M.E.(cvs)-wetenschap

december 28, 2014

Stress verandert expressie & methylatie van perforine bij CVS

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 2:09 pm
Tags: , , , , , , ,

Uit ‘DNA-methylatie modificaties geassocieerd met CVS’ onthielden we dat er een toegenomen aanwezigheid is van differentieel gemethyleerde genen gerelateerd aan de immuun-respons, het cellulair metabolisme en kinase-aktiviteit. Genen geassocieerd met immuun-cel regulering, de grootste gecoördineerde aanrijking van differentieel gemethyleerde mechanismen, vertoonden hypo-methylatie in promoters en andere gen-regulerende elementen bij M.E.(cvs). Epigenetische modificaties, zoals DNA-methylatie, die voornamelijk voorkomen op de cytosines van CpG dinucleotide sites (CpG) doorheen het genoom, zouden gen-expressie kunnen reguleren zonder de onderliggende gen-sequentie te wijzigen en optreden door genetische en milieu-factoren.

De onderzoek-groep van het CDC die onderstaande studie uitvoerde had blijkbaar eerder al bevindingen in die richting gedaan, meer bepaald dat er een link zou kunnen zijn tussen epigenetica (voor wat meer algemene achtergrond, zie ook: ‘Genetica & epigenetica van vermoeidheid’) en de dysfunkties qua ‘natural killer’ cellen. De resultaten werden echter pas een jaar na publicatie aan het algemeen publiek bekend gemaakt…

Bij het aanvallen van cellen door cytotoxische T-cellen en NK-cellen komt ook het enzyme perforine vrij; dat porieën boort in het celmembraan. De porie-achtige strukturen vergemakkelijken de toegang van granzymen in de target-cel en deze aktiveren meerdere apoptose (geprogrammeerde cel-dood) -mechanismen die het effektief doden van de target-cel verzekeren. Perforine en granzymen bleken verminderd in NK- én CD8+T-cellen bij M.E.(cvs).

Lees hier meer over de verminderde funktie van NK-cellen bij M.E.(cvs) en de mogelijke rol van een daling qua perforine-gehalte in de pathogenese van CVS: ‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS? & Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS.

In het stuk ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ wordt gemeld dat basale expressie-niveaus van perforine significant verhoogd bleken bij M.E.(cvs) in vergelijking met de controle-populatie. Uit de studie hieronder komt naar voor dat PRF1-expressie significant lager is bij M.E.(cvs)-individuen dan bij niet vermoeide-controles onmiddellijk na een psychosociale belasting. Bij het CDC wordt stress nogal snel gelimiteerd tot psychologische stress. Ook inspanning is een stress en wij vragen ons dan ook af hoe de resultaten zouden zijn mocht men dergelijke metingen doen na een inspanningtest…

————————-

Genet Epigenet. (2013) 5: 1-9

Acute psychosocial stress-mediated changes in the expression and methylation of perforin in Chronic Fatigue Syndrome

Virginia R. Falkenberg, Toni Whistler, Janna R. Murray, Elizabeth R. Unger & Mangalathu S. Rajeevan

Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Samenvatting

Perforine (PRF1) is essentieel voor immuniteit-bewaking en er zijn studies die rapporteren over verminderd perforine bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), een ziekte die mogelijk geassocieerd is met stress en/of infektie. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST) als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress en evalueerden het effekt op PRF1-expressie en methylatie bij CVS-patiënten (n = 34) vergeleken met NF (n = 47) controles. Tijdens de TSST bleken ‘natural killer’ (NK) cellen significant verhoogd bij CVS- (P ≤ 0.0001) en NF-individuen (P ≤ 0.0001). Anders dan bij eerdere rapporten, was er geen significant verschil qua PRF1-expressie bij baseline of tijdens TSST tussen CVS en NF. PRF1-expressie in vol-bloed verhoogde echter 1,6 maal tijdens de TSST bij CVS (P = 0.0003) en NF (P ≤ 0.0001). Verder was de piek-respons onmiddellijk na de TSST lager bij CVS vergeleken met NF (P = 0.04). Daarnaast was de PRF1-expressie 1,5 uur na de TSST verhoogd bij CVS in vergelijking met NF (vol-bloed: P = 0.06; PBMC: P = 0.02). Methylatie van 7 CpG-sites in het methylatie-gevoelige gebied van de PRF1-promoter varieerde tussen 38% en 79%, zonder significante verschillen tussen CVS en NF. Hoewel de gemiddelde baseline methylatie van alle 7 CpG-sites niet verschilde tussen de CVS- en de NF-groep, was er een significante negatieve correlatie met PRF1-expressie op alle TSST-tijdstippen bij zowel CVS (P ≤ 0.0001) en NF (P ≤ 0.0001). Bij de deelnemers met een hoge gemiddelde methylatie (≥ 65%), was de PRF1-expressie significant lager bij CVS-individuen dan NF-controles onmiddellijk na TSST. Deze bevindingen suggereren dat methylatie mogelijks een belangrijke epigenetische determinant is voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie, en dat de verschillen qua PRF1-expressie en methylatie tussen CVS en NF bij de acute stress-respons verder onderzoek vereisen.

Inleiding

Stress, zowel lichamelijk of psychosociaal, leidt tot aktivatie van de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPA) as en de afgifte van cortisol. Studies bij het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) identificeerden een verminderde cortisol-respons bij ontwaken die voortkomt uit glucocorticoïden-resistentie, hypersensitiviteit voor de negatieve feedback werking van cortisol of gewijzigde serotonerge aktivatie van de hypothalamus. Naast deze HPA-as bevindingen werden bij CVS veranderingen qua immuun-funktie gedocumenteerd. Deze omvatten een verschuiving van Th1- naar Th2-type T-cel responsen [Torres-Harding S, Sorenson M, Jason LA, Maher K, Fletcher MA. Evidence for T-helper 2 shift and association with illness parameters in Chronic Fatigue Syndrome. Bull IACFS ME (2008) 16: 19-33] en gereduceerde cytotoxische aktiviteit van ‘natural killer’ (NK) en CD8+ cytotoxische T-cellen [Brenu EW, van Driel ML, Staines DR et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. (2011) 9:81 – zie ‘Immunologische abnormaliteiten als potentiele biomerkers bij M.E.(cvs)’ /// Maher KJ, Klimas NG, Fletcher MA. Chronic Fatigue Syndrome is associated with diminished intracellular perforin. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505-11]. Stress kan het immuunsysteem beïnvloeden via zijn interakties met de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel (SZS). Er werd verhoogde SZS-aktiviteit aangetoond bij CVS en dit zou de gereduceerde cytotoxiciteit kunnen beïnvloeden door het onderdrukken van Th1 en versterken van Th2 T-cel responsen, resulterend in gereduceerde cytotoxiciteit aktiviteit bij mensen en muizen. Perforine is een porie-vormend proteïne dat samenwerkt met granzymes en caspases om apoptose in doelwit-cellen te induceren, en verminderde perforine-expressie of -werking resulteert in verminderde cytotoxiciteit van NK en CD8+ T-cellen. Aangezien perforine belangrijk is voor de cytolytische aktiviteit van NK en cytotoxische CD8+ T-cellen, zou stress-regulering van het immuunsysteem gedeeltelijk gemedieerd kunnen worden via perforine. Studies door 3 verschillende groepen identificeerden verminderd perforine bij CVS-individuen. Een daling (maal 8) van perforine (PRF1) boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd geïdentificeerd via ‘differential display’ Polymerase Ketting Reaktie (PCR) [techniek om veranderingen in gen-expressie op mRNA niveau te vergelijken en identificeren]. Verminderde werking of expressie van PRF1 bij CVS-patiënten werd herhaaldelijk aangetoond; in het algemeen is verminderd intracellulair perforine-proteïne gecorreleerd met PRF1 mRNA downregulering, hoewel één studie vond dat gereduceerde cytotoxiciteit voorkwam bij toegenomen PRF1 mRNA expressie. Studies geven aan dat methylatie een rol speelt bij de regulering van PRF1-expressie. Hypo-methylatie van de PRF1-promoter, bijzonderlijk in het methylatie-gevoelige gebied (MSR), bleek geassocieerd met verhoogde expressie van PRF1. In vitro testen toonden aan dat 70% van de totale PRF1 mRNA expressie zou kunnen gereduceerd zijn door methylatie van de 7 CpG-sites in het MSR. Daarenboven leidde behandeling van T-cellen met een methylatie-inhibitor, 5-azacytidine, tot verhoogde PRF1 mRNA expressie.

Stress-regulering van perforine werd nog niet direct onderzocht. We hypothiseren dat stress de regulering van PRF1-expressie kan beïnvloeden, en dat deze regulering zal verschillen tussen CVS en niet-vermoeide (NF) controles. We gebruikten de Trier Sociale Stress Test (TSST), een erkende en gevalideerde methode om de stress-respons te bestuderen via aktivatie van het sympathisch zenuwstelsel en de HPA-as, als een gestandaardiseerde acute psychosociale stress, en evalueerden het effekt ervan op PRF1-expressie en methylatie bij CVS (n = 34) in vergelijking met NF (n = 47) deelnemers.

Materialen & Methodes

Individuen

[…] Deze studie omvatte 81 individuen (34 CVS en 47 NF) uit een follow-up bevolking-studie naar CVS in Georgia (V.S.) die de TSST ondergingen als onderdeel van een 3-dagen durende studie […]. De CVS-gevallen voldeden aan de 1994 internationale research-definitie voor CVS (evaluatie d.m.v. gestandaardiseerde vragenlijsten, inclusief de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’, de ‘SF-36® Health Survey’ en de ‘CDC Symptom Inventory’. Er waren geen statistische verschillen tussen CVS en NF qua gemiddelde leeftijd (CVS: 45 ± 9 jaar, NF: 46 ± 9 jaar; P = 0.75), geslacht (CVS: 82% vrouwen, NF: 77% vrouwen; P = 0.53), ras (CVS: 76% Kaukasisch; NF: 85% Kaukasisch; P = 0.23) of BMI (CVS: 28 ± 5, NF: 26 ± 5; P = 0.075).

Trier sociale stress test

De TSST werd uitgevoerd om stress-geïnduceerde regulering van neuro-endocriene, autonome en immuun-responsen te bepalen. De TSST werd consistent op hetzelfde tijdstip van de dag gestart om een gelijkaardige diurnale [de dagelijkse cyclus volgende] respons voor alle deelnemers te verzekeren. De test bestaat uit een voorbereidende en anticipatie-fase (start om 1:15 pm) gevolgd door 10 min. spreken voor een publiek en een mentale rekenkundige test van 10 min. voor 3 getrainde staf-medewerkers (het TSST-panel, 1:30 pm tot 1:50 pm). Er werd een katheter voor bloedafname ingebracht om 7:30 am. Er werd bloed afgenomen voor micro-array analyse om 8:00 am en om 1:00 pm (baseline), alsook onmiddellijk vóór het TSST-panel om 1:30 pm, onmiddellijk ná het TSST-panel om 1:50 pm, en op opéénvolgende 15 minuten intervallen tot 3:05 pm. Er werd ook bloed afgenomen voor PBMC-isolatie om 10:00 am (3,5 uur vóór de TSST) en om 3:05 pm (1,5 uur ná de TSST). Er werden ook cel-tellingen gedaan.

DNA/RNA-extractie

Micro-array procedure

Kwantitatieve ‘reverse’ transcriptie PCR (qRT-PCR)

Kwantitative methylatie via bisulfiet-pyrosequentie-bepaling

Bioinformatische analyse van het PRF1 MSR [methylatie-gevoelige gebied]

Statistische analyse

Resultaten

Impact van TSST op bloedcel-tellingen en PRF1-expressie

Er was een significante toename in globaal percentage NK-cellen bij CVS- (P < 0.0001) en NF- (P < 0.0001) individuen tijdens de TSST, zonder significant verschil tussen de groepen. Ook de andere cel-type percentages (neutrofielen, T-cellen en B-cellen) verhoogden in respons op TSST en verschilden niet met betrekking tot ziekte-status (gegevens niet getoond).

Micro-array analyse van vol-bloed toonde een significante toename qua PRF1-expressie tussen de introductie/voorbereiding-fase en onmiddellijk vóór de TSST mondelinge presentatie (1:00 pm-1:30 pm) van ca. 1,6 maal in NF (P < 0.0001) en CVS (P = 0.0003). PRF1-expressie bleef stijgen bij NF-individuen tijdens de TSST mondelinge presentatie (1:30-1:50 pm) terwijl de expressie lichtjes daalde bij de CVS-individuen, resulterend in een significant verschil tussen NF- en CVS-individuen (P = 0.04) om 1:50 pm. Gedurende de 45 min. na de TSST, daalde de PRF1-expressie en keerde terug naar baseline waarden in beide groepen (om 2:35 pm). PRF1-expressie bij NF-individuen bleef afnemen maar nam toe bij CVS-individuen, resulterend in 1,3 maal hogere expressie bij CVS i.v.m. NF op dat moment (P = 0.06).

PRF1-expressie om 10:00 am en 3:05 pm in PBMCs – bepaald via qRT-PCR – was over het algemeen consistent met de resultaten van de vol-bloed micro-array. PRF1-expressie in PBMCs verschilde niet tussen CVS en NF om 10:00 am, maar om 3:05 pm was de PRF1-expressie hoger bij CVS dan NF (1,4 maal; P = 0.02).

Impact van TSST op PRF1-methylatie

Site-specifieke CpG-methylatie in het MSR om 10 am varieerde tussen 38% en 79%, en steeg op alle 7 CpG-sites met 2,1% tot 4% na de TSST (om 3:05 pm) voor de ganse studie-populatie (P < 0.0001 tot P = 0.01). Bij CVS-individuen was de toename qua methylatie na TSST echter significant voor slechts 2 CpG-sites, terwijl bij NF-controles de stijging significant was voor 4 CpG-sites. Er waren geen significante globale verschillen tussen CVS en NF in termen van site-specifiieke methylatie of gemiddelde methylatie voor alle 7 CpG-sites voor of na de TSST.

Impact van PRF1-methylatie op zijn expressie

Om te impact te onderzoeken van PRF1-methylatie op PRF1-expressie, bekeken we correlaties tussen gemiddelde methylatie van de 7 CpG-sites en gen-expressie voor elke deelnemer en tijdstip in vol-bloed en PBMCs. De gemiddelde baseline methylatie (10:00 am) was negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed op alle 8 tijdstippen in CVS en NF, statistisch significant voor alle tijdstippen uitgenomen één bij NF (2:35 pm). De gemiddelde methylatie om 3:05 pm was ook negatief gecorreleerd met PRF1-expressie in vol-bloed om 3:05 pm bij NF- en CVS-individuen, hoewel de correlatie niet significant was bij CVS. Er werden gelijkaardige negatieve correlaties tussen PRF1-methylatie en PRF1-expressie in PBMCs geobserveerd bij NF- en CVS-individuen.

We gebruikten lineaire regressie om het verband te kwantificeren tussen PRF1 gemiddelde methylatie om 10:00 am en vol-bloed PRF1-expressie op alle tijdstippen. Bij CVS-individuen voorspelde deze analyse een stijging van 3% qua PRF1-expressie […] bij elke 1% toename van de PRF1-methylatie […]. Er werd een gelijkaardig omgekeerd verband gevonden bij NF-individuen, maar 31% en 14% van de variantie qua PRF1-expressie werd verklaard door PRF1-promoter methylatie bij CVS en NF, respectievelijk.

We gebruikten de mediane opsplitsing van het gemiddeld methylatie-niveau van de 7 CpG-sites om 10:00 am om de individuen te categoriseren met hoge (≥ 65%) en lage (< 65%) methylatie. Vol-bloed PRF1-expressie was significant hoger in de lage-methylatie groep op alle TSST tijdstippen (P-waarde van 0.0002 tot 0.05). Wanneer de groepen met hoge- of lage-methylatie werden gestratificeerd op basis van ziekte, werd enkel om 1:50 pm (onmiddellijk na TSST) een significant verschil opgemerkt tussen CVS en NF. De CVS hoge-methylatie groep had een significant lagere PRF1-expressie dan de NF hoge-methylatie groep (P = 0.005).

Bespreking

Deze studie toont aan dat acute psychosociale stress een impact heeft op PRF1 gen-expressie en dat PRF1-methylatie bijdraagt tot individuele verschillen qua PRF1-expressie. De PRF1-expressie steeg ca. 1,6 maal (t.o.v. baseline) in respons op TSST en dit niveau van verandering valt binnen de relatieve perforine-expressie verandering die wordt gezien bij andere paradigma’s. De piek PRF1-expressie in respons op TSST was echter verminderd bij CVS– t.o.v. NF-individuen (P = 0.04). NK-cellen namen af in respons op de TSST bij CVS en NF, en aangezien PRF1-expressie grotendeels beperkt blijft tot NK-cellen, is het waarschijnlijk dat de toegenomen expressie van PRF1 in respons op de TSST gerelateerd kan zijn met NK-cel aantallen. Aangezien we de heterogeniteit qua NK-cellen naar gelang hun ontwikkeling niet beschreven, kunnen we niet onderscheiden of alle NK-cellen of slechts een deel van de rijpe NK-cellen bijdroegen tot de PRF1-expressie na TSST. Verdere analyses gebruikmakend van aangerijkte NK-cellen zijn nodig ter evaluatie van de toename qua PRF1-expressie in termen van transcript-copieën/cel, en het verband met NK-cel heterogeniteit in respons op acute stress.

We vonden ondersteuning voor het feit dat methylatie een regulering-mechanisme van PRF1-expressie is, aangezien er een significante negatieve correlatie bestond tussen de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites in de PRF1-promoter en zijn expressie. We zagen dit verband op alle TSST-tijdstippen, wanneer de methylatie op een continue schaal werd uitgezet of gecategoriseerd op basis van alge of hoge status. Op basis hiervan is het mogelijk dat ontbreken van een significant verschil qua gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites tussen CVS en NF zou kunnen bijdragen tot het ontbreken van een verschil qua PRF1-expressie tussen CVS en NF in deze studie. Onze resultaten suggereren dat methylatie een belangrijke epigenetische determinant voor inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie zou kunnen zijn en zodoende dat de gemiddelde methylatie van alle 7 CpG-sites verantwoordelijk kan zijn voor de gerapporteerde discrepanties (stijging, daling of geen verandering) qua PRF1-expressie bij verschillende CVS-studies. Deze resultaten impliceren verder het belang van het meten van PRF1-methylatie én -expressie voor het begrijpen van de mechanismen van PRF1-expressie bij immuniteit-bewaking. Hoewel er geen verschil was qua methylatie-niveaus tussen CVS en NF, vertoonden deze groepen enkele verschillen wat betreft het verband tussen methylatie en expressie, onmiddellijk na TSST (1:50 pm) en op het laatste tijdstip na TSST (3:05 pm). Het lijkt er op dat om 1:50 pm (na de TSST), een subgroep CVS-individuen met hoge baseline methylatie (10:00 am) in het MSR bijdroeg tot de afgestompte respons qua PRF1-expressie in vergelijking met NF-individuen. Op het laatste tijdstip na de TSST (3:05 pm) wanneer PRF1-expressie significant steeg bij CVS (zowel vol-bloed als PBMCs), werd zijn negatieve relatie met methylatie op het dichtste tijdstip (3:05 pm) niet-significant. Een verklaring voor de ziekte-specifieke verschillen die werden gezien in deze studie blijkt ingewikkeld. We focusten ons op het verband tussen PRF1-promoter methylatie en mRNA, maar er zouden veel andere mechanismen kunnen betrokken zijn om de expressie van PRF1 te reguleren, inclusief een GRE [glucocorticoïd responsief element; korte DNA-sequentie in de promoter van een gen dat kan binden met de glucocorticoïd receptor] en de op IL-2 reagerende regulering van ‘enhancers’ [enhancer = kort stuk DNA dat kan binden met proteïnen (aktivatoren) om transcriptie van (een) gen(en) te aktiveren] in de PRF1-promoter. Er zijn ook mechanismen waarbij post-transcriptionele, post-translationele en circadiane regulering van PRF1 betrokken zijn, die kunnen bijdragen tot de differentiële expressie of aktiviteit.

Er zijn meerdere beperkingen bij deze studie. De grootte van de groep is beperkt, hoewel deze vergelijkbaar is met eerdere studies die gebruik maken van de TSST. De deelnemers aan de studie werden gescreend op medicatie en niemand gebruikte immunosuppressors. De impact van medicijnen op HPA-as responsiviteit, als er al één is, is echter onbekend. Hoewel statistisch significant, waren de geobserveerde verschillen (2.6%-6.8%) qua CpG-site specifieke methylatie in het MSR tussen pre- (10:00 am) en post- (3:05 pm) TSST stalen klein, mogelijks verstoord door de mengeling van cel-types aanwezig bij PBMCs. Het methylatie-profiel van het PRF1 MSR in deze studie (81 individuen) was verschillend van een eerdere studie (5 individuen), mogelijks omwille van een substantieel verschil tussen deze studies wat betreft het aantal stalen. Eén van de belangrijke vragen is echter of het klein percentage veranderingen qua methylatie dat werd gezien bij deze studie een belangrijk biologisch mechanisme voor de regulering van PRF1-expressie is. Enkele studies suggereren dat kleine wijzigingen qua DNA-methylatie (2%-10%) zich inderdaad kunnen vertalen naar veranderingen (1,5- tot 32 maal) qua gen-expressie. [geen studies bij M.E.(cvs)-patiënten maar bv. hartfalen] Hoewel deze gerapporteerde schattingen van de impact van DNA-methylatie op expressie aanzienlijk variëren afhankelijk van het gen, weefsel, milieu en statistische analyse, komt onze schatting van een 3% toename qua PRF1-expressie met elke 1% afname qua methylatie overéén met de schatting van de impact of FXN [gen coderend voor het mirochondriaal proteïne frataxine] -methylatie op zijn expressie. Deze resultaten ondersteunen de visie dat subtiele epigenetische wijzigingen de gen-expressie kunnen beïnvloeden in respons op de omgeving.

Besluit

We documenteerden een toename qua PRF1-expressie die evenwijdig loopt met een verhoging van NK-cellen in respons op acute psychosociale stress, waarbij patiënten met CVS een afgestompte respons vertoonden vergeleken met NF-controles. Deze afgestompte expressie bij CVS zou kunnen verband houden met de hoge baseline PRF1-promoter methylatie die een belangrijke epigenetische determinant bleek voor de inter-individuele verschillen qua PRF1-expressie. Er zijn verdere studies nodig om deze resultaten te bevestigen en verklaringen voor de geobserveerde PRF1-expressie dynamiek te evalueren. Het zal ook interessant zijn de signaal-transductie die resulteert in perifere influx van NK-cellen te onderzoeken, alsook PRF1-expressie en zijn funktionele rol in de context van acute stress, en de molekulaire mechanismen te identificeren die overéénkomen bij stress en infektie.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: