M.E.(cvs)-wetenschap

mei 27, 2016

NK-cellen & SNPs in ion-kanalen en receptor-genen bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:19 am
Tags: , , , , , ,

Onderstaand artikel is een integratie van resultaten betreffende TRP (‘SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS’) en AChR (‘SNPs in in Acetylcholine Receptoren bij CVS’) gevonden in vol-bloed bij M.E.(cvs)-patiënten en het verder onderzoeken van deze bevindingen bij geïsoleerde NK-cellen. De lezer wordt aangeraden vooraf missschien ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ (en ev. andere artikels betreffende NK-cellen alhier ook nog eens na te lezen…

In essentie rapporteert men hier over abnormale genen coderend voor ion-kanalen & receptoren in (geïsoleerde) ‘natural killer’ cellen. Men legt uit, op basis hiervan, waarom NK-cellen (onderdeel van het immuunsysteem) bij M.E.(cvs) niet goed funktioneren. Deze genen worden ook niet enkel gevonden in NK-cellen en met stelt dat de anomalieën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor andere de andere symptomen van de ziekte.

Het research-team van het ‘National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases’ (NCNED) – waartoe deze onderzoekers behoren – blijken op termijn ook een screening-test op de markt te willen brengen op basis van “nieuwe merkers geïdentificeerd op witte bloedcellen”. Het is niet helemaal duidelijk of de hieronder beschreven SNPs daar ook onder vallen maar naar aanleiding van het persbericht daarover sprak Prof. Staines echter over “zeer specifieke delen van genen die coderen voor bepaalde receptoren of proteïnen die belangrijke rollen spelen bij het metabolisme, neuronale en cardiovasculaire funktie, enz.”. Wellicht zal het een combinatie zijn met de door deze onderzoeksgroep eerder gerapporteerde en gepatenteerde miRNAs…

————————-

Application of Clinical Genetics Vol. 9, pp 39-47 (2016)

Natural killer cells and single nucleotide polymorphisms of specific ion channels and receptor genes in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome

Sonya Marshall-Gradisnik (1,2), Teilah Huth (1,2), Anu Chacko (1,2), Samantha Johnston (1,2), Pete Smith (2), Donald Staines (2)

1School of Medical Science, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

2National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases [NCNED], Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Samenvatting

Doelstelling Het doel van dit artikel is om de cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) cellen te bepalen, en te kijken of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) en genotypes in ‘transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen en acetylcholine-receptoren (AChRs) aanwezig waren in geïsoleerde NK-cellen van patiënten die eerder de diagnose Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) kregen.

Individuen en methodes Er werd een totaal van 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar oud) en 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar oud) in deze studie opgenomen. Patiënten kregen de diagnose op basis van de CDC criteria. Er werd flow-cytometrie aangewend om de NK cytotoxische aktiviteit te onderzoeken. Er werd een totaal van 678 SNPs in geïsoleerde NK-cellen onderzocht (voor 21 zoogdier TRP ion-kanaal genen en 9 zoogdier AChR genen […]). SNP-associatie en genotype werd bepaald […].

Resultaten M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua percentage lysis van doelwit-cellen door NK (17% ± 4,68%) t.o.v. de niet-vermoeide controle-groep (31% ± 6,78%). Van de 678 onderzochte SNPs, werden 11 SNPs voor TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) geïdentificeerd in de M.E./CVS-groep. 5 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3, terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8, TRPC2 & TRPC4 (P < 0.05). 14 SNPs bleken geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen: 6 met CHRNA3, de rest met CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5 & CHRNE (P < 0.05). Er werden 16 genotypes geïdentificeerd met SNPs in TRP ion-kanalen en AChRs voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1) (P < 0.05).

Besluit We identificeerden een aantal SNPs en genotypes voor TRP ion-kanalen en AChRs bij geïsoleerde NK-cellen bij patiënten met M.E./CVS, wat suggereert dat deze SNPs en genotypes betrokken kunnen zijn bij veranderingen qua NK-cel funktie en de ontwikkeling van M.E./CVS-pathologie. Deze anomalieën suggereren een rol voor de ontregeling van Ca2+ in AChR en TRP ion-kanaal signalisering in het pathomechanisme van M.E./CVS.

Inleiding

‘Natural killer’ (NK) cellen zijn granulaire [gekorrelde] lymfocyten die worden gevonden in het perifeer bloed, het beenmerg, de milt en in lymfeknopen. In het perifeer bloed beslaan NK-cellen 15% van de lymfocyten en ze kunnen worden gegroepeerd in 4 subtypes volgens de expressie op het cel-oppervlak en de densiteit van CD56 (neurale cel-adhesie molekule) en CD16 (FcγIII receptor, de lage-affiniteit receptor voor IgG). Deze fenotypes omvatten CD56brightCD16-/dim, CD56dimCD16bright, CD56dimCD16 & CD56CD16bright. Ongeveer 90% van de NK-cellen in het perifeer bloed zijn CD56dimCD16bright en de CD56bright beslaan ca. 10%. NK-cel cytotoxische aktiviteit vereist een aantal gereguleerde processen om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] van de doelwit-cel te verzekeren.

Hoewel er weinig is geweten over Ca2+-signalisering in NK-cellen, werd er gezien dat het granule-afhankelijk pad voor apoptose calcium-afhankelijk is, terwijl het ‘death’-receptor mechanisme dat niet is. Bij apoptose bleken het transport van lytische proteïnen, exocytose [proces waarbij een vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan samensmelten en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte] en fusie duidelijk calcium-afhankelijk. Ca2+ is ook vereist voor de her-oriëntatie van microtubules [buisvormige proteïne-strukturen die deel uitmaken van het cel-skelet] en het actine-skelet [het proteïne actine is een onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid], alsook de aktivatie van cytokinen gen-transcriptie. Bovendien hebben studies aangetoond dat er een verband bestaat tussen calcium-mobilisatie en het stopzetten van de degranulatie in PLCγ2-deficiënte NK-cellen [PLC = fosfolipase; PLC-gamma is een belangrijke regulator van intracellulair Ca2+].

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen komen tot expressie op bijna alle cellen en hebben een significant effekt op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, zoals kanker, skeletale abnormaliteiten, pijn-syndroom, enz. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd bij aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen, en hebben een belangrijke rol bij Ca2+-signalisering.

Acetylcholine (ACh) bindt op 2 membraan-proteïnen, namelijk de muscarine receptor (mAChR) en de nicotine receptor (nAChR), waarvan meerdere isoformen bestaan. ACh heeft niet-neuronale funkties, het non-neuronaal cholinerg system genaamd, in pancreatische β-cellen, gliale cellen, lymfocyten, ooglens-cellen en vasculair endothelium [= bedekkende cellen van bloedvaten] van het brein, dat gemedieerd wordt door Ca2+-signalisering. AChRs brengen aktivatie-signalen over in een waaier van menselijke weefsels, inclusief skelet- en gladde spieren, alle pre-ganglionische [van het CZS tot de ganglia (zenuw-knopen)] autonome zenuw-vezels, post-ganglionische [van de ganglia naar een orgaan] autonome parasympathische zenuwen, en op veel plaatsen over gans het centraal zenuwstelsel.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.)/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) heeft een ongekende etiologie en er is geen specifieke diagnostische test. De ziekte wordt grotendeels gekenmerkt door significante stoornissen van de lichamelijke aktiviteit en uitputtende vermoeidheid, en kan gepaard gaan met stoornissen van het geheugen, de cognitie en concentratie, meer spier- en gewricht-pijn, hoofdpijn, pijnlijke keel en lymfeknopen. Het is verder geassocieerd met ontregeling van het gastro-intestinaal, cardiovasculair en immuunsysteem. Belangrijk: NK-cel dysfunktie, in het bijzonder verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit, is een courante bevinding bij M.E./CVS-patiënten. We hebben eerder ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) geïdentificeerd in TRP ion-kanaal genen (TRPM3, TRPA1, TRPC4) en AChR genen (CHRM3, CHRNA10, CHRNA5 & CHRNA2) in perifeer bloed van M.E./CVS-patiënten. [Marshall-Gradisnik SM, Smith P, Brenu EW, Nilius B, Ramos SB, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in transient receptor potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights. (2015) 7:1-6 /// Marshall-Gradisnik S, Smith P, Nilius B, Staines DR. Examination of single nucleotide polymorphisms in acetylcholine receptors in Chronic Fatigue Syndrome patients. Immunol Immunogenet Insights (2015) 7: 7-20; zie links onze inleiding] Deze SNP-anomalieën in genen coderend voor TRP ion-kanalen en AChRs kunnen gewijzigde receptor-proteïnen opleveren, die mogelijks de strukturen van TRP ion-kanalen en AChR, en ook hun funkties kunnen veranderen.

Het doel van deze studie was de NK cytotoxische aktiviteit te bepalen, alsook of SNPs en hun genotypes aanwezig waren in TRP ion-kanaal en AChR genen in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten.

Individuen en methodes

[…]

Resultaten

Deelnemers

Er waren 39 M.E./CVS-patiënten (51,69 ± 2 jaar) waarvan 71,79% vrouwen. Er waren 30 niet-vermoeide controles (47,60 ± 2,39 jaar) waarvan 56,67% vrouwen. […] Er werden geen significante verschillen gevonden qua tellingen van witte bloedcellen tussen M.E./CVS-patiënten en de niet-vermoeide controle-groep. […]

NK-cel zuiverheid

Er was geen significant verschil tussen de groepen wat betreft NK zuiverheid-graad. De zuiverheid van de NK-cellen na isolatie en aanrijking was > 93%.

NK-cel cytotoxische aktiviteit

Er was een significant verschil voor NK cytotoxische aktiviteit tussen de groepen wat betreft de E:T [effector/target’] ratio van 25:1 [de optimale verhouding voor het bepalen van de cytotoxische aktiviteit]. M.E./CVS-patiënten vertoonden een significante reductie qua NK percentage lyse van doelwit-cellen (17% ± 4,68%) vergeleken met de controle-groep (31% ± 6,78%).

SNP-analyse

Van de 678 SNPs geïdentificerd in TRP ion-kanaal and AChR genen van geïsoleerde NK-cellen, waren er 11 SNPs in TRP ion-kanaal genen (TRPC4, TRPC2, TRPM3 & TRPM8) die significant geassocieerd waren met de M.E./CVS-groep. Daarvan waren er 5 geassocieerd met TRPM3 […] terwijl de rest geassocieerd was met TRPM8 […] & TRPC4 […].

Er waren 14 SNPs geassocieerd met nicotine en muscarine AChR genen, waarvan er 6 met CHRNA3 […] en de rest met CHRNA2 […], CHRNB4 […], CHRNA5 […] & CHRNE […].

Genotype-analyse

Er werden 16 genotypes met SNPs geïdentificeerd die significant bleken voor TRPM3 (n = 5), TRPM8 (n = 2), TRPC4 (n = 3), TRPC2 (n = 1), CHRNE (n = 1), CHRNA2 (n = 2), CHRNA3 (n = 1) & CHRNB4 (n = 1). Van de als significant geïdentificeerde SNPs gingen we verder na of genotypes verschilden tussen de groepen. […] De ‘odds ratio’s [waarschijnlijkheid van het verband tussen aan- of afwezigheid van een bepaalde eigenschap en die van een andere eigenschap in een populatie] voor specifieke genotypes met SNPs in TRP & AChR genen in geïsoleerde NK-cellen varieerde tussen 3.13 & 11.39 voor M.E./CVS vergeleken met de niet-vermoeide controle-groep.

Bespreking

Verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit werd eerder al gerapporteerd bij M.E./CVS en de studie hier ondersteunt deze bevindingen. Het huidig onderzoek ondersteunt nieuwe bevindingen aangaande een aantal SNPs in genen coderend voor AChR en TRP varianten en genotypes van geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Een bijkomende nieuwe bevinding is de identificatie van SNPs in TRPM3 & TRPM8 bij geïsoleerde NK-cellen, suggererend dat er TRPM3 & TRPM8 receptoren gelokaliseerd zijn op NK-cellen.

We rapporteren een significante reductie van de NK-lyse bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. de niet-vermoeide controles. De rol van TRP ion-kanalen bij Ca2+-signalisering, en aangeboren en adaptieve immuun-cellen wordt meer en meer gedocumenteerd. De TRPs bleken TRP kation-kanalen [TRPC worden geaktiveerd door fosfolipase-C, membraan enzymen die fosfolipiden splitsen] en TRP-melastatine [TRPM; melastatine is een vermeende tumor-suppressor] subfamilies, voornamelijk TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPM2, TRPM4 & TRPM7 tot expressie te brengen. Deze kanalen zijn niet-selektief en doorlaatbaar voor calcium. Ca2+ speelt een sleutelrol bij fusie van lytische granules in NK-cellen, alsook bij het verzekeren dat lytische granules zich naar de immuun-synaps [de interface tussen een antigeen-presenterende cel of doelwit-cel en een lymfocyt zoals een effector-T-cel of NK-cel] verplaatsen om perforine en granzymes af te geven om doelwit-cellen te doden. Rho GTPase Miro [Mitochondriaal Rho GTPase; een enzyme met een belangrijke rol bij mitochondriaal transport, betrokken bij mitochondriale homeostase en apoptose] biedt een link tussen de mitochondrieën en de microtubules, waar het de Ca2+-afhankelijke stopzetting van de mitochondriale motiliteit medieert. Aangezien Miro mitochondriale polarisatie [ontstaan/opbouw van een spanningsverschil over de mitochondriale membranen] modificeert, zou het ook transport van lytische granules naar de immuun-synaps kunnen veranderen, alsook de lytische funktie, te wijten aan de modulatie door de Ca2+-concentratie in het cytosol via TRP-melastatine en AChR genen. Het is duidelijk: mitochondrieën spelen een belangrijke rol bij de werking van NK-cellen. De ontdekking dat mitochondrieën een waaier aan AChR-subtypes tot expressie brengen, inclusief nicotine-α3, die differentieel tot expressie komen naar gelang het weefsel-type, suggereert dat nAChRs een impact kunnen hebben op de mitochondriale funktie en regulering van oxidante stress. Interessant: we rapporteerden eerder een significante daling van de ‘respiratory burst’ [of ‘oxidative burst’; snelle afgifte van reaktieve zuurstof molekulen; speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem] funktie van neutrofielen bij M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW, Staines DR et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8:1; zie link onze inleiding]

TRPM2 en TRPM3 mobiliseren Ca2+, waarbij de laatste de Ca2+-signalisering bleek te mediëren voor polarisatie van cytolytische granules en degranulatie. [Na de herkenning van doelwit-cellen door NK-cellen worden NK-cel receptoren geaktiveerd, wat helpt bij de vorming van een immuun-synaps, waarbij cytolytische granules die perforine en granzymes bevatten, in dezelfde richting worden geleid.] […] Interessant is ook dat gelijkaardige bevindingen voor NK-cel funkties werden gerapporteerd in de M.E./CVS-research [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PloS One. (2014) 9: e102783 /// Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012)10: 88 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81], wat mogelijks suggereert dat de genotype-wijzigingen die hier werden gerapporteerd voor TRPM3 ook een gelijkaardige rol kunnen spelen bij polarisatie en degranulatie van cytolytische granules.

Van de 678 SNPs die werden onderzocht, waren er 11 varianten van TRP ion-kanalen en 14 varianten van AChRs die significant geassocieerd waren met M.E./CVS vergeleken met niet-vermoeide controles. De variante TRP-SNPs waren gelegen in de gen-sequentie van 2 [kanonieke] TRP ion-kanalen (TRPC2 & TRPC4) en 2 melastatine TRP ion-kanalen (TRPM3 & TRPM8). We rapporteren ook variante SNPs in genen coderend voor 2 van de CHRM3receptoren, 2 CHRM1receptoren, 6 CHRNA3receptoren, 3 CHRNA2receptoren en 1 CHRNA5receptor, alsook 1 CHRNB4-receptor en 1 CHRNE-receptor.

Deze research hier rapporteert significante SNP associaties van genotypes van AChRs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. Lymfocyten brachten muscarine en nicotine AChRs tot expressie, T- en B-cellen en monocyten brachten alle 5 de subtypes van mAChRs (M1-M5) tot expressie, terwijl nAChRs werden gevonden voor α2-α7, α9, α10, β2 & β10 subunits. Lymfocyten maken deel uit van een cholinerg systeem dat onafhankelijk is van cholinerge zenuwen, wat resulteert in de regulering van de immuun-funktie. AChR-agonisten bleken lymfocyten-cytotoxiciteit te versterken en hun intracellulair cyclisch guanosine-monofosfaat [cGMP; een cyclisch nucleotide met een belangrijke rol in verscheidene biochemische processen in de cel, een zgn. secundaire boodschapper voor intracellulaire signaal-overdracht] en inositol-1,4,5-trifosfaat [IP3; secundaire boodschapper bij signaal-overdracht en lipiden-signalisering] te verhogen, wat suggereert dat het lymfocyten cholinerg systeem betrokken is bij de regulering van de immuun-funktie via AChRs gekoppeld met fosfolipase-C via veranderingen in Ca2+. Er is onderzoek dat het belang heeft benadrukt van varianten bij het beïnvloeden van gen-transcripten door het veroorzaken van alternatieve ‘splicing’ [splicing = tijdens het verwerken van RNA (na de transcriptie van DNA) worden de niet-coderende stukken (intronen) uit het pre-mRNA geknipt en de exonen van het pre-mRNA aan elkaar geplakt.], wat resulteert in anomalieën in het boodschapper-RNA en translatie-produkten. We identificeerden ook SNPs en een genotype in CHRNE bij M.E./CVS-patiënten. Het is interessant dat deze SNP gelegen is in het 3’ onvertaald gebied [‘untranslated regions, UTR; RNA-gebied gelegen na de start van de ‘translatie’ dat instaat voor de regulering ervan): beïnvloeden dikwijls de gen-expressie], waar een bindingplaats is voor regulerende proteïnen alsook voor microRNAs (miRNAs). Door binding op specifieke plaatsen in het 3’ onvertaald gebied, kunnen miRNAs gen-expressie van meerdere boodschapper-RNAs doen dalen door het inhiberen van de translatie of het direct veroorzaken van degradatie van het transcript. Onze eerdere research vond significante verschillen qua NK cytotoxische aktiviteit, alsook qua miRNAs in geïsoleerde NK-cellen van M.E./CVS-patiënten. [Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269]

[Uitleg voor experten =>] Onderzoeken hebben gesuggereerd dat alternatieve ‘splicing’ in de coderende en ook niet-coderende sequenties significante onverwachte resultaten wat betreft het ‘splicing’-mechanisme van de gen-transcripten kunnen hebben. Het ‘splicen’ van genetische varianten gelegen in de exonen & intronen en de assemblage van het spliceosoom [complexe cellulaire ‘machine’ met een rol bij gen-expressie] dragen allemaal bij tot het ‘splicing’-mechanisme voor het correct coderen van een proteïne-sequentie. Bovendien zijn ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] en ‘silencers’ [transcriptie-regulerende factoren die zorgen voor verlaging of volledige onderdrukking van de vorming van RNA] gelegen in de exonen of intronen een integraal deel bij de herkenning van de correcte exon-sequentie. Belangrijk is dat intronen in staat zijn aktieve spliceosomen te genereren, wat aanleiding geeft tot alternatieve ‘splicing’. Gen 80036 (TRPM3) is geassocieerd met calcium-binnenkomst en calcium-opslag depletie via verschillende isoformen die geïdentificeerd werden via alternatieve ‘splicing’. Een gebied dat onontbeerlijk is voor kanaal-funktie [‘indispensable for channel function’; ICF] is een gebied van 18 aminozuren waarvan de afwezigheid zorgt dat de kanalen funktioneel niet in staat zijn om calcium-binnenkomst te mediëren, en dat bleek te ontbreken in een TRPM3 variant. Co-expressie van deze TRPM3 ICF varianten met funktionele TRPM3 ion-kanalen toonde daarenboven verstoorde calcium-mobilisatie. Aangezien TRPM3 ICF varianten overvloedige expressie vertonen in vele weefsels en cel-types, en 15% van alle TRPM3 isoformen uitmaken, kan de expressie op NK-cellen een mogelijke verklaring bieden voor gedaalde cytotoxische aktiviteit bij M.E./CVS-patiënten. Bepaalde ‘splice’-varianten, zoals TRPM3α1, kunnen mogelijks begunstigd zijn, culminerend in een gedaalde NK-cel cytotoxische respons en hitte-detektie, inclusief ontregeling van thermoregulerende responsen, nociceptie en transmissie van pijn, zoals centrale en perifere pijn-perceptie. Bovendien bleek TRPM8 ook geaktiveerd bij koude en schadelijke stimuli, wat suggereert dat de hier gerapporteerde genotype-wijzigingen overéénkomen met de klinische presentatie van thermoregulerende responsen, nociceptie, en transmissie van centrale en perifere pijn bij M.E./CVS-patiënten.

Onze resultaten suggereren dat SNP-varianten en genotypes gerapporteerd in NK-cellen wellicht niet exclusief zijn voor dit type immuun-cel. AChRs en TRP ion-kanaal receptoren komen overvloedig voor op meerdere cel-types en controleren andere funkties in lichamelijke systemen. Ca2+-signalisering in de context van TRP ion-kanalen en AChR-funktie is vitaal voor de werking van het centraal zenuwstelsel, en er is veel variëteit qua nicotine receptoren die tot expressie komen in dierlijke en menselijke immuun-cellen. Op te merken valt dat nAChRs betrokken bleken bij het wakker worden, slaap en vermoeidheid, alsook de funkties die verantwoordelijk zijn voor het verwerken van pijn, geheugen en cognitie, die allemaal klinische symptomen bij M.E./CVS zijn.

Besluit

In deze studie identificeerden we, voor de eerste keer, SNPs in genen coderend voor TRPM3 en TRPM8 ion-kanalen in geïsoleerde NK-cellen. We identificeerden ook talrijke SNPs in nAChRs samen met andere TRP-kanalen in geïsoleerde NK-cellen, wat de belangrijke rol van het niet-neuronale ACh systeem bij NK-cel funktie zou kunnen verklaren. Anomalieën in genotypes van TRP ion-kanalen en AChRs suggereren dat veranderd calcium een belangrijke funktionele consequentie kan zijn, niet enkel voor NK-cellen maar ook afhankelijk van weefsel-type, vatbaarheid of voorbestemdheid voor M.E./CVS.

Advertenties

april 1, 2016

MicroRNAs: Potentiële diagnostische biomerkers in NK-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 2:47 pm
Tags: , , , , , ,

Na het bestuderen van gen-expressie en SNPs bij M.E.(cvs) (‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’ / ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’), bekijkt Prof. Jonathan Kerr hier afwijkende gen-expressie van microRNAs in bloedcellen. Andere (Australische) onderzoekers bekeken dit al in het plasma (‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’) en zelfs in NK-cellen (‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’). Kerr et al. breiden dit laatste uit…

Eerst werd de miRNA gen-expressie geanalyseerd: 34 miRNAs bleken een afwijkende expressie te hebben. 4 konden via een andere techniek worden bevestigd. Daarna werd gekeken in welke immuun-cellen deze afwijkende gen-expressie voorkwam. Tenslotte werd nagegaan in welke effekten deze gewijzigde gen-expressie had bij NK-cellen. Er werden aanwijzingen gevonden voor een immuun-dysfunktie.

De lezer kan elders op deze paginas ook reeds één en ander bestuderen over bevindingen omtrent NK-cellen bij M.E.(cvs)…

 

“MicroRNA (of miRNA) hebben anders dan bv. mRNA (boodschapper-RNA, die een ‘positieve’ rol hebben bij het ontstaan van proteïnen) de neiging om mRNA-molekulen het ‘zwijgen’ op te leggen door ze te splitsen, ze te destabiliseren of er mee te interfereren. Ze bleken al betrokken bij verscheidene ziekten bij mensen (bv. een rol bij kanker) en bij het reguleren van de vorming van bloedcellen en het beïnvloeden van de immuniteit. Aangezien miRNAs ‘beschermd’ zijn en stabiel blijven in verscheidene lichaamsvochten en weefsels zijn ze erg in trek als mogelijke biomerkers (bij kanker maar ook epilepsie, malaria & Multipele Sclerose).” – Dr Neil Abbot; ‘ME Research UK’

————————-

PLoS One Vol 11, #3, e0150904 (maart 2016)

MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: Potential Diagnostic Biomarkers in Natural Killer (NK) Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome (CFS)/ Myalgic Encephalomyelitis (M.E.)

Robert D. Petty (1,2), Neil E. McCarthy (3), Rifca Le Dieu (2), Jonathan R. Kerr (1,4)

1 CFS Group, St George’s University of London, Cranmer Terrace, London, United Kingdom

2 Centre for Haemato-Oncology, Bart’s cancer institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

3 Centre for Immunobiology, The Blizzard institute, Queen Mary University of London, London, United Kingdom

4 Grupo de Salud Publica, Escuela de Medicine y Ciencias de la Salud, Universidad del Rosario, Quinta de Mutis, Bogotá 111221, Colombia

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS/M.E.) is een complexe multisysteem ziekte met een onbekende etiologie die invaliderende symptomen veroorzaakt bij 1% van de globale bevolking. Hoewel een grote groep genen gewijzigde expressie bleek te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten, is het nog niet geweten microRNA (miRNA) molekulen die gen-translatie reguleren, bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. We hypothiseerden dat veranderingen qua microRNA-expressie in leukocyten van patiënten bijdragen tot de CVS/M.E.-pathogoloie, en daarom bruikbare diagnostische biomerkers kunnen zijn die kunnen worden gedetekteerd in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten.

Methodes miRNA-expressie in mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) van CVS/M.E.-patiënten en gezonde controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de Ambion Bioarray V1. miRNA die differentiële expressie bleken te vertonen werden gevalideerd d.m.v. qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] en daarna gerepliceerd in subgroepen bloed-leukocyten van een onafhankelijke patiënten-groep. De via deze experimenten geïdentificeerde, met CVS/M.E. geassocieerde miRNA werden dan getransfecteerd in primaire NK-cellen en er werden gen-expressie analyses uitgevoerd om hun gen-doelwitten te identificeren.

Resultaten Micro-array [‘gen-chips’] analyse identificeerde differentiële expressie van 34 miRNA, die allemaal ge-upreguleerd waren. Van 4 op de 34 miRNA werden expressie-wijzigingen bevestigd via qRT-PCR. Het fractioneren van PBMC-stalen (van een onafhankelijke patiënten-groep) in verschillende cel-types, identificeerde veranderingen qua miRNA-expressie in NK-cellen, B-cellen en monocyten waarbij de meest significante abnormaliteiten voorkwamen bij NK-cellen. Transfectie [inbrengen van DNA of RNA in cellen] van primaire NK-cellen met hsa-miR-99b of hsa-miR-330-3p, resulteerde in gen-expressie wijzigingen consistent met NK-cel aktivatie maar verminderde cytotoxiciteit, wat suggereert dat gebrekkige NK-cel funkie bijdraagt tot CVS/M.E.-pathologie.

Besluit Deze studie toont gewijzigde microRNA-expressie aan in de perifeer bloed mononucleaire cellen van CVS/M.E.-patiënten, die potentiële diagnostische biomerkers zijn. De grootste miRNA-ontregeling werd geïdentificeerd in NK-cellen, met doelwitten die verband houden met cellulaire aktivatie en gewijzigde effector-funktie [een effector-cel pakt daadwerkelijk zijn doelwit-cel aan (herkenning en eliminatie)].

Inleiding

[…] Er is een echte klinische noodzaak om een diagnostische biomerker voor CVS/M.E. te identificeren. Een aantal studies hebben naar biomerkers voor CVS/M.E. gezocht in het mRNA [Frampton D, Kerr J et al. Assessment of a 44 gene classifier for the evaluation of Chronic Fatigue Syndrome from peripheral blood mononuclear cell gene expression. PLoS One (2011) 6: e16872 /// Kaushik N et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD et al. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9] of serum [Fletcher MA et al. Plasma neuropeptide Y: a biomarker for symptom severity in Chronic Fatigue Syndrome. Behav Brain Funct. (2010) 6: 76] van CVS/M.E.-patiënten, echter met beperkt succes. Research focust zich op het karakteriseren van immuniteit-defekten aangezien de aanvang van de symptomen dikwijls wordt voorafgegaan door een aanval op de immuniteit. Wijzigingen in populaties en aantallen leukocyten in het perifeer bloed van patiënten werden bevestigd. Onderzoek identificeerde significante immune ontregeling bij CVS/M.E.; met gewijzigde cytokine-expressie en vermindering van de dodende capaciteit van cytotoxische cellen als meest consistente bevinding. Veranderingen in mRNA-expressie in het perifeer bloed zijn goed gedocumenteerd bij CVS/M.E., met overwegend genen betrokken bij: immuun-funktie, apoptose, transcriptie, translatie en virus-infektie. mRNA gen-expressie studies waren ook succesvol bij het definiëren van CVS/M.E.-subtypes, elk met een afzonderlijk symptoom-profiel [Kerr JR et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis. (2008) 197: 1171-84]. Een groep molekulen die een rol spelen bij het reguleren van de translatie van mRNA en die nog systematisch dienen te worden onderzocht in bloedcellen van CVS/M.E.-individuen zijn microRNAs (miRNAs).

miRNA zijn een groep kleine, niet-coderende RNAs (~23 nucleotiden) met als funktie het reguleren van de translatie van mRNA post-transcriptie via directe afbraak van mRNA-transcripten of onderdrukking van de translatie. miRNAs zijn cruciaal voor het behouden van een normale haematopoïese [vorming van bloedcellen] en als bemiddelaars bij immuun-signalisering cascades, wat hun nut als biomerkers voor deze ziekte suggereert.

In deze studie screenden we bloedstalen van patiënten met een vastgestelde klinische diagnose van CVS/M.E. t.o.v. gematchte gezonde controles, en identificeerden we ontregeling van miRNAs die funkties hebben overéénkomend met gepubliceerde veranderingen qua mRNA-expressie bij CVS/M.E. Om te bepalen in welk cel-type deze miRNA-expressie veranderingen optreden, werd de ontregeling bevestigd in gefractioneerde perifere bloedcellen van een onafhankelijke patiënten-groep. De expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p in ‘natural killer’ cellen vertoonde de meeste over-expressie. In NK-cellen bleken deze (door miRNA beïvloedde) genen betrokken bij aktivatie, effector-funktie, actine-cytoskeleton [actine is een proteïne, onderdeel van het cytoskelet dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren in cellen, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en beweeglijkheid. Dit werk is ondersteuning en uitbreiding van de concepten van immuniteit-ontregeling bij CVS/M.E. en identificeert vermeende biomerkers voor ziekte-diagnose.

Resultaten

34 miRNA met verhoogde expressie in CVS/M.E. perifeer bloed

Om miRNA met differentiële expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werd RNA gehaald uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en gescreend m.b.v. Ambion Bioarray micro-arrays (385 miRNA-sequenties). 15 stalen van CVS/M.E.-individuen (Fukuda diagnostische criteria) en 30 van voor leeftijd en geslacht gematchte controles werden geanalyseerd. Een vergelijking identificeerde 34 miRNAs met differentiële expressie (verandering > 1,5 maal) […].

Ongecontroleerde cluster-analyse van de micro-array gegevens groepeerde de stalen in 2 clusters. Deze analyse kon de CVS/M.E.- en controle-stalen niet volledig in afzonderlijke clusters opdelen. Ongeveer de helft van de controle-stalen (n = 14) en 4 CVS/M.E.-stalen vormen een groep met lage globale miRNA-expressie. De overblijvende controles clusterden met de meerderheid van de CVS/M.E.-individuen, die hogere miRNA-expressie bij de meerderheid van de geanalyseerde miRNAs vertoonden. Het niveau van homogeniteit tussen de stalen is hoog (gemiddelde correlatie-coëfficient of 0.922 +/- 0.068), wat kan bijdragen tot de onvolledige klassificatie van de stalen.

Onderzoek van deze gegevens per miRNA toonde de deugdelijkheid van de expressie-gegevens […]. We bekeken de correlatie tussen miRNA gen-expressie gegevens en scores van klinische vragenlijsten (5 vragenlijsten over algemene gezondheid) maar vonden er echter geen. Deze gegevens tonen aan dat miRNAs ontregeld waren in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten en dat de waarden van deze miRNAs onafhankelijk waren van de symptoom-ernst.

Significante upregulering van de microRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E.-bloedstalen

De veranderingen qua miRNA-expressie van 29 op 34 miRNAs werden in hetzelfde staal gevalideerd in d.m.v. Taqman kwantitatieve PCR. 5 miRNAs (ambi-miR-7058, hsa-miR-331, mmu-miR-140-AS, mmu-miR-409, rno-miR-151-AS) werden niet opgenomen aangezien de testen niet beschikbaar waren. 4 op 29 miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-30c & hsa-miR-126) vertoonden significante differentiële expressie (≥ 1,5 maal, CVS vs. Controle, p ≤ 0.05 […]).

4 miRNAs hebben het potentieel als doeltreffende biomerkers bij CVS/M.E. op basis van ROC-analyse

Om te weten te komen of de 4 met differentiële expressie bevestigde miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) zouden kunnen dienen als biomerkers bij de diagnose van CVS/M.E., werd ‘Receiver Operating Characteristics’ (ROC) [statistische analyse waarbij men in een grafiek de gevoeligheid (sensitiviteit) in funktie van de specificiteit uitzet; gebruikt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] uitgevoerd voor elke relatieve hoeveelheid van elk miRNA. Deze statistiek beschrijft de mogelijkheid van een variabele om een bepaald staal te klassificeren in 2 groepen en werd eerder al gebruikt om serum-biomerkers bij CVS/M.E.te definiëren. […] De 4 geteste miRNAs vertoonden statistische significante verschillen t.o.v. het de hypothese van toevalligheid. Hsa-miR-330-3p werd via deze analyse geïdentificeerd als de variabele die ‘t meest waarschijnlijk CVS/M.E.-patiënten van controles differentieert […]. Deze gegevens tonen aan dat (binnen de grenzen van deze studie) deze 4 miRNAs diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. zouden kunnen zijn.

Hsa-miR-99b is significant ge-upreguleerd in NK-cellen van in CVS/M.E.-patiënten

Om te onderzoeken of de miRNA-veranderingen gezien in vol-bloed stalen specifiek waren voor een bepaalde PBMC-populatie, werden 20 patiënten en 20 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde vrijwilligers gerecruteerd (dezelfde klinische diagnostische criteria als de eerdere studie). Er werden bloedstalen genomen en PBMCs geïsoleerd. De cellen werden gefractioneerd via positieve selektie op basis van CD14+ (monocyten), CD19+ (B-cellen), CD56+ (NK-cellen) en CD3+ (T-cellen) microparels. Flow-cytometrie van de gefractioneerde populaties gaf een zuiverheid aan van 96,9% (+/- 2,1%) voor monocyten, 88,9% (+/- 7,6% SD) voor NK-cellen, 84,4% (+/- 8,8%) voor B-cellen en 91,2% (+/- 5,3%) voor T-cellen. Absolute cel-tellingen na fractionatie kon geen statistisch significante verschillen aantonen tussen de populatie-groepen voor de 4 onderzochte leukocyt-subgroepen.

De 4 miRNAs waarvan differentiële expressie werd bevestigd – via array & qRT-PCR – (hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-30c) werden onderzocht in RNA uit deze 4 belangrijkste bloed-leukocyten populaties. 3 van de geteste miRNAs (hsa-miR-99b, hsa-miR-126 & hsa-miR-330-3p) vertoonden significante ge-upreguleerde expressie in één of meer PBMC-subsets bij de CVS/M.E.-populatie. Hsa-miR-30c vertoonde geen significant expressie-verschil. het grootste verschil in expressie was de expressie van hsamiR-99b in NK-cellen (2-voudige toename in CVS/M.E.-stalen). Dit miRNA was ook 1,6 maal ge-upreguleerd in B-cellen maar niet gewijzigd in T-cellen en monocyten. Hsa-miR-330-3p was ook significant ge-upreguleerd in NK-cellen maar in veel mindere mate (1,3-voudige toename). Hsa-miR-126 was 1,45-voudig ge-upreguleerd in monocyten in de CVS/M.E.-groep. Deze gegevens toonden dat de ontregeling van miRNAs bij CVS/M.E. specifiek is per leukocyten-populatie en suggereren dat de dysfunktie van B-cellen, NK-cellen en monocyten bijdragen tot de ziekte-pathologie.

Hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p reguleren mechanismen die bijdragen tot NK-cel aktivatie en effector-funktie

Om de gen-doelwitten van hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p in NK-cellen identificeren, werd precursor miRNA [enkelstrengige (ss) miRNAs komen van ‘pri-miRNAs’; de twee strengen worden enzymatisch gesplitst, resulterend in voorloper miRNA of ‘pre-miRNA’] getransfecteerd in NK-cellen (die werden geïsoleerd uit PBMCs). De NK-cel zuiverheid na de aanrijking was 89,6% (bepaald via flow-cytometrie).

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-99b identificeerde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle [mRNA dat leidt tot een afgebroken, onvolledig, niet-funktioneel proteïne]) 37 genen met differentiële expressie (volgens de inclusie-criteria; p ≤ 0.05, verandering ≥ 1,5 maal). 21 genen vertoonden downregulering tussen 1,5 en 1,8 maal. 16 genen vertoonden verhoogde expressie tussen 1,5 en 2,6 maal. Interferon-gamma (IFN-γ), een belangrijke mediator van NK-cel aktivatie, was het sterkst geïnduceerde gen (2,6 maal). Granzyme-B (GZMB), dat codeert voor een component van de cytotoxische granules die door NK-cellen worden afgegeven na herkenning van doelwit-cellen, was 1,6 maal meer geïnduceerd. Genen betrokken bij cellulaire aktivatie, vesikel-vorming [vesikels = kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], beweeglijkheid en modulatie van het actine-cytoskeleton waren ook ge-upreguleerd […]. Cathepsine-L (CTSL) [enzyme betrokken bij proteïne-afbraak] was het meest ge-downreguleerde gen door hsa-miR-99b. Dit proteïne is vereist voor splitsing en aktivatie van perforine & granzyme-B in de lytische vesikels [bevatten cel-afbrekende stoffen]. CD6 & IL-8 (interleukine-8) waren ook ge-downreguleerd (1,6 & 1,5 maal, respectievelijk). Verminderde expressie van deze genen is geassocieerd met NK-cel rijping na aktivatie. Er werd ook verminderde expressie geïdentificeerd bij genen betrokken bij autofagie [strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen; maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten] en bepaalde signalisering-mechanismen […].

Om te bepalen of de genen die worden gereguleerd door hsa-miR-99b konden worden gegroepeerd in een specifieke funktionele klasse, voerden we een ‘over-representatie analyse’ uit [bekijkt de eventuele aanrijking van bepaalde mechanismen, molekulaire funkties en biologische processen]: dit identificeerde een significante aanrijking voor genen betrokken bij processen en mechanismen van de NK-cel funktie, inclusief cel-aktivatie, immuunsysteem-processen en cellulaire respons op een stimulus.

Transfectie van primaire NK-cellen met pre-miR-330-3p leverde (vergeleken met transfectie van een ‘non-sense’ controle) slechts 2 wijzigingen op: voor SOD2 [codeert voor mitochondriaal superoxide-dismutase-2] en MMP9 [codeert voor matrix-metallopeptidase 9] -expressie; ze waren allebei 1,6 maal gedownreguleerd. SOD2-expressie verstoort de normale T-cel differentiatie en cellulaire aktivatie, en verminderde expressie is geassocieerd met verstoorde neutrofiel effector-funktie. MMP9 reguleert NK-cel cytotoxiciteit en lymfocyten-beweeglijkheid.

Deze resultaten toonden aan dat verhoogde miRNAs expressie in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten gen-expressie wijzigingen bevordert die consistent zijn met cellulaire aktivatie maar verminderde effector-funktie.

Bespreking

De klinische diagnose van CVS/M.E. is gebaseerd op goed omschreven klinische criteria maar de diagnose omvat echter ook de uitsluiting van andere oorzaken voor vermoeidheid, wat kan leiden tot een langere diagnose-tijd. Zodoende is er een echte klinische noodzaak om diagnostische biomerkers voor CVS/M.E. te identificeren. We wilden de rol van miRNA bij patiënten met een vastgestelde diagnose of CVS/M.E. bestuderen, om te bepalen of deze regulerende molekulen bijdragen tot de ziekte-pathogenese en of het kandidaat diagnostische biomerkers zijn.

We identificeerden over-expressie van 34 miRNA die niet eerder werden beschreven bij CVS/M.E. [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma microRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One (2014) 9: e102783; zie ‘MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.’ /// Brenu EW et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-9; zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?] in stalen perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten. De micro-array analyse groepeert op een robuste manier de miRNAs met gecoördineerde expressie (hsa-miR-107 & hsa-miR-103) en levert zeer homogene resultaten. Wat gemeenschappelijk is met andere CVS/M.E.-studies is dat gen-expressie het miRNA-profiel CVS/M.E.-patiënten niet van controles onderscheidde Een studie van Brenu et al. [zie eerder] analyseerde plasma-stalen van CVS/M.E.-patiënten en identificeerde ontregeling van 19 menselijke miRNAs. Van deze 19, zaten er slechts 12 in onze array. Daarvan waren er 8 met een verschil van ≥ 1,5 maal (CVS/M.E. vs. normaal) maar allemaal met insignificante p-waarden; die werden niet verder onderzocht. Het feit dat de 2 studies niet overéénstemmen is niet verrassend, aangezien cellulaire en plasma miRNA-profielen van hetzelfde individu beperkt overlappen. Er werd voorgesteld dat deze beperkte overlap het resultaat is van het feit dat miRNAs opgeslagen zijn in vesikels die worden gesecreteerd met verschillende doeltreffendheid, of van de variabele stabiliteit van de verschillende miRNAs in het extracellulair milieu. De CVS/M.E.-populatie vertoonde een brede waaier aan klinische symptoom scores wijzend op subgroepen van de ziekte, die ook elders worden beschreven en kunnen bijdragen tot het niet volledig onderscheiden van de stalen in deze analyse. Deze observatie kan ook de slechte correlatie tussen klinische symptoom score en miRNA-expressie verklaren, en suggereert dat validatie in een meer uitgebreide patiënten-groep wenselijk is.

Bevestiging van de array-bevindingen d.m.v. qRT-PCR ondersteunde de upregulering van hsa-miR- 99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-126 & hsa-miR-30c in CVS/M.E. PBMCs. De mate van overéénkomst tussen de 2 methodes is bescheiden wat betreft het vergelijken van mRNA-expressie studies bij CVS/M.E. Er werd gesuggereerd dat deze discrepantie ten dele te wijten is aan de verschillen in methodologie: veranderingen onder +/- 2 maal en lagere transcriptie zouden kunnen gelinkt zijn met een slechtere overéénstemming tussen de methodes. Dit onderstreept een consistent probleem bij miRNA-studies aangezien de ‘cut-off’ die gewoonlijk wordt gehanteerd voor miRNA gen-expressie experimenten een verandering van 1,5 maal is, wat kan leiden tot uitsluiting van positieve gegevens.

De miRNAs met verhoogde expressie bij CVS/M.E. zouden mogelijks kunnen dienen als biomerkers voor de ziekte, die dan kunnen worden gebruikt om de diagnose te verbeteren en te bespoedigen. Dit werd eerder al geprobeerd in een aantal studies die potentiële biomerkers in het serum, cytokine-expressie, dipeptidyl-peptidase-4 (CD26) [Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of natural killer cell function and dipeptidyl peptidase IV/CD26. PLoS One (2010) 5: e10817; zie ‘Natural Killer Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?] en lymfocyten gen-expressie [Steinau M, Unger ER et al. Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. J Mol Med (2004) 82: 750-5 /// Light AR et al. Moderate exercise increases expression for sensory, adrenergic and immune genes in Chronic Fatigue Syndrome patients but not in normal subjects. J Pain. (2009) 10: 1099-112; zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS] identificeerden. Om te bepalen of de 4 ge-upreguleerde miRNAs geschikte merkers zijn om CVS/M.E.-individuen te onderscheiden van een gematchte controle-groep, werd een ROC-analyse uitgevoerd. Deze toonde aan dat alle 4 de merkers patiënten van controles konden onderscheiden, met een specificiteit vergelijkbaar met die van gepubliceerde studies. Deze miRNAs zouden specifiek voor CVS/M.E.-patiënten kunnen zijn […]. Validering bij grotere geblindeerde groepen patiënten is echter nodig vooraleer de diagnostische buikbaarheid van de in deze studie geïdentificeerde miRNAs volledig kan worden benut.

Lymfocyten uit perifeer bloed werden reeds intensief onderzocht bij CVS/M.E.-patiënten en dit identificeerde wijzigingen qua cytokine-secretie, en veranderingen in cellulaire populaties en aktiviteit [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]. De cellulaire mechanismen en processen die worden gereguleerd door miRNAs zijn dikwijls cel-specifiek. Om te proberen de leucocyten-populatie die bijdraagt tot gewijzigde miRNA-expressie bij CVS/M.E. te identificeren, werden de 4 miRNAs met verhoogde expressie gekwantificeerd in PBMC-fracties van een nieuwe patiënten-groep. Hsa-miR-126 vertoonde verhoogde expressie in monocyten. Hoewel er tot op heden nog geen specifiek defekt in monocyten-aktiviteit werd aangetoond bij CVS/M.E., bleek hsamiR-126 CRK-proteïne expressie te downreguleren. Dit proteïne inhibeert cel-invasie en -migratie en bleek proliferatie in dendritische cellen te controleren, wat suggereert dat verhoogde monocyten-aktiviteit gemedieerd door miRNA kan bijdragen tot de pathogenese van CVS/M.E.

Hsa-miR-330-3p & hsa-miR-99b wijzen op verhoogde expressie in B-cel en NK-cel populaties. Deze miRNAs bleken geassocieerd met kanker, endometriose, beslissingen aangaande het lot van cellen en angiogenese. Hsa-miR-99b bleek gericht te zijn op componenten van NF-κB, mTOR en AKT signalisering-mechanismen. mTOR signalisering is cruciaal voor normale proliferatie, cytotoxische en cytokine-effector funkties in gezonde NK-cellen, en normale BCR (B-cel receptor) signalisering en proliferatie in B-cellen. Verhoogde hsa-miR-99b expressie die mTOR reguleert, ondersteunt de vermindering qua effector-funktie die wordt geobserveerd in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten die wordt gerapporteerd in de literatuur, en ondersteunt de ontregeling van genen betrokken bij B-cel rijping en ontwikkeling die werd geïdentificeerd via gen-expressie studies [Vernon SD, Broderick G et al. Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood. Behav Brain Funct. (2008) 4: 44; zie ‘Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS]. Hsa-miR-330-3p bleek cellulaire beweeglijkheid te reguleren […] in prostaatkanker-celllen en proliferatie […] bij colorectale kanker.

Hsa-miR-30c vertoont geen veranderde expressie in de cellulaire fracties: dit suggereert dat de geobserveerde over-expressie in de oorspronkelijke PBMC-groep wellicht specifiek is voor die groep. Dit toont de noodzaak aan voor validering van de bevindingen bij afzonderlijke niet-gerelateerde groepen of patiënten.

Om de effekten van de gewijzigde miRNA-expressie geïdentificeerd bij CVS/M.E op cellulair mRNA te bestuderen, verkozen we transfectie van de miRNAs met de grootste over expressie (hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p) in gezonde NK-cellen (het meest consistent geïdentificeerd als zijnde funktioneel verstoord bij CVS/M.E.-patiënten). Interferon-gamma (IFN-γ) vertoonde de grootste expressie-wijziging in respons op introductie van hsa-miR-99b: een toename qua expressie van 2,6 maal. Dit gen codeert voor een cytokine gesecreteerd door NK-cellen met een cruciale rol in anti-virale, anti-tumor en immuun-regulerende effekten gecombineerd met het bevorderen van NK-cel aktiviteit. Meting van IFN-γ gaf in een aantal CVS/M.E.-studies variabele resultaten. Er werd verhoogd mRNA in NK-cellen van CVS/M.E.-patiënten aangetoond, ondersteund door een verhoging qua circulerende IFN-γ secreterende CD3 CD56+ NK-cellen beschreven bij CVS/M.E.-patiënten [Brenu EW et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-42; zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)]. Plasma-concentraties van IFN-γ bleven echter onveranderd bij 40 vrouwelijke CVS/M.E.-patiënten t.o.v. gematchte controles [Fletcher MA et al. Plasma cytokines in women with Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2009) 7: 96; zie ‘Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS].

Eén consistente bevinding bij CVS/M.E.-patiënten is de vermindering qua cytotoxische aktiviteit van NK-cellen, dikwijls geassocieerd met een verandering qua niveau van componenten van cytotoxische granules – granzyme & perforine. In deze studie was Granzyme-B (GZMB) significant ge-upreguleerd door hsa-miR-99b, wat een versterkte cytotoxische capaciteit suggereert. CTSL (Cathepsine-L) vertoonde echter de grootste downregulering door hsa-miR-99b. Dit enzyme is nodig voor het verwerken (van precursor tot aktieve vormen) van componenten uit lytische granules (granzyme & perforine), wat een verklaring suggereert voor het verhoogd GZMB mRNA – dat hier en in de literatuur wordt gemeld – leidend tot verminderde effector-funktie. Dit mechanisme suggereert een opéénstapeling van precursor-proteïnen voor GZMB en perforine in lytische vesikels met verminderde cytotoxische werking, wat wordt ondersteund door gegevens die gedaalde NK-cel cytotoxiciteit identificeerden bij CVS/M.E.-patiënten zonder een geassocieerde verstoring van de degranulatie. Over-expressie van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p induceerde een gen-expressie patroon dat consistent is met NK-cel aktivatie verhogende IFN-γ expressie en genen betrokken bij cellulaire beweeglijkheid, vesikel-vorming en modulatie van het actine-cytoskeleton (KLRF1, STOM, S100A4, FEZ1, ARPC3 & TPM3P5). Er werd gepostuleerd dat geaktiveerde NK-cellen in het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten het resultaat kunnen zijn van een onvolledig verdwijnen van virale infektie, wat de meest geciteerde trigger is als aanvang van CVS/M.E.-symptomen. Deze gegevens tonen ook een molekulaire basis voor de vermindering qua NK-cytotoxiciteit, die wordt gezien bij CVS/M.E.-patiënten, gemedieerd door miRNA, via directe downregulering van enzymen die vereist zijn voor het verwerken van componenten van cytotoxische vesikels, en downregulering van genen in autofagie-, WNT- en AKT-mechanismen [bepaalde signaal-traansductie mechanismen] (ULK1, ATG2A, PMEPA1, DKK3, PDCD4) vereist voor normale proliferatie en rijping van geaktiveerde NK-cellen. Bijkomende validering van de proteïne-doelwitten die worden gereguleerd door de geïdentificeerde miRNAs is wenselijk om de miRNA-gemedieerde NK-cel dysfunktie bij in CVS/M.E. volledig te definiëren.

De voorgestelde gegevens identificeren ontregeling van miRNA-expressie in cellen van het perifeer bloed van CVS/M.E.-patiënten, bevestigd in 2 patiënten-groepen, in PBMCs en cellulaire subgroepen, en identificeert 4 mogelijke diagnostische biomerkers. ‘Natural killer’ cellen vertoonden de grootste veranderingen qua miRNA-expressie met upregulering van hsa-miR-99b & hsa-miR-330-3p. Deze bevindingen zijn funktioneel consistent met het begrip van de pathogenese van CVS/M.E. Het werk dat hier wordt gepresenteerd levert nieuw bewijsmateriaal voor een gewijzigde NK-cel aktivatie-mechanisme bij CVS/M.E. waarbij hsa-miR-99b is betrokken en suggereert een mechanisme voor de verminderde effector-funktie die wordt gezien bij CVS/M.E., wat eerder nog niet werd aangetoond.

oktober 4, 2015

Longitudinale analyse van immune abnormaliteiten bij ernstige & matige M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 7:48 am
Tags: , , , ,

Verder werk over de rol van ‘Natural Killer’cellen bij M.E.(cvs) door het Australisch team rond Ekua Brenu, Donald Staines & Sonya Marshall-Gradisnik.

Voor wat meer achtergrond zie ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’, ‘Screening van NK-, B- & T-cel fenotype en funktie bij CVS’, ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ & de links meegegeven in het artikel en de stukken over hun eerder onderzoek op deze paginas.

————————-

J Transl Med. (2015) 13: 299

Longitudinal analysis of immune abnormalities in varying severities of Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis patients

Hardcastle SL, Brenu EW, Johnston S, Nguyen T, Huth T, Ramos S, Staines D, Marshall-Gradisnik S

National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, School of Medical Science, Griffith University, Parklands Drive, Gold Coast, QLD, 4222, Australia

Samenvatting

ACHTERGROND: Research heeft immunologische abnormaliteiten geïdentificeerd bij Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME), een heterogene ziekte met een onbekende oorzaak waarvoor geen diagnostische test beschikbaar is. Er zijn geen CVS/ME-studies die aangeboren en adaptieve immuun-cellen longitudinaal onderzochten bij patiënten met een verschillende ziekte-ernst. Dit is de eerste studie die immuun-cellen over een periode van 6 maand onderzoekt in relatie met de variërende symptoom-ernst bij CVS/ME-patiënten. De deelnemers werden gegroepeerd in 18 gezonde controles, 12 patiënten met matige CVS/ME en 12 met ernstige CVS/ME; en er werd flow-cytometrie toepast om cel-parameters te onderzoeken op 0 en 6 maand.

RESULTATEN: Met verloop van tijd verhoogde de CD62L [L-selectine, een cel-adhesie molekule] expressie op iNKT [invariante of type-1 NK T-cellen; dragen een invariante T-cel receptor (TCR)] significant bij matige CVS/ME-patiënten en CD56bright NK-receptoren [CD56 = ‘Neural cell adhesion molecule’, NCAM; menselijke NK-cellen kunnen worden onderverdeeld in verschillende populaties op basis van de expressie van de oppervlakte-merkers CD16 & CD56] verschilden bij ernstige CVS/ME. Naïeve [nog niet aan een antigen blootgesteld] CD8+ T-cellen, CD8CD4 en CD56CD16 iNKT fenotypes, γδ [gamma/delta] T-cellen [kleine subgroep T-cellen die een speciale TCR op hun oppervlak dragen] en effector geheugen subsets [Een antigen-specifieke ‘memory’ T-cel expandeert tot grote aantallen effector T-cellen bij her-blootstelling aan het oorspronkelijk antigen.] waren significant verhoogd bij ernstige CVS/ME-patiënten op 6 maand. Patiënten met ernstige CVS/ME vertoonden significante verminderingen qua CD56brightCD16dim NKG2D[zie bespreking], CD56dimCD16 KIR2DL2/DL3 [KIR = ‘Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors’; zie ook ‘Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS], CD9CD11a γδ T-cellen en CD62L+CD11a γδ T-cellen op 6 maand [CD9 & CD11 zijn adhesie-molekulen op het cel-oppervlak].

BESLUITEN: Patiënten met ernstige CVS/ME verschilden met verloop van tijd van controles en patiënten met matige CVS/ME en vertoonden significante wijzigingen qua expressie in iNKT cel fenotypes, merkers van CD8+ T-cellen, NK-cel receptoren en γδ T-cellen op 6 maand. Dit benadrukt het belang van het verder longitudinaal bepalen van deze potentiële immune biomerkers bij patiënten met matige en ernstige CVS/ME.

Achtergrond

In het immuunsysteem worden lymfocyten onderworpen aan continue oriëntatie, signalen en regulering om succesvolle cel-ontwikkeling en homeostase, en vervolgens ziekte te voorkomen. Immuun-responsen die worden opgewekt als gevolg van deze signalen tussen aangeboren en adaptieve cellen, kunnen fluctueren en hebben een cruciale invloed op het handhaven van fysiologische homeostase [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88]. Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME) is een heterogene ziekte, die verschilt qua ernst en aanvang maar de research heeft consistent immunologische abnormaliteiten vastgesteld [Brenu E et al. Natural killer cells in patients with severe Chronic Fatigue Syndrome. Autoimmun Highlights. (2013) 4: 1-12 /// Brenu E et al. Immune abnormalities in patients meeting new diagnostic criteria for Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Mol Biomark Diagn. (2013) 4: 4172 /// Brenu EW et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 => ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs) /// enz.].

Verminderde Natural Killer (NK) cel cytotoxische aktiviteit is de meest overheersende en consistente uitkomst bij immunologische studies omtrent CVS/ME. Een aantal parameters bleek ook gewijzigd: o.a. T regulerende cellen (Tregs) [sub-populatie T-cellen die het immuunsysteem moduleren, tolerantie voor zelf-antigenen helpen behouden en auto-immuun-ziekten voorkomen; voor wat duiding zie ‘Heterologe immuniteit – overzicht], iNKT-cellen, CD8+ T-cellen en cytokinen [o.a. Hardcastle S, Brenu E et al.. Analysis of the relationship between immune dysfunction and symptom severity in patients with Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME). J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 2]. Veranderingen qua aangeboren en adaptieve immuun-cellen weerspiegelen de mate van immune ontregeling bij CVS/ME, die mogelijks gelinkt is met het pathomechanisme van de ziekte of kan bijdragen tot toekomstige diagnostische methodes.

Longitudinale studies bij CVS/ME hebben ook consistent gereduceerde NK-cel aktiviteit aangetoond terwijl cytokine-waarden met verloop van tijd variëren. Het lijkt dat longitudinale onderzoeken van immuun-cellen bij CVS/ME een beoordeling van consistente immuun-parameters als potentiële biomerkers voor de ziekte toelaten. Deze research onderzoekt verder immunologische merkers van het aangeboren en adaptief immuunsysteem op 0 & 6 maand bij patiënten met matige en ernstige CVS/ME.

Methodes

Deelnemers

[…] De CVS/ME-patiënten hadden de ziekte minstens 6 maand voorafgaand aan de studie. CVS/ME werd gedefinieerd op basis van de 1994 Fukuda criteria. De ernst van de CVS/ME (matig of ernstig) werd bevestigd gebruikmakend van een uitgebreide vragenlijst die de symptomatologie, gezondheid-status, levenskwaliteit, ernst en mobiliteit beoordeelt. Deelnemers werden uitgesloten als ze eerder een diagnose van een auto-immune aandoening, psychose, hart-ziekte of schildklier-aandoening kregen, of als ze zwanger waren, borstvoeding gaven, rookten of symptomen van CVS/ME vertoonden die niet overéénkwamen met de Fukuda. […] De groep met ernstige CVS/ME was aan huis gebonden en de scores voor de ‘Fatigue Severity Scale’ (FSS), ‘Dr Bell’s Disability Scale’, de ‘FibroFatigue Scale’ en de ‘Karnofsky Performance Scale’ (KPS) werden bepaald als maat voor de ernst.

Staal

[vol bloed geanalyseerd binnen 12 uur na afname]

Intracellulaire analyse

[Merken met monoclonale antilichamen voor T regulerende cel (Treg) fenotypes, NK lytische proteïnen en CD8 lytische proteïnen (…). Expressie van FOXP3+ Tregs werd bepaald op CD4+CD25+CD127low T-cellen. NK- en CD8 T-(…) geïncubeerd met perforine, granzyme-A & granzyme-B monoclonale antilichamen om de expressie te meten.]

NK-fenotype en analyse van de receptoren

[NK-cellen gelabeld met CD56, CD16, CD3 en monoclonale antilichamen voor KIR-receptoren.]

Vol-bloed analyse

[iNKT, dendritische cellen (DC), B, γδ T en CD8+ T-cel fenotypes werden bepaald gebruikmakend van geschikte antilichamen.]

Gegevens en statistische analyse

[statistische significantie: p < 0.05]

Resultaten

Patiënten-kenmerken

Gemiddelde (± SD) leeftijd voor controles (n = 18), patiënten met matige CVS/ME (n = 12) en patiënten met ernstige CVS/ME (n = 12) was 41,94 ± 10,76, 44,73 ± 12,90 en 41,27 ± 10,05 (geen statistisch significante verschillen). Distributie volgens geslacht was ook niet significant verschillend (overwegend vrouwen: 72, 67 & 83 % voor de controles, patiënten met matige CVS/ME en patiënten met ernstige CVS/ME).

Alle CVS/ME-patiënten voldeden aan de 1994 Fukuda criteria […]. Volgens de ‘FibroFatigue Scale’ scores stelden alle CVS/ME-patiënten het significant slechter dan de controle-groep (uitgezonderd wat betreft ‘droevigheid’). Er was geen statistisch significant verschil tussen matige en ernstige CVS/ME wat betreft de ‘FibroFatigue Scale’ […]. ‘Dr Bells Disability scale’ (DRS) en de KPS waren significant verschillend tussen alle groepen: de scores van de patiënten met ernstige CVS/ME waren significant slechter t.o.v. die van de patiënten met ernstige CVS/ME.

Geen verandering qua intracellulaire parameters

Geen significante verschillen tussen de groepen (0 & 6 maand) voor Tregs, NK- of CD8+ T-cel lytische proteïnen.

Geen verandering qua vol-bloed fenotypes

Geen significante verschillen in DC of B-cel fenotypes tussen de groepen of tussen 0 & 6 maand.

iNKT-cellen

Tussen 0 & 6 maand waren iNKT-cellen die CD62L tot expressie brengen significant verhoogd op 6 maand bij patiënten met matige CVS/ME (p = 0.004).

Op 6 maand waren CD8CD4 en CD56CD16 iNKT-cellen significant verhoogd bij ernstige CVS/ME t.o.v. controles (p = 0.024 & 0.030).

KIRs

CD56brightCD16dim NK-cellen die KIR3DL1/DL2 tot expressie brengen waren significant verhoogd bij controles en patiënten met matige CVS/ME na 6 maand (p < 0.000 & 0.004). CD56brightCD16+ NK-cellen die KIR2DL1 tot expressie brengen waren significant verhoogd patiënten met ernstige CVS/ME na 6 maand (p = 0.011). CD56brightCD16+ NK-cellen die KIR2DL2/DL3 tot expressie brengen waren significant verhoogd bij controles en patiënten met matige CVS/ME na 6 maand (p = 0.018 & 0.049). CD56brightCD16+ NK-cellen die KIR2DS4/DL2 tot expressie brengen waren ook significant verhoogd bij controles en patiënten met matige CVS/ME na 6 maand (p = 0.038 & 0.023). Op 6 maand waren CD56brightCD16dim NK-cellen die NKG2D tot expressie brengen significant gereduceerd bij ernstige CVS/ME vergeleken met patiënten met matige CVS/ME (p = 0.014). Op 6 maand was ook de KIR2DL2/DL3 expressie in CD56dimCD16 NK-cellen significant verminderd bij patiënten met ernstige CVS/ME t.o.v. controles (p = 0.045).

CD8 T-cellen

Op 6 maand waren naïeve CD8 T-cellen significant verhoogd bij patiënten met ernstige CVS/ME in vergelijking met bij patiënten met matige CVS/ME (p = 0.041).

γδ T-cellen

Op 6 maand waren de totale γδ2 T-cellen significant verhoogd bij ernstige CVS/ME t.o.v. controles en patiënten met matige CVS/ME (p = 0.035 & 0.034). Op 6 maand waren de γδ2 effector geheugen en CD45RA+ effector geheugen T-cellen ook significant verhoogd in de groep patiënten met ernstige CVS/ME in vergelijking met controles en patiënten met matige CVS/ME (p = 0.003, 0.013 & 0.017, 0.032).

Op 6 maand vertoonden de γδ1 T-cellen in de groep patiënten met ernstige CVS/ME significant lagere CD94CD11a expressie vergeleken met controles en patiënten met matige CVS/ME (p = 0.018 & 0.047). Op 6 maand was de CD94CD11a expressie in γδ2 T-cellen van patiënten met ernstige CVS/ME significant hoger dan bij controles en patiënten met matige CVS/ME (p = 0.019 & 0.005). De groep met ernstige CVS/ME vertoonde ook significant hogere CD94CD11a+ expressie op γδ2 T-cellen t.o.v. controles (p = 0.025) op maand 6.

Op 6 maand was de γδ1 T-cel expressie van CD62L+CD11a significant gereduceerd bij ernstige CVS/ME in vergelijking met met zowel controles als patiënten met matige CVS/ME (p = 0.013 & 0.023). Op 6 maand was de expressie van CD62L+CD11a alsook CD62L+CD11a+ op de γδ2 T-cellen significant verhoogd in de groep met ernstige CVS/ME t.o.v. controles en patiënten met matige CVS/ME (p = 0.002, 0.001 & 0.045, 0.018 respectievelijk).

Bespreking

De huidige studie onderzocht aangeboren en adaptieve immuun-cellen op 0 en 6 maand om longitudinale veranderingen te bekijken bij patiënten met matige en ernstige CVS/ME. Patiënten met ernstige CVS/ME vertoonden significante verschillen qua NK-cel receptoren met verloop van tijd in vergelijking met controles en patiënten met matige CVS/ME. Op 6 maand vertoonden patiënten met ernstige CVS/ME ook significante wijzigingen qua iNKT-cel fenotypes, CD8+ T-cel merkers, NK-cel receptoren en γδ T-cellen vergeleken met de controles en/of patiënten met matige CVS/ME.

Onze studie toonde immunologische variatie met verloop van tijd aangezien de groepen verschillen tussen 0 en 6 maand. iNKT-cellen werden eerder nog niet onderzocht bij CVS/ME en de huidige studie vond dat de expressie van CD62L significant was verhoogd bij patiënten met matige CVS/ME tussen 0 en 6 maand. De funktie van CD62L in iNKT-cellen is niet gekend, hoewel dit variatie in iNKT-cel merkers of adhesie met verloop van tijd bij CVS/ME kan suggereren. De CD56bright NK-cel subset varieerde ook tussen de groepen met verloop van tijd, bijzonderlijk bij ernstige CVS/ME. CD56brightCD16dim NK-cellen die KIR3DL1/DL2 tot expressie brengen, en CD56brightCD16+ NK-cellen die KIR2DS4 en KIR2DL2/DL3 tot expressie brengen, waren significant verhoogd na 6 maand bij controles en patiënten met matige CVS/ME, terwijl patiënten met ernstige CVS/ME significant verhoogde CD56brightCD16+ NK-cellen, die de KIR2DL1 receptor tot expressie brengen, hadden na 6 maand. Deze research toonde veranderingen qua NK-receptoren met verloop van tijd, in het bijzonder in CD56bright NK-cellen. CD56bright NK-cellen beslaan ca. 10 % van de totale perifere NK-cellen en zijn de voornaamste producenten van NK-cel cytokinen, vooral IFN-γ, TNF-β, macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF), IL-10 & IL-13 tijdens een aangeboren immuun-respons. Eerder werd getoond dat perifere warden van IL-10 en IFN-γ significant verhoogd waren en longitudinale analyse toonde dat het CD56brightCD16 NK-cel fenotype verlaagd was bij CVS/ME-patiënten met verloop van tijd. De huidige studie suggereert mogelijk dat de wijzigingen qua CD56bright NK-cel subsets de cytokine-produktie bij CVS/ME met verloop van tijd zouden kunnen beïnvloeden. Onevenwichten tussen pro-inflammatoire cytokinen of cytokine-inhibitoren zouden een rol kunnen spelen bij de initiatie van een aantal ziekten, vooral Th1/Th2 cytokine verschuivingen die werden aangewend om de pathogenese van immunologische ziekte te verklaren.

NK-cel receptoren zijn vooral belangrijk bij CVS/ME aangezien verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit één van de meest consistente merkers van de ziekte is [zie o.a. Huth T, Brenu E et al. Characterization of natural killer cell phenotypes in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 2]. NK-cel cytotoxische aktiviteit kan worden gereguleerd via NKG2D, dat een aktiverende receptor is die eerder significant verhoogd bleek bij CVS/ME-patiënten gedefinieerd via de ‘International Consensus Criteria’, in vergelijking met CVS/ME-patiënten gedefinieerd via de 1994 Fukuda definitie. CD94 is een NK-receptor die afhankelijk is van NKG2 proteïne associatie en ook significant verhoogd bleek bij CD56dimCD16 NK-cellen van CVS/ME-patiënten. Onze studie vond significant gedaalde NKG2D-expressie bij CD56brightCD16dim NK-cellen bij ernstige CVS/ME t.o.v. patiënten met matige CVS/ME op maand 6. Gereduceerd NKG2D kan daarom geassocieerd zijn met de verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit die eerder werd getoond bij ernstige CVS/ME in vergelijking met patiënten met matige CVS/ME. Eerdere research suggereerde ook dat verstoring van de NK-cel cytolytische werking gedeeltelijk kan worden veroorzaakt door verminderde aktiverende NK-cel receptoren, zoals NKG2D [onderzoek niet bij M.E.(cvs)].

KIR2DL2/DL3 is een inhiberende receptor die eerder gereduceerd bleek bij patiënten met ernstige CVS/ME t.o.v. patiënten met matige CVS/ME. De huidige studie ondersteunt eerdere bevindingen waarbij KIR2DL2/DL3-expressie in CD56dimCD16 NK-cellen bij ernstige CVS/ME wederom significant verminderd was in vergelijking met controles. Deze reductie van de inhiberende receptor bij CVS/ME-patiënten kan een gevolg zijn van een grotere regulerende respons op de verminderde NK-cel cytotoxische aktiviteit die werd aangetoond bij de ziekte, in het bijzonder aangezien CD56dim NK-cellen zeer cytotoxisch zijn.

Significant verhoogde aantallen naïeve CD8+ T-cellen bij patiënten met ernstige CVS/ME op maand 6 van deze research kunnen het vermogen bevorderen van deze ernstig aangetaste patiënten om een immuun-respons tegen nieuwe antigenen te ontwikkelen en de vatbaarheid voor infekties te verlagen. CD8+ T-cellen zijn ook verantwoordelijk voor cytotoxische aktiviteiten en bleken eerder een significant verminderde aktiviteit te vertonen bij CVS/ME-patiënten. In tegenstelling daarmee bleken CVS/ME-patiënten eerder geassocieerd met CD8+ T-cel immuun-aktivatie, een gedaald niveau qua CD8+ suppressor T-cellen en een verhoging qua in CD8+ cytotoxische T-cellen. Daarom valideert de huidige studie eerdere research waar significant versterkte CD8+ T-cel aktivatie en CD8+ T-cel aantallen werden gevonden bij CVS/ME-patiënten.

Er is weinig research aangaande iNKT-cellen bij CVS/ME-patiënten, hoewel één studie significant gestegen aantallen iNKT-cellen heeft getoond bij ernstige CVS/ME; verminderde CD8CD4, CD8aCD4 fenotypes bij patiënten met matige CVS/ME, verhoogde CD56CD16 en CCR7 [C-C chemokine receptor type-7] SLAM [‘signalling lymphocyte activation molecule’, immuun-cel receptoren] fenotypes bij ernstige CVS/ME t.o.v. patiënten met matige CVS/ME en controles. De huidige studie vond wederom significant verhoogde iNKT-cellen die CD56CD16 tot expressie brengen bij patiënten met ernstige CVS/ME op maand 6. De funktie van CD56 en CD16 op iNKT-cellen is niet bekend maar gewijzigde expressie van deze merkers op NK-cel fenotypes wordt echter dikwijls aangetoond bij CVS/ME-patiënten. De CD8CD4 subset van iNKT-cellen is hoofdzakelijk verantwoordelijk voor cytotoxische aktiviteiten en bleek eerder gereduceerd bij patiënten met matige CVS/ME. De huidige studie heeft een significante toename qua CD8CD4 iNKT-cellen getoond bij ernstige CVS/ME, wat een mogelijk regulerend mechanisme suggereert waarbij cytotoxische aktiviteiten versterkt kunnen zijn in iNKT-cellen, aangezien een regulerende respons op de verminderde cytotoxische aktiviteit consistent werd gedocumenteerd bij NK-cellen en CD8+ T-cellen van CVS/ME-patiënten.

De huidige studie vond significant verhoogde globale aantallen γδ2 T-cellen bij ernstige CVS/ME op maand 6. Aangezien γδ T-cellen ‘schildwacht’-cellen zijn met cytotoxische eigenschappen, kan dit een aktivatie zoals een immuun-respons op bakteriële infektie, wond-herstel, antigen-presentatie of immunoregulering suggereren. Significant verhoogde aantallen effector geheugen en CD45RA+ effector geheugen γδ2 T-cellen bij ernstige CVS/ME suggereren dat ze een groter potentieel voor cytotoxische aktiviteit, ‘tissue-homing’ [adhesie van circulerende lymfocyten op gespecialiseerde cellen d.m.v. diverse weefsel-specifieke adhesie-molekulen] en doelwit-herkenning hebben. Effector geheugen fenotypes van γδ T-cellen belichten NK-achtige funkties, het detekteren van ‘major histocompatibility complex’ (MHC) expressie en het ondergaan van cytotoxische aktivitieiten volgende op cytokine-gedirigeerde proliferatie en regulerende mechanismen. Interessant is dat effector geheugen én CD45RA+ effector geheugen T-cel fenotypes preferentieel gemobiliseerd worden tijdens adrenerge stimulatie, wat suggereert dat immuun-responsen bij ernstige CVS/ME kunnen worden versterkt op een gelijkaardige manier als bij een situatie met psychologische stress. Er kan mogelijks een homeostatisch mechanisme plaatsvinden bij ernstige CVS/ME, die leidt tot hogere immuun-aktivatie, gelijkaardig met wat ook werd aangetoond in CD8+ T-cellen en Tregs bij CVS/ME.

CD94CD11a expressie was significant gereduceerd bij ernstige CVS/ME in γδ1 T-cellen en significant verhoogd bij ernstige CVS/ME in γδ2 T-cellen. CD94 is een molekule op het cel-oppervlak met NK-achtige capaciteiten, belangrijk bij MHC-expressie detektie en hoge cytotoxische aktiviteiten, terwijl CD11a een adhesie-molekule is die migratie naar inflammatoire sites helpt. γδ2 T-cellen die CD94CD11a+ tot expressie brengen, waren ook significant verhoogd bij ernstige CVS/ME, wat suggereert dat de meerderheid van de γδ T-cellen bij deze patiënten verbeterde adhesie en migratie naar inflammatie-sites kunnen vertonen. γδ1 en γδ2 T-cellen vertoonden ook variatie qua CD62LCD11a expressie, aangezien patiënten met ernstige CVS/ME significant verminderde CD62L+CD11a γδ1 T-cellen vertoonden alsook significant gedaalde CD62L+CD11a γδ2 T-cellen. CD62L+CD11a+ expressie was gestegen in γδ2 T-cellen bij ernstige CVS/ME, wat weerom mogelijks kan suggereren dat patiënten met ernstige CVS/ME een versterkte immuun-aktivatie hebben en een verhoogd adhesief en migratorisch vermogen kunnen hebben in vergelijking met patiënten met matige CVS/ME en controles. De alternatieve expressie van deze merkers in γδ1 en γδ2 T-cellen kan het resultaat zijn van verschillen qua γδ T cel fenotypes – γδ1 T-cellen zijn voornamelijk aanwezig in epitheliale weefsels met lage waarden in het bloed en γδ2 T-cellen vertegenwoordigen de meeste van de circulerende γδ T-cellen.

Besluiten

Dit onderzoek was het eerste om aangeboren en adaptieve immuun-cellen te bepalen met verloop van tijd bij patiënten met matige en ernstige CVS/ME. Patiënten met ernstige CVS/ME vertoonden significant gewijzigde NK-cel receptoren met verloop van tijd t.o.v. patiënten met matige CVS/ME en controles. Patiënten met ernstige CVS/ME vertoonden ook significante veranderingen qua expressie in iNKT-cel fenotypes, CD8+ T-cel merkers, NK-cel receptoren en γδ T-cellen t.o.v. controles en patiënten met matige CVS/ME op maand 6. Deze research benadrukte het belang van het longitudinaal bepalen bij variërende ernst-graden qua CVS/ME om de variatie que ziekte-graad en samenhang van potentiële immuun-abnormaliteiten die werden aangetoond verder te onderzoeken. Dit onderzoek kan ook bijdragen tot het verder begrijpen van CVS/ME en mogelijks bijdragen tot het vinden van een diagnostische test gebaseerd op afzonderlijke immunologische merkers.

————————-

In een daaropvolgend artikel (‘Pilot Study of Natural Killer Cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis’ in Scand J Immunol. 2015) rapporteert deze groep researchers “Co-expressie van CD57 en perforine was significant verhoogd op CD56dimCD16+ NK-cellen van CVS/ME-patiënten vergeleken met MS en niet-vermoeide controles. De resultaten van deze piloot-studie suggereren dat NK-cellen van CVS/ME- en MS-patiënten verhoogde differentiatie kunnen hebben ondergaan in respons op externe stimuli, die verschillende mechanismen in het NK-cel cytotoxische aktiviteit mechanisme hebben kunnen beïnvloed.”.

mei 29, 2015

SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:31 am
Tags: , , , , ,

We rapporteerden op deze pagina’s al meermaals over de mogelijke impact bij M.E.(cvs) van zgn. SNPs in bepaalde genen. Zie onder meer ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’.

TRP-kanalen zijn ion-kanalen die cellen triggeren om te reageren op veranderingen in hun omgeving; deze kunnen worden veroorzaakt door pathogenen, oxidatieve stress, chemische stoffen, toxinen en gewijzigde zuurtegraad. In ‘Sensory TRP channels: the key transducers of nociception and pain’ (Prog Mol Biol Transl Sci. (2015)131: 73-118) lezen we: “Bij de perifere detektie van nociceptieve en pijnlijke stimuli door sensorische neuronen is een ingewikkeld repertoire van molekulaire detektoren en transducers betrokken op bepaalde zenuw-vezels. De meerderheid van die detektoren/transducers behoort tot de ‘transient receptor potential’ (TRP) familie.”. TRPs zijn bij meerdere ziekten verstoord. Het is dus mogelijk dat bepaalde variaties (SNPs) in de genen coderend voor TRP ion-kanalen geassocieerd zijn met M.E.(cvs).

De Australische researchers die onderstaand artikel publiceerden vonden dat de frequentie van 13 SNPs significant verschilde tussen M.E.(cvs) en controles. 9 daarvan lagen in het TRPM3 gen, 2 in het TRPA1 gen en 2 in het TRPC4 gen. De resultaten zijn nog preliminair maar ze geven aan dat genetische wijzigingen in TRP ion-kanalen (receptoren van belangrijke signalisering-mechanismen betrokken bij de werking van cellen en het immuunsysteem, en het reageren op bedreigingen) een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling of het doen voortduren van M.E.(cvs).

De meldingen van SNPs bij M.E.(cvs) kunnen worden omschreven als ‘hypothese-genererend’. De vondsten kunnen worden voor het nader onderzoeken van specifieke gebieden van het genoom. Het is wel waarschijnlijk dat een complexe chronische ziekte zoals M.E.(cvs) het resultaat is van een groot aantal SNP-varianten die samen zorgen voor stoornissen.

Zie verder o.a. ook ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’, ‘Variaties in Pijn-perceptie zijn Genetisch bepaald’ en ‘Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is’.

————————-

Immunology and Immunogenetics Insights Vol 7, pp 1-6 (2015)

Examination of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Transient Receptor Potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients

Sonya M. Marshall-Gradisnik (1,2,*), Peter Smith (2), Ekua W. Brenu (1,2), Bernd Nilius (3), Sandra B. Ramos (1,2) & Donald R. Staines (2)

1 School of Medical Science

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, Australia

3 Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Ion Channel Research, KU Leuven, Belgium

Samenvatting

Achtergrond. De ‘transient receptor potential’ (TRP) super-familie omvat bij mensen 27 kation-kanalen met doorlaatbaarheid voor monovalente en divalente kationen [één- of twee-waardig positief geladen ionen]. Deze kanalen komen bij mensen op vele cellen en weefsels tot expressie en ze hebben significante sensorische en regulerende rollen bij de meeste fysiologische funkties. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen.

Doelstellingen. Het doel van deze studie was om de rol te bepalen van TRPs bij CVS.

Methodes. De studie omvatte 115 CVS-patiënten […] en 90 niet-vermoeide controles […]. De CVS-patiënten werden gedefinieerd volgens de 1994 CDC criteria voor CVS. Er werden in het totaal 240 ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNPs) bij 21 TRP ion-kanaal genen (TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5 & TRPV6) bepaald. […]

Resultaten. Er waren 13 SNPs significant geassocieerd met CVS vergeleken met de controles. Daarvan waren er 9 SNPs geassocieerd met TRPM3 […], terwijl de rest was geassocieerd met TRPA1 […] en TRPC4 […].

Besluit. De gegevens van deze piloot-studie suggereren een associatie tussen TRP ion-kanalen – voornamelijk TRPM3 – en CVS. Deze en andere TRPs kunnen bijdragen tot de etiologie en het pathomechanisme van CVS.

Inleiding

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen zijn kation-kanalen met een vermeende rol bij vele fysiologische signalisering-mechanismen. Bij zoogdieren omvatten TRPs 6 groepen: TRPA (ankyrine), TRPC (kanoniek), TRPM (melastatine), TRPML (mucolipine), TRPP (polycystine) en TRPV (vanilloïd). In het algemeen zijn de TRPC-kanalen niet-selektieve kation-kanalen; slechts 2 zijn zeer doorlaatbare Ca2+-kanalen en 2 zijn ondoorlaatbaar voor Ca2+. Belangrijk is dat meerdere TRPs doorlaatbaar zijn voor Mg2+ en Zn2+. TRPs komen uitgebreid tot expressie op bijna alle cellen en hebben daarom waarschijnlijk significante effekten op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, inclusief chronische pijn, over-aktieve blaas, diabetes, chronische obstructieve long-ziekte, cardiale hypertrofie [verdikking hartwand], familiale Alzheimer’s, huid-ziekten, skeletale dysplasiën [misvormingen van bot/kraakbeen], motor-neuropathieën, neurosensorische neuropathieën inclusief de ziekte van Charcot-Marie-Tooth [verzamelnaam voor een aantal erfelijke ziekten waarbij de zenuwen zijn aangetast] (type 2C) en kanker. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd na schommelingen of afwijkingen in de cellulaire omgeving. Factoren die deze veranderingen kunnen beïnvloeden zijn stressoren zoals pathogenen, temperatuur, druk, chemische stoffen, oxidatie/reductie, toxine, osmolariteit en pH.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen. Research suggereert significante immuun-stoornissen; het mechanisme van deze aandoening dient echter nog te worden bepaald. CVS-patiënten kunnen reakties vertonen op een aantal omgeving- en biologische factoren. Bovendien is er bewijs dat suggereert dat CVS een allergische component zou kunnen hebben. Atypische TRP-expressie werd gerapporteerd bij CVS; in het bijzonder upregulering van de expressie van TRPV1. [Light AR, Bateman L, Jo D et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia syndrome. J Intern Med. (2012) 271: 64-81; zie Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM] Aangezien TRPs een overvloed aan fysiologische signalisering-mechanismen reguleren, zouden ze een rol kunnen spelen bij CVS. Een aantal channelopathieën [ziekten veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanalen; zie o.a. ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS] bleken geassocieerd met TRP-genen en die hebben gevolgen voor de cellulaire funktie. Daarnaast kunnen TRP-kanalen een doelwit zijn tijdens inflammatoire reakties, aangezien ze makkelijk geaktiveerd worden in aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen. Daarnaast rapporteren CVS-patiënten een significante sensitiviteit voor toxinen en irriterende stoffen uit de omgeving, maar de oorzaken van deze gevoeligheden dienen nog te worden uitgeklaard. Het doel van deze piloot-studie was om te bepalen of polymorfismen in SNPs geassocieerd met TRP ion-kanaal genen een bijdragende factor zijn in de pathogenese van CVS.

Methodologie

Deelnemers. Er werden 115 CVS-patiënten en 90 niet-vermoeide controles gerecruteerd voor deze studie. Van de 115 CVS-patiënten (leeftijd 48,68 ± 1,06 jaar), waren er 84 (73,04%) vrouwen en 31 (26,96%) mannen. De 90 niet-vermoeide controles (leeftijd = 46,48 ± 1,22 jaar) omvatten 59 (65,56%) vrouwen en 31 (34,44%) mannen. De CVS-patiënten warden gedefinieerd volgens de 1994 criteria van het ‘Centre for Disease Prevention and Control’ (CDC) voor CVS. Alle deelnemers waren van Europese afkomst en inwoners van Australië […].

DNA-extractie. […]

SNP-genotypering. […]

Statistische analyse. […]

Resultaten

SNP associatie studies. Van de 240 SNPs die hier werden onderzocht, warden er 233 succesvol geïdentificeerd in beide groepen. 13 bleken significant geassocieerd met CVS. 9 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3 (rs12682832; P ≤ 0.003, rs11142508; P ≤ 0.004, rs1160742; P ≤ 0.08, rs4454352; P ≤ 0.013, rs1328153; P ≤ 0.013, rs3763619; P ≤ 0.014, rs7865858; P ≤ 0.021, rs1504401; P ≤ 0041, rs10115622; P ≤ 0.050), terwijl de overblijvende SNPs geassocieerd waren met TRPA1 (rs2383844; P ≤ 0.040, rs4738202; P ≤ 0.018) en TRPC4 (rs6650469; P ≤ 0.016, rs655207; P ≤ 0.018).

Bespreking

Het doel van deze piloot-studie was om de aanwezigheid te bepalen van mogelijke SNP-variaties bij CVS-patiënten, met een specifieke focus op SNPs in de coderende sequenties van 21 TRP ion-kanaal genen. Van de 240 onderzochte SNPs, bleken 13 allelen significant geassocieerd met CVS-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Aangezien CVS een heterogene aandoening is, is het waarschijnlijk dat verdere stratificatie van patiënten meer allel-associaties zou kunnen aantonen. Deze allelen waren gelegen in de gen-sequentie van één van de kanonieke TRP ion-kanalen (TRPC4), één ankyrine (TRPA1) en één melastatine TRP ion-kanaal (TRPM3).

SNPs die in een coderende sequentie zijn gelegen veranderen de amionozuur-sequentie van het geproduceerde proteïne al dan niet noodzakelijkerwijs. Een SNP dat de polypeptide-sequentie niet wijzigt, draagt de term ‘synoniem’ (soms een ‘stille variant’ genoemd), terwijl naar een SNP dat resulteert in een verschillende polypeptide-sequentie wordt verwezen als ‘niet-synoniem’ (mogelijks resulterend in gewijzigde gen-transcripten en ziekte-fenotypes). In dit onderzoek rapporteren we TRP SNP-anomalieën, suggererend dat ze de mogelijke aanvang of klinische presentatie van CVS kunnen mediëren; dit dient echter te worden bevestigd bij grotere groepen. Niettemin suggereert deze studie de mogelijke rol voor afwijkende TRPs bij CVS. Verdere uitleg, waarbij wordt aangetoond dat TRPs significante fysiologische rollen spelen, wordt hieronder verstrekt. In het bijzonder: CVS-patiënten rapporteren symptomen die geassocieerd zouden kunnen zijn met afwijkende TRP-funktie.

TRPC4 wordt geaktiveerd via receptor-afhankelijke aktivatie van het Gq/11/PLC (fosfolipase-C)/γ mechanisme maar ook via Gαi proteïnen, PI(4,5)P2 proteïnen en ook intracellulair Ca2+. Het is voornamelijk betrokken bij vasomotor-funktie [vaat-verwijding en -samentrekking], aggregatie van bloedplaatjes en werking van gladde spieren. Ca2+ staat ook bekend vereist te zijn voor de regulering van immuun-cellen, aangezien het werkt als een tweede boodschapper [na aktivatie van G-proteïne gebonden receptoren ontstaan er intracellulair zogenaamde ‘second messengers’ die, na een aantal biochemische tussenstappen, zorgen voor het uiteindelijk fysiologisch effekt] voor de meeste cellen, bijzonderlijk T- en B-cellen. Intracellulair Ca2+ verhoogt wanneer lymfocyt-receptoren worden blootgesteld aan antigenen. Bij CVS-patiënten zijn er talrijke meldingen over gecompromitteerde immuun-funktie, maar er is slechts beperkte informatie over de rol van Ca2+ bij deze patiënten. Ontregeling van TRPCs kan echter de intracellulaire calcium-concentratie beïnvloeden en desgevallend de lymfocyten-funktie. Lymfocyten zoals ‘Natural Killer’ (NK) cellen en T-cellen bleken gecompromitteerd bij CVS. In NK-cellen versterkt Ca2+ de cytotoxische aktiviteit, en de uitputting of overmatige toevloed ervan kan ernstige gevolgen hebben op de werking van NK-cellen. Bij CVS werd verminderde cytotoxische aktiviteit consistent gerapporteerd [Brenu EW, Huth TK, Hardcastle SL et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-242 = ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Ashton KJ, van Driel M et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269 = ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88 /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 = ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Staines DR, Baskurt OK et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8: 1 = ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ /// Barker E, Fujimura SF, Fadem MB, Landay AL, Levy JA. Immunologic abnormalities associated with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis. (1994) 18: S136-S141] en dit zou verband kunnen hebben met de ontregeling van Ca2+.

Ontregeling van TRPCs kan neuronale responsen beïnvloeden, in het bijzonder deze die geassocieerd zijn met de stimulatie van muscarine receptoren [werken als belangrijkste eind-receptor gestimuleerd door acetylcholine in het parasympathisch zenuwstelsel]. Na aktivatie van TRPCs door fosfolipase-C, treedt een influx van Ca2+ op, wat een inductie in muscarine receptoren veroorzaakt en onophoudelijk neuronaal ‘vuren’ [‘overbrengen van signalen’] onderhoudt. Secretie van Ca2+ en de beschikbaarheid van TRPCs in het neuronaal milieu zijn daarom van uiterst belang voor de optimale werking van muscarine receptoren en de globale werking van de hersenen. Belangrijk: dit proces is essentieel voor het geheugen, de aandacht, sensorische scherpte, emotie, pijn en motor-controle, en gebeurt in de amygdala, entorhinale cortex [bepaald deel van de hersenschors; o.a. van belang bij het geheugen], hippocampus en pre-frontale cortex. Neuronale gebreken met betrekking tot het geheugen en de aandacht werden geïdentificeerd bij CVS. [o.a. Nakatomi Y, Mizuno K, Ishii A et al. Neuroinflammation in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an 11C-(R)-PK11195 PET Study. J Nucl Med. (2014) 55: 945-950; zie ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie] Het gebrek/fouten aan TRPC4 kunnen ook de darm-funkie beïnvloeden. TRPC4 en TRPC6 vormen een paar met muscarine receptoren in de darm, wat depolarisatie van gladde spieren, toevloed van of Ca2+ en contractie van gladde spieren aktiveert. Intestinale dysfunktie is een component van CVS [Lakhan SE, Kirchgessner A. Gut inflammation in Chronic Fatigue Syndrome. Nutr Metab. (2010) 7: 79]; de mate van beschadiging aan de darm-wand of de exacte rol van ion-kanalen in de darm dient echter te worden bepaald. TRPC4 zou simultaan geregeld kunnen worden door G-proteïne gekoppelde receptoren [GPCRs; signaaloverdracht via een trans-membranair systeem, de G-eiwit receptor].

TRPA1 is een receptor voor meerdere chemische stoffen die werd geïdentificeerd op nociceptieve sensorische neuronen (C-vezels) en heeft een rol bij de regulering van de afgifte van neuropeptiden, pijn-sensatie en inflammatie. Het kan worden geaktiveerd door zowel exogene als endogene inflammatoire agentia, resulterend in inflammatie en pijn. GPCRs aktiveren ook TRPA1 via PLC-signalisering, waardoor het ion-kanaal wordt gesensitiseerd voor verscheidene stimuli. TRPA1 kan worden geaktiveerd en daaropvolgend geïnaktiveerd in aanwezigheid van intracellulaire en extracellulaire calcium-concentraties. Er werd voorgesteld dat het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli beïnvloedt; daarom zou bij CVS-patiënten met SNPs in het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli verhoogd kunnen zijn. In het centraal zenuwstelsel brengen astrocyten TRPA1-kanalen tot expressie en deze kanalen zijn nodig voor calcium-opname en neuronale regulering in de astrocyten. Veranderingen in qua calcium kunnen daarom de werking van astrocyten en communicatie tussen neuronen aantasten. Er werd aangetoond dat aktivatie van TRPA1 acute hoofdpijn kan induceren en dit zou kunnen gebeuren via het calcitonine-gen gerelateerd peptide [CGRP; het proteïne wordt geproduceerd door neuronen, is een krachtige vasodilator, kan tussenkomen bij pijn-transmissie], wat vasodilatie [vaat-verwijding] in de meningeale arterie [naar de hersenvliezen] kan veroorzaken. Belangrijk: hoofdpijn is een prominent symptoom van CVS. TRPA1 speelt ook een sleutelrol bij migraine, en neuropathische gewricht- en spier-pijn, die dikwijls wordt ervaren door patiënten met fibromyalgie. TRPA1 vormt funktionele hetero-tetrameren met TRPV1; daarom zouden variaties in het TRPA1 gen op funktionele gebreken aan TRPV1 kunnen wijzen, die misschien niet gerelateerd zijn aan een nucleotide-polymorfisme. Belangrijk ook is dat Spaanse onderzoekers rapporteerden dat TRPV1 bijdraagt tot de genetische voorbestemdheid voor migraine (grote studie bij 500 Spaanse deelnemers), wat suggereert dat TRPA1 en TRPV1 een rol kunnen spelen bij de symptoom-presentatie van CVS. Interessant is dat analgetica en anti-nociceptieve medicijnen gericht zijn op, respectievelijk, TRPV1 en TRPA1 om de pijn-sensatie te verlichten [tramadol, paracetamol cannabinoïden], en deze medicijnen worden routinematig voorgeschreven aan CVS-patiënten. Misschien zijn deze medicijnen bij CVS wel niet meer doeltreffend omwille van de stoornissen of variaties in deze ion-kanalen.

TRPM-kanalen zijn meestal doorlaatbaar voor magnesium en calcium. Enkel TRPM4 en TRPM5 zijn ondoorlaatbaar voor twee-waardige kationen. TRPM3 is doorlaatbaar voor kationen inclusief Ca2+ en Zn2+. Het doorlaatbaarheid-profiel hangt echter erg af van de tot expressie gebrachte variant. Er werd tot op heden geen erfelijke TRPM3 channelopathie beschreven. TRPM3 bleek betrokken bij inflammatoire pijn syndromen, Reumatoïde Arthritis en afgifte van pro-inflammatoire cytokinen. Aangezien pancreatische [insuline-producerende] β-cellen ook een groot aantal of TRPM3-kanalen dragen, bestaat de kans op verstoringen in de insuline/glucose-regulering bij CVS-patiënten. Metabole verstoring werd sinds lang geïdentificeerd als een kardinaal kenmerk van CVS. Bij mensen werd TRPM3 het meest gekarakteriseerd in het centraal zenuwstelsel en de ogen, waar een mis-sense mutatie [punt-mutatie waarbij een wijziging van één nucleotide resulteert in een ander aminozuur in het proteïne] van het TRPM3 gen ook ten grondslag bleek te liggen aan de ontwikkeling van katarakt en glaucoom. TRPM3 is betrokken bij de detektie van warmte en bij pijn-transmissie. TRPM3-deficiënte muizen vertonen duidelijke gebreken wat betreft hun vermijding-responsen ten aanzien van schadelijke warmte en bij de ontwikkeling van inflammatoire hitte hyper-algesie. Ontregeling van de thermoregulerende responsen werd gerapporteerd bij CVS-patiënten. Veralgemeende pijn is een kenmerk van CVS en treedt op in afwezigheid van weefsel-schade, en dit is suggestief voor mogelijke stoornissen van het centraal zenuwstelsel. [Meeus M, Nijs J. Central sensitization: a biopsychosocial explanation for chronic widespread pain in patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome. Clin Rheumatol. (2007) 26: 465-473; zie ook ‘Centrale sensitisatie & pijn-behandeling] Aangezien TRPM3 een rol speelt bij nociceptie en thermoregulering, zou het van belang kunnen zijn bij het pathomechansime van CVS. Daarnaast wordt TRPM3 geaktiveerd door pregnenolon-sulfaat [pregnenolon = een endogeen steroïd-hormoon, de voorloper van progestogenen, mineralo- en gluco-corticoïden, androgenen, oestrogenen en neuro-aktieve steroïden], wat suggereert dat het neuro-endocriene effekten heeft en het zou ook betrokken kunnen zijn bij de regulering van glutamaterge signalisering [via de neurotranimitter glumataat] in de hersenen.

Deze preliminaire bevindingen impliceren TRP ion-kanalen bij de etiologie en het pathomechanisme van CVS. Ontregeling van TRPs, inclusief de TRPM3-familie, is waarschijnlijk betrokken bij het vatbaar maken van CVS-patiënten voor stoornissen in het calcium-metabolisme en loopt evenwijdig met de symptoom-presentatie. Mogelijks zullen de ontregelde influx van calcium-ionen in de cellen een impact hebben op een aantal vitale componenten van de cel-regulerende machinerie. Deze componenten omvatten calcium-gevoelige adenylaat-cyclasen [ACs; enzymen van belang bij het energie-metabolisme] en dus cAMP-expressie en -funktie [cyclisch AMP; een signalisering-molekule]. Zo zouden bv. geïsoleerde cel-types, waarvan werd aangetoond dat ze calcium-sensitieve cel-regulerende mechanismen vertonen bij CVS-patiënten, voor verdere opheldering van TRP ion-kanalen en de waarschijnlijke gevolgen bij CVS kunnen zorgen. Bovendien dienen bevolking-analyse van TRP-SNPs wat betreft vatbaarheid voor CVS, alsook onderzoek van de voorgestelde subtypes, te worden overwogen. Dit zal waarschijnlijk van aanzienlijk belang blijken voor de publieke gezondheid, alsook voor researchers bij het bepalen van de rol van TRP ion-kanalen bij de CVS-symptomatologie, -ernst en -voorbestemdheid.

december 28, 2014

Stress verandert expressie & methylatie van perforine bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Uit ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS’ onthielden we dat er een toegenomen aanwezigheid is van differentieel gemethyleerde genen gerelateerd aan de immuun-respons, het cellulair metabolisme en kinase-aktiviteit. Genen geassocieerd met immuun-cel regulering, de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde mechanismen, vertoonden hypo-methylatie in promoters en andere gen-regulerende elementen bij M.E.(cvs). Epigenetische modificaties, zoals DNA-methylatie, die voornamelijk voorkomen op de cytosines van CpG dinucleotide sites (CpG) doorheen het genoom, zouden gen-expressie kunnen reguleren zonder de onderliggende gen-sequentie te wijzigen en optreden door genetische en milieu-factoren.

De onderzoek-groep van het CDC die onderstaande studie uitvoerde had blijkbaar eerder al bevindingen in die richting gedaan, meer bepaald dat er een link zou kunnen zijn tussen epigenetica (voor wat meer algemene achtergrond, zie ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’) en de dysfunkties qua ‘natural killer’ cellen. De resultaten werden echter pas een jaar na publicatie aan het algemeen publiek bekend gemaakt…

Bij het aanvallen van cellen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen komt ook het enzyme perforine vrij; dat porieën boort in het celmembraan. De porie-achtige strukturen vergemakkelijken de toegang van granzymen in de target-cel en deze aktiveren meerdere apoptose (geprogrammeerde cel-dood) -mechanismen die het effektief doden van de target-cel verzekeren. Perforine en granzymen bleken verminderd in NK- én CD8+T-cellen bij M.E.(cvs).

Lees hier meer over de verminderde funktie van NK-cellen bij M.E.(cvs) en de mogelijke rol van een daling qua perforine-gehalte in de pathogenese van CVS: ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS? & Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS.

In het stuk ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ wordt gemeld dat basale expressie-niveaus van perforine significant verhoogd bleken bij M.E.(cvs) in vergelijking met de controle-populatie. Uit de studie hieronder komt naar voor dat PRF1-expressie significant lager is bij M.E.(cvs)-individuen dan bij niet vermoeide-controles onmiddellijk na een psychosociale belasting. Bij het CDC wordt stress nogal snel gelimiteerd tot psychologische stress. Ook inspanning is een stress en wij vragen ons dan ook af hoe de resultaten zouden zijn mocht men dergelijke metingen doen na een inspanningtest…

————————-

Genet Epigenet. (2013) 5: 1-9

Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome

Virginia R. Falkenberg, Toni Whistler, Janna R. Murray, Elizabeth R. Unger & Mangalathu S. Rajeevan

Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Samenvatting

Perforine (PRF1) is essentieel voor immuniteit-bewaking en er zijn studies die rapporteren over verminderd perforine bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een ziekte die mogelijk geassocieerd is met stress en/of infektie. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST) als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress en evalueerden het effekt op PRF1-expressie en methylatie bij CVS-patiënten (n = 34) vergeleken met NF (n = 47) controles. Tijdens de TSST bleken ‘natural killer’ (NK) cellen significant verhoogd bij CVS- (P ≤ 0.0001) en NF-individuen (P ≤ 0.0001). Anders dan bij eerdere rapporten, was er geen significant verschil qua PRF1-expressie bij baseline of tijdens TSST tussen CVS en NF. PRF1-expressie in vol-bloed verhoogde echter 1,6 maal tijdens de TSST bij CVS (P = 0.0003) en NF (P ≤ 0.0001). Verder was de piek-respons onmiddellijk na de TSST lager bij CVS vergeleken met NF (P = 0.04). Daarnaast was de PRF1-expressie 1,5 uur na de TSST verhoogd bij CVS in vergelijking met NF (vol-bloed: P = 0.06; PBMC: P = 0.02). Methylatie van 7 CpG-sites in het methylatie-gevoelige gebied van de PRF1-promoter varieerde tussen 38% en 79%, zonder significante verschillen tussen CVS en NF. Hoewel de gemiddelde baseline methylatie van alle 7 CpG-sites niet verschilde tussen de CVS- en de NF-groep, was er een significante negatieve correlatie met PRF1-expressie op alle TSST-tijdstippen bij zowel CVS (P ≤ 0.0001) en NF (P ≤ 0.0001). Bij de deelnemers met een hoge gemiddelde methylatie (≥ 65%), was de PRF1-expressie significant lager bij CVS-individuen dan NF-controles onmiddellijk na TSST. Deze bevindingen suggereren dat methylatie mogelijks een belangrijke epigenetische determinant is voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie, en dat de verschillen qua PRF1-expressie en methylatie tussen CVS en NF bij de acute stress-respons verder onderzoek vereisen.

Inleiding

Stress, zowel lichamelijk of psychosociaal, leidt tot aktivatie van de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPA) as en de afgifte van cortisol. Studies bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) identificeerden een verminderde cortisol-respons bij ontwaken die voortkomt uit glucocorticoïden-resistentie, hypersensitiviteit voor de negatieve feedback werking van cortisol of gewijzigde serotonerge aktivatie van de hypothalamus. Naast deze HPA-as bevindingen werden bij CVS veranderingen qua immuun-funktie gedocumenteerd. Deze omvatten een verschuiving van Th1- naar Th2-type T-cel responsen [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason LA, Maher K, Fletcher MA. Evidence for T-helper 2 shift and association with illness parameters in Chronic Fatigue Syndrome. Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33] en gereduceerde cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) en CD8+ cytotoxische T-cellen [Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9:81 – zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Stress kan het immuunsysteem beïnvloeden via zijn interakties met de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel (SZS). Er werd verhoogde SZS-aktiviteit aangetoond bij CVS en dit zou de gereduceerde cytotoxiciteit kunnen beïnvloeden door het onderdrukken van Th1 en versterken van Th2 T-cel responsen, resulterend in gereduceerde cytotoxiciteit aktiviteit bij mensen en muizen. Perforine is een porie-vormend proteïne dat samenwerkt met granzymes en caspases om apoptose in doelwit-cellen te induceren, en verminderde perforine-expressie of -werking resulteert in verminderde cytotoxiciteit van NK en CD8+ T-cellen. Aangezien perforine belangrijk is voor de cytolytische aktiviteit van NK en cytotoxische CD8+ T-cellen, zou stress-regulering van het immuunsysteem gedeeltelijk gemedieerd kunnen worden via perforine. Studies door 3 verschillende groepen identificeerden verminderd perforine bij CVS-individuen. Een daling (maal 8) van perforine (PRF1) boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd geïdentificeerd via ‘differential display’ Polymerase Ketting Reaktie (PCR) [techniek om veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau te vergelijken en identificeren]. Verminderde werking of expressie van PRF1 bij CVS-patiënten werd herhaaldelijk aangetoond; in het algemeen is verminderd intracellulair perforine-proteïne gecorreleerd met PRF1 mRNA downregulering, hoewel één studie vond dat gereduceerde cytotoxiciteit voorkwam bij toegenomen PRF1 mRNA expressie. Studies geven aan dat methylatie een rol speelt bij de regulering van PRF1-expressie. Hypo-methylatie van de PRF1-promoter, bijzonderlijk in het methylatie-gevoelige gebied (MSR), bleek geassocieerd met verhoogde expressie van PRF1. In vitro testen toonden aan dat 70% van de totale PRF1 mRNA expressie zou kunnen gereduceerd zijn door methylatie van de 7 CpG-sites in het MSR. Daarenboven leidde behandeling van T-cellen met een methylatie-inhibitor, 5-azacytidine, tot verhoogde PRF1 mRNA expressie.

Stress-regulering van perforine werd nog niet direct onderzocht. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST), een erkende en gevalideerde methode om de stress-respons te bestuderen via aktivatie van het sympathisch zenuwstelsel en de HPA-as, als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress, en evalueerden het effekt ervan op PRF1-expressie en methylatie bij CVS (n = 34) in vergelijking met NF (n = 47) deelnemers.

Materialen & Methodes

Individuen

[…] Deze studie omvatte 81 individuen (34 CVS en 47 NF) uit een follow-up bevolking-studie naar CVS in Georgia (V.S.) die de TSST ondergingen als onderdeel van een 3-dagen durende studie […]. De CVS-gevallen voldeden aan de 1994 internationale research-definitie voor CVS (evaluatie d.m.v. gestandaardiseerde vragenlijsten, inclusief de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’, de ‘SF-36® Health Survey’ en de ‘CDC Symptom Inventory’. Er waren geen statistische verschillen tussen CVS en NF qua gemiddelde leeftijd (CVS: 45 ± 9 jaar, NF: 46 ± 9 jaar; P = 0.75), geslacht (CVS: 82% vrouwen, NF: 77% vrouwen; P = 0.53), ras (CVS: 76% Kaukasisch; NF: 85% Kaukasisch; P = 0.23) of BMI (CVS: 28 ± 5, NF: 26 ± 5; P = 0.075).

Trier sociale stress test

De TSST werd uitgevoerd om stress-geïnduceerde regulering van neuro-endocriene, autonome en immuun-responsen te bepalen. De TSST werd consistent op hetzelfde tijdstip van de dag gestart om een gelijkaardige diurnale [de dagelijkse cyclus volgende] respons voor alle deelnemers te verzekeren. De test bestaat uit een voorbereidende en anticipatie-fase (start om 1:15 pm) gevolgd door 10 min. spreken voor een publiek en een mentale rekenkundige test van 10 min. voor 3 getrainde staf-medewerkers (het TSST-panel, 1:30 pm tot 1:50 pm). Er werd een katheter voor bloedafname ingebracht om 7:30 am. Er werd bloed afgenomen voor micro-array analyse om 8:00 am en om 1:00 pm (baseline), alsook onmiddellijk vóór het TSST-panel om 1:30 pm, onmiddellijk ná het TSST-panel om 1:50 pm, en op opéénvolgende 15 minuten intervallen tot 3:05 pm. Er werd ook bloed afgenomen voor PBMC-isolatie om 10:00 am (3,5 uur vóór de TSST) en om 3:05 pm (1,5 uur ná de TSST). Er werden ook cel-tellingen gedaan.

DNA/RNA-extractie

Micro-array procedure

Kwantitatieve ‘reverse’ transcriptie PCR (qRT-PCR)

Kwantitative methylatie via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

Bioinformatische analyse van het PRF1 MSR [methylatie-gevoelige gebied]

Statistische analyse

Resultaten

Impact van TSST op bloedcel-tellingen en PRF1-expressie

Er was een significante toename in globaal percentage NK-cellen bij CVS- (P < 0.0001) en NF- (P < 0.0001) individuen tijdens de TSST, zonder significant verschil tussen de groepen. Ook de andere cel-type percentages (neutrofielen, T-cellen en B-cellen) verhoogden in respons op TSST en verschilden niet met betrekking tot ziekte-status (gegevens niet getoond).

Micro-array analyse van vol-bloed toonde een significante toename qua PRF1-expressie tussen de introductie/voorbereiding-fase en onmiddellijk vóór de TSST mondelinge presentatie (1:00 pm-1:30 pm) van ca. 1,6 maal in NF (P < 0.0001) en CVS (P = 0.0003). PRF1-expressie bleef stijgen bij NF-individuen tijdens de TSST mondelinge presentatie (1:30-1:50 pm) terwijl de expressie lichtjes daalde bij de CVS-individuen, resulterend in een significant verschil tussen NF- en CVS-individuen (P = 0.04) om 1:50 pm. Gedurende de 45 min. na de TSST, daalde de PRF1-expressie en keerde terug naar baseline waarden in beide groepen (om 2:35 pm). PRF1-expressie bij NF-individuen bleef afnemen maar nam toe bij CVS-individuen, resulterend in 1,3 maal hogere expressie bij CVS i.v.m. NF op dat moment (P = 0.06).

PRF1-expressie om 10:00 am en 3:05 pm in PBMCs – bepaald via qRT-PCR – was over het algemeen consistent met de resultaten van de vol-bloed micro-array. PRF1-expressie in PBMCs verschilde niet tussen CVS en NF om 10:00 am, maar om 3:05 pm was de PRF1-expressie hoger bij CVS dan NF (1,4 maal; P = 0.02).

Impact van TSST op PRF1-methylatie

Site-specifieke CpG-methylatie in het MSR om 10 am varieerde tussen 38% en 79%, en steeg op alle 7 CpG-sites met 2,1% tot 4% na de TSST (om 3:05 pm) voor de ganse studie-populatie (P < 0.0001 tot P = 0.01). Bij CVS-individuen was de toename qua methylatie na TSST echter significant voor slechts 2 CpG-sites, terwijl bij NF-controles de stijging significant was voor 4 CpG-sites. Er waren geen significante globale verschillen tussen CVS en NF in termen van site-specifiieke methylatie of gemiddelde methylatie voor alle 7 CpG-sites voor of na de TSST.

Impact van PRF1-methylatie op zijn expressie

Om te impact te onderzoeken van PRF1-methylatie op PRF1-expressie, bekeken we correlaties tussen gemiddelde methylatie van de 7 CpG-sites en gen-expressie voor elke deelnemer en tijdstip in vol-bloed en PBMCs. De gemiddelde baseline methylatie (10:00 am) was negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed op alle 8 tijdstippen in CVS en NF, statistisch significant voor alle tijdstippen uitgenomen één bij NF (2:35 pm). De gemiddelde methylatie om 3:05 pm was ook negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed om 3:05 pm bij NF- en CVS-individuen, hoewel de correlatie niet significant was bij CVS. Er werden gelijkaardige negatieve correlaties tussen PRF1-methylatie en PRF1-expressie in PBMCs geobserveerd bij NF- en CVS-individuen.

We gebruikten lineaire regressie om het verband te kwantificeren tussen PRF1 gemiddelde methylatie om 10:00 am en vol-bloed PRF1-expressie op alle tijdstippen. Bij CVS-individuen voorspelde deze analyse een stijging van 3% qua PRF1-expressie […] bij elke 1% toename van de PRF1-methylatie […]. Er werd een gelijkaardig omgekeerd verband gevonden bij NF-individuen, maar 31% en 14% van de variantie qua PRF1-expressie werd verklaard door PRF1-promoter methylatie bij CVS en NF, respectievelijk.

We gebruikten de mediane opsplitsing van het gemiddeld methylatie-niveau van de 7 CpG-sites om 10:00 am om de individuen te categoriseren met hoge (≥ 65%) en lage (< 65%) methylatie. Vol-bloed PRF1-expressie was significant hoger in de lage-methylatie groep op alle TSST tijdstippen (P-waarde van 0.0002 tot 0.05). Wanneer de groepen met hoge- of lage-methylatie werden gestratificeerd op basis van ziekte, werd enkel om 1:50 pm (onmiddellijk na TSST) een significant verschil opgemerkt tussen CVS en NF. De CVS hoge-methylatie groep had een significant lagere PRF1-expressie dan de NF hoge-methylatie groep (P = 0.005).

Bespreking

Deze studie toont aan dat acute psychosociale stress een impact heeft op PRF1 gen-expressie en dat PRF1-methylatie bijdraagt tot individuele verschillen qua PRF1-expressie. De PRF1-expressie steeg ca. 1,6 maal (t.o.v. baseline) in respons op TSST en dit niveau van verandering valt binnen de relatieve perforine-expressie verandering die wordt gezien bij andere paradigma’s. De piek PRF1-expressie in respons op TSST was echter verminderd bij CVS– t.o.v. NF-individuen (P = 0.04). NK-cellen namen af in respons op de TSST bij CVS en NF, en aangezien PRF1-expressie grotendeels beperkt blijft tot NK-cellen, is het waarschijnlijk dat de toegenomen expressie van PRF1 in respons op de TSST gerelateerd kan zijn met NK-cel aantallen. Aangezien we de heterogeniteit qua NK-cellen naar gelang hun ontwikkeling niet beschreven, kunnen we niet onderscheiden of alle NK-cellen of slechts een deel van de rijpe NK-cellen bijdroegen tot de PRF1-expressie na TSST. Verdere analyses gebruikmakend van aangerijkte NK-cellen zijn nodig ter evaluatie van de toename qua PRF1-expressie in termen van transcript-copieën/cel, en het verband met NK-cel heterogeniteit in respons op acute stress.

We vonden ondersteuning voor het feit dat methylatie een regulering-mechanisme van PRF1-expressie is, aangezien er een significante negatieve correlatie bestond tussen de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites in de PRF1-promoter en zijn expressie. We zagen dit verband op alle TSST-tijdstippen, wanneer de methylatie op een continue schaal werd uitgezet of gecategoriseerd op basis van alge of hoge status. Op basis hiervan is het mogelijk dat ontbreken van een significant verschil qua gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites tussen CVS en NF zou kunnen bijdragen tot het ontbreken van een verschil qua PRF1-expressie tussen CVS en NF in deze studie. Onze resultaten suggereren dat methylatie een belangrijke epigenetische determinant voor inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie zou kunnen zijn en zodoende dat de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites verantwoordelijk kan zijn voor de gerapporteerde discrepanties (stijging, daling of geen verandering) qua PRF1-expressie bij verschillende CVS-studies. Deze resultaten impliceren verder het belang van het meten van PRF1-methylatie én -expressie voor het begrijpen van de mechanismen van PRF1-expressie bij immuniteit-bewaking. Hoewel er geen verschil was qua methylatie-niveaus tussen CVS en NF, vertoonden deze groepen enkele verschillen wat betreft het verband tussen methylatie en expressie, onmiddellijk na TSST (1:50 pm) en op het laatste tijdstip na TSST (3:05 pm). Het lijkt er op dat om 1:50 pm (na de TSST), een subgroep CVS-individuen met hoge baseline methylatie (10:00 am) in het MSR bijdroeg tot de afgestompte respons qua PRF1-expressie in vergelijking met NF-individuen. Op het laatste tijdstip na de TSST (3:05 pm) wanneer PRF1-expressie significant steeg bij CVS (zowel vol-bloed als PBMCs), werd zijn negatieve relatie met methylatie op het dichtste tijdstip (3:05 pm) niet-significant. Een verklaring voor de ziekte-specifieke verschillen die werden gezien in deze studie blijkt ingewikkeld. We focusten ons op het verband tussen PRF1-promoter methylatie en mRNA, maar er zouden veel andere mechanismen kunnen betrokken zijn om de expressie van PRF1 te reguleren, inclusief een GRE [glucocorticoïd responsief element; korte DNA-sequentie in de promoter van een gen dat kan binden met de glucocorticoïd receptor] en de op IL-2 reagerende regulering van ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] in de PRF1-promoter. Er zijn ook mechanismen waarbij post-transcriptionele, post-translationele en circadiane regulering van PRF1 betrokken zijn, die kunnen bijdragen tot de differentiële expressie of aktiviteit.

Er zijn meerdere beperkingen bij deze studie. De grootte van de groep is beperkt, hoewel deze vergelijkbaar is met eerdere studies die gebruik maken van de TSST. De deelnemers aan de studie werden gescreend op medicatie en niemand gebruikte immunosuppressors. De impact van medicijnen op HPA-as responsiviteit, als er al één is, is echter onbekend. Hoewel statistisch significant, waren de geobserveerde verschillen (2.6%-6.8%) qua CpG-site specifieke methylatie in het MSR tussen pre- (10:00 am) en post- (3:05 pm) TSST stalen klein, mogelijks verstoord door de mengeling van cel-types aanwezig bij PBMCs. Het methylatie-profiel van het PRF1 MSR in deze studie (81 individuen) was verschillend van een eerdere studie (5 individuen), mogelijks omwille van een substantieel verschil tussen deze studies wat betreft het aantal stalen. Eén van de belangrijke vragen is echter of het klein percentage veranderingen qua methylatie dat werd gezien bij deze studie een belangrijk biologisch mechanisme voor de regulering van PRF1-expressie is. Enkele studies suggereren dat kleine wijzigingen qua DNA-methylatie (2%-10%) zich inderdaad kunnen vertalen naar veranderingen (1,5- tot 32 maal) qua gen-expressie. [geen studies bij M.E.(cvs)-patiënten maar bv. hartfalen] Hoewel deze gerapporteerde schattingen van de impact van DNA-methylatie op expressie aanzienlijk variëren afhankelijk van het gen, weefsel, milieu en statistische analyse, komt onze schatting van een 3% toename qua PRF1-expressie met elke 1% afname qua methylatie overéén met de schatting van de impact of FXN [gen coderend voor het mirochondriaal proteïne frataxine] -methylatie op zijn expressie. Deze resultaten ondersteunen de visie dat subtiele epigenetische wijzigingen de gen-expressie kunnen beïnvloeden in respons op de omgeving.

Besluit

We documenteerden een toename qua PRF1-expressie die evenwijdig loopt met een verhoging van NK-cellen in respons op acute psychosociale stress, waarbij patiënten met CVS een afgestompte respons vertoonden vergeleken met NF-controles. Deze afgestompte expressie bij CVS zou kunnen verband houden met de hoge baseline PRF1-promoter methylatie die een belangrijke epigenetische determinant bleek voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie. Er zijn verdere studies nodig om deze resultaten te bevestigen en verklaringen voor de geobserveerde PRF1-expressie dynamiek te evalueren. Het zal ook interessant zijn de signaal-transductie die resulteert in perifere influx van NK-cellen te onderzoeken, alsook PRF1-expressie en zijn funktionele rol in de context van acute stress, en de molekulaire mechanismen te identificeren die overéénkomen bij stress en infektie.

augustus 2, 2014

‘Heat-shock’ proteïne 60 herkenning bij M.E.

Filed under: Celbiologie — mewetenschap @ 1:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Op de 9e ‘Invest in M.E. International Conference’ over research naar M.E. (30 Mei 2014) besprak Jonas Blomberg (Hij was degene die rapporteerde dat er géén XMRV bij Zweedse M.E.-patiënten werd aangetroffen.) de mogelijkheid tot door infektie geïnduceerde auto-immuniteit bij M.E. Zijn lab gebruikt een techniek die hen in staat stelt honderden antilichamen ter zelfder tijd te bekijken. Auto-immuniteit kan het centraal zenuwstelsel en de perifere zenuwen beschadigen. Bij M.E. zouden er “post-translationele modificaties” (veranderingen in de eiwitten na de vertaling vanuit RNA) of kruis-reagerende microbiële proteïnen kunnen voorkomen. Er zijn aanwijzingen dat M.E.-patiënten een verstoorde mitochondriale werking vertonen, wat verband zou kunnen houden met de post-exertionele malaise en uitputting. Een slechter werkend energie-metabolisme zou te wijten kunnen zijn aan een blokkage door bepaalde antilichamen. Er zijn veel neurologische ziekten die een auto-immune basis hebben (bv. M.S.). Er zijn ook veel voorbeelden van post-infektueuze auto-immuniteit (Mycoplasma, Chlamydia, EBV, CMV, Toxoplasmose, Borrelia, enz. (Wij gaven hier al meermaals mee dat wellicht niet één enkele verwekker verantwoordelijk is voor M.E.). Volgens Blomberg is het “beter te kijken naar antilichamen, dan naar de microbe zelf”.

Onderstaand artikel van Blomberg en zijn collegas van de afdeling Klinische Microbiologie van het ‘Uppsala Academic Hospital’ (Zweden) in het prestigieus wetenschappelijk tijdschrift PLoS ONE maakt melding van het feit dat bij M.E.-patiënten antilichamen in hun bloed werden aangetroffen, die gericht zijn tegen een proteïne dat voorkomt in menselijke cellen en in bakterieën. Omdat gezonde mensen zelden of nooit dit soort antilichamen hebben, zouden hun resultaten de theorie ondersteunen dat M.E. minstens in sommige gevallen een zogenaamde auto-immune ziekte is die wordt getriggerd door een courante infektie.

In deze studie construeerden de researchers op een synthetische manier kleinere delen (peptiden, ketens van aminozuren) van een proteïne genaamd Hsp60. Dit komt voor in de energiefabriekjes van cellen (de mitochondrieën; die evolutionair eigenlijk ‘intracellulaire bakterieën’ zijn die oorspronkelijk – meer dan een miljard jaren geleden – door onze cellen werd opgenomen) van multi-cellulaire organismen (zoals de mens) en in microben. Antilichamen tegen delen van het Hsp60-proteïne komen ook courant voor bij patiënten met diabetes, Multipele Sclerose en andere auto-immuun ziekten.

Met behulp van de geconstrueerde peptiden hebben de onderzoekers kunnen nagaan of patiënten met M.E. antilichamen in hun bloed hebben die gericht zijn tegen delen van Hsp60. Dat was het geval. Maar niet bij allemaal; het aantreffen van antilichamen tegen Hsp60 verklaart dus niet alles. De resultaten komen wel overéén met het idee dat M.E. een auto-immuun ziekte is. In 17 op 69 (ca. 25%) bloedstalen van M.E.-patiënten waren antilichamen aanwezig tegen een peptide aanwezig in het Hsp60-proteïne uit het micro-organisme Chlamydia pneumoniae (Hsp60 van mensen en microben lijken echter erg op mekaar dus dit betekent niet noodzakelijk dat C. pneumoniae aanleiding heeft gegeven tot de antilichamen; dat moet verder worden nagegaan.). Slechts 1 staal van 331 gezonde bloed-donoren en 68 patiënten met één van de twee auto-immuun ziekten M.S. of S.L.E. had dergelijke antilichamen.

Op basis van deze bevindingen brachten Blomberg et al. de hypothese naar voor dat antilichamen aangemaakt in respons op een infektie zou kunnen bijdragen tot de symptomen van M.E. en dit door een ontwrichting van de normale werking van Hsp60 in mitochondrieën. Dit dient echter nog verder te worden onderzocht.

Het artikel is vrij technisch en alles tot in detail uitleggen zou ons te ver leiden. Het is dan ook onze bedoeling om onderzoekers in te lichten zodat ze dit kunnen meenemen naar hun research. Patiënten kunnen het doorgeven aan hun behandelaars en pleitbezorgers kunnen er verder op bouwen.

————————-

PLoS One (2013) 8(11): e81155

Epitopes of microbial and human heat-shock protein 60 and their recognition in Myalgic Encephalomyelitis

Elfaitouri A, Herrmann B, Bölin-Wiener A, Wang Y, Gottfries CG, Zachrisson O, Pipkorn R, Rönnblom L, Blomberg J

Section of Clinical Microbiology, Department of Medical Sciences, Uppsala University, Uppsala, Sweden

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis (M.E., ook Chronische Vermoeidheid Syndroom genoemd), een ziekte met chronische vermoeibaarheid, cognitieve dysfunkties en spierpijn met een ongekende etiologie, begint dikwijls met een infektie. Het chaperonine [Chaperoninen behoren tot een grote klasse molekulen die helpen bij proteïne-opvouwing, genaamd molekulaire chaperones. Zie o.a. ‘‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS] menselijk ‘heat-shock’ proteïne 60 (Hsp60) voorkomend in mitochondrieën en in bakterieën, is evolutionair sterk geconserveerd gebleven, antigeen [d.w.z. kan aanzetten tot antilichaam-produktie] en een belangrijk auto-antigen. De anti-Hsp60 humorale immuun-respons (IgG en IgM) werd bestudeerd bij 69 M.E.-patiënten en 76 bloed-donoren (BD) (de ‘training-set’ [Van de 69 M.E.-patiënten waren er 29 met enkel M.E. (Canadese criteria 2007), 13 met M.E.+FM, 15 M.E.+IBS & 12 M.E.+FM+IBS. Bij de 7 niet-M.E. patiënten: 4 met FM & 3 met FM+IBS.]) met recombinant menselijk en E. coli [bakterie] Hsp60, en 136 overlappende en geselekteerde peptiden van Hsp60 van mensen, Chlamydia, Mycoplasma en 26 andere soorten in een Suspensie Multiplex Immuno Test (SMIA) [bepalen van meerdere antilichamen ter zelfder tijd]). Peptiden van de Hsp60 helix [spiraalvormige secundaire struktuur van proteïnen] hadden een chaperonine-achtige aktiviteit maar deze en andere Hsp60-peptiden bonden ook IgG en IgM met een M.E. voorkeur, wat er theoretisch op wijst op een competitie tussen Hsp60 funktie en antilichaam-binding. Er werd een op Hsp60 gebaseerd panel van 25 antigenen geselekteerd. Bij evaluatie met 61 andere M.E. [De ‘evaluatie-set’: 61 patiënten met hoofd-diagnose of M.E., maar 5 voldeden ook de criteria voor FM en 6 voor IBS.] en 399 niet-M.E. stalen (331 BD, 20 Multipele Sclerose en 48 Systemische Lupus Erythematosus patiënten), detekteerde een peptide van Chlamydia pneumoniae Hsp60 IgM in 15 op 61 (24%) bij M.E. en in 1 op 399 niet-M.E. aan een hoge ‘cut-off’ (p < 0.0001). IgM tegen specifieke kruis-reagerende epitopen van menselijk en microbieel Hsp60 komt voor in een subgroep van M.E., wat compatibel is met door infektie-geïnduceerde auto-immuniteit.

Inleiding

Chaperoninen zijn courante auto-antigenen. Hsp60 is uniek wat betreft de hoge conservatie bij pro- en eukaryoten [cellen zonder en met kern] en het feit dat ze zeer antigeen zijn. Multipele Sclerose (M.S.) patiënten hebben auto-antilichamen (overwegend IgM) tegen chaperoninen zoals Hsp60, Hsp70 en alfa-B-crystalline [ook een (klein) ‘heat-shock proteïne]. Antilichamen tegen peptiden van humaan Hsp60 komen ook courant voor bij type-1 diabetes. Antilichamen tegen een microbieel Hsp60 zullen waarschijnlijk kruis-reageren met menselijk Hsp60, wat ook kan kruis-reageren met andere humane proteïnen.

Myalgische Encefalomyelitis (M.E.) – ook ‘Chronische Vermoeidheid Syndroom’ (CVS) genoemd, is een chronische invaliderende ziekte, gekenmerkt door chronische vermoeibaarheid, cognitieve dysfunktie en spierpijn. Talrijke onderzoeken hebben ook een onverklaarde langdurige chronische inflammatie en immuun-dysfunktie bij sommige M.E.-patiënten aangetoond, inclusief auto-immuniteit. Een mitochondriale dysfunktie bij M.E.-patiënten werd ook gerapporteerd maar dit vergt verder onderzoek. M.E. overlapt met fibromyalgie (FM) en prikkelbare darm syndroom (IBS). Het komt vaak naar boven na een ernstige virale of bakteriële infektie. Humaan herpes-virus 6 (HHV-6), Epstein-Barr virus (EBV), enterovirussen, parvovirus-B19, Chlamydia pneumoniae & Mycoplasma bleken betrokken bij M.E. maar er is geen bewijs dat ze de enige oorzaak van M.E. zijn. […] Hoewel er beperkingen zijn wat betreft de interpretatie van infektie-serologie [aantonen van antilichamen], is het in de praktijk dikwijls mogelijk voorbije of aanwezige microbiële aktiviteit vast te stellen door het bestuderen van de waarden van IgG en IgM [types antilichamen] gericht tegen de microbe. Het huidig onderzoek ontsprong uit een grote inspanning om serologische merkers die selektief zijn voor M.E. te vinden. Meer dan 1.000 virale, bakteriële en protozoale antigenen (volledige microben, recombinante proteïnen en synthetische peptiden) werden getest. We observeerden dan een tendens voor een selektief reageren van Hsp60-antigenen met M.E.-stalen vergeleken met controles. Dit was de aanleiding voor de huidige studie, waarbij SMIA werd gebruikt om simultaan IgG- en IgM-antilichamen tegen recombinante en peptide ‘heat-shock’ proteïne 60 (Hsp60) antigenen van mensen en vele microben te detekteren bij M.E. en controles. We vonden een belangrijk epitoop [deel van een macromolekule (meetsal proteïne) dat kan worden herkend door antilichamen of cellen van het immuunsysteem] dat overlapte met de peptide-bindende helix van Hsp60. Enkele van de Hsp60-epitopen bonden preferentieel antilichamen in M.E.-stalen. Bij het testen op een onafhankelijke evaluatie-groep van 61 M.E.-patiënten, reageerde één van de antigenen preferentieel met M.E.-, maar niet zoveel met BD-, M.S.- en S.L.E.-stalen.

Er werden abnormale Hsp60-waarden en een abnormale Hsp60-respons op inspanning gevonden bij M.E.-patiënten [Thambirajah AA, Sleigh K, Stiver HG, Chow AW. Differential heat-shock protein responses to strenuous standardized exercise in Chronic Fatigue Syndrome patients and matched healthy controls. Clin Invest Med (2008) 31: E319-E327; zie ‘‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS]. Het effekt van Hsp60-antilichamen op humaan Hsp60 en mitochondriale funkties, en hoe een mogelijk nadelig effekt van dergelijke antilichamen normaal wordt vermeden, dient nog te worden bepaald. Onze resultaten tonen Hsp60-epitopen aan die worden herkend door het immuunsysteem van gezonde individuen, meer bij IgM- dan bij IgG-antilichamen, alsook een selektieve immuun-respons gericht tegen enkele Hsp60-epitopen in een subgroep M.E.-patiënten. Het is waarschijnlijk dat Hsp60-antilichaam reakties te wijten aan infektie, de vorming van auto-antilichamen tegen humaan Hsp60 bevorderen. Of dit enige relevantie heeft voor de pathogenese en diagnose van M.E. is onzeker.

[…]

Bespreking

Hsp60 is een belangrijke molekule bij een aantal funkies, bv. als mitochondriaal chaperonine dat deelneemt aan cellulaire stress-reakties en het aanbieden van molekulen op het cel-oppervlak en extracellulair. Het zou ook NK-cel aktiviteit kunnen reguleren [Michaëlsson J, Teixeira de Matos C, Achour A, Lanier LL, Kärre K et al. A signal-peptide derived from Hsp60 binds HLA-E and interferes with CD94/NKG2A recognition. J Exp Med (2002) 196: 1403-1414]. Humaan Hsp60 ontstond waarschijnlijk uit Hsp60 van de alfa-proteobakterieën die de aanzet waren voor het ontstaan van mitochondrieën. De sterke conservatie in eu- en prokaryoten en hoge antigeniteit [capaciteit om specifiek te binden op antilichamen] bestemmen het voor tot immunologische kruis-reaktiviteit. Enkelvoudige nucleotide polymorfismen [kleine variaties in het DNA] in humaan Hsp60 veroorzaken ‘erfelijke spastische paraplegie’ [heterogene groep neurodegeneratieve aandoeningen gekenmerkt door progressieve spasticiteit en zwakte van de onderste ledematen]. Een verkeerde werking van Hsp60 kan zodoende theoretisch diverse effekten veroorzaken: mitochondriale dysfunktie, immune ontregeling en kwalen van het centraal zenuwstelsel. Het is een molekule die centraal staat bij auto-immuniteit. Auto-immune ziekten waar Hsp60-antilichamen werden gerapporteerd, zijn M.S., type-1 diabetes en atherosclerose. Dit artikel identificeert kruis-reagerende Hsp60-epitopen met een grote set van lange synthetische peptiden en hun selektieve herkenning bij sommige patiënten die lijden aan M.E. Het zou een toekomstige logische uitbreiding kunnen zijn om te onderzoeken of affiniteit-gezuiverde antilichamen tegen deze epitopen interfereren met Hsp60 of met de mitochondriale funktie.

Overlappende peptiden van humaan Hsp60 identificeerden een frequent herkend auto-epitoop (peptiden G20 en G20c) van humaan Hsp60, dat de helix, een belangrijke proteïne-bindende plaats van het Hsp60-chaperonine, overlapt. Epitopen die werden gedetekteerd met de IgM-test waren talrijker dan deze die werden gevonden met de IgG-test. Dit werd gezien bij de 3 epitoop-scans, met humaan, Chlamydia en Mycoplasma Hsp60. Dit duidelijk verschil in epitoop-repertoire tussen de IgG- en IgM-testen werd, naar ons weten, nog niet eerder veastgesteld. Bij de Ig-klasse ‘switch’ [wisseling van immuunglobuline-isotype] zou een epitoop-selektie kunnen betrokken zijn die gebaseerd is op de graad van auto-reaktiviteit en aviditeit [binding-neiging]. De manier van presentatie van peptiden aan het ‘bead’-oppervlak was ook belangrijk. [Bij de SMIA-test zijn de peptide-antigenen via een ‘spacer’-molekule gebonden op ‘beads’ (pareltjes)] Er werden verschillen gezien tussen reaktiviteit-patronen van Chlamydia Hsp60-peptiden met verschillende ‘spacer’-lengtes, het meest uitgesproken bij de IgG-test.

Enkele peptiden van humaan Hsp60 behielden een chaperonine-achtige, eerder gemengde proteïne-bindende aktiviteit. Deze niet-antilichaam-afhankelijke binding creëerde onzekerheid over hoeveel van het signaal van de antilichaam-afhankelijke binding specifiek was. In experimenten met blokkerende proteïnen en titraties vonden we echter dat de proteïne-inhoud van het patient-staal genoeg was om de algemene proteïne-binding van enkele Hsp60-peptiden te blokkeren. De verdunning-vloeistof van het test-systeem was proteïne-vrij. Dit liet ons toen de chaperonine-achtige peptide- en proteïne-binding van bepaalde Hsp60-peptiden te detekteren en evalueren. We gebruikten 5 [gelabelde] dodecapeptiden [peptide bestaande uit 12 aminozuren] die werden geselekteerd op hoge Hsp60-affiniteit. Twee daarvan bonden in onze SMIA-test op zowel recombinant humaan en E. coli Hsp60 en op peptiden homoloog met G20c die de helix bevatten. Zodoende was de binding-specificiteit van de G20c-peptiden gelijkaardig met die van het volledig Hsp60-proteïne. De proteïne-bindende aktiviteit kwam preferentieel voor dichtbij de helix, een primaire proteïne-bindende struktuur van het Hsp60 chaperonine.

Enkele humane Hsp60 peptiden reageerden selektief met M.E.-stalen vergeleken met deze van BD. IgM-reakties maakten meer onderscheid van IgG-reakties. Een humaan Hsp60-peptide (G20c), waarbij 3 aminozuren waren verschoven naar het amino-einde ten opzichte van het-G20 peptide, vertoonde een hogere verhouding antilichaam-binding/NTC-binding [NTC = ‘non-template control’; negative controle (zonder patiënten-staal); deze waarde kan worden beschouwd als ‘achtergrond’] in menselijke stalen dan het G20-peptide. Daarom kozen we het als basis voor verdere onderzoeken.

In een uitbreiding van de epitopen-scan vergeleken we peptiden die homoloog zijn met humaan G20c peptide, een ‘fyloscan’ [zoeken naar evolutionaire verbanden]. Bepaalde M.E.- en BD-stalen gaven hoge IgG en IgM antilichaam-reakties tegen Hsp60 peptides van Leishmania en Schistosoma. Net zoals Plasmodium, komen deze microben zelden voor in Zweden. De zeer sterk bewaarde sequentie van Hsp60 kan leiden tot onverwachte serologische kruis-reakties. De sterke correlatie-coefficiënten van enkele struktureel tegenstrijdige peptide-paren ondersteunt deze conclusie. Ondanks een duidelijk sequentie-verschil en een grote fylogenetische afstand [minder evolutionaire verwantschap], vertoonden peptiden van E. coli, Listeria, Burkholderia, Staphylococcus en Cryptosporidium [bakterieën] een bijna perfekte antigeniteit-correlatie voor de IgG-gegevens. Een minder perfekte, maar nog steeds sterke, correlatie werd gezien voor de antigeniteiten van vele G20c-homologen bij de IgM-test. De diversiteit van sequentie-herkenning was dus groter voor de IgM- dan voor de IgG-testen. Eén interpretatie is dat een grotere diversiteit qua IgM-herkenning wordt vervangen door een eenvoudiger IgG-herkenning tijdens maturatie van de humorale immuniteit; wat een “finaal gemeenschappelijk” anti-Hsp60 mechanisme suggereert. Dezelfde conclusie kan worden getrokken uit het hoger aantal epitopen herkend bij de IgM-test met overlappende peptiden van menselijk Hsp60, Chlamydia pneumoniae Hsp60 en Mycoplasma penetrans Hsp60. Een groot initieel aantal IgM epitopen zou kunnen vervangen zijn een klein aantal meer kruis-reacgerende IgG epitopen. Men kan redelijkerwijs veronderstellen dat herhaalde blootstellingen aan microbiële Hsp60-epitopen normaal gezien naar onschadelijke, meer of minder auto-reaktieve, antilichamen leidt. […]. Het fenomeen van ‘epitoop-spreiding’ [manier waarop auto-immuniteit kan optreden, gebruikmakend van een mechanisme van molekulaire nabootsing] zou een gelijkaardig iets kunnen zijn. De verregaande conservatie en kruis-reaktiviteit van bepaalde Hsp60 epitopen is van kritiek belang bij het onderscheiden van ‘self/non-self’, met een groot potentieel op fouten.

De observaties van de ‘fylo-scan’, en eerdere publicaties, leidden er ons toe 3 meer overlappende peptide-sets te synthetiseren: één met een tri-ethyleen-glycol ‘spacer’ [inerte molekule tussen antilichaam en drager om ruimtelijke afstand te scheppen] van Mycoplasma penetrans Hsp60 en 2 van Chlamydia pneumoniae Hsp60. De laatste 2 hadden ofwel een tri- of een hexa-ethyleen-glycol ‘spacer’. De ‘spacers’ leverden gelijkaardige, maar geen identieke, resultaten op. De relatief lange peptiden (30-meren) die hier werden aangewend, zouden enige secundaire struktuur en ‘mimicking’ [nabootsing] van conformationele epitopen kunnen toelaten. Dit ligt echter ver van de meer volledige epitoop-configuratie van een volledig proteïne.

Meerdere van de onderscheidende peptiden die werden gedefinieerd op basis van de training-set kwamen van Chlamydia pneumoniae en Mycoplasma penetrans. Drie belangrijke Hsp60-gebieden bevatten M.E.-selektieve epitopen, halverwege tussen het amino-einde en het midden, het midden, en halverwege tussen het midden en het carboxy-einde. Het helix-domein is dus niet het enige M.E.-specifieke domein. IgM-epitopen bleken meer frequent M.E. en niet-M.E. stalen te onderscheiden. Vele, maar niet alle, van de onderscheidende peptiden gaven ook hogere NTC-waarden. Het blokkerend effekt van de proteïnen in de stalen, en de subtractie-procedure [De waarden verkregen van de NTC en de ‘naakte pareltjes’ werden afgetrokken van de meet-waarden van de stalen.], waarbij de M.E. en niet-M.E. stalen op dezelfde manier werden behandeld, controleerde voor de chaperonine-achtige binding van die peptiden.

De meeste van de antigenen die werden gedefinieerd op basis van de ‘training-set’ waren niet zo M.E.-selektief in de ‘evaluatie-set’. Dit was te wijten aan de variërende IgM-reaktiviteit in de stalen van de bloed-donoren van verschillende jaren. Het is dus waarschijnlijk dat vele van de “M.E.-specifieke” IgM-reakties die werden gevinden in de ‘test-set’ te wijten waren aan de lage reaktiviteit in de bloed-donor stalen van 2010. Het Chlamydia pneumoniae G20c homoloog peptide in de IgM-test behield echter een uitgesproken M.E.-preferentie. Het verdient te worden overwogen als lid van een toekomstig M.E. biomerker-panel.

Reaktiviteit voor een waaier aan Hsp60-epitopen is courant bij zowel gezonde individuen als personen met gevarieerde ziekten. Er dient een bredere studie met inbegrip van meer stalen van verschillende soorten S.L.E.-patiënten en andere auto-immune ziekten (zoals T1D en Reumatoïde Arthritis) plus patiënten die lijden aan myocard-infarct en andere tekenen van atherosclerose, te worden uitgevoerd.

Overzicht van antigeniteiten van humaan, Chlamydia en Mycoplasma Hsp60-peptiden uit onze studie, in de context van resultaten van andere Hsp60-epitoop ‘mapping’-studies.

Onze resultaten vergeleken met eerder werk aangaande Hsp60-epitopen

Wanneer de resultaten van onze epitopen-scanning in de context van eerder gerappporteerde Hsp60-epitopen werden geplaatst, dook een complex beeld op. Er werden meerdere ziekte-correlaties en diagnostische toepassingen voor korte synthetische Hsp60-peptiden gemeld. Onze resultaten met 30-mer overlappende peptiden met menselijke, Chlamydia en Mycoplasma peptiden deden denken aan, maar waren verre van identiek met, eerdere resultaten.

Implicaties van de resultaten voor het begrijpen van de pathogenese van M.E.

Hsp60 is een belangrijk auto-antigen. De funktie van Hsp60 is het interageren met proteïnen op verschillende manieren, dus is het geen verrassing dat het naar voor komt als een kandidaat bij veel beschouwingen over het pathomechanisme. Hoewel we relatief hoge waarden van antilichamen tegen specifiieke Hsp60-epitopen vinden bij M.E., is de hoge frequentie van anti-HSP60 antilichamen in controle-stalen, en de hoge conservatie-graad en vele funkties van Hsp60, een argument tegen simplistische conclusies betreffende zijn etiologische rollen en mogelijke therapeutische implicaties [peptide-vaccins kunnen negatieve effekten geven]. Resultaten van anderen geven aan dat Hsp60 kruis-reakties ook epitopen van andere chaperoninen omvatten, en misschien virale kaspel proteïnen [coxsackie- en picorna-virussen]. Onze resultaten zijn compatibel met de aanwezigheid van door infektie opgewekte auto-antilichamen bij M.E. De bevinding dat auto-antilichamen voorkomen bij M.E. is niet nieuw [lees bv. ‘Vaccinatie en CVS]. Er werd een verhoogde frequentie van antilichamen tegen cardiolipine [belangrijk bestanddeel van het binnenste membraan van het mitochondrium] gerapporteerd [Hokama Y et al. Anticardiolipin antibodies in the sera of patients with diagnosed Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Lab Anal (2009) 23: 210-212]. Zoals Hsp60 is dit een molekule die voorkomt in zowel mitochondrieën als bakterieën. Het panorama aan auto-antilichamen bij M.E. zou verder onderzocht moeten worden.

Speculatie betreffende een mogelijke pathogene rol van anti-Hsp60

De verstrekkende vermoeibaarheid bij M.E. zou verband kunnen houden met een verstoord aëroob energie-metabolisme tijdens herstel van inspanning [Vanness JM, Snell CR et al. Subclassifying Chronic Fatigue Syndrome through exercise-testing. Medicine and science in sports and exercise (2003) 35: 908-913 /// White AT, Light AR et al. Severity of symptom-flare after moderate exercise is linked to cytokine-activity in Chronic Fatigue Syndrome. Psychophysiology (2010) 47: 615-624, zie Symptoom-opflakkering verbonden met cytokine-aktiviteit bij CVS] en mitochondriale dysfunktie [Plioplys AV, Plioplys S. Electron-microscopic investigation of muscle mitochondria in Chronic Fatigue Syndrome. Neuropsychobiology (1995) 32: 175-181 /// Lodi R, Taylor DJ, Radda GK. Chronic Fatigue Syndrome and skeletal muscle mitochondrial function. Muscle Nerve (1997) 20: 765-766]. Men kan speculeren dat anti-Hsp60 antilichamen bij M.E. ook interfereren met de werking van Hsp60, in mitochondrieën en elders. Auto-antilichamen tegen mitochondriale enzymen van de Krebs-cyclus komen voor bij primaire biliaire cirrhose [zie ookVerder onderzoek van mitochondriale funktie in spieren bij M.E.(cvs)]. Immunologische abnormaliteiten, zoals NK-cel dysfunktie, worden frequent gemeld bij M.E. [Brenu EW et al. Longitudinal investigation of Natural Killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med (2012) 10: 88. /// Fletcher MA et al. Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: evaluation of Natural Killer cell function and dipeptidyl-peptidase IV/CD26. PLOS ONE (2010) 5: e10817]. Het is denkbaar dat een verstoring van de Hsp60 turn-over die wordt teweeggebracht door anti-Hsp60 de NK-cel aktiviteit zou kunnen beïnvloeden. […] Een auto-antilichaam afhankelijk mechanisme achter M.E. is ook in overéénstemming met de resultaten van behandeling met anti-CD20 monoklonaal antilichaam [zie ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)], waarbij B-cel depletie leidde tot substantiële verbetering bij ca. 60% van de M.E.-patiënten. Er zou moeten worden onderzocht of M.E. een gelijkaardige pathogenese heeft als de post-infektueuze neuro-immunologische ziekten.

Besluiten

Gebruikmakend van 3 sets van volledig overlappende synthetische 30mer peptiden in een multiplex suspensie test, definieerden we het patroon van IgG- en IgM-herkenning van Hsp60-epitopen van bloed-donoren en M.E.-patiënten. Bepaalde peptiden van Hsp60 van pro- en eukaryoten (inclusief mensen), voornamelijk van de helix, behielden een chaperonine-achtige proteïne-bindende aktiviteit maar bonden ook IgG en IgM in M.E.-stalen, en dit meer frequent en meer intens dan die van de controles. De IgM-epitopen waren taltijker dan de IgG-epitopen. Enkele van hen waren onderscheidend voor M.E. De overéénstemming van de resultaten van Hsp60-peptiden van diverse gastheren pleit voor een kruis-reagerende bron (via mimotopen [macromolekulen, dikwijls peptiden, die de struktuur van een epitoop nabootsen en een antilichaam-respons opwekken]) van de auto-antilichamen die voorkomen bij M.E. en controles. Er werd een consensus peptide-sequentie van een belangrijk kruis-reagerend epitoop, samenvallend met de helix, gedefinieerd. Of de anti-Hsp60 antilichamen van M.E.-patiënten en controles ontstaan na één of meerdere acute of chronische infekties kan niet worden vastgesteld via deze uitsluitend serologische studie. We identificeerden een synthetisch Hsp60-peptide dat mogelijks diagnostisch nuttig kan zijn, samen met andere merkers, in een toekomstig biomerker-panel voor M.E.-patiënten. Afgezien van de mogelijke relatie van anti-Hsp60 antilichamen met M.E., zijn de definitie van Hsp60-epitopen en hun kruis-reaktiviteiten belangrijke uitkomsten van dit werk.

januari 11, 2014

Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 9:08 am
Tags: , , , , , ,

In onderstaande studie (door de groep rond Staines, Brenu en Marshall-Gradisnik van de Australische Griffith Universiteit) werden een aantal ‘nieuwe’ actoren van het immuunsysteem onderzocht bij M.E.(cvs).

Rapporten over T regulerende cellen (Tregs, een sub-populatie T-cellen die het immuunsysteem moduleren, tolerantie voor zelf-antigenen helpen behouden en auto-immuun-ziekten voorkomen; voor wat duiding zie ‘Heterologe immuniteit – overzicht’) en B-cellen zijn hier al gepasseerd…

γδT-cellen (gamma delta T-cellen) vertegenwoordigen een kleine subgroep of T-cellen die een speciale T-cel receptor (TCR) op hun oppervlak dragen. De meeste T-cellen hebben een TCR die bestaat uit de glycoproteïne-ketens α en β. Bij γδ T-cellen is dat een γ- en een δ-keten. Deze T-cellen komen minder courant voor maar het meest in darm-mucosa. Er is nog weinig over geweten maar men spreekt over een rol bij ‘eerste-lijn verdediging’, als ‘regulerende cellen of brug tussen aangeboren en adaptieve responsen’.

Dendritische cellen (DCs; een type witte bloedcellen) zijn antigen-presenterende cellen die immuun-responsen initiëren en reguleren; m.a.w. rijpe dendritische cellen van het aangeboren immuunsysteem zijn in staat antigenen te verwerken en dan rustende B-lymfocyten & T-lymfocyten te aktiveren en stimuleren door hen verwerkte antigenen aan te bieden. Ze zijn boodschappers tussen het aangeboren en adaptief immuunsysteem. Er zijn 2 fenotypes: conventionele dendritische cellen (ook myeloïde genoemd, cDC of mDC; produceren IL-12) en plasmacytoïde dendritische cellen (pDC; produceren interferon-alfa). Er werd hier ook al meer over dendritische cellen gemeld…

Voor wat uitleg over neutrofielen: zie onze inleiding bij ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’. Het ‘humaan neutrofiel antigen (HNA) systeem omvat 7 antigenen onderverdeeld in 5 antigen-groepen (Slechts de 3 HNA1 zijn specifiek voor neutrofielen, de andere komen ook tot expressie op andere cel-types.). Deze antigenen zijn betrokken bij verscheidene immuniteit-aandoeningen. Over hun rol bij M.E.(cvs) is weinig gekend…

————————-

International Immunology (Pre-print 16 december 2013)

The Role of Adaptive and Innate Immune Cells in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis

Ekua Weba Brenu (1,2,*), Teilah K. Huth (2), Sharni L. Hardcastle (2), Kirsty Fuller (2), Manprit Kaur (2), Samantha Johnston (2), Sandra B. Ramos (2), Don R. Staines (2,3) and Sonya M. Marshall-Gradisnik (1,2)

1 School of Medical Science, Griffith University, Gold Coast, Australia

2 The National Centre for Neuro-immunology and Emerging Diseases, Griffith Health Institute, Griffith University, Gold Coast, Australia

3 Queensland Health, Gold Coast Public Health Unit, Robina, Australia

Samenvatting

Verstoringen van immuun-processen zijn kenmerkend voor een aantal auto-immune en inflammatoire aandoeningen. Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME) is een inflammatoire aandoening met een mogelijk auto-immuun verband, gekarakteriseerd door gereduceerde Natural Killer (NK) cel aktiviteit, stijgingen qua regulerende T-cellen (Tregs) en ontregelde cytokine-waarden. De doelstelling van dit artikel is het onderzoeken van aangeboren en adaptieve immuun-cel fenotypes en funktionele karakteristieken die niet eerder werden nagekeken bij CVS/ME-patiënten. Er werden 30 patiënten met CVS/ME en 25 niet-vermoeide controles gerecruteerd voor deze studie. Er werden van alle deelnemers bloedstalen afgenomen om cel-fenotypes, funktionele eigenschappen, receptoren, adhesie-molekulen, antigenen en intracellulaire proteïnen te bepalen, gebruikmakend van flow-cytometrie. De onderzochte cellen omvatten: NK-cellen, dendritische cellen (DCs), neutrofielen, B-cellen, T-cellen, gamma delta T-cellen en Tregs. Er werden significante veranderingen gezien in B-cel subsets, Tregs, CD4+CD73+CD39+ T-cellen, cytotoxische aktiviteit, granzyme-B, neutrofiel-antigenen, TNF-alfa en IFN-gamma bij de CVS/ME-patiënten in vergelijking met de niet-vermoeide controles. Wijzigingen qua B-cellen, Tregs, NK-cellen en neutrofielen suggereren significante stoornissen van de immuun-regulering bij CVS/ME en deze zouden gelijkaardig kunnen zijn met een aantal auto-immune aandoeningen.

INLEIDING

Chronische Vermoeidheid Syndroom / Myalgische Encephalomyelitis (ME/CVS) blijft een controversiële aandoening in de research en de klinische geneeskunde. Aanhoudende slopende vermoeidheid en frequente episoden van griep-achtige symptomen die niet vermindert door rust of medicijnen behoren tot de kenmerken van deze enerverende stoornis. Hoewel bepaalde behandelingen als succesvol worden voorgesteld bij sommige patiënten, heeft de overgrote meerderheid van de patiënten geen nut van klinische interventies. Momenteel worden 6 klassificatie-systemen gebruikt om de diagnose CVS/ME te stellen en patiënten kunnen worden gegroepeerd in verschillende subgroepen op basis van de ernst of invaliderende aard van hun symptomen. Ondanks uitgebreid onderzoek in de afgelopen decennia, worden de oorzaken van CVS/ME nog niet volledig begrepen, terwijl verbeterde prognostische indicatoren, meer superieure en efficiënte gerichte behandeling en ‘coping’-strategieën ongrijpbaar blijven.

Coördinatie tussen het aangeboren en adaptieve immuunsysteem is noodzakelijk voor de gezondheid en het welzijn aangezien het zorgt voor overleving, rijping, proliferatie en funktionaliteit van cellen. Verstoringen in deze gesynchroniseerde processen kenmerken de meeste auto-immuunziekten en inflammatoire aandoeningen, en kunnen verminderde NK-cel lyse, verschuivingen in het cytokine-profiel, proliferatie van bepaalde T-cellen en abnormale cel-funkties omvatten. Gebreken in cellulaire processen tasten de fysiologische homeostase op een significante manier aan en werden bevestigd bij een aantal CVS/ME-patiënten [zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ /// ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS]

Belangrijk: rapporten over basale immuun-cel aantallen bij CVS/ME zijn inconsistent en dit kan gerelateerd zijn aan een aantal factoren, waaronder de ernst en de cyclische aard van de aandoening. Toch blijft verminderde NK cytotoxische aktiviteit een consistente bevinding bij de meeste ME/CVS-patiënten, wat wellicht een mogelijke storing in het cytotoxisch mechanisme van deze cellen bijCVS/ME suggereert. Verminderde NK-cel funktie en significante verhogingen qua Tregs bij CVS/ME-patiënten [zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)] kan een verhoging suggereren qua Treg-onderdrukking die het gedaald cytotoxisch vermogen van de NK-cellen bij CVS/ME-patiënten kan verklaren. Evenzo kunnen verhoogde Treg-waarden de antigeen-presenterende cellen substantieel onderdrukken door binding aan co-receptoren CD80 [een signaal-proteïne nodig voor T-cel aktivatie] en CD86 [proteïne dat tot expressie komt op antigen-presenterende cellen, geeft co-stimulerende signalen nodig voor T-cel aktivatie], en MHC II molekulen [voor wat uitleg over antigen-presentatie zie onze inleiding bij ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)] op het oppervlak van dendritische cellen (DCs), via de proteïnen cytotoxische T-lymfocyt antigeen 4 [CTLA-4, geeft een inhiberend signaal aan T-cellen] en lymfocyt-aktivatie gen 3 (LAG-3), respectievelijk. De onderdrukkende funkties van Tregs op DCs kan van belang zijn bij CVS/ME, aangezien een gebrek aan rijpe DCs de antigeen-presenterende funktie van DCs kan aantasten en in het bijzonder cytokine-secretie door T helper (Th) cellen kan veranderen. Interessant is dat werd aangetoond dat co-stimulerende molekulen zoals CD86 ofwel verlaagd of verhoogd zijn op de oppervlakken van DCs bij bepaalde ziekten [Multipele Sclerose & Reumatoïde Arthritis]. Bij CVS/ME is weinig bekend over de rol van DCs; gezien het feit dat DCs centraal staan bij een inéénstorting van de immuun-tolerantie is het noodzakelijk om hun rol bij ME/CVS te bepalen. DCs staan er om bekend de produktie van auto-reaktieve immuun-responsen aan te wakkeren, leidend tot de aanmaak van pathogene auto-antilichamen en chronische inflammatie.

DCs interageren ook met andere antigeen-presenterende cellen waaronder γδT-cellen [zie onze introductie] en dat is een krachtig mechanisme voor CD86-expressie. In de periferie vertegenwoordigen γδT-cellen ongeveer 1-10% van de lymfocyten en 2-5% van de totale T-cel populatie. Bij de mens zijn er 2 subsets γδT-cellen: Vδ1 en Vδ2. Vδ1 overheersen in de milt en thymus, terwijl Vδ2 in overvloed voorkomen in de periferie, de huid, de amandelen en de lymfe-knopen. γδT cellen funktioneren gelijkaardig als cytotoxische cellen, NK-cellen en CD8+ T-cellen. Deze cellen scheiden ook cytokinen af die CD4+ T-cel proliferatie inhiberen, apoptose induceren, B-cel antilichamen bevorderen en betrokken zijn bij een aantal ziekten; dus kunnen ze een rol spelen bij CVS/ME. Perifere γδT-cellen kunnen afnemen in aanwezigheid van hoge FOXP3-waarden [‘forkhead box P3’, een proteïne dat betrokken immuun-responsen; belangrijke regulator bij de ontwikkeling en werking van regulerende T-cellen (Tregs)]. Directe bevestiging van de rol van deze cellen bij het reguleren van immuun-mechanismen CVS/ME is er nog niet. Zo zijn er ook geen meldingen over de rol van menselijke neutrofiel antigenen (HNAs) bij CVS/ME-patiënten. Dit is de eerste studie die de mogelijke rol van aangeboren en adaptieve immuun-cel fenotypes en funktionele eiwitten van γδT-cellen, DCs en HNAs bij een CVS/ME symptoom-profiel onderzoekt.

METHODES

Deelnemers

[…] CVS/ME-patienten voldeden aan de CDC 1994 criteria […] uitgesloten: auto-immune aandoeningen, psychose, epilepsie, hart-aandoeningen, zwangerschap of borstvoeding. […]

Staal-afname

[…]

Cel-fenotypering

[…]

Bepaling van oppervlate-antigenen, adhesie-molekulen en receptoren

Neutrofielen-antigenen […] HNA-1 (CD16b), HNA-2 (CD177), HNA-4 (CD11b) & HNA-5 (CD11a). NK-receptoren […] CD158a/h (KIR2DL1/S1), CD158e (KIR3DL1), CD158b (KIR2DL2/DL3), CD158i (KIR2DS4) & NKG2D. Migratie-potentieel van γδT-cellen […] CD11a & CD62L merkers, CD94 MHC-herkenning. […]

Intracellulaire kleuring van funktionele proteïnen

[…]

NK-cel cytotoxische aktiviteit, degranulatie en IFN-γ

[…]

RESULTATEN

Bloed-karakteristieken van de patiënten

Voorafgaandelijk aan alle flow-cytometrische testen van immuun-cel fenotypes, werden bij alle deelnemers de bloed-karakteristieken nagegaan. Er waren significante verschillen tussen CVS/ME-patiënten en de niet-vermoeide controles qua bloed-parameters, inclusief bloedplaatjes, haematocriet en erythrocyten-sedimentatie-snelheid. Alle andere parameters bleven onveranderd. Alle CVS/ME-patiënten voldeden aan de CDC 1994 criteria. De duur van CVS/ME was meer dan 2 jaar.

Wijzigingen qua Tregs, B-cellen en DC-subsets bij CVS/ME

Het totaal aantal lymfocyten, monocyten of neutrofielen verschilde niet tussen de 2 groepen. Ook routine bloed-bepalingen toonden gelijkaardige bloed-karakteristieken. Er werd een significant verschil geobserveerd qua cel-subsets van DCs, B-cel fenotypes en Tregs. DC-fenotypes, in het bijzonder pDCs, waren significant gedaald in de CVS/ME-groep, terwijl de mDCs – hoewel verhoogd in de CVS/ME-groep – geen statistische significantie bereikten. De CVS/ME-patiënten vertoonden een significante daling qua onrijpe B-cellen en een stijging van de geheugen B-cellen [antilichaam-producerende cellen] in vergelijking met de niet-vermoeide controle-populatie. Tregs en CD4+CD73+CD39- T-cellen waren gestegen in de CVS/ME-groep in vergelijking met de niet-vermoeide controles terwijl er geen verschil werd gezien qua CD4+CD73-CD39+ cellen. [zie bespreking]

Dalingen qua antigenen zonder significante veranderingen qua oppervlakte-receptoren bij CVS/ME

HNA2 (CD177+) waren significant verminderd op de oppervlakken van neutrofielen bij ME/CVS-patiënten in vergelijking met de niet-vermoeide controles. Wanneer we de expressie van co-stimulerende merkers CD80 en CD86 pre- en post-stimulatie onderzochten, konden we geen enkele significante verandering vaststellen qua expressie van deze merkers op het oppervlak van DCs. Ook waren er geen significante verschillen tussen de twee groepen deelnemers qua expressie van KIR [‘Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors’] -receptoren of NKG2D [aktiverende receptor] op de oppervlakken van geïsoleerde NK-cellen. Er werden geen significante verschillen waargenomen wat betreft cel-oppervlak molekulen op γδ T-cellen […].

Een gereduceerde cytotoxische aktiviteit kan een prominent kenmerk van CVS/ME zijn aangezien het consistent wordt gerapporteerd bij CVS/ME-patiënten. In de huidige studie bevestigden we significante verminderingen wat betreft het vermogen van NK-cellen van CVS/ME-patiënten om K562-cellen [leukemie-cellen die makkelijk worden gedood door NK-cellen] te lyseren […]. Omgekeerd was degranulatie verhoogd bij CVS/ME-patiënten […]. Ook IFN-γ producerende CD3-CD56+ NK-cellen waren verhoogd bij de CVS/ME-patiënten vergeleken met de niet-vermoeide controles. Aangezien de cytotoxische aktiviteit routine-matig gedaald is bij CVS/ME-patiënten, bepaalden we de intracellulaire waarden van de lytische proteïnen (perforine, GZA en GZB) in NK- en T-cellen. Er waren geen significante verschillen in de waarden van perforine of GZA in de NK-cellen. GZB was echter significant gereduceerd terwijl IFN-γ waarden in CD3-CD56+ NK-cellen verhoogd waren bij de CVS/ME-patiënten.

Correlatie-studies

[…] Er werd een positieve correlatie gezien tussen de volgende variabelen: Tregs & CD73+ T-cellen […], HNA2 & onrijpe B-cellen […], degranulatie & IFN-γ […] en HNA2 & NK cytotoxische aktiviteit […]. Negatieve correlaties werden vastgesteld tussen de volgende parameters: degranulatie & NK cytotoxische […], Tregs & cytotoxische aktiviteit […], HNA2 (CD177+) & HNA2 (CD177-) […] en ten slotte tussen HNA2 & degranulatie […].

BESPREKING

CVS/ME wordt gezien als een multi-factoriële en heterogene aandoening met wisselende immunologische abnormaliteiten. Dit is de eerste studie die de rol van immuun-cel fenotypes – in het bijzonder γδT-cellen, DCs en Treg subsets – en neutrofiel-antigenen bij CVS/ME-patiënten onderzoekt. Dit is ook de eerste studie die rapporteert over de NK-cel degranulatie bij CVS/ME. De resultaten van de huidige studie suggereren dat het mechanisme voor CVS/ME dalingen qua NK-cel aktiviteit, NK lytische proteïnen, pDCs, IFN-γ, HNA2-antigenen en geheugen B-cellen zou kunnen omvatten, samenlopend met stijgingen qua onrijpe B-cellen, NK-cel degranulatie, TNF-α en NK-cel specifiek IFN-γ. Neutrofiel-antigenen hebben een klinische betekenis bij zowel allo-immune en auto-immune ziekten. Op dit moment zijn 5 neutrofiel-antigenen geklassificeerd: HNA-1, HNA-2, HNA-4, HNA-5 & HNA-3, en 4 daarvan hebben gekende ‘carrier’-glycoproteïnen: CD16b, CD177, CD11b & CD11a respectievelijk. Het glycoproteïne specifiek voor HNA-3 is momenteel onbekend. HNA-2 is het meest polymorfe neutrofiel-antigen en komt niet tot expressie op alle neutrofielen. Het is verhoogd bij patiënten met bakteriële infekties; dit kwam echter niet voor in de huidige studie. Gewijzigde expressie van CD177 werd gerapporteerd bij een aantal auto-immune aandoeningen. CD177 is een essentiële molekule bij neutrofiel-migratie doorheen het endotheliaal oppervlak [endothelium = bedekkende cellen van bloedvaten] aangezien het bindt op ‘platelet endothelial cell adhesion molecule’ (PECAM)-1 op de endotheliale cellen. Verhoogde trans-migratie van neutrofielen van het bloed naar infektie-plaatsen zou mogelijks lage waarden aan neutrofielen die CD177 tot expressie brengen, kunnen veroorzaken in de periferie van patiënten met CVS/ME. Dit kan ook wijzen op mogelijke abnormaliteiten bij de migratie-eigenschappen van de neutrofielen. Aangezien ook werd gerapporteerd dat de ‘respiratory burst’ [de snelle afgifte van ROS (superoxide radikalen en waterstof-peroxide)] verhoogd is in neutrofielen [zie ref. in inleiding] van CVS/ME-patiënten, zou een diepgaand onderzoek van andere neutrofielen-eigenschappen hun profiel bij CVS/ME kunnen verduidelijken. De oorzaak van de stijgingen qua bloedplaatjes en erythrocyten-sedimentatie-snelheid bij de CVS/ME-patiënten is niet helemaal begrijpbaar aangezien ze niet consistent worden aangetoond bij CVS/ME. Zoals bij eerdere studies, bevestigde de huidige studie dalingen qua NK cytotoxische aktiviteit bij de CVS/ME-patiënten. Bij CVS/ME zou een reductie van de NK cytotoxische aktiviteit geassocieerd kunnen zijn met differentiële expressie in miRNA [microRNAs; zie ref. inleiding], mRNA en concentraties aan lytische proteïnen [zie ref. in inleiding]. Lytische proteïnen, perforine en granzymes zijn belangrijke factoren bij granule-afhankelijke cytotoxische mechanismen. Na afgifte van granzymes in geïnfekteerde cellen, aktiveren deze proteïnen […] paden die apoptose van virus-geïnfekteerde of tumor-cellen verzekeren. Overdadige hoeveelheden GZB zijn voordelig aangezien het virale inhiberende signalen uitschakelt en de persistentie van virale pathogenen voorkomt. Gebreken qua GZB kan de uitstelling bevorderen van processen – zoals snelle celkern-desintegratie of DNA-fragmentatie van virus-geïnfekteerde cellen – die toelaten dat bepaalde virussen blijven bestaan. Belangrijk: GZB is het meest prominente bestanddeel van de NK-granules, dus: een reductie qua granzyme-B in de NK-cel kan mogelijk bijdragen tot de gedaalde cytotoxiciteit van NK-cellen bij CVS/ME-patiënten. De synergie tussen perforine en GZB is noodzakelijk voor de inductie van apoptose. Gereduceerde NK cytotoxische aktiviteit vergezeld van NK-degranulatie wijst op substantiële defekten qua in NK cytotoxische aktiviteit. Gewoonlijk is NK-cel degranulatie direct gecorreleerd met NK-cel cytotoxische aktiviteit; in de huidige studie was gereduceerde NK cytotoxische aktiviteit omgekeerd gecorreleerd met een toename van NK-cel degranulatie en IFN-γ. De NK-cellen van de CVS/ME-patiënten zijn dus vermoedelijk sterk geaktiveerd in respons op een mogelijke virale overbelasting maar niet in staat de virussen te elimineren. Daarnaast is een overvloed aan Tregs een bijkomende belemmering voor de NK cytotoxische aktiviteit bij de CVS/ME-patiënten.

Hoewel verlaagde pDCs omgekeerd gecorreleerd waren met verminderde cytotoxische aktiviteit, kunnen deze ook bijdragen aan het NK cytotoxische profiel bij CVS/ME-patiënten, aangezien pDCs belangrijke producenten zijn van type-I interferonen [IFN-I; binden op de IFN-α receptor] die de NK cytotoxische aktiviteit verrsterken. Verminderde pDCs kunnen dus resulteren in verminderde IFN-I die doeltreffende eliminatie van pathogenen bij ME/CVS-patiënten belemmert. IFN-I omvatten IFN-α en IFN-β. In vitro studies hebben een bescherming-mechanisme aangetoond van deze molekulen op geheugen B-cellen, waar zij bleken de levensduur van geheugen B-cellen te behouden en bevorderen, door het inhiberen van cel-dood. IFN-α is verhoogd bij sommige CVS/ME-patiënten en dit verbetert mogelijks de overleving van geheugen B-cellen.

Het B-cel distributie-patroon dat werd gezien in deze studie werd gerapporteerd bij auto-immune ziekten zoals Multipele Sclerose (MS) en Reumatoïde Arthritis (RA). Bij RA-patiënten zijn naïeve [nog niet aan een antigen blootgestelde] B-cellen gedaald en dit kan samenvallen met een toename van de geheugen B-cellen. Op dezelfde manier vertonen patiënten met geaktiveerde Systemische Lupus Erythematosus [SLE; een auto-immune aandoening] een vergelijkbare trend qua B-cellen, terwijl patiënten met MS verhoogde waarden qua geheugen B-cellen hebben. Er werd verstoorde B-cel homeostase gezien bij CVS/ME-patiënten [zie ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)]. Hoge waarden geheugen B-cellen kunnen defekten weerspiegelen wat betreft priming-mechanismen [priming = snellere herkenning of reaktie door het immuunsysteem als men een antigen al eerder heeft ontmoet] vereist voor B-cel differentiatie naar antilichaam-secreterende cellen of migratie van deze cellen uit andere weefsels zoals de milt. Geheugen B-cellen zijn heterogeen en kunnen daarom verder worden onderverdeeld in de fenotypes IgD+ en IgD-, respectievelijk ‘unswitched’ en ‘switched’ [al dan niet niet van immuunglobuline-isotype gewisselde] geheugen-cellen. Wijzigingen in deze fenotypes bleken geassocieerd met een aantal auto-immune ziekten, bv. bij Sjögren’s ziekte zijn IgM+ geheugen B-cellen toegenomen, terwijl toenames van dubbel-negatieve IgD-CD27- ‘switched’ geheugen-cellen werden geobserveerd bij SLE.

Het Treg-profiel in deze studie was gelijkaardig met eerdere bevindingen [hier wordt als ref. o.a. ‘Screening van NK-, B- & T-cel fenotype en funktie bij CVS’ vermeld, waar ook verhoogde waarden Tregs gevonden…]. De oorzaak van verhoogde waarden van Tregs bij CVS/ME is ongekend. Expressie van CD73 op het oppervlak van CD4+ T-cellen was gecorreleerd met een toename van Tregs bij de CVS/ME-patiënten. CD73 is een ectonucleotidase [enzyme dat tussenkomt bij het metabolisme van nucleotiden] dat vereist is voor de aanmaak van adenosine [een nucleoside, onderdeel van het energierijke ATP]. Onder optimale omstandigheden produceren CD4+ T-cellen (in het bijzonder Tregs) kleine hoeveelheden adenosine-deaminases [ADA, bij mensen van belang bij ontwikkeling en onderhoud van het immuunsysteem] die adenosine afbreken. Hoge waarden CD73 met beperkte hoeveelheden ADA doet de waarden toenemen van extracellulair adenosine in de circulatie en dit kan accumuleren in immuun-cellen en hun werking veranderen. Op het cel-oppervlak van veel leucocyten, inclusief Tregs, bindt ADA op CD26; wat anti-inflammatoir adenosine elimineert en suppressie door Tregs reduceert. Er werden verminderde waarden aan CD26 gerapporteerd op lymfocyten bij CVS/ME-patiënten en dit, samen met een toename van CD73, kan Treg-suppressie verhogen bij CVS/ME [zie ‘‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?]. Tregs kunnen NK cytotoxische aktiviteit en helper T-cellen onderdrukken via een aantal mechanismen, inclusief de aanmaak van adenosine door CD39 [ectonucleotidase; zie eerder] en CD73 molekulen. In aanwezigheid van adenosine produceren NK-cellen ook veel IFN-γ . Extracellulair adenosine heeft anti-inflammatoire effekten op zowel de aangeboren en adaptieve immuniteit; meer specifiek: het kan de aktivatie dempen van Th1 en Th17 cellen. Adenosine kan ook CD8+ T-cel cytotoxische aktiviteit inhiberen en de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen door CD4+ T-cel subsets. Bij muizen reduceert de aanwezigheid van adenosine-receptor agonist de NK cytotoxische aktiviteit door een daling van cAMP. In T-cellen tempert CD73 de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen via inhibitie van de NFκB-aktivatie, wat een Th2 respons bevordert. Hoge waarden aan adenosine of ATP aktiveren een negatief feedback-proces dat de neutrofiel-funktie inhibeert en beschermt tegen langdurige inflammatie of beschadiging.

Samengevat: de bevindingen van deze studie bevestigen een substantiële inéénstorting van de immuun-tolerantie en inflammatoire mechanismen bij patiënten met CVS/ME. Daarbij zijn waarschijnlijk significante stoornissen van de NK-cel werking, over-reaktieve Tregs, defekte DCs, neutrofielen, ontregeling van cytokine-waarden en abnormale aanmaak van adenosine betrokken. Te samen genomen zijn deze defekten overweldigend en verdere bevestigende studies zijn vereist omwille van de multi-factoriële en heterogene aard van de aandoening. Belangrijk: het kan noodzakelijk zijn om de waarden van circulerende IFN-I bij CVS/ME-patiënten te bevestigen, en het exact profiel van geheugen B-cellen en onrijpe B-cellen die disproportioneel zijn bij CVS/ME.

april 28, 2013

Screening van NK-, B- & T-cel fenotype en funktie bij CVS

Filed under: Immunologie — mewetenschap @ 3:24 pm
Tags: , , , , , ,

In een interview met ‘Health Rising’ (April 2013; phoenixrising.me) laat Dr Blanco (die deel uit maakt van een immunologie-groep die samenwerkt met de HIV Kliniek van het ‘Germans Trias I Pujol’ Ziekenhuis in Barcelona), één van de auteurs van onderstaand artikel, optekenen: “Onze preliminaire gegevens toonden veranderingen bij alle geanalyseerde lymfocyten-subgroepen (B, T & NK). Deze preliminaire gegevens kwamen van patiënten uit slechts één CVS-kliniek. Om ‘bias’ te vermijden, breidden we onze studie uit door patiënten te recruteren uit een ander klinisch centrum. Patiënten-organisaties financierden gedeeltelijk de initiële studies – eigenlijk bedoeld als zoekocht naar XMRV en om immunologische merkers te identificeren. De rol van het retrovirus werd snel uitgesloten maar de onderzoekers dachten dat de immunologische studies interessant genoeg waren om het werk verder te zetten. Deze bijkomende inspanning werd gefinancierd door de IrsiCaixa Stichting (een research-instituut gefinancierd door de Catalaanse regering en de ‘La Caixa’ stichting, een Catalaanse bank).”

Onzes inziens is deze studie wat ze is: een verkenning bij een kleine groep patiënten die bevestiging bij grotere populatie vergt. De eventueel bruikbare merkers moeten worden uitgetest bij ander ziekten met een gelijkaardige symptomatologie. Een deel van de resultaten bevestigt rapporteringen van andere teams, een ander deel is in tegenspraak met wat anderen vonden. Daarom zorgt dit voor nogal wat verwarring. We geven het voor de volledigheid en ter nuancering mee…

We weten ook nog niet of de beschreven lymfocyten-populaties direct betrokken zijn bij de pathofysiologie van M.E.(cvs); misschien gaat het om een secundair effekt? Specifieke NK-cel fenotype-profielen bleken (in de medische literatuur) geassocieerd met verscheidene virussen in en de resultaten zouden een (geïdentificeerd of niet) pathogen kunnen weerspiegelen. Tot dat een dergelijk pathogen wordt geïdentificeerd (als er al één is) bij M.E.(cvs), blijft dit speculatie.

————————-

J Transl Med. 2013; 11: 68

Screening NK-, B- and T-cell phenotype and function in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome

Marta Curriu (1); Jorge Carrillo (1), Marta Massanella (1), Josepa Rigau (2), José Alegre (3), Jordi Puig (4), Ana M Garcia-Quintana (5), Jesus Castro-Marrero (3), Eugènia Negredo (4), Bonaventura Clotet (1,4), Cecilia Cabrera (1) and Julià Blanco (1,6)

1 Institut de recerca de la sida, IrsiCaixa-HIVACAT, Institut d’Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias I Pujol|, Badalona, Spain

2 CFS Clinic, Tarragona, Spain

3 CFS Unit, Institut de Recerca Vall d’Hebron, Barcelona, Spain

4 Fundació Lluita contra la SIDA, Hospital Germans Trias I Pujol, Badalona, Spain

5 CFS Unit, Delfos Clinic, Barcelona, Spain

6 Institut de Recerca de la SIDA, IrsiCaixa/Institut d’Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona, 08916, Spain

Samenvatting

Achtergrond: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende neuro-immune aandoening met een onbekende etiologie waarvan de diagnose wordt gesteld via een reeks klinische manifestaties. Hoewel verscheidene immunologische abnormaliteiten werden beschreven bij CVS, heeft hun heterogeniteit de diagnostische toepasbaarheid beperkt.

Methodes: Immunologische kenmerken van CVS werden gescreend bij 22 CVS-individuen die voldeden aan de Fukuda criteria en 30 gezonde controle-individuen. In beide groepen werden de perifeer bloed T-, B- en NK-cel funktie en fenotype geanalyseerd d.m.v. flow-cytometrie.

Resultaten: CVS-individuen vertoonden gelijkaardige absolute aantallen T-, B- en NK-cellen, met kleine verschillen qua percentage CD4+ en CD8+ T-cellen. De B-cellen vertoonden gelijkaardige subgroup-frequenties en proliferatieve responsen tussen de groepen. Anderzijds werden significante verschillen geobserveerd qua T-cel subgroepen. CVS-individuen vertoonden verhoogde waarden qua of T regulerende cellen (CD25+/FOXP3+) en lagere proliferatieve responsen in vitro en in vivo. Daarenboven vertoonden de CD8 T-cellen van de CVS-groep significant lagere aktivatie en frequentie van effector geheugen cellen. Er werden geen duidelijke tekenen voor T-cel immunosenescentie [her-modellering (verslechtering) van het immuunsysteem naar mate het ouder worden] geobserveerd. NK-cellen van CVS-individuen vertoonden hogere expressie van NKp46 en CD69 maar lagere expressie van CD25 in alle NK-groepen. Globaal groepeerden T-cel en NK-cel kenmerken duidelijk de CVS-individuen.

Besluiten: Onze bevindingen suggereren dat wijzigingen qua T-cel fenotype en proliferatieve respons tesamen met de specifieke NK-cel fenotype signatuur nuttig kunnen zijn bij de identificatie van CVS-individuen. De opvallende down-modulering van T-cel gemedieerde immuniteit zou kunnen helpen bij het begrijpen van virale infekties bij CVS.

Achtergrond

[…]. De Wereld Gezondheid Organisatie erkent M.E./CVS als een ziekte van het zenuwstelsel (ICD G93.3). CVS is echter een multi-systeem ziekte waarbij neurologische aandoeningen gepaard gaan met veranderde immune, musculoskeletale, endocriene en cardiovasculaire systemen. […]

De karakterisatie van de immune toestand van CVS-individuen heeft dikwijls tegenstrijdige resultaten opgeleverd. Ander werk bracht CVS in verband met een toestand van immuun-aktivatie, vastgesteld via expressie van CD38 of HLA-DR [aktivatie-merkers] in CD8 T-cellen. Andere auteurs vonden echter gelijkaardige expressie van deze merkers bij CVS- en gezonde individuen; terwijl lagere expressie van de aktivatie-merkers CD69 of oplosbaar CD26 ook werd beschreven als een kenmerk van CVS [zie ‘‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?]. Zo ook werden B-cel funktie, B-cel gemedieerde auto-immuniteit of onevenwichtige cytokine-netwerken [zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ & Cytokinen in plasma bij vrouwen met CVS’] gelinkt met CVS; weerom met niet-overtuigende resultaten. Gewijzigde aantallen NK-subgroepen (gedefinieerd via CD56- of CD16-expressie) en een verstoorde NK-cel lytische aktiviteit bleken op een meer consistente manier geassocieerd met CVS [zie o.a. Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Journal of Translational Medicine (2012) 10: 88]; hoewel ook hier controversiële gegevens werden gerapporteerd en een consensus wat betreft relevante NK-cel merkers nog ontbreekt.

Ten minste enkele van deze bij CVS beschreven immuun-kenmerken zouden verband kunnen houden met aktieve, slecht gecontroleerde virale infekties, die immuun-responsen anders moduleren en zouden kunnen leiden tot immuun-hyperaktivatie/-uitputting (zoals dikwijls gerapporteerd bij HIV); zouden kunnen bijdragen tot immunosenescentie (zoals werd gepostuleerd voor CMV); of kunnen leiden tot een toestand van immune anergie [afwezigheid van (immuniteit)-respons] (zoals beschreven voor het mazelen-virus). In deze context wilden we het fenotype en de funktie van verschillende immuun-cellen tussen gezonde en ME/CVS-individuen vergelijken. De studie werd ontworpen in 2010 en kon de nieuwe definities, die tegenwoordig de scheiding tussen M.E. en CVS toelaten, nog niet gebruiken. Onze gegevens wijzen echter in de richting van een niet-aangetast B-cel compartiment, een overhellend NK-cel fenotype en een minder responsief T-cel compartiment als belangrijkste immune kenmerken bij M.E./CVS.

Methodes

Patiënten

Fukuda criteria […]. Algemene exclusie-criteria: diabetes, hypertensie, chronisch obstructief pulmonair lijden, inflammatoire darm-ziekte of Crohn’s, Reumatoïde Arthritis, Parkinson’s of Huntington’s, schizofrenie, organische mentale aandoeningen, drug-misbruik, Multipele Sclerose en een body-mass-index BMI > 30 kg/m2. […] Andere belangrijke co-morbiditeiten werden geëvalueerd maar niet als exclusie-criteria beschouwd […]. [Patiënten met identificeerbare infekties werden uitgesloten. Dit is nodig omdat deze een verschillend/verstorend immuun-profiel kunnen opleveren.]

Staal-verwerking

[…] Alle stalen werden afgenomen en direct verwerkt in het ‘Hospital Germans Trias i Pujol’. […]

Bepaling van absolute aantallen B-, T- & NK-cellen

Flow-cytometrie: absoluut aantal lymfocyten: (anti-CD45-V450), percentage van de verschillende lymfocyt-subgroepen (CD45-V450, CD19-AmCyan, CD3-APC-Cy7, CD4-APC, CD8-PerCP, CD56-PE & CD16-FITC).

Immunofenotypering

Karakterisering B-, T- & NK-cel populaties.

B-cel & T-cel proliferatie-testen

[…]

Cel-sterfte testen

[…]

NK-aktiviteit testen

[…]

Statistische analyses

[…]

Resultaten

Patiënten-karakteristieken

[…] CVS-diagnose mediaan 3-5 jaar, 53% rapporteerden een aanvang van de symptomen met virale infekties. De mediane ernst-graad was mild (ca 50% reductie qua aktiviteiten-niveau). […]

[…]

Kwantificatie van lymfocyten-subgroepen

Absolute aantallen en percentages B-cellen (CD19+), NK-cellen (CD3-CD56+CD16+), T-cellen (CD3+), CD4 T-cellen (CD3+CD4+) en CD8 T-cellen (CD3+CD8+) […] waren voor CVS en controles gelijkaardig. Er werd echter een significant lager frequentie CD3+CD56+ lymfocyten gezien bij de CVS-groep. Bovendien was er een lichtjes onevenwichtige samenstelling van de CD3+ cel subset, met een hogere CD4 T-cel vertegenwoordiging in de CVS-groep.

B-cel fenotype en funktie

[Zie ook ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)’ door Bansal et al.]

[…] Er werden geen significante verschillen gezien qua percentage IgD+, IgG+, IgA+ of CD27+ B-cellen, wat wijst op een gelijkaardig geheugen-compartiment. [B-cellen die aan een antigen werd blootgesteld en antilichamen gaat produceren] De waarden van transitionele [overgang onrijp/rijp] (CD19+IgD+CD38highCD10+CD5+), plasma-plasmablastische (CD19+CD27highCD38high) [plasmablasten = voorlopers van plasma-cellen] of marginale zone B-cellen (CD19+IgD+IgM+CD27+CD1c+) [zie link hierboven], waren vergelijkbaar. Consistent daarmee vertoonde de funktionele beoordeling van B-cel responsen gelijkaardige proliferatie […] en een gelijkaardig niveau ex vivo cel-sterfte. Dus: geen belangrijke verstoringen wat betreft het fenotype en de funktie van circulerende B-cellen.

NK-cel fenotype en funktie

[…] De 3 voornaamste NK-cel subsets die we identificeerden (CD56highCD16-, CD56+CD16+ en CD16+CD56- cellen) en de meeste van de geanalyseerde merkers waren vergelijkbaar. De expressie van CD69 [NK- & T-cel aktivatie-merker] en NKp46 [CD335; zie bespreking] was echter significant hoger bij de CVS-individuen, terwijl de expressie van CD25 [IL-2 receptor α-keten] significant lager was.

[…] In onze studie was het percentage NK-cellen dat CD57 tot expressie brengt gelijkaardig, hoewel de intensiteit van CD57-labeling significant lagere waarden vertoonde bij CVS-individuen. Niettegenstaande de veranderingen qua fenotype, waren er geen significante verschillen qua NK-cel cytotoxische aktiviteit (subgroep […] van stalen beschikbaar voor funktionele testen). Verder konden geen verschillen qua sensitiviteit van NK-cellen voor ex vivo cel-sterfte worden gedetekteerd […]. [Een daling van de CD57 (HNK1, human natural killer-1) lymfocyt-subset werd gesuggereerd als merker voor chronische Lyme…]

T-cel fenotype en funktie

Meerdere auteurs hebben gewezen op een algemene toestand van T-cel aktivatie bij CVS die consistent zou kunnen zijn met virale infekties. […]. Hier vertoonden CD4 T-cellen van CVS-individuen en controles gelijkaardige waarden qua naïeve (CD45RA+CCR7+CD27+CD28+), centrale (CD45RA-CCR7+CD27+CD28+), transitionele (CD45RA-CCR7-CD27+CD28+), effector (CD45RA-CCR7-CD27+CD28-) en terminaal gedifferentieerde geheugen (CD45RA-CCR7-CD27-CD28-) cellen. De meeste CD8 T-cel subsets waren ook gelijkaardig, hoewel CVS-individuen een lagere frequentie cellen met een effector-fenotype (gedefinieerd als CD8 T-cellen met de merkers CD45RA-CCR7-CD27-CD28+) vertoonden. Deze observatie zou verband kunnen houden met het lager niveau qua CD56 expressie bij CD3+ cellen, hoewel de heterogeniteit van deze laatste populatie een fatsoenlijke interpretatie van de gegevens belemmert. We analyseerden ook meerdere merkers voor immunosenescentie of immune uitputting; met tegenstrijdige resultaten: CVS en controles hadden gelijkaardige expressie van de T-cel immunosenescentie merker CD57 bij CD4 en CD8 T-cellen, terwijl verschillen qua expressie van uitputting-merkers PD-1 [Programmed cell death protein 1, CD279] en CD95 [Fas; trans-membraan proteïne van de TNF-familie] bij CD4 en CD8 T-cellen, respectievelijk, werden gezien.

We beoordeelden de frequentie van T regulerende cellen (Treg) en meerdere proliferatie-/aktivatie-merkers. Treg cellen gedefinieerd als CD4+CD25++FOXP3+ of CD4+CD25++FOXP3+CD127- vertoonden significant hogere percentages bij CVS-individuen, wat de lagere waarden Ki67+ cellen [Ki67 is een nucleair proteïne geassocieerd met cel-proliferatie] bij de CD4 T-cellen vergezelt. In tegenstelling daarmee vertoonden CD8 T-cellen geen verschillen qua Ki67 positiviteit, hoewel CVS-individuen hogere expressie van CD5, een merker geassocieerd met verstoorde T-cel responsen, etaleerden. De CVS-groep vertoonde ook lagere waarden wat betreft de aktivatie-merker CD38 bij totale en geheugen (CD45RO+) CD8 T-cellen [CD45RA & CD45RO isoformen van het algemeen leukocyten-antigen identificeren afzonderlijke ‘naïeve’ en ‘geheugen’ T cel-subsets; CD45RO+ percentage stijgt met de leeftijd]. Ondanks deze kleine verschillen qua T-cel subsets, waren ex vivo proliferatieve responsen van CD4 T-cellen significant lager bij CVS maar niet verschillend voor CD8 T-cellen. Ten slotte: er werden geen verschillen opgemerkt wat betreft cel-sterfte voor CD4 en CD8 T-cellen.

Als geheel suggereren deze gegevens een verstoorde T-cel respons bij CVS-individuen geassocieerd met verhoogde Treg aantallen en met enkele specifieke merkers bij CD4 én CD8 T-cellen, maar niet direct veroorzaakt door een algemene toestand van immunosenescentie.

Analyse van T-cel & NK-cel fenotype als merkers voor CVS

[…] De NK-merkers: CD25, CD69, NKp46 (uitgedrukt als percent positieve cellen) en CD57 (als fluorescentie-intensiteit) in combinatie met de T-cel subsets: regulerende, proliferatieve Ki67+CD4+, effector CD8+ en CD56+ T-cellen, vertoonden een hoge sensitiviteit (100%) maar een matig aantal vals-positieven (5/24, specificiteit 79%). Een meer restriktieve keuze qua parameters, met alleen maar NK-cel merkers, gaf een gelijkaardig aantal vals-positieven (5/23, specificiteit 78%) maar lagere sensitiviteit (95%) voor het detekteren van CVS.

Bespreking

De immunologische status van individuen die lijden aan CVS heeft heterogene resultaten opgeleverd. Duidelijke voorbeelden zijn gegevens van verschillende CVS-groepen die in één enkel lab werden geanalyseerd. Deze observaties zouden het gevolg kunnen zijn van een intrinsieke heterogeniteit in de klassificatie van CVS-individuen of zou verband kunnen houden met de aanwezigheid van infekties bij de gerecuteerde individuen bij de verschillende studies. Bijzonderlijk infekties met herpes-virussen of enterovirussen, welke als meer frequent bij CVS-individuen werden beschreven, zijn gekende modulatoren van het immuun-fenotype. We hebben een brede screening van het fenotype en de funktie van B-, NK- en T-cellen bij CVS uitgevoerd. In tegenstelling tot andere studies, was ons belangrijkste inclusie-criterium gefocust op de afwezigheid van aktieve infekties, i.p.v. op de met CVS gerelateerde co-morbiditeiten. Hoewel dit een beperking zou kunnen zijn, aangezien co-morbiditeiten ook de immuun-status kunnen beïnvloeden, dachten we dat deze criteria een meer homogeen immuun-profiel voor CVS zouden kunnen bieden.

Onze gegevens suggereren dat de meeste verschillen tussen CVS en gezonde controles werden geobserveerd bij NK- en T-cellen; terwijl het B-cel compartiment een gelijkaardige samenstelling in beide groepen vertoonde. Belangrijk: deze verschillen konden niet worden verbonden met het gebruik van meerdere medicijnen of co-morbiditeiten, hoewel de grootte van het staal bij onze studie de statische kracht van de analyses beperkte. De afwezigheid van B-cel wijzigingen die bij onze studie werd geobserveerd, contrasteert met de aktieve rol voor B-cellen en auto-immune responsen bij CVS die werden benadrukt door het klinisch gebruik van Rituximab [zie Bansal et al., link hierboven]. De mogelijkheid dat B-cel wijzigingen beperkt blijven tot weefsel B-cellen [niet in het bloed] zou deze klaarblijkelijke contradictie kunnen verklaren. Er moet echter worden opgemerkt dat in tegenstelling tot NK- en T-cel merkers die hier werden beschreven, de parameters van het B-cel fenotype heterogene waarden vertoonden en meer leken te worden beïnvloed door anti-oxidante/analgetische behandelingen. Dit zou een tweede beperking kunnen van onze studie kunnen zijn; zodoende is een meer gedetailleerde analyse van het B-cel fenotype en werking gebruikmakend van grotere groepen vereist om de rol van deze cellen bij CVS volledig te begrijpen.

Er wordt een verschillend scenario gezien bij NK-cellen. Hier vertoonden meerdere merkers consistente veranderingen bij CVS-individuen en illustreren we een gebrekkige NK-cel populatie met hoge CD69- en lage CD25-expressie, een paradoxaal fenotype dat werd beschreven bij acute influenza infektie of vaccinatie, en dat is duidelijk in conflict is met gegevens die lage CD69-expressie in NK- en T-cellen rapporteren bij CVS-individuen. Op te merken valt dat dit werk CD69-expressie heeft gemeten na in vitro stimulatie, terwijl onze gegevens werden verkregen via verse, ongestimuleerde cellen. Hoewel dus klaarblijkelijk tegenstrijdig, zouden beide gegevens verschillende aspekten van of een ontregelde CD69-expressie bij CVS kunnen weerspiegelen. We hebben ook gestegen waarden van NKp46 [CD335; een natuurlijke cytotoxciteit receptor (NCR)] expressie bij CVS-individuen gezien. Interessant is dat de expressie van deze receptor werd gelinkt aan T-cel responsesn in muis-modellen; er kon echter geen duidelijke associatie worden gevonden in onze groep. Het fenotype van NK-cellen wordt gecontroleeerd door genetische, epigenetische en omgeving-factoren, en vat waarschijnlijk de infektueuze geschiedenis van een individu samen als een slecht begrepen vorm van immunologisch geheugen. Specifieke fenotypes bleken geassocieerd met infektueuze agentia, zoals CMV of influenza. Hoewel het verleidelijk is te speculeren omtrent een gemeenschappelijke infektueuze geschiedenis in onze CVS-groep, toonde de analyse van hun serologische status voor sommige virussen (CMV, EBV, parvovirussen) geen duidelijke link tussen vroegere infekties en huidig NK-cel fenotype. Waarschijnlijk zijn bredere studies vereist om deze relevante kwestie te beantwoorden en de associatie tussen NK-cel fenotype en verstoorde lytische aktiviteit te bevestigen […]. De NK-funktie daal met de leeftijd, een fenomeen dat verbonden is met NK-immunosenescentie dat kan worden bewezen via de verhoogde expressie van CD57, aanwezig in terminaal gedifferentieerde NK-cellen. Er bestaat echter geen consensus over de rol van CD57 bij immunosenescentie van NK-cellen, en CVS bleek geassocieerd met lage expressie van CD57; een observatie die ten delen werd bevestigd in onze groep.

De meest onverwachte gegevens in onze groep CVS-individuen houdt verband met het T-cel fenotype en funktie, welke zou kunnen worden gedefinieerd als een veralgemeende verlaagde responsiviteit. Deze gegevens staan in contrast met beschrijvingen van hoge T-cel aktivatie bij CVS maar zijn consistent met ander meldingen die gereduceerde CD8 cytotoxische aktivieit beschrijven. Nogmaals: de aanwezigheid van aktieve virale infekties op het tijdstip van de staalname kan een bron voor heterogeniteit zijn. Anderzijds zou het lekken van bakteriële produkten uit de darm ook T-cel aktivatie kunnen bepalen. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, analyseerden we de plasma-concentraties van sCD14 [werkt als co-receptor voor de detektie van bakterieel lipopolysaccharide] bij gezonde en CVS-individuen; deze vertoonden mediane waarden (4.,5 en 4,7 μg/ml, respectivelijk, p = 0.44), wat suggereert dat darm-lekkage geen belangrijke bijdrage levert aan de immuniteit-veranderingen bij onze groep.

Onze gegevens zouden een algemeen gebrek van de T-cel funktie – dat kan worden geobserveerd gebruikmakend van merkers in de CD4- en CD8-subsets – kunnen suggereren. Terwijl CD4 T-cellen lagere Ki67-labeling en ex vivo proliferatie vertonen, vertonen CD8 T-cellen geen proliferatieve verschillen maar lagere CD56-expressie, effector (CCR7-CD45RA-) -cellen, CD38+ cellen en hogere expressie van CD5, een merker voor anergie geassocieerd met aanhoudende antigen-blootstelling. Bovendien lijkt deze algemene toestand van T-cel hypo-responsiteit geen verband te houden met immunosenescentie, aangezien er geen verschillen qua CD57 of geen verhoogde waarden van CD27- [geen drager van de TNF-receptor; CD27 is vereist voor het genereren en onderhouden van T-cel immuniteit] of CD28- [negatief voor CD28; CD28 biedt co-stimulerende signalen die vereist zijn voor T-cel aktivatie] cellen tussen de groepen werden geobserveerd. Een belangrijke factor wat betreft de controle van T-cel responsen is de funktie van Treg cellen, die significant verhoogd zijn in onze groep CVS-individuen; wat gegevens van een andere studie bevestigt [zie eerder: Brenu et al.]. Hoewel geen duidelijke correlatie tussen Treg-frequentie en andere merkers voor het NK-cel of T-cel fenotype werd gezien; zou een aktieve rol voor Treg kunnen worden ondersteund door de gerapporteerde gegevens betreffende belangrijke mediatoren van Treg-werking, zoals TGF-β, dat ook ge-upreguleerd lijkt bij CVS-individuen [zie ‘TGF-beta – vermoeidheid, neuro-protektie’ & ‘TGF-β1 expressie in PBMCs bij CVS].

Het potentieel gebruik van de in deze studie geïdentificeerde immunologische merkers werd onderzocht via cluster-analyses [klassificeren of groeperen in ‘clusters’ of ‘klassen’ op basis van bepaalde kenmerken]. Hoewel de beste resolutie zowel T- als NK-cel merkers vereiste, identificeerden we ook een robuste combinatie van NK-cel merkers die bruibaar kan zijn voor diagnose-stelling. Deze combinatie omvat CD25-, CD69- en NKp46-expressie van CD56+CD16+ cellen en CD56-expressie van CD3+ cellen, wat een flow-cytometrie strateyie met 5 kleuren suggereert. Een bredere groep parameters inclusief FOXP3 en Ki67-expressie van CD4 T-cellen verbeterde echter de specificiteit. Het gebruik van deze mogelijke combinaties als diagnostische instrumenten vereist validering via verdere studies, met grotere groepen én meer verscheiden patiënten.

Tot besluit: de in deze studie onderzochte CVS-individuen vertonen geen verschillen wat betreft het B-cel compartiment, gebrekkige NK-cellen en slecht responsieve T-cellen. De geobserveerde immunologische gebreken leveren geen oorzakelijke link voor de ziekte op maar zouden sommige van de symptomen – in het bijzonder de slechte beheersing van virale infekties die bij deze individuen wordt gerapporteerd – kunnen verklaren. Enkele van deze merkers, samen met andere eerder beschreven zoals NK-funktie of DPPIV, zouden echter bruikbaar kunnen zijn voor de karakterisering van CVS. Er bestaan echter nog belangrijke obstakels om een betrouwbare combinatie van immuniteit-biomerkers voor CVS te bekomen. Ten eerste: de mogelijke verschillende etiologieën of co-morbiditeiten van CVS, en ten tweede: de duidelijke identificatie van de doelwit-populatie (M.E., CVS of beide). Bijkomend: immunologische merkers zouden wel es slechts een deel van het complexe pathogeen spectrum van M.E./CVS kunnen onthullen. Meest waarschijnlijk zullen immuniteit-kenmerken in combinatie met een gedetailleerde analyse van infekties, en beschreven [zie o.m. ‘Neuropeptide-Y: biomerker voor symptoom-ernst bij CVS’ & ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS] neurologische en metabole aandoeningen, de sleutels kunnen bieden om een volledige set merkers te definiëren die behulpzaam zijn voor onze kennis van de CVS-pathogenese en zijn klinisch management.

————————-

Nog uit het eerder vermelde interview met Dr Blanco:

“De auto-immuniteit link met CVS maakte deel uit van onze initiële hypothese. Dat we geen verschillen qua B-cel subsets vonden, staat in contrast hiermee. We vonden (zoals anderen) een hogere frequentie van regulerende T-cellen (met als één van de voornaamste funkties auto-immune responsen te beheersen) De gegevens suggereren dat auto-immune responsen fatsoenlijk onder controle zijn bij CVS. Deze paradox, die verband zou kunnen houden met andere B-cel funkties moet nog worden opgelost.”

“We waren ook verrast door het ontbreken van verschillen in NK-cel aktiviteit. Die gegevens werden gegenereerd uit een subgroep van patiënten, wat de statistische kracht dus reduceerde. Ik denk dat dit de hoofd-oorzaak is van dit klaarblijkelijk gebrek aan verschil.”

“Zoals eerder vermeld suggereren onze gegevens dat auto-immuniteit geen belangrijke rol speelt bij CVS. Gegevens omtrent Rituximab-behandeling suggereren echter een klinische verbetering. Om deze ogenschijnlijke paradox (want er werden hier geen significante verschillen in B-cel fenotype/funktie gevonden) op te lossen zou een diepgaande analyse van B-cellen vóór en na Rituximab-behandeling zeer behulpzaam zijn. Het zou kunnen dat Rituximab indirect werkt, via het verwijderen van B-cellen die cytokinen aanmaken die bijdragen tot CVS-symptomen. Dit dient echter nog duidelijk te worden aangetoond.”

“Het artikel door Bansal et al. [link hierboven] suggereert abnormaliteiten van B-cellen (“subtiele ontregeling”) bij CVS. Enkele van deze veranderingen lijken te passen bij onze gegevens. We vonden een lichtjes gedaald aantal antilichaam-producerende cellen een laag niveau circulerend IgG bij sommige individuen. Jammer genoeg waren deze wijzigingen niet consistent bij onze patiënten en waren ze niet nuttig bij het identificeren van CVS.”

januari 19, 2013

Immuun-geheugen & virale infektie bij M.E.(cvs)

Filed under: Immunologie,Infektie — mewetenschap @ 9:29 am
Tags: , , , , , , ,

Hier volgt een overzicht-artikel over de stand van zaken aangaande de immuniteit bij M.E.(cvs), door de groep waarvan we eerder het stuk meegaven over veranderingen bij de subgroepen B-lymfocyten (zie ‘Gewijzigde funktionele B-cel subgroepen bij M.E.(cvs)’). Gezien veel zaken reeds op deze pagina’s aan bod kwamen, beperken we ons hier tot de stukken over immuun-geheugen en mogelijke nieuwe behandelingen.

 ————————-

Brain Behav Immun. 2012 Jan; 26(1):24-31

Chronic Fatigue Syndrome, the immune system and viral infection

A.S. Bansal (a), A.S. Bradley (a), K.N. Bishop (b), S. Kiani c, B. Ford (a)

a Dept. of Immunology, Epsom and St. Helier University Hospitals NHS Trust, Carshalton, Surrey, SM5 1AA and Chronic Illness Research Team, Stratford Campus, University of East London, London E15 4LZ, UK

b Division of Virology, MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, UK

c Dept. of Immunology, Kings College Hospital, Denmark Hill London, UK

Samenvatting

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), zoals het via de huidige criteria wordt gedefinieerd, is een heterogene aandoening met gemeenschappelijke symptomen die dikwijls volgt op een virale infektie of een periode van stress. Ondanks vele jaren van intens onderzoek is er weinig consensus aangaande de aanwezigheid, aard en graad van immuun-dysfunktie bij deze aandoening. Licht verhoogde parameters van inflammatie en pro-inflammatoire cytokinen zoals interleukine (IL) 1, IL-6 en tumor necrose factor (TNF) zijn echter waarschijnlijk aanwezig. Verstoorde ‘natural killer’ cel funktie lijkt daarenboven evident. Er werden veranderingen qua aantallen T-cellen beschreven door sommigen en dan weer niet door anderen. Hoewel de prevalentie van een positieve serologie voor de courante herpes-virussen niet verschillend lijkt van gezonde controles, is er enig bewijsmateriaal voor virale persistentie en ontoereikende inperking van virale replicatie. De capaciteit van bepaalde herpes-virussen om de ontwikkeling van T-cel geheugen te verstoren, zou deze virale persistentie kunnen verklaren alsook het aanhouden van de symptomen. Nieuwe therapieën gebaseerd op dit begrip zullen waarschijnlijk meer voordeel opleveren dan de huidige methodes.

1. Inleiding

[…]

Er wordt al lang gedacht dat CVS een significante immunologische component heeft. Dit is omwille van de aard van de symptomen en het vinden van abnormaliteiten van het immuunsysteem. Het is echter nog steeds niet duidelijk of deze defekten de oorzaak of het gevolg van CVS zijn. Wel duidelijk is dat behandelingen die het immuunsysteem moduleren kunnen resulteren in een klinische verbetering. Dit overzicht zal focussen op de rol van verstoord immunologische geheugen bij CVS, in het bijzonder met betrekking tot virale infekties en mogelijke therapeutische interventies. It Er moet echter worden opgemerkt dat het immuunsysteem significant wordt beïnvloed door stress, stemming en slaap-stoornissen. Dysfunkties op deze vlakken kunnen immuniteit-veranderingen initiëren of bestendigen die bijdragen tot een vatbaarheid voor ernstige of langdurige virale infektie en de ontwikkeling van CVS.

2. Heterogeniteit van CVS in relatie tot immuun-dysfunktie

3. Cytokine-ontregeling

4. Cellulaire dysfunktie

5. CVS en virale infektie

[…]

De huidige literatuur is gemengd wat betreft de sero-prevalentie van de courante virussen bij CVS-patiënten en dit kan, ten minste in zekere mate, worden toegeschreven aan de verschillende virale antigenen die worden gebruikt bij verschillende serologische studies. Bovendien waren de criteria die werden gebruikt ter diagnose van CVS anders tijdens de periode vóór 2000 in vergelijking met studies van daarna.

[…]

6. CVS, immuun-deficiëntie en verstoord immunologisch geheugen

We hebben gezien dat de frequentie van vermoeidheid en andere symptomen die compatibel zijn met CVS (diagnose via de Canadese en de Fukada criteria), ten minste twintig maal hoger ligt bij patiënten met primaire antilichaam-deficiëntie (ongepubliceerd). Daarnaast hebben we ook verstoorde specifieke antilichaam-produktie vastgesteld bij een aantal patiënten met CVS waarvan de serum-antilichaam-niveaus anderzijds binnen normale waarden liggen. Deze patiënten hadden terugkerende keelpijn gepaard met bronchitis, maar geen longontsteking of invasieve ziekte. Samen suggereren deze bevindingen dat immuun-dysfunktie voorbestemt tot CVS-achtige symptomen en dat ten minste sommige patiënten met CVS een defekt van het immuun-geheugen vertonen. Inderdaad: ons vroeger werk bevestigt een defekt van zowel B- als T-cel geheugen bij patiënten die voldoen aan de Fukada en de Canadese criteria voor CVS. […]

Normaliter blijkt het B-cel geheugen te worden onderhouden door een combinatie van lang-levende geheugen-cellen en constante antigen-stimulatie van B-cellen in lymfe-klieren, door antigen dat wordt vastgehouden in folliculaire [in de lymfe-klieren] dendritische cellen [DCs; een type witte bloedcellen, antigen-presenterende cellen die immuun-responsen initiëren en reguleren]. Bij patiënten met vastgestelde immuun-deficiëntie werden verminderingen van verscheidene geheugen B-cel populaties bevestigd bij degenen met gewone variabele immuun-deficiëntie (CVID). Interessant is dat verminderde aantallen ge‘switch’te [van immuunglobluline-isotype gewisselde] geheugen B-cellen (CD19, CD27+IgD-) werden gevonden bij CVID-patiënten met splenomegalie en een neiging tot granulomateuze orgaan-infiltratie. [Zie link in onze inleiding] Bij die patiënten met auto-immune manifestaties is het aantal niet-geswitchte geheugen B-cellen verhoogd. Bij patiënten met CVS werd een vermindering van het aantal CD19/IgM+ B-cellen [rijpe B-lymfocyten] waargenomen [Lundell et al. Clinical activity of folinic acid in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Arzneimittelforschung (2006) 56: 399-404] alhoewel de exacte betekenis hiervan onduidelijk is aangezien CVS nooit werd gekoppeld aan een tekort van antilichaam-immuniteit of terugkerende bakteriële infekties. In een andere studie bleek echter een monoklonaal antilichaam [rituximab] dat B-cellen uitput, wezenlijke verbetering van de klinische symptomen bracht bij drie patiënten met CVS, wat suggereert dat B-cellen een rol in de pathogenese van CVS hebben. Of B-cellen die EBV herbergen werden verwijderd door dit proces, is niet formeel onderzocht, maar duidelijk aannemelijk.

T-cel geheugen blijkt complexer en is gedeeltelijk gebaseerd op de sterkte van de initiële T-cel receptor – antigeen-MHC-interaktie. Terwijl acute virale infekties vaak uitgesproken expansie van de naïeve T-cel pool stimuleren, kunnen chronische virale infekties met aanhoudende immuun-stimulatie leiden tot immuun-uitputting, in het bijzonder van de CD8 T-cellen. De mate van klonale expansie is belangrijk en CD8 T-cel geheugen vereist een combinatie van IL-15 en in mindere mate IL-7, terwijl CD4-geheugen zowel T-cel receptor stimulatie en IL-7 vereist. Stroomafwaarts daarvan bepalen het evenwicht van pro-apoptotische factoren […] en anti-apoptotische factoren […] het lot van T-cellen. Overleving-genen […] winnen aan belang vanwege hun vermogen om expressie van de IL-15α receptor (CD122) te handhaven. Dit blijkt bijzonder belangrijk bij CD8 T-cel geheugen […]. Voor alle T-cellen wordt lang-levend geheugen sterkst onderhouden door verdere antigen-stimulatie of kruis-reaktieve antigeen-stimulatie. Dit is zeker duidelijk bij persistente virale infekties zoals deze veroorzaakt door EBV en HIV.

Tijdens een initiële immuun-respons blijken CD8 T-cellen massieve expansie te vertonen en daarna inkrimping met daaropvolgend lang-levende stabiele geheugen-populaties. Deze fases zijn veel minder intens bij CD4 T-cellen die ook een zeer traag verlies van geheugen-cellen vertonen.

Er is ook werk dat het belang van IL-15 bij het genereren en onderhouden van […] geheugen T-cellen bevestigde. Zo hebben experimenten IL-15 afhankelijke dendritische cellen (DC) aangetoond bij het optimaliseren van de overleving en proliferatie van NK-cellen en […] geheugen T-cellen. […] Ander werk heeft stabiele complexen van IL-15 met zijn receptor aangetoond op cel-oppervlakken. De IL-15α receptor presenteerde IL-15 […] zodat stimulatie van naburige T- en NK-cellen werd toegelaten. Hoewel deze complexen endosomale internalisering [het naar binnen in de cel brengen d.m.v. endosomen (blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan)] ondergingen, bleken ze resistent tegen lysosomale afbraak en werden naar het celoppervlak verplaatst als een reservoir van IL-15 dat geheugen-funktie […] geheugen T-cellen handhaafde. Dergelijke complexen zouden het ontbreken van significante circulerende niveaus van IL-15 kunnen verklaren, alsook de noodzaak van cel-tot-cel nabijheid voor het verzekeren van een sterke co-stimulerende funktie. Interessant is dat ander werk gereduceerde CD8 T-cel en NK-cel cytotoxiciteit aantoont bij 95 patiënten met CVS vergeleken met 50 gezonde controles [zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)]. Ons eigen werk heeft ook significant gedaalde geaktiveerde CD8+ CD27+ CD28+ cytotoxische geheugen-T-cellen aangetoond bij 14 patiënten met CVS, alsook een trend naar verminderde IL-15Ra expressie na aktivering door mitogeen (ongepubliceerd).

Er is nu een goed bewijsmateriaal voor het feit dat EBV grote veranderingen in T-cel geheugen-funktie kan veroorzaken. Zo was, bij acute door EBV geïnduceerde mononucleose, de expressie van IL-7Rα verloren bij alle CD8+ T-cellen, inclusief EBV-epitoop [deel van een antigen] specifieke populaties. Terwijl de expressie snel weer werd herwonnen op de totale CD8+ cellen, ging dit slechts langzaam en onvolledig op EBV-specifieke geheugen-cellen. In tegenstelling hiermee: hoewel de expressie van IL-15α ook verloren ging bij acute EBV mononucleose, bleef dit on-aantoonbaar, niet enkel op EBV-specifieke CD8+ populaties, maar op de gehele perifere T- en NK-cel voorraad. Van belang is dat dit defekt qua IL15Rα-expressie en de gebrekkige IL-15 respons in vitro consistent werd waargenomen bij patiënten tot 14 jaar na infektueuze mononucleose (IM). Het was echter afwezig bij patiënten na cytomegalovirus (CMV)-geassocieerde mononucleose, bij gezonde EBV-dragers zonder voorgeschiedenis van IM en bij EBV-naïeve personen. Het is mogelijk dat een dergelijke situatie even zeer waarschijnlijk is bij ten minste een deel van de patiënten met CVS met een acuut ontstaan en volgend op een virale ziekte. Zo zou EBV verantwoordelijk kunnen zijn, niet enkel voor het veroorzaken van een defekt van zijn eigen controle, maar misschien ook voor een vermindering van immuun-aktiviteit voor andere ziekteverwekkers. Interessant is dat EBV-infektie geassocieerd kan zijn met de produktie van verschillende auto-antilichamen met een verschillende aviditeit [binding-neiging] en klinische betekenis. Het is momenteel niet duidelijk of anti-cytokine antilichamen aanwezig zijn bij patiënten met CVS zoals werd ontdekt bij een aantal schijnbaar niet verwante aandoeningen. Deze omvatten chronische mucocutane candidiase [erfelijke immuun-deficiëntie waarbij de T-lymfocyten slecht funktioneren, waardoor het lichaam minder goed in staat is schimmel- en gist-infekties af te weren] (IL-17), pulmonale alveolaire proteïnose [long-aandoening] (GM-CSF [het cytokinegranulocyte macrophage colony-stimulating factor’]), bepaalde types verspreide niet-tuberculeuze mycobacteriose [nfektie met Mycobacteria] (IFN-γ) en sommige mensen met een ernstige stafylokokken-infektie van de huid (IL-6).

7. Behandel-opties voor CVS via immuun-modulatie en anti-virale therapie

Het is duidelijk dat de huidige behandel-strategieën slechts een beperkte capapciteit hebben om CVS te ‘genezen’ en de lichamelijk en mentale stamina te herstellen tot die van vóór de ziekte. Routine anti-inflammatoire agentia zijn, hoewel ze nuttig zijn bij een kleine groep individuen, weinig effektief om de aanhoudende virale proliferatie tot stilstand te brengen en de immuun-geheugen funktie te herstellen, die verdere virale infekties voorkomt. Dit is ook waar voor glucocorticoïde steroïden die de synthese van pro-inflammatoire cytokinen kunnen reduceren maar niet in staat zijn anti-virale cellulaire immuniteit en immuun-geheugen te stimuleren. Inderdaad: ze verslechteren dikwijls de anti-virale immuniteit. Intraveneuze immunoglobulinen therapie pakt ook de immuun-dysfunktie niet aan en reduceert verder de NK-cel aktiviteit zoals steroïden. Het is niet verrassend dat ze geen nut hadden bij 99 patiënten met CVS die in een dubbell-blinde, placebo-gecontroleerde proef gedurende 3 maanden werden behandeld met 3 verschillende dosissen IV Ig met een maandelijks interval [Vollmer-Conna U, Hickie I et al. Intravenous immunoglobulin is ineffective in the treatment of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Am J Med (1997) 103: 38-43]. Wat betreft interferon-therapie: dit is in staat cellulaire immuun-funktie te stimuleren. Bij 7 CVS-patiënten met initieel verstoorde NK-cel funktie gedurende 12 weken behandeld met interferon-α2a, was een significante verbeterde leven-kwaliteit vast te stellen [See DM & Tilles JG. Alpha-Interferon treatment of patients with Chronic Fatigue Syndrome. Immunol Invest (1996) 25: 153-164]. Het was onduidelijk waarom er geen verbetering was bij patiënten met verstoorde lymfocyten-proliferatie of CVS-patiënten in het algemeen. Ook onverklaarbaar is waarom de NK-cel funktie bij deze patiënten verstoord was, terwijl andere onderzoekers verhoogde waarden qua interferon-induceerbare proteïnen hebben gerapporteerd bij patiënten met virale en chemisch geïnduceerde CVS. Niettemin is verder werk nodig om na te gaan of interferon-therapie die subgroep CVS-patiënten met aantoonbare verstoorde cellulaire immuniteit zou kunnen helpen. Het is duidelijk dat de mogelijkheid van het induceren van nieuwe auto-immuniteit (in het bijzonder tegen schildklier-weefsel) dient te worden afgewogen tegen een mogelijk nut.

Gebaseerd op het verstoord immuun-geheugen bij patiënten met CVS, met name dit dat de CD8 T-cel populatie aantast, wat vooral belangrijk is bij het beheersen van EBV-geïnfekteerde B-cellen, zouden 4 behandeling-methoden nuttig kunnen blijken. De eerste zou het herstellen van CD8 T-cel geheugen funktie gebruikmakend van complexen van IL-15Ra en IL-15 kunnen omvatten. Bij muizen heeft dit sterk de halfwaarde-tijd en de biologische beschikbaarheid van IL-15 doen toenemen, leidend tot een aanzienlijke proliferatie van geheugen CD8 T-cellen, NK-cellen en NK T-cellen. Tot op heden zijn er geen studies betreffende het effekt van IL-15 op geheugen T-cellen bij CVS.

De tweede methode zou het gebruik van agentia die aktief zijn tegen EBV omvatten. In dit geval bleek het gebruik van valacycolvir in een dubbel-blinde, placebo-gecontroleerde proef (36 maanden) de cardiale dysfunktie te verbeteren en waren patiënten met bevestigde CVS in staat terug een normaal leven op te nemen [Lerner AM et al.. Valacyclovir treatment in Epstein-Barr virus subset Chronic Fatigue Syndrome: thirty-six months follow-up. In Vivo (2007) 21: 707-713]. Daarnaast werd in een open-label studie aangetoond dat valgancyclovir ook zeer voordelig was bij 12 patiënten met symptomen die zeer suggestief waren voor CVS, en die hoge titers antilichamen tegen HHV6 en EBV hadden. De resultaten van de gerandomiseerde, dubbel-blinde studie leken, hoewel niet formeel gepubliceerd, geen significant nut te hebben aangetoond; wat suggereert dat continue EBV/virale suppressie tenminste gedeeltelijk herstel van het globaal T-cel geheugen vereist om doeltreffend te zijn.

Ten slotte hebben Lerner et al. [Virus Adaptions and Treatment (2010) 2, 47-57], in een retrospectieve analyse, gerapporteerd over significant voordeel van ongeblindeerde toediening van valacyclovir of valgancyclovir bij 142 patiënten met CVS (behandeld tussen 2001 en 2007) die allen een aktieve EBV, CMV of HHV6 infektie hadden. Verbetering van CVS werd gemeten met behulp van een energie-index. Aktieve infektie werd vastgesteld als IgM-serologie positief was voor het viraal kapsel antigeen p18 en/of vroege antigeen-D (EBV), sterk verhoogde antilichamen tegen HCMV-stam AD69 lysaat en IgM HCMV p52 (CMV), en IgM- en IgG-titers > 1/160 voor HHV6-infektie.

De derde methode steunt op werk dat suggereert dat rapamycine [krachtig immunosuppressief medicijn, gebruikt bij orgaan-transplantatie] dat mTOR [TOR = ‘Target Of Rapamycin’; de ‘m’ staat voor ‘mammalian’ – van zoogdieren; mTOR is een centrale regulator van de cel-groei en proliferatie in respons op omgeving-stimuli zoals groei-factoren of nutriënten] inhibeert, ook geheugen CD8 T-cel responsen door virale infekties en vaccinaties zou kunnen aanwakkeren. Het kan daarom mogelijk van nut zijn bij patiënten met CVS.

De vierde methode behelst de adoptieve transfer van ex-vivo [buiten het lichaam] geëxpandeerde CD8 T-cellen gestimuleerd door EBV in het bijzonder, maar misschien ook door andere chronische virussen. Deze vorm van therapie werd voorgesteld behulpzaam te zijn bij EBV-gerelateerde kanker en werd ook gebruikt bij post-transplantatie lymfoproliferatieve ziekte. Hoe dan ook moet verder onderzoek ook kijken naar veranderde Treg-cellen en Th17-cel funktie alsook de betekenis controleren van de toegenomen Th2-cellen en verstoorde Th1-cellen bij CVS. Deze verschillende lymfocyt-subgroepen hebben centrale rollen bij de immuniteit tegen virussen en de immuun-respons, en zijn waarschijnlijk ontregeld bij CVS.

8. Samenvatting

Er zijn belangrijke uitdagingen aangaande de analyse van de immuun-funktie bij een aandoening die zo heterogeen is als CVS, waar de oorzaak onbekend is. Voeg daar de uitgesproken variabiliteit (van dag tot dag en van uur tot uur) qua symptoom-ernst aan toe en er moet vast variatie zijn qua niveaus van proteïnen zoals cytokinen – die een kort half-leven hebben. Verdere complicaties zijn evident bij de analyse van immuun-cellen die kunnen variëren qua aantal afhankelijk van het tijdstip van de dag en zelfs matige inspanning. Bovendien is nu vastgesteld dat stress en slaap-stoornissen, die courant voorkomen bij CVS, de immuun-funktie kunnen wijzigen. Koppel dit aan de kwetsbare aard van de meeste cytokinen (wat onmiddellijke scheiding van bloedcellen en serum vraagt) met de uitgesproken variatie qua test-gevoeligheid en -reproduceerbaarheid, en het valt makkelijk te begrijpen waarom er weinig consensus in de literatuur bestaat over de exacte immuun-dysfunktie bij CVS. Niettemin sugeereert de CVS-literatuur als geheel matig verhoogde circulerende pro-inflammatoire cytokinen en een vertekening in de richting van verstoorde cellulaire immuniteit. Er is meer werk nodig om het stress-niveau en slaap-stoornissen bij de studie-populatie in rekening te nemen en de immuun-funktie te correleren met de perceptie van de patient over hoe ernstig hun symptomen waren ten tijde van de immuniteit-analyse. Van uiterst belang: er zijn dringend meer longitudinale studies nodig die de immuun-funktie onderzoeken in relatie tot de ernst van de CVS-symptomen. Het is waarschijnlijk dat virale infektie(s) en immuun-dysfunktie bij CVS interageren op zo’n manier dat de omstandigheden nodig voor het doen voortduren van de symptomen worden bestendigd. […] Het is waarschijnlijk dat een initiële virale infektie of stress – alleen of gecombineerd – leidt tot een toestand van verstoorde cellulaire immuniteit, immuun-geheugen dysfunktie en verstoorde NK-cel aktiviteit. Dit bevordert reaktivatie van eerder opgelopen EBV of verwante virus-infektie en brede verspreiding van de originele virale infektie. EBV en andere virale proteïnen stimuleren de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen die bijdragen tot vermoeidheid, lichte koorts, pijn, slaap-stoornis en inaktiviteit. De ernst en langdurige aard van deze symptomen bevordert verdere stress die leidt tot een continue verlamming van de immuniteit en produktie van immuun-ontregelende virale proteïnen. Deze laatste bestendigen dan de immuun-dysfunktie en doen de symptomen aanhouden. In de optiek van de betekenisvolle interaktie tussen elk van deze gebieden, zullen behandelingen die simultaan gericht zijn tegen meerdere gebieden, waarschijnlijk meer succesvol zijn dan deze die selektief voor één gebied worden gebruikt.

juli 15, 2012

Overmaat aan KIRs & tekort aan HLA-Bw4 bij CVS

Filed under: Genetica,Immunologie — mewetenschap @ 6:16 am
Tags: , , ,

Op deze paginas werd al meermaals gerapporteerd over de abnormaliteiten van Natural Killer cellen bij M.E.(cvs). Zie: Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS; ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?’); Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs); Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?; enz.

De groep van Professor Mariaclara Cuccia ondernam genetisch onderzoek naar zgn. KIR’s (‘Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors’; behoren tot de immunoglobuline super-familie en binden specifiek met MHC klasse-I eiwitten die voorkomen élke cel van het lichaam met een kern) bij M.E.(cvs). Het ‘Major Histocompatability Complex’ (MHC) omvat genen die coderen voor eiwitten op de membranen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ (‘self’) en ‘niet-eigen’ (‘non-self’) elementen (antigenen).

Door de eigenschap van virussen om T-cellen te infekteren, worden peptide-splitsing-produkten van veel van hun gecodeerde eiwitten opgenomen in ontluikende klasse-I transplantatie-antigenen (‘major histocompatibility complex’; MHC molekulen), en gepresenteerd op het cel-oppervlak van CD8 (cytotoxische) T-cellen die T-cel-receptoren (TCR) dragen die specifiek zijn voor het peptide-MHC complex.

Ten einde een pathogen uit te schakelen, tonen de antigen-presenterende cellen (APC) deze aan de NK- en cytotoxische T-cellen. Daartoe dienen de APC een proteïne, HLA (‘human leukocyte antigen’; het ‘herkenningspunt’ of zgn. ‘ligand’), op hun oppervlak te dragen, waardoor de NK-cel een onderscheid kan maken tussen ‘self’ (eigen aan het organisme) en ‘non-self’ (vreemd). De verbinding tussen de NK-cel en het HLA-proteïne op de APC is een KIR.

De resultaten uit onderstaande studie zouden kunnen verklaren waarom de NK-cellen bij M.E.(cvs) slecht werken.

————————-

Mol Med Report. 2011 4 (3): 535-40

Excess of activating killer cell immunoglobulin-like receptors and lack of HLA-Bw4 ligands: A two-edged weapon in Chronic Fatigue Syndrome

Pasi A, Bozzini S, Carlo-Stella N, Martinetti M, Bombardieri S, De Silvestri A, Salvaneschi L, Cuccia M

HLA Laboratory, Immunohaematology and Transfusion Centre, Pavia, Italy

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een inflammatoire ziekte met onbekende etiologie. Researchers hebben infekteueze, neurologische en immunologische oorzaken voor dit syndroom voorgesteld. […] Er is één vastgesteld aspekt van de ziekte: een gedaalde efficiëntie qua lytische aktiviteit van de NK-cellen bij CVS-patiënten.

Hier analyseerden we de genomische polymorfismen van ‘killer cell’ immunoglobuline-achtige receptoren (KIRs) en hun HLA klasse-I verwante liganden bij patiënten met gecertificeerde CVS. Er werd een overmaat aan KIR3DS1 gevonden bij CVS-patiënten t.o.v. controles, alsook een toegenomen frequentie van het genotype waar KIR2DS5 ontbreekt.

44 CVS-patiënten en 50 controles ondergingen ook genoom-typering voor de HLA-liganden. Bij de patiënten werd een groot deel KIR3DL1 en KIR3DS1 receptoren gevonden waar hun HLA-Bw4Ile80 bindend motief ontbrak.

We hypothiseren dat een overmaat aan KIR3DS1, gecombineerd met een overmaat aan ligand-vrije KIR3DL1 en KIR3DS1 receptoren, de verwijdering van een pathogen via NK-cellen zou kunnen hinderen, wat de chroniciteit van de infektie begunstigt.

Inleiding

[…]

Verschillen qua aanvang van symptomen (acuut of geleidelijk; na een a virale infektie zoals influenza of mononucleose, of zonder enige prodromale episode [verslechtering qua funktie voor de aktieve fase van een aandoening]), m.b.t. het verloop van de ziekte (cyclisch, bestendig, langzaam verslechterend of geleidelijk verbeterend tot een normale gezondheid) en de frequente psychiatrische en allergische co-morbiditeit; suggereren dat CVS verscheidene etiologieën heeft. Researchers hebben infekueuze, neurologische of immunologische oorzaken voor het syndroom voorgesteld.

[…]

Een overzicht van de literatuur heeft macroscopische abnormaliteiten qua aantallen immuun-cellen uitgesloten maar er is controverse omtrent andere aspekten van de werking van het immuunsysteem. Onze gegevens onthulden een pro-inflammatoir genotype bij patiënten met CVS […] [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma 874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24(2):179-182; zie ook ‘Circadiaans ritme voor cytokine-secretie]. Daarom evalueerden we de aanwezigheid van auto-antilichamen om de onderliggende genetische en immunologische factoren op te helderen die bijdragen tot de pathogenese van CVS [Ortega-Hernandez OD, Cuccia M, Bozzini S et al. Auto-antibodies, polymorphisms in the serotonin-pathway and human leukocyte antigen class II alleles in Chronic Fatigue Syndrome: Are they associated with age at onset and specific symptoms? Ann N Y Acad Sci (2009) 1173:589-599]. Er werd een hoge prevalentie van anti-endotheliale en anti-neuronale cel antilichamen geobserveerd. In tegenstelling daarmee werden geen anti-NMDA antilichamen bij de patiënten gedetekteerd. Bovendien bestudeerden we het HLA klasse-II gen DRB1 [histocompatibiliteit-antigen] en twee polymorfismen van de RAGE [receptor die ‘advanced glycation endproduct (AGE) kan binden] gen-promoter [Carlo-Stella N, Bozzini S, De Silvestri A et al: Molecular study of receptor for advanced glycation endproduct gene promoter  and identification of specific HLA haplotypes possibly involved in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol (2009) 22: 745-754] in verband met CVS, en vonden merkwaardige RAGE-HLADRB1 haplotypes bij patiënten met dit syndroom; suggestief voor een betrokkenheid van het MHC-gebied.

Onderzoekers hebben bijkomend ook twee andere gewijzigde factoren gevonden in het immuunsysteem van CVS-patiënten: verhoogde expressie van CD28+ T-lymfocyten en verminderde NK-cel funktie [Klimas N, Salvato F, Morgain R, Fletcher MA: Immunologic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Microbiol 1990, 28:1403-1410]. NK-cellen spelen een essentiële rol bij het raakvlak tussen aangeboren en adaptieve immuniteit. Onder normale omstandigheden, via de inhiberende subset ‘killer immunoglobulin-like receptors’ (KIRs) die op hun oppervlak tot expressie komen, herkennen NK-cellen ‘self’ MHC klasse-I molekulen (KIR-liganden) op het cel-oppervlak en zenden ze een inhiberend signaal om de eliminatie van normale cellen te voorkomen. Wanneer KIRs echter een beschadigde cel met ontbrekende of te weinig tot expressie komende MHC klasse-I molekulen tegenkomen, worden NK-cellen niet geïnhibibeerd en doden ze de beschadigde cel. Dit concept staat bekend als de ‘missing-self’ hypothese. De prestaties van NK-cellen wordt gegarandeerd door een behoorlijk funktionerende HLA/KIR-interaktie en we vermoeden een ontregeling op dit niveau bij CVS. Daarom analyseerden we de variabiliteit qua aan-/afwezigheid van KIR-genen en HLA klasse-I liganden in een Italiaanse populatie om dit polymorfisme, wat een mogelijke oorzaak van de NK-cel lytische dysfunktie bij CVS is, te onderzoeken

Materialen en methodes

Individuen. Patiënten gerecruteerd via 3 Italiaanse referentiecentra voor CVS (‘Oncologic Reference Centre’, Aviano, Professor U. Tirelli; ‘Department of Infectious Diseases’, Universiteit van Chieti, Professor E. Pizzigallo; ‘Department of Rheumatology’, Universiteit van Pisa, Dr L. Bazzichi). Gecertificeerde diagnose van CVS. […].

Controles: 217 gezonde individuen […].

KIR-typering. 46 willekeurig geselekteerde [CVS-]patiënten; KIR molekulaire typering [16 KIR genen] m.b.v PCR-sequentie specifieke primers (PCR-SSP) – commercële kit (Pel-Freez, Brown Deer, WI, USA) […].

HLA klasse-I ligand typering. 44 CVS-patiënten en 50 willekeurig geselekteerde controles; KIR ligand genotypering m.b.v. PCR-SSP – commercële kit (Olerup SSP AB, Hasselstigen, Saltsjobaden, Sweden) – onderzoek naar de aanwezigheid van de polymorfismen HLA-Cwasparagine80, HLA-Cwlysine80, HLA-BBw4+threonine80, HLA-BBw4+isoleucine80 en HLA-ABw4+. […].

Statistische analyse. […]

Resultaten

Prevalentie van KIR3DS1 dragers bij CVS-patiënten. […] Er werden controle-gegevens verkregen via een nationaal samenwerking-netwerk waaraan onze groep ook deelnam […]. We bevestigden de aanwezigheid van het kader KIR2DL4, KIR3DL2 en KIR3DL3 genen bij alle patiënten en bij 96-100% van de controles.

In termen van gen-inhoud (de aan- of afwezigheid van één of meerdere KIR-genen), was het percentage van dragers van meer dan 3 aktivator KIR-genen algemeen hoger bij CVS-patiënten (45,7%) dan bij controles (35,6%), hoewel het verschil niet significant was. De frequentie patiënten die het KIR3DS1 gen dragen, was significant verhoogd in vergelijking met de controles (54,3 vs. 35,4%; p = 0.017); hoewel dit resultaat niet significant was na Bonferroni correctie [statische methode ter aanpassing/verbetering van de significantie wanneer meerdere statistische testen gelijktijdig worden uitgevoerd op één set gegevens => pc] […]. Niettemin was er een trend die een associatie aangaf tussen het KIR3DS1 gen en CVS. Dus besloten we de genotypes verder te onderzoeken.

Prevalentie van het genotype van alle genen buiten het KIR2DS5-gen bij CVS-patiënten. De aan-/afwezigheid van de KIR-genen werd geanalyseerd bij CVS-patiënten t.o.v. de controles. Bijna 40 KIR-genotypes (exclusief pseudo-genen) werden in de literatuur beschreven. […]

De CVS-patiënten vertoonden 19 verschillende genotype-combinaties waarvan de haplotypes [genetische varianten; combinaties van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] niet ondubbelzinnig vastgesteld waren, aangezien er geen familie-analyse werd uitgevoerd. Daarvan waren er 10 eerder beschreven […] en 7 kwamen voor bij Italiaanse controles; de genotypes van 9 CVS-patienten en 29 controles moeten echter nog in de literatuur worden beschreven. Het genotype dat alle genen buiten KIR2DS5 bevat, bleek significant meer frequent voor te komen bij patiënten t.o.v. controles: 15,2 vs. 3,7% (p = 0.003, pc = 0.038).

Negatief ‘linkage-disequilibrium’ tussen KIR3DS1 en KIR2DL5 of KIR2DS5. Twee-punts analyse tussen de verschillende KIR-genen bij patiënten openbaarde gelijkaardige resultaten als de controles […] en bevestigt de aanwezigheid van een ‘linkage-disequilibrium’ tussen bepaalde KIR-genen. [Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controle-personen. De term ‘linkage disequilibrium’ geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.] Dit maakt de evaluatie van de onafhankelijke bijdrage van afzonderlijke KIR-genen met betrekking tot gevoeligheid of bescherming tegen de ziekte moeilijker. De meest interessante data zijn waarden [Δ; verschillen tussen de geobserveerde haplotype-frequentie en de verwachte frequentie] voor het KIR3DS1 gen, dat in positief ‘linkage-disequilibrium’ was met KIR2DS1 (Δ = 0,012; p = 0.001, pc = 0.04), zoals in de controle-populatie; maar in negatief ‘linkage-disequilibrium’ met KIR2DL5 (Δ = -0,014; p = 0.005) en KIR2DS5 (Δ = -0,001; p = 0.020); in tegenstelling tot de controles en tot de verwachte resultaten, aangezien de KIR3DS1, KIR2DL5 en KIR2DS5 genen zeer dicht bij het telomeer deel [aan het uiteinde van een chromosoom] van het KIR-gebied op de lange arm van chromosoom 19. Deze resultaten waren echter niet significant na Bonferroni correctie.

Geen verschillen tussen de HLA-ligand verdeling bij CVS-patiënten en controles. Bij de HLA klasse-I molekulen is er een dimorfisme dat een andere ligand-affiniteit voor verschillende KIR-receptoren veroorzaakt. Dit dimorfisme ligt op positie 80, waar isoleucine vervangen kan zijn door threonine in de HLA-B molekulen en asparagine door lysine in de HLA-C dimeren. Hier werd de verdeling van de HLA aminozuur-motieven bij 44/46 Italiaanse CVS-patiënten en 50/217 controles geanalyseerd […]. De verdeling van HLA-ligand motieven toonden geen statistisch significant verschil tussen patiënten en controles.

Overmaat van ligand-vrij KIR3DS1 en KIR3DL1 bij CVS-patiënten. De interaktie tussen HLA-liganden en KIR-receptoren werd onderzocht. KIR2DL1 en KIR2DS1 interageren met HLA-Cwlysine80 terwijl KIR2DL2, KIR2DL3 en KIR2DS2 met het HLA-Cwasparagine80 aminozuur-motief interageren. KIR3DL1 en KIR3DS1 interageren met HLA-BBw4+, terwijl KIR3DL2 interageert met een aantal HLA-A sequentie-motieven. De verschillende combinatie-frequenties van KIRs met hun liganden werden bepaald. Er werden belangrijke resultaten verkregen over KIR3DS1/3DL1 en HLA verwante liganden. De frequentie van individuen met een KIR3DS1-receptor vrij van zijn HLA-ABw4+Ile80 ligand was verhoogd in de CVS-groep vergeleken met de controles (36 vs 16%; p = 0.024, pc = NS). De frequentie van KIR3DL1-receptoren die hun HLA-ligand (met het Ile80 motief) missen, was ook significant hoger bij CVS-patiënten dan bij controles (79,5 versus 52%; p = 0.005, pc = 0.04). Bovendien werd een significante toename van de frequentie individuen met KIR3DS1 waar het hun HLAIle80-motief ontbreekt, waargenomen in de CVS-groep vergeleken met de controles (50 vs 22%; p = 0.004, pc = 0.032).

Bespreking

Het KIR gen-systeem bestaat uit een familie van polymorfe genen (16 funktionele en 2 pseudo-genen) die op chromosoom 19q13.4 liggen in een 1Mb gebied dat bekend staat als de leukocyten receptor complex (LRC). Associaties tussen de aanwezigheid van bepaalde KIR-genen en ziekten, zoals Reumatoïde Artritis, psoriatische artritis, sclerodermie en p-ANCA positieve vasculitis, werden beschreven. Het is echter hun specifieke interaktie met HLA-liganden die hun mogelijke betrokkenheid verklaart bij het voorkomen van immuun-gemedieerde ziekten, bij kanker-progressie, het verwijderen van een pathogeen of transplantatie-ent. Door de interaktie tussen KIR/HLA, vertegenwoordigen NK-cellen de koppeling tussen het aangeboren en adaptieve immuniteit.

Op basis van de resultaten van de huidige studie, hypothiseren we dat de aanwezigheid van het aktiverende gen KIR3DS1 gevoeligheid voor CVS kan opleveren. Dit lijkt een scenario te ondersteunen waarin het risico op het ontwikkelen van CVS bestaat, via een reeks gebeurtenissen, afhankelijk van het niveau van NK-cel aktivatie.

KIR3DS1 wordt verondersteld te behoren tot de familie van KIR3DL1, en HLA-Bw4 is zijn ligand. KIR3DS1 is opgenomen in het ‘B-haplotype’ en uitgesloten van het ‘A-haplotype’. Het is geweten dat terwijl het KIR-A haplotype relatief homogeen genetisch georganiseerd is, gekenmerkt door een hoge graad aan inhiberende genen, en het B-haplotype veel meer variabel is en een groot aantal aktiverende genen omvat. Er lijken meer akiverende KIR-genen aanwezig te zijn bij CVS-patiënten: 45,7% van de patiënten bezitten meer dan 3 aktiverende KIR-genen, vergeleken met 35,6% bij de controles. Daarom als we enkel het KIR-profiel afzonderlijk (d.w.z. zonder ligand) beschouwen, is het redelijk te argumenteren dat dit syndroom wordt veroorzaakt door ontoereikende inhibiterende regulering zoals werd gehypothiseerd bij bepaalde auto-immune ziekten (bv. insuline-afhankelijke diabetes mellitus). Een eenvoudige interpretatie zou suggereren dat KIR3DS1 stimulatie van de produktie van inflammatoire cytokinen door NK-cellen bijdraagt tot het doen opflakkeren en voortduren van een inflammatoire aandoening.

De NK-cellen bij CVS zijn echter nogal anergisch [weinig of geen reaktie op indringers],wat een zeer lage inhiberende én aktiverende werking aantoont. De sleutel voor de interpretatie zou bij de KIR/HLA-interaktie kunnen liggen, eerder dan in één enkel genetisch systeem. In feite lijken CVS-patiënten een overmaat of KIR3DL1- en KIR3DS1-receptoren vrij van hun HLA-Bw4 isoleucine-80 ligand te vertonen, suggestief voor ten minste twee mogelijke scenarios: i) de ziekte kan afhangen van de aanwezigheid van de KIR3DL1 inhiberende receptor in afwezigheid van zijn corresponderend ligand, een toestand die een ernstig onenvenwicht in de immuun-respons genereert bij stressvolle gebeurtenissen; of ii) het gebrek aan KIR3DL1/KIR3DS1 aanverwante liganden zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de lage aktiviteit van de NK-cellen, wat werd aangetoond bij patiënten en hier wordt verklaard.

Deze studie was beperkt door het gering aantal patiënten, voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden bij het stellen van de CVS-diagnose. Deze is gebaseerd op een constellatie van symptomen en klinische indicatoren, aangezien er geen pathognomische testen [kenmerkend of indicatief voor een bepaalde ziekte] beschikbaar zijn en slechts enkele medische centra in Italië die in staat zijn de diagnose te stellen. De grootte van onze groep was echter voldoende, gebaseerd op de geobserveerde frequentie in onze controle-populatie.

Deze studie kan helpen bij het ophelderen van de pathogenese van CVS. De bevindingen wijzen er op dat CVS veroorzaakt zou kunnen worden door een gedeeltelijk deficiënte interaktie tussen aangeboren (KIR) en adaptieve (HLA) immuniteit.

Volgende pagina »

Blog op WordPress.com.