Transcriptie-profiel van spieren bij CVS

Dit is het vervolg op de eerdere studie betreffende de morfologie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten (‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS’). In feite gaat het over dezelfde groep patiënten en experimenten die gelijktijdig werden ondernomen.

Samengevat: er werd bij CVS-patiënten veranderde gen-expressie in de spieren gevonden en deze wijzigingen bleken terug te brengen naar de volgende processen en mechanismen: energie-produktie, oxidatieve stress, spierweefsel-morfolgie (vezel-type), spier-groei/-afbraak en geleiding van zenuwprikkels naar de spieren.

Wederom dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

International journal of immunopathology and Pharmacology, 22(3):795-807 (2009)

Transcription profile analysis of vastus lateralis muscle from patients with Chronic Fatigue Syndrome

Pietrangelo T, Mancinelli R, Toniolo L, Montanari G, Vecchiet J, Fanó G, Fulle S

Department of Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Aging (CeSI), University G. d’Annunzio Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Vele lichaam-systemen zijn aangetast en de etiologie werd nog niet geïdentificeerd. Naast immunologische en psychologische aspekten, zijn skeletale spieren symptomen prominent bij CVS-patiënten. In een poging vast te stellen welke mechanismen mogelijks betrokken zijn bij de aanvang en ontwikkeling van spier-symptomen, gebruikten we algemene transcriptoom [verzameling van alle boodschapper-RNA (mRNA) molekulen - ‘transcripten’ , tot expressie komende genen - geproduceerd in een cel of populatie van cellen] -analyse om genen te identificeren die differentieel tot expressie komen in de vastus lateralis spier [spier aan de voorzijde van het dijbeen, deel van de quadriceps] van vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten. We vonden dat de expressie van genen die een sleutel-rol spelen bij mitochondriale funktie en oxidatief evenwicht, inclusief superoxide-dismutase 2, was gewijzigd, net zoals genen betrokken bij energie-produktie, musculaire groei/ontwikkeling en bepaling van het vezel-fenotype. Belangrijk was dat de expressie van een gen coderend voor een component van de nicotine-cholinergische receptor-bindingsplaats verminderd was, wat een gestoorde neuromusculaire transmissie suggereert. We argumenteren dat deze belangrijke biologische processen betrokken kunnen zijn bij en/of verantwoordelijk voor de spier-symptomen van CVS.

[…]

Het is niet verrassend dat skelet-spieren het meest onderzochte orgaan zijn bij studies die zich richten op de lage tolerantie voor inspanning. Oxidatieve stress, door anderen en ons eigen laboratorium voorgesteld als een mogelijke bijdrage tot de pathofysiologie en klinische symptomen van CVS, is het brandpunt voor research geworden. [zie artikels van het lab van S. Fulle] Een studie vond dat reaktieve zuurstof soorten [ROS] niet enkel verantwoordelijk zijn voor molekulaire schade maar ook fungeren als belangrijke signalisering-molekulen die de samentrekbaarheid moduleren in niet-vermoeide én vermoeide skelet-spieren. Meerdere biochemische en metabole manifestaties in spiervezels bij CVS werden onderzocht maar de besluiten waren controversieel. Er werd getoond dat CVS-patiënten verminderde serum-concentraties aan acetylcarnitine hadden (Kuratsune et al. 1994) [zie ook: ‘Acetylcarnitine - verminderde opname in de hersenen’], wat mogelijks duidt op een verminderde mitochondriale energie-produktie in de spier. Matige inspanning veroorzaakt sustantiële musculaire verzuring en de aktiviteiten van adenylaat- en creatine-kinase kinase [enzymen die een rol spelen bij de energie-voorziening van spieren] in de spier zijn gebrekkig bij CVS-patiënten. Bovendien werden spier-pijn in afwezigheid van perifere weefsel-schade en gedaalde zuurstof-verzadiging na inspanning gerapporteerd. In het licht van het beschikbare maar controversiële bewijsmateriaal betreffende de betrokkenheid van spiervezels bij CVS en de karakterisatie van enkelvoudige spiervezels, met inbegrip van de bepaling van contractie-eigenschappen in vivo [zie: ‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS’], beslisten we een benadering te gebruiken die niet nog niet werd toegepast om skelet-spieren van CVS-patiënten te bestuderen: de identificatie van veranderingen qua gen-expressie m.b.v. micro-arrays. Ons doel was te bepalen of consistente gen-expressie wijzigingen konden worden geïdentificeerd bij CVS-patiënten. […]

Materialen en Methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria. […] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar en 5,4±0,7 jaar ziek) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar en 7,8±1,9 jaar ziek). […] controles hadden geen huidige of vroegere geschiedenis van diffuse musculoskeletale pijn/vermoeidheid die langer dan 10 dagen duurde. […]

Om de klinische diagnose van CVS te bevestigen en, in het bijzonder, patiënten met fibromyalgie uit te sluiten, gebruikten we ook een directe test. In een eerdere studie toonden we aan dat oxidatieve schade bij CVS de fluïditeit [omschrijvig van de viscositeit van de lipiden-lagen van een cel-membraan] en de vetzuur-samenstelling veranderde van membranen van skelet-spieren, resulterend in een specifiek en eigenaardig patroon dat volledig verschillend was van dat van fibromyalgie-patiënten. Deze laatsten, die over het algemeen hogere gelijkaardige symptomen hebben als CVS-ers, vertonen hogere membraan-fluïditeit dan CVS-patiënten en controles. [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] Om deze reden werd voorgesteld dat deze specifieke schade aan de membranen van skelet-spieren in staat is de excitatie-contractie [de elektrische aktivatie van de spiercel zet de samentrekking in werking] mechanismen te wijzigen [zie ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS’] en het zou dus nuttig kunnen zijn een onderscheid te maken tussen de twee aandoeningen. Tijdens het voorbereiden van de stalen in deze studie werden bij willekeurige biopten testen uitgevoerd om de membraan-fluïditeit te verifiëren als een inclusie-criterium; en de resultaten bevestigden de klinische diagnose.

[…]

Micro-array

De totale spier biopten hier gebruikt als RNA-bron zullen waarschijnlijk gecontamineerd zijn met andere cel-types (gladde spier, endotheliale cellen, ‘end-plates’ [uiteinden van een motor-neuron], fibroblasten) die kunnen bijdragen tot verschillen qua gen-expressie. Daarom werd een algemene micro-array i.p.v. een spier-specifieke gebruikt.

De humane oligonucleotide-set die hier werd gebruikt bestaat uit 21.329 oligonucleotiden […].

Analyse van gen-expressie profiel werd uitgevoerd bij vier patiënten (twee vrouwen, allebei 48 jaar, 4 en 65 jaar ziek; twee mannen, 27 en 36 jaar, respectievelijk 7 en 12 jaar ziek) aangezien slechts deze in aanmerking kwamen voor de analyse. […]

RNA-isolatie, amplificatie en labeling

[…]

Micro-array co-hybridisatie

[…]

Array-scan en statistische analyse van expressie-data

Resultaten

Samenvatting van het transcriptie-profiel

[…]

Transcriptie-analyse werd gebruikt om de expressie-waarden van duizenden genen gelijktijdig te monitoren, met de specifieke bedoeling transcripten en/of mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij CVS spier-symptomen. Ons experimenteel ontwerp vergeleek het RNA van elke CVS-patient met een ‘pool’ van controle-RNA verkregen van alle controle-individuen van het zelfde geslacht. Dit controle-RNA werd aangewend om de effekten van inter-indiviu heterogeniteit onder de controles te minimaliseren en een meer homogene ‘baseline’ te creëeren, om zo een grotere betrouwbaarheid te verkrijgen dat up- of downregulering van transcripten geïdentificeerd bij individuele CVS-patiënten gelinkt zijn met spier-symptomen van het syndroom.

Genen die differentieel tot expressie komen bij vrouwelijke én mannelijke CVS-patiënten

De ‘Significantie Analyse van Micro-Array’ (SAM) identificeerde 218 genen die differentieel tot expressie kwamen (96 ge-upreguleerde en 122 ge-downreguleerde) bij de twee vrouwelijke patiënten, en 453 genen (19 ge-upreguleerde en 434 ge-downreguleerde) bij de twee mannelijke patiënten.

[…]

Terwijl de expressie van 218 genen was gewijzigd bij de vrouwelijke patiënten en de expressie van 453 genen bij de mannelijke patiënten, was de expressie van slechts 47 genen significant veranderd in de bioptie-stalen van alle patiënten: twee genen waren die ge-upreguleerd en 38 waren ge-downreguleerd in biopten van van én mannelijke én vrouwelijke patiënten; zeven genen waren ge-upreguleerd bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten. Deze genen met differentiële expressie werden gebruikt als basis van onze poging om wijzigingen in sigalisering-mechanismen in spieren te identificeren bij dit syndroom.

Specifieke metabole veranderingen

De genen met differentiële expressie wijzen naar de mogelijke betrokkenheid van meerdere sigalisering-mechanismen en cellulaire processen in skelet-spieren bij de ontwikkeling van CVS. Ze omvatten (a) controle van de oxidatieve toestand, (b) DNA-herstel, (c) energie-balans, (d, e) trofische/inflammatoire processen, (f, g) groei-/apoptose-mechanismen, (h) neuromusculaire transmissie en (i) vezel-fenotype.

[We beperken ons hier tot een opsomming van de genen zonder al te veel wetenschappelijke uitleg; anders zouden we een ganse cursus biochemie en molekulaire biologie moeten meegeven. Geïnteresseerden kunnen altijd contact nemen voor meer informatie. Meer duiding ook in de bespreking…]

a) Oxidatieve stress. Ten minste drie mitochondriale genen die coderen voor proteïnen die direct of indirect gecorreleerd zijn met een onevenwicht in de oxidatieve status in de spier, waren ge-downreguleerd bij zowel vrouwelijke als mannelijke patiënten: (i) superoxide-dismutase 2 (SOD2), dat betrokken is bij het metabolisme van superoxide-anionen en een ‘opruimer’ van ROS gegenereerd in de mitochondrieën; (ii) ferrodoxine 1 (FDX1), dat een ijzer-zwavel proteïne is, in staat om elektronen te transfereren van NADH naar cytochroom-p450 en ook betrokken bij ROS-generatie; en (iii) NADPH-dehydrogenase-quinone 1 (NQO1), dat codeert voor een enzyme in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof] dat in staat is te beschermen tegen toxische agentia.

Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (IHPK3), belangrijk in de context van verhoogde oxidatieve schade. […]

b) DNA-herstel en gen-expressie. Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren bij CVS-patiënten was het gen coderend voor […] (POLB), een enzyme dat DNA dubbele helixen herstelt […]. Belangrijk was ook dat we vonden dat het gen […] (CITED2), een proteïne dat het start-complex vormt voor […] acetylering, ge-downreguleerd was. Verminderde acetylering […] aktiviteit van POLB verhoogt. Van het gen […] (SFPQ), dat ook ge-downreguleerd was, werd aangetoond dat het interageert met RNA-polymerase II om de transcriptie te reguleren. Naast een mogelijke rol bij oxidatieve stress, zou downregulering van IHPK3 kunnen resulteren in […], wat het DNA-herstel vermogen wijzigt of mRNA-export verstoort. Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (SRRM2), een component voor een proteïne van de cel-kern matrix dat funktioneert als een co-acktivator voor pre-mRNA ‘splicing’ [verandering van genetische informatie na transcriptie van DNA naar mRNA: tijdens het RNA-processing worden ‘introns’ (overbodige, niet-coderende stukken) uit het pre-mRNA geknipt en de exons van het pre-mRNA aan elkaar geplakt].

Downregulering van het gen coderend voor […] (NM23A/NME1) zou een poging tot compensatie-respons kunnen zijn, bedoeld om DNA-schade te verlichten.

Het is moeilijker de funktionele betekenis te interpreteren van genen die bleken ge-upreguleerd te zijn bij vrouwen maar ge-downreguleerd bij mannen. Deze genen omvatten […] (DYRK2), dat p53 [tumor-proteïne 53, een transcriptie-factor, reguleert de cel-cyclus en funktioneert als een tumor-suppressor] reguleert om apoptose [geprogrammeerde cel-dood] te induceren in respons op DNA-schade; […] (TBL1XR1), die betrokken is gebleken bij histoon-binding [eiwitten die aan DNA binden; zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’]; en […] (PDE4B), dat waarschijnlijk geen rol speelt in CVS-spieren.

c) Energie-balans. Eén kenmerk van het CVS-spier gen-profiel was de onderdrukte transcriptie van meerdere genen betrokken bij het energie-meatbolisme van skeletale spiervezels. We vonden dat twee […enzymen, […] (PFKFB3) en […] (PFKFB1) ge-downreguleerd waren; wat suggereert dat glycolyse [afbraak van glucose, waarbij energie vrijkomt, tot pyrodruivenzuur, dat verder kan verbrand worden of anäeroob omgezet tot lactaat] en/of gluconeogenese [vorming van glucose uit niet-koolhydraat bronnen zoals bv. aminozuren, maar vooral uit pyrodruivenzuur] verstoord waren. […] Ook ge-downreguleerd was het gen coderend voor […] (PDK4), dat pyruvaat-dehydrogenase fosforyleert, een enzyme dat belangrijk is voor de oxidatieve [omzetting] van pyruvaat dat uiteindelijk wordt gebruikt voor oxidatieve fosforylatie [ox-fos; mitochondriaal proces waarbij energie-rijke elektronen hun energie afgeven in een serie redox-reakties; zie ook: ‘M.E.(cvs) als Mitochondriale Ziekte’]. Bovendien was […] (GOT1) ge-downreguleerd, wat suggestief is voor een toename van de gluconeogenese zonder verbruik van aminozuren., consistent met een poging van de CVS-spieren om glucose te besparen. Genen betrokken bij de fosforylatie van nucleoside-difosfaten waren ook ge-downreguleerd: inclusief […] (AMPD3), een belangrijk enzyme in purine-afbraak [purine is één van de stikstof-basen waaruit nucleïnezuren zijn opgebouwd] in spieren. Het […] (ABCA5) bleek ook ge-downreguleerd, wat suggereert dat de efflux [verwijdering van opgestapeld cholesterol uit de vaatwanden] van cholesterol uit de vezel geïnhibeerd is.

Slechts één met een mogelijk belang voor het energie-evenwicht bleek ge-upreguleerd bij vrouwen én mannen: […] (VLDLR). Dit gen codeert voor de receptor die verantwoordelijk is voor de opname van VLDL [‘very low density’ lipoproteïnen; deeltjes die vetten en cholesterol uit de lever via het bloed naar weefsels transporteren] in de spiervezel en betrokken is bij het primair mechanisme voor vetzuur-transport in skelet-spieren.

d) Atrofische processen. Een ge-downreguleerd tanscript betrokken bij de atrofische processen was […] (FOXO3A). Proteïnen van deze familie zijn transcriptie-factoren die de expressie reguleren van meerdere genen [FOXO transcriptie-factoren controleren fundamentele cellulaire processen zoals metabolisme, cel-differentiatie, cel-cyclus, DNA-herstel en andere reakties op cellulaire stress] die ge-downreguleerd bleken bij onze screening (inclusief PDK4, SOD2 en GADD45, die van belang zijn bij cellulaire responsen zoals glucose-metabolisme, regulering van de cel-cyclus en apoptose). Het is het vermelden waard dat een ander gen dat betrokken is bij het FOXO-mechanisme, […] (H1FX), coderend voor een nucleosoom-proteïne dat DNA linkt met het nucleosoom [complex van DNA en histoon-eiwitten dat de gen-expressie regelt], ge-downreguleerd was.

Belangrijk in de context van atrofische processen: het ubiquitine-afhankelijk katabolisme [merken van proteïnen, door koppeling met ubiquitine, waardoor ze kunnen worden afgebroken] was waarschijnlijk ook onderdrukt; wat blijkt uit de downregulering van ubiquinatie-factor E4A (UBE4A), coderend voor de bijkomende conjugatie-factor E4. Deze factor, die sterk tot expressie komt in skelet-spieren, vervangt het E3-enzyme en is in staat ubiquitine te transfereren naar zijn doel. De onderdrukking van ubiquitine-afhankelijke processen in CVS-spieren wordt verder bevestigd door de downregulering bij vrouwelijke patiënten van […] (PSMD3), coderend voor een non-ATPase subunit [betrokken bij de afbraak van ge-ubiquitineerde proteïnen] van het proteasoom [proteasoom = cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende - overbodige of beschadigde - proteïnen afbreken via proteasen]. Bij mannelijke patiënten werd de downregulering van […] (PSMB2), coderend voor een beta subunit van het 20S proteasoom [onderdeel van het proteasoom dat ge-ubiquitineerde molekulen afbreekt], vastgesteld.

e) Inflammatoir proces. De volgende genen waren ge-downregeuleerd bij alle patiënten, wat een vermindering van de inflammatoire respons in CVS-spieren suggereert: (i) […] (SLPI), een gen coderend voor een serine-protease [proteasen die peptide-verbindingen, waarin één van de aminozuren serine is, doorknippen] met meerdere funkties bij aangeboren gastheer-verdediging, inflammatie en infektie; (ii) GRO2 oncogen [gen dat ervoor zorgt dat een cel zich als een kanker-cel gaat gedragen], […], een krachtig chemotactisch agens voor polymorfonucleaire leukocyten [stof die meerkernige witte bloedecellen aantrekt]; (iii) […] (GBP2), coderend voor een proteïne dat de proliferatie en de angiogene respons [angiogenese = vorming van nieuwe bloedvaten] van endotheliale cellen [bedekkende cellen van bloed-/lymfe-vaten en lichaamsholten] op inflammatie tegenwerkt, en ook weerstand biedt tegen de proliferatie van vesiculair stomatitis virus en encefalomyocarditis vrius; (iv) […] (TSC22D3/GILZ), een gen coderend voor de mediator van glucocorticoïd-geïnduceerde immunosuppressie, dat interfereert met AP-1 [zie ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’] […] om de binding van aktief AP-1 met zijn doelwit-DNA te inhiberen.

f, g) Groei/apoptose en cytoskeletale regulering. Meerdere ge-downreguleerde genen gemeenschappelijk bij mannelijke en vrouwelijke CVS-patiënten zijn betrokken bij cellulaire groei en apoptose-mechanismen, suggestief voor een relatieve uitdoving van deze inter-connecterende mechanismen. We vonden dat […] (FOS) en […] (MYC) ge-downreguleerd waren. FOS en MYC zijn transcriptie-factoren betrokken bij de proliferatie en cel-cyclus regulering […] maar ze induceren ook apoptose in gevoelige cellen. FOS downregulering is consistent met de downregulering van het met FOS interagerend proteïne TCS22/GILZ, waarmee het een gemeenschappelijke signaal-transductie mechanisme deelt. Ook ge-downreguleerd waren […] (AATF), een transcriptie-factor die EF2-transcriptie [EF = elongatie-factor; proteïne dat het verlengen van peptide-ketens bij proteïne-synthese vergemakkelijkt] stimuleert en cel-cyclus progressie bevordert, en […] (CEBPD), die werd gelinkt aan cel-groei en apoptose in spiercellen.

Vele genen betrokken bij controle van focale adhesie [cel-matrix adhesies of FAs; specifieke types grote macro-molekulaire samenstellingen waarmee mechanische kracht en regulerende signalen worden doorgegeven] en cytoskeletale en/of regulering van de extracellulaire matrix bleken ook ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Onder andere: (i) […] (PRELP), coderend voor een eiwit dat type-I collageen linkt met heparaan-sulfaat basale membranen [heparaan-sulfaat speelt een rol bij angiogenese, coagulatie en tumor-metastase]; (ii) collageen type-V alfa 3 (COL5A3); (iii) […] (LIMK1), coderend voor en proteïne dat eiwitten betrokken bij de organisatie van het actine-cytoskeleton linkt; en (iv) […] (SAT1), coderend voor een eiwit betrokken bij de regulering van apoptose, cellulaire proliferatie en cel-cyclus progressie.

Ook meldenswaardig is de downregulering van twee bijkomende proteïnen: (i) […] (PTK2/FAF), coderend voor een cytoplasmatisch proteïne gelokaliseerd op focale adhesies tussen groeiende cellen, dat belangrijk is voor transductie van externe signalen; en (ii) prion-proteïne (PRNP), ook bekend van bv. Creutzfel-Jakob ziekte […], coderend voor een glycoproteïne gehecht aan het cel-membraan […]; kenmerken die consistent zouden kunnen zijn met rollen qua cel-adhesie en trans-mebraan signalisering. Een ander gewijzigd gen in CVS-spieren, een anti-angiogene factor met een rol in de focale adhesie, is thrombospondine (FLJ14440, THBS1, THBS2), dat ge-upreguleerd blijkt bij vrouwelijke maar ge-downreguleerd bij mannelijke patiënten.

h) Neuromusculaire transmissie. Het gen CHRNA1, coderend voor een component van de acetylcholine binding-plaats van de nicotine-receptor […] bleek ge-downreguleerd. De afwezigheid van dit gen-produkt zou een verstoord vermogen om te antwoorden op motor-neuron ‘vuren’, belangrijk voor trage-vezel-type specificatie, kunnen impliceren.

h) Spiervezel-fenotype. De transcriptie-factor […] (MYF6/MRF4/herculine) bleek ge-downreguleerd bij CVS-patiënten. Bij muizen accumuleert MRF4 in trage vezels en er is bewijs dat dit gen de verschuiving naar het trage vezel-type reguleert. Dit suggereert dat her-modelering van spieren gericht is naar het snelle fenotype bij CVS-patiënten, een interpretatie die overeenstemt met de resultaten van vezel-typering op eiwit-niveau [zie ‘Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS’].

Downregulering van de volgende genen geïdentificeerd in de huidige transcriptoom-analyse ondersteunt ook deze visie: (i) calmoduline 1 (CALM1/fosforylase-kinase delta), coderend voor een belangrijk calmoduline-afhankelijk kinase dat betrokken is bij het decoderen van intracellulaire calcium-oscillaties tijdens myogenese en de differentiatie van het trage-vezel fenotype [calmoduline, CaM, ‘CALcium MODULated proteIN’, een calcium-bindend proteïne dat verschillende doelwit-proteïnen kan binden en reguleren, en zo verscheidene cellulaire funkties beïnvloeden]; en (ii) […] (Egralfa3), coderend voor een transcriptie-factor die sterk tot expressie komt bij ontwikkelende spier-spoelen [sensorische receptoren in de ‘buik’ van een spier die veranderingen detekteert in de lengte van deze spier]. Aangezien spier-spoelen meer aanwezig zijn in de delen van de spier waar type-I vezels geconcentreerd zijn, zou downregulering van dit gen consistent kunnen zijn met een spier-modelering in de richting van het snelle-vezel type. Andere observaties consistent met de visie dat gen-expressie veranderingen bij CVS een verschuiving van het vezel-type van traag naar snel weerspiegelen omvatten: (i) upregulering (beperkt tot vrouwelijke patiënten) van myosine lichte-keten kinase 2 (MYLK2), coderend voor een calmoduline-afhankelijk kinase dat sterk tot expressie komt bij regenererende en volwassen snelle vezels; en (ii) verandering (downregulering bij mannen, upregulering bij vrouwen) […] (CASQ2), coderend voor een proteïne dat kenmerkend is voor trage spiervezels, en belangrijk voor de opslag van calcium in het sarcoplasmatisch reticulum en regulering van de ryanodine-receptor [zie ‘Molekulair mechanisme voor verminderde inspanningscapaciteit’].

Bespreking

In deze studie vergeleken we de gen-expressie profielen van de vastus lateralis skelet-spier bij CVS-patiënten en gezonde controles. In deze context was het doel van onze analyse te bepalen of er consistente gen-expressie wijzigingen zijn bij CVS-patiënten die mogelijks de betrokkenheid kunnen tonen van skelet-spieren bij de manifestaties van deze ziekte en aanwijzingen zouden kunnen geven over welke cellulaire processen betrokken zijn. Eerdere studies door onze groep hebben specifieke oxidatieve veranderingen in DNA en lipiden in spier-stalen van CVS-patiënten aangetoond. Het is het vermelden waard dat Mn-SOD [superoxide-dismutase] deficiëntie geassocieerd is met ernstige lipiden-peroxidatie en andere ge-downreguleerde genen, zoals FDX1, NQO1 en IHPK3, kunnen mogelijks bijdragen tot de verstoring van anti-oxidante mechanismen. Daarenboven argumenteerden we dat oxidatieve schade zou kunnen voortkomen uit mitochondriale dysfunktie, gezien de gedocumenteerde strukturele veranderingen van mitochondriale cristae van de spier-mitochondrieën bij CVS, zoals eerder geobserveerd. [zie ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’] Eén van de twee genen die ge-upreguleerd waren in spieren van mannelijke én vrouwelijke CVS-patiënten is het gespecialiseerd DNA-polymerase POLB (zeer belangrijk omwille van zijn ‘base excision’ [cellulair mechanisme dat beschadigd DNA herstelt door het verwijderen van kleine base-paar gebreken] herstel-aktiviteit), dat mogelijks betrokken is bij de respons op verhoogde oxidatieve schade. POLB-aktiviteit kan post-transcriptioneel verhoogd zijn door een vermindering van POLB-acetylering, die een verwacht gevolg zou zijn van CITED2 downregulering. We zouden ook kunnen speculeren dat het cyclisch voorkomen en de variabiliteit van spier-symptomen bij dit syndroom een weerspiegeling zou kunnen zijn van het weefsel-specifiek vermogen van POLB om ROS-geïnduceerde schade te herstellen. In een eerdere studie werd verhoogde anti-oxidante aktiviteit in CVS-spieren aangetoond, te wijten aan verhoogde aktiviteit van peroxidase, transferase en katalase. Deze uitkomst lijkt een poging van de CVS-spieren te vertegenwoordigen om zichzelf te beschermen tegen oxidatieve stress, gebruikmakend van anti-oxidante enzymen die tegen ROS werken in het cytoplasma, en POLB dat in de cel-kern DNA-mutaties helpt herstelllen. Deze positieve feedback is in overeenstemming met de hypothese van verhoogd peroxinitriet (Lane er al. 1998) die reeds werd voorgesteld. In feite zou stikstof-oxide kunnen reageren met ROS en het krachtige oxidant peroxinitriet genereren dat op zijn beurt het niveau van Mn-SOD zou kunnen doen dalen.

De downregulering van fosfofructokinase-transcripten bij al onze geteste patiënten suggereert de hypothese dat CVS, in bepaald opzichten, vergelijkbaar zou kunnen zijn met type-VII glycogenose of Tarui-ziekte, een zeldzame erfelijke ziekte veroorzaakt door fosfofructokinase-deficiëntie in spieren. Een tekort aan dit enzyme resulteert in glycogeen [polymeer van glucose, als energie-reserve opgesalgen in de lever en spieren] opstapeling in weefsels, wat symptomen veroorzaakt die inspanning-intolerantie of voortijdige vermoeidheid, zwakte en stijfheid bij inspanning, en pijnlijke spier-krampen omvatten. In veel gevallen heeft dit defekt systemische consequenties maar in andere gevallen beperken compenserende mechanismen de effekten tot bepaalde weefsels. In enkele patiënten met Tarui-ziekte werd de AMP-deaminase aktiviteit van erythrocyten verhoogd door calmoduline-afhankelijke intracellulaire calcium-verhoging. Bij CVS-spieren vonden we dat AMP-deaminase én calmoduline-fosforylase-kinase ge-downreguleerd waren. Dit is direct bewijs dat CVS en Tarui-ziekte verschillend zijn, gezien beide pathologieën klinisch significante spier-zwakte veroorzaken maar enkel bij CVS zijn de patiënten niet in staat hun verzwakte toestand te verhelpen met rust. De geobserveerde downregulering bij mannelijke én vrouwelijk patiënten van het gen coderend voor AMP-deaminase verdient bijkomende commentaar. AMP-deaminase is een enzyme dat van uiterst belang is bij het behouden van de beschikbaarheid van ATP bij inspanning. Eerdere studies hebben bewijs geleverd van gebrekkige adenylaat-aktiviteit in spieren van CVS-patiënten na matige inspanning [Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al.. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259]. Deze verandering zou kunnen gelinkt zijn met de hoge vermoeibaarheid van CVS-patiënten tijdens uitputtende arbeid. De verstoorde afbraak van purine-nucleotiden in de spier werd geobserveerd bij andere ziekten zoals glycolytisch defekt ziekte en ook bij mitochondriale ziekten waarbij de lipiden- en koolhydraten-oxidatie zijn aangetast.

Het intense gebruik van anaërobe glycolyse voor de nood aan ATP tijdens matige inspanning en het verhoogd aantal glycolytische vezels impiceert lactaat-accumulatie. We kunnen suggereren dat in CVS-spieren er een samenloop is van metabool falen die een verstoring van aërobe energie-produktie, onderdrukking van de purine-afbraak en verhoogd lipiden-verbruik omvat.

Alle spier-stalen van CVS-patiënten vertoonden downregulering van FOXO3A, coderend voor […] één van de vooraanstaande regulators van ubiquitine-ligasen. Als we de mogelijke rol van fosforylatie bij FOXO-inaktivatie ter zijde laten, wat we niet bestudeerden, vonden we dat meerdere aan ubiquitine-proteïne-ligase verwante genen, die molekulaire doelwitten zijn voor FOXO-aktiviteit, waren ge-downreguleerd. Te samen genomen, wijzen deze gegevens naar een onderdrukking van atrofie-signalen in CVS-spieren.

Immuun-dysfunktie werd bij sommige CVS-patiënten gedocumenteerd […]. In onze analyse vonden we geen aanwijzing voor veranderde immuniteit noch enige indicatie voor inflammatoire respons. In tegenstelling daarmee vonden we dat enkele inflammatoire respons genen ge-downreguleerd waren.

Eén van de meest opvallende wijzigingen bij de huidige transcriptoom-analyse bij CVS-patiënten, is de uitgesproken downregulering van CHRNA1, coderend voor […] een component van de acetylcholine-bindingsplaats. De vermoeidheid ervaren door CVS-patiënten zou een centrale óf perifere oorzaak kunnen hebben. Het eerste hangt af van de ‘vuur-frequentie’ en het tweede van neuromusculaire transmissie en/of excitatie/contractie-koppeling. Eerdere rapporten suggereren dat de symptomen van vermoeidheid bij CVS kunnen worden afgeleid van een falen qua ‘vuur-frequentie’ van motor-neuronen en niet van een perifeer defekt in de spier-contractie. Onze resultaten leveren sterk bewijs voor deze opinie, suggererend dat daling van de transcripten leidend tot insufficiëntie wat betreft deze belangrijke cholinergische receptor component zou kunnen bijdragen tot verstoorde neuromusculaire transmissie.

[Dit zou ietwat contradictorisch kunnen lijken… Vroegere studies wijzen NIET op een perifeer defekt en de resultaten hier ondersteunen dit. TOCH wijst de bevinding van gestoorde neuromusculaire transmissie WEL op perifere betrokkenheid… Dr Pietrangelo verklaart (persoonlijke communicatie): “We hebben geen bewijs voor de etiopathogenese van CVS, dus weten we niet of de oorzaak centraal of perifeer is, maar toonden dat skelet-spieren bij CVS-patiënten (vezels en geaktiveerde genen) veranderd zijn. Dit wijst er op dat ook de periferie betrokken is door bv. gestoorde neurotransmissie, mitochondriale defekten, oxidatie enz. Meldenswaardig is dat bewijs is gevonden dat de toestand van de spieren het lot van motor-neuronen beïnvloedt (Musaro A et al., Cell Metabolism (2008) 8, 425-436, ‘Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD^1G93A-Mediated Toxicity’) dus denken we dat de interaktie spier-zenuw, en vice versa, heel belangrijk is.”. Voor een overzicht van hun ideëen aangaande CVS en spieren, zie: ‘Specific correlations between muscle oxidative stress and Chronic Fatigue Syndrome: a working hypothesis’.]

Een aantal hier gemelde wijzigingen qua gen-expressie wijzen consistent naar een verschuiving van trage- naar snelle-vezel fenotype zolas reeds aangetoond. Down-regulering van MRF4 en calmoduline-kinase suggereren dat regulerende mechanismen die het trage-vezel fenotype ondersteunen onderdrukt zijn. De downregulering van een gen zoals CASQ2, typisch voor het trage-vezel fenotype, en upregulering van MYLK2, hoewel beperkt tot een subgroep patiënten, is volledig consistent met deze interpretatie.

Ondanks de aanwezigheid van individuele en geslacht-specifieke variaties, zijn er significante en consistente wijzigingen in de transcriptie-profielen van spieren bij vrouwelijke en mannelijke CVS-patiënten; in het bijzonder zijn energie-produktie, management van oxidatieve schade, neuromusculaire transmissie en bepaling van het vezel-fenotype de belangrijkste biologische processen die betrokken zijn. Het is het melden waard dat vele processen gesuggereerd bij transcriptie-profiel analyse onafhankelijk ondersteuning vinden in eerdere rapporten, zoals in het geval van veranderde oxidatieve status en vezel-fenotype wijziging. Deze studie ondersteunt sterk de visie dat spiervezels direct betrokken zijn bij de funktionele en strukturele veranderingen die aan de basis liggen van de pathogene mechanismen van de ziekte en we kunnen besluiten dat spieren op molekulair en cellulair niveau betrokken zijn bij CVS-patiënten.

De twee studies (over veranderingen in vezel-fenotype en dit hier) plus het feit dat dit waarschijnlijk niet het resultaat is van deconditionering is opwindend. We vroegen hoe deze veranderingen ev. zouden kunnen worden omgekeerd Oefen-programmas lijken geen mogelijkheid, gezien vele patiënten een flinke terugval kennen na inspanning. Is er een andere (farmacotherapeutische) optie? Dr Pietrangelo: “ De enige suggestie die we hebben is uithouding-oefeningen. Dit zou het vezel-fenotype kunen doen verschuiven naar het trage type. Dit is echter slechts een opinie, we weten niet of dit effektief zou kunnen werken, en of het mogelijk is dit te doen bij deze patiënten en welk soort protocol zou moeten worden voorgesteld.”.

Struktuur en funktie van skelet-spieren gewijzigd bij CVS

De research-groep van Stefania Fulle hebben weer enkele toonaangevende artikels gepubliceerd. Een studie betreffende de morfologie en gen-expressie van skeletspier-fragmenten van CVS-patiënten leverde twee complementaire publicaties op.

Dit eerste deel toonde bij CVS-ers, in vergelijking met gezonde mensen, relatief meer zgn. ‘snelle’ vezels en minder ‘trage’ vezels. De ‘trage’ vezels zijn efficiënter in het gebruik van ATP, zijn beter gevasculariseerd en bevatten meer mitochondriën; kortom ze zijn resistenter tegen vermoeidheid en beter geschikt voor langdurige aërobe arbeid. Bij ‘snelle’ vezels duurt het aanvullen van ATP langer; er zijn minder mitochondrieën, minder myoglobine en minder bloedvaten. De ‘snelle’ vezels raken makkelijk vermoeid en produceren/accumuleren meer melkzuur, wat resulteert in pijn/krampen en kan mogelijks ook TRPV1- en ASIC3-kanalen aktiveren.

Er zijn dus morfologische veranderingen waar te nemen. En volgens de auteurs zouden die NIET te wijten zijn aan het minder gebruiken van de spieren (deconditionering).

Voor meer achtergrond zie ook: ‘Vertraagd herstel na Inspanning bij CVS’ en ‘Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS’.

Het tweede deel van de studie volgt…

Met dank aan dr Tiziana Pietrangelo voor de reprint.

International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 22(2):427-436. (2009)

Functional characterization of muscle fibres from patients with chronic fatigue syndrome: case-control study

Pietrangelo T, Toniolo L, Paoli A, Fulle S, Puglielli C, Fanò G, Reggiani C

Dept. Basic and Applied Medical Sciences (BAMS), Centre for Excellence on Ageing (CeSI), University – G. d’Annunzio- Chieti-Pescara, Chieti, Italy

Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is een invaliderende aandoening gekarakteriseerd door onverklaarde chronische vermoeidheid die de normale aktiviteiten schaadt. Niettegenstaande de aanwezigheid van immunologische en psychologische aspekten, zijn symptomen gerelateerd met skelet-spieren, zoals pijnlijke spieren, vermoeibaarheid en gestegen lactaat-accumulatie, prominent bij CVS-patiënten. In deze geval-controle studie werd het fenotype van dezelfde bioptie-stalen geanalyseerd door het bepalen van i) vezel-type proportie – d.m.v. myosine-isoformen als vezel-type molekulaire merker en gel-elektroforese [scheidingstechniek voor eiwitten of nucleïnezuren] als een instrument om myosine-isoformen te scheiden en te kwantificeren, en ii) contractie-eigenschappen van manueel gedissecteerde, chemisch permeabel gemaakte en calcium-geaktiveerde enkelvoudige spiervezels. De resultaten toonden dat de vezel-type proportie significant gewijzigd was bij CVS-stalen: een verschuiving van het trage- naar het snelle-samentrekking fenotype. Dwars-doorsnede, kracht, maximum verkorting-snelheid [Spiervezels genereren spanning door de wisselwerking van de proteïnen actine en myosine; daardoor kunnen ze verlengen, verkorten of hetzelfde blijven. Hoewel de term ‘contractie’ verkorting impliceert als we over het spier-stelsel spreken, betekent het spiervezels die spanning genereren m.b.v. of motor-neuronen. Naargelang de verkorting-snelheid stijgt, daalt de kracht die kan worden geleverd.] en calcium-gevoeligheid waren niet significant veranderd in enkelvoudige spiervezels van CVS-stalen. De samentrekking-eigenschappen van spiervezels bleven dus bewaard maar hun verhouding was gewijzigd, met een toename van het meer voor vermoeidheid vatbare, energie-verbruikende snelle vezel-type. Alles te samen ondersteunen deze resultaten de visie dat spier-weefsel direct betrokken is bij de pathogenese van CVS en dat het zou kunnen bijdragen tot de vroege aanvang van vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren bij CVS-patiënten.

[…]

Bij CVS-patiënten zijn de meest in het oog springende symptomen de invaliderende vermoeidheid, spier-pijn en spier-zwakte, wijzend op neuromusculaire dysfunktie. Eerdere studies toonden dat sommige CVS-patiënten bij toenemende inspanning een gedaalde anaërobe drempel vertoonden. Deficiëntie in serum-acetylcarnitine bij CVS-patiënten kan leiden tot een daling in oxidatief metabolisme en hoger plasma-lactaat. Dergelijke metabole defekten kunnen bijdragen tot de verminderde fysieke uithouding van CVS-patiënten. Bij dynamische inspanning raken CVS-patiënten sneller uitgeput dan controle-individuen niettegenstaande ze over normale spier-kracht beschikken en normale of lichtjes verminderde spier-uithouding hebben. […]

Skelet-spieren van zoogdieren zijn heterogeen, opgebouwd uit vezels met een verschillende molekulaire architektuur en specifieke funktionele eigenschappen, zoals samentrekking-snelheid, maxiumum verkorting-snelheid en weerstand tegen vermoeidheid. De fysiologische eigenschappen van spieren, o.m. weerstand tegen vermoeidheid, worden bepaald door de proporties van fenotypisch afzonderlijke vezel-types. Van de proteïnen die differentieel tot expressie komen bij afzonderlijke vezel-types, worden myosine zware ketens [‘myosin heavy chains’, MyHC] dikwijls als molekulaire merkers gebruikt, omdat ze i) het meest overvloedige proteïne uitmaken (ca. 50% van de totale proteïne-inhoud); ii) meerdere funktionele eigenschappen – zoals maxiumum verkorting-snelheid en ATPase-aktiviteit – bepalen; en iii) verantwoordelijk zijn voor de differentiële histochemische ATPase kleuring […], en procedure die reeds vele jaren wordt gebruikt om vezel-types te klassificeren. In volwassen menselijke skelet-spieren komen drie MyHC-types tot expressie: twee snelle isoformen (2A en 2X) en één trage isoform (type 1 of β-cardiale isoform). Zo komen drie vezel-types voor in humane skelet-spieren: trage vezels waar type 1 MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een oxidatief metabolisme, snelle 2X-vezels waar type 2X MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door een glycolyse-metabolisme en snelle 2A-vezels waar type 2A MyHC tot expressie komt en worden gekenmerkt door intermediaire metabole eigenschappen. Welk gen tot expressie komt in een bepaalde spier-vezel hangt af van intrinsieke programmas verbonden met de myoblast-lijn [voorlopers van spiercellen] waaruit de vezel ontwikkelt, en van extrinsieke invloeden zoals neurale, hormonale en mechanische factoren (inclusief spier-aktiviteit).

Een eerdere studie betreffende de samentrekking-eigenschappen van spieren bij CVS-patiënten toonde geen consistente correlaties tussen symptomen en veranderingen qua vezel-type proportie, vezel-grootte, degeneratieve of regeneratieve kenmerken. Die studie vond dat de samentrekking-eigenschappen van quadriceps […] niet significant waren veranderd vergeleken met controles (Edwards et al. 1993). Een later rapport over een grotere CVS-groep, waar bioptie-stalen de quadriceps werden geëvalueerd […] besloot dat CVS-patiënten met een abnormale lactaat-respons bij inspanning een significant lager aantal mitochondria-rijke type 1 spiervezels hadden (Lane et al. 1998). In de huidige studie analyseerden we kracht, doorsnede-oppervlakte, maxiumum verkorting-snelheid en calcium-gevoeligheid van enkelvoudige CVS-vezels om meer te weten te komen over de samentrekking-eigenschappen van CVS-spiervezels en hun verhouding.

Materialen en methoden

Individuen

CVS-patiënten […] diagnose volgens de CDC-criteria.

[…] vijf vrouwen (gemiddelde leeftijd 44,8±3,4 jaar) en vijf mannen (gemiddelde leeftijd 37,0±3,2 jaar).

Criteria voor opanme [in de studie] waren voor alle individuen: (a) leeftijd 25-55 jaar; (b) geen huidige pathologie buiten CVS […]; (c) niet zwanger; (d) type I voedsel-inname (richtlijnen ‘American Heart Assosciation’) [beperkt totaal vet: niet meer dan 30% en verzadig vet niet meer dan 10% van de totale calorie-inname, cholesterol minder dan 300 mg/dag]; (e) geen medicatie ten minste één maand voor het onderzoek; en (f) geïnformeerde, geschreven toestemming voor deelname.

Controles […] belangrijk criterium was de afwezigheid van enige diffuse musculoskeletale/vermoeidheid van langer dan 10 dagen in het heden of het verleden. […]

Experimenteel plan

[…] twee verschillende groepen experimenten: (i) transcriptie-profiel analyse van totaal spier-fragment, (ii) meting van spanning-ontwikkeling en vezel-type karakterisatie. […]

Elektroforese en Western blot analyse

[Elektroforese is een manier om eiwitten te scheiden volgens elektrische lading/grootte op een drager (polymeer/gel) in een elektrisch veld.]

[...] Scheiding van MyHC-isoformen […] volgens migratie [van snelle naar trage migratie in, van onder naar boven op een gel; de β traag-samentrekkende isoform verplaatst zich dus het snelst in een elektrisch veld]: MyHC-1, MyHC-2A en MyHC-2X. […]

Mechanische experimenten op enkelvoudige vezels

[Meten van isometrische spanning bij verschillende calcium-concentraties.]

Statistische analyse

[…]

Resultaten

De proportie van vezel-types in bioptie-stalen werd bepaald via het analyseren van MyHC-isoformen. […] Elektroforetische analyse werd uitgevoerd bij totaal spier-weefsel en enkelvoudige geïsoleerde spiervezels. […]

De resultaten tonen dat er aanzienlijke variabiliteit was qua isoformen tussen individuele patiënten. […] De snelle MyHC-2A vezels bij CVS-patiënten en controles was ongeveer gelijk. De proportie trage MyHC-1 vezels was echter significant lager en die van de snelle MyHC-2X vezels significant hoger bij CVS-patiënten vergeleken met controles.

Interessant is dat de proportie vezel-types niet varieerde naar gelang geslacht. Bij mannen lagen de gemiddelden op 33,9% MyHC-1, 37,2% MyHC-2A en 28,9% MyHC-2X; bij vrouwen waren de gemiddelden 32,1% MyHC-1, 40,4% MyHC-2A en 27,5% MyHC-2X. De verschuiving qua myosine-isoform expressie is een duidelijke aanwijzing voor veranderde vezel-type proportie […]. We vonden ook geen significante verschillen qua doorsnede-oppervlakte.

In de mechanische experimenten evalueerden we de samentrekking-capaciteiten van elke vezel. We maten de maximum verkorting-snelheid (V₀) tijdens maximale aktivatie van onbelaste vezels. Omdat de samentrekking-parameters, en in het bijzonder V₀, sterk afhankelijk zijn van het vezel-type, werden de vezels gegroepeerd op basis van hun MyHC-isoform inhoud. Het vezel-type waar MyHC-1 en MyHC-2A tot expressie komen zijn homogeen [qua V₀] voor patiënten en controles; terwijl de hybride MyHC-1-2A en de MyHC-2X vezels van CVS-spieren ietwat verschillen. Ook de hybride MyHC-2A-2X lijken te verschillen maar dit bleek statistisch niet significant.

De maximale isometrische spanning (P₀) werd bij de vrij-gedissekteerde vezels gemeten bij maximale calcium-concentratie. […] De CVS-en controle-vezels bleken vrij homogeen. Er waren geen statistisch-significante verschillen, wat suggereert dat de samentrekking-eigenschappen van de spier-vezels niet was veranderd bij CVS-patiënten.

[…] De relatieve spanning ontwikkeld bij sub-maximale aktivatie van de CVS-vezels was niet significant verschillend van controle-vezels, wat er op wijst dat de samentrekking-respons van de myofibrillen [bundel samentrekbare filamenten (myosine en actine), samen betrokken bij de beweging van (spier-)cellen] op calcium-stimulatie gelijkaardig was.

Discussie

Niettegenstaande aanzienlijke research over dit onderwerp blijft de associatie tussen strukturele veranderingen in skelet-spieren en zwakte of verminderde resistentie tegen vermoeidheid, gezien bij CVS-patiënten, controversieel. Onze studie toonde een verschuiving qua vezel-type proportie bij CVS-patiënten, m.n. de aanwezigheid van meer snelle 2X-vezels en minder trage vezels. Er waren geen verschillen qua doorsnede-oppervlakte en wat betreft de belangrijke parameters die spier-samentrekking kenmerken […].

De bevinding dat de MyHC-isoform proportie gewijzigd bleek, is volgens ons een duidelijke aanwijziging voor een veranderde vezel-type verhouding. MyHC-isoformen worden beschouwd als molekulaire merkers voor vezel-types. In eerdere studies hebben we de potentiële correlatie tussen MyHC-isoform en vezel-type verhouding onderzocht, en bereikten we de conclusie dat, in afwezigheid van belangrijke veranderingen qua doorsnede-oppervlakte van de vezels, de elektroforetische analyse van de MyHC-proportie een indicator was voor de verhouding van de vezel-types. De MyHC-isoformen verhouding bij de controles hier was vergelijkbaar met wat we vonden in eerdere studies; trage MyHC vertegenwoordigde ca. 45% van het totaal, een waarde die vergelijkbaar is met wat anderen vonden. Het aantal CVS-patiënten dat we hier bestudeerden was beperkt maar dat was ten dele te wijten aan de zeer precieze inclusie-criteria. De verschuiving qua vezel-type proportie werd verder bevestigd door de observatie dat gelijkaardige resultaten werden bekomen als de patiënten werden verdeeld op basis van geslacht.

De vermindering van trage MyHC-isoformen bij CVS-patiënten ging gepaard met een vermeerdering van snelle 2X MyHC, met vrijwel geen wijziging qua snelle 2A MyHC. Bovendien was de proportie MyHC-2X in stalen van CVS-patiënten duidelijk hoger dan die van controles in deze studie en, belangrijk, in andere onafhankelijke studies. De verschuiving qua vezel-type proportie van traag naar 2X, zoals gesuggereerd door de verschuiving qua myosine-isoformen, correspondeert niet enkel met een verandering in de hoeveelheid trage en snelle vezels, maar ook in die van oxidatieve en glycolytische vezels (bij menselijke spieren zijn trage vezels hoofdzakelijk oxidatief en 2X vezels hoofdzakelijk glycolytisch). Analyse van het expressie-profiel legde ook een aantal veranderingen bloot [zie later] die consistent zijn met een verschuiving van trage naar snelle vezels. […] Een vermindering van de expressie van overeenkomstige proteïnen suggereert een onderdrukking van de signalisering die een ‘trage vezel’ fenotype ondersteunt. […] Onze analyse van het expressie-profiel  toont ook de upregulering van het gen […] dat sterk tot expressie komt in regenererende en volwassen snelle vezels.

Eerdere studies bij CVS-patiënten hebben aanwijzingen opgeleverd voor een mogelijke wijziging qua vezel-type proportie. Lane et al. rapporteerden dat lactaat in hoger mate accumuleert in de spieren van CVS-patiënten dan die van controles. Volgens een breed geaccepteerde visie wordt lactaat tijdens inspanning geproduceerd door glycolytische vezels en opgenomen door oxidatieve vezels, en ook door cardiomyocyten [hartspier-cellen] en hepatocyten [lever-cellen]. Lane et al. toonden ook dat de regeneratie van ATP via mitochondriale oxidatieve processen bij een groep CVS-patiënten verstoord was. Onze expressie-profiel analyse toonde een aantal veranderingen qua gen-expressie […] die wijzen op een verstoord energie-metabolimse. Hoewel er geen post-transcriptionele [op vlak van proteïnen] informatie beschikbaar is, kunnen we hypothiseren dat de ATP-bronnen in CVS-spieren anaërobe glycolyse zouden kunnen zijn die de lactaat-concentratie doet stijgen. De verhoging van het percentage glycolytische vezels hier toonde bovendien dat het evenwicht werd verstoord: van lactaat-verwijdering naar lactaat-accumulatie.

Het is bekend dat spier-onbruik een overgang van trage naar snelle vezels en van oxidatief naar glycolytisch metabolisme kan opleveren. De observatie dat de vezel-type proportie is veranderd bij CVS-patiënten stelt dus een belangrijke vraag betreffende de oorzaak van CVS: is de verschuiving qua vezel-type de oorzaak of het gevolg van verminderd spier-gebruik? Onsze expressie-profiel analyse biedt enkele interessante en verhelderende aanwijzingen. Een ge-downreguleerd gen bevat de bindingsplaats voor acetylcholine [neurotransmitter]. Verminderde waarden van dit transcript suggereren de mogelijkheid van een defekte nicotine-receptor [acetylcholine bindt op een nicotine-receptor, een ionkanaal-receptor die werkt via een wijziging van de celmembraan-permeabiliteit] en verminderde efficiëntie van neuronale transmissie van de neuromusculaire junctie [synaps van een axon-uiteinde van een motor-neuron (neuron in het centraal zenuwstelsel waarbij de axonen buiten het CZS reiken en spieren controleren) met de ‘motor end plate’ (uiteinde van een motor-neuron dat neurale impulsen doorgeeft aan een spier)]. Deze deficiëntie zou het vermogen van de ‘end-plate’ om het repetitieve lage-frequentie vuren van motor-neuronen – dat specifiek is voor trage vezels – kunnen verstoren en, ten gevolge daarvan, kunnen resulteren in een daling van het aantal trage vezels. Daarenboven zouden enkel intra-cellulaire signalisering-mechanismen, die vermoedelijk een rol spelen in het doorgeven van de effekten van neurale stimulatie, ook kunnen ge-downreguleerd zijn. […]

De afwezigheid van een verandering qua vezel-grootte bij CVS verdient ook enige commentaar. Hoewel het niet in overeenstemming is met de hypothese dat ongebruik kan bijdragen tot de verschuiving van snel naar vast, zoals hierboven beschreven, komt het wel overeen met eerdere histologische [histolgie = weefselkunde] studies over spieren bij CVS-patiënten die niet in staat bleken significant bewijs te vinden voor spier-atrofie. Onze mening is dat de verhoogde aanwezigheid van snelle vezels niet afhangt van spier-onbruik maar een onbekende molekulaire oorzaak zou kunnen hebben die dieper onderzocht moet worden. Het gemelde gebrek aan spier-vezel atrofie wordt ondersteund door de expressie-profiel studies […] Te samen genomen suggereert de downregulering van de genen [zie later] dat de katabolische [katabolisme = afbrekende chemische processen in het lichaam, waarbij energie vrijkomt] en atrofische [atrofie = verschrompelen van een orgaan door het afsterven van de cellen waaruit het orgaan bestaat] processen die de spier-massa kunnen reduceren minder aktief zijn.

De karakterisatie van de samentrekking-eigenschappen van spiervezels van CVS-patiënten op het niveau van de enkelvoudige vezel biedt een nieuwe bijdrage tot ons begrip van de fysiopathologie van deze ziekte. We vonden dat isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid niet verschilden tussen spieren van CVS en controles. De mechanische kracht, die proportioneel is met het produkt van isometrische spanning en maximum verkorting-snelheid bij nul-belasting, zou ook ongewijzigd zijn. Hetzelfde was geldig voor de samentrekking-respons van het myofibrillair apparaat op calcium-stimulatie […]. Het is bekend dat ATPase-aktiviteit van myosine-motors [Myosine molekulaire motors bewegen langs actine-filamenten om bv. spier-samentrekking op te wekken. De koppen van myosine bevatten actine en ATP-bindingsplaatsen, dit zijn de motor-proteïnen die kracht geven aan spierspanning.], die ca. 75% van de totale energie-consumptie van de spieren bedraagt tijdens samentrekking, proportioneel is met de maximum verkorting-snelheid en dat deze groter zal zijn voor snel 2X-myosine dan voor traag myosine. De verschuiving qua vezel-type die hier werd geoberveerd, impliceert dus een hogere ATP-consumptie tijdens samentrekking. Dit creëert een nood voor snellere ATP-regeneratie, die kan worden bewerkstelligd via glycolyse en lactaat-produktie, met een daling van de extra-cellulaire pH [zuurtegraad] tot gevolg. Dit kan bijdragen tot een verslechtering van de spier-conditie tijdens aktiviteit via zuur-voelende ion-kanalen die werden gevonden op primaire afferente vezels [zie ook: ‘Matige Inspanning verhoogt Expressie van Sensorische, Adrenerge en Immuun Genen bij CVS’]

De bepaling van de contractie-prestatie werd uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de membranen (sarcolemma en sarcoplasmatisch reticulum) [sarcolemma = celmembraan van een dwarsgestreepte spiervezel; sarcoplsama = vloeistof die de myofibrillen van dwarsgestreepte spiervezels omgeeft] doorlaatbaar waren en de samentrekking werd geïnduceerd door immersie van de spiervezels in oplossingen met specifieke concentraties vrij calcium. Op deze manier waren mechanismen voor calcium-afgifte en -opname onbeschikbaar en dus kon geen conclusie worden getrokken aangaande dit aspekt van de contractie-regulering. Eerder werk door onze groep heeft echter getoond dat oxidanten zich opstapelen in CVS-spieren [zie: ‘Specifieke correlaties tussen oxidatieve stress in de spieren en CVS’ /// Fulle S, Mecocci P, Fanò G et al. Specific oxidative alterations in vastus lateralis muscle of patients with the diagnosis of Chronic Fatigue Syndrome. Free Radical Biol. Med. 29 (2000): 1252-1259] met daaraan verbonden stoornissen van proteïnen van het sarcoplasmatisch reticulum betrokken bij calcium-afgifte/-opname [Fulle S, Belia S, Vecchiet J et al. Modification of the functional capacity of sarcoplasmic reticulum membranes in patients suffering from Chronic Fatigue Syndrome. Neuromuscul Disord. 2003 Aug;13(6):479-84]; en dat mitochondriale aktiviteit aan de basis ligt van een toename van de produktie van reaktieve zuurstof soorten [ROS] leidend tot spier-vermoeidheid, een proces dat gelijkaardig is met het normale ouder worden. De resultaten die hier worden gerapporteerd kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat dergelijke post-transcriptionele veranderingen kunnen bijdragen tot funktionele wijzigingen, maar ze suggereren wel dat schade aan myfibrillaire proteïnen niet betrokken is.

[…]

Besluit: deze studie brengt sterk bewijs aan dat het idee ondersteunt dat struktuur en funktie van skelet-spieren zijn gewijzigd bij CVS-patiënten. Samen met de resultaten van de transcriptie-profiel analyse is de toename aan snelle, meer voor vermoeidheid vatbare 2X-vezels consistent met hogere ATP-consumptie en -regeneratie door glycolyse en lactaat-produktie. Ongeacht het mechanisme kan de verschuiving van traag-naar-snel, zoals gesuggereerd door de gegevens, bijdragen tot de verminderde weerstand tegen vermoeidheid die typisch is voor de skelet-spieren van CVS-patiënten.

NF-κB en Inspanning

In een artikel over NF-kappaB [NF-κB] bij proteïne-afbraak en immobilisatie, ouder worden en inspanning [Ann N Y Acad Sci. 2005 Dec;1057:431-447] besloten Marina Bar-Shai en haar collegas:

>>Inspanning en spier-aktiviteit zijn essentieel voor ons welbehagen. Met de leeftijd nemen de mogelijkheden om te trainen of zich in te spannen af. Bij ouderen zal de spier-massa verminderen en de spier-schade toenemen. Fysieke inspanning kan schadelijk zijn voor iemand op leeftijd. Aangezien spier-schade veroorzaakt door inspanning bij ouderen gedeeltelijk kan geassocieerd zijn met inflammatoire processen, is het logisch aan te nemen dat NF-κB – ten minste gedeeltelijk – verantwoordelijk is voor de schadelijke effekten van fysieke inspanning op hogere leeftijd. In het geval van de upregulering van NF-κB bij inspanning, is het ook mogelijk inhibitoren van het NF-κB mechanisme te gebruiken om de schade veroorzaakt door NF-κB afhankelijke inflammatoire processen te verminderen.<<

Aangezien de door patiënten gemelde verergering van M.E.(cvs)-symptomen en aangetoonde schade [zie o.a. ‘Specifieke correlaties tussen oxidatiev stress in de spieren en CVS’] zou het NF-κB ook wel eens heel belangrijk kunnen zijn. Te meer omdat NF-κB o.a. latente virussen zou kunnen aktiveren/stimuleren [commentaren van Prof. Pall & Dr Cheney]. Omdat inspanning de M.E.(cvs) verergert [zie: ‘Dubbele fietstest’], proberen we in de wetenschappelijke literatuur hieromtrent aanwijzingen te vinden. Om te beginnen hier wat Bar-Shai et al. nog meer zeggen over het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie (naast wat bijkomende duiding).

>>Aktivatie van NF-kappaB werd vastgesteld in spieren na acute en intense inspanning, wat impliceert dat inflammatoire processen kunnen plaatsvinden bij inspanning. Dit kan spier-schade en proteïne-afbraak veroorzaken. Het gebruik van inhibitoren van het NF-kappaB mechanisme zou nuttig kunnen zijn bij het verminderen van met NF-kappaB geassocieerde spier-schade.<<

Voor wat meer achtergrond betreffende de mechanismen die NF-κB stuurt, verwijzen we naar: ‘Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB’

Ann N Y Acad Sci. 2005 Dec;1057:431-47

The role of NF-kappaB in protein breakdown in immobilization, aging and exercise: from basic processes to promotion of health

Bar-Shai M, Carmeli E, Reznick AZ

Department of Anatomy and Cell Biology, Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Institute of Technology, P.O. Box 9649, Haifa 31096, Israel

Inleiding

Het verouderen van skelet-spieren

Het wegkwijnen van skelet-spieren, courant bij oudere mensen en dieren, wordt dikwijls ‘ouderdom-sarcopenie’ genoemd. Sarcopenie is een term voor het globaal verlies aan spier-massa, -kracht en -kwaliteit (strukturele samenstelling, bezenuwing, samentrekbaarheid, capillarire densiteit, vermoeibaarheid en glucose-metabolisme). Op oudere leeftijd, is er een uitgesproken afname van 20-30% qua spier-massa in vergelijking met die bij jongeren. Sarcopenie resulteert in spier-zwakte, wat leidt tot een verhoogd verkomen van valpartijen, hogere morbiditeit en verlies van funktionele autonomiteit. Er zijn meerdere voorstellen betreffende het onderliggend biochemisch mechanisme voor leeftijd-gerelateerde sarcopenie. Deze omvatten vermindering in mediërende factoren betrokken bij aktivatie van myoblasten [voorlopers van myocyten (spiercellen); bevinden zich aan de rand van spiervezels en kunnen door deling voor herstel zorgen], verminderde proteïnen-synthese in de spieren, een rol voor reaktieve zuurstof soorten [ROS], metabole gevolgen van de wijziging in enzyme-aktiviteiten, stikstof-onevenwicht, verstoord glucose-metabolisme en onevenwicht tussen afbraak en verwijdering van ‘oude’ beschadigde spier-proteïnen. De rol van mitochondrieën in spier-degeneratie en sarcopenie werden ook al voorgesteld. De factoren die leiden tot de veroudering van skelet-spieren zijn complex en talrijk. Ze omvatten biochemische en metabole veranderingen in spier-weefsel, wijzigingen in de grootte en samenstelling van spiervezels, en verlies van spier-massa. Het is echter niet duidelijk of dit fenomeen het resultaat is van de afname in spier-gebruik bij oudere leeftijd of, omgekeerd, een direct resultaat is van het veroudering-proces. De eerder vermelde wijzigingen zijn zelfs meer uitgesproken bij oudere mensen en dieren die gedurende langere perioden niet bewegen. Bij deze individuen ondergaan de skelet-spieren, in het bijzonder die van de onderste ledematen, progressieve atrofie en verlies van massa en funktie. Dit proces wordt ‘disuse muscle atrophy’ [spier-atrofie door ongebruik] genoemd en het kan schadelijke resultaten, zoals zwakte, instabiliteit en frequent vallen, opleveren die dikwijls het leven van ouder mensen belasten.

Proteolytische systemen in spieren

[…]

De betrokkenheid van TNF-α en NF-κB bij proteïne-afbraak in spieren

De connectie tussen inflammatoire processen, NF-κB aktivatie en proteïne-afbraak werd eerder al beschreven. In 1997, toonden Sen et al. [Sen CK, Khanna S, Reznick AZ et al. 1997. Glutathione-regulation of tumor necrosis factor-alpha induced NF-kappa B activation in skeletal muscle derived L6 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 645-649] dat […] TNF-α NF-κB kan aktiveren en dat deze aktivatie redox-gereguleerd is. In daaropvolgende studies, toonden Li et al. [Li YP, Schwartz RJ, Waddell ID et al. 1998. Skeletal muscle myocytes undergo protein-loss and reactive oxygen mediated NF-kappaB activation in response to tumor necrosis factor alpha. FASEB J. 12: 871-880] aan dat […], TNF-α proteïne-verlies induceerde, die gemedieerd werd door oxidatieve stress en NF-κB aktivatie. In andere studies werd getoond dat de blootstelling aan waterstof-peroxide of TNF-α leidde tot NF-κB afhankelijke proteïne-ubiquitinatie [Merken van eiwitten met ubiquitine-molekulen zodat ze afgebroken worden. Ubiquitine is in staat om te binden aan andere ubiquitine-molekulen waardoor er een poly-ubiquitine keten ontstaat.] en de expressie en aktiviteit van ubiquitine-ligasen van E3 familie [Ubiquitine wordt aan een eiwit gekoppeld via drie enzymatische stappen. Eerst wordt ubiquitine via E1 (aktivatie-enzyme) geaktiveerd, vervolgens wordt het doorgegeven aan E2 (conjugerend enzyme) en ten slotte wordt ubiquitine gekoppeld aan een target-eiwit via E3 (proteïne-ligase).].

[…]

NF-κB signalisering-mechanismen en spier-afbraak

Alle leden van de NF-κB familie members komen tot expressie in skelet-spieren. Het NF-κB transcriptie-factor complex is betrokken gebleken bij spier-atrofie toegeschreven aan het niet gebruiken én cachexie [algemene zwakte-toestand], maar de specifieke betrokken familie-leden bij de twee types van atrofie zijn duidelijk. Dit is belangrijk, omdat het er op wijst dat er verschillen zijn in de molekulaire signalisering voor deze twee types atrofie en, daardom, dat er mogelijks meer specifieke molekulen zijn die als doelwit kunnen dienen bij de ontwikkeling van therapieën.

Bij cachexie zijn de belangrijke upstream doelswitten circulerende cytokinen, vooral TNF-α, die de fosforylatie van het NF-κB inhibitor-proteïne I-κB α induceert, door het aktiveren van het specifiek kinase IKK. Na fosforylatie krijgt I-κB α meerder ubiquitine-molekulen en afgebroken door het proteasoom [cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende - overbodige of beschadigde - proteïnen afbreken via proteasen], zodat NF-κB nucleaire translokatie [verplaatsing naar de cel-kern] en transcriptionele aktiviteit [‘overschrijven’ van DNA naar RNA] mogelijk wordt. De meest overvloedige vorm van NF-κB, het p65/p50 heterodimeer, wordt geaktiveerd via het bovenstaande mechanisme, wat wordt beschouwd als de klassieke of kanonieke aktivering-wijze. [Janssen-Heininger YM, Poynter ME & Baeuerle PA. 2000. Recent advances towards understanding redox-mechanisms in the activation of nuclear factor kappaB. Free Radic. Biol. Med. 28: 1317-1327]

Bij het niet gebruiken van spieren, werd een alternatief mechansime voor NF-κB aktivering opgehelderd. Er werd aangetoond dat het niet gebruiken van de spieren leidt tot verhoogde transcriptie-aktiviteit van NF-κB. […] Het prototypisch NF-κB familie-lid p65 vertoonde geen gestegen nucleaire waarden, p50 en Bcl-3 (een nucleair I-κB familie-lid) was uitgesproken verhoogd. […]

[…]

Bespreking

[…]

Het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie

Er zijn tegenstrijdige rapporten geweest over het effekt van inspanning op NF-κB aktivatie in spier-cellen en andere weefsels. Als inderdaad bepaalde manieren van training spier-schade zouden veroorzaken, zou men verwachten dat NF-κB mogelijks participeert in de processen van spier-beschadiging zoals blijkt uit proteïne-afbraak door schadelijke inspanning-regimes. Veronderstellend dat bij de meeste inspanningen proteïne-synthese in de spieren wordt gestimuleerd, is het plausibel downregulering van NF-κB aktivatie te verwachten onder deze omstandigheden.

Een aantal rapporten wijst er op dat intense fysieke inspanning leidt tot de toename van de aktivatie van het NF-κB signalisering-mechanisme. Ji et al. [Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Steinhafel N & Vina J. 2004. Acute exercise activates nuclear factor (NF)-kappaB signalling-pathway in rat skeletal muscle. FASEB J. 18: 1499-1506] hebben gevonden dat bij ratten die zich inspanden tot uitputting, er hoge waarden van NF-κB aktivatie in de spieren waren, vergeleken met ratten die geen inspanning leverden. De inhoud van IKK en I-κB α in het cytosol [intra-cellulaire vloeistof met daarin de cel-organellen] van de spier-cellen was daarom ook gedaald. Behandeling met anti-oxidanten, zoals pyrrolidine-dithiocarbamaat (PDTC), deed de aktivatie van de NF-κB signalisering-cascade bijna volledig teniet. Zo rapporteerde Ho et al. ook dat NF-κB aktiviteit steeg met 50% in de kuit-spieren van ratten 1-3 uur na 60 minuten op een loopband. [Ho RC, Hirshman MF, Li Y et al. 2005. Regulation of I{kappa} B kinase and NF-{kappa}B in contracting adult rat skeletal muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 289(4): C794-801] Inhibitie van p38 en ERK MAP-kinasen [zie ook: ‘Glia, glutamaat-transport en chronische pijn’] resulteerde in 76% inhibitie van de IKK-fosforylatie. Dit suggereerde dat deze kinasen de aktivatie van IKK en NF-κB tijdens inspanning kunnen beïnvloeden.

Sen heeft een mechanisme gesuggereerd voor de mogelijke manier voor NF-κB aktivatie bij inspanning. [Sen CK. 1999. Glutathione-homeostasis in response to exercise-training and nutritional supplements. Mol. Cell. Biochem. 196: 31-42] In zijn artikel beschijft hij hoe intense acute inspanning de oxidatie van glutathion in spier-cellen kan veroorzaken, wat resulteert in verhoogde oxidatieve stress en NF-κB aktivatie. Regelmatige inspanning kan echter glutathion-waarden verhogen in spier-weefsel, wat resulteert in een downregulering van de NF-κB aktiviteit. Inderdaad: andere studies bij mensen hebben gesuggereerd dat acute vermoeiende inspanning de NF-κB aktiviteit in spieren lijkt te doen dalen. [Durhan WJ, Li YP, Gerken E et al. 2004. Fatiguing exercise reduces DNA-binding activity of NF-kappaB in skeletal muscle nuclei. J. Appl. Physiol. 97: 1740-1745]

Ander werk op het effekt van ouderdom en inspanning toonde dat er, met de leeftijd, een stijging qua NF-κB inhoud was in rat-levers. Dit werd significant verminderd door regelmatige inspanning. [Radak Z, Chung HY, Naito H et al. 2004. Age-associated increase in oxidative stress and nuclear factor kappaB activation are attenuated in rat-liver by regular exercise. FASEB J. 18: 749-750] Daarom kan regelmatige inspanning mogelijks de inflammatoire respons die wordt gezien op oudere leeftijd doen dalen.

[…]

Dit alles komt ook aan bod in een overzicht door dezelfde groep (‘Exercise and immobilization in aging animals: the involvement of oxidative stress and NF-kappaB activation’; Free Radic Biol Med. 2008 Jan 15;44(2):202-14):

>> Intense fysieke inspanning door jonge mensen gaat gepaard met verhoogde parameters voor oxidatieve stress in spieren en andere organen. Veeleisende inspanning door dieren leidde tot verhoogde proteïne-oxidatie (gemeten via proteïne-carbonyl accumulatie in de spieren, die kon worden verminderd door toediening van vitamine-E. Nucleaire factor kappaB (NF-kappaB) is een redox-gevoelige transcriptie-factor die responsief is voor ROS en reaktieve stikstof soorten (RNS) redox-cascades.<<

Er wordt hier ook melding gemaakt van het feit dat oxidatieve stress afkomstig van mitochondrieën de aktiviteit van NF-κB reguleert. [Wordt vervolgd]

*************************

Het bestuderen van het verband tussen NF-κB en inspanning gaat natuurlijk verder. Hoewel niet specifiek gericht op M.E.(cvs)-patiënten, vindt er men in de wetenschappelijke literatuur wel aanwijzingen die van belang zouden kunnen zijn… Eventeel tegenstrijdige uitkomsten kunnen te wijten zijn aan het inspanning-protocol, het onderzocht cellulair materiaal of de methodologie. In elk geval zouden onderzoeken specifiek bij M.E.(cvs) voor ons interessant zijn… Een bloemlezing:

Free Radic Res. 2005 Apr;39(4):431-9

Changes in oxidative stress markers and NF-kappaB activation induced by sprint-exercise

Cuevas MJ, Almar M, García-Glez JC, García-López D, De Paz JA, Alvear-Ordenes I, González-Gallego J

Department of Physiology, University of León, University Campus, León 24071, Spain

Deze studie was gericht op het onderzoek van veranderingen in bloed-merkers voor oxidatieve schade geïnduceerd door korte-termijn supra-maximale anaërobe inspanning en op het bepalen of oxidatieve stress geassocieerd was met aktivatie van de redox-gevoelige transcriptie-factor nuclear factor-kappaB (NF-kappaB). [Het betreft hier wel inspanningen die M.E.(cvs)-patiënten zelden zullen leveren: sprinten door professionele renners.] De waarden van 8-OH-2-deoxyguanosine [8-OH-2DG; maat voor oxidatieve schade aan DNA] in leukocyten waren significant verhoogd 24 h na inspanning. Een significante daling van de concentratie gereduceerd glutathion (GSH) in het bloed werd geobserveerd direct, 15, 60 en 120 min na inspanning, gevolgd door een terugkeer naar basale waarden na 24 h. Deze daling ging parallel met een significante stijging van de verhouding geoxideerd/gereduceerd glutathion (GSSG/GSH), met een aktivatie van NF-kappaB en met een significante daling in het proteïne-gehalte van zijn inhibitor IkappaB. […] We besluiten dat de hier geleverde inspanningen oxidatieve stress induceren, zoals wordt bewezen door schade aan macro-molekulen en verandeingen in de glutathion-status. Onze gegeven wijzen er op dat anaërobe inspanning van hoge intensiteit aanleiding geeft tot een aktivatie van de transcriptie- factor NF-kappaB tesamen met een afbraak van IkappaB.

Mech Ageing Dev. 2008 Jun;129(6):313-21. Epub 2008 Feb 23

Eccentric training impairs NF-kappaB activation and over-expression of inflammation-related genes induced by acute eccentric exercise in the elderly

Jiménez-Jiménez R, Cuevas MJ, Almar M, Lima E, García-López D, De Paz JA, González-Gallego J

Institute of Biomedicine, University of León, León, Spain

Deze studie richtte zich op het onderzoeken van wijzigingen qua in NF-kappaB aktivatie en in de expressie van de  met inflammatie gerelateerde genen iNOS (induceerbaar stikstof-oxide-synthase), COX-2 (cyclo-oxygenase-2) en IL-6 (interleukine-6) geïnduceerd in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) bij ouderen mensen bij acute excentrische inspanning [type spiersamentrekking waarin de weerstand groter is dan de kracht die door de spier wordt geleverd] en bij sub-maximale excentrische training. Elf individuen, met een leeftijd tussen 66-75 jaar, leverden 2 periodes van excentrische inspanning gescheiden door 8 weken training. Na de eerste inspanning stegen NF-kappaB aktivatie en proteïne-gehalte van de p50/p65 subunits, stegen fosfo-IkappaBalfa en fosfo-IKKalfa, terwijl het IkappaBalfa proteïne-gehalte significant was gereduceerd. Dit ging vergezeld van een significante stijgingin iNOS, COX-2 en IL-6 mRNA proteïne-gehalte en proteïne-hoeveelheid. Veranderingen waren significant afgenomen na de tweede inspanning. Belsuit: acute excentrische inspanning doet NF-kappaB aktivatie en de expressie van meerdere inflammatie-gerelateerde genen stijgen in PBMCs van oudere individuen. Regelmatige excentrische training zou een effektieve methode kunnen zijn ter preventie van ongewenste inflammatoire responsen geïnduceerd door excentrische inspanning. [Met nadruk op ‘zou’, zeker bij M.E.(cvs)-patiënten waarvan de symptomen aanwakkeren bij inspanning…]

Cell Biochem Funct. 2007 Jan-Feb;25(1):63-73

Acute exercise stimulates macrophage function: possible role of NF-kappaB pathways

Silveira EM, Rodrigues MF, Krause MS, Vianna DR, Almeida BS, Rossato JS, Oliveira LP Jr, Curi R, de Bittencourt PI Jr

Department of Physiology, Institute of Basic Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil

Matige fysieke inspanning uitgevoerd op een regelmatige basis heft een aantal voordelen voor gans het organisme, in het bijzonder wat betreft de werking van het immuunsysteem, zoals het verhogen van de weerstand tegen infekties en kanker. Hoewel glutamine-aanmaak door aktieve spier-cellen zowel als neuro-endocriene veranderingen gemedieerd door de chronische aanpassing aan inspanning een rol kunnen spelen, blijft het gehele mechanisme, waardoor inspanning het immuunsysteem bewust maakt van uitdagingen, grotendeels onbekend uncovered. Dit is in het bijzonder waar voor de effekten van een acute inspanning-sessie op de werking van het immuunsysteem. In dit werk werden circulerende monocyten/macrofagen van sedentaire ratten, onderworpen aan een acute (1 h) zwem-sessie, getest op het vermogen om zymosan-deeltjes te fagocyteren [zymosan induceert experimentele steriele inflammatie], op forbol-myristaat-acetaat [PMA; een krachtig promotor van de cel-deling, door aktivatie van het signaal-transductie enzyme proteïne-kinase-C] geïnduceerde produktie van waterstof-peroxide, stikstof-oxide (NO) release (bepaald via nitraat- en nitriet-produktie) en de expressie van NO-synthases (NOS-1, NOS-2 en NOS-3). De resultaten toonden dat een inspanning een 2,4-voudige stijging in macrofaag fagocyterende capaciteit induceerde (p = 0.0041), een 9,6-voudige verhoging in PMA-geïnduceerde waterstof-peroxide afgifte in het incubatie-medium (p = 0.0022) en een 95,5% verhoging van de basale nitriet-produktie (p = 0.0220), die geassocieerd was met een duidelijke expressie van NOS-2 (de induceerbare NOS isoform; p = 0.0319), maae niet van andere NOS gen-produkten. Hoewel NOS-2 expressie afhnakelijk is van nucleaire factor kappaB (NF-kappaB), werd geen systemische oxidatieve stress gevonden (op basis van de gegevens betreffende plasma-TBARS en de glutathion-disulfide (GSSG) – glutathion (GSH) ratio in erythrocyten die constant bleven na acute inspanning). Er leek ook geen stress-situatie te zijn voor monocyten/macrofagen, aangezien de expressie van de het 70-kDa heat-shock proteïne [Hsp70; zie ook: ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’ waar wél wijzigingen werden opgemerkt, en ‘Heat-shock’ proteïnen en inspanning bij CVS’] onveranderd bleef. We besluiten dat NF-kappaB afhankelijke inductie van NOS-2 en macrofaag-aktivatie verband moet houden met (een) plaatselijke factor(en) geproduceerd in de omgeving van de monocytns/macrofagen.

Appl Physiol Nutr Metab. 2009 Aug;34(4):745-53

Effects of eccentric treadmill exercise on inflammatory gene expression in human skeletal muscle

Buford TW, Cooke MB, Shelmadine BD, Hudson GM, Redd L, Willoughby DS

Exercise and Biochemical Nutrition Laboratory, Baylor University, Waco, TX 76798, USA

Deze studie onderzocht de expressie van meerdere genen gerelateerd met het inflammatoir proces in skelet-spieren voor en na een periode van bergafwaarts lopen. Negenentwintig mannen tussen 18 en 35 jaar voerden een 45 min bergafwaarts (-17.5%) loopban-protocol aan 60% van de maximale zuurstof-consumptie uit. Stalen veneus bloed spier-biopten van de vastus lateralis werden verkregen vóór, en 3h en 24-h na inspanning , samen met schattingen van de ervaren spier-pijn. Serum creatine-kinase [CK; enzyme dat een rol speelt bij de energie-voorziening van de spier; komt vrj in het bloed bij spier-beschadiging/-afbraak] werd bepaald, alsook gen-expressie van interleukine (IL)-6, IL-8, IL-12 (p35), tumor necrose factor-alfa (TNF-alfa), IL-1beta, cyclo-oxygenase 2 (COX2) en nucleaire factor kappa B (NFkB) (p105/p50) in skelet-spieren. […] Er werd significante (p < 0.05) upregulering van IL-6, IL-8 en COX2 mRNA-expressie geobserveerd vergeleken met basale waarden, terwijl geen significante veranderingen voor IL-12, IL-1beta, TNF-alfa of NF-kB werden gezien. Er werden significante stijgingen van IL-6 mRNA geobserveerd na 3 h (p < 0.001) en na 24 h (p = 0.043), terwijl significante verhogingen van IL-8 (p = 0.001) en COX2 (p = 0.046) mRNA werden gevonden 3h na inspanning. Daarenboven was de spier-gevoeligheid significant gecorreleerd met IL-8 na 24 h (p = 0.048), terwijl CK significant was gerelateerd met NF-kB bij aanvang (p = 0.012). Deze gegevens wijzen er op dat stijgingen in de mRNA-expressie van IL-6, IL-8 en COX2 voorkomen in de vastus lateralis ten gevolge een beschadigende excentrische inspanning bij jonge, recreationeel getrainde mannen. Verder lijkt het dat IL-8 transcriptie een zekere rol kan spleen bij het inhiberen van spier-gevoeligheid na inspanning, mogelijks via regulering van angiogenese [vorming van nieuwe bloedvaten].

Ann N Y Acad Sci. 2009 Aug;1171:464-71

Effects of exercise on cyclooxygenase-2 expression and nuclear factor-kappaB DNA binding in human peripheral blood mononuclear cells

Kim SY, Jun TW, Lee YS, Na HK, Surh YJ, Song W

Health and Exercise Science Laboratory, Institute of Sports Science, Seoul National University, Seoul, Korea

Er is veelvuldig dwingend bewijs dat de heilzame effekten van inspanning op de preventie en/of verbetering van bepaalde chronische ziekten ondersteunt. Uitputtende of intense inspanning veroorzaakt echter generatie van zuurstof vrije radicalen en oxidatieve stress, die kan leiden tot letsels en chronische vermoeidheid, alsook inflammatie. Abnormale upregulering van cyclo-oxygenase-2 (COX-2), een beperkend/bepalend enzyme bij prostaglandine-biosynthese, bleek betrokken bij vele met inflammatie geassocieerde chronische aandoeningen. Nucleaire factor-kappaB (NF-kappaB) is eenbelangrijke transcriptie-factor betrokken bij de regulering van COX-2 gen-expressie. Om te bepalen of inflammatie-inductie afhankelijk is van de inspanning-intensiteit, werden COX-2 expressie en NF-kappaB aktivatie als hoofd-doelwitten gekozen. Dertien vrijwilligers die deelnamen aan het inspanning-programma werden onderworpen aan vier inspanning-intensiteiten [40, 60, 80 en 100% hartslag-reserve [HRR; verschil tussen maximale hartslag en rustpols] op een loopband en rust-condities. Geïsoleerde menselijke perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werden verzameld tijdens de rust en onmiddellijk na inspanning, en onderworpen aan de ‘elektroforetische mobiliteit verschuiving’ test  [Een ‘electrophoretic mobility shift assay’ (EMSA, ook ‘gel shift assay’, ‘gel mobility shift assay’), is een courante techniek uit de molekulaire biologie gebruikt om interakties (affiniteit) tussen proteïne en DNA of tussen proteïne en RNA te bestuderen. Deze procedure kan bepalen of een eiwit of mengsel van eiwitten in staat is te binden op een bepaalde DNA- of RNA-sequentie. Bij een dergelijke test verandert de elektroforetische mobiliteit in een polacrylamide-gel van een radioaktief gemerkt eiwit als er een ander eiwit aan bindt. De verschuiving is dan waarneembaar ten opzichte van stalen waar geen binding optreedt.]en Western blot analyse. Naargelang de inspanning-intensiteit steeg, waren COX-2 expressie én NF-kappaB DNA-binding aktiviteit verhoogd. De expressie van IkappaB kinase alfa (IKKalfa) en IkappaBalfa waren niet significant gewijzigd. Uitputtende/energieke inspanning (100% HRR) kon echter de fosforylatie van IKKalfa én IkappaBalfa induceren. Besluit: een enkelvoudige inspanning induceerde COX-2 expressie en DNA-binding aktiviteit van NF-kappaB in menselijke PBMCs, en zowel COX-2 expressie en DNA-binding aktiviteit van NF-kappaB waren afhankelijk van de inspanning-intensiteit.

Vacuolair APTase bij CVS (‘channelopathy’)

Op de ‘9th International IACFS/ME Research and Clinical Conference’ (Reno, Nevada, USA 12-15 maart 2009) gaf Prof. Dr Suzanne Hagan (‘Glasgow Caledonian University’), de researcher die nauw samenwerkt met Prof. Dr John Gow, een presentatie over ‘Ion-channel function and CFS’: “Identificatie van veranderingen in gen-expressie van een aantal ATPase enzymen en ion-kanalen gebruikmakend van DNA micro-array wijst op een mogelijke rol voor ion-kanalen en ATPase-funktie bij de pathologie van CVS. Dit kan helpen bij het formuleren van een rationele hypothese voor de pathogenese van CVS.”.

In verband met de ‘Genetische basis van channelopathie bij M.E.(cvs)’ laat ze optekenen: “Er bestaan verschillende condities waarin schommelende vermoeidheid een symptoom is en vele daarvan worden veroorzaakt door abnormale ion-kanalen in het celmembraan. Deze condities omvatten genetisch bepaalde channelopathieën. Recente gegevens suggereren dat Multiple Sclerose een verworven channelopathie is. Bovendien werd recent een hypothese gesteld over de rol van de ion-channelopathieën in de pathogenese van fibromyalgie, een toestand met gelijkaardige symptomen en ontstaansgeschiedenis als die van M.E.(cvs). Bij 111 vrouwelijke M.E.(cvs)-patiënten werden significante veranderingen vastgesteld in de genen verantwoordelijk voor het ionentransport en de ionkanaal-aktiviteit. Ook een deel van de M.E.(cvs)-patiënten zou dus een ionkanaal-dysfunktie kunnen hebben, wat kan bijdragen tot de veelheid aan symptomen die geassocieerd wordt met M.E.(cvs).”.

In het artikel ‘A Gene Signature for Post-Infectious Chronic Fatigue Syndrome’ (BMC Medical Genomics 2009, 2:38) [zie ‘Gen-signatuur voor Post-Infektie CVS’] wordt daar echter nog niet over gerapporteerd…

Hieronder enkele stukken die verwijzen naar onderzoek dat aan de gang is en naar een patent dat Gow reeds in 2006 nam, anticiperend op resultaten die zij verder verwachten. Bron: European Patent Office (v3.espacenet.com) – August 10, 2006 – World Patent WO2006082390: MATERIALS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CHRONIC FATIGUE SYNDROME; John W. Gow and Abhijit Chaudhuri (Patent File Number GB0502042.5).

Misschien van belang om te geven is dat Prof. Gow, naast ‘Director for Forensic Investigation’ aan de ‘Glasgow Caledonian University’, ook oprichter en technisch directeur is van het bedrijfje ‘Crucial Genetics’ dat genetische vaderschapstesten aanbiedt…

Nog even herhalen dat er verschillende typen ATPasen zijn: P-type ATPasen verbruiken ATP (Na⁺K⁺-ATPasen wisselen natrium-ionen uit voor kalium-ionen waardoor een lage Na+-concentratie en een hoge K⁺-concentratie binnen de cel ontstaat en een transmembraan-potentiaal wordt gecreëerd; H⁺K⁺-ATPasen zorgen voor de lage zuurgraad in de maag; Ca²⁺-ATPasen zorgen voor een lage intracellulaire calcium-concentratie in spiercellen.), F-type ATPasen zorgen voor de aanmaak van ATP uit ADP en anorganisch fosfaat (mitochondrieën) en V-type ATPasen gebruiken ATP om protonen (H⁺) te pompen naar een compartiment met een hoge zuurgraad.

Vacuolar type H⁺-ATPase (v-ATPase) is een sterk geconserveerd evolutionair oer-oud enzyme met opmerkelijk diverse funkties bj eukaryote (met een echte kern) organismen. v-ATPasen controleren de zuurtegraad (pH) van een brede waaier intracellulaire organellen (elk van deze vereist een specifieke interne pH) en pompen protonen (H⁺) doorheen de plasma-membranen van talrijke cel-types. Het v-ATPase complex kan ook deelnemen aan het waarnemen van de interne pH van de organellen

v-ATPasen koppelen de energie van ATP-hydrolyse aan protonen-transport bij intracellulaire en plasma-membranen van eukaryote cellen. v-ATPasen werken dus exclusief als een ATP-afhankelijke protonen-pomp.

In een cel kunnen v-ATPasen betrokken zijn bij verscheidene essentiële cellulaire funkties, inclusief receptor-gemedieerde endocytose (het opnemen van extra-cellulaire macrom-molekulen in de cel via insluiting door het celmembraan; dit trekt steeds iets verder naar binnen toe totdat het uiteindelijk een zelfstandig blaasje of vesikel is), post-translationle modificatie (allerlei chemische wijzigingen van een proteïne na zijn translatie uit het mRNA), proteïne-sortering (het naar zijn bestemming leiden van een nieuw aangemaakt polypeptide) via het secretoir mechansime (proteïne-synthese gebeurt op de ribosomen, de polypeptide-ketens gaan naar het Golgi-complex en worden vandaar naar hun bestemmingen geleid; dit mechanisme waarbij zo proteïnen worden gesynthetiseerd en gesorteerd wordt het secretoir mechansime genoemd), proteïne-afbraak en secundair transport.

Deze processen worden gereguleerd via modulering van de expressie op het plasma-membraan en aktiviteit van het v-ATPase.

[Vraag desgewenst naar referenties]

www.ahummingbirdsguide.com

CVS Patent Gow et al.

“Eerdere rapporten hypothiseerden dat CVS een vorm van ‘channelopathy’ is – een aandoening van ion-kanalen in de cel-membranen. Er zijn meerdere meldingen in de literatuur waarvan we geloven dat ze de hypothese versterken die stelt dat vacuolair H⁺-ATPase een pathogene rol speelt bij CVS.

Lokale anaesthetica, waarvan is geweten dat ze op ion-kanalen inwerken, hebben een ongunstig effekt op patiënten met M.E.(cvs). Er werd ook aangetoond dat er bij sommige patiënten met M.E.(cvs) morfologische veranderingen zijn bij de rode bloedcellen. Opmerkelijk: een studie door Nishiguchi et al. heeft aangetoond dat het lokaal verdovingsmiddel lidocaine omkeerbare morfologische transformatie kan induceren van menselijke rode bloedcellen en dat deze verandering wordt gemedieerd door de aktivatie van vacuolair H⁺-ATPase. Daarenboven hebben Li et al. getoond dat het gen betrokken is bij ijzer-binding in rode bloedcellen.

Het ion-kanaal gen is een lid van de vacuolaire H⁺-ATPase proton-transporterende gen-familie. Deze familie van genen is direct betrokken bij de fosfocreatine-afhankelijke [zie ‘Metabole veranderingen in spieren en hersenen bij CVS’] glutamaat-opname door synaptische vesikels [zie items over glutamaat-opname]. Het gen is verantwoordelijk voor ‘vesicle-docking’ / exocytose [‘docking’ is het proces waarbij het vesikel (‘blaasje’ met inhoud) en het pre-synaptisch membraan zich zo positioneren dat ze klaar zijn om te fuseren; na samensmelten van de membranen ontstaat een kleine opening die groeit totdat de exocytose gebeurt en de inhoud van het vesikel wordt vrijgegeven in de synaptische ruimte.] tijdens neurotransmitter-release en is een belangrijke constituent van synaptische vesikels geassocieerd met intracellulaire membraan-strukturen. We hebben aangetoond, gebruikmakend van H-MRS, dat er een verstoring is van het choline/creatine evenwicht in het centraal zenuwstelsel [zie ‘Metabole veranderingen in spieren en hersenen bij CVS’]. Deze bevinding werd bevestigd door Puri et al. Zoals hierboven gesteld, is dit type gen direct betrokken bij de creatine-mechanismen. We hebben eerder aangetoond dat patiënten met CVS lage kalium-waarden in het lichaan hebben. Bailey et al. hebben een verband tussen kalium-depletie en upregulering van H⁺-ATPase getoond.

Zoals hierboven aangegeven, werden virussen dikwijls geassocieerd met CVS. Het binnenkomen van virussen in de cellen kan worden gemedieerd door H⁺-ATPase. Naast virale infektie die neurotransmitter-funktie aantast, is er een grote hoeveelheid bewijs dat aantoont dat vacuolair H⁺-ATPase ook is betrokken.”

[Voor referenties: neem contact]

www.ncf-net.org [National CFIDS Foundation]

Alan Cocchetto, NCF Medical Director ©2006

Dr. John Gow, van de ‘Glasgow University in Scotland’, heeft de gen-signatuur aangekondigd die zijn research-groep heeft geïdentificeerd bij patiënten met M.E./ CFIDS (World Patent WO2006082390). Het patent reveleert een aantal geïdentificeerde genen die tot expressie komen aan abnormale waarden bij patiënten met M.E.(cvs) vergeleken met normale, gezonde individuen. Volgens Dr. Gow zouden de geïdentificeerde genen objectieve ziekte-merkers kunnen leveren die kunnen worden gebruikt in diagnostische testen ter ondersteuning van de diagnose van M.E.(cvs).

In zijn patent toonde Dr. Gow zijn interesse in het ATPase-systeem. In dit patent wordt gesteld “Op het cellulair niveau wordt vermoeidheid gelinkt met wijzigingen in de cel-membraan ion-kanaal trafiek en het ATPase-systeem. [Chaudhuri A, Watson WS, Behan PO. Arguments for a role of abnormal ionophore function in Chronic Fatigue Syndrome. In: Yehuda S, Moltofsky DI (eds). Chronic Fatigue Syndrome. New York, Plenum Press 1997; 119-30] ATPasen worden ook gelinkt met neurotransmitter-afgifte (bv. dopamine) [Goncealves PP, Meireles SM, Neves P, Vale MGP. Ca²⁺-sensitivity of synaptic vesicle dopamine, gamma-aminobutyric acid and glutamate transport-system. Neurochemical research 2001; 26: 75-81] en cellulair energie-metabolisme via creatine-fosfatase. Verhoogde ATPase-aktiviteit werd gerapporteerd in spier-biopten van patiënten met CVS [Gow JW, McGarry F, Behan WMH, Simpson K, Behan PO. Molecular analysis of cell-membrane ion-channel function in Chronic Fatigue Syndrome (Abstract). International Meeting on Chronic Fatigue Syndrome, Dublin 1994]. Uit eerder werk bleek de mogelijkheid dat patiënten met CVS een ion-kanaal dysfunktie zouden kunnen hebben [Chaudhuri A, Watson WS, Pearn J, Behan PO. Symptoms of Chronic Fatigue Syndrome are due to abnormal ion-channel function. Medical Hypotheses 2000; 54: 59-63]. Deze dysfunktie zou kunnen worden geïnduceerd door veranderingen in de ion-kanaal funktie, neurotransmitters betrokken bij kanaal-‘gating’ [openen en sluiten] of door een verschuiving in het evenwicht van de cellulaire ‘energie-lading’, de ratio tussen ATP en ADP, die normalerwijs een funktie is van de ATPase-aktiviteit.”.

Dr. Gow vervolgde: “Een groep aan de ‘University of Ulm’ (Duitsland) heeft gesuggereerd dat een pentapeptide (QYNAD) [klein eiwit bestaande uit 5 aminozuren Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp] met Na⁺-kanaal blokkerende werking een biologische merker zou kunnen zijn van bepaalde inflammatoire en immunologische aandoeningen van het zenuwstelsel. De uitvinders vroegen zich af of het pentapeptide geïdentificeerd door de duitse groep al dan niet een rol zou kunnen spelen bij CVS. Serum-stalen werden naar ‘University of Ulm’ verzonden voor analyse. De 15 stalen omvatten 5 normale controles, 5 patiënten met CVS en 5 ziekte-controles (waarvan 2 patiënten met MS. De stalen waren 1-15 genummerd en de duitse groep was niet op de hoogte wat de stalen waren of welke stalen wat waren, tot na de beëindiging van het experiment. Toen de code werd verbroken, toonden de resultaten dat in de ziekte-controle groep de waarden van het pentapeptide 2,3x die van de normale controles waren (gelijkaardig met de gepubliceerde data) en bij de CVS-stalen lagen de waarden 3x hoger dan de gezonde controles… De duitse groep was niet in staat een endogeen gen te identificeren dat codeert voor het pentapeptide. De uitvinders voerden een […] aminozuur-vergelijking uit voor het pentapeptide QYNAD… Er werden een aantal gekloneerde nucleotide-sequenties gevonden en wanneer deze werden vergeleken met nucleotide-databases, vertoonde slechts één kloon ‘full-length’ homologie met een menselijk gen. Dit gen bleek een menselijk ion-kanaal gen – de vacuolaire protonen-pomp H⁺-ATPase (v-ATPase).”. Dr. Gow stelde dan: “De uitvinders vroegen zich daarna af of het v-ATPase een kandidaat gen voor een diagnostische test voor CVS vertegenwoordigt… De patiënten-stalen hebben een significant hogere waarden qua v-ATPase mRNA dan de gezonde controles. Dus: het v-ATPase gen lijkt een waarachtige biomerker voor CFS/M.E.(cvs) te vertegenwoordigen.”

[…]

Verder stelt Dr. Gow in zijn patent: “Het v-ATPase staat bekend te zijn betrokken bij de regulering van een aantal metabole funkties die verstoord zijn bij M.E.(cvs). v-ATPase upregulering zou daarom een verklaring kunnen bieden voor een aantal van de symptomen die worden geobserveerd. Bijvoorbeeld: gestegen v-ATPase aktiviteit zou de intracellulaire acidose kunnen verklaren in spieren bij inspanning, borst-pijn (syndroom X) [metabool syndroom; omvat insuline-resistentie in associatie met stoornissen van de koolhydraat-tolerantie en allerlei metabole afwijkingen]), veranderde neurotransmitter (dopamine) funktie en abnormale regulering van hypothalamische hormonen. Daarenboven zou het de verhoogde energie-conumptie en vermoeidheid geassocieerd met de aandoening kunnen verklaren.”.

[…]

Het QYNAD-verhaal blijkt nogal controversieel… Na 2006 is er ook niet meer over gepubliceerd…

Bafilomycine A1 (BFLA1), een lid van de plecomacrolide sub-klasse van macrolide antibiotica , is een krachtige en zeer specifieke inhibitor van vacuolair ATPase en intracellulaire verzuring (bij hoge concetraties). Het zou ook concentratie-afhankelijke effekten hebben op de leefbaarheid van neuronale cellen: BafA1 inhibeert de sterfte van neuronen geïnduceerd door autofage stress (autofagie, of autofagocytose, is een strikt geregeld proces waarbij de cel eigen cel-produkten verteert in de zogenaamde lysomen, het maakt deel uit van normale cel-groei, ontwikkeling en homeostase, en helpt het evenwicht behouden tussen synthese, afbraak en recyclage van cellulaire produkten.; autofage stress komt voor bij nutrienten-tekort of lysosoom-dysfunktie en kan leiden tot cel-sterfte, ook beschreven bij neurodegeneratieve aandoeningen).

Ook het struktureel gelijkaardige bafilomycine B1 en concanamycine A zijn neuroprotektief tegen chloroquine-geïnduceerde sterfte (chloroquine remt autofagie; de lysosomotrope stof chloroquine induceert autofage stress en daaropvolgende neuronale sterfte; het antibioticum bafilomycine A1 vermindert deze neuronale sterfte dramatisch.). Er zijn aanwijzingen dat plecomacroliden excitatorische synaptische transmissie kunnen blokkeren.

Andere meldingen van v-ATPase inhibite betreffen het NO-genererend S-nitrosoglutathion (SNG) en het nieuwere FR177995…

N-Glycosylering veranderd bij CVS

Glycosylering (het koppelen van één of meerdere suiker-molekulen aan proteïnen) speelt een belangrijke rol in de struktuur en funktie van glycoproteïnen en glycolipiden: suikers hebben vaak een signaal-funktie en sturen eiwitten naar een bepaalde plaats in een cel of een orgaan; suikers bepalen mee de aktiviteit van enzymen, hormonen en cytokinen; suikers dragen bij tot de stabiliteit van de molekulen waaraan ze gehecht zijn en bepalen zo mee de eigenschappen van de weefsels waarin ze overvloedig voorkomen.

Glycosylatie is een belangrijke post-translationale modificatie (aanpassing van een eiwit nadat het werd ‘vertaald’ uit het RNA) van de meeste proteïnen. De toegevoegde oligosacchariden (kleine suiker-molekulen) hebben diverse rollen bij de funktie van proteïnen, naast het feit dat ze specifieke herkenningsmotieven dragen.

Er zijn 2 types: N-glycosylatie (aanhechting van suikers aan het stikstof (N) -atoom aan het aminozuur asparagine in een eiwit) en O-glycosylatie (aanhechting van suikers aan het zuurstof (O) -atoom aan de aminozuren serine of threonine).

Congenitale (erfelijke) defekten van de glycosylering (CDG) worden veroorzaakt door defekten in de synthese van het koolhydraat- of glycaan-gedeelte van glycoproteïnen. Een bepaalde groep spier-dystrofieën bv. worden veroorzaakt door mutaties in glycosylatie-enzymen – defekten in het mechanisme dat suikers toevoegt verstoren de eigenschappen van een proteïne dat kritiek is voor de normale werking van spieren. Glycosylatie kan bij ziekte variëren: sommige observaties bij rheumatologische ziekten suggeren bv. een verband tussen of glycosylatie-stoornissen en de ziekte-processen. En therapeutische manipulatie kan de eigenschappen van glycoproteïnen gunstig veranderen.

Een team rond de glycosilatie-experten Axford en Alavi (met o.a. ook Prof Kerr, die publiceerde over gen-expressie bij M.E.) rapporteerde op een congres – (nog) geen publicatie – over de verschillen hieromtrent en de mogelijkheid dit eventueel als merker te gebruiken…

Ann Rheum Dis 2008; 67(Suppl II):250

(abstract gepresenteerd op EULAR – European League Against Rheumatism – conferentie; Parijs, 2008)

Chronic Fatigue Syndrome Patients have Serum N-Glycosylation Changes which may reflect Dolichol Dysfunction

John S. Axford¹, Owen P Fraser¹, Azita Alavi¹, Edward Tarelli², Jonathan R. Kerr¹

¹Cellular and Molecular Medicine, ²Medical Biomics Centre; St George’s University London, London, United Kingdom

Achtergrond: Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) wordt gekenmerkt door een ernstige, invaliderende vermoeidheid die ten minste 6 maanden aanhoudt alsook door talrijke andere musculaire, infektueuze en neuropsychiatrische symptomen en slaap-stoornissen. Er wordt aangenomen dat CVS wereldwijd een prevalentie van 0,4-1% heeft […]. De diagnose is gebaseerd op klinische criteria en is doorslaggevend afhankelijk van uitsluiting van andere fysieke en psychiatrische aandoeningen. Studies naar de pathogenese hebben abnormaliteiten van het immuunsysteem en chronische immuun-aktivatie blootgelegd; dysfunktie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as, hersen-abnormaliteiten en bewijsmateriaal voor aanvallen van buitenaf, bv. verscheidene infekties (Epstein-Barr virus, enterovirussen, parvovirus B19, Coxiella burnetii en Chlamydia pneumoniae), vaccinaties en blootstelling aan organofosfaten en andere toxinen. Een rapport over dysfunktie van het isoprenoid mechanisme bij CVS [zie: ‘Dysfunktie van het Isoprenoid Systeem bij M.E.(cvs)’] toonde een toename in dolichol-waarden, koolhydraten-residuen van glycoproteïnen, glycolipiden, totale/individuele glycosaminoglycaan-frakties [Glycosaminoglycanen (GAG’s) zijn lange overtakte polysaccharide-ketens bestaande uit herhaalde disachariden (twee monomere suikers aan elkaar gekoppeld)] en lysosomale enzymen [Het lysosoom is een sub-cellulair partikel in het cytoplasma waar lysosomale enzymen cellulair ‘afval’ afbreken, zodat de afbraakprodukten hergebruikt of veilig uitgescheiden kunnen worden.] bij CVS.

Doelstellingen: Analyseren van veranderingen in totaal serum N-glycosylatie bij CVS-patiënten vergeleken met gezonde controles.

Methode: N-glycanen werden enzymatisch geëxtraheerd uit serum-glycoproteïnen […], dan geïsoleerd en gezuiverd […]. De geëxtraheerde serum N-glycanen werden geanalyseerd d.m.v. ‘High Performance Anion Exchange Chromatography – Pulse Amperometric Detection’ (HPAEC-PAD) en ‘Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry’ (MALDI-TOF MS) [zeer complexe en dure analyse-methoden].

Resultaten: Er werden veranderingen qua N-glycosylatie geobserveerd wanneer CVS sera (n=20) werden vergeleken met die verkregen van gezonde controles (n=20). Er was een daling van het relatief percentage strukturen zonder gebonden galactose [een bepaald monosaccharide, basis-vorm van koolhydraten] (p=0.016) en met één galactose (p=0.016), en een stijging van het percentage strukturen met één gebonden siaalzuur-molekule [Siaalzuur - een monosaccharide - is een term voor de N- of O- gesubstitueerde afgeleiden van neuraminezuur; ook de naam voor het voornaamste lid van deze groep: N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac of NANA). Neu5Ac bindt normaal gesproken aan verschillende suiker-achtige moleculen op de membraan van cellen - mucoproteïnen en glycoproteïnen. Hiermee kunnen de cellen chemische signalen doorgeven en zich binden aan weefsels waar ze horen te binden. Zie ook: ‘Identifikatie en behandeling van symptomen geassocieerd met inflammatie’: een merker voor de acute fase van inflammatie.] (p=0.0002) en twee siaalzuur-molekulen (p=0.006) bij het vergelijken van de totale N-glycanen in het serum van CVS-patiënten met die van gezonde controles.

Besluit: Er zijn duidelijke verschillen qua N-glycosylatie van serum-glycoproteïnen bij CVS-patiënten. Deze verschillen zouden verband kunnen houden met de veranderde dolichol-waarden (wat van vitaal belang is voor N-glycosylatie van proteïnen en proteïne-verwerking) die geobserveerd werden bij CVS-patiënten. Deze veranderingen qua N-glycosylatie kan nuttig zijn bij het identificeren van biomerkers om de diagnose van CVS te helpen alsook bij de ontwikkeling van behandeling-monitoring bij CVS.

Commentaar door Prof. Dr. Guido Van Dessel (Dept. of Veterinary Sciences, University of Antwerp):

Volgende puntjes wil ik wel benadrukken:

1. Verwijzend naar de publicatie van Kurup et al. [zie ‘Dysfunktie van het Isoprenoid Systeem bij M.E.(cvs)’] kan niet gezegd worden dat de dolichol-verhoging te wijten is aan een stijging van het gehalte aan vrij dolichol of aan een stijging van alle (of één bepaalde) vorm van dolichol (dol-P-suiker, dol-PP, dol-PP-oligosacchariden) [P staat voor een fosfaat-groep]. Voor de glycosylering van eiwitten is dol-P nodig. Deze wordt normaal teruggewonnen in een dolichol-cyclus en niet nieuw vanuit dolichol aangemaakt. Een dolichol-dysfunktie moet waarschijnlijk dan ook gezien worden als een dysfunktie van een of meerdere enzymen die dol-P omzetten naar het eindproduct dol-PP-oligosacchariden dat vervolgens via een oligosacchariden-transferase zijn oligosacchariden-deel dan overdraagt op een eiwit (N-glycosylering). Indien één van deze katalysatoren deficiënt is, gebeurt er geen (of volgens sommigen een onvolledige glycosylering) van o.a. immunoglobulinen. Dit oligosacchariden-gedeelte bevat geen galactose noch siaalzuur. Beide suikers worden bij de verdere verwerking van het gevormde glycoproteïne aangehecht. Ook hier kan iets fout gaan.

2. Verhoging van dolichol-gehalte waarop Axford zich baseert: Na controle van meerdere onderzoeksrapporten over dolichol in bloed is de waarde van Kurup aan de hoge kant. Normaal 120 ng/ml; bij lysosomale ziekten x2. Bij Kurup 390 ng/ml; bij CVS 700 ng/ml dus x2.

3. N-glycoproteïnen die minder galactose bevatten moeten ook minder siaalzuur bevatten daar siaalzuur enkel bindt op een galactose of op een ander reeds gebonden siaalzuur.

4. Dat een dolichol-stijging de veranderde N-glycosylering zou verklaren acht ik weinig waarschijnlijk (tot het tegendeel bewezen is natuurlijk). Ik denk eerder aan en verstoring van het glycosylering-proces vertrekkende van dolichol-modifikatie tot en met de processing van het nieuwe N-glycoproteïne, een proces dat in het endoplasmatisch reticulum gebeurt.

————————-

De ‘Dubbo Infection Outcomes Study Group’ (Lloyd, Reeves, Vernon,…) rapporteerde in het artikel ‘Gene Expression Correlates of Post-infective Fatigue Syndrome after Infectious Mononucleosis’ (2007) over een aantal genen die geassocieerd bleken bij het ‘post-infektueuze vermoeidheid syndroom’. Eén van de 35 genen was ‘LEM domain containing 3’ (LEMD3; coderend voor een proteïne van het binnenste kern-membraan) dat betrokken is bij o.a. de glycosylering van N-gebonden oligosacchariden bij zoogdieren…

Wordt vervolgd ???

Interleukine-6 en isoprostanen bij CVS na inspanning

Onderzoeken betreffende cytokinen, oxidatieve stress bij inspanning in CVS volgen elkaar snel op en bevestigen elkaar of vullen mekaar aan.

Dit is de rol en het nut van wetenschappelijk onderzoek! Stapje voor stapje dichter bij de waarheid komen. Testen en (onafhankelijk) her-testen. In tegenstelling tot commerciële laboratoria waarvan de resultaten worden afgeschermd en niet voor toetsing door derden worden voorgelegd.

Wat volgt, betreft een studie door de ploeg van de Universiteit van Dundee, waartoe ook Vance Spence en Neil Abbot regelmatig bijdragen. Ook hier wordt de klemtoon gelegd op de problemen in de herstel-periode na inspanning bij CVS…

Scand J Med Sci Sports 2009: 13: 1-9

Plasma IL-6, its soluble receptors and F2-isoprostanes at rest and during exercise in Chronic Fatigue Syndrome

M. Robinson¹, S. R. Gray¹, M. S. Watson¹, G. Kennedy², A. Hill², J. J. F. Belch², M. A. Nimmo¹

1 Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, University of Strathclyde, Glasgow, UK

2 Division of Medicine and Therapeutics, Institute of Cardiovascular Research, Ninewells Hospital, Dundee, UK

Patiënten met Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) hebben o.a. te lijden van ernstige en dikwijls invaliderende vermoeidheid, waarvoor er geen duidelijke etiologie bestaat. Om deze reden onderzochten een aantal studies of CVS geassocieerd is met een daling aan inspanningscapaciteit en/of dysfunktie van skelet-spieren. De resultaten waren tot nu toe niet overtuigend. Enkele onderzoeken vonden dat CVS-patiënten een lagere VO₂max hebben en een vermindering qua spier-kracht, terwijl anderen geen verschillen bij geen enkele cardiorespiratoire parameter vonden. Verrassend is dat er geen studies zijn die inspanningscapaciteit bij CVS patiënten hebben onderzocht in relatie tot de lactaat-drempel [‘Lactate Treshold, LT; de inspanningsintensiteit waarbij het anaërobe metabolisme wordt getriggerd en melkzuur begint te accumuleren], die bekend staat als een betere meting van de metabole belasting en de verwarrende kwestie van deconditionering van skelet-spieren omzeilt. Verder werk heeft ook aangetoond dat CVS-patiënten, tijdens de herstel-periode na inspanning, te lijden hebben van significante post-exertionele malaise en spier-dysfunktie, tot 24 h na inspanning [Jammes et al. 2005: ‘Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle-excitability in response to incremental exercise’; zie: ‘Oxidatieve stress’].

Het team van Jammes noteerde dat de post-exertionele malaise geassocieerd was met een hoger niveau aan oxidatieve stress tijdens inspanning. Een gelijkaardig onderzoek vond ook hogere concentraties F2-isoprostanen, de ‘gouden standaard’ in vivo merker voor oxidatieve stress [zie: ‘Oxidatieve stress’], bij CVS-patiënten in rust; waarbij de grootte-orde van de oxidatieve stress correleert met de ernst van de CVS-symptomen [Kennedy et al. 2005: ‘Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms’; zie: ‘Oxidatieve stress’]. De reaktieve zuurstof-molekulen (ROS) bleken eerder te resulteren in spier-dysfunktie en in vitro studies toonden dat ze ook de produktie van het inflammatoir cytokine interleukine-6 (IL-6) stimuleren, hoewel de toename in IL-6 tijdens inspanning de stijging in TBARS voorafgaat [Steinberg et al. 2007: Cytokine and oxidative responses to maximal cycling-exercise in sedentary subjects’; zie ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’], wat suggereert dat deze in vitro bevindingen wellicht niet toepasbaar zijn op inspanning bij mensen.

Het cytokine IL-6, bleek metabole én inflammatoire effekten te hebben. De metabole rol van IL-6 is die van een energie-sensor in tijden van crisis, door het verhogen van koolhydraten- én vet-metabolisme. Er werd ook gevonden dat IL-6 dramatisch stijgt tijdens inspanning, en dat het pro- én anti-inflammatoire effekten heeft; één van zijn belangrijkste rollen tijdens inspanning is het bevorderen van de aanmaak en release van anti-inflammatoire cytokinen zoals IL-1Ra en IL-10. Het is duidelijk dat elke interferentie met deze systemen tijdens acute inspanning zal resulteren in een daling van de inspanningscapaciteit en een slecht herstel na inspanning. Daarenboven kan IL-6, samen met meerdere andere factoren, tijdens inspanning de bloed-hersen-barrière overschrijden; wat resulteert in hyperalgesie [verhoogde gevoeligheid voor pijn], verhoogd vermoeidheid-gevoel, meer depressieve gevoelens, een verminderd concentratie-vermogen en een verminderde inspanningscapaciteit – allemaal symptomen gelijkaardig aan deze ervaren bij CVS.

Desondanks werd bij eerder werk gevonden dat IL-6 concentraties in de circulatie niet gestegen zijn bij CVS-patiënten in rust [Sorensen et al. 2003: ‘Complement activation in a model of Chronic Fatigue Syndrome’; zie: ‘Complement-aktivatie na Inspanning bij CVS’]. Bovendien zijn er geen studies die IL-6 waarden hebben gemeten bij CVS-patiënten tijdens inspanning. Verder zijn er, naar ons weten, ook geen studies die de waarden aan IL-6 receptoren bij CVS-patiënten hebben gemeten. Over het algemeen signaliseert IL-6 via membraan-gebonden IL-6 receptoren (IL-6R en gp130) en terwijl gp130 overvloedig tot expressie komt, blijft IL-6R expressie beperkt tot hepatocyten [de funktionele cellen waaruit de lever is opgebouwd], leukocyten en adipocyten [vet-cellen]. Oplosbare IL-6 receptoren, sIL-6R en sgp130, bestaan en reguleren IL-6 signaliserng, in het bijzonder in weefsels zonder IL-6R. In het kort: de vorming van een IL-6/sIL-6R complex versterkt IL-6 signalisering, ‘transignaling’ genaamd, terwijl de toevoeging van sgp130 eigenlijk het IL-6/sIL-6R complex inhibeert. Een voorbeeld van de betrokkenheid van deze of receptoren in de pathologie van chronische ziekten kan worden gezien bij juveniele rheumatoïde arthritis, waar verhogingen van het IL-6/sIL-6R complex geïmpliceerd zijn in de pathologie van deze aandoening, die symptomen heeft die gelijkaardig zijn met CVS. Eerder werk heeft ook aangetoond dat het blokkeren van sIL-6R effektief is voor het verminderen van vermoeidheid geassocieerd met de ziekte van Castleman [goedaardige groei van lymfeklieren] en als verschillen in IL-6 receptoren bestaan bij CVS-patiënten, dan zou een dergelijke behandeling de chronsiche vermoeidheid waaronder ze lijden kunnen verlichten.

Het doel van de huidige studie is, gebruikmakend van een inspanningsmodel dat de metabole belasting van CVS-patiënten en gezonde controles vergelijkt, de niveaus van IL-6, sIL-6R, sgp130 en F2-isoprostanen bij rust en in respons op inspanning te onderzoeken. We stellen dat IL-6, sIL-6R en F2-isoprostaan verhoogd zullen zijn bij CVS- patiënten in rust en tijdens inspanning , terwijl sgp130 niet zal verschillen.

Methoden

Individuen

33 CVS en 33 gezonde controle deelnmers gematcht voor leeftijd, gslacht en BMI (20 vrouwen en 13 mannen in elke groep) voor de studie in rust; zes mannelijke CVS-patiënten en zes gezonde mannelijke controles gematcht voor leeftijd, voor het inspanning-gedeelte. CVS-patiënten kregen de diagnose volgens de ‘US Centres for Disease Control and Prevention criteria for CFS’ (Fukuda et al. 1994). Controle-individuen waren sedentair en – zoals bij de CVS-patiënten – deden niet aan regelmatige formele training. […]

Studie bij Inspanning

[…]

Studie bij Rust

[…]

Metingen

[…]

Resultaten

[…]

Bespreking

Dit onderzoek is de enige studie die naar de effekten peilt van een gestandardiseerde sub-maximale inspanningsbelasting op de respons van IL-6, zijn oplosbare receptoren en F2-isoprostanen bij patiënten met de diagnose van CVS. Bij deze patiënten waren er geen verschillen qua cardiorespiratoire parameters en inspanningscapaciteit, of IL-6 en zijn receptoren in de circulatie, in rust of tijdens inspanning. Terwijl eerdere studies IL-6 waarden hebben onderzocht bij kleine groepjes CVS-patiënten, is de huidige studie verder de eerste om IL-6 én sIL-6R te meten in een grote rustende patiënten-groep. In dit deel van het onderzoek hebben we aangetoond dat er geen verschillen qua IL-6 noch zijn oplosbare receptoren zijn in rust; wat bewijst dat ‘transignaling’ wellicht niet betrokken is bij de pathologie van deze aandoening. De huidige data bevestigden ook de verhoogde waarden van F2-isoprostanen bij rustende CVS-patiënten eerder werk en toonden aan dat deze verschillen blijven tijdens inspanning.

CVS gaat samen met ernstige vermoeidheid en post-exertionele malaise maar desondanks hebben weinig studies in detail de prestaties en cardiorespiratoire parameters in deze patiënten-groep onderzocht. Dit onderzoek heft aangetoond dat in onze groep patiënten er geen verschillen waren in VO₂max, kracht-output bij VO₂max, bloed-lactaat bij VO₂max, RPE [rating of perceived exertion; schaal die de subjectieve perceptie van een persoon’s inspanning beschrijft] of RER [respiratory exchange ratio; verhouding tussen het volume afgegeven CO₂ en het volume opgenomen O₂ = ca. 0,8 bij rust, kan groter dan 1 worden bij intense inspanning] bij LT of VO₂max tijdens een oplopende inspanning-test. Het enige geobserveerde verschil was een lagere kracht-output bij LT in de CVS-groep, hoewel de LT bij hetzelfde percentage VO₂max viel. Niettegenstaande enkele auteurs het bestaan van de LT betwisten, heeft recent werk zijn belang  voor het bepalen van inspanningscapaciteit, voor het afbakenen van inspanningsintensiteit en bij prognostische evaluatie beklemtoond. Het is om die reden dat we de belasting voor de deelnemers in verhouding met de LT kozen. De huidige bevindingen komen overéén met eerdere studies die tonen dat er geen cardiorespiratoire stoornis is bij CVS-patiënten [zie eerder: Jammes et al. 2005] hoewel een lagere VO₂max ook werd geobserveerd door De Becker et al. Bij deze was het echter onduidelijk of de deelnemers waren gematcht voor BMI en lichaamsvet, wat de verschillen zou kunnen verklaren.

Ons onderzoek heeft ook aangetoond dat de tijd tot uitputting tijdens sub-maximale inspanning dezelfde is bij CVS-patiënten en gezonde controles, wat benadrukt dat het belangrijkste vermoeiend effekt van inspanning in de herstel-periode ligt, zoals aangetoond door Paul et al. [Paul L, Wood L, Behan WMH, Maclaren WM. ‘Demonstration of delayed recovery from fatiguing exercise in Chronic Fatigue Syndrome’. Eur J Neurol 1999: 6: 63-69]. Gedurende de experimentele periode (inclusief de herstel-periode), waren er geen verschillen tussen de groepen qua concentraties glycerol en glucose, een schatting voor koolhydraten/vet-metabolisme tijdesn inspanning. Dit suggereert dat de beschikbaarheid van glucose en lipolyse [afbraak van vet opgeslagen in vet-cellen] niet zijn aangetast bij CVS-patiënten en geen factoren zijn die bijdragen tot de post-exertionele malaise en verergering van symptomen na inspanning.

In rust, tijdens inspanning en 24 h na inspanning, noteerden we verhoogde waarden aan F2-isoprostanen bij CVS-patiënten. Dit bevestigt de eerdere bevindingen van of Kennedy et al. [zie eerder] in rust en ondersteunt de verhoogde oxidatieve stress tijdens oplopende inspanning aangetoond door Jammes et al. [zie eerder]. Deze beide onderzoeken vonden ook verbanden tussen het niveau aan oxidatieve stress en CVS-symptomen én spier-dysfunktie, een bevinding die niet wordt ondersteund door de data hier, aangezien er geen verschillen waren qua prestatie. Daarom is, niettegenstaande deze merker voor oxidatieve stress verhoogd is bij CVS-patiënten, verder onderzoek nodig om de precieze rol van ROS in de pathologie van CVS te bevestigen.

Hoewel vroeger werk heeft aangetoond dat ROS de aanmaak van IL-6 stimuleert, heeft het huidig onderzoek gevonden dat IL-6 waarden niet verschillend zijn bij CFS-patiënten in rust, direct na inspanning of 24 h na inspanning. Dit kan de verschillen benadrukken in de respons van mensen op een verhoging in ROS en deze die wordt gezien wanneer myotubes [primitieve spiercellen of myoblasten versmelten onderling ter vorming van ‘myotubes’; deze vormen zich om tot ‘myofibrillen’ door de synthese van actine en myosine] aan ROS worden blootgesteld. Niettegenstaande eerder werk heeft aangetoond dat supplementering met anti-oxidanten (Vitaminen A, C, E, allopurinol en N-acetylcysteine) de cytokine-respons op inspanning vermindert, heeft recent werk getoond dat tijdens inspanning TBARS sneller stijgen dan de cytokinen [zie: ‘CVS * Oxidatieve Stress en Hsp bij inspanning’]; wat er op wijst dat er geen link zou kunnen zijn tussen ROS en cytokine-produktie tijdens inspanning bij mensen. Verder werk is duidelijk vereist om de relatie tussen ROS en cytokinen tijdens inspanning te onderzoeken.

Er is wat discussie geweest betreffende het feit of IL-6 als een pro- of een anti-inflammatoir cytokine werkt. Van chronische verhogingen van IL-6 is goed geweten dat ze betrokken zijn bij de etiologie van vele chronische ziekte-processen en dat ze resulteren in een verhoogd mortaliteit-risico. In dit opzicht zouden chronische verhogingen in IL-6 duidelijk niet wenselijk zijn bij CVS. Aan de andere kant hand is gebleken dat IL-6 ‘knock-out’ [Techniek uit de genetica om de funktie van een gen te achterhalen. Hierbij wordt het bestaande gen vervangen door een versie van het gen met deleties.] muizen obesitas en ongunstige bloed-profielen ontwikkelen. Verder werk suggereerde dat IL-6 ook verantwoordelijk is voor de anti-inflammatoire effekten van inspanning, aangezien het de TNF-α produktie inhibeert en de cascade van anti-inflammatoire cytokinen triggert. Van uitzonderlijk belang bij CVS is echter de bevinding dat infusie van IL-6 tijdens inspanning resulteert in meer vermoeidheid en gereduceerde inspanningscapaciteit, en dus zou elke stijging in de IL-6 respons op inspanning nadelig kunnen zijn.

Het verschijnen van IL-6 in de bloedsomloop tijdens inspanning is afhankelijk van de intensiteit en de duur van de inspanning bij gezonde vrijwilligers, met een piek onmiddellijk na inspanning. Dit patroon lijkt ook stand te houden bij CVS-patiënten, waar IL-6 waarden gelijkaardig waren met die van gezonde controles die arbeid hadden geleverd van dezelfde intensiteit en duur. Verder wijst de huidige bevinding, dat sIL-6R én sgp130 niet werden beïnvloed door inspanning en dat ze op geen enkel moment verschillend waren bij CVS, er op dat, in tegenstelling tot vele andere chronische ziekten, gewijzigde ‘transignaling’ niet betrokken is in de pathologie van CVS. Dit onderzoek ondersteunt daarom eerder werk dat gelijkaardige IL-6 waarden in rust heeft gevonden en sluit voor de eerste keer de mogelijke betrokkenheid van de oplosbare IL-6 receptoren bij CVS uit.

In deze huidige studie namen slechts zes CVS-patiënten en gematchte controles deel aan de inspanningstest, wat misschien niet volstaat om kleine in de IL-6 respons op inspanning te ontdekken. Nadat zes CVS-patiënten het belangrijkste experimenteel deel hadden afgewerkt, bleek de verandering qua IL-6 en zijn receptoren echter gelijk in rust en bij inspanning, en daarom zou een eventueel aanwezig verschil al in rust te zien moeten geweest zijn. Om die reden werden de waarden van IL-6 en zijn receptoren onderzocht in een grotere rustende groep om te vermijden dat meer CVS-patiënten de stress van de inspanning moesten ondergaan. Het is mogelijk dat omwille van het feit dat bloedstalen slechts op drie tijdstippen werden genomen, pieken werden gemist. Tijdens oplopende inspanning bleken cytokine en TBARS-expressie in eerdere studies te pieken tussen de 10 en 30 min. na inspanning. Gebruikmaken van evenwichtige inspanning zoals bij de huidige studie, zou het nemen van meerdere stalen misschien bijkomende informatie opleveren. De staalnamen onmiddellijk na inspanning en na 24 h werden gekozen omdat is aangetoond dat IL-6 piekt direct of kort na het beëindigen van de inspanning – het punt waar in de huidige studie de vermoeidheid intreedt – en omdat geweten is dat de malaise verbonden met CVS plaatsvindt de dag na de inspanning.

Tot besluit: het huidig onderzoek heft aangetoond dat er geen verschillen zijn in IL-6, sIL-6R en sgp130 bij CVS- patiënten in rust of tijdens inspanning. Anderzijds waren F2-isopoprostaan waarden gestegen in rust bij CVS en deze verschillen bleven tijdens en na inspanning.

Perspektieven

Er werd hier aangetoond dat patiënten met CVS geen gestoorde oxidatieve capaciteit [QO₂ = maat voor de maximale capaciteit om zuurstof te gebruiken, uitgedrukt in µl verbruikt zuurstof per gram spier per uur; factoren die dit beïnvloeden: de aktiviteit aan oxidatieve enzymen, het vezel-type en de beschikbaarheid aan zuurstof] hebben. Deze bevindingen komen overéén met die van Jammes et al. [zie ‘Oxidatieve Stress’: Jammes et al. noteerden: “Bij CVS-patiënten verschilde de relatie stijgingsgraad van VO₂ versus inspanningsvolume niet van controle-individuen…” maar besluiten wel: “De respons van CVS-patiënten op toenemende inspanning gaat gepaard met een verlengde en verhoogde oxidatieve stress...”] en we hebben deze uitgebreid door aan te tonen dat er ook geen stoornis in de inspanningscapaciteit bij een gestandaardiseerde aërobe inspanningstest is. [zoals aangegeven in de inleiding waren de resultaten daaromtrent tot nu toe niet overtuigend; zie ‘Metabole veranderingen in spieren en hersenen bij CVS’: “na inspanning … oxidatieve capaciteit … significant verminderd bij CVS-patiënten … geen verdere veranderingen gezien tijdens de periode na inspanning…”] Samen met de bevindingen van Paul et al. [zie eerder], ondersteunt dit de stelling dat het grootste deel van het probleem met inspanning voorkomt in de herstel-periode. Eerder werk heeft aangetoond dat de F2-isoprostanen waarden verhoogd zijn bij CVS-patiënten in rust en het huidig onderzoek heeft deze bevindingen verruimd door te tonen dat de stijging blijft tijdens inspanning en in de herstel-periode. In tegenstelling bleek het IL-6 signalisering-systeem (IL-6, sIL-6R en sgp130) niet verschillend bij CVS-patiënten in rust noch tijdens inspanning. Dit cytokine-systeem bleek eerdere betrokken bij de pathologie van vele inflammatoire processen en de ontwikkeling van vermoeidheid [Robson-Ansley PJ, Milander L, Collins M, Noakes TD. ‘Acute interleukin-6 infusion impairs athletic performance in healthy, trained male runners. Can J Appl Physiol 2004: 29: 411-418’; bij gezonde personen dus…].

Metabole veranderingen in spieren en hersenen bij CVS

Verminderde oxidatieve capaciteit in de spieren en verhoogd choline in hersen-gebieden…

Een ietwat ouder maar goed overzicht-artikel door twee gerenommeerde M.E.-specialisten (de neurlogen Prof. Peter Behan & Dr Abhijit Chaudhuri) over metabole veranderingen in spieren en hersenen.

N.B.

Spieren * aanwijzingen een verminderde beschikbaarheid van ATP en gestoord energie-metabolisme

Brein * de link met gliale cellen waar we het elders reeds over hadden en nog zullen hebben…

Speculatie:

hersenbeschadiging => aktivatie gliale cellen => cytokinen => communicatie perifere – hersen- immuniteit ?????

Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2004 Sep;71(3):181-3

In vivo magnetic resonance spectroscopy in Chronic Fatigue Syndrome

Chaudhuri A, Behan PO

Division of Clinical Neurosciences, Institute of Neurological Sciences, Southern General Hospital, University of Glasgow

1. Inleiding

[…]

Magnetische resonantie spectroscopie (MRS) is een niet-invasieve beeldvormingstechniek die kan worden toegepast om metabole veranderingen in spieren en in het brein in vivo te bestuderen. ³¹P MRS wordt aangewend om spieren bij inspanning van CVS-patiënten te bestuderen. ¹H MRS van hersen-gebieden die van belang zijn werden zorgvuldig onderzocht bij goed gedefinieerde CVS-patiënten. Dit artikel heft een kort overzicht van MR spectroscopische gegevens bij CVS en de implicaties van deze waarnemingen of met betrekking tot het ziekte-mechanisme en mogelijke behandeling.

[Conventionele magnetische resonantie beeldvorming verstrekt hoofdzakelijk anatomische informatie, terwijl in magnetische resonantie spectroscopie (MRS) metabolieten die slechts in een lage concentratie in weefsel voorkomen worden gemeten. Het unieke voordeel van MRS is dat het niet-invasief en onschadelijk is voor de proef-persoon. Er werd aangetoond dat er tijdens diverse ziekten zoals kanker, hersen-infarct, epilepsie, multipele sclerose biochemische, enz. veranderingen plaatsvinden die zich manifesteren als variaties in de concentraties van bepaalde metabolieten. ³¹P en ¹H zijn enkele van de mogelijke radioaktieve isotopen die kunnen worden gedetekteerd.]

2. MRS van skelet-spieren bij CVS

Eerdere MRS-studies bij patiënten met CVS concentreerden zich op de skelet-spieren omwille van de opinie van de researchers dat pijn en vermoeidheid bij CVS grotendeels een myopathie weerspiegelden. ³¹P MRS is een excellente methode voor het continu, in vivo, monitoren van het intracellulair energie-metabolisme in skelet-spieren. MRS-studies van skelet-spieren hebben een significante vermindering qua inspanningscapaciteit bij CVS aangetoond, vergezeld door bovenmatig vroege intracellulaire verzuring. Het eerste positieve rapport [D.L. Arnold, P.J. Bore, G.K. Radda, P. Styles, D.J. Taylor, Excessive intracellular acidosis of skeletal muscles in exercise in a patient with a post-viral exhaustion fatigue syndrome, Lancet (1984) 1367-1369] van een geval van CVS werd gevolgd door werk van dezelfde groep die gelijkaardige kenmerken aantoonde in vijf van de zes gevallen [D.L. Arnold, P.J. Bore, G.K. Radda, P. Styles, D.J. Taylor, Excessive intracellular acidosis of skeletal muscle on exercise in the post-viral exhaustion/fatigue syndrome: a ³¹P NMR study, Proceedings of the Third Annual Meeting of the Society for Magnetic Resonance in Medicine, New York, 1984, pp. 12-13] en dan, later, hadden 12 van 46 patiënten abnormaal gereduceerde fosfocreatine (PCr): adenosine-trifosfaat (ATP) verhoudingen en hoger adenosine-difosfaat (ADP) na inspanning bij ³¹P MRS van hun skelet-spieren [P.R.J. Barnes, D.J. Taylor, G.J. Kemp, G.K. Radda, Skeletal muscle bio-energetics in the Chronic Fatigue Syndrome, J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 56 (1993) 679-683]. [Fosfocreatine of creatine-fosfaat is een gefosforyleerde creatine-molekule die een belangrijke energie-voorraad in skelet-spieren en in de hersenen vertegenwoordigt. Het wordt aangewend om anaëroob ATP te regenereren uit ADP.] Andere onderzoekers hebben ook bevestigd dat patiënten met CVS relatief gedaalde ATP-concentraties in hun werkende spieren hebben. Een significante daling van het aëorob metabolisme werd genoteerd bij PCr recovery in de spieren tijdens inspanning [R. Wong, G. Lopsachuk, G. Zhu et al., Skeletal muscle metabolism in Chronic Fatigue Syndrome. In vivo assessment by ³¹P nuclear magnetic resonance spectroscopy, Chest 102 (1992) 1716-1722]. Een andere studie vergeleek 22 CVS-patiënten met normale sedentaire individuen vóór en 2 dagen na een maximale loopband test [K.K. McCully, B.H. Natelson, S. Iotti, S. Sisto, J.S. Leigh Jr., Reduced oxidative muscle-metabolism in Chronic Fatigue Syndrome, Muscle Nerve 19 (1996) 621-625]. De oxidatieve capaciteit van de spieren werd met ³¹P MRS gemeten als de maximale hoeveelheid PCr her-synthese na inspanning in kuit-spieren. De oxidatieve capaciteit (maximale hoeveelheid ATP-synthese) was significant verminderd bij CVS-patiënten, in tegenstelling tot controles. Er werden echter geen verdere veranderingen gezien tijdens de periode na inspanning. De metabole abnormaliteiten gebruikelijk bij dergelijke observaties zijn een verminderde beschikbaarheid aan ATP in de spieren, waarschijnlijk door een versnelde afbraak naar ADP.

Een sub-groep CVS-patiënten bleek consistent een overmaat aan lactaat te produceren na sub-anaërobe inspanning [R.J.M. Lane, D. Woodrow, L.C. Archard, Lactate-responses to exercise in Chronic Fatigue Syndrome, J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 57 (1994) 375-376]. Gegevens van MRS van spieren wijzen er op dat bij CVS-patiënten die een abnormale lactaat-respons hebben na sub-anaërobe inspanning, er mogelijks een metabole component bij hun spier-vermoeidheid is [R.J.M. Lane, M.C. Barnett, D.J. Taylor, G.J. Kemp, R. Lodi, Heterogeneity in Chronic Fatigue Syndrome: evidence from magnetic resonance spectroscopy of muscle, Neuromuscular Disord. 8 (1998) 204-209].

3. MRS in syndrome X and CFS

[…]

4. MRS van hersen-gebieden bij CVS

Er werd gerapporteerd dat ¹H MRS bij zeven CVS-patiënten toonde dat de waarden van of N-acetyl aspartaat (NAA) [zie ook ‘CVS en het Centraal Zenuwstelsel’] in de rechter hippocampus waren gedaald [J.C.W. Brooks, N. Roberts, G. Whitehouse, T. Majeed, Proton magnetic resonance spectroscopy and morphometry of hippocampus in Chronic Fatigue Syndrome, Br. J. Radiol. 73 (2000) 1206-1208]. In een studie met ¹H MRS bij acht CVS-patiënten zonder psychiatrische symptomen werd een relatieve stijging van de choline (Cho): creatine (Cr) verhouding geobserveerd in de occipitale cortex en dit met hoge statistische significantie [B.K. Puri, S.J. Counsell, R. Zaman et al., Relative increase in choline in the occipital cortex in Chronic Fatigue Syndrome, Acta. Psychiatr. Scand. 106 (2002) 224-226]. Gelijkaardig was de observatie dat de choline-resonantie verhoogd was bij ¹H MRS van de linker basale ganglia bij acht volwassen CVS-patiënten zonder psychiatrische co-morbiditeit. Of er water of andere metabolieten als referentie werd gebruikt: de piek van de choline-bevattende stoffen in de basale ganglia vertoonde significante stijgingen in de CVS-groep vergeleken met de gezonde controles. De statistische kracht van deze associatie was extreem hoog (P<0.001) [A. Chaudhuri, B.R. Condon, J.W. Gow, D. Brennan, D.M. Hadley, Proton magnetic resonance spectroscopy of basal ganglia in Chronic Fatigue Syndrome, Neuroreport 14 (2003) 225-228]. In de enige ¹H MRS studie bij pediatrische CVS (11-13 jaar) werd ook een beduidende verhoging van de Cho:Cr ratio geobserveerd in de basale ganglia [A. Tomoda, T. Miike, E. Yamada et al., Chronic Fatigue Syndrome in childhood, Brain Dev. 22 (2000) 60-64]. Geen enkele van de bestudeerde gevallen vertoonde focale strukturele abnormaliteiten in de hersenen via MRI.

¹H MRS is een relatief nieuw instrument voor de beeldvorming van metabole hersen-funktie. NAA-waarden correleren met de regionale neuronale funktie, terwijl Cr over het algemeen wordt beschouwd als een constante metabole merker, wat de reden is voor zijn gebruik als referentie bij ¹H MRS. De Cho piek is grotendeels afgeleid van de cel-membraan fosfolipiden (fosfatidylcholine en fosfoglycerylcholine) door fosfolipasen in een door ATP aangestuurde enzymatische reaktie. In afwezigheid van inflammatie en weefsel-necrose, wordt gestegen Cho resonantie beschouwd als een merker voor verhoogde cel-membraan turn-over verbonden met gliosis [A. Brand, C. Reichter-Landsberg, D. Leibfritz, Multinuclear NMR studies on the energy-metabolism of glial and neuronal cells, Dev. Neurosci. 15 (1993) 289-298] of veranderde intra-membraan signalisering [C.M. Moore, J.L. Breeze, S.A. Gruber et al., Choline, myoinositol and mood in bipolar disorder: a proton magnetic resonance spectroscopic imaging study of the anterior cingulated cortex, Bipolar Disord. 2 (2000) 207-216].

[Gliosis is een proliferatie van astrocyten - ze ondergaan hypertrofie en hyperplasie - in beschadigde gebieden van het CZS (CNS). Dit leidt gewoonlijk tot de vorming van een gliaal litteken. Dit is het meest belangrijke histopathologisch teken van CZS-letsel. Het gliaal litteken is het mechanisme ter bescherming en voor het starten van het herstel-/genezingsproces van het zenuwstelsel. Er is groeiend bewijs voor een nuttige rol voor dit litteken-weefsel als onderdeel van de endogene lokale immuun-regulatie. Het onderdrukt verdere fysieke schade maar er worden door de cellen binnen het litteken echter veel inhibitor-molekulen gesecreteerd die de axonale groei, en een compleet fysiek en funktioneel herstel verhinderen.

Willis CL, Davis TP. ‘Chronic inflammatory pain and the neurovascular unit: a central role for glia in maintaining BBB integrity?’ Curr Pharm Des. 2008;14(16):1625-43:

Pijn is een complex fenomeen waarbij een perifere aangeboren immuun-respons én een CZS-respons is betrokken, alsook aktivatie van de HPA-as. De perifere aangeboren immuun-respons op beschadiging omvat de snelle produktie en plaatselijke afgifte van pro-inflammatoire cytokinen zoals TNF-alfa, interleukine-1 en IL-6. Recente studies aangaande de CZS-respons op perifere chronische inflammatoire pijn impliceren sterk een rol voor glia en lokale synthese van pro-inflammatoire cytokinen en groei-factoren. Een karakteristiek kenmerk van CZS-inflammatie is gliosis, waarbij inflammatoire mediatoren glia-cellen aktiveren (bv. astrocyten en microglia, macrofagen en leukocyten) waarvan werd aangetoond dat ze hyperalgesie induceren en in stand houden. Daarenboven induceert inflammatoire pijn veranderingen in de doorlaatbaarheid van de bloed-hersen-barrière (BBB) en verandert het transport naar de hersenen van klinisch relevante medicijnen die gebruikt worden om pijn te behandelen. Ondanks de groter wordende hoeveelheid bewijsmateriaal voor de betrokkenheid van glia bij chronische pijn en hun rol bij het instandhouden van de BBB, zijn er weinig studies naar gliale/endotheliale interakties en de mechanismen waarmee glia de BBB mogelijks reguleren bij inflammatoire pijn.]

5. Bespreking en besluiten

MRS studies in spieren bij CVS lijken mogelijks te wijzen op een verminderde beschikbaarheid van ATP in de weefsels; door een verhoogde ATP-afbraak of een beperkte ATP re-synthese. Verminderde benutting van ATP kan voorkomen door geaktiveerde fosfolipasen en gestegen Cho resonantie bij cerebrale ¹H MRS kan dit proces weerspiegelen. Alle neurotransmitters en groei-factoren aktiveren één of meerdere fosfolipasen. Cytokinen aktiveren ook membraan fosfolipasen en het is geen verrassing dat symptomen van vermoeidheid vergelijkbar met CVS worden ervaren door patiënten met een brede waaier aan infektueuze en inflammatoire aandoeningen. Er is verder bewijs dat een aantal virussen op een direkte manier fosfolipase-funkties kunnen beïnvloeden. Viraal membraan-glycoproteïne en viroporine [Viroporines of virale ion-kanalen zijn een groep eiwitten die participeren in verscheidene virale functies, inclusief de promotie van het afscheiden van virale deeltjes van de cel. Verhoogde membraan-permeabiliteit veroorzaakt door viroporines, glycoproteïnen en proteasen is een typisch kenmerk van bepaalde virus-infekties.] induceren veranderingen in de membraan-doorlaatbaarheid van de gastheer, wat leidt tot de aktivatie van fosfolipasen met daaropvolgende afgifte van een aantal fosfolipide-onderdelen, waaronder choline.

Fosfolipase signaal-transductie mechanismen zijn ingewikkeld en kunnen een hele reeks membraan-funkties en receptor-gevoeligheid van de cellen aantasten. Tijdens het proces van fosfolipiden signaal-transductie waabij de fosfolipasen tussenkomen, worden veel belangrijke molekulen met diverse effekten op de cel-funktie vrijgegeven. Het werd reeds voorgesteld dat CVS-symptomen gerelateerd kunnen zijn met veranderde ion-kanaal funktie [A. Chaudhuri, W.S. Watson, J. Pearn, P.O. Behan, Symptoms of Chronic Fatigue Syndrome are due to abnormal ion-channel function, Med. Hypotheses 54 (2000) 59-63] en ¹H MRS studies suggereren dat het neuronaal fosfolipiden-metabolisme een belanrijke rol kan spelen bij CVS. Op het niveau van de spieren zal de verminderde beschikbaarheid van ATP waarschijnlijk het aëroob metabolisme schaden en de inspanningstolerantie beperken. Dit wordt ondersteund door een abnormale lactaat-respons op inspanning wat een gestoord energie-metabolisme in de spieren reflekteert in een deel van de CVS-patiënten. […].

Verhoogde choline-resonantie bij ¹H MRS van basale ganglia en de occipitale cortex kan een klinische diagnose van CVS en differentiatie met andere aandoeningen met chronische vermoeidheid ondersteunen. Er wordt echter niet enkel bepleit dat het nodig is om grotere studies te ondernemen maar ook om resultaten te vergelijken met patiënten met depressie vooraleer ¹H MRS kan worden aanbevolen voor klinisch gebruik bij CVS-patiënten. ³¹P MRS van spieren en ¹H MRS hersen-gebieden van kan ook potentieel hebben om te worden gebruikt als waarnemer-onafhankelijke uitkomst-metingen bij interventionele studies van CVS. Als oxidatieve stress wordt beschouwd als het uiteindelijk gemeenschappelijke mechanisme voor verhoogde fosfolipase-aktiviteit en gedaald ATP leidend tot vermoeidheid, dan zou het redelijk zijn therapeutische strategieën aan te wenden om dit proces te beheersen. Anti-oxidantia, inclusief ‘highly unsaturated fatty acids’ (HUFA) [hoog-onverzadigde vetzuren], zijn opties die met goede reden kunnen worden gebruikt bij CVS totdat meer specifieke kennis omtrent de neurobiologie en het cellulair mechanisme van deze complexe aandoening aan het licht komt. De bruikbaarheid van eender welk biologisch model hangt van het feit of het leidt tot een effektieve behandeling of niet. Het is noodzakelijk degelijk ontworpen therapeutische testen bij CVS te overwegen met objectieve merkers zoals ¹H MRS van bepaalde hersen-gebieden.

Samenspel tussen de Glucocorticoid Receptor en Nuclear Factor-κB

Eerder werd hier de mogelijke betrokkenheid van het glucocorticoid receptor gen (NR3C1) bij M.E.(cvs) besproken.

Tijdens een boeiende uiteenzetting getiteld ‘Induction and repression of inflammatory cytokines: molecular mechanisms and signal transduction pathways’ door Prof. Guy Haegeman (Lab voor Eukaryote Gen Expressie en Signaal Transductie, van de Universiteit Gent) kwam ik wat meer te weten over de interakties tussen de Glucocorticoid Receptor en de Nucleaire Factor NF-κB. Over deze laatste is er een preliminair rapport over verhoogde gestimuleerde produktie van NF-κB bij M.E.(cvs) . Toen ik mij daaromtrent verder ging verdiepen, vond ik o.a. een zeer uitgebreide en diepgaande literatuurstudie hieromtrent van de groep van Prof. Haegeman.

Bij verdere contacten bleek een interesse voor een mogelijk verband tussen het werk van deze groep en de pathofysiologie van M.E.(cvs), alsook dat een therapeuticum tegen chronsiche inflammatie misschien wel zou kunnen worden getest…

Onderstaand stuk handelt echter niet specifiek over M.E.(cvs) maar een (door de complexiteit van de materie, sterk gereduceerde) samenvatting van de voor ons belangrijkste elementen, kan misschien bijdragen tot het aangeven van richtingen voor verder biochemsich onderzoek…

Voor uitleg over sommige begrippen en om de samanhang te zien, kan men ook de meer complexe hoofdstukken te raadplegen.

Endocrine Reviews (2003) 24(4):488–522

The Interplay between the Glucocorticoid Receptor and Nuclear Factor-κB or Activator Protein-1: Molecular Mechanisms for Gene Repression

K. De Bosscher, W. Vanden Berghe & G. Haegeman

Department of Molecular Biology, Ghent University, Belgium

De inflammatoire respons is een sterk gereguleerd fysiologisch proces dat heel belangrijk is voor homeostase. Een nauwkeurige fysiologische controle van inflammatie laat een tijdige reaktie toe tegen invaderende pathogenen of andere aanvallen zonder een over-reaktie te veroorzaken die schade kan veroorzaken bij de gastheer. De cellulaire signaliseringsmechanismen die werden geïdentificeerd als belangrijke regelaars van inflammatie zijn de signaal-transductie cascades die worden gemedieerd door de nucleaire factor κB en het the aktivator-eiwit 1, die beiden kunnen worden gemoduleerd door glucocorticoïden. Hun gebruik in de kliniek omvat behandeling van Rheumatoïde Arthritis, asthma, allograft [transplantie] afstoting en allergische huidziekten. Hoewel glucocorticoïden veel worden gebruikt sinds de late jaren 40, worden de molekulaire mechanismen verantwoordelijk voor hun anti-inflammatoire aktiviteit nog steeds onderzocht. De diverse molekulaire mechanismen die tot nu werden voorgesteld worden hier gedetailleerd besproken.

I. Inleiding

[…] De inflammatoire respons kan worden geïinterpreteerd als kennisgeving van een bedreigend agens of organisme; de daaropvolgende aktivatie van het verdedigingssysteem werd ontwikkeld om deze bedreigingen te elimineren. Immuniteit en inflammatie zijn fysiologische processen die van uiterst belang zijn voor het organisme; zonder deze processen zou een gastheer snel bezwijken door de binnendringende pathogenen of beschadigende stimuli; terwijl overmatige of ongepaste aktivatie van deze responsen weefsel- en cel-schade, en zelfs sterfte kunnen veroorzaken. Daarom is het handhaven van immuun-homeostase kritiek voor het overleven van een organisme. Pro- én anti-inflammatoire mechanismen moeten aanwezig en funktioneel zijn opdat een cel (organisme) zou overleven bij blootstelling aan omgevingsstimuli die een immuun-respons opwekken. Deze mechanismen voorzien in homeostase door de cel in tegenstelde richtingen te bewegen. De transcriptie-factoren nucleaire factor (NF)-κB en aktivator-proteïne (AP)-1 werden aangewezen als cruciaal voor de inductie van genen betrokken bij inflammatie, zowel als bij een brede waaier aan ziekten ontstaan door chronische aktivatie van het immuunsysteem, inclusief asthma, atherosclerose, inflammatoire darm ziekte en auto-immuun-ziekten zoals Multipele Sclerose en Rheumatoïde Arthritis. Een overvloed aan immuniteit-regelende genen coderend voor cytokinen, cytokine-receptoren, chemotactische proteïnen of adhesie-molekulen, zoals TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, macrofaag chemotactisch proteïne (MCP-1), […] interferon (IFN)-β, granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF), intercellulair adhesie molekule-1 (ICAM-1), vasculair cellulair adhesie molekule-1 (VCAM-1) en E-selectine, bevatten NF-κB en/of AP-1 plaatsen in hun promotors [plaats in het DNA, voor een gen, waarop RNA-polymerase kan binden met behulp van transcriptie-factoren, om transcriptie te starten] of regulerende gebieden. Daarom vertegenwoordigen beide transcriptie-factoren een overduidelijk doelwit voor immunosuppressieve therapieën. Glucocorticoïden (GC) en catecholaminen, de belangrijkste stress-hormonen, werken de produktie van (pro)inflammatoire cytokinen, zoals IL-12, IL-6 en TNF-α, tegen terwijl ze de produktie stimuleren van anti-inflammatoire cytokinen, zoals IL-10, IL-4 en TGF-β. Een buitensporige immuun-respons stimuleert, door aktivatie van het stress-systerm, een belangrijk negatief feedback-mechanisme [chronische inflammatie => chronische overbelasting stress-systeem], dat het organisme beschermt tegen een teveel aan pro-inflammatoire cytokinen en andere weefsel-beschadigende produkten.

A. NF-κB

Transcriptionele regulators van de NF-κB / inhibirend proteïne (I)κB familie helpen de expressie van meer dan 100 doelwit-genen, waarvan de meerderheid participeren in de immuun-respons van de gastheer (zie http://people.bu.edu/gilmore/nf-kb/). Studies toonden rollen voor NF-κB in de ontogenie [ontwikkelingsleer] van het immuunsysteem en demonstreerden dat NF-κB in vele stappen deelneemt tijdens oncogenese [onstaan van kanker] en regulatie van geprogrammeerde cel-dood [apoptose]. De betrokkenheid van de alomtegenwoordige transcriptie-factor NF-κB bij de pathogenese van de inflammatoire respons is goed gedocumenteerd door allerlei experimenten. NF-κB is een heterodimeer [proteïne bestaande uit twee verschillende proteïne-subunits], bestaande uit [de 2 subunits] p50 en p65 monomere proteïnen. […] De NF-κB / Rel familie bij zoogdieren omvat vijf leden: p65 of RelA, RelB, c-Rel, NF-κB1(p50/p105) en NF-κB2 (p52/p100). Alle leden worden gekenmerkt door een geconserveerd gebied van 300 aminozuren: het Rel homologie domein (RHD). Dit is belangrijk voor DNA-binding en wederzijdse interakties tussen de verschillende Rel familie-leden. Het dient ook als een interaktie-oppervlak voor IκB. NF-κB is latent aanwezig in het cytoplasma, onder strenge controle van het geassocieerde proteïne IκB-α. De IκB protïnen-famile bestaat uit: IκB-α, IκB-β, IκB-γ/p105, IκB-δ/p100, IκB-ε en B-cel lymphoma (Bcl)-3. Ze worden gekenmerkt door meerdere 30 tot 33 aminozuur-motieven genaamde ‘ankyrin-repeats’. Krachtige induceerders van NF-κB omvatten de pro-inflammatoire cytokinen IL-1 en TNF, nevenprodukten van microbiële, schimmel- en virale infekties zoals lipopolysacchariden (LPS), sfingomyelinase, dubbelstrengig (ds)RNA, Tax-proteïne van humaan T-cel leukemie / lymfoma virus (HTLV) en pro-apoptotische en necrotische stimuli, zoals vrije zuurstof-radikalen, UV- en γ-straling. De eerste stap in het aktivatie-proces van NF-κB is een IκB kinase complex (IKK)-afhankelijke fosforylatie van IκB-α. […]

De aktiviteit van de twee IKK-kinasen op verschillende leden van de IκB familie resulteert waarschijnlijk ook in een anders gereguleerde NF-κB respons en aktiviteit verderop. […]

Er werden ook alternatieve IKK-complexen geïndentificeerd die NF-κB aktivatie veroorzaken. […] De release en aktiviteit van NF-κB zijn onderworpen aan verschillende controle-mechanismen. […]

B. AP-1

De transcriptie-factor AP-1 wordt gecodeerd door proto-oncogenen [genen waarvan de eiwit-produkten celgroei stimuleren en na mutatie kunnen veranderen in genen die bijdragen aan kwaadaardige celgroei] en reguleert verscheidene aspekten van cel-proliferatie [-vermeerdering] en -differentiatie. AP-1 kan samengesteld zijn uit ofwel homodimeren of heterodimeren van verschillende leden van Jun-familie, Fos-famie, aktiverende transcriptie-factoren of Maf-familie [bepaalde eiwit-families]; ze behoren allen tot de klasse van de ‘basic zipper’ (bZIP) familie [regulerende proteïnen die schijnbaar de vorm van een rits hebben] van sequentie-specifieke dimerische DNA-bindende proteïnen. […] De regulering van AP-1 aktiviteit is complex […]. Verscheidene stimuli, zoals fysiologische agentia (groei-factoren, mitogenen, polypeptide hormonen, cel-matrix interakties en inflammatoire cytokinen), bakteriële en virale infekties, farmacologische stoffen, cellulaire stress (ultraviolet of ioniserende straling), alsook belasting met zware metalen, induceren AP-1 aktiviteit. […] Bovenop de positief-regulerende effekten, is aangetoond dat het AP-1 complex negatieve regulering uitoefent, bv.op de GC-receptor (GR). […]

C. Glucocorticoid (GC) hormonen

1. Molekulaire aspekten en fysiologie

GC oefenen hun effekten uit door binding op de GR [Glucocorticoid Receptor], een transcriptie-factor die in staat is meerdere genen op een positieve of negatieve manier te reguleren. GR behoort tot de familie van de steroid-hormoon receptoren, bestaande uit struktureel gelijkaardige proteïnen, zoals progesteron (PR), mineralocorticoid (MR), androgeen (AR) en oestrogen (ER) receptor-vormen; die verder behoren tot de nucleaire receptoren (NR) super-familie. Andere klassen van NR omvatten thyroid (TR), retinoid en wees-receptoren. In het algemeen delen de receptor-leden een trans-aktivatie-gebied, een centraal en goed-bewaard DNA-bindend domein (DBD) en een matig bewaard gebied verantwoordelijk voor ligand-binding. Dit laatste omvat ook aktiverende funkties.

[Trans-aktivatie = toegenomen transcriptie, Trans-repressie = afgenomen transcriptie]

GC hormonen worden stapsgewijs gesynthetiseerd uit cholesterol via een aantal door cytochroom P450 gekatalyseerde reakties in de bijnierschors. De synthese en secretie van cortisol, het belangrijkste menselijk GC hormoon, wordt strikt gecontroleerd door het evenwicht van adrenocorticotropine (afgegeven door de hypofyse) en CRH (corticotropine-vrijgevend hormoon; gesecreteerd door de hypothalamus bij stress). Het meest geaccepteerde mechanisme voor het binnenkomen van GC in de cel is door diffusie van de lipofiele [‘vet-lievende’] molekulen door de dubbele laag lipiden van de cel in het cytoplasma. In deze rust-status (zonder ligand), in afwezigheid van GC hormoon, is GR aanwezig in het cytoplasma in een inaktief complex (d.i. DNA-binding incompetent) met chaperones [eiwitten die helpen om andere eiwitten in een goede vorm te brengen of te houden, die helpen bij het modelleren en vouwen; het ‘eiwit kwaliteitscontrole systeem’] en co-chaperone molekulen. De belangrijkste chaperones bij de werking van NR zijn ‘heat-shock’ proteïnen (hsp) 90 en hsp70. Hun werking wordt verder positief of negatief gereguleerd door co-chaperones […]. Receptor-aktivatie en hyper-fosforylatie gebeurt na binding met het ligand, […]. Verplaatsing van het cytoplasma naar de kern gaat vooraf aan de dissociatie van het gevormde complex en omzetting van GR naar de DNA-bindende vorm. […] Geaktiveerd GR bindt op specifieke DNA-sequenties. Genen die positief worden gereguleerd door GR worden gekenmerkt door ‘GC-response elements’ (GRE) in de promotor, terwijl negatief gereguleerde genen ofwel een negatief GRE (nGRE) bevatten of worden geïnhibeerd door direct of indirecte interferentie van GR met de transcriptionele aktiviteit van andere DNA-gebonden transcriptie-factoren (zoals NF-κB, AP-1, ‘signal-transduction activator of transcription’ (STAT), e.a.).

2. Biologishe effekten van GC

GC zijn van uiterst belang bij de bescherming van het lichaam tegen stress via regulering van het glucose-metabolisme en de bloeddruk. Ze zijn ook betrokken bij het lipiden-metabolisme en afzetting van glycogeen in de lever. Naast deze metabole aktiviteiten, werden ook GC effekten beschreven met betrekking tot gedrag en hersen-funktie. Verder, beïnvloeden GC orgaan-ontwikkeling, weefsel-maturatie, wondheling en calcium-reabsorptie. Erg van belang is de rol van GC bij de dynamische modulatie van inflammatoire en immuun-responsen. Dit omvat communicatie met transcriptie-factoren en signaliseringsmechansimen, effekten op cytokine-receptor expressie, regulering van thymocyten- en lymfocyten-overleving, -selektie en -funkties, alsook interferentie met eosinopoiese [vorming van eosinofiele granulocyten] of erythropoiese [vorming van rode bloedcellen]. Bij een optimaal evenwicht zullen GC-afhankelijke funkties bijdragen tot het oplossen van infektie, trauma of andere immuniteits-gerelateerde stressoren. Verstoring of dysfunktie van deze dynamische interakties kunnen echter resulteren in een acute inflammatie of kunnen voorbestemmen tot auto-immune of atopische reakties. Een goed begrip van de precieze rol van endogene GC in gastheer-verdediging kunnen nieuwe wegen openen voor de behandeling of profylaxis van immuniteit-gemedieerde ziekten.

3. Weefsel-specificiteit van GC-effekten

Omdat GR tot expressie komt in de overgrote meerderheid van de weefsels, is het redelijk te veronderstellen dat GC inwerken op bijna alle cellen in het lichaam. De regulering en werking van GC-gemedieerde effekten hangen verder af van andere weefsel-specifieke factoren, van de bio-beschikbaarheid van het hormoon en van weefsel-specifieke hormoon-modificerende enzymen. Op één niveau wordt de biologische sensitiviteit van GC tot stand gebracht door binding op circulerende proteïnen aanwezig in het plasma en bloed, zoals corticosteroid-bindend globuline (CBG). […] Op een ander niveau wordt GC gevoeligheid bepaald door expressie-waarden van het transport-proteïne LEM1 of het ‘multidrug resistance’ proteïne MDR1. De expressie-niveaus van GR zijn ook cel- en weefsel-specifiek. GR-waarden worden zelf negatief gereguleerd door GC, wat bijdraagt tot het feit dat langdurige behandeling met GC resulteert in een daling van de fysiologische respons. Andere niveaus van regulering die GC-sensitiviteit bepalen, omvatten variaties in het receptor-eiwit (mutaties, polymorfismen, isoformen), alternatieve receptor-dimerisatie […], receptor co-chaperones, DNA-binding, veranderde expressie-niveaus van hsp-proteïnen, effekten van signalisering-cascades en post-translationele modifikaties (fosforylatie, nitrosylatie,…). Ten slotte is het nu duidelijk dat verschillen tussen endogene GC (geproduceerd door de bijnieren) en synthetische GC, wat betreft hun regulerende mechanismen, cruciaal zijn voor hun biologische akties. […]

4. GC in de kliniek

GC behoren tot de meest gangbare en effektieve faramaceutica gebruikt om inflammatie en verscheidene immuniteitsaandoeningen te verlichten. Inflammatoire ziekten waarvoor toediening van GC een standaard behandeling zijn, omvatten Rheumatoïde Arthritis, inflammatoire darm ziekten, Systemische Lupus Erythematosus, sarcoidose en nefrotisch syndroom. Lokale behandeling met GC wordt toegepast bij dermatitis, ofthalmologische aandoeningen, asthma en conjunctivitis. Verder worden GC gebruikt om het immuunsysteem na transplantatie te onderdrukken. GC worden ook aangewend om hersen-oedeem, shock-condities en sommige kankers (e.g. haematologische kwaadaardigheden) te behandelen, zowel als aandoeningen met betrekking tot bijnierschors-insufficientie (bv. Addison’s). Er is echter een reusachtig nadeel naast het voordelige gebruik van GC omdat behandelingen met hoge dosissen gedurende langere perioden niet enkel resistentie tegen de op steroïden gebaseerde therapie kunnen veroorzaken, maar ook gepaard kunnen gaan met een waaier aan nadelige bijwerkingen. Deze omvatten diabetes, gestoorde wondheling, huid-atrofie, spier-atrofie, verhoogde vatbaarheid voor infekties, aktivatie van latente infekties, HPA-as insufficientie, katarakt, maagzweren, hypertensie (door aktivatie van de mineralocorticoid receptor), metabole aandoeningen (door de hyperglycemie en een gedaalde carbohydraten-tolerantie), retentie van water en natrium plus excretie van kalium (wat de water-huishouding balans van het lichaam verstoort), en verlies van mineralen uit bot (leidend tot osteoporose). Artsen pogen de bijwerkingen mimimaal te houden door gebruikt te maken van lokale behandelingen, intervallen, aanvulling met vitamin-D3 en oestrogenen, en specifieke GC met een minimum aan mineralocorticoïde effekten.

5. GC en inflammatie

Van GC werd beschreven dat ze leukocyten-migratie naar de plaatsen van inflammatie verhinderen en interferen met de funkties van endotheliale cellen, leukocyten en fibroblasten. Ze onderdrukken de produktie en effekten van humorale factoren betrokken bij de inflammatoire respons. Er wordt algemeen verondersteld dat het voordelig, anti-inflammatoir potentieel van de GR schuilt in een negatieve modulatie van pro-inflammatoire cytokinen en dat zijn bijwerkingen hoofdzakelijk het gevolg zijn van zijn trans-aktiverende capaciteiten. Niettemin hebben andere stoffen het klinisch gebruik van GC als krachtig immunosuppressivum en anti-inflammatoir agens niet kunnen evenaren.

Om de onderdrukkende werking van GC op immune doelwit-genen te verklaren, werd de rol van GC bij de inhibitie van de aktiviteit van de transcriptie-factoren NF-κB, AP-1 of CREB veelvuldig onderzocht. […] Het zou een verbetering zijn voor vele met steroïden behandelde patiënten als iemand de funktie van GR zou kunnen her-ontwerpen en zijn bijwerkingen zou kunnen reduceren maar met behoud van de anti-inflammatoire karakteristieken. Daarvoor proberen vele onderzoekers te verhelderen hoe het aktie-mechanisme van GC verloopt. Het uiteindelijke doel is een meer effektieve en doelgerichte immunosuppressieve therapie te vinden. […]

Het hoofddoel van dit overzicht is het bespreken van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de anti-inflammatoire eigenschappen van GC. […] Er wordt gefocust op tegenstellingen in de hypothesen en op de bijkomende controverse aangaande mechanismen die de communicatie tussen de GR en de door NF-κB of AP-1 aangedreven genen verklaren.

II. Molelulair Mechanismen

[Vanwege de complexiteit en het academisch niveau wordt dit beperkt tot de hoofdlijnen. De uitgebreide besprekingen van experimenten en hypothesen zijn voor de specialisten. Dit alles betreft de stand van zaken in 2003. Enkele vaststellingen kunnen mogelijks een licht werpen op de M.E.(cvs)-problematiek. De details vallen buiten dit gezichtsveld.]

A. GC receptor (GR) aktiviteit en directe DNA-binding

Geaktiveerd GR bindt op specifieke DNA-sequenties als een homodimeer. […] Eén funktie van het dimerisatie-domein is het discrimineren tussen verschillende respons-elementen en bepalen welke doelwit-genen worden geaktiveerd. […]

Directe transcriptionele onderdrukking door GC kan worden bereikt via de interaktie van GR met een plaats op het DNA, nGRE genoemd. […] Daarnaast bleek voor sommmige genen het mechanisme ook de betrokkenheid van GR-afhankelijke verplaatsing van een andere factor of DNA-onafhankelijke verankering van GR met een andere transcriptie-factor te omvatten. […]

B. Proteïne-proteïne koppeling

Omdat bij de meerderheid van inflammatoire genen geen nGRE kon worden gedekteerd, werd ontdekt dat transcriptionele interferentie meestal resulteert uit ‘cross-talk’ tussen de GR en andere transcriptie-factoren, zoals NF-κB of AP-1. GC repressie door een directe fysieke associatie tussen GR en NF-κB werd door meerdere research-groepen ondersteund met in vitro gegevens. […] Om verder te begrijpen hoe GR interfereert met de aktiviteit van NF-κB en AP-1, zijn bijkomende experimenten nodig. […] De aanwezigheid van een verschillende subset co-factoren of chaperones die de GR-funktie moduleren of uitgesproken signaliseringsmechanismen in verschillende cellijnen zouden bepaalde discrepanties kunnen verklaren. Anders zou de promotor-context of de effector-site ook kunnen bepalen of een specifieke NR kan interfereren met NF-κB activiteit. […]

Hoewel AP-1 trans-repressie veel gelijkenissen vertoont met NF-κB repressie, moeten sommige belangrijke verschillen worden opgemerkt. […] Net zoals voor NF-κB, werd aangetoond dat repressie van AP-1 aktiviteit ook strikt afhankelijk is van de promotor, receptor en cel-type.

C. Up-regulering van IκB-α

De wijziging of geïnduceerde expressie van een regulerend proteïne dat in staat is NF-κB aktiviteit te inhiberen, zou aan de basis kunnen liggen van GC repressie van NF-κB gemedieerde gen-expressie. Eén zo’n kandidaat is de cytoplasmische inhibitor van NF-κB: IκB-α. […]

1. Transcriptionele regulering van de IκB-α promotor door GC

[…]

Homodimerisatie van de GR is een eerste vereiste voor inductie van het IκB-α gen, wat een argument is voor een klassieke GRE in de promotor. […]

De IκB-α promotor bevat ook drie elementen die responsief zijn voor NF-κB, wat een negatieve feedback-lus voor aktivatie van NF-κB verzekert. […] De diversiteit aan NR-interakties met co-factor-complexen kan verder meebepaald worden door chaperone-proteïnen.

2. IκB-α expressie vs. NF-κB/DNA binding

[…] Resultaten wijzen er op dat NR DNA-gebonden NF-κB kunnen onderdrukken via verankering, zonder DNA-binding zelf te beïnvloeden. Onderzoeken bewezen dat GC repressie gebeurt door de confirmatie te veranderen van de proteïne-complex binding met de NF-κB bindingsplaats, zonder klaarblijkelijke verstoring van NF-κB binding. […]

[…] Verder is gebleken dat er geen exclusieve relatie is tussen NF-κB relokalisatie van de nucleus naar het cytoplasma, verminderde NF-κB/DNA binding en stijjging van expressie-niveaus van IκB-α tijdens GC repressie.

3. Discriminerende omstandigheden die een mogelijke upregulering van IκB-α door GC bepalen

Hoe kunnen GC een upregulering van IκB-α in sommige cel-types en niet in andere bereiken? Verschillende cel-types maken mogelijks gebruik van alternatieve mechanismen om GC effekten te mediëren. In cellen van lymfoïde origine bv. werden unieke redox-gevoelige NF-κB signaliseringsmechansismen die lipoxygenasen [enzyme dat de omzetting van vetzuren tot hydroperoxiden katalyseert - veroorzaakt de vorming van zgn. leucotriënen, die voor chronische ontstekingen verantwoordelijk zijn; het anti-oxidant curcumine is een lipoxygenase-inhibitor en zou NF-κB inaktiveren; Boswellia-zuren remmen ook lipoxygenase en zouden daardoor het ontstekingsproces kunnen tegengaan] of glutathion nodig hebben beschreven. In dit opzicht werden reeds GC effekten op oxidatieve stress en op lipoxygenase en glutathion-waarden aangetoond voor cellen van lymfoïde oorsprong. […]

Naast cel-afhankelijke variaties in bepaalde redox-mechanismen, is sensitiviteit voor GC-geïnduceerde apoptose ook een cellulaire respons die gekend is zeer afhankelijk te zijn van het cel-type en stimulus-afhankelijk. Cellulaire schade induceert een adaptieve respons die afhangt van de aard van de beschadiging: fysiek (bv. hitte, straling), chemisch (bv. reaktieve zuurstof (ROS), GC), infektueus (bv. bakterieën) of inflammatoir (bv. LPS, TNF). Recente gegevens wijzen er op dat de communicatie tussen verscheidene responsen niet voorspelbaar is en dat wisselende triggers tegengestelde effekten op het resultaat van de beschadiging kunnen hebben. Bijvoorbeeld: hoewel het goed geweten is dat een voorafgaande ‘heat-shock’ cellen kan beschermen tegen inflammatoire stress in vitro en in vivo, werd ook aangetoond dat inductie van een ‘heat’-stress in cellen met inflammatie cel-dood door apoptose kan bewerkstelligen. […] Hsp-proteïnenn kunnen ‘death-receptor’ signalisering, steroid-aktiviteiten en inflammatoire responsen verbinden; naast zijn chaperone-funktie bij GR-aktiviteit is hsp90 een funktionele component van het IKK-complex, vereist voor TNF-signalisering, gebleken. […]

Naast hsp, werden ras [een signaal-transductie proteïne, communiceert dus ook signalen van buiten de cel naar de nucleus] chaperone-proteïnen, proteasomen [cytoplasmatische of nucleaire eiwit-complexen die afwijkende - overbodige of beschadigde - proteïnen afbreken via proteasen] en caspasen [proteasen, eiwit-afbrekende enzymen, die een essentiële rol vervullen bij de apoptose] beschreven als doelwittenvoor GC. […]

Men moet in gedachten houden dat, bij modellen voor chronische inflammatoire ziekten in vivo, de continue inductie van pro-inflammatoire responsen alsook de behandeling, veel langer duren (dagen tot maanden) dan onderzoekers doen bij in vitro cellijnen (minuten tot uren). Daarenboven moeten in in vivo situaties, met veel meer parameters rekening worden gehouden. Dit omvat signaal-transductie cascades teweeggebracht door verschillende cel-cel contacten, systemische signalen, GR metabolisme en neuro-endocriene effekten.

4. Zijn GC-gemedieerde trans-repressie en IκB-α upregulering ongekoppelde fenomenen?

Observaties doen de veronderstelling rijzen dat upregulering van het IκB-α eiwit niet het hoofd-mechanisme is waardoor GC immuun-genen kunnen onderdrukken. […] Bevindingen demonstreren dat upregulering van IκB-α en het fenomeen van GC repressie in veel gevallen twee onafhankelijke processen zijn.

[…] Dat twee onafhankelijke mechanismen van NF-κB repressie door GR binnen dezelfde cel kunnen bestaan, suggereert dat het behouden van negatieve controle op NF-κB signaliserngsmechanismen van reëel fysiologisch belang is. IκB-α upregulering vertegenwoordigt een ‘rotonde’ route om effektieve repressie tot stand te brengen, terwijl een directe interferentie tussen vooraf bestaande, geaktiveerde GR en NF-κB proteïnen een directe en snellere manier om onmiddelijk pro-inflammatoire overdaad te onderdrukken. […] Data impliceren dat bepaalde cel-types (zoals T-lymfocyten), om te overleven, drempelwaarden aan NF-κB transcriptionele aktiviteit nodig hebben om cel-cyclus progressie te behouden. Deze drempel kan onderworpen zijn aan modulatie door GC via regulering van IκB-α expressie tijdens apoptose. Dit feedback-mechanisme kan fungeren als een back-up of finaal controle-punt om op efficiënte manier apoptose te induceren in cellen die te veel schade ondervonden en om een lawine te vookomen van systemische immuun-responsen, die in staat zijn een levensbedreigende septische shock te induceren.

D. Co-factor competitie model

Co-aktivator molekulen worden gekenmerkt door een intrinsieke histoon-acetyltransferase (HAT) [enzymen die histoon-proteïnen (kleine eiwitten met een hoog aantal van positief geladen aminozuren die aan negatief geladen DNA bindt en er als het ware zijn rond gedraaid) van een acetyl-groep voorzien bij aktivatie van transcriptie, door ‘opening’ van het nucleosoom (DNA + histonen) struktuur] aktiviteit, waarvan wordt geloofd dat deze resulteert in een meer gerelaxeerd DNA, wat dan gen-aktivitieit bevordert. Vandaar dat er zou kunnen worden verondersteld dat competitie tussen nucleaire transcriptie-factoren voor beperkte hoeveelheden co-aktivator molekulen leidt tot gen-repressie. […] Het competitie-model worstelt met een gebrek aan of specificiteit. […]

Een aantal of observaties zijn meer consistent met de notie van een territoriale onderverdeling dan met een competitie voor factoren. Als transcriptie-factor complexen worden geassembleerd binnen afgezonderde kern-compartmenten, dan zouden co-factor effekten beperkt kunnen worden gehouden tot de aangewezen compartmenten, zonder dezelfde factoren te beïnvloeden in andere compartmenten geassocieerd met andere genen. […]

Naast de ruimtelijke dimensie van transcriptie, spelen temporale aspekten tegen het co-factor competitie-model.

E. Nieuwe perspektieven

1. Histoon vs. (co)factor acetylatie

Omdat eenvoudige competitie voor gebruikelijke co-aktivatoren waarschijnlijk niet het belangrijste mechanisme voor GC repressie is, blijft de vraag wat het effektieve mechanisme is. Als een alternatief voor co-factor competitie werd een co-aktivator afstotingsmodel, […] gesuggereerd.

Er bestaat geen tijfel dat GR specifieke co-aktivatoren recruteert om trans-aktivatie mogelijk te maken. De sleutel-vraag is of een bijzondere GR co-factor configuratie betrokken is bij repressie van NF-κB gemedieerde gen-expressie.

2. Methylatie van histonen, (co)factoren en DNA

Naast acetylatie gebeuren nog andere post-translationele veranderingen zoals fosforylatie en methylatie in histonen. […] Omdat de inflammatoire respons van NF-κB doelwit-genen sterk afhankelijk bleek van zijn histoon-modifikaties […], blijft de potentiële interferentie van GC in histoon-regulering een research-onderwerp […].

[…] In welke mate methylatie van CBP [een co-factor], GR, AP-1 of NF-κB/IκB bijdraagt tot hormoon-afhankelijke repressie blijft een vraag. Uiteindelijk werd een rol voor DNA-methylatie in GR-trans-repressie én trans-aktivatie beschreven. Recent werd gevonden dat DNA-methylatie wordt begeleid door histoon-modifikaties.

3. GR repressie en histoon/co-factor/transcriptie-factor code

In parallel met modifikaties aan het DNA-chromatine raakvlak, hangt een specifieke biologische respons ook af van het volledig patroon van wijzigingen anwezig in de omringende transcriptie-factor of co-regulatoren op een bepaald tijdstip.

[…] een evenwicht in co-factor niveaus speelt ook een rol. […]

Hoewel ligand-binding essentieel is voor de aktivatie van GR, is de receptor ook onderhevig aan post-translationele modifikatie door fosforylatie. GR is een fosfo-proteïne in afwezigheid van ligand; bijkomende fosforylatie gebeurt na hormoon-binding (ligand-afhankelijk). […]

Naast GR, zijn NF-κB en AP-1 ook onderworpen aan fosfo-regulering via verscheidene signaliseringsmechanismen […]. Fosforylatie van NF-κB en AP-1 heeft een invloed op verscheidene niveaus, bv. lokalisatie, dimerisatie, translokatie, DNA-binding, stabiliteit, trans-aktivatie en co-factor recrutering. […] MAPK-inhibitoren en GC kunnen onafhankelijk NF-κB aktiviteit onderdrukken, wat afzonderlijke anti-inflammatoire mechanismen suggereert. […]

Behalve fosforylatie hebben andere post-translationele modifikaties (acetylatie, ubiquitinylatie, sumoylatie en nitrosylatie) ook een invloed op GR, NF-κB p65 en AP-1 funktie en deze zullen verder de complexiteit van transcriptie-factor communicatie verhogen. […]

4. GR-repressie en chromatine-hermodelering

Naast chromatine-modifikatie, is er een ander type strukturele verandering in vivo genaamd chromatine-hermodelering. Dit refereert naar een dramatische, gelokaliseerde verandering in het chromatine waarbij een bijzonder nucleosoom, of meerdere naburige nucleosomen, een receptor-gecontroleerde strukturele wijziging ondergaan. […] Chromatine-hermodelering effekten geïnduceerd door GR kunnen variëren naar gelang de chromosomale lokatie. […]

5. GR-repressie en basale RNA-polymerase-II transcriptie

[…] De mogelijkheid bestaat dat GR NF-κB onderdrukt of vice versa, door een sterisch belemmeringsmechanisme [verschijnsel ten gevolge waarvan een reaktie vertraagd of binding gehinderd wordt door de aanwezigheid van grote atoomgroepen in de buurt van de reaktie-/bindingscentra] […] of door modifikatie van één van de basale machinerie-componenten, om een transcriptioneel aktief complex te elimineren. […]

6. GC en T-cel funktie

T-lymfocyten zijn verantwoordelijk voor coördinatie van de immuun-respons en betekenen een belangrijke bron van cytokinen. Verschillende cytokinen induceren verscheidene T-cel subsets of hebben uitéénlopende effekten op proliferatie binnen een bepaalde subset. De immuun-respons wordt gereguleerd door het evenwicht tussen T-helper (Th)1 en Th2 cytokinen. Th1-cellen produceren IL-2, IFN-γ en TNF-β, terwijl Th2-cellen IL-4, IL-6, IL-10 en IL-13 produceren. Deze twee mechanismen sluiten elkaar dikwijls wederzijds uit. Ontregelde chronische Th1-cel responsen resulteren dikwijls in auto-immuniteit, terwijl verlengde Th2-cel responsen tot allergie en atopie kunnen leiden. Inflammatie wordt ge-upreguleerd na aktivatie van Th1-cellen, terwijl Th2-cellen een significante rol kunnen spelen in de downregulering van Th1 pro-inflammatoire responsen door overproduktie van Th2 cytokinen. Hoe helper T-cellen gestuurd worden naar eender van deze mechanismen; wordt verder onderzocht. Er zijn aanwijzingingen dat GR, AP-1 en NF-κB participeren in het sturen van deze complexe mechansimen.

GC worden gebruikt bij het behandelen van immuniteitsaandoeningen zoals transplantaat-afstoting, ten gevolge hun capaciteit om T-cel aktivatie en apoptose te voorkomen via meerdere mechanismen; deze omvatten veranderde ontwikkeling van de Th-familie door het bevoordelen van het genereren van (anti-inflammatoire) Th2-cellen (humorale immuun-respons), het onderdrukken van de inductie of aktiviteit van (pro-inflammatoire) Th1-cellen (cellulaire immuniteit) en inductie van de expressie van het immunosuppressieve cytokine TGF-β. Om de immuun-respons om te zetten van een Th1 naar een Th2 fenotype, wordt de synthese van Th1 cytokine geïnhibeerd en IL-10 produktie wordt gestimuleerd. Gezien de induceerbaarheid van TGF-β expressie door GCs en de gelijkenissen van hun inhiberende effekten op cytokine-expressie en T-cel aktivatie met die geïnduceerd door TGF-β, werd gespeculeerd dat GC hun anti-proliferatief effekt uitoefenen via de inductie van TGF-β expressie op transcriptioneel en post-transcriptioneel niveau.

Lymfoïde cellen, in het bijzonder CD4⁺CD8⁺ thymocyten, behoren tot de weinige cel-types die apoptose ondergaan in respons op corticosteroïden. Niettegenstaande de enorme inspanningen om GC-gereguleerde cel-dood te begrijpen, zijn de mechanismen nog grotendeels onbekend […]. Of trans-aktivatie van dood-genen of trans-repressie van overleving-genen vereist is voor GC-geïnduceerde anti-proliferatieve of apoptotische eigenschappen is nog niet bekend. Er is bewijs ten voordele van beide hypothesen. […] Tot op heden werden geen overtuigende apoptotische doelwit-genen van GR gerapporteerd. […]

7. Niet-genomische GR-akties

Omdat GR gelokaliseerd zijn in het cytoplasma, moeten ze in de nucleus raken om gen-expressie te veranderen. Het duurt minder dan 30 min […] om te resulteren in biologische effekten. Andere regulerende akties manifesteren zich binnen sekonden tot enkele minuten. Dit is te snel om te wijten te zijn aan veranderingen op genomisch niveau en worden daarom niet-genomische of snelle akties genoemd om het onderscheid te maken met de klassieke regulering van gen-expressie door steroid-hormonen. Bepaalde GR vormen zouden de snelle akties van GC kunnen mediëren; deze omvatten mogelijks ofwel een a uniek gen-produkt, een specifieke isoform [verschillende vormen van hetzelfde proteïne, gevormd door bv. ‘single nucleotide polymorphisms’ in het gen] of een gemodificeerde versie van de klassieke GR die in staat is te binden, associëren of integreren in het plasma-membraan. […] De snelle werking van steroïden is een integraal deel van de genomische aktie en, zoals de laatste, kan ze funktioneren in fysiologische en pathofysiologische processen.

8. Hormoon-selektiviteit door steroid-receptoren

GR behoort tot de NR-superfamilie, die MR, ER, PR, AR, PPAR, vitamin-D (VDR) en TR hormoon-receptoren omvat. Endogene steroid-hormonen zoals cortisol, testosteron of progesteron delen een gelijkaardige chemische struktuur maar komen tussen in afzonderlijke biologische responsen. Strukturele vergelijkingen van GR, AR, PR en ER bieden inzicht in hoe funktionele specificiteit wordt bekomen: er bestaan vele subtiele verschillen in de secundaire struktuur en de topologie van hun ligand-bindende plaats in deze steroid-receptoren. Steroïden-selektiviteit blijkt te worden bekomen door de complementariteit van vorm en waterstof-bruggen tussen liganden en ligand-bindende plaats in de receptoren. […] Trans-repressie van NF-κB en AP-1 door meerdere NR (AR, ER, PR, GR, PPAR, ROR-α, arylhydrocarbon receptor (AhR), vitamin-D, RAR/RXR) werd ook aangetoond en dit verhoogt verder de complexiteit van steroïden-specificiteit.

Het is evident dat hormoon-selektiviteit ook afhangt van cel-type specifieke receptor-expressie, bio-beschikbaarheid van het hormoon (systemisch transport) en weefsel-specifieke hormoon-modificerende enzymen (metabolisme). […] De werking van een om ‘t even welk hormoon is veel meer dan een simpele enkelvoudige lineaire sequentie van oorzaken en gevolgen. Hormonen en de regulerende mechanismen die ze controleren vormen in elkaar verstrengelde netwerken. […]

9. Steroïden-resistentie en combinatie-therapie

GC-resistentie vertegenwoordigt een ernstig klinisch probleem bij verscheidene chronische inflammatoire ziekten. GC-responsieve weefsels met een geaktiveerde inflammatoire respons (gemedieerd door geaktiveerd NF-κB) kan resistent worden voor GC-signalisering omwille van een geblokkeerde GR-funktie. […] Deze resistentie wordt vastgesteld op de plaats van inflammatie, waar cytokinen worden geproduceerd, maar niet op niet-geïnflammeerde plaatsen. […]

[…]

Veel pro-inflammatoire cytokinen, die abnormaal ge-upreguleerd zijn bij chronische inflammatoire ziekten, vergen geconcerteerde aktivatie van NF-κB en AP-1. […]

Naast de stress-signalerende aspekten die eerder warden besproken, werden van andere parameters ook aangetoond dat ze bijdragen tot steroïden-resistente pathologieën: NR-mutaties die ligand-binding beïnvloeden of co-factor affiniteiten, gewijzigde co-factor expressie-niveaus, NF-κB afhankelijke expressie van het ‘multi-drug resistance’ proteïne MDR1, oncogene aktivatie van groei-factor signalerende mechanismen en veranderde schakelingen in non-genomische NR-mechanismen.

III. Algemeen Besluit

Inspanningen voor de ontdekking van medicijnen zijn gericht op het selektief moduleren van NF-κB en AP-1. GC zijn de meest gebruikte anti-inflammatoire en immuun-modulerende moddelen; hun aktivitrieit is gebaseerd op de interferentie met deze transcriptie-factoren. Het begrijpen van hun precies werkingsmechanisme werd vertroebeld door talrijke en soms tegenstrijdige hypothesen, die zouden kunnen voortvloeien uit verschillen in het target-gen, receptor of cellijn die wordt onderzocht. Dit overzicht belicht niet enkel het enorme werk dat reeds heeft geleid tot de ontwikkeling van (op het eerste zicht plausibele) modellen maar heeft ook gewezen op enkele van de tekortkomingen van de huidige dogmas. We zouden er willen op attenderen dat de verschillende modellen die werden besproken elkaar niet noodzakelijk uitsluiten. […]

Tot besluit, co-factor(en) (domeinen) die specifiek interakties van GR met NF-κB, AP-1 en/of het RNA-polymerase-II holo-enzyme moduleren in een bepaalde promotor context, zowel als dynamische subcellulaire lokalisatie van de verscheidene transcriptie-componenten en spatio-temporaal gereguleerde signalen die de corresponderende promotor-‘enhanceosomen’ [een proteïne-complex dat bindt op het ‘enhancer’-gebied van een gen - het kan transcriptiefactoren omvatten, versnelt de transcriptie van een gen] beïnvloeden, moeten nog verder worden onderzocht en ze zullen het belangrijkste aandachtspunt van onderzoekers in de toekomst zijn. Recente vooruitgang in dat gebied omvat de ontwikkeling en karakterisatie van zogenaamde dissociërende liganden. […] Deze laten toe inzicht te verwerven in de manier waarop GC pro-inflammatoire genen kunnen onderdrukken maar vergemakkelijken ook de ontwikkeling van een doelgerichte strategie om inflammatie en auto-immun ziekten te bestrijden. Ze bieden verder perspektieven om ongewenste bijwerkingen te elimineren. […] Het is evident dat de molelulaire mechanismen betrokken bij GR/NF-κB of GR/AP-1 kruis-repressie nog helemaal niet volledig worden begrepen.

Oxidatieve stress

Voor wie nog zou twijfelen aan het belang van oxidatieve stress bij M.E.(cvs): hierbij samenvattingen van (enkele van de vele) artikels over de jaren door verscheidene onderzoeksgroepen…

*************************

Life Sci 2001 Mar 16;68(17):2037-49

Anti-oxidant status and lipoprotein-peroxidation in CFS

Manuel y Keenoy B, Moorkens G, Vertommen J, De Leeuw I

University Hospital, University of Antwerp, Belgium

De etiologie en pathogenese van het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) blijven grotendeels onopgelost.

Begeleidende metabole aandoeningen zoals selektieve n-6 vetzuren depletie suggereert dat oxidatieve stress en meer specifiek lipiden-peroxidatie een rol zou kunnen spelen bij de pathogenese. [Oxidatieve stress is het resultaat van een onevenwicht tussen oxidante aanvallen te wijten aan de produktie van vrije radikalen en anti-oxidante verdediging.]

Om deze hypothese te onderzoeken, werd de oxidant/anti-oxidant status [TEAC (Trolox Equivalent Anti-oxidant Capacity), transferrine (ijzer-bindend proteïne) en ceruloplasmine (ijzer-oxiderend proteïne) - zorgen voor bescherming tegen ijzer-geïinduceerde lipiden-peroxidatie, vitamine-E en -A, glutathion (GSH) en glutathion-peroxidase; thiobarbituur-zuur reaktieve substanties (TBARS)] en de impact daarvan op lipoproteïnen-peroxidatie in vitro bestudeerd bij 61 patiënten met onverklaarde vermoeidheid die meer dan een maand duurde.

Ze werden onderverdeeld in 2 groepen: de groep CVS+ (33 individuen) voldeed aan de ‘Centre of Disease Control’ criteria (1988.) voor CVS en groep CVS- deed dat niet maar ze waren wel gelijkwaardig qua leeftijd, geslacht en klinische karakteristieken.

Anti-oxidant status was gelijkaardig voor de 2 groepen uitgezonderd voor het lager serum-transferrine bij CVS+ [serum-waarden van transferrine dalen dikwijls bij chronische inflammatie en trauma; oxidative stress kan ook mRNA voor transferrine doen dalen] (gemiddeld (95 % CI) 2.41 (2.28-2.54) versus 2.73 (2.54-2.92) g/l bij CVS-, p = 0.009) en de hogere lipoproteïnen-peroxidatie in vitro: 6630 (5949-7312) versus 5581 (4852-6310) nmol MDA/mg LDL en VLDL cholesterol x minuten, p = 0.035). CVS intensifieerde de invloed van LDL cholesterol (p = 0.012) en van transferrine (p = 0.045) op peroxidatie in vitro, wat bijkomende pro-oxidante effekten suggereert. [Voor vitamine-E was er ook een tendens naar lagere waarden bij CFS+ patiënten. Zie verder]

Deze resultaten wijzen er op dat patiënten met CVS een verhoogde vatbaarheid hebben qua koper-geïnduceerde lipiden-peroxidatie van LDL en VLDL en dat dit gerelateerd is met hun lagere serum-transferrine waarden en met andere ongeïdentificeerde pro-oxiderende effekten bij CVS.

[De auteurs melden nog dat de chronische inflammatoire status, die dikwijls wordt vastgesteld bij CVS, een mogelijke bron voor de oxidatieve stress is.]

*************************

Neurosci Lett. 2003 Jan 2;335(3):151-4

Relationship between musculoskeletal symptoms and blood-markers of oxidative stress in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Vecchiet J, Cipollone F, Falasca K, Mezzetti A, Pizzigallo E, Bucciarelli T, De Laurentis S, Affaitati G, De Cesare D, Giamberardino MA

Department of Medicine and Science of Aging, G. D’Annunzio University of Chieti, Italy

We onderzochten het oxidant/anti-oxidant evenwicht en zijn correlatie met spier-symptomen in 21 patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) versus 20 normale individuen. De patiënten vertoonden significante verschillen: lagere lag-fase, vitamine-E (Vit E) plasma-concentraties in plasma en lage-densiteit lipoproteïnen (LDL), meer LDL thiobarbituur-zuur reaktieve substanties (TBARS), meer vermoeidheid en lager spierpijn-drempels bij elektrische stimulatie. Er werd ook een significante direct lineaire correlatie gevonden tussen vermoeidheid en TBARS, drempels en lag-fase, drempels en vit-E in plasma en LDL. Een significante omgekeerd lineaire correlatie werd gevonden tussen vermoeidheid en lag-fase, vermoeidheid en Vit-E, drempels en TBARS. Verhoogde oxidatieve stress en verminderde anti-oxidant verdediging zijn verbonden met de symptomatologie bij CVS, suggererend dat anti-oxidant supplementen de spier-symptomen bij dit syndroom kunnen verlichten.

[Spectrofotometrische meting van TBARS verloopt in drie fasen: 1) the lag-time, waarbij de fluorescentie niet significant stijgt, geeft de capaciteit van de anti-oxidanten om lipoproteïnen-peroxidatie te vertragen aan; 2) de stijging bij de propagatie-fase, waarbij de fluorescentie snel toeneemt, geeft de snelheid van de oxidatieve veranderingen aan; 3) de verzadigingsfase, waarbij de fluorescentie een plateau bereikt, geeft de totale hoeveelheid geoxideerde lipiden aan.]

*************************

Free Radic Biol Med. 2005 Sep 1;39(5):584-9

Oxidative stress levels are raised in Chronic Fatigue Syndrome and are associated with clinical symptoms

Kennedy G, Spence VA, McLaren M, Hill A, Underwood C, Belch JJ

Vascular Diseases Research Unit, The Institute of Cardiovascular Research, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee, Scotland DD1 9SY, UK

De etiologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) is niet gekend; recent bewijsmateriaal suggereert echter dat een overmatige aanmaak van vrije radikalen (VR) betrokken kan zijn. Deze studie onderzocht voor de eerste keer 8-iso-prostaglandine-F(2alfa)-isoprostaan waarden samen met andere plasma-merkers voor oxidatieve stress bij CVS-patiënten en controle-individuen.

[Isoprostanen zijn stabiele produkten van arachidonzuur, gevormd op een niet-enzymatische, door vrije radikalen gekatalyseerde manier. Urinaire excretie van 8-iso-prostaglandine F2alfa, een isomeer van het PGG/H synthase (cyclooxygenase of COX) enzyme-produkt, prostaglandine F2alfa (PGF2alfa), bleek eerder beloftevol als een aanwijzing voor oxidatieve stress en lipiden-peroxidatie in vivo - hier werden ze in het plasma gemeten. Isoprostanen weerspiegelen niet alleen oxidatieve stress maar ze hebben ook krachtige biologische effekten geassocieerd met de peroxidatie van membraan-lipiden, verhoogde cel-permeabiliteit en een daaruit volgende verhoging van intracellulair calcium.]

Zevenenveertig patiënten (18 mannen, 29 vrouwen, gemiddelde leeftijd 48 [19-63] jaar) die voldeden aan de ‘Centres for Disease Control’ klassificatie voor CVS en 34 gezonde vrijwilligers (13 mannen, 21 vrouwen, gemiddelde leeftijd 46 [19-63] jaar) werden opgenomen in de studie. De CVS-patiënten werden ingedeeld in twee groepen: één groep had eerder gedefinieerde cardiovasculaire (CV) risico-factoren voor obesitas en hypertensie (groep 1) en de tweede hadden een normale bloeddruk en waren niet obees (groep 2).

Patiënten vertoonden significant verhoogde waarden aan isoprostanen (groep 1, P = 0.007; groep 2, P = 0.03, ongepaarde t-test vergeleken met controles) en geoxideerde lage-densiteit lipoproteïnen (groep 2, P = 0.02) wat wijst op een VR-aanval op de lipiden. CVS-patiënten hadden ook significant lagere hoge-densiteit lipoproteïnen (groep 1, P = 0.011; groep 2, P = 0.005). CVS-symptomen correleerden met isoprostaan-waarden maar enkel bij laag CV-risico CVS-patiënten van groep 2 (isoprostanen correleerden met de totale symptoom score P = 0.005, gewrichtspijn P = 0.002 en post-exertionele malaise P = 0.027, Pearson).

[De pro-oxidant status bleek een gevolg van de ziekte en geen secundair effekt van een CV-risico. De oxidatieve stress bij CVS is volgens dit onderzoek te wijten aan bovenmatige vorming van vrije radikalen en niet aan uitputting van de anti-oxidant reserves.

Ook te onthouden: ox-LDL, hier significant verhoogd, heeft ook het vermogen om genen geassocieerd met anti-oxidante responsen zoals de gen transcriptie-factor nuclear factor-kappa B (NF-κB) te stimuleren.]

Dit is de eerste keer dat gestegen waarden voor de ‘gouden standaard’ meting van in vivo oxidatieve stress (isoprostanen) en hun associatie met CVS-symptomen worden gerapporteerd.

*************************

Journal of Internal Medicine (March 2005) Volume 257 Issue 3 Page 299-310

Chronic Fatigue Syndrome: assessment of increased oxidative stress and altered muscle-excitability in response to incremental exercise

Jammes Y, Steinberg JG, Mambrini O, Bregeon F, Delliaux S

From the Laboratoire de Physiopathologie Respiratoire (UPRES EA 2201), Faculté de Medecine, Institut Federatif de Recherche Jean Roche and Service des Explorations Fonctionnelles Respiratoires, Hopital Nord, Assistance Publique-Hopitaux de Marseille, Marseille, France

Omdat de spier-respons op toenemende inspanning niet goed is gedocumenteerd bij patiënten die lijden aan het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS), combineerden we elektrofysiologische en biochemische (melkzuur-produktie, oxidatieve stress) metingen om vast te stellen of er spier-dysfunktie is in respons op een routine fiets-inspanning.

Deze ‘case-control’ studie vergeleek 15 CVS-patiënten met een controle-groep van gezonde individuen gematcht qua geslacht, leeftijd en gewicht (n = 11).

Alle individuen voerden een fietstest met toenemende inspanning tot uitputting uit.

We maten de zuurstof-opname (VO₂), hartslag (HR), systemische bloeddruk, percutane O₂-saturatie (SpO₂), M-wave [‘compound-evoked muscle action potentials’ - de geschikte zenuw wordt elektrisch gestimuleerd en de opgewekte respons kan worden gemeten; een niet-invasieve manier om perifere spier-vermoeidheid bij inspanning te meten] van de vastus lateralis [spier aan de voorzijde van het dijbeen, deel van de quadriceps] en namen veneus bloed af om zo de zuurtegraad (pHv), PO₂ (PvO₂), melkzuur (LA) en drie merkers voor oxidatieve stress (thiobarbituurzuur-reaktieve substanties – TBARS, gereduceerd glutathion – GSH en ascorbinezuur – RAA) te kunnen meten.

Bij CVS-patiënten verschilde (i) de relatie stijgingsgraad van VO₂ versus inspanningsvolume niet van controle-individuen en er was een tendens voor een aangescherpte PvO₂ daling bij dezelfde inspanningsintensteit, wat wijst op een verhoogde zuurstof-opname in de spieren bij inspanning; (ii) de HR- en bloeddruk-respons bij inspanning varieerde niet; (iii) de anaërobe mechanismen waren niet geaccentueerd; (iv) de door inspanning geïnduceerde oxidatieve stress was versterkt (vroege veranderingen in TBARS en RAA, en verhoogd maximaal RAA-verbruik); en (v) de M-wave duur was duidelijk gestegen tijdens de herstel-periode. [Hierbij werden geen wijzigingen in de neuromusculaire transmissie (geleidingstijd van spiervezels) gemeld maar er worden wel uitgesproken veranderingen van spier-prikkelbaarheid aangetoond vroeg na het beëindigen van de inspanning.]

Besluiten: De respons van CVS-patiënten op toenemende inspanning gaat gepaard met een verlengde en verhoogde oxidatieve stress samen met uitgesproken wijzigingen van de prikkelbaarheid van het spier-membraan. Deze twee objectieve tekenen van spier-dysfunktie volstaan om de spierpijn en post-exertionele malaise, gerapporteerd door onze patiënten, te verklaren.

*************************

Int J Cardiol. 2008 Aug 4. [ahead of print]

Increased oxidative stress suggested by low serum vitamin-E concentrations in patients with Chronic Fatigue Syndrome

Kunihisa Miwa^a and Masatoshi Fujita^b

^aDepartment of Internal Medicine, Nanto Home and Regional Medical Centre, 577 Matsubara, Nanto, Toyama 939-1518, Japan

^bHuman Health Sciences, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan

Serum alfa-tocoferol [vitamine-E; een belangrijke endogene vet-oplosbare anti-oxidatieve substantie, verbruikt tijdens het lipiden-peroxidatie proces, zou - samen met het mineraal seleen - de oxidatie van cellen en celmembranen tegen gaan. De werking is niet precies bekend.] concentraties werden bepaald bij 50 patiënten met het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) en 40 controle-individuen (Controle).

Prevalentie van om het even welke coronaire risico-factor was niet significant verschillend tussen CVS en Controle. CVS-patiënten vertoonden significant lagere alfa-tocoferol concentraties dan controles. De concentraties waren significant lager bij de individuen met om het even welke coronaire risico-factoren dan deze zonder, bij CVS zowel als Controle. Zelfs onder de individuen met om het even welke coronaire risico-factoren en ook deze zonder, hadden CVS-patiënten significant lagere alfa-tocoferol concentraties dan controles.

Tot bersluit: CVS-patiënten hadden significant lagere alfa-tocoferol concentraties ongeacht coronaire risico-factoren dan controles, wat de aanwezigheid suggereert van verhoogde oxidatieve stress bij CVS. [Of verhoogde oxidatieve stress één van de oorzaken van CVS is of een gevolg blijft onbekend.]

*************************

Clin Invest Med. 2008 Dec 1;31(6):E319-27

Differential heat shock protein responses to strenuous standardized exercise in Chronic Fatigue Syndrome patients and matched healthy controls

Anita A. Thambirajah BSc¹; Kenna Sleigh RN, MSN, PhD²; H. Grant Stiver MD, FRCPC³; Anthony W. Chow MD, FACP, FRCPC⁴

1 Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, Victoria, Canada

2 Department of Surgery, Division of Urology, Department of Urological Sciences at Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

3 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

4 Division of Infectious Diseases, Vancouver General Hospital and University of British Columbia, Vancouver, Canada

Doel: Aangezien fysieke inspanning de symptomen van het Chronische Vermoeidheid Syndroom verergert en metabole veranderingen, inclusief oxidatieve stress, de expressie van heat-shock proteïnen (HSP) kunnen moduleren, wilden we bepalen of HSP-expressie is gewijzigd bij CVS-patiënten voor en na inspanning.

Methoden: HSP27, HSP60, HSP70 en HSP90 expressie van 6 CVS-patiënten en 7 controles (gematcht voor leeftijd en geslacht) werden onderzicht m.b.v. ‘western blot’ analyse van perifeer bloed mononucleaire cellen onmiddellijk voor, na en 1 dag en 7 dagen volgend op een gestandardiseerde loopband-inspanning.

Resultaten: Basaal HSP27 was hoger bij CVS-patiënten dan bij controles (0.54 +/- 0.13 vs. 0.19 +/- 0.06, gemiddelde +/- SEM; P < 0.01). Verder waren deze waarden bij CVS-patiënten gedaald onmiddellijk na inspanning (0.25 +/- 0.09; P < 0.05) en bleven onder basale waarden 1 dag na inspanning (0.18 +/- 0.05; P < 0.05). P < 0.05). […] In tegenstelling hiermee bleven HSP27-waarden relatief constant na inspanning bij controle-individuen. Gelijkaardige patronen van verminderende HSP-waarden bij CVS-patiënten worden ook gezien voor HSP60 (0.94 +/- 0.40 vs. 1.32 +/- 0.46; P < 0.05) en voor HSP90 (0.34 +/- 0.09 vs. 0.49 +/- 0.10; P < 0.05) op dag 7 na inspanning vergeleken met basale waarden, respectievelijk. Contrasterend was dat HSP60-waarden bij controle-individuen waren gedaald op dag 1 (1.09 +/- 0.27) en dag 7 (1.24 +/- 0.50) na inspanning vergeleken met corresponderende waarden onmiddellijk na inspanning (0.55 +/- 0.06) (P < 0.05, respectievelijk).

Besluit: Deze voorlopige bevindingen suggereren een abnormale of defekte adaptieve respons op oxidatieve stress bij CVS en de mogelijkheid rijzen dat HSP-profilering kan voorzien in een meer objectieve biologische merker voor deze ziekte.

*************************

Wordt vervolgd…

Afwijkende Pijndrempels en Morfologie in de Spieren bij CVS

De ‘Clinic of Infectious Diseases’ van de ‘G. D’Annunzio’ Universiteit te Chieti is één van de belangrijkste ‘National Reference Centres’ voor de studie van CVS in Italië. De onderzoeksgroep o.l.v. Professor Eligio Pizzigallo (in het ‘Department of Medicine and Science of Aging’) heeft over de jaren enkele interessante papers gepubliceerd die niet altijd werden opgemerkt. Er bestaan dus ook referentiecentra waar degelijk biomedisch onderzoek wordt verricht!

Het team was zo vriendelijk een aantal van hun studies te bezorgen…

Hieronder een stuk dat, reeds jaren geleden, veranderingen in de spieren bij CVS-patiënten op morfologisch, biochemisch en molekulair vlak aantoonde en bevestigde. “Bij CVS lijken mitochondriale en/of spier-veranderingen dus bij te dragen aan de symptomen maar schade aan het centraal zenuwstelsel kan ook niet worden uitgesloten. Een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong zou de daling in funktionele mogelijkheden van de spier kunnen verklaren, zowel als een vermindering in kracht maar, vooral, een vermindering in weerstand.”

[Met ‘parietaal’ wordt hier bedoeld: van het bewegingsapparaat]

Neurosci Lett. 1996 Apr 19;208(2):117-20

Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with Chronic Fatigue Syndrome

Vecchiet Leonardo, Montanari Giuseppe, Pizzigallo Eligio, Iezzi Sabina, de Bigontina Paolo, Dragani Luca, Vecchiet Jacopo, Giamberardino Maria Adele

Institute of Medical Pathophysiology & Clinic of Infectious Disease, ‘G. D’Annunzio’ University of Chieti, Italy

Studie gesponsord door de ‘Italian National Research Council’; Projekt ‘Preventie en Controle van Ziekte Factoren’, Subprojekt ‘Stress’, ‘Neurofysiologische en Psychologische Aspekten van Fibromyalgische Syndromen’.

De symptomatologie van het Chronische Vermoeidheid Syndroom (CVS) ligt vooral in het musculoskeletale domein: onverklaarde ernstige en invaliderende chronische of terugkerende vermoeidheid, verlaagde tolerantie voor fysieke inspanning en, zeer frequent, diffuse spierpijnen. De pathofysiologie van het syndroom, waarvan het begin dikwijls samengaat met an acute virale ziekte, is nog steeds ongekend, alhoewel meerdere hypothesen werden geuit. Eén zo’n hypothese is dat CVS-symptomen van puur centrale origine zijn, nl. de uitdrukking van een veralgemeende verhoogde perceptie van fysiologische signalen komende van alle lichaamsgebieden in plaats van significante perifere abnormaliteiten van het spierweefsel. Dit wordt ondersteund door auteurs die de afwezigheid van enige selektieve spier-overgevoeligheid en specifieke morfostrukturele veranderingen van spiervezels uit biopten bij CVS-patienten claimen.

Wat betreft pijngevoeligheid werden echter nooit pogingen ondernomen om de spieren van CVS-patiënten selektief te karakteriseren en om te differentiëren tussen spier- en cutane/ subcutane gevoeligheid. Wat betreft de morfologische veranderingen hebben de verscheidene studies die werden ondernomen tegenstrijdige resultaten opgeleverd, en samen met deze die significante afwijkingen van de norm voor spiervezels uitsloten, rapporteren andere duidelijke abnormaliteiten [Behan WMH, More IAR, Behan PO. Mitochondrial abnormalities in the post-viral fatigue syndrome. Acta Neuropathol, 83 (1991) 61-65]. Deze belangrijke controverse in de literatuur zou, ten minste gedeeltelijk, te wijten kunnen zijn aan het gebruik van verschillende diagnostische criteria voor het screenen van CVS, een pathologie die slechts recent werd gedifferentieerd van andere gelijkaardige aandoeningen, in het bijzonder fibromyalgie (FS).

In deze studie onderzochten we patiënten waarvan de diagnose CVS werd gesteld door het strikt toepassen van de 1988 CDC (Centres for Disease Control and Prevention) criteria. Het doel was om ze te karakteriseren vanuit een sensorisch standpunt door het selektief bepalen van pijndrempels in de huid, subcutis en spier in verschillende lichaamsgebieden en te kijken of een mogelijke wijziging in spiergevoeligheid correspondeert met anatomische veranderingen in spier-biopten.

21 CVS-patiënten (17 vrouwen, 4 mannen; gemiddelde leeftijd 36,14 ± 11,06 jaar) warden onderzocht in het ‘Centre for the Study of CFS’ aan de ‘G. D’Annunzio’ University of Chieti (Italië).

Hun symptomen waren 7-252 maand (gemiddelde 35,3 maand) eerder begonnen met een post-infektueuze start en aanwezigheid van spierpijnen in 48% van de gevallen. Ze hadden normale parameters bij de routine haematochemische testen en hadden geen medicijnen genomen gedurende een maand vóór evaluatie. Bij alle patiënten werden pijndrempels bij elektrische stimulatie gemeten in de trapezius, deltoid en quadriceps spieren aan één kant en de tegenoverliggende huid en subcutis. De resultaten werden vergeleken met die van corresponderende gebieden bij 30 normale individuen (15 vrouwen en 15 mannen; gemiddelde leeftijd 38,26 ± 7,31 jaar). Stimulatie […] (frequentie 310 Hz), elke 2 s op de huid via twee oppervakte-elektroden, en in de subcutis en spier via twee naald-elektroden. Met deze stimulatie-parameters en elektroden bereikt men, door een graduele toename van de stroom-intensiteit, een duidelijke pijnlijke sensatie bij de individuen, met specifieke karakteristieken, in de drie weefsels: prikkende pijn voor de huid, lineair stralende prik-pijn voor de subcutis, kramp-achtige pijn voor de spier. De drempel van deze sensaties (pijn-drempel) werd gemeten, in mA, op hetzelfde tijdstip van de dag (10:00-12:00 h) en tijdens dezelfde periode van de menstruatie-cyclus bij de vruchtbare vrouwen (vroege follikulaire fase, dag 2-6).

Bij negen patiënten (8 vrouwen en 1 man; gemiddelde leeftijd 34,33 ± 13,69 years; post-virale aanvang in vijf gevallen) werd ook een spier-bioptie uitgevoerd in de rechter quadriceps. Een equivalent aantal biopten bij normale individuen van vergelijkbare leeftijd kon, om ethische redenen, kon niet worden gedaan; slechts vier normale vrijwilligers (17, 23, 35, 60 jaar) werden onderzocht en dienden als controles. Het bioptie-beeld van de patiënten werd echter ook geanalyseerd op basis van de resultaten bij normale individuen beschikbaar in de literatuur.

Bioptie-stalen (0,1-0,3 g) werden onderverdeeld in vier stukjes. Het eerste werd onmiddellijk gefixeerd voor elektronen-microscopie (EM), het tweede werd verwerkt voor histologische en histochemische licht-microscopie (LM) studies. Bij slechts drie patiënten werden de laatste twee stukjes aseptisch in twee afzonderlijke tubes onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof voor kwantitatieve bepaling van de belangrijkste mitochondriale enzymatische aktiviteiten en studie van de 4.977 bp deletie van mitochondriaal DNA (mtDNA) (exponentiële PCR lwantitative analyse).

[…]

Pijndrempels bij elektrische stimulatie bij CVS-patiënten waren normaal in de huid en subcutis maar significant lager dan normaal (hyperalgesie) in de spier op alle drie de geteste lichaamsplaatsen (P < 0.001).

Bij LM van de bioptie-stalen werd een aantal morfologische veranderingen gevonden bij alle onderzochte patiënten: hypotrofie (in het bijzonder type IIa en type IIb vezels in acht gevallen en type I vezels in één geval; vezel-fragmentatie, aanwezigheid van ‘red ragged fibers’ [RRF; rode gerafelde vezels: Als een spier-cel over minder energie beschikt, worden meer mitochondriën geproduceerd in een poging om de nodige energie te leveren. Die nieuwe mitochondriën zijn zelf defekt, zodat nog meer mitochondriën worden aangemaakt en zich opstapelen. Bij een spier-biopt dat wordt gekleurd met de ‘Gomori trichroom’ kleuring zijn de mitochondriën rood en de spiervezel heeft een karakteristiek gerafeld uitzicht onder een microscoop.] en fusies met kern-centralisatie; vette en vezel-degeneratie; endomysiale verdikking. [endomysium = bindweefselschede rond een spiercel/-vezel in een spierbundel] Bij zeven patiënten waren ook vezel-regeneratie-processen (‘striped nuclei’ [gestreepte kernen]) aanwezig samen met proliferatief weefsel rijk aan fibroblasten.

Bij EM werd de overvloed aan vezel-proliferatie en lipiden-accumulatie bevestigd, en funktionele verandering van de myofibrillen, te wijten aan degeneratie van de I-band [onder een microscoop vertoont een ontspannen myofibril afwisselend donkere banden (de A-banden) afgewisseld door lichte banden (de I-banden)], werd ook gedetekteerd, samen met poly- (acht gevallen) en, soms, pleo-morfisme [veel-/meer-vormigheid] van mitochondriën met verdikking van de cristae [instulpingen van het binnenste membraan in een mitochondrium].

Geen van de vermelde micro- of ultra-microscopische veranderingen werden ooit gedetekteerd bij de vier normale individuen. In het bijzonder werd bij LM vezel-compactheid geobserveerd, zonder hypotrofie en/of fusie; de hematoxilyne-eosine kleuring toonde een regelmatige morfologie van de van myofibrillen met perfekte en constante positie van de kernen aan de periferie. Bij EM leken de Z-lijnen perfekt uitgelijnd, met ‘wilde’ [tegengesteld van gemuteerd] mitochondriën overwegend gepositioneerd aan de uiteinden van elk sarcomeer; inter-myofibrillaire ruimten waren smal.

[Elke spiervezel bestaat uit organellen, kleine organen binnen de cel. De eiwitten die een rol spelen bij samentrekking nemen van die organellen de meeste ruimte in. Deze eiwitten zijn opgebouwd uit actine- en myosine-molekulen en liggen binnen de spiervezels in bundeltjes gerangschikt (de myofibrillen). Deze bundels vertonen in de lengtedoorsnede een dwarsgestreept patroon. De strepen noemen we Z-lijnen. De dwarse streping ontstaat door de regelmatige opbouw van de myofibrillen: actine- en myosine-filamenten wisselen elkaar af. Binnen een myofibril noemen we de afstand van een Z-lijn tot een volgende Z-lijn een sarcomeer.]

Alle patiënten vertoonden hypo-captatie of zonale capitatie [opname van kleurstof] bij NADHtr en COX [bepaalde histochemische mitochondriale] kleuringen, en hyper-captatie van succinaat-dehydrogenase (SDH), wat wijst op een vermindering van de oxidatieve eigenschappen in de spier, geëvalueerd op een enzyme van de mitochondriale matrix. Een vermindering van sommige enzymatische aktiviteiten (cytochroom-oxidase en citraat-synthetase) was ook aanwezig bij kwantitative bepaling en stijgingen van 150 tot 3.000 keer de normale waarden van de gebruikelijke deletie van 4.977 bp mitochondriaal DNA werden gevonden.

De studie toonde dat patiënten met CVS, met of zonder spierpijnen, een toestand vertonen van diffuse hyperalgesie in de spieren, in contrast met een normale pijn-gevoeligheid in de huid en subcutis, een bevinding die de aanwezigheid van een veralgemeende verhoogde perceptie van fysiologische signalen uitsluit, zoals gesuggereerd door sommige auteurs. De resultaten van de sensorische testen bij CVS zijn ook verschillend van die uit corresponderende gebieden bij patiënten met fibromyalgia (FS) [De Bigontina P, Giamberardino MA, Pizzigallo E, Vecchiet L. Chronic Fatigue Syndrome, fibromyalgia and myofascial pain syndrome: comparative sensory evaluation of parietal tissues, Proceedings of the Research Conference of the American Association for Chronic Fatigue Syndrome, October 7-9, 1994 (Abstracts Book), p.78], niettegenstaande het feit dat CVS en FS lang werden beschouwd (en door sommige auteurs nog worden beschouwd) als verschillende aspekten van dezelfde pathologie eerder dan onafhankelijke syndromen. In eerdere studies door onze groep bij patiënten met FS werd een veralgemeende verlaging van pijndrempels gevonden: niet enkel in de spieren maar ook in de huid en subcutis, binnen (‘tender spots’) én buiten de pijnlijke plaatsen.

Samen met selektieve spier-hypergevoeligheid is er de bevinding van een aantal anatomische veranderingen in de spieren die, hoewel niet specifiek, gedocumenteerd werden in alle onderzochte CVS-patiënten, terwijl ze veel minder frequent voorkomen in bioptie-stalen van gezonde individuen. Het globaal beeld van de wijzigingen suggereert een degeneratieve status van spier-weefsel, wijzend op een verminderde funktionele capaciteit. De resultaten van onze research aangaande de anatomische spier-veranderingen bij CVS komen overeen met bevindingen van ander auteurs [Gow JW, Behan WMH, Simpson K, McGarry F, Kay D, Behan PO. Mitochondrial damage in Chronic Fatigue Syndrome. Meeting on Chronic Fatigue Syndrome, Dublin. 18-20 May 1994] die veranderingen vonden (alhoewel enkel bij patiënten met post-viraal vermoeidheids syndroom) die compatibel zijn met een myopathie van waarschijnlijk mitochondriale oorsprong.

Tot bersluit: alhoewel de selektieve spier-hyperalgesie op zichzelf niet wijst op een perifere eerder dan een centrale oorsprong van spier-symptomen bij in CVS, suggereert de aanwezigheid van lokale morfostrukturele spier-veranderingen naast de hyperalgesie dat perifere mechanismen een rol kunnen spelen bij het ontstaan van de CVS-symptomatologie.