M.E.(cvs)-wetenschap

oktober 10, 2014

MicroRNAs in plasma bij CVS/M.E.

Filed under: Diagnostiek — mewetenschap @ 5:55 am
Tags: , , , ,

Onderstaand artikel komt van dezelfde onderzoeksgroep die eerder rapporteerde over veranderingen qua miRNAs in cytotoxische cellen die de funktionele capaciteit van deze cellen kunnen verminderen en de effektieve cytotoxische aktiviteit, samen met andere immuun-funkties bij CVS/ME-patiënten verstoren. Zie ‘Cytotoxische lymfocyten microRNAs – merkers voor M.E.(cvs)’.

‘High-Throughput Sequencing’ is een techniek voor de bepaling van de sequentie (de volgorde van de nucleotiden) van DNA of RNA waarbij er veel materiaal in één keer (geautomatiseerd) kan worden verwerkt. Het wordt ook ‘next-generation sequencing’ genoemd en levert duizenden of miljoenen sequenties terzelfder tijd op. RT-qPCR, ‘reverse transcriptase’-kwantitatieve polymerase ketting-reaktie, is een techniek waarbij met vertrekt van RNA dat via ‘omgekeerde transcriptie’ wordt omgezet in cDNA (complementair DNA) om zo de gen-expressie te bepalen.

————————-

PLoS One. 2014 Sep 19;9(9): e102783

High-Throughput Sequencing of Plasma MicroRNA in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis

Brenu EW (1), Ashton KJ (2), Batovska J (2), Staines DR (3), Marshall-Gradisnik SM (1)

1 School of Medical Science, Griffith Health Centre, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia

2 Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University, Robina, Queensland, Australia

3 The National Centre for Neuroimmunology and Emerging Diseases, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australia; Queensland Health, Gold Coast Public Health Unit, Robina, Gold Coast, Queensland, Australia

Samenvatting

ACHTERGROND: MicroRNAs (miRNAs) reguleren vele biologische processen en hun ontregeling bleek geassocieerd met een waaier aan ziekten inclusief Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis (CVS/ME). De ontdekking van stabiele en reproduceerbare miRNAs in plasma heeft de mogelijkheid verhoogd dat circulerende miRNAs zouden kunnen dienen als diagnostische merkers. De doelstelling van deze studie was het bepalen van de rol van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

RESULTATEN: Gebruikmakend van Illumina ‘high-throughput sequencing’ [HTS] identificeerden we 19 miRNAs met differentiële expressie in het plasma van CVS/M.E.-patiënten vergeleken met niet-vermoeide controles. Na RT-qPCR analyse, waren we in staat de significante upregulering van 3 miRNAs (hsa-miR-127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p [has = Homo sapiens]) bij de CVS/M.E.-patiënten te bevestigen.

BESLUIT: Onze studie is de eerste om circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te identificeren en ook om 3 differentieel tot expressie komende circulerende miRNAs bij CVS/M.E.-patiënten te bevestigen, en zo een basis te bieden voor verdere studie om bruikbare CVS/M.E.-biomerkers te vinden.

Inleiding

[…]. Er is bewijsmateriaal dat een belangrijke ontwrichting van immunologische processen bij CVS/M.E. suggereert en deze zou gekenmerkt kunnen zijn door verminderde cytotoxische aktiviteit en verhoogde regulerende T-cellen [zie onze inleiding]. Daarnaast kunnen patiënten met CVS/M.E. differentiële expressie van mRNA en microRNA (miRNA) genen – die verscheidene fysiologische processen reguleren waarvan is geweten dat ze ontregeld zijn bij CVS/M.E., inclusief cytotoxiciteit, cytokine-secretie en apoptose – vertonen. Ondanks intensieve research wordt de pathofysiologie van CVS/M.E. nog niet volledig begrepen en blijven duidelijke diagnostische biomerkers ongrijpbaar.

MicroRNAs zijn een klasse van kleine (typisch 18-25 nucleotiden groot) enkel-strengige, niet-coderende RNAs die gen-expressie reguleren op post-transcriptioneel niveau [optredend na de overschrijving van DNA naar RNA]. Hun regulerende rollen bleken betrokken bij de meeste biologische processen, ook immunologische, neurologische en fysiologische. Differentiële expressie van miRNAs bleek geassocieerd met meer dan 300 ziekten, waaronder kanker, cardiomyopathieën [hartspier-ziekten], neurologische aandoeningen en onverklaarde aandoeningen zoals CVS/M.E. Er circuleren stabiele en reproduceerbare extracellulaire miRNAs in het bloed en andere bio-vloeistoffen, waar ze werden geïdentificeerd. Er werd voorgesteld dat deze miRNAs het potentieel hebben om te worden aangewend als niet-invasieve nieuwe biomerkers voor ziekte-diagnose en -prognose.

In deze studie gebruikten we ‘high-throughput sequencing’ om het profiel te tekenen van de expressie van circulerende miRNAs. Dit werd gevolgd door bevestigende ‘reverse transcription-quantitative’ PCR (RT-qPCR) om de differentiële miRNA-expressie bij CVS/M.E. te bepalen.

Materialen en Methodes

Deelnemers

CVS/M.E.-patiënten (n = 20, 44,5 ± 6,0 jaar) […]. Inclusie-criteria […] CDC 1994 definitie. Niet-vermoeide controles (n = 20, 47,3 ± 6,7 jaar) […].

Staal-verwerking en RNA-extractie

[…] 10 ml vol bloed […].

MicroRNA-profilering d.m.v. sequentie-bepaling

De 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles met de hoogste hoeveelheid klein RNA werden gebruikt voor HTS. […] cDNA constructie via ‘reverse transcription-PCR’ (RT-PCR) uit klein RNA, zuivering, isolatie van miRNAs en sequentie-analyse […]

Sequentie data-analyse

[…]

Kwantificering van miRNAs d.m.v. RT-qPCR

De expressie van 8 miRNAs werd gevalideerd […]. Daarnaast werd van 4 miRNAs (miR-10, miR-15b, miR-16 & miR-24) bekeken om te zien of ze geschikt zijn als een stabiel referentie-gen. […].

Statistische analyse

[…] Statistische significantie P < 0.05.

Resultaten

Karakteristieken van de individuen

[…] Er waren geen significante verschillen qua leeftijd en tellingen op vol bloed tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen. […] Er werd een significant verschil qua percentages lymfocyten en granulocyten, aantal lymfocyten en distributie-breedte van rode bloedcellen gezien tussen de CVS/M.E.- en controle-groepen [telkens de 6 hierboven vermelde stalen].

HTS van plasma-miRNAs bij CVS/M.E.

Om kandidaat plasma-miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E. te selekteren, voerden we een initiële screening uit naar klein RNA over het ganse genoom bij 6 CVS/M.E.-patiënten en 6 niet-vermoeide controles d.m.v. HTS. [verwerking van de gegevens leidde tot een ‘bibliotheek’] Initiële analyse van de RNA-lengtes in de ‘bibliotheek’ toonde pieken aan bij 22 en 32 nucleotiden. Deze RNA-groepen bleken miRNA en lang niet-coderend RNA (lncRNA) sequenties te bevatten. […] 17% was matuur miRNA, 80,5% was ander RNA (inclusief lncRNA en snoRNA [‘small nucleolar RNA’; klasse van kort enkelstrengig RNA dat tussenkomt bij modificaties van andere RNAs]). 75,1% van het ander RNA bestond uit lncRNA dat gekend staat als ‘Ro-associated’ RNA Y4 (RNY4) [Y RNAs zijn kleine niet coderende RNAs; oorspronkelijk geïdentificeerd als de RNA-component van ribonucleoproteïnen] […]. Bij het bekijken van de unieke RNA-stukken, bestond 44,3% uit miRNA, de andere RNA-soorten uit slechts 7%.

Differentiële expressie van plasma-miRNA bij CVS/M.E.

[…] Een totaal van 19 microRNAs was significant ontregeld bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles. Van die 19 miRNAs waren er 16 waarvan de hoeveelheid als laag werd beschouwd […], hun detektie bleek onbetrouwbaar […]. De overblijvende 3 miRNAs (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) waren allemaal ge-upreguleerd bij CVS/M.E. vergeleken met niet-vermoeide controles.

RT-qPCR bevestiging van de plasma-miRNA sequentie-gegevens

De keuze van een stabiel referentie-gen is kritiek voor accurate gen-expressie analyse via RT-qPCR. Van de 4 vermeende referentie-genen die werden getest, bleek hsa-miR-16-5p de meest stabiele expressie te vertonen. Om de RNA-Seq resultaten (n = 6/groep) te valideren, voerden we RT-qPCR uit bij uitgebreidere groepen (n = 20/groep). Drie miRNAs met differentiële expressie (hsa-miR127-3p, hsa-miR-142-5p & hsa-miR-143-3p) en vier miRNAs met niet-differentiële expressie (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103-3p, hsa-miR-146a-5p & hsa-miR-223-3p) werden geselekteerd en hun expressie gekwantificeerd gebruikmakend van RT-qPCR. De vier miRNAs met niet-differentiële expressie werden geselekteerd omdat ze eerder ontregeld bleken in cytotoxische lymfocyten van CVS/M.E.-patiënten, hoewel HTS geen differentiële expressie in plasma identificeerde. Alle RT-qPCR resultaten voor de overblijvende drie miRNAs waren consistent met de RNA-Seq gegevens.

Bespreking

Screenen op CVS/M.E. is tot nu toe gebaseerd op wel-omschreven definities. Profilering van circulerende miRNAs zou kunnen dienen om de molekulaire diagnose van CVS/M.E. te versterken. Gebruikmakend van Illumina HTS, identificeerde de huidige studie 19 miRNAs met differentiële expressie bij CVS/M.E.-patiënten. Daarvan werden er slechts 3 bevestigd als zeer overvloedig bij de CVS/M.E.-patiënten in vergelijking met controles. Deze resultaten suggereren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p betrokken zouden kunnen zijn bij de pathogenese van CVS/M.E.

Hoewel er momenteel geen definitieve bron werd geïdentificeerd voor de aanwezigheid van miRNAs in bio-bloeistoffen, zouden bloedcellen – in het bijzonder reticulocyten [voorlopers van erythrocyten], myeloïde cellen [differentiëren naar erythrocyten, leukocyten en bloedplaatjes], lymfoïde cellen [differentiëren naar B-, T-, NK- en dendritische cellen], bloedplaatjes – cellen uit de lever, longen en nieren of gelyseerde cellen miRNAs kunnen afgeven in de circulatie. Ook zouden miRNAs in het plasma kunnen worden uitgescheiden na weefsel-schade – circulerend miR-1 & miR-133a zijn bv. significant verhoogd na acuut hart-infarct. De miRNAs in de huidige studie komen tot expressie in verscheidene weefsels. MiR-127-3p wordt gevonden in de testikels en het zenuwstelsel, miR-143-3p komt tot expressie in het colon, terwijl miR-142-5p tot expressie komt in cellen van het immuunsysteem. Er werd echter gerapporteerd dat miR-142-5p & miR-143-3p behoren tot de miRNAs die frequent worden gevonden in plasma en serum. Over-expressie van miR-142-5p werd gezien bij de meeste kanker-gerelateerde en immunologische aandoeningen. Dit miRNA komt overvloedig voor in de meeste haematopoïetische [haematopoïese = vorming van bloedcellen] cel-lijnen en zou betrokken kunnen zijn bij het counteren van inflammatoire processen. Bij Systemische Lupus Erythematosus (SLE) voorkomt verhoogde expressie van miR-142-5p in CD4+ T-cellen auto-immuniteit, terwijl een downregulering zou kunnen leiden tot autoreaktieve T-cellen en hyperaktieve B-cellen.

MiR-142-5p is belangrijk voor T-cel ontwikkeling […]. Inhibitie van miR-142-5p zou de expressie van CD84, IL-10, SAP [met SLAM – ‘signaling lymphocyte activation molecule’ – geassocieerd proteïne, een signaal-overdragend eiwit dat tot expressie komt op immuun-cellen] en IgG-produktie kunnen verhogen. CD84 is een belangrijke T-cel regulerende merker aangezien het cytokine-produktie, funktie, adhesie en interaktie met B-cellen reguleert. De waarden van IL-10 bleken dubbelzinnig bij CVS/M.E.-patiënten. De oorzaak van een stijging qua miR-142-5p is onbekend; het is echter waarschijnlijk dat dit verband zou kunnen houden met verhoogde Treg-suppressie en bijkomende auto-immune responsen.

MiR-143-3p […] is een tumor-suppressor gen en is sterk gedownreguleerd bij dikkedarm-kanker. Het inhibeert het oncogen KRAS [mutatie in het KRAS gen is essentieel voor de ontwikkeling van veel kankers]. Over-expressie van miR-143-3p doet in de meeste kanker-cellen de groei van tumoren en kanker-cellen stagneren aangezien het BCL2 [B-cell lymfoma 2] mRNA kan reduceren, waardoor het de proliferatie van tumor- of kanker-cellen voorkomt en apoptose bevordert. miR-143-3p werd geïdentificeerd als een neutrofiel-specifiek miRNA. Belangrijk: de expressie ervan wordt ge-upreguleerd in gevallen van verhoogde erythropoïese [vorming van rode bloedcellen] zoals bij polycytemie [abnormale toename van het aantal rode bloedcellen in het bloed]. Bij CVS/M.E. komt verhoogde neutrofiel-apoptose voor bij sommige patiënten [Zie: Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS] en dit komt mogelijks voort uit gestegen waarden van miR-143-3p.

MiR-127-3p interfereert met ERK-signalisering [‘extracellular signal-regulated kinases’], een tumor-suppressor, en upregulering bleek apoptose te verhogen. Belangrijk: het richt zich op BCL6 [B-cell lymfoma 6], een transcriptie-factor die p53 expressie verhoogt [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor]. BCL6 inhibeert de produktie van IL-10; daarom: het dempen van BCL6 tengevolge miR-127 upregulering zou kunnen resulteren in significante toenames van IL-10. In CVS/M.E. waren de rapporteringen over IL-10 waarden dubbelzinnig en een over-expressie van miR-127-3p zou in zekere matige sommige van deze patronen kunnen verklaren. BCL6 is een belangrijke transcriptie-factor die nodig is voor ontwikkeling van kiem-centra B-cellen [kiem-centra of ‘germinal centres’ zijn plaatsen in de lymfeknopen en het perifeer lymfe-weefsel waar rijpe B-lymfocyten snel prolifereren] en folliculaire [in de lymfe-klieren] helper T-cellen. Onregelmatigheden in de expressie van BCL6 zouden kunnen leiden tot afwijkende inflammatoire responsen en de ontwikkeling van verscheidene lymfomas.

[De volgende 3 alinea’s bespreken de technische uitdagingen qua methodiek.]

De aanwezigheid van een een hoog perecntage RNA Y4 in bij de kleine RNAs reduceerde de capaciteit van de miRNA sequentie-bepaling. Y RNAs zijn componenten van Ro ribonucleoproteïnen (RNPs) en werden eerst geïdentificeerd in het serum van patiënten met de auto-immune aandoening lupus erythematosus. Y RNAs zijn gelijkaardig qua grootte en struktuur als miRNAs aangezien ze beide vergelijkbare strukturen hebben. Deze overéénkomsten zouden de aanwezigheid van Y RNA na constructie van de kleine-RNA ‘bibliotheek’ kunnen verklaren. Efficiënte depletie van Y RNA zou ‘HTS’ miRNA gegevens van hogere kwaliteit opleveren, leidend tot diepere sequentie-bepaling. Methodes voor het verminderen van Y RNA op een zelfde manier als rRNA-depletie zou aangewend kunnen worden om de ratio van bruikbare miRNA-gegevens te verbeteren. De meeste studies over extracellulair miRNA zeggen niets over de overvloedigheid van Y RNAs in de circulatie […].

Plasma-miRNAs lijken beloftevol als mogelijke niet-invasieve biomerkers maar momenteel zijn de precieze en accurate meting nog een uitdaging. Een aantal factoren, inclusief cellulaire contaminatie, haemolyse en lage kwantitieit, kan leiden tot een vertekend beeld dat de oorspronkelijke biologische toestand van het staal niet weerspiegelt. De huidige research omtrent circulerend miRNA wijst aan dat haemolyse de beschikbaarheid van circulerende miRNAs kan beïnvloeden. Haemolyse kan worden geëvalueerd in gearchiveerde gegevens via het onderzoeken van de delta Cq [methode voor het bepalen van de genormaliseerde concentratie in een staal bij qPCR] van miR-451 en miR-23a. In gezonde individuen kunnen 194 miRNAs worden gedetekteerd in zowel gehaemolyseerde als niet-gehaemolyseerde bloedstalen; 40,2% vertoont upregulering bij haemolyse, 13% downregulering en 28,9% blijkt onveranderd door haemolyse. In de huidige studie zijn onze 3 kandidaat-miRNAs (miR-127-3p, miR-143-3p & miR-142-5p) bij de miRNA-genen die niet veranderen door haemolyse (bij gezonde individuen).

Het voordeel van circulerende miRNAs als biomerkers voor ziekten houdt verband met een aantal kenmerken zoals mindere complexiteit vergeleken met proteïnen, stabiliteit, geconserveerde sequenties bij verscheidene soorten en beperkte expressie in specifieke weefsels en biologische processen. Er werd gesuggereerd dat 206 miRNAs tot expressie komen in bloedcellen, serum en plasma; dus is het bij de meeste plasma- en serum-studies heel erg noodzakelijk strikte staal-verwerking-procedures in acht te nemen om er zeker van te zijn dat de stalen cel-vrij zijn. Contaminatie van bio-vloeistoffen met cellulaire inhoud kan worden beperkt door gebruik te maken van bijkomende centrifugatie-stappen tijdens de initiële plasma-afscheiding om mogelijke contaminatie met cellulair afval en haemolyse te verminderen. Daarnaast kan het belangrijk zijn bloedcel-aantallen en lyse te bepalen tijdens de staalname aangezien variatie qua plasma-waarden van miRNAs in sommige gevallen werd toegeschreven aan de effekten van circulerende bloedcellen. De begin-concentratie van miRNA varieert naar gelang het individu door de leeftijd, het geslacht en andere factoren, en dit kan een significante impact hebben op de uitkomsten van verschillende expressie-studies. Tot op heden zijn er geen vastgelegde referentie-waarden voor miRNAs bij normale individuen en dit kan noodzakelijk zijn wil men ze als diagnostische merker gaan gebruiken; vandaar dat de inclusie van geschikte calibrator-controles tijdens de RT-qPCR analyse noodzakelijk is. Niettemin: ondanks deze uitdagingen zijn miRNA-signaturen van normale individuen reproduceerbaar, met gelijklopende expressie-patronen en een beperkte mate variabiliteit.

Besluiten

De huidige studie suggereert dat plasma een bevredigende parameter zou kunnen zijn voor het bepalen van miRNAs als biomerkers bij CVS/M.E. De gegevens illustreren dat miR-127-3p, miR-142-5p & miR-143-3p mogelijke plasma-biomerkers voor CVS/M.E.-diagnose zouden kunnen zijn. Verdere studies zijn echter vereist om deze bevindingen te valideren bij een grotere groep om de diagnostische kracht van deze bevindingen vast te stellen. De tekortkomingen bij het gebruik van bio-vloeistofen is de minieme hoeveelheid RNA, dus is een grote hoeveelheid staal dikwijls vereist om hoge opbrengsten en kwaliteit van het RNA te verkrijgen. Momenteel staat het gebruik van HTS als een middel om mogelijke veranderingen in miRNAs bij ziekten te detekteren in zijn kinderschoenen. Verdere studies zijn vereist om de methode ter verbetering van de detektie en het verkrijgen van betrouwbare gegevens die over verschillende studies kunnen worden gerepliceerd, te evalueren en verfijnen.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: