M.E.(cvs)-wetenschap

juni 10, 2010

‘Natural Killer’ Cel Funktie & Dipeptidyl Peptidase IV/CD26 – biomerkers voor CVS?

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 11:09 am
Tags: , , , ,

Nancy Klimas en haar team spraken hier al over op conferenties. Ook op deze paginas werd het al aangekondigd (zie ‘Neuropeptide-Y en CD-26’). Het is een belangrijk artikel en bouwt trouwens verder op eerdere resultaten. Met goede verdere studies die deze observaties hopelijk herhalen en waarbij men de NKCC veranderingen met verloop van tijd worden bekeken, zou dit een betrouwbare merker voor ziekte-ernst kunnen zijn als blijkt dat er een duidelijke correlatie tussen NKCC en ziekte-ernst is bij M.E.(cvs). Het eerste artikel van haar i.v.m. immunologische abnormaliteiten bij CVS dateert reeds van 1990! En haar vertrouwdheid met NK-cellen blijkt al van voorheen…

Hoewel Professor Klimas op de ‘Invest in ME conference’ (24 mei 2010) refereerde naar de hieronder besproken (en dat “CD26 lymfocyt aktivatie kan leiden tot de aanmaak van neuropeptide-Y (NPY), dat inwerkt op de adrenaline-responsen in het sympathisch zenuwstelsel, een bevinding die enkele van de symptomen verbonden met dysfunktie van het autonoom zenuwstelsel bij M.E.(cvs) kan helpen verklaren. Een observatie die mogelijkheden biedt tot nieuwe vormen van behandeling.”), wordt in het huidige artikel echter (voorlopig?) niets over neuropeptide-Y vermeld… Wellicht wilde men zich concentreren op de biomerker-kwestie…

Klimas blijft er op wijzen dat NKC-dysfunktie moet worden beschouwd als een consistente bevinding bij M.E.(cvs)-patiënten en ze meent dat er een significant verband is tussen NKC-funktie, en de algemene gezondheid-toestand en funktioneren (vermoeiheid, cognitieve stoornissen) bij M.E.(cvs). ‘Natural Killer’ cel cytotoxiciteit blijkt een subgroep-merker voor ziekte-aktiviteit: (uit het besluit) Mensen met CVS vertonen verminderde funktie van NK-cellen, en abnormale aktivatie van T- en NK-cellen. NKCC en dipeptidyl-peptidase/CD26 werden geïdentificeerd als potentiële biomerkers voor CVS doordat werd aangetoond dat ze nauwkeurig CVS-patiënten van gezonde controles kunnen onderscheiden. Dipeptidyl-peptidase/CD26 op lymfocyten of in serum bleek niet gecorreleerd met NKCC.

PLoS ONE (2010) Volume 5, Issue 5

Biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome: Evaluation of Natural Killer Cell Function and Dipeptidyl Peptidase IV/CD26

Mary A. Fletcher1,2,3#*, Xiao R. Zeng1,2, Kevin Maher1, Silvina Levis1,2, Barry Hurwitz3, Michael Antoni3, Gordon Broderick4, Nancy G. Klimas1,2,3#

1 Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, Miami, Florida, United States of America,

2 Miami Veterans Health Care Centre, Miami, Florida, United States of America,

3 Department of Psychology, University of Miami, Coral Gables, Florida, United States of America,

4 Department of Medicine, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada

Samenvatting

Achtergrond Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) studies in ons laboratorium en van anderen vonden gedaalde ‘natural killer’ cel cytotoxiciteit [NKCC, hebben het vermogen om geïnfekteerde cellen te vernietigen; zie – o.a. – Immuniteit- en haemorheologische wijzigingen bij CVS’] en verhoogd percentage van lymfocyten die de aktivatie-merker dipeptidyl-peptidase IV (DPPIV) – ook bekend als CD26 – tot expressie brengen. Geen van deze bepalingen noch andere laboratorium-testen worden echter algemeen aanvaard voor de diagnose of prognose van CVS. De studie hier was bedoeld te bepalen of NKCC of DPPIV/CD26 diagnostische nauwkeurigheid voor CVS hebben.

Methodes/Resultaten De individuen waren vrouwen en mannen met CVS en gezonde controles. De NK-cel funktie werd gemeten d.m.v. een bio-assay, gebruikmakend van K562-cellen en 51Cr release [zie verder]. Lymfocyten-geassocieerd DPPIV/CD26 werd bepaald via kwalitatieve en kwantitatieve flow-cytometrie. Serum DPPIV/CD26 werd gemeten d.m.v. ELISA. Analyse via ‘receiver operating characteristic’ curve [ROC-curve; grafiek van de gevoeligheid tegen de specificiteit, ROC-analyse is een statistische methode die internationaal gebruikt wordt als toets voor de voorspellende waarde van een variabele of instrument] bepaalde het biomerker-potentieel. De cytotoxische funktie van NK-cellen bij 176 CVS-individuen was significant lager dan bij de 230 controles. Volgens de ROC-analyse was NKCC een goede voorspeller van de CVS-status. Er was geen significant verschil qua NK-cel aantallen tussen gevallen en controles. Het percentage CD2+ lymfocyten (T-cellen en NK-cellen) dat positief was voor DPPIV/C26 bleek verhoogd bij CVS maar er was een daling van het aantal molekulen (rMol) DPPIV/C26 dat tot expressie kwam op T-cellen en NK-cellen, en een daling van de oplosbare vorm van het enzyme in serum. Analyses d.m.v. ROC-curves wezen er op dat alle drie de metingen van DPPIV/CD26 potentieel hadden als biomerkers voor CVS. Geen enkele van de DPPIV/C26 bepalingen waren significant gecorreleerd met NKCC.

Besluiten Via ROC-analyse werd aangetoond dat NKCC en drie manieren om DPPIV/C26 te meten die hier werden onderzocht, potentieel hadden als biomerkers voor CVS. NKCC, %CD2+CD26+ lymfocyten en rMol CD26/CD2+ lymfocyt vereisten flow-cytometrie, vers bloed en toegang tot complexe laboratorium-technieken. Oplosbaar DPPIV/C26 in serum wordt bepaald via een standaard ELISA-assay, of met andere oplosbare factoren in een multiplex ELISA. Dipeptidyl-peptidase IV op lymfocyten of in serum was niet voorspellend voor NKCC […]. Abnormaliteiten qua DPPIV/CD26 en NK-cel funktie zijn van bijzonder belang voor de mogelijke rol van infektie bij de initiatie en/of persistentie van CVS.

Inleiding

[…]

Zoals bij zoveel chronische ziekten is de pathofysiologie van CVS complex en zijn meerdere van de belangrijkste regulerende systemen van het lichaam aangetast. Er is een aanzienlijke hoeveelheid literatuur die immuun-dysfunktie bij CVS beschrijft, hoewel overzichten over de immunologie bij CVS opmerken dat universele overéénstemming wat betreft immunologische abnormaliteiten nog niet werd bereikt, in niet geringe mate te wijten aan verschillen qua methodologieën, definitie en studie-kwaliteit. Rapporten ondersteunen echter 1) verminderde funktie van ‘ natural killer’ (NK) cellen met deficiënties qua perforine en granzymen [Perforine proteïne dat een gaatje boort in het membraan van te vernietigen cellen – wordt samen met granzymen – enzyme in de granulen van NK-cellen en cytotoxische T-cellen, in het bijzonder granzyme-B, afgegeven en vergemakkelijkt de passage van deze molekulen door het membraan van de doelwit-cel.] in NK-cellen én CD8 T-cellen; 2) inflammatie; 3) gewijzigde cytokine-profielen met verhogingen qua pro-inflammatoire cytokinen en Th2 (T helper cel-type 2) polarisatie; en 4) chronische lymfocyten-aktivatie [voor elke van deze punten zie ook elders op deze paginas].

Research-inspanningen zijn gericht op het identificeren van een individuele merker of combinatie van merkers die voldoende geassocieerd zijn met CVS om een objectieve diagnose en management van CVS te vergemakkelijken. We meldden reeds dat CVS-patiënten met slechte NK-funktie meer vermoeidheid, minder energie, meer dysfunktie gedurende de dag en meer cognitieve stoornissen vertoonden. Deze resultaten leverden preliminair bewijs ter ondersteuning van het gebruik van NKCC als subgroep-merker voor ziekte-ernst bij CVS [Siegel SD, Antoni MH, Fletcher MA, Maher K, Segota MC et al. Impaired natural immunity, cognitive dysfunction and physical symptoms in patients with Chronic Fatigue Syndrome: preliminary evidence for a subgroup? J Psychosom Res (2006) 60: 559-566].

DPPIV/CD26, aanwezig op het oppervlak van vele cellen – inclusief lymfocyten, is een trans-membraan glycoproteïne en een serine-peptidase dat proline dipeptides afsplitst van de het N-uiteinde van polypeptiden, inclusief chemokinen en neuropeptiden. Een enzymatisch aktieve, oplosbare vorm wordt gevonden in serum. We observeerden een gestegen aandeel lymfocyten die deze aktivatie-merker bij CVS-patiënten tot expressie brengt, in vergelijking met controles.

Er zijn geen algemeen aanvaarde laboratorium-testen beshikbaar voor de diagnose of prognose van CVS. deze studie probeerde de nauwkeurigheid te bepalen waarmee metingen van NKCC of DPPIV/CD26 patiënten met de klinische diagnose CVS onderscheiden van gematchte gezonde controles.

Methodes

Doelstellingen

[…]

Deelnemers

CVS-patiënten (18 tot 60 jaar, gemiddeld 44; 83% vrouwen) […] CDC klinische diagnostische criteria […]. Exclusie-criteria […]. De CVS-individuen werden bestudeerd 2 tot 25 jaar na aanvang van de symptomen, met een gemiddelde van 10 jaar. Gezonde controles (23-74, gemiddeld 41 jaar, 86% vrouwelijk) […].

Beschrijving van Procedures of Onderzoeken

Bloed-afname

[…]

‘Natural Killer’ cel cytotoxiciteit

[…] op totaal bloed binnen 8 uur na afname via een chroom-release test [NK cytotoxische aktiviteit wordt gemeten via het bepalen van het vermogen van NK-lymfocyten doelwit-cellen kapot te maken. Een klassieke methode om dit vast te stellen is via het radio-aktief 51Cr.]. De NK-gevoelige erythroleukemische K562 cel-lijn [leukemie-cellen die makkelijk worden gedood door NK-cellen] werd gebruikt als doelwit-cel. […] Het % cytotoxiciteit bij elke doelwit/effector-verhouding en aantal CD3-CD56+ (NK) cellen werd gebruikt om de resultaten weer te geven als % cytotoxiciteit bij een doelwit/effector-verhouding van 1:1.

Bepaling van of Lymfocyt Subsets en Bepaling van Cel-oppervlakte Proteïne Concentraties d.m.v. Kwantitatieve Fluorescentie

[…]. Bepaling van lymfocyten-, monocyten- en granulocyten-populaties gebeurde […] op basis van fluorescentie voor de CD45 ‘bright’ en CD14 negatieve populatie d.m.v. een flow-cytometer. […] Phycoerythrine [PE; fluorescerende kleurstof] gelabelde antilichamen […] omzetting van fluorescentie-intensiteit naar mediane aantallen molekulen PE gebonden per cel (relatief aantal molekulen proteïne per cel; rMol/cel). Deze techniek laat de bepaling toe van het relatief (r) aantal molekulen (Mol) CD26 op CD2+ lymfocyten (T-cellen en NK-cellen).

Bepaling van Oplosbaar CD26

[…] ELISA.

Ethische kwesties

[…]

Statistiek

[…] De diagnostische nauwkeurigheid van biomerkers werd bepaald in termen van echt positieve (gevoeligheid) t.o.v. echt negatieve (specificiteit) d.m.v. niet-parametrische ROC-analyses [De klinische prestatie van een laboratorium-test kan worden beschreven in termen van diagnostische nauwkeurigheid of het vermogen om individuen correct te klassificeren in klinisch relevante subgroepen. Diagnostische nauwkeurigheid verwijst naar de kwaliteit van de geboden informatie door het klassificatie-instrument (meting, parameter) en moet worden onderscheiden van het nut of de werkelijke praktische waarde van de informatie. ‘Receiver-operating characteristic’ curves bieden een pure nauwkeurigheid-index door de beperkingen van het vermogen om het onderscheid te maken tussen gezondheid-toestanden (hier: CVS en gezonde controles) over het complete spectrum van funktie-voorwaarden van een test aan te tonen.]. […] De berekening van de ‘area under the curve’ [AUC; gebied onder de curve] biedt een handig enkelvoudig getal. Een AUC > 0,5 geeft aan dat test geen verschil vertoont tussen de twee groepen, AUC = 1,0 wordt bekomen als de test de twee groepen perfekt scheidt. […]

Resultaten

‘Natural Killer’ cel cytotoxiciteit

De NKCC waarden waren significant lager bij CVS (p<.000). Aantallen NK-cellen waren niet verschillend tussen CVS en controles. De waarden voor CD3-CD56+ lymfocyten [NK-cellen]/mm3 waren: 176 (134-256) voor CVS en 236 (151-336) voor controles. Volgens de niet-parametrische ROC-curve voor 406 stalen, was NKCC een goede voorspeller voor de CVS-status. […]

Dipeptidyl-peptidase IV/CD26

We maten dit peptidase op het cel-oppervlak en in serum bij een subset waarvan we NKCC hadden bepaald. De resultaten […] wezen op een stijging van het percentage CD26+ CD2+ lymfocyten maar een daling van het aantal molekulen CD26 op T-cellen en NK-cellen, en een vermindering qua oplosbare vorm van CD26 in serum. ROC-curve analyses en AUC […] toonden dar alle drie de metingen voor CD26 potentieel hebben als biomerkers voor CVS. De kwalitatieve flow-cytometrie bepaling voor CD26+CD2+ lymfocyten en de ELISA-assay voor sCD26 in serum waren goede voorspellers. De kwantitatieve flow-methode voor concentratie van CD26 op CD2+ lymfocyten waren minder precies. Geen enkele van de CD26 testen bleken significant gecorreleerd met NKCC.

Bespreking

Data uit deze en andere studies boden geloofwaardige ondersteuning voor verminderde NKCC-funktie bij CVS. Deze effector-cellen van het aangeboren immuunsysteem hebben een belangrijke rol bij antivirale, anti-bakteriële en anti-tumor immuniteit, maar bleken ontoereikend als we de directe cytolyse van doelwit-cellen en intracellulaire lytische proteïnen [perforine] maten. Bij 60 tot 80% van de gepubliceerde monsters vertoonde CVS een acute ziekte-begin, met systemische symptomen gelijkaardig aan influenza-infektie die niet tot bedaren komt. De plotse aanvang, de symptomen zoals spier-/gewricht-pijn, pijnlijke keel en gevoelige lymfadenopathie [gezwollen lymfeklieren] deed denken aan een door infektie geïnduceerde ziekte. Gepubliceerde rapporten ondersteunen én ontkennen associaties met microbiële infekties, reaktivatie van latente herpes-virus infekties en/of retrovirus infekties bij CVS. Van belang is de bevinding dat de nadelige immunologische effekten van aanhoudende infekties met Epstein-Barr Virus (EBV) geen virale DNA-synthese vereisen. Gepubliceerd werk suggereerde de mogelijkheid van verhoogde risico op kanker bij patiënten met CVS, hoewel er geen lange-termijn studie dit risico nauwkeurig vaststelt.

We toonden eerder dat het aandeel lymfocyten (NK-cellen en T-cellen) die CD26 tot expressie brengen, verhoogd is bij CVS . Hier vonden we dat de dichtheid van DPPIV/CD26 op het oppervlak van lymfocyten en de concentratie van het enzyme in plasma verminderd is bij CVS-individuen, vergeleken met controles. We hypothiseren dat deze daling te wijten is aan chronische lymfocyten-aktivatie bij CVS-patiënten. Dit draagt bij tot het bewijs van verlies van aangeboren immuun-funktie en chronische immuun-aktivatie, ten gevolge de langdurige aanwezigheid van antigen-stimulatie, lichaam-eigen of vreemd. Vergeleken met gezonde controles, hadden chronische hepatitis-C patiënten significant lagere waarden aan oplosbaar CD26 in het serum. In een andere studie werd acute infektie met levend influenza-vaccin en chronische infektie met persistent antigen – zoals bij cytomegalovirus (CMV), EBV of humaan immunodeficiëntie virus (HIV) – vergeleken […]. Deze analyses identificeerden een uniek patroon met een hoge dichtheid qua DPPIV/CD26 expressie bij influenza-specifieke CD8 T-cellen maar niet bij CD8 T-cellen specifiek voor CMV, EBV of HIV. Deze bevindingen werden geïnterpreteerd als een aanwijzing dat expressie van CD26 kenmerkend is voor een geheugen-cel, aanwezig bij acute infektie maar niet bij chronische infektie.

Dipeptidyl-peptidase IV/CD26 splitst N-terminale X-Pro dipeptiden [eender wel aminozuur gekoppeld met het aminozuur proline aan het N-uiteinde van een keten aminozuren] af van peptiden. Het peptidase controleert het in vivo half-leven van het pro-inflammatoir chemokine ‘stromal cell-derived factor-1’ (SDF-1). Muizen die deficient zijn voor DPPIV/CD26 vertoonden verhoogde waarden aan circulerend aktief SDF-1, geassocieerd met verhoogde aantallen SDF-1 receptor (CXCR4) [‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’: “CXCR4 is significant ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten maar dit is wellicht niet specifiek voor CVS.”] positieve cellen die arthritische gewrichten infiltreren. In een klinische studie door dezelfde researchers bleken de plasma-waarden aan DPPIV/CD26 van patiënten met reumatoïde arthritis significant gedaald vergeleken met die van osteoarthritis-patients en omgekeerd gecorreleerd met C-reaktief proteïne concentraties. Ze stelden dat gedaalde waarden van circulerend oplosbaar DPPIV/CD26 bij arthritis mogelijks door DPPIV/CD2 gemedieerde regulering van de chemotactische SDF-1/CXCR4 as beïnvloeden Deze patiënten hebben gestegen aantallen T-cellen die DPPIV/CD26 tot expressie brengen, en gereduceerde DPPIV enzymatische aktiviteit en DPPIV/CD26-antigen in plasma vergeleken met controles.

Dipeptidyl-peptidase IV/CD26 veroorzaakt de afbraak van ‘glucagon-like’ peptide 1 (GLP-1), een incretine hormoon [Incretines zijn natuurlijke kleine hormonen die worden afgescheiden wanneer er voedsel door de darmen passeert. Ze dragen bij tot een goede suiker-huishouding door hun specifiek effekt op de insuline-producerende β-cellen van de pancreas én de glucagon-producerende α-cellen. Ze zorgen ook voor een verzadiging-gevoel.]. Inhibitoren van DPPIV/CD26 zoals sitagliptine, die afbraak van of GLP-1 voorkomen, zijn nu beschikbaar als behandeling van diabetes type 2. Gezien het feit dat DPPIV/CD26 een sleutel-rol heeft bij in immuun-regulering als een T-cel aktivatie molekule en bij immuun-gemedieerde aandoeningen, is het opmerkenswaardig dat de effekten van inhibitie van DPPIV/CD26 op het immuun-systeem nog niet uitgebreid werden onderzocht. Er zijn rapporten dat infekties verhoogden na sitagliptine-behandeling. [Leidt een daling van DPPIV/CD26 zoals bij CVS tot meer infekties? Onderzoek gewenst!] Tot nu toe werden slechts routine laboratorium veiligheid-variabelen gemeten bij de gepubliceerde klinische testen.

Toediening van DPPIV/CD26-inhibitoren voor de behandeling van type 2 diabetes zouden de immune-funktie kunnen beïnvloeden, inclusief NKCC. Een studie bij CD26-gen ‘knock-out’ muizen [met een ‘knock-out gen: een bestaand gen is vervangen door een versie dat niet werkt] besloot dat DPPIV/C26 bijdraagt tot de regulering van ontwikkeling, rijping en migratie van CD4 T-, NK- en NKT-cellen, cytokine-secretie, T-cel afhankelijke antilichaam-produktie en switchen van immunoglobuline-isotype door B-cellen. Een initiële diagnose van CVS zou niet worden gesteld bij patiënten met duidelijke diabetes type 2. De frequentie van het ontwikkelen hiervan na het stellen van de diagnose CVS is echter niet gekend – noch de effekten van een DPPIV/C26 inhibitor bij de CVS-patient.

De ziekte-duur overschrijdt gewoonlijk 10 jaar. Persistentie kan ingewikkelde interaktie van immune, autonome en neuro-endocriene regulering omvatten en blijft slecht begrepen. Het is belangrijk te onthouden dat de geassocieerde chronische inflammatie belangrijke gevolgen kan hebben op het energie-metabolisme door het opwekken van insuline-resistentie. Deze chronische inflammatoire toestand zou ook een gelijktijdige lage-graad Th1-respons kunnen ondersteunen door het inhiberen van de beschermende effekten van de T regulerende cel subset via verhoogde IL-6 expressie. De gedaalde NKCC en de abnormale DPPIV/C26 manifestaties bij CVS kunnen compatibel zijn met de hypothese dat het immuunsysteem van aangetaste individuen neigt naar een T-helper (Th) 2 type of cytokine-patroon georiënteerd naar humorale immuniteit [immuniteit van B-lymfocyten en hun antistoffen, component, enz. <=> cellulaire immuniteit].

De gegevens verkregen betreffende NK-cel funkie, immuun-aktivatie en DPPIV/C26 op cel-oppervlakken en in serum, zijn consistent met een virale etiologie voor CVS. Het verhoogd aantal geaktiveerde CD4 en CD8 T-cellen, en gebrekkige NKCC bij CVS suggereert dat T-cellen metabool beperkt zijn bij het uitvoeren van hun helper-funktie. De geobserveerde abnormaliteiten zouden toepassingen kunnen hebben bij andere complexe, chronische en slecht begrepen ziekten, inclusief fibromyalgie, Golf Oorlog ziekte, reumatologische aandoeningen en Multipele Sclerose – hoewel de precieze constellatie van patronen die wordt vastgesteld bij deze biomerkers bij elk van hen kan verschillen. Het specifieke panel dat we hier hebben geïdentificeerd is echter waarschijnlijk behulpzaam als objectieve merkers voor het stellen van een CVS-diagnose, het bepalen van subgroepen, het opvolgen van patiënten en als doelwitten voor therapeutische strategieën. Deze indicatoren zijn onderdelen van een ingewikkeld en geïntegreerd systeem en hun onderlinge afhankelijkheid moet worden aangepakt. [zie: ‘Cytokine-netwerken bij CVS] Dienoveréénkomstig zijn we bezig met het in kaart brengen van de netwerk-struktuur van neuro-endocriene/immuun interaktie bij CVS.

Beperkingen

Evident beperkingen bij deze studie zijn dat elk patient-staal één enkel tijd-punt vertegenwoordigt. Om dit te aan te pakken, voeren we een grote longitudinale studie uit waarbij 150 individuen worden gevolgd gedurende 18 maanden. Er worden monsters verzameld op momenten van relatieve symptoom-remissie en -verergering. Het vervolledigen van dergelijke studie zal toelaten CVS gerelateerde symptomen te correleren met lymfocyten-funktie en aktivatie. Omdat CVS een aandoening is die vrouwen onevenredig aantast, waren meer dan 80 % van de gevallen in deze studie vrouwen. De grotere studie zal voldoende kracht hebben om een sub-studie van biomerker-patronen toe te laten bij mannen met CVS.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: