XMRV & MLV => scepsis

De XMRV-controverse blijft aanhouden en dat zal nog een periode zo zijn. Niettegenstaande alle nuances en zelfs waarschuwingen van gedegen, onafhankelijke wetenschappers is er echter een grote groep patiënten die voorbarig beweert dat XMRV de oorzaak van M.E.(cvs) is, dure/niet-gevalideerde testen (zelfs meermaals) laat uitvoeren en sommigen die zelfs niet-aangewezen/ gevaarlijke anti-retrovirale therapieën starten. We dachten hierover niet verder te rapporteren (positief noch negatief) tot er onweerlegbare duidelijkheid is maar gezien de vele vragen en misverstanden, gaan we er toch nog even kort op in. Na de negatieve Europese studies, was er die van het CDC (ook negatief) en velen zagen dan ook uit naar de PNAS studie. Het moet uit de duiding die hierover werd gegeven in het wetenschappelijk tijdschrift ‘Science’ (dat ook de oorspronkelijke WPI studie publiceerde) te begrijpen vallen dat er niet echt een replicatie gebeurd is van de studie van Mikovits en dat er nog meer verwarring ontstaan is…

Zie ook de andere stukken i.v.m. XMRV op deze pagina’s: ‘XMRV bij M.E.(cvs)’, ‘XMRV controverse’ & ‘Afwezigheid van XMRV bij CVS-patiënten uit het V.K.’.

Science (www.sciencemag.org) Vol 329 (augustus 2010), p. 1000 (by Martin Enserink)

Nieuw XMRV artikel ziet er goed uit, geven sceptici toe – Toch blijft de twijfel hangen

De plot wordt sterker. Een lang verwacht artikel door Amerikaanse gouvernementele labs over het verband tussen een virus en het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) zag uiteindelijk het licht. De studie bevestigt een controversieel artikel uit 2009 waarin werd gemeld dat CVS-patiënten vaak besmet zijn met het virus, genaamd XMRV. Sindsdien hebben vier andere studies deze bevindingen niet kunnen dupliceren. Zelfs sceptici zijn onder de indruk over hoeveel zorg de auteurs van de nieuwe studie namen om de nauwkeurigheid te waarborgen. Maar dat maakt het des te verbijsterend waarom sommige labs het virus makkelijk detekteren, terwijl anderen er geen spoor van kunnen vinden bij patiënten.

Het nieuwe artikel, gepubliceerd in de ‘Proceedings of the National Academy of Sciences’ (PNAS), draagt ook bij tot de verwarring: in plaats van XMRV zelf, vond het team een bredere en meer diverse groep van nauw verwante virussen. Dat leidt sommige critici er toe te zeggen dat het artikel gaat over een nieuwe bevinding, geen bevestiging van het eerste artikel. “Laten we duidelijk zijn. Dit is een ander virus.”, zegt Myra McClure, retrovirologe van het ‘Imperial College London’, een co-auteur van één van de vier negatieve studies.

De controverse begon in oktober 2009, toen een team geleid door Judy Mikovits van het Whittemore Peterson Instituut (WPI) in Reno, Nevada, in Science rapporteerde [zie links hierboven] dat 67% van de CVS-patiënten besmet waren met XMRV, vergeleken met slechts 3,4% van gezonde controles. De studie veroorzaakte grote opwinding onder patiënten en de wekte hoop op een behandeling. Maar toen vier andere groepen niet in staat bleken om de resultaten te herhalen, vermoedden sommigen dat het WPI, een privaat gefinancierd lab waar vele onderzoekers zelfs nooit van hadden gehoord, het wel es verkeerd voor zouden kunnen hebben.

Amerikaanse overheid-labs bevonden zich al snel aan tegengestelde kanten in het debat. Onderzoekers van de ‘Centres for Disease Control en Prevention’ (CDC) konden het virus niet vinden, terwijl de nieuwe studie – door wetenschappers van de ‘Food and Drug Administration’ (FDA), de ‘National Institutes of Health’ (NIH) en de ‘Harvard Medical School’ – zeggen dat Mikovits gelijk had. Beide groepen hielden hun artikels tijdelijk op standby om hun resultaten te controleren en te proberen begrijpen wat er gaande was. Beide voelden zich uiteindelijk zelfverzekerd genoeg om te publiceren en het negatieve artikel door de CDC verscheen in Retrovirology in juli.

Wat betreft het PNAS artikel: daar zochten researchers naar sporen van het zogenaamde ‘gag’ gen van XMRV in monsters genomen bij 37 CVS-patiënten midden van de jaren ‘90. Ze vonden bewijs voor het virus in 32 (87%) van de patiënten maar in slechts 3 van de 44 gezonde controles (6,8%). De groep deed veel moeite om fouten te voorkomen, zegt hoofd-auteur Harvey Alter van de NIH Klinisch Centrum. XMRV is nauw verwant met een endogeen muizen-retrovirus, dus testte het team ieder monster dat positief was voor XMRV op sporen van muis mitochondriaal DNA, dat een verklikker zou zijn geweest van laboratorium-contaminatie. Ze vonden er geen. Zij hebben ook verse stalen genomen bij acht van de patiënten en vonden dat, 15 jaar later, ze nog steeds besmet waren en dat het virus was geëvolueerd, “Net zoals we zouden verwachten van een retrovirus”., zegt Alter.

De gegevens lijken solide, erkent Steve Monroe, directeur van de CDC’s afdeling voor ‘Pathogenen en Pathologie van Groot Belang’. “Het is gewoon een goed artikel.”, voegt Reinhard Kurth, viroloog en voormalig directeur van het Robert Koch Instituut in Berlijn, toe. Alter, een alom gerespecteerd viroloog en winnaar van de ‘Albert Lasker Award for Clinical Medical Research’, “weet duidelijk wat hij doet.” Maar Kurth blijft toch sceptisch. Dat geldt ook voor Robin Weiss van het ‘Imperial College London’, die zegt dat hij te veel gevallen heeft gezien van voorgestelde nieuwe menselijke retrovirussen die na nader te zijn bekeken op niets uitdraaiden – met inbegrip van één dat werd gerapporteerd in 1999. “Je kunt een zeer goede reputatie hebben en heel voorzichtig zijn, en het nog steeds bij het verkeerde eind hebben.”, zegt Weiss.

Een deel van het probleem is, zeggen sceptici, dat de onderzoekers niet precies het Science artikel herhaalden. XMRV is een zogenaamd xenotroop muizen-virus, wat betekent dat het niet langer muizen-cellen kan binnendringen maar wel cellen van andere soorten kan infekteren. De PNAS auteurs zeggen dat de virale sequenties die ze vinden zeer divers zijn en meer lijken op de zogenaamde polytrope muizen-virussen, reden waarom zij de term MLV-gerelateerd virus adopteerden voor het muizen-leukemie virus. Maar Alter zegt dat XMRV een subgroep van MLVs is en dat zijn werk de eerdere studie ondersteunt. Mikovits – die “verheugd”’ is met de resultaten – zegt dat haar groep in de tussentijd ook meer diversiteit in het virus heeft gevonden.

Een werkgroep gecoördineerd door het ‘National Heart, Lung and Blood Institute’ (NHLBI) is al aan het proberen uit te vinden waarom zorgvuldige studies van veteraan-wetenschappers dergelijke tegengestelde resultaten kan opleveren. Patient-selektie kan een rol spelen: verschillende studies hebben verschillende diagnostische en recrutering-criteria gebruikt. Maar dan nog: het is moeilijk uit te leggen waarom bij de vier studies geen enkele geïnfekteerde patient zou opgenomen geweest zijn.

Subtiele verschillen bij de staalname en het verwerken of in de wijze waarop testen worden uitgevoerd, kunnen ook geleid hebben tot het feit dat de vier labo’s het virus niet vonden. Maar Monroe van het CDC zegt dat hij ervan overtuigd is dat zijn lab XMRV correct kan identificeren. Als onderdeel van de NHLBI-programma hebben researchers van de FDA, CDC, WPI en andere laboratoria allemaal, geblindeerd, een panel van stalen getest, sommige van hen waren ‘aangerijkt’ met verschillende hoeveelheden van het virus; en die hebben allen goed gepresteerd. Verdere uitwisseling van monsters en reagentia is nu aan de gang. “Ze moeten in staat zijn om hieromtrent duidelijkheid te scheppen tegen kerst.”, zegt Kurth.

Een samenvatting van het FDA/NIH onderzoek in PNAS:

Proceedings of the National Academy of Sciences ot the USA (Preprint augustus 2010)

Detection of MLV-related virus gene sequences in blood of patients with Chronic Fatigue Syndrome and healthy blood donors

Shyh-Ching Lo (a,1), Natalia Pripuzova (a), Bingjie Li (a), Anthony L. Komaroff (b), Guo-Chiuan Hung (a), Richard Wang (c), and Harvey J. Alter (c,1)

a Tissue Microbiology Laboratory, Division of Cellular and Gene Therapies and Division of Human Tissues, Office of Cellular, Tissue and Gene Therapy, Centre for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration, Bethesda, MD 20892;

b Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02115;

c Department of Transfusion Medicine, The Warren Grant Magnuson Clinical Centre, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een ernstige systemische ziekte met onbekende oorzaak. Een studie identificeerde DNA van een ‘xenotroop muizen leukemie virus gerelateerd’ virus (XMRV) in mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) van 68 of 101 patiënten (67%) d.m.v. ‘nested’ PCR, vergeleken met 218 (3,7%) gezonde controles. Vier daaropvolgende rapporten konden echter geen enkele muizen leukemie virus (MLV) gerelateerd virus gen-sequenties detekteren in bloed van CVS-patiënten. We onderzochten 41 van PBMC afgeleide DNA-stalen van 37 patiënten die voldeden aan aanvaarde diagnostische criteria voor CVS en vonden ‘gag’ gen-sequenties van MLV-achtige virussens bij 32 van 37 (86,5%) vergeleken met slechts 3 of 44 (6,8%) gezonde vrijwillige bloed-donoren. Er werd geen bewijs voor contaminatie met muizen-DNA gevonden in het PCR test-systeem of de klinische stalen. Zeven van 8 ‘gag’-positieve patiënten testten opnieuw positief in een staal verkregen 15 jaar later. In tegenstelling met de gerapporteerde bevindingen van quasi genetische gelijkenis van alle XMRVs, identificeerden we een genetisch diverse groep van MLV-gerelateerde virussen. De ‘gag’ en ‘env’ sequenties bij CVS-patiënten waren nauwer gerelateerd met die van polytrope endogene muizen-retrovirussen dan met die van XMRVs en waren zelfs minder nauw verwant dan die van ecotropie MLVs. Verdere studies zijn nodig om te bepalen of dezelfde sterke associatie met MLV-gerelateerde virussen wordt gevonden in andere groepen van patiënten met CVS, of deze virussen een oorzakelijke rol spelen bij de ontwikkeling van CVS en of ze een bedreiging vormen voor de bloed.

Gezien de afwezigheid van genuanceerde aanbevelingen door medische adviseurs van patiënten-verenigingen in de lage landen geven we hier deze van het Britse ‘MEA’ (www.meassociation.org.uk; bij monde van Dr Charles Shepherd) mee. Enkele fragmenten uit hun reaktie op het PNAS artikel…

[…] Het bevestigen of verwerpen van nieuwe bevindingen is een essentieel onderdeel van het wetenschappelijke evaluatie-proces en omvat dat onafhankelijke onderzoek-groepen proberen de resultaten te repliceren of valideren.

Met betrekking tot XMRV zou een echte replicatie-studie exact dezelfde laboratorium-methodes en hetzelfde ‘type’ patiënten die werden gebruikt in de originele Science studie moet omvatten. Een validatie-onderzoek geeft wetenschappers een zekere mate aan flexibiliteit. In het bijzonder biedt het de mogelijkheid voor andere onderzoek-groepen om te proberen de bevindingen te herhalen met behulp van wat ze denken de meest gevoelige en nauwkeurige laboratorium-methodes te zijn waar zij toegang toe hebben voor het testen XMRV.

In het geval van XMRV omvatte de gehele eerste golf van onderzoek validatie-studies. Ten eerste, omdat er geen internationale overeenkomst bestaat over de meest nauwkeurige en gevoelige manier voor het opsporen van XMRV in bloed-stalen. Ten tweede, omdat deze onderzoek-groepen allemaal snel willen gaan snel en de makkelijkste manier om dat te doen, was om opgeslagen bloed-stalen te gebruiken van mensen met die in het verleden de diagnose CVS op basis van onderzoek Fukuda-criteria kregen. Opgeslagen bloed-stalen van mensen die aan de Fukuda én de Canadese criteria (die gebruikt werden in de oorspronkelijke studie) voldeden, zijn niet direct beschikbaar.

[…]

Hoewel zeer valabele kritiek werd geuit over alle negatieve XMRV-studies […] waren een aantal vooraanstaande virologen die werken met retrovirussen en XMRV betrokken; dus deze XMRV-negatieve resultaten moeten ook ernstig worden genomen.

[…]

De PNAS-studie is dus geen echte replicatie-studie en om het met de woorden van de auteurs te zeggen, ze hebben niet geprobeerd de oorspronkelijke studie van Lombardi te repliceren. Lo et al. hebben verschillende laboratorium-methodes en verschillende patiënten-criteria gebruikt en hun bevindingen hebben betrekking op wat MLV-gerelateerde virussen wordt genoemd. De onderzoek-groep heeft segmenten van genetisch materiaal (niet het volledige virus) gevonden van wat zij aanduiden als een genetisch diverse groep van MLV-verwante virussen. Deze sequenties zijn meer verwant aan die van de polytrope endogene muizen-retrovirussen dan aan die van XMRVs – vandaar het gebruik van de term MLV (= muizen leukemie virus) in de titel. Maar ze behoren allemaal tot een nauw verwante familie van retrovirussen.

[…]

Deze resultaten gelden dus voor een eerder bredere groep van M.E./CVS-patiënten dan deze die werd gebruikt in de Lombardi studie en het patient-staal is waarschijnlijk zeer vergelijkbaar met ten minste één van de andere validatie-studies die negatieve bevindingen opleverden wat betreft XMRV. Net als bij sommige van de andere validatie-studies, is het zeer waarschijnlijk dat een aanzienlijk aantal mensen die ook aan de Canadese klinische criteria voldeden, zal opgenomen geweest zijn in deze studie.

[…]

Het bewijs in het PNAS-artikel heeft dus betrekking op een genetisch diverse groep van MLV-verwante virussen met gen-sequenties die meer verwant zijn aan die van polytrope endogene muizen-retrovirussen polytroop muis (mERVs) dan aan die van XMRV. XMRV is een genetische variant van MLV-achtige virussen – dit is dus een subtiel maar relevant onderscheid.

[…]

De auteurs stellen: “Het ultieme bewijs van lage-graad infektie door MLV-verwante virussen bij de mens zal berusten op het aantonen van de integratie van virale genen in het menselijk genoom.”.

[…]

De auteurs wijzen er op dt het vinden van XMRV or MLV genetische sequenties bij personen met M.E./CVS, of enig andere ziekte, geen definitief bewijs vormt voor virale infektie. Verdere research zal nodig zijn vooraleer een definitief besluit kan worden getrokken wat betreft de vraag of MLV-verwante virussen een rol spelen bij de oorzaak van M.E./CVS. Dit is een proces dat veel tijd en onderzoek zal vergen. Een hoge frequentie van MLV-verwante virussen (of XMRV) bij M.E./CVS-patiënten kan een verhoogde vatbaarheid weerspiegelen voor virale infekties te wijten aan de onderliggende immuun-dysfunktie die word gevonden bij M.E./CVS in plaats van een primair oorzakelijk verband bij de pathogenese van M.E./CVS. Met andere woorden: het retrovirus kan net zo goed een ‘onschadelijke passagier’ zijn.

[…]

De MEA blijft van mening dat het geen nut heeft zeer grote sommen geld uit te geven aan bloed-testen die niet goed zijn gevalideerd, voor XMRV (of MLVs). Een positief resultaat is, bij onze huidige stand van kennis, geen diagnostische merker voor M.E./CVS. Ook betekent een negatief resultaat niet dat je geen M.E./CVS hebt. Een positief resultaat zal momenteel geen enkele invloed hebben op behandeling van M.E./CVS en deze informatie zou, bij opname in medische dossiers, te zijner tijd kunnen leiden tot problemen met andere gezondheid-zaken, zoals aanvragen voor verzekeringen of reizen naar het buitenland.

[…]

De auteurs van dit artikel geven geen commentaar of aanbevelingen met betrekking tot het gebruik van antivirale middelen. Anderen (met inbegrip van de auteurs van het begeleidend commentaar-stuk) suggereren echter dat het tijd is om het gebruik van anti-retrovirale therapie (ART) bij M.E./CVS in sommige klinische proeven te beoordelen. Het is algemeen geaccepteerd dat een manier van onderzoek naar de mogelijke oorzaak van een ziekte de beoordeling is van de respons op specifieke vormen van behandeling.

De MEA heeft er al meermaals op gewezen dat dit type klinische proeven met de grootst mogelijke dient te gebeuren, gezien het feit dat ART ernstige bijwerkingen kan hebben. AZT, kan mitochondriale schade veroorzaken – wat uiteraard zeer relevant is bij M.E./CVS. Maar er zijn andere ARTs die lijken aktief te zijn tegen XMRV en veel veiliger in gebruik zijn (bv. reverse transcriptase remmers, zoals tenofovir en emtracitabine).

We hebben er ook op gewezen dat ARTs een zeer beperkt effekt lijken te hebben bij het verminderen van vermoeidheid bij HIV/AIDS en dat dit te wijten zou kunnen zijn aan de immuunsysteem-aktivatie die in deze situatie voordoet, in plaats van aan een direct effekt op de vermindering van de virale belasting van de HIV-infektie. Dus zouden medicijnen die de immuun-aktiviteit dempen (bv. een tumor necrose factor remmer, zoals etanercept) wellicht een meer geschikte manier.

In het V.K. zullen artsen zeer waarschijnlijk niet bereid zijn om het even welk type van antivirale behandeling voor te schrijven op een individuele basis (d.w.z. niet in het kader van een onderzoek). […] Als er iets misgaat door het gebruik van een potentieel giftige antivirale geneesmiddelen, kan de verantwoordelijke arts gerechtelijk worden vervolgd, niettegenstaande de patient het risico aanvaard.

[…]

Door de uitéénlopende resultaten van de verschillende gerespecteerde retrovirale laboratoria, blijft de klinische en wetenschappelijke gemeenschap in onduidelijkheid of sceptisch over het verband tussen retrovirale infectie en M.E./CVS.

[…]

Over het geheel is er geen teken van een echte wetenschappelijke consensus over de vraag of XMRV en / of MLVs een belangrijke rol spelen bij M.E./CVS en veel belangrijke vragen over de prevalentie, de transmissie en pathogenese blijven onbeantwoord.

[…]

Laten we vooral niet vergeten naast onderzoek betreffende bovenstaande piste zeker ook research op andere gebieden relevant voor M.E.(cvs) te blijven aanmoedigen. ALS een retrovirus ooit een oorzaak zou blijken en er een therapie werkt om het uit te roeien dan nog zal de geleden schade moeten hersteld worden… Het is niet evident dat één enkele therapie het gehele ziektebeeld zal verhelpen!

Afwezigheid van XMRV bij CVS-patiënten uit het V.K.

Gezien de aankondiging van de mogelijkheid tot het testen voor XMRV door commerciële laboratoria, willen wij – gezien het ontbreken van een standpunt van patiëntengroepen in ons taalgebied (in tegenstelling tot bv. het V.K.) – nogmaals duidelijk maken dat er, niettegenstaande hardnekkige geruchten, nog steeds geen causaliteit van XMRV bij M.E.(cvs) is aangetoond. We rapporteerden reeds over de te plaatsen vraagtekens bij de beweringen hieromtrent door het ‘WPI Institute’ (zie ‘XMRV bij M.E.(cvs)’) en duidden de tegenstrijdigheden aangegeven door de verschillen qua XMRV bij prostaat-kanker (zie ‘XMRV controverse’). Daarom is veel geld uitgeven voor een dergelijke test (nog) niet aangewezen, temeer daar er helemaal geen behandeling voor handen is.

Aan de oproep tot het proberen repliceren van de resultaten van de Amerikaanse studie werd alvast in het V.K. gehoor gegeven. Eerder werd reeds een eerste melding van totale afwezigheid van XMRV bij M.E.(cvs) gedaan door een research-team van het Londense ‘Kings College Hospital’ (voor de selektie van patiënten) en ‘Imperial College’ (voor het laboratorium-onderzoek) (PLoS ONE 5:1 (2010); Failure to Detect the Novel Retrovirus XMRV in Chronic Fatigue Syndrome). Dit werd door een groot aantal patiënten(-groepen) op veel scepticisme onthaald omwille van de betrokkenheid van enkele onderzoekers die de ‘biopsychosociale school’ aanhangen en het feit dat de patiënten geen M.E.(cvs) zouden hebben. Hun resultaten blijken nu te worden bevestigd door een ander Brits team dat hiervan niet kan worden verdacht (o.a. Dr. Jonathan Kerr en Prof. John Gow maken deel uit van deze onderzoeksgroep) en sommige stalen werden geleverd door de neurologen (en M.E.(cvs)-experten) Professor Peter Behan en Dr Abhijit Chaudhuri.

Wij vinden het onze plicht onze mede-patiënten te wijzen op deze uitkomsten…

Natuurlijk eindig het ‘verhaal’ hier niet. Meerdere replicatie-studies zullen volgen en hopelijk een duidelijk beeld geven van het voorkomen van XMRV bij M.E.(cvs) en in de gezonde bevolking in verschillende geografische gebieden.

Retrovirology 2010, 7:10 (Pre-print Februari 2010)

Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with Chronic Fatigue Syndrome

Harriet C T Groom¹, Virginie C Boucherit¹, Kerry Makinson², Edward Randal², Sarah Baptista², Suzanne Hagan³, John W Gow³, Frank M Mattes⁴, Judith Breuer⁵, Jonathan R Kerr², Jonathan P Stoye¹ and Kate N Bishop¹

1 Division of Virology, MRC National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, United Kingdom

2 CFS Group, Division of Cellular & Molecular Medicine, St George’s University of London, Cranmer Terrace, London SW17 0RE, United Kingdom

3 The Centre for Forensic Investigation, Dept. of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, Glasgow G4 0BA, United Kingdom

4 Department of Virology, Barts and The London NHS Trust, 18 Newark St, Whitechapel, London E1 2ES, United Kingdom

5 Division of Infection and Immunity, University College London, Windeyer Building, 46 Cleveland St, London W1T 4JF, United Kingdom

Samenvatting

Achtergrond Detektie van een retrovirus, xenotroop muizen leukemie virus gerelateerd virus (XMRV), werd eerder gerapporteerd bij 67% van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom. Wij hebben een totaal aantal van 170 stalen van Chronische Vermoeidheid Syndroom patiënten uit twee groepen uit het V.K. en 395 controles bestudeerd op zoek naar bewijs voor XMRV-infektie door te zoeken naar de aanwezigheid van virale nucleïne-zuren [DNA/RNA] gebruikmakend van kwantitatieve PCR (detektie-limiet <16 virus-copieën) óf naar de aanwezigheid van serologische responsen d.m.v. een virus-neutralisatie test.

Resultaten We hebben m.b.v. PCR géén XMRV-DNA geïdentificeerd bij geen enkel staal (0/299). Sommige serum-stalen vertoonden XMRV-neutraliserende aktiviteit (26/565) maar slechts één van deze positieve sera kwam van een CVS-patient. De meeste van de positieve sera waren ook in staat MLV-partikels die enveloppe-proteïnen van andere virussen (inclusief vesiculair stomatitis virus, VSV) bevatten, te neutraliseren – wat wijst op significante kruis-reaktiviteit qua serologische responsen. Vier positieve stalen waren specifiek voor XMRV.

Conclusies Er werd geen verband tussen XMRV-infektie en CVS geobserveerd in de geteste stalen, noch via PCR noch serologische methoden. De niet-specifieke neutralisatie gezien bij meerdere serum-stalen suggereert dat het onwaarschijnlijk is dat deze responsen werden teweeggebracht door XMRV en beklemtoont het gevaar van het overschatten van de frequentie van XMRV gebaseerd op serologische testen. Desondanks geloven wij dat de detektie van neutraliserende aktiviteit die VSV-G pseudo-getypeerde MLV [construktie waarbij het genoom van het MLV retrovirus ook de code voor het G-proteïne van een ander virus - het vesiculair stomatitis virus - draagt] niet inhibeerde bij ten minste vier serum-stalen van mensen, er op wijst dat XMRV-infektie kan voorkomen in de algemene bevolking – hoewel met onzekere uitkomsten.

Achtergrond

In 2006 identificeerden Urisman en collegas een nieuw gamma-retrovirus bij prostaat-kanker. Dit virus werd m.b.v. PCR aangetoond bij 9 van de 86 (10%) onderzochte prostaat-tumoren. De sequentie was zeer gelijkaardig met xenotroop muizen endogeen retrovirus elementen en werd dus ‘xenotroop muizen leukemia virus gerelateerd virus’ (XMRV) genoemd. […] Fylogenetische analysen [studie van verwantschap van organismen] plaatsten XMRV bij de muizen endogene retrovirussen […]. Andere groepen stalen van patiënten met prostaat-kanker werd onderzocht op de aanwezigheid van XMRV met positieve [Schlaberg R, Choe DJ, Brown KR, Thaker HM, Singh IR: XMRV is present in malignant prostatic epithelium and is associated with prostate-cancer, especially high-grade tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106:16351-16356] én negatieve [Fischer N, Hellwinkel O, Schulz C, Chun FK, Huland H, Aepfelbacher M, Schlomm T: Prevalence of human gamma-retrovirus XMRV in sporadic prostate-cancer. J Clin Virol 2008, 43:277-283 ///  Hohn O, Krause H, Barbarotto P, Niederstadt L, Beimforde N, Denner J, Miller K, Kurth R, Bannert N: Lack of evidence for xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) in German prostate cancer-patients. Retrovirology 2009, 6:92] resultaten tot gevolg. [zie ‘XMRV controverse’]

Een artikel [door de WPI-groep, in ‘Science’] rapporteerde de PCR-detektie van XMRV in PBMC van 68/101 patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS). Replicerend virus kon worden geïsoleerd uit gestimuleerde PBMC met sequenties bijna, maar niet helemaal, identiek aan de virussen geïsoleerd uit prostaat-kanker patiënten. Als klaarblijkelijk overtuigend bewijsmateriaal tegen de mogelijkheid van laboratorium-contaminatie, werd bij een aantal van de patiënten een immun-respons tegen XMRV aangetoond. Ongeveer 4% van de controle-patiënten bleek het virus te dragen.

Replicatie [herhaling door onafhankelijke onderzoeksgroepen] van deze resultaten en de mogelijke identificatie van rollen voor XMRV bij de etiologie van prostaat-kanker en/of CVS zou van grote medische betekenis zijn. Detektie van XMRV zou mogelijks bruikbare diagnostische instrumenten opleveren en zou ook therapeutische mogelijkheden tot behandeling kunnen suggereren. Bovendien zou de wijdverspreide aanwezigheid van een potentieel pathogeen virus belangrijke implicaties kunnen hebben wat betreft zijn rol als een co-factor bij andere aandoeningen en bij de veiligheid van de bloed-voorraad. We hadden dan ook de bedoeling de verspreiding van XMRV bij CVS-patiënten in het V.K. te onderzoeken, gebruikmakend van PCR, om te zoeken naar de aanwezigheid van XMRV-DNA, en van neutralisatie-testen om een anti-XMRV immuun-respons te detekteren. We vonden geen enkel verband tussen XMRV-infektie en CVS in deze studie.

Methodes

Verzameling van stalen

Stalen van de volgende drie centra werden getest: ‘St George’s University of London’ (SGUL), ‘Barts and the London Hospital Trust’ (BLT) en ‘Glasgow Caledonian University’ (GC).

De SGUL groep omvatte 142 volwassen CVS-patiënten en 157 gezonde bloed-donoren. De leeftijd lag tussen 18 en 65, en de man/vrouw-verhoudingen waren 45/97 (CVS) en 43/114 (bloed-donoren). Bij de staalname (2003-2008) werd bloed verzameld in drie tubes (een EDTA bloed-tube voor DNA-bereiding; een tube voor RNA-bereiding en een gewone tube voor serum-preparatie uit gestold bloed). CVS-patiënten werden gerecruteerd via klinieken in Bristol, Dorset, London, Birmingham, Norfolk en Epsom, en alle patiënten voldeden aan de diagnostische criteria van Fukuda et al. Bloed-stalen werden afgenomen tussen 1,5 en 4 jaar na de diagnose. Gezonde normale bloed-donoren kwamen van de ‘National Blood Service’ (NBS) in Dorset, V.K. […]

De BLT cohorte omvatte 226 anonieme serum-stalen afgenomen in 2008-2009 (57 van de prenatale kliniek; 58 met haematologische aandoeningen; 55 lever-patiënten en 56 van de nier-kliniek). […]

The GC groep omvatte 28 CVS-patiënten (20 sera en 8 plasma-stalen) en 12 controles (8 sera en 4 plasma-stalen) uit West-Schotland. CVS-patiënten waren tussen 28 en 79 jaar oud, met een man/vrouw-verhouding van 16/12. Stalen werden verzameld tussen 1995 en 2003. Controles waren tussen 23 en 63, 7mannen/5 vrouwen – stalen verzameld tussen 2002 en 2004. Sommige controles waren verwanten van de patiënten sommige waren vrijwillgers onder het ziekenhuis-personeel. Alle patiënten voldeden aan de Fukuda criteria. […]

PCR

[genomisch gDNA = direct uit de cellen bereid, omvat het ganse genoom; complementair of copie cDNA = uit mRNA verkregen door ‘omgekeerde transcriptie, bevat geen intronen of signaal-sequenties]

Genomisch (g)DNA werd bereid uit PBMCs van de SGUL patiënten en controles [….] [bij standaard PCR:] zeer uniforme amplificatie van of alle sequenties […]. Initieel werden 48 CVS-patient gDNA-stalen gescreend d.m.v. PCR voor gag en env genen [coderend voor- respectievelijk - de kapsel- en matrix-proteïnen, en de enveloppe-glycoproteïnen van het retrovirus], alsook GAPDH [een zgn. ‘huishoudelijk’ gen dat makkelijk te amplificeren is en als controle bij PCR wordt gebruikt], zoals beschreven door Lombardi et al. [WPI studie]. […] Aaangezien amplificatie via deze PCR geen produkten opleverde, ontwikkelden we nog twee sensitieve PCR-testen gebaseerd op 2 gebieden van het env gen […]). Daarmee werden stalen gDNA gescreend […]. In totaal werden 136 CVS gDNA- en 140 CVS cDNA-stalen, en 95 controle gDNA en 141 controle cDNA-stalen geanalyseerd, zodat alle 142 CVS-patiënten en 157 bloed-donoren werden gescreend voor XMRV […].

Plasmiden

[…]

Virus-produktie

[…]

Neutralisatie-testen

[…]

Resultaten

PCR screening

[…]. Om te proberen de [door Lombardi et al. gemelde] associatie van XMRV met deze ziekte te bevestigen, voerden we PCRs uit voor gag, env en GAPDH op 48 (van 142) CVS-patient gDNA-stalen van SGUL, gerbuikmakend van de [door Lombardi et al.] gepubliceerde PCR-methodologie. Hoewel alle stalen positief waren voor GAPDH [bewijs dat deze PCR sequenties kan amplificeren], vonden we echter geen bewijs voor XMRV-DNA in geen enkele van de stalen. Voor het geval we lage waarden viraal DNA misten, ontwierpen we een meer gevoelige PCR. Om de sensitiviteit van deze methode te testen, werden drievoudige seriële 1/10 verdunningen van het VP62-plasmide (coderend voor het volledige XMRV-genoom) toegevoegd aan PBMC-DNA van een gezonde donor en getest via PCR […]. We besloten dat het met onze test mogelijk was op een betrouwabre minstens 16 copieën pro-viraal DNA te detekteren en dat deze waarschijnlijk even gevoelig, wellicht nóg gevoeliger, was dan de andere testen [van Lombardi et al.]. We testten dan het ganse SGUL panel met 142 CVS-stalen en 157 controle-stalen (gDNA, cDNA of beide) […]. Hoewel positief voor GAPDH, waren alle stalen negatief voor XMRV. Om de mogelijkheid van specifieke PCR-inhibitie van de stalen uit te sluiten, voegden we XMRV VP62 DNA toe aan 3 normale controle cDNAs, die eerder negatief hadden getest voor XMRV-DNA, tot een finale concentratie van 2,3×10^-6 ng/µl en herhaalden de PCR […]. In deze reakties konden we met succes de VP62 amplificeren, wat bewijst dat de PCR XMRV in de patient-stalen had geamplificeerd als het aanwezig was geweest.

Neutralisatie-testen

In het licht van de negatieve data verkregen d.m.v. PCR-testen, probeerden we te zoeken naar bewijs voor XMRV-infektie m.b.v. een tweede methode. Virale infektie kan een neutraliserende antilichaam-respons opwekken. Het aantonen van een dergelijke neutraliserende aktiviteit kan als bewijs worden beschouwd voor een virale infektie […]. Het definiëren van neutralisatie is moeilijk in afwezigheid van gekende positieve en negatieve sera. Een aantal neutraliserende monoklonale antilichamen [zeer specifieke antilichamen geproduceerd door de klonen van een hybride-cel gevormd door de versmelting van een antilichaam-producerende B cel met een tumor-cel] gericht tegen het Env-proteïne van muizen-retrovirussen werden echter beschreven. We verkregen er meerdere via Leonard Evans [Laboratory of Persistent Viral Diseases, Rocky Mountain Laboratories, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Hamilton, MT] en testten ze op neutralisatie van XMRV en NZB xenotroop MLV(X) alsook ecotroop Friend en Moloney MLV [verwante retrovirussen] door te kijken of er vermindering is qua virus-infektiviteit na incubatie van virus-bevattend supernatant [vloeistof die boven de cellen staat na centrifugatie] met het monoklonaal antilichaam. Zoals verwacht waren enkele monoklonale antilichamen in staat XMRV te neutraliseren, terwijl andere geen effekt hadden op XMRV-infektiviteit. Interessant: we identificeerden drie monoklonale antilichamen die MLV(X) maar niet XMRV neutraliseerden en één dat XMRV maar niet MLV(X) neutraliseerde. Deze reagentia kunnen dan ook mogelijks bruikbare instrumenten zijn waarmee XMRV kan worden onderscheiden van andere xenotrope MLVs bij toekomstige onderzoeken. Via deze experimenten definieerden we twee negatieve en één positieve antilichaam-controle voor toekomstige experimenten. Om de neutralisatie-test te valideren en de mogelijke responsen op ‘normaal serum’ te onderzoeken, testten we neutralisatie gebruikmakend van een panel van 226 serum-stalen van BLT. Eerdere onderzoeken hebben XMRV-DNA in ca. 1-6% van controle-stalen gedetekteerd. Van ons panel vertoonden slechts een handvol mogelijke neutralisatie-aktiviteit, […], met verminderingen qua virale infektiviteit gelijkaardig aan of hoger dan die gezien bij de positieve controle. Meer dan 90% van de geteste stalen had minder dan een 2-voudig effekt op infektiviteit. Via deze gegevens definieerden we een staal positief als de virale infektiviteit met ten minste 70% vermindert bij een verdunning van 1/40 en een daling van 50% geeft bij een 1/80 verdunning. Volgens deze definitie bevat de BLT stalen-set 3 neutraliserende sera – 1,3% van de stalen is dus positief.

Om te bevestigen dat de aangetoonde neutralisatie-aktiviteit specifiek was voor XMRV, testten we een subset van sera op neutralisatie van XMRV naast MLV-partikels die waren pseudo-getypeerd met verscheidene enveloppe-proteïnen van MLV(X), Friend-MLV of VSV. Van deze vier virus-preparaties, werd enkel XMRV-infektiviteit geïnhibeerd door één van de getestte sera. Zelfs de infektiviteit van partikels die de nauw verwante MLV(X) enveloppe (94% identiek met XMRV) tot expressie brengen, bleek onaangetast door sera die XMRV inhibeerden. Het blijkt dus dat de neutraliserende aktiviteit specifiek is voor XMRV.

We vonden daarom dat deze test gevoelig en specifiek genoeg was om het neutraliserend vermogen van de SGUL cohorte van ongekende patient serum-stalen te onderzoeken. Na het bekendmaken van de stalen, bleek dat van de 142 getestte CVS-patient sera er geen enkele positief was zoals gedefinieerd volgens de criteria hierboven. Deze resultaten suggereerden dat er geen link was tussen XMRV en CVS. In tegenstelling daarmee bevatte de controle-groep van 157 bloed-donoren 22 positieven, een frequentie van 14%, aanzienlijk hoger dan bij de BLT groep. Het was ook merkbaar dat de neutraliserende aktiviteit van alle, op één na, van de SGUL positieve stalen veel sterker was dan bij de BLT positieve stalen. De meeste van de SGUL positieve sera reduceerden in feite de XMRV-infektiviteit met een factor 100 bij de 1/40 én 1/80 verdunningen. Intrigerend was dat vele van deze serum-stalen werden verzameld tijdens één enkele bloed-donatie sessie. Sommige stalen van deze sessie waren echter negatief. Verrassend genoeg waren de PCR-analyses van DNA-stalen corresponderend met de positieve sera van de SGUL controles uniform negatief. We onderzochten daarom de specificiteit van deze respons door 21 van de positieve sera te testen op neutralisatie van MLV pseudo-getypeerd me de enveloppe-proteïnen van MLV(X), Friend-MLV of VSV. In ieder van de gevallen was het serum in staat bijkomende virussen naast XMRV te neutraliseren, inclusief partikels pseudo-getypeerd met de non-retrovirale enveloppe van VSV. Dit impliceert dat de sterke positieve neutraliserende aktiviteit aangetoond bij de SGUL bloed-donor controles niet specifiek was voor XMRV en naar alle waarschijnlijkheid niet werd opgewekt door dit virus.

Om na te gaan of SGUL cohorte van CVS-patiënten uniek was, onderwierpen we ook 40 stalen (inclusief enkele plasma-stalen en sera) van een aparte CVS-cohorte aan onze neutralisatie-test. Deze GC groep gaf één enkele postieve van 28 CVS-stalen (3,6%) en géén positieven bij de 12 controle-stalen. Het positieve CVS-patient serum was ook in staat MLV pseudo-getypeerd met MLV(X) of Friend enveloppes te neutraliseren, hoewel – interessant – het niet in staat bleek VSV-G pseudo-getypeerd MLV te neutraliseren. […] Samengevat: we vonden geen verband tussen XMRV en enige CVS-cohorte.

Bespreking

We vingen de studie aan met de bedoeling de resultaten van Lombardi et al. betreffende het verband van XMRV met CVS te bevestigen. In totaal testten we142 CVS-stalen op de aanwezigheid van XMRV-DNA in PBMCs d.m.v. PCR en op de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen tegen XMRV in onze virale neutralisatie-test, en nog eens 28 CVS-stalen voor alleen neutraliserende antilichamen. In tegenstelling tot Lombardi et al. vonden we echter geen bewijs voor XMRV-DNA in geen enkel getest patient-stalen en slechts één enkel neutralisatie-positief patient-serum. Onze bevindingen blijken daarom inconsistent met het eerder rapport over isolatie van XMRV uit PBMCs van CVS-patiënten. We zijn er van overtuigd dat, hoewel we niet in staat waren de PCR-detektie van XMRV in PBMC-DNA van CVS-patiënten te herhalen, onze PCR-test gevoeliger is dan de gepubliceerde PCR-methode [van het WPI] en over de nodige gevoeligheid beschikt om XMRV te detekteren als het effektief aanwezig was geweest. Bovendien waren we in staat om neutraliserende aktiviteit te detekteren bij één patient en bij meerdere controle serum-stalen, wat impliceert dat onze neutralisatie-test ook de vereiste sensitiviteit heeft. Het ontbreken van neutraliserende aktiviteit in CVS-stalen vergeleken met controles kan het onvermogen van deze patiënten weerspiegelen om een immuun-respons op te wekken. In dat geval echter zou kunnen worden verwacht dat het virus tot hogere waarden vermenigvuldigt in CVS-patiënten waardoor het makkelijker te detektern zou zijn d.m.v. PCR. Aangezien we geen bewijs konden vinden van XMRV-infektie via onze PCR-testen, denken we dat dit een onwaarschijnlijke verklaring is. Bij onze groepen vonden we dus geen associatie van XMRV met CVS. Dit staat in sterk contrast met het resultaat van Lombardi et al.. Het wordt echter waarschijnlijk geacht dat de term CVS meerdere ziekten omvat en het blijft formeel mogelijk dat een fraktie geassocieerd is met XMRV. Tijdens het indienen van dit manuscript werd een ander rapport gepubliceerd door Erlwein et al. dat ook geen XMRV kon detekteren bij CVS-patiënten via PCR [Erlwein O, Kaye S, McClure MO, Weber J, Wills G, Collier D, Wessely S, Cleare A: Failure to Detect the Novel Retrovirus XMRV in Chronic Fatigue Syndrome. PLoS ONE 2010, 5:e8519]. De publicatie van deze resultaten heeft veel discussie en controverse opgewekt bij zowel CVS-researchers als -patiënten, en heeft de nood voor bijkomende onderzoeken in dit gebied beklemtoont. Volgend op de hier gemelde bevindingen, zou het een oordeelkundige volgende stap voor verdere studies zijn stalen en protocollen te vergelijken tussen verschillende laboratoria over gans de wereld.

Er zijn ook tegenstrijdige rapporten geweest die het verband van XMRV met prostaat-kanker beschreven. Twee studies uit de V.S. hebben een verhoogde prevalentie van het virus gevonden bij prostaat-kanker patiënten, hoewel ze verschilden qua afhankelijkheid van het genotype van de patient. Anderzijds konden twee Duitse studies geen link vaststellen tussen het virus en ziekte. [zie ‘XMRV controverse’] Nochtans werd XMRV gedetekteerd in de controle-groepen van meerdere onderzoeken, waarbij de incidentie varieerde tussen 1 en 6%. Bij onze serologische studies hebben we ook neutraliserende aktiviteit tegen XMRV geïdentificeerd in ca. 4% van alle geteste stalen. Merkwaardig veel (maar niet alle) seropositieve stalen werden geïdentificeerd in een relatief kleine groep bloed-donoren binnen het SGUL-cohort, wat mogelijks een lokale infektie-uitbraak suggereert. Er is geen bewijs dat deze groep gerelateerd is met of dat ze een bijzonder hoog risico liep voor het oplopen van een retrovirale infektie. Daarom lijkt een dergelijke uitbraak onwaarschijnlijk. Bovendien: alle positieve stalen – op één na – van de SGUL set die we testten, waren ook in staat met het VSV enveloppe-proteïne pseudo-getypeerd MLV te neutraliseren. Het ene serum dat daar niet toe in staat bleek, was echter in staat MLV-partikels die pseudo-getypeerd waren met andere retrovirale enveloppes te neutraliseren. We beschouwen deze positieven bij gezonde bloed-donoren daarom als niet-specifieke kruis-reagerende responsen. De overblijvende vier positieve stalen van de the BLT en GC cohorten hadden veel zwakkere neutralisatie-aktiviteiten en neutraliseerden pseudo-getypeerd MLV niet, hoewel het positieve serum van GC ook hier partikels neutraliseerde die andere retrovirale enveloppes tot expressie brachten. Hoewel we de mogelijkheid niet kunnen uitsluiten dat de aktiviteit van deze stalen tegen XMRV ook niet-specifiek is, blijft een mogelijke verklaring voor deze serologische bevindingen dat XMRV-infektie voorkomt bij ca. 1 percent van de bevolking. Dit cijfer is consistent met de eerder gemelde algemene prevalentie in controle-stalen. Gezien de oncogene eigenschappen van gamma-retrovirussen en de gerapporteerde link tussen XMRV en prostaat-kanker, kan een dergelijke observatie een aanzienlijke betekenis hebben, in het bijzonder naar bloed-transfusie toe. Er moet echter worden opgemerkt dat we tot hier toe niet in staat zijn geweest om bakterieel tot expressie gebrachte XMRV Gag proteïnen op een betrouwbare manier te detekteren door deze sera in immunoblot-experimenten te gebruiken. Het is daarom denkbaar dat deze neutraliserende aktiviteiten niet werden opgewekt door XMRV. Verdere onderzoeken zijn vereist om de aard van deze antivirale aktiviteiten te bepalen.

Besluiten

We hebben 299 DNA-stalen en 565 serum-stalen bestudeerd op zoek naar bewijs voor XMRV-infektie. We hebben d.m.v. PCR geen XMRV-DNA geïdentificeerd in geen enkele van de stalen. Sommige serum-stalen bleken echter in staat XMRV te neutraliseren in onze testen. Slechts één enkele van deze positieve sera kwam van een CVS-patient, wat impliceert dat er geen verband is tussen XMRV-infektie en CVS. Verder waren de meeste van de positieve sera ook in staat om MLV-partikels te neutraliseren die pseudo-getypeerd waren met andere enveloppe-proteïnen, wat er op wijst dat er kruis-reaktiviteit kan optreden met andere retrovirussen en zelfs met andere virussen met een enveloppe. Het lijkt daarom onwaarschijnlijk dat deze responsen waren opgewekt door XMRV. De detektie van neutraliserende aktiviteit die VSV-G pseudo-getypeerd MLV bij ten minste vier menselijke sera niet neutraliseerde, kan er echter op wijzen dat XMRV-infektie voorkomt in de algemene bevolking, hoewel de uitkomst van dergelijke infekties nu nog onzeker is.



XMRV controverse

Velen vergalopperen zich in voorbarige conclusies, niettegenstaande de auteurs van het artikel over XMRV bij M.E.(cvs) zelf waarschuwen: “Ons werk suggereert, maar bewijst niet, dat XMRV de onderliggende oorzaak van M.E.(cvs) is. Veel bijkomend werk is nodig om te begrijpen hoe XMRV eventueel de ziekte, of andere die er mogelijks mee gelinkt zijn, veroorzaakt.”.

Dr Anthony L. Komaroff, MD (Harvard Medical School) liet hieromtrent het volgende noteren (Journal Watch/Medscape oktober 2009):

Ondanks objectieve biologische abnormaliteiten (neurologische, immunologische en metabole), heeft de afwezigheid van een duidelijk etiologisch agens dat al deze abnormaliteiten zou kunnen verklaren, geleid tot het feit dat sommigen besluiten dat CVS een psychiatrische aandoening is. Verscheidene amerikaanse research-teams rapporteren dat ze DNA van een humaan retrovirus, XMRV, hebben geïdentificeerd DNA, bij 67% van patiënten met CVS t.o.v. 4% bij gezonde controles. Vele CVS-patiënten [d.w.z. NIET alle], maar weinig [d.w.z. NIET geen] gezonde controles, hadden virale nucleïnzeuren en proteïnen in meerdere types witte bloedcellen, en antilichamen tegen het virus waren prevalent bij CVS-patiënten. Wanneer ongeïnfekteerde humane cellen werden gecultiveerd met witte bloedcellen van CVS-patiënten, bleken ze ongeïnfekteerd te raken. De gekende humane retrovirussen veroorzaken neurologische, immunologische en metabole abnormaliteiten en kunnen ook latente virale infekties reaktiveren. Dit nieuw virus, XMRV, is dus een mogelijk etiologisch agens voor CVS. We weten reeds dat CVS kan volgen op infekties [dit wil noodzakelijk zeggen dat ze de oorzaak zijn] met andere agentia, dus is het onwaarschijnlijk dat XMRV het enige etiologische agens voor CVS is. Zelfs als de associatie tussen XMRV en CVS wordt bevestigd door andere researchers bij andere groepen patiënten, dan nog zullen die data alleen de causaliteit niet vaststellen.

*************************

De aanleiding voor het zoeken naar XMRV bij M.E.(cvs) was de ‘ontdekking’ van dergelijke virussen bij prostaat-kanker tumoren. Dat men best heel voorzichtig is met het claimen dat M.E.(cvs) wordt veroorzaakt door dit retrovirus, vertellen alle wetenschappers ons en wordt nogmaals aangegeven door een bevinding van een duitse onderzoek-groep betreffende het voorkomen van dit retrovirus bij een groep gevallen met prostaat-kanker uit een andere bevolking-groep.

Prof Robert Silverman en zijn team van de ‘Department of Cancer Biology, The Cleveland Clinic Foundation’ waren de eersten om XMRV bij prostaat-kanker te associëren (Proc Natl Acad Sci U S A. (2007); 104(5): 1655-1660 ‘An infectious retrovirus susceptible to an IFN antiviral pathway from human prostate tumors’). Toen ook al werd de vraag ‘oorzaak of gevolg?’ opgeworpen…

Een rapport door een team van het ‘Robert Koch-Institute’ uit Berlijn, in het tijdschrift ‘Retrovirology’, stelt de associatie in vraag… Bij het bestuderen van 589 prostaat-kanker patiënten vondt men géén link tussen XMRV en prostaat-kanker; bij geen enkele werden nucleïnezuur-fragmenten van XMRV gevonden. Ook had geen enkele patient antilichamen tegen XMRV. Er werd dan ook besloten dat XMRV niet ‘dé’ oorzaak van, geen vereiste voor prostaat-kanker is. Het is meer waarschijnlijk dat XMRV enkel wordt gevonden bij patiënten met een onderdrukt immuunsysteem (een conditie waarbij kanker kan groeien).

Het houdt dus wellicht meer steek te stellen dat het retrovirus een bijwerking is van M.E.(cvs). (Een andere mogelijkheid zou kunnen zijn dat het retrovirus werd geïntroduceerd via een vaccin.)

Laat ons dus vooral de onafhankelijke bevestiging door academische laboratoria bij patiënten uit verschillende bevolkingsgroepen en geografische streken afwachten vooraleer definitieve besluiten te trekken; en niet zomaar niet-gevalideerde testen te laten uitvoeren of experimentele (bv. anti-retrovirale) middelen te proberen… Verschillende technieken en methodologieën kunnen ook leiden tot verschillen in het al dan niet detekteren van XMRV. Een andere mogelijkheid is dat de stam die voorkomt in Europa een (lichtjes) verschillende RNA-sequentie heeft dan in de V.S. of dat XMRV gewoonweg meer voorkomt in de V.S.

Retrovirology. 2009 Oct 16;6(1):92

Lack of evidence for xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) in German prostate cancer patients

Hohn O, Krause H, Barbarotto P, Niederstadt L, Beimforde N, Denner J, Miller K, Kurth R, Bannert N

Robert Koch-Institute, Centre for Biological Safety 4, Nordufer 20, 13353 Berlin, Germany

Samenvatting

[…]

Resultaten: […]. DNA- en RNA-stalen van patiënten [prostaat-kanker] werden gescreend voor de aanwezigheid van XMRV-specifieke […] sequenties d.m.v. de zeer gevoelige techniek ‘nested PCR’ en RT-PCR. Verder werden 146 sera […] getest op antilichamen tegen XMRV […] d.m.v. een nieuw ontwikkelde ELISA. […] XMRV-specifieke sequentes werden niet gedetekteerd op DNA- noch op RNA-niveau. Consistent met dit resultaat, bevatte geen enkele van de geanalyseerde serum-stalen van prostaat-kanker XMRV-specifieke antilichamen.

Besluit: Onze resultaten wijzen op een veel lagere prevalentie (of zelfs totale afwezigheid) van XMRV bij prostaat-tumor patiënten in Duitsland. Een mogelijke reden hiervoor zou een geografisch beperkt voorkomen van XMRV-infekties kunnen zijn.

*************************

Spijtig dat Prof. Silverman over de research betreffende XMRV bij CVS meent te moeten stellen. “We moeten de data voor ons zelf houden.” Het is inderdaad “niet gepast ongepubliceerde gegevens, die niet ‘peer-reviewed’ zijn, publiek te maken” (www.cleveland.com/healthfit/; 24 november 2009) maar ‘negatieve’ resultaten niet publiceren is vanzelfsprekend ook geen optie…

Er zijn hoedanook nog een boel vragen onbeantwoord… “Wat is de prevalentie in de algemene bevolking? Is het de oorzaak van een ziekte? Zijn CVS-patiënten geïnfekteerd omdat ze meer vatbaar zijn voor het retrovirus? Is het een bedreiging voor de publieke gezondheid of niet?”

Het amerikaanse ‘National Cancer Institute’ (co-auteurs van het artikel over XMRV & CVS) stelt duidelijk: “XMRV […] werd voor het eerst geïdentificeerd in 2006 in prostaat-tumoren van mannen. Het is nauw verwant met muizen leukemie virussen, die een brede waaier aan kankers, en immunologische en neurologische ziekten bij muizen veroorzaken. […] Er is momenteel geen bewijs dat suggereert dat XMRV een epidemie veroorzaakt. De oorsprong van XMRV is onbekend maar researchers vermoeden dat het kan zijn verschenen door overdracht tussen verschillende species: van muizen of mogelijks een andere dier-soort naar mensen.”.

Volgend artikel (door Silverman – en wel degelijk gepubliceerd) doet ook verder nadenken over de rol van XMRV bij M.E.(cvs). Deze aandoening komt veel meer bij vrouwen voor dan bij mannen. Toch rapporteert de ‘ontdekker’ van het retrovirus dat androgenen (mannelijke hormonen) de transcriptie en replicatie ervan stimuleren…

J Virol. 2009 Nov 11

Androgen Stimulates Transcription and Replication of XMRV (Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus)

Beihua Dong and Robert H. Silverman

Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 9500 Euclid Avenue, Cleveland, OH 44195

Samenvatting

XMRV is een gamma-retrovirus dat oorspronkelijk werd geïdentificeerd in een subset prostaat-kanker patiënten. Omdat androgenen [natuurlijke of synthetische mannelijke geslacht-hormonen, o.a. testosteron] prostaat-tumoren en sommige retrovirussen stimuleren, onderzochten we het effekt van dihydrotestosteron [DHT; androstanolon, een sterk biologisch aktieve stof die in de cel wordt gemaakt uit de zelf minder aktieve voorloper testosteron] op XMRV-transcriptie en -replicatie. Transcriptie van het XMRV U3-gebied [zie verder: onderdeel van de LTR die de ‘enhancer’ en andere transcriptie-regulerende signalen omvat] was tot het dubbel gestimuleerd door DHT, maar enkel in cellen die een funktionele androgen-receptor [AR, of NR3C4 (nucleaire receptor subfamilie 3, group C, lid 4), wordt geaktiveerd door binding van de androgene hormonen testosteron of dihydrotestosteron; en is nauw verwant met de progesteron-receptor; kan gen-expressie moduleren via interaktie met specifieke elementen in de regulerende gebieden van doelwit-genen] bevatten. Mutaties in het glucocorticoid respons element [GRE; zie ‘NR3C1 - Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS’ en ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’] van XMRV verstoorden de basale transcriptie en androgen-responsiviteit. Bovendien stimuleerde DHT XMRV-replicatie tot het 3-voud, terwijl androgen-inhibitoren (casodex en flutamide) de virale groei onderdrukten tot het 3-voudige. De bevindingen suggereren dat integratie van het XMRV LTR [‘long terminal repeat’; controle-centrum voor gen-expressie; lange sequentie van herhaalde nucleotiden aan het uiteinde van het retrovirus-RNA die o.a. het U3-gebied bevat] in gastheer-DNA androgen-stimulatie op cellulaire genen zou kunnen betekenen.

[De receptoren die XMRV gebruikt om cellen te infekteren zijn XPR1 en SYG1. XPR1 wordt normal gebruikt door progesteron...]

[…] Een analyse van gans het genoom voor XMRV integratie-plaatsen in een prostaat-kanker cel-lijn en in menselijk prostaat-kanker weefsels reveleerde een voorkeur voor transcriptie start-plaatsen [promoter; plaats in het DNA, voor een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie te starten], CpG-eilanden [DNA-fragmenten met soms tot honderden opeenvolgende cytosine-guanosine dinucleotiden, meestal ‘upstream’ van genen, komen voor in ongeveer de helft van gen-promoters; resistent voor methylatie en veelal geassocieerd met genen die frequent ‘aan’ staan], plaatsen die hyper-gevoelig zijn voor DNase [deoxyribonuclease, een enzyme dat DNA afbreekt door het verbreken van de fosfodiester-verbindingen] en gebieden met hoge gen-densiteit [RH Silverman et al. Integration-site preference of xenotropic murine leukemia virus-related virus, a new human retrovirus associated with prostate-cancer. J Virol (2008) 82:9964-77]. Verder vertoonden XMRV integratie-plaatsen in menselijk prostaat-DNA een voorkeur voor met kanker gerelateerde genen en breekpunten, gemeenschappelijke fragiele plaatsen en microRNA-genen [miRNA of μRNA zijn enkel-strengige RNA-molekulen van 21-23 nucleotiden lang die gen-expressie reguleren, ze worden gecodeerd door en  overgeschreven van DNA maar de miRNAs wordt niet vertaald in proteïnen]. Deze bevindingen suggereerden dat XMRV-integratie ontregeling zou kunnen veroorzaken van selekte gastheer–genen die mogelijks bijdragen tot oncogenese [het ontstaan van kwaadaardige cellen die kan leiden tot een tumor / kanker]. Daarnaast werden meerdere XMRV pro-virussen geïdentificeerd in menselijke […] prostaat-carcinoma cellen, wat een rol suggereert voor virale integratie in carcinogenese.

Transcriptie van het XMRV-genoom wordt gemedieerd door elementen in het U3-gebied van de ‘5’-long terminal repeat’ (LTR), een segment van 390 nucleotiden dat de promoter en ‘enhancers’ [korte DNA-sequentie die proteïnen (aktivatoren) kan binden; waardoor de transcriptie van een gen - mogelijks een eindje verwijderd van de ‘enhancer’ of zelfs op een ander chromosoom - wordt geïnitieerd; de aktivatoren recruteren transcriptie-factoren die de binding van RNA polymerase versterken] omvat. Vele retrovirussen bevatten glucocorticoid respons element(en) in het U3-gebied, inclusief XMRV en andere gamma-retrovirussen zoals Moloney MLV (Mo-MLV) en Friend muizen leukemie (F-MLV) alsook het beta-retrovirus muizen melk-klier tumor virus (MMTV). Virale GREs worden gestimuleerd in respons op verscheidene steroïden, inclusief glucocorticoïden, mineralocorticoïden, progesteron en androgen. Virale GREs vertonen dikwijls homologie met het klassieke androgen respons element (ARE), een binding-plaats voor dimeren [proteïne-subunits] van de androgen-receptor (AR) […]. Er is homologie tussen deze virale GREs en AREs in sommige zoogdier-genen. […]

Om te bepalen of het XMRV U3-gebied van de 5’-LTR een funktioneel [zonder mutaties] ARE omvat, werden experimenten uitgevoerd met een menselijke prostaat-kanker cel-lijn […] die een funktionele androgen-receptor tot expressie brengt. […] Er werden twee mutaties gegenereerd in het vermeende ARE. […] Cellen werden in cultuur gebracht […] behandeld met 4,5a-dihydrotestosterone (DHT) […]. Resultaten […] toonden dat de geïnduceerde transcriptie-aktiviteit van het WT [‘wild type’, zonder mutaties] U3 door 100 nM DHT 158±24% was van het controle (onbehandeld) aktiviteit-niveau, terwijl het gemuteerde U3-gebied gereduceerde basale aktiviteit (56 tot 60% van WT U3 aktiviteit) had en niet-responsief was voor DHT.

[…]

Om het androgen-effekt op XMRV-transcriptie te vergelijken met dat van een ander steroid-hormoon, werden DU145 [cel-lijn zonder AR] en LNCaP [menselijke prostaat-kanker cel-lijn] cellen die een glucocorticoid receptor hebben, […] behandeld met het glucocorticoid, dexamethason, gedurende 24 h. Dexamethason verhoogde de transcriptie van het XMRV U3-gebied respectievelijk met een factor 1,3 en 1,5.

Om het effekt van androgeen op virale replicatie te onderzoeken, werden LNCaP cellen gecultiveerd […] zonder hormonen. […] RT [‘Reverse Transcriptase’; een enzyme dat RNA overschrijft naar DNA; komt voor bij retrovirussen] -bepalingen werden uitgevoerd […].DHT-behandeling stimuleerde XMRV-replicatie tot 304±45% van de controle.

Om de androgeen-regulering van XMRV-replicatie te verifiëren, werden de LNCaP cellen geïnfekteerd met XMRV […] behandeld met verschillende concentraties van een anti-androgeen, casodex óf flutamide. De anti-androgenen  […] inhibeerden virale replicatie […] tot 33,6±5,2% (casodex) en 49,7±3,6% % (flutamide) van de controle. […]

Om te bepalen of de XMRV GRE/ARE androgeen-responsiviteit verleent aan intact virus […]. WT en mutanten in LNCaP cellen […] Behandeling met DHT stimuleerde WT XMRV replicatie tot 167±33% van de controle […].DHT had echter geen effekt op de replicatie van XMRV met de mutatie […].

Onze bevindingen tonen de aanwezigheid van een funktioneel androgen respons element (ARE) in het U3-gebied van de XMRV LTR. De XMRV ARE-sequentie […] blijft behouden bij verschillende XMRV-stammen [RH Silverman et al. Identification of a Novel Gamma-retrovirus in Prostate Tumors of Patients ... PLoS Pathog (2006) 2:e25]. Inhibitie van XMRV-replicatie met anti-androgenen suggereert dat virale groei ook onderdrukt zou kunnen zijn bij met XMRV geïnfekteerde prostaat-kanker patiënten tijdens androgen ablatie [het verwijderen van lichamelijk weefsel] therapie. We rapporteerden dat XMRV integratie-plaatsen in menselijke prostaat-tumoren vele met kanker gerelateerde genen omvatten. XMRV heeft een sterke voorkeur om te integreren in de nabijheid van transcriptionele start-plaatsen die mogelijks androgen-responsiviteit opleggen aan gastheer-genen. […] XMRV-integratie in stromale [steun-/ bindweefsel-] en epitheliale [bedekkende] cellen zou aanleiding kunnen geven tot androgen-stimulatie van pro-inflammatoire genen en proto-oncogenen [stimuleren de cel-deling; een proto-oncogen is een normaal gen dat een oncogen kan worden door mutaties of verhoogde expressie en zo de kwaadaardigheid van kanker doen toenemen] die tot kanker leiden. Daarenboven: omdat de androgen-receptor tot expressie komt prostaat-cellen, zouden deze bevindingen ook kunnen helpen verklaren waarom XMRV-infekties zich lokaliseren in de prostaat.

*************************

In Silverman’s oorspronkelijk artikel over XMRV bij prostaat-kanker (PLoS Pathog. 2006 March; 2(3): e25) werd dus al gemeld dat het U3-gebied van de LTR een “glucocorticoid respons element [GRE] sequentie” bevat. “Van deze elementen werd reeds aangetoond dat ze door LTR aangestuurde transcriptie en virale replicatie (in vitro) kunnen aktiveren in respons op verscheiden steroïden, inclusief androgenen.”

Cortisol (hét ‘stress-hormoon’ is een belangrijk menselijk glucocorticoid hormoon… Er wordt gesuggereerd dat cortisol XMRV zou aktiveren maar daar zijn(nog) geen publikaties over; de bewering is dus voorbarig. Stress kan vanzelfsprekend het immuunsysteem verstoren maar een verhoogd cortisol-gehalte is niet noodzakelijk een factor bij het aktiveren van XMRV bij M.E.(cvs). Er is overigens geen duidelijkheid over de rol van cortisol bij M.E.(cvs): Er zijn meldingen van gedaalde én verhoogde concentraties.

Een andere bewering is dat het retrovirus een cortisol-receptor zou hebben… Ook daar is niets over gepubliceerd. Men verwart wellicht het glucocorticoid respons element (een onderdeel van het genoom van het retrovirus en dus bestaande uit RNA) van XMRV met een “cortisol-receptor” (het gen NR3C1 codeert voor de de glucocorticoid receptor, GR), dat een proteïne is. Het gen coderend voor dit proteïne is veel groter dan het GRE.

Ook (het gen coderend voor) NF-κB omvat een GRE (DNA-sequentie; genen die positief worden gereguleerd door GR worden gekenmerkt door ‘GC-response elements’ (GRE) in de promotor). Men zou dus ook kunnen claimen dat NF-κB XMRV aktiveert. Daar valt rekening mee te houden, aangezien cortisol (glucocorticoïden); NF-κB aktivatie kan inhiberen. Het zou kunnen dat een laag cortisol-gehalte (dat bij M.E.(cvs) soms wordt vastgesteld) XMRV aktiveert via upregulering van NF-κB. In een TV-interview (‘Nevada Newsmakers’, 8 oktober 2009) heeft Judy Mikovits (co-auteur van het XMRV-artikel in ‘Science’) het over ongepubliceerde gegevens betreffende het “NF-κB element” dat de XMRV-expressie zou regelen: de DNA-sequentie die NF-κB bindt en zo de expressie van (virale) genen eventueel zou kunnen wijzigen…

Ook Dr Cheney (www.cheneyresearch.com, 9 oktober 2009) laat noteren: “Oxidatieve stress zal mogelijk XMRV-replicatie versterken.” Hij beweert dat aktivatie van NF-κB dit virus aktiveert en dat onderdrukking van NF-κB XMRV inhibeert maar geeft geen referentie. Prof. Pall meldt op een forum (niet in een wetenschappelijk tijdschrfift): “De replicatie van het retrovirus [XMRV], gebaseerd op zijn DNA-sequentie, wordt gestimuleerd door NF-κB aktiviteit.”.

Het ultieme bewijs daarvoor moet dus echter nog worden geleverd! Onderzoek gewenst dus…

De moeilijkheid wat betreft het verminderen van NF-κB, is dat het zo’n sleutel-rol speelt en vele mechanismen beïnvloedt. Cheney heeft het over de artemisine (artesunaat) als één van de beste inhibitoren van NF-κB. Het is onze mening dat selektieve/specifieke onderdrukking meer aangewezen is en daarbij denken we aan het therapeuticum dat wordt onderzocht door LEGEST (UGent)…



XMRV bij M.E.(cvs)

Door de jaren heen zijn er steeds meldingen/claims geweest over micro-organismen (al dan niet oorzakelijk) verbonden met M.E.(cvs): het Epstein-Barr virus e.a. herpes-virussen (bv. HHV-6), Mycoplasma sp., Chlamydia pneumoniae, enterovirussen, Borrelia burgdorferi (Lyme), Borna-virus, Coxiella burnetti, Parovirus-B19, HERV-K18, Parainfluenza Virus-5, retrovirussen, enz. Tot nu toe bleken geen van de resultaten onafhankelijk reproduceerbaar, kon geen oorzakelijk verband worden bewezen of bleek het om opportunistische infekties te gaan.

Het is tot op heden onze overtuiging dat, ook al zullen vele van deze microben en virussen bij (grote of minder grote) M.E.(cvs)-subgroepen opduiken, geen zal blijken dé oorzaak te zijn. Het feit dat telkens weer andere organismen worden gevonden, bewijst o.i. dat zij een gevolg, eerder dan de oorzaak, van de ziekte zijn. De nadruk van de research aangaande M.E.(cvs) zou moeten liggen op de mechanismen die deze organismen ‘toelaten’ – genetische defekten in bv. transcriptie-factoren zoals NF-κB [zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]…

Onderstaande melding over XMRV is interessant maar zoals de auteurs zelf (en menig ander onderzoeker) aangeven is de melding zeker (nog) geen bewijs voor een oorzakelijk verband.

Het verontrust ons dat M.E.(cvs)-patiënten steeds weer wanhopig willen geloven in iets dat nog niet is bewezen. Ze gaan zelfs zo ver mensen die zich afzetten tegen on-wetenschappelijke beweringen, te stigmatiseren en te catalogeren bij de biopsychosociale kliek. Wetenschap is geen geloof of religie!

We geven hier de samenvatting van het artikel in ‘Science’ (met daarnaast duiding door niet aan het onderzoek gerelateerde onderzoekers) en een omschrijving door de britse NHS (overheidsdienst voor gezondheidszorg).

*************************

www.sciencemag.org (Published Online October, 2009)

Detection of an Infectious Retrovirus, XMRV, in Blood Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome

Vincent C. Lombardi ¹, Francis W. Ruscetti ², Jaydip Das Gupta ³, Max A. Pfost ¹, Kathryn S. Hagen ¹, Daniel L. Peterson ¹, Sandra K. Ruscetti ⁴, Rachel K. Bagni ⁵, Cari Petrow-Sadowski ⁶, Bert Gold ², Michael Dean ², Robert H. Silverman ³, Judy A. Mikovits ¹

¹ Whittemore Peterson Institute, Reno, NV 89557, USA.

² Laboratory of Experimental Immunology, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

³ Department of Cancer Biology, The Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH 44106, USA.

⁴ Laboratory of Cancer Prevention, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

⁵ Advanced Technology Program, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

⁶ Basic Research Program, Scientific Applications International Corporation, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een uitputtende ziekte met onbekende etiologie waarvan wordt geschat dat wereldwijd 17 miljoen mensen zijn aangetast. Bij het bestuderen van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten, identificeerden we DNA van een humaan gamma-retrovirus, xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV), bij 68 van 101 patiënten (67%) vergeleken met 8 van 218 (3,7%) gezonde controles. Cel-cultuur experimenten reveleerden dat XMRV van patiënten infektueus is, en dat cel-geassocieerde én cel-vrije transmissie van het virus mogelijk zijn. Secundaire virale infekties werden verkregen in niet-geïnfekteerde primaire lymfocyten en indicator cel-lijnen na blootstelling aan geaktiveerde PBMCs, B-cellen, T-cellen of plasma van CVS-patiënten. Deze bevindingen wijzen op de mogelijkheid dat XMRV een contribuerende factor kan zijn bij de pathogenese van CVS.

[Xenotroop virus: een genetisch overgedragen retrovirus dat niet kan vermenigvuldigen in de gastheer-soort die het herbergt maar dat cellen van een verschillende soort kan infekteren en enkel daar kan vermenigvuldigen.]

Vincent Lombardi was de mede-oprichter van REDLabs USA, een lab dat testen aanbiedt (hun belangrijkste test werd door hen zelf ooit uitgeroepen tot ‘merker’ voor CVS maar werd nooit onafhankelijk gevalideerd; de internationale research-gemeenschap schuift die dan ook ter zijde); en ‘directeur operaties’ toen ze hun naam veranderden naar VIP Dx (Viral Immune Pathology Diagnostics). VIP Dx is gelokaliseerd in de buurt van het ‘Whittemore Peterson Institute’ in Reno, Nevada.

Judy Mikovits is tevens vice-president van het medicijn-ontwikkelend bedrijf Genyous Biomed in Henderson, Nevada.

Oprichter/voorzitter van de ‘Wingfield Nevada Group’, de firma achter het ‘Whittemore-Peterson Institute for Neuro-immune diseases’ is Harvey Whittemore: niet onbesproken multimiljonair, advocaat, federaal lobbyist, land-ontwikkelaar en één van het dozijn van de machtigste mensen in Nevada die zaken doet met enkele van Nevada’s grootste bedrijven.

*************************

www.nhs.uk/news (October 2009)

Deze studie vergeleek bloed-stalen van 101 CVS-patiënten met stalen van 218 mensen zonder de ziekte. Er werd bewijs gevonden voor het XMRV-virus in ongeveer twee-derden van de mensen met CVS en minder dan 4% mensen zonder de ziekte.

Deze bevindingen alleen bewijzen niet dat het virus CVS veroorzaakt, omdat ze niet aantonen of de infektie gebeurde vóór of na de CVS zich ontwikkelde. Het research-artikel is behoedzaam qua conclusies en stelt dat XMRV een bijdragend factor “kan” zijn tot CVS maar het tegengestelde kan ook waar zijn: CVS kan mensen meer vatbaar maken voor infektie met dit virus.

Ondanks deze beperkingen, zullen deze bevindingen van belang zijn voor de research-gemeenschap, artsen en patiënten. Grotere studies en onderzoek dat vaststelt of de XMRV-infektie vóór of na de aanvang van CVS optreedt zullen nodig zijn vooraleer enige besluiten kunnen worden getrokken.

Waar komt het verhaal vandaan?

Het onderzoek werd uitgevoerd door Dr Vincent C Lombardi en collegas van het ‘Whittemore Peterson Institute’ en andere research-instituten in de V.S. Het werd gefinancierd door het ‘Whittemore Peterson Institute’, de ‘Whittemore Family Foundation’, het ‘National Cancer Institute’, de ‘National Institutes of Health’, het ‘US Department of Defense’, de ‘Foundation for Cancer Research’, de ‘Charlotte Geyer Foundation’, en Mal en Lea Bank.

De studie werd gepubliceerd in het ‘peer-reviewed’ wetenschappelijk tijdschrift ‘Science’.

Welke soort wetenschappelijke studie is dit?

Deze research keek naar de aanwezigheid van een retrovirus in de witte bloedcellen van mensen met Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het betrof een gevallen-controle studie en bijkomende laboratorium-experimenten.

CVS tast een reeks organen in het lichaam aan en patiënten vertonen een abnormale werking van het immuunsysteem. De oorzaak is niet gekend maar één theorie is dat bepaalde virussen de ziekte triggeren.

Deze studie onderzocht of een retrovirus genaamd xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV) betrokken zou kunnen zijn. Eerdere research toonde dit virus aan in enkele stalen van prostaat-kanker weefsel. Andere studies bij muizen hadden gevonden dat de immuun-respons op sommige retrovirussen geassocieerd is met neurologische problemen.

Het onderzoek omvatte het nemen van bloedstalen van 101 mensen met CVS (de gevallen) en van 218 gezonde mensen zonder CVS (controles). Het DNA van witte bloedcellen in deze stalen werd onderzocht om te kijken of ze XMRV-DNA bevatten. De mensen met CVS kregen de diagnose op basis van de standaard criteria (1994 CDC Fukuda criteria en 2003 Canadian Consensus criteria) en ze hadden allemaal ernstige invaliditeit, langdurige uitputtende vermoeidheid, cognitieve stoornissen en immuunsysteem abnormaliteiten. Ze kwamen uit gebieden in de V.S. waar CVS-epidemieën werden gerapporteerd.

De volledige genetische sequentie van het XMRV van twee patiënten die het viraal DNA hadden, werd dan onderzocht om te bepalen welke virus-stam het betrof. Deze stam werd vergeleken met de stam die eerder was geïdentificeerd bij prostaat-kanker patiënten en met een muizen leukemie virus (MLV) dat dikwijls in laboratoria wordt gevonden, om de mogelijkheid uit te sluiten dat MLV de experimenten contamineerde. Testen die zochten naar proteïnen van het XMRV-virus in de bloedcellen werden ook uitgevoerd.

Er werden ook laboratorium-testen gedaan om te kijken of de stalen infektueus XMRV bevatten. Bij die testen werden witte bloedcellen die XMRV bevatten van CVS-patiënten gegroeid en gemengd met prostaat-kanker cellen, die vatbaar zijn voor infektie met XMRV.

De prostaat-kanker cellen werden ook blootgesteld aan vloeistoffen van de CVS-patient of aan controle bloedstalen die waren behandeld door de bloedcellen te verwijderen en mogelijks aanwezige virussen te concentreren. Gelijkaardige experimenten, waarbij pogingen werden ondernomen om T-cellen (een type witte bloedcel) te infekteren, werden ook uitgevoerd.

De researchers onderzochten dan of CVS-patiënten die XMRV-DNA dragen of gezonde controles antilichamen hadden tegen een gelijkaardig virus, wat zou suggereren dat ze een immuun-respons hadden ontwikkeld tegen XMRV.

Wat waren de resultaten van de studie?

De onderzoekers vonden dat bloed van 67% van de mensen met CVS XMRV-DNA bevatte, vergeleken met 3,7% van de controles.

De virale DNA-sequenties waren zeer gelijkend met deze geïdentificeerd in een eerdere studie betreffende prostaat-kanker. De sequenties van deze virussen waren niet genoeg gelijkend met het MLV-virus om te suggereren dat deze resultaten werden veroorzaakt door laboratorium-contaminatie.

Het onderzoeken van de witte bloedcellen van dertig CVS-patiënten toonde dat 63% (19 mensen) van de geteste stalen virale proteïnen vertoonden. Testen op stalen van vijf gezonde controles toonde geen virale proteïnen aan.

Globaal gezien bleken stalen van mensen met CVS 54 keer meer waarschijnlijk virale sequenties te bevatten dan stalen van gezonde controles.

De researchers vonden dat XMRV die in de witte bloedcellen van CVS-patiënten werden aangetroffen kon worden overgedragen op prostaat-kanker cellen wanneer ze samen werden gegroeid in het laboratorium. Bij 10 van de 12 mensen met CVS (83%) kon vloeistof afkomstig van hun bloedstalen ook de prostaat-kanker cellen infekteren in het lab. Gelijkaardige resultaten werden bekomen wanneer niet-geïnfekteerde witte bloedcellen werden blootgesteld aan deze vloeistof. Vloeistof van de bloedstalen van twaalf gezonde controles infekteerde de prostaat-kanker cellen niet.

De onderzoekers vonden dat de helft (9 van de 18) van de CVS-patiënten met XMRV-DNA antilichamen hadden tegen een gelijkaardig virus, terwijl geen enkele van de 7 gezonde controles die werden getest een antilichaam-respons vertoonden. Dit suggereert dat de helft van de CVS-patiënten een immuun-respons tegen XMRV vertoonde.

Welke interpretaties maakten de researchers op basis van deze resultaten?

De researchers concluderen dat hun bevindingen suggereren dat XMRV mogelijks een contribuerende factor is bij de ontwikkeling van CVS. Ze suggereren dat infektie met het XMRV-virus verantwoordelijk zou kunnen zijn voor enkele van de abnormale immuun-respons en neurologische problemen die worden gezien bij CVS.

Wat maakt de ‘NHS Knowledge Service’ van deze studie?

Dit onderzoek heeft een associatie tussen de aanwezigheid van XMRV viraal DNA en Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) geïdentificeerd.

Het is echter nog niet mogelijk om met zekerheid te zeggen of het virus daadwerkelijk CVS veroorzaakt, een feit dat ook wordt erkend door de auteurs. Dit is omdat de aanwezigheid van virus werd vastgesteld bij mensen die reeds CVS hadden, en dus is het niet duidelijk of de infektie gebeurde vóór ze de ziekte ontwikkelden.

Een alternatieve mogelijkheid is dat mensen die reeds CVS hebben, gewijzigde immuunsystemen hebben die hen meer vatbaar voor deze virussen maakt.

De studie heeft enkele beperkingen, enkele daarvan worden ook gemeld in een begeleidend editoriaal:

* Er werden een relatief klein aantal mensen getest, vooral bij sommige experimenten.

* De CVS-stalen komen alle van patiënten die ernstig geïnvalideerd waren, met langdurige uitputtende vermoeidheid, cognitieve defekten en immuunsysteem abnormaliteiten, en die kwamen uit gebieden waar er CVS-‘epidemieën’ of waren. Het is mogelijk dat deze patiënten niet representatief waren voor het volledige spectrum aan patiënten met CVS, waar de ernst nogal kan variëren. De selektie van gevallen die samen werden geclusterd in ‘epidemieën’ kan betekenen dat deze gevallen een verschillende oorzaak of trigger hebben dan de geïsoleerde gevallen.

* De karakteristieken van de bloed-stalen van gezonde mensen die werden gebruikt werden niet gerapporteerd en er zouden meer verschillen kunnen zijn met de CVS-gevallen dan enkel de ziekte zelf die bijdroeg tot de verschillende mate van XMRV-infektie.

* Hoewel de researchers probeerden contaminatie van hun stalen uit te sluiten, suggereert de molekulair bioloog die het XMRV-virus mee ontdekte in het begeleidend editoriaal [zie hieronder] dat ze niet genoeg ondernamen om contaminatie volledig uit te sluiten. Hij wijst er ook op dat bevestiging van de resultaten door een onafhankelijke groep die onwetend is over het feit of stalen van gevallen of controles komen van vitaal belang is.

* Hoewel de studie suggereert dat in het laboratorium het virus zich zou kunnen verspreiden van witte bloedcellen of bloed naar andere cellen, betekent dit niet dat het virus noodzakerlijkerwijs van persoon naar persoon zou kunnen worden overgedragen.

Niettegenstaande deze beperkingen, zijn de oorzaken van CVS nog niet gekend en blijven beschikbare behandelingen beperkt, dus zullen deze bevindingen van belang zijn voor de research-gemeenschap, artsen en patiënten. Verder onderzoek is nodig om deze bevindingen te bevestigen in meer stalen en vast te stellen of de XMRV-infektie gebeurt vóór of na de aanvang van CVS.

*************************

Als achtergrond-informatie betreffende het XMRV-virus, hier een begeleidend stuk (‘Perspective’) van de hand van 2 onderzoekers die niet deelnamen aan de studie, in het zelfde nummer van ‘Science’ als het bovenstaande rapport…

Een Nieuw Virus voor Oude Ziekten?

John M. Coffin [1] & Jonathan P. Stoye [2]

[1] Department of Molecular Microbiology, Tufts University, Boston, MA 02111, USA

[2] Division of Virology, Medical Research Council, National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, UK

Er is weinig consensus in de medische gemeenschap over het feit of het Chronische Vermoeidheid Syndroom een duidelijke ziekte is. Zoals de naam name impliceert, wordt de aandoening gekenmerkt door uitputtende vermoeidheid die vele jaren aanhoudt, en ze tast zowat 1% van de wereld-bevolking aan. Hoewel dikwijls chronische inflammatie wordt gevonden bij deze patiënten, weerden geen infektueuze of toxische agentia gevonden die duidelijk betrokken bleken bij deze ziekte, waarvan de diagnose grotendeels wordt gesteld door het uitsluiten van andere aandoeningen die gelijkaardige symptomen veroorzaken. In deze ‘Science Express’ beschrijven Lombardi et al. de detektie van xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV) in ongeveer twee-derden van patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Zowel laboratorium- en epidemiologische studies zijn nu nodig om te bepalen of dit virus een veroorzakende rol speelt, niet enkel voor deze ziekte, maar misschien ook bij andere.

Chronische Vermoeidheid Syndroom is niet de eerste ziekte bij mensen waaraan XMRV wordt gelinkt. Het virus werd in 2006 voor het eerst beschreven bij enkele prostaat-kanker patiënten en in 2009 gedetekteerd bij bijna een kwart van alle prostaat-kanker biopten. Het werd geïsoleerd uit prostaat-kanker én Chronische Vermoeidheid Syndroom patiënten, en is gelijkaardig aan een groep van endogene muizen leukemie virussen (MLVs) die worden gevonden in de genomen van inteelt en verwante wilde muizen. Hoewel een halve eeuw studies betreffende MLVs en andere gamma-retrovirussen hebben geleid tot belangrijke ontdekkingen waarop veel van ons huidig begrip van kanker rust, is er geen duidelijk bewijs gevonden dat infektie bij mensen aantoont met gamma-retrovirussen of die deze agentia associeert men een menselijke ziekte.

Endogene virussen, zoals xenotroop MLV, duiken op wanneer retrovirussen geslacht-cellen infekteren. Het geïntegreerde viraal DNA, of pro-virus, wordt overgedragen op nakomelingen als onderdeel van het gastheer-genoom. Endogene pro-virussen vormen een groot deel van het genetisch aanvulsel [het zgn. afval-DNA] van moderne zoogdieren, ongeveer 8% van het menselijk genoom. Xenotrope pro-virussen maakten voor het eerst hun intrede in de muizen geslacht-cellen ca. een miljoen jaar geleden, maar kunnen cellen van de muis die hen draagt niet infekteren omwille van een mutatie – waarvan wordt verondersteld dat deze ontstaan is na het binnenkomen van het virus in de geslacht-cellen – in de cellulaire receptor voor het virus. De tendens van xenotrope MLVs om snel-delende menselijke cellen te infekteren, heeft het tot een courante contaminant van gecultiveerde cellen gemaakt, in het bijzonder bij bepaalde humane tumor cel-lijnen.

Meer dan 90% van DNA-sequenties van XMRV en xenotroop MLV is identiek, en hun biologische eigenschappen zijn virtueel niet te onderscheiden, waardoor er weinig twijfel wordt gelaten dat het eerste is afgeleid van het laatste door één of meerdere transmissies tussen species. Er zijn meerdere bewijzen dat transmissie gebeurde in de buiten-wereld en dat het geen laboratorium-contaminant was. Eén ervan is dat XMRVs van verschillende lokaties, en van Chronische Vermoeidheid Syndroom en prostaat-kanker patiënten bijna identiek zijn: de virale genomen verschillen slechts in enkele nucleotiden [DNA-bouwstenen], terwijl er honderden sequentie-verschillen zijn tussen XMRVs en xenotroop muizen leukemie pro-virussen van laboratorium-muizen. Ander bewijs omvat de aanwezigheid van XMRV en grote hoeveelheden antilichamen tegen XMRV en andere MLVs bij Chronische Vermoeidheid Syndroom en prostaat-kanker patiënten.

Er is nog veel dat we niet begrijpen. Of het virus een veroorzakende rol speelt bij Chronische Vermoeidheid Syndroom of prostaat-kanker is niet geweten. XMRV-infektie zou bv., toevallig, meer frequent kunnen voorkomen in dezelfde geografische regio als een cluster van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom. En individuen met één van beide ziekten zouden gewoonweg meer geïnfekteerd kunnen zijn omwille van immuun-aktivatie. XMRV zou preferentieel kunnen groeien in snel-delende prostaat-kanker cellen en de aanwezigheid van snel-delende cellen bij één van beide aandoeningen zou infektie gemakkelijker detekteerbaar kunnen maken. We weten niet hoe het virus wordt overgedragen en de suggestie, gebaseerd op indirect bewijs, dat er sexuele transmissie zou zijn, is voorbarig. Gezien het feit dat er infektueus virus aanwezig is in plasma en in bloed-cellen, is transmissie via bloed een mogelijkheid. Verder weten niet wat de prevalentie of distributie van virus is in menselijke of dierlijke populaties, en dier-modellen voor infektie en pathogenese zijn dringend gewenst.

Twee kenmerken van XMRV zijn bijzonder opmerkenswaardig. Eén is de bijna genetische gelijkheid van isolaten afkomstig van verschillende ziekten en van individuen uit verschillende delen van de Verenigde Staten. De twee meest ver verwijderde genomen waarvan tot op heden de sequentie werd bepaald verschillen in minder dan 30 van de ca. 8.000 nucleotiden. Alle XMRV-isolaten lijken dus meer op elkaar dan de genomen geïsoleerd uit eender welk individu geïnfekteerd met het HIV. In dit opzicht lijkt XMRV meer op humaan T-cel lymfotrope virussen (HTLVs) geïsoleerd in dezelfde geografische regio. Zoals het geval is bij HTLV, impliceert het gebrek aan diversiteit dat XMRV recent afstamt van een, gemeenschappelijke ‘voorvader’, en dat het aantal replicatie-cycli binnen één geïnfekteerd individu beperkt is.

Een andere meldenswaardige eigenschap van XMRV is dat de frequentie van infektie in niet-zieke controles opmerkelijk hoog is: ongeveer 4% in normale individuen van dezelfde geografische regio als geïnfekteerde patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom, én in niet-kwaadaardige prostaten. Als deze cijfers worden bevestigd in grotere studies, zou het betekenen dat wellicht 10 miljoen mensen in de Verenigde Staten en honderden of miljoenen wereldwijd geïnfekteerd zijn met een virus waarvan het pathogeen potentieel bij mensen nog onbekend is. Het is echter duidelijk dat nauw verwante virussen een waaier aan belangrijke ziekten veroorzaken, inclusief kanker, in veel andere zoogdieren. Verder onderzoek zou XMRV kunnen aanduiden als een oorzaak van meer dan één goed-gekende ‘oude’ ziekte, met mogelijks belangrijke implicaties voor diagnose, preventie en behandeling.

*************************

Nog enkele losse commentaren…

“Dit zou wel eens de controverse kunnen beëindigen over de vraag of ere en onderliggende infektie is bij sommige gevallen van Chronische Vermoeidheid Syndroom maar het is onwaarschijnlijk dat dit alle gevallen verklaart. Retrovirussen kunnen latente virussen die reeds in de cellen aanwezig zijn wakker maken. Het is mogelijk dat chronische vermoeidheid symptomen niet worden veroorzaakt door XMRV maar door andere virussen die het aktiveert.” (internist Dedra Buchwald van de ‘University of Washington’ – www.sciencenews.org 8 okt 09).

>> De auteurs stellen vragen over deze ontdekking op het einde van het artrkel: “Is XMRV infektie een oorzakelijke factor in de pathogenese van CVS of een ‘passagier-virus’ in de CVS patiënten-populatie met onderdrukt immuunsysteem?” Deze en andere vragen stellen dat bijkomend onderzoek en de herhaling van de bevindingen van deze studie bij andere patiënten-groepen een prioriteit zou moeten zijn. << (www.cfids.org)

>> Precies hoe dit virus gerelateerd is met chronische vermoeidheid blijft echter een mysterie. Eén van de problemen bij het opsporen van CVS is dat dit wellicht niet één enkele ziekte is. “We denken dat het probleem is dat CVS een verzameling is van vele verschillende ziekten zelfs al hebben ze gelijkaardige symptomen.” Zij en anderen vermoeden dat het retrovirus andere onderliggende aandoeningen en virussen in het lichaam zou kunnen loslaten. <<

“Dit nieuw retrovirus zou, door infektie van menselijke cellen, transcriptie van een endogeen virus kunnen induceren. We hebben al aangetoond dat Epstein-Barr virus dit kan doen. “Hoewel deze achtergrond-ruis van verscheidene virussen moeilijk te onderscheiden zou kunnen zijn, reikt het sleutels aan die researchers helpen de hoofd-oorzaak van CVS te vinden. “Het is mogelijk dat, downstream, dit allemal zal uitmonden in het zelfde mechanisme.” (Brigitte Huber, professor pathologie aan de ‘Tufts University’s Sackler School of Graduate Biomedical Sciences’. – www.scientificamerican.com 8 okt 09)

>> Dr. William C. Reeves […] waarschuwt voor haastige conclusies gebaseerd op de bevindingen, hoewel hij ze belovend noemde. “Het is bijna ongehoord om een verband van deze grootte-orde te vinden in om het even welke studie van een infektueus agens en een goed-gedefinieerde ziekte, laat staan een [slecht-gedefinieerde] ziekte zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom.” […]. Het is bijzonder moeilijk om een oorzakelijk verband te bewijzen met een alomtegenwoordig virus zoals XMRV en het “is zelfs nog moeilijker in het geval van CVS, een klinisch en epidemiologisch complexe ziekte”. << (Dr. William C. Reeves, hoofd ‘Chronic Fatigue Syndrome research’ van de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ – www.latimes.com 9 okt 09)

>> XMRV is een puzzel op zijn eigen. John Coffin, een viroloog aan de ‘Tufts University’ in Boston, die MLV heeft bestudeerd, wijst er op dat de prevalentie van het virus bij gezonde controles “op één of andere manier, een even opmerkelijk resultaat is”. << (www.nature.com 9 okt 09)

“XMRV-infektie van [natural killer] cellen kan hun funktie aantasten.”, zegt Jonathan Kerr die niet betrokken was bij de studie. “Het past.”, voegt hij er aan toe, maar “een onafhankelijke studie die deze bevindingen kan bevestigen is heel erg gewenst”. (Jonathan Kerr, onderzoeker aan ‘St George’s, University of London’ – www.newscientist.com 8 okt 2009)

“Dit ziet ere en zeer interessante start uit Het is niet onmogelijk dat dit een ziekte kan veroorzaken met neurologische en immunologische gevolgen maar we weten het niet zeker.” (John Coffin, viroloog aan de ‘Tufts University’ in Boston – www.newscientist.com 8 October 2009)

>> [Mikovits’] colleagae vinden de melding van een virale link voorbarig: Joseph DeRisi, een molekular bioloog aan de ‘University of California’, San Francisco, die XMRV mee ontdekte, was niet tevreden over details in het artikel: Hij wilde meer weten over de ‘virale lading’ in CVS-patiënten en hoe de demografie van de controle-groep overeenkwam met die van CVS-patiënten. En het team van Mikovits deed niet voldoende om contaminatie uit te sluiten, zegt hij. “Men moet heel zorgvuldig zijn bij het maken van claims over dergelijke gevoelige en emotioneel geladen zaak als CVS, waarover al veel werd beweerd in het verleden.” Een dubbel-blinde studie waarbij een ‘derde partij’ lab zoekt naar XMRV bij CVS-patiënten controles is vitaal, zegt hij. << (ScienceNOW.org 9 okt 09)

>> Tony Britton van de ‘ME Association’ [V.K.] zei: “Dit is fascinerend – maar het bewijst niet onweerlegbaar dat een link bestaat tussen het XMRV virus en CVS of M.E.”.

Dr Richard Grunewald, een consulterend neuroloog van de ‘Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust’ zei dat hij voorbehoud maakte wat betreft de research. Hij zie: “Het idee dat alle gevallen van CVS worden veroorzaakt door één enkel virus klinkt niet plausibel voor de meeste mensen die op het terrein werken. […]”

Sir Peter Spencer, hoofd bestuurslid van ‘Action for ME’ [V.K.] zei: “Het is nog te vroeg dus proberen we niet al te opgewonden te worden maar dit nieuws zal zeker de hoop doen rijzen in de patiënten-groep die al veel te lang werd verwaarloosd.” <<

(news.bbc.co.uk)

“We weten zelfs niet of infektie met het XMRV-virus de ziekte of één van de meerdere geassocieerde gereaktivateerde virussen (zoals HHV-6, EBV en enterovirus) veroorzaakt. […] Het is belangrijk deze bevindingen over XMRV-virus te bekijken als niet meer dan een opwindende nieuwe ontwikkeling. We hebben nood aan bevestigende studies, daarna studies om te kijken of het virus bijdraagt tot de oorzaak van de ziekte en symptomen.” (Dr. Nancy G. Klimas, directeur van de afdeling immunologie van de ‘University of Miami School of Medicine’ en research-directeur voor klinische AIDS/HIV-research van het ‘Miami Veterans Affairs Medical Centre’ – consults.blogs.nytimes.com 15 okt 09)

[…]

Zie ook:

‘XMRV controverse’

‘Afwezigheid van XMRV bij CVS-patiënten uit het V.K.’

Cytokine polymorfismen & respons op infektie

Ongeveer 10 jaar geleden begonnen de Australische onderzoekers Dr Andrew Lloyd, Dr Ian Hickie en Dr Ute Vollmer-Conna post-infektueuze vermoeidheid te bestuderen als een model om de mechanismen bij of CVS te begrijpen. In 2006, publiceerden ze een artikel getiteld ‘Post-infective and chronic fatigue syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens: prospective cohort study’ waarin beschreven werd dat CVS in ca. 12% van de gevallen volgt op een infektie en grotendeels wordt voorspeld door de ernst van de acute ziekte. Het feit dat iemand chronisch ziek blijft, houdt dus geen verband houdt met virale aktiviteit of cytokine-produktie ná de acute fase. [Cytokinen zijn, eenvoudig uitgedrukt, hormonale eiwit-boodschappers van het immuunsysteem die helpen verdedigen tegen infektie.] Sommige patiënten betwisten het feit dat CVS (M.E. is overigens niet helemaal hetzelfde) geen relatie met het soort infektie blijkt te hebben. Dit wil echter niet zeggen dat er geen organische oorzaak is! Ellen Goudsmit schrijft: “Verschillen tussen patiënten die herstellen van virale infekties en zij die dat niet doen, blijken reeds in een vroege fase; en de ernst van de acute ziekte voorspelt de slechte uitkomst, psychiatrische factoren NIET.” Lees ook de commentaren op de BMJ site…

Nogmaals: de analyse van de invloed van psychosociale en omgeving-factoren op de ziekte (inclusief demografische kenmerken, socio-economische status, persoonlijkheid, hoe iemand met problemen omgaat, stemming en psychiatrische voorgeschiedenis) toonde dat deze geen significante effekten hadden. Psychiaters die de biopsychosociale school aanhangen worden hier dus tegengesproken: psychologische factoren zijn niet de belangrijkste reden voor het aanhouden van vermoeidheid na infektie.

Sindsdien heeft dit team (‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’) proberen bepalen wáárom sommigen een ernstiger ziekte na acute infektie doormaken dan anderen.

De researchers onderzochten genetische variaties in genen van pro- en anti-inflammatoire cytokinen. Individuen met het gen-polymorfisme [natuurlijk voorkomende genetische variatie] IFN-γ +874 TT (hoge produktie van het pro-inflammatoire cytokine interferon-γ) of IL-10 592 CA of AA (lage produktie van anti-inflammatoir interleukine-10) reageren heviger op een infektie en hebben een veel groter risico om chronisch ziek te blijven. Dit is nog meer het geval als beide polymorfismen gecombineerd zijn. Dit profiel werd het ‘hoog risico genotype genoemd’.

Merk ook op dat bij er bij drie specifieke infekties (Mononucleose, Ross River of Q-koorts) geen invloed is op de intensiteit van de acute fase en het verder verloop. De aard (viraal, bakterieel of parasitair) van of het type pathogen speelt GEEN rol! Een waaier aan pathogenen kan CVS triggeren en het onevenwicht in de immuun-respons doet CVS voortduren.

Of microglia ook bij M.E.(cvs) een rol spelen en perifere cytokine-signalen effektief cerebraal kunnen worden doorgegeven dient nog te worden aangetoond. In elk geval is er aanzienlijk en groeiend bewijs voor een rol bij tal van neurologische ziekten. Perifere immun-stimulatie kán microglia in het CZS aktiveren. In het artikel ‘Chronic Microglial Activation and Excitotoxicity Secondary to Excessive Immune Stimulation: Possible Factors in Gulf War Syndrome and Autism’ worden bv. mechanismen opgesomd die deze 2 aandoeningen linken met immuun-stimulatie secundair aan over-vaccinatie…

In een interview (www.theage.com.au December, 2008) zei Dr Vollmer-Conna dat de individuen met de kwetsbaarheid een “buitensporige immuun-respons” hebben. “Sommige mensen zullen ernstiger symptomen hebben bij een acute ziekte dan anderen met dezelfde infektie omdat hun lichaam meer intens reageert, wat te wijten is aan hun genetische opmaak.” “De bevindingen zouden er uiteindelijk kunnen leiden tot een betere identificatie van kwetsbare mensen om hen van geïndividualiseerde preventie en behandeling voor gewone infekties te voorzien.” “In sommige gevallen zou het zelfs mogelijk hun leven kunnen redden.”

Clin Infect Dis. 2008 Dec 1;47(11):1418-25

Cytokine polymorfismen hebben een synergistisch effekt op de ernst van de acute ziekte-respons op infektie

Vollmer-Conna U, Piraino BF, Cameron B, Davenport T, Hickie I, Wakefield D, Lloyd AR; Dubbo Infection Outcomes Study Group

Collaborators (8): Dunckley H, Geczy A, Harris R, Khanna R, Marmion B, Rawlinson B, Reeves WC, Vernon S

School of Psychiatry and Centre for Infection and Inflammation Research, School of Medical Sciences, University of New South Wales, Sydney, Australia

ACHTERGROND: Funktionele polymorfismen in immuun-respons genen worden meer en meer erkend als een belangrijke bijdrage aan de uitgesproken individuele verschillen in gevoeligheid voor en gevolgen van infektueuze ziekten. De acute ziekte-respons is een stereotypische set ziekte-manifestaties gemedieerd door de pro-inflammatoire cytokinen die worden geïnduceerd door veel verschillende pathogenen. De genetische determinanten voor de ernst van de acute ziekte-respons werden eerder nog niet onderzocht.

METHODEN: We bekeken de impact van funktionele polymorfismen in cytokine-genen die een kritieke rol spelen in de vroege immuun-respons (tumor necrosis factor-alfa, interleukine-6, interleukine-10 en interferon-gamma) op de ernst en de duur van de ziekte na acute infektie met Epstein-Barr virus, Coxiella burnetii (het organisme dat Q-koorts veroorzaakt) of Ross River virus.

RESULTATEN: We vonden dat de interferon-gamma +874T/A en de interleukine-10 -592C/A polymorfismen significant de ernst en de duur van de ziekte beïnvloeden, alsook de cytokine proteïne-concentraties. Deze cytokine-genotypes werken samen om hun invloed op de gevolgen van de ziekte te versterken.

BESLUITEN: Deze bevindingen suggereren dat genetisch bepaalde variaties in de intensiteit van de inflammatoire respons aan de basis liggen van de ernst van de acute ziekte-respons en voorspellen de herstel-tijd na uiteenlopende infekties.

Acute infekties komen universeel voor en zijn een hoofd-oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Desondanks is er weinig gekend over de redenen waarom sommige individuen sneller herstellen van een ziekte, terwijl anderen ernstige acute ziekte en soms een langgerekt klinisch verloop ervaren na acute infektie. In de meeste (dier-)soorten triggert de immuun-respons op acute infektie door een brede waaier aan pathogenen, een stereotypische set klinische manifestaties – koorts, vermoeidheid, hypersomnie, hyperalgesie, anorexie, vertroebelde stemming en cognitieve stoornissen – genaamd acute ziekte-respons. Deze respons gaat gepaard met verschijnselen voortkomend uit lokale weefsel-schade en vormt de symptomen van of acute infektie.

Het universele karakter van de of acute ziekte-respons, werd door ons team bevestigd bij een onderzoeksgroep die werden geobserveerd van bij het begin van een gedocumenteerde acute infektie te wijten aan Epstein-Barr virus (EBV; de veroorzaker van infektiueuze mononucleosie), Coxiella burnetii (veroorzaker van Q-koorts) of Ross River virus (RRV; epidemische polyarthritis), tot volledig herstel. In twee afzonderlijke stalen was een kern-set acute symptomen evident bij alle indivduen, onafhankelijk van het micro-organisme verantwoordelijk voor de infektie (EBV, een DNA-virus dat B-lymfocyten infekteert; RRV, een door muggen meegedragen RNA-virus dat synoviale [in gewrichtsvocht] macrofagen [type witte bloedcellen] infekteert en C. burnetii, a zoönotische [die kan worden overgedragen van dieren op mensen] bakterie die weefsel-macrofagen infekteert). De gerapporteerde ernst van deze symptomen en hun funktionele impact varieerden echter significant tussen individuen: van relatief mild tot een ernstige, invaliderende ziekte leidend tot hospitalisatie. De ziekte-graad correleerde sterk met de concentraties aan IL-1b en IL-6 in ongestimuleerde PBMC-culturen, wat in het verlengde ligt van bestaand bewijs uit dieren-studies en een sleutel-rol voor pro-inflammatoire cytokinen bevestigt als determinanten van de individuele verschillen in symptomatisch respons op infektie in mensen. In tegenstelling hiermee toonde analyse van de invloed van psychosociale en omgeving-factoren op ziekte-uitkomst (inclusief demografische kenmerken, socio-economische status, persoonlijkheid, ‘coping’-stijl, stemming en psychiatrische voorgeschiedenis) geen significante effekten aan.

Tweelingen- en familie-studies wezen er op dat er significante genetische bijdragen zijn aan de verschillen in de gastheer-respons op immunogene stimuli. Schattingen van de erfelijkheid van door lipopolysaccharide (LPS) gestimuleerde produktie van pro-inflammatoire cytokinen door PBMCs bleken bijvoorbeeld 53%, 57% en 87% voor TNF-a, IL-6 en IL-1b, respectievelijk. Originele research van de ‘Danish Adoption Register’ identificeerde een relatief risico van 5,8 voor een geadopteerd kind om te sterven door infektie als de biologische ouder ook was gestorven aan infektie voor de leeftijd van 50 – het vergelijkbare relatieve risico voor sterfte door kanker of cardiovasculaire ziekte was 1,2 en 4,5 respectievelijk.

Funktionele ‘single nucleotide polymorphisms’ (SNPs) in de pro-inflammatoire cytokine genesn IL-6 (-174G/C) en TNF-a (-308G/A), alsook SNPs die de produktie van anti-inflammatoire cytokinen, zoals IL-10 (-1082G/A, -819C/T, en -592C/A beïnvloeden), worden geassocieerd met vatbaarheid voor én uitkomsten van infektie-ziekten, met inbegrip van EBV, mycobacteriële infekties (lepra en tuberculose), malaria, leishmaniasis en bakteriële sepsis. Polymorfismen in cytokine-genen die adaptieve immuun-responsen reguleren, werden ook geassocieerd met ziekte-respons. Bijvoorbeeld: een SNP in het eerste intron [een stukje DNA in een gen dat niet codeert, niet in het messenger-RNA of eiwit terecht komt maar wel een invloed kan hebben op de transcriptie] van het IFN-γ gen (+874T/A) – waarvan is aangetoond dat het gen-expressie moduleert – werd geassocieerd met uitkomsten na tuberculose, malaria, lepra en ernstig acuut respiratoir syndroom, alsook met der ernst van infektie met respiratoir syncytiaal virus.

Deze gegevens suggereren dat polymorfismen in cytokine-genen die pro- en anti-inflammatoire cytokine-produktie veranderen, een sterke invloed uitoefenen op de gastheer-respons op een diversiteit aan infekties, waarbij ze de ernst en het verloop moduleren van de acute ziekte-respons. In deze studie onderzochten we de impact van funktionele polymorfismen in de TNF-α, IL-6, IL-10 en IFN-γ genen op de ernst en de duur van ziekte bij patiënten met een gedocumenteerde infektie met EBV, RRV of C. burnetii.

PATIËNTEN EN METHODEN

Deelnemers. 300 caucasische individuen (gemiddelde leeftijd 34, tussen 16 en 77; 47% vrouwen) uit de ‘Dubbo Infection Outcomes Study’. Dit is een onderzoekgsgroep samnegesteld uit individuen met serologisch bevestigde acute EBV, RV orf Q-koorts die werden geobserveerd van kort na de aanvang van de symptomen tot het herstel. […]

Afleiding van het ‘ernstigheid’-fenotype. Een index die de ernst van de acute ziekte-respons kwantificeert werd empirisch afgeleid via een ‘principal components’ analyse van de data verkregen tijdens acute infektie door gebruikt te maken van de ‘Somatic and Psychological Health Report’ en een ‘Physical Symptoms Checklist’, die een brede waaier aan fysieke en psychologische symptomen omvatten. Deze index omvatte o.a. koorts, vermoeidheid, slaapstoornis, pijn, verlies van eetlust, verstoorde stemming en verslechterde concentratie. Statistische analyse toonde geen substantiële voorspellende relatie tussen het type infektie of demografische factoren (leeftijd en geslacht) en ernst van de ziekte. […]

DNA-verzameling en genotypering. […]

Cytokine-kwantificatie. […]

Statistische analyses. […]

RESULTATEN

Individuen. […]

Kenmerken van acute infektueuze ziekte voor individuen qua ernst-fenotype extremen. Er waren substantiële verschillen tussen individuen met hoge versus lage ernst-fenotypes qua symptomen van de acute ziekte-respons. Er waren consistente en statistisch significante verschillen qua koorts, slaap, vermoeidheid, pijn, verminderde eetlust, verstoorde stemming en verslechterde concentratie, zowel als wat betreft de graad van futloosheid tijdens de acute ziekte, wat wordt weerspiegeld door het aantal dagen in bed of in ziekteverlof doorgebracht. Een zeer gelijkaardig patroon was evident wanneer de ernst voor elk type infektie afzonderlijk werd vergeleken.

Cytokine-genotype en Ernst van de acute infektueuze ziekte. […] Er was een significant verband tussen het fenotype met hoge ziekte-ernst en het IFN-γ +874T allel [Een gen op een bepaalde plaats van een homoloog chromosoom kan een licht verschillende vorm hebben; bij een SNP is slechts één nucleotide anders. Nucleotiden worden aangegeven met de letters A, C, T of G.]. Een meer bescheiden relatie werd gevonden tussen het SNP op IL-10 -592C/A en het fenotype met lage ziekte-ernst. Individuen homozygoot voor het IL-10 -592C allel (IL-10 -592CC genotype) hadden een lager risico op ernstige symptomen tijdens de acute ziekte dan de individuen met de IL-10-genotypes -592CA of -592AA. Deze associaties waren geldig voor alle 3 sub-cohorten [verschillend type infektie]. […]

IL-10 -592C/A SNP versterkt het effekt van het IFN-γ genotype op ziekte-ernst. Individuen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel (IFN-γ +874TT genotype; hoge IFN-γ produktie) die ook een A allel op IL-10 -592 hadden (IL-10 -592 CA of AA genotype; lage IL-10 produktie) hadden een opmerkelijk verhoogd risico op het doormaken van een ernstige ziekte, vergeleken met individuen homozygoot voor én het IFN-γ +874A (IFN-γ +874AA genotype) én het IL-10 -592C allel (IL-10 -592CC genotype). Het risico op het doormaken van een ernstiger acute ziekte was voor individuen met ‘hoog risico’ IFN-γ +874TT en IL-10 -592 CA of AA genotype meer dan het dubbel dan dat geassocieerd met het IFN-γ +874TT genotype alleen.

Impact van genetische variatie op produktie van cytokine-proteïne. Om eerdere rapporten over genetisch bepaalde verschillen in IFN-γ en IL-10 produkie te bevestigen, werd de cytokine-produktie bestudeerd in een subgroep van de studie-onderzoeksgroep (n=35). Er werden significant hogere waarden voor IFN-γ produktie gevonden in gestimuleerde culturen van PBMCs bij personen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel (hoge ziekte-ernst), vergeleken met een IFN-γ +874 AA of AT genotype […]. Getimuleerde cel-culturen van personen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel bevatten ook hogere waarden pro-inflammatoire cytokinen IL-1b en TNF-α, vergeleken met een IFN-γ +874 AA of AT genotype […]. Er waren geen significante verschillen in cytokine-produktie bij ongestimuleerde PBMC-culturen.

[…]

Ziekte-ernst voorspelt ziekte-duur. Analyses van de tiid-tot-herstel toonden een sterke relatie tussen het ziekte-ernst fenotype en de totale duur van de symptomatische ziekte. Individuen met een lage ziekte-ernst fenotype hadden symptomen gedurende 20 dagen (mediaan), terwijl die met het hoge ziekte-ernst fenotype 135 dagen symptomatisch bleven. De combinatie van IFN-γ en IL-10 genotypes hadden ook een impact op de duur van de ziekte. Personen met het ‘laag risico’ genotype (IFN-γ +874AA en IL-10 -592CC) waren 34 dagen symptomatisch maar personen met het ‘hoog risico’ genotype (IFN-γ +874TT en IL-10 -592 AA or CA) hadden ziekte-symptomen gedurende 80 dagen.

BESPREKING

Funktionele polymorfismen IFN-γ en IL-10 beïnvloeden de cytokine-produktie, alsook de ernst en duur van ziekte na infektie met EBV, RRV of C. burnetii op significante wijze. Deze bevindingen versterken het bewijs voor een sleutel-rol van een gebalanceerde cytokine-respons in het verwerken van acute infekties en van sterke genetische regulerende effekten op die respons. Bovendien hebben we gedocumenteerd dat met risico geassocieerde cytokine-genotypes samenwerken om hun impact op de ernst van ziekte te versterken. Omwille van de zeer gevarieerde karakteristieken van de bestudeerde pathogenen, mogen deze bevindingen vermoedelijk worden veralgemeend tot de gastheer-respons van vele infektueuze agentia. Het moet worden opgemerkt dat, bij acute infekties, complicaties resulterend uit lokale weefsel-beschadiging (verbonden met de directe effekten van het pathogen of met immunopathologie) ook aanleiding kunnen geven tot ziekte-verschijnselen. In sommige gevallen kunnen dergelijke verschijnselen het ziekte-complex domineren (bv. veranderingen in de kleine bloedvaten die leiden tot coma bij cerebrale malaria), alhoewel deze typisch worden vergezeld door de systemische kenmerken van de acute ziekte-respons (zoals koorts). Het zijn deze laatste die stereotyperend zijn bij verscheidene infekties en de focus van deze analyse. Verder worden, in vele gevallen, allebei de lokale en systemische verschijnselen gemedieerd door dezelfde pro- en anti-inflammatoire cytokinen.

Deze bevindingen zijn in overeenstemming met substantieel bewijs voor de centrale rol van IFN-γ én IL-10 in het bepalen van de karakeristieken van de aangeboren en adaptieve gastheer-responsen op een brede waaier aan pathogenen en, daardoor, de vatbaarheid voor vele intracellulaire bakteriële, parasitaire en virale infekties. In verband met de acute ziekte-respons, zijn de krachtige inhiberende effekten van IL-10 op IL-1b en TNF-α produktie bij geaktiveerde macrofagen het opmerken waard, omdat deze cytokinen dikwijls samenwerken bij de inductie van inflammatie. Daarnaast is aangetoond dat de toediening van IL-10 in vivo de produktie van pro-inflammatoire inhibeert.

Het T-allel van de IFN-γ +874T/A SNP vertoont niet enkel een sterke associatie met de ernst van de acute ziekte-respons maar het risico op het doormaken van een ernstige acute ziekte is ook wezenlijk verhoogd voor homozygote dragers van het T-allel, vergeleken met heterozygote dragers, wat een gen-dosage effekt [gen-dosage = aantal copieën van een bepaald gen-locus in het genoom, meestal één of twee; voorkomen van meerdere copieën van een gen kan leiden tot over-expressie] suggereert. Dit is consistent met de observatie dat de toediening van IFN-γ tot symptomen leidt die doen denken aan de acute ziekte-respons. Associaties tussen het hoge-aktiviteit IFN-γ +874TT genotype en ernst van de ziekte bij patiënten met tuberculose en infektie met respiratoir syncytiaal virus [RSV] werden elders reeds gemeld. Verder werd verhoogde produktie van IFN-γ en pro-inflammatoire cytokinen geassocieerd met ernstige infektueuze mononucleose en tuberculose. IFN-γ en TNF-α zijn ook betrokken bij bij het aansturen van het immunopathologisch proces dat leidt tot levensbedreigende cerebrale complicaties bij ernstige malaria, terwijl IL-10 dit proces leek tegen te werken.

De studie hier toonde een verband tussen het genotype voor lage IL-10 produktie en het SNP bij de nucleotide-positie -592 maar niet het SNP bij -1082. Eerdere studies die de impact onderzochten van de 3 prevalente SNPs (bij nucleotide-posities -1082, -819 en -592) in de IL-10 promotor op uitkomsten van infektueuze ziekten, leverden inconsistente resultaten op die mogelijks toe te schrijven waren aan verwarrende immunogenetische invloeden. […]

Hoewel de bijdrage van het IL-10 -592C/A SNP tot de ernst van de ziekte bescheiden was, hadden individuen met een A-allel op positie -592 en het IFN-γ -874TT genotype 8 keer meer kans op een ernstige ziekte-respons. Deze ontdekking van een beduidend hoger risico voor de ‘hoog risico’ genotype-combinaties wijzen op het belang, in het gebied van immunogenetica; van verder te kijken dan het bestuderen van individuele cytokinen bij onderzoek van de complexe micro-omgeving resulterend uit de interaktie van meerdere genen en gen-produkten.

Onderzoek van de produktie van cytokine-proteïnen bevestigde de funktionele significantie van de gerapporteerde genetische associaties. Bovenop de verwachte veranderingen in de concentraties van IFN-γ en IL-10, vertoonden cel-culturen van individuen met genotypes die een meer intense inflammatoire respons zouden begunstigen (hoge IFN-γ, lage IL-10 produktie) ook hogere waarden aan pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-1b, TNF-α en IL-6. Dit suggereert een feedback-mechanisme van IFN-γ (geproduceerd door T-lymfocyten) die de produktie van deze pro-inflammatoire cytokinen (waarschijnlijk vooral geproduceerd door monocyten) beïnvloedt.

Deze stelling is consistent met onze bevindingen van een ernstiger acute ziekte en vertraagd herstel geassocieerd met het IFN-γ +874T allel. Deze uitkomsten verschillen een beetje van deze in het lymfocytisch choriomeningitis virus model bij muizen, waar experimentele vermindering van IL-10 aktiviteit T-cel-responsen ondersteunde (inclusief IFN-γ produktie) en snelle verwijdering van het micro-organisme bleek te vergemakkelijken, wat leidde tot een kortere ziekte-duur. Voor de hier beschreven gegevens, was het genotype met de hoge IFN-γ en lage IL-10 produktie geassocieerd met een ernstiger acute fase en een langere ziekte-duur. Dit is in overeenstemming met bewijsmateriaal uit de ‘Dubbo Infection Outcomes Study’ onderzoeksgroep, waar werd gevonden dat langdurige ziekte niet was geassocieerd met aan de gang zijnde virale aktiviteit of cytokine-produktie in het perifeer bloed.

De acute ziekte-respons wordt in gang gezet door de produktie van pro-inflammatoire cytokinen maar wordt uiteindelijk gemedieerd door neurochemische veranderingen in de hersenen. De mechanismen waardoor perifere cytokine-signalen worden doorgegeven naar het brein worden niet volledig begrepen maar omvatten directe neurale wegen (via primaire afferente zenuwen van het autonoom zenuwstelsel) en binnenkomen van cytokinen in hersen-gebieden waar de bloed-hersen-barrière onvolkomen is. Dier-studies wijzen er op dat perifere cytokinen daar de synthese door microglia [immuuncellen - macrofagen - van het centrale zenuwstelsel] en astrocyten [stervormige, vertakte gliacel met uitlopers; steuncellen in de zenuwbaan die liggen tussen een bloedvat en een zenuwcel] van nieuwe cytokinen induceren. [Microglia en astrocyten zou op zijn minst gedeeltelijk aan de basis kunnen liggen van de pathogenese van een aantal klinisch belangrijke neurodegeneratieve aandoeningen van het centraal zenuwstelsel zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, e.a.] De mechanismen voor de vertaling van deze cytokine-signalen in veranderde neurale transmissie blijven onduidelijk. Van belang voor de geobserveerde associatie tussen ernst van de acute ziekte-respons en de duur van de ziekte is de groeiende bewustwording van een overwegende respons van microglia op een waaier van infekties en inflammatoire stimuli via Toll-like receptoren [‘Glial toll-like receptor signaling in central nervous system infection and auto-immunity’; Toll-Like Receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren; aktivatie van TLR’s - 10 types geïdentificeerd - leidt tot aktivatie van de transcriptie-factor NF-κB en vervolgens tot produktie van pro-inflammatoire cytokinen als IL-1 en TNF-α] en de erkenning dat een enkelvoudige blootstelling aan door LPS geïnduceerd TNF-α aktivatie van microglia kan triggeren die 10 maand bleef aanhouden in afwezigheid van systemische inflammatie. We vermoeden daarom dat bij individuen met een langdurige post-infektueuze ziekte, een prominente cytokine-respons in de acute fase sensitisatie verzoorzaakt in deze ZNS-mechanismen, wat leidt tot aanhoudende neurologische fenomenen die zich manifesteren met blijvende symptomen in afwezigheid van aanhoudende perifere cytokine-produktie.

De uitdaging voor het immuunsysteem van een geïnfekteerde gastheer is om te antwoorden met voldoende intensiteit en duur om het pathogen te controleren of te elimineren, maar om er tegelijk voor te zorgen dat korte-termijn én aanhoudende immunopathologische schade minimaal blijft. Onze resultaten tonen dat gewone polymorfismen in respons-genen van de gastheer een impact hebben op de acute ziekte-respons op infektie. De individuen wiens genetische opmaak een meer intense inflammatoire reaktie bevoordeelt, zullen wellicht ernstiger symptomen en een langduriger ziekte ervaren bij infektueuze aandoening. Verdere studies om bijkomende immunologische en neurologsiche genen geassocieerd met de acute ziekte-respons te verduidelijken, zijn gerechtvaardigd. Uiteindelijk zullen de ontdekking van combinatie-haplotypes geassocieerd met de acute ziekte-respons en het onderzoek van de gerelateerde biologische processen, de identifikatie toelaten van individuen met een hoog risico op ernstige en langdurige ziekte na infektie, om geïndividualiseerde preventie en behandeling voor courante infektie-ziekten te kunnen voorstellen.

Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS

De pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis is nog steeds niet (volledig) gekend; waarschijnlijk spelen verschillende (erfelijke en omgevings-) factoren een rol.

Veel bewijsmateriaal ondersteunt de betrokkenheid van chronische immuun-aktivatie en andere immunologische dysfunkties. De tevens gevonden verhoogde oxidatieve stress is consistent met een chronische inflammatoire toestand. Verhoogde NK-cel aktiviteit, meer allergische en auto-immune beelden wijzen op een Th2-gericht cytokine-patroon. Genetische voorbestemdheid kan ook bijdragen tot de veranderingen in bv. cytokine-profielen.

In Australië is er de ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ waarbij researchers mensen volgen die na verloop van tijd infektueuze ziekten ontwikkelen om te proberen begrijpen waarom sommigen of onder hen niet herstellen maar een aandoening blijven hebben die voldoet aan de criteria voor het Chroniscshe Vermoeidheid Syndroom.

In een artikel uit 2006 in de British Medical Journal (Post-infective and Chronic Fatigue Syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens) rapporteerden Hickie et al. hier over. Ze hebben het percentage vergeleken van mensen die mononucleose (EBV-virus; klierkoorts), Q-fever (veroorzaakt door de intracellulaire bakterie Coxiella burnetii) en Ross River virus gehad hebben en die later voldeden aan de criteria voor CVS.

De auteurs vonden dat het percentage die CVS kregen na de drie infekueuze ziekten hetzelfde was (11% na 6 maand). Dit resultaat is zeer betekenisvol aangezien het suggereert dat de reden dat deze mensen CVS ontwikkelen niet geassocieerd is met een bepaald pathogen maar eerder met hoe hun respons als gastheer hierop wass. Citaat: “Onderzoek van uitkomsten na de drie acute infekties impliceert in hoge mate dat aspekten van de gastheer-respons op infektie (eerder dan het pathogen zelf) bepalend zijn voor een post-infektueus vermoeidheidssyndroom, aangezien het aantal gevallen na infektie met Epstein-Barr virus (een DNA-virus), Ross River virus (een RNA-virus) en Coxiella burnetii (een intracellulaire bakterie) vergelijkbaar waren en de symptoom-karakteristieken na verloop van tijd samenvielen.”. Interessant in dit ‘British Medical Journal artikel is overigens de melding dat psychologische factoren hier geen hoofdreden blijken te zijn voor de persistentie voor de vermoeidheid volgend op infektie.

M.E.(cvs) kan dus door een infektie worden getriggerd maar het zou eigenlijk niet uitmaken door welke. Na verloop van tijd verdwijnt de ‘schuldige’ dikwijls. Er zijn andere factoren bij de getroffene die de buitensporige, afwijkende (hierboven reeds vermelde) dysfunkties tot gevolg hebben. Een hypothese kan zijn dat de aanzet voor CVS wordt veroorzaakt door een combinatie van genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen waarmee deze mensen worden geboren en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren. Zoals bij zovele aandoeningen gaat het dus wellicht om ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren)…

Hoewel de aanzet kan zijn gegeven door (virale of andere) infektes (maar even goed door bv. een toxine) en bij sommige subgroepen sommige infektueuze agentia worden gerapporteerd, is nog steeds niet één enkel infektueus agens gevonden dat verantwoordelijk is voor M.E.(cvs) in het algemeen. Hieronder, een studie van het CDC die dit aantoont: er komen géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties (inidicatief voor bakterieën) voor bij CVS.

[Het bijzondere aan het gen coderend voor 16S rDNA is dat er veel verschillen zijn tussen micro-organismen onderling maar dat het ook juist zeer gelijk is op bepaalde stukken (geconserveerde regio’s). Van die constante gebieden wordt gebruik gemaakt bij het ontwerpen van een primer (startplaats) voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’). Door achteraf de sequentie (volgorde van de nucleotiden waaruit het DNA is opgebouwd) te bepalen, kan worden achterhaald welke prokaryote micro-organismen er aanwezig zijn.]

De ‘Dubbo studie’ vertelt ons overigens niet welke behandeling dient te worden ingesteld (enkel wat de karakteristieken zijn van de CVS-categorie met een post-infektueuze oorsprong). Zomaar aan alle M.E.(cvs)-patiënten antibiotica (tegen bakterieën) – maar ook antivirale middelen – toedienen lijkt niet aangewezen. De risico’s op (multi-)resistente bakterieën en de toxiciteit van sommige (antivirale) middelen nopen tot voorzichtigheid. Wat niet wil zeggen dat dit in specifieke gevallen (waarbij een pathogene infektie werd aangetoond – met internationaal aanvaarde methodieken en in gecertificeerde laboratoria!) wel nodig kan zijn. Het voorkomen van enterovirussen, HHV-n, enz. bewijst ook nog steeds geen oorzakelijk verband voor M.E.(cvs).

BMC Microbiology 2002, 2:39

Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of Chronic Fatigue Syndrome and non-fatigued subjects

Suzanne D Vernon^*1, Sanjay K Shukla², Jennifer Conradt², Elizabeth R Unger¹ and William C Reeves¹

1 Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

2 Clinical Research Centre, Marshfield Medical Research Foundation, 1000 North Oak Avenue, Marshfield WI 54449-5790, USA

Dit onderzoek werd deels ondersteund door financiering van het ‘National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention’ aan Sanjay K Shukla van de ‘Marshfield Medical Research Foundation’ [een gerenommeerd molekulair microbioloog en researcher op gebied van infectueuze ziekten].

Samenvatting

Achtergrond: Het associëren van een infektueus agens met het Chronische Vermoeidheid Syndroom is moeilijk en wordt verder bemoeilijkt door het ontbreken van een letsel of ziek weefsel. DNA uit cel-vrij plasma DNA zou kunnen dienen als een ‘schildwacht’ [aanwijzing] voor infektie en ziekte die plaatsgrijpt over het gans het lichaam. Dit type systemisch staal gekoppeld aan amplificatie van een brede waaier aan bakteriële sequenties werd gebruikt om te bepalen of een bakterieel pathogeen gerelateerd is met CVS. Plasma DNA van 34 CVS- en 55 niet-vermoeide individuen werd onderzocht om plasma DNA-concentratie en de aanwezigheid van bakteriële 16S ribosomaal DNA (rDNA) sequenties te bepalen.

Resultaten: DNA werd geïsoleerd bij 81 (91%) van 89 plasma-stalen. De 55 niet-vermoeide individuen hadden hogere plasma DNA-concentraties dan deze met CVS (gemiddeld 151 versus 91 ng) een meer CVS-individuen (6/34, 18%) hadden geen detekteerbaar plasma-DNA dan niet-vermoeide individuen (2/55, 4%) maar deze verschillen waren niet significant. Bacteriële sequenties werden gedekteerd bij 23 (26%) van 89. Bij slechts 4 (14%) CVS-individuen werden16S rDNA sequenties geamplificeerd uit het plasma vergeleken met 17 (32%) van de niet-vermoeiden (P = 0.03). Bij allle uitgezonderd 1 van de 23 16S rDNA amplicon-positieve individuen waren vijf of meer unieke sequenties aanwezig.

Besluiten: CVS-individuen hadden lichtjes lagere concentraties dan niet-vermoeide individuen of geen detekteerbaar plasma-DNA. Er tekende zich een brede waaier aan 16S rDNA sequenties af in plasma-DNA van én CVS én niet-vermoeide indivduen. Er waren géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties bij CVS of niet-vermoeide individuen.

Achtergrond

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een complexe ziekte gedefinieerd door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en een combinatie van niet-specifieke symptomen. Er zijn geen consistente anatomische letsels of klinisch-chemische abnormaliteiten. Hoewel geen bekende infektueuze agentia of immunologische verstoringen op een consistente manier werden geassocieerd met CVS, heeft de ziekte veel kenmerken die suggestief zijn voor een infektueuze ziekte. Vermoeidheid, spier- en gewrichtspijn, pijnlijke keel en gezwollen klieren zijn allen gebruikelijke symptomen die worden gedeeld met infektie en CVS. Daarenboven beschrijven veel mensen met CVS de aanvang van hun ziekte als plots of ‘griep-achtig’, een mogelijke infektueuze etiologie suggererend. Nochtans is de identifikatie van een infektueus agens dat specifiek is geassocieerd met CVS niet mogelijk gebleken via conventionele laboratorium-analyse. Uitgebreide sero-epidemiologische onderzoeken gericht op de detektie van antilichaam-responsen op talrijke gekende virale, bakteriële en rickettsiale agentia hebben geen verschillen tussen CVS-gevallen en normale controles kunnen aantonen [Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, Gary HE Jr, Stewart JA, Reyes M, Steele L, Schmid DS and Reeves WC. Sero-epidemiology of Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Clin Infect Dis 1995, 21:1386-1389. --- Buchwald D, Ashley RL, Pearlman T, Kith P and Komaroff A. Viral serologies in patients with chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J Med Virol 1996, 50:25-30].

Zoeken naar gekende of nieuwe infektueuze agentia bij personen met CVS is ingewikkeld door het ontbreken van een gekend letsel of ziek weefsel om te onderzoeken. Recent werd aangetoond dat circulerend cel-vrij DNA uit plasma en serum sequenties van tumorale, virale en bakteriële oorsprong bevat. Dit plasma-DNA dient daarom als een ‘schildwacht’ voor verborgen ziekte voorkomend op diverse plaatsen in het lichaam. We gebruikten dit plasma-DNA om te zoeken naar voordien ongekarakteriseerde zowel als naar gekende bakteriële pathogenen. Om dit te doen, gebruikten we PCR voor bakteriële 16S ribosomaal RNA genen (rRNA) [15]. Dit breed amplificatie-schema is succesvol bij het detekteren en karakteriseren van bakteriële pathogenen bij verscheidene ziekten en bij meerdere types klinische stalen.

We bepaalden het gehalte circulerend plasma-DNA bij CVS-individuen als een mogelijke aanwijzing voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie. We amplificeerden en sequenceten ook het 16S rRNA gen om te zoeken naar gekende en eerder ongekarakteriseerde bakteriële agentia in cel-vrij circulerend DNA om te bepalen of een bakterieel pathogen was geassocieerd met CVS.

Indviduen en methoden

Gevallen en controle-individuen

Als onderdeel van een longitudinale populatie-studie naar CVS in Wichita, Kansas werden stalen perifeer bloed verzameld tijdens de klinische evaluatie van vermoeide individuen die mogelijks CVS zouden hebben en een willekeurige selektie niet-vermoeide individuen. Bij de personen die klinisch geëevalueerd werden, bleken 34 individuen te zijn die voldeden aan de CVS-definition uit 1994. Daarvan werden, alsook uit de 55 niet-vermoeide individuen, die met voldoende plasma geselekteerd voor analyse.

[…]

Polymerase ketting reaktie (PCR)

[…] Water-stalen genomen tijdens het plasma-DNA concentratie- en extraktie-proces werden als stalen meegenomen om ‘background’ bakteriële sequenties aanwezig in reagentia en toebehoren te identificeren. Twee sets 16S rDNA primers, 515F/RD1 en 515F/806R, werden gebruikt in afzonderlijke amplificaties. Deze primers leveren amplificatie-produkten van 1045 en 300 bp op. […]

16S rDNA sequetie-bepaling

[…]

Resultaten

[…]

Karakterisatie van plasma-DNA

De hoeveelheid cel-vrij DNA varieerde van 0 tot 1.320 ng per ml plasma (gemiddeld 128 ng DNA), waarbij 91% (81/89) detekteerbare waarden opleverden. CVS-individuen vertoonden een tendens voor verlaagd plasma-DNA in vergelijking met niet-vermoeide individuen (gemiddeld 91 versus 151 ng) maar dit verschil was niet significant. Zes (18%) van de 34 plasma-stalen van CVS-indivduen hadden geen detekteerbaar cel-vrij DNA, terwijl slechts 2 (4%) van de 55 niet-vermoeide individuen geen detekteerbaar cel-vrij DNA in hun plasma hadden (P = 0.08). Er werd ook geen verschil in plasma DNA-concentratie gevonden als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte.

Alle 89 stalen, of er nu plasma-DNA werd geïsoleerd of niet, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van bakteriële 16S rDNA sequenties. Alles te samen hadden 23 (26%) individuen 16S rDNA sequenties die werden geamplificeerd en gekarakteriseerd. Het gemiddeld aantal 16S rDNA sequenties bij de 23 individuen was 9 (range 3-14). De CVS-individuen hadden gemiddeld 11 16S rDNA sequenties en de niet-vermoeide individuen hadden gemiddeld 9 16S rDNA sequenties. Het plasma-DNA van 4 (14%) van de 28 CVS-individuen had 16S rDNA sequenties vergeleken met 17 (32%) van de 53 of niet-vermoeide individuen (P = 0.03). Er werden geen verschillen genoteerd qua detektie van bakteriële 16S rDNA sequenties als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte. Er was geen verband tussen de hoeveelheid plasma-DNA en de mogelijkheid om 16S rDNA sequenties te amplificeren. […] Sequenties werden gedetekteerd in stalen van CVS- en niet-vermoeide individuen met plasma DNA-concentraties die varieerden van 24 tot 294 ng/ml.

Van alle 16S rDNA geamplificeerde produkten werd de sequentie bepaald om de prokaryote oorsprong te identificeren. Elk van de sequenties was óf identiek óf zeer gelijkaardig (97% of meer) met prokaryote sequenties van de GenBank. Om te bepalen of een bijzondere bakteriële sequentie werd gevonden in CVS-gevallen versus niet vermoeide controles, werd een ‘cluster-analyse’ [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier DNA-patronen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uitgevoerd. Er waren geen 16S rDNA sequenties uniek of predominant bij de CVS- of de niet-vermoeide groep, zoals aangetoond door de willekeurige verdeling en het gebrek aan clustering bij de CVS- of niet-vermoeide individuen. Er was ook geen aanwijzing dat bakterieën die bekend staan langdurige vermoeiende ziekten (e.g. Coxiella sp. of Borellia sp.) te veroorzaken, meer prevalent waren bij CVS-individuen.

Bespreking

Aangezien er bij CVS geen gekende anatomische letsels kunnen worden aangeduid, besloten we cel-vrij plasma-DNA als een systemische aanwijzing voor de ziekte te onderzoeken. Plasma-DNA werd geïsoleerd uit de meeste van de CVS- en niet-vermoeide individuen. We detekteerden een hogere concentratie plasma-DNA bij de niet-vermoeide individuen dan bij de CVS-individuen en er waren minder niet-vermoeide individuen die plasma-DNA negatief waren dan CVS-individuen (de verschillen waren echter niet significant). De fysiologische betekenis en de bron van cel-vrij DNA in het plasma worden niet ten volle geapprecieerd maar we vermoeden dat het kan resulteren uit cellulaire degradatie. Tot op heden wordt plasma-DNA gebruikt als een relatief niet-invasieve manier om aan-de-gang-zijnde pathogene gebeurtenissen, zoals minimale residuele ziekte [symptoomloze rest-aanwezigheid van een aantal maligne tumorcellen tijdens of na een kanker-behandeling] of kanker te detekteren. Onze gegevens tonen geen significant verschil in de waarden van plasma cel-vrij DNA bij CVS- versus niet-vermoeide individuen, wat er op wijst dat er wellicht geen ongebruikelijke celulaire turn-over is bij de CVS-populatie. Het is ook mogelijk dat concentratie cel-vrij plasma-DNA geen gevoelige indicator is voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie.

Niettegenstaande een uitgebreide zoektocht naar gekende pathogenen d.m.v. conventionele laboratorium-methoden, werd geen uniek pathogeen op consistente wijze geïdentificeerd als een oorzaak voor CVS. Bijna elk gekend viraal en bakterieel agens dat vermoeiende ziekte kan veroorzaken werd getest bij CVS-individuen en er was geen verschil in de prevalentie van deze agentia tussen CVS- en gezonde individuen [Koelle DM, Barcy S, Huang ML, Ashley RL, Corey L, Zeh J, Ashton S and Buchwald D. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis 2002, 35:518-525]. Eén verklaring is dat het met CVS geassocieerde pathogen nieuw of eerder ongekarakteriseerd is. Om te zoeken naar prokaryote agentia die mogelijks specifiek geassocieerd zijn met CVS, gebruikten we PCR met consensus-primers [primer die meerdere gerelateerde stukken DNA kan amplificeren; handig voor het screenen van meerdere stammen: men heeft maar één primer-set nodig om een soort virus/bakterie/genenfamilie op te sporen] om de geconserveerde 16S rRNA subunit te detekteren en deze sequenties te karakteriseren. Van de 89 individuen werden bij 4 CVS- en 17 niet-vermoeide individuen 16S rDNA sequenties geamplificeerd. Dit verschil in de aan- of afwezigheid van 16S rDNA tussen CVS en niet-vermoeiden was niet gerelateerd aan verschillen in plasma-DNA concentraties. Er werden geen unieke of eerder niet-gekarakteriseerde prokaryote sequenties geïdentificeerd bij de CVS- noch bij de niet-vermoeide groep. Er werd eerder een diverse serie van gekende prokaryote sequenties gevonden circulerend in het plasma.

Niettegenstaande het onwaarschijnlijk is dat de hier gekarakteriseerde 16S rDNA sequenties te wijten zijn aan experimentele of omgevings-contaminatie, kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de gebruikte bloefafname-buisjes een bron waren van het gedetekteerde bakterieel DNA. Nochtans was dit onwaarschijnlijk aangezien alle plasma-stalen, of er nu DNA aanwezig was of niet, werden onderworpen aan amplificatie voor de 16S ribosomale subunit. Alle plasma-DNA negatieve stalen waren negatief voor het 16S rDNA amplificatie-produkt. Daarenboven waren water-controles die door het hele extraktie-proces werden meegnomen, consistent negatief. Ten slotte waren slechts 23 van de 89 plasma-stalen positief voor 16S rDNA sequenties. Als onze resultaten een weerspiegeling zijn van het voorkomen van 16S rDNA sequenties bij gezonde individuen, is het aanneembaar te stellen dat aanwezigheid, eerder dan afwezigheid, van deze sequenties de normale fysiologische toestand en symbiotische relatie tussen mensen en microben reflekteert. Dit is niet de eerste illustratie van de duidelijke symbiotische relatie die bestaat tussen mensen en bakterieën. Het onderzoek van bloed van gezonde personen via amplificatie van het 16S rRNA gen toonde talrijke bakteriële sequenties die niet werden gevonden bij reagentia-controles. Weber et al. hebben een aantal microbiële en virale transcripten uit humane cDNA verzamelingen geïdentificeerd via de computer-substrakie methode. Het is niet verrassend dat het menselijk lichaam een ‘microbieel observatorium’ wordt genoemd. Verder analyse van de microbiële flora die op verscheidene plaatsen in het lichaam bestaat bij gezonde en zieke personen zou ons begrip i.v.m. inter-relaties tussen microben en hun menselijke gastheren moeten bevorderen.

Het experimenteel ontwerp die bij studie werd gebruikt; heeft enkele beperkingen wat betreft het toetsen van onze hypothese dat een nieuw pathogen zou zijn geassocieerd met CVS. Plasma-DNA zou niet het ideale staal kunnen zijn voor het detekteren van prokaryote sequenties. Granulocyten-subsets zouden meer geschikt kunnen zijn aangezien deze perifeer bloed cel-fraktie neutrofielen en andere opruim-cellen bevat die belangrijk zijn bij het verwijderen van virussen en bakterieën. Deze perifeer bloed stalen zijn misschien niet op optimale wijze verzameld en verwerkt voor preservatie van DNA in plasma maar alle stalen van alle individuen werden wel op dezelfde manier verwerkt. De CVS-individuen waren, ten slotte, al jaren ziek en het agens dat de trigger voor hun ziekte was, werd misschien al lang opgeruimd.

Besluiten

DNA geïsoleerd uit het plasma kan worden gebruikt om de associatie van pathogenen met verborgen ziekte te onderzoeken. De CVS-individuen met plasma-DNA hadden lichtjes gedaalde concentraties vergeleken met de niet-vermoeide individuen en er waren meer CVS-individuen zonder detekteerbaar DNA in het plasma. Er was een brede waaier aan 16S rDNA sequenties in plasma-DNA van én CVS- én niet-vermoeide individuen. Verder onderzoek van 16S rDNA sequenties in perifeer bloed zal zich moeten toespitsen op de granulocyt-cellen.

Biofilms en chronische infekties (antibiotica-resistentie)

Reeds vele jaren worden M.E.(cvs)-patiënten dikwijls langdurige antibiotica-therapieën voorgeschreven voor ‘infekties’ die op basis van dubieuze diagnostische methodes werden ‘vastgesteld’. Mijn insziens (en dat wordt door meerdere onderzoekers onderschreven) is er niet één enkel organisme verantwoordelijk voor het ontstaan van de aandoening. Laat ons dus verder op subcellulair niveau zoeken wat eventuele inflammatie toelaat.

Op de website van Jacob Teitelbaum, M.D. (directeur van het ‘Annapolis Centre for Effective CFS/Fibromyalgia Therapies’; www.endfatigue-dev.com) lazen we bijvoorbeeld: “Nieuwe research geeft ons een duidelijker beeld van wat er nodig is om infekties in ’t algemeen en in ’t bijzonder bij chronische ziekten zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom en Fibromyalgie, aan te pakken. Eén van de nieuwe concepten die ons nieuwe instrumenten en inzichten aanrijkt bij het elimineren van deze infekties zijn Biofilms. Een manier om zich aan te passen tegen antibiotica, is het creëren van biofilms. Deze vertegenwoordigen een laag van bakterieën en andere organismen die samenleven in een gel-achtige film. Deze film beschermt hen tegen antibiotica, ultraviolet licht en andere ‘aanvallers’, zodat ze moeilijk te vernietigen zijn.”

“Deze biofilms lijken op een sort slijm (genaamd ‘Extracellulaire Polymerische Substanties’ of EPS) – gesecreteerd door de organismen – en zorgen er voor dat de infekties zeer resistent zijn tegen antibiotica.”

[…]

Hij licht ook een topje van de sluier op over eventueel mogelijke behandelingen: “…nieuwe benaderingen worden ontwikkeld om ze [biofilms] te bestrijden. Van het eenvoudig mineraal genaamd ‘bismut’ [bismut-dimercaptopropanol (BisBAL) - bismut-subcitraat, bismut-subsalicylaat (Pepto-Bismol), bismut-subgallaat] werd aangetoond dat het duidelijk biofilms verstoort bij een lage dosis. Interessant om weten is dat dit mineraal soms een bestanddeel van tandpasta is. Bismut wordt nu ook gebruikt in medische katheters om infekties te voorkomen. Ik vermoed dat, gezien sinusitis ook een biofilm reflekteert, bismut onder de vorm van een neusspray zal worden getest. In tussentijd: de ‘Sinusitis Nose Spray’ die ik aanbeveel (ITC Pharmacy, op voorschrift) bevat xylitol, die een gelijkaardig effekt kan hebben.” [Dit laatste komt ook voor in een patent voor een mogelijk middel tegen biofilms; alsook (apo-)lactoferrine.]

Ook het gebruik van probiotica ziet er veelbelovend uit. Een belgisch bedrijf berichtte over een succesvolle proef met hun produkt ‘PIP [Probiotica in Progress] Healthcare’ ter bestrijding van ziekenhuisinfekties veroorzaakt door biofilms…

De boodschap blijft dus: voorzichtig met (langdurige) antibiotica-behandelingen!

http://jama.ama-assn.org/cgi/content/full/299/22/2682

JAMA. 2008 Jun 11;299(22):2682-4

Biofilms en chronische infekties

Randall D. Wolcott, MD; Garth D. Ehrlich, PhD

Dr Wolcott: Medical Biofilm Research Institute, Lubbock, Texas

Dr Ehrlich: Centre for Genomic Sciences, Allegheny Singer Research Institute, Allegheny General Hospital, and Departments of Microbiology and Immunology and Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Drexel College of Medicine, Allegheny Campus, Pittsburgh, Pennsylvania

Het heersend paradigma voor infektie-ziekten is gebaseerd op het werk van Koch en collegas, die meer dan 150 jaar geleden individuele bakterie-stammen isoleerden en de pure cultuur-methode ontwikkelden die heden-ten-dage nog steeds wordt gebruikt. Dat werk verlichtte de geneeskunde door stevig de kiem-theorie van overdraagbare ziekten vast te leggen en demonstreerde dat ziekten zoals dysenterie, tuberculose en anthrax worden veroorzaakt door microbiologische agentia¹ Zodoende, ontwikkelde de microbiologie zich rond Koch’s methodes met klinische microbiologen die op een overweldigende manier werkten met pure log-fase culturen in nutrient-rijke media omdat dit zo’n krachtig instrument voor de studie van acute epidemische bakteriële ziekten aanleverde. Maar deze benadering bestudeert enkel planktonische bakterieën (vrij-bewegend, enkelvoudige cel fenotype) en dit zou wel es de ontwikkeling kunnen beperkt hebben van een grondiger begrip van microbiële processen. Het planktonisch fenotype bestaat in de meeste natuurlijke omgevingen en bij chronische bakteriële infekties over het algemeen enkel tijdelijk en gewoonlijk als een minderheidsrpopulatie.

Nieuw bewijsmateriaal beschrijft bakteriële populaties als overheersend poly-microbiële, verankerde, in gemeeschapsvorm levende aggregaties ingebed in een zelf-gesecreteerde matrix, wat veelvuldige voordelen voor persistentie verstrekt bij uitdagingen door de omgeving en gastheer. Daarom voorzien biofilms en het bestaan van een complexe bakteriële levenscyclus in een nieuw perspektief van waaruit infektie-ziekten moeten worden bekeken. Veel van de steun voor dit perspektief is voortgekomen uit de toepassing van nieuwe detektie- en visualiseringsmethodes die bewijs leverden voor de theorie dat chronische infekties fundamenteel verschillen van acute infekties en dat verschillende interventionele benaderingen nodig zijn om deze biofilm-infekties efficiënter te behandelen.

Wat is een Biofilm?

Een biofilm is een dunne laag micro-organismen die vastplakken aan het oppervlak van een organische of anorganische struktuur, samen met de door hen gesecreteerde polymeren. Biofilms zijn het overheersend fenotype van bijna alle bakterieën in hun natuurlijk habitat, pathogeen of niet. De biofilm verstrekt een bolwerk tegen milieu-stressors en kan organismen omvatten van verscheidene groepen zoals in het geval van gemengde bakterie-schimmel biofilms.

Dertig jaar geleden waren Costerton et al.² de eersten om de eigenschappen van biofilms te bestuderen, door de extracellulaire polymeer-substanties (EPS) die deze bakteriële gemeenschap samen houdt te onderzoeken. Hij en andere researchers hebben sindsdien biofilms betrokken bij diverse a-biotische en biotische systemen, inclusief olie-pijplijnen, warme baden, tanden en mucosa. Daarom zijn biofilms, met hun gemeenschapsverdediging, een alomtegenwoordig kenmerk van bakterieën in de natuur en bij sommige bakteriële infekties. De in een biofilm gevestigde bakteriële gemeenschap heeft verdedigingsmiddelen en veelvuldige overlevingsmechanismen aangebracht, zoals verweer tegen fagocytose, UV-straling, virale aanvallen, mechanische stress en dehydratie; alsook tegen biocides, antibiotica en gastheer-immuniteit. Biofilms hebben het vermogen te weerstaan aan 100 tot 1000 voudige concentraties aan antibiotica en biocides die planktonische cellen kunnen inhibiren.³ Op gelijkaardige wijze zijn granulocyten, macrofagen en andere fagocyten niet in staat een biofilm in te palmen zoals ze zouden doen bij individuele planktonische cellen. De genotypische en fenotypische diversiteit van de biofilm laat adaptatie toe om meervoudige stress-factoren te overwinnen en de meeste sequentiële therapieën te overleven.

Het hoofdkenmerk van biofilms is genetische en fenotypische diversiteit, die de stevigheid van de bakteriële gemeenschap versterkt.⁴ Een steeds groter wordende hoeveelheid bewijsmateriaal suggereert dat in het laboratorium gecultiveerde bakterieën maar weinig karakteristieken gemeen hebben met infektueuze biofilms. Wanneer bakterieën op natuurlijke wijze overgaan van individuele planktonische cellen naar een gemeenschap van biofilm-weefsel, verandert de transcriptionele expressie van de bakterieën radikaal. De bakterieën scheiden beschermende polymeren uit en incorporeren omgevingsmolekulen die de bakteriële gemeenschap op een oppervlak en aan elkaar binden bij deze fenotypische transitie. De bakteriële gemeenschap van de biofilm gebruikt gesecreteerde feromonen (bv. quorum-aftastende molekulen) en andere molekulen voor cel-cel signaliserng, zelfs tussen soorten. Deze gecoördineerde aktiviteiten veranderen de biofilm in een formidabele opponent voor de gastheer.

Biofilms als een Nieuwe Focus

Er zijn 3 significante beperkingen om te blijven werken binnen het the planktonisch paradigma.

Ten eerste: omdat planktonische cellen minder verdedigingsmiddelen hebben dan biofilm-gemeenschappen, zou een behandeling zoals een antibioticum wel excellente in vitro test-resultaten kunnen opleveren, wanneer het uitgetest wordt op planktonische cellen alleen, maar povere in vivo resultaten, waar het biofilm-fenotype overheerst. Dezelfde bakterie-stam kan honderden of duizenden keren meer resistent zijn voor antibiotica wanneer deze deel uitmaakt van een biofilm-gemeenschap.^3,5 Deze planktonische bias brengt ongetwijfeld ten minste iets van de discrepantie in rekening die kan optreden tussen in vitro test-resultaten en in vivo respons op een antibiotia-therapie.⁶

Ten tweede: de huidige cultuur-methodes identificeren de meerderheid van de bakterieën die heden ten dage bekend staan bij gastheer-infekties niet.⁷ Researchers hebben molekulaire, genomische, meta-genomische, transcriptomische en proteomiscshe methodes ontwikkeld omdat zij vaststelden dat slechts bij benadering 1% van de cellen die ze observeerden in ecosystemen daadwerkelijk kolonies produceerden bij conventionele cultuur-methodes.⁸ De conclusie van deze op DNA en RNA gebaseerde studies is: cultuur-methodes detekteren enkel een kleine minderheid van de organismen die werkelijk aanwezig zijn in natuurlijke en pathogenische bakteriële gemeenschappen. Daarom pakken behandelingen gebaseerd op conventionele culturen mogelijks enkel 1 of 2 bakteriële species aan in een complexe biofilm-gemeenschap die wellicht dozijnen andere bakterie-soorten, of zelfs schimmels, omvat.

Ten derde: planktonische technieken zoals culturen geven mogelijks aanleiding tot een onnauwkeurige of onvolledige diagnose want culturen detekteren geen biofilm-cellen (die wel levensvatbaar maar niet cultiveerbaar zijn). Van ziekten die enkel nu en dan positieve culturen opleveren (bv. otitis media, prostatitis) wordt gesuggereerd dat het ‘steriele inflammaties’ of virale infekties zijn.⁹ […]

Nieuwe Perspektieven, Opties voor Detektie en Behandeling

Het veranderen van de perspektieven aangaande chronische infektie-ziekten door biofilms te laten meetellen, laat 2 belangrijke inzichten toe. Ten eerste opent het nieuwe methodes voor detektie en behandeling. Ten tweede verstrekt het een globale reconceptualisering van vele chronische infektie-ziekten resulterend uit biofilms, door toe te laten dat biofilm-principes tussen disciplines worden gedeeld.

Recente studies hebben nieuwe methodes onderzocht voor de detektie van de componenten van een biofilm. Verscheidene onderzoeken maakten gebruik van moderne molekulaire methodes, zoals denaturerende gradient gel-elektroforese en denaturerende hoge-performantie vloeistof-chromatografie, tesamen met beeldvormingstechnieken met inbegrip van fluorescente in situ hybridisatie. Ook molekulaire methodes zoals polymerase ketting reaktie (PCR) en ‘pyro’-sequenering’, samen met conventionele cultuur-methodes, werden gebruikt om de bakteriële samenstelling van chronische infekties te bepalen.⁷

Het uitvoeren van molekulaire testen als onderdeel van een routine bakteriële analyse wordt een echte optie voor klinische laboratoria. Deze testen zouden methodes kunnen omvatten zoals PCR, reverse transcriptase PCR, micro-arrays, antigen-testen en snelle sequenering. Slechts enkele van deze methodes worden gebruikt om bepaalde pathogenen op te sporen maar cultuur-vrije identifikatie van alle pathogenen en hun corresponderende resistentie-merkers zou wel eens snel routine kunnen worden.¹¹

Een focus op biofilms levert ook nieuwe strategieën op voor behandeling van chronissche infekties. Op biofilms gebaseerde behandelingen kunnen mogelijks initiële bakteriële vasthechting op een oppervlak verhinderen, EPS-formatie blokkeren of vernietigen, tussenkomen bij cel-cel signaliseringsmechanismen en terzelfdertijd bakteriostatische of baktericide agentia gebruiken. Bijkomende therapieën die niet enkel pogen bakterieën uit te roeien maar ook de gemeenschapsstruktuur en communicatie van de biofilms beïnvloeden, zouden wel eens veel effektiever kunnen zijn dan een enkelvoudige sequentiële strategie zoals een antibiotica-therapie.⁴ Deze benaderingsvorm van behandeling wordt gewoonlijk gebruikt in andere gebieden van de geneeskunde; zoals de behandeling HIV, waarvoor een combinatie anti-retrovirale therapie wordt aangewend om de beste klinische uitkomst te bereiken.

Chronische Bakteriële Ziekte als Biofilm Ziekte

Een ander groot voordeel dat het biofilm-model toelaat, is de her-conceptualisering van verscheidene chronische ziekten als biofilm-ziekten. Biofilm-ziekte werd gezien als meerdere ziekten betreffende een variëteit aan weefsels en strukturen, inclusief oren, neus, keel, mond, ogen, longen, hart, nieren, galblaas, pancreas, zenuwstelsel, huid, beenderen, zowel als bijna elk geïmplanteerd medisch apparaat. Het ‘Centres for Disease Control and Prevention’ schat dat meer fan 65% van de infekties wordt veroorzaakt door bakterieën die groeien in biofilms¹² en Lewis¹³ suggereert dat de proportie 80% is – veruit de meerderheid aan infekties wordt geschat door biofilms veroorzaakt te zijn. Dus, wanneer biofilm-infekties worden gecombineerd in een enkelvoudige ziekte-categorie, is de prevalentie van de ziekte significant en de mortaliteit geassocieerd met biofilm-ziekte substantieel. Verder zijn de ziekte-processen en management-strategieën van biofilms verwant. Bijvoorbeeld: de biofilm-ziekten cystische fibrose, longontsteking en een geïnfekteerde knie-prosthese zijn verschillend maar strategieën gebruikt om de biofilm aan te pakken in de longen zal gelijkaardig zijn met de strategie gebruikt voor de biofilm in een geïnfekteerd knie-implantaat.

Typische en Vertrouwde Biofilms

De typische biofilm-ziekte manifesteert zich met gemeenschappelijke kenmerken. De initiële infektie is subtiel en gewoonlijk niet onmiddellijk levensbedreigend, en doorgaans worden antibiotica voorgeschreven. Daaropvolgende verergeringen komen voor, en deze worden over het algemeen weer met antibiotica en aanvullende therapieën zoals corticosteroïden behandeld. Niettemin wordt de infektie erger wanneer de behandeling wordt gestopt. Wanneer de klinische status van de patient slechter wordt of de ziekte vordert tot op het punt dat de werking van het betreffende weefsel of apparaat in die mate is aangetast, wordt dikwijls de beslissing genomen het geïnfekteerde weefsel of de component chirurgisch te verwijderen. Het doel van de arts bij het aanpakken van de ziekte is om de symptomen en signalen te beheersen, en terugval te onderdrukken, met dien verstande dat de uitroeiing van de ziekte onwaarschijnlijk is zonder chirurgische tussenkomst.

Misschien wel de meest algemeen voorkomende biofilm-ziekte is tand-plak, een toestand die efficiënt kan worden gemanaged door tandartsen. Periodontale ziekte en tandbederf werden de voorbije eeuw sterk teruggedrongen dank zij de meerdere gezamelijke strategieën die tandartsen zich hebben eigen gemaakt. De onderdrukking van biofilms in de mondholte begint met het frequent verwijderen van de biofilm door dagelijks poetsen en flossien, gekoppeld aan periodieke tandartsbezoeken voor het verwijderen van tandplak. Als de hoeveelheid bakterieën in de biofilm te groot is en de ziekte vordert, wordt de frequentie van biofilm-management opgevoerd in een poging om de ziekte te overwinnen. De tandheelkunde heeft biofilm-ziekte op een succesvolle manier geconfronteerd en gelijkaardige benaderingen kunnen worden gebruikt als een model om chronische infekties in de geneeskunde aan te pakken.

Conclusies

Het behandelen van chronische infektie-ziekten kan niet worden beperkt tot infektie-specialisten, net zoals het management van diabetes kan beperkt blijven tot endocrinologen. Door het verschuiven van het planktonisch model van de microbiologie naar het biofilm-model, komen nieuwe methodes voor de detektie en behandeling beschikbaar. Door molekulaire methodes heeft de wetenschap nu de mogelijkheid om biofilms te detekteren en de implikaties te begrijpen van de ‘interspecies chaos’ die bijdraagt tot infekties. Met deze nieuwe wetenschappelijke benaderingen, samen met de coördinatie van klinische en laboratorium-inspanningen, onderwijs en research, is het mogelijk zich in te beelden dat veel van de biofilm-ziekten zullen kunnen worden overwonnen.