M.E.(cvs)-wetenschap

maart 22, 2017

Epigenetische modificaties & glucocorticoïden sensitiviteit bij M.E.(cvs)

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 12:58 pm
Tags: , , , , , ,

Lees, ter introductie, o.a. nog es ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’…

Epigenetica betreft de chemische wijzigingen die voorkomen op het DNA van onze genen – dikwijls het toevoegen van/ binden met methyl (CH3)-groepen (op een cytosine (C) nucleotide) – die veranderen hoe onze genen tot expressie komen. Eenvoudig uitgedrukt: de werking van een gen wordt gewijzigd zonder dat de onderliggende DNA-sequentie verandert. Veel/meer methylatie kan gen-expressie verminderen/stilleggen en geen methylatie betekent dat gen-expressie wordt aangezet (transcriptie van DNA naar mRNA).

Onderstaand artikel is een vervolg op ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS(de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757). Nu werden hier 12.608 verschillen op het DNA (“differentieel gemethyleerde sites”) gevonden bij M.E.(cvs)-patiënten in vergelijking met gezonde mensen; een groot biologisch verschil. Deze verschillen op het DNA beïnvloeden ook de werking van immuniteit-cellen. Er werd meer hyper-methylatie gevonden bij de M.E.(cvs)-patiënten (71,6% t.o.v. 28,4% hypo-methylatie) vergeleken met controles. 1.600 differentieel gemethyleerde genen waren gelinkt met lichamelijke stoornissen (RAND-36 score) bij M.E.(cvs). Vele van deze genen zijn betrokken bij cellulaire energie-produktie, metabolisme en immuun-signalisering.

Er werd ook bekeken of deze verschillen een invloed hadden op de immuun-funktie. Daartoe werden cellen uit het bloed onderworpen aan een specifieke test waarbij de immuuncellen worden geaktiveerd (simulatie van een immuun-respons) en deze respons dan wordt gestopt met een synthetische vorm van cortisol. Bij een subgroep M.E.(cvs)-patiënten waren de cellen hyper-sensitief voor cortisol (de hoeveelheid nodig om gezonde immuuncellen te ‘kalmeren’ veroorzaakte bij M.E.(cvs) dat deze cellen werden uitgezet. Er waren differentieel gemethyleerde genen geassocieerd met deze hyper-sensitiviteit voor cortisol.

Eens te meer wordt hier aangegeven dat M.E.(cvs) een biologische oorzaak heeft… De auteurs: “Deze bevindingen komen overéén met ander werk die aangeven dat de energie-produktie verstoord is in de cellen van mensen met M.E.(cvs).”.

 

————————-

BMC Med Genomics. 23 (2017) 10: 11

Epigenetic modifications and glucocorticoid sensitivity in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS)

de Vega WC1,2, Herrera S1,3, Vernon SD4,5, McGowan PO6,7,8,9

1Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

3Department of Biological Sciences, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA

4Solve ME/CFS Initiative, Los Angeles, CA, USA

5Present affiliation: The Bateman Horne Centre of Excellence, Salt Lake City, UT, USA

6Department of Biological Sciences, University of Toronto, Toronto, ON, M1C 1A4, Canada

7Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

8Department of Psychology, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

9Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada

Samenvatting

Achtergrond: Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een invaliderende idiopathische ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde vermoeidheid die niet verdwijnt door voldoende rust. De diagnose is gebaseerd op een lijst symptomen en uitsluiting van andere vermoeidheid-gerelateerde gezondheid-aandoeningen. Ondanks de heterogene patiënten-populatie komen verschillen qua immuniteit en de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, zoals versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden, steeds terug in M.E./CVS-studies. Het is geweten dat epigenetische modificaties, zoals CpG-methylatie [DNA-methylatie komt voornamelijk voor op de cytosines van CpG dinucleotide sites], lange-termijn fenotypische verschillen reguleren en eerder werk door ons groep toonde DNA-methyloom [het geheel van DNA-methylaties in een genoom] verschillen bij M.E./CVS; het verband tussen DNA-methyloom modificaties, klinische en funktionele karakteristieken geassocieerd met M.E./CVS werd echter niet onderzocht.

Methodes: We onderzochten het DNA-methyloom in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van een grotere groep vrouwelijke M.E./CVS-patiënten (‘Illumina Human Methylation 450 BeadChip Array’ [‘chip’ waarmee > 485.000 methylatie-sites per staal kunnen worden geanalyseerd]). Parallel met de analyse van het DNA-methyloom, bekeken we de glucocorticoïden-gevoeligheid ‘in vitro’ door het stimuleren van PBMCs met fyto-haemagglutinine [PHA] en onderdrukten de groei met dexamethason [synthetisch glucocorticoid]. We gingen DNA-methylatie verschillen na d.m.v. bisulfiet-pyrosequentie-bepaling [‘pyrosequencing’ = moderne vorm van sequentie-bepaling] en statistische permutatie. Er werd lineaire regressie [statistische analyse] toegepast om epigenomische gebieden geassocieerd met zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit te ontdekken, en netwerk-analyse van gen-ontologische termen [gestandardiseerde weergave van de eigenschappen van genen en gen-produkten] om de resultaten in een biologische context te plaatsen.

Resultaten: We detekteerden 12.608 verschillende gemethyleerde plaatsen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles voornamelijk gelokaliseerd in genen m.b.t. het cellulair metabolisme; enkele daarvan waren ook gerelateerd met scores van zelf-gerapporteeerde levenskwaliteit. Bij de M.E./CVS-patiënten was glucocorticoid-sensitiviteit geassocieerd met differentiële methylatie op 13 loci. [locus = waar een gen of een reeks nucleotiden zich in het DNA bevindt]

Besluiten: Onze resultaten geven aan dat DNA-methylatie modificaties in het cellulair metabolisme bij M.E./CVS – ondanks een heterogene patiënten-populatie – deze processen in immune en HPA-as dysfunktie bij M.E./CVS impliceren. Modificaties op epigenetische loci geassocieerd met verschillen qua glucocorticoid-gevoeligheid kunnen belangrijk zijn als biomerkers. Globaal genomen komen deze bevindingen overéén met werk dat wijst op stoornissen bij de cellulaire energie-produktie in deze patiënten-populatie.

Achtergrond

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een idiopathische ziekte gekenmerkt door ernstige en invaliderende vermoeidheid, cognitieve stoornissen, niet-verfrissende slaap, autonome verschijnselen en post-exertionele malaise. Andere ziekten of gezondheid-aandoeningen die de persistente aanwezigheid van vermoeidheid kunnen verklaren, zoals majeure depressie, anorexie en boulimie, worden uitgesloten voor het stellen van de diagnose M.E./CVS. De heterogeniteit wat betreft de klinische kenmerken van M.E./CVS is een obstakel bij het bepalen van de biologische oorzaak.

Veel studies die de pathofysiologie van M.E./CVS onderzochten, hebben wijzigingen in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as gerapporteerd. De HPA-as is een belangrijke component van het neuro-endocrien systeem dat homeostatische processen, het circadiaans ritme en stress-responsen reguleert via een hormonen-cascade die leidt tot de afgifte van glucocorticoïden (GCs). GCs interageren met de GC-receptor (GR) om de stress-respons en inflammatie te reguleren. M.E./CVS-patiënten vertonen een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback responsen op GCs, wat een belangrijke rol van de HPA-as bij deze ziekte suggereert.

Naast de veranderde werking van de HPA-as, werden ook wijzigingen qua immuun-fenotype alom gedocumenteerd bij M.E./CVS. Hoewel de specifieke patronen van de verschillen nog niet zijn opgelost, bleek M.E./CVS geassocieerd met abnormale cytokine-profielen, lymfocyten-proporties en verstoorde immuun-funktie (in het bijzonder verminderde cytotoxiciteit). Verhoogde inflammatie in het darm-microbioom bleek ook geassocieerd met M.E./CVS. Dit omvat gedaalde diversiteit van het darm-microbioom, verschuivingen naar pro-inflammatoire bakteriële soorten en een proliferatie van merkers voor pro-inflammatoire processen in het serum [Giloteaux L, Goodrich JK, Walters WA, Levine SM, Ley RE, Hanson MR. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30].

Epigenetische modificaties, inclusief de methylatie van DNA op CpG-dinucleotiden, kan lange-termijn fenotypische veranderingen beïnvloeden in respons op externe stimuli. DNA-methylatie modificaties in genen betrokken bij de HPA-as en het immuunsysteem bleken sterk gelinkt met omgeving-stress. We documenteerden eerder DNA-methyloom abnormaliteiten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van ‘sudden-onset’ M.E./CVS-patiënten (gevalideerd via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling) [de Vega WC, Vernon SD, McGowan PO. DNA methylation modifications associated with Chronic Fatigue Syndrome. PLoS One (2014) 9: e104757]; deze abnormaliteiten waren significant geconcentreerd in genen gelinkt met immuun-regulering. Er bleven belangrijke vragen over het feit of deze epigenetische modificaties een impact hadden op de werking van immuun-cellen en hun relatie met klinische kenmerken van M.E./CVS.

In de huidige studie brachten we loci in kaart die epigenetische gemodificeerd waren in PBMCs en onderzochten hun gevoeligheid voor glucocorticoïden. Onze doelstellingen waren te bepalen hoe epigenetische patronen in verband staan met HPA-as signalisering in immuun-cellen bij M.E./CVS-patiënten, en de identificatie van neuro-immune mechanismen die waren beïnvloed bij M.E./CVS.

Methodes

Criteria voor selektie van deelnemers

[…] De diagnose M.E./CVS werd gesteld op basis van de Fukuda en Canadese criteria. […] Vragenlijsten over symptomen, medicatie en medische geschiedenis, en de RAND-36 voor zelf-rapportering over gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit. [36 items ter beoordeling van 8 gezondheid-concepten: lichamelijk funktioneren, beperkingen veroorzaakt door fysieke gezondheid problemen, beperkingen veroorzaakt door emotionele problemen, sociaal funktioneren, emotioneel welzijn, energie/vermoeidheid, pijn & algemene gezondheid percepties] […] We selekteerden vrouwen voor deze studie. […] 49 M.E./CVS-patiënten en 25 gezonde controles voldeden aan de volgende criteria: 1) negatief voor HIV, AIDS en/of hepatitis-C, en 2) blanke non-obese vrouwen (BMI < 30) die geen immunomodulerende en/of epigenetisch aktieve medicatie gebruikten. […]

Isolatie en bewaring van PBMCs

[…]

DNA Extractie en zuivering van genomisch DNA

[…]

DNA-methyloom chips

[…]

Normalisatie en statistische analyses va, DNA-methyloom gegevens

[…]

DNA-methylatie validering via by bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

[…]

Dexamethason-suppressie test en verband met DNA-methylatie verschillen

[…]

Associatie tussen klinische gegevens en DNA-methylatie

[…]

Resultaten

RAND-36 scores significant lager bij M.E./CVS-patiënten

Globaal hadden de M.E./CVS-patiënten een lagere gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit dan de gezonde controles (significant lager voor 7 van 8 RAND-36 categorieën (alle p-waarden ≤ 0.05). Er waren geen verschillen qua gemiddelde leeftijd of BMI. […] Verdere analyse toonde een duidelijke scheiding tussen M.E./CVS-patiënten en controles […].

DNA-methyloom verschillen bij M.E./CVS

We vonden – na correctie voor leeftijd, BMI en verschillen qua in cel-proporties – 12.608 significant verschillend gemethyleerde loci in onze groep. 5.544 daarvan waren toegekend aan een gekend proteïne-coderend gen (UCSC Genome Browser). […] In termen van de richting van de methylatie-verschillen bij de M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles, waren 71,6% van de differentieel gemethyleerde sites hyper-gemethyleerd en 28,4% hypo-gemethyleerd. […] Hoewel er geen significante verschillen waren qua proportie hypo-/hyper-gemethyleerde sites volgens genetische lokatie, waren er significante verschillen wat betreft deze proporties wanneer de afstand van een CpG-eiland in acht werd genomen. De hoeveelheid hyper-methylatie daalde naar gelang de afstand tot een CpG-eiland vergrootte. […]

Glucocorticoïden-gevoeligheid in PBMCs bij bij M.E./CVS-subgroepen

Globaal genomen was er een significant gemiddelde toename qua glucocorticoïden-sensitiviteit in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles (p ≤ 0.05). Een visuele inspectie van de gegevens onthulde een bimodale verdeling van de glucocorticoïden-gevoeligheid binnen de M.E./CVS-groep: een GC-hypersensitieve groep (die een verhoogde respons op glucocorticoid-behandeling vertoonde t.o.v. de gemiddelde controle) en een GC-typische groep (die een respons vertoonde gelijkaardig met de gezonde controles). De verschillen qua GC-sensitiviteit waren niet geassocieerd met het type M.E./CVS-aanvang of de RAND-36 (scores voor de ganse vragenlijst of bepaalde categorieën; p > 0.10).

DNA-methylatie verschillen in dexamethason-test subgroepen via pyrosequentie-bepaling en permutatie-testen

Om het verband te bepalen tussen verschillen qua DNA-methylatie en glucocorticoïden-gevoeligheid, pasten we dezelfde statistische criteria toe die werden gebruikt om methylatie-verschillen tussen M.E./CVS-patiënten en gezonde controles te identificeren toe op 3 verschillende vergelijkingen: 1) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch; 2) M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles; en 3) M.E./CVS GC-typisch vs. controles. We vonden dat er geen methylatie-verschillen voldeden aan deze statistische criteria. Een groot aantal loci vertoonden echter significant nominale p-waarden ≤ 0.05 [De ‘significantie’ is een nominale p-waarde die de researcher selekteert als ‘cut-off’ punt voor het interpreteren of iets statistisch significant ka worden beschouwd of niet.]. Als alternatieve methodes voor statistische analyse van de 3 glucocorticoïden-gevoeligheid vergelijkingen, evalueerden we de verschillen die werden gevonden met de ‘450K array’ via 2 doelgerichte statistische methodes.

Wat betreft de pyrosequentie-bepaling analyse was onze strategie het selekteren van 3 loci die nominaal significante verschillen vertoonden tussen M.E./CVS GC-hypersensitief en M.E./CVS GC-typisch: 2 loci in JRK [gen coderend voor een proteïne lijkend op DNA-bindende proteïnen] & 1 locus in SLC6A4 [codeert voor de serotonine-transporter]. Deze sites werden gekozen om de betrouwbaarheid te onderzoeken van de ‘450K array’ om significante verschillen te detekteren zowel boven als onder de 5% cut-off die we implementeerden bij het zoeken naar significant differentieel gemethyleerde plaatsen bij M.E./CVS, en om DNA-methylatie verschillen te valideren die zowel potentieel gerelateerd zijn met GC-sensitiviteit verschillen, alsook uniek voor M.E./CVS. De JRK-sites weden geselekteerd voor de volgende redenen: ze waren bij de top sites in termen van verschil-grootte > 5% methylatie-verschil op de ‘450K array’ […] en ze lagen ook dicht bijéén in het genoom (5 bp uit elkaar), wat ons toeliet af te leiden hoe de DNA-methylatie status wordt gereflekteerd binnen hetzelfde gen-gebied. […] Na pyrosequentie-bepaling werden de JRK-sites significant verklaard (p ≤ 0.05) of ‘trending’ (p ≤ 0.10) naargelang de resultaten. Het < 5% nominaal significant verschil gevonden op de ‘450K array’ gegevens voor SLC6A4 was hier echter niet significant; wat er op wijst dat methylatie-verschillen < 5% op de ‘450K array’ niet op een betrouwbare manier werden gedetekteerd voor deze vergelijkingen.

Wat betreft de permutatie-analyse [een type statistische significantie-test] onderzochten we de mate van overlapping tussen de sites met een > 5% gemiddeld methylatie-verschil die nominaal significant waren op de ‘450K array’ […] en de sites die significant verschillende werden verklaard bij 10.000 permutaties. We vonden dat een meerderheid van de nominaal significanten ook significant waren volgens de permutatie-test: 76,8% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch, 84,5% bij de vergelijking M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles, en 99,6% bij de vergelijking M.E./CVS GC-typisch vs. controles; wat er op wijst dat de meerderheid van de methylatie-verschillen die nominaal significant waren met > 5% gemiddeld methylatie-verschil waarschijnlijk differentiële methylatie reflekteerden.

Gezien deze resultaten implementeerden we de 5% verschil cut-off voor de verschillende dexamethason-test subgroep-vergelijkingen, en onderzochten sites die significant bleken […]. Om potentiële epigenomische loci geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit te bepalen, onderzochten we de overlap qua nominaal significante loci voor de 3 vergelijkingen. Er waren 5 sites die differentieel gemethyleerd waren bij de 3 vergelijkingen; één die correspondeerde met een coderend gen: NPAS3 [transcriptie-factorNeuronal PAS domain protein 3’], een gen betrokken bij neurogenese. We vonden 13 loci die differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles én M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch. Deze loci […] zijn waarschijnlijk geassocieerd met glucocorticoïden-gevoeligheid. De top 3 sites met de grootste verschillen bij vergelijking van M.E./CVS GC-hypersensitief vs. M.E./CVS GC-typisch correspondeerden met GSTM1 [Glutathion S-transferase Mu 1] (14,3% verhoogde methylatie), MYO3B [myosine IIIB] (13,7% stijging) en GSTM5 [Glutathion S-transferase Mu 5] (12,0% stijging). Naast deze glucocorticoïden-sensitieve sites vonden we 4.699 loci die waarschijnlijk geassocieerd zijn met M.E./CVS, aangezien ze differentieel gemethyleerd waren bij de M.E./CVS GC-hypersensitief vs. controles en de M.E./CVS GC-typisch vs. controles vergelijkingen. GO-analyse van deze sites onthulde een aanrijking van differentiële methylatie bij M.E./CVS geassocieerd met regulerende processen, inclusief neuronale cel ontwikkeling, signaal-transductie, metabole regulering en transcriptie-regulering. Er waren 203 significant differentieel gemethyleerde sites die uniek waren voor M.E./CVS GC-typische individuen maar er waren echter geen GO-termen significant geassocieerd met deze sites.

Verbanden tussen differentieel gemethyleerde gebieden en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit

Om het verband te onderzoeken tussen DNA-methylatie en gezondheid-gerelateerde levenskwaliteit […] onderzochten we gen-gebieden om potentiële epigenomische plaatsen te bepalen die een significante relatie vertonen met levenskwaliteit-scores. Na lineaire regressie analysis vonden we meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden met een > 5% methylatie-verschil (M.E./CVS en controles) die een significant verband vertoonden met de globale RAND-36 score. De top 5 differentieel gemethyleerde gebieden correspondeerden met TSS-methylatie [TSS = ‘transcription start site’; plaats waar de transcriptie start] in GRAMD1A [GRAM Domain Containing 1A’], ATP6V0E2 [ATPase H+ Transporting V0 Subunit E2’] & LOC144571 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne], en gen-‘body’ methylatie [in het gen zelf] in LOC401431 [niet coderend RNA/hypothetisch proteïne] & IL6R [IL-6 receptor].

Bespreking

In deze studie detekteerden we 12.608 differentieel gemethyleerde sites in PBMCs van M.E./CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles, sommige daarvan waren significant geassocieerd met scores van zelf-gerapporteerde levenskwaliteit. 71,6% van deze sites vertoonden hyper-methylatie bij M.E./CVS en de hyper-methylatie bleek te delen naar gelang de afstand van een CpG-eiland steeg; dit suggereert dat epigenetische ontregeling bij M.E./CVS significant varieert afhankelijk van de relatieve plaats t.o.v. CpG-eilanden [gebieden waar veel CpG-sites voorkomen; formeel: een gebied van minstens 200 bp met een GC-percentage > 50%]. Binnen de groep M.E./CVS-patiënten zagen we 2 subgroepen op basis van de in vitro [‘in een proefbuis’] sensitiviteit voor blootstelling aan glucocorticoïden. Het verschil qua glucocorticoïden-gevoeligheid was geassocieerd met differentiële methylatie op 13 sites (op basis van vergelijkingen van differentiële methylatie bij M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. M.E./CVS GC-typisch en M.E./CVS GC-hypersensitief t.o.v. gezonde controles).

DNA-methylatie modificaties in cellulaire processen/metabolisme-mechanismen bij M.E./CVS

Genen geassocieerd met cellulaire en metabole regulering waren belangrijke mechanismen met differentiële epigenetische profielen bij M.E./CVS vergeleken met gezonde controles. Deze bevindingen zijn consistent met een eerder rapport van onze groep bij M.E./CVS-patiënten waarbij de ziekte plots startte [zie link/ref. in onze inleiding] en met andere rapporten over genomische, transcriptomische en metabolomische verschillen bij M.E./CVS [Carmel L, Efroni S, White PD, Aslakson E, Vollmer-Conna U, Rajeevan MS. Gene expression profile of empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 375-86 /// Presson AP, Sobel EM, Papp JC, Suarez CJ, Whistler T, Rajeevan MS, Vernon SD, Horvath S. Integrated weighted gene co-expression network analysis with an application to Chronic Fatigue Syndrome. BMC Syst Biol. (2008) 2: 95 /// Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405 /// Naviaux RK, Naviaux JC, Li K, Bright AT, Alaynick WA, Wang L, Gordon E. Metabolic features of Chronic Fatigue Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences (2016) 113: E5472-E5480], die een rol aangeven voor DNA-methylatie modificaties bij de metabole stress die wordt vastgesteld bij deze ziekte. Oxidatieve en nitrosatieve stress werden gedocumenteerd in immuuncellen van M.E./CVS-patiënten, en een daling van metabolieten van de elektronen-transport-keten suggereert een rol in de M.E./CVS-pathologie voor processen die de mitochondriale werking beïnvloeden. Er is een gekend verband tussen oxidatieve stress en epigenetische modificaties. DNA-beschadigingen zijn dikwijls het resultaat van oxidatieve stress, en deze beïnvloeden op hun beurt de epigenetische regulering, wat leidt tot afwijkende DNA-methylatie en gen-expressie patronen. Het is mogelijk dat oxidatieve stress, zoals in onze studie aangegeven door de verschillen gevonden in genen betrokken bij cellulaire en metabole regulering (inclusief ARL4C & HOXA11), sommige van de epigenetische veranderingen bij M.E./CVS kunnen aansturen. Er is echter bijkomend werk – zoals het karakteriseren van het effekt van ARL4C [‘ADP-Ribosylation Factor Like Protein 4C’] & HOXA11 [transcriptie-factor ‘Homeobox protein Hox-A11’] op DNA-methylatie patronen – vereist om dit verband te onderzoeken.

Genen geassocieerd met neuronale cel ontwikkeling bleken ook een belangrijke klasse genen met differentiële methylatie bij M.E./CVS-patiënten. Ten minste 2 eerdere studies die gen-expressie patronen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten onderzochten, rapporteerden ook significante verschillen voor genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling en regulerende processen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST et al. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. (2005) 58: 826-32 /// Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. (2002) 18: 193-9]. Het is ook bekend dat genen die geassocieerd zijn met psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen rijke expressie-profielen vertonen in PBMCs [Vernon SD, Nicholson A, Rajeevan M, Dimulescu I, Cameron B, Whistler T, Lloyd A. Correlation of psycho-neuroendocrine-immune (PNI) gene expression with symptoms of acute infectious mononucleosis. Brain Res. (2006) 1068: 1-6]. DNA-methylatie verschillen op neuronale genen in PBMCs kunnen sommige centrale verschillen in psycho/neuro-endocriene/immune mechanismen bij M.E./CVS weerspiegelen, zoals wordt gesuggereerd door de resultaten van onze glucocorticoïden-sensitiviteit test, die overéénkomen met werk dat perifeer bloed en immuuncellen identificeert als geschikte kandidaten die differentiële DNA-methylatie in het brein weerspiegelen.

Dexamethason-respons subgroepen bij bij M.E./CVS

We stelden een gemiddelde toename qua glucocorticoïden-gevoeligheid vast bij M.E./CVS-patiënten, die niet kon worden verklaard op basis van het type M.E./CVS-aanvang of levenskwaliteit. Daarnaast onthulde een meer gedetailleerd onderzoek van onze resultaten 2 subgroepen bij de M.E./CVS-patiënten. Er werd een mild hypocortisolisme en versterkte negatieve feedback op glucocorticoïden geobserveerd in meerdere studies van de GC-responsen bij M.E./CVS. De aanwezigheid van een GC-typische en GC-hypersensitieve subgroep binnen onze M.E./CVS-groep komt dus overéén met de geobserveerde heterogeniteit van HPA-gerelateerde verschillen in deze eerdere rapporten.

Glucocorticoïden staan bekend om hun anti-inflammatoire effekten en worden typisch gebruikt om immuun-responsen te onderdrukken. Een ongepaste respons op behandeling met glucocorticoïden is echter geassocieerd met verhoogde vatbaarheid voor metabole en hart-ziekten. Onze resultaten op basis van PHA, een T-cel mitogen [molekule die een cel aanzet tot delen], als immuun-stressor gaven een funktionele stoornis qua T-cel GR-gevoeligheid bij GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten aan. Bijkomend bewijsmateriaal suggereert dat T-cellen kandidaten zijn voor een primaire immuuncel-populatie bij M.E./CVS-pathologie. Bv.: een GWAS [‘genome-wide association study’] vond significante verschillen qua polymorfismen geassocieerd met T-cel receptoren bij M.E./CVS-patiënten [Schlauch KA, Khaiboullina SF, Rawat S, Petereit J, Rizvanov AA, Blatt N, Mijatovic T, Kulick D, Palotas A et al. Genome-wide association analysis identifies genetic variations in subjects with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Transl Psychiatry. (2016) 6: e730]. Daarnaast werden DNA-methylatie verschillen gerapporteerd in CD4+ T-cellen van M.E./CVS-patiënten [Brenu EW, Staines DR, Marshall-Gradisbik SM. Methylation profile of CD4+ T cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Cell Immunol. (2014) 5: 228], een cel-populatie die een verhoogde dexamethason-sensitiviteit lijkt te vertonen bij M.E./CVS [Visser J, Blauw B, Hinloopen B, Brommer E, de Kloet ER, Kluft C, Nagelkerken L. CD4 T-lymphocytes from patients with Chronic Fatigue Syndrome have decreased interferon-gamma production and increased sensitivity to dexamethasone. J Infect Dis. (1998) 177: 451-4].

We vonden 13 sites geassocieerd met glucocorticoïden-sensitiviteit bij in GC-hypersensitieve M.E./CVS-patiënten in vergelijking met zowel GC-typische M.E./CVS-patiënten als gezonde controles. Naar ons weten zijn er geen andere EWAS [‘epigenome-wide association study’] of GWAS studies die specifiek de epigenetische of genetische verschillen onderzochten in de context van GC-sensitiviteit. Genomische studies bij M.E./CVS hebben echter polymorfismen in GC-signalisering genen bij M.E./CVS-patiënten gerapporteerd. Interessant: deze genen lijken niet te overlappen met andere aandoeningen die worden gekenmerkt door verstoorde GC-signalisering [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-76]. Daarnaast was FKBP5 [gen met een rol bij post-traumatische stress, depressie en angst], een gen dat differentieel gemethyleerd bleek bij het syndroom van Cushing [hormonale aandoening gekenmerkt door een verhoogd gehalte aan cortisol in het bloed], niét bij de genen die in onze studie werden geïdentificeerd. De potentiële link tussen M.E./CVS en epigenetische modificatie van deze genen zou dus echter met voorzichtigheid moeten worden bekeken. Niettemin suggereren de resultaten dat epigenetische verschillen op deze sites nuttige informatie kunnen bieden betreffende geassocieerde GC-sensitiviteit bij sommige M.E./CVS-patiënten.

6 van de 13 sites waren onderdeel van coderende genen, 4 daarvan met rollen in het cellulair metabolisme. ‘Patatin Like Phospholipase Domain Containing 4’ (PNPLA4) is een fosfolipase dat een rol speelt bij het lipiden-metabolisme en sterk tot expressie komt in metabool aktief weefsel. PNPLA4 maakt ook deel uit van de PNPLA-familie, die aktiveert na interaktie met glucocorticoïden. D-aspartaat-oxidase (DDO) is een enzyme dat D-aspartaat en N-methyl-D-aspartaat, overvloedig aanwezig in neuro-endocrien weefsel, deaminiseert. Gen ‘knock-out’ studies over DDO in muizen hebben onthuld dat dit enzyme belangrijk is bij de produktie van melanocortinen [groep of peptide-hormonen] en betrokken is bij de regulering van basale corticosteron-waarden. Fosfodiesterase-1C (PDE1C) is verantwoordelijk voor de hydrolyse van cyclische nucleotiden, wat belangrijk is voor fysiologische regulering, calcium-signalisering mechanismen en circadiaans ritme. Stiudies met cel-culturen hebben getoond dat inhibitie van PDE1C […] resulteert in geïnhibeerde cel-proliferatie en dat PDE1C geaktiveerd wordt na behandeling met dexamethason.

De top 3 sites, op basis van grootte-verschillen tussen on GC-hypersensitieve en GC-typische (M.E./CVS & controle) individuen, correspondeerden met GSTM1, MYO3B & GSTM5 [zie eerder], die alle een > 10% toename van de methylatie vertoonden. GSTM1 & GSTM5 maken deel uit van de mu-klasse van de GST genen-familie, waarvan de primaire rol detoxificatie is van milieu- en exogene toxinen, specifiek polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Genetische polymorfismen in GSTM zijn gekende voorspellers van de potentiële respons op glucocorticoïden bij acute lymfoblastische leukemie, wat er op wijst dat GSTM een significante rol zou kunnen spelen bij glucocorticoïden-signalisering in immuuncellen. MYO3B is een ATPase dat geaktiveerd wordt door actine [onderdeel van het cel-‘geraamte’ dat bestaat uit verschillende soorten proteïne-polymeren, die samen zorgen voor stevigheid, vorm en beweeglijkheid] en betrokken is bij kinase-aktiviteit. MYO3B en z’n meerdere interakties worden echter nog niet goed begrepen vergeleken met andere myosine-genen [van belang bij spier-samentrekking], zo dat het onduidelijk is hoe verschillen in MYO3B verband kunnen houden met glucocorticoïden-signalisering.

De 13 differentie gemethyleerde sites zouden als biomerkers voor of glucocorticoïden-hypersensitiviteit beschouwd kunnen worden maar er is echter nog bijkomend werk vereist om de funktionele impact van hyper-methylatie op deze genen en het verband met glucocorticoïden-signalisering te begrijpen en te bevestigen. Gen ‘knock-out’ en RNA ‘knock-down’ studies kunnen helpen bij het bepalen van de precieze impact die deze genen op glucocorticoïden-signalisering hebben. Het meten van mRNA-transcripten, methylatie-verschillen en proteïne-waarden van deze genen bij baseline, PHA-gestimuleerd en DEX-onderdrukt in vitro en in vivo, kunnen tot een beter begrip van de dynamiek die aan de basis ligt van GC-sensitiviteit verschillen bij M.E./CVS leiden.

DNA-methylatie modificaties geassocieerd met levenskwaliteit-scores

We vonden meer dan 1.600 differentieel gemethyleerde gebieden die significant geassocieerd waren met de globale RAND-36 score, waarbij variatie in methylatie in deze gebieden significant was geassocieerd met variatie in de globale RAND-36 score. De scores van deze vragenlijst kunnen wijzen in de richting van veranderingen in biologische systemen. Van de top 5 differentieel gemethyleerde gebieden [zie ‘resultaten’] vermelden we de volgende. ATP6V0E2 is een isoform van de H+-ATPase V0 e subunit (belangrijk is voor cellulaire energie [ATPases pompen protonen (H+) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types]), LOC401431 codeert de het anti-sense RNA voor ATP6V0E2 (suggererend dat de regulering-dynamiek van dit gen beïnvloed zou kunnen zijn bij M.E./CVS), IL6R codeert voor de IL-6 receptor (een pleiotroop cytokine [met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]) en LOC144571 is het anti-sense RNA [inaktiveert het mRNA] voor alfa-2-macroglobuline (een protease-inhibitor en cytokine-transporter). De lage ‘Physical Health’ scores bij de M.E./CVS-patiënten suggereren dat de lichamelijke stoornissen bij M.E./CVS geassocieerd zijn met een epigenetisch onevenwicht qua cellulaire energie, metabolisme en immuun-signalisering.

Besluiten

We rapporteren hier DNA-methylatie verschillen in PBMCs van M.E./CVS-patiënten, waarvan sommige significant geassocieerd waren met de globale levenskwaliteit alsook met glucocorticoïden-hypersensitiviteit in een subgroep M.E./CVS-patiënten. We bepaalden epigenetische loci geassocieerd met verschillen in glucocorticoïden-sensitiviteit die de onderliggende M.E./CVS-pathologie van sommige patiënten kan weerspiegelen. Er is bijkomend werk vereist om de mogelijke mechanistische verbanden tussen DNA-methylatie in deze genen, gen-expressie en proteïne-profielen, en M.E./CVS-fenotype te bevestigen. Er zijn longitudinale studies (zowel in vivo als in vitro) nodig om de stabiliteit te bepalen van deze epigenetische modificaties, inclusief veranderingen qua symptoom-profielen en in respons op behandeling met glucocorticoïden. Bv.: cytokines zoals IL-10 & IFN-gamma, die differentieel gemethyleerd bleken in onze studie, staan bekend om hun interaktie met GR en vertonen expressie-verschillen in vitro na dexamethason-behandeling [Visser J, Graffelman W, Blauw B, Haspels I, Lentjes E, de Kloet ER, Nagelkerken L. LPS-induced IL-10 production in whole blood cultures from Chronic Fatigue Syndrome patients is increased but supersensitive to inhibition by dexamethasone. J Neuroimmunol. (2001) 119: 343-9]. Hoewel GR-densiteit en binding-affiniteit in PBMCs van M.E./CVS niet lijken te verschillen qua ‘steady-state’ [evenwicht-toestand] condities, staat GR bekend om z’n upregulering tijdens inspanning bij M.E./CVS [Meyer JD, Light AR, Shukla SK, Clevidence D, Yale S, Stegner AJ, Cook DB. Post-exertion malaise in Chronic Fatigue Syndrome: symptoms and gene expression. Fatigue (2013) 1: 190-204]. Toekomstig werk zou DNA-methylatie signaturen moeten onderzoeken tijdens inspanning bij M.E./CVS om de dynamiek van glucocorticoïden-signalisering beter te kunnen begrijpen. Niettemin kunnen de differentieel gemethyleerde sites die in deze studie werden geïdentificeerd op z’n minst belangrijk zijn als biomerkers voor toekomstige klinische testen om te bepalen of epigenetische wijzigingen in deze genen verband houden met ziekte-aanvang of -progressie.

De resultaten van deze studie onderlijnen het potentieel nut van immuuncel-subtypering binnen de M.E./CVS-populatie en geven aan dat epigenetische gegevens kunnen helpen bij het ophelderen van relevante biologische mechanismen die bij M.E./CVS beïnvloed zijn. Klinisch onderzoek naar de regulering van het cellulair metabolisme is nodig om deze mogelijkheid te beoordelen, aangezien we vonden dat genen zoals GSTM1, MYO3B, GSTM5 & ATP6V0E2 significante epigenetische modificaties vertoonden bij M.E./CVS. Een beter begrip van M.E./CVS-subtypes zal patiënten en artsen helpen de geschikte interventies te bepalen om symptomen te behandelen en de gezondheid te verbeteren.

Advertenties

oktober 22, 2011

Verhoogd HDAC samen met verlaagd Cortisol bij ouderen met CVS

Bij een studie van 2 gen-gen associatie-netwerken bij CVS (Integratie van klinische, genetische en proteïne-gegevens bij CVS) bleek HDAC7A in beide voor te komen. Gen-expressie van HDAC7A (een gen dat codeert voor een histoon-deacetylase (enzyme); histoon-acetylatie/-deacetylatie verandert de struktuur van chromosomen en beïnvloedt de toegang van transcriptie-factoren tot DNA) bleek tevens gecorreleerd met onverklaarde vermoeidheid in een andere studie (Whistler T, Taylor R, Craddock RC, Broderick G, Klimas N, Unger ER. Gene-expression correlates of unexplained fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7: 395-405).

In onderstaand artikel worden verbanden gelegd tussen HDAC’s en andere bevindingen bij M.E.(cvs): voornamelijk verlaagd cortisol, de verstoorde HPA-as en de mogelijk rol van de Glucocorticoid Receptor (gecodeerd door het NR3C1-gen; zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS’). Dit laatste hangt dan weer samen met de immuniteit/inflammatie via NF-κB (zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’ en ‘NF-κB en Inspanning’). Verregaande conclusies zijn nog niet aan de orde daar deze studie slechts een kleine groep ouderen met CVS omvat

Histoon-deacetylases (HDAC) zijn een klasse enzymes die acetyl-groepen (O=C-CH3) van een geacetyleerd lysine (bepaald aminozuur) op een histoon (histoon-proteïnen = kleine eiwitten met een hoog aantal positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA binden; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt) verwijderen. Zo wordt (via acetylering -via histoon-acetyltransferase (HAT)- en deacetylering) de vertaling van DNA (dat rond de histonen is gewikkeld) naar RNA geregeld. HAT’s en HDAC’s gaan een fysieke interaktie aan met een sequentie-specifieke transcriptie-factor (TF). Ze werken gewoonlijk in een multi-molekulair complex (enzymatisch complex), waarbij de andere subunits nodig om nucleosomen rond de binding-plaats te modifiëren. Er zijn 4 klassen HDACs, telkens met verschillende leden (HDAC’s 1-11 en sirtuinen, SIRT 1-7).

*************************

Brain Behav Immun. 2011 Apr 28. [pre print]

Increased HDAC in association with decreased plasma cortisol in older adults with Chronic Fatigue Syndrome

Jason L, Sorenson M, Sebally K, Alkazemi D, Lerch A, Porter N, Kubow S

Department of Nursing, DePaul University, Chicago, IL, United States

Samenvatting

Hypocortisolisme is een frequente bevinding bij individuen met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) [zie opmerking in rood hieronder], waarbij andere research-bevindingen ook een potentiële ontregeling van de glucocorticoid-signalisering [zie links in onze inleiding] impliceren. Glucocorticoid-signalisering staat onder invloed van diverse mechanismen, waarvan meerdere van interesse zijn bij de studie van CVS. Oxidatieve stress en verminderde anti-oxidante capaciteit staan er om bekend de hypothalamus-hyopfyse-bijnier (HPA) as te verstoren en de aanwezigheid van histoon-deacetylases (HDAC) zouden ook een impact kunnen hebben op de glucocorticoid-signaliserinng. De intentie van deze piloot-studie was de relatie tussen oxidatieve stress elementen, selekte HDAC’s (2/3) en glucocorticoid receptor signalisering te onderzoeken bij een groep ouderen met CVS. De bevindingen suggereren verhoogde aktiviteit van histoon-deacetylases, lager totaal anti-oxidant vermogen in de context van verlaagde plasma-cortisol en verhoogd plasma dehydroepiandrosteron die samen voorkomen met verminderde expressie van het gen coderend voor de Glucocorticoid Receptor. Deze bevindingen ondersteunen de aanwezigheid van HPA-as ontregeling bij oudere individuen met CVS.

1. Inleiding

In volwassen populaties, is de ontregeling van de hypothalamus-hyopfyse-bijnier (HPA) as geassocieerd met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), suggestief voor een gewijzigde fysiologische respons op stress. Verscheidene studies hebben glucocorticoïde regulering bij CVS aangewezen, met een waaier aan bevindingen: volwassenen met CVS vertonen lagere cortisol-waarden [D.i. echter geen alomtegenwoordige bevinding… Uit ‘Neuro-immunologisch model voor CVS: “Een aandacht-punt van het onderzoek betreffende de CVS-pathofysiologie is de exploratie van afwijkingen van de HPA-as. Nogmaals: dit is niet absoluut, maar er bestaat bewijs voor een milde HPA-as suppressie met onderdrukte produktie van adrenocorticotroop hormoon (ACTH) in respons op psychosociale stress en een verhoogde invloed van negatieve feedback van cortisol op de HPA-as. Gezien de immunosuppressieve effekten van glucocorticoid-hormonen, is het gemakkelijk te bedenken hoe hypo-funktie van de HPA-as zou kunnen bijdragen tot de inflammatoire pathologie van CVS het ontbreken van een negatieve regulator van het immuunsysteem. De oorzakelijkheid van deze relatie blijft echter ook onopgelost: bestemt een hypo-aktieve HPA-as voor tot CVS, of moedigt de immuun-dysfunktie van CVS de abnormale funktie van de HPA-as aan?”], een mogelijk gebrek aan responsiviteit van de HPA-as, een patroon van glucocorticoïde resistentie en ontwrichting of ontregeling van het verwachte diurnale cortisol-patroon [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason L, Maher K, Fletcher MA, Reynolds N,Brown M. The associations between basal salivary cortisol and illness-symptomatology in Chronic Fatigue Syndrome. J. Appl. Biobehav. Res. (2008) 13: 157-180; zie ‘Cortisol bij CVS – verband met pijn en vermoeidheid]. Eerder vonden we verminderde genetische expressie van de glucocorticoid receptor (NR3C1) gelijktijdig met lage waarden qua plasma-cortisol bij CVS [Jason LA, Sorenson M, Porter N, Brown M, Lerch A, Van der Eb C, Mikovits J. Possible genetic dysregulation in paediatric CFS. Psychology (2010) 1: 247-251; zie ‘Mogelijke Genetische Ontregeling bij Pediatrische CVS (NR3C1 & NF-kB)]. De aanwezigheid van een verminderde boodschap-overdracht bij minder hormoon leidde tot een concept van epigenetische ontregeling van GR-signalisering. Op basis van de literatuur besloten we dat HDAC’s de meest waarschijnlijke schuldigen waren. Deze piloot-studie werd ontworpen om dit te testen.

Histoon-deacetylases (HDAC) zijn een groep enzymes met uitgesproken effekten op gen-regulering. Deze enzymes inhiberen gen-regulering via de verwijdering van acetyl-groepen, wat uiteindelijk gen-transcriptie vermindert. Dit werking-mechanisme is het primair middel waarmee glucocorticoïden hun effekten uitoefenen. HDAC’s lijken te worden gerecruteerd door glucocorticoïden en onderdrukken op hun beurt de codering van inflammatoire genen, wat bijdraagt tot de globale anti-inflammatoire werking van glucocorticoid. Een stijging qua HDAC-aktiviteit, in aanwezigheid van gedaalde glucocorticoid-concentraties zou een ontregeling van mechanisme-signalisering kunnen weerspiegelen die zou kunnen bijdragen tot een chronische pro-inflammatoire toestand. Terwijl HDAC-aktiviteit inflammatie zou kunnen onderdrukken via effekten op het NF-κB mechanisme, zouden elementen van oxidatieve stress nog steeds in staat kunnen zijn inflammatie te initiëren via effekten op het aktivator proteïne-1 [AP-1; een transcriptie-factor] mechanisme. Differentiële mechanisme-aktivatie zou de uitéénlopende immunologische bevindingen kunnen verklaren die worden geobserveerd bij mensen met CVS. Oxidatieve stress, een toestand van chronische inflammatie, zou expressie van HDAC kunnen verminderen, wat een mechanisme oplevert waarmee inflammatoire processen de expressie van HDAC kunnen beïnvloeden, en daarmee de expressie van andere genen en cel-proliferatie. Het is ook mogelijk dat de aktiviteiten van HDAC’s verminderd zijn bij bepaalde ziekte-toestanden. Het is dan ook belangrijk de relatie te onderzoeken tussen oxidatieve stress en HDAC bij mensen met CVS.

Een nauw verband tussen glucocorticoïde sensitiviteit en oxidatieve stress werd uitvoerig beschreven [Adcock IM, Cosio B, Tsaprouni L, Barnes PJ, Ito K. Redox-regulation of histone-deacetylases and glucocorticoid-mediated inhibition of the inflammatory response. Antioxid. Redox Signal. (2005) 7: 144-152]; dit zou van toepassing kunnen zijn op CVS. Oxidatieve stress is gelinkt met glucocorticoïde resistentie via de aantasting van meerdere aspecten van GR-aktivatie en -werking, inclusief verminderd GR nucleair transport [bij binding van het hormoon verplaatst de GR zich naar de cel-kern om gen-expressie te reguleren] [Okamoto K, Tanaka H, Ogawa H, Makino Y, Eguchi H, Hayashi S, Yoshikawa N, Poellinger L, Umesono K, Makino I. Redox-dependent regulation of nuclear import of the glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. (1999) 274, 10363-10371: “nucleaire translocatie van de GR is verstoord bij oxidatieve toestanden”], gereduceerde GR-transcriptie via daling qua histoon-deacetylase (HDAC) aktiviteit en verminderde expressie van glucocorticoid regulerende genen. De primaire bedoeling van deze piloot-studie was het bepalen van de basale karakteristieken van gen-expressie gezien zijn invloed op een bestanddeel van de HPA-as in een geriatrische populatie met CVS. Specifieke hypotheses waren dat individuen met CVS het volgende zouden vertonen: (1) verminderde expressie van NR3C1 die gedaalde waarden qua plasma-cortisol vergezellen; (2) verminderde expressie en aktiviteit van klasse I HDAC’s. Plasma-DHEA en totaal anti-oxidant vermogen werden geëvalueerd om andere variabelen te beoordelen die mogelijks de cortisol-secretie in deze populatie beïnvloeden.

2. Methodes

2.1. Staal

Er werden data verkregen bij 9 individuen van 65 jaar of ouder met een diagnose van CVS volgens de Fukuda criteria. Er waren 6 vrouwen en 3 mannen. De gemiddelde leeftijd was 69 (65-79). Serum-cortisol diende als een indicator voor de funktie van de HPA-as. De stalen kwamen van het ‘Whittemore Peterson Institute for Neuro-immune Disease’.

2.2. Cortisol en DHEA

Cortisol-concentraties [commerciële ELISA-test]. Aangezien cortisol zelf wordt beïnvloed door een ander hormoon, dehydroepiandrosteron (DHEA), dat betrokken bleek bij het pathogenetisch proces van vermoeidheid, vonden we het belangrijk dit hormoon ook te onderzoeken [commerciële EIA-test].

2.3. Oxidatieve stress en anti-oxidant metingen

Het is belangrijk het homeostatisch vermogen van een organisme om de effekten van oxidatieve stress te bepalen. Dit is dikwijls gedaald bij ziekte en kan worden gemeten via een reeks testen die het ijzer-reducerend vermogen van plasma (‘ferric reducing ability of plasma’, FRAP) meet.

De redox-status van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd bepaald aangezien deze cellen tijdens inflammatoire processen zijn bloodgesteld aan ROS [reaktieve zuurstof soorten], wat een doeltreffende GSH [gereduceerd glutathion] -capaciteit vereist om ROS te neutraliseren die anders de immuun-funktie kan ontwrichten. De cytosol-fractie [intra-cellulaire vloeistof met daarin de cel-organellen] van geïsoleerde PBMCs werd gezuiverd […]. HDAC-aktiviteit werd dan gemeten via een colorimetrische test […].

Een daling qua HDAC-produktie kan op z’n beurt bijdragen tot een chronische pro-inflammatoire toestand, die kan resulteren in vermoeidheid. PBMC nucleaire cel-extracten werden geïncubeerd met HDAC test-substraat (een kort peptide met een geacetyleerd lysine-residu, dat kan worden gedeacetyleerd met HDAC-enzymes). Na incubatie werd ontwikkel-vloeistof toegevoegd dat met het the gedeacetyleerd lysine-residu reageert en colorimetrisch kan worden gemeten […] als HDAC-aktiviteit.

[…] De FRAP-test meet colorimetrisch totaal anti-oxidant vermogen […] en beschrijft de status van plasma anti-oxidanten (afgezien van proteïne-sulfhydrylen [reducerende -SH groepen]). De plasma-componenten die bijdragen tot de totale anti-oxidante capaciteit wordt geschat op 15% ascorbaat, 5% alfa-tocoferol [vitamine-E], 60% urinezuur, 5% bilirubine en 15% andere anti-oxidanten. […]

2.4. Gen-expressie

De cellen werden verstuurd naar Panomic’s Inc. voor onderzoek van mRNA-transcripten. Deze test-dienst wist niets af van de klinische populatie waarvan de cellen werden verkregen […]. Het ‘Quantigene Plex’ systeem gebruikt cel-lysaten en vertakt DNA […]. Resultaten werd uitgedrukt t.o.v. het gemiddeld signaal van glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase [GAPDH; een ‘huishoudelijk’ gen; makkelijk te amplificeren en als controle gebruikt bij PCR en gen-expressie]. […]

In plaats van polymorfismen in de GR te onderzoeken, keken we naar de aanwezigheid van RNA-transcripten die de receptor-expressie aantasten. Een transcript betrokken bij receptor-acetylering was NR3C1 (nucleaire receptor sub-familie 3, groep C, lid 1 Glucocorticoid Receptor). Door deze factor te onderzoeken, keken we naar de variantie qua expressie van een factor die betrokken is bij de regulering en expressie van een element van de HPA-as bij individuen met CVS. Onze rationale voor de selektie van dit gen was de volgende: polymorfismen van het NR3C1 gen bleken geassocieerd met CVS bij volwassenen [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I; Unger ER, Vernon SD, Heim C. Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes Brain Behav. (2007) 6: 167-176] en dit gen is één van de voornaamste transcriptionele regulatoren van de GR. Bijkomende onderzochte transcripten omvatten HDAC2, HDAC3, SIRT1 en NGF.

Sirtuine-1 (SIRT1) [NAD-afhankelijk deacetylase] is een belangrijke regulator van het p53 mechansime [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] en lijkt apoptose bij stress te doen verminderen. SIRT1 lijkt ook circadiaanse gen-expressie te beïnvloeden [Belden WJ, Dunlap JC. SIRT1 is a circadian deacetylase for core clock components. Cell (2008) 134: 212-214]. Het p53 mechanisme wordt ook beïnvloed door histoon-deacetylases die geassocieerd zijn met corticosteroïde ontregeling. Eerder vonden we een daling in mRNA-transcripten voor NR3C1, samen voorkomend met lagere cortisol-waarden in een populatie van volwassenen met chronische vermoeidheid (niet gepubliceerde data). Verminderde boodschap-overdracht van de glucocorticoid receptor in aanwezigheid van gedaald hormoon suggereerde ontregeling van signalisering. De meest waarschijnlijke gen-kandidaten, op basis van eerdere gegevens, waren HDAC2 en HDAC3. Deze werden gekozen omwille van hun invloed op het NF-κB mechanisme en verwevenheid met glucocorticoid [Ito K, Yamamura S, Essilfie-Quaye S, Cosio B, Ito M, Barnes PJ, Adcock IM. Histone-deacetylase 2 mediated deacetylation of the glucocorticoid receptor enables NF-kappaB suppression. J. Exp. Med. (2006) 203: 7-13]. We kozen er ook voor de aanwezigheid te onderzoeken van ‘nerve growth-factor’ [NGF; een klein eiwit, belangrijk voor de groei en overleving van bepaalde neuronen, werkt ook als een signalisering-molekule; ‘nerve growth-factors’ refereert naar een familie factoren, de zgn. neurotrofinen (waartoe o.a. ook de ‘Brain-Derived Neurotrophic Factor’ (BDNF) behoort)] die geassocieerd bleek met pijn-aandoeningen en betrokken bij CVS [Seidel MF, Herguijuela M, Forkert R, Otten U. Nerve growth factor in rheumatic diseases. Semin. Arthritis Rheum. (2010) 40: 109-126; zie ook ‘Glia, glutamaat-transport en chronische pijn].

2.5. Statistische procedures

[…]

3. Resultaten

Allereerst bepaalden we cortisol- en DHEA-waarden. Er werd een laag gemiddeld plasma-cortisol gevonden (64,36 ng/ml), wat aanzienlijk minder is dan bij gezonde controles. De gemiddelde DHEA-waarde was 21,68 ng/ml, wat aanzienlijk hoger is dan wat werd opgetekend voor een populatie van gezonde ouderen van 65-79 jaar (2,7 ng/ml).

Daarna bepaalden we de gen-regulering van de GR [Glucocorticoid Receptor] NRC31 bij de 9 oudere individuen met CVS en vergeleken deze met genormaliseerde ratios voor HDAC2, HDAC3 en SIRT1. Kwantificering van expressie gebeurde via de Quantigene micro-chip. De resultaten werden dan genormaliseerd t.o.v. GAPDH en de expressie-ratios werden bepaald. [De gemiddelde expressie-verhoudingen bij oudere volwassenen met CVS waren: 0,11 voor NR3C1 (0,65), 0,166 voor HDAC2 (0,037), 0,088 voor HDAC3 (0,044) en 0,58 voor SIRT1 (0,081); de waarden tussen haakjes zijn die voor “universeel RNA”)]

NGF correleerde positief met HDAC2 (p < .05), wat in overéénstemming is met de waarneming dat NGF een belangrijke rolspeelt bij neutrofinen-afhankelijke nitrosylering [toevoegen van een nitrosyl-groep (R-N=O) aan een proteïne] van HDAC-2 op cysteine [aminozuur met een zwavel-atoom] -residuen […], wat nodig bleek om de dissociatie van HDAC-2 van chromatine [= complex van DNA en eiwitten in de celkern] te induceren en daardoor de acetylering van histonen te vergemakkelijken. DHEA correleerde daarnaast negatief met SIRT1 (p < 0.1) en de verhouding DHEA/Cortisol correleerde negatief met HDAC2 (p < .01). Daarenboven vonden we verhoogde HDAC-aktiviteit (182 pmol/min/mg proteïne), wat aanzienlijk hoger ligt dan bij normatieve controles. HDAC correleerde ook negatief met leeftijd, wat verminderde aktiviteit naar gelang de leeftijd suggereert (p < .01). Cortisol correleerde positief met HDAC3 (p < .05) wat een mogelijke relatie tussen de twee parameters ondersteunt.

Voor dezelfde 9 individuen verkregen we FRAP-resultaten uitgedrukt als ascorbinezuur [vitamine-C] -equivalenten. De gemiddelde FRAP-waarde was 227,3 µm/l, wat uitgesproken lager is dan de typisch geobserveerde waarden van 400-800 µm/l bij gezonde of hypertensieve individuen van middelbare of oudere leeftijd. FRAP correleerde positief met DHEA (p < .01) en negatief met SIRT1 (p < .01).

4. Bespreking

Onze bevindingen suggereren dat in de context van verlaagd plasma-cortisol en verhoogd plasma-DHEA, vastgesteld in een geriatrisch staal patiënten met CVS, er verhoogde HDAC-expressie en aktiviteit is, samen met verminderd totaal anti-oxidant vermogen samenlopend met downregulering van het gen NR3C1. Hoewel deze bevinding validatie vereist bij een grotere en meer diverse groep individuen met CVS, kan het de klaarblijkelijke ontregeling van diurnale cortisol-secretie [men basseert zich dus best niet op één enkelvoudige meting] die wordt gevonden bij mensen met CVS helpen verklaren.

De akties van glucocorticoïden zijn complex. In het kort: bij vermeend gezonde volwassenen, zou men verwachten dat cortisol-binding op de GR een verhoging qua klasse-I HDAC aktiviteit zou initiëren. Een stijging van deze HDAC’s, in het bijzonder HDAC2, verhoogt DNA-winding en voorkomt inflammatoire gen-transcriptie. Deze verhoogde HDAC-aktiviteit lijkt het voornaamste mechanisme te bieden waardoor glucocorticoïden dan pro-inflammatoire gen-expressie onderdrukken. In deze studie, hebben een klaarblijkelijke ontregeling van dat mechanisme gevonden. We vonden verhoogde HDAC2/3 (klasse I) aktiviteit in aanwezigheid van gereduceerde waarden van hormoon en verminderde receptor-transcriptie. Dit impliceert dat andere mechanismen zouden kunnen dienen om verhoogde HDAC-aktiviteit te behouden. Hoewel cortisol significant correleerde met het HDAC3-niveau, vonden we een globale reductie qua plasma-cortisol vergeleken met dat gevonden in studies bij controles. Een bijkomende overweging is dat oxidatieve stress de neiging heeft HDAC-aktiviteit te reduceren, een werking die tegengesteld is aan deze gezien in onze bevindingen.

Een toename qua HDAC-2 expressie en -aktiviteit zou een algemene ontwrichting van belangrijke immunoregulerende mechanismen kunnen weerspiegelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat HDAC mRNA’s verhoogd zijn in geaktiveerde immuun-cellen, wat er op wijst dat ze dienen als merkers van immuunsysteem-aktivatie en ook zouden fungeren als potentiële doelwitten voor behandeling. Verhoogde HDAC-2 aktiviteit is geassocieerd met neuronale sterfte bij een brede waaier aan neurologische aandoeningen die vormen van cellulaire oxidatieve stress omvatten en leidt tot een verminderde histoon/transcriptie-factor acetylatie en verhoogde transcriptionele repressie [Dit laatste is een essentieel mechanisme bij de precieze controle van gen-expressie. Transcriptionele repressor-proteïnen binden op hun ‘target’-genen – direct via een DNA-bindend domein of indirect door interaktie met andere DNA-gebonden proteïnen.]. Omgekeerd: HDAC-2 inhibitie werkt beschermend tegen door oxidatieve stress geïnduceerde neuronale sterfte door het verschuiven van het evenwicht tussen histoon-acetyltransferases (HAT) en HDAC ten voordele van HAT-aktiviteit; zodoende wordt de transcriptionele repressie verlicht, wat leidt tot verhoogde expressie van anti-apoptotische genen, zoals p21 en Hsp70 [een ‘heat-shock’ proteïne, beschermen cellen tegen de schadelijke effekten van oxidatieve stress zie ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ & ‘‘Heat shock’ proteïnen en inspanning bij CVS] die gelinkt zijn met neuroprotektie. HDAC-inhibitie versterkt ook de interaktie van de transcriptie-factor Nrf2 op het anti-oxidant respons-element [ARE] ter upregulering van belangrijke anti-oxidante enzymes zoals glutathion-S-transferases, NAD(P)H, quinone-oxidoreductase-1 en haem-oxygenase-1 [expressie van deze genen beschermt cellen tegen oxidatieve schade en kan mutagenese & kanker voorkomen] die anti-oxidante en anti-inflammatoire effekten faciliteren. In samenhang met bovenstaande bevindingen, lijkt het dat CVS zou kunnen geassocieerd zijn met een onevenwichtige endogene anti-oxidante respons op oxidatieve stress, wat wordt weerspiegeld door de lagere FRAP-waarden bij de CVS-individuen.

Lagere cortisol-waarden worden dikwijls gevonden bij studies van mensen met CVS [bv. Nater UM, Youngblood LS, Jones JF, Unger ER, Miller AH, Reeves WC, Heim C. Alterations in diurnal salivary cortisol rhythm in a population-based sample of cases with Chronic Fatigue Syndrome. Psychosom. Med. (2008) 70: 298-305]. Eerder vonden wij een ontwrichting van het verwachte circadiaans secretie-patroon bij individuen met CVS. De huidige data demonstreren een patroon van downregulering van de NR3C1 gen-expressie in dit staal van mensen met CVS die verhoogde expressie van of HDAC2, HDAC3 en SIRT1 vertonen. De expressie van NR3C1 (het gen coderend voor de GR) was duidelijk gedownreguleerd. Interessant is dat studies hebben gevonden dat HDAC3 kan deacetyleren en dus transcriptie van NF-κB reduceren, waarvan is geweten dat het kan interfereren met GR-expressie en funktie [Nissen RM, Yamamoto KR. The glucocorticoid receptor inhibits NF-kappaB by interfering with serine-2 phosphorylation of the RNA polymerase II carboxyterminal domain. Genes. Dev. (2000) 15: 2314-2329]. Te samen met de bevinding van gedaald plasma-cortisol, biedt de gereduceerde expressie van het gen coderend voor de GR ondersteuning voor verdere research maar de werking van de HPA-as bij mensen met CVS.

Deze piloot-studie bleef beperkt tot een kleine groep en het gelimiteerd aantal onderzochte variabelen die de werking van de HPA-as beïnvloeden. Ook werd een beperkte set HDAC’s onderzocht en we keken niet naar de aktiviteit van histoon-acetyltransferase. We waren ook niet in staat een normatief controle-staal mee te nemen. De bevindingen ondersteunen evenwel ons concept voor een rol van epigenetische ontregeling van de Glucocorticoid Receptor bij het pathogenisch proces van CVS [zie ook ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid]. Het verder onderzoeken van de rol van HDAC’s bij CVS kan de variërende immunologische bevindingen die opdoken bij het bestuderen van CVS helpen verklaren. De bevindingen van deze studie dienen te worden gerepliceerd bij een groter staal en bij andere leeftijden van mensen met CVS.

december 14, 2010

Mogelijke Genetische Ontregeling bij Pediatrische CVS (NR3C1 & NF-kB)

Filed under: Endocrinologie,Genetica — mewetenschap @ 6:23 am
Tags: , , , , , ,

Eerder (zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS’) besloten we dat het verder bekijken van de interakties tussen de Glucocorticoid Receptor en ‘Nuclear Factor-κB’ de moeite waard zou zijn. Onderstaand stuk bevestigt dit nog eens. Onderzoekers zijn geïnteresseerd maar financiële middelen voor dergelijke research in de lage landen ontbreken…

 

Psychology, Vol.1 No.4, 2010, 247-251

Possible Genetic Dysregulation in Paediatric CFS

Leonard A. Jason1, Matthew Sorenson1, Nicole Porter1, Molly Brown1, Athena Lerch1, Constance Van der Eb1, Judy Mikovits2

1 DePaul University, Chicago, USA

2 The Whittemore Peterson Institute for Neuroimmune Disease, Reno, Nevada

SAMENVATTING

Hypocortisolisme is een frequente bevinding bij mensen met het Chronisch Vermoeidheid Syndroom (CVS) en zou een verklarende rol kunnen spelen in de ontwikkeling van de ziekte-symptomen. Het etiologisch [ziekte-veroorzakend] mechanisme achter deze bevinding zou de genetische variatie in expressie van de glucocorticoid receptor (GR) of verhoogde weerstand tegen de effekten van glucocorticoïden kunnen zijn. Verschillende onderzoekers zijn van mening dat allel-variatie in een GR (NR3C1) de expressie van chronische vermoeidheid medieert, mogelijks via een invloed op de werking van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA)-as [Rajeevan MS, Smith AK, Dimulescu I, Unger ER, Vernon SD, Heim C, Reeves WC. Glucocorticoid  Receptor Polymorphisms and Haplotypes Associated with Chronic Fatigue Syndrome. Genes, Brain & Behavior (2007) 6(2): 167-176; zie ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS); en ook Bhattacharjee M, Botting CH, Sillanpaa MJ. Bayesian biomarker identification based on marker-expression proteomics data. Genomics (2008) 92:384-392]. Daarnaast zijn verschillende immunologische variabelen geassocieerd met CVS. Het NF-κB mechanisme [zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’ & ‘NF-κB en Inspanning] is nauw betrokken bij cellulaire transcriptie en regulering, en bleek geassocieerd te zijn met de ontwikkeling van CVS. Het NF-κB mechanisme wordt direct gereguleerd door en beïnvloedt de aanwezigheid van de GR. Onze studie concentreerde zich op de beoordeling of een dergelijke inflammatoire transcriptie optreedt tijdens de adolescentie. Bevindingen gaven verminderde expressie van NFKB1, NFKB2 en NR3C1 aan. Een daling qua expressie van deze genen kan effekten hebben op de werking van immuuncellen en op cytokine-produktie die de immunologische bevindingen die worden gezien bij mensen met CVS zouden kunnen verklaren.

 

1. Inleiding

Bij volwassen populaties bleek de ontregeling van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA-as) geassocieerd met CVS. Volwassenen met CVS neigen lagere cortisol-waarden te vertonen, het belangrijkste signalering-hormoon van de HPA-as. De literatuur staat vol met de bevindingen die HPA-as ontregeling impliceren bij CVS, hetzij door een lagere basale cortisol, een gebrek aan responsiviteit van de HPA-as, een patroon van glucocorticoid-resistentie of verstoring/ontregeling van het verwachte dagelijkse cortisol-patroon. [Er is echter geen volledige eensgezindheid: zie ‘Cortisol bij CVS – verband met pijn en vermoeidheid]

Een gen coderend voor een defekt cortisol-bindend eiwit bleek geassocieerd met CVS [Torpy DJ & Ho JT. Corticosteroid-Binding Globulin Gene Polymorphisms: Clinical Implications and Links to Idiopathic Chronic Fatigue Disorders. Clinical Endocrinology (2007) 67(2): 161-167]. Dit defekt cortisol-bindend eiwit kan het vermogen om te reageren op cortisol verminderen. Smith et al. [Polymorphisms in Genes Regulating the HPA Axis Associated with Empirically Delineated Classes of Unexplained Chronic Fatigue. Pharmacogenomics (2006) 7(3): 387-394] vonden dat verhoogde expressie van genen die de HPA-as beïnvloeden en cortisol-produktie veranderen, de prevalentie voorspelden van onverklaarde chronische vermoeidheid. In een gen-studie door Rajeevan et al.. [zie hierboven] bleek cortisol ook betrokken bij CVS: er werden ‘single nucleotide’ polymorfismen gevonden in het glucocorticoid receptor (GR) gen (meerdere dergelijke allelen waren geassocieerd met verhoogd risico op CVS). Cortisol-binding wordt beïnvloed door elementen van de neuro-endocriene mechanismen.

Complexe interakties van neurologische, immuun- en endocriene systemen, vertrekkend vanuit de genetica van het individu, werken in combinatie met omgeving-factoren om het begin van CVS en het beloop ervan te beïnvloeden. In het bijzonder is een veranderde werking van de HPA-as betrokken bij het verminderd vermogen om reakties op stress te reguleren, zoals te zien bij aandoeningen zoals CVS. Variatie in de expressie van genen gelinkt met de HPA-as funktie is geassocieerd met CVS bij volwassen populaties. Eerder werk heeft variatie in de expressie van GR (NR3C1) gevonden bij personen met CVS, vergeleken met controles [Smith et al.; zie eerder]. Mensen met CVS zouden een verminderde gevoeligheid voor de effekten van cortisol kunnen hebben ten gevolge een downregulering van de GR.

Het is duidelijk dat een zekere mate van HPA-as dysfunktie betrokken is bij het pathogenetisch proces van CVS bij volwassenen en het is mogelijk dat soortgelijke variabelen het bestaan van HPA-as dysfunktie kunnen voorspellen bij pediatrische CVS-gevallen waarbij kinderen, adolescenten en jonge volwassenen betrokken zijn. Er werd bv. gevonden dat de aanwezigheid van HPA-as ontregeling in de adolescentie deze ziekte kan voorspellen. Japanese onderzoekers vonden dat cortisol-secretie was gereduceerd in een pediatrische populatie met CVS in vergelijking met de controle-groep. Anderen vonden een subtiele verandering in de bijnier-werking bij adolescenten met CVS, wat een vermindering van de centrale stimulatie van de bijnieren suggereert, waarbij meisjes een meer verzwakte respons op ACTH vertonen dan jongens. Er is consistente literatuur die ontregeling van glucocorticoid-funktie heeft gevonden in verband met CVS bij zowel volwassen als adolescente populaties.

De huidige studie richt zich op expressie van de steroid-receptor expressie in een pediatrische populatie met CVS en we onderzochten de aanwezigheid van meerdere specifieke genen geassocieerd met de ontwikkeling van CVS bij volwassenen. Eén van de primaire hypothesen die ten grondslag liggen van het voorgestelde werk, is dat een patroon van hypocortisolisme gezien bij volwassenen met CVS [Torres-Harding SR, Sorenson M, Jason L, Reynolds N, Brown M, Mahe  K, Fletcher MA. The Associations between Basal Salivary Cortisol and Illness Symptomatology  in Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Applied Biobehavioral Research (2008) 13(3): 157- 180 * zie ‘Cortisol bij CVS – verband met pijn en vermoeidheid], zich zou manifesteren in een pediatrische populatie met dezelfde ziekte. Daarnaast is NR3C1 één van de belangrijkste transcriptionele regulatoren van de GR en polymorfismen van het NR3C1 gen bleken geassocieerd met CVS bij volwassenen. We hebben ook NFKB1 en NFKB2, geassocieerd met inflammatoire responsen die gerelateerd zijn met de ontwikkeling van CVS bij volwassenen, gemeten. De initiatie van inflammatoire veranderingen kan verscheidene jaren voorafgaan aan de ontwikkeling van de vermoeidheid-symptomatologie. Daarom wilden we bepalen of een dergelijke inflammatoire transcriptie voorkwam tijdens de adolescentie.

2. Methode

[…] adolescenten met CVS (n = 6) […] gemiddelde leeftijd was 17,8 jaar (16 tot 21). Alle kregen de diagnose CVS door een arts die bekend was met deze ziekte. [Duidelijke karakterisatie van de CVS-populatie ontbreekt…]

[…] analyse van de gewenste mRNA-transcripten met behulp van een QuantiGene Plex System (Panomics Inc; Fremont, CA) […] berekend in verhouding tot het gemiddeld signaal van glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase (GAPDH) [een ‘huishoudelijk’ gen; makkelijk te amplificeren en als controle gebruikt bij PCR].

Rationale voor de selektie van cortisol en mRNA-transcripten:

We zochten naar de aanwezigheid van boodschapper-RNA transcripten die van invloed kunnen zijn op receptor-expressie. De reden voor de selektie van de onderzochte transcripten (NR3C1, NFKB1, NFKB2) was gebaseerd op eerdere bewijzen waaruit een mogelijke relatie tussen deze transcripten en CVS blijkt, samen met een evaluatie van hun bekende biologische aktiviteit. Op basis van eerdere bevindingen bij volwassen populaties, kozen we ook om cortisol-waarden in deze populatie te onderzoeken. Het NR3C1 gen codeert voor een proteïne-receptor voor glucocorticoïden. Dit proteïne kan binden aan DNA en andere eiwitten en zo transcriptionele regulering beïnvloeden. Mutaties in de struktuur van dit proteïne kunnen glucocorticoid-binding beïnvloeden, resulterend in een zekere mate van weerstand tegen de werking van glucocorticoïden.

Het NF-κB mechanisme is één van de belangrijkste regulatoren van de inflammatoire respons bij meerdere cel-populaties. Dit mechanisme beïnvloedt en wordt beïnvloed door het vrijkomen van cytokinen en andere inflammatoire mediatoren. NFKB1 is betrokken bij de cel-differentiatie en pro-inflammatoire immuun-respons. NFKB2 is ook betrokken bij de cel-differentiatie en pro-inflammatoire immuun-respons, maar heeft een sterkere rol op B-cellen en apoptose (geprogrammeerde cel-dood). De expressie van de nucleaire receptor familie NFKB1 (nucleire factor kappa licht polypeptide) en NFKB2 (nucleaire factor kappa lichte polypeptide gen-‘enhancer’) worden ook direct gereguleerd door en beïnvloeden de aanwezigheid van GR [De Brosscher K, Vandenberghe W, Haegeman G. The Interplay between the Glucocorticoid Receptor and Nuclear Factor-kb or Activator Protein-1: Molecular Mechanisms for Gene Repression. Endocrine Reviews (2003) 24(4): 488-522 * zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB]. Het bepalen van de niveaus van NFKB1 en NFKB2 biedt een manier om de relatieve efficiëntie van GR-funktie te bepalen en een inzicht te krijgen in de regulering van deze receptor in een adolescente populatie met vermoeidheid. In deze verkennende studie hebben we ervoor gekozen om ons te concentreren op deze waarvan is aangetoond dat ze bij volwassenen zijn geassocieerd met CVS. Zo onderzochten we de variatie in expressie van factoren die betrokken zijn bij de regulering en expressie van componenten van het immuunsysteem in een populatie van adolescenten met CVS.

3. Resultaten

De verkregen stalen vertoonden lage gemiddelde cortisol-waarden (56,73 ng/ml, SD = 24,73). Deze pediatrische CVS waarden zijn aanzienlijk lager dan die gevonden bij de pediatrische controle-stalen (6-16 jaar: 91,0 ng/ml, SD = 19) en ondersteunen de aanwezigheid van hypocortisolisme bij pediatrische stalen met CVS. [Cortisol-meting was éénmalig ’s morgens…]

Daarnaast werden de zes stalen naar de test-dienst van Panomics (Fremont, CA) gestuurd voor de bepaling van de drie afzonderlijke genen passend in het concept voor de ontwikkeling van CVS: NRC31, NFKB1 en NFKB2. Resultaten werden genormaliseerd t.o.v. GAPDH en de expressie-ratios afgeleid. […] De gegevens tonen een patroon van downregulering van gen-expressie in het pediatrisch staal met CVS, gelijktijdig met verminderde cortisol-waarden.

4. Bespreking

De belangrijkste bevindingen van de studie waren hypocortisolisme en de ge-downreguleerde expressie van NR3C1 (het gen dat codeert voor de GR), NFKB1 en NFKB2. De verlaagde expressie van het gen coderend voor de GR levert bewijs voor dysfunktie van de HPA-as bij mensen met CVS. De expressie van NF-κB wordt geassocieerd met pro-inflammatoire immuun-responsen en wordt veroorzaakt door stimuli, zoals reaktieve zuurstof soorten, mitogenen, cytokinen TNF-α en IL-1. In ons pedriatisch staal was er een duidelijke downregulering van NFKB1 en NFKB2. Er kan echter worden verwacht dat, in respons op ge-downreguleerde endogene glucocorticoïden, de transcriptie van inflammatoire genen door NF-κB ge-upreguleerd zijn. Glucocorticoïden hebben aanzienlijke onderdrukkende effekten op de expressie van NF-κB, een aktie die gebeurt door middel van ligand-binding van de glucocorticoid receptor. In aanwezigheid van downregulering van de glucocorticoid receptor, is het mogelijk dat onderdrukking van NF-κB inaktief is. Een andere mogelijkheid is een verstoring van een geassocieerde co-receptor of molekule die adequate GR-binding inhibeert, wat leidt tot een toestand waarin NF-κB en NR3C1 waarden beiden zijn verlaagd.

NF-κB is een pro-inflammatoire transcriptie-factor, en voorkomt apoptose en onderdrukking van het immuunsysteem die typisch worden aangetoond door ge-upreguleerde CD8+. In een studie bij meisjes met CVS, vonden Ter Wolbeek et al. [Longitudinal Analysis of Pro- and Anti-Inflammatory Cytokine Production in Severely Fatigued Adolescents. Brain, Behavior and Immunity (2007) 21(8):1063- 1074] ook verlaagde waarden van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en TNF-α maar verhoogde waarden van de anti-inflammatoire cytokinen IL-10 en interferon (IF)-γ. Aanwijzingen voor een proces van anti-inflammatoire transcriptie of onderdrukking van het immuunsysteem zou echter worden ondersteund door een overwicht van Th2-type immuun-respons en verhoogde cortisol-waarden [2].

Een mogelijke verklaring voor deze downregulering van alle drie de genen is een bi-directionele competitieve inhibitie of trans-repressie op NFKB1/NFKB2 en NR3C1, op elkaar uitgeoefend. Dit proces kan het eind-resultaat zijn van een langdurige aktivatie van het NF-κB mechanisme, zodat de expressies van NFKB1/NFKB2 zijn uitgeput via de produktie van hun eigen remmer Ik-Bα na translocatie naar de kern. Ik-Bα (een lid van de IK-B familie van inhiberende eiwitten) creëert een feedback controle-circuit dat voorkomt dat NF-κB waarden te hoog oplopen en overmatige inflammatie veroorzaken. Ik-Bα zal pro-inflammatoire transcriptie van NF-κB inhiberen via negatieve feedback, wat eventueel de downregulering van NFKB1and NFKB2 genen zou kunnen verklaren. Het initiëren van de triggering van het NF-κB mechansime wordt waarschijnlijk geregisseerd door de aanwezigheid van meerdere factoren: mitogenen, bakterieën, UV-straling, virussen, cytokinen IL-1 en TNF-α, samen met andere pro-inflammatoire molekulen en reaktieve zuurstof soorten (die allemaal het potentieel hebben om inflammatie te triggeren en cortisol-waarden te onderdrukken). Het is mogelijk dat een langdurige aktivatie van dit inflammatoir mechanisme heeft geleid tot de downregulering van de produktie van NFKB1 en NFKB2 door hun inhibitor Ik-Bα. Deze inhibitie zou dan de cel in een anti-inflammatoire toestand achterlaten, wat kan leiden tot de downregulering van het NR3C1 gen dat codeert voor de GR, aangezien de expressie ervan niet nodig zou zijn wanneer de cel zich in een anti-inflammatoire of onderdrukte toestand bevindt.

Een tweede mogelijke verklaring waarom alle drie de genen zijn ge-downreguleerd is competitie tussen NF-κB en de GR voor beperkte hoeveelheden van de volgende co-aktivatoren: steroid receptor co-aktivator-1 (SRC-1) en CREB-bindend eiwit (CBP). Beide co-activatoren binden aan NR3C1 en NF-κB, en zijn noodzakelijk voor de trans-aktivatie (transport naar de kern waar transcriptie wordt uitgevoerd) van zowel NF-κB en de GR [De Bosscher K, Schmitz ML, Vandenberghe W, Plaisance S, Fiers W, Haegeman G. ‘Glucocorticoid-Mediated Repression of Nuclear Factor-KappaB-Dependent Transcription Involves Direct Interference with Transactivation. Proceedings of the National Academy of Science USA (1997) 94 (25): 13504-13509]. Ontoereikende toelevering of onvoldoende hoeveelheden van deze co-activatoren kunnen leiden tot de ge-downreguleerde expressie van elk van de drie genen die coderen voor transcriptie-factoren. Het is ook mogelijk dat NFKB1 en NFKB2 betrokken zijn bij het beïnvloeden van de mate waarin de glucocorticoid receptor (GR) sensitiviteit voor zijn ligand (cortisol) vertoont. Zowel de expressie en gevoeligheid van de GR voor zijn ligand kan worden beïnvloed door een aantal factoren, waaronder maar niet beperkt tot: post-translationele modificaties, de effekten van signalisering-cascades, verminderde of veranderde expressie van heat-shock proteïnen, DNA-‘bending’ [buigingen (en ook verdraaiingen/lus-vormingen in het DNA) reguleren transcriptie], variaties in het receptor-proteïne, dimerisatie van een alternatieve receptor, receptor chaperone defekt [chaperones: eiwitten die helpen om andere eiwitten in een goede vorm te brengen of te houden, die helpen bij het modelleren en vouwen].

Deze gegevens tonen aan dat in een pediatrische populatie met CVS, er verminderde expressie is van het gen dat codeert voor de GR. In een adolescente populatie kan er een verhoogd niveau qua kwetsbaarheid voor verstoringen van de HPA-as aanwezig zijn. In een kwetsbare populatie kunnen dergelijke verstoringen eind-effekten hebben op de cognitieve mechanismen en levenslange neuro-endocriene responsiviteit. Hoewel veel van de speculaties betreffende de effekten van cortisol de neiging had om de gevolgen van hypercortisolisme te onderzoeken, kan het gebrek aan toereikend hormoon net zo verstorend zijn. Deze gegevens benadrukken het belang van het onderzoeken van dit mechanisme in een adolescente populatie. Deze bevindingen moeten als preliminair worden beschouwd gezien de beperkte grootte van het staal, en er is een nood aan replicatie bij een grotere groep.

september 12, 2010

alfa-MSH verhoogd bij CVS

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 7:02 am
Tags: , , , ,

BMC Neurol. 2010;10(1):73 [ahead of print]

The increase of alpha-melanocyte-stimulating hormone in the plasma of Chronic Fatigue Syndrome patients

Nobue Shishioh-Ikejima1, Tokiko Ogawa1, Kouzi Yamaguti2, Yasuyoshi Watanabe2,3, Hirohiko Kuratsune2,4,5, Hiroshi Kiyama1*

1 Department of Anatomy & Neurobiology, Osaka City University, Graduate School of Medicine, Osaka, 545-8585, Japan

2 Department of Physiology, Osaka City University, Graduate School of Medicine, Osaka, 545-8585, Japan

3 Center for Molecular Imaging Science, RIKEN, Kobe, Hyogo 650-0047, Japan

4 Faculty of Health Science for Welfare, Kansai University of Welfare Sciences, Kashihara, Osaka, 582-0026, Japan

5 Department of Comparative Pathophysiology, Graduate School of Agricultural & Life Sciences, The University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo, 113-8657, Japan

Samenvatting

ACHTERGROND: Ondanks uitgebreide research, werd nog geen betrouwbare biologische merker voor Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) geïdentificeerd. Hyper-ahtivatie van melanotrofen [alfa-melanocyt-stimulerend hormoon (alfa-MSH) secreterende cellen] in de hypofyse en verhoogde waarden van plasma alfa-MSH [ontstaat uit pro-opio-melanocortin (POMC), dat ook een voorloper is voor o.a. ACTH] werden echter gedetekteerd in een dier-model voor chronische stress. Omdat CVS wordt beschouwd gedeeltelijk te worden veroorzaakt door chronische stress, zouden verhoogde alfa-MSH plasma-waarden kunnen voorkomen bij CVS-patiënten. We bekeken daarom alfa-MSH waarden bij CVS-patiënten.

METHODES: 55 CVS-patiënten, waarbij voorafgaandelijk de diagnose (binnen de 10 jaar) werd gesteld, werden opgenomen in deze studie. 30 gezonde vrijwilligers werden bestudeerd als controles. ‘s Morgens werden nuchtere bloedstalen afgenomen en het plasma geëvalueerd op alfa-MSH [commerciële radio-immuno-assay; kruis-reaktiviteit met andere pro-opio-melanocortine peptiden < 0,002%.], adrenocorticotroop hormoon (ACTH), serum-cortisol en dehydroepiandrosteron-sulfaat (DHEA-S). De gemiddelde waarden van alfa-MSH werden vergeleken tussen de CVS- en controle-groepen.

RESULTATEN: De gemiddelde plasma alfa-MSH concentratie in de CVS-groep (17,9 +/- 1,0 pg/ml) was significant hoger dan bij gezonde controles (14,5 +/- 1,0 pg/ml, p = 0.02). Er was echter een brede reikwijdte in de CVS-groep. De factoren gecorreleerd met de plasma alfa-MSH waarden werden geanalyseerd. Er werd een negatieve correlatie gevonden tussen de duur van CVS en de plasma alfa-MSH waarden maar er werden geen verbanden met ACTH, cortisol of DHEA-S waarden geïdentificeerd. De CVS-patiënten werden onderverdeeld in twee groepen: patiënten waarvan de diagnose was gesteld binnen een duur van 5 jaar en binnen een duur van 5-10 jaar. Ze werden vergeleken met de gezonde controles. De gemiddelde alfa-MSH concentratie in de eerste groep (binnen 5 jaar) was 20,8 +/- 1,2 pg/ml, wat significant hoger was dan die bij de gezonde controles (p < 0.01). Er was geen significant verschil tussen de tweede groep (binnen 5-10 jaar) (15,6 +/- 1,4 pg/ml) en de gezonde controles.

BESLUITEN: CVS-patiënten met een ziekte-duur vanminder dan of gelijk aan of 5 jaar hadden significant hogere waarden voor alfa-MSH in hun perifeer bloed. alfa-MSH zou een krachtige biologische merker voor de diagnose van CVS, ten minste tijdens de eerste 5 jaar na het begin van de ziekte, kunnen zijn.

Achtergrond

Volgens de richtlijnen van de CDC [Fukuda 1994] wordt het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) gedefinieerd als blijvende moeheid, die niet wezenlijk door rust wordt verlicht en die vergezeld wordt door andere specifieke symptomen, gedurende een minimum van 6 maanden. De etiologie en de pathofysiologie van CVS blijven echter onduidelijk. Homeostatische systemen worden verondersteld verstoord te zijn bij CVS-patiënten, wat leidt tot langdurige ziekte en chronische moeheid symptomen. Er werd gebruik gemaakt van verscheidene benadering-wijzen om de mogelijke oorzaken van CVS aan te pakken. Psychologische aandoeningen zoals depressie, virale besmettingen, auto-immuun ziekten en langdurige stress werden allen als potentiële kandidaten beschouwd, hoewel de mechanismen waardoor deze aandoeningen de symptomen van CVS zouden kunnen veroorzaken nog onduidelijk zijn. CVS is een zeer heterogene en gedeeltelijk subjectieve ziekte, en er is geen standaard laboratorium-test beschikbaar voor een betrouwbare diagnose van CVS. Deze heterogeniteit en het gebrek aan betrouwbare biomerkers resulteren in een gebrek aan aanwijzingen voor het onderzoeken van de etiologie en de pathologie van CVS. Om deze vicieuze cirkel te doorbreken, wordt al lang gestreefd naar de identificatie van meerdere objectieve biomerkers voor CVS. In dit verband was de huidige studie gericht op het verkrijgen van een nieuwe biomerker voor CVS.

Een dier-model [ratten die verplicht werden te zwemmen] voor vermoeidheid werden opgezet door Tanaka en dit toonde een verminderd vermogen tot inspanning. Bij dit model vonden wij onlangs dat de langdurige stress diverse wijzigingen in de hersenen en daaropvolgende veranderingen in de endocriene organen en het brein veroorzaakte. De opmerkelijkste veranderingen kwamen voor in de hypofyse. Langdurige stress resulteerde in over-aktivatie van melanotrofen in de hypofyse en hun uiteindelijke cel-dood. Deze over-aktivatie en verdere cel-dood werden veroorzaakt door veranderde dopamine-expressie in een specifiek gebied van de hypothalamus, suggererend dat de molekulaire veranderingen in de hersenen kunnen leiden tot de dysfunktie en de verdere dood van hypofyse-cellen [Ogawa T, Shishioh-Ikejima N, Konishi H, Makino T, Sei H, Kiryu-Seo S, Tanaka M, Watanabe Y, Kiyama H: Chronic stress elicits prolonged activation of alpha-MSH secretion and subsequent degeneration of melanotroph. J Neurochem. (2009) 109:1389-99]. Significante verhogingen van plasma α-MSH waarden werden waargenomen in dit dier-model en de verwijdering van de hypofyse onderdrukte de verhoging die door de stimulus wordt veroorzaakt helemaal. Deze resultaten suggereerden dat de hyper-aktivatie van melanotrofen de overmatige afscheiding van α-MSH door de hypofyse in respons op continue stress veroorzaakte. We stelden daarom dat een gelijkaardige stijging van plasma α-MSH waarden, die de aktivatie van melanotrofen onder chronische stress weerspiegelt, bij mensen zou kunnen voorkomen; vooral bij patiënten die lijden onder blijvende vermoeidheid. In deze studie vergeleken we daarom plasma α-MSH waarden bij CVS-patiënten met die van gezonde controles tijdens de eerste 10 jaar van de ziekte.

[…]

Resultaten

[…] De gemiddelde plasma-concentratie van α-MSH in de CVS-groep was 17,9 ± 1,0 pg/ml, wat hoger was dan dat in de gezonde groep (14,5 ± 1,0 pg/ml, p = 0.02). De variatie qua waarden was groter in de CVS-groep dan in de gezonde groep. Wij onderzochten in de CVS-groep daarom de factoren die met niveaus α-MSH zouden kunnen gecorreleerd zijn. Er was een negatieve correlatie tussen plasma α-MSH waarden en ziekteperiode van CVS in maanden. Er waren geen correlaties tussen α-MSH en de volgende factoren: geslacht, leeftijd, visuele analoge schaal [pijn], score voor prestatie, BMI, DHEA-S, ACTH, cortisol, bloeddruk, voorgeschreven medicatie, of fysieke of mentale symptomen. Er werden, in het bijzonder, geen significante verschillen waargenomen qua α-MSH waarden tussen CVS-patiënten met en zonder depressie. Wij onderzochten de correlaties tussen de duur van CVS en concentraties stress-responsieve hormonen. Er waren geen significante correlaties tussen de duur van CVS en plasma-ACTH of serum-cortisol of DHEA-S. De CVS-patiënten werden verdeeld in twee groepen: een groep met kortere CVS-duur (6-60 maanden) en een groep met langere CVS-duur (61-120 maanden). […] De groep met de kortere duur had beduidend hogere waarden qua α-MSH dan de gezonde controles (p = 0.002). […] Er waren geen significante verschillen qua concentraties van andere stress-responsieve hormonen tussen de groep met kortere en die met langere duur. Daarnaast onderzochten wij de verschillen qua symptomen bij aanvang onder de patiënten met plotseling of geleidelijk begin, en vonden geen significante verschillen.

Bespreking

In deze studie toonden we aan dat de plasma α-MSH waarden van CVS-patiënten significant hoger waren dan die in normale gezonde controles en dat er een significante negatieve correlatie bestaat tussen α-MSH concentraties en de duur van CVS. Deze resultaten suggereren dat α-MSH een biomerker voor CVS zou kunnen zijn bij patiënten die minder dan 5 jaar aan de ziekte lijden. In tegenstelling daarmee konden we geen enkele significante correlatie tussen de ziekte-periode van CVS en de concentraties aan ACTH, cortisol of DHEA-S identificeren. Dit suggereert dat goed-gekende stress-merkers zoals ACTH en cortisol geen geschikte merkers voor CVS zijn. α-MSH heeft ook het voordeel dat de plasma-waarden, zowel qua dagelijkse variaties als qya seizoen-gebonden variaties vrij stabiel blijven. Voorts vallen de waarden van α-MSH bij gezonde controles binnen een vrij smal bereik, zoals getoond in de huidige als vroegere rapporten. α-MSH zou dus een voordeel als biomerker kunnen hebben om de diagnose van CVS in termen van stabiliteit te stellen, omdat de α-MSH waarde niet door acute stress en ritmiek wordt beïnvloed.

Circulerend α-MSH zou kunnen voortkomen uit de hypofyse en/of de bloedcellen. De resultaten van experimenten die een continue stress rat-model gebruiken, suggereren dat α-MSH door de hypofyse werd geproduceerd. Dopaminerge neuronen gelokaliseerd in het hypothalamisch peri-ventriculair gebied projecteren hun axonen naar de midden-kwab en onderdrukken melanotrofe aktiviteit via dopamine-produktie. In onze vorige studie, veroorzaakte de verminderde dopamine-synthese in deze neuronen hyper-aktivatie van melanotrofen. Dit werd bevestigd door de toepassing van een dopamine-agonist [bromocriptine], die de afscheiding van α-MSH door de hypofyse onderdrukte. Voorts resulteerde de verwijdering van de hypofyse in de onderdrukking van de stress-geïnduceerde verhoging van het plasma α-MSH, suggererend dat de chronische stress-geïnduceerde verhoging van α-MSH zijn oorsprong vindt in de hypofyse. Deze resultaten suggereren dat de dopamine-synthese in sommige hypothalamische neuronen wordt onderdrukt bij CVS-patiënten en melanotrofen kunnen dus hyper-geaktiveerd worden. Intrigerend is dat Sharpe et al. een verhoging aantoonden van de prolactine-repons bij CVS en suggereerden de mogelijkheid dat CVS-patiënten een abnormale dopamine-neurotransmissie konden hebben. Globaal suggereren deze resultaten dat een aandoening van de hypothalamische dopaminerge neuronen of de dopamine-neurotransmissie bij CVS-patiënten zou kunnen voorkomen en dat dit de afscheiding van hyofyse-hormonen verder kan beïnvloeden. Hoewel de struktuur van de middenkwab minder duidelijk is dan bij knaagdieren, worden melanotrofen gevonden in het midden-gebied van de hypofyse bij mensen. Het lijkt dus waarschijnlijk dat de verhoging van circulerend α-MSH bij CVS-patiënten voortkomt uit de hypofyse, in respons op blijvende en verlengde stress. Nochtans hebben sommige studies bij mensen gerapporteerd dat sommige bloedcellen in patiënten met sepsis en sommige inflammatoire ziekten α-MSH secreteren en de mogelijkheid dat α-MSH wordt afgescheiden door sommige bloedcellen bij CVS-patiënten na langdurige stress kan niet worden uitgesloten.

We vonden een negatieve correlatie tussen α-MSH waarden en de duur van CVS. Naar mate de duur steeg, viel α-MSH terug op gelijkaardige waarden als bij gezonde controles. Dit kan een resultaat zijn van melanotrofe dysfunktie na langdurige stimulatie. In een rat-model vertonen melanotrofen onderworpen aan ononderbroken stress die meer dan 5 dagen duurt degeneratieve kenmerken, toe te schrijven aan hyper-secretie van α-MSH, en de verhoogde α-MSH waarden verminderden vijf dagen na stimulatie. Zodoende raken melanotrofen bij mensen met CVS waarschijnlijk uitgeput en verstoord door langdurige stress. Het is ook mogelijk dat melanotrofen na verlengde stimulatie ongevoelig worden of dat langdurig hoge α-MSH waarden een niet-geïdentificeerd feedback-systeem vanuit de periferie kunnen aktiveren.

De funktionele betekenis van circulerend α-MSH blijft onduidelijk, hoewel is aangetoond dat α-MSH een anti-inflammatoire funktie heeft. In vitro werden door lipopolysaccharide gestimuleerde inflammatoire cytokinen onderdrukt door toediening van α-MSH [bv. Yoon SW, Goh SH, Chun JS, Cho EW, Lee MK, Kim KL, Kim JJ, Kim CJ, Poo H: alpha-Melanocyte-stimulating hormone inhibits lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha production in leukocytes by modulating protein kinase A, p38 kinase and nuclear factor kappa B signaling pathways. J Biol Chem. (2003) 278:32914-20]. Overeenkomstig deze studie in vitro werden de verhogingen van plasma α-MSH ook gerapporteerd bij sommige met inflammatie geassocieerde ziekten, zoals HIV en sepsis. Intrigerend is dat gestegen α-MSH waarden in het bijzonder werden waargenomen bij patiënten met niet-progressieve HIV en bij sepsis-patiënten met lagere tumor necrose factor-α (TNF-α) waarden in het plasma. Deze observaties suggereren dat de verhoogde α-MSH waarden de inflammatoire respons zouden kunnen onderdrukt hebben, en bijgevolg de progressie van HIV en de verhoging van TNF-α zouden kunnen geremd hebben. Sommige CVS-patiënten in de huidige studie hadden ook symptomen zoals lichte koorts, keelpijn en lymfadenopathie, hoewel er geen significante correlaties tussen α-MSH waarden en deze symptomen werden waargenomen. Nochtans konden we bij deze studie niet besluiten dat de verhoging van α-MSH kwam door de anti-inflammatoire funktie. In sommige artikels werden gestegen α-MSH waarden ook aangetoond bij patiënten die lijden aan hart-falen [CHF, ‘congestive heart failure’: het hart kan niet genoeg bloed naar de organen pompen] en zwaarlijvigheid. Geen enkele van de patiënten in de huidige studie had CHF en acht hadden BMIs van > 25. Wij konden dus de mogelijke correlatie tussen CVS en CHF niet bekijken en er werd geen correlatie gevonden tussen α-MSH waarden en BMI bij de onderzochte patiënten. Bijgevolg is het moeilijk om één of andere funktionele betekenis voor de verhoging van α-MSH bij CVS-patiënten te bedenken en we konden de mogelijkheid dat dit eenvoudigweg een empirische associatie was niet uitsluiten.

[…]

Hoewel α-MSH een biomerker voor CVS met een duur van max. vijf jaar zou kunnen zijn, zou de α-MSH concentratie in andere met moeheid verwante ziekten, zoals slapeloosheid, slaap-apnoea en inflammatoire ziekten veroorzaakt door virus-infekties, hoger kunnen zijn. Deze punten zouden in toekomstige studies moeten worden verduidelijkt.

Besluiten

Samenvattend: er worden verhoogde plasma-waarden van α-MSH gevonden bij patiënten met CVS tijdens de eerste 5 jaar van de ziekte. Hoewel de verhoogde α-MSH waarden ook bij CHF, zwaarlijvigheid en inflammatoire ziekten zoals sepsis en HIV worden waargenomen, kunnen al deze ziekten worden gediagnostiseerd en worden uitgesloten als diagnose bij patiënten met CVS. Na uitsluiting van deze andere ziekten, heeft α-MSH het potentieel om als biomerker voor CVS te fungeren. Verdere studies bij met vermoeidheid verwante ziekten zijn nodig om dit potentieel te bevestigen en de betrouwbaarheid van α-MSH als merker voor CVS te verduidelijken.

————————-

Er wordt vermeld dat de toediening van een dopamine-agonist de secretie van α-MSH door de hypofyse onderdrukt in een dier-model voor CVS. Men zou dan kunnen veronderstellen dat molekulen zoals bv. pramipexol en ropinirol – middelen die worden voorgeschreven aan mensen met Parkinson’s en RLS – de verhoogde alfa-MSH waarden bij CVS kunnen verlagen en van nut zouden kunnen zijn voor CVS-patiënten? We hebben omtrent de  toediening van dopamine-agonisten bij CVS geen publicaties gevonden; ook de hoofd-auteur (Hiroshi Kiyama; Professor Anatomie & Neurobiologie) van bovenstaand artikel heeft er nog geen gezien en heeft dit niet onderzocht maar veronderstelt dat ze de release van alfa-MSH kunnen onderdrukken. Misschien toch de moeite om dienaangaande een klinische proef op te zetten? Momenteel is er dus nog geen bewijs voor een nut bij M.E.(cvs)…

Dat alfa-MSH verhoogd is bij langdurige stress wil nog niet zeggen dat dit de oorzaak van M.E.(cvs) is; het kan, mede door effekten op het immuunsysteem, wel een onderhoudende factor zijn.

december 28, 2009

Cortisol bij CVS – verband met pijn en vermoeidheid

Filed under: Diagnostiek,Endocrinologie — mewetenschap @ 7:12 am
Tags: , , , , , ,

De publicaties betreffende de HPA-as en/of cortisol bij M.E.(cvs) zijn legio. De resultaten zijn echter zeer heterogeen… Ook de resultaten van de studie door de groep van Prof. Jason (Chicago) komen niet altijd overeen met wat door anderen werd gevonden. De reden waarom we er hier nu toch melding van maken is omdat werd getracht te verduidelijken dat men zich best niet op één enkelvoudige meting baseert en dat men dient onder te verdelen in subgroepen…

Journal of Applied Biobehavioral Research (2008) Vol. 13, #3, pp. 157-180

The associations between basal salivary cortisol and illness symptomatology in Chronic Fatigue Syndrome

Susan Torres-Harding (1), Matthew Sorenson (2), Leonard Jason (2), Nadia Reynolds (2), Molly Brown (2), Kevin Maher (3), Mary Ann Fletcher (3)

1 Roosevelt University / 2 DePaul University / 3 University of Miami

Samenvatting

Hypocortisolisme [te lage hoeveelheden cortisol in het bloed] werd reeds gerapporteerd bij Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) maar de significantie hiervan voor de ziekte-etiologie is onduidelijk. Deze studie onderzocht cortisol-waarden en hun relaties met symptomen in een groep van 108 individuen met CVS. De CVS-symptomen die werden bestudeerd waren vermoeidheid, pijn, slaap-problemen, neurocognitieve funktie en psychiatrische toestand. Veranderingen in cortisol-waarden werden onderzocht door berekening van het gemiddeld dagelijks cortisol en de variatie in cortisol-funktie werd bestudeerd d.m.v. een regressie-curve. Daarenboven werd de afwijking van het verwacht diurnaal patroon [volgens slaap/waak-ritme, aktief gedurende de dag] van cortisol bepaald via klinische beoordeling. De resultaten wezen er op dat vermoeidheid en pijn geassocieerd waren met cortisol-waarden in speeksel. In het bijzonder was de variantie van het verwacht cortisol-patroon verbonden met verhoogde vermoeidheid. De implicaties van deze bevindingen worden besproken.

[…] De oorzaken van CVS zijn momenteel onbekend en, tot op heden, is er geen duidelijke diagnostische merker voor deze ziekte opgedoken. Fysiologische studies hebben de aanwezigheid gesuggereerd van ontregeling van de immuun-, endocrien en neurologische systemen, en researchers hebben talrijke abnormaliteiten in deze systemen gevonden. Vele van deze fysiologische abnormaliteiten werden echter nog niet bevestigd bij andere studies, en een verwarrend beeld bestaat nog betreffende de pathofysiologie van deze ziekte. Er werd gesuggereerd dat individuen met CVS een heterogene populatie vormen en het feit dat er weinig vooruitgang werd geboekt in het duidelijk aflijnen van de fysiologie van deze ziekte, zou het resultaat kunnen zijn van de aanwezigheid van afzonderlijke subgroepen binnen de grotere paraplu-diagnose [Jason LA, Corradi K, Torres-Harding S, Taylor RR & King C. Chronic Fatigue Syndrome: The need for subtypes. Neuropsychology Review (2005) 15, 29-58].

Enkele abnormaliteiten werden echter meer consistent gerapporteerd bij een subset van individuen met CVS. Een bevinding die frequent wordt gemeld, is een dysfunktie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as met daaruit voortvloeiend hypocortisolisme [bv. Cleare AJ. Neuro-endocrine dysfunction. In L.A. Jason, P.A. Fennell & R.R. Taylor (Eds.), Handbook of Chronic Fatigue Syndrome (2003) Hoboken, NJ: John Wiley & Sons]. Cortisol, een glucocorticoid, is het belangrijkste eind-produkt van de HPA-as en is betrokken bij de regulering van meerdere lichaam-systemen. Enkele onderzoekers hebben opgemerkt dat ca. 20%-25% van de individuen met CVS en aanverwante aandoeningen – zoals fibromyalgie (FM) of post-traumatische stress aandoening (PTSD) – hypocortisolisme en downregulering van de HPA-as vertoonden. Cleare vond bij een literatuur-‘review’ betreffende HPA-dysfunktie bij CVS dat vele – maar niet alle – studies over cortisol bij CVS lagere ‘baseline’ cortisol-waarden en veranderingen qua sensitiviteit van de HPA-as in ten minste sommige patiënten met CVS. Daarenboven vond men verlaagde cortisol-responsen bij het ontwaken bij individuen met CVS [Roberts ADL, Wessely S, Chalder T, Papadopoulos A & Cleare AJ. Salivary cortisol response to awakening in Chronic Fatigue Syndrome. British Journal of Psychiatry (2004) 184, 136-141].

Er is mogelijks een daling van de globale cortisol-secretie bij individuen met CVS en er zouden ook wijzigingen qua sensitiviteit of responsiviteit van de HPA-as kunnen zijn geassocieerd met vermoeidheid. Veranderingen in de responsiviteit van de HPA-as, een belangrijke arm van de stress-respons, zou een verhoogde of gedaalde stress-respons kunnen impliceren. Dit is vergelijkbaar met literatuur die CVS karakteriseert als een stress-gerelateerde aandoening in de zin dat veel individuen met CVS meer symptomen en/of opflakkeringen of herval na perioden van ernstige stress meldden, en stress werd door enkele researchers voorgesteld als oorzaak voor dysfunktie van in het endocrien én het immuunsysteem bij CVS. Hypocortisolisme bleek voor te komen bij meerdere fysiologische en psychologische aandoeningen, inclusief CVS, FM, chronische bekken-pijn, prikkelbare darm syndroom en PTSD. Dit heeft enkelen er toe geleid een gemeenschappelijk endocrinologisch mechanisme voor te stellen dat aan de basis zou kunnen liggen van de ontwikkeling van ‘stress-gerelateerde’ aandoeningen en dat mogelijks gemeenschappelijke symptomen van verhoogde stress-gevoeligheid, vermoeidheid en pijn zou kunnen helpen verklaren.

De oorzaak van hypocortisolisme bij sommige patiënten met CVS blijft echter onduidelijk. Sommig bewijsmateriaal suggereert dat het zou kunnen worden veroorzaakt door signalisering van het central zenuwstelsel naar de bijnieren, zoals beperkte output van adrenocorticotroop hormoon (ACTH) [corticotropine; hormoon gesecreteerd door de hypofyse dat inwerkt op de bijnier-schors en de aanmaak van corticosteroïden zoals cortisol stimuleert]; verminderde grootte van de bijnieren; compenserende verschuiving naar hypocortisolisme na een periode van of hyper-aktiviteit van de HPA-as volgend op chronische stress; en versterkte negatieve feedback van de HPA-as en gedaalde respons van ACTH vergezeld van normale cortisol-release na HPA-stimulatie, suggestief voor een gedaalde afgifte van corticotropine-afgevend hormoon (CRH) [vrijgegeven door de hypothalamus bij stress; stimuleert o.a. de adenohypofyse tot het aanmaken van ACTH] op centraal niveau. Deze dysfunktie lijkt niet verbonden met perifere veranderingen qua vrij cortisol, zoals verhoogde synthese van cortison uit cortisol. [zie ook: ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS’]

De klinische betekenis van hypocortisolisme en/of een abnormaal afgeplat diurnaal patroon is onduidelijk. Bij onderzoek uitgevoerd bij niet-klinische stalen óf bij individuen met andere chronische, medische of psychiatrische aandoeningen werden echter van wijzigingen qua HPA-funktie aangetoond dat ze gerelateerd zijn met andere fysiologische en psychiatrische symptomen, zoals slaap-patronen, cognitieve veranderingen, depressie, pijn. Hypocortisolisme zou kunnen geassocieerd zijn met de cognitieve funktie. De associatie tussen neuro-endocriene funktie en neurocognitieve funktie werd bv. onderzocht bij een groep van 50 vrouwen met FM, een verwante aandoening. De researchers vonden dat lager cortisol geassocieerd was met slechtere prestatie bij testen van het visuele onmiddellijke en vertraagde her-oproepen, en van het vertraagde verbale her-oproepen. Ze vonden ook dat depressieve symptomen verbonden waren met geheugen-dysfunktie. Ze besloten dat hypocortisolisme en depressieve symptomen een impact zouden kunnen hebben op cogniteive dysfunktie in. In een andere ziekte-groep (Multipele Sclerose) was HPA-werking – gemeten d.m.v. baseline cortisol – gerelateerd met cognitieve stoornissen in een groep van 15 patiënten.

Daarenboven staan bijnier-corticosteroïden bekend om hun associatie met slaap. Enkele onderzoekers merken op dat acute cortisol-toediening ‘slow-wave’ slaap [diepe slaap met patroon van trage golven op het EEG; spieren zijn compleet ontspannen, hartritme (en dus ook bloeddruk) daalt, ademhaling is regelmatig en lichaamstemperatuur daalt] verhoogt en REM-slaap inhibeert. Cortisol heeft ook een circadiaans ritme [cyclus van ca. 24 uur in de biochemische, fysiologische of gedrag-processen van levende wezens; biologische klok], met de hoogste waarden bij het ontwaken, met een piek an het wakker-worden en dalend met het verloop van de dag. Slaap-onthouding is verbonden met aktivatie van de HPA-as, en slaap-fragmentatie of nachtelijke ontwakingen bleken geassocieerd met pulsatiele cortisol-afgifte. Het is dus mogelijk dat de slaap-problemen gezien bij CVS zouden kunnen gelinkt zijn met dagelijkse variaties van baseline cortisol-waarden.

Hypocortisolisme zou ook gerelateerd kunnen zijn met pijn-symptomen. In een studie bij 131 individuen met FM, individuen met risico voor het ontwikkelen van chronische pijn en gezonde controles, werden individuen met FM en risico op het ontwikkelen van FM lagere cortisol-waarden gevonden dan bij de controle-groep. Cortisol-waarden in het speeksel waren echter niet verbonden met andere psycho-sociale factoren (inclusief zelf-gerapporeerte slaap-problemen, een meting van algemeen leed, somatische symptomen, ziekte-gedrag en gezondheid-angst), noch met de aanwezigheid recente stressvolle levensgebertenissen. Ook anderen vonden dat pijn en cortisol-waarden in het speeksel geassocieerd waren bij 28 patiënten met FM.

Ten slotte: co-morbide depressieve symptomen bij CVS liggen 50% hoger vergeleken met andere chronische medische aandoeningen. Bij CVS, waar hypocortisolisme frequent word gemeld, is het verband tussen cortisol-dysfunktie en depressie onduidelijk. Inderdaad: vele studies i.v.m. hypocortisolisme en CVS verklaren de depressieve symptomen niet en dit zou gedeeltelijk verantwoordelijk kunnen zijn voor de negatieve bevindingen die door sommige researchers werden gerapporteerd bij het vergelijken van cortisol-waarden tussen CVS-patiënten en controles. Eén studie vond dat individuen met CVS met of zonder ernstige depressie (gemeten d.m.v. de ‘Beck Depression Inventory’) lagere serum cortisol-waarden hadden vergeleken met gezonde controles. Bij deze studie werd de associatie tussen depressie en cortisol-waarden zelf echter niet onderzocht, dus is het niet gekend of de aanwezigheid of de ernst van depressie zou kunnen geassocieerd zijn met cortisol-waarden. Van andere variabelen zoals leeftijd en sexe werd gemeld dat ze een impact hebben op cortisol-waarden en deze kunnen potentieel verwarrende variabelen zijn.

Ons onderzoek exploreerde de verbanden tussen cortisol-waarden in speeksel, symptomen van CVS en psychiatrische status. Er werd verwacht dat individuen met CVS waarbij bewijs werd gevonden voor abnormale basale cortisol-waarden of hypocortisolisme meer vermoeidheid, meer pijn en slaap-moeilijkheden zouden vertonen vergeleken met individuen met CVS met hogere cortisol-waarden. Verder werd er verwacht dat basale cortisol-waarden zouden geassocieerd zijn met psychiatrische status, inclusief het hebben van een depressie of PTSD, en met algemene depressie- en angst-waarden.

Methode

Alle gegevens werden verzameld in de context van een grotere studie die de effektiviteit onderzocht van cognitieve gedrag therapieën bij individuen met CVS [Jason LA, Torres-Harding S, Friedberg F, Corradi K, Njoku MG, Donalek J et al. Non-pharmacologic interventions for CFS: A randomized trial. Journal of Clinical Psychology in Medical Settings (2007) 14, 275-296]. […] Alle deelnemers moesten ten minste 18 jaar oud zijn, niet zwanger en in staat engels te lezen en spreken, en geacht fysiek in staat te zijn om de geplande sessies bij te wonen. […] Omdat CVS een uitsluiting-diagnose is, werden toekomstige deelnemers gescreend op identificeerbare psychiatrische en medische aandoeningen die CVS-achtige symptomen kunnen verklaren. […]

Alle mogelijke deelnemers kregen een medisch onderzoek bij de studie-arts om de diagnose van CVS te bevestigen. Nadat werd bevestigd dat het individu volledig aan de criteria voor CVS volgens Fukuda et al. (1994) definitie voldeed, werden de individuen onderworpen aan een batterij baseline metingen (zie verder). Ze werden ook willekeurig ingedeeld bij één van vier behandel-condities en ondergingen metingen op drie follow-up tijdstippen. Enkel de data verkregen bij baseline werden echter in overweging genomen bij het huidig onderzoek. Een totaal van 114 individuen werd uitgekozen; […]. Van deze 114 deelnemers, waren er 108 die het staalname-protocol voor speeksel-cortisol vervolledigden en de huidige studie onderzoekt de resultaten van deze deelnemers. […].

Metingen

De CVS-vragenlijst

[zie ‘Energie Enveloppe Theorie’ en ‘Energie Quotient’ bij M.E.(cvs)] Voor elk symptoom van de Fukuda et al. (1994) definitie gaven de deelnemers de intensiteit op een a schaal van 0 tot 100, waarbij 0 = geen probleem en 100 = het ergst mogelijke probleem.

Het gestruktureerd klinisch interview voor DSM-IV as I

Dit interview werd gebruikt om psychiatrische diagnosen te stellen. […] laat klinische beoordeling toe bij het toewijzen van symptomen aan psychiatrische of medische categorieën, een cruciaal onderscheid bij het bepalen van symptomen die overlappen bij CVS en psychiatrische aandoeningen […].

Medisch onderzoek

De screening-evaluatie door de arts omvatte een algemeen en neurologisch fysisch onderzoek. De batterij laboratorium-testen omvatte het minimum nodig om andere ziekten uit te sluiten (Fukuda et al. 1994). […]

Vermoeidheid-graad

Krupp, LaRocca, Muir-Nash en Steinberg’s (1989) ‘Fatigue Severity Scale’ (FSS) werd gebruikt om vermoeidheid te meten. Deze schaal bestaat uit 9 items telkens op een schaal met 7 punten en is gevoelig voor verschillende aspekten en gradaties van vermoeidheid. […] Een studie door Taylor, Jason en Torres (2000) vond dat, in een CVS-achtige groep, de ‘Fatigue Severity Scale’ geassocieerd was met de graad voor de acht Fukuda et al. CVS-symptomen.

Beck’s depressie-inventaris II

[…] Depressie-symptomen werden gemeten met de BDI-II (Beck, Steer & Brown 1996), een zelf-rapportering instrument met 21 items met goed vastgestelde psychometrie. […].

Korte pijn-inventaris

De ‘Brief Pain Inventory’ (BPI; Cleeland & Ryan, 1994) werd toegepast voor het meten van de pijn-intensiteit (pijn-ernst) en de interferentie van pijn in het dagelijks leven van patiënten (pijn-interferentie).

Beck’s angst-inventaris

Angst-symptomen werden gemeten met de ‘Beck Anxiety Inventory’ (BAI), een zelf-rapportering instrument met 21 items met vastgestelde en herhaalde validiteit. […]

‘California Verbal Learning Test – Second Edition’

Deze CVLT (Delis, Kramer, Kaplan & Ober 2000) is een meting van het vermogen van de deelnemer om verbale informatie te leren en te herinneren. Het houdt in dat de deelnemer een woordenlijst met 16 items leert en onthoudt na herhaalde voorstellingen, onmiddellijk erna en met een vertraging van ca. 20 minuten. Deze test omvat ‘free recall’ [spontaan her-oproepen], ‘cued recall’ [her-oproepen na een hint] en woord-herkenning. […]

‘Digit-span’

Dit is één van de sub-tests van de ‘Wechsler Adult Intelligence Scales-Third Edition’ (WAIS-III). Deze test meet aandacht en korte-termijn aandacht. Deze sub-test omvat twee delen: cijfers voorwaarts en cijfers achterwaarts. […]

Rey-Osterreith figuur-tekenen

De ‘Rey-Osterreith Complex Figure’ (ROCF) teken-test omvat het reproduceren van een abstracte visuele stimulus. Het houdt in dat een complexe figuur met de hand wordt gecopieerd. Daarna wordt de deelnemer gevraagd de figuur uit het hoofd te reproduceren onmiddellijk erna en een derde keer 30 minuten na de eerste poging. Deze test meet visuo-spatiaal, visueel-organisationeel en integratie-vermogen, motor-capaciteiten, en instant en vertraagd geheugen voor complexe visuele stimuli (Lezak 1995).

‘Neurobehavioral Evaluation System’ continue prestatie test

Het ‘Neurobehavioral Evaluation System’ (NES-2) continue prestatie test is een sub-test van de NES (Letz & Baker 1988), een computer-test voor neurocognitieve funktie die uitvoerig wordt gebruikt bij beroepsgezondheid-studies (Arcia & Otto 1992). Deze bestaat uit een test waarbij letters kort oplichten op het scherm (ca. 50 ms), à rato van één per seconde. De deelnemer moet op de respons-knop drukken als de letter ‘S’ op het scherm komt maar niet bij om het even welke andere letter. Cognitieve mogelijkheden die hier worden gemeten zijn respons-snelheid en aandacht. […].

‘Trailmaking’-test, trajekt A en B’

Dit is een korte, makkelijk af te nemen test voor aandacht, aaneenschakeling, mentale flexibiliteit, visueel zoeken en motor-funktie (Spreen & Strauss 1998). Ze bestaat uit twee delen, A en B. De deelnemer moet eerst opeenvolgende genummerde cirkels verbinden op een werk-blad (deel A) en wordt dan gevraagd om de opeenvolgende verbonden genummerde en geletterde cirkels afwisselend volgens nummers en letters te ordenen (deel B). De deelnemer wordt aangemoedigd zo snel mogelijk te werken. […]

Gegroefd gaatjesbord

Dit is een manipulatieve handigheid-test. Ze bestaat uit een bord met 25 openingen en het individu moet de pinnen in willekeurig geplaatste openingen in het bord plaatsen. Hier wordt de complexe visuele motor-coördinatie, manuele vaardigheid en verwerking-snelheid gemeten. De test wordt twee keer uitgevoerd: één keer per hand. […]

Slaap-moeilijkheden

Slaap-stoornissen werden onderzocht d.m.v. de ‘Pittsburgh Sleep Quality Index’ (PSQI), die werd ontwikkeld om de slaap-kwaliteit te meten in psychiatrische research (Buysse, Reynolds, Monk, Berman & Kupfer 1989). Deze index meet slaap-verstoringen en slaap-kwaliteit. Er zijn 19 vragen (op een 0-3 schaal) die een globale score opleveren. […]

Cortisol-variabelen

Speeksel-cortisol

Individuen leverden vijf speeksel-stalen af voor cortisol-bepaling. In het verloop van één dag werden stalen afgenomen onmiddellijk na het eerste ontwaken en 45 minuten daarna. Cortisol-waarden bij ontwaken werden gemeten omdat werd aangetoond dat de bepaling onder verschillende omstandigheden kan gebeuren, de afname niet-invasief is en makkelijk in gebruik is. Tevens heeft het gebruik van orale contraceptiva, roken, moment van ontwaken en slaap-duur geen sterke impact op de concentraties vrij cortisol na ontwaken, wat suggereert dat dit een bijzonder robuste meting van vrij cortisol in het speeksel kan zijn. Daarnaast werd speeksel-cortisol bepaald om 9:00., 16:00 en 21:00. Deze afname op vaste tijden werd aangewend om de mogelijkheid te voorzien morgen, namiddag en avond cortisol-waarden in speeksel te bepalen en vergelijken. […]

De kit voor speeksel-afname bestond uit watten-staafjes in kleine plastiek tubes […]. Er werd de patiënten aangeleerd hoe de speeksel-stalen correct af te nemen. Er werd hen eerst getoond hoe ze het watten-staafje in hun mond morsten plaatsen en dan 30-45 seconden voorzichtig te kauwen. Er werd de deelnemers uitgelegd het bevochtigde watten-staafje te deponeren in zijn plastiek tube en de tube in de container te plaatsen. De container nam de exacte tijd op dat ze de tube er in plaatsten. De stalen werden verstuurd naar het ‘E.M. Papper Clinical Immunology Laboratory’ van de ‘University of Miami’ voor laboratorium-analyse […]. Alle deelnemers leverden vier of vijf speeksel-stalen af […]. Omdat het doel van de studie was om natuurlijk voorkomende baseline-waarden van cortisol aan het licht te brengen, werd de individuen onderricht stalen af te nemen op een ‘typische’ dag of op een dag waarop ze geen ongewone stress ervaarden of waarop er geen verandering in hun routine optrad. Twee deelnemers […] vervolledigden hun staalname op een andere dag en deze tweede staalname werd hier gebruikt. […]

Totaal gemiddeld cortisol

Het gemiddelde van de cortisol-waarden over het verloop van de dag werd berekend. […]

Cortisol-curve

Een ruwe curve [regressie-lijn] werd geconstrueerd door de gegevens per individu te verbinden. Dit gaf een aanwijzing van hoe cortisol-waarden veranderden met het verloop van een dag. Een hogere waarde [van de regressie-factor] – een positieve curve – wees op stijgende waarden (laagst ‘s morgens). Een negatieve waarden – een negatieve curve – wees er op dat de cortisol over het algemeen daalde. Ideaal wordt verwacht dat cortisol-waarden bij gezonde populaties een negatieve curve vertonen omdat cortisol-waarden het hoogst zijn ’s morgens en het laagst ‘s avonds. Een afgeplatte curve suggereert abnormale produktie; cortisol-waarden bij een afgeplatte curve [regressie-factor bij benadering 0] wijst op relatief weinig verandering gedurende de dag.

Klinische klassificatie

De cortisol-waarden van elk individu werden beoordeeld door een arts die het cortisol-patroon onderzocht en bepaalde of dit ‘patroon’ (klinisch) normaal of abnormaal was. Deze had een grote privé-praktijk met CVS-individuals en was niet op de hoogte van de identiteit van een deelnemer. Cortisol-patronen werden beoordeeld op variatie van het verwachtte piek-patroon, samen met de algemene curve, in vergelijking met verwachtte patronen van diurnale variatie. Dagelijkse cortisol-patronen of resultaten die uiteenlopende piek-tijden, dalingen van de cortisol-waarde gevolgd door plotse stijgingen of algemene vermindering van patroon vertoonden, werden als ‘abnormaal’ geklassificeerd. Patronen die overeenkwamen met het verwachtte diurnaal patroon werden als ‘normaal’ geklassificeerd. Deze manier van klassificatie voor diurnale cortisol-patronen werd reeds bij andere research-studies en in een klinische setting gebruikt. Deze klassificatie gebeurde om te bepalen of klinische beoordelingen ‘normaal’ of ‘abnormaal’ voor een set dagelijkse cortisol-resultaten op een betekenisvolle manier patiënten differentiëren.

Resultaten

Preliminaire analyses

De klinische klassificatie-methode toonde dat 51 deelnemers (47,2%) gerangschikt werd met een abnormaal dagelijks baseline cortisol-patroon. 57 (52,8%) deelnemers werden als normaal geklassificeerd. De resultaten van twee individuen werden niet in de analyses opgenomen omwille van verhoogde cortisol-waarden (hoger dan 5 µg/ml), zodat al hun cortisol-waarden extremen bleken. Potentieel verwarrende variabelen werden onderzocht om te bepalen of ze de resultaten van de cortisol uitkomst-metingen (totaal gemiddeld cortisol, cortisol-curve en klinische groep) zouden kunnen voorspellen. Kirschbaum et al. (1999) merkte op dat speeksel-cortisol resultaten beïnvloed kunnen worden door orale contraceptiva of hormoon-vervanging therapie, gebruik van antidepressiva, roken en de demografische variabelen (leeftijd en geslacht). Een serie afzonderlijke statistische testen werd uitgevoerd om het verband te onderzoeken tussen de speeksel-cortisol variabelen (curve, gemiddelde) en de onafhankelijke variabelen: geslacht, medicatie-gebruik, gebruik van antidepressiva, gebruik van hormonale behandelingen of schildklier-medicatie, en huidige rook-status. […]

Uit deze analyses bleek dat geslacht een significante voorspeller is voor gemiddelde cortisol-waarden (p=.01). […] Daarnaast bleek het gebruik van antidepressiva significant gerelateerd met de cortisol-curve (p<.01) en de klinische variabele (p<.01). Daarom werden deze twee opgenomen als co-variabelen bij alle analyses […]. Leeftijd, hormonale behandeling/medicatie en roken waren niet geassocieerd met eender welke cortisol uitkomst-meting.

Hoofd-analyses

[…] Het significantie-niveau werd vastgesteld op p < .01.

Vermoeidheid

De associatie tussen elk van de cortisol-metingen en de ‘Fatigue Severity Scale’ van Krupp, en zelf-gerapporteerde vermoeidheid-graad (0-100) werd onderzocht. […] De variabele klinische groep was significant gerelateerd met zelf-gerapporteerde vermoeidheid-graad (p<.01). Die deelnemers die als ‘abnormaal’ werden beoordeeld qua dagelijks cortisol-patroon rapporteerden zelf hogere gemiddelde waarden voor vermoeidheid vergeleken met individuen met normale cortisol-waarden.

Pijn

Een reeks analyses onderzocht de verbanden tussen scores voor pijn-ernst en pijn-interferentie (gemeten met de BPI en de cortisol-variabelen. […] Er werd statistische significantie gevonden voor de associatie tussen scores voor pijn-ernst en de curve-variabele (p<.01) […]. Daarnaast werden ook statistisch significante resultaten gevonden voor het behoren tot een klinische groep (p<.01) […]. Individuen met meer positieve scores, suggestief voor een atypisch patroon qua cortisol-verandering gedurende de dag, bleken frequenter ernstige pijn te rapporteren. Daarnaast meldden individuen die als abnormaal werden geklassificeerd na klinische beoordeling, significant meer ernstige pijn. De associatie tussen pijn-interferentie en de curve benaderde maar bereikte geen statistische significantie (p=.04).

De graad van zelf-gerapporteerde pijnlijke keel, spier-pijn, gewricht-pijn, hoofdpijn en pijn in de lymfeklieren werden ook onderzocht om vast te stellen of er een verband bestond tussen baseline speeksel-cortisol en zelf-gerapporteerde variabelen voor pijn op een schaal van 0-100. […] Geen enkele van pijn-symptomen was significant geassocieerd met de cortisol-metingen.

Slaap

De relaties tussen slaap-moeilijkheden en de cortisol-metingen werden bekeken. De PSQI totale score en zelf-gerapporteerde niet-verfrissende slaap (schaal van 0 tot 100) werden uitgezet t.o.v. […] de cortisol-curve of cortisol-gemiddelden […]. Geen enkele van deze analyses was statistisch significant.

Neurocognitieve funktie

Het verband tussen cortisol uitkomst-variabelen en de neurocognitieve funktie werd onderzocht. Uitkomsten […] werden vergeleken met de cortisol-curve of cortisol-gemiddelde […]. Voor deze analyses was er geen enkele statistische significantie […].

Psychiatrische toestand

Ten slotte werd de associatie tussen cortisol-waarden in speeksel en psychiatrische status bekeken. […] Bij alle analyses waren er geen statistisch significante verbanden […].

Bespreking

Deze studie vergeleek de associaties tussen een reeks CVS-symptomen en psychiatrisch funktioneren, en dagelijkse cortisol-waarden in het speeksel (metingen van dagelijkse gemiddelde waarden, cortisol-curve of verandering qua cortisol-waarden met het verloop van de dag, en een klassificatie abnormaal/normaal van het globale dagelijks patroon van cortisol-waarden van een  individu). Resultaten van deze studie suggereren dat er meerdere mogelijke associaties waren tussen dagelijkse cortisol-produktie, vermoeidheid en pijn.

Ten eerste werd een verband gevonden tussen ernst-scores voor zelf-gerapporteerde vermoeidheid en of een individu een abnormal of normaal cortisol-patroon had. Dysfunktie van de HPA-as werd door enkelen gesuggereerd aan de basis te liggen voor de symptomen van CVS, inclusief vermoeidheid maar tot op heden bevat de CVS-literatuur tegenstrijdige opinies betreffende de kwestie of de ernst van de vermoeidheid gelinkt is met wijzigingen van cortisol-waarden; sommige researchers rapporteren negatieve bevindingen [Gaab et al. 2004; Rubin, Hotopf, Papadopoulos & Cleare 2005; ter Wolbeek, van Doornen, Coffeng, Kavelaars & Heijnen 2007 * referenties beschikbaar voor geïnteresseerden]. Verschillen qua resultaten zouden echter te wijten kunnen zijn aan variabiliteit in de manieren waarop cortisol werd gemeten. Bij de studie van ter Wolbeek et al. bv. werd geen associatie gevonden tussen cortisol-waarden en vermoeidheid-graad bij adolescente vrouwen met chronische vermoeidheid. Bij de studie van Gaab et al. was vermoeidheid-graad gecorreleerd met ACTH maar het verband bleek niet statistisch significant. Bij het onderzoek van Rubin et al. werd cortisol niet als een voorspeller voor post-operatieve vermoeidheid bevonden. In tegenstelling daarmee was bij onze studie, waarbij baseline cortisol werd gemeten op drie verschillende manieren bij volwassenen, enkel het behoren tot de klinische klassificatie-groep geassocieerd met vermoeidheid-graad.

Resultaten van het huidig onderzoek suggereren dat het bekijken van de algemene dagelijkse patronen en of cortisol-waarden binnen of buiten verwachte grenzen vallen, wellicht zeer belangrijk zijn, waarbij enkel de individuen die de meest atypische patronen vertonen meer vermoeidheid ervaren. Lage cortisol-waarden of atypische of ‘afgeplatte’ curves bleken geassocieerd met vermoeidheid bij andere ziekte-groepen, zoals bij vitale uitputting and personen die borst-kanker overleefden, maar niet bij FM. Meer onderzoek zou zich moeten focussen op de associatie tussen vermoeidheid-graad en de dagelijkse cortisol-patronen bij CVS om deze mogelijke link verder te exploreren.

Ten tweede werd een verband gevonden tussen ernst van de pijn, gemeten via de BPI, en behoren tot cortisol-groep (normaal vs. abnormaal) én cortisol-curve. De curve-variabele mat de verandering qua cortisol over het verloop van een dag, en individuen met positieve (een stijging van de cortisol-produktie gedurende de dag) óf meer afgeplatte patronen (d.w.z. weinig verandering qua cortisol met het verloop van de dag), rapporteerden ernsitger pijn dan individuen met een negatieve curve qua dagelijks cortisol (hoogste waarden ‘s morgens, laagste ‘s avonds). Allebei deze patronen (positieve en afgeplatte curves) zijn atypisch en kunnen wijzen op een dysfunktie van de HPA-as. Deze resultaten zijn consistent met resultaten die werden gevonden bij mensen met FM. Gezien de overlapping van symptomen en de hoge co-morbiditeit van symptomen bij CVS en FM, is het mogelijk dat een gelijkaardige associatie tussen gewijzigde cortisol-funktie en pijn-ernst kan bestaand bij deze overlappende, maar toch afzonderlijke, syndromen.

In tegenstelling tot onze hypothese bleken cortisol-gemiddelde, cortisol-curve en abnormale cortisol-waarden niet gerelateerd met neurocognitieve symptomen, psychiatrische toestand of slaap-moeilijkheden. Wat betreft neurocognitieve waarden: hoewel enkele analyses significantie benaderden, waren er geen statistisch significante associaties tussen cognitieve funktie, gemeten d.m.v. een korte cognitieve test-batterij, en baseline cortisol-waarden in het speeksel. Deze niet-significante bevindingen contrasteren met die van een groep die verbanden vonden tussen cortisol en geheugen bij een groep FM-patiënten. De verschillen tussen de twee studies zouden echter te wijten kunnen zijn aan het feit dat het huidig onderzoek CVS betrof, overlappend met FM maar toch afzonderlijke patiënten-groepen. De huidige studie mat ook geen speeksel cortisol-waarden op dezelfde dag als waarop de neurocognitieve metingen werden afgenomen en het is mogelijk dat onderzoek naar de verbanden tussen cortisol-waarden en neurocognitieve funktie op gelijktijdige tijdstippen associaties kunnen opleveren die per dag of per uur kunnen optreden. Het is echter ook mogelijk dat cortisol-waarden in het speeksel en algemene neurocognitieve werking niet direct zijn verbonden bij CVS.

Daarenboven waren cortisol-waarden niet geassocieerd met de psychiatrische status – gemeten via een anamnese óf huidige diagnose van een depressieve aandoening of PTSD, of met huidige depressie en angst. CVS komt frequent samen voor met depressie. Een eerdere of huidige depressieve aandoening bleek echter niet geassocieerd met wijzigingen qua baseline cortisol. Een reden voor het ontbreken van een verband zou kunnen zijn dat het type depressie voorkomend bij CVS verschillend is van individuen met een primaire depressieve aandoening, zoals melancholische depressie. Bijvoorbeeld: CVS-patiënten bleken minder de zelf-verwijt items van de BDI te onderschrijven en meer items te onderschrijven die wijzen naar somatische depressie-klachten (d.i. slapeloosheid, etenslust-/gewicht-wijziging) die worden verward met de symptomen van CVS. Er was ook geen verschil qua cortisol-waarden bij individuen met een geschiedenis van huidige of eerdere PTSD. Gezien het feit echter dat CVS én PTSD geassocieerd zijn met lage cortisol-waarden en hypo-funktie van de HPA-as, is het mogelijk dat verdere verergeringen of veranderingen qua hypercortisolisme niet bleken als iemand CVS én een geschiedenis van PTSD had, vergeleken met enkel CVS.

Tenslotte waren er geen statistisch significante verbanden tussen slaap-moeilijkheden en cortisol-waarden bij CVS. Deze bevinding was onverwacht, gezien de ernstig verstoorde slaap-patronen die sommigen met CVS melden. Deze individuen rapporteren frequent heel wat variabiliteit betreffende hun ontwaak-tijden en er zou kunnen worden verwacht dat dit het diurnaal patroon van de cortisol-secretie zou kunnen wijzigen. Bij het bekijken van de algemene produktie (gemiddeld), wijziging met het verloop van de dag (curve) en de globale normaliteit van het patroon van speeksel-cortisol (beoordeeld door een studie-arts), werd echter geen associatie gevonden. Buckley and Schatzberg (2005) suggereren dat nachtelijke ontwakingen gelinkt kunnen zijn met verhoogde pulsatiele cortisol-waarden maar dat nachtelijke ontwakingen geen impact zouden kunnen hebben op cortisol-waarden bij het wakker worden. Daarnaast is het mogelijk dat het meten van veranderingen qua cortisol-waarden gedurende de dag, de nachtelijke waarden – die mogelijks meer aangetast zijn door slaap-vertoringen – niet zou kunnen omvatten. Daarenboven werd in deze studie enkel de algemene slaap-kwaliteit gemeten en cortisol-produktie zou kunnen geassocieerd zijn met specifieke aspekten van slaap-dysfunktie, zoals de duur van de ‘slow-wave’ slaap.

Mogelijke beperkingen van deze studie omvatten het feit dat enkel baseline cortisol gedurende 1 dag werd gemeten en er mogelijks inter-individu variabiliteit is geweest die niet werd gemeten omwille van de deze staalname-methodologie. Bij het meten van variabiliteit tussen individuen werd echter gevonden dat de consistentie van resultaten van verschillende staalname-protocollen voor de meting van cortisol in speeksel varieerde van 1 dag tot 24 dagen. Het is dus te verwachten dat het gebruik van inter-individu vergelijkingen bij de huidige onderzoeken over het verloop van 1 dag geschikt is. Cleare (2003) noteerde dat het onderzoeken van de aktivatie van de HPA-as na blootstelling aan stress belangrijke informatie kan opleveren betreffende de HPA-funktie bij CVS; HPA-as reaktiviteit na stress kon echter niet worden afgeleid uit de huidige studie omdat enkel baseline cortisol-metingen werden gebruikt.

Een andere beperking was dat de metingen van cortisol in het speeksel en ander metingen niet op dezelfde dag gebeurden en soms was er een periode van dagen of weken tussen cortisol-staalname en het afwerken van andere metingen. Zodoende kon geen directe samenhang in de tijd tussen speeksel cortisol en andere fysiologische variabelen, zoals neurocognitieve funktie, niet kon worden gemeten en er kon geen richting voor oorzakelijkheid worden vastgesteld. […] De analyses voorgesteld in dit onderzoek zouden echter moeten worden beschouwd als verklarend en herhaling van deze resultaten bij andere stalen van mensen met CVS zou ondersteuning kunnen bieden voor de the validiteit van deze bevindingen.

Samengevat: baseline waarden van speeksel-cortisol bleken geassocieerd te zijn met ziekte-parameters bij CVS, inclusief vermoeidheid-graad en pijn. Deze bevindingen zijn bijzonder belangrijk gezien het feit dat vermoeidheid en pijn twee kenmerkende symptomen van CVS zijn. Deze bevindingen zijn consistent met de hypothese dat hypocortisolisme aan de basis kan liggen van enkele van de frequent gerapporteerde aspekten van CVS. Toekomstige research zou moeten focussen op het afbakenen van de connecties tussen de waarden beschikbaar cortisol en mogelijke effekten op neurologische en immunologische systemen. Daarnaast moet aandacht worden geschonken aan die individuen die diurnale ontregeling van cortisol vertonen omdat deze individuen degenen kunnen zijn die meest waarschijnlijk significante CVS-symptomen van vermoeidheid en pijn ervaren.

In het ‘IACFS/ME Bulletin’, Vol 16: 3 van 2008 (www.iacfsme.org) vonden we van dezelfde groep een artikel getiteld ‘Evidence for T-helper 2 Shift and Association with Illness Parameters in Chronic Fatigue Syndrome (CFS)’ – waarom dit niet werd publiceerd in een wetenschappelijk tijdschrift is onduidelijk… Hier toch de samenvatting:

Er werden weinig immunologische merkers consistent gerapporteerd bij CVS. Er is echter de hypothese voor een verschuiving naar T-helper 2 (Th2) type immuun-respons bij individuen met CVS. De huidige studie onderzocht of individuen met CVS die een sterkere verschuiving naar een Th2 type immuun-respons vertoonden, ook ernstiger symptomen, slechtere neurocognitieve, fysieke en psychosociale funktie zouden hebben. We maten het percentage Th1-achtige en Th2-achtige geheugen-cellen d.m.v. cel-oppervlakte flow-cytometrie bij 114 individuen met CVS. De associaties tussen de verhouding Th1/Th2 geheugen-cellen en verscheidene ziekte-parameters, inclusief symptoom-ernst, psychiatrische funktioneren, neurocognitieve funktie, cortisol-waarden in speeksel en chronische pijn, werden dan onderzocht. De resultaten wezen er op dat individuen die een sterkere verschuiving naar een Th2 immuun-respons vertoonde, ook een slechtere slaap en hogere basale cortisol-waarden in het speeksel hadden.

Niettegenstaande de meest frequent gerapporteerde endocriene abnormaliteit bij CVS verlaagde cortisol-produktie is; blijkt hier dat een hogere, níet lagere, cortisol-output verbonden is met immune veranderingen. Dit wijst nogmaals op de heterogeniteit van de CVS-diagnose.

Blog op WordPress.com.