M.E.(cvs)-wetenschap

juli 9, 2021

Gewijzigde, met endotheliale dysfunktie gerelateerde miRs in plasma bij M/E.(cvs)

We gaven hier al aandacht aan de kwestie van endotheliale dysfunktie bij M.E.(cvs). Zie: ‘Endotheliale dysfunktie in bloedvaten bij CVS’, ‘Perifere endotheliale dysfunktie bij M.E.(cvs)’ & ‘Hypothese: Pathofysiologie van skeletspier-stoornissen bij M.E.(cvs)’. Het endothelium, een laag cellen (ECs) die de bloedvaten omgeven en de bloeddoorstroming kunnen wijzigen (vaatverwijding, vasodilatatie of vaatvernauwing, vasoconstrictie), is van essentieel belang voor het behoud van de vasculaire tonus, het neemt deel aan de regulering van de bloeddoorstroming in respons op verandering qua perfusie-behoeften in weefsels en organen. Als de bloeddoorstroming in een bloedvat verhoogt, zet het uit; dit fenomeen wordt ‘flow-mediated dilatation’ (FMD) genoemd.

Een goede regulering van de vasculaire tonus zorgt voor adequate toevoer van voedingstoffen en zuurstof naar de weefsels. Verstoring van de endotheliale funktie zou dus kunnen gepaard gaan met de symptomen van M.E.(cvs), zoals vermoeidheid en post-exertionele malaise.

De cellulaire mechanismen die de endotheliale funktie moduleren berusten op de aanmaak van stikstof-oxide (NO), een gas dat wordt afgegeven door het endothelium. NO helpt dus bij het regelen van de bloed- en zuurstof-voorziening. De endotheliale cellen reguleren ook het immuunsysteem, en endotheliale dysfunktie (ED) is ook verbonden met inflammatie en oxidatieve stress (die ook kan worden veroorzaakt door ontoereikende NO-produktie). Dit zou allemaal kunnen meespelen bij de ingewikkelde pathofysiologie van M.E.(cvs).

De ‘M.E. Association’ benadrukt dat de resultaten van deze en toekomstige gelijkaardige studies kan helpen bij het vinden van biomerkers voor de diagnose van M.E.(cvs). Het werk waarover hieronder wordt gerapporteerd, gebruikte stalen van de ‘UK ME/CFS Biobank’ (UKMEB; ondersteund door ‘ME Research UK’).

De onderzoekers maakten gebruik van een vijftal microRNAs (kleine niet-coderende RNAs met een belangrijke funktie bij de regulering van gen-expressie) die gerelateerd zijn met endotheliale dysfunktie (ED), waarvan is geweten dat ze de aanmaak van NO in endotheliale cellen doen dalen. De waarden ervan waren allemaal verhoogd in vergelijking met die van gezonde controles. Deze zouden dus kunnen worden aangewend als merkers om te helpen bij de evaluatie van de ziekte en om de endotheliale funktie beter te beoordelen.

De resultaten zijn significant aangezien wordt aangetoond dat deze microRNAs worden gevonden bij ca. 60% van individuen met M.E.(cvs) en ze komen overéén met de eerdere meldingen dat ED wordt vastgesteld bij 40 à 50% (vastgesteld via andere methodes: FMD-meting – verwijding van de arm-slagader na een periode van verminderde bloedvoorziening wordt via ultrasound gemeten, en/of ‘peripheral arterial tonometry’, EndoPAT = niet invasieve techniek om de perifere arteriële tonus te meten – detektie van drukveranderingen in de vingertoppen veroorzaakt door de arteriële puls).

Er wordt nu gefocust op het bevestigen van de resultaten bij een grotere groep (en nieuwe patiënten) en door te bekijken of de cellulaire/metabole mechanismen die de NO-produktie controleren gewijzigd zijn bij M.E.(cvs). Er zal ook worden nagegaan of blootstelling van endotheliale cellen aan plasma van mensen met M.E.(cvs) verstoorde NO-produktie gaan vertonen; met de bedoeling de impact van endotheliale dyfunktie bij M.E.(cvs) na te gaan op cellulair niveau. Er dient ook te worden onderzocht of virale infekties een rol spelen bij de (verstoorde) aanmaak van NO…

————————-

Scientific Reports Vol 11, #1, artikel 10604 (mei 2021)

Altered endothelial dysfunction-related miRs in plasma from ME/CFS patients

J Blauensteiner (1), R Bertinat (2), LE Leon (3), M Riederer (1), N Sepulveda (4,5,6), F Westermeier (7,8)

1 Institute of Biomedical Science, Department of Health Studies, FH Joanneum University of Applied Sciences, Graz, Austria

2 Centro de Microscopia Avanzada, CMA-BIO BIO, Facultad de Ciencias Biologica, Universidad de Concepcion, Concepcion, Chile

3 Instituto de Ciencias Biomedicas, Facultad de Ciencias de La Salud, Universidad Autonoma de Chile, Santiago, Chile

4 Department of Infection Biology, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, UK

5 Centro de Estatistica e Aplicacoes, Universidade de Lisboa, Lisbon, Portugal

6 Institute of Medical Immunology, Charité-Universitatsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universität (FU) Berlin, Humboldt-Universität Zu Berlin and Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Germany

7 Institute of Biomedical Science, Department of Health Studies, FH Joanneum University of Applied Sciences, Graz, Austria

8 Centro Integrativo de Biologia y Quimica Aplicada (CIBQA), Universidad Bernardo O’Higgins, Santiago, Chile

Samenvatting

Myalgische Encefalomyelitis/ Chronische Vermoeidheid Syndroom (M.E./CVS) is een complexe ziekte die wordt gekenmerkt door onverklaarde invaliderende vermoeidheid. Hoewel de etiologie onbekend is, is er bewijsmateriaal dat de immunologische abnormaliteiten (persistente inflammatie en immuncel-aktivatie bij een subgroep patiënten) ondersteunt. Aangezien de interaktie tussen inflammatie en vasculaire veranderingen goed bekend is bij andere ziekten, is endotheliale dysfunktie naar voor gekomen als een bijkomende factor bij de pathogenese van M.E./CVS. Endotheliaal stikstof-oxide-synthase (eNOS) genereert stikstof-oxide (NO) dat de endotheliale homeostase onderhoudt. eNOS wordt geaktiveerd door ‘silent information regulator 1’ (Sirt1), een anti-inflammatoir proteïne. Ondanks het belang er van, zijn er nog geen studies aangaande de Sirt1/eNOS-as bij M.E./CVS. De interesse voor circulerende microRNAs (miRs) als potentiële biomerkers voor M.E./CVS is toegenomen. Dienoveréénkomstig analyseren we een set miRs waarvan werd gerapporteerd dat ze de Sirt1/eNOS moduleren in plasma van M.E./CVS-patiënten. Onze resultaten tonen dat miR-21, miR-34a, miR-92a, miR-126 & miR-200c gezamenlijk zijn toegenomen bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. gezonde controles. Er werd een gelijkaardige bevinding verkregen bij analyse van publieke miR-gegevens van perifeer bloed mononucleaire cellen. Bio-informatica analyse toont dat signalisering-mechanismen gerelateerd met endotheliale funktie (inclusief oxidatieve stress & zuurstof-regulering) geassocieerd zijn met deze miRs. Interessant: histoon-deacetylase-1, een proteïne verantwoordelijk voor epigenetische regulering, vertegenwoordigde het meest relevante knooppunt binnen het netwerk. Tot besluit: onze studie levert een basis om biomerkers gerelateerd met endotheliale dysfunktie te vinden en nieuwe doelwitten bij M.E./CVS te verkennen.

Inleiding

[…]

Ondanks het feit dat het pathofysiologisch mechanisme nog onduidelijk is, wordt steeds meer bewijs gevonden dat M.E./CVS verbindt met immunologische abnormaliteiten en inflammatie bij een subgroep M.E./CVS-patiënten. Endotheliale cellen (ECs) zijn aktief betrokken bij de regulering van het immuunsysteem en endotheliale dysfunktie (ED) is gelinkt met inflammatie en oxidatieve stress. Door het afgeven van stikstof-oxide (NO), zorgen ECs voor de regulering van de vasculaire tonus om de weefsels adequaat van bloed en zuurstof te voorzien. Andersom is een inadequate NO-produktie een belangrijke oorzaak van ED. Twee studies hebben ED gerapporteerd ‘in vivo’ bij M.E./CVS-patiënten [Scherbakov N et al. Peripheral endothelial dysfunction in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. ESC Hear. Fail. (2020) 7: 1064-1071 /// Sorland K et al. Reduced endothelial function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – results from open-label cyclophosphamide intervention study. Front. Med. (2021) 8: 294], wat eerder bewijs voor vasculaire abnormaliteiten ondersteunt [Newton DJ, Kennedy G et al. Large and small artery endothelial dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome. Int J Cardiol. (2012) 154: 335-336] en de veronderstelling versterkt dat ED een bijkomend stukje van deze complexe pathofysiologische puzzel is.

In gezonde bloedvaten wordt NO gegenereerd uit L-arginine door de endotheliale isoform [verschillende vorm van een proteïne/enzyme] van stikstof-oxide synthase (eNOS), in respons op meerdere stimuli, inclusief schuif-stress tijdens inspanning. Overéénkomstig daarmee wordt via eNOS geproduceerd NO beschouwd als een cruciale speler bij cardiovasculaire homeostase. Interessant: ‘silent information regulator 1’ (Sirt1) reduceert inflammatie en oxidatieve stress, en verhoogt de aanmaak van NO via het aktiveren van eNOS in ECs. Ondanks het biologisch belang van de Sirt1/eNOS-as bij zowel endotheliale als immuun-homeostase, zijn er geen studies die de potentiële veranderingen bij M.E./CVS adresseren.

De algemene rol van microRNAs (miRs) bij het behoud van de endotheliale funktie heeft significante aandacht gekregen. miRs zijn kleine niet-coderende RNAs die gewijzigd zijn bij veel ziekten en, bijgevolg, worden voorgesteld als geschikte biomerkers omwille van hun potentieel ziekten te voorspellen of te monitoren. Bij deze gedachtelijn werden meerdere miRs-profielen gerapporteerd [Brenu EW et al. High-throughput sequencing of plasma micro-RNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. PLoS One (2014) 9: e102783 /// Nepotchatykh E et al. Profile of circulating microRNAs in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome and their relation to symptom severity, and disease pathophysiology. Sci. Rep. (2020) 10: 19620], in plasma, extracellulaire vesikels [Almenar-Perez E et al. Assessing diagnostic value of microRNAs from peripheral blood mononuclear cells and extracellular vesicles in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Sci. Rep. (2020) 10: 2064] en perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) [Cheema AK et al. Unravelling Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): Gender-specific changes in the microRNA expression profiling in ME/CFS. J. Cell. Mol. Med. (2020) 24: 5865-5877 /// Petty RD et al. MicroRNAs hsa-miR-99b, hsa-miR-330, hsa-miR-126 and hsa-miR-30c: Potential diagnostic biomarkers in natural killer (NK) cells of patients with Chronic Fatigue Syndrome (CFS)/ Myalgic Encephalomyelitis (ME). PLoS One (2016) 11: e0150904] van M.E./CVS-patiënten. Er zijn echter geen studies die focussen op het identificeren van met endotheliale dysfunktie gerelateerde miRs en ev. wijzigingen bij M.E./CVS.

In dit werk selekteerden we een set van vijf miRs (miR-21, miR-34a, miR-92a, miR-126 & miR-200c) waarvan eerder werd gerapporteerd dat ze de endotheliale funktie reguleren via de Sirt1/eNOS-as in ECs en observationele klinische studies. We evalueerden hun expressie d.m.v. ‘real-time’ PCR in plasma van patiënten met milde/matige (mm) en ernstige (sa) M.E./CVS vergeleken met gezonde controles (HC), met in acht neming van meerdere statistische aanpassingen. Om onze bevindingen verder te ondersteunen, analyseerden we ook hun expressie gebruikmakend van beschikbare micro-chip gegevens (PBMCs van M.E./CVS-patiënten) [zie Petty RD et al. hierboven]. Ten slotte integreerden we onze experimentele bevindingen d.m.v. het uitvoeren van bio-informatica analyses om biologische processen en potentiële doelwitten gelinkt met de Sirt1/eNOS-gerelateerde miRs bij M.E./CVS te voorspellen.

Methodes

Stalen en klinische gegevens

[…] Stalen van de UK ME/CFS Biobank (UKMEB) […] Plasma-stalen van mild/matig aangetaste (n = 28) en ernstig aangetaste (n = 30) M.E./CVS-patiënten, en voor leeftijd gematchte gezonde individuen (n = 29) […]. […] Deelnemers: 19-58 jaar. M.E./CVS-diagnose: Canadese Consensus en/of CDC-1994 (Fukuda) criteria […].

Exclusion-criteria: […].

Islatie van totaall RNA. […]

cDNA-synthese & ‘real‑time( PCR. […]

Statistische analyse van de UKMEB gegevens (plasma). […]

Analyse van micro-chip gegevens (PBMCs). […]

Statistische software. […]

Integratieve network-analyse. […]

Resultaten

Karakteristieken van de studie-deelnemers

De uiteindelijke voor leeftijd gematchte groep omvatte 58 patiënten met M.E./CVS, opgedeeld in mild/matig ziek (M.E./CVSmm: n = 28, 71% vrouwen) en ernstig aangetasten affected (M.E./CVSsa: n = 30, 80% vrouwen). Er waren 29 gezonde controles (HCs) (41% vrouwen). De scores voor vermoeidheid-ernst lagen hoger voor zowel M.E./CVSmm als M.E./CVSsa t.o.v. HCs (p < 0.0001). Klinische beoordelingen met betrekking tot pijn en vermoeidheid waren hoger bij M.E./CVS-patiënten vergeleken HCs, met hogere scores voor M.E./CVSsa in vergelijking met M.E./CVSmm (p < 0.0001). […] Bloed-testen toonden een verhoogd aantal bloedplaatjes (p = 0.0264), basofiele witte bloedcellen (p = 0.0359), hogere erythrocyten-sedimentatie-snelheid (ESR) (p = 0.0110), en verminderd creatinine (p = 0.0045) en creatine-fosfokinase (CPK) (p < 0.0001) bij zowel M.E./CVSmm en M.E./CVSsa t.o.v. HCs. […]

Analyse van miR-expressie gegevens van plasma-stalen

We gebruikten plasma-stalen voor de analyse van de relatieve hoeveelheid van miRs waarvan werd gerapporteerd dat ze de Sirt1/eNOS-as moduleren. We detekteerden dat miR-21, miR-34a, miR-92a, miR-126 & miR-200 allemaal verhoogd waren bij beide M.E./CVS-groepen vergeleken met HCs, en dat deze miRs sterk en positief met elkaar correleerden ongeacht de studiegroep. […] Interessant: de ‘principal component’ analyse [wiskundige procedure om een set observaties van mogelijks gecorreleerde variabelen om te zetten naar een set waarden van niet-gecorreleerde variabelen, genaamd ‘principal components’ (belangrijkste componenten) – hier: om de gelijkenis van de studie-deelnemers te beoordelen in termen van de variabelen] toonde dat sommige M.E./CVS-patiënten duidelijk verschilden van HCs wat betreft de hoeveelheden van deze miRs maar dit lijkt niet gerelateerd met ziekte-ernst. […] ‘linear discriminant’ analyse [doel: de beste lineaire combinatie van een reeks variabelen vinden die groepen zou kunnen onderscheiden] suggereerde dat de miR-gegevens 60,8% (n = 31) van de patiënten correct konden klassificeren met minstens 80% probabiliteit. In tegenstelling daarmee kon slechts 30,4% (n = 7) van de HCs als dusdanig geklassificeerd worden met dezelfde minimum waarschijnlijkheid. Wanneer ‘linear discriminant’ analyse werd aangewend om het onderscheid te maken tussen M.E./CVSsa- & M.E./CVSmm-patiënten, lagen de corresponderende klassificatie-probabiliteiten in de buurt van 50% voor individuen van elke ziekte-groep. Tot besluit: miR-expressie gegevens kunnen een ondersteunende biomerker betekenen om M.E./CVS-patiënten en HCs te onderscheiden maar kunnen ziekte-ernst niet voorspellen.

Er werden correlatie-coefficiënten gebruikt ter beoordeling van een link tussen de verhoogde Sirt1/eNOS-gerelateerde miRs en elke klinische parameter, om nieuwe verbanden vast te stellen die zouden kunnen helpen om patiënten en controles beter te onderscheiden. Bij HCs neigt de correlatie-coëfficient met betrekking tot ESR positief te zijn voor miR-34, miR-92a & miR-200c. Diastolische bloeddruk neigt positief gecorreleerd te zijn met miR-34 & miR-92a. Het aantal witte bloedcellen en neutrofielen neigt positief gecorreleerd te zijn met miR-34a. De correlatie-schattingen geassocieerd met M.E./CVS-patiënten en alle deelnemers (HCs & M.E./CVS-patiënten) neigt rond nul te liggen voor alle miRs en klinische parameters, suggestief voor het feit dat de heterogeniteit van M.E./CVS-patiënten sterkere verbanden gerelateerd met de geanalyseerde co-variabelen kan maskeren. De associatie-analyse – vergelijking tussen de groepen na aanpassing voor leeftijd/geslacht, BMI of leeftijd/geslacht/BMI – toont dat alle associaties statistisch significant zijn ongeacht hun aanpassing voor mogelijk storende factoren, wat de noodzaak benadrukt om deze analyses te overwegen om meer betrouwbare bevindingen te bekomen. […].

Analyse van micro-chip gegevens van PBMCs

Om bijkomend bewijs voor bovenstaande bevindingen te leveren, voerden we een her-analyse uit van eerder gepubliceerde micro-chip gegevens van 15 patiënten met M.E./CVS en 29 voor leeftijd en geslacht gematchte HCs [zie Petty RD et al. hierboven]. We vonden dat de vijf miRs verhoogd waren bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. HCs. Deze toename was statistisch significant voor miR-21, miR-34a, miR-92a & miR-126 na aanpassing voor ‘multiple testing’ en controleren voor mogelijke storende factoren (leeftijd en geslacht). Wat betreft miR200c: de gestegen expressie was ‘borderline’ statistisch significant (aangepaste p-waarde = 0.06). Tot besluit: de vijf miRs zijn verhoogd in zowel plasma (huidige gegevens) en PBMCs van verschillende studiegroepen, wat hun gewijzigde expressie bij M.E./CVS ondersteunt.

Bio-informatica analyse

Er werden bio-informatica analyses uitgevoerd om de doelwitten en biologische processen gelinkt met de miRs te tonen. Op basis van miR/mRNA-interaktie analyses zagen we 182 genen geassocieerd met miR-21 (n = 49), miR-34a (n = 61), miR-92a (n = 17), miR-126 (n = 33) & miR-200c (n = 38) ; wat aangeeft dat ze eventueel gereguleerd worden door meer dan één miR. Na integratie met proteïne/proteïne-interaktie gegevens zagen we een cluster van 135 proteïnen met experimenteel bewijs voor een fysieke interaktie. Er word zodoende voorspeld dat onze set van toegenomen miRs zich richten op sterk intergeconnecteerde proteïnen, suggestief voor een funktionele module. Interessant: histoon-deacetylase-1 (HDAC1) vertegenwoordigde het meest relevante knooppunt (op basis van centraliteit-metingen [aantal verbindingen op een knooppunt]). Nadien identificeerden we meerdere biologische processen geassocieerd met miR-21-5p, miR-34a-5p, miR-92a-3p, miR-126-3p & miR-200c-3p d.m.v. een experimenteel gevalideerde genen-lijst. Funktionele mechanisme aanrijking-analyses toonden dat 5 van de 20 meest over-gerepresenteerde biologische processen gelinkt zijn met regulering van de ontwikkeling van de vasculatuur, gevolgd door ontwikkeling van de reproductieve strukturen, respons op oxidatieve stress, ERK1/ERK2-cascade [centraal signalisering-mechanisme dat een brede waaier aan gestimuleerde cellulaire processen reguleert] en respons op zuurstof-waarden. Daarnaast werden nog 232 biologische processen via dezelfde analyse aangereikt. Globaal is de set miRs die voor onze studie werd geselekteerd hoofdzakelijk geassocieerd met endotheliale funktie via regulering van sterk intergeconnecteerde proteïnen, waarbij HDAC1 & Sirt1 als centrale spelers worden voorspeld.

Bespreking

Ondanks het feit dat M.E./CVS tientallen jaren wordt bestudeerd en dit significante vooruitgang opleverde, blijft de etiologie ongrijpbaar. De diagnose M.E./CVS wordt dan ook nog gesteld op basis van symptoom-gerelateerde criteria, wat ook leidt tot ofwel ongediagnostiseerde of verkeerd geklassificeerde gevallen omwille van de heterogeniteit van de symptomen. Bijgevolg is er geen objectieve diagnostische of therapeutische biomerker, en is de behandeling voornamelijk gefocust op het verlichten van de complexe symptomatologie. Daarom is er een dringende noodzaak om betrouwbare biomerkers te identificeren die een meer precieze diagnose en follow-up toelaten. Dus zijn strategieën om de reproduceerbaarheid van studies te verbeteren (zoals het gebruik van uniforme klinische en research-criteria), standardisatie van staalname tesamen met geschikte statistische analyse zeker cruciaal om deze uitdaging te overwinnen.

Wij gebruikten plasma-stalen van gezonde controles en voor leeftijd gematchte, matig en ernstig zieke M.E./CVS-patiënten, verkregen via het UKMEB. In overéénstemming met de stratificatie van groepen in deze studie waren alle klinische parameters gerelateerd met pijn en vermoeidheid hoger bij M.E./CVSsa dan M.E./CVSmm dan HCs. In direct tegensteling daarmee waren de parameters geassocieerd met spiermassa (spier-impedantie [wisselstroom-weerstand]) en spier-aktiviteit (creatinine & CPK) lager bij M.E./CVSsa dan M.E./CVSmm dan HCs, terwijl vetmassa een tegengesteld patroon bleek te vertonen, zoals wordt verwacht door de invaliderende aandoening en de mogelijkheid van een graduele opvulling van de ruimte van atrofisch spierweefsel door vet, zoals dat gebeurt bij andere myopathiën – wat echter de BMI niet wijzigt ondanks een tendens voor verlaagd lichaamsgewicht. Zoals in andere rapporten waren de bloeddruk en CRP niet verschillende binnen onze studie-populatie (overéénkomstig de immunologische heterogeniteit). Verder werd gevonden dat de niet-specifieke inflammatie-merker ESR gestegen was bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs, zoals werd gemeld voor een andere UKMEB-studiegroep [Cliff JM et al. Cellular Immune Function in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS). Front. Immunol. (2019) 10: 796].

Niettegenstaande de huidige kennis dat inflammatie ED bevordert bij verschillende ziekten, zijn er weinig studies die de endotheliale funktie hebben bekeken bij M.E./CVS-patiënten in vivo. Vanuit een klinisch perspectief rapporteerden Newton DJ et al. [zie hierboven] ED in grote en kleine arterieën van M.E./CVS-patiënten, gelinkt met verhoogd serum-CRP. Omgekeerd meldde een andere onderzoeksgroep noch significante verschillen qua CRP, noch endotheliale funktie tussen M.E./CVS-patiënten (die nog in staat zijn inspanningen te leveren) en sedentaire controles. Scherbakov N et al. [zie hierboven] evalueerden ook de endotheliale funktie en toonden dat ED geassocieerd is met ziekte-ernst en immune symptomen bij 51% van M.E./CVS-patiënten. Overéénkomstig deze bevindingen hebben Sorland K et al. [zie hierboven] gerapporteerd over ED bij 40% van M.E./CVS-patiënten. Interessant: onze resultaten tonen dat ca. 61% van de M.E./CVS-patiënten uit onze groep kan worden geklassificeerd als patiënten met minstens 80% kans op ED, op basis van de gestegen miRs waarvan werd gerapporteerd dat ze endotheliale funktie regeluren via de Sirt1/eNOS as. Hoewel deze bevindingen ook suggereren dat ED een kenmerk zou kunnen zijn dat wordt gezien bij een subgroep (ca. 40-60%) M.E./CVS-patiënten, zouden verdere studies – gericht op de evaluatie van zowel endotheliale funktie in vivo en deze set Sirt1/eNOS-gerelateerde miRs in plasma van dezelfde groep – van grote waarde kunnen zijn voor de ondersteuning van deze veronderstelling, en een meer sensitieve benadering kunnen bieden om ED vroeger te detekteren.

Het enzyme eNOS speelt een cruciale rol bij de endotheliale funktie: het is een belangrijke mediator van de vasodilatatie door de omzetting van L-arginine naar NO en L-citrulline. In tegenstelling daarmee is ongekoppeld eNOS en/of verminderde eNOS-aktiviteit (geïnduceerd door oxidative stress en inflammatie) een trigger voor ED. Sirt1 is een andere belangrijke modulator voor de endotheliale homeostase via de aktivatie van eNOS om endothelium-afhankelijke vasodilatatie te bevorderen, waarvan de expressie/aktiviteit gereduceerd is tijdens inflammatie. miRs doken op als interessante kandidaten voor biomerkers voor M.E./CVS, aangezien deze niet-coderende RNAs wijdverspreide rollen spelen bij het reguleren van gen-expressie. Micro-chip analyses hebben meerdere miRs met differentiële expressie geïdentificeerd bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs, ook ondersteund door analyses die aangeven dat inflammatie-gerelateerde processen en immune abnormaliteiten een rol spelen bij de pathofysiologie [zie Nepotchatykh E et al. hierboven]. We vergeleken dan de expressie van miR-21, miR-34a, miR-92a, miR-126 & miR-200c in plasma-stalen van M.E./CVSmm & M.E./CVSsa versus HCs, verkregen via de UKMEB.

We detekteerden verhoogde plasma-waarden van elk miR bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs, onafhankelijk van de ziekte-ernst. Om bijkomend bewijs te leveren, her-analyseerden we ook beschikbare micro-chip gegevens over PBMCs van andere M.E./CVS-patiënten. miR-21, miR-34a, miR-92a & miR-126 bleken ook gestegen vergeleken met HCs, terwijl miR-200c dezelfde trend vertoonde maar met ‘borderline’ statistische significantie. Alles tesamen ondersteunen deze bevindingen niet enkel het feit dat evaluatie van deze set miRs (waarvan werd gerapporteerd dat ze de endotheliale funktie reguleren via de Sirt1/eNOS-as) kan worden gebruikt om een subgroep M.E./CVS-patiënten te differentiëren van HCs maar benadrukt ook het belang van beschikbare gegevens om bevindingen te vergelijken met die van andere studies.

Rekening houdend met de immunologische heterogeniteit van patiënten met verloop van de ziekte, hebben meerdere studies immuun-patronen bij M.E./CVS onderzocht, dikwijls met tegenstrijdige resultaten [VanElzakker MB et al. Neuroinflammation and cytokines in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS): A critical review of research methods. Front. Neurol. (2019) 9: 1033]. Niettemin lijken pro-inflammatoire cytokinen (zoals TGF-β, TNF-α, IL-1β & IL-6) een rol te spelen gerelateerd met ziekte-duur en -ernst. In overéénstemming met een studie uitgevoerd met PBMCs en extracellulaire vesikels van M.E./CVSsa-patiënten [zie Almenar-Perez E et al. hierboven], vonden we verhoogde waarden qua miR-21 in plasma-stalen van zowel M.E./CVSmm- als M.E./CVSsa-patiënten t.o.v. HCs. miR-21 wordt beschreven als downregulator van de Sirt1/eNOS-as via TGF-β & TNF-α mechanismen in ECs en endotheliale voorloper-cellen (EPCs), respectievelijk. Steeds meer experimentele en klinische gegevens hebben ook gesuggereerd dat asymmetrisch dimethyl-arginine (ADMA), een endogene eNOS-inhibitor, ED bevordert door het reduceren van NO bio-beschikbaarheid. Inderdaad: door TNF-α geïnduceerde miR-21 upregulering is verbonden met gestegen ADMA-concentratie en gedaalde eNOS-aktiviteit in ECs. L-citrulline, het nevenprodukt van NO-synthese uit L-arginine via eNOS, verbeterde ADMA-geïnduceerde ED door het versterken van de eNOS-werking en het reduceren van oxidatieve stress [bij varkens]. Interessant: L-citrulline bleek significant lager in plasma van M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs [Yamano E et al. Index markers of Chronic Fatigue Syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles. Sci. Rep. (2016) 6: 34990]. Aangezien de voornaamste bron van L-citrulline de darm is, worden circulerende waarden gebruikt als indicator van de darm-funktie. Er werd voorgesteld dat microbiële dysbiose in de darm betrokken is bij M.E./CVS [Giloteaux L et al. Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Microbiome (2016) 4: 30] en dat de mate van vermoeidheid geassocieerd is met de afname van plasma L-citrulline bij andere pathologische settings met dysbiose. Gestegen plasma-waarden van ADMA en gedaalde plasma-waarden qua L-citrulline kunnen dus de NO-produktie bij M.E./CVS-patiënten negatief beïnvloeden. Daarnaast wordt gedacht dat miR-21 werkt als een positieve maar indirecte regulator van Foxp3-expressie [‘forkhead box P3’, een proteïne betrokken bij immuun-responsen; belangrijke regulator bij de ontwikkeling en werking van regulerende T-cellen (Tregs)] in menselijke regulerende CD4+ T-cellen (Tregs), een belangrijke cellulaire populatie van het adaptief immuunsysteem dat auto-immuniteit en auto-reaktieve T-cellen controleert. Dienoveréénkomstig verbeterde miR-21 de klinische ernst van experimentele auto-immune encefalomyelitis bij muizen via een mechanisme waarbij Tregs betrokken zijn. Het is daarom mogelijk te hypothiseren dat een over-expressie van miR-21 de expressie van Foxp3 in naïeve CD4+ T-cellen en hun omzetting naar de Treg-voorraad kunnen bevorderen. Deze vermoedelijke Treg-cel conversie zou een verklaring kunnen bieden voor de toename van het aandeel van deze cellen bij M.E./CVS-patiënten (wat bij sommige studies werd gezien) [Sepulveda N et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome as a hyper-regulated immune system driven by an interplay between regulatory T cells and chronic Human Herpesvirus infections. Front. Immunol. (2019) 10: 2684].

Overéénkomstig deze observatie: miR-34 reguleert ook Tregs via NF-κB signalisering, een goed beschreven mechanisme dat inflammatie induceert via de inhibitie van Sirt1. miR-34a lijk ook een belangrijke rol te spelen bij de regulering van endotheliale cel inflammatie via de differentiële modulatie van de antagonistische communicatie tussen NF-κB en Sirt1. Bovendien is de negatieve regulering door miR-34a van de Sirt1/eNOS-as geassocieerd met de voortijdige senescentie [veroudering] van ECs. Interessant: een gerandomiseerde klinische studie rapporteerde een negatieve correlatie tussen miR-34 en Sirt1-expressie bij patiënten met coronaire arteriële ziekte. Overwegende dat miR-34a verhoogd bleek bij M.E./CVS-patiënten vergeleken met HCs, zijn verdere studies dus zeker nodig om z’n mogelijke bijdrage aan de immune en endotheliale abnormaliteiten, die worden gezien bij M.E./CVS-patiënten, op te helderen.

Onze resultaten toonden ook gestegen circulerend miR-92a (zowel bij M.E./CVSmm- als M.E./CVSsa-patiënten), in overéénstemming met een studie gebruikmakend van PBMCs [zie Cheema AK et al. hierboven]. In vitro wordt ED verzwakt door de inhibitie van miR-92a via het doen dalen van de afgifte van TNF-α & IL-6 door ECs. Daarnaast deed miR-92a over-expressie de eNOS-aktiviteit en afgifte van NO dalen, terwijl z’n inhibitie de eNOS-gemedieerde endotheliale funktie herstelde via het verhogen van Sirt1-expressie in ECs. In observationele klinische studies bleek circulerend miR-92a positief te correleren met microvasculaire coronaire ED. Bovendien was miR-92a omgekeerd gecorreleerd met FMD en positief geassocieerd met IL-1β & CRP in het serum van patiënten met coronaire arteriële ziekte.

Overéénkomstig onze bevindingen bleek miR-126 ook verhoogd te zijn in extracellulaire vesikels van M.E./CVSsa-patiënten [zie Almenar-Perez E et al. hierboven]. Van miR-126 wordt beschreven dat het een endothelium beschermende rol uitoefent tegen hypoxie/reoxygenatie-geïnduceerd letsel, oxidatieve stress en TNF-α, door aktivatie van de Sirt1/eNOS-as in ECs. Circulerend miR-126 was gecorreleerd met verbetering van de endotheliale funktie bij mannelijke obese adolescenten (na controle voor inspanning en dieet). Daarnaast: miR-126 reduceert oxidatieve stress, IL-6 & TNF-α, en aktiveert zowel eNOS als vasculaire endotheliale groei-factor (VEFG) in ECs. VEGF bleek gedaald in het serum van M.E./CVS-patiënten [Landi A et al. Reductions in circulating levels of IL-16, IL-7 and VEGFA in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome. Cytokine (2016) 78: 27-36], een interessante bevinding gezien het feit dat VEGF de overleving en stabiliteit van ECs bevordert. Alles tesamen zouden hogere plasma-waarden miR-126 bij M.E./CVS-patiënten een compenserend mechanisme tegen kunnen omvatten.

Een grote hoeveeleid bewijsmateriaal suggereert een auto-immune etiologie voor een subgroep M.E./CVS-patiënten [Sotzny F et al. Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome – Evidence for an autoimmune disease. Autoimmun. Rev. (2018) 17: 601-609; zie ook ‘Hypothese over de pathofysiologie van M.E.(cvs) op basis van de bevindingen omtrent auto-antilichamen tegen ß2-adrenerge receptoren]. De M3 muscarine acetylcholine receptor doet bv. de NO-synthese gemedieerd door acetylcholine in ECs stijgen maar auto-antilichamen tegen deze receptor bleken significant hoger bij M.E./CVS-patiënten t.o.v. HCs [Loebel M et al. Antibodies to β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Brain. Behav. Immun. (2016) 52: 32-39; zie ook ‘Syndromen met chronische pijn/vermoeidheid gelinkt met auto-immune dysautonomie & ‘small-fibre’ neuropathie]. Er werden meerdere auto-antilichamen, inclusief deze tegen de M3 muscarine acetylcholine receptor, geïdentificeerd bij mensen met posturale orthostatische tachycardie syndroom (POTS), gekenmerkt door tachycardie bij de overgang van ruglig naar stand, een aandoening gelinkt met M.E./CVS. Interessant: miR-200c over-expressie verzwakt de door acetylcholine geïnduceerde endothelium-afhankelijke ontspanning van de nier-arteriën bij mensen. Dus zou miR-200c verbonden kunnen zijn met acetylcholine-gerelateerde ED. In dit opzicht werd gerapporteerd dat circulerend miR-200c verhoogd was bij patiënten met atherosclerose geassocieerd met verminderde Sirt1/eNOS-expressie. Daarnaast reduceerde miR-200c upregulering geïnduceerd door oxidatieve stress de Sirt1/eNOS-as aktiviteit, met apoptose en senescentie in ECs tot gevolg.

Er werden ook meerdere bio-informatica analyses uitgevoerd om bijkomende doelwitten en biologische processen geassocieerd met de set miRs bloot te leggen. We valideerden dat endotheliale funktie-gerelateerde signalisering-mechanismen nauw verwant zijn met deze miRs, inclusief oxidatieve stress en zuurstof-regulering. Interessant: HDAC1 was het meest relevante knooppunt in het netwerk dat we opbouwden met miR-21, miR-34a, miR-92a, miR-126 & miR-200c. Histoon-deacetylases verwijderen acetyl-lysine merktekens op proteïnen, bijzonderlijk in histonen [specifieke eiwitten die aan DNA in de celkern binden en het chromatine vormen], wat leidt tot chromatine-verdichting en verminderde gen-expressie. Veranderingen in chromatine-dichtheid door gewijzigd HDAC1, tesamen met andere epigenetische veranderingen die eerder werden gedetekteerd bij M.E./CVS-patiënten [Trivedi MS et al. Identification of Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome-associated DNA methylation patterns. PLoS One (2018) 13: e0201066], zouden ook een rol kunnen spelen bij dit syndroom. Sirt1 deacetyleert en aktiveert HDAC1 maar cel-stress induceert zowel Sirt1-degradatie als HDAC1-acetylatie, wat HDAC1 minder aktief maakt. Er werd gerapporteerd over andere HDAC-isoformen die verhoogd zijn in PBMCs van M.E./CVS-patiënten [Jason L et al. Increased HDAC in association with decreased plasma cortisol in older adults with Chronic Fatigue Syndrome. Brain. Behav. Immun. (2011) 25: 1544-1547]. Met name de upregulering van HDAC1 bleek de NO-produktie te reduceren door deacetylatering van eNOS in ECs in vitro. Ondanks het feit dat deze bevindingen potentiële strategieën voor het voorkomen van ED via HDAC1 kunnen vertegenwoordigen, dienen ze omzichtig te worden geïnterpreteerd omdat zowel upregulering van HDAC1 als farmacologische inhibitie HDACs de endotheliale funktie negatief beïnvloedt. Er zijn dus verdere studies nodig om enige wijziging qua hoeveelheid en/of aktiviteit van HDAC1 direct gerelateerd met ED te bevestigen. Op basis van de wederzijdse regulering tussen Sirt1 en HDAC1 zou een betere analyse van de endotheliale funktie echter de HDAC1/Sirt1/eNOS-as als een nieuw platform moeten adresseren om de veranderde regulerende mechanismen die leiden tot ED te ontleden.

Opmerkelijk: we vonden gelijkenissen wat betreft de expressie van onze doelwit miRs in plasma vergeleken met PBMCs van een andere studiegroep. Vanuit een biologisch standpunt worden miRs aangemaakt, afgegeven en opgenomen door verschillende celtypes, met wijdverspreide rollen bij het reguleren van gen-expressie over gans het lichaam. NF-κB is ook betrokken bij de modulatie van een brede waaier aan pleiotrope responsen [pleiotroop = met meerdere effekten op verschillende cel-soorten of verschillende biologische funkties beïnvloedend]. Het is dus niet verrassend dat deze ‘master’ transcriptie-factor, goed gekend om z’n modulatie van immune en inflammatoire responsen, ook zou kunnen deelnemen in raadselachtige signalisering-mechanismen, gaande van metabool syndroom tot depressie, in communicatie met meerdere miRs, inclusief miR-2175, miR-34a55, miR-92a22 & miR-12676. Op basis van de heterogene aard van M.E./CVS, zijn er ons van bewust dat deze verhoogde miRs niet exclusief gerelateerd zijn met dit syndroom, maar ze weerspiegelen een wijziging, niet gerelateerd met de ernst, die verder kan worden geëxploiteerd om nieuwe mechanismen met diagnostische en therapeutische waarde voor M.E./CVS te identificeren. Aangezien de EC-gerelateerde funktie varieert van acute naar chronische inflammatie, en zelfs tijdens de ‘switch’ van aangeboren naar adaptieve immuniteit, zijn verdere studies zeker vereist om op te helderen of de door ons bestudeerde miRs betrokken zijn bij de immune abnormaliteiten van M.E./CVS.

Naar ons weten is dit het eerste rapport dat circulerende miRs geassocieerd met de Sirt1/eNOS-as collectief evalueert en een basis verschaft voor verdere studies om ED-gerelateerde biomerkers voor M.E./CVS te vinden. Globaal zou de weinig invasieve detektie van deze miRs in plasma kunnen helpen om M.E./CVS-patiënten te identificeren, maar de hoeveelheden er van kunnen niet per se het onderscheid maken tussen M.E./CVSsa- & M.E./CVSmm-patiënten. Onze bevindingen ondersteunen ook de hypothese dat endotheliale homeostase een onderschat en gedeeltelijk geadresseerd proces bij M.E./CVS is, dat een belangrijke rol kan spelen in de complexe pathofysiologie van M.E./CVS. Bij het overwegen van de hoofd-werking uitgeoefend door ECs en het feit dat ze overvloedig voorkomen in weefsels over gans het lichaam, ondersteunt onze studie niet enkel ander meldingen die M.E./CVS associëren met ED maar doet ook onze kennis vooruitgaan omtrent potentiële nieuwe spelers waarover nog niet gerapporteerd werd. Tot besluit: we stellen voor dat een combinatie van klinische evaluatie van de endotheliale funktie (via FMD en/of EndoPAT), tesamen met de detektie van circulerende met Sirt1/eNOS gerelateerde miRs, een sensitievere karakterisatie van ED in een subgroep M.E./CVS-patiënten zou kunnen toelaten, wat zich zeker zal vertalen in verbeterde behandel-mogelijkheden.

We zijn er ons van bewust dat deze bevindingen nog niet transfereerbaar zijn naar een klinische setting. Overéénkomstig hiermee zijn observationele studies met follow-up metingen bij een grotere groep zeker noodzakelijk om de ‘power’ van de analyse te verbeteren en onze bevindingen te bevestigen. Op die manier gaan we akkoord met Jason L et al. dat het cruciaal is om minimale gegevens (patiënten-karakteristieken, staalname, statistische methodes, klinische en research-beoordelingen) op te nemen in M.E./CVS-rapporten, zoals we hier probeerden te doen. Bovendien vertegenwoordigt het gebruik van meer specifieke en restrictieve definities een centrale strategie om mis-klassificatie-bias te verminderen en, daardoor, de kansen te verbeteren om betrouwbare biomerkers voor M.E./CVS te identificeren.

Bijvoorbeeld: ondanks het feit dat de Fukuda-definitie het meest wordt gebruikt bij M.E./CVS-research, worden individuen met majeure depressie verkeerdelijk als M.E./CVS-patiënten geklassificeerd. Samengevat: gestandardiseerde diagnose en research-criteria zullen de reproduceerbaarheid/vergelijkbaarheid van studies verhogen en een positieve impact hebben op de gezondheidszorg van M.E./CVS-patiënten.

Geef een reactie »

Nog geen reacties.

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit /  Bijwerken )

Google photo

Je reageert onder je Google account. Log uit /  Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit /  Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit /  Bijwerken )

Verbinden met %s

Deze site gebruikt Akismet om spam te bestrijden. Ontdek hoe de data van je reactie verwerkt wordt.

Blog op WordPress.com.

%d bloggers liken dit: