M.E.(cvs)-wetenschap

mei 29, 2015

SNPs in TRP ion-kanalen bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 11:31 am
Tags: , , , , ,

We rapporteerden op deze pagina’s al meermaals over de mogelijke impact bij M.E.(cvs) van zgn. SNPs in bepaalde genen. Zie onder meer ‘Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes’.

TRP-kanalen zijn ion-kanalen die cellen triggeren om te reageren op veranderingen in hun omgeving; deze kunnen worden veroorzaakt door pathogenen, oxidatieve stress, chemische stoffen, toxinen en gewijzigde zuurtegraad. In ‘Sensory TRP channels: the key transducers of nociception and pain’ (Prog Mol Biol Transl Sci. (2015)131: 73-118) lezen we: “Bij de perifere detektie van nociceptieve en pijnlijke stimuli door sensorische neuronen is een ingewikkeld repertoire van molekulaire detektoren en transducers betrokken op bepaalde zenuw-vezels. De meerderheid van die detektoren/transducers behoort tot de ‘transient receptor potential’ (TRP) familie.”. TRPs zijn bij meerdere ziekten verstoord. Het is dus mogelijk dat bepaalde variaties (SNPs) in de genen coderend voor TRP ion-kanalen geassocieerd zijn met M.E.(cvs).

De Australische researchers die onderstaand artikel publiceerden vonden dat de frequentie van 13 SNPs significant verschilde tussen M.E.(cvs) en controles. 9 daarvan lagen in het TRPM3 gen, 2 in het TRPA1 gen en 2 in het TRPC4 gen. De resultaten zijn nog preliminair maar ze geven aan dat genetische wijzigingen in TRP ion-kanalen (receptoren van belangrijke signalisering-mechanismen betrokken bij de werking van cellen en het immuunsysteem, en het reageren op bedreigingen) een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling of het doen voortduren van M.E.(cvs).

De meldingen van SNPs bij M.E.(cvs) kunnen worden omschreven als ‘hypothese-genererend’. De vondsten kunnen worden voor het nader onderzoeken van specifieke gebieden van het genoom. Het is wel waarschijnlijk dat een complexe chronische ziekte zoals M.E.(cvs) het resultaat is van een groot aantal SNP-varianten die samen zorgen voor stoornissen.

Zie verder o.a. ook ‘Verhoogde aanwezigheid van 2 mitochondriale DNA polymorfismen bij CVS’, ‘Variaties in Pijn-perceptie zijn Genetisch bepaald’ en ‘Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is’.

————————-

Immunology and Immunogenetics Insights Vol 7, pp 1-6 (2015)

Examination of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Transient Receptor Potential (TRP) ion channels in Chronic Fatigue Syndrome patients

Sonya M. Marshall-Gradisnik (1,2,*), Peter Smith (2), Ekua W. Brenu (1,2), Bernd Nilius (3), Sandra B. Ramos (1,2) & Donald R. Staines (2)

1 School of Medical Science

2 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, Australia

3 Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Ion Channel Research, KU Leuven, Belgium

Samenvatting

Achtergrond. De ‘transient receptor potential’ (TRP) super-familie omvat bij mensen 27 kation-kanalen met doorlaatbaarheid voor monovalente en divalente kationen [één- of twee-waardig positief geladen ionen]. Deze kanalen komen bij mensen op vele cellen en weefsels tot expressie en ze hebben significante sensorische en regulerende rollen bij de meeste fysiologische funkties. Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen.

Doelstellingen. Het doel van deze studie was om de rol te bepalen van TRPs bij CVS.

Methodes. De studie omvatte 115 CVS-patiënten […] en 90 niet-vermoeide controles […]. De CVS-patiënten werden gedefinieerd volgens de 1994 CDC criteria voor CVS. Er werden in het totaal 240 ‘single’ nucleotide polymorfismen (SNPs) bij 21 TRP ion-kanaal genen (TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5 & TRPV6) bepaald. […]

Resultaten. Er waren 13 SNPs significant geassocieerd met CVS vergeleken met de controles. Daarvan waren er 9 SNPs geassocieerd met TRPM3 […], terwijl de rest was geassocieerd met TRPA1 […] en TRPC4 […].

Besluit. De gegevens van deze piloot-studie suggereren een associatie tussen TRP ion-kanalen – voornamelijk TRPM3 – en CVS. Deze en andere TRPs kunnen bijdragen tot de etiologie en het pathomechanisme van CVS.

Inleiding

‘Transient receptor potential’ (TRP) ion-kanalen zijn kation-kanalen met een vermeende rol bij vele fysiologische signalisering-mechanismen. Bij zoogdieren omvatten TRPs 6 groepen: TRPA (ankyrine), TRPC (kanoniek), TRPM (melastatine), TRPML (mucolipine), TRPP (polycystine) en TRPV (vanilloïd). In het algemeen zijn de TRPC-kanalen niet-selektieve kation-kanalen; slechts 2 zijn zeer doorlaatbare Ca2+-kanalen en 2 zijn ondoorlaatbaar voor Ca2+. Belangrijk is dat meerdere TRPs doorlaatbaar zijn voor Mg2+ en Zn2+. TRPs komen uitgebreid tot expressie op bijna alle cellen en hebben daarom waarschijnlijk significante effekten op fysiologische funkties. Ontregeling van TRPs bleek geassocieerd met pathologische aandoeningen en ziekten, inclusief chronische pijn, over-aktieve blaas, diabetes, chronische obstructieve long-ziekte, cardiale hypertrofie [verdikking hartwand], familiale Alzheimer’s, huid-ziekten, skeletale dysplasiën [misvormingen van bot/kraakbeen], motor-neuropathieën, neurosensorische neuropathieën inclusief de ziekte van Charcot-Marie-Tooth [verzamelnaam voor een aantal erfelijke ziekten waarbij de zenuwen zijn aangetast] (type 2C) en kanker. TRP ion-kanalen worden geaktiveerd na schommelingen of afwijkingen in de cellulaire omgeving. Factoren die deze veranderingen kunnen beïnvloeden zijn stressoren zoals pathogenen, temperatuur, druk, chemische stoffen, oxidatie/reductie, toxine, osmolariteit en pH.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een onverklaarde aandoening met veelvoudige fysiologische stoornissen. Research suggereert significante immuun-stoornissen; het mechanisme van deze aandoening dient echter nog te worden bepaald. CVS-patiënten kunnen reakties vertonen op een aantal omgeving- en biologische factoren. Bovendien is er bewijs dat suggereert dat CVS een allergische component zou kunnen hebben. Atypische TRP-expressie werd gerapporteerd bij CVS; in het bijzonder upregulering van de expressie van TRPV1. [Light AR, Bateman L, Jo D et al. Gene expression alterations at baseline and following moderate exercise in patients with Chronic Fatigue Syndrome and fibromyalgia syndrome. J Intern Med. (2012) 271: 64-81; zie Gen-expressie veranderingen na matige inspanning bij CVS & FM] Aangezien TRPs een overvloed aan fysiologische signalisering-mechanismen reguleren, zouden ze een rol kunnen spelen bij CVS. Een aantal channelopathieën [ziekten veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanalen; zie o.a. ‘Inspanning-responsieve genen bij CVS] bleken geassocieerd met TRP-genen en die hebben gevolgen voor de cellulaire funktie. Daarnaast kunnen TRP-kanalen een doelwit zijn tijdens inflammatoire reakties, aangezien ze makkelijk geaktiveerd worden in aanwezigheid van irriterende stoffen, inflammatoire produkten en xenobiotische [lichaamsvreemde] toxinen. Daarnaast rapporteren CVS-patiënten een significante sensitiviteit voor toxinen en irriterende stoffen uit de omgeving, maar de oorzaken van deze gevoeligheden dienen nog te worden uitgeklaard. Het doel van deze piloot-studie was om te bepalen of polymorfismen in SNPs geassocieerd met TRP ion-kanaal genen een bijdragende factor zijn in de pathogenese van CVS.

Methodologie

Deelnemers. Er werden 115 CVS-patiënten en 90 niet-vermoeide controles gerecruteerd voor deze studie. Van de 115 CVS-patiënten (leeftijd 48,68 ± 1,06 jaar), waren er 84 (73,04%) vrouwen en 31 (26,96%) mannen. De 90 niet-vermoeide controles (leeftijd = 46,48 ± 1,22 jaar) omvatten 59 (65,56%) vrouwen en 31 (34,44%) mannen. De CVS-patiënten warden gedefinieerd volgens de 1994 criteria van het ‘Centre for Disease Prevention and Control’ (CDC) voor CVS. Alle deelnemers waren van Europese afkomst en inwoners van Australië […].

DNA-extractie. […]

SNP-genotypering. […]

Statistische analyse. […]

Resultaten

SNP associatie studies. Van de 240 SNPs die hier werden onderzocht, warden er 233 succesvol geïdentificeerd in beide groepen. 13 bleken significant geassocieerd met CVS. 9 van deze SNPs waren geassocieerd met TRPM3 (rs12682832; P ≤ 0.003, rs11142508; P ≤ 0.004, rs1160742; P ≤ 0.08, rs4454352; P ≤ 0.013, rs1328153; P ≤ 0.013, rs3763619; P ≤ 0.014, rs7865858; P ≤ 0.021, rs1504401; P ≤ 0041, rs10115622; P ≤ 0.050), terwijl de overblijvende SNPs geassocieerd waren met TRPA1 (rs2383844; P ≤ 0.040, rs4738202; P ≤ 0.018) en TRPC4 (rs6650469; P ≤ 0.016, rs655207; P ≤ 0.018).

Bespreking

Het doel van deze piloot-studie was om de aanwezigheid te bepalen van mogelijke SNP-variaties bij CVS-patiënten, met een specifieke focus op SNPs in de coderende sequenties van 21 TRP ion-kanaal genen. Van de 240 onderzochte SNPs, bleken 13 allelen significant geassocieerd met CVS-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Aangezien CVS een heterogene aandoening is, is het waarschijnlijk dat verdere stratificatie van patiënten meer allel-associaties zou kunnen aantonen. Deze allelen waren gelegen in de gen-sequentie van één van de kanonieke TRP ion-kanalen (TRPC4), één ankyrine (TRPA1) en één melastatine TRP ion-kanaal (TRPM3).

SNPs die in een coderende sequentie zijn gelegen veranderen de amionozuur-sequentie van het geproduceerde proteïne al dan niet noodzakelijkerwijs. Een SNP dat de polypeptide-sequentie niet wijzigt, draagt de term ‘synoniem’ (soms een ‘stille variant’ genoemd), terwijl naar een SNP dat resulteert in een verschillende polypeptide-sequentie wordt verwezen als ‘niet-synoniem’ (mogelijks resulterend in gewijzigde gen-transcripten en ziekte-fenotypes). In dit onderzoek rapporteren we TRP SNP-anomalieën, suggererend dat ze de mogelijke aanvang of klinische presentatie van CVS kunnen mediëren; dit dient echter te worden bevestigd bij grotere groepen. Niettemin suggereert deze studie de mogelijke rol voor afwijkende TRPs bij CVS. Verdere uitleg, waarbij wordt aangetoond dat TRPs significante fysiologische rollen spelen, wordt hieronder verstrekt. In het bijzonder: CVS-patiënten rapporteren symptomen die geassocieerd zouden kunnen zijn met afwijkende TRP-funktie.

TRPC4 wordt geaktiveerd via receptor-afhankelijke aktivatie van het Gq/11/PLC (fosfolipase-C)/γ mechanisme maar ook via Gαi proteïnen, PI(4,5)P2 proteïnen en ook intracellulair Ca2+. Het is voornamelijk betrokken bij vasomotor-funktie [vaat-verwijding en -samentrekking], aggregatie van bloedplaatjes en werking van gladde spieren. Ca2+ staat ook bekend vereist te zijn voor de regulering van immuun-cellen, aangezien het werkt als een tweede boodschapper [na aktivatie van G-proteïne gebonden receptoren ontstaan er intracellulair zogenaamde ‘second messengers’ die, na een aantal biochemische tussenstappen, zorgen voor het uiteindelijk fysiologisch effekt] voor de meeste cellen, bijzonderlijk T- en B-cellen. Intracellulair Ca2+ verhoogt wanneer lymfocyt-receptoren worden blootgesteld aan antigenen. Bij CVS-patiënten zijn er talrijke meldingen over gecompromitteerde immuun-funktie, maar er is slechts beperkte informatie over de rol van Ca2+ bij deze patiënten. Ontregeling van TRPCs kan echter de intracellulaire calcium-concentratie beïnvloeden en desgevallend de lymfocyten-funktie. Lymfocyten zoals ‘Natural Killer’ (NK) cellen en T-cellen bleken gecompromitteerd bij CVS. In NK-cellen versterkt Ca2+ de cytotoxische aktiviteit, en de uitputting of overmatige toevloed ervan kan ernstige gevolgen hebben op de werking van NK-cellen. Bij CVS werd verminderde cytotoxische aktiviteit consistent gerapporteerd [Brenu EW, Huth TK, Hardcastle SL et al. Role of adaptive and innate immune cells in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. Int Immunol. (2014) 26: 233-242 = ‘Rol van adaptieve en aangeboren immuun-cellen bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Ashton KJ, van Driel M et al. Cytotoxic lymphocyte microRNAs as prospective biomarkers for Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Affect Disord. (2012) 141: 261-269 = ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)?’ /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Longitudinal investigation of natural killer cells and cytokines in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2012) 10: 88 /// Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9: 81 = ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Brenu EW, Staines DR, Baskurt OK et al. Immune and hemorheological changes in Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med. (2010) 8: 1 = ‘Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’ /// Barker E, Fujimura SF, Fadem MB, Landay AL, Levy JA. Immunologic abnormalities associated with Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis. (1994) 18: S136-S141] en dit zou verband kunnen hebben met de ontregeling van Ca2+.

Ontregeling van TRPCs kan neuronale responsen beïnvloeden, in het bijzonder deze die geassocieerd zijn met de stimulatie van muscarine receptoren [werken als belangrijkste eind-receptor gestimuleerd door acetylcholine in het parasympathisch zenuwstelsel]. Na aktivatie van TRPCs door fosfolipase-C, treedt een influx van Ca2+ op, wat een inductie in muscarine receptoren veroorzaakt en onophoudelijk neuronaal ‘vuren’ [‘overbrengen van signalen’] onderhoudt. Secretie van Ca2+ en de beschikbaarheid van TRPCs in het neuronaal milieu zijn daarom van uiterst belang voor de optimale werking van muscarine receptoren en de globale werking van de hersenen. Belangrijk: dit proces is essentieel voor het geheugen, de aandacht, sensorische scherpte, emotie, pijn en motor-controle, en gebeurt in de amygdala, entorhinale cortex [bepaald deel van de hersenschors; o.a. van belang bij het geheugen], hippocampus en pre-frontale cortex. Neuronale gebreken met betrekking tot het geheugen en de aandacht werden geïdentificeerd bij CVS. [o.a. Nakatomi Y, Mizuno K, Ishii A et al. Neuroinflammation in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: an 11C-(R)-PK11195 PET Study. J Nucl Med. (2014) 55: 945-950; zie ‘Neuro-inflammatie bij Myalgische Encefalomyelitis (CVS) – een PET-studie] Het gebrek/fouten aan TRPC4 kunnen ook de darm-funkie beïnvloeden. TRPC4 en TRPC6 vormen een paar met muscarine receptoren in de darm, wat depolarisatie van gladde spieren, toevloed van of Ca2+ en contractie van gladde spieren aktiveert. Intestinale dysfunktie is een component van CVS [Lakhan SE, Kirchgessner A. Gut inflammation in Chronic Fatigue Syndrome. Nutr Metab. (2010) 7: 79]; de mate van beschadiging aan de darm-wand of de exacte rol van ion-kanalen in de darm dient echter te worden bepaald. TRPC4 zou simultaan geregeld kunnen worden door G-proteïne gekoppelde receptoren [GPCRs; signaaloverdracht via een trans-membranair systeem, de G-eiwit receptor].

TRPA1 is een receptor voor meerdere chemische stoffen die werd geïdentificeerd op nociceptieve sensorische neuronen (C-vezels) en heeft een rol bij de regulering van de afgifte van neuropeptiden, pijn-sensatie en inflammatie. Het kan worden geaktiveerd door zowel exogene als endogene inflammatoire agentia, resulterend in inflammatie en pijn. GPCRs aktiveren ook TRPA1 via PLC-signalisering, waardoor het ion-kanaal wordt gesensitiseerd voor verscheidene stimuli. TRPA1 kan worden geaktiveerd en daaropvolgend geïnaktiveerd in aanwezigheid van intracellulaire en extracellulaire calcium-concentraties. Er werd voorgesteld dat het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli beïnvloedt; daarom zou bij CVS-patiënten met SNPs in het TRPA1 gen de sensitiviteit voor nociceptieve stimuli verhoogd kunnen zijn. In het centraal zenuwstelsel brengen astrocyten TRPA1-kanalen tot expressie en deze kanalen zijn nodig voor calcium-opname en neuronale regulering in de astrocyten. Veranderingen in qua calcium kunnen daarom de werking van astrocyten en communicatie tussen neuronen aantasten. Er werd aangetoond dat aktivatie van TRPA1 acute hoofdpijn kan induceren en dit zou kunnen gebeuren via het calcitonine-gen gerelateerd peptide [CGRP; het proteïne wordt geproduceerd door neuronen, is een krachtige vasodilator, kan tussenkomen bij pijn-transmissie], wat vasodilatie [vaat-verwijding] in de meningeale arterie [naar de hersenvliezen] kan veroorzaken. Belangrijk: hoofdpijn is een prominent symptoom van CVS. TRPA1 speelt ook een sleutelrol bij migraine, en neuropathische gewricht- en spier-pijn, die dikwijls wordt ervaren door patiënten met fibromyalgie. TRPA1 vormt funktionele hetero-tetrameren met TRPV1; daarom zouden variaties in het TRPA1 gen op funktionele gebreken aan TRPV1 kunnen wijzen, die misschien niet gerelateerd zijn aan een nucleotide-polymorfisme. Belangrijk ook is dat Spaanse onderzoekers rapporteerden dat TRPV1 bijdraagt tot de genetische voorbestemdheid voor migraine (grote studie bij 500 Spaanse deelnemers), wat suggereert dat TRPA1 en TRPV1 een rol kunnen spelen bij de symptoom-presentatie van CVS. Interessant is dat analgetica en anti-nociceptieve medicijnen gericht zijn op, respectievelijk, TRPV1 en TRPA1 om de pijn-sensatie te verlichten [tramadol, paracetamol cannabinoïden], en deze medicijnen worden routinematig voorgeschreven aan CVS-patiënten. Misschien zijn deze medicijnen bij CVS wel niet meer doeltreffend omwille van de stoornissen of variaties in deze ion-kanalen.

TRPM-kanalen zijn meestal doorlaatbaar voor magnesium en calcium. Enkel TRPM4 en TRPM5 zijn ondoorlaatbaar voor twee-waardige kationen. TRPM3 is doorlaatbaar voor kationen inclusief Ca2+ en Zn2+. Het doorlaatbaarheid-profiel hangt echter erg af van de tot expressie gebrachte variant. Er werd tot op heden geen erfelijke TRPM3 channelopathie beschreven. TRPM3 bleek betrokken bij inflammatoire pijn syndromen, Reumatoïde Arthritis en afgifte van pro-inflammatoire cytokinen. Aangezien pancreatische [insuline-producerende] β-cellen ook een groot aantal of TRPM3-kanalen dragen, bestaat de kans op verstoringen in de insuline/glucose-regulering bij CVS-patiënten. Metabole verstoring werd sinds lang geïdentificeerd als een kardinaal kenmerk van CVS. Bij mensen werd TRPM3 het meest gekarakteriseerd in het centraal zenuwstelsel en de ogen, waar een mis-sense mutatie [punt-mutatie waarbij een wijziging van één nucleotide resulteert in een ander aminozuur in het proteïne] van het TRPM3 gen ook ten grondslag bleek te liggen aan de ontwikkeling van katarakt en glaucoom. TRPM3 is betrokken bij de detektie van warmte en bij pijn-transmissie. TRPM3-deficiënte muizen vertonen duidelijke gebreken wat betreft hun vermijding-responsen ten aanzien van schadelijke warmte en bij de ontwikkeling van inflammatoire hitte hyper-algesie. Ontregeling van de thermoregulerende responsen werd gerapporteerd bij CVS-patiënten. Veralgemeende pijn is een kenmerk van CVS en treedt op in afwezigheid van weefsel-schade, en dit is suggestief voor mogelijke stoornissen van het centraal zenuwstelsel. [Meeus M, Nijs J. Central sensitization: a biopsychosocial explanation for chronic widespread pain in patients with fibromyalgia and Chronic Fatigue Syndrome. Clin Rheumatol. (2007) 26: 465-473; zie ook ‘Centrale sensitisatie & pijn-behandeling] Aangezien TRPM3 een rol speelt bij nociceptie en thermoregulering, zou het van belang kunnen zijn bij het pathomechansime van CVS. Daarnaast wordt TRPM3 geaktiveerd door pregnenolon-sulfaat [pregnenolon = een endogeen steroïd-hormoon, de voorloper van progestogenen, mineralo- en gluco-corticoïden, androgenen, oestrogenen en neuro-aktieve steroïden], wat suggereert dat het neuro-endocriene effekten heeft en het zou ook betrokken kunnen zijn bij de regulering van glutamaterge signalisering [via de neurotranimitter glumataat] in de hersenen.

Deze preliminaire bevindingen impliceren TRP ion-kanalen bij de etiologie en het pathomechanisme van CVS. Ontregeling van TRPs, inclusief de TRPM3-familie, is waarschijnlijk betrokken bij het vatbaar maken van CVS-patiënten voor stoornissen in het calcium-metabolisme en loopt evenwijdig met de symptoom-presentatie. Mogelijks zullen de ontregelde influx van calcium-ionen in de cellen een impact hebben op een aantal vitale componenten van de cel-regulerende machinerie. Deze componenten omvatten calcium-gevoelige adenylaat-cyclasen [ACs; enzymen van belang bij het energie-metabolisme] en dus cAMP-expressie en -funktie [cyclisch AMP; een signalisering-molekule]. Zo zouden bv. geïsoleerde cel-types, waarvan werd aangetoond dat ze calcium-sensitieve cel-regulerende mechanismen vertonen bij CVS-patiënten, voor verdere opheldering van TRP ion-kanalen en de waarschijnlijke gevolgen bij CVS kunnen zorgen. Bovendien dienen bevolking-analyse van TRP-SNPs wat betreft vatbaarheid voor CVS, alsook onderzoek van de voorgestelde subtypes, te worden overwogen. Dit zal waarschijnlijk van aanzienlijk belang blijken voor de publieke gezondheid, alsook voor researchers bij het bepalen van de rol van TRP ion-kanalen bij de CVS-symptomatologie, -ernst en -voorbestemdheid.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: