Variaties in Pijn-perceptie zijn Genetisch bepaald

In het artikel van Light et al. (zie ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS’) bleek dat het nog niet altijd even duidelijk is of de beschreven genetische defekten te wijten zijn aan het CVS of aan de overlappende FMS: “We kunnen nog niet kunnen onderscheiden of de geobserveerde responsen typisch zijn voor alle CVS-patiënten of slechts voor de subgroep die beide aandoeningen heeft.”.

In afwachting van verder onderzoek bekijken we hier de literatuur over één van de genen die al wat beter bestudeerd zijn: catechol-O-methyltransferase (COMT).

*************************

Variaties in Pijn-perceptie zijn Genetisch bepaald

Pijn helpt mensen beschermen door te waarschuwen voor bedreigingen maar ongecontroleerde chronische pijn kan het leven ook ondraaglijk maken. Hoeveel pijn iemand kan verduren verschilt van persoon tot persoon. Sommigen verdragen veel fysieke en psychologisch stress zonder klaarblijkelijke gevolgen terwijl anderen chronische pijn aandoeningen ontwikkelen.

Een team wetenschappers van de ‘University of North Carolina’, de ‘National Institutes of Health’, de ‘University of Adelaide’ en Attagene Inc. publiceerden in 2005 een aanzet voor een beter begrip hieromtrent.

Subtiele variaties in bepaalde genen kunnen iemand zeer gevoelig maken voor mijn pijn en meer vatbaar voor het ontwikkelen van chronische pijn aandoeningen, terwijl andere beschermend kunnen zijn: “Sommige mensen zijn zeer pijn-resistent alsof ze een klinische dosis morfine hebben genomen.”, “Mensen die minder gevoelig zijn voor pijnlijke stimuli zijn beschermd tegen het ontwikkelen van een een zeer courante en invaliderende pijn-aandoening genaamd ‘temporomandibular joint disorder’ (TMJD; aandoening van het scharniergewricht in de kaak gepaard gaan met pijn e.a. symtomen). Deze variaties in pijn-gevoeligheid zijn stabiel in de tijd, wat een genetische voorbestemdheid suggereert.”.

COMT, catechol-O-methyltransferase, een enzyme dat de concentraties aan epinefrine en andere stoffen controleert, en wordt afgegeven in respons op stress, bleek significante variaties in pijn-gevoeligheid te verklaren. Bij 202 gezonde vrouwen werden de COMT gen-varianten, de pijn-gevoeligheid en het risico op TMJD geanalyseerd. Molekulair biologische, cel-cultuur en dieren-gedrag experimenten werden ook uitgevoerd om de relatie aan te tonen tussen COMT-aktiviteit en pijn-gevoeligheid.: “We identificeerden drie genetische varianten van COMT die zeer prevalent zijn in de menselijke bevolking.”, “Een genetische variatie beïnvloedt de menselijke pijn-perceptie én het risico voor het ontwikkelen van een chronische pijn aandoening.”

De researchers geloven dat hun ontdekkingen ook toepasbaar zullen zijn op aandoeningen zoals fibromyalgie-syndroom, prikkelbare darm syndroom en meerdere andere chronische aandoeningen die ook worden gekenmerkt door verhoogde pijn-gevoeligheid. “De resultaten hebben brede vertakkingen betreffende het begrijpen van pijn-fysiologie en genetica, voor de ontwikkeling van genetische merkers voor pijn-aandoeningen en door het ontwerpen van nieuwe en betere strategieën voor het behandelen van pijn.”

Hum Mol Genet. 2005 Jan 1;14(1):135-43

Genetic basis for individual variations in pain perception and the development of a chronic pain condition

Diatchenko L, Slade GD, Nackley AG, Bhalang K, Sigurdsson A, Belfer I, Goldman D, Xu K, Shabalina SA, Shagin D, Max MB, Makarov SS, Maixner W

Comprehensive Centre for Inflammatory Disorders, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA

Pijn-gevoeligheid varieert substantieel bij mensen. Een significant deel van de meselijke bevolking ontwikkelt chronische pijn aandoeningen die worden gekarakteriseerd door verhoogde pijn-gevoeligheid. We identificeerden drie genetische varianten (haplotypes) van het gen coderend voor catecholamine-O-methyltransferase (COMT) die we benoemden als lage pijn-sensitiviteit (LPS), gemiddelde pijn-sensitiviteit (APS) en hoge pijn-sensitiviteit (HPS). We tonen aan dat deze haplotypes 96% van de menselijke bevolking omvatten en dat combinaties van deze haplotypes sterk geassocieerd (P=0.0004) zijn met variatie qua gevoeligheid voor experimentele pijn. De aanwezigheid van zelf één enkel LPS haplotype vermindert, tot 2,3 maal, het risico voor het ontwikkelen van myogeen ‘temporomandibular joint disorder’ (TMD), een courante musculoskeletale pijn aandoening. Het LPS haplotype produceert veel hogere waarden aan COMT enzymatische aktiviteit vergeleken met de APS of HPS haplotypes. Inhibitie van COMT bij ratten resulteert in een intense verhoging qua pijn-gevoeligheid. COMT-aktiviteit beïnvloedt dus substantieel de pijn-gevoeligheid en de drie belangrijke haplotypes bepalen COMT-aktiviteit, die omgekeerd correleert met pijn-gevoeligheid en het risico op het ontwikkelen van TMD.

————————-

In 2003 linkten researchers ook reeds verschillen in de manier waarop mensen met pijn omgaan – fysieke én emotionele stress – met het gen dat catechol-O-methyltransferase (COMT), een enzyme dat vitaal is voor het opruimen van dopamine, – maakt. Het team van Jon-Kar Zubieta aan de ‘University of Michigan’ vond dat mensen met een minder aktieve vorm van COMT meer acute pijn bleken te voelen.

Het COMT gen bestaat onder twee vormen die copieën maken die verschillen in één enkel aminozuur. Deze kleine variatie blijkt een groot effekt op de aktiviteit van COMT te hebben. Mensen met de meest luie vorm van het gen – met twee copieën van de methionine versie – maken enzymen die drie tot vier maal minder effektief zijn dan de andere varianten met enkel het aminozuur valine of één van beiden. De onderzoekers gebruikten beeldvorming van de hersenen om de hersen-aktiviteit in kaart te brengen van 29 mensen die werden blootgesteld aan een ‘verdraagbare’ pijn gedurende 20 minuten. (De vrijwilligers kregen een injektie met een zout-oplossing in hun kaak-spieren om een toestand gelijkaardig met ‘temporomandibular joint-pain disorder’ te simuleren. Ze scoorden elke 15 seconden zelf hun pijn tijdens de beeldvorming.)

Science. 2003 Feb 21;299(5610):1240-3

COMT val158met genotype affects mu-opioid neurotransmitter responses to a pain stressor

Zubieta JK, Heitzeg MM, Smith YR, Bueller JA, Xu K, Xu Y, Koeppe RA, Stohler CS, Goldman D

Department of Psychiatry and Mental Health Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-0720, USA

Responsen op pijn en andere stressoren worden geregeld door interakties tussen meerdere hersen-gebieden en neurochemische systemen. We onderzochten de invloed van een courant funktioneel genetische polymorfisme, die het metabolisme van catecholaminen aantast, op de modulatie van responsen op aanhoudende pijn bij mensen. Individuen die homozygoot waren voor het met158 allel van het catechol-O-methyltransferase (COMT) polymorfisme (val158met) vertoonden verminderde regionale responsen van het mu-opioid systeem [produceert endogene opioïden, o.a. endorfinen; natuurlijke pijnstillers in de hersenen] op pijn vergeleken met heterozygoten. Deze effekten gingen vergezeld met hogere sensorische en affectieve [verbonden met stemming, gevoelens en gedragingen] pijn-scores en een meer negatieve interne affectieve toestand. Tegengestelde effekten werden geobserveerd bij val158 homozygoten. Het COMT val158met polymorfisme beïnvloedt dus de pijn-ervaring bij mensen en zou kunnen aan de basis liggen voor inter-individuele verschillen qua adaptatie aan en responsen op pijn en andere stressvolle stimuli.

*************************

Wat betreft FMS… Twee studies die elkaar lijken tegen te spreken…

Rheumatol Int. 2003 May;23(3):104-7. Epub 2002 Oct 22

Significance of catechol-O-methyltransferase gene polymorphism in fibromyalgia-syndrome

Gursoy S, Erdal E, Herken H, Madenci E, Alasehirli B, Erdal N

Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Gaziantep University Medical Hospital, 2700 Kolejtepe Gaziantep, Turkey

Fibromyalgie-syndroome (FMS) is geassocieerd met een neuro-endocriene aandoening gekarakteriseerd door abnormale funktie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, inclusief hyper-aktieve afgifte van adrenocorticotroop hormoon (ACTH) en hypo-responsiviteit van de bijnieren. Catechol-O-methyltransferase (COMT) inaktiveert catecholaminen en catecholamine-bevattende medicijnen. […] We bepaalden de betekenis van het COMT polymorfisme bij FMS. Er zijn drie polymorfismen van het COMT-gen: LL, LH en HH. De analyse van het COMT polymorfisme werd uitgevoerd gebruikmakend van polymerase ketting reaktie (PCR). 61 patiënten met FMS en 61 gezonde vrijwilligers werden opgenomen in de studie. Hoewel geen significant verschil werd gevonden tussen LL en LH afzonderlijk, waren de LL- en LH-genotypes samen meer vertegenwoordigd bij patiënten dan controles ( P=0.024). Daarenboven waren er significant minder HH-genotypes bij patiënten dan bij de controles ( P=0.04). […] Concluderend: COMT polymorfisme is van potentieel farmacologisch belang wat betreft individuele verschillen in het metabolisme van catechol-medicijnen en zou ook betrokken kunnen zijn bij de pathogenese en behandeling van FMS via adrenerge mechanismen zowel als genetische voorbestemdheid voor FMS.

Rheumatol Int. 2008 Jan 15

Polymorphisms of the serotonin-2A receptor and catechol-O-methyltransferase genes: a study on fibromyalgia susceptibility

Tander B, Gunes S, Boke O, Alayli G, Kara N, Bagci H, Canturk F

Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Ondokuzmayis University School of Medicine, 55139, Kurupelit, Samsun, Turkey

Genetische en omgeving-factoren worden verondersteld rollen te spelen in de etiopathologie van fibromyalgie-syndroom (FMS). De doelstelling van deze studie was de mogelijke effekten van ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in catechol-O-methyltransferase (COMT) en 5-hydroxytryptamine (serotonine) 2A (5-HT2A) receptor genen op de vatbaarheid voor FMS te bepalen. 171 vrouwen (80 FMS, 91 controles) werden opgenomen in de studie. […] Analyses van genotypes en allel-frequenties werden uitgevoerd […]. Er waren geen verschillen qua frequenties van allelen en genotypes tusen patiënten en controles voor de COMT en twee 5-HT2A receptor gen polymorfismen (P > 0.05). Onze resultaten suggereren dat de onderzochte polymorfismen geen vatbaarheid-factoren zijn bij de etiologie van FMS.

————————-

CVS… Light et al. vonden dus hogere COMT gen-expressie bij de CVS-patiënten vs controles; maar zekerheid over de eventuele bijdrage van FMS hierbij is er nog niet.

Een team o.l.v. Benjamin N Goertzel (‘Virginia Tech, National Capital Region’) vroeg zich eerder af of de aanwezigheid van CVS nauwkeuriger kan worden voorspeld d.m.v. ‘single nucleotide’ polymorfisme (SNP) profielen. In de top drie van de genen die de SNPs bevatten die meest belangrijk zijn, stond o.a. catechol-O-methyltransferase. (zie: ‘NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS‘)

Pharmacogenomics Volume 7, Number 3, Pages 475-483 (April 2006)

Combinations of single-nucleotide polymorphisms in neuro-endocrine effector- and receptor-genes predict Chronic Fatigue Syndrome

Benjamin N Goertzel [1,2,*], Cassio Pennachin [2], Lucio de Souza Coelho [2], Brian Gurbaxani [3], Elizabeth M Maloney [3] & James F Jones [3]

[1] Virginia Tech, National Capital Region, Arlington, VA, USA; [2] Biomind LLC, Rockville, MD, USA; [3] Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Doelstelling: Dit artikel stelt de vraag of de aanwezigheid van Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) meer accuraat kan worden voorspeld via ‘single nucleotide’ polymorfisme (SNP) profielen.

Methoden: SNP-profielen van 43 CVS-patiënten en 58 controles werden gebruikt om regels te identificeren die voorspellen of een patient CVS heeft.

Resultaten: […]. De top drie genen met de SNPs die verantwoordelijk zijn voor de grootste belangrijkheid waren neuronaal tryptofaan-hydroxylase (TPH2), catechol-O-methyltransferase (COMT) en de nucleaire receptor subfamilie 3, groep C, lid 1 glucocorticoid receptor (NR3C1).

Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS

De studie hier wordt uitgebreid weergegeven voor degenen die er zich willen in verdiepen. Het betreft een uitbreiding van eerder aangehaald werk door Alan & Kathy Light. Leken worden verwezen naar de samenvatting en besluiten.

Korte omschrijving van dit onderzoek…

* Hypothesen:

25 minuten matige inspanning zou de gen-expressie verhogen van:

- Acid-sensing ion-channel [zuur-gevoelig ion-kanaal] (waarschijnlijk ASIC3)

- Purinerge type 2X receptoren (waarschijnlijk P2X4 en P2X5), en

- ‘Transient receptor potential vanilloid’ type 1 (TRPV1).

Dit werd getest 8, 24 en 48 uren na inspanning bij CVS-patiënten vs normale individuen.

* Resultaten:

— RT-PCR toonde dat 19 CVS-patiënten lagere expressie van beta-2 adrenerge receptoren hadden maar anders niet verschilden van 16 controle-individuen vóór inspanning.

— Na een volgehouden matige inspanning-test vertoonden CVS-patiënten grotere stijgingen qua gen-expressie voor:

- Metaboliet-detekterende receptoren ASIC3, P2X4 en P2X5

- Sympatisch zenuwstelsel (SZS) receptoren alfa-2A, beta-1, beta-2 en

- COMT en immuunsysteem (IS) genen IL10 en TLR4 van 0,5 tot 48 uur na inspanning.

— Deze verhogingen werden ook vastgesteld bij de CVS-subgroep met co-morbide fibromyalgie (FMS).

— Ze waren sterk gecorreleerd met fysieke vermoeidheid, mentale vermoeidheid en pijn.

— Deze nieuwe bevindingen suggereren ontregeling van metaboliet-detekterende receptoren zowel van het SZS en IS bij CVS en CVS-FMS.

Zie ‘Spier-metaboreceptoren’ voor meer achtergrond over ASIC3, P2X & TRPV1.

Adrenerge receptoren binden specifiek met en worden geaktiveerd door de catecholaminen adrenaline en noradrenaline; ze komen tussen bij het overbrengen van impulsen van zenuw naar eindorgaan. Er zijn vijf types, α-1 en α-2, en β-1, β-2 en β-3. Noradrenaline heeft een grotere affiniteit voor α; voor adrenaline hangt de gevoeligheid af van het subtype. Bloedvaten van skeletspieren bevatten zowel α als β.

COMT = catechol-O-methyltransferase; enzyme dat catecholaminen inaktiveert (ook dopamine is een catecholamine).

TLR4 = Toll-Like receptor die een rol speelt bij de herkenning van bakterieel lipopolysaccharide en het aangeboren immuunsysteem aktiveert.

IL10 = interleukine-10; een anti-inflammatoir cytokine; heeft effekten bij immuun-regulering en inflammatie.

J Pain. 2009 Jul 30. [Epub ahead of print]

Moderate Exercise Increases Expression for Sensory, Adrenergic and Immune Genes in Chronic Fatigue Syndrome Patients But Not in Normal Subjects

Alan R. Light^*†, Andrea T. White^‡, Ronald W. Hughen^* and Kathleen C. Light^*

^†Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah Salt Lake City, Utah, University of Utah Salt Lake City, Utah

^‡Department of Exercise and Sport Science, University of Utah Salt Lake City, Utah

^*Department of Anaesthesiology, University of Utah Salt Lake City, Utah, University of Utah Salt Lake City, Utah

Samenvatting

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) wordt gekenmerkt door invaliderende vermoeidheid, dikwijls vergezeld van wijd-verspreide spier-pijn die voldoet aan de criteria voor fibromyalgie-syndroom (FMS). Symptomen verergeren uitgeproken na inspanning. Eerdere studies toonden betrokkenheid van een ontregeling van het sympatisch zenuwstelsel (SZS) en het immuunsysteem (IS) bij CVS en FMS. Recent toonden we dat ‘acid sensing ion-channel’ (waarschijnlijk ASIC3), ‘purinergic type 2X’ receptoren (waarschijnlijk P2X4 en P2X5) en de ‘transient receptor potential vanilloid type 1’ (TRPV1) molekulaire receptoren zijn in sensorische neuronen van muizen die metabolieten detekteren die acute spier-pijn en mogelijks spier-moeheid veroorzaken. Deze molekulaire receptoren worden gevonden op menselijke leukocyten, samen met SZS en IS genen. Real-time kwantitatieve PCR [techniek uit de molekulaire genetica] toonde dat 19 CVS-patiënten een lagere expressie van beta-2 adrenerge receptoren hadden maar dat ze anderzijds niet verschilden van 16 controle-individuen vóór inspanning. Na een volgehouden milde inspanning-test, vertoonden CVS- patiënten grotere stijgingen dan controle-individuen qua gen-expressie van metaboliet-detekterende receptoren ASIC3, P2X4 en P2X5, van SZS receptoren alfa-2A, beta-1, beta-2 en COMT, en van IS-genen IL10 en TLR4; en dit van 0,5 tot 48 uur (P < .05) na inspanning. Deze stijgingen werden ook gezien in de CVS-subgroep met co-morbide FMS en waren sterk gecorreleerd met symptomen van fysieke vermoeidheid, mentale vermoeidheid en pijn. Deze nieuwe bevindingen suggereren ontregeling van metaboliet-detekterende, zowel als SZS- en IS-receptoren bij CVS en CVS/FMS.

[…] Eén van de meest voorkomende aandoeningen die co-morbide zijn met CVS is fibromyalgie […], tot 70% van de patiënten met CVS hebben ook FMS (gehad). Alle symptomen van CVS en FMS zijn subjectief, wat het stellen van een diagnose en de behandeling moeilijk maakt. Er is een duidelijke nood aan objectieve biomerkers voor deze syndromen.

Zoals bij andere ziekten met een onbekende etiologie is de strategie om aanwijzingen te vinden voor de oorzaken, het gebruik van gen-expressie micro-arrays om te genen met over- of onder-expressie aan te wijzen bij CVS-patiënten. Er zijn enkele pogingen ondernomen om zo biomerkers te vinden bij kleine CVS-populaties maar de resultaten tot op heden waren dubbelzinnig. [Aspler AL, Bolshin C, Vernon SD, Broderick G: Evidence of inflammatory immune-signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot-study of gene-expression in peripheral blood. Behav Brain Funct (2008) 4:44; Fang H, Xie Q, Boneva R, Fostel J, Perkins R, TongW: Gene-expression profile exploration of a large dataset on Chronic Fatigue Syndrome. Pharmacogenomics (2006) 7:429-440; Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D, Sinclair LI, Mattey DL, Richards SC, Montgomery J, Baldwin DA, Kellam P, Harrison TJ, Griffin GE, Main J, Enlander D, Nutt DJ, Holgate ST: Gene-expression subtypes in patients with on Chronic Fatigue Syndrome / Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis (2008) 197:1171-1184; Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker-genes for differential diagnosis of on Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med (2008) 14:599-607; Whistler T, Unger ER, Nisenbaum R, Vernon SD: Integration of gene-expression, clinical and epidemiologic data to characterize Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med (2003) 1:10] Eén verklaring voor het verschil zou kunnen zijn dat er meerdere types CVS bestaan, waarbij elk type een verschillende gen-expressie profiel heeft. Zo veel als 7 subtypes van CVS werden voorgesteld op basis van gen-expressie. [Kerr et al.] Andere onderzoekers hebben een meer gerichte benadering gebruikt door gebruik te maken van kwantitative mRNA metingen van genen gerelateerd aan immuun-funktie; evenzeer met weinig overéénkomst tussen de onderzochte genen. [Natelson BH, Zhou X, Ottenweller JE, Bergen MT, Sisto SA, Drastal S, Tapp WN, Gause WL: Effect of acute exhausting exercise on cytokine gene-expression in men. Int J Sports Med (1996) 17:299-302; Sorensen B, Jones JF, Vernon SD, Rajeevan MS: Transcriptional control of complement-activation in an exercise-model of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med (2009) 15:34-429]

Wij hebben een verschillende strategie gevolgd bij onze pogingen om gen-expressie te gebruiken om bruikbare biomerkers voor CVS en factoren bij de initiatie en het in stand houden van dit syndroom te bepalen. We focusten op genen die zouden kunnen bijdragen tot het primair symptoom van CVS – vermoeidheid – en op 2 van de meest gebruikelijke bijkomende symptomen, spier-pijn en langdurige post-exertionele verslechtering van symptomen.

Vermoeidheid heeft veel definities: van verlies van vrijwillige spier-samentrekking tot de perceptie van ‘moe voelen’. De symptomen beschreven bij CVS en gemeten met vermoeidheid-vragenlijsten benadert echter beter het laatste fenomeen. Deze ‘vermoeidheid’ is afkomstig van de spieren en van een unieke cognitieve toestand in de hersenen. Dit gevoel van vermoeidheid van spieren (dat voorkomt met of zonder spier-pijn) wordt veroorzaakt door metabolieten die worden geproduceerd tijdens spier-samentrekking en wordt versterkt na uitputtende inspanning bij normale individuen. Matige inspanning veroorzaakt echter weinig langdurige vermoeidheid na inspanning en gewoonlijk geen spier-pijn bij normale individuen, terwijl deze symptomen dikwijls verergerd zijn zelfs na matige inspanning bij CVS-patiënten.

Om meer te weten te komen over sensorische spier-moeheid en -pijn, voerden we muis-experimenten uit om te bepalen welke types sensorische neuronen die metabolieten geproduceerd bij spier-contractie coderen. We vonden ten minste 2 klassen sensorische neuronen. Deze 2 klassen vertegenwoordigen waarschijnlijk (1) sensorische neuronen die in staat zijn signalen die worden geïnterpreteerd als fysieke vermoeidheid te versturen en (2) sensorische neuronen die in staat zijn signalen die geïnterpreteerd worden als spier-pijn. Onze analyse suggereerde, gebruikmakend van antagonisten [stof die een biologische receptor blokkeert of geneesmiddel dat de werking of een specifieke bijwerking van een geneesmiddel afremt] en agonisten [stof die een biologische receptor aktiveert en zo een reaktie of aktiviteit in gang zet], dat ten minste 4 molekulaire receptoren synergistisch werken om de metabolieten geproduceerd bij spier-contractie te detekteren. Deze omvatten een zuur-voelend ion-kanaal – ook ‘amiloride-sensitive ion-channel’ of ASIC genaamd (waarschijnlijk ASIC3), 2 purinergische receptoren van het X-type (P2X5 en/of P2X4) die worden geaktiveerd door ATP en ‘transient receptor potential vanilloid’ type 1 (TRPV1) die wordt geaktiveerd door warmte, zuur of endocannabinoïden [Endogene cannabis-achtige substanties, groep neuro-modulerende stoffen die samen met hun receptoren betrokken zijn bij eetlust, pijn-gevoel, stemming en geheugen. De cannabinoid CB1 receptor komt veel voor in hersen-gebieden betrokken bij beweging-controle, cognitie, emotionele responsen, gemotiveerd gedrag en homeostase. Buten de hersenen is het endocannabinoid systeem één van de cruciale modulatoren van het autonoom zenuwstelsel, het immuun-systeem en de micro-circulatie.]. Het verschil qua codering tussen de ‘vermoeidheid’- vs de ‘nociceptieve’ [pijn-waarnemende] mechanismen leek te zijn verbonden met de P2X5 vs P2X4 receptoren, terwijl P2X5 de verhoogde sensitiviteit overbracht nodig om lage concentraties aan metabolieten geassocieerd met ‘vermoeidheid’ te detekteren. Het delen van de meeste (maar niet alle) molekulaire receptoren door ‘vermoeidheid’- en ‘nociceptieve’ spier-afferenten [afferente neuronen brengen prikkels van de spieren/organen naar het centraal zenuwstelsel] voorspelt ten minste enige overlapping tussen vermoeidheid-symptomen bij CVS en spier-pijn symptomen. Ander onderzoekers hebben gevonden dat ASIC3 sterk verhoogd wordt door spier- en gewricht-ontsteking, die hyperalgesie  [verhoogde gevoeligheid voor pijn] omvat. Dus suggereren we dat de primaire symptomen van CVS, vermoeidheid en spier-pijn, resulteren uit versterkte aktivatie van ‘vermoeidheid’- en ‘nociceptieve’ afferenten van spieren. Hieruit volgt dat verhoogde expressie van de molekulaire receptoren coderend voor metabolieten een merker zouden kunnen zijn voor verhoogde vermoeidheid en/of spier-pijn.

Het sympatisch zenuwstelsel (SZS), omwille van zijn belangrijke rol bij het reguleren van regionale doorbloeding in respons op de opstapeling van metabolieten in werkende spieren; en het immuunsysteem (IS), omwille van zijn vermogen om de gevoeligheid van perifere én centrale sensorische mechanismen te veranderen, zou ook kunnen bijdragen tot de symptomen van CVS en FMS. De hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as bleek ook betrokken bij de inductie en instandhouding van CVS. Dit zijn dezelfde systemen waarbij ontregelde genen werden gevonden gebruikmakend van micro-array analyse bij CVS-patiënten. [referenties: zie hierboven] Specifiek: (1) adrenerge receptoren kunnen veranderd zijn bij CVS en (2) immuun-cel cytokinen en receptoren zouden kunnen veranderd zijn bij CVS, alhoewel er veel tegenstellingen bestaan. (3) Ten slotte bleken polymorfismen in HPA-as receptor genen en ontregelde waarden van HPA-hormonen en expressie of HPA-as genen ook betrokken bij CVS.

Omdat circulerende immuun-cellen reageren op adrenerge agonisten en metaboliet-stijgingen in skelet-spieren, en omdat het IS betrokken is bij CVS, zochten we naar veranderingen in mRNA van metaboliet-detekterende, adrenerge en immuun-funktie genen uit leukocyten van CVS-patiënten en vergeleken die met mRNA-wijzigingen bij controle-individuen. Omdat vermoeidheid en spier-pijn bij CVS en FMS veel meer verergeren door fysieke inspanning dan bij controle-individuen, bekeken we gen-expressie vóór en na 25 minuten matige inspanning op tijdstippen vóór, tijdens en na, waar we verhoogde gen-expressie hadden gevonden in deze 3 systemen bij normale individuen bij maximale inspanning.

Initiële experimenten met normale individuen wezen er op dat mRNA voor metaboliet-detekterende (ASIC3, P2X4, P2X5, TRPV1), adrenerge (α-2A, β-1, β-2, COMT) en immune (IL6, IL10, TNF-α, TLR4, CD14) genen ge-upreguleerd waren 8 en 24 uur na ernstige inspanning. De mRNA-verhogingen keerden terug naar bijna normale waarden 48 uur na ernstige inspanning. [Light AR, Hughen RW, Zhang J, White A, Light KC, Jensen BT, Fitschen KL: Molecular receptors for pH found on sensory neurons are also found on mouse and human leukocytes and increase 8-48 hours post-exercise in both control-subjects and fibromyalgia and chronic fatigue patients. Soc Neurosci (2007) 510:3] Dit tijdsverloop van mRNA-stijgingen bevestigde de meldingen van ‘delayed onset muscle-soreness’ (DOMS) [spierpijn en/of stijfheid die met 24-48h tot 72h vertraging optreedt; wellicht veroorzaakt door micro-scheurtjes in spier-bindweefsel en cel-membraan] en vertraagde spier-moeheid bij deze normale individuen. CVS-patiënten rapporteren dat zelfs matige inspanning moderate die niet tot DOMS of spier-moeheid leidt bij normale individuen, fysieke moeheid en pijn van ten minste 48 uur of langer veroorzaakt. Daarom testten we de hypothesen dat 25 minuten matige inspanning de gen-expressie van eerder-genoemde genen zou verhogen, gemeten 8, 24 en 48 uur na inspanning bij CVS-patiënten maar niet bij normale individuen. Verder verzamelden we subjectieve metingen voor vermoeidheid en pijn, en maten enkele fysiologische inspanning-parameters om te bepalen of de wijzigingen qua gen-expressie gelinkt waren met vermoeidheid en/of pijn-symptomen bij CVS-patiënten en controle-individuen.

Methoden

Deelnemers

[…] Door het verlies van gegevens tijdens mRNA-analyses omvat het staal van jet huidige for rapport 19 CVS-patiënten (15 vrouwen) en 16 controle-individuen (11 vrouwen). […] Eén vrouwelijk controle-individu ontwikkelde fibromyalgie binnen het jaar na de testen en werd niet opgenomen analyses. Alle CVS-patiënten voldeden aan de CDC-criteria voor CVS (Fukuda et al. 1994). Voorafgaandelijk had de screening alle andere gekende oorzaken voor persistente of terugkerende vermoeidheid uitgesloten bij deze CVS-patiënten. Exclusie-criteria omvatten aktieve infekties van de bovenste luchtwegen; gebruik van corticosteroëden, SZS-agonisten of analgetica op voorschrift die het SZS, de HPA of cytokine-aktiviteit beïnvloeden; en/of ongecontroleerde cardiovasculaire of long-ziekte. Allen stopten dergelijke medicijnen 3 dagen vóór en 3 dagen tijdens het inspanning-protocol […]. Alle patiënten werden ook gescreend voor FMS met de ‘American College of Rheumatology’ (ACR) criteria […]. Dertien van de 19 CVS-patiënten (68%) voldeden ook aan de ACR-criteria voor FMS […]. Bij de primaire analysen werden alle 19 CVS-patiënten vergeleken met de 15 controle-individuen. In afzonderlijke secundaire analysen werden de 13 patiënten die voldeden aan CVS- én FMS-criteria vergeleken met controle-individuen. Omdat slechts 6 patiënten voldeden aan de criteria voor CVS zonder FMS ontbrak het ons staal aan voldoende statistische kracht om de effekten in deze subgroep te onderzoeken.

Protocol-overzicht

Alle deelnemers onthielden zich van formele inspanning buiten de vereiste inspanning-test gedurende een periode van 4 dagen, te beginnen 48 uur vóór de inspanning-test tot na de laatste (48 uur) bloed-afname. Veneus bloed (arm) werd afgenomen bij ‘baseline’ en 0,5 / 8 / 24 en 48 uur na inspanning. Om de ernst te bepalen van vooraf-bestaande en inspanning-gerelateerde vermoeidheid en myalgie-symptomen bij elke bloed-afname, tijdens en onmiddellijk na de inspanning, gaf elk individu numerieke waarden voor mentale vermoeidheid, fysieke vermoeidheid en algemene lichaamspijn op een schaal van 0 tot 100 […]. Meteen na de ‘baseline’ bloed-afname starten de deelnemers de inspanning.

Inspanning-protocol

[…] 25-minuten, ‘whole-body’ inspanning-test. Er werd de individuen gevraagd tijdens de eerste 5 minuten van de inspanning de pedaalslag te verhogen tot 70% van de leeftijd-voorspelde maximale hartslag was bereikt. Daarna werd de arbeid aangepast opdat deze hartslag gedurende het sub-maximale inspanning-protocol kon worden aangehouden. De ervaren inspanning [‘ratings of perceived exertion’, RPE] werd elke 5 minuten gemeten op een schaal van 1 tot 10; de hartslag werd elke minuut opgenomen en de bloeddruk bij ‘baseline’, elke 10 minuten gedurende de inspanning en bij het beëindigen van de inspanning. We kozen voor een volgehouden matige inspanning i.p.v. een maximale inspanning-test (die gewoonlijk slechts 5 tot 9 minuten duurt bij CVS-patiënten) omwille van de betere gelijkenis met de natuurlijke inspanning-ervaringen die in het dagelijks leven symptomen van CVS-patiënten verslechten. Onze 25 minuten durende sub-maximale inspanning-taak veroorzaakte consistente verergering van vermoeidheid en pijn-symptomen van 8 tot 48 uur na inspanning. In tegenstelling tot een kortere maximale inspanning-taak, waar meldingen van verslechtering van CVS-symptomen inconsistent of afwezig waren tot 5 dagen na de test, een patroon dat gewoonlijk niet wordt gezien in ‘real life’. Protocols met maximale inspanning hebben weinig verschillen aangetoond qua cardiorespiratoire en perceptuele responsen (bv. RPE) tussen CVS-patiënten en controle-individuen gematcht voor fitness. Het is echter opmerkelijk dat responsen op sub-maximale inspanning, inclusief VO₂, de inspanning-prestatie piek bij CVS-patiënten niet voorspellen.

mRNA Extraktie en Analyse

[…] Baseline-waarden voor elk gen werden berekend t.o.v. TF2B [Transcriptie-initatie-factor die een belanrijke rol speelt bij aktivatie van eukaryote genen; vertoont weinig intrinsieke variatie, stijgt of daalt niet door het inspanning-protocol.] en deze werden gebruikt als ijkpunt voor alle metingen na de inspanning-periode.

Complete Blood Cell Counts

[…] Groep-verschillen waren klein en zouden de mRNA-resultaten die hier worden gerapporteerd niet mogen beïnvloeden.

Statistische Analyse

[…]

Waarden na inspanning werden voor elke meting van gen-expressie eerst genormaliseerd ten opzichte van de baseline-waarden van het individu (1,00 = baseline). Om vals-positieve resultaten bekomen bij het onderzoeken van multipele uitkomsten te minimaliseren, ondernamen we 2 stappen. Ten eerste: in plaats van groep-verschillen afzonderlijk te onderzoeken bij elke van de 4 tijdspunten na inspanning, combineerden we ze tot één enkele meting, genaamd ‘area under the curve’ (AUC) [gebied onder de curve]. De AUC na inspanning voor elke gen-expressie meting werd berekend door het totaliseren van de waarden na 0,5 / 8 / 24 en 48 uur […]. Ten tweede: […] we groepeerden eerst onze AUC-metingen in 3 categorieën (metaboliet-detekterende merkers, adrenerge merkers en immune merkers) en […] onderzochten of er betrouwbare groep-verschillen voor elke van deze 3 waren. Er waren significante globale groep-effekten in de richting van grotere mRNA-stijgingen na inspanning bij CVS-patiënten vs controle-individuen […], wat ons dan toeliet groep-effekten te onderzoeken op elke specifieke AUC-meting […].

We onderzochten of groep-verschillen gerelateerd waren met verschillen qua leeftijd, geslacht of ‘body-mas-index’ (BMI) […]. In geen enkel geval was leeftijd of geslacht een significante factor, Terwijl BMI significant was voor 2 metingen: β-1 en β-2 AUC; dus werden de resultaten vóór én na aanpassing voor BMI voor deze metingen gerapporteerd. […]

Resultaten

Primaire Analysen

[…] Groepen verschilden niet qua leeftijd, bloeddruk of hartslag bij baseline of tijdens de inspanning-taak. Beide groepen behaalden de vooropgestelde 70% van de maximum door leeftijd voorspelde hartslag tijdens inspanning. De CVS-patiënten hadden een significant hogere BMI dan controle-individuen en ze rapporteerden significant hogere gemiddelde waarden van ervaren inspanning (RPE) zelfs al leverden ze significant minder arbeid dan controle-individuen.

[…] CVS-patiënten hadden significant hogere waarden voor vermoeidheid (fysiek en mentaal) en pijn dan controle-individuen zelfs bij baseline en deze verschillen bleven op alle andere tijdpunten. Er waren ook verhogingen voor deze 3 symptomen tijdens en na inspanning, vergeleken met baseline. Midden in de inspanning vertoonden controle-individuen én CVS-patiënten verhoogde waarden voor fysieke vermoeidheid maar enkel de CVS-patiënten bleven verhoogde fysieke vermoeidheid vertonen 0,5 / 8 / 24 en 48 uur na inspanning. Ook enkel de CVS-patiënten vertoonden significant verhoogde waarden qua pijn 8 / 24 en 48 uur en verhoogde mentale vermoeidheid 8  en 48 uur na inspanning.

Gen-expressie Metingen

Bij baseline was de expressie van β-2 adrenerge receptor significant lager bij CVS-patiënten vs controle-individuen, terwijl de expressie van α-2A adrenerge receptor verwaarloosbaar hoger (P < .09) was. Geen enkele van de andere gen-expressie metingen verschilde bij baseline tussen de groepen.

Zoals eerder beschreven gaven AUC-metingen na inspanning initieel significante groep-effekten voor metaboliet-detekterende genen, adrenerge genen en immune genen. Daaropvolgende statistische testen per variabele voor metaboliet-voelende merkers gaven significante groep-verschillen na inspanning – CVS en controles – voor ASIC3, P2X4 en P2X5 maar niet voor TRPV1. […] CVS-patiënten vertoonden consistent grotere gemiddelde stijgingen voor ASIC3, P2X4 en P2X5 gen-expressie dan controle-individuen op alle tijdpunten na inspanning. TRPV1 verhogingen vertoonden ook een consistente hoewel niet-significante trend tot verhoging in de CVS-groep.

Significante groep-effekten werden ook gezien voor alle adrenerge AUC merkers na inspanning, te wijten aan consistent grotere gemiddelde verhogingen α-2a, β-1 en β-2 adrenerge receptor expressie en hogere COMT gen-expressie bij de CVS-patiënten vs controles […].

Voor β-1 en β-2, waarbij BMI een significante invloed bleek te hebben, werd de statistische analyse herhaald met opname van BMI in het model. Groep-verschillen in AUC β-2 receptor expressie na inspanning waren nog steeds significant. Verrassend was dat opname van BMI in het model, de AUC toename in β-1 receptor expressie na inspanning, waarvoor de gemiddelde groep-verschillen groter waren geweest dan om het even welke gen-expressie merker, het groep-effekt niet-significant (P = .19) deed worden.

Voor immuun-merkers na inspanning toonde statische analyse met één variabele, significante groep-verschillen in TLR4 en IL-10 AUC expressie maar niet in CD14, IL-6 of TNF-α AUC expressie. CVS-patiënten vertoonden grotere stijgingen in TLR4 en IL-10 na inspanning dan controle-individuen.

Correlaties tussen post-exertionele vermoeidheid en pijn, en de AUC gen-expressie metingen na inspanning; samen met de inter-correlaties bij de gen-expressie metingen wezen er op dat stijgingen in metaboliet-detekterende receptoren, adrenerge receptoren en bepaalde immuun-merkers na inspanning in parallel gebeurden; en grotere stijgingen bij al deze receptoren waren geassocieerd met grotere vermoeidheid. Pijn-symptomen na inspanning waren niet geassociaeerd met verhogingen in P2X4, P2X5, β-1 of TLR4 receptor expressie maar waren gelinkt met ASIC3, TRPV1, α2-A, β-2 en IL-10 stijgingen. Interessant was dat bij de CVS-patiënten de inspanning-arbeid niet correleerde met vermoeidheid, pijn of toename in eender welke metaboliet-detekterende of immuun-merker na inspanning, en omgekeerd was gerelateerd met de toename in β-1 en β-2 AUC receptor expressie.

Secundaire Analyses

Hoewel hartslag en percentage van door de leeftijd voorspelde maximum hartslag redelijk dicht bij elkaar lagen voor de groepen tijdens inspanning, leverden de controle-individuen meer arbeid dan CVS-patiënten. Wanneer we echter onze univariate statische analyse voor AUC gen-expressie na inspanning herhaalden – waarbij groepen met arbeid als een co-variabele werden vergeleken – vonden we dat het geen significante co-variabele voor om het even welke meting was uitgenomen voor β-1 receptor expressie (P < .02). Zoals met de inclusie van BMI als co-variabele, speelde arbeid een rol bij het significant worden van het groep-effekt voor β-1 AUC receptor expressie na inspanning. Dit patroon wijst er op dat een hoge BMI, lage verrichtte arbeid en stijgingen in β-1 receptor expressie na inspanning alle met elkaar zijn verbonden bij CVS.

Univariate statische analyse werd ook herhaald na weglaten van de 6 CVS-patiënten die niet voldeden aan de ACR criteria voor FMS. De bevindingen waren in essentie niet veranderd van deze gerapporteerd hierboven, uitgezonderd wat betreft de immuun-receptor, TLR4; verschillen tussen CVS/FMS-patiënten en controle-individuen waren marginaal verschillend (P=.07) voor dit gen. Voor alle andere metingen waar significante groep-verschillen werden gezien bij de primaire analyses, toonden dezelfde metingen significante verschillen tussen de CVS/FMS-patiënten en controle-individuen. Hoewel de grootte van de groep patiënten met CVS (n = 6) onvoldoende was om apart te onderzoeken, waren de gemiddelde AUC-metingen voor deze subgroep na inspanning in de meest gevallen gelijkaardig […] met die van de CVS/FMS-subgroep, met uitzondering van ASIC3 en TRPV1 stijgingen.

Om de kwestie van de verschillen qua fitheid te adresseren, werden statistische analyses die AUC-metingen na inspanning herhaald na weglating van de meest fitte controle-individuen en de minst fitte CVS-patiënten. De overblijvende 11 controle-individuen (9 vrouwen) en 10 patiënten (8 vrouwen) werden gematcht voor de geleverde arbeid nodig om 70% van de maximum voorspelde hartslag te bereieken. Deze subgroepen verschilden niet qua leeftijd, BMI, arbeid tijdens inspanning, of enige BP- of HR-meting vóór of tijdens inspanning. Niettemin vertoonden de voor fitness gematchte CVS-patiënten nog steeds grotere of marginaal grotere stijgingen dan controle-individuen na inspanning voor ASIC3 (P < .036), P2X4 (P < .07), P2X5(P < .028), β-1 (P < .045), β-2 (P < .002), COMT (P < .085) en IL-10 (P < .006), en enkel de TLR4 verschillen waren tenietgedaan. Ondanks inspanning met dezelfde arbeid, rapporteerden de patiënten ook nog steeds grotere waargenomen uitputting tijdens de taak (RPE = 4.65 vs 2.95, P < .001).

Om te onderzoeken of de tijd van staalname een belangrijke factor was, werden bijkomende statistische analyses uitgevoerd, met groep en tijd (0,5 / 8 / 24 en 48 uur na inspanning) als factoren […]. Dezelfde eerder gemelde groep-effekten werden met deze benadering bekomen, en geen effekten betreffende tijd waren significant, wat suggereert dat CVS-patiënten op dezelfde manier van controle-individuen verschilden bij alle staalnamen.

Bespreking

Belangrijkste Bevindingen

Baseline mRNA-waarden waren niet verschillend tussen controle-individuen en CVS-patiënten voor geen enkele van de metaboliet-detekterende of immuun-genen. Bij de adrenerge metingen was baseline β-2 lager en baseline α-2A had neiging tot hogere waarden bij de CVS-patiënten. Hoewel deze verschillen bij baseline bescheiden waren, zouden β-2 en verhoogde α-2A receptoren in de vasculatuur [het bloedvatenstelsel] kunnen leiden tot verhoogde totale vasculaire weerstand; zoals we rapporteerden [Light KC, Bragdon EE, Grewen KM, Brownley KA,Girdler SS, Maixner W: Adrenergic dysregulation and pain with and without acute beta-blockade in women with fibromyalgia and temporomandibular disorder. J Pain (2009) 10:542-552] voor patiënten met FMS. Geen enkele eerdere studie heeft metaboliet-detekterende gen-expressie onderzocht en vroegere studies die immuun-funktie gen-expressie vergeleken bij CVS-patiënten vs controle-individuen in rust hebben ook weinig consistente verhogingen gemeld van deze mRNAs met uitzondering van of TNF-α.

In tegenstelling tot de zeer weinige groep-verschillen bij baseline, vertoonden CVS-patiënten grotere mRNA stijgingen dan gezonde controle-individuen voor de meerderheid van de metaboliet-detekterende, adrenerge en immuun-funktie genen die hier werden onderzocht na 25 minuten matige’ whole-body’ inspanning (opgtelde waarden na 30 minuten, 8, 24 en 48 uur na inspanning). Bij deze milde inspanning vertoonden gezonde controle-indviduen geen significante verhogingen t.o.v. baseline qua expressie van deze genen, terwijl CVS-patiënten stijgingen openbaarden qua expressie van ASIC3, P2X4, P2X5, α-2A, β-1, β-2, COMT, IL10 en TLR4 die de responsen van de controle-individuen overstegen. TRPV1-expressie steeg bij CVS-patiënten significant boven baseline-waarden, terwijl de verschillen voor de controle-groep een niet-significant trend vertoonden voor deze meting.

Groepen verschilden ook niet qua verhoogde expressie van IL6 of TNF-α. Hoewel gen-expressie van IL6 en TNF-α boven baseline gestegen waren na inspanning in de CVS-groep, vertoonden controle-individuen gelijkaardige verhogingen na inspanning. Deze CVS-patiënten en controle-individuen vertoonden gelijkaardige verhogiugen qua circulerend IL6 en TNF-α [White AT, Light AR, Hughen RW, Bateman L, Martins TB, Hill HR, Light KC: Severity of symptom-flare after moderate exercise is linked to cytokine activity in Chronic Fatigue Syndrome. Psychophysiology (in press) 2009] in serum na inspanning – wat ook door anderen werd gerapporteerd. Andere studies hebben er op gewezen dat, hoewel serum-waarden van IL6 en TNF-α waren verhoogd na inspanning, mRNA-expressie in leukocyten niet was gestegen voor deze 2 cytokines. Cytokine mRNA uit spieren na inspanning (in tegenstelling tot leukocyten) vertoonde echter geen verhoogd TNF-α mRNA. Onze [hierboven aangehaalde] studie observeerde ook dat IL10 in het serum feitelijk daalde na inspanning bij controle-individuen (die geen veranderingen vertoonden qua IL10 mRNA) maar niet daalde bij CVS-patiënten (wiens IL10 mRNA steeg).

Verrassend was dat we een trend voor mRNA-stijgingen bij patiënten zagen al na 30 minuten na inspanning, meerdere uren eerder dan we stijgingen bij controle-individuen na inspanning aan hoge intensitieit hadden gezien [Light AR, Hughen RW, Zhang J, White A, Light KC, Jensen BT, Fitschen KL: Molecular receptors for pH found on sensory neurons are also found on mouse and human leukocytes and increase 8-48 hours post-exercise in both control-subjects and fibromyalgia and chronic fatigue patients. Soc Neurosci (2007) 510:3]. Verhogingen van mRNA, met uitzondering van β-1, werden niet beïnvloed door BMI of geleverde arbeid, en waren aanwezig bij CVS-patiënten met én zonder co-morbide FMS. Het volgende onderlijnt de relatie tussen de primaire symptomen die CVS definiëren: er werden sterke correlaties gevonden tussen de opgetelde scores voor fysieke en mentale vermoeidheid na inspanning, en de opgetelde verhogingen qua mRNA van de genen. Sterke correlaties werden evenzeer gevonden tussen opgetelde scores voor pijn na inspanning en ASIC3, TRPV1, α-2A, β-2 en IL10 stijgingen. Van ASIC3, TRPV1 en β-2 werd recent aangetoond dat ze een rol spelen bij spier-pijn.

Het feit dat 68% van de patiënten in ons staal voldeden aan de criteria voor CVS én FMS is ietwat problematisch omdat we nog niet kunnen onderscheiden of de geobserveerde responsen typisch zijn voor alle CVS-patiënten of slechts voor de subgroep die beide aandoeningen heeft. De huidige gegevens wijzen er op dat de groep patiënten die niet voldeden aan de criteria voor FMS (‘enkel CVS’ groep) gemiddele AUC en varianties hadden die gelijkaardig zijn met de CFS-FMS groep voor de meeste van de 13 genen die hier werden onderzocht. Opmerkelijke uitzonderingen waren ASIC3 en TRPV1, die de neiging hadden om kleinere stijgingen te vertonen bij de ‘enkel CVS’ groep. Hoewel de meeste van de gen-veranderingen toepasbaar zijn op beide groepen, zijn er dus mogelijks gen-veranderingen die deze 2 groepen onderscheiden. Onze huidige research heeft de bedoeling een uitgebreid sub-staal van patiënten met ‘alleen-CVS’ te onderzoeken om deze belangrijke kwestie op te helderen.

Het is van belang te melden dat ‘complete blood counts’ (CBC) werden afgenomen bij alle patiënten en controle-individuen op elk tijdpunt. Bij baseline, vóór inspanning, waren […] het totaal aantal witte bloed-cellen bij CVS-patiënten lichtjes hoger dan bij controle-indviduen en in het bijzonder: het aantal monocyten, eosinofielen en granulocyten was hoger voor de patiënten-groep. Tellingen bij patiënten en controle-individuen waren significant verhoogd, in vergelijking met ‘baseline’, 8 uur na inspanning maar keerden terug naar baseline-waarden na 24 en 48 uren. Haemoglobine-waarden waren echter lager bij patiënten dan bij controle-individuen en daalden na 8 uur. Deze tegenstrijdige effekten bij witte vs rode cel-tellingen wijst er op dat hydratatie-verschillen niet verantwoordelijk waren. Deze CBC-verschillen waren niet klinisch significant en gelijkaardige verschillen werden reeds eerder gemeld.

mRNAs als Biomerkers voor Vermoeidheid, Spier-pijn, CVS en FMS

De uitgesproken veranderingen qua gen-expressie in circulerende leukocyten van CVS-patiënten na inspanning suggereren dat deze zouden kunnen worden aangewend als objectieve merkers voor CVS. Kerr besprak potentiële biomerkers voor CVS inclusief meerdere micro-array experimenten die gen-expressie bekeken bij grote aantallen genen van leukocyten. Sakai et al. [Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker-genes for differential diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med (2008) 14:599-607] stelde ook dat mRNA-veranderingen in 9 leukocyten-genen (geselekteerd uit 1.400 stress-gerelateerde genen) mogelijke biomerkers voor CVS waren. Geen enkele van de genen geïdentificeerd als specifiek voor 1 of meerdere subtypes van CVS in deze publicaties waren deze die hier werden onderzocht. De funktionele groepen van genen gevonden met de micro-array experimenten waren echter gelijkaardig aan deze die hier werden gemeten. Immuniteit en verdediging, energie-metabolisme, signaal-transductie en ion-kanaal genen werden allemaal geïdentificeerd in vroegere experimenten. Al de genen in het huidige rapport kunnen worden ondergebracht in 1 of meerdere van deze groepen.

In de huidige populatie kon ca. 90% van de CVS-patiënten worden onderscheiden van controle-indivduen door gebruik te maken van 4 van de bestudeerde genen (P2X4, β-1, β-2, IL10). Als alle van de 9 genen die verhoogd waren bij CVS/FMS-patiënten vs controles werden gebruikt, bleken de resultaten gelijkaardig. We kunnen echter nog niet besluiten dat gen-expressie veranderingen na matige inspanning specifieke biomerkers zijn voor CVS.

Mogelijks kunnen enkele van de genen die hier werden gebruikt andere oorzaken van overdreven vermoeidheid na inspanning onderscheiden en/of andere genen zouden kunnen worden aangewend om gekende oorzaken van vermoeidheid, zoals virale infekties, abnormaliteiten van het metabolisme, enz. te vinden. Een eenvoudige bloed-test die een objectieve meting biedt voor overmatige en invaliderende vermoeidheid, zou diagnostisch waardevol zijn voor artsen en patiënten met CVS (of chronische vermoeidheid door andere oorzaken). Daarenboven zouden dergelijke testen subtypes van CVS, en de verschillende contribuerende ontregeling(en) betrokken bij elk van die subtypes, kunnen helpen afbakenen. Uiteindelijk zouden deze testen kunnen worden gebruikt om het succes van verscheidene behandelingen voor chronische vermoeidheid en fibromyalgie syndromen objectief te evalueren.

Funktie van Genen waarvan de Expressie was Gewijzigd bij CVS-patiënten vergeleken met Controle-individuen

We onderzochten het mRNA van meerdere receptoren die zelden werden beschreven bij witte bloed-cellen, vooral deze die essentieel zijn voor het detekteren van metabolieten geproduceerd door sensorische neuronen bij inspanning [zie ‘Spier-metaboreceptoren’]. ASIC3, P2X4, P2X5 en TRPV1 (telkens mRNA én proteïne) werden gevonden in monocyten. De funktie van ASIC3, P2X4 en TRPV1 receptoren in leukocyten is niet gekend maar zou verbonden kunnen zijn met de recrutering van monocyten en lymfocyten die voorkomt na inspanning. Het ontbreekt het P2X5-eiwit bij de meeste mensen aan het essentieel stuk van het porie-vormend deel van het kanaal, zo dat het niet in staat is om ionen te pompen en waarschijnlijk ook niet om te worden ingevoegd in het plasma-membraan. […]

β-Adrenerge receptoren zijn normal geassocieerd met cardiovasculaire funktie. Van aktivatie van β-1 receptoren is geweten dat het de hartslag en -samentrekbaarheid verhoogt, en aktivatie van β-2 receptoren zorgt voor dilatatie van arterieën en arteriolen die de skelet-spieren voeden. Deze receptoren spelen een belangrijke rol bij het onderhouden van een voldoende doorbloeding van skelet-spieren tijdens inspanning en vermijden overmatige accumulatie van metabolieten. β-2-adrenerge receptoren kunnen ook de SZS effekten op het IS mediëren. Minder zekerheid bestaat over effekten van α-adrenerge receptoren op circulerende immuun-cellen. Onze resultaten tonen dat leukocyten substantiële adrenerge α2-A, β-1 en β-2 receptor mRNAs hebben, zowel als hoge waarden aan COMT mRNA – een belangrijk enzyme betrokken bij de inaktivering van epinefrine and norepinefrine. Polymorfismen in COMT bleken betrokken bij depressie en een aantal pijn-aandoeningen. Inspanning verhoogde het mRNA van al deze genen met adrenerge funktie bij CVS-patiënten veel meer dan bij in controle-individuen. Deze uitermate versterkte upregulering suggereert krachtige upstream signalisering naar het IS bij CVS.

IL10 mRNA was ge-upreguleerd na inspanning bij CVS-patiënten vergeleken met controle-individuen. IL10 is een anti-inflammatoir cytokine dat de produktie van pro-inflammatoire cytokinen zoals TNF-α inhibeert. De toename van IL10 mRNA die hier werd geobserveerd is consistent met een melding die suggereert dat bij FMS-patiënten een anti-inflammatoir profiel tot expressie komt dat gerelateerd zou kunnen zijn met enkele van hun symptomen. Onze patiënten hadden gestegen serum-waarden voor anti-inflammatoir IL10 en IL13 8 uur na inspanning maar enkel bij deze met CVS die meer en langer vermoeidheid en pijn rapporteerden. Deze patiënten vertoonden echter ook verhogingen qua pro-inflammatoir IL1β, IL8 en IL12 zowel als IL6, wat algemene immuun-aktivatie suggereert. Het mRNA voor TLR4 was ook verhoogd door inspanning bij CVS-patiënten maar niet bij controle-individuen; hoewel dit verschil bij de subgroepen gematcht voor fitness afwezig was, wat suggereert dat het te wijten was aan de verminderde fitheid bij de CVS-groep. TLR4 is een immuun-funktie receptor die bakteriële invasie signaleert door het detekteren van de lipopolysaccharide-mantel van bakteriën. Het is van belang bij de preventie van infektie.

Implicaties van Ontregelde mRNAs voor CVS

Stijgingen in mRNA kunnen worden veroorzaakt door gestegen transcriptie en/of verhoogde stabiliteit van mRNA (verminderde afbraak). Transcriptie én stabiliteit kunnen worden gewijzigd door omgeving-factoren. Voor de meeste van de hier onderzochte genen zijn transcriptionele veranderingen via gekende transcriptie-factoren gedocumenteerd. Regulering van deze genen door RNA-modulerende factoren is ook aannemelijk. De correlaties tussen veranderingen in veel van de geteste genen suggereert dat courante upstream transcriptie-factoren [eiwit dat bindt op specifieke DNA-sequenties en de transcriptie regelt; upstream betekent dat ze binden vóór de initiatie-plaats] geaktiveerd kunnen zijn bij CVS-patiënten. Deze bevindingen ondersteunen ook eerdere studies die interaktieve wijzigingen tussen SZS, IS en sensorische systemen bij CVS suggereren.

Bewijs dat Metaboliet-detektie en Adrenerge Betrokkenheid bij Verhoogde Vermoeidheid bij CVS Ondersteunt

De snelle en aanhoudende verhogingen qua mRNA van sensorische genen (ASIC3, P2X4, P2X5) en adrenerge β-1 en β-2 receptoren zowel als sterke correlaties tussen deze receptoren bij CVS-patiënten na matige inspanning, suggereren een mogelijk mechanisme voor het kenmerkende symptoom van CVS, sensorische vermoeidheid, en zijn versterking na inspanning. Wijzelf en anderen ontdekten dat ASIC3 en P2X5, en mogelijks P2X4 en TRPV1, op sensorische neuronen van spieren, samenwerken om de metabolieten geproduceerd bij spier-samentrekking – die kunnen leiden tot de signalisering van spier-moeheid en pijn – te detekteren. Als het aantal van deze receptoren sterk verhoogd zou zijn in deze sensorische neuronen, zouden basale waarden van metabolieten sensorische vermoeidheid afferenten kunnen aktiveren, en zo een continu signaal van sensorische vermoeidheid in de spieren kunnen zenden naar het centrale SZS en ontregeling van SZS-reflexen veroorzaken, en naar het centraal zenuwstelsel – aanleiding gevend tot de cognitieve herkenning van versterkte vermoeidheid.

Ander werk in ons laboratorium suggereert dat β-adrenerge receptoren op sensorische neuronen een rol spelen bij sensorische vermoeidheid van de spieren én spier-pijn. Ten eerste: bij muizen met ontstoken spieren reageren afferente neuronen in de spieren op veel lagere concentraties metabolieten als β-agonisten samen met de metabolieten worden aangewend (Light AR, ongepubliceerde observaties). Ten tweede: adrenerge β-1 en β-2 receptor mRNAs waren ge-upreguleerd in ‘dorsal root ganglia’ [zie ‘Spier-metaboreceptoren’] van mannelijke muizen 24 uur tot 8 dagen na inflammatie van skeletspieren van de achterpoot door carrageenan [polysaccharide uit zeewier]. [Light AR, Hughen RW, Zhang J: Increases in receptor mRNA in mouse dorsal root ganglion (DRG) neurons following carrageenan induced inflammation of mouse hindlimb muscle. Soc Neurosci (2008) 174:16] Ten derde: klinische pijn werd snel verminderd bij patiënten met FMS of ‘temporomandibular disorder’ [TMD; aandoening van het scharniergewricht in de kaak gepaard gaan met pijn e.a. symtomen] wanneer de a-specifieke β-antagonist propranolol werd toegediend in lage dosissen. [Light KC, Bragdon EE, Grewen KM, Brownley KA, Girdler SS, Maixner W: Adrenergic dysregulation and pain with and without acute beta-blockade in women with fibromyalgia and temporomandibular disorder. J Pain (2009) 10: 542-552] Ten slotte sugeereerden Khasar et al. een mechanisme van het SZS en de hypothalamus-hyspofyse-bijnier as (HPA) waarbij stress zou kunnen bijdragen tot hyperalgesie gemedieerd door adrenerge en hormoon-receptoren op sensorische neuronen. Al deze gegevens suggereren dat β-adrenerge receptoren op sensorische afferenten van spieren de metaboliet-signalen kunnen versterken, in het bijzonder bij patiënten met FMS. Als de upregulering van mRNA voor sensorische en adrenerge receptoren geobserveerd in leukocyten bij CVS-patiënten ook voorkomt in de sensorische afferenten van hun spieren (sensorische vermoeidheid afferenten), kunnen CVS-patënten dus een versterkt sensorisch signaal voor vermoeidheid hebben dat verder wordt verhoogd na inspanning. De gelijkaardige transcriptionele controle voor al deze molekulaire receptoren kan ook verklaren waarom een groot percentage CVS-patiënten ook FMS hebben. Omdat de sensorische afferente neuronen die sensorische vermoeidheid van spieren en spier-pijn detekteren enigzins verschillende combinaties van molekulaire receptoren gebruiken die differentieel geregeld worden, zouden patiënten echter sensorische spier-vermoeidheid én spier-pijn, of elk symptoom onafhankelijk van elkaar kunnen ervaren.

Een andere mogelijkheid is dat leukocyten dezelfde sensorische receptoren gebruiken om metabolieten geproduceerd bij spier-samentrekking te detekteren. Als deze receptoren verhoogd zijn bij CVS-patiënten, is het mogelijk dat lage waarden aan metabolieten leukocyten kunnen aktiveren, en matige inspanning zou het signaal kunnen versterken, waarbij cytokine-waarden, die sensorische afferenten sensitiseren die vermoeidheid van spieren signaliseren, verhogen. Aanzienlijk bewijs voor cytokine-sensitisatie van sensorische afferenten bestaat. Dit en het voorgaande mechanisme kunnen samenwerken.

Versterking van perifere sensorische signalen, wat deze hypothesen ondersteunt, werd aangetoond bij patiënten met FMS en CVS. Omdat het signaal voor sensorische vermoeidheid van spieren waarschijnlijk de SZS-reflexen aktiveert, die normaal toereikende bloed-doorstroming naar de hersenen en de skelet-spieren onderhouden, kan een tonisch [tegengesteld van fasisch] signaal van vermoeidheid-afferenten leiden tot SZS-ontregeling omdat vasculaire adrenerge receptoren van gladde spieren desensitiseren door de aanhoudende afgifte van catecholaminen. Deze ontregeling zou kunnen leiden tot zuurstof-tekort in de spieren en perioden van verhoogde metabolieten die de sensorische receptoren verder zouden aktiveren. Het zou ook kunnen leiden tot orthostatische intolerantie die dikwijls geassocieerd is met CVS. Interessant is dat ASIC3, P2X en TRPV1 receptoren betrokken bleken bij versterkte signalen van de darm in dier-modellen voor prikkelbare darm syndroom en dat TRPV1 geassocieerd is met multipele chemische gevoeligheid. ASICs werden ook geassocieerd met veranderingen in het gehoor en hyperacusis werd ook geassocieerd met CVS en FMS. Misschien kan courante regulering van de transcriptie van deze receptoren voorkomen in een aantal weefsels, wat zou resulteren in enkele van de co-morbiditeiten die gewoonlijk voorkomen bij CVS.

Ten slotte kan langdurige aktivatie van sensorische receptoren leiden tot sensitisatie van ruggemerg- en hersen-systemen die vermoeidheid-signalen overbrengen, wat langdurige versterking van vermoeidheid in het CZS zou veroorzaken. Dergelijke wijzigingen in hersen-transmissie werden aangetoond bij chronische pijn en bij CVS en FMS.

Besluiten

De experimenten die hier worden gerapporteerd tonen dat 25 minuten matige inspanning grote en snelle stijgingen genereren qua gen-expressie in leukocyten van CVS-patiënten maar niet bij controle-individuen. Er werden stijgingen van mRNA gevonden voor genen die verhogingen kunnen detekteren in door spieren geproduceerde metabolieten (ASIC3, P2X4, P2X5), genen die essentieel zijn voor SZS-processen (adrenerge α-2A, β-1 en β-2, zowel als COMT) en immuun-funktie genen (IL10 en TLR4). Deze bevindingen bevestigen eerdere hypothesen die suggereren dat wijzigingen in alle delen van de HPA-as symptomen van CVS en FMS kunnen mediëren en bestendigen. Deze gen-veranderingen suggereren een mogelijke rol voor wijzigingen qua perifere sensorische signalisering bij de symptomen van CVS, zoals werd voorgesteld bij FMS. Ze suggereren ook dat een bloed-test zou kunnen worden ontworpen als een objectieve biomerker voor sensorische spier-vermoeidheid en spier-pijn bij CVS.

Nog even over de schijnbare tegenstrijdigheid (zie ‘Resultaten’:) “TRPV1 verhogingen vertoonden ook een consistente alhoewel niet-significante trend om hoger te zijn in de CVS-groep.”  versus (zie ‘Bespreking’:) TRPV1 expressie verhoogde enkel bij CFS-patiënten significant boven baseline.”… Prof. Light verduidelijkt (persoonlijke communicatie): “Het lijkt contradictorisch maar is het niet. TRPV1 verhoogde niet significant bij de CVS-patiënten (alle CVS-patiënten, met én zonder FMS) vergeleken met controles. TRPV1 verhoogde echter signficant boven baseline bij de CVS-patiënten (alle CVS-patiënten, met én zonder FMS). Uit de gegevens van het groter staal waarover we nu beschikken, blijkt dat de reden voor deze statistische anomalieën is dat de ‘enkel CVS’ patiënten bijna geen verschil vertonen qua TRPV1 verhogingen in vergelijking met controles. Alle verschillen lijken te wijten aan de toevoeging van fibromyalgie bij de ‘CVS+FMS’ patiënten.”

Inspanning-responsieve genen bij CVS

In zijn commentaar op gen-expressie onderzoek (zie ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’) liet Prof. Pall noteren dat de zoektocht naar specifieke biomerker-testen volgens hem zou moeten focussen op specifieke responsen op inspanning, responsen waar M.E.(cvs)-patiënten verschillen van normale controles. Het meest specifieke symptoom van M.E.(cvs) is de zogenaamde post-exertionele malaise, waarbij inspanning het hele spectrum van symptomen die kenmerkend zijn voor M.E.(cvs)-patiënten upreguleert. Onderstaande studie heeft zich eerder al gericht op inspanning-responsieve genen…

Het ‘Gen Ontologie’ projekt (zie methodiek) [Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM et al.: Gene-ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000, 25: 25-29] is een belangrijk bio-informatica initiatief met het doel de voorstelling van genen en gen-produkten bij verschillende species en databases te standardiseren. Het projekt voorziet een gecontroleerd vocabularium met termen die gen-produkt karakteristieken en gegevens van leden van het ‘GO Consortium’ beschrijven, alsook instrumenten om toegang te krijgen tot deze data en ze te verwerken. (www.geneontology.org).

Ion-kanalen zijn kleine kanaaltjes in de celwanden, proteïnen die het kleine voltage-verschil op het plasma-membraan controleren en die er voor zorgen dat ionen (zo zijn er natrium-, kalium-, calcium- en chloor-kanalen) van buiten naar binnen en van binnen naar buiten worden gepompt. Kanalopathieën zijn ziekten (genetisch bepaald of verworven) veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanaal subunits of de proteïnen die ze reguleren. Bij spieren geven ze aanleiding tot een overprikkelbaarheid van de spiervezel of een verminderde prikkelbaarheid, leidend tot spierzwakte. De prikkelbaarheid van de celwand wordt gereguleerd door zogenaamde voltage-afhankelijke ion-kanalen: de aktiviteit van deze kanalen is afhankelijk van de stroomspanning. ‘Voltage-gated’ ion-kanalen zijn een klasse trans-membraan ion-kanalen die worden geaktiveerd door veranderingen in het elektrisch potentiaal verschil bij dit kanaal en geven aanleiding tot elektrische signalen; ze zijn bijzonder belangrijk in zenuw- en spiercellen maar komen in veel cellen voor.

ATPase katalyseert de reaktie: ATP + H₂O = ADP + fosfaat. Het betreft een groep enzymen die werken als pomp en daarbij het energierijke ATP omzetten in ADP of andersom. Er zijn verschillende typen ATPasen: P-type ATPasen verbruiken ATP (Na⁺K⁺-ATPasen wisselen natrium-ionen uit voor kalium-ionen waardoor een lage Na⁺-concentratie en een hoge K⁺-concentratie binnen de cel ontstaat en een transmembraan-potentiaal wordt gecreëerd; H⁺K⁺-ATPasen zorgen voor de lage zuurgraad in de maag; Ca²⁺-ATPasen zorgen voor een lage intracellulaire calcium-concentratie in spiercellen.), F-type ATPasen zorgen voor de aanmaak van ATP uit ADP en anorganisch fosfaat (mitochondrieën) en V-type ATPasen gebruiken ATP om protonen (H⁺) te pompen naar een compartiment met een hoge zuurgraad. Bij M.E.(cvs) werd een significante inhibitie van de RBC-membraan Na⁺K⁺-ATPase aktiviteit gevonden [zie: ‘Dysfunktie van het Isoprenoid Systeem bij M.E.(cvs)’].

De resultaten van deze studie tonen een groep van gen-ontologie categorieën die goed overéénkomen met funktionele groepen waarvan werd gevonden dat ze CVS van niet-vermoeide indviduen onderscheiden. Inspanning-responsieve genen verschilden tussen CVS-gevallen en controles. Dat was bij genen geklassificeerd in chromatine- en nucleosoom-opbouw, cytoplasmische vesikels, membraan-transport en G-proteïne gekoppelde receptor ontologieën. Verschillen qua ion-transport aktiviteit/ ion-kanaal aktiviteit waren evident bij aanvang en waren verhoogd na inspanning zoals bewezen door een groter aantal differentiële genen voor deze molekulaire funkties.

BMC Physiol. 2005 Mar 24;5(1):5

Exercise-responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control-subjects

Toni Whistler, James F. Jones, Elizabeth R. Unger and Suzanne D. Vernon

Viral Exanthems and Herpesvirus Branch, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

Achtergrond

In een gezonde toestand heeft fysieke inspanning een kwantificeerbaar effekt op neuro-endocriene, autonome en immuunsystemen die metabole en immuun-responsen beïnvloeden. In de initiële fase van acute ziekte is er echter een vermijden van fysieke stressoren opdat energie wordt voorbehouden voor het genezen en een terugkeer naar homeostase. Terwijl fysiologische stoornissen bij acute ziekte van voorbijgaande aard zijn, vertonen chronische ziekten – zoals Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) – langer stoornissen die een invaliderend effekt hebben, fysiologisch en psychologisch. Aktiviteiten die fysiologische stressoren zijn, zoals fysieke inspanning, verergeren bijgevolg de symptomen die CVS definiëren.

[…]

Misschien wel het grootste methodologisch probleem bij het bestuderen van CVS is dat veel individuen die werden geïdentificeerd bij populatie-studies al ten minste 5 jaar ziek zijn. Gedurende die tijd ‘komt en gaat’ de ziekte, waardoor het moeilijk wordt biomerkers te identificeren of de pathogenese te definiëren. Fysieke, mentale en emotionele stress verergeren CVS en resulteren in de definiërende post-exertionele vermoeidheid met meetbare fysiologische verschillen. Daarom is inspanning van mensen met CVS een effektieve methode om CVS-individuen te controleren en zodoende de waarschijnlijkheid van uniform identificerende biomerkers en/of fysiologische abnormaliteiten te verhogen.

We gebruikten gen-expressie profilering van perifeer bloed om verschillen tussen CVS-individuen en sedentaire gezonde controles voor en na een inspanning te evalueren. Globaal vonden we dat de gen-expressie profielen vrij gelijkaardig waren en, belangrijk, dat de meeste verschillen aanwezig waren vóór de inspanning. Die verschillen lagen bij G-proteïne gekoppelde receptor [GPCR: een grote proteïnen-familie trans-membraan receptoren die molekulen buiten de cel ‘voelen’ en in de cel signaal-transductie mechansimen aktiveren; uiteindelijk worden daardoor cellulaire responsen in gang gezet], en ion-transport en ion-kanaal aktiviteit ontologieën. De laatste bleek verhoogd na inspanning, zoals aangegeven door de differentiële expressie van een groter aantal genen betrokken bij molekulaire funkties. Verschillen bleken ook evident bij inspanning-respons; inclusief chromatine- en nucleosoom-assemblage, [chromatine (complex van DNA en eiwitten in de celkern) -assemblage is een belangrijk proces dat nauw verbonden is met DNA-replicatie, het laat de cel toe de chromosomen correct te dupliceren; een nucleosoom is een complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt, een onderdeel van een ckromatine-ketting] cytoplasmische vesikels [kleine membraan-blaasjes die kunnen versmelten met het cel-membraan zodat de stof die ze bevatten kan vrijkomen], membraan-transport en G-proteïne gekoppelde receptor ontologieën. Deze verschillen kunnen de symptomen van CVS helpen verklaren.

Methoden

Studie-individuen

[…] Vrouwen die ambulant een CVS vermoeidheid-kliniek bezochten, namen vrijwillig aan de studie deel. Allen voldeden aan de huidige definitie voor CVS [Fukuda ‘94] […]. Gezonde controles […] gematcht voor leeftijd, geslacht en aktiviteit-graad (sedentair tot matig aktief). […] Inspanningstest 5 tot 10 dagen na de eerste dag van hun menstruatie-cyclus. Alle individuen werden gevraagd geen inhalatie- of systemische corticosteroïden, anti-histaminen of anti-inflammatoire medicatie te gebruiken gedurende 7 dagen voor de inspanningstest. […] sub-maximale (70% van de voorspelde maximum arbeid), evenwichtige inspanning gedurende 20 minuten op een fiets-ergometer. […] Bloed-stalen werden afgenomen direct voor en 24 uur na inspanning. De selektie van de individuen voor de gen-expressie piloot-studie focuste op degenen zonder allergieën: 5 vrouwen met CVS en 5 vrouwelijke controles.

RNA-isolatie

[…]

Preparatie en hybridisatie van gelabeld cDNA

[…] Atlas Human 3.8I oligonucleotide glazen micro-chips (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) […].

Data-analyse

Voor-verwerking gegevens: […] Genen waarvan de expressie ten minste 1,5 maal verschilde van de mediaan bij ten minste 20% van de arrays [DNA-chips] werden behouden (3.699 genen), zodat genen die minimale variatie vertoonden over de set van arrays werden uitgesloten. Als een expressie-waarde ontbrak of was weggefilterd in meer dan 50% van de arrays, werd deze niet opgenomen; dit gaf een totaal van 3.682 genen voor analyse.

Analyse

We gebruikten meerdere analytische benaderingen om te zoeken naar differentiële expressie onder vier vooraf gedefinieerde klassen: controle-individuen vóór inspanning, controle-individuen na inspanning, CVS-individuen vóór inspanning en CVS-individuen na inspanning. Vergelijkingen omvatten gepaarde analyses van controles vóór versus na inspanning en CVS-gevallen vóór versus na inspanning. Daarenboven onderzochten we controles versus CVS-individuen vóór inspanning (baseline) en controles versus CVS-individuen na inspanning.

Analytische bendaring 1: De meer gangbare benadering gebruikt voor micro-chip gen-expressie analyse is vaststellen of gen-expressie profielen verschillen tussen individuen in vooraf-bepaalde klassen en de genen identificeren die verantwoordelijk zijn voor de verschillen. De ‘Class Comparison’ analyse-methode [hier aangewend] gebruikt deze benadering met toepassing van een willekeurige variantie t-test [bepaalde statistische benadering om gegevens te verwerken]. Dit is een verbetering […] aangezien het toelaat informatie over intra-klasse variatie onder genen te delen zonder aan te nemen dat alle genen dezelfde variantie [Maat voor de spreiding van de verschillende metingen in een onderzoek; d.i. de mate waarin de waarden onderling verschillen. Hoe groter de variantie, hoe meer de afzonderlijke waarden onderling verschillen en dus ook hoe meer de waarden van het gemiddelde afwijken.] hebben. Het is een aan te raden wijziging als de aantallen stalen per klasse klein zijn. Genen werden statistisch significant beschouwd als de p-waarde minder dan 0.005 was. Daarna werd een multivariate permutatie-test [statische test] uitgevoerd om te bepalen of de expressie-profielen verschilden tussen de klassen […].

Het EASE software-pakket werd dan gebruikt om de biologische significantie te evalueren van de ontologie van genen met differentiële expressie geïdentificeerd via klasse-vergelijking. EASE voert een statistische analyse uit van gen-categorieën in een genen-lijst met betrekking tot alle genen op de chip en berekent een variant van de standaard ‘Fisher exact probability’ [test voor statistische significantie], genaamd de EASE-score. De meest significante categorieën, zoals aangegeven met de EASE score, worden beschouwd als ‘themas’ van de genen-lijst. Deze themas corresponderen met de systematische en getandardiseerde nomenclatuur ontwikkeld door het ‘GO (Gene Ontology) Consortium’ [Gene-ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000, 25: 25-29]. De drie organiserende principes van ‘GO’ zijn molekulaire funktie, biologisch proces en cellulaire component, en momenteel zijn reeds 22.665 menselijke gen-produkten opgenomen. De associatie van genen met gerelateerde ‘GO’-termen draagt bij tot de interpretatie van expressie-patrnonen. Een ‘GO’-categorie omvat genen die worden beschreven door die term [benaming] en deze opgenomen in eender welke subset (of ‘afstammelingen’) van die ‘GO’-term. Een gen kan gecategoriseerd zijn in meer dan één ontologie-categorie.

Om de afzonderlijke gen-clusters te tonen, voerden we een twee-weg hiërarchische cluster-analyse [Techniek om binnen een bepaalde populatie de te bestuderen onderzoeksobjecten (hier genen) te klassificeren op basis van overeenkomstige kenmerken.] uit bij de genen die werden geïdentificeerd via deze analytische benadering […].

Analytische bendaring 2: We gebruikten de Gen-Ontologie vergelijkingsmodule van BRB Array tools [software-pakket voor de visualisering en statistische analyse van DNA micro-array gen-expression data] als een tweede analytische benadering. Bij deze methode krijgen de genen ‘GO’-termen toegewezen voorafgaand aan de analyse. Voor elke ‘GO’-term werd het totaal aantal genen op de chip behorende tot die categorie bepaald. […] de p-waarden [significantie] werden berekend […]. Dit levert een lijst op met ‘GO’-categorieën die meer genen met differentiële expressie hebben onder de klassen dan per toeval kan worden verwacht. We beschouwden een GO-categorie differentieel gereguleerd als die significantie kleiner was dan 0.005. Alle ‘GO’-categorieën met tussen 5 en 100 genen vertegenwoordigd op de array werden bekeken.

Resultaten

Inspanning-respons genen werden geëvalueerd d.m.v. een willekeurige variantie t-test in een gepaarde, klasse-vergelijking van controle-individuen vóór en na inspanning; en 21 genen met een differentiële expressie werden geïdentificeerd. [Zie tabel (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/table/T2) - Lijst van genen met differentiële expressie bij controle-individuen na inspanning: De p-waarde is een maat voor de significantie.] De waarschijnlijkheid dat deze 21 genen per toeval, zonder echte verschillen tussen de groepen, zouden zijn geïdentificeerd was 0,056 […]. Van de 21 genen konden 16 worden gecategoriseerd in de ‘Gene Ontology’ (GO) bij biologische processen en 15 bij molekulaire funktie. De meest significante categorieën of ‘themas’ van deze inspanning-responsieve genen, zoals bepaald door een EASE-score van < 0,10, behoorden bij het biologisch proces van transport (vesikel-gemedieerd én proteïne-transport). 5 van de 21 genen waren bij dit proces betrokken.

Aangezien deze 21 genen de perifeer bloed gen-expressie respons op inspanning van gezonde individuen weerspiegelen, redeneerden we dat de expressie van deze genen zou gewijzigd zijn bij CVS-individuen. Om een visuele presentatie van deze verschillen te bekomen, werd de genen-lijst [tabel van hierboven] gebruikt voor een […] cluster-analyse {{Figuur 1 – Hiërarchische clustering van inspanning-responsieve genen bij controle-individuen: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F1) De 21 genen met differentiële expressie (Tabel 2) werden geclusterd […]. In de matrix stelt elke rij de resultaten voor van één gen en elke kolom een individu. Transcript-waarden worden afgebeeld als boven (rood) of onder (groen) het gemiddelde. De dendogrammen [boom-strukturen die mogelijke verwantschappen aangeven] illustreren […] hiërarchische clustering van individuen (boven) en genen (links). […]}}. De respons van 10 van de 21 genen was vrij gelijkaardig qua grootte-orde en richting voor CVS- en controle-individuen. Voor de andere 11 genen was de grootte-orde van de verandering na inspanning aanzienlijk kleiner bij CVS-individuen dan bij controle-indivduen. Met betrekking tot de ‘GO’-categorieën van deze 21 genen, waren 10 genen geassocieerd met binding en 8 met metabolisme, allen daarvan waren gelijk verdeeld over de twee respons-types (# in Figuur 1). 5 genen geklassificeerd bij vesikel-gemedieerd en proteïne-transport ontologieën verschilden echter tussen CVS- en controle-individuen (geel in Figuur 1).

Er werden geen genen met differentiële expressie geïdentificeerd d.m.v. klasse-vergelijking analyse (significantie-niveau p > 0.005) voor CVS-indviduen vóór en na inspanning, voor CVS-indviduen vóór inspanning vergeleken met controles vóór inspanning, of voor CVS-indviduen na inspanning vergeleken met controles na inspanning.

Omdat genen met differentiële expressie werden geïdentificeerd d.m.v. klasse-vergelijking voorafgaand aan de inspanning, redeneerden we dat een vergelijking van gen-expressie bij CVS- en controle-indviduen, gebruikmakend van genen gecategoriseerd volgens ontologie, meer efficiënt de verstoorde fysiologishe mechanismen zou blootleggen. Figuren 2 en 3 tonen de resultaten van deze analyses. ‘GO’-termen met gedefinieerde ouder-kind relaties werden gegroepeerd […]. {{Figuur 2 – Significante gen-ontologie categorieën die inspanning-gerelateerde veranderingen bij controles (a) en CVS-individuen (b) definiëren: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F2) De drie organiserende principes van GO (voorgesteld in de grijze kaders) zijn molekulaire funktie, biologisch proces en cellulaire component. Gerelateerde ontologieën en/of subgroepen van de ontologieën worden aangegeven door kaders met dezelfde kleur. Ontologieën weergegeven op deze figuren waren significant met een p-waarde < 0.005. […]}} Slechts twee inspanning-responsieve ‘GO’-categorieën [fosfolipiden-binding en chromatine-architectuur waren gelijkaardig bij controles en CVS-individuen. Voor de chromatine-architektuur categorie benadrukte de CVS-vergelijking echter 7 overlappende ontologieën (met 59 unieke genen), vergeleken met 1 ontologie van 33 genen bij de controle-vergelijking. De 33 genen overlappen met de 59 die werden geïdentificeerd bij de CVS-vergelijking. De fosfolipiden-binding ontologieën waren identiek qua gen-samenstelling. Veranderingen gerelateerd aan inspanning die enkel bij controle-individuen als significant werden geïdentificeerd, waren verbonden met genen betrokken bij vesikel- (geel), dehydrogenase-, ATPase- en transporter-aktiviteiten. Inspanning-gerelateerde veranderingen die enkel bij CVS-individuen werden gezien, waren verbonden met G-proteïne gekoppelde receptor signalisering.

Gen-ontologie vergelijking werd ook gebruikt om verschillen tussen controle- en CVS-individuen te evalueren (d.i. baseline en na inspanning. {{Figuur 3 - Gen Ontologie categorieën geïdentificeerd als significant verschillend tussen controles en CVS-gevallen vóór (a) en na (b) inspanning: (http://www.biomedcentral.com/1472-6793/5/5/figure/F3)}} Baseline-verschillen tussen CVS-individuen en controles die bleven na inspanning waren ‘GO’-termen gerelateerd aan ion-transport. Na inspanning lijken deze verschillen versterkt te zijn, zoals blijkt uit het verhoogd aantal genen aanwezig in deze GO-categorieën en ook uit het feit dat meer GO-termen behoren bij de ATPase trans-membraan beweging van ionen. G-proteïne-gekoppelde receptor binding, onderdeel van de brede funktionele categorie van signaal-overdracht, verschilde tussen CVS-individuen en controles vóór inspanning. Dit baseline verschil tussen controles en CVS-individuen was niet significant na inspanning. Interessant was dat complement-aktivatie één van de door inspanning geïnduceerde verschillen was tussen CVS-individuen en controles die enkel aanwezig was na inspanning. Genen in de meeste van de als verschillend geïdentificeerde ontologieën tussen CVS- en controle-individuen hadden lagere expressie-waarden bij CVS-individuen.

Bespreking

Gen-expressie profilering biedt een unieke kans om CVS te karakteriseren op biologisch niveau. Veranderingen qua gen-expressie liggen aan de basis van veel biologische processen en zouden inzicht kunnen bieden in ziekte-specifieke gen-expressie en de respons van genen op omgeving-stimuli. In een ‘bewijs-van-concept’ studie, vonden we dat CVS-patiënten verschillende gen-expressie patronen in mononucleaire cellen uit bloed hadden in vergelijking met niet-vermoeide controles [Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC: Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers 2002, 18: 193-199] en dat CVS een heterogene ziekte is, zoals werd bewezen via verschillende gen-expressie profielen voor patiënten die een graduele aanvang van hun ziekte melden vergeleken met degenen die een plotse aanvang melden [Whistler T, Unger ER, Nisenbaum R, Vernon SD: Integration of gene-expression, clinical and epidemiologic data to characterize Chronic Fatigue Syndrome. J Transl Med 2003, 1: 10]. Daarenboven identificeerde ‘differential display’ PCR [techniek om gen-expressie bij een experimentele en controle-groep (op zicht) te vergelijken; echter minder gevoelig en nauwkeurig dan kwantitatieve PCR] bij een klein aantal CVS- en controle-individuen kandidaat biomerkers in perifeer bloed [Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S, Almond J: Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients. Clin Exp Allergy 2003, 33: 1450-1456 --- Steinau M, Unger ER, Jones J.F., Rajeevan MS: Differential display PCR of peripheral blood for biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Molecular Medicine 2004, 82: 750-755].

CVS wordt gedefinieerd door een post-exertionele vermoeidheid die niet vermindert binnen 24 uur na fysieke stress. In tegenstelling daarmee, induceert inspanning bij gezonde, ongetrainde mensen veranderingen qua cellulaire homeostase in 1 tot 4 uur en een terugkeer naar basale waarden binnen 24 uur, gemeten in spieren. Analyse van perifeer bloed gen-expressie bij de gezonde controle-individuen bevestigde deze observatie aangezien de meerderheid van de gen-expressie waarden dezelfde waren vóór en 24 uur na inspanning. Dit impliceerde dat de expressie terugkeerde naar basale waarden óf onveranderd was ten gevolgde de inspanning. Inderdaad: veel van de 21 door inspanning geïnduceerde genen met differentiële expressie bij controle-individuen werd gekenmerkt door ‘GO’s die een diverse set molekulaire funkties, nodig voor cel-funktie en -leefbaarheid, weerspiegelen. (Deze ontologieën overlapten met deze geïdentificeerd bij de ‘GO’-vergelijking analyse in Figuur 2a.). Figuur 1 illustreert duidelijk het patroon van gen-expressie bij de 21 genen voor de meeste van de controle-indivduen. In tegenstelling daarmee waren 11 van de genen ongewijzigd bij CVS-individuen vóór en na inspanning; waarbij er 5 werden geklassificeerd in een transport-gerelateerde ontologie. Omdat dit verschil qua gen-expressie zo dramatisch is, impliceert het een fundamentele verstoring van de biochemische aktiviteit van lymfocyten en monocyten uit perifeer bloed bij CVS-individuen vergeleken met controle-individuen; die de klassieke immunologische merkers (CD45) [algemeen leukocyten-antigen] – waarvan werd aangetoond dat ze niet waren aangetast bij CVS-patiënten – niet beïnvloedt. Lage expressie van deze genen kunnen veeleer subtiele effekten hebben op immuun-funktie. De betrokkenheid van immuun-dysfunktie bij de pathogenese van CVS is niet altijd even consistent gebleken.

Klassen-vergelijking, gebruikt om deze 21 genen met differentiële expressie te identificeren, wees op de mogelijke verstoring van biologische mechansimen (Figuur 1). Om deze mogelijkheid te onderzoeken, gebruikten we de ‘GO’-vergelijking die is gebaseerd op de kennis dat gen-expressie waarden onafhankelijke variabelen zijn bij biologische processen, cellulaire componenten en molekulaire funkties. Op deze manier versterken multipele genen in dezelfde categorie elkaar en verhogen ze de sterkte voor het identificeren van de significantie van de categorie. De ‘GO’-categorieën die als significant verschillend (p < 0.005) werden beschouwd bij het vergelijken van CVS-individuen met controles na inspanning, waren deze behorende tot ion-transporter aktiviteit (een totaal van 87 genen in deze categorie) en ATPase-aktiviteit gekoppeld met trans-membraan beweging (42 genen). Als de CVS- en controle-klassen worden vergeleken vóór inspanning, worden ion-transport aktiviteit en ‘voltage-gated’ ion-kanaal aktiviteit geïdentificeerd (38 en 44 genen in de respectievelijke ‘GO’-categorieën).

Het is duidelijk dat ion-transport en ion-kanaal aktiviteit de gevallen onderscheiden van controles en dat inspanning deze verschillen lijkt te intensifiëren. Van meerdere andere aandoeningen is geweten dat de fluctuerende vermoeidheid die optreedt wordt veroorzaakt door abnormale ion-kanalen. Deze aandoeningen omvatten genetisch bepaalde ‘channelopathieën’ [ziekten veroorzaakt door een verstoorde funktie van ion-kanaal] en verworven aandoeningen zoals neuromyotonie, myasthenische syndromen, Multipele Sclerose en polyneuropathieën [Chaudhuri A, Behan PO: Fatigue in neurological disorders. Lancet 2004, 20: 978-988 --- Chaudhuri A, Watson WS, Pearn J, Behan PO: The symptoms of Chronic Fatigue Syndrome are related to abnormal ion-channel function. Med Hypotheses 2000, 54: 59-63].

Er zijn andere trans-membraan funkties geassocieerd met verschillen tussen controles en CVS-patiënten, o.a. signaal-overdracht aktiviteit via receptor-binding/aktiviteit (Figuur 3a). Signaal-transductie van trans-membraan receptoren gebeurt via een aantal mechanismen, waaronder strukturele veranderingen, ion-kanalen en wijzigingen van trans-membraan potentialen. De G-proteïne gekoppelde receptoren spelen een belangrijke rol bij de membraan-trafiek machinerie. De meest opvallende inspanning-geïnduceerde veranderingen bij CVS-gevallen behoren tot gen-regulering op het punt van chromatine-struktuur; of deze veranderingen de verschillen weerspiegelen die worden gezien bij de mRNA-transcripten verbonden met verschillen qua membraan-traffiek tussen gevallen en controles, is nog niet bepaald.

Eén interessante samenhang bij deze studie was de bevinding dat het complement-mechanisme significante verschillen vertoonde tussen CVS- en controle-individuen na inspanning. Dit werd eerder gerapporteerd bij de analyse van gelijkaardige inspanning-leverende indivduen. Sorensen et al. [Sorensen B, Streib JE, Strand M, Make B, Giclas PC, Fleshner M et al.: Complement-activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome. J Allergy Clin Immunol 2003, 112: 397-403; zie: ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’] maten concentraties complement-afbraakprodukten in de sera van deze individuen en vonden verschillen tussen CVS- en controle-individuen bij C4a na inspanning. Complement-aktivatie werd geïdentificeerd als een ontologie die significant verschillend was tussen CVS- en controle-individuen na inspanning. De correlatie bij deze data is interessant aangezien hun studie proteïne-waarden (d.w.z.. gen-produkt) mat en onze studie mat de transcript-waarden.

[…] Het gebrek aan statistische significantie bij de 3 andere klasse-vergelijking analysen die werden uitgevoerd (CVS-gevallen vergeleken vóór en na inspanning, vergelijking van gevallen met basale controles en de vergelijking van gevallen met controles 24 uur na inspanning) weerspiegelt de lage experimentele gevoeligheid, waarschijnlijk te wijten aan het klein aantal individuen, eerder dan een afwezigheid van biologisch effekt. […]

Verder onderzoek zal grotere aantallen individuen omvatten voor de expressie-arrays. De nadruk bij dergelijke studies zal liggen op het ontwikkelen van een op gen-expressie gebaseerde multivariate funktie, of voorspeller, die het behoren tot een klasse van een nieuw staal correct voorspelt gebaseerd op de expressie-niveaus van belangrijke genen. Instrumenten voor het ontdekken van klassen zullen ook worden toegepast op expressie-profielen van CVS-individuen, in een poging afzonderlijke sub-groepen van deze ziekte verder te beschrijven op basis van gen-expressie; zoals we hebben gedaan voor graduele en plotse aanvang van de ziekte. De methoden gebruikt bij deze studie zullen echter ook worden toegepast op deze data-sets aangezien deze analytische instrumenten zeer nuttig zullen blijken bij het definiëren van de pathofysiologie of CVS. We hopen dat deze bredere, meer omvattende benadering van CVS-research veel deuren zal openen naar het begrijpen van dit syndroom en misschien van vermoeidheid en ziekte in het algemeen.

Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS

Ten einde een beetje duidelijkheid te krijgen over de stand van zaken aangaande gen-expressie bij M.E.(cvs), volgt hier een uitgebreid rapport van Prof. Dr Dr John W Gow (Senior Lecturer in Clinical Neuroscience; University Dept. of Neurology, Southern General Hospital, Glasgow, Scotland) en medewerkers. Er wordt regelmatig verwezen naar en vergeleken met anders studies; en biedt daarom een goed overzicht.

Samen met Prof. Chaudhuri en de ‘University of Glasgow’ heeft Gow in 2006 een patent aangevraagd onder de titel ‘Materials and Methods for Diagnosis and Treatment of Chronic Fatigue Syndrome’: “… Een aantal genen werden geïdentificeerd die tot een abnormale expressie kwamen bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met normal gezonde individuen. Deze genen omvatten deze encoderen voor defensine-α1, haemoglobine-γ, CXCR4, tubuline-beta-1, serine/threonine-kinase-17B, HLA DRss4 en prostaglandine-D2 synthase. De geïdentificeerde genen bieden objectieve ziekte-merkers die mogelijks gebruikt kunnen worden bij diagnostische testen om de diagnose van M.E.(cvs) te ondersteunen of bij het monitoren van de effektiviteit van een therapie. Ze bieden ook een rationele basis voor het klassificeren van M.E.(cvs)-patiënten volgens het onderliggend biochemisch letsel en voor geschikte doelgerichte therapieën.”.

In de leken-pers doken al verklaringen op gaande van “CVS is geen ziekte die veroorzaakt wordt door een erfelijk gen-defekt maar is een verworven aandoening.” tot “Een medicijnen-cocktail zou kunnen worden aangewend om de genen ‘uit te schakelen’, zodat patiënten een ‘redelijk normaal’ leven zouden kunnen leiden.”. In onderstaand artikel is men ietwat meer genuanceerd en minder voortvarend… Zoals eerder al aangegeven: ‘Nature’ en ‘Nurture’ bepalen een aandoening…

BMC Medical Genomics 2009, 2:38 [Published: 25 June 2009]

A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome

John W Gow¹, Suzanne Hagan¹, Pawel Herzyk², Celia Cannon³, Peter O Behan¹, Abhijit Chaudhuri⁴

1 Dept. of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, Glasgow, G4 0BA, UK;

2 The Sir Henry Wellcome Functional Genomics Facility, Faculty of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, G12 8QQ, UK;

3 Glasgow Veterinary School, University of Glasgow, UK;

4 Essex Centre for Neurological Sciences, Oldchurch Hospital, Romford, RM7 0BE, UK

Achtergrond

Aanhoudende vermoeidheid na infektie wordt erkend en maakt deel uit van een klinisch gedefinieerd syndroom (Chronische Vermoeidheid Syndroom). CVS is een zeer heterogene ziekte die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van nieuwe, persistente of terugkerende vermoeidheid, zo ernstig dat ze interfereert met de normale aktiviteit. Patiënten melden ook verstoord korte-termijn geheugen en concentratie, spier-pijn en post-exertionele malaise. Het klinisch voorkomen van CVS in de bevolking varieert van 0,23-2% en bijna 75% van de patiënten zijn vrouwen. De oorzaak en pathogenese van CVS zijn niet gekend en, tot op heden, is er geen standaard laboratorium-test die op een betrouwbare manier CVS-patiënten onderscheidt van gezonde individuen. Ten gevolgde daarvan wordt de persistentie van anderzijds medisch-onverklaarde chronische vermoeidheid dikwijls toegeschreven aan psychologische factoren. De voorbije jaren werden talrijke micro-chip studies ondernomen om patiënten met chronische vermoeidheid te onderscheiden van gezonde controles. Dit onderwerp werd ook behandeld in een speciale uitgave (2006) van het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’ [zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC’]. Daarin gebruikten meerdere artikels […], bioinformatica, algorithmen en rekenkundige analyses van micro-chip gegevens om een betere discriminatie te bekomen tussen individuen met onverklaarde chronische vermoeidheid en CVS, en gezonde controles.

Hoewel chronische vermoeidheid na bepaalde infekties bekend is (bv. Epstein-Barr virus), wordt CVS gewoonlijk niet beschouwd als te wijten aan een blijvende infektie. […]. [zie bv. ‘Géén unieke, eerder niet-gekarakteriseerde bakterieën bij CVS’] Er zijn echter weinig studies die specifiiek de veranderingen qua gen-expressie bij post-infektueuze individuen hebben onderzocht.

Onze hypothese stelde dat patiënten met aanhoudende vermoeidheid die zich ontwikkelen na infekties biologisch verschillend zijn van individuen en dat dit zou worden weerspiegeld in een verschillende gen-signatuur. Recente vooruitgang in genoom sequentie-bepaling en geautomatiseerde chip-fabricage hebben DNA-chip (‘micro-array’) technologie makkelijk beschikbaar gemaakt. Deze technologie laat simultane differentiële expressie profilering toe voor een groot aantal genen in weefsel-stalen van CVS-patiënten en controles. Een eerdere studie, gebruikmakend van micro-array technologie met 1.764 genen en RNA uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC), toonde het nut van witte bloed-cellen voor gen-expressie profilering bij een ziekte zonder gekend pathologisch letsel, zoals CVS. Een meer recente micro-array studie met 9.522 genen concludeerde dat patiënten met CVS reproduceerbare veranderingen qua gen-regulatie vertonen [Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P, Harrison TJ, Wilkinson RJ, Tyrrell DA, Holgate ST, Kerr JR: Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol 2005, 58:826-832]. Daarenboven toonde een studie over inspanning-responsieve genen met een 3.800 oligonucleotide micro-chip significante verschillen in membraan ion-transport genen bij vrouwen met CVS, vergeleken met controle-individuen [Whistler T, Jones JF, Unger ER, Vernon SD: Exercise responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control subjects. BMC Physiology 2005, 5:5].

In onze studie, was het doel een complete ‘gen-signatuur’ te verkrijgen voor niet-psychiatrische patiënten met post-infektueuze, aanhoudende chronische vermoeidheid. We sloten vrouwelijke individuen uit om storende factoren voortkomend door de maandelijkse reproduktieve cyclus te voorkomen. Door gebruik te maken van een ‘Affymetrix GeneChip Human Genome U133’ dubbele chip set met bijna 45.000 probe-sets [een probe bij molekulaire genetica is een stukje erfelijk materiaal dat gemerkt werd om de aanwezigheid van een (deel van een gen) te detekteren of identifceren] – die 39.000 transcripten afgeleid van meer dan 33.000 gen-sequenties bevatten – werd het meeste van het gekende menselijk genoom in dit werk omvat.

Resultaten

Identificatie van genen met differentiële expressie.

Een aantal genen hadden een significante over- of onder-expressie bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde controles, bij micro-array analyse van het ganse genoom. De ‘Rank Products’ (RP) analyse [statistische berekening voor de detektie van differentieel tot expressie komende genen bij herhaalde micro-array experimenten] toonde dat 413 Affymetrix probe-sets significant waren ge-upreguleerd en 189 significant ge-downreguleerd (602 in totaal) bij de CVS-stalen. Van de significant ge-upreguleerd probe-sets, vertoonden 141 een verandering qua expressie van ten minste het 2-voud en 20 ten minste het 3-voud. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde probe-sets zijn respectievelijk 57 en 2.

IPA-resultaten.

[‘Ingenuity Pathway Analysis’, IPA, is software om via RP gegenereerde expressie-profielen te analyseren.]

Na analyse van de 602 probe-sets met differentiële expressie bleken 366 niet-overbodige ‘focus’ genen opgenomen in de IPA-database. Daarvan waren 286 genen significant ge-upreguleerd en 80 significant ge-downreguleerd bij de CVS-patiënten. Van de significant ge-upreguleerde genen waren er 105 waarvan de expressie ten minste verdubbelde en 16 ten minste ver-3-voudigde. De corresponderende aantallen voor de ge-downreguleerde genen zijn respectievelijk 25 en 3. De tien hoogst ge-upreguleerde genen en de drie hoogst ge-downreguleerde genen zijn te vinden op: http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T1.

Om de biologische context van genen met differentiële expressie bij CVS-patiënten te onderzoeken, werd de IPA-software gebruikt. […] De netwerk-analyse toonde het bestaan van 21 netwerken met een significante score tussen 9 en 47, die tesamen 349 van de 366 genen bevatten. De top drie netwerken, met 5 van de top 10 ge-upreguleerde genen, omvatten lactotransferrine (7,2 x ge-upreguleerd), CXCR4 (3,6 x ge-upreguleerd), de integrinen α2B en β3 (respectievelijk 4,1 x en 3,8 x ge-upreguleerd) en defensine-α1 (6 x ge-upreguleerd).

Veranderde bio-systemen bij CVS.

De gen-signatuur van CVS benadrukte veranderingen qua gen-expressie in drie belangrijke gebieden: oxidatieve stress, apoptose en viraal-achtige immuun- dysfunktie. (http://www.biomedcentral.com/1755-8794/2/38/table/T2)

Oxidatieve stress

Er is een grote hoeveelheid bewijsmateriaal bij CVS dat er op wijst dat oxidatieve stress bijdraagt tot ziekte-progressie en symptomen. Ons gen-array bevestigt bewijs van oxidatieve stress door een grote verandering in de genen coderend voor prostaglandine-endoperoxide synthase 1 en 2 (ook gekend als COX-1 en -2). Deze enzymen zijn verantwoordelijk voor de regulering van de synthese van de pro-inflammatoire mediatoren: prostaglandinen. De induceerbare vorm van COX-2 katalyseert de omzetting van arachidonzuur naar prostaglandinen, de afgifte van prostanoïden [prostaglandinen (mediatoren van inflammatoire en anafylactische reakties), prostacyclinen (aktief bij de resolutie-fase van inflammatie) en tromboxanen (mediatoren van vasoconstrictie)], die perifere nociceptor [een sensorische receptor die reageert op pijn] -uiteinden sensitiseren en gelokaliseerde hyper-gevoeligheid voor pijn veroorzaken. Er werd ook aangetoond dat COX-2 tot over-expressie komt op plaatsen met inflammatie en bij verscheidene tumoren, met verhoogde expressie van het belangrijkste arachidonaat-metaboliet, prostaglandine-E2 (PGE2). Van COX-2 afgeleid PGE2 is ook gekend de expressie te verhogen van ‘decay-accelerating factor’ (DAF of CD55). DAF is én van de belangrijke beschermende complement-receptor genen en een immuun-regulator, wat van belang is aangezien DAF ge-upreguleerd was op onze chip. Dit is zeer betekenisvol wat betreft immuun-suppressie/ontwrichting en cel-verspreiding (verder besproken bij immuun-modulering). Gecultiveerde, door TNFα gestimuleerde lymfocyten van CVS-patiënten bleken te resulteren in over-expressie van NF-kappaB (NFκB) [zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]. COX-2 is verantwoordelijk voor meerdere inflammatoire akties, Terwijl NFκB het belangrijkste mechanisme is dat inflammatoire en oxidatieve stress mediatoren, zoals pro-inflammatoire cytokinen en COX-2 regelt, en de aanmaak van induceerbaar NOS (iNOS). De over-expressie van genen voor oxidatieve stress bij CVS is ook consistent met de upregulering van de haemoglobine-genen, in het bijzonder gamma-haemoglobine, dat gewoonlijk alleen tot expressie komt in de foetus. Bijkomende ge-upreguleerde genen betrokken bij oxidatieve stress bleken leukotriene B4, cytochroom-P450, superoxide-dismutase en de mono-oxygenasen. Indirect bewijs voor een O^2--aanval komt van de upregulering van gamma- en alfa-haemoglobine, in het bijzonder gamma-haemoglobine. De unieke eigenschap van verhoogde zuurstof-binding van dit proteïne zou kunnen worden geïnduceerd ten gevolge een oxidatieve aanval.

Apoptose

Er is aktieve apoptose in de cellen van patiënten met CVS en consistent daarmee is de bevinding dat veel met apoptose geassocieerde genen, o.a. caspase-1, ge-upreguleerd zijn. Meerdere factoren kunnen apoptose triggeren: cellulaire beschadiging, virus-infektie en homeostase. Het signaal voor apoptose kan van binnenin de cel komen, van het omringend weefsel of van een cel behorend tot het immuun-systeem. Bij de top 100 ge-upregueerde genen is er een overwicht van met apoptose geassocieerde genen. Apoptotische cellen en hun kernen krimpen en fragmenteren dikwijls. Ze kunnen dan efficiënt via fagocytose worden verwijderd door macrofagen of naburige cellen. Uit het gen-array blijkt ook bewijs voor macrofaag-aktivatie, via de upregulering van Toll-like receptor (TLR)-4 en TLR-8 [Toll-Like receptoren = op het oppervlak van leukocyten voorkomende receptoren; er zijn ca. 10 types geïdentificeerd], en monocyt-naar-macrofaag differentiatie genen. Omtrent welke cellen apoptose ondergaan, zijn er theorieën te over. Kennedy en co hebben eerder verhoogde in neutrofiel-apoptose bij CVS gerapporteerd [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’]. Het kan zijn dat het deze groep cellen is die het doelwit is voor apoptose en onze array-gegevens omvatten zeker veel genen die gerelateerd zijn met neutrofielen, alsook eosinofielen.

Immuun-modulatie

Ontwijking van het immuunsysteem is een goed gedocumenteerd mechanisme waarbij virussen, bakterieën, parasieten en kanker-cellen vernietiging door de gastheer voorkomen. Immuun-modulaties kunnen uitéénlopend en complex zijn. Ze omvatten doelgerichte verstoring van T-cel funktie, onderdrukking van T-cel cytotoxische dood-receptoren [zie ‘Verhoogde neutrofiel apoptose bij CVS’], inductie van apoptose-proteïnen, inhibitie van aangeboren immuunsystemen zoals dendritische cel en ‘natural killer’ (NK) receptoren. Uit deze studie blijkt dat meerdere genen die verbonden zijn met het immuunsysteem ge-upreguleerd zijn bij patiënten met CVS, wat wijst op mogelijke funktionele wijzigingen. Onder die genen die geïdentificeerd werden, zijn 2 genen die behoren tot het ‘Major Histocompatibility Complex’ [MHC; genen die coderen voor eiwitten op de membranen van de meeste cellen en een rol spelen bij de herkenning van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ elementen]: HLA-DRB4 en HLA-DQB1; deze genen coderen voor β-ketens [bepaalde eiwitten, isoformen, die samen met andere het volledige proteïne vormen] van MHC klasse II molekulen. MHC klasse II molekulen worden gevonden op antigen-presenterende cellen, namelijk B-cellen, dendritische cellen en macrofagen [klasse I molekulen komen voor op élke cel van het lichaam met een kern]. Antigenen geassocieerd met MHC klasse II worden aangeboden aan CD4+ cellen, een sub-groep van T-cellen. Vroegere studies hebben storingen geïdentificeerd in de expressie van MHC klasse II genen bij patiënten met CVS. Steinau en collegas wezen op een downregulering van MHC klasse II molekulen; dit werk identificeerde echter geen individuele MHC klasse II genen [Steinau M, Unger ER, Vernon SD, Jones JF, Rajeevan MS: Differential-display PCR of peripheral blood for biomarker discovery in chronic fatigue syndrome. J Mol Med 2004, 82:750-755]. Vervolgens duidden Smith et al. [Smith J, Fritz EL, Kerr JR, Cleare AJ, Wessely S, Mattey DL: Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol 2005, 58:860-863] verhoogde expressie van HLA-DQB1 aan en benadrukten een aantal andere MHC-genen die waren veranderd bij CVS. De hier voorgestelde data ondersteunen daarom enkele van deze bevindingen maar ze identificeren ook veranderingen qua expressie van HLA-DRB4 bij patiënten met CVS, wat eerder niet werd aangetoond.

Naast het MHC zitten bij de top van de ge-upreguleerde genen meerdere genen die coderen voor immuun-proteïnen die behoren tot het aangeboren immuunsysteem. Van patiënten met CVS worden verondersteld dat ze subtiele immuun-dysfunktie hebben. Veranderde NK-cel funktie bij CVS-patiënten werd eerder gerapporteerd door Morrison et al. en werd geverifieerd via de significante downregulering van NK KIR receptoren op onze gen-chip. Deze gegevens helpen te bevestigen dat immuun-modulerende gen-expressie significant verschillend is bij CVS-patiënten, vergeleken met gezonde individuen. Immuun-dysfunktie lijkt aanwezig te zijn bij patiënten met CVS in afwezigheid van eender welk pathogen. De klassieke Th1 naar Th2 omschakeling laat intracellulaire pathogenen toe opsporing te ontwijken. Zoals hierboven gemeld is DAF een regulator van het complement-systeem en een immuun-regulator. DAF lijkt NK-cellen te inhiberen en is gekend als één van de meest krachtige aktivatoren van tumor-genese/virale verspreiding. DAF is ook gekend als een receptor voor bepaalde virussen (inclusief enterovirussen) en andere micro-organismen. […] Het is geweten dat gen-expressie profielen van totale gemengde PBMC-populaties gen-expressie in sub-groepen van cellen kunnen maskeren. Deze studie toont echter zeer hoge expressie van een aantal MHC klasse II genen die normaal wordt gezien in de minder belangrijke delen van de PBMCs, wat wijst op significante veranderingen binnen deze cel-groepen.

Ge-upreguleerede immuun-gerelateerde genen bij patiënten omvatten lactotransferrine, defensine-α1 en integrinen. Lactotransferrine is een ijzer-bindend proteïne dat verantwoordelijk is voor immunologische reakties, terwijl defensinen een familie van bakterie-dodende en cytotoxische peptiden zijn, afgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Defensinen zijn ook betrokken bij de anti-mikrobiële verdediging van epithelia (van het ademhaling- en urinogenitaal systeem). Van patiënten met CVS is geweten dat ze meer vatbaar zijn voor infekties […]. Integrinen zijn extra-cellulaire matrix proteïnen betrokken bij in cel-adhesie en aktiveren ook signalisering-mechanismen voor cel-groei en -regulering in het cytosol. Arginase is een belangrijk enzyme waarvan wordt gedacht dat het aktief is bij immuun-modulering en is ook betrokken bij NK-cel funktie. Andere opmerkenswaardige ge-upreguleerde genen zijn haemoglobinen, in het bijzonder foetaal haemoglobine, en dit zou een respons op verhoogde oxidatieve stress kunnen suggereren. Een andere familie ge-upreguleerde genen staat in verband met cellulaire apoptose en serine-threonine kinase is een lid van de hersen kinase familie betrokken bij neurale apoptose en vorming van corpora amylacea [kleine korrels in neuroglia, bestaande uit gedegenereerde cellen]. Van de ge-downreguleerde genen, zijn ribosomaal proteïne [proteïnen die, samen met rRNA, de ribosomale subunits vormen die betrokken zijn bij de vertaling van RNA naar eiwitten] gen en ‘zinc-finger’ proteïne [grote super-familie van proteïne-domeinen die op DNA kunnen binden] genen betrokken bij de cel-cyclus en cellulaire groei.

Validatie van gen-array gegevens via RT-PCR en ‘western blotting’.

[RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) is een variant van PCR waarbij RNA i.p.v. DNA het uitgangspunt is voor amplificatie. Hiervoor wordt het RNA (enkel-strengig) eerst omgezet in cDNA (‘complementary DNA’) door gebruik te maken van het enzym reverse-transcriptase. Het cDNA kan vervolgens met PCR worden geamplificeerd om het dan te visualiseren en ev. te kwantificeren. Het is de meest gevoelige techniek om mRNA te detekteren.

‘Western blotting’: Methode die met behulp van antilichamen specifiek proteïnen kan aantonen. De proteïnen in een staal worden eerst gescheiden en dan naar een drager getransfereerd d.m.v. een elektrische stoom. Op de drager kunnen dan de (gemerkte) antilichamen binden zodat één bepaald eiwit kan worden gevisualiseerd en gemeten.]

Twee leden van de defensine gen-familie bleken zich onder de genen met de hoogste expressie te bevinden: defensine-α1 en -α4. Defensinen zijn een groep cytotoxische peptiden die te vinden zijn in de bakterie-dodende granulen van neutrofielen en macrofagen, en worden vrijgegeven in respons op virale en bakteriële infekties. Deze proteïnen spelen dus waarschijnlijk een rol bij fagocyten-gemedieerde gastheer-verdediging. Ten gevolde de hoge defensine-waarden die werden gemeten via de micro-chip, werd defensine-α1 gekozen voor verder analyse. We probeerden de gegevens te bevestigen op RNA- en proteïne-niveau, aan de hand van een andere groep of bloed-stalen van 10 CVS-patiënten en 10 normale, gezonde controles. We gebruikten oligonucleotiden [korte DNA-sequenties] (bij RT-PCR) en specifieke antilichamen (bij ‘western blotting’) om defensine-α1 veranderingen te detekteren op RNA- en proteïne-niveau. We tonen upregulering van defensine-α1 op het RNA-niveau bij patiënten met CVS, vergeleken met normale gezonde controles. Bovendien toont de immuno-blot upregulering van defensine-α1 bij alle CVS-patiënten (uitgezonderd één), vergeleken met controles die weinig of geen defensine-proteïne vertoonden. […]

Bespreking

Er werd een uitgebreide gen-signatuur van niet-psychiatrische patiënten met CVS gegenereerd d.m.v. een micro-chip test van het ganse genoom. De micro-array data die hier werden gepresenteerd, illustreren verschillen in gen-expressie verspreid over het ganse genoom tussen post-infektueuze, niet-psychiatrische mannelijke patiënten met CVS en gezonde controles. Analyse van de gen-signatuur van CVS suggereert dat drie significante mechanismen zijn veranderd in patiënten: oxidatieve stress, apoptose en virus-achtige immuun-modulering. Eerder voerden Gu et al. een micro-array met 588 genen uit waarbij patiënten met spondyloarthropathie [chronische inflammatoire ziekte van de gewrichten], rheumatoïde arthritis en psoriatische arthritis [specifieke vorm van ontstekingsreuma gepaard met bepaalde vorm van huiduitslag] werden vergeleken met normale, gezonde individuen. Van belang was hun bevinding dat expressie van CXCR4 onverwacht hoog was bij alle individuen met arthritis. Dit gen codeert een CXC chemokine receptor [chemokinen = chemotactische cytokinen; geproduceerd door mast-cellen en afgegeven om leukocyten aan te trekken; sommige chemokine-receptoren kunnen aan diverse pathogenen binden] die specifiek is voor één ligand (‘stromal cell-derived factor-1’) [SDF-1; klein cytokine behorend tot de chemokine-familie] en CXCR4 is gekend samen te werken met CD4 proteïne [eiwit op het oppervlak van helper T-lymfocyten dat hen toelaat te interageren met cellen die MHC klasse II gen-produkten tot expressie brengen] om toegang van HIV in cellen te ondersteunen. DNA micro-chip studies door Watanabe en co toonde significante upregulering van het CXCR6 motief [chemokine receptor 6] in patiënten met colitis ulcerosa [chronische ontsteking van de de dikke darm met zweer-vorming]; terwijl ander werk er op wees dat de CXCL12/CXCR4 interaktie betrokken is bij meerdere inflammatoire aandoeningen, inclusief inflammatoire darm ziekte. Daarom wijst de bevinding van onze studie (dat CXCR4 significant was ge-upreguleerd bij mannelijke CVS-patiënten) er op dat dit gen wellicht niet specifiek is voor CVS. We noteren echter dat in de CVS-studies door Kerr et al. [Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D, Sinclair LI, Mattey DL, Richards SC, Montgomery J, Baldwin DA, Kellam P, Harrison TJ, Griffin GE, Main J, Enlander D, Nutt DJ, Holgate ST: Gene expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis. J Infect Dis 2008, 197:1171-1184 --- Kerr JR, Burke B, Petty R, Gough J, Fear D, Mattey DL, Axford JS, Dalgleish AG, Nutt DJ: Seven genomic subtypes of Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: a detailed analysis of gene networks and clinical phenotypes. J Clin Pathol 2008, 61:730-739], CXCR4 ook was ge-upreguleerd.

Het algemeen beeld dat naar voor komt uit deze resultaten wijst naar een significante, hoewel fenotypisch subtiele, verstoring van de mikrobiële afweer, virale immuun-bewaking en cel-groei bij patiënten met post-infektueuze chronische vermoeidheid. Een mogelijke kritiek op dit werk is dat vrouwelijke patiënten werden uitgesloten. Zoals reeds uitgelegd was de reden hiervoor het vermijden van verstorende endocriene invloeden op de gen-signatuur. Eerdere research heeft weinig geslacht-gebonden verschillen wat betreft symptoom-ernst gevonden. Er was geen geslacht-effekt in een ‘prospective cohort’ studie [volgt gedurende een tijd een groep van gelijkaardige individuen die verschillen met betrekking tot bepaalde te onderzoeken (risico-)factoren, om te bepalen hoe die factoren met verloop van tijd een bepaalde uitkomst (bv. ziekte) opleveren] van patiënten met post-infektueuze vermoeidheid uit de eerstelijn-zorg. Over het algemeen onderscheiden demografische, klinische en psychosociale factoren mannelijke niet van vrouwelijke patiënten met CVS en we geloven dat de resultaten van onze research toepasbaar zijn op CVS-patiënten van de beide geslachten.

Besluiten

Recente studies hebben geprobeerd de molekulaire basis voor CVS te bepalen [zie eerder Kerr et al. --- Saiki T, Kawai T, Morita K, Ohta M, Saito T, Rokutan K, Ban N: Identification of marker genes for differential diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Mol Med 2008, 14:599-607 --- Gräns H, Nilsson P, Evengård B: Gene expression profiling in the Chronic Fatigue Syndrome. Journal of Internal Medicine 2005, 258:388-390]. Onderstaande tabel illustreert overlappende genen geobserveerd bij CVS-patiënten in onze analyse en in eerdere micro-array studies (en één filter-array studie), door andere researchers. Hoewel er enige overlap is, is er over het algemeen een gebrek aan correlatie tussen verschillende publikaties over gen-arrays tot nu toe. Of dit verschillende patiënten-populaties en selektie-criteria weerspiegelt, blijft onduidelijk. Het moet echter in gedachten worden gehouden dat veel mRNAs zeer korte half-waarde tijden [tijd waarin de helft van het mRNA wordt afgebroken] hebben (d.i. minder dan 2 min) en daarom is wat wordt geobserveerd met een micro-array een moment-opname en weerspiegelt het niet noodzakelijk het chronische biologische proces inherent aan deze aandoening. Het is, daarom, noodzakelijk de micro-array gegevens te valideren d.m.v. meer gevestigde technologieën zoals RT-PCR, ‘western blotting’ en ELISA, en grotere populaties met zorgvuldige geselekteerde patiënten te gebruiken om de resultaten te bevestigen.

De data die hier worden voorgesteld illustreren duidelijk belangrijke verschillen qua gen-expressie tussen patiënten met post-infektueuze CVS en gezonde controles. Niettegenstaande deze verschillen in gen-signaturen een rationele verklaring voor de symptomen kunnen bieden, en bevestigen dat CVS een echte en biologische ziekte is, impliceren gen micro-array resultaten niet dat CVS hoofdzakelijk een genetische aandoening is. Daarenboven bewijzen de research-data niet of differentieel tot expressie komende genen de voorbestemmende oorzaak of verder gevolg van CVS zijn. We geloven echter dat de hier voorgestelde gegevens een belangrijke eerste stap voorwaarts zijn naar het doel, nl. het identificeren van vermeende biomerkers om de klinische diagnose van CVS te ondersteunen. Bovendien bieden de geïdentificeerde (via genen met over-expressie) biologische mechanismen, een rationeel begrip en mogelijke verklaring voor de complexe en dikwijls multi-systemische aard van CVS – wat een potentieel invaliderende ziekte, op zoek naar een effektieve genezing, blijft.

CVS-genen met over-expressie bij verschillende micro-chip studies

Bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is

Aansluitend op ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’ hier een aanmoediging om verder te zoeken naar merker-genen voor M.E.(cvs)! Het betreft een overzichtsartikel en geïnteresseerden kunnen eventueel ontbrekende referenties opvragen…

Eén van de auteurs, Esther Crawley – “de enige (?) pediater in het V.K. die specialiseert in M.E.(cvs) – ontving begin 2009 de ‘Clinician Scientist Award’. Ze kreeg ook £ 730.000 research-fondsen van het ‘National Institute of Health Research’ voor research bij pediatrische M.E.(cvs). Dr Crawley is medisch adviseur voor de ‘Association of Young people with ME’ (AYME).” Ze krijgt echter in de M.E.(cvs)-wereld ook flink wat kritiek om dat ze cognitieve gedragstherapie en graduele oefenprogrammas zou promoten. Ze zou de meldingen van patiënten over nadelige effekten hiervan verwerpen…

Voor dit artikel werden Dr Crawley en haar research-team gedeeltelijk gesponsord door ‘The Linbury Trust’ en de ‘Bath Unit for Research in Paediatrics’.

George Davey Smith is Professor Klinische Epidemiologie en Hoofd van de Afdeling Epidemiologie van de ‘University of Bristol’. Dit voornaamste research-interesse ligt bij de sociale ongelijkheden bij gezondheid en hoe deze worden gegenereerd door blootstellingen met een invloed op de ganse levensloop. Hij heeft ook gewerkt rond de geschiedenis van epidemiologie, meta-analyse epidemiologische methodologie en schreef o.a. een artikel over ‘Mendeliaans Randomisering’ (zie hieronder)…

Het werd reeds eerder aangegeven op deze paginas: zoals bij zovele aandoeningen speelt wellicht een interaktie van ‘nature and nurture’ (aard en omgevingsfactoren); genetische voorbestemdheid (wellicht meerdere polymorfismen die patiënten kunnen over-erven en die op elkaar inspelen) en een aantal stressoren (bv. infektie). Dit wordt hier bevestigd…

Archives of Disease in Childhood 2007 Dec;92(12):1058-61

Is Chronic Fatigue Syndrome (CFS/ME) heritable in children, and if so why does it matter?

Esther Crawley¹ en George Davey Smith²

1 Centre for Child and Adolescent health; Hampton House, Cotham Hill, Bristol, BS6 6JS, UK

2 MRC centre for Causal Analyses in Translational Epidemiology (CaiTE), Department of Social Medicine, University of Bristol, UK

Chronische Vermoeidheid Syndroom of M.E. is verrassend courant bij kinderen – een prevalentie tussen 0,19 and 2%, gebaseerd op telefoon-bevragingen in het V.K. en de V.S. Een prevalentie (tot 30 jaar oud) van zelf-gerapporteerde, niet door een arts bevestigde M.E.(cvs) van 0,8% werd gemeld op basis van het ‘1970 British Birth Cohort’. Prevalentie (leeftijd 8 tot 17 jaar) voor invaliderende vermoeidheid gedurende 3 maanden en 6 maanden bleek 2,34% en 1,29% uit een longitudinale tweelingen-studie. Dit betekent dat bijna alle kinderartsen die dit lezen wel eens kinderen met M.E.(cvs) hebben gezien en behandeld. Enkele pediaters zullen een familiale geschiedenis van met M.E.(cvs) hebben opgemerkt en zich hebben afgevraagd of dit te wijten was aan genetische overdraagbaarheid of een omgevingsfactor. Over de oorzaken van M.E.(cvs) wordt reeds lang gedebateerd maar dit is niet noodzakelijk nuttig gebleken voor de klinische behandeling van kinderen met M.E.(cvs). Dit artikel onderzoekt het bewijs voor de genetische overdraagbaarheid van M.E.(cvs). […]

Familiale aggregatie

De familiale aggregatie van M.E.(cvs) werd voor het eerst beschreven in Lyndonville (staat New York) [Bell KM, Cookfair D, Bell DS, Reese P, Cooper L. Risk-factors associated with Chronic Fatigue Syndrome in a cluster of paediatric cases. Rev Infect Dis. 1991; 13 Suppl 1:S32-S38]. In deze studie werd een vragenlijst betreffende de symptomen van M.E.(cvs) en mogelijke risico-factoren (allergieën, astma, risico-factoren voor infektie en familiale geschiedenis) uitgedeeld aan alle 914 studenten van de ‘Lyndonville Central School’. Het hebben van een familie-lid met M.E.(cvs) bleek een sterke voorspellende factor voor M.E.(cvs), met een risico-verhouding van 35,9. Het blijkt niet duidelijk uit deze studie of de auteurs enkel vroegen naar eerste-graad verwanten of ‘om het even welke’ verwanten. In dit stadium besloten de auteurs dat dit kon te wijten zijn aan de overdracht van een infektueus agens, de aanwezigheid van genetische factoren of één of andere nog te definiëren omgevingsfactor. Later, in een andere kleine studie hadden 50% van de kinderen met M.E.(cvs) een familiale geschiedenis van M.E.(cvs) [Bell DS, Bell KM, Cheney PR. Primary juvenile fibromyalgia-syndrome and Chronic Fatigue Syndrome in adolescents. Clin Infect Dis. 1994; 18 Suppl 1:S21-S23]; maar ook hier was niet duidelijk over welke verwanten het ging.

Tweelingen-studies

Onderzoekers hebben een tweelingen-methodologie gebruikt om te bepalen hoeveel van de beschreven familiale aggregatie te wijten is aan genetische factoren en hoeveel aan de omgeving. Tweelingen-studies bij volwassenen hebben voor M.E.(cvs) consequent hogere overeenstemming getoond bij monozygote tweelingen vergeleken met dizygote tweelingen, waarbij de monozygote correlatie gewoonlijk tenminste het dubbel was van die van de dizygote correlatie […]. Aangezien omgevingsfactoren (bv. infekties of ouderlijke opvoeding) tijdens de kindertijd gelijkaardig moeten zijn geweest bij monozygote en dizygote tweelingen-paren, kan het verschil tussen de monozygote tweelingen – die 100% hetzelfde DNA hebben – en de dizygote tweelingen – die gemiddeld 50% gemeen hebben – gebruikt worden om te berekenen wat de bijdrage is van genetische overdraagbaarheid. Het verschil in overeenstemming stijgt bij het hanteren van een striktere definitie bij volwassenen. Dit levert bewijs voor een kern M.E.(cvs)-groep waarbij genetische factoren een belangrijke rol spelen.

[…]

Tweelingen-studies die vermoeidheid bij kinderen onderzoeken komen overeen met deze bij volwassenen. In het V.K. werden verzorgers van 670 tweelingen-paren bevraagd over invaliderende vermoeidheid van meer dan een week en meer dan een maand. In beide gevallen was de overeenkomst groter bij monozygote tweelingen vergeleken met dizygote tweelingen (0,81 vs 0,59 voor één week, 0,75 vs 0,47 voor één maand). Dit suggereert dat de genetische bijdrage tot het ervaren van invaliderende vermoeidheid hoog is. Deze studie werd uitgebreid: de duur van de vermoeidheid werd gedefinieerd als enkele dagen, meer dan een week, meer dan 1, 3 of 6 maanden; en de relatie tussen vermoeidheid en depressie werd nagegaan bij 1.468 tweelingen-paren. Voor kort-durende vermoeidheid was de genetische overdraagbaarheid hoog en er kon geen gedeelde bijdrage van omgevingsfactoren worden gedetekteerd. Voor langdurige vermoeidheid doken er substantiële omgevingsinvloeden op en een matige genetische bijdrage.

Is de erfelijkheid van vermoeidheid te wijten aan depressie?

Dit stelt de vraag of de vermoeidheid die wordt gemeten eigenlijk een deel is van een stemmingsaandoening zoals depressie (ook gekend als erfelijk). In de pediatrische studie hierboven beschreven, werd voor allebei de korte en verlengde vermoeidheid aangetoond dat de meerderheid van de genetische en milieu-variantie specifiek is voor invaliderende vermoeidheid en verschillend van factoren die bijdragen tot depressie. Dit is consistent met een studie bij volwassenen waar depressie, angst en psychologisch leed werden gemeten bij 1.004 volwassen tweelingen-paren. ‘Structural equation modelling’ [SEM is een statistische techniek voor jet testen en inschatten van oorzakelijke verbanden via combinatie van of statistische gegevens en kwalitatieve causale veronderstellingen; het is geschikt voor het testen, niet het ontwikkelen, van een theorie.] suggereerde dat de familiale aggregatie van vermoeidheid grotendeels te wijten was aan genetische factoren, welke niet voorkwamen bij andere metingen van psychologisch leed. Met andere woorden: chronische vermoeidheid is erfelijk en deze erfelijkheid is etiologisch verschillend van psychologisch lijden. Deze studies zijn belangrijk aangezien ze suggereren dat vermoeidheid NIET ‘slechts een variant van depressie’ is.

M.E.(cvs) lijkt daarom, ten minste gedeeltelijk, te gehoorzamen aan Turkheimer’s ‘wetten van gedragsgenetica’ [Wet 1: Alles is erfelijk * Wet 2: Het milieu-effekt te zijn opgegroeid in hetzelfde gezin is substantieel kleiner dan het genetisch effekt en benadert dikwijls nul. * Wet 3: De meeste gedragsmatige variabiliteit blijft in de fouten-marge nadat genetische effekten en de effekten van te zijn opgegroeid in hetzelfde gezin werden in rekening gebracht.]. Veel aandoeningen die aan deze wetten gehoorzamen worden echter ook door de omgeving bepaald wanneer men veranderingen qua risico over de tijd en tussen populaties in overweging neemt. Obesitas, bv., vertoont een hoge erfelijkheid – typisch rond 70% – maar ter zelfder tijd hebben we een dramatische stijging in prevalentie gezien, wat er duidelijk op wijst dat omgevingsfactoren betrokken zijn. Schattingen van genetisch en omgevingsbijdragen aan ziekte-risico uit tweelingen-studies kan natuurlijk niet de bijdrage weerspiegelen van bijna universele milieu-blootsellingen of van deze die veranderen over alle lagen van de maatschappij, zoals het evenwicht tussen energie-besteding en energie-opname. Bovendien is de veronderstelling dat schijnbaar gemeenschappelijke blootstellingen – zoals scheiding van de ouders – hetzelfde effekt heeft op twee individuen niet noodzakelijk gerechtvaardigd, aangezien eerdere ervaringen en individuele karakteristieken bij blootstelling kunnen leiden tot verschillende effekten bij verschillende mensen.

Associatie-studies

Zoals bij veel aandoeningen met bewijs voor substantiële erfelijke overdraagbaarheid – en enkele zonder – omvatte veel recent werk zoekwerk naar associaties met kandidaat-genen in gevallen-controle studies bij de bevolking. De kandidaat-genen werden zo gekozen dat ze de gepostuleerde mechanismen via dewelke M.E.(cvs) ontstaat, weerspiegelen; bv. varianten in de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as. Als varianten verbonden met verschillende HPA aktiviteit-profielen geassocieerd zouden zijn met risico voor M.E.(cvs), zou dit goed bewijs leveren voor het feit dat potentieel modificeerbare milieu-invloeden op HPA-funktie oorzakelijk gerelateerd zijn met het risico om M.E.(cvs) te ontwikkelen. De redenering hier is complex maar belangrijk. Als we de HPA-as als voorbeeld blijven gebruiken, kunnen we zien dat potentiële omgevingsinvloeden op de HPA-funktie van een kind (bv. onenigheid tussen de ouders) of zelfs directe metingen van de HPA-funktie, verband zullen hebben met een brede waaier aan andere mogelijke oorzaken van M.E.(cvs). Daarom zullen de associaties verstoord worden door deze factoren en is het niet mogelijk de etiologische processen te isoleren die zouden kunnen gemodificeerd worden om M.E.(cvs) te voorkomen of behandelen […]. Bovendien zou het bij M.E.(cvs) betrokken ziekte-proces de HPA-funktie kunnen wijzigen, eerder dan dat verstoorde HPA-funktie leidt tot M.E.(cvs), een situatie die ‘causale omkering’ wordt genoemd. Genotypes zijn echter niet geassocieerd met verstorende factoren; ook veranderen ziekte-processen genetische varianten van geslachtscellen niet. Een genotype verbonden met HPA-funktie kan dus als merker worden genomen voor dergelijke eigenschappen die niet worden verstoord door noch vatbaar zijn voor omkering van oorzakelijk verband, en zodoende beter bewijs voor of causaliteit leveren. Naar deze benadering om genetische data te gebruiken wordt gerefereerd als ‘Mendeliaanse Randomisering’ [De willekeurige overdracht van genen van ouders naar nageslacht die plaatsvindt tijdens vorming van geslachtscellen en bevruchting. * Het aanwenden van verbanden tussen genotype en ziekte om dingen te weten te komen over door het milieu modificeerbare oorzaken van ziekte en zo het causaal effekt te testen, gebruikmakend van gemeten variatie in genen met een gekende funktie.] en dit wordt ook toegepast in andere klinische settings. Deze benadering van genetische epidemiologie gebruikt genetische gegevens om de potentieel modificeerbare oorzaken van ziekte te begrijpen, eerder dan om een basis aan te reiken voor voorspellende genetische testen.

Studies naar genetische associatie bij M.E.(cvs) zijn tot op heden enkel uitgevoerd bij volwassenen. De bevindingen waren gemengd; ze worden hier samengevat.

HPA-as: Varianten van het Corticosteroid Bindend Globuline (CBG) gen werden beschreven in een geïsoleerde verwantschap en de aanwezigheid was geassocieerd met idiopathische chronische vermoeidheid en M.E.(cvs) (CDC definitie) [Torpy DJ, Bachmann AW, Grice JE, Fitzgerald SP, Phillips PJ, Whitworth JA et al. Familial corticosteroid-binding globulin deficiency due to a novel null-mutation: association with fatigue and relative hypotension. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86(8):3692-3700]. Bij onderzoek in een gevallen-controle studie was er echter geen sterk verschil in CBG-prevalentie in een groep van 248 patiënten met M.E.(cvs) in vergelijking met 248 controles [Torpy DJ, Bachmann AW, Gartside M, Grice JE, Harris JM, Clifton P et al. Association between Chronic Fatigue Syndrome and the corticosteroid-binding globulin gene ALA SER224 polymorphism. Endocr Res. 2004; 30(3):417-429]. Andere ‘single nucleotide’ polymorfismen [SNPs; variaties in een DNA-sequentie die voorkomt wanneer één enkel nucleotide (A, T, C of G) in een genoom verschilt] van belang bij HPA-as worden verder beschreven.

HLA-genotype: Of HLA-genotypen geassocieerd zijn met M.E.(cvs) of niet is controversieel. Eén studie toonde geen significante verbanden vergeleken met controls [Underhill JA, Mahalingam M, Peakman M, Wessely S. Lack of association between HLA-genotype and Chronic Fatigue Syndrome. Eur J Immunogenet. 2001; 28(3):425-428] en één studie suggereerde een verhoogde frequentie van HLA-DQ A1*01 [Humaan Lymocyt Antigen klasse II, DQ alfa 1, een gen coderend voor een eiwit dat vereist is bij de vorming van een receptor op het cel-oppervlak die essentieel is voor de werking van het immuunsysteem.] [Smith J, Fritz EL, Kerr JR, Cleare AJ, Wessely S, Mattey DL. Association of Chronic Fatigue Syndrome with human leucocyte antigen class II alleles. J Clin Pathol. 2005; 58(8):860-863]. Beide studies waren klein (respectievelijk 58 en 49 patiënten) […].

Cytokinen: Eén studie bij italiaanse patiënten met M.E.(cvs) onderzocht promoter [plaats in het DNA, voor een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie te starten] -polymorfismen voor IL-10, IL-6 en IFNγ, en toonde een verhoging qua TNF-genotypen vergeleken met controles met een daling van lage IFNγ  producenten [Carlo-Stella N, Badulli C, De SA, Bazzichi L, Martinetti M, Lorusso L et al. A first study of cytokine genomic polymorphisms in CFS: Positive association of TNF-857 and IFNgamma 874 rare alleles. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24(2):179-182]. Dit is echter slechts één enkele studie waarvan tot nu toe and de bevindingen niet werden her-bevestigd. [De ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ leverde in 2008 ook bewijs voor het feit dat genetisch bepaalde variaties in de intensiteit van de inflammatoire respons aan de basis liggen van de ernst van de acute ziekte-respons; zie: ‘Cytokine polymorfismen & respons op infektie’]

Het belangrijkste aspekt wat betreft associatie-studies in dit domein moet zijn dat ze ernstig onderbemand zijn, dus is  het niet onverwacht dat er geen robuste bevindingen zijn opgedoken. Realistische veronderstellingen over de effekt-grootte die zou kunnen bestaan tussen courante genetische varianten en een complexe niet-homoge ziekte zoals M.E.(cvs) zouden suggereren dat, om informatief te zijn, studies vereist zijn met aantallen die ten minste een orde groter zijn dan de huidige studies. De inspanning is het echter waard, aangezien ze het potentieel hebben ons te informeren over modificeerbare risico-factoren voor M.E.(cvs), door gebruik te maken van de ‘Mendeliaanse Randomisering’ hierboven bessproken. Indien studies met voldoende grote aantallen bevestigde associaties tussen genetische varianten en risico voor M.E.(cvs) opleveren, dan suggereert dit tevens dat de bestudeerde M.E.(cvs) patiënten-groep ten minste een subgroep met een coherente diagnose vertegenwoordigt; want als de diagnose eigenlijk volledig incoherent is, kunnen geen echte verbanden worden gevonden.

Naast onderzoeken van genetische varianten en M.E.(cvs)-risico, zijn er studies geweest over verschillen qua gen-expressie – d.w.z. hoeveelheden RNA transcriptie-produkten – in patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met controles. Deze studies zijn informatief in de zin dat ze ons vertellen over mogelijke mechanismen van ziekte-ontwikkeling maar uiteindelijk zijn gen-expressie gegevens metingen van de lichamelijke toestand en reaktie, in tegenstelling tot genotype-gegevens. Aangezien patiënten met een diagnose van M.E.(cvs) worden onderscheiden van degenen die er geen krijgen op basis van fenotypische verschillen, wordt verwacht dat verschillen qua gen-expressie zullen bestaan. Er rijzen echter problemen omdat sedentaire aktiviteit zelf, laat staan verschillen qua medicatie of dieet, even goed gen-expressie kunnen wijzigen. Gen-expressie studies zijn daarom minder informatief over de ontologie [het ontstaan] van M.E.(cvs) dan genetische associatie-studies, hoewel studies die gen-expressie en genetische variantie combineren bijzonder doortastend kunnen zijn wanneer ze overeenstemmende informatie verstrekken.

Drie relatief kleine studies hebben gewijzigde gen-expressie beschreven bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met controles [***]. Elke studie identificeerde genen met differentiële expressie-patronen (tabel 1). De geïdentificeerde verbanden werden echter niet herhaald en elke studie beschreef verschillende biologische mechanismen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de geringe grootte van het staal van wat vermoedelijk een niet-homogene ziekte is, samen met de problemen hierboven besproken.

Meer recent dook meer genetische informatie op uit een uitgebreid onderzoek bij 227 inwoners van Wichita [o.a. Vollmer-Conna U, Aslakson E, White PD. An empirical delineation of the heterogeneity of chronic unexplained fatigue in women. Pharmacogenomics. 2006; 7(3):355-364], uitgevoerd door het ‘Centres for Disease Control and Prevention’. [zie: ‘Genen-studies bij CVS door het CDC’]

Naast het bestuderen van gen-expressie (tabel 2), keek de CDC-groep ook naar genomisch DNA. Eén onderzoeksgroep testte of ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) de vijf groepen kon onderscheiden, terwijl een andere groep onderzoch of SNP-profielen konden worden gebruikt om te voorspellen of een patient M.E.(cvs) had of niet.

In de eerste studie vond men dat drie van de op basis van klinische en laboratorium-gegevens beschreven klassen geassocieerd waren met genen betrokken bij de HPA-as funktie of stemming-gerelateerde neurotransmitter-systemen (monoamine-oxidase A en B, en tryptofaan-hydroxylase). In de tweede studie bleek één bepaalde combinatie van 5 SNPs in staat patiënten te identificeren tegenover controls (OR 8.94, p<0.00001). De meest belangrijke genen van deze studie codeerden voor neuronaal tryptofaan-hydroxylase (TPH2), catechol-o-methlyltransferase en een glucocorticoid receptor NR3C1. (TPH2 is bepalende enzyme bij de synthesr van serotonin, zelf een voorloper van melatonine). Genen voor corticotropine-afgevend hormoon [CRH] receptoren bleken ook betrokken. Alhoewel potentieel interessant wat betreft betrokken biologische mechansimen, zijn deze studies zwaar onderbemand en is herhaling vereist vooraleer de bevindingen enige geloofwaardigheid kunnen krijgen.

————————-

Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker discovery in Chronic Fatigue Syndrome. Dis Markers. 2002; 18(4):193-199

Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S, Almond J. Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients. Clin Exp Allergy. 2003; 33(10):1450-1456

[zie ‘Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid’]

Kaushik N, Fear D, Richards SC, McDermott CR, Nuwaysir EF, Kellam P,…, Kerr JR. Gene-expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Pathol. 2005; 58(8):826-832

“Analyse van micro-array data reveleerde differentiële expressie van 35 genen. Real-time PCR bevestigde dezelfde differentiële expressie voor 16 van deze genen; 15 ervan waren ge-upreguleerd (ABCD4, PRKCL1, MRPL23, CD2BP2, GSN, NTE, POLR2G, PEX16, EIF2B4, EIF4G1, ANAPC11, PDCD2, KHSRP, BRMS1 en GABARAPL1) en één ge-downreguleerd (IL-10RA). Dit profiel suggereert T-cel aktivatie en verstoring van neuronale en mitochondriale funktie.”

————————-

Samengevat: er is groeiend en sterk bewijs dat M.E.(cvs) erfelijk is. Het lijkt er op dat de erfelijkheid bijdraagt tot het ervaren van vermoeidheid alsook tot de ontwikkeling van M.E.(cvs) zelf. Het zou daarom niet moeten verrassen dat M.E.(cvs) familiaal voorkomt en pediaters zullen families tegenkomen waar meer dan één persoon is aangetast. Alhoewel er enige instemming is dat een model moet worden aangewend waarbij de samenwerking van genen en omgevingsfactoren vereist is, is er momenteel weinig overeenkomst betreffende de eigenlijke betrokken genen en omgevingsfactoren.

Het feit dat M.E.(cvs) heterogeen is, hindert de research op dit vlak. Het beter doorzien van de verschillende biologische processen en de betrokken genen bij M.E.(cvs) is echter een belangrijke stap bij het begrijpen en ontwikkelen van methoden ter preventie of behandeling van deze belangrijke aandoening. Genetische studies kunnen deze research vooruitstuwen en een anker-punt vormen waardoor M.E.(cvs) kan worden begrepen, en de wijzigbare risico-factoren bepaald die een invloed hebben.

*************************

Tabellen 1 & 2 kunnen worden bekeken op

http://www.cfids-cab.org/rc/Crawley-1.pdf

Gen-expressie bij tweelingen met/zonder chronische vermoeidheid

In een artikel in het Journal of Clinical Pathology uit 2007 (‘Current research priorities in Chronic Fatigue Syndrome/ Myalgic Encephalomyelitis: disease-mechanisms, a diagnostic test and specific treatments’) schreef Professor Jonathan Kerr (van de Collaborative Clinical Study Group): “Verscheidene groepen hebben gen-expressie bestudeerd in perifeer bloed van patiënten met CVS [...] We kennen echter de precieze gen-signatuur en de betrokken metabole mechansimen nog niet. [...] Het zal belangrijk zijn te verzekeren dat eens een gen-signatuur geïdentificeerd is, deze specifiek is voor CVS en niet voorkomt bij andere ziekten en infekties.”.

Onderstaand artikel pretendeert dat er GEEN verschillen in gen-expressie zijn tussen chronisch vermoeiden en controles. Hoewel er in de vele publikaties door andere groepen daaromtrent nog niet één gen als specifieke CVS-merker kon worden aangeduid, is de bewering van dit team voorbarig. Zeker als men rekening houdt met de fouten die ze maken. Lees daarom ook de commentaren van andere wetenschappers op dit vlak…

Ook dit is wetenschap: discussie en (her-)evaluatie!

Zoals in de kritieken op dit artikel werd aangegeven, zijn er wel meer publikaties dan die waarnaar hier wordt gerefereerd. Maar, inderdaad: een merker is (nog) niet aangeduid. Daarom werd er op deze paginas ook nog geen melding van gemaakt.

www.plosone.org

PLoS One. 2009 Jun 5;4(6):e5805

Gen-expressie in perifeer bloed leukocyten in monozygote tweelingen met en zonder chronische vermoeidheid: geen bewijs voor een biomerker

Byrnes A, Jacks A, Dahlman-Wright K, Evengard B, Wright FA, Pedersen NL, Sullivan PF

Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, United States of America

ACHTERGROND: Chronische vermoeiende ziekte wordt nog steeds een slecht begrepen syndroom met ongekende pathogenese. We probeerden biomarkers hiervoor te identificeren d.m.v. ‘micro-chips’ om het transcriptoom [verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen - ‘transcripten’ , tot expressie komende genen - geproduceerd in een cel of populatie van cellen] in perifeer bloed leukocyten te onderzzoeken.

METHODEN: De gevallen waren 44 individuen die klinisch werden geëvalueerd en bleken te voldoen aan de standaard internationale criteria voor Chronische Vermoeidheid Syndroom of idiopathische chronische vermoeidheid, en de controles waren hun monozygote [‘ééneiïge’] tweeling-helften die klinisch werden geëvalueerd en nooit, zelfs niet één maand invaliderende vermoeidheid hadden. De omstandigheden voor de biologische staalname waren gestandardiseerd en RNA-stabiliserende media werden gebruikt. Deze methodologische kenmerken bieden rigoureuze controle voor bias […] en experimentele fouten. Individuele gen-expressie profielen werden beoordeeld met ‘Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0’ chips.

BEVINDINGEN: Er waren geen significante verschillen qua gen-expressie voor om het even welk transcript.

BESLUITEN: In tegenstelling tot onze verwachtingen, konden we geen biomerker voor chronische vermoeiende ziekte in het transcriptoom van perifeer bloed leukocyten identificeren; wat suggereert dat positieve bevindingen in vroegere studies wellicht het resultaat zijn van experimentele bias.

Inleiding

[…] De beschikbaarheid van een biomerker voor CVS zou van bijzonder nut zijn voor klinisch en fundamenteel onderzoek.

Gen-expressie studies met perifeer bloed leukocyten (PBLs) zijn een potentieel veelbelovende bron voor biomerkers voor CVS. PBLs zijn makkelijk verkrijgbaar en van belang voor CVS gezien de prominentie van immuniteit- en infektie-theorieën. Bovendien zijn gen-expressie patronen in menselijke PBLs niet ongerelateerd met minder toegankelijke weefsels zoals de hersenen. We hebben weet van vier gepubliceerde niet-overlappende studies die gen-expressie in PBLs vergelijken bij gevallen met CVS en controles [***]. Deze kleine studies omvatten totaal slechts 45 gevallen (5, 7, 8 en 25) en van de 108 transcripten waarvan werd gerapporteerd dat ze een gewijzigde expressie hebben, was slechts één enkel transcript veranderd in meer dan één studie (MSN, moesin) [‘membrane-organizing extension spike protein’, lid van een familie proteïnen die blijkbaar werken als cross-linkers tussen plasma-membranen en actine-cytoskeleton, ze  zijn betrokken bij signalisering-mechanismen; moesin blijkt cruciaal te zijn bij T-cel aktivatie].

Gezien het gebrek aan duidelijkheid bij de bestaande studies bij CVS, ondernamen we een ‘onbevooroordeelde’ zoektocht over het ganse transcriptoom naar veranderingen qua gen-expressie geassocieerd met PBLs bij CVS. Onze studie had twee opmerkenswaardige ontwerp-kenmerken. Ten eerste: we gebruikten een controle-groep die optimaal is voor het detekteren van wijzigingen in status-gerelateerde gen-expressie en minimaliseerden vals-positieve resultaten te wijten aan genetische mis-matching tussen gevallen en controles aangezien we 44 individuen met klinisch geëvalueerde chronische vermoeiende ziekte tegenover hun 44 onaangetaste monozygote tweeling-helften stelden. Gebruik van strikt tegenstrijdige, monozygote tweelingen geeft de beste controle qua genetische achtergrond die momenteel mogelijk is bij mensen en laat gepaarde statistische testen met een grotere statistische kracht toe. Ten tweede: we standardiseerden zorgvuldig de staalname-condities zodat de PBL-stalen werden afgenomen in RNA-stabiliserende media en op dezelfde tijd en plaats voor beide tweeling-helften.

Materialen en Methoden

[…]

We screenden ca. 61.000 individuele tweelingen uit het Zweeds Tweelingen Register op de symptomen van vermoeinde ziekte. […] CVS screening-vragen identificeerden 140 paar tweelingen die voldeden aan preliminaire inclusie-criteria: […] tegenstrijdigheid voor chronische vermoeiende ziekte (d.i. één tweeling rapporteerde substantiële vermoeidheid en de andere tweeling was klaarblijkelijk gezond). Via een telefonisch interview beoordeelden we de geschiktheid voor deelname. Tweelingen die geschikt bleken, werden gedurende een halve dag klinisch geëvalueerd door een speciaal getrainde arts. Daarbij werd een op CVS gericht medisch onderzoek uitgevoerd met inbegrip van een gestandardiseerde anamnese, fysiek onderzoek en biochemische, hormonale en haematologische screening overeenkomstig internationale aanbevelingen.

[…] Na uitsluiting van 83 tweelingen-paren, woonden 57 paar de klinische evaluatie-sessies bij: 10 paar bleken niet aan de inclusie-criteria te voldoen. […] Zygositeit werd bevestigd d.m.v. genotypering van 46 ‘single nucleotide’ polymorfismen. [DNA-onderzoek waarbij SNPs - kleine wijzigingen van slechts één bouwsteentje - worden vergeleken]

Het analyse-staal bestond uit 44 paar of strikt tegenstrijdige en genetisch bewezen monozygote tweelingen. De definitie van verschil was: één tweeling voldoet aan criteria voor idiopathische chronische vermoeidheid (ICF, 12 paar) of CVS (32 paar) [Fukuda] en de co-tweeling had nooit invaliderende ongewone vermoeidheid of moeheid van langer dan een maand gehad. Alle aangetaste tweelingen moesten dus aktuele, langdurige (≥6 maand), medisch onverklaarde vermoeidheid geassocieerd met substantiële stoornis qua sociaal en beroepsmatig funktioneren hebben en de niet-aangetaste co-tweelingen waren effektief gezond. Een diagnose van CVS vergt bijkomend ≥4 van 8 specifieke symptomen (bv. niet-verfrissende slaap, spier-pijn) naast die van ICF. We legden eerder al de rationale uit voor de inclusie van ICF samen met CVS op basis van fenotypische [Sullivan PF, Jacks A, Pedersen NL, Evengard B. ‘Chronic fatigue in a population sample: definitions & heterogeneity’. Psychologal Medicine 35(2005): 1337-1348] en tweelingen-analyses [Sullivan PF, Evengard B, Jacks A, Pedersen NL. ‘Twin analyses of chronic fatigue in a Swedish national sample’. Psychol Med 35(2005): 1327-1336].

[Wat betreft deze rationale: Deze auteurs hebben het over het gebrek aan empirische ondersteuning voor de vereiste van vier van acht kardinale CVS-symptomen. Ze stelden eerder dat een “CVS-achtige ziekte” bestaat maar dat de dominante benadering enkel variaties op bevolkingsniveau weergeeft. Ze suggereerden dat een meer “spaarzame” definitie moet worden betracht… Dit weerspiegelt de ganse discussie van ‘splitters’ en ‘lumpers’ (het samenvoegen van CVS met andere chronisch vermoeiden). zie: ‘Evaluatie van de CDC Empirische Definitie’ voor kritiek op deze aanpak.]

Voorbijgaande/situationele factoren kunnen metingen van gen-expressie beïnvloeden. Biologische staal-name werd gestandardiseerd door het bloed van beide tweeling-helften af te nemen op dezelfde plaats en tijd (ca. 09:00) na overnacht vasten. […] zonder acute ziekte of recente verslechtering. Het was niet praktisch noch ethisch om de individuen vrij van medicatie te bestuderen maar we stelden de beoordeling uit als er recent significante veranderingen qua dosis waren geweest.

[…]

Resultaten

[…]

De voornaamste analyse stelde gen-expressie in PBLs bij 44 monozygote tweelingen met CVS of ICF tegenover die van hun gezonde tweeling-helft. Aangezien inclusie van mannen de ‘ruis’ zou kunnen verhogen, vergeleek een tweede analyse 39 vrouwelijke tweelingen met CVS of ICF en een derde analyse vergeleek 28 vrouwelijke tweelingen met CVS. Voor elk van deze drie sets statistische vergelijkingen, weken de geobserveerde resultaten niet af van deze die worden verwacht door toevalligheid. Wanneer we onze bevindingen vergeleken met een lijst van 108 transcripten met een verschillende expressie bij CVS gerapporteerd in eerdere studies, waren er 107 die ook in ons experiment werden bestudeerd, 101/107 hadden p>0.1 [niet significant] in onze studie en slechts twee hadden p<0.05 (CXCR4 p=0.03 en RAP2C p=0.04) [p staat voor ‘probalilty’, een maat voor statische significantie]. Op het niveau van alleenstaande transcripten, was er geen biologisch bewijs voor gewijzigde gen-expressie in PBLs dat correleerde met chronische, invaliderende en medische onverklaarde vermoeiende ziekte. Ter verificatie gebruikten we qRT-PCR [kwalitatieve Reverse Transcriptase PCR; techniek om kleine hoeveelheden mRNA te detekteren] om de expressie te bepalen van zeven genen geselekteerd uit de CVS gen-expressie literatuur en onze empirische bevindingen (ANKLE2, BLKE, BRD1, CPA3, DCTN1, ICAM en ORC). Alle p-waarden van gepaarde t-testen die zieke en gezonde monozygote tweelingen tegen over elkaar stelden waren ≥0.26 [niet significant].

Het is mogelijk dat funktioneel-gerelateerde genen belangrijke gen-expressie veranderingen per set vertonen zonder dat een individueel transcript voldoet aan de criteria voor significantie. Hypothese-genererende analyses […] reveleerden significante verschillen in cel-replicatie processen en aminozuur en lipiden metabole mechanismen. Deze resultaten verwijzen niet direct naar de huidige theorieën voor CVS-pathogenese […].

Bespreking

Belangrijkste bevinding

Het overkoepelende doel van deze studie was te proberen één of meerdere biomerkers te identificeren voor chronische vermoeiende ziekte via een uitvoerig onderzoek van het transcriptoom in een toegankelijk weefsel (perifeer bloed leukocyten, PBLs) die mogelijks betrokken zijn bij de pathofysiologie van dit idiopathisch [onbekende oorzaak] syndroom. We poogden methodologische kwesties in eerdere rapporten te corrigeren door zorgvuldig te controleren op bronnen van mogelijke bias (bv. door het bestuderen van tegenstrijdige monozygote tweelingen-paren, het gebruik van RNA-stabiliserende media en gestandardiseerde staalname-condities). We vonden geen bewijs voor verschillen qua gen-expressie in PBL die de aan- of afwezigheid van CVS of ICF zouden kenmerken. Daarom, in tegenstelling tot de meeste eerder gepubliceerde studies, vonden we geen bewijs voor een gen-expressie biomarker voor chronische vermoeiende ziekte.

Methodologische kwestie: genetische overeenkomsten in gen-expressie studies

Deze resultaten kunnen een les inhouden voor ‘case-control’ gen-expressie studies bij mensen. Er zijn zeker voorbeelden waarbij transcriptoom-studies resultaten hebben opgeleverd die het potentieel hebben om de prognose en het management van een ziekte te verbeteren (bv. borst-kanker); gen-expressie studies hebben echter het potentieel vals positieve bevindingen op te leveren als de afstamming van de gevallen en controles niet op een passende manier zijn gematcht. Genetische achtergrond wordt normaal gezien niet in overweging genomen hoewel gen-expressie én erfelijk kan zijn én onder strikte genetische controle kan staan. Studies met relatief lage resolutie in onsterfelijk gemaakte PBLs suggereren dat honderden menselijke genen onder relatief sterke genetische controle staan van courante genetische varianten […]. Als gevallen en controles niet extreem goed gematcht zijn voor genetische achtergrond (inclusief voor ligging in Europa) zouden sterk significante verschillen kunnen worden genoteerd omwille van bias door het ongeschikt matchen van gevallen en controles. Deze bezorgdheid is bijzonder belangrijk voor studies met PBLs aangezien genen waarvan de expressie onder strenge genetische controle staat, sterk zijn aangerijkt qua genen die tot expressie komen in lymfe-weefsel en lymfocyten-populaties […].

Gebruik van discordante monozygote tweelingen vertegenwoordigt op dit moment de beste controle voor genetische achtergrond die mogelijk is bij mensen. Uitgaande van het feit dat er identificatie op DNA-niveau en controle voor experimentele bias is, kunnen gen-expressie verschillen in niet overéénstemmende monozygote tweelingen netjes aan de ziekte-toestand worden toegeschreven. […] Gebruik van tegenstrijdige monozygote tweelingen levert beter interpreteerbare resultaten op, bijzonderlijk omdat er grote aantallen niet-causale loci onder genetische controle zijn. We zouden ook moeten argumenteren dat een gen-expressie studie een slechte manier is om genetische loci, oorzakelijk voor een ziekte, te identificeren als een alternatief studie-ontwerp (de ‘genome-wide association study’)

[Onderzoek van genetische variatie over gans het genoom, ontworpen om genetisch verbanden met observeerbare eigenschappen te identificeren. Het ‘Human Genome Project’ maakte het mogelijk om de genetische bijdragen te vinden voor ziekten en stalen te analyseren voor genetische variaties die bijdragen tot hun aanvang.] zo succesvol is geweest.

Besluiten

We waren niet in staat een biomerker te identificeren voor chronische vermoeiende ziekte in het transcriptoom van perifeer bloed leukocyten; wat suggereert dat de positieve bevindingen in eerdere studies het resultaat zou kunnen zijn geweest van experimentele bias.

————————-

Volgens de auteurs de enige meldingen van positieve resultaten betreffende gen-expressie profielen/sub-types bij CVS???!!!… Merk op: kleine groepen en verschillende methodologie.

Vernon SD, Unger ER, Dimulescu IM, Rajeevan M, Reeves WC. ‘Utility of the blood for gene-expression profiling and biomarker-discovery in Chronic Fatigue Syndrome’. Dis Markers. 2002;18:193-199

“Acht genen kwamen verschillend tot expressie [1.764 genen op filter-arrays met RNA uit PBMCs] in een gevallen-controle-analyse (gematcht voor leeftijd) én bij vergelijking van alle CVS-gevallen [n = 5] met alle controles. Meerdere van die genen zijn geassocieerd met immunologische funkties (bv. CMRF35 antigen [cel-membraan antigen betrokken bij de interaktie tussen T-cellen], IL-8, HD proteïne [‘Huntingdon Disease’ eiwit, wellich teen link met neurologische schade zoals Alzheimer’s en Parkinson’s]) en impliceren immuun-dysfunktie bij de pathophysiologie van CVS.”

Powell R, Ren J, Lewith G, Barclay W, Holgate S et al. ‘Identification of novel expressed sequences, up-regulated in the leucocytes of Chronic Fatigue Syndrome patients’. Clin Exp Allergy. 2003;33:1450-1456

“Twaalf korte sequenties met over-expressie werden geïdentificeerd in lymfocyten van CVS-patiënten [n = 7]. Twee ervan corresponderen met cathepsine-C en MAIL1 – genen met gekende upregulering in geaktiveerde lymfocyten. Bijkomend bewijs voor het idee dat CVS een ziekte is die wordt gekenmerkt door subtiele veranderingen in het immuun-systeem.”

Grans H, Nilsson P, Evengard B. ‘Gene-expression profiling in the Chronic Fatigue Syndrome’. J Intern Med. 2005;258:388-390

“We vonden geen aanwijzingen voor verschillende expressie tussen de ganse patiënten-groep [n = 20] en de controle-groep. […] Verdere analyses werden uitgevoerd bij enkel de vrouwelijke studie-deelnemers. […] Significante verschillen qua gen-aktiviteit werd gedetekteerd voor drie genen (CD83 [funktionele rol in het immuunsysteem], BOLA1 [enzyme betrokken bij de synthesie van nicotinamide] en NRK1 [funktie onbekend]).”

Kerr JR, Petty R, Burke B, Gough J, Fear D et al. ‘Gene-expression subtypes in patients with Chronic Fatigue Syndrome / Myalgic Encephalomyelitis’. J Infect Dis. 2008;197:1171-1184

“… differentiële expressie van 88 genen bij M.E(cvs). …12 genen ge-upreguleerd die elders ook ge-upreguleerd bleken, direct of indirect, bij EBV-infektie: NFKB1, EGR1, ETS1, GABPA, CREBBP, CXCR4, EBI2, HIF1A, JAK1, IL6R, IL7R en PIK3R1.”

*************************

Commentaren

Dr Jonathan Kerr (St George’s University of London) 08 juli 2009

Dit artikel beschrijft een kleine studie (totaal of 28 CVS-patiënten en 28 controles) en besluit dat gen-expressie in PBL niet nuttig is voor het vinden van een biomerker voor CVS. Er zijn echter meerdere zwakheden en enkele onverenigbare aspekten aan deze studie.

De patiënten werden geïdentificeerd via screening van symptomen en daaropvolgende klinische beoordeling. Maar er werd niet gemeld hoeveel van de 28 CVS-patiënten voorheen de diagnose van CVS hadden gekregen. Deze recrutering-strategie zal een verschillende populatie identificeren dan de studies die focussen op patiënten met een voorafgaande diagnose van CVS die een CVS-kliniek bezoeken.

Daarenboven is de opname van patiënten met ‘idiopathische chronische vermoeidheid slechts vulling (vermoedelijk was het moeilijk om aan een voldoende aantal te komen), aangezien deze diagnose (ICF) er niet één is die formeel wordt erkend. De titel bevat ook de formele diagnose ‘Chronische Vermoeidheid Syndroom’ niet maar ‘chronische vermoeidheid’, waarvoor geen diagnostische criteria werden vermeld in het artikel.

Er wordt gemeld dat nadat micro-chip bevindingen negatief bleken, de auteurs probeerden om 7 eerder gerapporteerde met CVS geassocieerde genen te bevestigen via ‘real-time’ PCR met 18S-rRNA als endogene controle. We hebben echter gevonden dat 18S-rRNA statisch significant verschillend tot expressie komt bij CVS-patiënten en normale bloed-donoren (ongepubliceerd). Dus is dit geen bruikbaar endogeen controle-gen en zal het misleidende resultaten geven in deze context. Wij gebruikten in onze studies in plaats daarvan GAPDH, dat niet verschilt tussen CVS- en normale populates (Kaushik et al. 2005; Kerr et al. 2008); Powell et al. 2003 gebruikten ook GAPDH.

De auteurs melden dat het gen MSN (moesin) het enige is tot op heden dat gemeenschappelijk werd gevonden bij CVS gen-studies (dit is niet correct – wat te zeggen over PRKARIA, EIF4G1, EGR1, CXCR4, enz.); dit gen, MSN, werd als eerste geïdentificeerd door Powell en bevestigs door Kaushik en Kerr, gebruikmakend van PCR, bij een totaal van 62 CVS-patiënten en >100 normale controles (gecombineerde individuen van deze studies). Dus zou dit zeker een ideaal gen zijn geweest om te testen en ev. als biomerker te weerleggen, gezien zijn achtergrond en PCR-bevestiging. Daarnaast rapporteerden we 88 menselijke genen via micro-chips en PCR (Kerr et al. 2008); 16 daarvan werden eerder geïdentificeerd in een afzonderlijke studie via micro-chips en PCR (Kaushik et al. 2005). Maar in plaats daarvan kozen de auteurs 7 genen geïdentificeerd in een kleine studie die 8 CVS-gevallen en 7 normalen omvatte (Gow et al. 2009), en dit enkel via micro-chips zonder PCR bevestiging, waarbij 366 genen werden geïdentificeerd. Waarom gebruikten de auteurs niet de identieke PCRs en endogene controles uit eerdere studies om eventueel bevestigde CVS gen-merkers, zoals MSN en om het even welke van de 87 andere te weerleggen? Dit is duidelijke bevooroordeling wat betreft gen-selektie.

De grootste zwakte in het artikel is dat de SF36 [vragenlijst peilend naar lichamelijke pijn, algemene gezondheid, vitaliteit, sociaal funktioneren] -scores van de patiënten versus controles niet bijzonder verschillend waren. Het ziet er naar uit dat de patiënten lage SF36-scores hadden maar de ‘normale’ controles vertoonden scores die deze van de patiënten benaderden en zelfs overlapten! De SF36 fysieke funktie was 41,2 (bereik 28-48) voor CVS en 48,2 (bereik 40-52) voor normalen. Om de selektie van hun gevallen te ondersteunen, zou een [statistische] t-test nuttig geweest zijn maar ik vermoed dat dit zou hebben aangetoond dat deze 2 populaties niet statistisch verschillend waren, gebaseerd op deze scores. Deze SF36-resultaten zijn erg problematisch en zijn niet overtuigend voor het feit dat de fenotypes [het geheel van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken) van een organisme] van deze 2 populaties significant verschillen.

Waarom publiceerden de auteurs niet de volledige SF36-score in al zijn domeinen en niet enkel de fysieke en mentale funktie. De totale score is de meest nuttige en zou duidelijk het globaal funktioneren van de individuen hebben aangetoond, en zou een vergelijking van de funktionaliteit tussen gevallen en controles hebben makkelijker gemaakt. In onze studies, waren de gemiddelde SF36 totale scores <50 voor CVS en >80 voor controles, een weerspiegeling van afzonderlijke fenotypes. We gebruikten ook neurocognitieve funktie-testen (Cantab software), die ook de defekten van de CVS-patiënten bevestigden (Kerr et al. 2008).

Er zijn zoveel zwakheden aan deze studie dat de resultaten niet betrouwbaar kunnen worden geïnterpreteerd.

Dr Suzanne Vernon (CFIDS Association of America) 06 juli 2009

De studie van gen-expressie bij tweelingen is inderdaad een unieke en belangrijke kans om status-gerelateerde gen-expressie te detekteren. Het is onfortuinlijk dat de auteurs niet dezelfde stiptheid hanteerden in het laboratorium en qua methodologie als voor de selektie van de studie-populatie. Deze fouten, bovenop de overdrijvingen/ verkeerde voorstellingen moeten onder de aandacht van de lezer worden gebracht.

De inleiding geeft vier niet-overlappende studies over gen-expressie bij CVS aan. Een zoekopdracht voor ‘gene-expression’ en ‘Chronic Fatigue Syndrome’ in PubMed levert meer dan 50 publikaties op waarvan ten minste 10 niet-overlappende studies.

Bij de methodologie, gooien de auteurs CVS en ICF op één hoop [‘to lump’; vandaar ‘lumpers’] en negeren daardoor alle gepubliceerd bewijsmateriaal (uitgezonderd hun eigen) dat aantoont dat CVS klinisch en biologisch kan worden onderscheiden van ICF. De auteurs overwegen niet de uitdagingen gen-expressie te vergelijken tussen verschillende testen en berekening-technieken. Wellicht de meest ongehoord fout in deze publikatie is de vergelijking van gen-expressie in vol bloed met gen-expressie in perifeer bloed mononucleaire cellen. Veel voorkomende transcripten (bv. globine) zijn gekend om hun interferentie met gen-expressie. Er werd aangetoond dat de overvloed aan globine-genen in vol bloed de onderligggende biologische verschillen tussen stalen vol bloed van hetzelfde individu kan maskeren. Maskering van differentieel tot expressie komende genen bij de discordante tweelingen in deze studie is de waarschijnlijke verklaring voor het gebrek aan significante bevindingen in dit artikel, in plaats van het gebrek aan verschillende gen-aktiviteit. Het is opmerkelijk dat de auteurs dit gegeven niet in acht namen gezien het feit dat meer dan 50 artikels differentiële gen-expressie bij CVS hebben beschreven.

De auteurs wijten hun gebrek aan significante bevindingen aan experimentele bevooroordeling van andere onderzoekers terwijl het er, in feite, op lijkt dat hun eigen methodologische fouten en bias zijn die aanleiding geven tot hun onverwachte resultaten. Werd dit artikel haastig geschreven? Bovenop de eerder vermelde kwesties, staan er verscheidene typografische fouten in de bespreking, waardoor men zich gaat afvragen hoeveel aandacht de auteurs eigenlijk schonken bij het publiceren van dergelijke gebrekkige resultaten.

*************************

In een persoonlijke communicatie beschrijft Prof. Martin Pall (Professor of Biochemistry and Basic Medical Sciences, Washington State University, USA) nog enkele extra mogelijkheden:

Dit is een interessant artikel maar de interpretatie ervan is onduidelijk, omwille van meerdere redenen. Er zijn zowat acht verschillende studies die rapporteerden dat gen-expressie bij M.E.(cvs)-patiënten verschillend is van die van normale controles. En deze studies rapporteerden dat enkele wijzigingen qua gen-expressie, met betrekking tot genen die in verband staan met funkties die compleet verschillende types bewijs vormen, geïmpliceerd zijn bij M.E.(cvs). Deze omvatten bv. genen betrokken bij mitochondriale funktie en genen betrokken bij inflammatoire responsen.

Deze studie gebeurde bij paren identieke (monozygote) tweelingen waarbij één tweeling-helft ziek was en de andere niet. Deze studie is dus beter dan de andere studies in de zin dat er werd gecontroleerd qua exacte genetica. Deze studie was echter relatief klein. Daarenboven waren er bij de 44 tweeling-paren, 12 paren waarvan de zieke tweeling-helft ‘idiopathische chronische vermoeidheid’ had en bij de andere 32 was de M.E.(cvs) van de aangestaste tweeling-helft gebaseerd op de Fukuda criteria. Dit mengen van de groepen zou problematisch kunnen zijn als de gen-expressie patronen verschillend zijn bij de beide.

De eind-conclusie is dat ze niet in staat waren enige statistisch significante veranderingen qua gen-expressie te vinden bij de vergelijking van zieke tweeling-helften met gezonde.

Het gebruik van gepaarde identieke tweelingen is duidelijk een sterk punt van deze studie. Het mixen van twee verschillende types vermoeidheid is in mijn opinie een zwakte en het is mogelijk dat een grotere studie nodig is, één waarbij M.E.(cvs)-patiënten  worden bestudeerd.

Anderzijds suggereren de auteurs enkele mogelijke interpretaties voor het schijnbare verschil van deze studie in vergelijking met de andere. Eén mogelijke interpretatie is dat de ethniciteit van de controles en de zieke individuen in de andere studies onvoldoende [afgestemd] was; wat leidt tot verschillen qua gen-expressie die niets te maken hebben met de oorzaak van M.E.(cvs). Ik betwijfel dit ten zeerste omdat de gen-expressie wijzigingen in de eerdere studies duidelijk gerelateerd zijn met wat we weten over de veranderingen die voorkomen bij M.E.(cvs)-patiënten.

Er is een tweede mogelijke verklaring, één die heel interessant is. Het is mogelijk dat er genetisch bepaalde veranderingen qua gen-expressie zijn die voorkomen bij veel M.E.(cvs)-patiënten maar dat de wijziging qua gen-expressie gelinkt is met veranderingen die hen eenvoudigweg meer vatbaar maken om M.E.(cvs) te krijgen. In dit geval zouden gepaarde monozygote tweelingen geen verschillen tonen qua gen-expressie, maar willekeurige M.E.(cvs)-patiënten zouden verschillen van controles. Deze verschillen zouden voorafgaan aan het krijgen van M.E.(cvs). Dit zou werkelijk interessant zijn omdat dan de verschillen qua gen-expressie ons iets zouden vertellen over de genetische controle van vatbaarheid voor de ziekte. In dit geval vertellen de eerder gepubliceerde wijzigingen qua gen-expressie ons nog steeds iets heel belangrijk over M.E.(cvs), alhoewel iets redelijk verschillend van wat de auteurs dachten te bestuderen.

Er zijn gepubliceerde studies die aantonen dat pro-inflammatoire allelen van cytokine-genen geassocieerd zijn met verhoogde incidentie van M.E.(cvs). En Boles en zijn collegas hebben bewijs gepubliceerd voor het feit dat het dragen van mutant mitochondriaal DNA mensen meer vatbaar maakt voor een brede waaier aan ziekten, inclusief M.E.(cvs). Dus heeft de hypothese die ik suggereerde ten minste een beetje experimentele ondersteuning, hoewel deze indirect is. Ik denk dat we, op dit punt, veel meer moeten te weten komen over de reproduceerbaarheid van de verscheidene types relevante data. En we moeten ook te weten komen of de verschillende research-groepen patiënten-populaties bestuderen met gelijkaardige ziekte-ernst. Iets dat is makkelijk duidelijk wordt bij ernstig aangetaste patiënten kan moeilijk te onderscheiden zijn in meer matig-aangetaste patiënten.

Mijn mening is dat het vergelijken van gen-expressie bij M.E.(cvs)-patiënten versus normale controles, of dat nu co-tweelingen of andere zijn, niet de manier is om een specifieke biomerker-test te ontwikkelen voor M.E.(cvs). Het meest specifieke symptoom van M.E.(cvs) is de zogenaamde post-exertionele malaise, waarbij inspanning het hele spectrum van symptomen die kenmerkend zijn voor M.E.(cvs)-patiënten upreguleert. Ik denk dat de zoektocht naar specifieke biomerker-testen zou moeten focussen op specifieke responsen op inspanning, responsen waar M.E.(cvs)-patiënten verschillen van normale controles.

NR3C1 – Glucocorticoid receptor geassocieerd met CVS

Bij de eerder vermelde genetische studies bij CVS door het CDC maar ook bij andere, komt regelmatig het NR3C1 gen, coderend voor de de glucocorticoid receptor, naar voor. Hieronder volgt een samenvatting van wat wetenschappelijke artikels daaromtrent…

Een transcriptie-factor is een eiwit dat bindt op specifieke DNA-sequenties en zo de transfer (of transcriptie) controleert van genetische informatie van DNA naar RNA.

SNP = single nucleotide polymorfisme; kleine wijziging van slechts één bouwsteentje in het DNA van een gen.

Het eiwit waartoe dit gen aanleiding heeft is een receptor voor glucocorticoïden die als transcritpie-factor (bindend op ‘glucocorticoid response elements’, GRE) én als een regulator voor andere transcriptie-factoren kan werken. (Tussen de genen in zitten stukken DNA die niet voor eiwitten coderen. In deze stukken niet-coderend DNA liggen gebieden die de activiteit van genen regelen, de zogenaamde promotors. Voor ieder gen zit zo’n promotor. Aan deze promotor kan het RNA-polymerase binden met behulp van andere eiwitten, de zogenaamde transcriptie-factoren.) Het kan ook worden gevonden in heteromere cytoplasmatische complexen samen met o.a. ‘heat shock’ factoren. Het eiwit komt typisch in het cytoplasma voor totdat het bindt met een ligand (molekule die past op de bindplaats van een receptor), waarna het complex naar de cel-kern verhuist. NR3C1 is betrokken bij de glucocorticoïde feedback bij uitdagende omstandigheden en medieert ook cortisol-effekten op de immuun-funktie. Onevenwichten in het aantal, verwerking en funktie van NR3C1 gen-produkten kan het niveau van de negatieve feedback invloed op de HPA-as aktiviteit en op het immuunsysteem veranderen.

Sommigen vinden dat de nadruk te sterk wordt gelegd op dergelijke stress- en stemmingsgebonden genen bij de pathogenese van CVS. Het moet echter worden benadrukt dat de er een nauwe communicatie verloopt tussen de HPA-as en het immuunsysteem (waarover later meer).

Er moet ook worden opgemerkt dat sommige researchers ‘chronisch vermoeiden’ samen nemen met CVS. Voorzichtigheid blijft dus geboden bij de interpretatie. Er zijn aanwijzingen voor een verband met CVS maar verder onderzoek blijft aangewezen.

Neem gerust contact voor meer uitleg of voor discussie!

NR3C1

nucleaire receptor subfamilie 3, groep C, lid 1

glucocorticoid receptor gen

In één van de eerder ingeleide Pharmacogenomics studies (2006 Apr;7(3):387-394) – ‘Polymorphisms in genes regulating the HPA-axis associated with empirically delineated classes of unexplained chronic fatigue’ – rapporteerden Rajeevan et al. (Centres for Disease Control and Prevention, Division of Viral and Rickettsial Diseases, National Centre for Infectious Diseases) dat het glucocorticoid receptor gen (NR3C1) een potentiële mediator voor CVS is.

Chronische Vermoeidheid Syndroom wordt gekarakteriseerd door aanhoudende of terugkerende vermoeidheid die niet weggaat met rust, een aanzienlijke vermindering van aktiviteiten veroorzaakt en vergezeld gaat met een verscheidenheid aan symptomen. De onbekende etiologie wou kunnen weerspiegelen dat CVS een heterogene aandoening is. ‘Latent class analyse’ [zie ‘ Inflammatoire Immuun-signalisering’] van symptomen en fysiologische systemen werden gebruikt om subgroepen af te bakenen in een staal uit de bevolking van vermoeide en niet-vermoeide individuen. De studie onderzocht of genetische verschillen aan de basis liggen van de subgroepen. Polymorfismen in 11 kandidaat-genen gerelateerd met hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as funktie en stemmings-gerelateerde neurotransmitter-systemen werden geëvalueerd door elk van de vijf [door hen zelf bedachte] ziekte-klassen (Klasse 1, n = 33; Klasse 3, n = 22; Klasse 4, n = 22; Klasse 5, n =17; Klasse 6, n = 11) van [medisch onverklaarde] vermoeide invividuen [CVS en andere] te vergelijken met individuen die als gezond werden beschouwd (Klasse 2, n = 35). Van de vijf klassen individuen met onverklaarde vermoeidheid werden drie klassen onderscheiden d.m.v. gen-polymorfismen betrokken bij HPA-as funktie of neurotransmitter-systemen, inclusief proopiomelanocortine (POMC), nucleaire receptor subfamilie 3, groep C, lid 1 (NR3C1), monoamine-oxidase A (MAOA), monoamine-oxidase B (MAOB) en tryptofaan-hydroxylase 2 (TPH2). Deze gegevens ondersteunen de hypothese dat medisch onverklaarde vermoeidheid heterogeen is en geven preliminair bewijs van de genetische mechanismen aan de basis van de aandoeningen [niet enkel CVS dus] liggen.

In een ander artikel o.l.v. Rajeevan (‘Glucocorticoid receptor polymorphisms and haplotypes associated with Chronic Fatigue Syndrome’ in in Genes Brain Behav. 2007 Mar;6(2):167-76) werd de aandacht toegespitst op die belangrijke factor van de HPA-as, het glucocorticoid receptor-gen (NR3C1). In deze studie werd onderzocht of er een verband is tussen sequentie-variaties in het glucocorticoid receptor-gen (NR3C1) en CVS. Er waren 137 deelnemers (40 met CVS, 55 met onvoldoende symptomen of vermoeidheid – ISF, en 42 niet-vermoeide controles); deze werden klinisch geëvalueerd en waren afkomstig uit de algemene bevolking van Wichita, Kansas. Er werden negen ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) in NR3C1 getest op een mogelijk verband met CVS.

Men stelde een associatie vast van meerdere SNPs met chronische vermoeidheid [CVS maar ook andere vermoeiden] in vergelijking met niet-vermoeide (NF) individuen (P < 0.05); en men vond gelijkaardige associaties met kwantitatieve bepalingen van funktionele beperking (via de ‘SF-36’) [met lichamelijke pijn, algemene gezondheid, vitaliteit en sociaal funktioneren maar NIET met emotionele en mentale gezondheid], met vermoeidheid (via de ‘Multidimensional Fatigue Inventory’) en met symptomen (via de ‘Centres for Disease Control Symptom Inventory’). Het belangrijkste allel [Verschillende vorm van een gen dat op een bepaalde plaats (= locus) van homologe chromosomen kan voorkomen. Allelen coderen voor dezelfde eigenschap.] kwam frequenter voor bij vermoeide individuen en zij die homozygoot voor dit belangrijkste allel (van alle geassocieerde SNPs) waren, hadden een verhoogd risico op ISF of CVS. Vijf SNPs, in een gebied van ongeveer 80 kb [kilo-baseparen; maat voor de grote van een stuk DNA], toonde een hoog ‘linkage-disequilibrium’ (LD) [Allelen op verschillende loci erven niet onafhankelijk van elkaar over. Bij een ziekte wordt verwacht dat het geassocieerde allel in een verhoogde frequentie aanwezig is in een steekproef van patiënten vergeleken met een steekproef van controlepersonen. De term 'linkage disequilibrium' geeft aan dat een allel van een ziekte-gen gekoppeld overerft met specifieke allelen van naburige genen.] in CVS aan maar dit LD daalde geleidelijk aan bij ISF- en NF-individuen. [Dit zou een genetische basis voor klassificatie van individuen met CVS, ISF en NF kunnen betekenen.]. Bovendien toonde haplotype-analyse [haplotype = combinatie van allelen zoals die voorkomen op een chromosoom] van het gebied met LD, twee geassocieerde haplotypes aan met tegengestelde allelen: één beschermend en het ander risico-houdend voor CVS.

Deze resultaten tonen aan dat NR3C1 een potentiële mediator voor chronische vermoeidheid [N.B.: ook hier is dit niet noodzakelijk CVS] is en impliceren variaties in het DNA van NR3C1 als een mogelijk mechanisme waarlangs de veranderingen in regulering van de HPA-as bij CVS zich kan manifesteren.

Ook een team o.l.v. Benjamin N Goertzel (Virginia Tech, National Capital Region, Arlington, VA, USA) vroeg zich af of de aanwezigheid van CVS nauwkeuriger kan worden voorspeld d.m.v. ‘single nucleotide’ polymorfisme (SNP) profielen (Pharmacogenomics. 2006 Apr;7(3):475-83: ‘Combinations of single nucleotide polymorphisms in neuro-endocrine effector- and receptor-genes predict Chronic Fatigue Syndrome’). Ze zochten naar regels om a.h.v. SNP-profielen te kunnen voorspellen of een patient CVS had. Analyse van de SNPs die meest frequent werden gebruikt gaf aanleiding tot een lijst van ‘belangrijkste SNPs’ (wat niet hetzelfde is als ‘meest differentiërende SNPs’). De top drie genen die de SNPs bevatten die meest belangrijk zijn, waren neuronaal tryptofaan-hydroxylase (TPH2, betrokken bij het serotonine-metabolisme), catechol-O-methyltransferase (COMT, betrokken bij de methylatie van norepinefrine) en nucleaire receptor subfamilie 3, groep C, member 1 glucocorticoid receptor (NR3C1, betrokken bij corticosteroïden-gevoeligheid via signaal-transductie en transcriptie via de RNA-polymerase II promotor). [De combinatie van de ‘corticotropin releasing hormone’ receptor (CRHR)1 en CRHR2 bleek ook relatief belangrijk, wat een potentieel significante rol voor corticotropine-afgevende hormonen suggereert.] Uit de meerdere miljoen mogelijke SNPs waren er slechts 28 die, met een nauwkeurigheid van 76%, voorspellen of een persoon CVS heeft. Dit wijst er op dat CVS een genetische component heeft die sommige aspekten van de ziekte kan helpen verklaren.

Naast het feit dat genetische en milieu-factoren een rol spelen, dienen we te onthouden dat dit ook ondersteunend bewijs is voor een polygeen eerder dan een monogeen overervingspatroon en voorbestemdheid voor CVS. Voor de meeste gewone ziekten met erfelijke componenten is het trouwens zo dat niet één enkel of enkele ‘single nucleotide’ polymorfismen (SNPs) het overgrote deel van de variantie verklaren. Veel van de variantie kan worden veroorzaakt door interakties (epistasis) [Het onderdrukken of belemmeren van het tot uiting komen van een eigenschap door een andere factor welke niet tot hetzelfde factoren-set behoort.] tussen meerdere SNPs of interakties met milieu-condities.

NR3C1 blijft alvast verder het voorwerp van onderzoek…

Aan de Universiteit Antwerpen was in de onderzoeksgroep ‘Toegepaste Molekulaire Genomica’ tot eind 2008 een studie aangekondigd met de titel ‘Molekulair-genetische analyse van het Chronische Vermoeidheid Syndroom’. Men meldde daaromtrent “Er zijn aanwijzingen dat de kwetsbaarheid voor het Chronisch Vermoeidheids Syndroom (CVS) deels genetisch bepaald is. Molekulair genetisch onderzoek kan bijdragen tot inzicht in de pathogenese van CVS en kan leiden tot de identifikatie van biomerkers en therapeutische doelwitten. De doelstelling van het genetisch luik van dit onderzoek bestaat erin de betrokkenheid van 3 funktionele kandidaat-genen (TPH2, COMT en NR3C1) te onderzoeken in relatie tot CVS.”. Contact met het Departement Molekulaire Genetica van de UA leerde dat de criteria voor de diagnostiek deze volgens Fukuda et al. (1994) zijn. Het genetisch onderzoek werd nog niet aangevat en er worden geen resultaten of publikaties verwacht in de nabije toekomst. [januari 2009]

Maar ook elders blijft dit gen de aandacht van onderzoekers houden:

Pharmacogenomics. 2009 Jan;10(1):35-42

A Bayesian approach to gene-gene and gene-environment interactions in Chronic Fatigue Syndrome

Lin E [1], Hsu SY [2]

[1] Vita Genomics, Inc., 7th floor, No. 6, Sec. 1, Jung-Shing Road, Wugu Shiang, Taipei, Taiwan

[2] Department of Psychiatry, Chi Mei Medical Centre, Liouying, Tainan, Taiwan

Inleiding: Bij genoom-onderzoek, is het essentieel om gen-gen en gen-milieu interakties te bekijken voor het beschrijven van de complexe kenmerken betrokken bij ziekte-gerelateerde mechanismen. In dit werk was ons doel gen-gen en gen-milieu interakties te detekteren via de analyse van genetische en demografische factoren – inclusief SNPs, leeftijd, geslacht en BMI – van patiënten met Chronische vermoeidheid Syndroom.

Materialen & methoden: We benutten de data-set uit een eerdere studie uitgevoerd door de ‘Centres for Disease Control and Prevention Chronic Fatigue Syndrome Research Group’. Om gen-gen en gen-milieu interakties te onderzoeken, implementeerden we een methode voor het identificeren van significante interakties tussen factoren: een twee-staps Bayesiaanse variabelen-selektie methodologie gebaseerd op Markov Chain Monte Carlo benaderingen.

[Bayesiaanse statistiek is een benaderingswijze die veel wordt gebruikt in de medische statistiek. De Bayesiaanse methodiek is gebaseerd op de stelling van Bayes die kwantificeert wat de nieuwe a posteriori onzekerheden zijn, gegeven een verzameling van a priori onzekerheden en nieuwe gegevens. Met behulp van de stelling van Bayes kunnen verschillende bronnen van informatie worden gecombineerd. Markov-keten Monte Carlo is een algemene computer-techniek die op grote schaal gebruikt wordt in de natuurkunde, chemie, biologie, statistiek en informatica.]

Resultaten: Door het toepassen van onze benadering, vonden we NR3C1 significant in het twee-locus gen-gen effekt-model, zowel als in het twee-factor gen-milieu effekt-model. Verder werd een significante gen-milieu interaktie geïdentificeerd tussen NR3C1 en geslacht. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat NR3C1 en geslacht een rol kunnen spelen in biologische mechanismen geassocieerd met Chronische Vermoeidheid Syndroom.

Besluit: We toonden aan dat onze benadering een veelbelovende methode is om de gen-gen en gen-milieu interakties te bepalen bij patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom door genetische factoren (SNPs) en demografische factoren zoals leeftijd, geslacht en BMI te gebruiken.

[Voor nog meer over het detekteren van gen-gen interakties en de SNPs (NR3C1 e.a.) uit de data-set verkregen door de ‘CDC Chronic Fatigue Syndrome Research Group’ kunnen geïnteresseerden terecht in het artikel ‘Odds ratio based multifactor dimensionality reduction method for detecting gene-gene interactions’ (Bioinformatics. 2006 Nov 08.) van het team van Chung (Korea). Het is een stuk over een methode om combinaties van multi-locus genotypes en afzonderlijke omgevingsfactoren, geassocieerd met een bepaalde ziekte, te identificeren. Men gebruikt de bovengenoemde set gegevens als voorbeeld.]

Voor de toekomst: bekijken van de interakties tussen de Glucocorticoid Receptor en ‘Nuclear Factor-κB’

<<De glucocorticoid receptor (GR) is een ligand-bindende transcriptie-factor in het cytoplasma, een enorm proteïne-complex met meerdere chaperones, adaptor- en inhibitor-molekulen. Na aktivatie door ligand-binding wordt GR vrijgegeven van dit complex en reist het naar de cel-kern, waar het als een echte DNA-gebonden transcriptie-factor of als een niet-DNA-gebonden co-factor voor gen-inductie of -repressie werkt.

Voor de meeste van de typische glucocorticoid-responsieve genen geldt dat GR als een homodimere factor bindt op het DNA via de zogenaamde GR-responsieve elementen en de nodige co-factoren recruteert voor het remodelleren van chromatine en aktivatie van de basale transcriptie-machinerie. Dit alles te samen leidt tot specifieke, glucocorticoid-gemedieerde gen-transcriptie.

In het geval van gen-repressie geldt dat GR niet bindt op het DNA maar, meest waarschijnlijk als een monomere factor, interfereert met andere DNA-bindende transcriptie-factor complexen om zo gen-transcriptie af te sluiten. Dit GR-effekt is zeer belangrijk bij vele fysiologische aandoeningen en ziekten.>>

Prof. Guy Haegeman, LEGEST (Laboratory for Eukaryotic Gene Expression and Signal Transduction)

Genen-studies bij CVS door het CDC

In hun artikel ‘Is Chronic Fatigue Syndrome (CFS/M.E.) heritable in children, and if so why does it matter?’ in het tijdschrift ‘Archives of Disease in Childhood’ (Dec 2007;92(12):1058-61) besloten Esther Crawley en George Davey Smith dat er meer en meer sterk bewijsmateriaal wordt gevonden voor het feit dat M.E.(cvs) erfelijk is. Dit heeft echter nog niet geleid tot het aanwijzen van specifieke genen (en biologische processen) betrokken bij de ziekte; laat staan tot een merker (en dus betere diagnose) of een behandeling.

Er is wel degelijk een rol voor genen (te samen met omgevingsfactoren). Eén van de grootste moeilijkheden bij het bestuderen van de aandoening blijft echter dat het heterogene groep betreft. Naast een duidelijk definitie (en merker) is er nood aan genetische studies bij grote groepen.

Ondertussen werd daar een begin van gemaakt. Hieronder een inleidende samenvatting over rapporten op basis van een grote hoeveelheid gegevens verzameld door het CDC en verwerkt door specialisten uit allerhande vakgebieden… Deze werden gebundeld in het april-nummer (vol 7, #3) 2006 van het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’. Voor meer over de hieruitvolgende studies: neem contact.

(Geïnspireerd door Cort Johnson…)

De Genen-studies bij CVS door het CDC, gepubliceerd in ‘Pharmacogenomics’

Inleiding

S. Vernon S. en W. Reeves; 2006. De uitdaging van het integreren van een grote hoeveelheid uiteenlopende gegevens: epidemiologische, klinische en laboratorium-data verzameld tijdens een ziekenhuis-studie over het Chronische Vermoeidheid Syndroom. Pharmacogenomics. 2006 Apr;7(3):345-354

Dit artikel omvat een introduktie betreffende de inspanningen van het CDC om een model voor CVS te vervaardigen. Het werk resulteerde in de simultane publikatie van 14 research-artikels in het tijdschrift ‘Pharmacogenomics’ in april 2006. Een grote set gegevens verzameld bij een 2-daags ziekenhuisverblijf van CVS-patiënten en controles in Wichita Kansas in 2003 (eerder aangehaald in het artikel over ‘Inflammatoire Immuun-signalisering’) werd door 20 researchers genalyseerd.

Vernon en Reeves, de twee leidinggevende onderzoekers die het werk superviseerden, poneren dat ‘complexe’ chronische ziekten (zoals o.a. CVS) veranderingen in de homeostatische mechanismen van het lichaam vertegenwoordigen die voortvloeien uit de combinatie van genen en omgevingsfactoren. [Dit betekent niet noodzakelijk dat CVS ‘tussen de oren zit’ en moet worden aangepakt met gedragstherapie.] De CDC stelt voor dat deze processen zo ingewikkeld zijn dat ze een multi-disciplinaire benadering vereisen om ze te bestuderen.

De benadering van het CDC bestond er in een vrij grote set gegevens te verzamelen bij CVS-patiënten en controles, die te onderwerpen aan een brede waaier van testen, inclusief gen-expressie onderzoek, en dan de data aan vier groepen onderzoekers te geven en hen te vragen modellen te leveren die zouden kunnen bijdragen tot de klassificatie, diagnose en behandeling van CVS.

Deelnemers

Gedurende meerdere jaren gebruikt het CDC een nieuwe (en eerder lastige) methode voor het recruteren van zijn deelnemers aan studies: genaamd ‘community sampling’ (staalname uit de gemeenschap). Dit is bedoeld om vooroordelen bij het recruteren te elimineren en te voorzien in niet-contesteerbare controle-groepen. ‘Community sampling’ houdt in: het willekeurig opbellen van grote aantallen mensen om zo een willekeurig gerecruteerde, representatieve set studie-deelnemers op te bouwen. In dit geval screende het CDC telefonisch eerst 56.151 mensen in Wichita, Kansas op CVS. Uit deze groep kwam een kern-groep van 7.162 mensen die verder werd geëvalueerd via de telefoon en in een kliniek. Na weglating van degenen met uitsluitende factoren (een andere ziekte, de meeste psychiatrische aandoeningen, idiopathische vermoeidheid) bleven slecht 70 mensen die echt CVS hadden over.

[Men zou zich kunnen afvragen waarom dit aantal zo klein is. In hun poging om een echt representatieve studie-groep te bekomen, zou het kunnen dat het CDC een set CVS-patiënten heeft verzameld die gewoonlijk niet wordt gezien in CVS-klinieken. Sommigen vinden dat een groot percentage van deze CVS-patiënten niet voldeden aan de CDC-criteria voor CVS. Het is mogelijk dat de CDC een populatie CVS-patiënten heeft ontdekt die, hoewel ze al of niet ziek zijn, toch in staat zijn, ten minste volgens de CDC-criteria, sneller de ziekte achter zich te laten dan de CVS-patiënten die hun weg vinden naar de klinieken en centra. Dit is waarschijnlijk geen onverwachte bevinding; de meeste chronische ziekten hebben een wisselende graad van invalidering, de meest ernstige worden natuurlijk echter meer gezien door artsen.]

Van de 70 mensen met CVS, gingen 58 (83%) akkoord om naar een ziekenhuis te komen voor een twee dagen durende test-periode. Ze werden gematcht met 55 controles van het zelfde geslacht, leeftijd, ras en body-mass-index; mensen die ook eerder werden gescreend. Het CDC nam ook 59 mensen op die vermoeid waren maar niet voldeden aan de criteria voor CVS in de studie op, alsook 41 mensen met depressie die wel voldeden aan de CVS-criteria, en 39 mensen met depressie en vermoeidheid maar zonder CVS. Merk op dat melancholische depressie wordt beschouwd als een exclusie-factor voor CVS. Deze personen met een psychiatrische aandoening (ten tijde van de ziekenhuis-studie) die CVS uitlsuit, werden aldus geïdentificeerd en in de studie data-set opgenomen om te kunnen vergelijken.

Aangezien deelnemers aan de studie waren geklassificeerd als CVS (individuen die voldeden aan alle drie de empirische criteria – op basis van de SF-36, MFI en ‘symptom-inventory’), ISF (‘onvoldoende symptomen of vermoeidheid’) of niet-vermoeid tijdens de surveillance tot 6 jaar voordien, en omdat CVS zich cyclisch manifesteert qua voorkomen en ernst van de symptomen, werd ziekte-status van de deelnemers geklassificeerd op het moment dat ze deelnamen aan de klinische studie (in het ziekenhuis). Deze huidige ziekte-klassificatie volgens empirische criteria werd opgenomen in de data-set en de onderzoeksteams konden kiezen of ze die al of niet gebruikten.

Klassificatie van de deelnemers via de definitie uit ‘94 tijdens de voorafgaande surveillance was dus niet steeds in overéénstemming met de empirische klassificatie bij de ziekenhuis-studie. Wellicht door het komen en gaan van de ziekte, naast de heterogene aard van de medisch onverklaarde vermoeidheid. Daardoor negeerden sommige teams de empirische klassificatie en stelden hun eigen op.

Qua fysieke karakteristieken van de groepen, zien we dat ongeveer 85% van de CVS-patiënten had overgewicht [BMI ≥ 25] had, 31% was obees [BMI ≥ 30] en 12% ziekelijk obees [BMI ≥ 35]. Hoe is dit in vergelijking met de obesitas-graad in de algemene bevolking? De percentages voor de controles bedroegen respectievelijk 36, 34 en 11. Volgens de website van het CDC is de prevalentie van obesitas 31-33% bij mannen en bij vrouwen 33-35%. Aangezien obesitas, en in bijzonderlijk ziekelijke obesitas op zichzelf een risico-factor voor veel problemen is zou deze factor alleen de resultaten kunnen hebben verstoord. Het CDC controleerde echter voor deze factor door het opnemen van een groep gezonde controles die even zwaar was. De leeftijd van de CVS-patiënten was ietsjes hoger (mediaan van de verschillende onderzoeksgroepen: rond 50). De populatie hier was bijna helemaal blank (94%) en ongeveer 82% van de ganse groep waren vrouwen (maar in sommige studies van de 4 onderzoeksgroepen werden de mannen niet opgenomen).

Testen

De testen waren vanzelfsprekend een heel belangrijk deel van de studie. Het zijn ten slotte deze gegevens die de onderzoekers gebruiken om hun modellen op te stellen. Uiteraard: hoe meer metingen, hoe beter – maar er zijn financiële grenzen; het CDC moest kiezen welke gegevens zij dachten het meest te zullen bijdragen tot het verbeteren van ons begrip van CVS.

Gedurende twee dagen ondergingen alle deelnemers het volgende:

Fysieke testen – temperatuur, lengte, gewicht en body-mass-index

Laboratorium-testen – complete bloed-cel telling (‘CBC’), C-reaktief proteïne, ALT, albumine, AP, AST, bilirubine, calcium, bicarbonaat, chloride, creatinine, glucose, kalium, total eiwit, natrium, ureum

HPA-as – speeksel-cortisol, androsteendion, SHBG, testosteron, ACTH, DHEA, DHEA-S, T3, reverse T3, T4, TSH, insulin-like growth factor, oestradiol en progesteron (bij vrouwen)

Cytokinen – TNF-α, IL-6, sR-IL-6

Catecholaminen – norepinefrine, epinefrine, normetanefrine [catecholamine-metabolieten], neuropeptide-Y

Mineralocorticoïden – renine, aldosteron

Autonoom Zenuwstelsel – bloeddruk, hartslag (neerliggend, rechtstaand)

Psychiatrische evaluatie

Medical Outcomes Survey Short Form (meting funktionele stoornissen)

Multi-dimensional Fatigue Inventory (vermoeidheid – algemeen, fysiek, mentaal, enz.)

CDC Symptom Inventory

Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (cognitieve testen voor korte-termijn geheugen, patroon-herkenning, reaktie-tijd, enz.)

Slaap-studie (twee nachten)

Perifereer bloed gen-expressie – 20.000 genen

Het CDC noemde dit “een uitgebreide lijst” van klinische, epidemiologische en laboratorium-gegevens. Als men echter de gen-expressie resultaten uitsluit, was dit niet echt de grootste set laboratorium-metingen ooit uitgevoerd bij een groep CVS-patiënten. Buchwald’s team aan de University of Washington onderzocht tijdens een intensieve tweelingen-studie (‘Chronic Fatigue Twin Registry’) prevalentie van pathogenen, immuun-factoren, ze deden beeldvorming van de hersenen en gesofisticeerde testen voor orthostase en aërobe funktie, alsook een slaap-studie. Deze studie van Buchwald leidde ook tot een grote hoeveelheid artikels maar de meeste van de bevindingen waren niet significant. De hier door het CDC uitgevoerde testen kom wel overéén met die van vele anders studies.

[Meten van de ‘allostatic load’ = verzamelen van informatie over fysiologische aktiviteit van meerdere belangrijke regelsystemen zoals de HPA-as en het sympathisch zenuwstelsel, zowel als het cardiovasculair systeem, het immuunsysteem en metabole processen.]

Deze studie was echter ook uniek op meerdere manieren. Het is de eerste poging om gen-expressie data, en laboratorium- en klinische gegvens te integreren om een statistisch model voor CVS op te stellen. Dat moet uitputtend zijn geweest gezien de enorme hoeveelheden data die werden gegenereerd bij de gen-expressie studies. Sommige van deze studies zijn zo veel complexer dan wat ooit is geprobeerd.]

De laboratorium-gegevens omvatten een brede waaier aan neuro-endocriene factoren plus andere merkers waarvan wordt geloofd dat ze de allostatische status van de cardiovasculaire, immuun- en andere systemen in het lichaam weerspiegelen. C-reactief proteïne bv. wordt gebruikt om de inflammatoire toestand van het lichaam te bepalen in één van de studies. Terwijl de laboratorium-data betreffende neuro-endocriene factoren uitgebreid zijn; zijn de data aangaande het immuunsysteem en het cardiovasculair iets minder extensief. De immuun-gegevens bestaan grotendeels uit pro-inflammatoire cytokinen bekend om hun interaktie met het neuro-endocrien systeem. Sommige systemen werden helemaal niet onderzocht; er waren bv. geen metingen van de oxidatieve stress in deze studies.

Met uitzondering van de gen-expressie data zijn vele van deze gegevens niet echt nieuw. Vernon en Reeves noteerden dat studies bij CVS (inclusief de gen-expressie studies) over het algemeen enkel ‘subtiele’ verstoringen blootlegden die voorkomen in verschillende systemen, in het bijzonder het centraal zenuwstelsel, het immuunsysteem en het metabolisme. Gezien deze voorgeschiedenis verwachtte het CDC niet meer dan subtiele abnormaliteiten te vinden in hun laboratorium-gegevens. Ze hoopten echter dat een analyse van deze grote data-set verstoringspatronen zou aantonen die CVS-patiënten kunnen differentiëren van controles.

Het CDC lijkt hier te bevestigen dat het probleem bij CVS het resultaat is van meerdere stoornissen (genetische defekten * nature * en omgevingsgeïnduceerde dysfunkties * nurture *), sommige misschien subtiel, die samen leiden tot het ontstaan van de ziekte die bekend staat als CVS. Eén van de studies suggereert dat CVS kan voorkomen als een zekere graad aan allostatische belasting [term uit de psychosomatiek: opéénstapeling van ontregelde fysiologische regelsystemen waardoor de soepelheid van de adaptatie afneemt; een vorm van slijtage; ook: een slechte stress-reaktie, in plaats van je evenwicht te bewaren gaan de stresshormonen je psychisch en lichamelijk ondermijnen] wordt bereikt. De keuze van het CDC om te focussen op het neuro-endocriene systeem wijst er op dat ze geloven dat de interakties in dit grote en ingewikkelde systeem waarschijnlijk centraal liggen bij de ziekte. Dit systeem regulereert vele van de processen die voorkomen in het lichaam met inbegrip van die van het immuunsysteem. Het bestuderen van alle systemen blijft noodzakelijk. Elders werden ook al aanwijzingen gevonden voor perifere bijdragen bij de pathogenese van CVS.

Teams

Vier ploegen analyseerden de gegevens. De manier waarop ze waren samengesteld was nieuw: het eerste team omvatte experten op gebied van computer-wetenschap, fysica en statistiek, zowel als een immunoloog en een psychiater; team twee omvatte experten scheikundig ingenieur en bio-ingenieur, zowel een immunoloog, een patholoog en een molekulair bioloog; in team 3 zaten experten wiskunde en geïnformatiseerde chemie, zowel als een cardioloog en een infektie-specialist; en het vierde team bestond uit experten wiskunde en bio-informatica, zowel als een epidemioloog en een kinderarts.

Elk team pakte de gegevens verschilled aan. Team 1, dat vier artikels produceerde, hypothiseerde dat CVS heterogeen is qua nosologie en resulteert uit een ontregeling van meerdere genotype-fenotype relaties die interageren met omgevingsfactoren en zo verschillende aandoeningen opleveren. [Het genotype is een gedetailleerde beschrijving en/of klassificatie van de genetische informatie van een bepaald organisme die het heeft overgeërfd en is opgeslagen in het DNA van de genen, in tegenstelling tot het fenotype van dat organisme dat al zijn observeerbare eigenschappen - geërfd of verworven - omvat. Het onderscheid is belangrijk omdat het genotype en niet het fenotype wordt gereproduceerd, maar het is het fenotype en niet het genotype waarop natuurlijke selektie ingrijpt.] Ze stelden hun eigen klassen op (a.h.v. de klinische en epidemiologische gegevens) en probeerden die dan te matchen met gen-expressie en genetische profielen. Team 2, dat drie artikels schreef, reduceerde de complexiteit van de data met behoud van zoveel mogelijk, potentieel belangrijke, biologische informatie. Ze gebruikten de empirische klassificatie en deden een poging om de centrale factoren te vinden in klinische en gene-expressie data, en om gen-expressie signaturen van de fenotypen te identificeren. Team 3, dat twee artikels leverde, verkoos een alternatieve benadering voor de analyse (beginnend met de stelling dat de diagnostische begrenzingen voor CVS vrij willekeurig zijn). Ze gebruikten dus de vragen over symptomen om de waarde te bepalen van de huidige CVS-klassificatie. Team 4 onderzocht de fysiologsiche, genetische en genomische karakteristieken om de vier verschillende groepen (empirische klassificatie) te differentiëren volgens allostatische belasting.

Een Verschillende Benadering

Het CDC gelooft dat drie factoren kunnen verklaren waarom ons begrip van CVS zo traag is vooruitgegaan de voorbije 20 jaar. Ze citeren de 3.000 peer-reviewed artikels die gewoonlijk de revue passeren maar dit is misleidend in die zin dat slechts een kleiner aantal studies zijn die de biomedische kant van de CVS-pathofysiologie exploreren.

Ten eerste geloven ze dat patiënten-recrutering uit specialistische en verwijzingsklinieken resulteert in ‘recruteringsbias’. Ze denken dat niet enkel verschillende soorten patiënten naar CVS-klinieken worden getrokken maar dat elke kliniek een unieke set patiënten heeft. Dit zou er kunnen voor zorgen dat het vergelijken van resultaten tussen studies problematisch is. Ze stellen ook dat deze benadering, die de CVS-research heeft gedomineerd, “kritische vergelijking van resultaten uitsluit”, d.w.z. het onmogelijk maakt om resultaten van de ene met de andere research-groep kritisch te vergelijken. [Misschien toch iets té sterk uitgedrukt?!]

Ten tweede denken ze dat de controle-groepen die zo belangrijk zijn bij het studie-proces veelal onvolkomen zijn; ofwel zijn ze er gewoon niet of het gaat om ‘gemakshalve controles’. Gezonde controles vinden kan moeilijk zijn. Dikwijls gaat het om werknemers van een ziekenhuis of studenten. Deze studie identificeerde echter controles uit dezelfde algemene bevolking als de CVS-gevallen en deze controles waren gelijkaardig.

Ten derde geloofden ze dat het diagnose-proces bij CVS (m.a.w. de definitie) gebrekkig is.

[De meeste researchers zullen zeker met alle drie deze punten akkoord gaan maar de eerste twee zijn misschien ietsje te ongenuanceerd. Het zijn standaard-problemen bij vele research-onderzoeken. Het is echter mogelijk dat ze aangescherpt zijn bij CVS. Als CVS uit subsets bestaat, dan is het mogelijk dat bepaalde subsets geneigd zijn naar bepaalde klinieken te trekken. Patiënten met depressie zullen eerder terechtkomen in klinieken die geleid worden door psychologen, enz.]

Er lijkt een consensus te ontstaan dat het grootste probleem bij CVS-onderzoek de niet zo precieze definitie is, die de inclusie toelaat van subgroepen die uiteindelijk de onderzoeksresultaten vertroebelen. Eén van de doelstellingen van de benadering van het CDC was om de heterogeniteit te ‘vatten’ en aldus te voorzien in een beter klassificatie-schema voor CVS. Dit kan enkel worden gedaan door gebruik te maken van grote aantallen CVS-patiënten en grote data-sets. Men kan zich afvragen of het aantal CVS-patiënten hier, plus de 41 met depressie, een voldoende groot aantal is om dit te doen. Het CDC wierp een redelijk groot net; hun inclusie van patiënten met idiopathische vermoeidheid betekende dat ze een blik wierpen op de oorzaken van vermoeidheid in het algemeen. Het opnemen van CVS-patiënten met majeure depressie – een subset van patiënten die dikwijls wordt uitgesloten bij research-studies – breidde hun staal verder uit. Men zou kunnen argumenteren dat een grotere groep van enkel CVS-patiënten hen beter zou hebben geholpen bij het vinden van meetbare subgroepen. Vreemd genoeg echter, lijkt het CDC in dit opzicht te zijn gehandicapeerd door hun staalname-protocol.

Ze mogen echter wel stellen dat een ingewikkelde ziekte zoals CVS, met stoornissen in meerdere complexe homeostase-systemen, niet het resultaat is van één enkele mutatie of omgevingsfactor; maar van een gecombineerde aktie van meerdere genen, milieu-factoren en de repons van de patient hierop. De gepubliceerde artikels tonen ook de heterogeniteit van de ziekte. Er is op dit moment niet één knop, één software-programma of één onderzoeker die de verscheidenheid kan integreren en interpreteren om inzicht te scheppen in alle complexe biologische systemen. De artikels tonen wel aan dat met samenwerking en multidisciplinaire inspanning nieuwe perspektieven kunnen worden gevonden.

Besluit

De conclusie is fascinerend. Er wordt gesteld dat de integratie van metingen voor verschillende lichaamssystemen en klinische kenmerken ons zal toelaten de subgroepen aanwezig bij CVS en de verstoorde fysiologische mechanismen te identificeren; dat het zal aantonen dat CVS (en andere ziekten met invaliderende vermoeidheid) medisch kunnen worden verklaard. Het CDC gelooft dat algorithmen (complexe formules) die multi-systemische gegevens integreren een objectieve diagnostische merker zal opleveren, de pathofysiologie zal ontcijferen en aangepaste therapieën voor CVS-patiënten zal creëeren.

Gezien de toekomstige tijd werd gebruikt, is het duidelijk dat (nog) niets van het bovengenoemde werd bereikt via deze studies: ze identificeerden nu nog geen aantoonbare subsets, ze gaven geen medisch verklaring voor CVS en er werd geen diagnostische merker gevonden, enz. Vernon en Reeves geloven echter dat de resultaten er op wijzen dat ze op het juiste pad zitten en dat met verloop van tijd men daar wel in zal slagen. De huidige resultaten waren bevredigend genoeg om te besluiten over te gaan tot nieuwe studies om deze uit te breiden en te verifiëren.

Sommigen stellen de vraag of het CDC echt wel gelooft dat ze op de juiste weg zitten? Er staat nl. een merkwaardige disclaimer op het einde van elk van de Pharmacogenomics artikels. Dit werd eerder niet gezien bij Vernon’s andere gen-studies. Er staat: “De bevindingen en besluiten in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de opinies van het agentschap.”. Slaan Vernon en Reeves er hier een beetje een slag in? Betekent dit dat het agentschap niet zeker is van deze creatieve (en dure) nieuwe benadering van CVS? Of is het slechts een standaard clausule?…

*** Wordt vervolgd! ***

Bewijs voor inflammatoire immuun-signalisering bij CVS

Een vrij complex stuk waarbij het voor leken niet altijd essentieel is 100% van de technische kant te snappen. Het zou een academische cursus immunologie en molekulaire genetica vergen alles te verduidelijken. De belangrijke zaken worden benadrukt en de conclusies zijn wel heel belangwekkend. Dit is dan ook vooral bestemd voor researchers, klinici én patiënten die geïnteresseerd zijn in de wetenschap van M.E.(cvs)…

Een micro-array is een klein (micro) rechthoeking plaatje met daarop kleine druppeltjes / stipjes met DNA in een matrixpatroon (array). Ieder stipje op de micro-array bevat een stukje van het DNA van één specifiek gen van bijvoorbeeld de mens waarop genetisch materiaal (bv. afkomstig uit biologisch materiaal) kan ‘hybridiseren’ en zo worden gedetekteerd. Een micro-array wordt ook wel eens ‘DNA-chip’ genoemd.

Voor bijkomende inlichtingen en/of uitleg; neem gerust contact.

Behav Brain Funct. 2008 Sep 26;4:44

Evidence of inflammatory immune signaling in Chronic Fatigue Syndrome: A pilot study of gene expression in peripheral blood

Anne L Aspler¹, Carly Bolshin¹, Suzanne D Vernon² and Gordon Broderick¹

1 Department of Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, T6G 2H7, Canada

2 The CFIDS Association of America, Charlotte, North Carolina, 28222, USA

Achtergrond

[…] chronische immuun-cel dysfunktie en aktivatie werd reeds aangetoond bij CVS door verscheidene groepen. Hoewel ze gelijkaardig zijn qua brede lymfocyt-klassen, kunnen CVS-patiënten en niet-vermoeide indviduen vlot van elkaar onderscheiden worden als specifieke immuun-cel ondergroepen worden onderzocht. Klimas et al. bv. meldden een significante uitbreiding van CD26+ (DPP-IV) geaktiveerde T-cellen bij CVS-individuen [Immunologic abnormalities in Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Microbiol 1990;28:1403-1410]. Deze multifunktionele molekule speelt een belangrijke rol bij de regulering, ontwikkeling, rijping en migratie van T-helper (Th) en ‘natural killer’ (NK) cellen, zowel als bij immunoglobuline-isotype wisseling van B-cellen. Daarenboven wordt abnormale expressie van CD26+ gevonden bij auto-immuun ziekten. Meer recent werd ook gerapporteerd dat CVS-patiënten significant minder CD3+/CD25- T-cellen en significant meer CD20+/CD5+ B-cellen, een subset geassocieerd met auto-antilichamen, hebben. Significant minder CD56+ NK-cellen werden ook gezien bij recent werk door Racciatti et al. [Study of immune-alteration in patients with Chronic Fatigue Syndrome with different etiologies. J Immunopath Pharm. 2004;17:57-62]. Hoewel belangrijk, laten flow-cytometrie resultaten zoals deze veel vragen betreffende de cellulaire status onbeantwoord. Micro-array profilering van gen-expressie licht anderzijds een tipje van de sluier op wat betreft aktivatie van systemen bij ziekte-pathogenese op molekulair niveau. Micro-array analysen van cDNA profielen van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) hebben veranderde expressie bij CVS van verscheidene immuun-genen [zie Pharmacogenomics. 2006;7] betrokken bij de respons op oxidatieve stress, NK-cel aktiviteit en elementen van antigen-verwerking, getoond. Instabiliteit qua immuun-respons en restrukturering van immuun-cel signalisering bij inspanning werd ook geobserveerd [Exercise-responsive genes measured in peripheral blood of women with Chronic Fatigue Syndrome and matched control-subjects. BMC Physiol. 5:5]. Jammer genoeg wordt micro-array profilering normaal uitgevoerd op populaties van gemengde cellen, wat een gemiddeld profiel oplevert waarbij het zeer moelijk is de bijdragen van de relatieve cel-aandelen, de cel-aktivatie-status en de cel-cel-signalisering te ontleden. Nog belangrijker: dit maken van gemiddelden kan significante veranderingen in de status van cel-subpopulatie-minderheden vertroebelen.

Niettegenstaande deze uitdagingen suggereert een overzicht van dit bewijsmateriaal dat de pathogenese van CVS wellicht een karakteristieke immunologische component omvat in ten minste één subset van de patiënten-populatie. De exacte aard van deze immunologische component blijft echter het voorwerp van aanzienlijk debat, ten minste gedeeltelijk omwille van de onmogelijkheid om gen-expressie profielen in de nuttige context van immuun-cel populaties te zien. In een poging om deze kwestie aan te pakken, werden methoden voorgesteld om globale gen-expressie profielen te verdelen in afzonderlijke elementen die toe te wijzen zijn aan biologische processen. De toewijzing van genen aan afzonderlijke modules of sets is in meerdere opzichten succesvol geweest. Een eerste bijdrage houdt het eenvoudig reduceren in van de aantallen van meer dan 55.000 gen-expressie metingen tot ongeveer 10 genen-sets. De interpreteerbaarheid van resultaten wordt verder verhoogd door het associëren van sets met fundamentele cellulaire funkties. Uiteindelijk wordt de numerieke sterkte verbeterd door het gemiddelde te maken van de veranderingen in expressie van vele genen. Daarenboven zijn genen-sets transporteerbaar over micro-array platforms wat het mogelijk maakt om studies te vergelijken op basis van verschillende technologieën.

In dit werk exploreren we het gebruik van afzonderlijke genen-sets bij het verzamelen van nuttige informatie betreffende immuun-dysfunktie bij CVS uit gen-expressie profielen van populaties gemengde lymfocyten. We construeren in het bijzonder genen-sets die elementen bevatten van aantallen en aktiviteit die toewijsbaar zijn aan specifieke immuun-cel subsets waardoor directe integratie met flow-cytometrie resultaten wordt vergemakkelijkt. Gegevens van een grote bevolkingsstudie aangaande CVS wordt dan onderzocht op veranderingen van immuun-set expressie over twee afzonderlijke CVS klassificatie-benaderingen. Daarenboven werden patronen van gecoördineerde expressie die deze immuun-sets verbinden onderzocht, gebruikmakend van eenvoudige correlatie-netwerken. Deze netwerken werden onderzocht op verschuivingen qua topologie [plaats van een gen in een netwerk] en aanwijzingen van patronen in immuun-signalisering bij CVS die consistent zijn met chronische inflammatie. Deze observaties zouden een signatuur voor CVS of een component daarvan kunnen vormen.

Methoden

Individuen en diagnostische klassen

Recent kwam een data-set beschikbaar van een 2-daagse ziekenhuis-studie naar CVS in de algemene bevolking van Wichita (Kansas, V.S.) [Pharmacogenomics. 2006;7:345-354]. Deze wordt de Wichita Clinical Study genoemd en omvatte een zeer uitgebreid spectrum van gedetailleerde klinische en laboratorium-metingen, en PBMC expressie-profielen van 20.000 genen. Uit deze data-set werd uiteindelijk een analyse-groep van 111 vrouwelijke individuen bekomen door de weinige mannelijke individuen en zij met medische of psychiatrische aandoeningen uit te sluiten. Individuen in deze data-set werden geklassifieerd als CVS gebruikmakend van de ‘CDC Symptom Inventory’, ‘Multidimensional Fatigue Inventory’ (MFI) en ‘Short Form 36’ (SF-36). Deze klassificatie zal ‘empirisch’ worden genoemd en resulteerde in 39 CVS, 37 niet-vermoeide (NF) en 35 individuen met onvoldoende symptomen of vermoeidheid (ISF). Een tweede klassificatie voorgesteld door Vollmer-Conna en collegas [Pharmacogenomics. 2006;7:355-364] gebruikte ‘latent class analysis’ (LCA) [statistische methode waarbij op een systematische manier mensen of andere onderzoekobjecten worden ingedeeld in homogene groepen] van 440 klinische en biologische metingen om 5 vermoeidheidsklassen, een niet-vermoeide klasse en 2 niet-toegewezen individuen af te bakenen. Obese individuen met uitgesproken vermoeidheid na inspanning, hypnoea en verstoorde slaap vormden Klasse 1. Redelijk gezonde individuen met weinig symptomen, lage depressie-scores en goede slaap vormden Klasse 2. Individuen in Klasse 3 leken op die in Klasse 1 maar vertoonden ook een lage hartslag-variabiliteit tijdens slaap en lage 24-uur cortisol-waarden. Klass 4 was bevolkt met gezondere, minder depressieve individuen met een rustgevende slaap maar met spierpijn. Tenslotte omvatten Klassen 5 en 6 allebei minder obese maar sterk symptomatische en depressieve individuen met uitgesproken vermoeidheid na inspanning. Individuen in Klasse 6 hadden ook een gestoorde slaap, lage hartslag-variabiliteit en laag cortisol. […]

Het verzamelen en verwerken van PBMCs inclusief hybridisatie op MWG micro-arrays (MWG Biotech, Ebersberg, Duitsland) werd beschreven door Vernon en Reeves [BMC Medicine. 2005;3:8].

Genen-set ontwikkeling

Het zoeken naar elementen die de hoeveelheid en aktiviteit van een specifieke leukocyten-subset vertegenwoordigden, werd benaderd door de identifikatie van afzonderlijke sets van genen die uniek of hoofdzakelijk tot expressie komen in een bepaald cel-type. Momenteel bieden afzonderlijke genen-sets de eenvoudigste en meest onmiddellijk toegankelijke methode voor de analyse via micro-array platformen. We maakten een aantal genen-sets a priori voor CD4+ T-cellen, CD8+ T-cellen, CD19+ B-cellen, CD14+ monocyten en CD16+ neutrofielen door gebruik te maken van gegevens verzameld op Affymetrix micro-arrays (Affymetrix, Santa Clara, V.S.). Van de 12.022 gecontroleerde genen kwamen 2.641 verschillend tot expressie tussen individuele lymfocyten-subsets. Van deze oorspronkelijke 2.641 onderscheidende genen waren 268 aanwezig op de MWG micro-arrays die werden gebruikt in de ‘Wichita Clinical Study’. We ontleedden deze subbset-specifieke profielen in afzonderlijke niet-overlappende sets, samengesteld uit genen die ten minste 2-maal ge-upreguleerd of 2-maal ge-downreguleerd zijn in elke cel-lijn. Een bijkomende genen-set werd gedefinieerd voor NK-cel aktiviteit en T_reg-cel aktiviteit werd bepaald uit de expressie van het FoxP3 gen.

Statistische analyse

[…]

Resultaten

Afstemmen van empirische en LCA-klassificaties

[…] Er was goede opvereenkomst van niet-vermoeide individuen met 90% van de empirische NF-controles uit LCA-klassen 0 (Gezond) and 2 (Niet-toegewezen). LCA-klasse 1 (40%) en 5 (26%) samen bevatten twee derden van de individuen toegewezen aan de empirische CVS-klasse. ISF-individuen waren bijna gelijkmatig verdeeld over LCA-klassen 1 (23%), 3 (31%) en 4 (26%). De meeste individuen van LCA-klassen 3 en 4 werden geïdentifieerd als ISF, en de meeste individuen in LCA-klassen 1, 5 en 6 kregen een empirische CVS-klassificatie.

Differentiële expressie van a priori gedefinieerde immuun-cel genen-sets

In een eerste analyse werd de differentiële expressie van immune genen-sets over ziekte-fenotypes en controle-groepen voor beide klassificatie-systemen geëvalueerd. Resultaten tonen dat de mediane expressie van de CD19+ B-cel ge-upreguleerde genen-set [6 genen] significant lager was bij CVS (p = 0.01) en ISF (p = 0.05) individuen vergeleken met NF-groep [vooral te wijten aan de PTPRK en TSPAN3 expressie]. Expressie van deze genen-set was ook significant onderdrukt in LCA-klasse 3 (p = 0.04) en marginaal onderdrukt in LCA-klasse 5 (p = 0.09) vergeleken met controle-individuen in LCA-klassen 0 en 2. Onthou dat 11 van de 17 gevallen in LCA-klasse 3 ook werden aangewezen als ISF. Ook: 10 van de 14 LCA-klasse 5 gevallen werden aangewezen als CVS. NK genen-set expressie was marginaal gestegen in de CVS-groep (p = 0.07). Hoewel geen enkele andere genen-set verschillend tot expressie bij p < 0.05, verschilden co-expressie patronen in elke groep duidelijk.

Hoewel niet significant was de nul-probabiliteit [De hypothese die men formuleert en toetst in een statistische test wordt de nul-hypothese genoemd. Deze moet bij het begin van het onderzoek worden geformuleerd. De nul-hypothese heeft de vorm van een exacte, kwantitatieve uitspraak over een parameter van de populatie, waaruit de steekproef is getrokken. De kans op een bepaalde gebeurtenis (eng. probability of event, notatie P) wordt uitgedrukt in een getal tussen 0 en 1.] voor NK-cel expressie het laagst bij de LCA-klassen voor LCA-3 (p = 0.11). Ten slotte was de expressie van de T-regulator set (FoxP3) marginaal onderdrukt in LCA-klasse 1 (p = 0.09), die 40% van de CVS-individuen bevatte, hoewel geen significant verschil werd gevonden voor de grotere CVS-groep (p = 0.31).

De prestaties van deze genen-sets werd vergeleken met die die werden verkregen door gebruik van willekeurige sets van dezelfde grootte zowel als door willekeurige klassificatie-toewijzing van elk individu. Nul-distributie resultaten wezen er op dat de CD19+ B-cel (ge-upreguleerd) én NK-cel genen-sets significant beter presteerden dan willekeurige sets van gelijkaardige grootte bij het onderscheiden van CVS en NF (p < 0.05). Performantie van de T-regulator genen-set (FoxP3) was op z’n best beperkt (p~0.15) qua differentiële expressie. Daarenboven wees een gedetailleerde analyse van individuele genen in de CD19+ ge-upreguleerde set er op dat geen enkel gen differentieel tot expressie kwam zelfs als de set op p = 0.01 niveau tot expressie kwam. Dit herbevestigt dat hoge niveaus van ‘metingsruis’ effektief kunnen worden aangepakt door genen bijeen te voegen tot biologisch relevante sets.

Karakteristieke associatie-patronen tussen immuun-genen-sets bij CVS

[…]

De LCA controle-klassen 0 en 2 vertoonden een genen-set co-expressie patroon bij p < 0.10 dat identiek was aan dat van de empirische NF-groep, alhoewel in deze laatste dit patroon ook behouden bleef bij p < 0.05. In de NF én LCA-0/LCA-2 netwerken correleerden de CD 19+ B-cel ge-upreguleerde en ge-downreguleerde genen-sets heel erg. T-regulator en NK-cel genen-sets ondersteunden allebei significante positieve interaktie met één of beide van de CD19+ B -cel sets. Daarenboven waren de CD8+ T-cel aktiviteit en CD14+ monocyten aktiviteit significant tegestrijdig. In tegenstelling vertoonde het netwerk bekomen voor de CVS-individuen een verschuiving qua interakties. Significante interakties leken inderdaad de expressie van de CD14+ monocyten genen-set te linken met die van de B-cel (CD19+ ge-upreguleerd) en de CD16+ neutrofielen genen-sets. [Significante co-expressie van CD14+ monocyten met CD16+ neutrofielen (p = 0.01) en CD19+ B-cel sets (p = 0.00) karakteriseert CVS en groepen met een vermoeidheidsfenotype.] De neutrofielen-set had ook significante co-expressie gemeen met de CD8+ T-cel genen-set (p < 0.05) bij CVS. Interessant is ook dat interakties met de neutrofielen genen-set volledig afwezig waren bij NF zelfs op p < 0.10 niveau. Ook duidelijk bij CVS was de verschijning van een significant negatieve correlatie tussen de expressie van CD8+ en CD19+ ge-upreguleerde genen-sets (p = 0.02). [én NK genen-sets (p = 0.08). Deze patronen waren afwezig bij controles.] Bovendien leken CD19+ B-cellen veranderd: ge-upreguleerde en ge-downreguleerde sets vertoonden niet langer een sterke directe correlatie bij ISF of CVS. Interaktie met NK-cel genen-set expressie was ook een onderscheidend kenmerk in het bijzonder voor ISF. In plaats van als een overgangstoestand tussen NF en CVS te verschijnen, vertoonde ISF een opvallend co-expressie patroon gekarakteriseerd door een significante interaktie van NK-cel en monocyten genen-sets (p < 0.05). In tegengestelling tot NF correleerde de NK en CD19+ ge-downreguleerde genen-sets negatief (p < 0.10) bij ISF.

Op bijna dezelfde manier als de ISF-groep werden meerdere van de LCA-groepen gekarakteriseerd door een gebrek aan gecoördineerde aktiviteit tussen immuun-genen-sets. Er bestonden inderdaad geen significante correlaties voor LCA-4, zelfs niet op het p < 0.10 niveau. Ditwasook het geval voor LCA-3 en LCA-6 klassen op het p < 0.05 niveau. […] LCA-1 vertoonde een significant positieve correlatie (p < 0.05) tussen de CD14+ monocyten en CD16+ neutrofielen sets; een kenmerk van CVS. Op het p < 0.10 niveau was er een negatieve correlatie tussen de NK en CD19+ B-cel ge-downreguleerde set; een ISF-eigenschap. Uniek voor LCA-1 was een positieve correlatie tussen T-reg (FoxP3) en CD14+ monocyten gene-set expressie (p < 0.10), een karakteristiek die niet werd gezien bij CVS en zelfs omgekeerd in LCA-3. LCA-5 had 2 kenmerken die specifiek zijn voor de CVS-groep, namelijk een sterk positieve correlatie tussen de CD19+ B-cel en CD14+ monocyten ge-upreguleerde sets (p < 0.05) samen met een sterk negatieve correlatie tussen de eerste en CD8+ genen-set expressie. Deze 2 kenmerken werden niet gedeeld met de LCA-1 groep. Deze resultaten herbevestigden de sterke links tussen de CVS-groep en LCA-klassen 1 en 5, naast de suggestie dat immuun-set co-expressie inzicht zou kunnen bieden in de opvallende aard van deze duidelijke subklassen van CVS.

Bespreking

In dit werk ontleedden we PBMC gen-expressie profielen in componenten die preferentieel tot expressie kwamen in verscheidene geïsoleerde lymfocyt-subpopulaties. We gebruikten ook 2 systemen om de individuen onder te verdelen in ziekte-groepen. De LCA-klas struktuur werd direct afgeleid uit een uitgebreide set klinische en biologische indicatoren. Alle indicatoren werden gelijkwaardig geacht en tegengesteld aan de gebruikelijke praktijk werd geen enkele subset a priori belangrijker beschouwd. In tegenstelling tot de empirische klassificatie die gebaseerd was op een consensus van meningen van expert-klinici. De resultaten bevestigen sterke links tussen beide systemen maar de LCA-klassificatie leverde bijkomende inzichten in de potentiële subklassen van CVS. De overeenkomsten tussen deze klassificatie-systemen zijn gemakkelijk waar te nemen in de patronen van co-expressie in de genen-set. De empirische CVS-groep lijkt inderdaad een samenvoeging van de genen-set co-expressie patronen geobserveerd in LCA-klassen 1 en 5. De differentiële expressie van genen-sets bereikt echter enkel statistische significantie in het geval van de ruwere empirische klassen, waarbij de grotere groepen betere achtergrond-onderdrukking bieden. In het bijzonder in de empirische CVS-klasse vonden we een significante daling in de expressie van een set van 6 genen die bij voorkeur ge-upreguleerd waren in geïsoleerde CD19+ B-cellen vergeleken met niet-vermoeide controles. Expressie van deze CD19+ B-cel ge-upreguleerde genen-set discrimineerde ook ISF van controles bij een 0.05 betrouwbaarheidsniveau. In een recente studie van CVS-voorkomen in aan- én af-wezigheid van virale infektie, vonden Racciati et al. geen significante verschillen in CD19+ cel overvloed. […] Deze bevindingen, tesamen met onze observaties van onderdrukte CD19+ gen-expressie en veranderde associatie tussen ge-up- en downreguleerde B-cel funkties suggereren dat de funktie van deze cellen gecompromitteerd kan zijn bij CVS-individuen. […] Genen coderend voor leden van de ‘zinc-finger’ proteïnen-familie [grote super-familie van proteïne-domeinen die op DNA kunnen binden] werden ook geïdentifieerd als prominente bijdrage-leveranciers aan het CVS-symptomen spectrum in eerder werk [Identifying illness parameters in fatiguing syndromes using classical projection methods. Pharmacogenomics. 2006;7:407-19]. Als we de 6 genen die de CD19+ ge-upreguleerde set vormen van naderbij bekijken, zien we dat de PTPRK en TSPAN3 genen, beide geassocieerd met immuun-cel adhesie en ontwikkeling, het sterkst onderdrukt waren. Downregulering van PTPRK, een TGF-β doelwit gen, staat bekend ge-downreguleerd te worden door het Epstein-Barr virus (EBV), een infektueus agens dat CVS kan triggeren. Downregulering van TGF-β werd gerapporteerd bij CVS door Tomoda et al.

NK-cel aktiviteit is onderdrukt in CVS en deze verminderde cytotoxiteit werd geassocieerd met verlaagd intracellulair perforine. In dit werk observeren we een verhoogde expressie van de NK-cel genen-set. Van de 4 genen gebruikt om de NK-cel funktie weer te geven, was de expressie van NKG2A/C (NM 002260) het meest verhoogd. Van de binding van NKG2A op zijn natuurlijk ligand, humaan niet-klassiek klasse I leukocyt antigen (HLA) E, is geweten dat het zijn ‘immunoreceptor tyrosine-based inhibition-motif’ (ITIM) induceert en cytotoxische cel effektor-aktiviteit onderdrukt. Daarenboven staat NKG2A ook bekend voor zijn co-expressie op geaktiveerde Th2- maar niet Th1-lymfocyten. Een bevoordeling naar Th2-type immuun-respons bij CVS-patiënten werd ook gesuggereerd op basis van intracellulaire T-cel cytokine-profielen door Skowera et al. [High levels of type 2 cytokine-producing cells in Chronic Fatigue Syndrome. Clin Exp Immunol. 2004;135:294-302] Interessant is dat dit ook overeenkomt met veranderde expressie van het PTPRK gen, dat eerder werd vermeld, aangezien Asano et al. gestoorde Th1-funktie rapporteren bij PTPRK deletie in ratten. Onze observaties ondersteunen daarom bevindingen van verhoogde onderdrukking van cytotoxische aktiviteit bij CVS en wijzen op verhoogde Th2-aktiviteit hoewel dit laatste niet specifiek werd onderzocht in deze analyse.

Neutrofielen van hun kant worden enkel sporadisch gevonden en contaminerende hoeveelheden zitten in de meeste PBMC-preparaten, dus is het interessant te noteren dat de neutrofielen genen-set verscheen als een kern-element in het tevoorschijnkomen van gecoördineerde immuun-aktiviteit. In het bijzonder de CD16+ neutrofielen genen-set en de CD14+ monocyten genen-set delen significante co-expressie. Ze ontstaan niet enkel uit dezelfde haematopoietische CD34+ voorloper-cel maar aangezien de immuniteitsgemeenschap heel erg geïntegreerd is, zal de aan- of afwezigheid van neutrofielen ook worden weerspiegeld in de status van de resterende cel-populatie. De CD14+ monocyten-set had ook significante co-expressie gemeen met de CD19+ B-cel genen-sets. Deze neutrofielen-monocyten,-B-cel immuun-interaktie triade is zeer consistent met een model voor chronische inflammatie zoals voorgesteld door Lefkowitz en Lefkowitz. Volgens dit model zijn neutrofielen, eens dat een gebeurtenis inflammatie inititieert, van de eerste cellen die ter plaatse komen. Ze degranuleren, waarbij MPO [aktief myeloperoxidase] in de micro-omgeving wordt afgegeven, dit bindt samen met iMPO [inaktief myeloperoxidase] op de macrofaag MMR [macrofaag mannose receptor] en induceert de afgifte van TNF-α [theorie voor de instandhouding van inflammatie]. Deze laatste werkt op een autocriene manier en naast iMPO initieert deze een cytokine-cascade (IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF). IL-8 trekt meer neutrofielen aan en samen met GM-CSF laten ze die weer degranuleren. Met de overeenkomstige afgifte van bijkomend MPO, start de cyclus opnieuw. The door TNF-α geïnitieerde cascade induceert IL-6 die door B-cellen wordt gebruikt voor maximale antilichaam-secretie, gewoonlijk IgM. Bijkomend aan de huidige analyse, wees een preliminair onderzoek van de cytokine-gegevens verzameld in de Wichita studie op een toename in TNF-α bij CVS-individuen, zoals eerder werd gedocumenteerd door Moss et al. [TNF-alpha and Chronic Fatigue Syndrome. J Clin Immunol. 1999;19:314-316]

Naast dit kern-netwerk, observeerden we ook dat expressie van de CD8+ T-cel set negatief correleerde met die van de NK en CD19+ ge-upreguleerde B-cel sets. Bij een mogelijk mechanisme die deze drie celtypes linkt, zouden IgG-antilichamen die aan GD3 [ganglioside D3, een membraan-component van menselijke T-cellen die betrokken is bij de groei van T-cellen] binden op het oppervlak van CD4+ en CD8+ T-cellen signalen voor de proliferatie van deze subsets en expressie van de IL-2 receptor CD25 kunnen veroorzaken. Van NK-cellen werd door Claus et al. aangetoond dat ze selektief deze antilichaam-gemedieerde proliferatie van CD8+ T-cellen inhiberen, misschien via downregulering van de autologe ‘mixed lymphocyte reaction’ (MLR). Deze basis-analyse van immuun-genen-set co-expressie wijst daarom op het bestaan van immuun-signaliseringsprocessen bij CVS die aanleunen bij ten minste één gekend mechanisme van chronische inflammatie en ondersteunt mogelijke antilichaam-gemedieerde NK-cel modulatie van T-cel aktiviteit. Verder suggereerden associatie-netwerken geconstrueerd voor LCA-classen 1 en 5 dat B-cel betrokkenheid in deze processn kan dienen als factor om onderscheid te maken tussen afzonderlijke subgroepen CVS-individuen.

Hoewel meerdere zeer plausibele immuun-respons mechanismen werden bekomen door deze analyse, moet worden beklemtoond dat het gebruik van afzonderlijke genen-sets meerdere beperkingen heeft. In het bijzonder wordt het steeds moeilijker om genen te identificeren die exclusief of zelfs predominant tot expressie komen in specifieke cel-lijnen wanneer ze veel gemeenschappelijk hebben qua funktie en doel. Deze kwestie kwam tot uiting door de kleine genen-sets die in dit werk werden geïdentifieerd uit lymfocyten-subset expressie-profielen. Een benadering die belooft robuster en openbarender te zijn, impliceert nog steeds het directe gebruik van de genoom-wijde expressie voor deze cel-populaties. Dit blijft een aktief research-domein. Zelfs deze eenvoudige analyse wijst echter dramatische verschillen aan qua immuun-netwerk topologie en cel-signaliserng bij CVS en we verwachten dat deze verschillen groetendeels behouden zullen blijven na uitgebreidere analyses. De methodologie die in dit werk werd beschreven en de kwesties die werden besproken, tonen bovendien het belang aan van ontwikkelende benaderingen die flow-cytometrie met cytokine- en gen-expressie-profilering integreren. Het onderlijnt in het bijzonder het belang van verder te kijken dan differentiële expressie van individuele componenten, naar veranderingen in hun patronen van gecoördineerde aktiviteit en formeel de netwerk-eigenschappen van het immuunsysteem te erkennen.