M.E.(cvs)-wetenschap

december 1, 2008

Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS

Filed under: Diagnostiek,Immunologie — mewetenschap @ 3:15 pm
Tags: , , , ,

In 2003 verscheen in het ‘Journal of Allergy & Clininical Immunology’ reeds een artikel dat gewag maakte dat er bij de post-exertionele vermoeidheid, die M.E.(cvs) zo typeert, meer aan de hand is dan simpele deconditionering…

In ‘Complement activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome’ rapporteerden Sorensen B et al. dat bij CVS significante stijgingen in complement-splitsingsprodukt C4a waar te nemen zijn 6 h na inspanning. Daaruit werd besloten dat dit een waardevol instrument zou kunnen zijn bij de ontwikkeling van diagnostsiche testen voor CVS. De verdere rol van complement-aktivatie-produkten als merkers van of deelnemers aan het ontstaan van de ziekte zou verder worden bestudeerd.

Hieronder dan nieuwe bevindingen van deze groep… Er wordt duidelijk zorgvuldig werk gemaakt van het bestuderen van een mogelijke merker (in tegenstelling tot groepen die zomaar niet-reproduceerbare, zogenaamde “diagnostische merker”-testen op de markt brengen…!?!?!

*************************

Mol Med. 2008 Nov 16. [Epub ahead of print]

Transcriptional Control of Complement Activation in an Exercise Model of Chronic Fatigue Syndrome

Bristol Sorensen1, James F. Jones, Suzanne D. Vernon2 and Mangalathu S. Rajeevan3

Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Zoonotic, Vector-borne and Enteric Diseases, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA 30333;

1 Department of Integrative Biology, University of Colorado at Boulder, Boulder, CO

2 The CFIDS Association of America, 6827 Fairview Road, Suite A, Charlotte, NC

3 Centres for Disease Control and Prevention, 1600 Clifton Road, MSG 41, Atlanta, GA

INLEIDING

CVS is een medisch onverklaarde ziekte geïdentifieerd door zelf-gerapporteerde symptomen en uitsluitende voorwaarden. Inspanningen om diagnostische merkers voor CVS te vinden, blijven uitdagend. Ontdekking van biomerkers wordt gehinderd door het feit dat de unieke biologische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor de oorspronkelijke ziekte wellicht niet langer aanwezig zijn in de meeste gevallen van CVS die werden geïdentifieerd via verscheidene klinische definities. Een constant geobserveerd symptoom bij CVS-individuen is echter de verergering van symptomen na inspanning (post-exertionele malaise) in tegenstelling tot de verlichting van symptomen na inspanning bij patiënten met andere met vermoeidheid geassocieerde aandoeningen zoals depressie, Reumatoïde Arthritis, Systemische Lupus Ertyhematosus en Multipele Sclerose. Post-exertionele malaise was verder één van de sleutel-symptomen in de symptoom-inventarislijst van de ‘Centres for Disease Control (CDC)’ die individuen met chronische vermoeidheid van niet-vermoeide individuen onderscheidde. Bij een analyse om de heterogeniteit in medisch onverklaarde vermoeidheidsziekten af te bakenen, was post-exertionele malaise de belangrijkste factor van een set gegevens van 38 onafhankelijke klinische en laboratorium-metingen. Beschikbaar bewijsmateriaal wijst zodoende post-exertionele malaise aan als uniek en belangrijk symptoom, wat studies naar zijn klinische en molekulaire karakterisatie nodig maakt. Identifikatie van specifieke biologische veranderingen geassocieerd met post-exertionele malaise biedt een veelbelovende benadering voor de ontdekking van biomerkers voor CVS.

Aangezien klinische evaluatie ter identifikatie van infektueuze of inflammatoire ziekten bij patiënten met ziekte-gedrag wees op complement-aktivatie bij individuen met CVS, gebruikten we eerder een inspanningsparadigma om veranderingen qua complement-splitsingsprodukten vast te stellen en vonden dat inspanning een significante stijging van C4a, een vermeend anafylatoxine [anafylaxis = vorm van allergie die wordt teweeggebracht door de vereniging in het lichaam van een bepaald antigeen met een specifieke soort antistoffen, gebonden aan mastocyten of circulerende basofiele granulocyten; proteïnen in de complement-aktivatie cascade van het ontstekingsproces hebben mogelijk zowel neuro-protektieve als toxiciteits-bevorderende effekten] induceerde 6 h na inspanning, enkel bij CVS-individuen. Gemiddelde symptoom-scores en gemiddelden voor verminderde aktiviteit en mentale vermoeidheidscategorieën van de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ waren ook significant verhoogd na inspanning bij deze CVS-individuen. Twee complement-splitsingsprodukten die universeel worden aanvaard als anafylatoxinen, C3a en C5a, waren niet verhoogd bij de CVS-individuen. Een micro-array [‘DNA-chip’] studie aangaande 3.800 genen en gebruikmakend van totaal RNA van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van deze individuen identificeerde ook verschillen in complement-ackivatie tussen CVS- en controle-individuen na inspanning. Samen tonen deze resultaten aan dat complement-aktivatie een merker kan zijn voor met CVS geassocieerde post-exertionele malaise en dat inspannings-geïnduceerde complement-aktivatie, in het bijzonder leidend tot verhoging van C4a splitsingsprodukt, zou kunnen gereguleerd worden op het niveau van de transcriptie [het proces waarbij het DNA van een gen wordt gecopieerd naar RNA].

C4a ontstaat na splitsing van het oorspronkelijke complement-proteïne C4 via de klassieke en lectine-mechanismen. Bij het klassieke mechanisme wordt C4 gesplitst door C1s geaktiveerd door C1q, terwijl bij het lectine-mechanisme, C4 wordt gesplitst door mannan-bindend lectine serine-protease 2 (MASP2) wat geaktiveerd wordt door mannose-bindende lectinen (MBL) of ficolinen (FCN). Sommige pro-inflammatoire cytokinen zijn gekend voor de modulatie van de synthese van deze proteïnen op het mRNA- én het proteïne-niveau. Van C1q mRNA en proteïnen werd gerapporteerd dat ze worden gestimuleerd door interferon-gamma (IFN-γ), IFN-α, IFN-β en interleukine-6 (IL-6). De afscheiding van het serine-protease C1s kan worden versterkt door óf IFN-α óf IFN-γ. C4 expressie op protein- én mRNA-niveau kan worden gereguleerd door IFN-γ, IFN-α en IL-6. Op een ander niveau zou verhoogd C4 voor splitsing kunnen beschikbaar zijn als de C1-inhibitor (SERPING1), die de aktieve enzymen C1s en MASP-2 van hun respectievelijke complexen – die ze vormen met C1q en ficolinen – verwijdert, transcriptioneel onderdrukt wordt. Verhoogde waarden van C4a kunnen zo hypothetisch resulteren uit één of meerdere transcriptionele wijzigingen geassocieerd met verhoogde hoeveelheden van de initiële proteïnen van het klassieke en/of lectine-mechanisme, verhoogde hoeveelheden pro-inflammatoire cytokinen die de produktie van de initiële proteïnen van het complement-mechanisme kunnen stimuleren of onderdrukking van de inhiberende regulering van het het klassieke of lectine-mechanisme. Gebaseerd op bovenstaande hypothese, onderzochten we veranderingen in de expressie van meerdere genen van het complement-mechanisme met ‘real-time reverse’ transcriptie PCR (real-time RT-PCR) [techniek waarbij je mRNA uit biologisch materiaal eerst omzet naar complementair cDNA om dit dan uiteindelijk te vermenigvuldigen en te detekteren] als de eerste stap in het testen van de molekulaire basis van veranderd complement-metabolisme na inspanning.

MATERIALEN EN METHODEN

Individuen en bloed-afname. […] Deze studie betreft een subgroup van individuen (8 CVS en 7 Controle) van een eerdere studie die een significante stijging van C4a splitsingsprodukt toonde bij CVS-individuen 6 h na inspanning. […] Alle individuen leverden 20 minuten sub-maximale inspanning op een fiets-ergometer. Bloed werd afgenomen […] onmiddellijk voor inspanning (T0 ), 1 h na inspanning (T1) en 6 h na inspanning (T2). […]

[…]

Experimenteel ontwerp en statistische analyse.

Bepaling van de verschillen in gen-expressie gebeurde in 4 afzonderlijke experimenten: experiment 1 om een standard-curve voor doelwit-genen te generen […]; experiment 2 om een standard-curve voor referentie-genen te generen […]; experiment 3 voor amplificatie van doelwit-genen in ongekende stalen samen met calibrator cDNA […]; experiment 4 voor amplificatie van referentie-genen in ongekende stalen samen met calibrator […].

[…]

Voor te doel van deze studie bepaalden we de definitie van een gen met over- of onder-expressie als 50% of meer van de CVS-individuen ≥2-voud verandering in expressie vertoonden vergeleken met de mediaan van de controle-groep (bepaald door ten minste 2 van de 3 normalisatie-methoden). […]

RESULTATEN

Reproduceerbaarheid en normalisatie van real-time RT-PCR.

[…] We testten 14 genen (9 doelwit-genen [Complement component 1, q subcomponent, A keten (C1QA); Complement component 1, s subcomponent (C1S); Complement component 4 (C4); Mannose-bindend lectine 2 (MBL2); Mannan-bindend lectine serine-protease 2 (MASP2); Ficoline 1 (FCN1); Ficoline 2 (FCN2); Complement component 1 inhibitor (SERPING1); Interferon-gamma (IFN-γ)] en 5 referentie-genen [Eukaryotic elongation factor 1 (EEF1A1); Ribosomal protein, large, P0 (RPLPO); Phosphoglycerate kinase 1 (PGK1); Peptidylpropyl isomerase B (PPIB); Ribulose -1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL)]) […]

[…] hoge PCR-efficiëntie […] alle stalen en PCR-runs vertoonden een goede reproduceerbaarheid […]

Inspannings-responsieve complement-genen bij CVS-individuen. MBL2 transcripten waren niet detekteerbaar, dus werd dit uitgesloten bij verdere analyse Van de overblijvende 8 genen die werden geanalyseerd, vertoonde enkel MASP2 en IFN-γ over-expressie vóór inspanning (T0) […] en enkel 3 genen (C4, MASP2 en FCN1) waren inspannings-responsief op T1 […]. C4 vertoonde het hoogste percentage CVS-individuen (63-75%; 5-6 van de 8 individuen) met over-expressie vergeleken met MASP2 of FCN1 (50-63%; 4-5 van de 8 individuen). Verder vertoonden 88% (7 van het totaal) van de CVS-individuen ≥2-voud over-expressie van C4 of MASP2 bij T1.

Bij verdere analyse was enkel differentiële expressie in MASP2 statistisch significant tussen CVS- en controle-groepen bij T1 […].

BESPREKING

Deze studie rapporteert de eerste systematische evaluatie van complement gen-expressie in PBMCs. Van de 9 complement-genen die werden getest, werden transcripten van alle genen, uitgezonderd MBL2, gedetekteerd in PBMCs; wat er op wijst dat complement-gen-aktiviteit niet is beperkt tot gespecialiseerde cellen zoals hepatocyten. Gebrek aan MBL2 expressie in PBMCs is overeenkomstig met eerdere rapporten maar MBL2 kan in vitro worden geïnduceerd in adherente monocyten en van monocyten afgeleide dendritische cellen. Terwijl expressie van sommige genen (C1Q, C4 en FCN1) werd gedetekteerd in PBMCs zoals in eerdere rapporten, werd MASP2 expressie niet eerder gedetekteerd in PBMCs. Initiatie van het klassiek mechansime is antilichaam-afhankelijk maar het lectine-mechanisme is antilicaam-onafhankelijk en start met de herkenning en binding van suiker- of N-acetyl-groepen op pathogene cellen (pathogeen-geassocieerde molekulaire patronen) door MBL of ficolinen. Genen behorende tot het klassiek (C1QA, C1S) en het lectine-mechanisme (ficolinen en MASP2) komen tot expressie in PBMCs, waarbij het lectine-mechansime wordt geaktiveerd door de plaatselijke synthese van ficolinen, eerder dan door MBL2.

De belangrijkste focus van deze studie was: bepalen of verschillen in gen-expressie in het complement-systeem zouden correleren met de eerdere observatie van verhoogd C4a splitsingsprodukt bij CVS-individuen 6 h na inspanning. Initiële analyse identificeerde transcripten van C4, MASP2 en FCN1 op hogere niveaus (≥ 2-voud) bij ten minste 50% van de CVS-individuen 1 h na inspanning en het percentage CVS-individuen met een repons op complement-gen-expressie steeg tot 88% als individuen met over-expressie van C4 of MASP2 werden gecombineerd. Verdere analyse identificeerde een significant verschil in het niveau van MASP2 mRNA tussen CVS- en controle-individuen 1 h na inspanning. Dit verschil in MASP2 mRNA liijkt te wijten aan een significante maar voorbijgaande downregulering bij controle-individuen. MASP2 expressie was bijna gelijk in beide groepen 6 h na inspanning. Deze significante verandering in MASP2 expressie 1 h na inspanning werd geïdentifieerd onafhankelijk van de gebruikte methode, wat er op wijst dat de hier geobserveerde rol van het door MASP2 gemedieerd lectine-mechanisme na inspanning waarschijnlijk reproduceerbaar is, niettegenstaande de beperkte grootte van de groepen in deze studie. […]

De huidige gegevens adresseren niet onmiddellijk de aktivatie van het complement-systeem tijdens of na inspanning. Wat ook de trigger moge zijn, het zou kunnen dat aktivatie van monocyten is betrokken aangezien deze een gemeenschappelijke bron van C4, MASP2 en ficolinen kunnen zijn. Binding van ficolinen in samengang met MASP2 en C4 initieert splitsing van C4, wat leidt tot de afgifte van C4a (tesamen met andere componenten van het klassieke mechanisme). FCN1 (M-ficoline) en FCN2 (L-ficoline), gelokaliseerd op chromosoom 9q34 en 22 kb van elkaar gescheiden, werden beide gedetekteerd in PBMCs, waarbij FCN1 meer tot expressie kwamen in PBMCs dan FCN2 en ook verschillend tussen CVS- en controle-individuen. Alhoewel FCN1 tot op heden enkel werd geassocieerd met monocyten, neutrofielen en milt-cellen en werd gehypothiseerd dat het een secretoir proteïne is, werd het recent bij lage concentraties gevonden in serum. Indien afgegeven door monocyten, zou FCN1 kunnen binden aan een gans gamma van zijn liganden, geacetyleerde suikers of proteïnen, die overmatig aanwezig zijn tijdens of na inspanning.

Eerdere rapporten over serum- of plasma-waarden van complement-aktivatie-produkten suggereert dat C-aktivatie onmiddellijk bij uitputtende inspanning plaatsvindt maar trager bij de individuen in deze studie die zich sub-maximaal inspanden. De trend voor downregulering van expressie met een terugkeer naar basale waarden, die de geaktiveerde proteïnen meerdere uren voorafgaat bij controle-individuen, komt overeen met ingebouwde regulerende processen inherent aan het complement-systeem. In tegenstelling bleef expressie van meerdere complement-genen op een hoger niveau bij CVS-individuen voor en na inspanning, wat wijst op een tekort aan transcriptionele respons in de acute fase bij deze genen wat kan leiden tot gelokaliseerde en oncontroleerbare door inflammatie gemedieerde weefsel-schade [Markiewski MM; Lambris JD. The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight. Am J Pathol. 2007;171:715-727]. Het lectine-mechanisme wordt mogelijk ook geaktiveerd via translokatie van microbiële produkten van de darm (zou gebeuren tijdens inspanning) [Shek PN; Shephard RJ. Physical exercise as a human model of limited inflammatory response. Can J Physiol Pharmacol 1998;76:589-597] of andere gebeurtenissen zoals infektie, letsel of vaccinatie die lokale inflammatie kan veroorzaken en een gamma aan auto-immuun ziekten. Deze situaties kunnen leiden tot verhoogd C4a bij CVS-individuen vergeleken met controles en dit C4a kan een regulerende rol spelen bij inflammatie door het inhiberen van monocyten-chemotaxis of via funkties lijkend op C3a ‘aktivator en inhibitor’ sequenties zoals voorgesteld door proposed Erdei et al. (2004). Een anti-inflammatoire rol zou samenvallen met de downregulering van MASP2 expressie bij controle-individuen, 1 h na inspanning.

Mechanismen die de expressie van MASP2 reguleren zijn tot op heden onbekend maar er is wel een rapport over een zwak stimulerend effekt van IL-1B dat wordt opgeheven door IL-6 en een vermeende rol voor de transcriptie-factor Stat 3 bij zijn expressie. Onze bio-informatica analyse van de MASP2 promotor met MatInpsector reveleerde meerdere transcriptie-factor bindingsplaatsen inclusief twee potentiële glucocorticoid responsieve elementen (GRE) gelokaliseerd tussen nucleotide-posities -154 tot -136 en -989 tot -971 (posities genummerd in relatie tot de transcriptie start-plaats). Een centrale rol voor de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as bij het moduleren van post-exertionele malaise bij CVS-individuen in de context van hypocortisolisme werd reeds besproken in de literatuur, zonder verklaringen. Studies aangaande behandeling met steroïden rapporteren een vermindering of een algemene downregulering van complement-aktivatie door glucocorticoïden. Gebaseerd op de aanwezigheid van GRE in de MASP2 promotor en de anti-inflammatoire respons van glucocorticoïden in het algemeen, werd gehypothesieerd dat inspanning bij controle-indviduen cortisol-secretie induceert die MASP2 transcriptie inhibeert via GRE, terwijl ten minste bij een subgroep van CVS-individuen, door inspanning geïnduceerde cortisol-secretie lager ligt dan de drempel (hypocortisolisme) waarbij MASP2 expressie wordt geïnhibeerd. Hoewel cortisol in deze studie niet werd gemeten, hebben andere studies significante stijging van cortisol en zijn correlatie met prestaties na inspanning gerapporteerd bij gezonde individuen. Accumulerend bewijsmateriaal suggereert dat fysieke inspanning, afhankelijk van het soort inspanning en individu-karakteristieken, een krachtige modulator van de HPA-as kan zijn en het centraal zenuwstelsel in het algemeen kan beïnvloeden. Het complement-systeem zou, alleenstaand of inter-agerend met pro-inflammatoire cytokinen, een mogelijke link kunnen zijn in de bidirectionele communicatie tussen de HPA-as en immuun-funkties die waarschijnlijk veranderd zijn bij individuen met CVS.

Onze bevindingen zouden enkel mogen worden veralgemeend in het licht van de besperkingen in het studie-ontwerp. Een eerdere studie die de significante stijging in C4a splitingsprodukt meldde [Sorensen B; Streib JE; Strand M; Make B; Giclas PC; Fleshner M; Jones JF. Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J Allergy Clin Immunol. 2003;112:397-403] en de huidige studie die de transcriptie-veranderingen in complement-genen onderzocht maakten gebruik van individuen uit dezelfde recrutering. Leeftijd en geslacht van de CVS- en controle-individuen werden gematcht in de C4a splitingsprodukt studie maar dit werd niet behouden in de huidige studie. We onderzochten veranderingen qua gen-expressie in PBMCs, een niet-invasieve bron voor de ontdekking en validatie van een biomerker. PBMCs zijn echter mengelingen van lymfocyten en monocyten, en de bevindingen als zodanig reflekteren cel-type specifieke responsen niet. Verder blijft het te bekijken of de geobserveerde transcriptionele veranderingen in complement-genen worden weerspiegeld in hun plasma proteïne-waarden.

Tot besluit: deze studie detekteerde expressie van én het klassiek én het lectine-mechanisme in PBMCs van normale gezonde en CVS-individuen, maar transcriptie van componenten van het lectine-mechanisme (C4 en MASP2) was hoger bij CVS-individuen 1 h na inspanning. Hogere expressie van C4 en MASP2 zou kunnen bijdragen tot de verhoogde C4a splitsingsprodukten bij CVS-individuen 6 h na inspanning. Expressie van MASP2 was significant ge-downreguleerd bij controle-individuen 1 h na inspanning en deze downregulering wordt mogelijks gemedieerd door het anti-inflammatoir effekt van cortisol in respons op inspanning. Verdere studies zijn nodig om de differentiële expressie van complement-genen en zijn mogelijke link met inflammatie en cortisol-secretie na inspanning te bevestigen.

 

SAMENVATTING

Complement-aktivatie resulterend in een significante stijging van C4a splitsingsprodukt zou een merker voor post-exertionele malaise bij CVS-individuen kunnen zijn. Deze studie was gericht op het identificeren van de transcriptionele controle die zou kunnen bijdragen tot het verhoogd C4a bij CVS-individuen na inspanning. Differentiële expressie van genen van het klassiceke en het lectine-mechanisme werd geëvalueerd in perifeer bloed mononucleaire cellen d.m.v. kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR. […] All negen geteste genen, uitgezonderd mannose-binding lectin 2 (MBL2), kwam tot expressie in PBMCs. 1 h na inspanning werden hogere waarden (≥ 2-voud) C4, mannan-bindend lectine serine-protease 2 (MASP2) en ficoline 1(FCN1 ) transcripten gedetekteerd bij ten minste 50% CVS-individuen, wat steeg tot 88% CVS-individuen als deze met over-expressie van C4 of MASP2 werden gecombineerd. Enkel de stijging in MASP2 transcript was statistisch significant Dit zou kunnen te wijten zijn aan de significante maar voorbijgaande downregulering van MASP2 bij controles. 6 h na inspanning was MASP2 expressie gelijkaardig bij beide groepen. We besluiten dat het lectine-mechanisme verschillend reageerde bij CVS- en controle-individuen na inspanning. MASP2 downregulering zou een anti-inflammatoire acute-fase respons bij gezonde controles kunnen zijn, terwijl de verhoogde waarden verantwoordelijk kunnen zijn voor verhoogde C4a en inflammatie-gemedieerde post-exertionele malaise bij CVS-individuen.

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: