M.E.(cvs)-wetenschap

september 1, 2008

Dysfunktie van het Isoprenoid Systeem bij M.E.(cvs)

Filed under: Celbiologie,Diagnostiek — mewetenschap @ 2:17 pm
Tags: , , , ,

In 2003 poneerde een neuroloog-researcher uit India, Dr Kurup, een aantal hypothesen gebaseerd op defekten in het zogenaamde ‘isoprenoid pathway’. Hij beschreef in twee artikels (‘Isoprenoid pathway dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome’; Acta Neuropsychiatrica (2003) 15(5): 266-273 en ‘Hypothalamic digoxin, cerebral chemical dominance and Myalgic Encephalomyelitis’; International Journal of Neuroscience (2003) 113(5): 683-701) een reeks mogelijke verklaringen voor de symptomen van M.E.(cvs). Het lijkt me dat hier niet genoeg aandacht is besteed en gezien de mogelijke implicaties naar diagnostiek toe, wil ik deze informatie eens belichten. Hopelijk zijn er onderzoekers die hier willen op voortbouwen… We proberen contacten te leggen…

Het ‘isoprenoid biosynthese pathway’ is cruciaal bij cellulaire regulatie en voorziet cellen van meerdere bio-aktieve molekulen (waaronder digoxine, dolichol, ubiquinon – Co-enzym Q10, isoprenyl-groepen, de polyprenyl-keten van haem-A en sterolen). Een bekend voorbeeld van een isoprenoid is cholesterol. Isoprenoiden worden in verschillende stappen opgebouwd uit stoffen als vetten, suikers en aminozuren. Elke stap wordt verzorgd door een enzyme. Anti-oxidanten zoals vitamine-A, het Co-enzym Q10 of squaleen (non-sterole isoprenoïden) bevatten zgn. isoprene eenheden. Squaleen-synthase (SQS) is het enzyme dat bepaalt dat de sterol-biosynthese tak van de ‘pathway’ wordt gekozen. Poly-isoprenoïde alkoholen (polyprenolen en dolicholen) zijn lineaire polymeren bestaande uit tot meer dan 100 isopreen-eenheden (geïdentifieerd in bijna alle levende organismen). Een ander belangrijk enzymein deze ‘pathway’ is het 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase.

Specifieke inhibitie van de cholesterol-biosynthese tak van het ‘mevalonate/isoprenoid pathway’ induceert kanker-cel sterfte.

Voor het M.E.(cvs)-verhaal zijn er 3 belangrijke metabolieten: digoxine (membraan natrium-kalium-ATPase inhibitor en regulator van neurotransmitter-transport), dolichol (reguleert N-glycosylatie van proteïnen) en ubiquinon (opruimer van vrije radikalen). Hypothalamisch digoxine, is een endogene inhibitor van membraan Na(+)-K(+) ATPase (een ionenpomp) gesecreteerd door onze hypothalamus, en regulator van immuun-aktivatie en synaptische neurotransmissie. Ubiquinon is van groot belang in de mitochondriale elektron-transport-keten. Cholesterol is een belangrijke component van cellulaire membranen. Hieronder leest u meer over de studie. Besef wel dat de metingen slechts bij 15 patiënten gebeurden (het ene artikel spreekt over M.E., het andere over CVS; afhankelijk van de gebruikte criteria). En nog even meegeven dat bij het ouder worden er een progressieve stijding in het brein is aan dolichol een een afname aan ubiquinon.

Dolichol refereert naar verbindingen uit een groep aan lange-keten, meestal onverzadigde, organische molekulen die bestaan uit een variërend aantal of isopreen-eenheden die eindigen op een α-verzadigde isoprenoid groep, en een alkohol-groep bevatten. Dolicholen worden vastgehecht aan proteïnen tijdens post-translationele modifikatie. Ze aktiveren en verankeren suiker-molekulen op cellulaire membranen. Daarenboven spelen ze een belangrijke rol bij N-glycosylatie van proteïnen onder de vorm van dolichol-pyrofosfaat. Dolichol is ook betrokken bij de transfer van monosacchariden. Dolichol stapelt zich met verloop van tijd in de weefsels op en werd gesuggereerd als biomerker voor ouder-worden (J Gerontol A Biol Sci Med Sci. (2005) 60(1):39-43)

Het is een produkt van de HMG-CoA reductase pathway en karakteristiek voor alle terpenen die geproduceerd worden via de ‘mevalonate-pathway’.

Proteïnen kunnen door een groot aantal covalent-gebonden sacchariden worden gemodificeerd. Er zijn twee types reakties: proteïne N-glycosylatie en proteïne O-mannosylatie; deze zijn, op enkele uitzonderingen na, evolutionair, van gist tot mens, bewaard gebleven. De glycosylatie-processen hebben dolichol-geaktiveerde voorlopers nodig. Er bestaan ernstige ontwikkelingsstorrnissen bij kinderen die gerelateerd zijn met proteïne-glycosylatie (bv. CDG-syndroom = congenital disorders of glycosylation, erfelijke glycosylatie-stoornissen)…

Isoprenoid pathway dysfunction in Chronic Fatigue Syndrome (Acta Neuropsychiatrica 2003)

Hypothalamic digoxin, cerebral chemical dominance and Myalgic Encephalomyelitis (International Journal of Neuroscience 2003)

Ravi Kumar Kurup1, Parameswara Achutha Kurup2 *

1 Department of Neurology, Medical College Hospital, Trivandrum, Kerala, India

2 Metabolic Disorders Research Centre, Trivandrum, Kerala, India

*Dr P. A. Kurup, Gouri Sadan,T.C.4/1525, North of Cliff House, Kattu Road, Kowdiar P.O.,Trivandrum, Kerala, India

SAMENVATTING

Achtergrond en doelstellingen: De ‘isoprenoid pathway’ werd onderzocht bij 15 patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS).

Methodes: De isoprenoid metabolieten – digoxine, dolichol en ubiquinon – RBC membraan Na+-K+ ATPase aktiviteit, serum magnesium en tyrosine/tryptofaan katabole patronen werden bepaald. Het vrije radikalen metabolisme, glycoconjugate- metabolisme en RBC-membraan samenstelling werden ook onderzocht.

Resultaten: Membraan Na+-K+ ATPase aktiviteit en serum magnesium-waarden waren gedaald terwijl HMG-CoA reductase aktiviteit en serum digoxine-waarden verhoogd waren bij Myalgic Encephalomyelitis (M.E.) / CVS. Er waren verhoogde waarden voor tryptofaan-katabolieten – nicotine, strychnine, quinolinezuur en serotonine – en verlaagde waarden voor tyrosine-katabolieten – dopamine, norepinefrine en morfine – bij M.E. / CVS. Er was een stijging van dolichol-gehaltes, koolhydraat-residuen van glycoproteïnen, glycolipiden, totale/individuele glycosaminoglycaan (GAG) frakties en lysosomale enzymen bij M.E. / CVS. Verminderde gehaltes ubiquinon, verlaagd glutathion en vrije radikalen opruiminende enzymen zowel als verhoogde lipiden-peroxidatie produkten en stikstofoxide werden opgemerkt bij M.E. / CVS.

Conclusies: De rol van hypothalamisch digoxine en neurotransmitter-geïnduceerded immuun-aktivatie, gewijzigd glycoconjugaat-metabolisme en de daaruit resulterende defekte presentatie van virale antigenen, NMDA excitotoxiciteit en cognitieve en mitochondriale dysfunktie in de pathogenese van M.E. / CVS wordt beklemtoond.

RESULTATEN

De aktiviteit van HMG CoA reductase en de concentratie aan digoxine en dolichol waren verhoogd bij M.E. / CVS. De concentratie aan serum-ubiquinon, de aktiviteit van erythrocyt-membraan Na+-K+ ATPase en serum-magnesium waren verminderd.

De concentraties aan tryptofaan, quinolinezuur en serotonine in het plasma waren verhoogd terwijl deze van tyrosine, dopamine en norepinefrine [noradrenaline] verlaagd waren. Nicotine en strychnine waren detekteerbaar in plasma van patiënten met M.E. / CVS maar niet bij de controles. Morfine was niet detekteerbaae in in plasma van M.E.- / CVS-patiënten.

Totale glycosaminoglycanen (GAG) in het serum is verlaagd bij M.E. / CVS. De concentraties aan heparine-sulfaat (HS), heparine (H), dermatan-sulfaat (DS), chondroïtine-sulfaten (ChS) en hyaluronzuur (HA) waren verhoogd. De concentratie aan totaal hexose, fucose en siaalzuur was verhoogd in de glycoproteïnen in het serum van deze patiënten. De concentratie aan gangliosiden, glycosyl-diglyceriden, cerebroside en sulfatide vertoonden een significante stijging in het serum van deze patiënten.

De aktiviteit van de glycosaminoglycaan-afbrekende enzymen – beta-glucuronidase, beta-N-acetyl-hexosaminidase, hyaluronidase en cathepsine-D – was verhoogd bij M.E. / CVS. De aktiviteit van beta-galactosidase, beta-fucosidase en beta-glucosidase was hoger bij M.E. / CVS.

De concentratie aan totaal GAG en hexose- en fucose-residuen van glycoproteïnen in de RBC-membranen was significant verlaagd bij M.E. / CVS. De concentratie aan RBC-membraan cholesterol was gestegen bij M.E. / CVS, terwijl die van de fosfolipiden was verlaagd. De verhouding cholesterol:fosfolipiden in de RBC-membranen was gestegen bij M.E. / CVS.

De aktiviteit van superoxide-dismutase (SOD), katalase, glutathion-reductase en glutathion-peroxidase in de erythrocyten was significant gedaald bij M.E. / CVS. De concentraties aan MDA, hydroperoxiden, geconjugeerde diënen en NO waren significant verhoogd. De concentratie aan glutathion was verlaagd bij M.E. / CVS. Ijzer-bindingscapaciteit, ceruloplasmine [proteïne dat in het bloed zorgt voor het transport van koper-ionen] en albumine waren significant verlaagd bij M.E. / CVS.

DISCUSSIE

De toename van de HMG CoA reductase aktiviteit bij M.E. / CVS suggereert een upregulatie van de ‘isoprenoid pathway’. Er is een uitgesproken stijging van het plasma-digoxine en -dolichol en dit kan het gevolg zijn van een toegnomen kanalisatie van intermediairen van deze ‘isoprenoid pathway’ voor hun biosynthese. De toename van endogeen digoxine, een krachtige inhibitor van membraan Na+-K+ ATPase, kan de aktiviteit hiervan doen dalen. Bij M.E. / CVS was er een significante inhibitie van de RBC-membraan Na+-K+ ATPase aktiviteit.

Deze inhibitie staat bekend een stijging van intracellulair calcium te veroorzaken, resulterend uit gestegen Na+-Ca2+ uitwisseling, verhoogde insijpeling van calcium en verhoogde afgifte van calcium uit de intracellulaire endoplasmatisch reticulum calcium-voorraden. Deze stijging van het intracellulair calcium, door het verdrijven van magnesium van zijn bindingsplaatsen, veroorzaakt een daling van de funktionele beschikbaarheid van magnesium wat verminderde mitochondriale ATP-vorming kan veroorzaken. Laag intracellulair magnesium en hoog intracellulair calcium door Na+-K+ ATPase inhibitie lijkt cruciaal voor de pathofysiologie van M.E. / CVS.

Gestegen intracellulair calcium aktiveert het calcium-afhankelijke calcineurine-signalisatie-transduktie mechanisme [calcineurine is een sleutel-enzyme, een fosfatase, in de Ca signaal-transductie binnen de cel; in de hippocampus speelt het ook een cruciale rol bij het aanpassen van het geheugen] dat T-cel aktivatie en secretie van interleukine-3, -4, -5, -6 en TNF-alfa kan veroorzaken. TNF-alfa bindt op zijn receptor TNFRI en aktiveert de transcriptie-factoren NF-kB en AP-1, wat leidt tot de inductie van pro-inflammatoire en immunomodulerende genen. Dit kan de immuun-aktivatie bij M.E. / CVS verklaren.

Digoxine kan het transport van aminozuren en verscheidene neurotransmitters beïnvloeden. Twee aminozuren zijn belangrijk: tryptofaan, een voorloper voor strychnine en nicotine; en tyrosine, een voorloper voor morfine. De resultaten toonden dat de concentraties aan tryptofaan, quinolinezuur, nicotine, strychnine en serotonine in het plasma van patiënten met M.E. / CVS hoger was, terwijl die van tyrosine, morfine, dopamine en norepinefrine lager waren. Er is dus een toename aan tryptofaan en zijn katabolieten en een afname aan tyrosine en zijn katabolieten in het serum van patiënten. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat digoxine het aminozuur transport-systeem kan regelen ten voordele van tryptofaan-transport i.p.v. tyrosine. De daling in membraan Na+-K+ ATPase aktiviteit bij M.E. / CVS kan te wijten zijn aan het feit dat de hyper-polariserende neurotransmitters (dopamine, morfine en norepinefrine) verminderd zijn en de depolariserende neuro-aktieve stoffen (serotonine, strychnine, nicotine en quinolinezuur) gestegen. […]

Door de hypo-magnesemie, wordt de Mg2+ blokkage op de NMDA-receptor verwijderd, wat leidt tot NMDA-excitotoxiciteit. [(N-methyl-D-aspartaat)receptor medieert normale excitatorische neurotransmissie, bij (overprikkeling) excitotoxiciteit loopt deze uit de hand en kan leidend tot sterfte van neuronen] Het gestegen pre-synaptisch neuronaal Ca2+ kan aanleiding geven tot cyclisch AMP-afhankelijke fosforylatie van synapsinen [deze zijn van belang voor de efficiëntie van de signaaloverdracht in neuronale netwerken], resulterend in verhoogde neurotransmitter-release in de synaps en vesikulaire recyclage. Gestegen intracellulair Ca2+ in het post-synaptische neuron kan ook de Ca2+-afhankelijke NMDA-signaal-transductie aktiveren. […] De verhoogde waarden van de positieve NMDA-modulatoren quinolinezuur, strychnine en serotonine kunnen ook bijdragen tot NMDA-excitotoxiciteit. Deze is betrokken bij neuronale degeneratie en zou kunnen bijdragen tot de veranderde hersen-funktie, inclusief concentratie-verlies en geheugen, bij M.E. / CVS.

Quinolinezuur is betrokken bij immuun-aktivatie bij andere auto-immune ziekten zoals systemische lupus erythematosus (SLE) en zou tot hetzelfde kunnen bijdragen bij M.E. / CVS. Serotonine-, dopamine- en norepinefrine-receptoren warden aangetoond op de lymfocyten. Er zijn rapporten dat serotonine is gestegen, met een corresponderende reductie in dopamine en norepinefrine in de mono-aminerge kernen van de hersenstam tijdens immuun-aktivatie. Zo kunnen verhoogd serotonine en verlaagd norepinefrine en dopamine bijdragen tot de immuun-aktivatie bij M.E. / CVS. Endogene morfine-deficiëntie wordt opgemerkt bij patiënten met M.E. / CVS. Morfine heeft immuun-suppressieve effekten en een deficiëntie kan ook bijdragen tot de immuun-aktivatie bij M.E. / CVS.

Mg2+ depletie kan het metabolisme van GAG, glycoproteïnen en glycolipiden beïnvloeden . De verhoging in het gehalte van dolichol kan zijn verhoogde beschikbaarheid voor N-glycosylatie van proteïnen suggeren. Magnesium-deficiëntie kan leiden tot verhoogde cerebroside- [cerebrosiden zijn glycosfingolipiden die een belangrijk onderdeel vormen van o.a. zenuwcel-membranen;. myeline is het best bekende cerebroside] en ganglioside- [glycosfingolipiden die zich bevinden aan de buitenzijde van de zenuwbanen, met name op de plek waar een zenuwvezel contact maakt met een spiervezel; ze spelen een cruciale rol bij het overbrengen van de boodschap] synthese. Bij Mg2+-deficiëntie zijn de glycolyse, citroenzuur-cyclus en oxidatieve fosforylatie geblokkeerd, en wordt meer glucose-6-fosfaat naar de synthese van GAG geleid. De resultaten tonen een stijging van de concentraties van totale en differentiële GAG-frakties in serum, glycolipiden en koolhydraat-componenten voor glycoproteïnen bij M.E. / CVS. De verhoging van de koolhydraat-componenten, totaal hexose, fucose en sialzuur is niet in dezelfde mate, wat kwalitatieve verandering in de glycoproteïne-struktuur suggereert. Bij M.E.- / CVS-patiënten is de aktiviteit van GAG-afbrekende enzymen en glycohydrolasen significant verhoogd. Intracellulaire Mg2+-deficiëntie resulteert ook in defekte ubiquitine-afhankelijke proteolytische verwerking van glycoconjugaten, aangezien dit Mg2+ nodig heeft bij zijn werking. De verhoging van de aktiviteit van glycohydrolasen en GAG-afbrekende enzymen zou te wijten kunnen zijn aan een verminderde lysosomale stabiliteit en daaruitvolgende lekkage van lysosomale enzymen in het serum. De stijging van de concentratie aan koolhydraat-componenten van glycoproteïnen en GAG, niettegenstaande de verhoogde aktiviteit van glycohydrolasen, kan te wijten zijn aan hun mogelijke resistentie tegen afbraak door glycohydrolasen ten gevolgde verandering van hun struktuur. Proteoglycan-complexen gevormd in aanwezigheid van veranderde calcium/magnesium-verhoudingen intracellulair zijn mogelijks struktureel abnormaal en resistent aan lysosomale enzymen.

De defekte proteïne-verwerking kan resulteren in gebrekkige glycosylatie van exogene virale glycoproteïne-antigenen met daaruitvolgende ondeugdelijke vorming van het MHC-glycoproteïne-antigen complex. De MHC-gebonden peptide-transporter, een P-glycoproteïne dat MHC-antigen-complex transporteert naar het oppervlak van de antigen-presenterende cel, heeft een ATP-bindingsplaats. De peptide-transporter is dysfunktioneel bij magnesium-deficiëntie. Dit resulteert in gebrekkig transport van MHC klasse 1 – viraal glycoproteïne-antigen-complex naar het oppervlak van de antigen-presenterende cel voor herkenning foor CD4- of CD8-cellen. Defekte presentatie van exogene virale antigenen kan aanleiding geven tot immuniteits-ontwijking door het virus bij CVS en virale persistentie. Dit zou de reden kunnen zijn voor de persistentie van enterovirus en EBV bij M.E. / CVS. Een aantal fucose- en siaalzuur-bevattende natuurlijke liganden zijn betrokken bij de adhesie van lymfocyten, leukocyten-trafiek en migratie in de perivasculaire ruimte, en hetzelfde fenomeen zou kunnen bijdragen tot de pathologie van M.E. / CVS.

De verandering in het ‘isoprenoid pathway’, cholesterol, glycoproteïnen en GAG kunen cellulaire membranen aantasten. de upregulatie van het ‘isoprenoid pathway’ kan leiden tot verhoogde cholesterol-synthese en magnesium-deficiëntie kan de fosfolipiden-synthese inhiberen. Fofolipiden-degradatie is verhoogd door toename van intracellulair calcium die fosfolipasen A2 en D aktiveren. De cholesterol:fosfolipiden verhouding in het RBC-membraan is gestegen bij M.E. / CVS.

De concentratie aan totaal GAG, hexose en fucose van glycoproteïne is gedaald in het RBC-membraan en verhoogd in het serum, wat wijst op een gereduceerde incorporatie in het membraan en gebrekkige membraan-vorming. De membraan-trafiek hangt af van GTPasen en lipide-kinasen die cruciaal afhankelijk zijn van magnesium. De verandering van de membraan-struktuur voortkomend uit de wijziging van glycoconjugaten en cholesterol:fosfolipiden ratio kan veranderingen veroorzaken in de opbouw van natrium-kalium ATPase, resulterend in verdere Na+-K+ ATPase inhibitie in de membranen. Dezelfde veranderingen tasten mogelijks de struktuur van organellen-membranen aan. Dit resulteert in gebrekkige lysosomale stabiliteit en lekkage van glycohydrolasen en GAG-afbrekende enzymen naar het serum.

Defekte peroxisomale membranen kan leiden tot katalase-dysfunktie die reeds werd gedocumenteerd bij M.E. / CVS.

De concentratie aan ubiquinon is significant gedaald bij M.E. / CVS; wat kan veroorzaakt zijn door lage tyrosine-gehaltes, ten gevolge het effekt van digoxine dat preferentieel het tryptofaan-transport bevoordeelt ten nadele van tyrosine. De aromatische ring van ubiquinon komt van tyrosine. Ubiquinon, een belangrijke component van de mitochondriale elektron-transport-keten, is een anti-oxidant en contribueert tot het opruimen van vrije radikalen. De toename aan intracellulair calcium kan de mitochondriale PT [‘Permeability Transition’; toestand van verhoogde doordringbaarheid: opengaan van een grote porie, de mitochondriale overgang, in de binnenste membraan; de grootte van de opening wordt verhoogd door calcium en verlaagd door magnesium; in ischemische situaties, waarin deze porie door calcium-influx wordt geopend, kan magnesium op deze wijze een beschermende rol spelen] porie openen, wat een inéénstorting van de waterstof-gradient over het binnenste membraan en ontkoppeling van de respiratoire keten veroorzaakt. Intracellulaire magnesium deficiëntie kan leiden tot een defekt in de werking van ATP-synthase. Dit alles veroorzaakt defekten in de mitochondriale oxidatieve fosforylatie, onvolledige reductie van zuurstof en generatie van superoxide-ionen, wat lipiden-peroxidatie oplevert. Ubiquinon-deficiëntie leidt ook tot verminderde opruiming van vrije radikalen. De stijging van intracellulair calcium leidt mogelijks tot verhoogde generatie van NO door de inductie van het enzyme stikstof-oxide synthase dat met de superoxide-radikalen peroxynitriet vormt. Verhoogd calcium kan ook fosfolipase-A2 aktiveren, wat resulteert in verhoogde generatie van arachidonzuur dat lipiden-peroxidatie kan ondergaan. Magnesium-deficiëntie kan de funktie van glutathion-synthase en glutathion-reductase aantasten. Het mitochondriaal SOD lekt en wordt dysfunktioneel. […] Vorming van vrije radikalen gerelateerd aan mitochondriale dysfunktie is mogelijks betrokken bij de pathogenese van M.E. / CVS. Deze mitochondriale dysfunktie kan verantwoordelijk zijn voor de bij M.E. / CVS bekende spierpijn en vermoeidheid.

Het verhoogde intracellulair calcium en ceramide- [een sfingolipide in celmembranen waarvan bekend is dat het signalen door kan geven die leiden tot celdood] gerelateerde opening van de mitochondriale PT porie leidt tot volume-deregulatie van de mitochondria, wat hyper-osmolaliteit van de matrix en expansie van de matrix-ruimte veroorzaakt. Het buitenste membraan van de mitochondria breekt en laat apoptose-inducerende factor en cytochrome-C vrij in het cytoplasma. Dit resulteert in activatie van caspase-9 en caspase-3. Caspase-9 kan cel-apoptose teweegbrenegen. Verhoogde apoptose kan ook brijdragen tot de pathogenese van M.E. / CVS.

Retrovirussen worden ook gelinkt aan de pathogenese van M.E. / CVS. Het retroviraal genoom wordt waarschijnlijk geïntegreerd in het menselijk genoom, als endogene pro-virussen. De retrovirale transposons worden stil gehouden door DNA-methylatie. Verhoogde secretie van hypothalamisch digoxine draagt bij tot een intracellulaire magnesium-deficiënctie, wat leidt tot een gebrekkige DNA-methylatie. DNA-methylatie vraagt een overvloedige voorraad S-adenosyl-methionine die magnesium vergt voor zijn generatie. In de aanwezigheid van hyper-digoxinemie is de DNA-methylatie ondeugdelijk en worden de retrovirale transposons geaktiveerd en geëxprimeerd. Dit kan leiden tot transcriptie van retrovirale proteïnen, het samenstellen van het virus en retrovirale persistentie.

Zodoende kan de ‘isoprenoid pathway’ en endogene Na+-K+ ATPase inhibitie een rol spelen in het ontstaan van M.E. / CVS. […]

Geef een reactie »

Nog geen reacties

RSS feed for comments on this post. TrackBack URI

Geef een reactie

Vul je gegevens in of klik op een icoon om in te loggen.

WordPress.com logo

Je reageert onder je WordPress.com account. Log uit / Bijwerken )

Twitter-afbeelding

Je reageert onder je Twitter account. Log uit / Bijwerken )

Facebook foto

Je reageert onder je Facebook account. Log uit / Bijwerken )

Google+ photo

Je reageert onder je Google+ account. Log uit / Bijwerken )

Verbinden met %s

Maak een gratis website of blog op WordPress.com.

%d bloggers op de volgende wijze: