Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS

De research-groep van Stefania Fulle hebben weer enkele toonaangevende artikels gepubliceerd. Een studie betreffende de morfologie en gen-expressie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten leverde twee complementaire publicaties op.

Dit eerste deel toonde bij CVS-ers, in vergelijking met gezonde mensen, relatief meer zgn. ‘snelle’ vezels en minder ‘trage’ vezels. De ‘trage’ vezels zijn efficiënter in het gebruik van ATP, zijn beter gevasculariseerd en bevatten meer mitochondriën; kortom ze zijn resistenter tegen vermoeidheid en beter geschikt voor langdurige aërobe arbeid. Bij ‘snelle’ vezels duurt het aanvullen van ATP langer; er zijn minder mitochondrieën, minder myoglobine en minder bloedvaten. De ‘snelle’ vezels raken makkelijk vermoeid en produceren/accumuleren meer melkzuur, wat resulteert in pijn/krampen en kan mogelijks ook TRPV1- en ASIC3-kanalen aktiveren.

Er zijn dus morfologische veranderingen waar te nemen. En volgens de auteurs zouden die NIET te wijten zijn aan het minder gebruiken van de spieren (deconditionering).

Voor meer achtergrond zie ook: ‘Vertraagd herstel na Inspanning bij CVS’ en ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’.

Het tweede deel van de studie volgt…

Met dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

————————-

International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 22(2):427-436. (2009)

Functional characterization of muscle fibres from patients with Chronic Fatigue Syndrome: case-control study

Pietrangelo T, Toniolo L, Paoli A, Fulle S, Puglielli C, Fanò G, Reggiani C

Dept. Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Ageing (CeSI), University – G. d’Annunzio- Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Niettegenstaande de aanwezigheid van immunologische en psychologische aspekten, zijn symptomen gerelateerd met skelet-spieren, zoals pijnlijke spieren, vermoeibaarheid en gestegen lactaat-accumulatie, prominent bij CVS-patiënten. In deze geval-controle studie werd het fenotype van dezelfde bioptie-stalen geanalyseerd door het bepalen van i) vezel-type proportie – d.m.v. myosine-isoformen als vezel-type molekulaire merker en gel-elektroforese [scheidingstechniek voor eiwitten of nucleïnezuren] als een instrument om myosine-isoformen te scheiden en te kwantificeren, en ii) contractie-eigenschappen van manueel gedissecteerde, chemisch permeabel gemaakte en calcium-geaktiveerde enkelvoudige spiervezels. De resultaten toonden dat de vezel-type proportie significant gewijzigd was bij CVS-stalen: een verschuiving van het trage- naar het snelle-samentrekking fenotype. Dwars-doorsnede, kracht, maximum verkorting-snelheid [Spiervezels genereren spanning door de wisselwerking van de proteïnen actine en myosine; daardoor kunnen ze verlengen, verkorten of hetzelfde blijven. Hoewel de term ‘contractie’ verkorting impliceert als we over het spier-stelsel spreken, betekent het spiervezels die spanning genereren m.b.v. of motor-neuronen. Naargelang de verkorting-snelheid stijgt, daalt de kracht die kan worden geleverd.] en calcium-gevoeligheid waren niet significant veranderd in enkelvoudige spiervezels van CVS-stalen. De samentrekking-eigenschappen van spiervezels bleven dus bewaard maar hun verhouding was gewijzigd, met een toename van het meer voor vermoeidheid vatbare, energie-verbruikende snelle vezel-type. Alles te samen ondersteunen deze resultaten de visie dat spier-weefsel direct betrokken is bij de pathogenese van CVS en dat het zou kunnen bijdragen tot de vroege aanvang van vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren bij CVS-patiënten.

[…]

Bij CVS-patiënten zijn de meest in het oog springende symptomen de invaliderende vermoeidheid, spier-pijn en spier-zwakte, wijzend op neuromusculaire dysfunktie. Eerdere studies toonden dat sommige CVS-patiënten bij toenemende inspanning een gedaalde anaërobe drempel vertoonden. Deficiëntie in serum-acetylcarnitine bij CVS-patiënten kan leiden tot een daling in oxidatief metabolisme en hoger plasma-lactaat. Dergelijke metabole defekten kunnen bijdragen tot de verminderde fysieke uithouding van CVS-patiënten. Bij dynamische inspanning raken CVS-patiënten sneller uitgeput dan controle-individuen niettegenstaande ze over normale spier-kracht beschikken en normale of lichtjes verminderde spier-uithouding hebben. […]

Skelet-spieren van zoogdieren zijn heterogeen, opgebouwd uit vezels met een verschillende molekulaire architektuur en specifieke funktionele eigenschappen, zoals samentrekking-snelheid, maxiumum verkorting-snelheid en weerstand tegen vermoeidheid. De fysiologische eigenschappen van spieren, o.m. weerstand tegen vermoeidheid, worden bepaald door de proporties van fenotypisch afzonderlijke vezel-types. Van de proteïnen die differentieel tot expressie komen bij afzonderlijke vezel-types, worden myosine zware ketens [‘myosin heavy chains’, MyHC] dikwijls als molekulaire merkers gebruikt, omdat ze i) het meest overvloedige proteïne uitmaken (ca. 50% van de totale proteïne-inhoud); ii) meerdere funktionele eigenschappen – zoals maxiumum verkorting-snelheid en ATPase-aktiviteit – bepalen; en iii) verantwoordelijk zijn voor de differentiële histochemische ATPase kleuring […], en procedure die reeds vele jaren wordt gebruikt om vezel-types te klassificeren. In volwassen menselijke skelet-spieren komen drie MyHC-types tot expressie: twee snelle isoformen (2A en 2X) en één trage isoform (type 1 of β-cardiale isoform). Zo komen drie vezel-types voor in humane skelet-spieren: trage vezels waar type 1 MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een oxidatief metabolisme, snelle 2X-vezels waar type 2X MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een glycolyse-metabolisme en snelle 2A-vezels waar type 2A MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door intermediaire metabole eigenschappen. Welk gen tot expressie komt in een bepaalde spier-vezel hangt af van intrinsieke programmas verbonden met de myoblast-lijn [voorlopers van spiercellen] waaruit de vezel ontwikkelt, en van extrinsieke invloeden zoals neurale, hormonale en mechanische factoren (inclusief spier-aktiviteit).

Een eerdere studie betreffende de samentrekking-eigenschappen van spieren bij CVS-patiënten toonde geen consistente correlaties tussen symptomen en veranderingen qua vezel-type proportie, vezel-grootte, degeneratieve of regeneratieve kenmerken. Die studie vond dat de samentrekking-eigenschappen van quadriceps […] niet significant waren veranderd vergeleken met controles (Edwards et al. 1993). Een later rapport over een grotere CVS-groep, waar bioptie-stalen de quadriceps werden geëvalueerd […] besloot dat CVS-patiënten met een abnormale lactaat-respons bij inspanning een significant lager aantal mitochondria-rijke type 1 spiervezels hadden (Lane et al. 1998). In de huidige studie analyseerden we kracht, doorsnede-oppervlakte, maxiumum verkorting-snelheid en calcium-gevoeligheid van enkelvoudige CVS-vezels om meer te weten te komen over de samentrekking-eigenschappen van CVS-spiervezels en hun verhouding.

Materialen en methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria.

[…] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar).

Criteria voor opanme [in de studie] waren voor alle individuen: (a) leeftijd 25-55 jaar; (b) geen huidige pathologie buiten CVS […]; (c) niet zwanger; (d) type I voedsel-inname (richtlijnen ‘American Heart Assosciation’) [beperkt totaal vet: niet meer dan 30% en verzadig vet niet meer dan 10% van de totale calorie-inname, cholesterol minder dan 300 mg/dag]; (e) geen medicatie ten minste één maand voor het onderzoek; en (f) geïnformeerde, geschreven toestemming voor deelname.

Controles […] belangrijk criterium was de afwezigheid van enige diffuse musculoskeletale/vermoeidheid van langer dan 10 dagen in het heden of het verleden. […]

Experimenteel plan

[…] twee verschillende groepen experimenten: (i) transcriptie-profiel analyse van totaal spier-fragment, (ii) meting van spanning-ontwikkeling en vezel-type karakterisatie. […]

Elektroforese en Western blot analyse

[Elektroforese is een manier om eiwitten te scheiden volgens elektrische lading/grootte op een drager (polymeer/gel) in een elektrisch veld.]

[…] Scheiding van MyHC-isoformen […] volgens migratie [van snelle naar trage migratie in, van onder naar boven op een gel; de β traag-samentrekkende isoform verplaatst zich dus het snelst in een elektrisch veld]: MyHC-1, MyHC-2A en MyHC-2X. […]

Mechanische experimenten op enkelvoudige vezels

[Meten van isometrische spanning bij verschillende calcium-concentraties.]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

De proportie van vezel-types in bioptie-stalen werd bepaald via het analyseren van MyHC-isoformen. […] Elektroforetische analyse werd uitgevoerd bij totaal spier-weefsel en enkelvoudige geïsoleerde spiervezels. […]

De resultaten tonen dat er aanzienlijke variabiliteit was qua isoformen tussen individuele patiënten. […] De snelle MyHC-2A vezels bij CVS-patiënten en controles was ongeveer gelijk. De proportie trage MyHC-1 vezels was echter significant lager en die van de snelle MyHC-2X vezels significant hoger bij CVS-patiënten vergeleken met controles.

Interessant is dat de proportie vezel-types niet varieerde naar gelang geslacht. Bij mannen lagen de gemiddelden op 33,9% MyHC-1, 37,2% MyHC-2A en 28,9% MyHC-2X; bij vrouwen waren de gemiddelden 32,1% MyHC-1, 40,4% MyHC-2A en 27,5% MyHC-2X. De verschuiving qua myosine-isoform expressie is een duidelijke aanwijzing voor veranderde vezel-type proportie […]. We vonden ook geen significante verschillen qua doorsnede-oppervlakte.

In de mechanische experimenten evalueerden we de samentrekking-capaciteiten van elke vezel. We maten de maximum verkorting-snelheid (V₀) tijdens maximale aktivatie van onbelaste vezels. Omdat de samentrekking-parameters, en in het bijzonder V₀, sterk afhankelijk zijn van het vezel-type, werden de vezels gegroepeerd op basis van hun MyHC-isoform inhoud. Het vezel-type waar MyHC-1 en MyHC-2A tot expressie komen zijn homogeen [qua V₀] voor patiënten en controles; terwijl de hybride MyHC-1-2A en de MyHC-2X vezels van CVS-spieren ietwat verschillen. Ook de hybride MyHC-2A-2X lijken te verschillen maar dit bleek statistisch niet significant.

De maximale isometrische spanning (P₀) werd bij de vrij-gedissekteerde vezels gemeten bij maximale calcium-concentratie. […] De CVS-en controle-vezels bleken vrij homogeen. Er waren geen statistisch-significante verschillen, wat suggereert dat de samentrekking-eigenschappen van de spier-vezels niet was veranderd bij CVS-patiënten.

[…] De relatieve spanning ontwikkeld bij sub-maximale aktivatie van de CVS-vezels was niet significant verschillend van controle-vezels, wat er op wijst dat de samentrekking-respons van de myofibrillen [bundel samentrekbare filamenten (myosine en actine), samen betrokken bij de beweging van (spier-)cellen] op calcium-stimulatie gelijkaardig was.

Discussie

Niettegenstaande aanzienlijke research over dit onderwerp blijft de associatie tussen strukturele veranderingen in skelet-spieren en zwakte of verminderde resistentie tegen vermoeidheid, gezien bij CVS-patiënten, controversieel. Onze studie toonde een verschuiving qua vezel-type proportie bij CVS-patiënten, m.n. de aanwezigheid van meer snelle 2X-vezels en minder trage vezels. Er waren geen verschillen qua doorsnede-oppervlakte en wat betreft de belangrijke parameters die spier-samentrekking kenmerken […].

De bevinding dat de MyHC-isoform proportie gewijzigd bleek, is volgens ons een duidelijke aanwijziging voor een veranderde vezel-type verhouding. MyHC-isoformen worden beschouwd als molekulaire merkers voor vezel-types. In eerdere studies hebben we de potentiële correlatie tussen MyHC-isoform en vezel-type verhouding onderzocht, en bereikten we de conclusie dat, in afwezigheid van belangrijke veranderingen qua doorsnede-oppervlakte van de vezels, de elektroforetische analyse van de MyHC-proportie een indicator was voor de verhouding van de vezel-types. De MyHC-isoformen verhouding bij de controles hier was vergelijkbaar met wat we vonden in eerdere studies; trage MyHC vertegenwoordigde ca. 45% van het totaal, een waarde die vergelijkbaar is met wat anderen vonden. Het aantal CVS-patiënten dat we hier bestudeerden was beperkt maar dat was ten dele te wijten aan de zeer precieze inclusie-criteria. De verschuiving qua vezel-type proportie werd verder bevestigd door de observatie dat gelijkaardige resultaten werden bekomen als de patiënten werden verdeeld op basis van geslacht.

De vermindering van trage MyHC-isoformen bij CVS-patiënten ging gepaard met een vermeerdering van snelle 2X MyHC, met vrijwel geen wijziging qua snelle 2A MyHC. Bovendien was de proportie MyHC-2X in stalen van CVS-patiënten duidelijk hoger dan die van controles in deze studie en, belangrijk, in andere onafhankelijke studies. De verschuiving qua vezel-type proportie van traag naar 2X, zoals gesuggereerd door de verschuiving qua myosine-isoformen, correspondeert niet enkel met een verandering in de hoeveelheid trage en snelle vezels, maar ook in die van oxidatieve en glycolytische vezels (bij menselijke spieren zijn trage vezels hoofdzakelijk oxidatief en 2X vezels hoofdzakelijk glycolytisch). Analyse van het expressie-profiel legde ook een aantal veranderingen bloot [zie later] die consistent zijn met een verschuiving van trage naar snelle vezels. […] Een vermindering van de expressie van overeenkomstige proteïnen suggereert een onderdrukking van de signalisering die een ‘trage vezel’ fenotype ondersteunt. […] Onze analyse van het expressie-profiel  toont ook de upregulering van het gen […] dat sterk tot expressie komt in regenererende en volwassen snelle vezels.

Eerdere studies bij CVS-patiënten hebben aanwijzingen opgeleverd voor een mogelijke wijziging qua vezel-type proportie. Lane et al. rapporteerden dat lactaat in hoger mate accumuleert in de spieren van CVS-patiënten dan die van controles. Volgens een breed geaccepteerde visie wordt lactaat tijdens inspanning geproduceerd door glycolytische vezels en opgenomen door oxidatieve vezels, en ook door cardiomyocyten [hartspier-cellen] en hepatocyten [lever-cellen]. Lane et al. toonden ook dat de regeneratie van ATP via mitochondriale oxidatieve processen bij een groep CVS-patiënten verstoord was. Onze expressie-profiel analyse toonde een aantal veranderingen qua gen-expressie […] die wijzen op een verstoord energie-metabolimse. Hoewel er geen post-transcriptionele [op vlak van proteïnen] informatie beschikbaar is, kunnen we hypothiseren dat de ATP-bronnen in CVS-spieren anaërobe glycolyse zouden kunnen zijn die de lactaat-concentratie doet stijgen. De verhoging van het percentage glycolytische vezels hier toonde bovendien dat het evenwicht werd verstoord: van lactaat-verwijdering naar lactaat-accumulatie.

Het is bekend dat spier-onbruik een overgang van trage naar snelle vezels en van oxidatief naar glycolytisch metabolisme kan opleveren. De observatie dat de vezel-type proportie is veranderd bij CVS-patiënten stelt dus een belangrijke vraag betreffende de oorzaak van CVS: is de verschuiving qua vezel-type de oorzaak of het gevolg van verminderd spier-gebruik? Onsze expressie-profiel analyse biedt enkele interessante en verhelderende aanwijzingen. Een ge-downreguleerd gen bevat de bindingsplaats voor acetylcholine [neurotransmitter]. Verminderde waarden van dit transcript suggereren de mogelijkheid van een defekte nicotine-receptor [acetylcholine bindt op een nicotine-receptor, een ionkanaal-receptor die werkt via een wijziging van de celmembraan-permeabiliteit] en verminderde efficiëntie van neuronale transmissie van de neuromusculaire junctie [synaps van een axon-uiteinde van een motor-neuron (neuron in het centraal zenuwstelsel waarbij de axonen buiten het CZS reiken en spieren controleren) met de ‘motor end plate’ (uiteinde van een motor-neuron dat neurale impulsen doorgeeft aan een spier)]. Deze deficiëntie zou het vermogen van de ‘end-plate’ om het repetitieve lage-frequentie vuren van motor-neuronen – dat specifiek is voor trage vezels – kunnen verstoren en, ten gevolge daarvan, kunnen resulteren in een daling van het aantal trage vezels. Daarenboven zouden enkel intra-cellulaire signalisering-mechanismen, die vermoedelijk een rol spelen in het doorgeven van de effekten van neurale stimulatie, ook kunnen ge-downreguleerd zijn. […]

De afwezigheid van een verandering qua vezel-grootte bij CVS verdient ook enige commentaar. Hoewel het niet in overeenstemming is met de hypothese dat ongebruik kan bijdragen tot de verschuiving van snel naar vast, zoals hierboven beschreven, komt het wel overeen met eerdere histologische [histolgie = weefselkunde] studies over spieren bij CVS-patiënten die niet in staat bleken significant bewijs te vinden voor spier-atrofie. Onze mening is dat de verhoogde aanwezigheid van snelle vezels niet afhangt van spier-onbruik maar een onbekende molekulaire oorzaak zou kunnen hebben die dieper onderzocht moet worden. Het gemelde gebrek aan spier-vezel atrofie wordt ondersteund door de expressie-profiel studies […] Te samen genomen suggereert de downregulering van de genen [zie later] dat de katabolische [katabolisme = afbrekende chemische processen in het lichaam, waarbij energie vrijkomt] en atrofische [atrofie = verschrompelen van een orgaan door het afsterven van de cellen waaruit het orgaan bestaat] processen die de spier-massa kunnen reduceren minder aktief zijn.

De karakterisatie van de samentrekking-eigenschappen van spiervezels van CVS-patiënten op het niveau van de enkelvoudige vezel biedt een nieuwe bijdrage tot ons begrip van de fysiopathologie van deze ziekte. We vonden dat isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid niet verschilden tussen spieren van CVS en controles. De mechanische kracht, die proportioneel is met het produkt van isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid bij nul-belasting, zou ook ongewijzigd zijn. Hetzelfde was geldig voor de samentrekking-respons van het myofibrillair apparaat op calcium-stimulatie […]. Het is bekend dat ATPase-aktiviteit van myosine-motors [Myosine molekulaire motors bewegen langs actine-filamenten om bv. spier-samentrekking op te wekken. De koppen van myosine bevatten actine en ATP-bindingsplaatsen, dit zijn de motor-proteïnen die kracht geven aan spierspanning.], die ca. 75% van de totale energie-consumptie van de spieren bedraagt tijdens samentrekking, proportioneel is met de maximum verkorting-snelheid en dat deze groter zal zijn voor snel 2X-myosine dan voor traag myosine. De verschuiving qua vezel-type die hier werd geoberveerd, impliceert dus een hogere ATP-consumptie tijdens samentrekking. Dit creëert een nood voor snellere ATP-regeneratie, die kan worden bewerkstelligd via glycolyse en lactaat-produktie, met een daling van de extra-cellulaire pH [zuurtegraad] tot gevolg. Dit kan bijdragen tot een verslechtering van de spier-conditie tijdens aktiviteit via zuur-voelende ion-kanalen die werden gevonden op primaire afferente vezels [zie ook: ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS’]

De bepaling van de contractie-prestatie werd uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de membranen (sarcolemma en sarcoplasmatisch reticulum) [sarcolemma = celmembraan van een dwarsgestreepte spiervezel; sarcoplasma = vloeistof die de myofibrillen van dwarsgestreepte spiervezels omgeeft] doorlaatbaar waren en de samentrekking werd geïnduceerd door immersie van de spiervezels in oplossingen met specifieke concentraties vrij calcium. Op deze manier waren mechanismen voor calcium-afgifte en -opname onbeschikbaar en dus kon geen conclusie worden getrokken aangaande dit aspekt van de contractie-regulering. Eerder werk door onze groep heeft echter getoond dat oxidanten zich opstapelen in CVS-spieren [zie: ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS’ /// Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] met daaraan verbonden stoornissen van proteïnen van het sarcoplasmatisch reticulum betrokken bij calcium-afgifte/-opname [Fulle S, Belia S, Vecchiet J et al. Modification of the functional capacity of sarcoplasmic reticulum membranes in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome. Neuromuscul Disord. (2003) 13: 479-84]; en dat mitochondriale aktiviteit aan de basis ligt van een toename van de produktie van reaktieve zuurstof soorten [ROS] leidend tot spier-vermoeidheid, een proces dat gelijkaardig is met het normale ouder worden. De resultaten die hier worden gerapporteerd kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat dergelijke post-transcriptionele veranderingen kunnen bijdragen tot funktionele wijzigingen, maar ze suggereren wel dat schade aan myfibrillaire proteïnen niet betrokken is.

[…]

Besluit: deze studie brengt sterk bewijs aan dat het idee ondersteunt dat struktuur en funktie van skelet-spieren zijn gewijzigd bij CVS-patiënten. Samen met de resultaten van de transcriptie-profiel analyse is de toename aan snelle, meer voor vermoeidheid vatbare 2X-vezels consistent met hogere ATP-consumptie en -regeneratie door glycolyse en lactaat-produktie. Ongeacht het mechanisme kan de verschuiving van traag-naar-snel, zoals gesuggereerd door de gegevens, bijdragen tot de verminderde weerstand tegen vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren van CVS-patiënten.