M.E.(cvs)-wetenschap

november 1, 2014

Gebruik van SNPs om gen-expressie te onderscheiden bij M.E.(cvs)-subtypes

Filed under: Genetica — mewetenschap @ 8:10 am
Tags: , , ,

Prof. Jonathan Kerr, destijds verbonden aan de afdeling Cellulaire & Molekulaire geneeskunde van de St. George’s University of London, publiceerde in 2008, samen met onderzoekers van andere universiteiten en ziekenhuizen het artikel: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (in J Infect Dis (2008) 197: 1171-84; en zie ook Curr Rheumatol Rep (2008) 10: 482-491). Daarin werd gen-expressie in perifeer bloed van 25 M.E.(cvs)-patiënten onderzocht. De genen met veranderde expressie (t.o.v. gezonde bloed-donoren) werden via een tweede methode verder geanalyseerd bij 55 M.E.(cvs)-patiënten. Er werd differentiële expressie gevonden voor 88 genen. Veel voorkomende funkties waren hematologische aandoeningen, immunologische ziekte, kanker, cel-dood, immuun-respons en infektie. De patiënten konden worden onderverdeeld in 7 subtypes.

In een bijkomend artikel (Kerr JR, Burke B, Petty R et al. Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol (2008) 61: 730-9) wordt gerapporteerd hoe van elk M.E.(cvs)-subtype die genen werden geïdentificeerd waarvan de expressie significant verschilde van normale bloed-donoren, en hoe gen-interakties, associaties met ziekten en molekulaire & cellulaire funkties van die genen-sets werden bepaald. Er werden enkele gemeenschappelijke (neurologische, hematologische, kanker) en enkele afzonderlijke (metabole, endocriene, cardiovasculaire, immunologische, inflammatoire) ziekte-associaties voor subtypes gevonden.

Gegevens uit de eerste studie werden later – door een team waartoe hij zelf ook behoorde – bevestigd bij 62 nieuwe M.E.(cvs)-patiënten (Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Pathol (2009) 63:156-64).

Ook de Schotse onderzoekers John Gow, Peter Behan & Abhijit Chaudhuri (A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome. BMC Medical Genomics (2009) 2:38) vonden “verschillen in gen-expressie verspreid over het ganse genoom tussen post-infektueuze, niet-psychiatrische mannelijke patiënten met CVS en gezonde controles” (zie Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’) maar zijn merkten op dat er een “gebrek aan correlatie tussen verschillende publikaties over gen-arrays” is. Zij stipten aan: “een micro-array is een moment-opname en niet noodzakelijk het chronische biologische proces inherent aan de aandoening weerspiegelt”.

Het bleef geruime tijd stil rond dit alles maar hier rapporteert Prof. Kerr over zijn vervolg-onderzoek met een andere, wellicht meer reproduceerbare techniek. Hij onderzocht kleine mutaties – ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) – in genen met differentiële expressie bij M.E.(cvs) en vond er die significant geassocieerd zijn met de ziekte en met afzonderlijke subtypes. Het vinden van deze SNPs zou kunnen leiden tot het ontwikkelen van een subtype-specifieke diagnostische test. Over de betekenis van de ‘aangetaste’ genen / transcriptie-factoren wordt (nog) niet gespeculeerd.

Het onderzoek werd mede gefinancierd door ‘ME Research UK’.

————————-

J Clin Pathol (Publicatie September 2014)

Use of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) to distinguish gene expression subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME)

Nana Shimosako (1), Jonathan R Kerr (1,2)

1 CFS Group, Department of Cellular & Molecular Medicine, St George’s University of London, London, UK

2 Escuela de Medicina y Ciencias de Salud, Universidad del Rosario, Bogota, Colombia

Samenvatting

Doelstellingen We rapporteerden eerder over gen-expressie veranderingen bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/M.E.) en het feit dat dergelijke gen-expressie gegevens kunnen worden gebruikt om subtypes van CVS/M.E. met afzonderlijke klinische fenotypes te identificeren. Omwille van moeilijkheden bij het gebruik van een vergelijkende gen-expressie methode als hulpmiddel bij de diagnose van CVS/M.E. en de subtypes, hebben we geprobeerd een dergelijke methode gebaseerd op ‘single-nucleotide’ polymorfisme (SNP) analyse te ontwikkelen.

Methodes Om SNP-allel associaties met CVS/M.E. en CVS/M.E.-subtypes te identificeren, hebben we genomisch DNA getest van patiënten met CVS/M.E. (n = 108), patiënten met endogene depressie (n = 17) en normale bloed-donoren (n = 68) op 504 menselijke SNP-allelen gelokaliseerd in 88 met CVS geassocieerde menselijke genen gebruikmakend van een SNP genotypering test. 360 ‘afkomst informatieve merkers’ (AIM) werden ook onderzocht.

Resultaten 21 SNPs bleken significant geassocieerd met CVS/M.E. vergeleken met depressie en normale controle. 148 SNP-allelen vertoonden een significant verband met één of meer CVS/M.E.-subtypes. Voor elk subtype hadden de geassocieerde SNPs de neiging zich te groeperen in afzonderlijke genen. AIM SNPs gaven aan dat 4 individuen van Aziatische origine waren en de rest Kaukasisch. Hiërarchisch clusteren van de AIM-data onthulde het verwantschap tussen 2 koppels patiënten met CVS en bevestigde de globale heterogeniteit van alle individuen.

Besluiten Deze studie levert bewijs dat menselijke SNPs gelokaliseerd in met CVS/M.E. geassocieerde genen gerelateerd zijn met afzonderlijke genomische subtypes van CVS/M.E. Er is verder werk vereist om dit te ontwikkelen tot een klinisch bruikbare subtype-specifieke diagnostische test.

Inleiding

[…] De precieze onderliggende ziekte-mechanismen en manieren waarop de abnormaliteiten verband houden bij patiënten met CVS/M.E. moeten nog worden opgehelderd.

We hebben eerder gerapporteerd over de differentiële expressie van 88 menselijke genen bij CVS/M.E. die werden geïdentificeerd m.b.v. een omvangrijke micro-array [‘gen-chips’] studie met bevestiging van de of genen via ‘real-time’ PCR. [Kerr JR, Petty R, Burke B et al. Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME). J Infect Dis (2008) 197: 1171-84] Deze gegevens werden later geconfirmeerd in een follow-up studie. [Zhang L, Goudh J, Christmas D et al. Microbial infections in eight genomic subtypes of Chronic Fatigue syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Clin Pathol (2009) 63:156-64] Clusteren van gen-expressie gegevens onthulde 8 genomische CVS/M.E.-subtypes met duidelijke verschillen qua Short Form-36 (SF-36) scores, klinische fenotypes, ziekte-graad en geografische distributie.

Het werd al erkend dat CVS/M.E.-subtypes bestaan en er wordt gedacht dat dergelijke subtypes, ten minste gedeeltelijk, de afzonderlijke etiologische factoren kunnen weerspiegelen. [Jason LA, Corradi K, Torres-Harding S et al. Chronic Fatigue Syndrome: the need for subtypes. Neuropsychol Rev (2005) 15: 29-58] Een op symptomen gebaseerde benadering heeft wat succes gekend wat betreft de identificatie van musculoskeletale, inflammatoire en neurologische subtypes; deze groepen vertoonden echter slechts kleine verschillen in algemene funktionele ernst in tegenstelling met deze van onze gen-expressie studies.

Hoewel het intrigerend is dat dergelijke subtypes kunnen worden geïdentificeerd door gebruik te maken van gen-expressie methodes, is het onwaarschijnlijk dat zo’n benadering bruikbaar zou kunnen zijn in de klinische praktijk om dergelijke subtypes te identificeren, aangezien het moeilijk is referentie-waarden te definiëren voor elk gen bij elk subtype. Daarom probeerden we zo’n test te bekomen gebruikmakend van ‘single-nucleotide’ polymorfismen (SNPs) gelokaliseerd in de 88 met CVS/M.E. geassocieerde genen. Deze studie toont aan dat er 148 menselijke SNPs waren die significante associaties hadden met één of meer CVS/M.E. genomisch subtype. Hoewel deze studie geen robuust subtype-differentiërende test voorstelt, bieden de resultaten bewijs dat zo’n benadering haalbaar is.

Methodes

Recrutering van indviduen en klinische karakterisatie

CVS/M.E.-patiënten (n = 108) Fukuda diagnostische criteria. 6 na Q-koorts; de rest idiopathisch. Majeure psychiatrische ziekte uitgesloten, alsook drug- of alkohol-misbruik […]. De patiënten maakten deel uit van een eerder gepubliceerde studie over gen-expressie waar ze een genomisch subtype was toegewezen. [zie Zhang et al. hierboven]

[…]

[…] Lichamelijke en mentale vermoeidheid werd bepaald d.m.v. de Chalder vermoeidheid-schaal [niet de meest geschikte voor M.E.(cvs)], mate van invaliditeit vai de ‘Medical Outcomes Survey SF-36’; symptomen werden gekarakteriseerd d.m.v. de ‘Somatic and Psychological Health Report’; slaap-abnormaliteiten d.m.v. de ‘Pittsburgh Sleep Questionnaire’; en type en ernst van de pijn d.m.v. de ‘McGill Pain Questionnaire’.

[…]

Bloed-afname en DNA-extractie

[…]

Totaal-genoom amplificatie

[…]

Afkomst informatieve merkers

Om de DNA-stalen te screenen op test-prestaties vóór het uitvoeren van de genotypering en wat informatie te verkrijgen betreffende de afkomst van elk individu, gebruikten we 360 SNPs gekozen als genomische controles die wellicht niet met ziekte geassocieerd zijn.

SNPs in CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen

We zochten naar SNPs in de promoter- en coderende gebieden (inclusief introns [overbodige, niet-coderende stukken] in 88 menselijke genen die eerder differentiële expressie bleken te vertonen bij CVS/M.E.-patiënten vergeleken met normale bloed-donoren. Zo selekteerden we 504 SNPs voor de analyse: 1-8 SNPs per CVS/M.E.-geassocieerd menselijk gen.

SNP-genotypering test

Van de te testen SNPs (360 afkomst informatieve merkers (AIM) SNPs & 504 CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs) werd het waarschijnlijk succes van elk SNP voor het ontwikkelen van een test bepaald. Enkel SNPs met een goede waarschijnlijkheid op succes werden verder bekeken.

[…]

Mogelijke invloed van CVS/M.E.-geassocieerde SNPs op eerdere gen-expressie resultaten

[voor techneuten:] We onderzochten elk van de SNPs die geassocieerd bleken met CVS/M.E. op hun positie t.o.v. de zogenaamde ‘interrogatie-positie’ van de sondes die worden gebruikt in de gen-expressie array. Deze ‘interrogatie-positie is het nucleotide dat doelbewust werd gemuteerd in de ‘mismatch’ sonde-sequentie vergeleken met de perfect gematchte sonde. De mogelijkheid bestaat dat bij een SNP in deze positie, de ‘mismatch’ sonde sterker bindt dan de perfect gematchte sonde […].

Vergelijkende sequentie-analyse voor het detekteren van gewijzigde transcriptie-factor binding-plaatsen

Elk van de 21 SNP loci die CVS/M.E. van depressie / normaal of CVS/M.E. van normaal differentieerden werd onderzocht op mogelijke lokalisatie binnen binding-plaatsen van CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factoren en mogelijke effekten op CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factor (TF) binding op CVS/M.E.-geassocieerde genen. […] (NFKB1 [nucleaire factor NF-kappa-B], NHLH1 [helix-lus-helix proteïne 1], GABPA [GA-bindende proteïne alfa keten], REPIN1 [replicatie initiator 1], EGR1, EGR3 [EGR = ‘early growth response’ proteïne], ETS1 [ETS = familie transcriptie-factoren]) […]

Gegevens-analyse en visualisering

Voor de patiënten met CVS/M.E., werden de CVS/M.E.-geassocieerde SNP haplotypes [genetische varianten; combinaties van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] omgezet naar nummers (AA=1, AB=2, BB=3, waar A = allel A en B is allel B) en geanalyseerd d.m.v. grafische programma’s […]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Individuen

Deze studie omvatte 108 CVS/M.E.-patiënten, 17 patiënten met endogene depressie en 68 normale bloed-donoren. […]

Afkomst informatieve merkers

Er werden gegevens betreffende AIM SNP-allelen verkregen voor alle CVS/M.E.-patiënten, alle patiënten met endogene depressie en 29 van de 68 normale bloed-donoren. Deze gaven aan dat alle normale bloed-donoren en depressie-patiënten van Europese origine waren; alsook alle CVS/M.E.-patiënten, uitgezonderd 4 die van Aziatische origine waren.

Bij onderzoek naar de graad van verwantschap tussen de deelnemers aan de studie bleek dat – met uitzondering van 6 individuen – ze niet nauw verwant waren met elkaar […].

CVS/M.E.-gessocieerd gen SNP-allelen bij CVS/M.E., depressie en normale controles

We vonden dat 21 CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs een frequentie-distributie over de CVS/M.E-., depressie- en normale groepen hadden, die niet als toevallig kan worden beschouwd en die significant was. Interessant was dat 7 van deze SNPs in het BMP2K gen [coderend voor een kinase-enzyme dat een rol speelt bij skelet-ontwikkeling] & 2 in het IL6ST gen [interleukine-6 signaal-transducer; deel van het cytokine receptor complex] lagen. Wat betreft CVS/M.E.-geassocieerd gen SNPs die een onverwachte distributie tussen CVS/M.E. en normalen vertoonden, waren er 10 die significant bleken [Deze worden genoemd maar er wordt verder niet over uitgewijd.].

SNP-allelen bij CVS/M.E.-subtypes

Er waren 148 SNPs met een distributie over de CVS/M.E.-subtypes die niet alles toevallig kan worden beschouwd. Alle 148 werden geïdentificeerd door de allel-distributie in één subtype te vergelijken met deze in alle andere subtypes gecombineerd. […]. De distributie van afzonderlijke SNP-allelen over afzonderlijke CVS/M.E.-subtypes is interessant en toont dat elk subtype geassocieerd is met afzonderlijke SNP-allelen en dat deze SNP-allelen gegroepeerd zijn in afzonderlijke genen voor elk CVS/M.E.-subtype, op die manier dat bv. SNP-allelen in ACTR3 [actine-gerelateerd proteïne 3; maakt deel uit van een complex dat essentieel is voor cel-vorm en -beweeglijkheid] geassocieerd zijn met subtype-F, terwijl SNP-allelen AKAP10 [codeert voor A-kinase anker-proteïne dat gelokaliseerd is in mitochondrieën] geassocieerd zijn met subtype-G [De rest wordt ook opgesomd maar er wordt verder niet over uitgeweid.].

Mogelijke invloed van CVS/M.E.-geassocieerde SNPs op eerdere gen-expressie resultaten

We vonden dat slechts 1 SNP zich in de interrogatie-positie van een sonde-sequentie van één van de 88 CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen bevond. Dit SNP was rs2228431 in het ARSD gen […]. Bij het her-bekijken van de eerder gepubliceerde data-set over gen-expressie bij CVS/M.E. versus normale controles, zagen we dat deze sonde deze resultaten niet beïnvloedde aangezien het werd uitgesloten van de analyse omwille van zijn gebrek aan specificiteit voor het ARSD gen.

Vergelijkende sequentie-analyse voor het detekteren van gewijzigde transcriptie-factor binding-plaatsen

Vergelijkende sequentie-analyse voorspelde dat 4 van de 21 CVS/M.E.-geassocieerde SNPs gewijzigde CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factor binding met CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen vertoonden. [NHLH1, GABPA, REPIN1, ETS1]

Gegevens-analyse en visualisering

[…] Gebruikmakend van de SNP-haplotype gegevens kwam er enige mate van afscheiding van de verschillende CVS/M.E.-subtypes naar voor […]. Deze subgroepen vertoonden 73% correlatie met de gen-expressie subtypes (gegevens niet getoond).

Bespreking

Deze studie werd ondernomen om CVS/M.E.-geassocieerde SNPs te identificeren die voorkomen in de promoter- en coderende sequenties van 88 CVS/M.E.-geassocieerde menselijke genen. Deze 88 menselijke genes werden oorspronkelijk geïdentificeerd via analyse van het perifeer bloed van 55 CVS/M.E.-patiënten en 75 normale bloed-donoren gebruikmakend van uitgebreide gen-expressie micro-array (en bevestiging van de resultaten via ‘real-time’ PCR.

Het is belangrijk te bevestigen dat er geen significante verwantschap onder de individuen – die de resultaten zou verstoren – in de studie werd vastgesteld; dit werd geconfirmeerd via de AIM SNP-allel gegevens van het DNA test-panel. Het is ook belangrijk te verzekeren dat elke gevonden SNP-allel associaties niet het resultaat zijn van een significante over-vertegenwoordiging van een ras vergeleken met de andere in een groep, en dit werd ook uitgesloten door de resultaten van de AIM SNP gegevens.

We hebben getoond dat de allel-frequentie voor elk van de 21 SNPs een statistisch significante en onverwachte verdeling over de CVS-M.E./ depressie/ normale groepen heeft en dat voor 10 van deze 21 SNPs, afzonderlijke allelen geassocieerd zijn met CVS/M.E. vergeleken met normale controles. Hoewel SNP-allel associaties eerder werden gerapporteerd bij CVS/M.E., kan deze lage opbrengst (21 van 504) verrassend lijken gezien het feit dat deze SNP-loci voorkwamen in genen waarvoor differentiële expressie werd gevonden bij CVS/M.E. Deze observatie is echter waarschijnlijk te verklaren door de gekende heterogeniteit van CVS/M.E. in het algemeen en het bestaan van subtypes in deze CVS/M.E.-groep, die werden onthuld gebruikmakend van clustering van de gen-expressie gegevens [zie Zhang L et al.]. Deze subtypes hadden een apart klinisch fenotype en ernst-graad. Deze veronderstelling wordt verder ondersteund door de vondst van 148 SNP-allelen die geassocieerd bleken met één of meer CVS/M.E.-subtypes. De verdeling van afzonderlijke SNP-allelen over afzonderlijke CVS/M.E.-subtypes is interessant. Dit hield echter geen waarneembaar verband met de gen-expressie gegevens voor elk van deze subtypes (gegevens niet getoond) in.

Het is geruststellend dat onze analyse van de lokatie van deze SNPs t.o.v. de sonde-sets van de gen-array, die oorspronkelijk werd gebruikt om de differentiële expressie van deze genen te identificeren, geen significante invloed van de gen-expressie gegevens in het algemeen ondersteunde.

Het feit dat werd voorspeld dat 4 van de SNP-allelen die geassocieerd bleken met CVS/M.E. verminderde binding met CVS/M.E.-geassocieerde transcriptie-factoren zou vertonen [Deze worden genoemd maar er wordt hier verder niet over uitgewijd.], suggereert dat dergelijke mutaties wel eens de gen-expressie signaturen die werden gevonden bij patiënten met CVS/M.E. zouden kunnen beïnvloeden; in het bijzonder omdat bij 3 van de 4, het allel geassocieerd was met de ganse CVS/M.E.-groep en niet enkel één subtype en aangezien deze transcriptie-factoren talrijke binding-plaatsen hebben in de promoter-gebieden van deze genen.

Een mogelijke toepassing van de kennis dat deze SNPs significant verschillende distributie vertonen over de CVS/M.E.-subtypes, is de ontwikkeling van een subset SNPs voor een subtype-specifieke diagnostische test. Dit kan nuttig zijn eens het bestaan van de eerder gepubliceerde gen-expressie CVS/M.E.-subtypes onafhankelijk werd bevestigd en wanneer we meer over ze weten in termen van natuurlijke geschiedenis, triggers, respons op verschillende behandelingen, enz. Een dergelijk op SNPs gebaseerde test is zeer wenselijk vergeleken met een op gen-expressie gebaseerde test aangezien dit robuust en makkelijk reproduceerbaar is; anders dan de vergelijkende gen-expressie methode die werd gebruikt om deze 88 menselijke genen te identificeren. Dit zal echter uitgebreide verdere testen en validering vereisen vooraleer het kan worden aanbevolen voor dit doel.

Tot besluit: in dit artikel rapporteren we over 21 SNP-allelen die significant geassocieerd zijn met CVS/M.E. vergeleken met depressie-patiënten en normale controles, en over 148 SNP-allelen die geassocieerd zijn met één of meer CVS/M.E.-subtypes – waarvan er 27 een p-waarde ≤ 0.05 vertoonden. De grootte van de groep in deze studie, en bijzonderlijk de grootte van elk gen-expressie subtype, is te klein om stevige conclusies te trekken. Als we echter veronderstellen dat deze resultaten kunnen worden gerepliceerd, zou het mogelijk moeten zijn om een subtype-specifieke diagnostische test te ontwikkelen gebruikmakend van een SNP-subset, wat het onderzoek en klinisch management van patiënten met CVS/M.E zou kunnen helpen.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: