62) toonde redelijk potentieel als biomerkers.

Bespreking

Meerdere studies melden cytokine-abnormaliteiten bij CVS; de bevindingen zijn echter gemengd. Verschillen tussen rapporten kunnen grotendeels te wijten zijn aan verschillen qua methodologie. Hoeveelheden cytokinen in plasma of serum liggen dikwijls lager dan het detektie-niveau bij traditionele ELISA-testen. Naast test-sensitiviteit worden resultaten gebruikmakend van de directe benadering beïnvloed door de tijd tussen bloed-afname en afscheiding van het serum of plasma, de bewaar-temperatuur en het herhaald ontdooien/invriezen. In vitro stimulatie van totaal bloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) is een andere benadering om cytokinen te bestuderen. ELISA wordt dan gebruikt om cytokine-inhoud van supernatants [vloeistof die boven de cellen staat na centrifugatie] van cultuur-media te meten. Het is vanzelfsprekend dat resultaten afhangen van de cultuur-condities en de gebruikte stimulantia. Andere technieken omvatten ofwel ongestimuleerde of gestimuleerde PBMCs. Resultaten verkregen met deze methodologieën zijn niet direct vergelijkbaar.

De beschikbaarheid van sensitieve multiplex technologie liet de bepaling toe van 16 cytokinen tegelijkertijd op plasma-stalen van vrouwelijke CVS-patiënten en gezonde controles gematcht voor leeftijd en geslacht. Bij de CVS-gevallen vonden we een ongebruikelijk patroon qua cytokinen die de CD4 T-cel definiëren. IL-12 afgeleid van dendritische cellen [soort witte bloedcellen; antigeen-presenterende cellen die antigenen presenteren aan CD4 T-cellen en CD8 T-cellen, waarna deze prolifereren in volwassen, antigeen-specifieke T-cellen; ze spelen dus een rol bij de immuun-respons], het belangrijkste T_H1-inducerend cytokine leidend tot de aanmaak van IFNγ, IL-2 en TNFα, was gestegen. IFNγ, IL-2 en TNFwaren echter onveranderd in plasma bij CVS-gevallen in vergelijking met controles. Een ander cytokine afgeleid van dendritische cellen, IL-15, was gedaald. IL-2 en IL-15 zijn belangrijke participanten in CD8 T-cel en NK-cel aktivatie en funktie. Het feit dat ze de beta en gamma receptor-subunits gemeen hebben, resulteert in meerdere gemeenschappelijk funkties: bv. cytotoxiciteit. Aan de andere kant spelen ze, door hun verschillende alfa receptor-subunits, tegenovergestelde rollen bij immuun-processen zoals aktivatie-geïnduceerde cel-dood (IL-2) en immunologisch geheugen (IL-15). IL-23 (onveranderd bij gevallen t.o.v. controles) stimuleert de differentiatie en funktie van de T_H17-subset van CD4 T-cellen, een relatief nieuw beschreven immuun-verdediging. DeT_H17 CD4-cel produceert IL-17, beschermt oppervlakten (bv. huid, darmwand-bekleding) tegen bakterieën en speelt een kritieke rol bij chronische intestinale inflammatie. De ongewijzigde IL-17 en IL-23 waarden bij CVS opgetekend in deze studie zou een argument zijn tégen bakteriële gastro-intestinale infekties en tégen een belangrijke rol bij persisterende ziekte.

Samen met de T_H1-abnormaliteite vonden we upregulering van T_H2-geassocieerde cytokinen, IL-4 en IL-5 bij de CVS-individuen. Allergie is courant bij CVS-gevallen. Straus et al. rapporteerden >50% atopie [de aanleg om immunoglobuline (Ig)-E (antistoffen) aan te maken specifiek gericht tegen stoffen uit de omgeving] bij 24 CVS-patiënten. De verhoging van deze twee cytokinen impliceert een type 2 verschuiving – en verminderde stimulus voor cytotoxische lymfocyten funktie.

De waarschijnlijkheid van chronische inflammatie bij CVS wordt ondersteund door de verhoging van vier cytokinen van de pro-inflammatoire cascade, LTα, IL-1α, IL-1β en IL-6, in de CVS-stalen vergeleken met controles. De uitzondering was TNFα, hoewel de mediane waarde voor de gevallen 14% hoger was dan de controles en ca. 1/4 van CVS-patiënten in andere studies studies hadden verhoogd TNFα. Interleukine-13, geassocieerd met inhiberende effekten op de produktie van inflammatoire cytokinen, was lager bij gevallen vergeleken met controles. Het anti-inflammatoire cytokine, IL10, was niet verschillend. De inflammatoire mediator IL-8 (een chemokine [chemotactisch cytokine dat leukocyten kan aan trekken] gekend als CXCL8) is geweten verantwoordelijk te zijn voor de migratie en aktivatie van neutrofielen en NK-cellen, was gedaald in plasma van CVS-patiënten.

De observaties van abnormale cytokine-patronen bij CVS-patiënten ondersteunen de meldingen van retrovirus-infekties en reaktivatie van latente herpes-virus infekties. […]

Latente herpes-virus infekties zijn waarschijnlijk van belang bij CVS. Immunologische effekten van persistente herpes-infekties vergen geen virus DNA-synthese. Glazer et al. rapporteerden dat door EBV gecodeerd deoxyuridine trifosfaat nucleotidohydrolase (dUTPase) [enzyme dat het verkeerdelijk inbouwen van uracil in het DNA voorkomt en zodoende kritiek is voor de betrouwbaarheid van DNA-replicatie en -herstel] de produktie van pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-1β en IL-6, upreguleerde. dUTPase toegediend aan muizen, veroorzaakte ook ziekte-gedrag; waarvan is geweten dat geïnduceerd wordt door enkele van de cytokinen die geupreguleerd bleken bij onze studie. Een ander artikel [Waldman et al.] toonde dat EBV dUTPase de aanmaak van pro-inflammatoire cytokinen kan versterken in monocyten/macrofagen in contact met endotheliale cellen van bloedvaten. Daarenboven demonstreerden Ariza et al. dat het gezuiverd EBV dUTPase NF-kappaB op een dosis-afhankelijke manier aktiveerde via Toll Like Receptor 2 (TLR2). Behandeling van menselijke, van monocyten afgeleide macrofagen met een anti-EBV dUTPase of met een anti-TLR2 blokkeerde de produktie van IL-6. Iwakiri et al. meldden dat door EBV gecodeerd (klein) RNA [EBER; bepaalde proteïnen die tijdens de latente cyclus, wanneer geen virus-partikels worden geproduceerd, van het virus worden aangemaakt], dat wordt afgegeven door met EBV geïnfekteerde cellen, verantwoordelijk was voor immuun-aktivatie door EBV, inclusief de release van pro-inflammatoire cytokinen. Een studie (M Vera, MA Fletcher, C Cuba, L Garcia, N Klimas, gepresenteerd voor de ‘International Association for Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalitis’, Reno, 2009) rapporteerde dat het anti-virale en immuno-modulerende medicijn inosine-pranobex [Isoprinosine^®, Imunovir^®; een afgeleide van inosine, bootst de werking na van immuun-stimulerende hormonen aangemaakt in de thymus] tot significante verbetering leidde van de klinische scores van 61 patiënten behandeld gedurende 6 maanden. Immuun-aktivatie was verminderd, NK-cel aktiviteit verbeterd en titers van anti-Epstein Barr Virus Viraal Capside Antigen IgG waren significant gedaald. Antilichaam-titers tegen Humaan Herpes Virus 6 bleven onveranderd. Een grotere gerandomiseerde proef lijkt zinvol.

Volgens de ROC-analyse was plasma IL-5 best bij het onderscheiden van CVS-gevallen van controles […]. We rapporteerden eerder verhoging van IL-5 in de supernatants van door mitogen gestimuleerde, gecultiveerde lymfocyten van gevallen met Golf Oorlog Ziekte (GWI) vergeleken met controles. De symptomen van GWI zijn gelijkaardig met die van CVS. Drie andere cytokinen met AUC-waarden consistent met een goed potentieel als biomerkers waren LTα, IL-4 en IL-12. Minder beloftevol als systemische merkers voor CVS, maar met een AUC significant verschillend tussen gevallen en controles, waren IL-6, IL-15, IL-13, IL-1α en IL-1β.

De cytokine-veranderingen geobserveerd tussen CFS-patiënten en gezonde, gematchte controles zijn wellicht indicatief voor immuun-aktivatie en nd inflammatie. Fibromyalgie, GWI, reumatologische aandoeningen en Multipele Sclerose zouden gelijkaardige cytokine-patronen kunnen vertonen. Toekomstig onderzoek zal nodig zijn om te bepalen of de cytokine-patronen geassocieerd met CVS-gevallen gelijkaardig zijn met of verschillend van ander complexe, chronische en slecht-begrepen ziekten.

Duidelijke beperkingen van deze studie zijn dat de stalen een enkelvoudig tijdpunt en één geslacht vertegenwoordigen. Het hoofd-protocol, waarvan de CVS-stalen waren verzameld, is een grotere longitudinale studie. Individuen worden 18 maanden gevolgd en stalen worden verzameld op tijdstippen van relatieve symptoom-remissie of -verslechtering. Het vervolledigen van de studie zal de correlatie toelaten van met CVS gerelateerde symptomen en andere immuun-merkers met de cytokine-patronen. CVS is een aandoening die onevenredig meer vrouwen aantast. De grotere studie zal voldoende kracht hebben om het bestuderen van cytokine-patronen bij mannen met CVS toe te laten. Zoals Broderick et al. aanstipten: merkers van de immuun-status hebben de neiging om zeer variabel en context-specifiek te zijn, wat leidt tot inconsistente biomerker-lijsten [Fuite J, Vernon SD, Broderick G: Neuro-endocrine and immune network re-modeling in Chronic Fatigue Syndrome: an exploratory analysis. Genomics 2008, 92:393-9]. Deze indicatoren zijn onderdeel van een complex en geïntegreerd systeem en hun onderlinge afhankelijkheid moet worden aangepakt. Daarom zijn we bezig met het combineren van de proteomische en genomische gegevens over cytokinen met andere immunologische en neuro-endocriene merkers, zowel proteomisch en genomisch, om de netwerk-struktuur van neuro-endocriene-immune interaktie bij CVS in kaart te brengen. We zullen focussen op identificerende associaties tussen knooppunten die differentieel tot expressie komen bij de ziekte-groep en controles.

De bevinding van cytokine-onevenwichten in perifeer bloed heeft implicaties voor fysiologische en psychologische funktie. De gedaalde natural killer (NK) cel cytotoxiciteit en lymfoproliferatieve aktiviteiten, en verhoogde allergische en auto-immune manifestaties bij CVS zouden compatibel zijn met de hypothese dat het immuunsysteem van aangetaste individuen neigt naar een T-helper (T_H) 2 type, of een cytokine-patroon dat georiënteerd is naar humorale immuniteit. De verhogingen qua LTα, IL-1α, IL1β en IL-6 wijzen op inflammatie, waarschijnlijk vergezeld van auto-antilichaam produktie, ongepaste vermoeidheid, spier- en gewricht-pijn, zowel als van stemming en slaap-patronen.

Besluit

Deze studie is één van de eerste in de CVS-literatuur die plasma-profielen rapporteert van een redelijk groot panel cytokinen gelijktijdig bepaald met een multiplex techniek. Cytokine-abnormaliteiten lijken courant te zijn bij CVS. Meerdere bleken beloftevol als potentiële biomerkers. De veranderingen in vergelijking met de normale situatie duiden op immuun-aktivatie en inflammatie – en wijzen naar to mogelijke therapeutische strategieën. De resultaten impliceren een gedesorganiseerd regulerend patroon van T_H1-funktie, kritiek voor anti-virale verdediging. De gegevens van de studie ondersteunen een T_H2-verschuiving, upregulering van pro-inflammatoire cytokinen en downregulering van belangrijke mediatoren van cytotoxische cel funktie.