XMRV bij M.E.(cvs)

Door de jaren heen zijn er steeds meldingen/claims geweest over micro-organismen (al dan niet oorzakelijk) verbonden met M.E.(cvs): het Epstein-Barr virus e.a. herpes-virussen (bv. HHV-6), Mycoplasma sp., Chlamydia pneumoniae, enterovirussen, Borrelia burgdorferi (Lyme), Borna-virus, Coxiella burnetti, Parovirus-B19, HERV-K18, Parainfluenza Virus-5, retrovirussen, enz. Tot nu toe bleken geen van de resultaten onafhankelijk reproduceerbaar, kon geen oorzakelijk verband worden bewezen of bleek het om opportunistische infekties te gaan.

Het is tot op heden onze overtuiging dat, ook al zullen vele van deze microben en virussen bij (grote of minder grote) M.E.(cvs)-subgroepen opduiken, geen zal blijken dé oorzaak te zijn. Het feit dat telkens weer andere organismen worden gevonden, bewijst o.i. dat zij een gevolg, eerder dan de oorzaak, van de ziekte zijn. De nadruk van de research aangaande M.E.(cvs) zou moeten liggen op de mechanismen die deze organismen ‘toelaten’ – genetische defekten in bv. transcriptie-factoren zoals NF-κB [zie: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]…

Onderstaande melding over XMRV is interessant maar zoals de auteurs zelf (en menig ander onderzoeker) aangeven is de melding zeker (nog) geen bewijs voor een oorzakelijk verband.

Het verontrust ons dat M.E.(cvs)-patiënten steeds weer wanhopig willen geloven in iets dat nog niet is bewezen. Ze gaan zelfs zo ver mensen die zich afzetten tegen on-wetenschappelijke beweringen, te stigmatiseren en te catalogeren bij de biopsychosociale kliek. Wetenschap is geen geloof of religie!

We geven hier de samenvatting van het artikel in ‘Science’ (met daarnaast duiding door niet aan het onderzoek gerelateerde onderzoekers) en een omschrijving door de britse NHS (overheidsdienst voor gezondheidszorg).

*************************

www.sciencemag.org (Published Online October, 2009)

Detection of an Infectious Retrovirus, XMRV, in Blood Cells of Patients with Chronic Fatigue Syndrome

Vincent C. Lombardi ¹, Francis W. Ruscetti ², Jaydip Das Gupta ³, Max A. Pfost ¹, Kathryn S. Hagen ¹, Daniel L. Peterson ¹, Sandra K. Ruscetti ⁴, Rachel K. Bagni ⁵, Cari Petrow-Sadowski ⁶, Bert Gold ², Michael Dean ², Robert H. Silverman ³, Judy A. Mikovits ¹

¹ Whittemore Peterson Institute, Reno, NV 89557, USA.

² Laboratory of Experimental Immunology, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

³ Department of Cancer Biology, The Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH 44106, USA.

⁴ Laboratory of Cancer Prevention, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

⁵ Advanced Technology Program, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

⁶ Basic Research Program, Scientific Applications International Corporation, National Cancer Institute-Frederick, Frederick, MD 21701, USA.

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een uitputtende ziekte met onbekende etiologie waarvan wordt geschat dat wereldwijd 17 miljoen mensen zijn aangetast. Bij het bestuderen van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CVS-patiënten, identificeerden we DNA van een humaan gamma-retrovirus, xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV), bij 68 van 101 patiënten (67%) vergeleken met 8 van 218 (3,7%) gezonde controles. Cel-cultuur experimenten reveleerden dat XMRV van patiënten infektueus is, en dat cel-geassocieerde én cel-vrije transmissie van het virus mogelijk zijn. Secundaire virale infekties werden verkregen in niet-geïnfekteerde primaire lymfocyten en indicator cel-lijnen na blootstelling aan geaktiveerde PBMCs, B-cellen, T-cellen of plasma van CVS-patiënten. Deze bevindingen wijzen op de mogelijkheid dat XMRV een contribuerende factor kan zijn bij de pathogenese van CVS.

[Xenotroop virus: een genetisch overgedragen retrovirus dat niet kan vermenigvuldigen in de gastheer-soort die het herbergt maar dat cellen van een verschillende soort kan infekteren en enkel daar kan vermenigvuldigen.]

Vincent Lombardi was de mede-oprichter van REDLabs USA, een lab dat testen aanbiedt (hun belangrijkste test werd door hen zelf ooit uitgeroepen tot ‘merker’ voor CVS maar werd nooit onafhankelijk gevalideerd; de internationale research-gemeenschap schuift die dan ook ter zijde); en ‘directeur operaties’ toen ze hun naam veranderden naar VIP Dx (Viral Immune Pathology Diagnostics). VIP Dx is gelokaliseerd in de buurt van het ‘Whittemore Peterson Institute’ in Reno, Nevada.

Judy Mikovits is tevens vice-president van het medicijn-ontwikkelend bedrijf Genyous Biomed in Henderson, Nevada.

Oprichter/voorzitter van de ‘Wingfield Nevada Group’, de firma achter het ‘Whittemore-Peterson Institute for Neuro-immune diseases’ is Harvey Whittemore: niet onbesproken multimiljonair, advocaat, federaal lobbyist, land-ontwikkelaar en één van het dozijn van de machtigste mensen in Nevada die zaken doet met enkele van Nevada’s grootste bedrijven.

*************************

www.nhs.uk/news (October 2009)

Deze studie vergeleek bloed-stalen van 101 CVS-patiënten met stalen van 218 mensen zonder de ziekte. Er werd bewijs gevonden voor het XMRV-virus in ongeveer twee-derden van de mensen met CVS en minder dan 4% mensen zonder de ziekte.

Deze bevindingen alleen bewijzen niet dat het virus CVS veroorzaakt, omdat ze niet aantonen of de infektie gebeurde vóór of na de CVS zich ontwikkelde. Het research-artikel is behoedzaam qua conclusies en stelt dat XMRV een bijdragend factor “kan” zijn tot CVS maar het tegengestelde kan ook waar zijn: CVS kan mensen meer vatbaar maken voor infektie met dit virus.

Ondanks deze beperkingen, zullen deze bevindingen van belang zijn voor de research-gemeenschap, artsen en patiënten. Grotere studies en onderzoek dat vaststelt of de XMRV-infektie vóór of na de aanvang van CVS optreedt zullen nodig zijn vooraleer enige besluiten kunnen worden getrokken.

Waar komt het verhaal vandaan?

Het onderzoek werd uitgevoerd door Dr Vincent C Lombardi en collegas van het ‘Whittemore Peterson Institute’ en andere research-instituten in de V.S. Het werd gefinancierd door het ‘Whittemore Peterson Institute’, de ‘Whittemore Family Foundation’, het ‘National Cancer Institute’, de ‘National Institutes of Health’, het ‘US Department of Defense’, de ‘Foundation for Cancer Research’, de ‘Charlotte Geyer Foundation’, en Mal en Lea Bank.

De studie werd gepubliceerd in het ‘peer-reviewed’ wetenschappelijk tijdschrift ‘Science’.

Welke soort wetenschappelijke studie is dit?

Deze research keek naar de aanwezigheid van een retrovirus in de witte bloedcellen van mensen met Chronische Vermoeidheid Syndroom. Het betrof een gevallen-controle studie en bijkomende laboratorium-experimenten.

CVS tast een reeks organen in het lichaam aan en patiënten vertonen een abnormale werking van het immuunsysteem. De oorzaak is niet gekend maar één theorie is dat bepaalde virussen de ziekte triggeren.

Deze studie onderzocht of een retrovirus genaamd xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV) betrokken zou kunnen zijn. Eerdere research toonde dit virus aan in enkele stalen van prostaat-kanker weefsel. Andere studies bij muizen hadden gevonden dat de immuun-respons op sommige retrovirussen geassocieerd is met neurologische problemen.

Het onderzoek omvatte het nemen van bloedstalen van 101 mensen met CVS (de gevallen) en van 218 gezonde mensen zonder CVS (controles). Het DNA van witte bloedcellen in deze stalen werd onderzocht om te kijken of ze XMRV-DNA bevatten. De mensen met CVS kregen de diagnose op basis van de standaard criteria (1994 CDC Fukuda criteria en 2003 Canadian Consensus criteria) en ze hadden allemaal ernstige invaliditeit, langdurige uitputtende vermoeidheid, cognitieve stoornissen en immuunsysteem abnormaliteiten. Ze kwamen uit gebieden in de V.S. waar CVS-epidemieën werden gerapporteerd.

De volledige genetische sequentie van het XMRV van twee patiënten die het viraal DNA hadden, werd dan onderzocht om te bepalen welke virus-stam het betrof. Deze stam werd vergeleken met de stam die eerder was geïdentificeerd bij prostaat-kanker patiënten en met een muizen leukemie virus (MLV) dat dikwijls in laboratoria wordt gevonden, om de mogelijkheid uit te sluiten dat MLV de experimenten contamineerde. Testen die zochten naar proteïnen van het XMRV-virus in de bloedcellen werden ook uitgevoerd.

Er werden ook laboratorium-testen gedaan om te kijken of de stalen infektueus XMRV bevatten. Bij die testen werden witte bloedcellen die XMRV bevatten van CVS-patiënten gegroeid en gemengd met prostaat-kanker cellen, die vatbaar zijn voor infektie met XMRV.

De prostaat-kanker cellen werden ook blootgesteld aan vloeistoffen van de CVS-patient of aan controle bloedstalen die waren behandeld door de bloedcellen te verwijderen en mogelijks aanwezige virussen te concentreren. Gelijkaardige experimenten, waarbij pogingen werden ondernomen om T-cellen (een type witte bloedcel) te infekteren, werden ook uitgevoerd.

De researchers onderzochten dan of CVS-patiënten die XMRV-DNA dragen of gezonde controles antilichamen hadden tegen een gelijkaardig virus, wat zou suggereren dat ze een immuun-respons hadden ontwikkeld tegen XMRV.

Wat waren de resultaten van de studie?

De onderzoekers vonden dat bloed van 67% van de mensen met CVS XMRV-DNA bevatte, vergeleken met 3,7% van de controles.

De virale DNA-sequenties waren zeer gelijkend met deze geïdentificeerd in een eerdere studie betreffende prostaat-kanker. De sequenties van deze virussen waren niet genoeg gelijkend met het MLV-virus om te suggereren dat deze resultaten werden veroorzaakt door laboratorium-contaminatie.

Het onderzoeken van de witte bloedcellen van dertig CVS-patiënten toonde dat 63% (19 mensen) van de geteste stalen virale proteïnen vertoonden. Testen op stalen van vijf gezonde controles toonde geen virale proteïnen aan.

Globaal gezien bleken stalen van mensen met CVS 54 keer meer waarschijnlijk virale sequenties te bevatten dan stalen van gezonde controles.

De researchers vonden dat XMRV die in de witte bloedcellen van CVS-patiënten werden aangetroffen kon worden overgedragen op prostaat-kanker cellen wanneer ze samen werden gegroeid in het laboratorium. Bij 10 van de 12 mensen met CVS (83%) kon vloeistof afkomstig van hun bloedstalen ook de prostaat-kanker cellen infekteren in het lab. Gelijkaardige resultaten werden bekomen wanneer niet-geïnfekteerde witte bloedcellen werden blootgesteld aan deze vloeistof. Vloeistof van de bloedstalen van twaalf gezonde controles infekteerde de prostaat-kanker cellen niet.

De onderzoekers vonden dat de helft (9 van de 18) van de CVS-patiënten met XMRV-DNA antilichamen hadden tegen een gelijkaardig virus, terwijl geen enkele van de 7 gezonde controles die werden getest een antilichaam-respons vertoonden. Dit suggereert dat de helft van de CVS-patiënten een immuun-respons tegen XMRV vertoonde.

Welke interpretaties maakten de researchers op basis van deze resultaten?

De researchers concluderen dat hun bevindingen suggereren dat XMRV mogelijks een contribuerende factor is bij de ontwikkeling van CVS. Ze suggereren dat infektie met het XMRV-virus verantwoordelijk zou kunnen zijn voor enkele van de abnormale immuun-respons en neurologische problemen die worden gezien bij CVS.

Wat maakt de ‘NHS Knowledge Service’ van deze studie?

Dit onderzoek heeft een associatie tussen de aanwezigheid van XMRV viraal DNA en Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) geïdentificeerd.

Het is echter nog niet mogelijk om met zekerheid te zeggen of het virus daadwerkelijk CVS veroorzaakt, een feit dat ook wordt erkend door de auteurs. Dit is omdat de aanwezigheid van virus werd vastgesteld bij mensen die reeds CVS hadden, en dus is het niet duidelijk of de infektie gebeurde vóór ze de ziekte ontwikkelden.

Een alternatieve mogelijkheid is dat mensen die reeds CVS hebben, gewijzigde immuunsystemen hebben die hen meer vatbaar voor deze virussen maakt.

De studie heeft enkele beperkingen, enkele daarvan worden ook gemeld in een begeleidend editoriaal:

* Er werden een relatief klein aantal mensen getest, vooral bij sommige experimenten.

* De CVS-stalen komen alle van patiënten die ernstig geïnvalideerd waren, met langdurige uitputtende vermoeidheid, cognitieve defekten en immuunsysteem abnormaliteiten, en die kwamen uit gebieden waar er CVS-‘epidemieën’ of waren. Het is mogelijk dat deze patiënten niet representatief waren voor het volledige spectrum aan patiënten met CVS, waar de ernst nogal kan variëren. De selektie van gevallen die samen werden geclusterd in ‘epidemieën’ kan betekenen dat deze gevallen een verschillende oorzaak of trigger hebben dan de geïsoleerde gevallen.

* De karakteristieken van de bloed-stalen van gezonde mensen die werden gebruikt werden niet gerapporteerd en er zouden meer verschillen kunnen zijn met de CVS-gevallen dan enkel de ziekte zelf die bijdroeg tot de verschillende mate van XMRV-infektie.

* Hoewel de researchers probeerden contaminatie van hun stalen uit te sluiten, suggereert de molekulair bioloog die het XMRV-virus mee ontdekte in het begeleidend editoriaal [zie hieronder] dat ze niet genoeg ondernamen om contaminatie volledig uit te sluiten. Hij wijst er ook op dat bevestiging van de resultaten door een onafhankelijke groep die onwetend is over het feit of stalen van gevallen of controles komen van vitaal belang is.

* Hoewel de studie suggereert dat in het laboratorium het virus zich zou kunnen verspreiden van witte bloedcellen of bloed naar andere cellen, betekent dit niet dat het virus noodzakerlijkerwijs van persoon naar persoon zou kunnen worden overgedragen.

Niettegenstaande deze beperkingen, zijn de oorzaken van CVS nog niet gekend en blijven beschikbare behandelingen beperkt, dus zullen deze bevindingen van belang zijn voor de research-gemeenschap, artsen en patiënten. Verder onderzoek is nodig om deze bevindingen te bevestigen in meer stalen en vast te stellen of de XMRV-infektie gebeurt vóór of na de aanvang van CVS.

*************************

Als achtergrond-informatie betreffende het XMRV-virus, hier een begeleidend stuk (‘Perspective’) van de hand van 2 onderzoekers die niet deelnamen aan de studie, in het zelfde nummer van ‘Science’ als het bovenstaande rapport…

Een Nieuw Virus voor Oude Ziekten?

John M. Coffin [1] & Jonathan P. Stoye [2]

[1] Department of Molecular Microbiology, Tufts University, Boston, MA 02111, USA

[2] Division of Virology, Medical Research Council, National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, UK

Er is weinig consensus in de medische gemeenschap over het feit of het Chronische Vermoeidheid Syndroom een duidelijke ziekte is. Zoals de naam name impliceert, wordt de aandoening gekenmerkt door uitputtende vermoeidheid die vele jaren aanhoudt, en ze tast zowat 1% van de wereld-bevolking aan. Hoewel dikwijls chronische inflammatie wordt gevonden bij deze patiënten, weerden geen infektueuze of toxische agentia gevonden die duidelijk betrokken bleken bij deze ziekte, waarvan de diagnose grotendeels wordt gesteld door het uitsluiten van andere aandoeningen die gelijkaardige symptomen veroorzaken. In deze ‘Science Express’ beschrijven Lombardi et al. de detektie van xenotroop muizen leukemie virus-gerelateerd virus (XMRV) in ongeveer twee-derden van patiënten met de diagnose van Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Zowel laboratorium- en epidemiologische studies zijn nu nodig om te bepalen of dit virus een veroorzakende rol speelt, niet enkel voor deze ziekte, maar misschien ook bij andere.

Chronische Vermoeidheid Syndroom is niet de eerste ziekte bij mensen waaraan XMRV wordt gelinkt. Het virus werd in 2006 voor het eerst beschreven bij enkele prostaat-kanker patiënten en in 2009 gedetekteerd bij bijna een kwart van alle prostaat-kanker biopten. Het werd geïsoleerd uit prostaat-kanker én Chronische Vermoeidheid Syndroom patiënten, en is gelijkaardig aan een groep van endogene muizen leukemie virussen (MLVs) die worden gevonden in de genomen van inteelt en verwante wilde muizen. Hoewel een halve eeuw studies betreffende MLVs en andere gamma-retrovirussen hebben geleid tot belangrijke ontdekkingen waarop veel van ons huidig begrip van kanker rust, is er geen duidelijk bewijs gevonden dat infektie bij mensen aantoont met gamma-retrovirussen of die deze agentia associeert men een menselijke ziekte.

Endogene virussen, zoals xenotroop MLV, duiken op wanneer retrovirussen geslacht-cellen infekteren. Het geïntegreerde viraal DNA, of pro-virus, wordt overgedragen op nakomelingen als onderdeel van het gastheer-genoom. Endogene pro-virussen vormen een groot deel van het genetisch aanvulsel [het zgn. afval-DNA] van moderne zoogdieren, ongeveer 8% van het menselijk genoom. Xenotrope pro-virussen maakten voor het eerst hun intrede in de muizen geslacht-cellen ca. een miljoen jaar geleden, maar kunnen cellen van de muis die hen draagt niet infekteren omwille van een mutatie – waarvan wordt verondersteld dat deze ontstaan is na het binnenkomen van het virus in de geslacht-cellen – in de cellulaire receptor voor het virus. De tendens van xenotrope MLVs om snel-delende menselijke cellen te infekteren, heeft het tot een courante contaminant van gecultiveerde cellen gemaakt, in het bijzonder bij bepaalde humane tumor cel-lijnen.

Meer dan 90% van DNA-sequenties van XMRV en xenotroop MLV is identiek, en hun biologische eigenschappen zijn virtueel niet te onderscheiden, waardoor er weinig twijfel wordt gelaten dat het eerste is afgeleid van het laatste door één of meerdere transmissies tussen species. Er zijn meerdere bewijzen dat transmissie gebeurde in de buiten-wereld en dat het geen laboratorium-contaminant was. Eén ervan is dat XMRVs van verschillende lokaties, en van Chronische Vermoeidheid Syndroom en prostaat-kanker patiënten bijna identiek zijn: de virale genomen verschillen slechts in enkele nucleotiden [DNA-bouwstenen], terwijl er honderden sequentie-verschillen zijn tussen XMRVs en xenotroop muizen leukemie pro-virussen van laboratorium-muizen. Ander bewijs omvat de aanwezigheid van XMRV en grote hoeveelheden antilichamen tegen XMRV en andere MLVs bij Chronische Vermoeidheid Syndroom en prostaat-kanker patiënten.

Er is nog veel dat we niet begrijpen. Of het virus een veroorzakende rol speelt bij Chronische Vermoeidheid Syndroom of prostaat-kanker is niet geweten. XMRV-infektie zou bv., toevallig, meer frequent kunnen voorkomen in dezelfde geografische regio als een cluster van patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom. En individuen met één van beide ziekten zouden gewoonweg meer geïnfekteerd kunnen zijn omwille van immuun-aktivatie. XMRV zou preferentieel kunnen groeien in snel-delende prostaat-kanker cellen en de aanwezigheid van snel-delende cellen bij één van beide aandoeningen zou infektie gemakkelijker detekteerbaar kunnen maken. We weten niet hoe het virus wordt overgedragen en de suggestie, gebaseerd op indirect bewijs, dat er sexuele transmissie zou zijn, is voorbarig. Gezien het feit dat er infektueus virus aanwezig is in plasma en in bloed-cellen, is transmissie via bloed een mogelijkheid. Verder weten niet wat de prevalentie of distributie van virus is in menselijke of dierlijke populaties, en dier-modellen voor infektie en pathogenese zijn dringend gewenst.

Twee kenmerken van XMRV zijn bijzonder opmerkenswaardig. Eén is de bijna genetische gelijkheid van isolaten afkomstig van verschillende ziekten en van individuen uit verschillende delen van de Verenigde Staten. De twee meest ver verwijderde genomen waarvan tot op heden de sequentie werd bepaald verschillen in minder dan 30 van de ca. 8.000 nucleotiden. Alle XMRV-isolaten lijken dus meer op elkaar dan de genomen geïsoleerd uit eender welk individu geïnfekteerd met het HIV. In dit opzicht lijkt XMRV meer op humaan T-cel lymfotrope virussen (HTLVs) geïsoleerd in dezelfde geografische regio. Zoals het geval is bij HTLV, impliceert het gebrek aan diversiteit dat XMRV recent afstamt van een, gemeenschappelijke ‘voorvader’, en dat het aantal replicatie-cycli binnen één geïnfekteerd individu beperkt is.

Een andere meldenswaardige eigenschap van XMRV is dat de frequentie van infektie in niet-zieke controles opmerkelijk hoog is: ongeveer 4% in normale individuen van dezelfde geografische regio als geïnfekteerde patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom, én in niet-kwaadaardige prostaten. Als deze cijfers worden bevestigd in grotere studies, zou het betekenen dat wellicht 10 miljoen mensen in de Verenigde Staten en honderden of miljoenen wereldwijd geïnfekteerd zijn met een virus waarvan het pathogeen potentieel bij mensen nog onbekend is. Het is echter duidelijk dat nauw verwante virussen een waaier aan belangrijke ziekten veroorzaken, inclusief kanker, in veel andere zoogdieren. Verder onderzoek zou XMRV kunnen aanduiden als een oorzaak van meer dan één goed-gekende ‘oude’ ziekte, met mogelijks belangrijke implicaties voor diagnose, preventie en behandeling.

*************************

Nog enkele losse commentaren…

“Dit zou wel eens de controverse kunnen beëindigen over de vraag of ere en onderliggende infektie is bij sommige gevallen van Chronische Vermoeidheid Syndroom maar het is onwaarschijnlijk dat dit alle gevallen verklaart. Retrovirussen kunnen latente virussen die reeds in de cellen aanwezig zijn wakker maken. Het is mogelijk dat chronische vermoeidheid symptomen niet worden veroorzaakt door XMRV maar door andere virussen die het aktiveert.” (internist Dedra Buchwald van de ‘University of Washington’ – www.sciencenews.org 8 okt 09).

>> De auteurs stellen vragen over deze ontdekking op het einde van het artrkel: “Is XMRV infektie een oorzakelijke factor in de pathogenese van CVS of een ‘passagier-virus’ in de CVS patiënten-populatie met onderdrukt immuunsysteem?” Deze en andere vragen stellen dat bijkomend onderzoek en de herhaling van de bevindingen van deze studie bij andere patiënten-groepen een prioriteit zou moeten zijn. << (www.cfids.org)

>> Precies hoe dit virus gerelateerd is met chronische vermoeidheid blijft echter een mysterie. Eén van de problemen bij het opsporen van CVS is dat dit wellicht niet één enkele ziekte is. “We denken dat het probleem is dat CVS een verzameling is van vele verschillende ziekten zelfs al hebben ze gelijkaardige symptomen.” Zij en anderen vermoeden dat het retrovirus andere onderliggende aandoeningen en virussen in het lichaam zou kunnen loslaten. <<

“Dit nieuw retrovirus zou, door infektie van menselijke cellen, transcriptie van een endogeen virus kunnen induceren. We hebben al aangetoond dat Epstein-Barr virus dit kan doen. “Hoewel deze achtergrond-ruis van verscheidene virussen moeilijk te onderscheiden zou kunnen zijn, reikt het sleutels aan die researchers helpen de hoofd-oorzaak van CVS te vinden. “Het is mogelijk dat, downstream, dit allemal zal uitmonden in het zelfde mechanisme.” (Brigitte Huber, professor pathologie aan de ‘Tufts University’s Sackler School of Graduate Biomedical Sciences’. – www.scientificamerican.com 8 okt 09)

>> Dr. William C. Reeves […] waarschuwt voor haastige conclusies gebaseerd op de bevindingen, hoewel hij ze belovend noemde. “Het is bijna ongehoord om een verband van deze grootte-orde te vinden in om het even welke studie van een infektueus agens en een goed-gedefinieerde ziekte, laat staan een [slecht-gedefinieerde] ziekte zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom.” […]. Het is bijzonder moeilijk om een oorzakelijk verband te bewijzen met een alomtegenwoordig virus zoals XMRV en het “is zelfs nog moeilijker in het geval van CVS, een klinisch en epidemiologisch complexe ziekte”. << (Dr. William C. Reeves, hoofd ‘Chronic Fatigue Syndrome research’ van de ‘Centres for Disease Control and Prevention’ – www.latimes.com 9 okt 09)

>> XMRV is een puzzel op zijn eigen. John Coffin, een viroloog aan de ‘Tufts University’ in Boston, die MLV heeft bestudeerd, wijst er op dat de prevalentie van het virus bij gezonde controles “op één of andere manier, een even opmerkelijk resultaat is”. << (www.nature.com 9 okt 09)

“XMRV-infektie van [natural killer] cellen kan hun funktie aantasten.”, zegt Jonathan Kerr die niet betrokken was bij de studie. “Het past.”, voegt hij er aan toe, maar “een onafhankelijke studie die deze bevindingen kan bevestigen is heel erg gewenst”. (Jonathan Kerr, onderzoeker aan ‘St George’s, University of London’ – www.newscientist.com 8 okt 2009)

“Dit ziet ere en zeer interessante start uit Het is niet onmogelijk dat dit een ziekte kan veroorzaken met neurologische en immunologische gevolgen maar we weten het niet zeker.” (John Coffin, viroloog aan de ‘Tufts University’ in Boston – www.newscientist.com 8 October 2009)

>> [Mikovits’] colleagae vinden de melding van een virale link voorbarig: Joseph DeRisi, een molekular bioloog aan de ‘University of California’, San Francisco, die XMRV mee ontdekte, was niet tevreden over details in het artikel: Hij wilde meer weten over de ‘virale lading’ in CVS-patiënten en hoe de demografie van de controle-groep overeenkwam met die van CVS-patiënten. En het team van Mikovits deed niet voldoende om contaminatie uit te sluiten, zegt hij. “Men moet heel zorgvuldig zijn bij het maken van claims over dergelijke gevoelige en emotioneel geladen zaak als CVS, waarover al veel werd beweerd in het verleden.” Een dubbel-blinde studie waarbij een ‘derde partij’ lab zoekt naar XMRV bij CVS-patiënten controles is vitaal, zegt hij. << (ScienceNOW.org 9 okt 09)

>> Tony Britton van de ‘ME Association’ [V.K.] zei: “Dit is fascinerend – maar het bewijst niet onweerlegbaar dat een link bestaat tussen het XMRV virus en CVS of M.E.”.

Dr Richard Grunewald, een consulterend neuroloog van de ‘Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust’ zei dat hij voorbehoud maakte wat betreft de research. Hij zie: “Het idee dat alle gevallen van CVS worden veroorzaakt door één enkel virus klinkt niet plausibel voor de meeste mensen die op het terrein werken. […]”

Sir Peter Spencer, hoofd bestuurslid van ‘Action for ME’ [V.K.] zei: “Het is nog te vroeg dus proberen we niet al te opgewonden te worden maar dit nieuws zal zeker de hoop doen rijzen in de patiënten-groep die al veel te lang werd verwaarloosd.” <<

(news.bbc.co.uk)

“We weten zelfs niet of infektie met het XMRV-virus de ziekte of één van de meerdere geassocieerde gereaktivateerde virussen (zoals HHV-6, EBV en enterovirus) veroorzaakt. […] Het is belangrijk deze bevindingen over XMRV-virus te bekijken als niet meer dan een opwindende nieuwe ontwikkeling. We hebben nood aan bevestigende studies, daarna studies om te kijken of het virus bijdraagt tot de oorzaak van de ziekte en symptomen.” (Dr. Nancy G. Klimas, directeur van de afdeling immunologie van de ‘University of Miami School of Medicine’ en research-directeur voor klinische AIDS/HIV-research van het ‘Miami Veterans Affairs Medical Centre’ – consults.blogs.nytimes.com 15 okt 09)

[…]

Cytokine polymorfismen & respons op infektie

Ongeveer 10 jaar geleden begonnen de Australische onderzoekers Dr Andrew Lloyd, Dr Ian Hickie en Dr Ute Vollmer-Conna post-infektueuze vermoeidheid te bestuderen als een model om de mechanismen bij of CVS te begrijpen. In 2006, publiceerden ze een artikel getiteld ‘Post-infective and chronic fatigue syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens: prospective cohort study’ waarin beschreven werd dat CVS in ca. 12% van de gevallen volgt op een infektie en grotendeels wordt voorspeld door de ernst van de acute ziekte. Het feit dat iemand chronisch ziek blijft, houdt dus geen verband houdt met virale aktiviteit of cytokine-produktie ná de acute fase. [Cytokinen zijn, eenvoudig uitgedrukt, hormonale eiwit-boodschappers van het immuunsysteem die helpen verdedigen tegen infektie.] Sommige patiënten betwisten het feit dat CVS (M.E. is overigens niet helemaal hetzelfde) geen relatie met het soort infektie blijkt te hebben. Dit wil echter niet zeggen dat er geen organische oorzaak is! Ellen Goudsmit schrijft: “Verschillen tussen patiënten die herstellen van virale infekties en zij die dat niet doen, blijken reeds in een vroege fase; en de ernst van de acute ziekte voorspelt de slechte uitkomst, psychiatrische factoren NIET.” Lees ook de commentaren op de BMJ site…

Nogmaals: de analyse van de invloed van psychosociale en omgeving-factoren op de ziekte (inclusief demografische kenmerken, socio-economische status, persoonlijkheid, hoe iemand met problemen omgaat, stemming en psychiatrische voorgeschiedenis) toonde dat deze geen significante effekten hadden. Psychiaters die de biopsychosociale school aanhangen worden hier dus tegengesproken: psychologische factoren zijn niet de belangrijkste reden voor het aanhouden van vermoeidheid na infektie.

Sindsdien heeft dit team (‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’) proberen bepalen wáárom sommigen een ernstiger ziekte na acute infektie doormaken dan anderen.

De researchers onderzochten genetische variaties in genen van pro- en anti-inflammatoire cytokinen. Individuen met het gen-polymorfisme [natuurlijk voorkomende genetische variatie] IFN-γ +874 TT (hoge produktie van het pro-inflammatoire cytokine interferon-γ) of IL-10 592 CA of AA (lage produktie van anti-inflammatoir interleukine-10) reageren heviger op een infektie en hebben een veel groter risico om chronisch ziek te blijven. Dit is nog meer het geval als beide polymorfismen gecombineerd zijn. Dit profiel werd het ‘hoog risico genotype genoemd’.

Merk ook op dat bij er bij drie specifieke infekties (Mononucleose, Ross River of Q-koorts) geen invloed is op de intensiteit van de acute fase en het verder verloop. De aard (viraal, bakterieel of parasitair) van of het type pathogen speelt GEEN rol! Een waaier aan pathogenen kan CVS triggeren en het onevenwicht in de immuun-respons doet CVS voortduren.

Of microglia ook bij M.E.(cvs) een rol spelen en perifere cytokine-signalen effektief cerebraal kunnen worden doorgegeven dient nog te worden aangetoond. In elk geval is er aanzienlijk en groeiend bewijs voor een rol bij tal van neurologische ziekten. Perifere immun-stimulatie kán microglia in het CZS aktiveren. In het artikel ‘Chronic Microglial Activation and Excitotoxicity Secondary to Excessive Immune Stimulation: Possible Factors in Gulf War Syndrome and Autism’ worden bv. mechanismen opgesomd die deze 2 aandoeningen linken met immuun-stimulatie secundair aan over-vaccinatie…

In een interview (www.theage.com.au December, 2008) zei Dr Vollmer-Conna dat de individuen met de kwetsbaarheid een “buitensporige immuun-respons” hebben. “Sommige mensen zullen ernstiger symptomen hebben bij een acute ziekte dan anderen met dezelfde infektie omdat hun lichaam meer intens reageert, wat te wijten is aan hun genetische opmaak.” “De bevindingen zouden er uiteindelijk kunnen leiden tot een betere identificatie van kwetsbare mensen om hen van geïndividualiseerde preventie en behandeling voor gewone infekties te voorzien.” “In sommige gevallen zou het zelfs mogelijk hun leven kunnen redden.”

Clin Infect Dis. 2008 Dec 1;47(11):1418-25

Cytokine polymorfismen hebben een synergistisch effekt op de ernst van de acute ziekte-respons op infektie

Vollmer-Conna U, Piraino BF, Cameron B, Davenport T, Hickie I, Wakefield D, Lloyd AR; Dubbo Infection Outcomes Study Group

Collaborators (8): Dunckley H, Geczy A, Harris R, Khanna R, Marmion B, Rawlinson B, Reeves WC, Vernon S

School of Psychiatry and Centre for Infection and Inflammation Research, School of Medical Sciences, University of New South Wales, Sydney, Australia

ACHTERGROND: Funktionele polymorfismen in immuun-respons genen worden meer en meer erkend als een belangrijke bijdrage aan de uitgesproken individuele verschillen in gevoeligheid voor en gevolgen van infektueuze ziekten. De acute ziekte-respons is een stereotypische set ziekte-manifestaties gemedieerd door de pro-inflammatoire cytokinen die worden geïnduceerd door veel verschillende pathogenen. De genetische determinanten voor de ernst van de acute ziekte-respons werden eerder nog niet onderzocht.

METHODEN: We bekeken de impact van funktionele polymorfismen in cytokine-genen die een kritieke rol spelen in de vroege immuun-respons (tumor necrosis factor-alfa, interleukine-6, interleukine-10 en interferon-gamma) op de ernst en de duur van de ziekte na acute infektie met Epstein-Barr virus, Coxiella burnetii (het organisme dat Q-koorts veroorzaakt) of Ross River virus.

RESULTATEN: We vonden dat de interferon-gamma +874T/A en de interleukine-10 -592C/A polymorfismen significant de ernst en de duur van de ziekte beïnvloeden, alsook de cytokine proteïne-concentraties. Deze cytokine-genotypes werken samen om hun invloed op de gevolgen van de ziekte te versterken.

BESLUITEN: Deze bevindingen suggereren dat genetisch bepaalde variaties in de intensiteit van de inflammatoire respons aan de basis liggen van de ernst van de acute ziekte-respons en voorspellen de herstel-tijd na uiteenlopende infekties.

Acute infekties komen universeel voor en zijn een hoofd-oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Desondanks is er weinig gekend over de redenen waarom sommige individuen sneller herstellen van een ziekte, terwijl anderen ernstige acute ziekte en soms een langgerekt klinisch verloop ervaren na acute infektie. In de meeste (dier-)soorten triggert de immuun-respons op acute infektie door een brede waaier aan pathogenen, een stereotypische set klinische manifestaties – koorts, vermoeidheid, hypersomnie, hyperalgesie, anorexie, vertroebelde stemming en cognitieve stoornissen – genaamd acute ziekte-respons. Deze respons gaat gepaard met verschijnselen voortkomend uit lokale weefsel-schade en vormt de symptomen van of acute infektie.

Het universele karakter van de of acute ziekte-respons, werd door ons team bevestigd bij een onderzoeksgroep die werden geobserveerd van bij het begin van een gedocumenteerde acute infektie te wijten aan Epstein-Barr virus (EBV; de veroorzaker van infektiueuze mononucleosie), Coxiella burnetii (veroorzaker van Q-koorts) of Ross River virus (RRV; epidemische polyarthritis), tot volledig herstel. In twee afzonderlijke stalen was een kern-set acute symptomen evident bij alle indivduen, onafhankelijk van het micro-organisme verantwoordelijk voor de infektie (EBV, een DNA-virus dat B-lymfocyten infekteert; RRV, een door muggen meegedragen RNA-virus dat synoviale [in gewrichtsvocht] macrofagen [type witte bloedcellen] infekteert en C. burnetii, a zoönotische [die kan worden overgedragen van dieren op mensen] bakterie die weefsel-macrofagen infekteert). De gerapporteerde ernst van deze symptomen en hun funktionele impact varieerden echter significant tussen individuen: van relatief mild tot een ernstige, invaliderende ziekte leidend tot hospitalisatie. De ziekte-graad correleerde sterk met de concentraties aan IL-1b en IL-6 in ongestimuleerde PBMC-culturen, wat in het verlengde ligt van bestaand bewijs uit dieren-studies en een sleutel-rol voor pro-inflammatoire cytokinen bevestigt als determinanten van de individuele verschillen in symptomatisch respons op infektie in mensen. In tegenstelling hiermee toonde analyse van de invloed van psychosociale en omgeving-factoren op ziekte-uitkomst (inclusief demografische kenmerken, socio-economische status, persoonlijkheid, ‘coping’-stijl, stemming en psychiatrische voorgeschiedenis) geen significante effekten aan.

Tweelingen- en familie-studies wezen er op dat er significante genetische bijdragen zijn aan de verschillen in de gastheer-respons op immunogene stimuli. Schattingen van de erfelijkheid van door lipopolysaccharide (LPS) gestimuleerde produktie van pro-inflammatoire cytokinen door PBMCs bleken bijvoorbeeld 53%, 57% en 87% voor TNF-a, IL-6 en IL-1b, respectievelijk. Originele research van de ‘Danish Adoption Register’ identificeerde een relatief risico van 5,8 voor een geadopteerd kind om te sterven door infektie als de biologische ouder ook was gestorven aan infektie voor de leeftijd van 50 – het vergelijkbare relatieve risico voor sterfte door kanker of cardiovasculaire ziekte was 1,2 en 4,5 respectievelijk.

Funktionele ‘single nucleotide polymorphisms’ (SNPs) in de pro-inflammatoire cytokine genesn IL-6 (-174G/C) en TNF-a (-308G/A), alsook SNPs die de produktie van anti-inflammatoire cytokinen, zoals IL-10 (-1082G/A, -819C/T, en -592C/A beïnvloeden), worden geassocieerd met vatbaarheid voor én uitkomsten van infektie-ziekten, met inbegrip van EBV, mycobacteriële infekties (lepra en tuberculose), malaria, leishmaniasis en bakteriële sepsis. Polymorfismen in cytokine-genen die adaptieve immuun-responsen reguleren, werden ook geassocieerd met ziekte-respons. Bijvoorbeeld: een SNP in het eerste intron [een stukje DNA in een gen dat niet codeert, niet in het messenger-RNA of eiwit terecht komt maar wel een invloed kan hebben op de transcriptie] van het IFN-γ gen (+874T/A) – waarvan is aangetoond dat het gen-expressie moduleert – werd geassocieerd met uitkomsten na tuberculose, malaria, lepra en ernstig acuut respiratoir syndroom, alsook met der ernst van infektie met respiratoir syncytiaal virus.

Deze gegevens suggereren dat polymorfismen in cytokine-genen die pro- en anti-inflammatoire cytokine-produktie veranderen, een sterke invloed uitoefenen op de gastheer-respons op een diversiteit aan infekties, waarbij ze de ernst en het verloop moduleren van de acute ziekte-respons. In deze studie onderzochten we de impact van funktionele polymorfismen in de TNF-α, IL-6, IL-10 en IFN-γ genen op de ernst en de duur van ziekte bij patiënten met een gedocumenteerde infektie met EBV, RRV of C. burnetii.

PATIËNTEN EN METHODEN

Deelnemers. 300 caucasische individuen (gemiddelde leeftijd 34, tussen 16 en 77; 47% vrouwen) uit de ‘Dubbo Infection Outcomes Study’. Dit is een onderzoekgsgroep samnegesteld uit individuen met serologisch bevestigde acute EBV, RV orf Q-koorts die werden geobserveerd van kort na de aanvang van de symptomen tot het herstel. […]

Afleiding van het ‘ernstigheid’-fenotype. Een index die de ernst van de acute ziekte-respons kwantificeert werd empirisch afgeleid via een ‘principal components’ analyse van de data verkregen tijdens acute infektie door gebruikt te maken van de ‘Somatic and Psychological Health Report’ en een ‘Physical Symptoms Checklist’, die een brede waaier aan fysieke en psychologische symptomen omvatten. Deze index omvatte o.a. koorts, vermoeidheid, slaapstoornis, pijn, verlies van eetlust, verstoorde stemming en verslechterde concentratie. Statistische analyse toonde geen substantiële voorspellende relatie tussen het type infektie of demografische factoren (leeftijd en geslacht) en ernst van de ziekte. […]

DNA-verzameling en genotypering. […]

Cytokine-kwantificatie. […]

Statistische analyses. […]

RESULTATEN

Individuen. […]

Kenmerken van acute infektueuze ziekte voor individuen qua ernst-fenotype extremen. Er waren substantiële verschillen tussen individuen met hoge versus lage ernst-fenotypes qua symptomen van de acute ziekte-respons. Er waren consistente en statistisch significante verschillen qua koorts, slaap, vermoeidheid, pijn, verminderde eetlust, verstoorde stemming en verslechterde concentratie, zowel als wat betreft de graad van futloosheid tijdens de acute ziekte, wat wordt weerspiegeld door het aantal dagen in bed of in ziekteverlof doorgebracht. Een zeer gelijkaardig patroon was evident wanneer de ernst voor elk type infektie afzonderlijk werd vergeleken.

Cytokine-genotype en Ernst van de acute infektueuze ziekte. […] Er was een significant verband tussen het fenotype met hoge ziekte-ernst en het IFN-γ +874T allel [Een gen op een bepaalde plaats van een homoloog chromosoom kan een licht verschillende vorm hebben; bij een SNP is slechts één nucleotide anders. Nucleotiden worden aangegeven met de letters A, C, T of G.]. Een meer bescheiden relatie werd gevonden tussen het SNP op IL-10 -592C/A en het fenotype met lage ziekte-ernst. Individuen homozygoot voor het IL-10 -592C allel (IL-10 -592CC genotype) hadden een lager risico op ernstige symptomen tijdens de acute ziekte dan de individuen met de IL-10-genotypes -592CA of -592AA. Deze associaties waren geldig voor alle 3 sub-cohorten [verschillend type infektie]. […]

IL-10 -592C/A SNP versterkt het effekt van het IFN-γ genotype op ziekte-ernst. Individuen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel (IFN-γ +874TT genotype; hoge IFN-γ produktie) die ook een A allel op IL-10 -592 hadden (IL-10 -592 CA of AA genotype; lage IL-10 produktie) hadden een opmerkelijk verhoogd risico op het doormaken van een ernstige ziekte, vergeleken met individuen homozygoot voor én het IFN-γ +874A (IFN-γ +874AA genotype) én het IL-10 -592C allel (IL-10 -592CC genotype). Het risico op het doormaken van een ernstiger acute ziekte was voor individuen met ‘hoog risico’ IFN-γ +874TT en IL-10 -592 CA of AA genotype meer dan het dubbel dan dat geassocieerd met het IFN-γ +874TT genotype alleen.

Impact van genetische variatie op produktie van cytokine-proteïne. Om eerdere rapporten over genetisch bepaalde verschillen in IFN-γ en IL-10 produkie te bevestigen, werd de cytokine-produktie bestudeerd in een subgroep van de studie-onderzoeksgroep (n=35). Er werden significant hogere waarden voor IFN-γ produktie gevonden in gestimuleerde culturen van PBMCs bij personen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel (hoge ziekte-ernst), vergeleken met een IFN-γ +874 AA of AT genotype […]. Getimuleerde cel-culturen van personen homozygoot voor het IFN-γ +874T allel bevatten ook hogere waarden pro-inflammatoire cytokinen IL-1b en TNF-α, vergeleken met een IFN-γ +874 AA of AT genotype […]. Er waren geen significante verschillen in cytokine-produktie bij ongestimuleerde PBMC-culturen.

[…]

Ziekte-ernst voorspelt ziekte-duur. Analyses van de tiid-tot-herstel toonden een sterke relatie tussen het ziekte-ernst fenotype en de totale duur van de symptomatische ziekte. Individuen met een lage ziekte-ernst fenotype hadden symptomen gedurende 20 dagen (mediaan), terwijl die met het hoge ziekte-ernst fenotype 135 dagen symptomatisch bleven. De combinatie van IFN-γ en IL-10 genotypes hadden ook een impact op de duur van de ziekte. Personen met het ‘laag risico’ genotype (IFN-γ +874AA en IL-10 -592CC) waren 34 dagen symptomatisch maar personen met het ‘hoog risico’ genotype (IFN-γ +874TT en IL-10 -592 AA or CA) hadden ziekte-symptomen gedurende 80 dagen.

BESPREKING

Funktionele polymorfismen IFN-γ en IL-10 beïnvloeden de cytokine-produktie, alsook de ernst en duur van ziekte na infektie met EBV, RRV of C. burnetii op significante wijze. Deze bevindingen versterken het bewijs voor een sleutel-rol van een gebalanceerde cytokine-respons in het verwerken van acute infekties en van sterke genetische regulerende effekten op die respons. Bovendien hebben we gedocumenteerd dat met risico geassocieerde cytokine-genotypes samenwerken om hun impact op de ernst van ziekte te versterken. Omwille van de zeer gevarieerde karakteristieken van de bestudeerde pathogenen, mogen deze bevindingen vermoedelijk worden veralgemeend tot de gastheer-respons van vele infektueuze agentia. Het moet worden opgemerkt dat, bij acute infekties, complicaties resulterend uit lokale weefsel-beschadiging (verbonden met de directe effekten van het pathogen of met immunopathologie) ook aanleiding kunnen geven tot ziekte-verschijnselen. In sommige gevallen kunnen dergelijke verschijnselen het ziekte-complex domineren (bv. veranderingen in de kleine bloedvaten die leiden tot coma bij cerebrale malaria), alhoewel deze typisch worden vergezeld door de systemische kenmerken van de acute ziekte-respons (zoals koorts). Het zijn deze laatste die stereotyperend zijn bij verscheidene infekties en de focus van deze analyse. Verder worden, in vele gevallen, allebei de lokale en systemische verschijnselen gemedieerd door dezelfde pro- en anti-inflammatoire cytokinen.

Deze bevindingen zijn in overeenstemming met substantieel bewijs voor de centrale rol van IFN-γ én IL-10 in het bepalen van de karakeristieken van de aangeboren en adaptieve gastheer-responsen op een brede waaier aan pathogenen en, daardoor, de vatbaarheid voor vele intracellulaire bakteriële, parasitaire en virale infekties. In verband met de acute ziekte-respons, zijn de krachtige inhiberende effekten van IL-10 op IL-1b en TNF-α produktie bij geaktiveerde macrofagen het opmerken waard, omdat deze cytokinen dikwijls samenwerken bij de inductie van inflammatie. Daarnaast is aangetoond dat de toediening van IL-10 in vivo de produktie van pro-inflammatoire inhibeert.

Het T-allel van de IFN-γ +874T/A SNP vertoont niet enkel een sterke associatie met de ernst van de acute ziekte-respons maar het risico op het doormaken van een ernstige acute ziekte is ook wezenlijk verhoogd voor homozygote dragers van het T-allel, vergeleken met heterozygote dragers, wat een gen-dosage effekt [gen-dosage = aantal copieën van een bepaald gen-locus in het genoom, meestal één of twee; voorkomen van meerdere copieën van een gen kan leiden tot over-expressie] suggereert. Dit is consistent met de observatie dat de toediening van IFN-γ tot symptomen leidt die doen denken aan de acute ziekte-respons. Associaties tussen het hoge-aktiviteit IFN-γ +874TT genotype en ernst van de ziekte bij patiënten met tuberculose en infektie met respiratoir syncytiaal virus [RSV] werden elders reeds gemeld. Verder werd verhoogde produktie van IFN-γ en pro-inflammatoire cytokinen geassocieerd met ernstige infektueuze mononucleose en tuberculose. IFN-γ en TNF-α zijn ook betrokken bij bij het aansturen van het immunopathologisch proces dat leidt tot levensbedreigende cerebrale complicaties bij ernstige malaria, terwijl IL-10 dit proces leek tegen te werken.

De studie hier toonde een verband tussen het genotype voor lage IL-10 produktie en het SNP bij de nucleotide-positie -592 maar niet het SNP bij -1082. Eerdere studies die de impact onderzochten van de 3 prevalente SNPs (bij nucleotide-posities -1082, -819 en -592) in de IL-10 promotor op uitkomsten van infektueuze ziekten, leverden inconsistente resultaten op die mogelijks toe te schrijven waren aan verwarrende immunogenetische invloeden. […]

Hoewel de bijdrage van het IL-10 -592C/A SNP tot de ernst van de ziekte bescheiden was, hadden individuen met een A-allel op positie -592 en het IFN-γ -874TT genotype 8 keer meer kans op een ernstige ziekte-respons. Deze ontdekking van een beduidend hoger risico voor de ‘hoog risico’ genotype-combinaties wijzen op het belang, in het gebied van immunogenetica; van verder te kijken dan het bestuderen van individuele cytokinen bij onderzoek van de complexe micro-omgeving resulterend uit de interaktie van meerdere genen en gen-produkten.

Onderzoek van de produktie van cytokine-proteïnen bevestigde de funktionele significantie van de gerapporteerde genetische associaties. Bovenop de verwachte veranderingen in de concentraties van IFN-γ en IL-10, vertoonden cel-culturen van individuen met genotypes die een meer intense inflammatoire respons zouden begunstigen (hoge IFN-γ, lage IL-10 produktie) ook hogere waarden aan pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-1b, TNF-α en IL-6. Dit suggereert een feedback-mechanisme van IFN-γ (geproduceerd door T-lymfocyten) die de produktie van deze pro-inflammatoire cytokinen (waarschijnlijk vooral geproduceerd door monocyten) beïnvloedt.

Deze stelling is consistent met onze bevindingen van een ernstiger acute ziekte en vertraagd herstel geassocieerd met het IFN-γ +874T allel. Deze uitkomsten verschillen een beetje van deze in het lymfocytisch choriomeningitis virus model bij muizen, waar experimentele vermindering van IL-10 aktiviteit T-cel-responsen ondersteunde (inclusief IFN-γ produktie) en snelle verwijdering van het micro-organisme bleek te vergemakkelijken, wat leidde tot een kortere ziekte-duur. Voor de hier beschreven gegevens, was het genotype met de hoge IFN-γ en lage IL-10 produktie geassocieerd met een ernstiger acute fase en een langere ziekte-duur. Dit is in overeenstemming met bewijsmateriaal uit de ‘Dubbo Infection Outcomes Study’ onderzoeksgroep, waar werd gevonden dat langdurige ziekte niet was geassocieerd met aan de gang zijnde virale aktiviteit of cytokine-produktie in het perifeer bloed.

De acute ziekte-respons wordt in gang gezet door de produktie van pro-inflammatoire cytokinen maar wordt uiteindelijk gemedieerd door neurochemische veranderingen in de hersenen. De mechanismen waardoor perifere cytokine-signalen worden doorgegeven naar het brein worden niet volledig begrepen maar omvatten directe neurale wegen (via primaire afferente zenuwen van het autonoom zenuwstelsel) en binnenkomen van cytokinen in hersen-gebieden waar de bloed-hersen-barrière onvolkomen is. Dier-studies wijzen er op dat perifere cytokinen daar de synthese door microglia [immuuncellen - macrofagen - van het centrale zenuwstelsel] en astrocyten [stervormige, vertakte gliacel met uitlopers; steuncellen in de zenuwbaan die liggen tussen een bloedvat en een zenuwcel] van nieuwe cytokinen induceren. [Microglia en astrocyten zou op zijn minst gedeeltelijk aan de basis kunnen liggen van de pathogenese van een aantal klinisch belangrijke neurodegeneratieve aandoeningen van het centraal zenuwstelsel zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, e.a.] De mechanismen voor de vertaling van deze cytokine-signalen in veranderde neurale transmissie blijven onduidelijk. Van belang voor de geobserveerde associatie tussen ernst van de acute ziekte-respons en de duur van de ziekte is de groeiende bewustwording van een overwegende respons van microglia op een waaier van infekties en inflammatoire stimuli via Toll-like receptoren [‘Glial toll-like receptor signaling in central nervous system infection and auto-immunity’; Toll-Like Receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren; aktivatie van TLR’s - 10 types geïdentificeerd - leidt tot aktivatie van de transcriptie-factor NF-κB en vervolgens tot produktie van pro-inflammatoire cytokinen als IL-1 en TNF-α] en de erkenning dat een enkelvoudige blootstelling aan door LPS geïnduceerd TNF-α aktivatie van microglia kan triggeren die 10 maand bleef aanhouden in afwezigheid van systemische inflammatie. We vermoeden daarom dat bij individuen met een langdurige post-infektueuze ziekte, een prominente cytokine-respons in de acute fase sensitisatie verzoorzaakt in deze ZNS-mechanismen, wat leidt tot aanhoudende neurologische fenomenen die zich manifesteren met blijvende symptomen in afwezigheid van aanhoudende perifere cytokine-produktie.

De uitdaging voor het immuunsysteem van een geïnfekteerde gastheer is om te antwoorden met voldoende intensiteit en duur om het pathogen te controleren of te elimineren, maar om er tegelijk voor te zorgen dat korte-termijn én aanhoudende immunopathologische schade minimaal blijft. Onze resultaten tonen dat gewone polymorfismen in respons-genen van de gastheer een impact hebben op de acute ziekte-respons op infektie. De individuen wiens genetische opmaak een meer intense inflammatoire reaktie bevoordeelt, zullen wellicht ernstiger symptomen en een langduriger ziekte ervaren bij infektueuze aandoening. Verdere studies om bijkomende immunologische en neurologsiche genen geassocieerd met de acute ziekte-respons te verduidelijken, zijn gerechtvaardigd. Uiteindelijk zullen de ontdekking van combinatie-haplotypes geassocieerd met de acute ziekte-respons en het onderzoek van de gerelateerde biologische processen, de identifikatie toelaten van individuen met een hoog risico op ernstige en langdurige ziekte na infektie, om geïndividualiseerde preventie en behandeling voor courante infektie-ziekten te kunnen voorstellen.

Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS

De pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom/ Myalgische Encefalomyelitis is nog steeds niet (volledig) gekend; waarschijnlijk spelen verschillende (erfelijke en omgevings-) factoren een rol.

Veel bewijsmateriaal ondersteunt de betrokkenheid van chronische immuun-aktivatie en andere immunologische dysfunkties. De tevens gevonden verhoogde oxidatieve stress is consistent met een chronische inflammatoire toestand. Verhoogde NK-cel aktiviteit, meer allergische en auto-immune beelden wijzen op een Th2-gericht cytokine-patroon. Genetische voorbestemdheid kan ook bijdragen tot de veranderingen in bv. cytokine-profielen.

In Australië is er de ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ waarbij researchers mensen volgen die na verloop van tijd infektueuze ziekten ontwikkelen om te proberen begrijpen waarom sommigen of onder hen niet herstellen maar een aandoening blijven hebben die voldoet aan de criteria voor het Chroniscshe Vermoeidheid Syndroom.

In een artikel uit 2006 in de British Medical Journal (Post-infective and Chronic Fatigue Syndromes precipitated by viral and non-viral pathogens) rapporteerden Hickie et al. hier over. Ze hebben het percentage vergeleken van mensen die mononucleose (EBV-virus; klierkoorts), Q-fever (veroorzaakt door de intracellulaire bakterie Coxiella burnetii) en Ross River virus gehad hebben en die later voldeden aan de criteria voor CVS.

De auteurs vonden dat het percentage die CVS kregen na de drie infekueuze ziekten hetzelfde was (11% na 6 maand). Dit resultaat is zeer betekenisvol aangezien het suggereert dat de reden dat deze mensen CVS ontwikkelen niet geassocieerd is met een bepaald pathogen maar eerder met hoe hun respons als gastheer hierop wass. Citaat: “Onderzoek van uitkomsten na de drie acute infekties impliceert in hoge mate dat aspekten van de gastheer-respons op infektie (eerder dan het pathogen zelf) bepalend zijn voor een post-infektueus vermoeidheidssyndroom, aangezien het aantal gevallen na infektie met Epstein-Barr virus (een DNA-virus), Ross River virus (een RNA-virus) en Coxiella burnetii (een intracellulaire bakterie) vergelijkbaar waren en de symptoom-karakteristieken na verloop van tijd samenvielen.”. Interessant in dit ‘British Medical Journal artikel is overigens de melding dat psychologische factoren hier geen hoofdreden blijken te zijn voor de persistentie voor de vermoeidheid volgend op infektie.

M.E.(cvs) kan dus door een infektie worden getriggerd maar het zou eigenlijk niet uitmaken door welke. Na verloop van tijd verdwijnt de ‘schuldige’ dikwijls. Er zijn andere factoren bij de getroffene die de buitensporige, afwijkende (hierboven reeds vermelde) dysfunkties tot gevolg hebben. Een hypothese kan zijn dat de aanzet voor CVS wordt veroorzaakt door een combinatie van genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen waarmee deze mensen worden geboren en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren. Zoals bij zovele aandoeningen gaat het dus wellicht om ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren)…

Hoewel de aanzet kan zijn gegeven door (virale of andere) infektes (maar even goed door bv. een toxine) en bij sommige subgroepen sommige infektueuze agentia worden gerapporteerd, is nog steeds niet één enkel infektueus agens gevonden dat verantwoordelijk is voor M.E.(cvs) in het algemeen. Hieronder, een studie van het CDC die dit aantoont: er komen géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties (inidicatief voor bakterieën) voor bij CVS.

[Het bijzondere aan het gen coderend voor 16S rDNA is dat er veel verschillen zijn tussen micro-organismen onderling maar dat het ook juist zeer gelijk is op bepaalde stukken (geconserveerde regio’s). Van die constante gebieden wordt gebruik gemaakt bij het ontwerpen van een primer (startplaats) voor PCR (reaktie waarbij een bepaald stuk DNA exponentieel wordt vermenigvuldigd, ‘geamplificeerd’). Door achteraf de sequentie (volgorde van de nucleotiden waaruit het DNA is opgebouwd) te bepalen, kan worden achterhaald welke prokaryote micro-organismen er aanwezig zijn.]

De ‘Dubbo studie’ vertelt ons overigens niet welke behandeling dient te worden ingesteld (enkel wat de karakteristieken zijn van de CVS-categorie met een post-infektueuze oorsprong). Zomaar aan alle M.E.(cvs)-patiënten antibiotica (tegen bakterieën) – maar ook antivirale middelen – toedienen lijkt niet aangewezen. De risico’s op (multi-)resistente bakterieën en de toxiciteit van sommige (antivirale) middelen nopen tot voorzichtigheid. Wat niet wil zeggen dat dit in specifieke gevallen (waarbij een pathogene infektie werd aangetoond – met internationaal aanvaarde methodieken en in gecertificeerde laboratoria!) wel nodig kan zijn. Het voorkomen van enterovirussen, HHV-n, enz. bewijst ook nog steeds geen oorzakelijk verband voor M.E.(cvs).

BMC Microbiology 2002, 2:39

Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of Chronic Fatigue Syndrome and non-fatigued subjects

Suzanne D Vernon^*1, Sanjay K Shukla², Jennifer Conradt², Elizabeth R Unger¹ and William C Reeves¹

1 Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

2 Clinical Research Centre, Marshfield Medical Research Foundation, 1000 North Oak Avenue, Marshfield WI 54449-5790, USA

Dit onderzoek werd deels ondersteund door financiering van het ‘National Centre for Infectious Diseases, Centres for Disease Control and Prevention’ aan Sanjay K Shukla van de ‘Marshfield Medical Research Foundation’ [een gerenommeerd molekulair microbioloog en researcher op gebied van infectueuze ziekten].

Samenvatting

Achtergrond: Het associëren van een infektueus agens met het Chronische Vermoeidheid Syndroom is moeilijk en wordt verder bemoeilijkt door het ontbreken van een letsel of ziek weefsel. DNA uit cel-vrij plasma DNA zou kunnen dienen als een ‘schildwacht’ [aanwijzing] voor infektie en ziekte die plaatsgrijpt over het gans het lichaam. Dit type systemisch staal gekoppeld aan amplificatie van een brede waaier aan bakteriële sequenties werd gebruikt om te bepalen of een bakterieel pathogeen gerelateerd is met CVS. Plasma DNA van 34 CVS- en 55 niet-vermoeide individuen werd onderzocht om plasma DNA-concentratie en de aanwezigheid van bakteriële 16S ribosomaal DNA (rDNA) sequenties te bepalen.

Resultaten: DNA werd geïsoleerd bij 81 (91%) van 89 plasma-stalen. De 55 niet-vermoeide individuen hadden hogere plasma DNA-concentraties dan deze met CVS (gemiddeld 151 versus 91 ng) een meer CVS-individuen (6/34, 18%) hadden geen detekteerbaar plasma-DNA dan niet-vermoeide individuen (2/55, 4%) maar deze verschillen waren niet significant. Bacteriële sequenties werden gedekteerd bij 23 (26%) van 89. Bij slechts 4 (14%) CVS-individuen werden16S rDNA sequenties geamplificeerd uit het plasma vergeleken met 17 (32%) van de niet-vermoeiden (P = 0.03). Bij allle uitgezonderd 1 van de 23 16S rDNA amplicon-positieve individuen waren vijf of meer unieke sequenties aanwezig.

Besluiten: CVS-individuen hadden lichtjes lagere concentraties dan niet-vermoeide individuen of geen detekteerbaar plasma-DNA. Er tekende zich een brede waaier aan 16S rDNA sequenties af in plasma-DNA van én CVS én niet-vermoeide indivduen. Er waren géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde of predominante 16S rDNA sequenties bij CVS of niet-vermoeide individuen.

Achtergrond

Het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een complexe ziekte gedefinieerd door onverklaarde invaliderende vermoeidheid en een combinatie van niet-specifieke symptomen. Er zijn geen consistente anatomische letsels of klinisch-chemische abnormaliteiten. Hoewel geen bekende infektueuze agentia of immunologische verstoringen op een consistente manier werden geassocieerd met CVS, heeft de ziekte veel kenmerken die suggestief zijn voor een infektueuze ziekte. Vermoeidheid, spier- en gewrichtspijn, pijnlijke keel en gezwollen klieren zijn allen gebruikelijke symptomen die worden gedeeld met infektie en CVS. Daarenboven beschrijven veel mensen met CVS de aanvang van hun ziekte als plots of ‘griep-achtig’, een mogelijke infektueuze etiologie suggererend. Nochtans is de identifikatie van een infektueus agens dat specifiek is geassocieerd met CVS niet mogelijk gebleken via conventionele laboratorium-analyse. Uitgebreide sero-epidemiologische onderzoeken gericht op de detektie van antilichaam-responsen op talrijke gekende virale, bakteriële en rickettsiale agentia hebben geen verschillen tussen CVS-gevallen en normale controles kunnen aantonen [Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, Gary HE Jr, Stewart JA, Reyes M, Steele L, Schmid DS and Reeves WC. Sero-epidemiology of Chronic Fatigue Syndrome: A case-control study. Clin Infect Dis 1995, 21:1386-1389. --- Buchwald D, Ashley RL, Pearlman T, Kith P and Komaroff A. Viral serologies in patients with chronic fatigue and Chronic Fatigue Syndrome. J Med Virol 1996, 50:25-30].

Zoeken naar gekende of nieuwe infektueuze agentia bij personen met CVS is ingewikkeld door het ontbreken van een gekend letsel of ziek weefsel om te onderzoeken. Recent werd aangetoond dat circulerend cel-vrij DNA uit plasma en serum sequenties van tumorale, virale en bakteriële oorsprong bevat. Dit plasma-DNA dient daarom als een ‘schildwacht’ voor verborgen ziekte voorkomend op diverse plaatsen in het lichaam. We gebruikten dit plasma-DNA om te zoeken naar voordien ongekarakteriseerde zowel als naar gekende bakteriële pathogenen. Om dit te doen, gebruikten we PCR voor bakteriële 16S ribosomaal RNA genen (rRNA) [15]. Dit breed amplificatie-schema is succesvol bij het detekteren en karakteriseren van bakteriële pathogenen bij verscheidene ziekten en bij meerdere types klinische stalen.

We bepaalden het gehalte circulerend plasma-DNA bij CVS-individuen als een mogelijke aanwijzing voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie. We amplificeerden en sequenceten ook het 16S rRNA gen om te zoeken naar gekende en eerder ongekarakteriseerde bakteriële agentia in cel-vrij circulerend DNA om te bepalen of een bakterieel pathogen was geassocieerd met CVS.

Indviduen en methoden

Gevallen en controle-individuen

Als onderdeel van een longitudinale populatie-studie naar CVS in Wichita, Kansas werden stalen perifeer bloed verzameld tijdens de klinische evaluatie van vermoeide individuen die mogelijks CVS zouden hebben en een willekeurige selektie niet-vermoeide individuen. Bij de personen die klinisch geëevalueerd werden, bleken 34 individuen te zijn die voldeden aan de CVS-definition uit 1994. Daarvan werden, alsook uit de 55 niet-vermoeide individuen, die met voldoende plasma geselekteerd voor analyse.

[…]

Polymerase ketting reaktie (PCR)

[…] Water-stalen genomen tijdens het plasma-DNA concentratie- en extraktie-proces werden als stalen meegenomen om ‘background’ bakteriële sequenties aanwezig in reagentia en toebehoren te identificeren. Twee sets 16S rDNA primers, 515F/RD1 en 515F/806R, werden gebruikt in afzonderlijke amplificaties. Deze primers leveren amplificatie-produkten van 1045 en 300 bp op. […]

16S rDNA sequetie-bepaling

[…]

Resultaten

[…]

Karakterisatie van plasma-DNA

De hoeveelheid cel-vrij DNA varieerde van 0 tot 1.320 ng per ml plasma (gemiddeld 128 ng DNA), waarbij 91% (81/89) detekteerbare waarden opleverden. CVS-individuen vertoonden een tendens voor verlaagd plasma-DNA in vergelijking met niet-vermoeide individuen (gemiddeld 91 versus 151 ng) maar dit verschil was niet significant. Zes (18%) van de 34 plasma-stalen van CVS-indivduen hadden geen detekteerbaar cel-vrij DNA, terwijl slechts 2 (4%) van de 55 niet-vermoeide individuen geen detekteerbaar cel-vrij DNA in hun plasma hadden (P = 0.08). Er werd ook geen verschil in plasma DNA-concentratie gevonden als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte.

Alle 89 stalen, of er nu plasma-DNA werd geïsoleerd of niet, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van bakteriële 16S rDNA sequenties. Alles te samen hadden 23 (26%) individuen 16S rDNA sequenties die werden geamplificeerd en gekarakteriseerd. Het gemiddeld aantal 16S rDNA sequenties bij de 23 individuen was 9 (range 3-14). De CVS-individuen hadden gemiddeld 11 16S rDNA sequenties en de niet-vermoeide individuen hadden gemiddeld 9 16S rDNA sequenties. Het plasma-DNA van 4 (14%) van de 28 CVS-individuen had 16S rDNA sequenties vergeleken met 17 (32%) van de 53 of niet-vermoeide individuen (P = 0.03). Er werden geen verschillen genoteerd qua detektie van bakteriële 16S rDNA sequenties als de stalen werden gegroepeerd volgens geslacht, leeftijd, aanvang van CVS of duur van de ziekte. Er was geen verband tussen de hoeveelheid plasma-DNA en de mogelijkheid om 16S rDNA sequenties te amplificeren. […] Sequenties werden gedetekteerd in stalen van CVS- en niet-vermoeide individuen met plasma DNA-concentraties die varieerden van 24 tot 294 ng/ml.

Van alle 16S rDNA geamplificeerde produkten werd de sequentie bepaald om de prokaryote oorsprong te identificeren. Elk van de sequenties was óf identiek óf zeer gelijkaardig (97% of meer) met prokaryote sequenties van de GenBank. Om te bepalen of een bijzondere bakteriële sequentie werd gevonden in CVS-gevallen versus niet vermoeide controles, werd een ‘cluster-analyse’ [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier DNA-patronen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uitgevoerd. Er waren geen 16S rDNA sequenties uniek of predominant bij de CVS- of de niet-vermoeide groep, zoals aangetoond door de willekeurige verdeling en het gebrek aan clustering bij de CVS- of niet-vermoeide individuen. Er was ook geen aanwijzing dat bakterieën die bekend staan langdurige vermoeiende ziekten (e.g. Coxiella sp. of Borellia sp.) te veroorzaken, meer prevalent waren bij CVS-individuen.

Bespreking

Aangezien er bij CVS geen gekende anatomische letsels kunnen worden aangeduid, besloten we cel-vrij plasma-DNA als een systemische aanwijzing voor de ziekte te onderzoeken. Plasma-DNA werd geïsoleerd uit de meeste van de CVS- en niet-vermoeide individuen. We detekteerden een hogere concentratie plasma-DNA bij de niet-vermoeide individuen dan bij de CVS-individuen en er waren minder niet-vermoeide individuen die plasma-DNA negatief waren dan CVS-individuen (de verschillen waren echter niet significant). De fysiologische betekenis en de bron van cel-vrij DNA in het plasma worden niet ten volle geapprecieerd maar we vermoeden dat het kan resulteren uit cellulaire degradatie. Tot op heden wordt plasma-DNA gebruikt als een relatief niet-invasieve manier om aan-de-gang-zijnde pathogene gebeurtenissen, zoals minimale residuele ziekte [symptoomloze rest-aanwezigheid van een aantal maligne tumorcellen tijdens of na een kanker-behandeling] of kanker te detekteren. Onze gegevens tonen geen significant verschil in de waarden van plasma cel-vrij DNA bij CVS- versus niet-vermoeide individuen, wat er op wijst dat er wellicht geen ongebruikelijke celulaire turn-over is bij de CVS-populatie. Het is ook mogelijk dat concentratie cel-vrij plasma-DNA geen gevoelige indicator is voor verhoogde cellulaire turn-over of chronische inflammatie.

Niettegenstaande een uitgebreide zoektocht naar gekende pathogenen d.m.v. conventionele laboratorium-methoden, werd geen uniek pathogeen op consistente wijze geïdentificeerd als een oorzaak voor CVS. Bijna elk gekend viraal en bakterieel agens dat vermoeiende ziekte kan veroorzaken werd getest bij CVS-individuen en er was geen verschil in de prevalentie van deze agentia tussen CVS- en gezonde individuen [Koelle DM, Barcy S, Huang ML, Ashley RL, Corey L, Zeh J, Ashton S and Buchwald D. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for Chronic Fatigue Syndrome. Clin Infect Dis 2002, 35:518-525]. Eén verklaring is dat het met CVS geassocieerde pathogen nieuw of eerder ongekarakteriseerd is. Om te zoeken naar prokaryote agentia die mogelijks specifiek geassocieerd zijn met CVS, gebruikten we PCR met consensus-primers [primer die meerdere gerelateerde stukken DNA kan amplificeren; handig voor het screenen van meerdere stammen: men heeft maar één primer-set nodig om een soort virus/bakterie/genenfamilie op te sporen] om de geconserveerde 16S rRNA subunit te detekteren en deze sequenties te karakteriseren. Van de 89 individuen werden bij 4 CVS- en 17 niet-vermoeide individuen 16S rDNA sequenties geamplificeerd. Dit verschil in de aan- of afwezigheid van 16S rDNA tussen CVS en niet-vermoeiden was niet gerelateerd aan verschillen in plasma-DNA concentraties. Er werden geen unieke of eerder niet-gekarakteriseerde prokaryote sequenties geïdentificeerd bij de CVS- noch bij de niet-vermoeide groep. Er werd eerder een diverse serie van gekende prokaryote sequenties gevonden circulerend in het plasma.

Niettegenstaande het onwaarschijnlijk is dat de hier gekarakteriseerde 16S rDNA sequenties te wijten zijn aan experimentele of omgevings-contaminatie, kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de gebruikte bloefafname-buisjes een bron waren van het gedetekteerde bakterieel DNA. Nochtans was dit onwaarschijnlijk aangezien alle plasma-stalen, of er nu DNA aanwezig was of niet, werden onderworpen aan amplificatie voor de 16S ribosomale subunit. Alle plasma-DNA negatieve stalen waren negatief voor het 16S rDNA amplificatie-produkt. Daarenboven waren water-controles die door het hele extraktie-proces werden meegnomen, consistent negatief. Ten slotte waren slechts 23 van de 89 plasma-stalen positief voor 16S rDNA sequenties. Als onze resultaten een weerspiegeling zijn van het voorkomen van 16S rDNA sequenties bij gezonde individuen, is het aanneembaar te stellen dat aanwezigheid, eerder dan afwezigheid, van deze sequenties de normale fysiologische toestand en symbiotische relatie tussen mensen en microben reflekteert. Dit is niet de eerste illustratie van de duidelijke symbiotische relatie die bestaat tussen mensen en bakterieën. Het onderzoek van bloed van gezonde personen via amplificatie van het 16S rRNA gen toonde talrijke bakteriële sequenties die niet werden gevonden bij reagentia-controles. Weber et al. hebben een aantal microbiële en virale transcripten uit humane cDNA verzamelingen geïdentificeerd via de computer-substrakie methode. Het is niet verrassend dat het menselijk lichaam een ‘microbieel observatorium’ wordt genoemd. Verder analyse van de microbiële flora die op verscheidene plaatsen in het lichaam bestaat bij gezonde en zieke personen zou ons begrip i.v.m. inter-relaties tussen microben en hun menselijke gastheren moeten bevorderen.

Het experimenteel ontwerp die bij studie werd gebruikt; heeft enkele beperkingen wat betreft het toetsen van onze hypothese dat een nieuw pathogen zou zijn geassocieerd met CVS. Plasma-DNA zou niet het ideale staal kunnen zijn voor het detekteren van prokaryote sequenties. Granulocyten-subsets zouden meer geschikt kunnen zijn aangezien deze perifeer bloed cel-fraktie neutrofielen en andere opruim-cellen bevat die belangrijk zijn bij het verwijderen van virussen en bakterieën. Deze perifeer bloed stalen zijn misschien niet op optimale wijze verzameld en verwerkt voor preservatie van DNA in plasma maar alle stalen van alle individuen werden wel op dezelfde manier verwerkt. De CVS-individuen waren, ten slotte, al jaren ziek en het agens dat de trigger voor hun ziekte was, werd misschien al lang opgeruimd.

Besluiten

DNA geïsoleerd uit het plasma kan worden gebruikt om de associatie van pathogenen met verborgen ziekte te onderzoeken. De CVS-individuen met plasma-DNA hadden lichtjes gedaalde concentraties vergeleken met de niet-vermoeide individuen en er waren meer CVS-individuen zonder detekteerbaar DNA in het plasma. Er was een brede waaier aan 16S rDNA sequenties in plasma-DNA van én CVS- én niet-vermoeide individuen. Verder onderzoek van 16S rDNA sequenties in perifeer bloed zal zich moeten toespitsen op de granulocyt-cellen.

Biofilms en chronische infekties (antibiotica-resistentie)

Reeds vele jaren worden M.E.(cvs)-patiënten dikwijls langdurige antibiotica-therapieën voorgeschreven voor ‘infekties’ die op basis van dubieuze diagnostische methodes werden ‘vastgesteld’. Mijn insziens (en dat wordt door meerdere onderzoekers onderschreven) is er niet één enkel organisme verantwoordelijk voor het ontstaan van de aandoening. Laat ons dus verder op subcellulair niveau zoeken wat eventuele inflammatie toelaat.

Op de website van Jacob Teitelbaum, M.D. (directeur van het ‘Annapolis Centre for Effective CFS/Fibromyalgia Therapies’; www.endfatigue-dev.com) lazen we bijvoorbeeld: “Nieuwe research geeft ons een duidelijker beeld van wat er nodig is om infekties in ’t algemeen en in ’t bijzonder bij chronische ziekten zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom en Fibromyalgie, aan te pakken. Eén van de nieuwe concepten die ons nieuwe instrumenten en inzichten aanrijkt bij het elimineren van deze infekties zijn Biofilms. Een manier om zich aan te passen tegen antibiotica, is het creëren van biofilms. Deze vertegenwoordigen een laag van bakterieën en andere organismen die samenleven in een gel-achtige film. Deze film beschermt hen tegen antibiotica, ultraviolet licht en andere ‘aanvallers’, zodat ze moeilijk te vernietigen zijn.”

“Deze biofilms lijken op een sort slijm (genaamd ‘Extracellulaire Polymerische Substanties’ of EPS) – gesecreteerd door de organismen – en zorgen er voor dat de infekties zeer resistent zijn tegen antibiotica.”

[…]

Hij licht ook een topje van de sluier op over eventueel mogelijke behandelingen: “…nieuwe benaderingen worden ontwikkeld om ze [biofilms] te bestrijden. Van het eenvoudig mineraal genaamd ‘bismut’ [bismut-dimercaptopropanol (BisBAL) - bismut-subcitraat, bismut-subsalicylaat (Pepto-Bismol), bismut-subgallaat] werd aangetoond dat het duidelijk biofilms verstoort bij een lage dosis. Interessant om weten is dat dit mineraal soms een bestanddeel van tandpasta is. Bismut wordt nu ook gebruikt in medische katheters om infekties te voorkomen. Ik vermoed dat, gezien sinusitis ook een biofilm reflekteert, bismut onder de vorm van een neusspray zal worden getest. In tussentijd: de ‘Sinusitis Nose Spray’ die ik aanbeveel (ITC Pharmacy, op voorschrift) bevat xylitol, die een gelijkaardig effekt kan hebben.” [Dit laatste komt ook voor in een patent voor een mogelijk middel tegen biofilms; alsook (apo-)lactoferrine.]

Ook het gebruik van probiotica ziet er veelbelovend uit. Een belgisch bedrijf berichtte over een succesvolle proef met hun produkt ‘PIP [Probiotica in Progress] Healthcare’ ter bestrijding van ziekenhuisinfekties veroorzaakt door biofilms…

De boodschap blijft dus: voorzichtig met (langdurige) antibiotica-behandelingen!

http://jama.ama-assn.org/cgi/content/full/299/22/2682

JAMA. 2008 Jun 11;299(22):2682-4

Biofilms en chronische infekties

Randall D. Wolcott, MD; Garth D. Ehrlich, PhD

Dr Wolcott: Medical Biofilm Research Institute, Lubbock, Texas

Dr Ehrlich: Centre for Genomic Sciences, Allegheny Singer Research Institute, Allegheny General Hospital, and Departments of Microbiology and Immunology and Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Drexel College of Medicine, Allegheny Campus, Pittsburgh, Pennsylvania

Het heersend paradigma voor infektie-ziekten is gebaseerd op het werk van Koch en collegas, die meer dan 150 jaar geleden individuele bakterie-stammen isoleerden en de pure cultuur-methode ontwikkelden die heden-ten-dage nog steeds wordt gebruikt. Dat werk verlichtte de geneeskunde door stevig de kiem-theorie van overdraagbare ziekten vast te leggen en demonstreerde dat ziekten zoals dysenterie, tuberculose en anthrax worden veroorzaakt door microbiologische agentia¹ Zodoende, ontwikkelde de microbiologie zich rond Koch’s methodes met klinische microbiologen die op een overweldigende manier werkten met pure log-fase culturen in nutrient-rijke media omdat dit zo’n krachtig instrument voor de studie van acute epidemische bakteriële ziekten aanleverde. Maar deze benadering bestudeert enkel planktonische bakterieën (vrij-bewegend, enkelvoudige cel fenotype) en dit zou wel es de ontwikkeling kunnen beperkt hebben van een grondiger begrip van microbiële processen. Het planktonisch fenotype bestaat in de meeste natuurlijke omgevingen en bij chronische bakteriële infekties over het algemeen enkel tijdelijk en gewoonlijk als een minderheidsrpopulatie.

Nieuw bewijsmateriaal beschrijft bakteriële populaties als overheersend poly-microbiële, verankerde, in gemeeschapsvorm levende aggregaties ingebed in een zelf-gesecreteerde matrix, wat veelvuldige voordelen voor persistentie verstrekt bij uitdagingen door de omgeving en gastheer. Daarom voorzien biofilms en het bestaan van een complexe bakteriële levenscyclus in een nieuw perspektief van waaruit infektie-ziekten moeten worden bekeken. Veel van de steun voor dit perspektief is voortgekomen uit de toepassing van nieuwe detektie- en visualiseringsmethodes die bewijs leverden voor de theorie dat chronische infekties fundamenteel verschillen van acute infekties en dat verschillende interventionele benaderingen nodig zijn om deze biofilm-infekties efficiënter te behandelen.

Wat is een Biofilm?

Een biofilm is een dunne laag micro-organismen die vastplakken aan het oppervlak van een organische of anorganische struktuur, samen met de door hen gesecreteerde polymeren. Biofilms zijn het overheersend fenotype van bijna alle bakterieën in hun natuurlijk habitat, pathogeen of niet. De biofilm verstrekt een bolwerk tegen milieu-stressors en kan organismen omvatten van verscheidene groepen zoals in het geval van gemengde bakterie-schimmel biofilms.

Dertig jaar geleden waren Costerton et al.² de eersten om de eigenschappen van biofilms te bestuderen, door de extracellulaire polymeer-substanties (EPS) die deze bakteriële gemeenschap samen houdt te onderzoeken. Hij en andere researchers hebben sindsdien biofilms betrokken bij diverse a-biotische en biotische systemen, inclusief olie-pijplijnen, warme baden, tanden en mucosa. Daarom zijn biofilms, met hun gemeenschapsverdediging, een alomtegenwoordig kenmerk van bakterieën in de natuur en bij sommige bakteriële infekties. De in een biofilm gevestigde bakteriële gemeenschap heeft verdedigingsmiddelen en veelvuldige overlevingsmechanismen aangebracht, zoals verweer tegen fagocytose, UV-straling, virale aanvallen, mechanische stress en dehydratie; alsook tegen biocides, antibiotica en gastheer-immuniteit. Biofilms hebben het vermogen te weerstaan aan 100 tot 1000 voudige concentraties aan antibiotica en biocides die planktonische cellen kunnen inhibiren.³ Op gelijkaardige wijze zijn granulocyten, macrofagen en andere fagocyten niet in staat een biofilm in te palmen zoals ze zouden doen bij individuele planktonische cellen. De genotypische en fenotypische diversiteit van de biofilm laat adaptatie toe om meervoudige stress-factoren te overwinnen en de meeste sequentiële therapieën te overleven.

Het hoofdkenmerk van biofilms is genetische en fenotypische diversiteit, die de stevigheid van de bakteriële gemeenschap versterkt.⁴ Een steeds groter wordende hoeveelheid bewijsmateriaal suggereert dat in het laboratorium gecultiveerde bakterieën maar weinig karakteristieken gemeen hebben met infektueuze biofilms. Wanneer bakterieën op natuurlijke wijze overgaan van individuele planktonische cellen naar een gemeenschap van biofilm-weefsel, verandert de transcriptionele expressie van de bakterieën radikaal. De bakterieën scheiden beschermende polymeren uit en incorporeren omgevingsmolekulen die de bakteriële gemeenschap op een oppervlak en aan elkaar binden bij deze fenotypische transitie. De bakteriële gemeenschap van de biofilm gebruikt gesecreteerde feromonen (bv. quorum-aftastende molekulen) en andere molekulen voor cel-cel signaliserng, zelfs tussen soorten. Deze gecoördineerde aktiviteiten veranderen de biofilm in een formidabele opponent voor de gastheer.

Biofilms als een Nieuwe Focus

Er zijn 3 significante beperkingen om te blijven werken binnen het the planktonisch paradigma.

Ten eerste: omdat planktonische cellen minder verdedigingsmiddelen hebben dan biofilm-gemeenschappen, zou een behandeling zoals een antibioticum wel excellente in vitro test-resultaten kunnen opleveren, wanneer het uitgetest wordt op planktonische cellen alleen, maar povere in vivo resultaten, waar het biofilm-fenotype overheerst. Dezelfde bakterie-stam kan honderden of duizenden keren meer resistent zijn voor antibiotica wanneer deze deel uitmaakt van een biofilm-gemeenschap.^3,5 Deze planktonische bias brengt ongetwijfeld ten minste iets van de discrepantie in rekening die kan optreden tussen in vitro test-resultaten en in vivo respons op een antibiotia-therapie.⁶

Ten tweede: de huidige cultuur-methodes identificeren de meerderheid van de bakterieën die heden ten dage bekend staan bij gastheer-infekties niet.⁷ Researchers hebben molekulaire, genomische, meta-genomische, transcriptomische en proteomiscshe methodes ontwikkeld omdat zij vaststelden dat slechts bij benadering 1% van de cellen die ze observeerden in ecosystemen daadwerkelijk kolonies produceerden bij conventionele cultuur-methodes.⁸ De conclusie van deze op DNA en RNA gebaseerde studies is: cultuur-methodes detekteren enkel een kleine minderheid van de organismen die werkelijk aanwezig zijn in natuurlijke en pathogenische bakteriële gemeenschappen. Daarom pakken behandelingen gebaseerd op conventionele culturen mogelijks enkel 1 of 2 bakteriële species aan in een complexe biofilm-gemeenschap die wellicht dozijnen andere bakterie-soorten, of zelfs schimmels, omvat.

Ten derde: planktonische technieken zoals culturen geven mogelijks aanleiding tot een onnauwkeurige of onvolledige diagnose want culturen detekteren geen biofilm-cellen (die wel levensvatbaar maar niet cultiveerbaar zijn). Van ziekten die enkel nu en dan positieve culturen opleveren (bv. otitis media, prostatitis) wordt gesuggereerd dat het ‘steriele inflammaties’ of virale infekties zijn.⁹ […]

Nieuwe Perspektieven, Opties voor Detektie en Behandeling

Het veranderen van de perspektieven aangaande chronische infektie-ziekten door biofilms te laten meetellen, laat 2 belangrijke inzichten toe. Ten eerste opent het nieuwe methodes voor detektie en behandeling. Ten tweede verstrekt het een globale reconceptualisering van vele chronische infektie-ziekten resulterend uit biofilms, door toe te laten dat biofilm-principes tussen disciplines worden gedeeld.

Recente studies hebben nieuwe methodes onderzocht voor de detektie van de componenten van een biofilm. Verscheidene onderzoeken maakten gebruik van moderne molekulaire methodes, zoals denaturerende gradient gel-elektroforese en denaturerende hoge-performantie vloeistof-chromatografie, tesamen met beeldvormingstechnieken met inbegrip van fluorescente in situ hybridisatie. Ook molekulaire methodes zoals polymerase ketting reaktie (PCR) en ‘pyro’-sequenering’, samen met conventionele cultuur-methodes, werden gebruikt om de bakteriële samenstelling van chronische infekties te bepalen.⁷

Het uitvoeren van molekulaire testen als onderdeel van een routine bakteriële analyse wordt een echte optie voor klinische laboratoria. Deze testen zouden methodes kunnen omvatten zoals PCR, reverse transcriptase PCR, micro-arrays, antigen-testen en snelle sequenering. Slechts enkele van deze methodes worden gebruikt om bepaalde pathogenen op te sporen maar cultuur-vrije identifikatie van alle pathogenen en hun corresponderende resistentie-merkers zou wel eens snel routine kunnen worden.¹¹

Een focus op biofilms levert ook nieuwe strategieën op voor behandeling van chronissche infekties. Op biofilms gebaseerde behandelingen kunnen mogelijks initiële bakteriële vasthechting op een oppervlak verhinderen, EPS-formatie blokkeren of vernietigen, tussenkomen bij cel-cel signaliseringsmechanismen en terzelfdertijd bakteriostatische of baktericide agentia gebruiken. Bijkomende therapieën die niet enkel pogen bakterieën uit te roeien maar ook de gemeenschapsstruktuur en communicatie van de biofilms beïnvloeden, zouden wel eens veel effektiever kunnen zijn dan een enkelvoudige sequentiële strategie zoals een antibiotica-therapie.⁴ Deze benaderingsvorm van behandeling wordt gewoonlijk gebruikt in andere gebieden van de geneeskunde; zoals de behandeling HIV, waarvoor een combinatie anti-retrovirale therapie wordt aangewend om de beste klinische uitkomst te bereiken.

Chronische Bakteriële Ziekte als Biofilm Ziekte

Een ander groot voordeel dat het biofilm-model toelaat, is de her-conceptualisering van verscheidene chronische ziekten als biofilm-ziekten. Biofilm-ziekte werd gezien als meerdere ziekten betreffende een variëteit aan weefsels en strukturen, inclusief oren, neus, keel, mond, ogen, longen, hart, nieren, galblaas, pancreas, zenuwstelsel, huid, beenderen, zowel als bijna elk geïmplanteerd medisch apparaat. Het ‘Centres for Disease Control and Prevention’ schat dat meer fan 65% van de infekties wordt veroorzaakt door bakterieën die groeien in biofilms¹² en Lewis¹³ suggereert dat de proportie 80% is – veruit de meerderheid aan infekties wordt geschat door biofilms veroorzaakt te zijn. Dus, wanneer biofilm-infekties worden gecombineerd in een enkelvoudige ziekte-categorie, is de prevalentie van de ziekte significant en de mortaliteit geassocieerd met biofilm-ziekte substantieel. Verder zijn de ziekte-processen en management-strategieën van biofilms verwant. Bijvoorbeeld: de biofilm-ziekten cystische fibrose, longontsteking en een geïnfekteerde knie-prosthese zijn verschillend maar strategieën gebruikt om de biofilm aan te pakken in de longen zal gelijkaardig zijn met de strategie gebruikt voor de biofilm in een geïnfekteerd knie-implantaat.

Typische en Vertrouwde Biofilms

De typische biofilm-ziekte manifesteert zich met gemeenschappelijke kenmerken. De initiële infektie is subtiel en gewoonlijk niet onmiddellijk levensbedreigend, en doorgaans worden antibiotica voorgeschreven. Daaropvolgende verergeringen komen voor, en deze worden over het algemeen weer met antibiotica en aanvullende therapieën zoals corticosteroïden behandeld. Niettemin wordt de infektie erger wanneer de behandeling wordt gestopt. Wanneer de klinische status van de patient slechter wordt of de ziekte vordert tot op het punt dat de werking van het betreffende weefsel of apparaat in die mate is aangetast, wordt dikwijls de beslissing genomen het geïnfekteerde weefsel of de component chirurgisch te verwijderen. Het doel van de arts bij het aanpakken van de ziekte is om de symptomen en signalen te beheersen, en terugval te onderdrukken, met dien verstande dat de uitroeiing van de ziekte onwaarschijnlijk is zonder chirurgische tussenkomst.

Misschien wel de meest algemeen voorkomende biofilm-ziekte is tand-plak, een toestand die efficiënt kan worden gemanaged door tandartsen. Periodontale ziekte en tandbederf werden de voorbije eeuw sterk teruggedrongen dank zij de meerdere gezamelijke strategieën die tandartsen zich hebben eigen gemaakt. De onderdrukking van biofilms in de mondholte begint met het frequent verwijderen van de biofilm door dagelijks poetsen en flossien, gekoppeld aan periodieke tandartsbezoeken voor het verwijderen van tandplak. Als de hoeveelheid bakterieën in de biofilm te groot is en de ziekte vordert, wordt de frequentie van biofilm-management opgevoerd in een poging om de ziekte te overwinnen. De tandheelkunde heeft biofilm-ziekte op een succesvolle manier geconfronteerd en gelijkaardige benaderingen kunnen worden gebruikt als een model om chronische infekties in de geneeskunde aan te pakken.

Conclusies

Het behandelen van chronische infektie-ziekten kan niet worden beperkt tot infektie-specialisten, net zoals het management van diabetes kan beperkt blijven tot endocrinologen. Door het verschuiven van het planktonisch model van de microbiologie naar het biofilm-model, komen nieuwe methodes voor de detektie en behandeling beschikbaar. Door molekulaire methodes heeft de wetenschap nu de mogelijkheid om biofilms te detekteren en de implikaties te begrijpen van de ‘interspecies chaos’ die bijdraagt tot infekties. Met deze nieuwe wetenschappelijke benaderingen, samen met de coördinatie van klinische en laboratorium-inspanningen, onderwijs en research, is het mogelijk zich in te beelden dat veel van de biofilm-ziekten zullen kunnen worden overwonnen.